ＰＰＲ−γ受容体の活性化による自己免疫疾患およびアルツハイマー病の治療に有用なＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓｐａｎｉｃｕｌａｔａから抽出されたラブダンジテルペン類の組成物
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａからの貴重な植物種の乾燥薬草から特殊な抽出法により得られるジテルペンラブダン類と同定された分子から構成される、ヒトおよび動物の自己免疫その他の免疫学的疾患の治療のための、低毒性および重大な副作用のないことを特徴とする組成物。同様に、この新規な組成物はアルツハイマー病の予防および治療のために有用な医薬組成物を調製するためにも有用である。本組成物はＰＰＡＲγ受容体を活性化してＮＦκＢを減らす結果、炎症誘発性サイトカインの合成を阻止する。それ自身の治療特性に加えて、この新規な組成物は、重要な毒性レベルを有しかつ／または望ましくない副作用を引き起こす現在の製品、薬および処置の不便を解決する。本発明は、免疫薬理学、臨床および前臨床のヒトおよび獣医科の薬理学、製薬技術、リウマチ学および臨床免疫学、免疫療法、臓器および組織移植、ならびにエイズのような免疫不全疾患に用途を有する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
説明
免疫薬理学および生物薬剤学の主な目的は、免疫疾患の症状を治療しその経過を修飾する新規な治療解決策を継続的に探索することである。
【０００２】
発明の背景
自己免疫疾患は、それ自身の生体に対する免疫系の自発的反応を特徴とする。これらの反応は、液性（自己抗体生産）および細胞性（リンパ球およびマクロファージの細胞毒性活性の増加）の免疫反応を起動させる役割を担うＴリンパ球による自己抗原の認識により生じる。自己免疫疾患には、リウマチ様疾患、乾癬、全身の皮膚筋炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡（lupus erythematous）、または抗原により悪化される免疫応答、即ち喘息、薬剤および食物に対するアレルギー、その他が含まれる。全てのこれらの疾患は制限的、慢性的であり、場合によっては致死性であるが、それらを治療する有効な治療法は現在存在しない。したがって、疾患の経過において寛解または減少をもたらすことができるあらゆる薬剤、医薬または媒体は、患者の健康のための重要な解決策となる。
【０００３】
自己免疫疾患のための治療法の探索は、適切な薬剤および方法を見つける重要な努力をもたらした。
現在、これらの疾患の治療は、主に糖質コルチコイド、カルシニューリン阻害剤および抗増殖剤−代謝拮抗物質などの免疫抑制剤の使用に基づいている。しかし、これらの薬理学的療法は多くの異なる標的に作用するので、それらは免疫機能を全体として低下させるか、または、長期使用では異なる細胞傷害作用という不利を有する可能性があり、したがって、非特異的に免疫系を抑制して患者を感染症および癌のリスクにさらす可能性がある。カルシニューリンおよび糖質コルチコイドは、それらの腎毒性および糖尿病誘発作用のために、いくつかの臨床状態（例えば腎不全、糖尿病）でのそれらの有用性を制限するさらなる不利を示す。
【０００４】
免疫抑制における最新の治療上の進歩は抗ＣＤ３モノクローナル抗体、即ち抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体および抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である。これらの治療法は著しい免疫抑制作用、アナフィラキシー反応、日和見感染（結核）および新生物を示すにもかかわらず、熱、じんま疹、低血圧症、呼吸困難がこれらの薬と関連し、前記組成物および医薬品の適用において深刻な問題となっている。注射用途の場合、患者３人中１人は痒み、腫脹および疼痛を示しうる。
【０００５】
発明の簡単な要約
本発明で請求する組成物は、自己免疫疾患、アレルギーの特徴である免疫反応を減少させて疾患の症状および経過を緩和し、「免疫寛容」を維持することができる。
【０００６】
言い換えると、本発明で開示される組成物は、それがもたらす免疫寛容によって本質的に特徴づけられ、これは、抗原に対する特異的な反応が欠如した活性状態に対応し、現行の免疫抑制薬剤の副作用を引き起こすことがない。
【０００７】
具体的には、この組成物は、ＰＰＡＲγ受容体を刺激してＮＦκＢ因子を減らすことにより、インターフェロンγ、ＩＬ−２の合成および発現を阻害する。
したがってこのジテルペン性ラブダン類の新規な組成物は、自己免疫疾患の病因に関係するサイトカイン過剰発現を選択的に減少させることを特徴とする。
【０００８】
急性および慢性炎症性疾患および癌に関係するメディエーターの科学的理解における最近の進歩は、有効な治療法の探索における新規な戦略をもたらした。伝統的な手法としては、特異的抗体、受容体アンタゴニストまたは酵素阻害剤の使用など、直接的標的介入があり、これらは全て重大レベルの副作用（例えばアレルギー、胃腸の潰瘍、出血、その他）を伴う。様々なメディエーターの転写および翻訳に関係する調節機構の解明が最近進展したことにより、遺伝子転写レベル（例えば、ＣＯＸ２、ｉＮＯＳ、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ、その他）に向けられた治療手段に対する関心が増加した。
【０００９】
最も重要なメディエーターの１つは、Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーのポリペプチドの様々な組合せから構成される緊密に関連したダイマー転写因子複合体ファミリーに属している、ＮＦκＢである。このファミリーは、哺乳類の５つの個々の遺伝子産物である、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０／ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ４９／ｐ１００）、ｃ−ＲｅｌおよびＲｅｌＢからなり、その全てはヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成することができる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合および二量体化ドメインを含有する相同の高い３００アミノ酸の「Ｒｅｌ相同性ドメイン」を共有する。Ｒｅｌ相同性ドメインの最Ｃ末端には、細胞質から核へのＮＦ−κＢの輸送において重要な核転座配列がある。さらに、ｐ６５およびｃＲｅｌは、それらのＣ末端に強力なトランス活性化ドメインを有する。
【００１０】
ＮＦ−κＢの活性は、阻害剤ＩκＢファミリーのタンパク質のメンバーとの相互作用によって調節される。この相互作用は効果的にＮＦ−κＢタンパク質上の核移行配列を遮断することにより、核への二量体の移動を防止する。多種多様な刺激が、おそらくは複数のシグナル伝達経路を介して、ＮＦ−κＢを活性化する。これには細菌生成物（ＬＰＳ）、一部のウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１）および環境ストレスが含まれる。しかし、表面上全ての刺激に共通するのは、リン酸化および以降のＩκＢの分解である。ＩκＢは、最近特定されたＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β）によって、２つのＮ末端セリン上でリン酸化される。部位特異的突然変異誘発研究によると、一度リン酸化されるとタンパク質はユビキチン−プロテアソーム経路による分解のために目印をつけられることから、これらのリン酸化はＮＦ−κＢの後の活性化のために重要であることが示されている。ＩκＢから遊離すると、活性ＮＦ−κＢ複合体は核に移行して、そこで好ましい遺伝子特異的エンハンサー配列に選択的に結合することができる。ＮＦ−κＢによって調節される遺伝子には、いくつかのサイトカイン、細胞接着分子および急性期タンパク質が含まれる。
【００１１】
ＮＦ−κＢが、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカイン、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭなどの細胞接着分子、ならびに誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を含む多数の炎症誘発性メディエーターの調節された発現で重要な役割を果たすことは、周知である。そのようなメディエーターは炎症部位で白血球を補充する役をつとめることが知られており、ｉＮＯＳの場合は、一部の炎症性疾患および自己免疫疾患では臓器破壊をもたらす可能性がある。
【００１２】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要性は、ＮＦ−κＢが活性化されることが明らかにされている喘息を含む気道炎症の研究においてさらに強調されている。この活性化は、これらの障害の特徴であるサイトカイン生産の増加および白血球浸潤の根底にあるかもしれない。さらに、吸入されたステロイドは喘息の気道で気道過敏症を減少させ、炎症性反応を抑えることが知られている。糖質コルチコイドのＮＦ−κＢ阻害に関する最近の知見を考慮すると、これらの効果はＮＦ−κＢの阻害により媒介されると推測することができる。
【００１３】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割のさらなる証拠は、リウマチの滑膜に関する研究からもたらされる。ＮＦ−κＢは通常不活性の細胞質複合体として存在するが、近年の免疫組織化学的研究は、リウマチ性滑膜を含む細胞ではＮＦ−κＢが核に存在し、したがって活性であることを示している。さらに、ＮＦ−κＢはＴＮＦαによる刺激に応じてヒト滑膜細胞で活性化されることが示された。そのような分布は、この組織の特徴であるサイトカインおよびエイコサノイド産生の増加の根底にあるメカニズムであるかもしれない。Ｒｏｓｈａｋ、Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、３１４９６〜３１５０１（１９９６）を参照。
【００１４】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割のさらなる証拠は、リウマチの滑膜に関する研究からもたらされる。ＮＦ−κＢは通常不活性の細胞質複合体として存在するが、近年の免疫組織化学的研究は、リウマチ性滑膜を含む細胞ではＮＦ−κＢが核に存在し、したがって活性であることを示している。さらに、ＮＦ−κＢはＴＮＦαによる刺激に応じてヒト滑膜細胞で活性化されることが示された。そのような分布は、この組織の特徴であるサイトカインおよびエイコサノイド産生の増加の根底にあるメカニズムであるかもしれない。Ｒｏｓｈａｋ、Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、３１４９６〜３１５０１（１９９６）を参照。
【００１５】
ＮＦ−κＢ／ＲｅｌおよびＩκＢタンパク質も、悪性形質転換で重要な役割を果たしているようである。ファミリーメンバーは、過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子再構成または転座の結果としてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞形質転換と関連している。さらに、これらのタンパク質をエンコードしている遺伝子の再構成および／または増幅が、ある種のヒトリンパ性腫瘍の２０〜２５％で見られる。さらに、アポトーシスの調節におけるＮＦ−κＢの役割が報告され、細胞増殖の制御におけるこの転写因子の役割を強化している。
【００１６】
ＮＦ−κＢの最初の植物由来のモジュレーターは、サリチル酸ナトリウムおよびその半合成誘導体のアスピリンを特定したＫｏｐｐとＧｈｏｓｈ（１９９４）によって、ほぼ１０年前に報告された。この発見の後、異なる化学クラスのいくつかの新規な天然物が、ＮＦ−κＢ阻害活性を示した。
【００１７】
いくつかのＮＦ−κＢ阻害剤が文献：Ｃ．Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５）、１１６３〜１１７４（１９９８）；Ｒ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１、４１３〜４１９（１９９８）；Ｊ．Ｗ．Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２１０９６〜２１１０３（１９９７）に記載されている。海洋性天然物ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）は、ＮＦ−κＢを阻害することが知られている：Ｒｏｓｈａｋ、Ａら、ＪＰＥＴ、２８３、９５５〜９６１（１９９７）。Ｂｒｅｔｏｎ、Ｊ．ＪおよびＣｈａｂｏｔ−Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、Ｍ．Ｃ．、ＪＰＥＴ、２８２、４５９〜４６６（１９９７）。サリチルアニリドは公知の化合物であり、Ｍ．Ｔ．Ｃｌａｒｋ、Ｒ．Ａ．Ｃｏｂｕｒｎ、Ｒ．Ｔ．Ｅｖａｎｓ、Ｒ．Ｊ．Ｇｅｎｃｏ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、２９、２５〜２９によって記載されている。
【００１８】
最近、ＮＦ−κＢ阻害の重要なメカニズムにより、ペルオキシソーム受容体の活性化の可能性が示唆されている。
「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体」（ＰＰＡＲ）［この用語の通常の使用に注目するときには、科学の領域で公知のその略語で表し、当該略語はこの受容体を特定するために使用されるものとする］として知られるペルオキシソームの受容体は、自己免疫疾患および他の疾患、即ち糖尿病、心血管および胃腸の疾患ならびにアルツハイマー病との関係が示唆されている。ＰＰＡＲγアゴニストを含む現在の医薬剤はまだ実験段階であり、その作用機構のために人には深刻な副作用を起こす。したがって、上述の疾患または病態を予防、治療および／または軽減するために、より正確にこれらの受容体をモジュレートすることができるより毒性の低い新規な薬剤を開発する必要がある。
【００１９】
この新規な組成物はこれらの受容体をより正確にモジュレートするので、患者に望ましくない副作用を引き起こすことなく、自己免疫疾患をより有効に予防、治療および／または軽減することを可能にする。
【００２０】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、遺伝子発現を調節するリガンド活性化転写因子である核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＰＰＡＲの様々な亜型が発見されている。これらには、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβまたはＮＵＣ１、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδが含まれる。
【００２１】
ＰＰＡＲγは、当初脂肪細胞分化および脂質代謝の重要な調節因子と特徴づけされた。ＰＰＡＲγの発現は異なる複数のプロモーターによって指示される、３つのＰＰＡＲγアイソフォームが生じる。ＰＰＡＲγは繊維芽細胞、筋細胞、乳房細胞、ラット脾臓の白色および赤色脾髄、ヒト骨髄前駆体ならびにマクロファージ／単球を含む他の細胞型でも見られることが、現在明らかとなっている。さらに、ＰＰＡＲγはアテローム硬化型プラーク内のマクロファージ泡沫細胞で見られた。糖代謝におけるＰＰＡＲγの重要な役割は、あるクラスの抗糖尿病薬であるチアゾリジンジオンが高親和性のＰＰＡＲγリガンドであることが証明されたときに特定された。チアゾリジンジオンは、当初、インスリン抵抗性の齧歯類モデルでグルコースレベル（および循環脂肪酸のレベル）を下げるそれらの能力に基づき、２型糖尿病の治療のために開発された。チアゾリジンジオンはＰＰＡＲγとの直接相互作用を通してそれらの治療効果を媒介するとの知見により、ＰＰＡＲγがグルコースおよび脂質のホメオスタシスの重要な調節因子であると立証された。当初は脂質およびグルコースの代謝の調節因子として記載されたにもかかわらず、近年、ＰＰＡＲγは細胞増殖および悪性腫瘍における役割を有することも立証された。ＰＰＡＲγのリガンドは、細胞増殖および悪性腫瘍に対する正および負の作用を媒介することが示された。
【００２２】
チアゾリジンジオンクラスの抗糖尿病薬に加えて、様々な非ステロイド性抗炎症薬もＰＰＡＲγリガンドとして機能することができるが、後者の親和性は比較的低い。
プロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）脱水物ＰＧＪ2は、最初に発見されたＰＰＡＲγの内因性リガンドであった。別のＰＧＤ2脱水物１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2（１５ｄ−ＰＧＪ2）も直接ＰＰＡＲγと結合する天然物質であり、ＰＰＡＲγ活性化のための強力なリガンドである。
【００２３】
ＰＰＡＲおよびマクロファージを関連づける最も初期の知見の１つは、ＰＰＡＲγがヒトおよびマウスのアテローム硬化性病変のマクロファージ由来泡沫細胞で高度に発現されたことであった。その後、ＰＰＡＲγがヒトおよびマウスの単球／マクロファージで発現されることが証明された。機能的に、ＰＰＡＲγは、単球の分化および活性化で、また炎症性作用の調節において役割を果たすことが示された。
【００２４】
多くの研究は、ＰＰＡＲγリガンドがマクロファージ炎症性応答を阻害することを証明している。ＰＰＡＲγ活性化の抗炎症効果は、ヒトおよびマウスの単球／マクロファージおよび単球／マクロファージ系で証明された。マクロファージの活性化は、通常いくつかの異なる炎症誘発性メディエーターの分泌をもたらす。１５ｄ−ＰＧＪ2またはチアゾリジンジオンによる治療は、これらのメディエーター（ゲラチナーゼＢ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを含む）の多くの分泌を阻止し、また誘導可能なＮＯＳ（ｉＮＯＳ）の誘導性発現およびスカベンジャー受容体Ａ遺伝子の転写を減少させることが見出された。
【００２５】
ＰＰＡＲγの関連性は、いくつかのヒト自己免疫疾患および自己免疫疾患の動物モデルで研究された。Ｋａｗａｈｉｔｏらは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者で滑膜組織がＰＰＡＲγを発現することを証明した。ＰＰＡＲγはマクロファージで高度に発現されることが発見され、中程度の発現が滑膜内層（synovial-lining）れた。１５ｄ−ＰＧＪ2およびトログリタゾンによるＰＰＡＲγの活性化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＡ滑膜細胞アポトーシスを誘導した。
【００２６】
ＰＰＡＲγは新たに単離されたＴ細胞で機能的に関連しているか、活性化の初期に機能的に関連するようになることが示唆されている。これらの研究で、ＰＰＡＲγの２つのリガンドがＴ細胞クローンによるＩＬ−２分泌の阻止を媒介し、そのようなクローンのＩＬ−２誘導性増殖を阻止しないことが証明された。
【００２７】
いくつかの研究は、自己免疫疾患の動物モデルを修飾する際のＰＰＡＲγリガンドの役割を調査した。Ｓｕらは、炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて、チアゾリジンジオンは結腸炎症を著しく減少させたことを示した。この効果は、ＰＰＡＲγを高度に発現して炎症性サイトカインを生産することができる結腸上皮細胞に及ぼす直接的効果の結果であるかもしれないと、提唱された。Ｋａｗａｈｉｔｏらは、ＰＰＡＲリガンド、１５ｄ−ＰＧＪ2およびトログリタゾンの腹腔内投与はアジュバント誘導性の関節炎を寛解させることを示した。Ｎｉｎｏらは実験的アレルギー性脳脊髄炎に及ぼすチアゾリジンジオンの効果を調べ、この療法が多発性硬化症のこのマウスモデルで炎症を弱め、臨床症状を減少させることを発見した。最後に、Ｒｅｉｌｌｙらは、腎臓糸球体メサンギウム細胞がループス腎炎の炎症性応答の重要なモジュレーターであり、活性化されるとＮＯおよびシクロオキシゲナーゼ生成物を含む炎症伝達物質を分泌することにより局所炎症性応答を永続させることを証明した。上記研究から、炎症性または自己免疫性病因を有する疾患におけるＰＰＡＲの関連性およびＰＰＡＲアゴニストによる治療の有用性は、おそらく研究の焦点であり続けるであろう。
【００２８】
近年では、ＰＰＡＲγに対する１５ｄ−ＰＧＪ2の特異性の問題は、少なくとも部分的に解明された。ＮＦ−κＢは、炎症および免疫に関係する遺伝子の重要な活性化物質である。この活性化では、ＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫ）はＮＦ−κＢ阻害剤（ＩκＢタンパク質）をリン酸化し、ユビキチンとのコンジュゲーションおよびその後のプロテオソームによる分解へと導く。これは次に、遊離ＮＦ−κＢ二量体が核に移行して標的遺伝子を誘導することを可能にする。Ｒｏｓｓｉらは、１５ｄ−ＰＧＪ2を含むシクロペンテノンＰＧがＩＫＫのＩＫＫ２サブユニットを直接阻害して修飾することを証明した。これは、次に、抑制性ＩκＢタンパク質のリン酸化を防止するこれらのタンパク質をユビキチンコンジュゲーションおよび分解の標的にする。これは次にＮＦ−κＢの活性化を防止する。同様に、ＣａｓｔｒｉｌｌｏらはＬＰＳおよびＩＦＮ−αで処理したＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞において、１５ｄ−ＰＧＪ2とのインキュベーションがＩＫＫ２活性のかなりの阻害および抑制性ＩκＢタンパク質の分解の阻害をもたらすことを示した。これは、次に、ＮＦ−κＢ活性の部分阻害、および２型ＮＯＳおよびシクロオキシゲナーゼ２などのＮＦ−κＢ活性化を必要とする遺伝子の損なわれたた発現を引き起こした。
【００２９】
したがって、ＰＰＡＲγおよびＮＦ−κＢは自己免疫疾患に関係する重要なメディエーターであり、医薬産業がこれらのメディエーターに影響を及ぼす新規な選択的薬剤および薬を探索する刺激をもたらすと結論することができる。
【００３０】
一方、アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳内のβアミロイド原線維の細胞外沈着およびアミロイドプラークと関連しているミクログリア細胞の活性化を特徴とする。活性化されたミクログリアは、その後広範な炎症性生成物を分泌する。Ｋｉｔａｍｕｒａらは特異抗体を使って正常およびＡＤの脳内のＰＰＡＲγおよびＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２の発生を評価し、ＡＤ脳でのこれらの分子の発現増加を発見した。非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、ＡＤの発生率およびリスクを低下させ、疾患の進行を遅延させる効果を有することが示された。Ｃｏｍｂｓらは、その全てはＰＰＡＲγアゴニストであるＮＳＡＩＤ、チアゾリジンジオンおよびＰＧＪ2は、ミクログリアおよび単球によるβ−アミロイド刺激による炎症性生成物の分泌を阻害することを証明した。ＰＰＡＲγアゴニストは、β−アミロイド刺激によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの遺伝子の発現およびＣＯＸ−２の発現を阻害することが示された。Ｈｅｎｅｋａらは、ラット小脳へのＬＰＳおよびＩＦＮ−αのマイクロインジェクションは、小脳顆粒細胞でのｉＮＯＳ発現およびその後の細胞死を誘導することを証明した。ＰＰＡＲγアゴニスト（トログリタゾンおよび１５ｄ−ＰＧＪ2を含む）の同時注入はｉＮＯＳの発現および細胞死を減少させたが、選択的なＣＯＸ阻害剤の同時注入は効果がなかった。全体として、ＡＤの研究はＰＰＡＲγアゴニストが脳内の炎症性応答をモジュレートすることができること、およびＮＳＡＩＤはＰＰＡＲγに対するそれらの効果の結果としてＡＤで役に立ちうることを示唆しているようである。
【００３１】
これまで本明細書で開示したことから、以下の結論が得られる。
現在まで、薬草から単離されたＰＰＡＲγアゴニスト化合物の前例がない。今日、自己免疫疾患の治療のためのこれらの特性を有する薬剤、組成物又は薬は存在しない。
【００３２】
一方、この新規な組成物は、自己免疫疾患および神経変性疾患で増加する炎症誘発性サイトカインの生産を減らすことができる。
さらに、本発明の組成物は低毒性であり、いかなる有害な副作用も示さない。
【００３３】
現在の科学の「技術の現状」を考慮すると、前記組成物の使用は当業者が推測できるものではなく、前記組成物は前記特性を有して上述の疾患を対象にし、これらの疾患のために現在使用されている他の物質で起こるような悪影響を引き起こすことなく免疫寛容を維持する。
【００３４】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（Ｎｅｅｓ）はアジア、インド、マレーシア、中国、韓国およびその他で自生するキツネノマゴ科に属する薬草である。これらの国では、異なる疾患、例えば風邪、肝臓状態、糖尿病、その他における生植物および乾燥植物またはその成分の有益効果のために、この薬草は広く使用されてきた。
【００３５】
発明の詳しい説明
本出願では、本明細書で開示されている手法を適用することによってＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａから抽出されたアンドログラホリド混合物を用いてＰＰＡＲ−γアゴニスト効果を誘導し、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を阻害する新規な組成物が記載されている。
【００３６】
アンドログラホリド組成物の説明
本出願で請求されている組成物は、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物の抽出から得られ、以下の一般式を有するジテルペン系ラブダン類の混合物を含む：
Ｃ20Ｈ30Ｏ5 アンドログラホリド（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）
Ｃ20Ｈ30Ｏ4 １４−デオキシアンドログラホリド（１４−Ｄｅｏｘｙａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）
Ｃ26Ｈ41Ｏ8 ネオアンドログラホリド（Ｎｅｏａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）
これらアンドログラホリド化合物の化学構造および特徴を以下に示す。
・アンドログラホリド
ｉ．一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ5
ｉｉ．分子量：３５０．４６
ｉｉｉ．分子名：３−［２−［デカヒドロ−６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−５，ｈａ−ジメチル−２−メチレン−１−ナフタレニル］エチリデン］ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２（３ｈ）−フラノン。
【００３７】
ｉｖ．分子構造：
【００３８】
【化１】
【００３９】
・１４−デオキシアンドログラホリド
ｉ．一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ4
ｉｉ．分子量：３３６．４６
ｉｉｉ．分子構造：
【００４０】
【化２】
【００４１】
・ネオアンドログラホリド
ｉ．一般式：Ｃ20Ｈ41Ｏ8
ｉｉ．分子量：３２６．４６
ｉｉｉ．分子構造：
【００４２】
【化３】
【００４３】
本組成物の代表的抽出物は、次のアンドログラホリド類：アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドの混合物で構成される。前記個々の成分は、乾燥抽出物中、アンドログラホリドが約２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドが約３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドが約０．２〜０．８ｗ／ｗ％含まれる。好ましくは、これらの化合物は、最終的な抽出物中にアンドログラホリドが約２５から３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドが約４．５から５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドが約０．４から０．８ｗ／ｗ％含まれる。
【００４４】
より好ましい態様では、本発明の新規な抽出物は以下を含む：
アンドログラホリド ２４．６％
１４−デオキシアンドログラホリド ４．８％
ネオアンドログラホリド ０．６％
前記製剤は、薬学的に許容される担体と共に投与され得る、即ち錠剤の形態で投与され得る、アンドログラホリド混合物の約１〜６．５ｍｇ／ｋｇ体重／日を含む用量で投与されうる医薬品を製造することが許容される。
【００４５】
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【００４６】
本明細書で開示されている実施例によると、他の製剤および投与の態様に影響することなく、本明細書で開示されている態様は、既に言及されている自己免疫疾患の治療のために、加えてアルツハイマー病の治療のために効率的にかつ効果的に寄与する。
【００４７】
したがって、本組成物およびその医薬製剤は、特に錠剤の形態で上記の用量で投与される場合に、炎症性障害特に糖尿病、炎症性腸疾患、自己免疫疾患（紅斑性狼瘡、多発性硬化症および慢性関節リウマチ）などの様々な自己免疫疾患を治療するための薬剤を提供する。
【００４８】
その作用機構のために、本明細書で開示されている化合物および医薬組成物は、ＡＩＤＳおよび組織及び臓器の拒絶反応を治療するためにも有用でありうる。
本発明の組成で、特に開示されている処方により製造することができる医薬組成物は、適切な経腸、非経口、皮膚、目、鼻、耳、直腸、膣、尿道、舌下、咽頭−気管−気管支の医薬形態に対応することができる。
【００４９】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ原材料の取得法および分析法
有効成分：Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ Ｎｅｅｓ（Ｂｕｒｍ．ｆ．）
科：キツネノマゴ科
使用する部分：地上部（ｈｅｒｂａ）
発明者の管理下で有機栽培された緑葉、茎および地上部を、種を含めて天日乾燥する。全ての異物を手で除去し、原材料は１〜１．５ｃｍの断片に切断して、換気のよい場所で保存する。同一性を調査するために慣用の分析を実行する。肉眼および顕微鏡による分析、官能性パラメータおよびＴＬＣ分析（薄層クロマトグラフィー）を、ヨーロッパ薬局方に従い実施する。
【００５０】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物の取得方法
Ａ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出は、パート１の極性溶媒を使用した粉砕乾燥植物（地上部）の連続パーコレーションによって実施される。
【００５１】
適切に分析された薬剤材料を、ナイフハンマーミル（０．８ｃｍ2）で適切な粒径に粉砕する。粉砕された材料はステンレス鋼パーコレーターに入れ、抽出溶液を５０℃の温度で加える。パーコレーション時間は、２サイクルの抽出で約６日（６×２４時間）である。パーコレーションが終了するまで、パーコレートをステンレス鋼タンクで収集する。パーコレートは、溶媒および大部分の水を除去するために、蒸発ユニットへ直接移す。蒸発は、１４０〜１５８°Ｆ（６０〜７０℃）および０．６５〜０．８５ｂａｒ（６５ｋＰａ〜８５ｋＰａ）の真空で、ＬＵＷＡ薄膜エバポレーター内で実施する。蒸発工程は３〜４サイクルで実施され、その間、抽出物は１日につき３０分間に４回、混合され続ける。ｓｐｉｓｓｕｍ抽出物の水分含量が正常なとき、以下の分析をする：灰分、ＨＣｌ−灰、乾燥減量、ｐＨ、ＴＬＣ同定およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドの分析。その後、ｓｐｉｓｓｕｍ抽出物を乾燥ユニットへ移す。乾燥の前に、最終乾燥抽出物を以降の分析のためにファイバードラム内のプラスチック袋に詰める。
【００５２】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ３０％抽出物の調製法
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの切断および篩い分けされた葉／茎を、発明者の直接監督下で農場から収集する。地上部は前述のとおり同定のために分析し、次に抽出のために採取する。
【００５３】
地上部は、真空下のステンレス鋼抽出装置内でｎ−ヘキサンまたはクロロホルムなどの低極性溶媒（Ａ）で抽出する。連続抽出の後に溶媒を除去し、絞り滓はＰｅｔエーテル４０：６０または酢酸エチルなどの第２のより高い極性を有するの溶媒（Ｂ）で処理し、１回抽出の後溶媒を除去して、絞り滓はエタノールまたは水などのより大きな極性の溶媒（Ｃ）で処理する。
【００５４】
第３の溶媒を回収して蒸発させると水分が３０〜４０％の塊が残り、その絞り滓は前に記載した低極性の溶媒で処理し、塊は次に濾過して水分が５％未満になるまで真空下で乾燥する。その粒状体をアンドログラホリド類として計算されるラブダンジテルペン類を３０％以上有する微粉に粉砕する。
【００５５】
抽出の詳細：
ステップ１：Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの細かく切断された葉茎を重量比で３〜５倍の溶媒ＡとともにＳ Ｓ反応器に詰める。
【００５６】
ステップ２：その草は４〜６時間繰り返し抽出して、溶媒を除去する。
ステップ３：次に絞り滓は、溶媒Ａより高い極性を有する溶媒Ｂで処理して、３〜５時間で一度抽出する。
【００５７】
ステップ４：溶媒Ｂを除去し、次に絞り滓を溶媒ＡまたはＢより高い極性を有する溶媒Ｃで抽出する。
ステップ５：溶媒Ｃが３〜５時間絞り滓内に循環されて真空下でＳ Ｓ蒸発装置に取り出され、絞り滓は溶媒Ｃで再び抽出し、この過程を３〜４回繰り返す。
【００５８】
ステップ６：溶媒Ｃを全ての洗液から回収して、生じる塊は一緒にプールする
ステップ７：ステップ４〜７から得られる塊は、次に溶媒ＡまたはＢで処理し、残留物は６０℃以下の真空下で乾燥させる
ステップ８：ステップ７から得られる乾燥塊は、１００〜２００ＡＳＴＭのステンレス鋼メッシュを有するＧＭＰグラインダーを使って粉末にする。
【００５９】
ステップ９：ステップ８から得られる粉体を自動篩い機で篩いにかけ、直ちに密封できる殺菌ＰＰバッグに直接詰める。
上述したように得た粉体を本明細書で記載のプロトコルに従って分析すると、最終抽出物中にアンドログラホリドは２５から３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドは約４．５から５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドは約０．４から０．８ｗ／ｗ％含まれる。
【００６０】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの同一性−ＴＬＣ
試液：１ｇの薬草抽出物に２０ｍｌのメタノールを加えて約１時間振とうさせ、メタノールはフィルターを通してデカントする。残留物を２０ｍｌのメタノールで振とうし、濾過してから最初の抽出物と混合する（４０ｍｌの試液となる）。
【００６１】
標準液：１．アンドログラホリド（Ａ）、１４−デオキシアンドログラホリド（ＤＡ）およびネオアンドログラホリド（ＮＡ）のメタノール溶液。２．試験抽出物と同様に処理された標準抽出物。２０〜３０μｌの試液をＴＬＣプレート（コーティング物質としてシリカゲルＧＦ２５４）に付し、７７容量部の酢酸エチル、１５容量部のメタノールおよび８容量部の水（７７：１５：８）の混合液を使って１５ｃｍ展開する。その後、プレートを風乾させてＵＶ（２５４ｎＭ）下で検査する。クロマトグラムの少数の黒点は、Ｒｆ：０．６５〜０７がアンドログラホリドに、Ｒｆ：０．７５〜０．８が１４−デオキシアンドログラホリドに、およびＲｆ：０．６０〜０．６５がネオアンドログラホリドに対応する。
【００６２】
ジテルペンラブダン類の定量化のためのＨＰＬＣ法
それら３化合物をアセトン（４：１）で抽出して、次に逆相ＲＰ−Ｃ１８ ｌｉｃｒｏｓｐｈｅｒカラム（４×１２５ｍｍ）を使用してＨＰＬＣによって分析する。移動相は２６％アセトニトリルおよび０．５％リン酸からなり１．１ｍｌ／分の速度であり、Ｂｕｒｇｏｓら、１９９９、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔ．（ＩＳＨＳ）５０１：８３〜８６頁に従って２２８ｎｍで検出される。
【００６３】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物は最低３０％の総アンドログラホリド類に標準化されるが、これは、アンドログラホリドを約２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを０．２〜０．８ｗ／ｗ％含む。
【００６４】
本発明による組成物はこれまで現在の科学における「技術の現状」では開示されておらず、自己免疫疾患およびＡＤに関して記載されている方法論上の問題を解決するためのその利用に関しては前例がない。
【００６５】
本発明の医薬組成物は経口的にまたは非経口的に投与することができ、非経口投与としては静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射および関節内注射がある。
本発明の医薬組成物の正しい投薬量は、特定の製剤、投与様式、患者の年齢、体重および性別、食事、患者の疾患状態、補完的薬剤ならびに有害反応によって変動する。通常の熟練医師ならば、この医薬組成物の正しい投薬量を容易に決定して処方することができるものと理解される。好ましくは、この医薬組成物の日用量は、体重１ｋｇにつきアンドログラホリド混合物が１から６．５ｍｇの範囲である。
【００６６】
当業者に公知の慣用技術によると、本発明の医薬組成物は先に述べたような薬学的に許容される担体および／またはビヒクルと共に、例えば単位用量剤形として製剤化することができる。製剤のそれには非限定的な例としては、無菌液、溶液、懸濁液またはエマルション、抽出物、エリキシル、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル、塗り薬、ローションおよび軟膏があるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明は、アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドのラブダン化合物を、そのような組成物を調製する際に通常使用される薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物も包含する。
【００６８】
本発明の医薬組成物において、薬学的に許容される担体は医薬製剤のために記載されている慣用的ないかなるものでもよく、例えばラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸、マグネシウムおよび鉱油などがあるが、それには限定されない。さらに、本発明の医薬組成物は、湿潤剤、甘味剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、着香剤、香料、滑沢剤またはこれらの物質の混合物のいずれも含有することができる。
【００６９】
典型的には、本医薬組成物は混合物のアンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドのラブダン類を２０〜４０％、好ましくは２５〜３５％、最も好ましくは３０ｗ／ｗ％、ならびに薬学的に許容される担体を含有する。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、それを必要とする哺乳類に対して単回で、または分割して経口ルートで投与することができる。したがって、経口投与の場合、化合物を適切な固体担体と組み合わせてカプセル、錠剤、散剤を形成することができる。さらに、本医薬組成物は、着香剤、甘味料、賦形剤等のような他の成分を含有することができる。
【００７１】
さらに、本発明はアンドログラホリド混合物を含む組成物で患者を治療するための、それを必要とする患者に対して本発明の組成物を含む溶液の静脈内投与および錠剤の経口投与することを含む方法を提供する。注射液製剤の好ましい投薬量は、当該組成物が約６０〜２１０ｍｇ／日、最も好ましくは６０〜８０ｍｇ／日であり、１回、２回または３回の注射で投与される。
【００７２】
注射液形態の本製剤は、１ｍｌにつき当該組成物を約８〜１６ｍｇ含む。患者に投与するときは、当該組成物は好ましくは０．９％生理食塩水で約１：５から１：１０の容量比に希釈する。
【００７３】
以下の実施例は例示が目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。分別のある職人ならば思いつくような理にかなった変更は、本発明の範囲から逸脱することなく本明細書に加えることができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、医薬産業で典型的である規模ならびにより小さな手段で調製するのに適切である所望の経口用または非経口用製品を提供する。錠剤の形態のためには、適宜必要に応じて湿式造粒法、乾式造粒法、直接圧縮法、流動床造粒法を含む医薬産業で慣用の技術に従う。
【００７５】
以下の実施例で示されるパーセンテージは全て重量に基づく。
【実施例】
【００７６】
活性剤を含む錠剤を調製するための典型的方法の例は、先ず活性剤をゼラチン、エチルセルロースその他の結合剤と混合することである。その場合、混合は標準的なＶブレンダー内で、通常無水条件下で適切に行われる。次に、調製された直後の混合物は従来の錠剤機で強打し、スラッグを錠剤に成形することができる。調製された直後の錠剤は、シェラック、メチルセルロース、カルナバワックス、スチレン−マレイン酸共重合体などの適切なコーティングで、コーティングされる。
【００７７】
経口投与のために、アンドログラホリド混合物を３０ｍｇから４０ｍｇまで含む圧縮錠剤が、上で開示されかつＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３９章、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９６５年、で示されている当技術分野で公知の製造方法に従って製造される。
【００７８】
本発明製剤の好ましい医薬組成物は、以下の実施例のいくつかで示されている。
実施例１
薬草Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ Ｎｅｅｓから得られた乾燥抽出物に含有されるアンドログラホリド混合物を用いた、本発明の錠剤を調製するための医薬組成物
【００７９】
【表１】
【００８０】
一様に錠剤を製剤化するために、乾燥抽出物（アンドログラホリド混合物）の活性化合物、ジャガイモ澱粉、タルク、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、無水二酸化ケイ素、ポリエチレングリコールおよび炭酸カルシウムを、全ての成分が一様に混合されるまで乾燥条件下で慣用のＶブレンダーで混合する。混合物を次に標準的な軽メッシュスクリーンに通し、無水環境下で乾燥させ、次にステアリン酸マグネシウムとブレンドして錠剤に圧縮成形し、シェラックでコーティングする。１１６から１６２ｍｇを含有する他の錠剤は、同様に調製される。
【００８１】
実施例２
薬草Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ Ｎｅｅｓから得られた乾燥抽出物を用いた、本発明のカプセルを調製するための医薬組成物
【００８２】
【表２】
【００８３】
３０ｍｇから４０ｍｇのアンドログラホリド混合物を含む経口用カプセルの製造は、乾燥抽出物（アンドログラホリド混合物）を担体と混合して、この混合物を通常ゼラチンその他のポリマーシースに封入することから本質的になる。カプセルは食用の適合する担体中の細かく分散した化合物を封入することによって作られる当技術分野で公知のソフト形態のカプセルでよく、または、カプセルはタルク、ステアリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、その他の無毒性固体と混合した新規な組成物から本質的になる硬カプセル剤でもよい。治療使用のために３０ｍｇまたは４０ｍｇを含むカプセルを用いる典型的な使用例が指示されている。
【００８４】
単回投与であれ複数回投与であれ、または日ごとの用量であれ、投与される用量は、化合物の効力が変動するため本発明のどの化合物が使用されるかにより、選択される投与経路により、患者のサイズおよび病状の性質により当然ながら変動する。投与される用量は、１日８０から１６０ｍｇの一般経口投与量に対応し、経口投与量は通常１日１２０ｍｇを３回；通常の静脈内用量は６０から８０ｍｇであり、指示があれば後に７０から１００ｍｇを投与し；通常の筋肉内用量は２４時間ごとの７０から１００ｍｇであり１日に１〜２回注射される。
【００８５】
本発明の乾燥抽出物（アンドログラホリド混合物を含有する）を含む新規の有用な医薬組成物は、皮膚送達系、胃腸薬剤送達用デバイスなどの薬剤送達系からの予想される生理効果のための投与に適応可能であり、この送達用デバイスは天然および合成のポリマー材から製造される。制御された薬剤投与のために化合物を含有する薬剤送達系の製造で許容される材料の代表例としては、ポリ塩化ビニル、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、ポリジメチルシロキサン、アクリルおよびメタクリル酸のエステルの親水性ヒドロゲル、ポリ酢酸ビニル、プロピレン酢酸ビニル共重合体などの材料がある。
【００８６】
実施例３
上記組成物を含有するシェラックで被覆された錠剤は、錠剤の剤形のための混合、顆粒化、および必要に応じて圧縮する工程を含む、医薬産業で慣用される技術に従って調製する。
【００８７】
具体的には、実施例１の組成物を十分な量のＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物と完全に混合する。アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドを含む錠剤の製造のためには、その混合物を実施例１で言及した不活性成分と共に直接的に圧縮し、その後しかるべくシェラックで被覆する。
【００８８】
実施例４
本組成物によって誘導されるＨＬ−６０細胞の分化
化学物質：Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ、ＮＢＴ、レチノイン酸、サイトカラシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）。ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのウシ胎仔血清、全トランスレチノイン酸およびアンドログラホリドは、Ａｌｄｒｉｃｈから入手。他の分離系統は、Ａｍｓａｒ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．、インド、から入手した。ＦＵＲＡ２−ＡＭはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（アメリカ合衆国）から購入した。ニトロブルーテトラゾリウムはＳｉｇｍａから入手。
【００８９】
細胞培養：ＨＬ−６０細胞は、２０％熱不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で、５％のＣＯ2を含有する３７℃の加湿環境で増殖させた。細胞は３×１０5細胞／ｍｌで、週２回播種した。１００ｎＭの全トランスレチノイン酸を単独でまたは組成物（１７．５μｇｍｌ）と組み合わせて加えることによって分化を誘導し、Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色の後の形態変化およびＮＢＴ’（１１）を還元する能力により評価した。未分化型培養物は、３％未満のＮＢＴ陽性細胞を含んでいた。分化した培養物は、レチノイン酸処理の５日後に調査した。
【００９０】
カルシウム測定［Ｃａ２＋］ｃ
ＨＬ−６０顆粒球（２×１０7ｍｌ）にＣａ2+培地＋０．１％ウシ血清アルブミン中で２μＭのｆｕｒａ−２／ＡＭを３７℃で４５分間ロードし、次に１０7細胞／ｍｌに希釈して氷上で保存した。使用直前に、この細胞懸濁液の０．５ｍｌを遠心分離にかけ、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含む示された培地の２．４ｍｌで再懸濁した。Ｆｕｒａ−２蛍光（Ｆ）は、温度自動調節されたキュベット内（３７℃）（ＬＳ５５蛍光計、パーキン−エルマー社）で３４０および３８０ｎｍの励起および５０５ｎｍの発光波長で測定した。
【００９１】
実施例５
本組成物によるＴ細胞内のＩＬ−２およびＩＦＮ−γ生産の阻害
化学物質：ＳｉｇｍａからのコンカナバリンＡおよびＲＰＭＩ１６４０培地
細胞培養：Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒマウスをエーテルによって屠殺し、膝窩の神経節および脾臓を５ｍｌの培地ＲＰＭＩ１６４０を含むペトリプラークに置いた。無菌のＲＰＭＩ１６４０溶液中でこれらの臓器を破壊することによってリンパ球を得、これらのリンパ球は１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、ヌーバウアーチャンバーで定量化した。最後に、リンパ球の懸濁液を１ｍｌのＲＰＭＩにつき４×１０6細胞数の濃度に調節した。得られたならば、リンパ球は組成物の存在下または非存在下で培養した。この目的のために、１ｍｌの細胞および異なる濃度の組成物および１ｍｌのマイトジェンコンカナバリンＡ（ＣＯＮＡ、０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）を含む、２４穴（それぞれ２ｍｌ）のポリスチレンの培養プラークを使用した。
【００９２】
プラークは湿度５％およびＣＯ2の環境で３７℃のオーブンで２４時間インキュベートし、次にそれぞれ２ｍｌの試料を加えて３２００ｒｐｍで１分間遠心分離した。その後、細胞を０．６ｍｌに小分けして冷凍し、サイトカインをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）で検出した。
【００９３】
ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのためのＥＬＩＳＡ
化学物質：ＩＬ−２とＩＦＮγはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手。ＴＭＢはＰｉｅｒｃｅから、Ｈ2Ｏ2およびＨ2ＳＯ4はＭｅｒｃｋから入手。
【００９４】
サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ）の測定のために、抗抗原を捕捉する第１の抗体、ペルオキシダーゼ酵素とコンジュゲートする第２の抗体、および検量線のための標準溶液を使用した。ＥＬＩＳＡ「高結合」９６穴ポリスチレンプレートを使用した。ウェルへの付着を助長するために１ウェルにつき１００μｌの第１の抗体を炭酸緩衝液ｐＨ９．５で希釈し、固体部分への結合を完全にするために４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルの内容物を除去して１ウェルにつき３００μｌのＴｗｅｅｎ２０、０．０５％ｐ／ｖおよびＰＢＳ ｐＨ７．０で３回洗浄した。その後、ウェルを２００μｌの無脂肪ミルク５％およびＰＢＳでブロックし、室温で１時間インキュベートした。完了後、既に説明したようにウェル内容を除去して洗浄した。その後、１ウェルにつき１００μｌの抗原を含む検査試料を２反復で、およびサイトカインに特異的な校正曲線を１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。その後、後者のプロトコルに従ってウェル内容を除去して５回洗浄した。その後、第２のコンジュゲート抗体にペルオキシダーゼ酵素を加え、ＰＢＳおよびＳＢＦ溶液１０％に希釈し、１ウェルにつき１００μｌをプレーティングして室温で１時間放置した。その後、７回洗浄して、１ウェルにつき１００μｌのＴＭＢ溶液およびＨ2Ｏ2に暴露させ、３０分後に暗所で展開し、反応は１ウェルにつき５０μｌの２ＭのＨ2ＳＯ4で停止させた。反応の結果は、４５０ｎｍフィルター（Ｅｌｘ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー、Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してＥＬＩＳＡで測定した。
【００９５】
実施例６
本組成物によるＰＰＡＲ−γ受容体の刺激
化学物質：ジメチルスルホキシドはＭｅｒｃｋから購入した。他の全ての試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。
【００９６】
転写アッセイ：ＨＬ−６０細胞を、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下のヒトＰＰＡＲγ１発現ベクターであるｐＣＭＸ−ｈＰＰＡＲγ１でトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性はＨＬ−６０中のβ−ガラクトシダーゼ標準にノーマライズした。
【００９７】
プラスミド：ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびｍＰＰＡＲγリガンド結合ドメイン（ｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ｍＰＰＡＲγ）を発現しているプラスミドは、ｐＧＢＴｍＰＰＡＲγ１からのＳｃａＩ／ＢａｍＨＩ断片として単離されたマウスＰＰＡＲγ１リガンド結合ドメイン（アミノ酸１６２〜４７５から）をｐＣＭＸＧａｌ４ ＤＢＤへインフレーム挿入することによって構築した。
【００９８】
細胞はＤＭＳＯまたは１７．５μｇ／ｍｌの本発明の組成物で処理し、ルシフェラーゼ活性は化学発光により測定した。
実施例７
本組成物による好中球中のＮＦ−κＢ阻害
化学物質：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＭｅｒｃｋから入手。ウシ胎児血清およびＲＰＭＩ−１６４０培地はＧｉｂｃｏ、米国、から入手。ニトロテトラゾリウムブルーはＳｉｇｍａから、ｐＲＬ−ＴＫ、ｐＧＬ３および二重ルシフェラーゼリポーターアッセイ系はＰｒｏｍｅｇａから。Ｆｕｇｅｎｅ６はＲｏｃｈｅから入手。
【００９９】
細胞培養
急性骨髄性白血病からの細胞骨髄性のＨＬ−６０系を使用した。この細胞は、ジメチルスルホキシド１．３％（ＤＭＳＯ）の存在下で分化することができる（Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｅｉｔら、２０００）。細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％の熱不活化ウシ胎児血清および抗生物質を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％ＣＯ2と共に３７℃に保たれる。細胞は、好中球を１．３％ＤＭＳＯで４日間インキュベートすることによって好中球に分化する。分化細胞は、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）で分析する。
【０１００】
ＨＬ−６０細胞へのＮＦκＢ−ｐＧＬ３ベクターのトランスフェクションおよびルシフェラーゼ測定
他で記載されているように、ＨＬ−６０細胞を培養して４日間で好中球に分化させた。４日後、細胞をｐＧＬ３−ＮＦκＢベクターでトランスフェクションし、トランスフェクションの内部標準としてｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターを使用したが、これはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの中レベルの発現を可能にする単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む発現ベクターである。これらのベクターは、リポソームに基づく系（Ｆｕｇｅｎｅ６、Ｒｏｃｈｅ）によって細胞にトランスフェクションされる。トランスフェクションの後、細胞を２４時間保ち、次に本発明の組成物の存在下または非存在下で異なる時間にＰＡＦまたはｆＭＬＰで刺激する。その後、細胞抽出物は、ルシフェラーゼ活性の測定まで−７０℃に保つ。ルシフェラーゼの活性は、蛍（ｐＧＬ３）およびＲｅｎｉｌｌａ（ｐＲＬ）ルシフェラーゼ酵素の基質を有する市販の系デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、化学発光で測定する。
【０１０１】
ＩκＢａイムノブロット
化学物質：ｆＭＬＰ、ＰＭＳＦおよびＰＡＦは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。トリス、ＮａＣｌ、ＮＰ−４０、デオキシコール酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、イプロテアーゼ（ｉｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤、メルカプトエタノールはＭｅｒｃｋから入手。
【０１０２】
好中球は１０分間プレインキュベートし、その後６０分間ｆＭＬＰ（０．１μＭ）およびＰＡＦ（０．１μＭ）で刺激した。タンパク質の分析のために、細胞は溶解タンポン（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸塩、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ2ＶＯ4、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０μｇ／ｍｌイプロテアーゼ阻害剤）で溶解した。タンパク質はブラッドフォード法で定量し、変性条件のポリアクリルアミドゲル１２％（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）で電気泳動により分解し、ニトロセルロース膜へ電気的に移動させた。膜を抗ＩκＢα抗体と共にインキュベートし、次に第２のペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベートし、最後に化学発光（ＥＣＬ）で視覚化した。ゲル内のタンパク質の量の対照として、抗体をストリッピング溶液（１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２％ ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．７）で処理して抗アクチン抗体とインキュベートした。最後に、各抗体について得られたシグナルの濃度測定分析を実施した。
【０１０３】
実施例８
野生型ラットにおける本組成物によるβ−アミロイド形成の阻害
アミロイド形成
アミロイド形成を検査するために、２つの相補性技術、チオフラビン−Ｔ蛍光法（Ｌｅｖｉｎｅ、１９９３；Ｓｏｔｏら、１９９５；Ｒｅｙｅｓら、１９９７；Ｉｎｅｓｔｒｏｓａら、２０００）およびコンゴーレッド結合法（Ａｌｖａｒｅｚら、１９９８）を使用した。簡単に説明すると、チオフラビン−Ｔアッセイは、アミロイド線維と結合するときのチオフラビンの蛍光発光に基づき、４５０ｎｍで励起されたときの４８２ｎｍの発光の増加を示す。コンゴ−レッドアッセイは、形成されたアミロイドの量を測定する非常に特異的な定量アッセイである。これらの技術は、特定のアミロイド形成を確認するために、現在使用されている。
【０１０４】
実施例９
アンドログラホリド組成物からの化合物の説明
本発明の代表組成物は錠剤形態の医薬製剤であり、それは以下の化合物
アンドログラホリド ２４．６％
１４−デオキシアンドログラホリド ４．８％
ネオアンドログラホリド ０．６％
の混合物をその後の異なる医薬形態の製造のために供給し、以下の用量で適用される：
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【０１０５】
実施例１０
紅斑性狼瘡の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド類の混合物を使用すると、狼瘡による症状の正常化は３ヵ月間の投与を経て起こる。さらに、本組成物は他の伝統的な非ステロイド系抗炎症剤の通常の再構築（rebuilding）効果に干渉しない。
【０１０６】
実施例１１
多発性硬化症の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド混合物を使用すると、当該疾患による症状の正常化は本発明の組成物による３ヵ月間の治療を経て起こる。さらに、本組成物は他の治療法に干渉しない。
【０１０７】
実施例１２
関節症および慢性関節リウマチの治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド混合物を使用すると、変形性関節症による関節硬直の正常化は、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸または他の抗炎症薬の有無にかかわらず、３ヵ月を経て起こる。さらに、本組成物は、伝統的な非ステロイド系抗炎症剤と異なり、これら２つのプロテオグリカン構成要素の通常の関節再構築効果に干渉しない。
【０１０８】
実施例１３
糖尿病の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド混合物を使用すると、糖レベルの正常化は５週を経て起こる。さらに、本組成物は他の糖低下剤の通常の再構築効果に干渉しない。
【０１０９】
実施例１４
ＡＩＤＳの治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されている経口製剤を、ＨＩＶ陽性の患者に投与する。正常なＣＤ４計数値は、３ヵ月以内の治療で回復する。
【０１１０】
実施例１５
アルツハイマー病の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されている経口製剤を、掛かりつけの開業医に診断され、独立した認定神経科医に確認されたアルツハイマー病（ＡＤ）の初期段階を示している患者に投与する。臨床試験の２週間前に、患者はＭｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｕｓ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）、Ｂｏｓｔｏｎ Ｎａｍｉｎｇ Ｔｅｓｔ（ＢＮＴ）およびＴｏｋｅｎ Ｔｅｓｔ（ＴＴ）などの適切な精神神経病学的検査を受ける。
【０１１１】
神経心理学的検査は、臨床試験当日、６週後および３ヵ月後に繰り返し行われる。これらの検査は、患者の治療法を知らない神経心理学者によって実施される。
試験の開始時に、患者は試験製剤またはプラセボに無作為に割付けされる。試験製剤およびプラセボは、１日に１、２回、経口投与される。試験中は、糖尿病、高血圧、その他の病態の治療は許容される。スコアは、各３つの観察期間中に試験製剤とプラセボの間で統計学的に比較される。治療しない場合、ＡＤの自然経過は、臨床試験期間中に検査スコアがかなり悪化する。当該処方で記載されている組成物で治療した患者は、臨床試験期間中、患者のスコアが同じであるか向上した場合に、改善されたとみなされる。
【０１１２】
患者は、試験の始めに無作為に本組成物またはプラセボを投与される。本組成物およびプラセボは、１日２回投与される。試験の間、患者は糖尿病、高血圧、その他の病態の治療が許可される。本組成物およびプラセボの結果は、全ての試験期間について統計学的に比較される。プラセボを使用する患者は、かなりの認知悪化を示す。本組成物で治療する患者は、検査スコアが相当改善される。
【０１１３】
前述の説明から、当業者が本発明の本質的特徴を容易に確かめることはできず、また、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件にそれを適応させるために本発明に様々な変更および／または修正を加えることができることは明らかである。このように、これらの変更および修正は、請求項の均等物の全範囲内に適切に、正当に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ＦＵＲＡ２−ＡＭインディケーターで標識されたＨＬ−６０細胞を用いて３４０／３８０ｎｍの比により測定されたＰＡＦ誘導性カルシウム置換を示している代表的なグラフである。実施例１〜２で記載されているように、細胞はレチノイン酸だけで、または本発明の組成物（３．５μｇ／ｍｌ）の存在下で分化した。
【図２】ＰＰＡＲγのプロモーターを含むベクターでトランスフェクションしたＨＬ−６０細胞内の相対ルシフェラーゼ活性および本発明の組成物の効果を表している棒グラフである。
【図３】本発明の組成物によるコンカナバリンＣＯＮＡで活性化されたＴ細胞内のＩＬ−２およびＩＮＦ−γ濃度の阻害を表している棒グラフである。
【図４】本発明の組成物によるｌκＢα分解の阻害を示す図であり、棒グラフはＮＦκＢプロモーターを含むベクターでトランスフェクションしたＨＬ−６０細胞における相対ルシフェラーゼ活性に対する本発明の組成物の阻害率を表す。
【図５】チオフラビン染色を用いた本発明の組成物によるβアミロイド形成のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を示している顕微鏡写真である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
説明
免疫薬理学および生物薬剤学の主な目的は、免疫疾患の症状を治療しその経過を修飾する新規な治療解決策を継続的に探索することである。
【０００２】
発明の背景
自己免疫疾患は、それ自身の生体に対する免疫系の自発的反応を特徴とする。これらの反応は、液性（自己抗体生産）および細胞性（リンパ球およびマクロファージの細胞毒性活性の増加）の免疫反応を起動させる役割を担うＴリンパ球による自己抗原の認識により生じる。自己免疫疾患には、リウマチ様疾患、乾癬、全身の皮膚筋炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡（lupus erythematous）、または抗原により悪化される免疫応答、即ち喘息、薬剤および食物に対するアレルギー、その他が含まれる。全てのこれらの疾患は制限的、慢性的であり、場合によっては致死性であるが、それらを治療する有効な治療法は現在存在しない。したがって、疾患の経過において寛解または減少をもたらすことができるあらゆる薬剤、医薬または媒体は、患者の健康のための重要な解決策となる。
【０００３】
自己免疫疾患のための治療法の探索は、適切な薬剤および方法を見つける重要な努力をもたらした。
現在、これらの疾患の治療は、主に糖質コルチコイド、カルシニューリン阻害剤および抗増殖剤−代謝拮抗物質などの免疫抑制剤の使用に基づいている。しかし、これらの薬理学的療法は多くの異なる標的に作用するので、それらは免疫機能を全体として低下させるか、または、長期使用では異なる細胞傷害作用という不利を有する可能性があり、したがって、非特異的に免疫系を抑制して患者を感染症および癌のリスクにさらす可能性がある。カルシニューリンおよび糖質コルチコイドは、それらの腎毒性および糖尿病誘発作用のために、いくつかの臨床状態（例えば腎不全、糖尿病）でのそれらの有用性を制限するさらなる不利を示す。
【０００４】
免疫抑制における最新の治療上の進歩は抗ＣＤ３モノクローナル抗体、即ち抗ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体および抗ＴＮＦαモノクローナル抗体である。これらの治療法は著しい免疫抑制作用、アナフィラキシー反応、日和見感染（結核）および新生物を示すにもかかわらず、熱、じんま疹、低血圧症、呼吸困難がこれらの薬と関連し、前記組成物および医薬品の適用において深刻な問題となっている。注射用途の場合、患者３人中１人は痒み、腫脹および疼痛を示しうる。
【０００５】
発明の簡単な要約
本発明で請求する組成物は、自己免疫疾患、アレルギーの特徴である免疫反応を減少させて疾患の症状および経過を緩和し、「免疫寛容」を維持することができる。
【０００６】
言い換えると、本発明で開示される組成物は、それがもたらす免疫寛容によって本質的に特徴づけられ、これは、抗原に対する特異的な反応が欠如した活性状態に対応し、現行の免疫抑制薬剤の副作用を引き起こすことがない。
【０００７】
具体的には、この組成物は、ＰＰＡＲγ受容体を刺激してＮＦκＢ因子を減らすことにより、インターフェロンγ、ＩＬ−２の合成および発現を阻害する。
したがってこのジテルペン性ラブダン類の新規な組成物は、自己免疫疾患の病因に関係するサイトカイン過剰発現を選択的に減少させることを特徴とする。
【０００８】
急性および慢性炎症性疾患および癌に関係するメディエーターの科学的理解における最近の進歩は、有効な治療法の探索における新規な戦略をもたらした。伝統的な手法としては、特異的抗体、受容体アンタゴニストまたは酵素阻害剤の使用など、直接的標的介入があり、これらは全て重大レベルの副作用（例えばアレルギー、胃腸の潰瘍、出血、その他）を伴う。様々なメディエーターの転写および翻訳に関係する調節機構の解明が最近進展したことにより、遺伝子転写レベル（例えば、ＣＯＸ２、ｉＮＯＳ、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ、その他）に向けられた治療手段に対する関心が増加した。
【０００９】
最も重要なメディエーターの１つは、Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーのポリペプチドの様々な組合せから構成される緊密に関連したダイマー転写因子複合体ファミリーに属している、ＮＦκＢである。このファミリーは、哺乳類の５つの個々の遺伝子産物である、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０／ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ４９／ｐ１００）、ｃ−ＲｅｌおよびＲｅｌＢからなり、その全てはヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成することができる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合および二量体化ドメインを含有する相同の高い３００アミノ酸の「Ｒｅｌ相同性ドメイン」を共有する。Ｒｅｌ相同性ドメインの最Ｃ末端には、細胞質から核へのＮＦ−κＢの輸送において重要な核転座配列がある。さらに、ｐ６５およびｃＲｅｌは、それらのＣ末端に強力なトランス活性化ドメインを有する。
【００１０】
ＮＦ−κＢの活性は、阻害剤ＩκＢファミリーのタンパク質のメンバーとの相互作用によって調節される。この相互作用は効果的にＮＦ−κＢタンパク質上の核移行配列を遮断することにより、核への二量体の移動を防止する。多種多様な刺激が、おそらくは複数のシグナル伝達経路を介して、ＮＦ−κＢを活性化する。これには細菌生成物（ＬＰＳ）、一部のウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１）および環境ストレスが含まれる。しかし、表面上全ての刺激に共通するのは、リン酸化および以降のＩκＢの分解である。ＩκＢは、最近特定されたＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β）によって、２つのＮ末端セリン上でリン酸化される。部位特異的突然変異誘発研究によると、一度リン酸化されるとタンパク質はユビキチン−プロテアソーム経路による分解のために目印をつけられることから、これらのリン酸化はＮＦ−κＢの後の活性化のために重要であることが示されている。ＩκＢから遊離すると、活性ＮＦ−κＢ複合体は核に移行して、そこで好ましい遺伝子特異的エンハンサー配列に選択的に結合することができる。ＮＦ−κＢによって調節される遺伝子には、いくつかのサイトカイン、細胞接着分子および急性期タンパク質が含まれる。
【００１１】
ＮＦ−κＢが、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカイン、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭなどの細胞接着分子、ならびに誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を含む多数の炎症誘発性メディエーターの調節された発現で重要な役割を果たすことは、周知である。そのようなメディエーターは炎症部位で白血球を補充する役をつとめることが知られており、ｉＮＯＳの場合は、一部の炎症性疾患および自己免疫疾患では臓器破壊をもたらす可能性がある。
【００１２】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要性は、ＮＦ−κＢが活性化されることが明らかにされている喘息を含む気道炎症の研究においてさらに強調されている。この活性化は、これらの障害の特徴であるサイトカイン生産の増加および白血球浸潤の根底にあるかもしれない。さらに、吸入されたステロイドは喘息の気道で気道過敏症を減少させ、炎症性反応を抑えることが知られている。糖質コルチコイドのＮＦ−κＢ阻害に関する最近の知見を考慮すると、これらの効果はＮＦ−κＢの阻害により媒介されると推測することができる。
【００１３】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割のさらなる証拠は、リウマチの滑膜に関する研究からもたらされる。ＮＦ−κＢは通常不活性の細胞質複合体として存在するが、近年の免疫組織化学的研究は、リウマチ性滑膜を含む細胞ではＮＦ−κＢが核に存在し、したがって活性であることを示している。さらに、ＮＦ−κＢはＴＮＦαによる刺激に応じてヒト滑膜細胞で活性化されることが示された。そのような分布は、この組織の特徴であるサイトカインおよびエイコサノイド産生の増加の根底にあるメカニズムであるかもしれない。Ｒｏｓｈａｋ、Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、３１４９６〜３１５０１（１９９６）を参照。
【００１４】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割のさらなる証拠は、リウマチの滑膜に関する研究からもたらされる。ＮＦ−κＢは通常不活性の細胞質複合体として存在するが、近年の免疫組織化学的研究は、リウマチ性滑膜を含む細胞ではＮＦ−κＢが核に存在し、したがって活性であることを示している。さらに、ＮＦ−κＢはＴＮＦαによる刺激に応じてヒト滑膜細胞で活性化されることが示された。そのような分布は、この組織の特徴であるサイトカインおよびエイコサノイド産生の増加の根底にあるメカニズムであるかもしれない。Ｒｏｓｈａｋ、Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、３１４９６〜３１５０１（１９９６）を参照。
【００１５】
ＮＦ−κＢ／ＲｅｌおよびＩκＢタンパク質も、悪性形質転換で重要な役割を果たしているようである。ファミリーメンバーは、過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子再構成または転座の結果としてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞形質転換と関連している。さらに、これらのタンパク質をエンコードしている遺伝子の再構成および／または増幅が、ある種のヒトリンパ性腫瘍の２０〜２５％で見られる。さらに、アポトーシスの調節におけるＮＦ−κＢの役割が報告され、細胞増殖の制御におけるこの転写因子の役割を強化している。
【００１６】
ＮＦ−κＢの最初の植物由来のモジュレーターは、サリチル酸ナトリウムおよびその半合成誘導体のアスピリンを特定したＫｏｐｐとＧｈｏｓｈ（１９９４）によって、ほぼ１０年前に報告された。この発見の後、異なる化学クラスのいくつかの新規な天然物が、ＮＦ−κＢ阻害活性を示した。
【００１７】
いくつかのＮＦ−κＢ阻害剤が文献：Ｃ．Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５）、１１６３〜１１７４（１９９８）；Ｒ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１、４１３〜４１９（１９９８）；Ｊ．Ｗ．Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２１０９６〜２１１０３（１９９７）に記載されている。海洋性天然物ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）は、ＮＦ−κＢを阻害することが知られている：Ｒｏｓｈａｋ、Ａら、ＪＰＥＴ、２８３、９５５〜９６１（１９９７）。Ｂｒｅｔｏｎ、Ｊ．ＪおよびＣｈａｂｏｔ−Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、Ｍ．Ｃ．、ＪＰＥＴ、２８２、４５９〜４６６（１９９７）。サリチルアニリドは公知の化合物であり、Ｍ．Ｔ．Ｃｌａｒｋ、Ｒ．Ａ．Ｃｏｂｕｒｎ、Ｒ．Ｔ．Ｅｖａｎｓ、Ｒ．Ｊ．Ｇｅｎｃｏ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、２９、２５〜２９によって記載されている。
【００１８】
最近、ＮＦ−κＢ阻害の重要なメカニズムにより、ペルオキシソーム受容体の活性化の可能性が示唆されている。
「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体」（ＰＰＡＲ）［この用語の通常の使用に注目するときには、科学の領域で公知のその略語で表し、当該略語はこの受容体を特定するために使用されるものとする］として知られるペルオキシソームの受容体は、自己免疫疾患および他の疾患、即ち糖尿病、心血管および胃腸の疾患ならびにアルツハイマー病との関係が示唆されている。ＰＰＡＲγアゴニストを含む現在の医薬剤はまだ実験段階であり、その作用機構のために人には深刻な副作用を起こす。したがって、上述の疾患または病態を予防、治療および／または軽減するために、より正確にこれらの受容体をモジュレートすることができるより毒性の低い新規な薬剤を開発する必要がある。
【００１９】
この新規な組成物はこれらの受容体をより正確にモジュレートするので、患者に望ましくない副作用を引き起こすことなく、自己免疫疾患をより有効に予防、治療および／または軽減することを可能にする。
【００２０】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、遺伝子発現を調節するリガンド活性化転写因子である核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＰＰＡＲの様々な亜型が発見されている。これらには、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβまたはＮＵＣ１、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδが含まれる。
【００２１】
ＰＰＡＲγは、当初脂肪細胞分化および脂質代謝の重要な調節因子と特徴づけされた。ＰＰＡＲγの発現は異なる複数のプロモーターによって指示される、３つのＰＰＡＲγアイソフォームが生じる。ＰＰＡＲγは繊維芽細胞、筋細胞、乳房細胞、ラット脾臓の白色および赤色脾髄、ヒト骨髄前駆体ならびにマクロファージ／単球を含む他の細胞型でも見られることが、現在明らかとなっている。さらに、ＰＰＡＲγはアテローム硬化型プラーク内のマクロファージ泡沫細胞で見られた。糖代謝におけるＰＰＡＲγの重要な役割は、あるクラスの抗糖尿病薬であるチアゾリジンジオンが高親和性のＰＰＡＲγリガンドであることが証明されたときに特定された。チアゾリジンジオンは、当初、インスリン抵抗性の齧歯類モデルでグルコースレベル（および循環脂肪酸のレベル）を下げるそれらの能力に基づき、２型糖尿病の治療のために開発された。チアゾリジンジオンはＰＰＡＲγとの直接相互作用を通してそれらの治療効果を媒介するとの知見により、ＰＰＡＲγがグルコースおよび脂質のホメオスタシスの重要な調節因子であると立証された。当初は脂質およびグルコースの代謝の調節因子として記載されたにもかかわらず、近年、ＰＰＡＲγは細胞増殖および悪性腫瘍における役割を有することも立証された。ＰＰＡＲγのリガンドは、細胞増殖および悪性腫瘍に対する正および負の作用を媒介することが示された。
【００２２】
チアゾリジンジオンクラスの抗糖尿病薬に加えて、様々な非ステロイド性抗炎症薬もＰＰＡＲγリガンドとして機能することができるが、後者の親和性は比較的低い。
プロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）脱水物ＰＧＪ2は、最初に発見されたＰＰＡＲγの内因性リガンドであった。別のＰＧＤ2脱水物１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2（１５ｄ−ＰＧＪ2）も直接ＰＰＡＲγと結合する天然物質であり、ＰＰＡＲγ活性化のための強力なリガンドである。
【００２３】
ＰＰＡＲおよびマクロファージを関連づける最も初期の知見の１つは、ＰＰＡＲγがヒトおよびマウスのアテローム硬化性病変のマクロファージ由来泡沫細胞で高度に発現されたことであった。その後、ＰＰＡＲγがヒトおよびマウスの単球／マクロファージで発現されることが証明された。機能的に、ＰＰＡＲγは、単球の分化および活性化で、また炎症性作用の調節において役割を果たすことが示された。
【００２４】
多くの研究は、ＰＰＡＲγリガンドがマクロファージ炎症性応答を阻害することを証明している。ＰＰＡＲγ活性化の抗炎症効果は、ヒトおよびマウスの単球／マクロファージおよび単球／マクロファージ系で証明された。マクロファージの活性化は、通常いくつかの異なる炎症誘発性メディエーターの分泌をもたらす。１５ｄ−ＰＧＪ2またはチアゾリジンジオンによる治療は、これらのメディエーター（ゲラチナーゼＢ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを含む）の多くの分泌を阻止し、また誘導可能なＮＯＳ（ｉＮＯＳ）の誘導性発現およびスカベンジャー受容体Ａ遺伝子の転写を減少させることが見出された。
【００２５】
ＰＰＡＲγの関連性は、いくつかのヒト自己免疫疾患および自己免疫疾患の動物モデルで研究された。Ｋａｗａｈｉｔｏらは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者で滑膜組織がＰＰＡＲγを発現することを証明した。ＰＰＡＲγはマクロファージで高度に発現されることが発見され、中程度の発現が滑膜内層（synovial-lining）れた。１５ｄ−ＰＧＪ2およびトログリタゾンによるＰＰＡＲγの活性化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＡ滑膜細胞アポトーシスを誘導した。
【００２６】
ＰＰＡＲγは新たに単離されたＴ細胞で機能的に関連しているか、活性化の初期に機能的に関連するようになることが示唆されている。これらの研究で、ＰＰＡＲγの２つのリガンドがＴ細胞クローンによるＩＬ−２分泌の阻止を媒介し、そのようなクローンのＩＬ−２誘導性増殖を阻止しないことが証明された。
【００２７】
いくつかの研究は、自己免疫疾患の動物モデルを修飾する際のＰＰＡＲγリガンドの役割を調査した。Ｓｕらは、炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて、チアゾリジンジオンは結腸炎症を著しく減少させたことを示した。この効果は、ＰＰＡＲγを高度に発現して炎症性サイトカインを生産することができる結腸上皮細胞に及ぼす直接的効果の結果であるかもしれないと、提唱された。Ｋａｗａｈｉｔｏらは、ＰＰＡＲリガンド、１５ｄ−ＰＧＪ2およびトログリタゾンの腹腔内投与はアジュバント誘導性の関節炎を寛解させることを示した。Ｎｉｎｏらは実験的アレルギー性脳脊髄炎に及ぼすチアゾリジンジオンの効果を調べ、この療法が多発性硬化症のこのマウスモデルで炎症を弱め、臨床症状を減少させることを発見した。最後に、Ｒｅｉｌｌｙらは、腎臓糸球体メサンギウム細胞がループス腎炎の炎症性応答の重要なモジュレーターであり、活性化されるとＮＯおよびシクロオキシゲナーゼ生成物を含む炎症伝達物質を分泌することにより局所炎症性応答を永続させることを証明した。上記研究から、炎症性または自己免疫性病因を有する疾患におけるＰＰＡＲの関連性およびＰＰＡＲアゴニストによる治療の有用性は、おそらく研究の焦点であり続けるであろう。
【００２８】
近年では、ＰＰＡＲγに対する１５ｄ−ＰＧＪ2の特異性の問題は、少なくとも部分的に解明された。ＮＦ−κＢは、炎症および免疫に関係する遺伝子の重要な活性化物質である。この活性化では、ＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫ）はＮＦ−κＢ阻害剤（ＩκＢタンパク質）をリン酸化し、ユビキチンとのコンジュゲーションおよびその後のプロテオソームによる分解へと導く。これは次に、遊離ＮＦ−κＢ二量体が核に移行して標的遺伝子を誘導することを可能にする。Ｒｏｓｓｉらは、１５ｄ−ＰＧＪ2を含むシクロペンテノンＰＧがＩＫＫのＩＫＫ２サブユニットを直接阻害して修飾することを証明した。これは、次に、抑制性ＩκＢタンパク質のリン酸化を防止するこれらのタンパク質をユビキチンコンジュゲーションおよび分解の標的にする。これは次にＮＦ−κＢの活性化を防止する。同様に、ＣａｓｔｒｉｌｌｏらはＬＰＳおよびＩＦＮ−αで処理したＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞において、１５ｄ−ＰＧＪ2とのインキュベーションがＩＫＫ２活性のかなりの阻害および抑制性ＩκＢタンパク質の分解の阻害をもたらすことを示した。これは、次に、ＮＦ−κＢ活性の部分阻害、および２型ＮＯＳおよびシクロオキシゲナーゼ２などのＮＦ−κＢ活性化を必要とする遺伝子の損なわれたた発現を引き起こした。
【００２９】
したがって、ＰＰＡＲγおよびＮＦ−κＢは自己免疫疾患に関係する重要なメディエーターであり、医薬産業がこれらのメディエーターに影響を及ぼす新規な選択的薬剤および薬を探索する刺激をもたらすと結論することができる。
【００３０】
一方、アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳内のβアミロイド原線維の細胞外沈着およびアミロイドプラークと関連しているミクログリア細胞の活性化を特徴とする。活性化されたミクログリアは、その後広範な炎症性生成物を分泌する。Ｋｉｔａｍｕｒａらは特異抗体を使って正常およびＡＤの脳内のＰＰＡＲγおよびＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２の発生を評価し、ＡＤ脳でのこれらの分子の発現増加を発見した。非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、ＡＤの発生率およびリスクを低下させ、疾患の進行を遅延させる効果を有することが示された。Ｃｏｍｂｓらは、その全てはＰＰＡＲγアゴニストであるＮＳＡＩＤ、チアゾリジンジオンおよびＰＧＪ2は、ミクログリアおよび単球によるβ−アミロイド刺激による炎症性生成物の分泌を阻害することを証明した。ＰＰＡＲγアゴニストは、β−アミロイド刺激によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの遺伝子の発現およびＣＯＸ−２の発現を阻害することが示された。Ｈｅｎｅｋａらは、ラット小脳へのＬＰＳおよびＩＦＮ−αのマイクロインジェクションは、小脳顆粒細胞でのｉＮＯＳ発現およびその後の細胞死を誘導することを証明した。ＰＰＡＲγアゴニスト（トログリタゾンおよび１５ｄ−ＰＧＪ2を含む）の同時注入はｉＮＯＳの発現および細胞死を減少させたが、選択的なＣＯＸ阻害剤の同時注入は効果がなかった。全体として、ＡＤの研究はＰＰＡＲγアゴニストが脳内の炎症性応答をモジュレートすることができること、およびＮＳＡＩＤはＰＰＡＲγに対するそれらの効果の結果としてＡＤで役に立ちうることを示唆しているようである。
【００３１】
これまで本明細書で開示したことから、以下の結論が得られる。
現在まで、薬草から単離されたＰＰＡＲγアゴニスト化合物の前例がない。今日、自己免疫疾患の治療のためのこれらの特性を有する薬剤、組成物又は薬は存在しない。
【００３２】
一方、この新規な組成物は、自己免疫疾患および神経変性疾患で増加する炎症誘発性サイトカインの生産を減らすことができる。
さらに、本発明の組成物は低毒性であり、いかなる有害な副作用も示さない。
【００３３】
現在の科学の「技術の現状」を考慮すると、前記組成物の使用は当業者が推測できるものではなく、前記組成物は前記特性を有して上述の疾患を対象にし、これらの疾患のために現在使用されている他の物質で起こるような悪影響を引き起こすことなく免疫寛容を維持する。
【００３４】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（Ｎｅｅｓ）はアジア、インド、マレーシア、中国、韓国およびその他で自生するキツネノマゴ科に属する薬草である。これらの国では、異なる疾患、例えば風邪、肝臓状態、糖尿病、その他における生植物および乾燥植物またはその成分の有益効果のために、この薬草は広く使用されてきた。
【００３５】
発明の詳しい説明
本出願では、本明細書で開示されている手法を適用することによってＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａから抽出されたアンドログラホリド混合物を用いてＰＰＡＲ−γアゴニスト効果を誘導し、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を阻害する新規な組成物が記載されている。
【００３６】
アンドログラホリド組成物の説明
本出願で請求されている組成物は、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物の抽出から得られ、以下の一般式を有するジテルペン系ラブダン類の混合物を含む：
Ｃ20Ｈ30Ｏ5 アンドログラホリド（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）
Ｃ20Ｈ30Ｏ4 １４−デオキシアンドログラホリド（１４−Ｄｅｏｘｙａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）
Ｃ26Ｈ41Ｏ8 ネオアンドログラホリド（Ｎｅｏａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）
これらアンドログラホリド化合物の化学構造および特徴を以下に示す。
・アンドログラホリド
ｉ．一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ5
ｉｉ．分子量：３５０．４６
ｉｉｉ．分子名：３−［２−［デカヒドロ−６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−５，ｈａ−ジメチル−２−メチレン−１−ナフタレニル］エチリデン］ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２（３ｈ）−フラノン。
【００３７】
ｉｖ．分子構造：
【００３８】
【化１】
【００３９】
・１４−デオキシアンドログラホリド
ｉ．一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ4
ｉｉ．分子量：３３６．４６
ｉｉｉ．分子構造：
【００４０】
【化２】
【００４１】
・ネオアンドログラホリド
ｉ．一般式：Ｃ20Ｈ41Ｏ8
ｉｉ．分子量：３２６．４６
ｉｉｉ．分子構造：
【００４２】
【化３】
【００４３】
本組成物の代表的抽出物は、次のアンドログラホリド類：アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドの混合物で構成される。前記個々の成分は、乾燥抽出物中、アンドログラホリドが約２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドが約３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドが約０．２〜０．８ｗ／ｗ％含まれる。好ましくは、これらの化合物は、最終的な抽出物中にアンドログラホリドが約２５から３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドが約４．５から５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドが約０．４から０．８ｗ／ｗ％含まれる。
【００４４】
より好ましい態様では、本発明の新規な抽出物は以下を含む：
アンドログラホリド ２４．６％
１４−デオキシアンドログラホリド ４．８％
ネオアンドログラホリド ０．６％
前記製剤は、薬学的に許容される担体と共に投与され得る、即ち錠剤の形態で投与され得る、アンドログラホリド混合物の約１〜６．５ｍｇ／ｋｇ体重／日を含む用量で投与されうる医薬品を製造することが許容される。
【００４５】
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【００４６】
本明細書で開示されている実施例によると、他の製剤および投与の態様に影響することなく、本明細書で開示されている態様は、既に言及されている自己免疫疾患の治療のために、加えてアルツハイマー病の治療のために効率的にかつ効果的に寄与する。
【００４７】
したがって、本組成物およびその医薬製剤は、特に錠剤の形態で上記の用量で投与される場合に、炎症性障害特に糖尿病、炎症性腸疾患、自己免疫疾患（紅斑性狼瘡、多発性硬化症および慢性関節リウマチ）などの様々な自己免疫疾患を治療するための薬剤を提供する。
【００４８】
その作用機構のために、本明細書で開示されている化合物および医薬組成物は、ＡＩＤＳおよび組織及び臓器の拒絶反応を治療するためにも有用でありうる。
本発明の組成で、特に開示されている処方により製造することができる医薬組成物は、適切な経腸、非経口、皮膚、目、鼻、耳、直腸、膣、尿道、舌下、咽頭−気管−気管支の医薬形態に対応することができる。
【００４９】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ原材料の取得法および分析法
有効成分：Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ Ｎｅｅｓ（Ｂｕｒｍ．ｆ．）
科：キツネノマゴ科
使用する部分：地上部（ｈｅｒｂａ）
発明者の管理下で有機栽培された緑葉、茎および地上部を、種を含めて天日乾燥する。全ての異物を手で除去し、原材料は１〜１．５ｃｍの断片に切断して、換気のよい場所で保存する。同一性を調査するために慣用の分析を実行する。肉眼および顕微鏡による分析、官能性パラメータおよびＴＬＣ分析（薄層クロマトグラフィー）を、ヨーロッパ薬局方に従い実施する。
【００５０】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物の取得方法
Ａ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出は、パート１の極性溶媒を使用した粉砕乾燥植物（地上部）の連続パーコレーションによって実施される。
【００５１】
適切に分析された薬剤材料を、ナイフハンマーミル（０．８ｃｍ2）で適切な粒径に粉砕する。粉砕された材料はステンレス鋼パーコレーターに入れ、抽出溶液を５０℃の温度で加える。パーコレーション時間は、２サイクルの抽出で約６日（６×２４時間）である。パーコレーションが終了するまで、パーコレートをステンレス鋼タンクで収集する。パーコレートは、溶媒および大部分の水を除去するために、蒸発ユニットへ直接移す。蒸発は、１４０〜１５８°Ｆ（６０〜７０℃）および０．６５〜０．８５ｂａｒ（６５ｋＰａ〜８５ｋＰａ）の真空で、ＬＵＷＡ薄膜エバポレーター内で実施する。蒸発工程は３〜４サイクルで実施され、その間、抽出物は１日につき３０分間に４回、混合され続ける。ｓｐｉｓｓｕｍ抽出物の水分含量が正常なとき、以下の分析をする：灰分、ＨＣｌ−灰、乾燥減量、ｐＨ、ＴＬＣ同定およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドの分析。その後、ｓｐｉｓｓｕｍ抽出物を乾燥ユニットへ移す。乾燥の前に、最終乾燥抽出物を以降の分析のためにファイバードラム内のプラスチック袋に詰める。
【００５２】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ３０％抽出物の調製法
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの切断および篩い分けされた葉／茎を、発明者の直接監督下で農場から収集する。地上部は前述のとおり同定のために分析し、次に抽出のために採取する。
【００５３】
地上部は、真空下のステンレス鋼抽出装置内でｎ−ヘキサンまたはクロロホルムなどの低極性溶媒（Ａ）で抽出する。連続抽出の後に溶媒を除去し、絞り滓はＰｅｔエーテル４０：６０または酢酸エチルなどの第２のより高い極性を有するの溶媒（Ｂ）で処理し、１回抽出の後溶媒を除去して、絞り滓はエタノールまたは水などのより大きな極性の溶媒（Ｃ）で処理する。
【００５４】
第３の溶媒を回収して蒸発させると水分が３０〜４０％の塊が残り、その絞り滓は前に記載した低極性の溶媒で処理し、塊は次に濾過して水分が５％未満になるまで真空下で乾燥する。その粒状体をアンドログラホリド類として計算されるラブダンジテルペン類を３０％以上有する微粉に粉砕する。
【００５５】
抽出の詳細：
ステップ１：Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの細かく切断された葉茎を重量比で３〜５倍の溶媒ＡとともにＳ Ｓ反応器に詰める。
【００５６】
ステップ２：その草は４〜６時間繰り返し抽出して、溶媒を除去する。
ステップ３：次に絞り滓は、溶媒Ａより高い極性を有する溶媒Ｂで処理して、３〜５時間で一度抽出する。
【００５７】
ステップ４：溶媒Ｂを除去し、次に絞り滓を溶媒ＡまたはＢより高い極性を有する溶媒Ｃで抽出する。
ステップ５：溶媒Ｃが３〜５時間絞り滓内に循環されて真空下でＳ Ｓ蒸発装置に取り出され、絞り滓は溶媒Ｃで再び抽出し、この過程を３〜４回繰り返す。
【００５８】
ステップ６：溶媒Ｃを全ての洗液から回収して、生じる塊は一緒にプールする
ステップ７：ステップ４〜７から得られる塊は、次に溶媒ＡまたはＢで処理し、残留物は６０℃以下の真空下で乾燥させる
ステップ８：ステップ７から得られる乾燥塊は、１００〜２００ＡＳＴＭのステンレス鋼メッシュを有するＧＭＰグラインダーを使って粉末にする。
【００５９】
ステップ９：ステップ８から得られる粉体を自動篩い機で篩いにかけ、直ちに密封できる殺菌ＰＰバッグに直接詰める。
上述したように得た粉体を本明細書で記載のプロトコルに従って分析すると、最終抽出物中にアンドログラホリドは２５から３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドは約４．５から５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドは約０．４から０．８ｗ／ｗ％含まれる。
【００６０】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの同一性−ＴＬＣ
試液：１ｇの薬草抽出物に２０ｍｌのメタノールを加えて約１時間振とうさせ、メタノールはフィルターを通してデカントする。残留物を２０ｍｌのメタノールで振とうし、濾過してから最初の抽出物と混合する（４０ｍｌの試液となる）。
【００６１】
標準液：１．アンドログラホリド（Ａ）、１４−デオキシアンドログラホリド（ＤＡ）およびネオアンドログラホリド（ＮＡ）のメタノール溶液。２．試験抽出物と同様に処理された標準抽出物。２０〜３０μｌの試液をＴＬＣプレート（コーティング物質としてシリカゲルＧＦ２５４）に付し、７７容量部の酢酸エチル、１５容量部のメタノールおよび８容量部の水（７７：１５：８）の混合液を使って１５ｃｍ展開する。その後、プレートを風乾させてＵＶ（２５４ｎＭ）下で検査する。クロマトグラムの少数の黒点は、Ｒｆ：０．６５〜０７がアンドログラホリドに、Ｒｆ：０．７５〜０．８が１４−デオキシアンドログラホリドに、およびＲｆ：０．６０〜０．６５がネオアンドログラホリドに対応する。
【００６２】
ジテルペンラブダン類の定量化のためのＨＰＬＣ法
それら３化合物をアセトン（４：１）で抽出して、次に逆相ＲＰ−Ｃ１８ ｌｉｃｒｏｓｐｈｅｒカラム（４×１２５ｍｍ）を使用してＨＰＬＣによって分析する。移動相は２６％アセトニトリルおよび０．５％リン酸からなり１．１ｍｌ／分の速度であり、Ｂｕｒｇｏｓら、１９９９、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔ．（ＩＳＨＳ）５０１：８３〜８６頁に従って２２８ｎｍで検出される。
【００６３】
Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物は最低３０％の総アンドログラホリド類に標準化されるが、これは、アンドログラホリドを約２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを０．２〜０．８ｗ／ｗ％含む。
【００６４】
本発明による組成物はこれまで現在の科学における「技術の現状」では開示されておらず、自己免疫疾患およびＡＤに関して記載されている方法論上の問題を解決するためのその利用に関しては前例がない。
【００６５】
本発明の医薬組成物は経口的にまたは非経口的に投与することができ、非経口投与としては静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射および関節内注射がある。
本発明の医薬組成物の正しい投薬量は、特定の製剤、投与様式、患者の年齢、体重および性別、食事、患者の疾患状態、補完的薬剤ならびに有害反応によって変動する。通常の熟練医師ならば、この医薬組成物の正しい投薬量を容易に決定して処方することができるものと理解される。好ましくは、この医薬組成物の日用量は、体重１ｋｇにつきアンドログラホリド混合物が１から６．５ｍｇの範囲である。
【００６６】
当業者に公知の慣用技術によると、本発明の医薬組成物は先に述べたような薬学的に許容される担体および／またはビヒクルと共に、例えば単位用量剤形として製剤化することができる。製剤のそれには非限定的な例としては、無菌液、溶液、懸濁液またはエマルション、抽出物、エリキシル、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル、塗り薬、ローションおよび軟膏があるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明は、アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドのラブダン化合物を、そのような組成物を調製する際に通常使用される薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物も包含する。
【００６８】
本発明の医薬組成物において、薬学的に許容される担体は医薬製剤のために記載されている慣用的ないかなるものでもよく、例えばラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸、マグネシウムおよび鉱油などがあるが、それには限定されない。さらに、本発明の医薬組成物は、湿潤剤、甘味剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、着香剤、香料、滑沢剤またはこれらの物質の混合物のいずれも含有することができる。
【００６９】
典型的には、本医薬組成物は混合物のアンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドのラブダン類を２０〜４０％、好ましくは２５〜３５％、最も好ましくは３０ｗ／ｗ％、ならびに薬学的に許容される担体を含有する。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、それを必要とする哺乳類に対して単回で、または分割して経口ルートで投与することができる。したがって、経口投与の場合、化合物を適切な固体担体と組み合わせてカプセル、錠剤、散剤を形成することができる。さらに、本医薬組成物は、着香剤、甘味料、賦形剤等のような他の成分を含有することができる。
【００７１】
さらに、本発明はアンドログラホリド混合物を含む組成物で患者を治療するための、それを必要とする患者に対して本発明の組成物を含む溶液の静脈内投与および錠剤の経口投与することを含む方法を提供する。注射液製剤の好ましい投薬量は、当該組成物が約６０〜２１０ｍｇ／日、最も好ましくは６０〜８０ｍｇ／日であり、１回、２回または３回の注射で投与される。
【００７２】
注射液形態の本製剤は、１ｍｌにつき当該組成物を約８〜１６ｍｇ含む。患者に投与するときは、当該組成物は好ましくは０．９％生理食塩水で約１：５から１：１０の容量比に希釈する。
【００７３】
以下の実施例は例示が目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。分別のある職人ならば思いつくような理にかなった変更は、本発明の範囲から逸脱することなく本明細書に加えることができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、医薬産業で典型的である規模ならびにより小さな手段で調製するのに適切である所望の経口用または非経口用製品を提供する。錠剤の形態のためには、適宜必要に応じて湿式造粒法、乾式造粒法、直接圧縮法、流動床造粒法を含む医薬産業で慣用の技術に従う。
【００７５】
以下の実施例で示されるパーセンテージは全て重量に基づく。
【実施例】
【００７６】
活性剤を含む錠剤を調製するための典型的方法の例は、先ず活性剤をゼラチン、エチルセルロースその他の結合剤と混合することである。その場合、混合は標準的なＶブレンダー内で、通常無水条件下で適切に行われる。次に、調製された直後の混合物は従来の錠剤機で強打し、スラッグを錠剤に成形することができる。調製された直後の錠剤は、シェラック、メチルセルロース、カルナバワックス、スチレン−マレイン酸共重合体などの適切なコーティングで、コーティングされる。
【００７７】
経口投与のために、アンドログラホリド混合物を３０ｍｇから４０ｍｇまで含む圧縮錠剤が、上で開示されかつＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３９章、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９６５年、で示されている当技術分野で公知の製造方法に従って製造される。
【００７８】
本発明製剤の好ましい医薬組成物は、以下の実施例のいくつかで示されている。
実施例１
薬草Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ Ｎｅｅｓから得られた乾燥抽出物に含有されるアンドログラホリド混合物を用いた、本発明の錠剤を調製するための医薬組成物
【００７９】
【表１】
【００８０】
一様に錠剤を製剤化するために、乾燥抽出物（アンドログラホリド混合物）の活性化合物、ジャガイモ澱粉、タルク、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、無水二酸化ケイ素、ポリエチレングリコールおよび炭酸カルシウムを、全ての成分が一様に混合されるまで乾燥条件下で慣用のＶブレンダーで混合する。混合物を次に標準的な軽メッシュスクリーンに通し、無水環境下で乾燥させ、次にステアリン酸マグネシウムとブレンドして錠剤に圧縮成形し、シェラックでコーティングする。１１６から１６２ｍｇを含有する他の錠剤は、同様に調製される。
【００８１】
実施例２
薬草Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ Ｎｅｅｓから得られた乾燥抽出物を用いた、本発明のカプセルを調製するための医薬組成物
【００８２】
【表２】
【００８３】
３０ｍｇから４０ｍｇのアンドログラホリド混合物を含む経口用カプセルの製造は、乾燥抽出物（アンドログラホリド混合物）を担体と混合して、この混合物を通常ゼラチンその他のポリマーシースに封入することから本質的になる。カプセルは食用の適合する担体中の細かく分散した化合物を封入することによって作られる当技術分野で公知のソフト形態のカプセルでよく、または、カプセルはタルク、ステアリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、その他の無毒性固体と混合した新規な組成物から本質的になる硬カプセル剤でもよい。治療使用のために３０ｍｇまたは４０ｍｇを含むカプセルを用いる典型的な使用例が指示されている。
【００８４】
単回投与であれ複数回投与であれ、または日ごとの用量であれ、投与される用量は、化合物の効力が変動するため本発明のどの化合物が使用されるかにより、選択される投与経路により、患者のサイズおよび病状の性質により当然ながら変動する。投与される用量は、１日８０から１６０ｍｇの一般経口投与量に対応し、経口投与量は通常１日１２０ｍｇを３回；通常の静脈内用量は６０から８０ｍｇであり、指示があれば後に７０から１００ｍｇを投与し；通常の筋肉内用量は２４時間ごとの７０から１００ｍｇであり１日に１〜２回注射される。
【００８５】
本発明の乾燥抽出物（アンドログラホリド混合物を含有する）を含む新規の有用な医薬組成物は、皮膚送達系、胃腸薬剤送達用デバイスなどの薬剤送達系からの予想される生理効果のための投与に適応可能であり、この送達用デバイスは天然および合成のポリマー材から製造される。制御された薬剤投与のために化合物を含有する薬剤送達系の製造で許容される材料の代表例としては、ポリ塩化ビニル、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、ポリジメチルシロキサン、アクリルおよびメタクリル酸のエステルの親水性ヒドロゲル、ポリ酢酸ビニル、プロピレン酢酸ビニル共重合体などの材料がある。
【００８６】
実施例３
上記組成物を含有するシェラックで被覆された錠剤は、錠剤の剤形のための混合、顆粒化、および必要に応じて圧縮する工程を含む、医薬産業で慣用される技術に従って調製する。
【００８７】
具体的には、実施例１の組成物を十分な量のＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ乾燥抽出物と完全に混合する。アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドを含む錠剤の製造のためには、その混合物を実施例１で言及した不活性成分と共に直接的に圧縮し、その後しかるべくシェラックで被覆する。
【００８８】
実施例４
本組成物によって誘導されるＨＬ−６０細胞の分化
化学物質：Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ、ＮＢＴ、レチノイン酸、サイトカラシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）。ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのウシ胎仔血清、全トランスレチノイン酸およびアンドログラホリドは、Ａｌｄｒｉｃｈから入手。他の分離系統は、Ａｍｓａｒ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．、インド、から入手した。ＦＵＲＡ２−ＡＭはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（アメリカ合衆国）から購入した。ニトロブルーテトラゾリウムはＳｉｇｍａから入手。
【００８９】
細胞培養：ＨＬ−６０細胞は、２０％熱不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で、５％のＣＯ2を含有する３７℃の加湿環境で増殖させた。細胞は３×１０5細胞／ｍｌで、週２回播種した。１００ｎＭの全トランスレチノイン酸を単独でまたは組成物（１７．５μｇｍｌ）と組み合わせて加えることによって分化を誘導し、Ｍａｙ Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色の後の形態変化およびＮＢＴ’（１１）を還元する能力により評価した。未分化型培養物は、３％未満のＮＢＴ陽性細胞を含んでいた。分化した培養物は、レチノイン酸処理の５日後に調査した。
【００９０】
カルシウム測定［Ｃａ２＋］ｃ
ＨＬ−６０顆粒球（２×１０7ｍｌ）にＣａ2+培地＋０．１％ウシ血清アルブミン中で２μＭのｆｕｒａ−２／ＡＭを３７℃で４５分間ロードし、次に１０7細胞／ｍｌに希釈して氷上で保存した。使用直前に、この細胞懸濁液の０．５ｍｌを遠心分離にかけ、５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含む示された培地の２．４ｍｌで再懸濁した。Ｆｕｒａ−２蛍光（Ｆ）は、温度自動調節されたキュベット内（３７℃）（ＬＳ５５蛍光計、パーキン−エルマー社）で３４０および３８０ｎｍの励起および５０５ｎｍの発光波長で測定した。
【００９１】
実施例５
本組成物によるＴ細胞内のＩＬ−２およびＩＦＮ−γ生産の阻害
化学物質：ＳｉｇｍａからのコンカナバリンＡおよびＲＰＭＩ１６４０培地
細胞培養：Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒマウスをエーテルによって屠殺し、膝窩の神経節および脾臓を５ｍｌの培地ＲＰＭＩ１６４０を含むペトリプラークに置いた。無菌のＲＰＭＩ１６４０溶液中でこれらの臓器を破壊することによってリンパ球を得、これらのリンパ球は１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、ヌーバウアーチャンバーで定量化した。最後に、リンパ球の懸濁液を１ｍｌのＲＰＭＩにつき４×１０6細胞数の濃度に調節した。得られたならば、リンパ球は組成物の存在下または非存在下で培養した。この目的のために、１ｍｌの細胞および異なる濃度の組成物および１ｍｌのマイトジェンコンカナバリンＡ（ＣＯＮＡ、０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）を含む、２４穴（それぞれ２ｍｌ）のポリスチレンの培養プラークを使用した。
【００９２】
プラークは湿度５％およびＣＯ2の環境で３７℃のオーブンで２４時間インキュベートし、次にそれぞれ２ｍｌの試料を加えて３２００ｒｐｍで１分間遠心分離した。その後、細胞を０．６ｍｌに小分けして冷凍し、サイトカインをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）で検出した。
【００９３】
ＩＬ−２およびＩＦＮ−γのためのＥＬＩＳＡ
化学物質：ＩＬ−２とＩＦＮγはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手。ＴＭＢはＰｉｅｒｃｅから、Ｈ2Ｏ2およびＨ2ＳＯ4はＭｅｒｃｋから入手。
【００９４】
サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ）の測定のために、抗抗原を捕捉する第１の抗体、ペルオキシダーゼ酵素とコンジュゲートする第２の抗体、および検量線のための標準溶液を使用した。ＥＬＩＳＡ「高結合」９６穴ポリスチレンプレートを使用した。ウェルへの付着を助長するために１ウェルにつき１００μｌの第１の抗体を炭酸緩衝液ｐＨ９．５で希釈し、固体部分への結合を完全にするために４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルの内容物を除去して１ウェルにつき３００μｌのＴｗｅｅｎ２０、０．０５％ｐ／ｖおよびＰＢＳ ｐＨ７．０で３回洗浄した。その後、ウェルを２００μｌの無脂肪ミルク５％およびＰＢＳでブロックし、室温で１時間インキュベートした。完了後、既に説明したようにウェル内容を除去して洗浄した。その後、１ウェルにつき１００μｌの抗原を含む検査試料を２反復で、およびサイトカインに特異的な校正曲線を１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。その後、後者のプロトコルに従ってウェル内容を除去して５回洗浄した。その後、第２のコンジュゲート抗体にペルオキシダーゼ酵素を加え、ＰＢＳおよびＳＢＦ溶液１０％に希釈し、１ウェルにつき１００μｌをプレーティングして室温で１時間放置した。その後、７回洗浄して、１ウェルにつき１００μｌのＴＭＢ溶液およびＨ2Ｏ2に暴露させ、３０分後に暗所で展開し、反応は１ウェルにつき５０μｌの２ＭのＨ2ＳＯ4で停止させた。反応の結果は、４５０ｎｍフィルター（Ｅｌｘ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー、Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してＥＬＩＳＡで測定した。
【００９５】
実施例６
本組成物によるＰＰＡＲ−γ受容体の刺激
化学物質：ジメチルスルホキシドはＭｅｒｃｋから購入した。他の全ての試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。
【００９６】
転写アッセイ：ＨＬ−６０細胞を、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下のヒトＰＰＡＲγ１発現ベクターであるｐＣＭＸ−ｈＰＰＡＲγ１でトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、ルシフェラーゼ活性はＨＬ−６０中のβ−ガラクトシダーゼ標準にノーマライズした。
【００９７】
プラスミド：ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびｍＰＰＡＲγリガンド結合ドメイン（ｐＧＡＬ４ＤＢＤ−ｍＰＰＡＲγ）を発現しているプラスミドは、ｐＧＢＴｍＰＰＡＲγ１からのＳｃａＩ／ＢａｍＨＩ断片として単離されたマウスＰＰＡＲγ１リガンド結合ドメイン（アミノ酸１６２〜４７５から）をｐＣＭＸＧａｌ４ ＤＢＤへインフレーム挿入することによって構築した。
【００９８】
細胞はＤＭＳＯまたは１７．５μｇ／ｍｌの本発明の組成物で処理し、ルシフェラーゼ活性は化学発光により測定した。
実施例７
本組成物による好中球中のＮＦ−κＢ阻害
化学物質：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はＭｅｒｃｋから入手。ウシ胎児血清およびＲＰＭＩ−１６４０培地はＧｉｂｃｏ、米国、から入手。ニトロテトラゾリウムブルーはＳｉｇｍａから、ｐＲＬ−ＴＫ、ｐＧＬ３および二重ルシフェラーゼリポーターアッセイ系はＰｒｏｍｅｇａから。Ｆｕｇｅｎｅ６はＲｏｃｈｅから入手。
【００９９】
細胞培養
急性骨髄性白血病からの細胞骨髄性のＨＬ−６０系を使用した。この細胞は、ジメチルスルホキシド１．３％（ＤＭＳＯ）の存在下で分化することができる（Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｅｉｔら、２０００）。細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％の熱不活化ウシ胎児血清および抗生物質を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％ＣＯ2と共に３７℃に保たれる。細胞は、好中球を１．３％ＤＭＳＯで４日間インキュベートすることによって好中球に分化する。分化細胞は、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）で分析する。
【０１００】
ＨＬ−６０細胞へのＮＦκＢ−ｐＧＬ３ベクターのトランスフェクションおよびルシフェラーゼ測定
他で記載されているように、ＨＬ−６０細胞を培養して４日間で好中球に分化させた。４日後、細胞をｐＧＬ３−ＮＦκＢベクターでトランスフェクションし、トランスフェクションの内部標準としてｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターを使用したが、これはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの中レベルの発現を可能にする単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む発現ベクターである。これらのベクターは、リポソームに基づく系（Ｆｕｇｅｎｅ６、Ｒｏｃｈｅ）によって細胞にトランスフェクションされる。トランスフェクションの後、細胞を２４時間保ち、次に本発明の組成物の存在下または非存在下で異なる時間にＰＡＦまたはｆＭＬＰで刺激する。その後、細胞抽出物は、ルシフェラーゼ活性の測定まで−７０℃に保つ。ルシフェラーゼの活性は、蛍（ｐＧＬ３）およびＲｅｎｉｌｌａ（ｐＲＬ）ルシフェラーゼ酵素の基質を有する市販の系デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、化学発光で測定する。
【０１０１】
ＩκＢａイムノブロット
化学物質：ｆＭＬＰ、ＰＭＳＦおよびＰＡＦは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。トリス、ＮａＣｌ、ＮＰ−４０、デオキシコール酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、イプロテアーゼ（ｉｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤、メルカプトエタノールはＭｅｒｃｋから入手。
【０１０２】
好中球は１０分間プレインキュベートし、その後６０分間ｆＭＬＰ（０．１μＭ）およびＰＡＦ（０．１μＭ）で刺激した。タンパク質の分析のために、細胞は溶解タンポン（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸塩、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ2ＶＯ4、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０μｇ／ｍｌイプロテアーゼ阻害剤）で溶解した。タンパク質はブラッドフォード法で定量し、変性条件のポリアクリルアミドゲル１２％（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）で電気泳動により分解し、ニトロセルロース膜へ電気的に移動させた。膜を抗ＩκＢα抗体と共にインキュベートし、次に第２のペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベートし、最後に化学発光（ＥＣＬ）で視覚化した。ゲル内のタンパク質の量の対照として、抗体をストリッピング溶液（１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２％ ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．７）で処理して抗アクチン抗体とインキュベートした。最後に、各抗体について得られたシグナルの濃度測定分析を実施した。
【０１０３】
実施例８
野生型ラットにおける本組成物によるβ−アミロイド形成の阻害
アミロイド形成
アミロイド形成を検査するために、２つの相補性技術、チオフラビン−Ｔ蛍光法（Ｌｅｖｉｎｅ、１９９３；Ｓｏｔｏら、１９９５；Ｒｅｙｅｓら、１９９７；Ｉｎｅｓｔｒｏｓａら、２０００）およびコンゴーレッド結合法（Ａｌｖａｒｅｚら、１９９８）を使用した。簡単に説明すると、チオフラビン−Ｔアッセイは、アミロイド線維と結合するときのチオフラビンの蛍光発光に基づき、４５０ｎｍで励起されたときの４８２ｎｍの発光の増加を示す。コンゴ−レッドアッセイは、形成されたアミロイドの量を測定する非常に特異的な定量アッセイである。これらの技術は、特定のアミロイド形成を確認するために、現在使用されている。
【０１０４】
実施例９
アンドログラホリド組成物からの化合物の説明
本発明の代表組成物は錠剤形態の医薬製剤であり、それは以下の化合物
アンドログラホリド ２４．６％
１４−デオキシアンドログラホリド ４．８％
ネオアンドログラホリド ０．６％
の混合物をその後の異なる医薬形態の製造のために供給し、以下の用量で適用される：
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【０１０５】
実施例１０
紅斑性狼瘡の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド類の混合物を使用すると、狼瘡による症状の正常化は３ヵ月間の投与を経て起こる。さらに、本組成物は他の伝統的な非ステロイド系抗炎症剤の通常の再構築（rebuilding）効果に干渉しない。
【０１０６】
実施例１１
多発性硬化症の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド混合物を使用すると、当該疾患による症状の正常化は本発明の組成物による３ヵ月間の治療を経て起こる。さらに、本組成物は他の治療法に干渉しない。
【０１０７】
実施例１２
関節症および慢性関節リウマチの治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド混合物を使用すると、変形性関節症による関節硬直の正常化は、グルコサミンまたはコンドロイチン硫酸または他の抗炎症薬の有無にかかわらず、３ヵ月を経て起こる。さらに、本組成物は、伝統的な非ステロイド系抗炎症剤と異なり、これら２つのプロテオグリカン構成要素の通常の関節再構築効果に干渉しない。
【０１０８】
実施例１３
糖尿病の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されているアンドログラホリド混合物を使用すると、糖レベルの正常化は５週を経て起こる。さらに、本組成物は他の糖低下剤の通常の再構築効果に干渉しない。
【０１０９】
実施例１４
ＡＩＤＳの治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されている経口製剤を、ＨＩＶ陽性の患者に投与する。正常なＣＤ４計数値は、３ヵ月以内の治療で回復する。
【０１１０】
実施例１５
アルツハイマー病の治療のための経口製剤の臨床的有効性
実施例７で記載されている経口製剤を、掛かりつけの開業医に診断され、独立した認定神経科医に確認されたアルツハイマー病（ＡＤ）の初期段階を示している患者に投与する。臨床試験の２週間前に、患者はＭｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｕｓ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）、Ｂｏｓｔｏｎ Ｎａｍｉｎｇ Ｔｅｓｔ（ＢＮＴ）およびＴｏｋｅｎ Ｔｅｓｔ（ＴＴ）などの適切な精神神経病学的検査を受ける。
【０１１１】
神経心理学的検査は、臨床試験当日、６週後および３ヵ月後に繰り返し行われる。これらの検査は、患者の治療法を知らない神経心理学者によって実施される。
試験の開始時に、患者は試験製剤またはプラセボに無作為に割付けされる。試験製剤およびプラセボは、１日に１、２回、経口投与される。試験中は、糖尿病、高血圧、その他の病態の治療は許容される。スコアは、各３つの観察期間中に試験製剤とプラセボの間で統計学的に比較される。治療しない場合、ＡＤの自然経過は、臨床試験期間中に検査スコアがかなり悪化する。当該処方で記載されている組成物で治療した患者は、臨床試験期間中、患者のスコアが同じであるか向上した場合に、改善されたとみなされる。
【０１１２】
患者は、試験の始めに無作為に本組成物またはプラセボを投与される。本組成物およびプラセボは、１日２回投与される。試験の間、患者は糖尿病、高血圧、その他の病態の治療が許可される。本組成物およびプラセボの結果は、全ての試験期間について統計学的に比較される。プラセボを使用する患者は、かなりの認知悪化を示す。本組成物で治療する患者は、検査スコアが相当改善される。
【０１１３】
前述の説明から、当業者が本発明の本質的特徴を容易に確かめることはできず、また、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件にそれを適応させるために本発明に様々な変更および／または修正を加えることができることは明らかである。このように、これらの変更および修正は、請求項の均等物の全範囲内に適切に、正当に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ＦＵＲＡ２−ＡＭインディケーターで標識されたＨＬ−６０細胞を用いて３４０／３８０ｎｍの比により測定されたＰＡＦ誘導性カルシウム置換を示している代表的なグラフである。実施例１〜２で記載されているように、細胞はレチノイン酸だけで、または本発明の組成物（３．５μｇ／ｍｌ）の存在下で分化した。
【図２】ＰＰＡＲγのプロモーターを含むベクターでトランスフェクションしたＨＬ−６０細胞内の相対ルシフェラーゼ活性および本発明の組成物の効果を表している棒グラフである。
【図３】本発明の組成物によるコンカナバリンＣＯＮＡで活性化されたＴ細胞内のＩＬ−２およびＩＮＦ−γ濃度の阻害を表している棒グラフである。
【図４】本発明の組成物によるｌκＢα分解の阻害を示す図であり、棒グラフはＮＦκＢプロモーターを含むベクターでトランスフェクションしたＨＬ−６０細胞における相対ルシフェラーゼ活性に対する本発明の組成物の阻害率を表す。
【図５】チオフラビン染色を用いた本発明の組成物によるβアミロイド形成のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を示している顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物アンドログラフィス・パニキュラータ（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）の乾燥抽出物から得られ、その一般式が、
Ｃ20Ｈ30Ｏ5 アンドログラホリド
Ｃ20Ｈ30Ｏ4 １４−デオキシアンドログラホリド
Ｃ26Ｈ41Ｏ8 ネオアンドログラホリド
であるジテルペンラブダン類の混合物を含む組成物。
【請求項２】
前記アンドログラホリド成分が、
ｉ）一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ5
ｉｉ）分子量：３５０．４６
ｉｉｉ）分子名：３−［２−［デカヒドロ−６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−５，ｈａ−ジメチル−２−メチレン−１−ナフタレニル］エチリデン］−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２（３ｈ）−フラノン
ｉｖ）分子構造：
【化１】
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１４−デオキシアンドログラホリド成分が、
ｉ）一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ4
ｉｉ）分子量：３３６．４６
ｉｉｉ）分子名：
ｉｖ）分子構造：
【化２】
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ネオアンドログラホリド成分が、
ｉ）一般式：Ｃ26Ｈ41Ｏ8
ｉｉ）分子量：３４５．８９
ｉｉｉ）分子名：
ｉｖ）分子構造：
【化３】
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
薬、薬剤、医薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項６】
自己免疫疾患の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項７】
慢性関節リウマチの治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項８】
紅斑性狼瘡の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項９】
多発性硬化症の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
アルツハイマー病の予防および治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
喘息およびアレルギーの治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
乾癬の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
全身性皮膚筋炎の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
変形性関節症の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
糖尿病の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
組織および臓器移植患者における拒絶反応の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物中にアンドログラホリドを２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．２〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物中にアンドログラホリドを約２５〜３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約４．５〜５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．４〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物に基づいてアンドログラホリドを２４．６ｗ／ｗ％、デオキシアンドログラホリドを４．８ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを０．６ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
錠剤の形態の医薬製剤に対応することを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
経口投与され、以下の分子の以下の用量に寄与することを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物：
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【請求項２４】
自己免疫疾患の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
慢性関節リウマチの治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
紅斑性狼瘡の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２７】
多発性硬化症の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
アルツハイマー病の予防および治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２９】
喘息およびアレルギーの治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
乾癬の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３１】
全身性皮膚筋炎の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３２】
変形性関節症の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３４】
糖尿病の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３５】
移植患者の臓器および組織の拒絶反応の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
適切な経腸、非経口、皮膚、目、鼻、耳、直腸、膣、尿道、舌下、咽頭−気管−気管支の医薬形態であることができ、アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドのジテルペンラブダン混合物を含有する乾燥抽出物を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物重量に基づいてアンドログラホリドを２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．２〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物重量に基づいてアンドログラホリドを約２５〜３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約４．５〜５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．４〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物重量に基づいてアンドログラホリドを２４．６ｗ／ｗ％、デオキシアンドログラホリドを４．８ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを０．６ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
対応する経路により以下の用量で投与されることを特徴とする、請求項３６に記載の医薬組成物：
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【請求項４１】
自己免疫疾患の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
慢性関節リウマチの治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４３】
紅斑性狼瘡の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４４】
多発性硬化症の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４５】
アルツハイマー病の予防および治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４６】
喘息およびアレルギーの治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４７】
乾癬の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４８】
全身性皮膚筋炎の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４９】
変形性関節症の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５０】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５１】
糖尿病の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５２】
移植患者の臓器および組織の拒絶反応の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１】
植物アンドログラフィス・パニキュラータ（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）の乾燥抽出物から得られ、その一般式が、
Ｃ20Ｈ30Ｏ5 アンドログラホリド
Ｃ20Ｈ30Ｏ4 １４−デオキシアンドログラホリド
Ｃ26Ｈ41Ｏ8 ネオアンドログラホリド
であるジテルペンラブダン類の混合物を含む組成物。
【請求項２】
前記アンドログラホリド成分が、
ｉ）一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ5
ｉｉ）分子量：３５０．４６
ｉｉｉ）分子名：３−［２−［デカヒドロ−６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−５，ｈａ−ジメチル−２−メチレン−１−ナフタレニル］エチリデン］−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２（３ｈ）−フラノン
ｉｖ）分子構造：
【化１】
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１４−デオキシアンドログラホリド成分が、
ｉ）一般式：Ｃ20Ｈ30Ｏ4
ｉｉ）分子量：３３６．４６
ｉｉｉ）分子名：
ｉｖ）分子構造：
【化２】
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ネオアンドログラホリド成分が、
ｉ）一般式：Ｃ26Ｈ41Ｏ8
ｉｉ）分子量：３４５．８９
ｉｉｉ）分子名：
ｉｖ）分子構造：
【化３】
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
薬、薬剤、医薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項６】
自己免疫疾患の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項７】
慢性関節リウマチの治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項８】
紅斑性狼瘡の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項９】
多発性硬化症の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
アルツハイマー病の予防および治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
喘息およびアレルギーの治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
乾癬の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
全身性皮膚筋炎の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
変形性関節症の治療に適切な薬を調製するために特に有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
糖尿病の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
組織および臓器移植患者における拒絶反応の治療に適切な薬を調製するために有用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物中にアンドログラホリドを２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．２〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物中にアンドログラホリドを約２５〜３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約４．５〜５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．４〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物に基づいてアンドログラホリドを２４．６ｗ／ｗ％、デオキシアンドログラホリドを４．８ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを０．６ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
錠剤の形態の医薬製剤に対応することを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
経口投与され、以下の分子の以下の用量に寄与することを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物：
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【請求項２４】
自己免疫疾患の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
慢性関節リウマチの治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
紅斑性狼瘡の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２７】
多発性硬化症の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
アルツハイマー病の予防および治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２９】
喘息およびアレルギーの治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
乾癬の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３１】
全身性皮膚筋炎の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３２】
変形性関節症の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３４】
糖尿病の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３５】
移植患者の臓器および組織の拒絶反応の治療に有用であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
適切な経腸、非経口、皮膚、目、鼻、耳、直腸、膣、尿道、舌下、咽頭−気管−気管支の医薬形態であることができ、アンドログラホリド、１４−デオキシアンドログラホリドおよびネオアンドログラホリドのジテルペンラブダン混合物を含有する乾燥抽出物を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物重量に基づいてアンドログラホリドを２０〜４０ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約３〜６ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．２〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物重量に基づいてアンドログラホリドを約２５〜３５ｗ／ｗ％、１４−デオキシアンドログラホリドを約４．５〜５．５ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを約０．４〜０．８ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ジテルペンラブダン混合物が最終乾燥抽出物重量に基づいてアンドログラホリドを２４．６ｗ／ｗ％、デオキシアンドログラホリドを４．８ｗ／ｗ％およびネオアンドログラホリドを０．６ｗ／ｗ％含むことを特徴とする、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
対応する経路により以下の用量で投与されることを特徴とする、請求項３６に記載の医薬組成物：
ａ）１〜５ｍｇのアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｂ）０．２〜１ｍｇの１４−デオキシアンドログラホリド／ｋｇ／日
ｃ）０．０２〜０．１２ｍｇのネオアンドログラホリド／ｋｇ／日。
【請求項４１】
自己免疫疾患の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
慢性関節リウマチの治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４３】
紅斑性狼瘡の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４４】
多発性硬化症の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４５】
アルツハイマー病の予防および治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４６】
喘息およびアレルギーの治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４７】
乾癬の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４８】
全身性皮膚筋炎の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４９】
変形性関節症の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５０】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５１】
糖尿病の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５２】
移植患者の臓器および組織の拒絶反応の治療に有用であることを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５１９７５９（Ｐ２００７−５１９７５９Ａ）
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１７２３（Ｐ２００６−５５１７２３）
【出願日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５５１６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４９５３
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０６２６３９８５）ウニベルシダドゥ・アウストゥラル・デ・チリ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５５１６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４９５３
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０６２６３９８５）ウニベルシダドゥ・アウストゥラル・デ・チリ (1)
【Ｆターム（参考）】
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