説明

PQQGDH制御アプタマー及びその用途

【課題】B/F分離の操作をすることなく、疾病マーカーを簡便・迅速・高感度に検出するための手段を提供する。
【解決手段】ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(PQQGDH)に結合しその酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子、該アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の認識アプタマー部位への結合により、酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位に結合したPQQGDHとを含む測定試薬。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼに結合してその酵素活性を変化させることができるアプタマー分子及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
様々な疾病の早期診断・早期治療を行う上で、疾病マーカーとなるペプチドや蛋白質の検出は極めて重要である。現在、最も一般的にこのような疾病マーカーを検出する技術として用いられているのが、抗体を利用したELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)である。この方法では、標的分子に結合する抗体を担体上に固定化し、標的分子と標的分子の異なる箇所に結合する二つ目の抗体を添加して担体固定化抗体にトラップさせる検出方法である。トラップされなかった抗体の分離操作は必要であるが、比較的高感度、簡便に検出することが可能な系である。
【0003】
しかしながら、ELISAには次のような問題点がある。まず、一点目として、抗体は標的と結合した際に信号発信を行わないので、標的分子の異なる箇所に結合する二種類の抗体が必要となる点である。一つの標的分子の異なる箇所に結合する二種類の抗体を作製することは難しく、また抗体はそもそも作製に時間と労力がかかり、値段も高価である。二点目としては、一つの抗体に酵素などの分子を修飾することで信号発信を行うので、標的分子に結合しなかった抗体を除去する、B/F分離の操作が必須な点である。
【0004】
疾病を早期治療するためには、早期診断が必須であり、その為には採取した血液をその場で測定することが可能な簡便・迅速な検出システムが求められる。しかし、ELISAでは分離操作が必要であるため、その分時間がかかり、迅速な系とは言えない。
【0005】
一方、任意の分子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドであるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、修飾が容易であるため、センシング素子としての応用が期待されている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献1)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を10回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。
【0006】
本願発明者らは、B/F分離の操作が不要な疾病マーカー検出技術として、特定の分子の検出を行う際に、その分子を認識するアプタマーと酵素制御アプタマー(酵素活性に変化を及ぼすアプタマー)を連結することで、アプタマーを酵素のサブユニットとして用いたセンシング技術であるAES(Aptameric Enzyme Subunit)を構築している(特許文献1)。検出原理は、特定の分子が存在した場合、その分子に対するアプタマーが結合すると、連結されている酵素制御アプタマーの構造に影響を及ぼし、その結果酵素活性に変化が生じるので、その変化を測定するというものである。この検出法の利点として、ELISAによる検出と異なり、標的分子の結合を直接、酵素活性のシグナルとして検出するため、B/F分離を必要としない、迅速で簡便な検出が可能である点があげられる。また、一度、酵素活性を阻害するアプタマーを獲得してしまえば、検出したい標的分子に結合するアプタマーは1種類でよく、様々な標的分子の検出に用いることも可能である。さらに、アプタマーは抗体に比べ、作成が簡単で安価である。
【0007】
ただし、特許文献1に記載のAESは、分子認識アプタマーとしてアデノシンアプタマーを、酵素制御アプタマーとしてトロンビンアプタマーを用いたものであって、アデノシンをフィブリン凝固時間の変化により検出するものである。かかる検出方法は、測定に比較的時間がかかるため迅速性に欠けるという欠点がある。
【0008】
ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(PQQGDH)は、溶存酸素の影響を受けず、高い触媒活性を示すことから、市販の血糖値測定用グルコースセンサーに使用されている酵素である。本酵素の利点は、一点目として、およそ5000U/mgと高い触媒活性を有するためシグナル増幅が期待できる点、二点目として、血糖値測定に用いられているグルコースセンサーのセンシングシステムを適用できる点である。このような利点より、既存の酵素の中ではセンシング素子として非常に有効な酵素であると考えられる。AESにPQQGDHを利用することができれば、さらに迅速な検出方法を提供することができる。
【0009】
しかしながら、アプタマーの創製方法は、上記した通り偶然を積極的に利用する方法であるので、標的物質に対して高い結合能を有するアプタマーが得られるかどうかは、実際に膨大な実験を行なってみなければわからない。特に、AESを構築する場合、酵素制御アプタマーとしては、センシング素子として利用する酵素との結合能を有し、かつ、分子認識アプタマーと対象分子との結合により、酵素活性に変化を生じさせることのできるアプタマーを創製しなければならないため、AESの酵素制御アプタマーに利用し得るアプタマーを取得することは非常に困難である。
【0010】
【特許文献1】国際公開WO2005/049826号公報
【非特許文献1】Tuerk, C. and Gold L. (1990), Science, 249, 505-510
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
従って、本発明の目的は、B/F分離の操作をすることなく、疾病マーカーを簡便・迅速・高感度に検出するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本願発明者らは、PQQGDHに結合し、その活性に影響を及ぼすアプタマーの探索をするに当たり、ランダムライブラリーからのアプタマーのスクリーニング工程において、(1)PQQGDH固定化担体として負に帯電している磁性ビーズを用いる手法、(2)担体としてニトロセルロース膜を用い、PQQGDHと共に腫瘍マーカータンパク質を担体に固定化して競合させる手法の2種類の探索方法を用いて、PQQGDHに対するアプタマーの探索を行うことにより、PQQGDHへの高い結合能を有するアプタマーを取得し、さらに、該アプタマーの中から、PQQGDHの活性を上昇又は阻害することができるアプタマーを見出し、本願発明を完成した。
【0013】
すなわち、本発明は、以下の(a)ないし(c)のいずれかの塩基配列から成るアプタマー分子であって、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(PQQGDH)に結合し、PQQGDHの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子を提供する;(a) 配列表の配列番号2、3及び29のいずれかに示される塩基配列、(b) (a)の塩基配列のうち1ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び/又は挿入された塩基配列、(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列。また、本発明は、配列番号2、3、11、12、16、18、20、24及び29のいずれかに示される塩基配列から成りPQQGDHに結合する能力を有するアプタマー分子から選択される同一又は異なる2つのアプタマー分子が2つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、PQQGDHに結合し、PQQGDHの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のアプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の前記認識アプタマー部位への結合により、前記酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの前記酵素制御アプタマー部位に結合したPQQGDHとを含む測定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の測定試薬を、標的物質を含み得る検体と接触させ、次いで、前記酵素制御アプタマー部位に結合した前記PQQGDHの酵素活性を測定し、該酵素活性を指標として検体中の標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法を提供する。
【発明の効果】
【0014】
本発明により、PQQGDHへの高い結合能を有し、且つ、PQQGDHの酵素活性を変化させることができるアプタマーが初めて提供された。さらに、該アプタマー構造を利用した標的物質測定システムも構築された。本発明のアプタマーと、疾病マーカー等の所望の標的物質を認識する他のアプタマーとを組み合わせれば、PQQGDHの高い触媒活性を利用して、高感度に標的物質を測定するシステムを構築することができる。アプタマーはDNA合成機を用いて化学的に合成することができるため、抗体に比べると作製に労力がかからず、費用も安価であり、測定キットそのものの価格を下げることが可能である。迅速・簡便・安価に疾病マーカーの検出を行うことができる本検出システムは、疾病の早期診断への極めて大きな貢献が期待できる。また、PQQGDHは市販のグルコースセンサーにも使用されている酵素であり、これらのグルコースセンサーの検出システムをそのまま応用することが可能であるから、実用化の面でも極めて有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
本発明のアプタマー分子は、PQQGDHに結合し、その酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子である。該アプタマー分子は、一本鎖のポリヌクレオチドから成るものであり、下記いずれかの塩基配列から成る。
(a) 配列表の配列番号2、3及び29のいずれかに示される塩基配列。
(b) (a)の塩基配列のうち1ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び/又は挿入された塩基配列。
(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列。
【0016】
ポリヌクレオチドは、DNAでもRNAでもよく、またPNA等の人工核酸でもよいが、安定性の観点からDNAが好ましい。
【0017】
「酵素活性を変化させる」とは、本発明のアプタマー分子が結合していない状態のPQQGDHと比較して、PQQGDHの酵素活性が上昇又は低下することをいう。以下、本明細書において、このような酵素活性を変化させる能力のことを「酵素制御能」といい、酵素制御能を有するアプタマーを「酵素制御アプタマー」という。
【0018】
本発明のアプタマーの結合能は、PQQGDHへの結合能がある限り、PQQGDH以外の他のタンパク質にも結合し得るものであってよいが、PQQGDHへの特異性及び親和性が高く、他のタンパク質への結合が全くないかあるとしても相対的に無視できるほど少量しか結合しないことが好ましい。
【0019】
配列表の配列番号2〜33にそれぞれ示される塩基配列は、下記実施例に記載される30merのランダム領域を含むssDNAライブラリー(配列番号1)のスクリーニングにより、PQQGDH制御アプタマーの候補として取得されたssDNAの塩基配列である。これらのうち、配列番号2、3及び29は、PQQGDHへの結合能を有し、かつ、PQQGDHの酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー(それぞれMag1、Mag2及びPGa9)の塩基配列である(実施例1−4及び2−6参照)。これらのアプタマーが所定の条件下(フォールディング条件下)で形成する二次構造は、コンピューターを用いた常法により容易に決定することができる。最近接塩基対法を用いた周知の核酸構造予測プログラムであるm-fold(商品名、Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)、The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth のウェブサイトからダウンロード可能)を用いて決定した、Mag1、Mag2及びPGa9の二次構造を、それぞれ図5及び図8(C)中に示す。なお、「フォールディング条件」とは、1分子のアプタマーの一部の領域同士が分子内で塩基対合して二本鎖から成るステム部を形成する条件であり、公知の通常のアプタマーの使用条件でもある。通常、室温下で、所定の塩濃度を有し、カルシウムキレート剤、さらに所望により界面活性剤を含む水系緩衝液中である。例えば、下記実施例で採用した、10mM MOPS及び1mM CaCl2を含む水溶液や、20mM Tris-HCl及び150mM NaClを含む水溶液中で、室温下にてフォールディングを行なうことができる。なお、本明細書において、「フォールディングする」という語は、アプタマー分子の分子内における塩基対合によりステム部を形成することのみならず、複数のポリヌクレオチド分子の分子間における塩基対合も包含する意味で用いる。
【0020】
酵素制御アプタマーは、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが等しいものであれば、同様のアプタマー活性(結合能及び酵素制御能)を発揮し得る。例えば、末端から少数の塩基を欠失させても、もとのアプタマー活性を維持し得る。ステム部を形成する塩基については、対合する塩基の位置を相互に入れ替えた塩基配列としてもよいし、また、対合する塩基対を例えばa-t対からg-c対に置き換えてもよい。具体的には、例えば、配列番号29に示す塩基配列から成るアプタマーPGa9では、4ntのcと20ntのgが対合してステム部を構成するが、4ntをgとして20ntをcにしてもよいし、また、4ntと20ntのg-c対をa-t対に変えてもよい。また、ループ部を形成する塩基については、その位置に同じサイズのループが形成される限り、他の塩基配列を採用してもよい。また、下記実施例にもある通り、標的タンパク質との結合に重要ではないループ構造であれば、該ループ構造内に任意の塩基配列を付加させても、アプタマー活性を維持できる。下記実施例では、アプタマーをループ部で分断し、互いに相補な塩基配列をその分断部位に連結させているが、このような分割アプタマーでもアプタマー活性が維持されているため、互いに相補な領域を持つ塩基配列をループ構造内に挿入させた場合であっても、同様にアプタマー活性が維持されると考えられる。従って、配列番号2、3及び29の塩基配列のうち、1ないし数個(好ましくは1又は2個)の塩基が上記に例示したように置換し、欠失し及び/又は挿入された塩基配列から成るアプタマーも、もとの塩基配列から成るアプタマーと同様のアプタマー活性を有し得るので、本発明の範囲に包含される。
【0021】
また、アプタマーの一端又は両端に任意の塩基配列を付加させても、アプタマー領域においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが等しい限り、同様のアプタマー活性を有し得る。従って、配列番号2、3又は29の塩基配列を部分配列として含む塩基配列から成るアプタマーも、本発明の範囲に包含される。任意の付加配列のサイズは特に限定されないが、あまりに長いとアプタマー合成の手間とコストがかかる。従って、付加配列のサイズは、通常、合計で40塩基程度以下、好ましくは10塩基程度以下、より好ましくは1〜2塩基程度である。ただし、付加配列が他のアプタマー配列である場合にはこの限りではなく、付加されるアプタマー配列の鎖長に応じてサイズが定まる。
【0022】
なお、本発明において、「Xnt」(Xは数字)は、その配列における、5'末端からX番目の塩基を示す。また、「mer」はヌクレオチド数を示す。
【0023】
また、本発明は、配列番号2、3、11、12、16、18、20、24及び29のいずれかに示される塩基配列から成りPQQGDHに結合する能力を有するアプタマー分子(以下「モノマーアプタマー」ということがある)から選択される同一又は異なる2つのアプタマー分子が2つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、PQQGDHに結合し、PQQGDHの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子(以下「ダイマーアプタマー」ということがある)を提供する。PQQGDHはダイマー構造の酵素であるため、上記モノマーアプタマーの結合部位はPQQGDH分子上に2箇所存在する。従って、アプタマーをダイマー化することにより、アプタマー1分子でPQQGDH分子上の2箇所の結合部位に結合することができるようになるため、モノマーアプタマーよりも結合能を高めることができ、ひいては、モノマー状態では発揮できなかった酵素制御能を発揮させることができるようになる。例えば、下記実施例に具体的に記載される通り、モノマーアプタマーPGa4(配列番号24)はスクリーニング前のランダムライブラリーと同程度の酵素活性上昇作用を示すのみで、PQQGDHに対する酵素制御能は有さないといえるが、これをダイマー化することにより(D-PGa4、配列番号34、図8(C))、結合能が高まり、PQQGDHの酵素活性を半分程度にまで低下させることができるようになる(下記実施例2−5及び2−6)。
【0024】
連結するモノマーアプタマーは同一でも異なっていてもよい。モノマーアプタマーがPQQGDHの酵素活性を上昇させるものである場合には、かかるモノマーをダイマー化することにより、酵素活性を上昇させる割合がさらに高まると考えられる。連結する際には、必要に応じアデニン又はチミンのいずれかのみから成るリンカーを介して連結することができる。すなわち、5'上流側のモノマーアプタマーの3'末端領域及び/又は3'下流側のモノマーアプタマーの5'末端領域にステムループ構造が存在する場合には、直接連結させるとステムループ構造が望ましく形成されないおそれがあるため、かかる場合にはリンカーを介して連結させることが好ましい。リンカーの鎖長は、ダイマーアプタマー中の各モノマー領域が所期の二次構造をとるために十分なだけのスペースを確保できる鎖長であればよく、特に限定されないが、通常は1mer〜20mer程度、好ましくは5mer〜15mer程度である。
【0025】
本発明はまた、上記した本発明のPQQGDH制御アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチド(以下「酵素制御ポリヌクレオチド」と呼ぶ)を提供する。酵素制御ポリヌクレオチドは、1分子又は2分子のポリヌクレオチド鎖から成り(以下、1分子からなるものを「1分子性酵素制御ポリヌクレオチド」、2分子からなるものを「2分子性酵素制御ポリヌクレオチド」ということがある)、標的物質が認識アプタマー部位へ結合することにより、酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を変化させる能力が変化することを特徴とする。酵素制御アプタマー部位が有する酵素活性を変化させる能力の変化は、該部位に結合したPQQGDHの活性の変化を調べることで知ることができる。酵素制御アプタマー部位に結合しているPQQGDHは、該部位の作用により、酵素活性が上昇又は低下した状態にあるが、この状態で、認識アプタマー部位に標的物質が結合すると、酵素活性がさらに変化する(すなわち、酵素制御アプタマー部位が有する「酵素活性を変化させる能力」が変化する)。通常は、酵素制御アプタマー部位に結合しているPQQGDHの酵素活性は、活性が上昇又は低下した状態から、もとの活性に戻る(すなわち、酵素制御アプタマー部位が有する「酵素活性を変化させる能力」が低下する)。この、酵素活性を変化させる能力の低下の原理は、例えば、図11に示されるように、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素制御ポリヌクレオチドの立体構造が変化し、制御アプタマー部位からPQQGDHが離脱することによるものと考えられるが、これに限定されない。
【0026】
具体的には、例えば、酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を上昇させる能力を有する場合、標的物質が認識アプタマー部位に結合することにより、通常、酵素活性を上昇させる能力が低下し、制御アプタマー部位に結合しているPQQGDHの酵素活性は、認識アプタマー部位への標的物質の結合により低下することになる。また、酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を低下させる能力を有する場合、標的物質が認識アプタマー部位に結合することにより、通常、酵素活性を低下させる能力が低下し、制御アプタマー部位に結合しているPQQGDHの酵素活性は、認識アプタマー部位への標的物質の結合により上昇することになる。従って、上記本発明のポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位にPQQGDHを結合させて調製した酵素−ポリヌクレオチド複合体を用いれば、PQQGDH活性の変化を指標として、検体中の標的物質の測定を行なうことができる。すなわち、本発明は、上記した本発明の酵素制御ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位に結合したPQQGDHとを含む標的物質測定試薬をも提供する。なお、本発明において、「測定」には検出、定量及び半定量が包含される。
【0027】
「アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される」とは、上記酵素制御ポリヌクレオチド中で酵素制御アプタマー部位がとる二次構造が、1分子で構成される本発明のアプタマー分子がとる二次構造と近似するようにして構成されることをいう。従って、酵素制御アプタマー部位を構成する領域は、上記酵素制御ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチド鎖中において、必ずしも連続する1つの領域として存在する必要はなく、1分子又は2分子のポリヌクレオチド鎖中に分断して存在するものであってもよい。分断して存在していても、ポリヌクレオチド鎖をフォールディング条件下でハイブリダイズさせ、分子内及び/又は分子間の適当な部位において塩基対を形成させることにより、それらの領域が組み合わされて、もとにしたアプタマー分子の二次構造と近似した二次構造を形成することが可能な限り、酵素制御アプタマー部位の構成態様として許容される。具体的には、例えば下記実施例に記載されるように、Mag2(配列番号3)の塩基配列を1nt〜31ntと32nt〜65ntの2つの領域に分断し、これらの断片を2分子のポリヌクレオチド鎖に分けて含ませた構成(配列番号36及び37)としてもよい。このように構成しても、酵素制御ポリヌクレオチド中で望ましく酵素制御能を発揮できる。
【0028】
本発明のアプタマー分子の塩基配列を分断する位置としては、ループ構造内のいずれかの部位が好ましい。ループ構造内で分断すれば、分断後の断片をそれぞれ含む2分子のポリヌクレオチド鎖を調製しても、これらのポリヌクレオチド鎖をフォールディング条件下で塩基対合させることにより、ステム部分が望ましく形成され、もとにしたアプタマー分子の二次構造を再現できる(もとにしたアプタマー分子の二次構造と近似した二次構造を形成する)可能性が高く、ひいては酵素制御アプタマー部位がもとのアプタマー分子の有する結合能及び酵素制御能を維持する可能性が高くなる(以下、このような、もとの1分子のアプタマーと近似した二次構造をとり得る、2分子のポリヌクレオチド鎖から成るポリヌクレオチドを「分割アプタマー」と呼ぶことがある)。例えば、上述した通り、実施例ではMag2(配列番号3)を31ntと32ntの間で分断しているが、Mag2のループ構造を形成する領域は25nt〜39ntの領域であり、これはループ構造内での分断である。このようにして構築した2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドは、後述するとおり、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を変化させる能力を好ましく低下させることができる。なお、アプタマー分子がとる二次構造は、上述の通りコンピューターを用いた常法により容易に決定することができる(図5、図8参照)。
【0029】
上記認識アプタマー部位は、標的物質に対し特異的に結合する能力を有するアプタマー部位である。認識アプタマー部位として利用できるアプタマーは、ピロロキノリンキノン及びPQQGDH以外の物質を標的とする限り、特に限定されず、公知の種々のアプタマーを利用することができるし、所望の標的物質に対して新規に創製したアプタマーを利用することもできる。ただし、複数のステムを持つ複雑な構造のアプタマーについては本発明の酵素制御ポリヌクレオチドの調製が困難な場合があるので、ステム部の少ない(好ましくは1〜3箇所程度)二次構造を有するアプタマーがより好ましい。具体的には、例えば下記実施例に記載のアデノシンアプタマー(配列番号35)等を利用することができる。標的物質は、それに対するアプタマーが調製できるものであれば特に限定されず、ピロロキノリンキノン及びPQQGDH以外の物質であればいかなるものであってもよい。
【0030】
酵素制御ポリヌクレオチド分子中において、認識アプタマー部位を設ける位置は特に限定されず、酵素制御アプタマー構造の末端部であってもよく、また、酵素制御アプタマー部位のループ構造に付加するようにして設けてもよい。例えば、ループ構造内で分断した分割アプタマーの、一方のポリヌクレオチド鎖の分断部位側末端に認識アプタマーを連結させることにより、酵素制御アプタマーのループ構造部に認識アプタマー部位を設定した、2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを得ることができる。この際、他方の断片の分断部位側末端に、該認識アプタマー配列中の少なくとも一部の領域と相補的な配列から成る断片を連結させると、認識アプタマーと該相補配列断片とがハイブリダイズして塩基対を形成するので、酵素制御アプタマー部位の二次構造を安定させることができ好ましい。該相補配列断片のサイズは、採用する認識アプタマーのサイズに応じて、該認識アプタマーの全長と同一以下の任意のサイズを選択することができ、特に限定されないが、通常3mer以上20mer以下(ないしは認識アプタマーの全長の半分以下)程度である。このように、ループ構造内で分断した酵素制御アプタマーを用いて調製した本発明の2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドは、後述するとおり、認識アプタマー部位の構造変化を効率的に酵素制御アプタマーに伝えることができるため、1分子の酵素制御アプタマーの末端に認識アプタマーを連結して調製される1分子性の酵素制御ポリヌクレオチドよりも好ましい。
【0031】
酵素制御アプタマー部位と認識アプタマー部位とは、直接連結してもよいが、リンカーを介して連結させてもよい。例えば、酵素制御アプタマーと認識アプタマーとをそれぞれの末端部で連結させて1分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを調製する場合には、ダイマーアプタマーについて上述したように、連結部近傍の二次構造を保持する観点から、適当な鎖長のリンカーを介して連結させてもよい。また、ループ部で分断した分割アプタマーを用いて2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを調製する場合にも、認識アプタマーをリンカーを介して分断部末端に連結させることができる。リンカーを介する場合、上記相補配列断片には、リンカーと相補的な領域を含ませることが好ましい。なお、相補配列断片の連結もリンカーを介するものであってよい。リンカーは、アデニンのみ又はチミンのみから成ることが好ましい。リンカーの鎖長は、酵素制御アプタマーと認識アプタマーとを末端部で連結させる場合には、上記したダイマーアプタマーにおけるリンカーの条件と同様に、通常は1mer〜20mer程度、好ましくは5mer〜15mer程度である。また、分割アプタマーを用いてループ部分に認識アプタマーを設ける場合には、特に限定されないが、通常1mer〜10mer程度、好ましくは1mer〜5mer程度である。
【0032】
認識アプタマー部位を構成する領域は、標的物質との結合能を有するアプタマー配列のみから成るものであってもよく、また、酵素制御ポリヌクレオチド分子中で認識アプタマー部位の二次構造を安定化させるため等に有用な任意の塩基配列をさらに含ませてもよい。例えば、下記実施例で用いているアデノシンアプタマーは、配列番号35に示される塩基配列から成るアプタマーであるが、その二次構造はバルジ型であり、図11(A)に示す通り5'末端のgと3'末端のcが対合してステム部を構成する。この場合には、アデノシンと結合したときのアデノシンアプタマー部位の立体構造をより安定化する観点から、アデノシンアプタマー断片のうち分割アプタマーと連結していないフリーの末端部(図11(B)の例においてはアデノシンアプタマー断片の3'末端部)に、リンカーと相補的な塩基を1ないし数個程度付加させてもよい。
【0033】
酵素制御アプタマー部位のループ構造に認識アプタマー部位を連結した2分子性のポリヌクレオチドにPQQGDHを結合させた、本発明の標的物質測定試薬の想定される測定スキームを図11(B)に示す。図11(B)中に例示する本発明の試薬は、酵素制御アプタマー部位としてMag2の分割アプタマー、認識アプタマー部位としてアデノシンアプタマーを用いたものであり、測定対象となる標的物質はアデノシンである。Mag2は上述した通りPQQGDHの酵素活性を上昇させる作用を有する。アデノシンの非存在下では、アデノシンアプタマーが部分相補鎖とハイブリ形成して、Mag2は安定した構造をとり、PQQGDHを活性化する。一方で、アデノシン存在下ではアデノシンアプタマーがアデノシンと結合し、リジットな構造を形成することで、連結しているMag2の構造が不安定になり、PQQGDH活性化能が減少する。即ち、アデノシンをPQQGDH活性の減少で検出する系が想定される。
【0034】
本発明の標的物質測定試薬は、本発明の酵素制御ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチド中の酵素制御アプタマー部位に結合したPQQGDHとを含むものである。該PQQGDHは、上記した通り、試薬中の認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素活性が変化する。具体的には、酵素制御ポリヌクレオチドに採用される酵素制御アプタマーが、PQQGDHの活性を上昇させる作用を有する場合、標的物質測定試薬では、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、PQQGDHの酵素活性が低下する。これとは逆に、採用される酵素制御アプタマーがPQQGDHの活性を低下させる作用を有する場合、標的物質測定試薬では、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、PQQGDHの酵素活性が上昇する。従って、標的物質を含み得る検体と本発明の試薬を接触させ、試薬のPQQGDHの酵素活性の変化を調べることにより、標的物質を測定することができる。標的物質の濃度が既知の試料を用いて酵素活性を調べ、検量線を作成すれば、検体中の標的物質を定量することも可能である。PQQGDHの酵素活性は、例えば、フェナジンメトサルフェート(PMS)及び2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)等の適当な活性試薬を含む溶液中で、基質であるグルコースを反応させ、吸光度を測定することにより、容易に測定することができる。
【0035】
本発明のアプタマー分子及び酵素制御ポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、標的物質測定試薬は、下記実施例に詳述されるように、酵素制御ポリヌクレオチドをフォールディング後、ホロ化させたPQQGDHと混合し、室温で5分〜30分程度インキュベートすることにより、容易に調製することができる。
【0036】
本発明のPQQGDH制御アプタマー分子の主な用途は、バイオセンサーのセンシング素子としての利用であり、具体的には、本発明の酵素制御ポリヌクレオチドや測定試薬への適用のような、特許文献1記載のAESへの利用を挙げることができる。ただし、本発明のアプタマー分子の用途はこれらに限定されず、PQQGDHへの結合能を利用して、それ自体周知の方法により、PQQGDHの測定に使用することもできる。この場合には、PQQGDH制御アプタマーは、アプタマーによる周知の通常の方法に従って使用することができ、例えば抗体の代わりに本発明のアプタマーを利用した免疫測定法を行なうことができる。また、下記実施例に記載されるアプタマーブロッティングや、表面プラズモン共鳴法(SPR)等の周知の方法によってもPQQGDHの測定を行なうことができる。被検試料としてはPQQGDHを含む溶液であればいかなるものであってもよい。
【実施例】
【0037】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0038】
実施例1−1 アプタマーのスクリーニングに適したPQQGDH固定担体の検討
PQQGDHに対して高い親和性と特異的を有するDNAアプタマーを効率よくスクリーニングするために、PQQGDHでなく、PQQGDHの固定担体に非特異的に吸着してしまうDNA量を最小限に抑える必要がある。そこで、より溶液系に近い自由度の高い環境で非特異的に吸着したDNAを洗浄、除去するためにPQQGDHの固定担体として、磁性ビーズを用いることとした。さらに、DNAのリン酸骨格が負電荷を帯びていることに着目し、負のゼータ電位を帯びている磁性ビーズを用いると静電的な反発により、DNAの磁性ビーズへの非特異吸着を抑えることができると考えた。
【0039】
DNAと静電的相互作用を示すと考えられる正のゼータ電位を帯びたビーズ1と、DNAと静電的に反発すると考えられる負のゼータ電位を帯びたビーズ2、ビーズ3の計3種類の同粒径(500〜750nm)のビーズで検討を行った。まず、スクリーニングで用いるライブラリーである、FITC修飾66mer ssDNA(18merのプライマー配列を30merのランダム配列の両末端に付加したもの、配列番号1)を15μMとなるようにBinding Buffer(10mM MOPS、1mM CaCl2、pH 7.0)で調製したものを250μl用意した。その後、500 mg/mlのビーズ溶液を20μl添加し、1時間室温で振とうした後、上清を除き、Binding bufferで15分間、5分間、5分間、5分間ずつ洗浄を行った。500μlの7M ureaを加え、80℃で7分振等することで吸着DNAを溶出する作業を2回行った。溶出DNAをエタノール沈殿させ、真空乾燥させた後、20μlのMilliQ水でペレットを溶解し、10倍希釈して、蛍光分光測定(Ex:495nm、Em:520nm)により各ビーズの非特異吸着DNA量を比較した。
【0040】
その結果、ゼータ電位が+30mVで正に帯電しているビーズ1は、負に帯電しているビーズ2、ビーズ3に比べると圧倒的に高い蛍光強度を示した。これより、ビーズ1と核酸が静電的相互作用を示したため、核酸が大幅に非特異吸着してしまったと考えられる。一方で、負に帯電しているビーズ2、ビーズ3はビーズ1と比較すると蛍光強度が著しく低い値を示した。これより、ビーズ2、3と核酸が静電的に反発して、核酸の非特異吸着量が低下したと考えられる。さらに、ビーズ2とビーズ3を比較するとゼータ電位はそれぞれ、−60mV、−50mVであり、負の絶対値のより大きいビーズ2はビーズ3と比べ、さらに低い蛍光強度を示し、今回比較したビーズの中で、最も核酸の非特異吸着量が低いビーズであるといえる。また、ビーズ2は負に帯電しているので、スクリーニング時のpH7.0で正に帯電するPQQGDHを固定する際に静電的に物理吸着させることも可能である。これらより、ビーズ2が今回の目的であるPQQGDHに対するアプタマーのスクリーニングに最も適していると考えられる。
【0041】
実施例1−2 磁性ビーズを用いたPQQGDHに対するDNAアプタマーの探索
66merイニシャルライブラリーをBinding buffer(10mM MOPS、1mM CaCl2、pH7.0)で1nmol/100μLに調製し、95℃で3分間加熱した後、30分間で室温の25℃まで徐々に冷却することにより、フォールディングさせた。一ラウンド目に限り、15 mgのビーズに100μg(1 nmol相当)のビーズを固定化し、5μM、500μMのライブラリーとインキュベートし、(GDH : ssDNA = 1nmol : 2.5nmol)、2ラウンド目以降は2mgの磁性ビーズに10μgのPQQGDHを固定化したものを0.5μM、100μlのフォールディングさせた66merイニシャルライブラリーと1時間室温にてインキュベート(GDH : ssDNA = 100pmol : 50 pmol)した後、Binding buffer(10mM MOPS、1mM CaCl2、pH7.0)で15分間、3回洗浄した。その後、フェノール/クロロホルムでPQQGDHに結合したssDNAを抽出し、イソプロパノール沈殿により生じたペレットを30μlのTE bufferに溶かした。そのうちの一部を30サイクルでPCR増幅し、一本鎖を調製した。その後、イソプロパノール沈殿により生じたペレットを30μlのTE bufferに溶かし、次のラウンドのライブラリーとした。同様の操作をPQQGDHを固定化していない等量のビーズに対しても行い、ビーズに親和性の高いssDNAが濃縮されていないかどうか検討した。以上の操作を1ラウンドとし、合計6ラウンド行なった。なお、ライブラリーに含まれていたssDNAのモル数に対する、PQQGDHに吸着したssDNAのモル数の割合を回収率として算出した。また、一本鎖調製は具体的には次のようにして行った。すなわち、PCR産物に、その1/10倍量の×50 TE Bufferおよび1/5倍量の5 M NaClを添加し、この溶液をアビジン固定化アガロースに加え、30分インキュベートした。その後、上清を取り除き、Column buffer (30 mM HEPES、500 mM NaCl、5mM EDTA、pH7.0)で2回洗浄した。上清を取り除いた後、0.15 M NaOHを加えて10分間攪拌し、上清を回収する操作を2回繰り返し行うことにより、ssDNAを溶出させた。ssDNAを含む上清を2M HClで中和し、エタノール沈殿によりssDNAを回収した。
【0042】
6ラウンド目までの回収率の変遷を図1に示す。PQQGDHを固定化していない磁性ビーズに対する回収率はラウンドを重ねてもほとんど変化が見られず、また、PQQGDHを固定化したものより回収率が低いので、ビーズに対して親和性の高いssDNAは濃縮されていないと考えられる。一方、PQQGDHを固定化したものはラウンドを重ねるごとに回収率が上昇していることがわかる。6ラウンド目では、回収率が20%程度まで上昇したので、PQQGDHに対して親和性の高いアプタマーが濃縮されていると考えられたので、6ラウンド目に抽出したssDNAのシーケンス解析を行った。結果を表1に示す。配列の収束及び相同性の高い領域は見られなかった。なお、表1中には両末端のプライマー配列を省略したランダム領域の配列のみを示す。
【0043】
【表1】

【0044】
実施例1−3 シーケンシングの結果得られた各クローンのPQQGDHに対する結合能の評価
各クローンのPQQGDHに対する結合能の評価は、(1)アプタマーブロッティング、(2)SPRで評価した。
【0045】
(1) アプタマーブロッティングでの評価
PQQGDH、血清を1×2cmのニトロセルロース膜に滴下し、片面で250ng(PQQGDH 2.5pmolに相当)を固定化した。その後、4%スキムミルクを用いて、室温で1時間ブロッキングを行った。Binding-T(10mM MOPS、1mM CaCl2、0.05% Tween、pH7.0)で洗浄した後、1nMのFITC修飾した19本それぞれのssDNA溶液3mlとインキュベートさせ、洗浄した。HRP修飾した坑FITC抗体とインキュベートさせ、洗浄した後、各タンパク質に結合したDNA量を化学発光により検出した。なお、結合能の比較を行うために、イニシャルライブラリーと19本のクローンを等量ずつ混ぜた(終濃度1nM)Mixライブラリーを用いて同様の操作を行った。
【0046】
検出結果を図2に示す。19本のクローンのうち、ほとんどのクローンにおいてPQQGDHへの結合を示すスポットがイニシャルライブラリーのスポットよりも強度が強く検出された。これより、多くのクローンがPQQGDHに対し、高い親和性をもつことが示された。しかし、全てのクローンにおいて、血清に対するスポットも検出されており、また、多くのクローンで、PQQGDHと血清に対するスポットの強度に違いが見られなかった。各クローンが血清中の正電荷に富んだタンパク質に結合してしまった可能性が考えられる。化学発光強度解析の結果、PQQGDHに対する親和性が高く、さらに血清よりもPQQGDHに対する親和性が高いクローンである、Mag1、Mag2、Mag3、Mag7、Mag10、Mag11、Mag13、Mag15、Mag17、Mag19などが有力であると考えられた。
【0047】
(2) SPRでの評価
アプタマーブロッティングでの結合能の評価の結果からPQQGDHへの結合能が比較的高いと考えられる7つのクローン(Mag1、2、10、11、15、17、19)に関して、SPRでの結合能の評価を試みた。まず、CM5チップにアミンカップリングでPQQGDHを22000RU固定化した後、各クローンを1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.015、0.0075μMの8点の濃度に振って、それぞれ流速10μl/minで40μlインジェクトした。なお、チップの再生化は250mMのNaClで行った。イニシャルライブラリーに関しても同様に測定を行った。
【0048】
C richであるMag10、11、15、17、19に関してはイニシャルライブラリーと同程度のシグナルしか得られなかった。一方で、G richであるMag1、2に関しては、アプタマーブロッティングの結果と同様に、どのDNA濃度においても、イニシャルライブラリーの3倍程度のSPRシグナルが確認された。特にMag2のPQQGDHに対する結合能が最も優れていることが示され、スキャッチャードを作成し算出された解離定数はおよそ200nM程度であった。図3にイニシャルライブラリーとMag2の各DNA濃度におけるSPRシグナルを示す。
【0049】
実施例1−4 各クローンのPQQGDH活性に与える影響の評価
アプタマーブロッティングでの結合能の評価の結果からPQQGDHへの結合能が比較的高いと考えられる7つのクローン(Mag1、2、10、11、15、17、19)が、PQQGDH活性に与える影響の評価を試みた。
【0050】
酵素活性の測定は、PMS-DCIP系を用い、DCIPの600nmにおける吸光度変化を30秒間追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。
【0051】
まず、終濃度3.8nM PQQGDH、2mM CaCl2、1μM PQQとなる混合溶液20μlをBinding bufferを用いて調製し、10分間室温でインキュベートしてPQQGDHをホロ化した。その後、ホロ化したPQQGDH溶液にフォールディングしたクローン溶液をそれぞれPQQGDHの10倍量となるように10μl加え、混合溶液30μlとし、これを15分間室温でインキュベートして、ssDNAとPQQGDHを結合させた。インキュベート後の溶液に141μlのBinding buffer、9μlの活性試薬(終濃度 0.6mM PMS、0.06mM DCIP)、20μlグルコース(終濃度 20mM)を加え、30秒間、吸光度測定を行った。各クローンのPQQGDH活性に与える影響を調べるために、クローン溶液のかわりに等量のBinding bufferとインキュベートしたサンプル(no DNAサンプル)の酵素活性を測定した。
【0052】
活性測定結果を図4に示す。C richであるMag10、11、15、17、19に関してはイニシャルライブラリーと同様に、ほとんどPQQGDH活性に影響を与えないことが示された。一方でG-richであるMag1、2に関しては、PQQGDH活性を向上させる傾向が見られた。特に、Mag2はPQQGDH活性を30%程度向上させることが示された。mfoldで予測したMag1、2の二次構造を図5に示す。
【0053】
実施例2−1 PQQGDHを標的としたSELEXを始めるにあたっての、固定化タンパク質量とブロッキング溶液の検討
本実施例では、PQQGDHに対するSELEXを始めるにあたり、担体に固定化するタンパク質量及びブロッキング溶液の種類、濃度の検討をAptamer blotting法により行った。なお、血清中でGDHに対するアプタマーを利用することを考えているため、血清中の他のタンパク質には結合しないように、血清をブロッキング溶液として用いることを試みた。
【0054】
より具体的には、GDHを10mM MOPSで希釈し、12.5、2.5、0.5、0.1g/lの濃度の溶液を調製した。各々をPQQ、CaClを終濃度1μM、1mMとなるように添加してホロ化した後、1 cm×1 cm四方のニトロセルロース膜に片面1μlずつPQQGDHを滴下し乾燥させた。その後、4%スキムミルクまたは4%、20%、100%の血清のいずれかを用いて、室温で1時間ブロッキングを行った。TBS−T(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05% Tween、1mM EDTA、pH 7.4)で洗浄を行った後、1μMのFITC(fluorescein isothiocyanate)修飾した一本鎖DNAランダムライブラリー(配列番号1)溶液1.5 mlとインキュベートさせ、洗浄し、さらにHRP(horseradish peroxidase)修飾した抗FITC抗体とインキュベートさせ、再び洗浄を行った。タンパク質に結合したDNA量を確認するため、HRPに対する基質用溶液を添加して化学発光により検出した。
【0055】
その結果、4%スキムミルクを用いてブロッキングを行った膜に比べ、血清を用いた膜ではタンパク質を固定化していない部分に対する結合が少なかった。100%、20%、4%の各血清では、検出結果に大きな違いが見られず、4%でも十分にブロッキングが行えていると考えられる。また、固定化するタンパク質量については、25、5、1μgで検出できることが明らかになった。よって、SELEXでは、4%の血清を用いてブロッキングを行い、加えるDNAとの比が1:1となるように25μgのGDHを固定化し、1ラウンド目を行うこととした。
【0056】
実施例2−2 PQQGDHを標的としたアプタマーの探索
本実施例においては、PQQGDHに対してSELEXを7ラウンド行った。競合タンパク質として大腸癌の腫瘍マーカーであるCRP(C-reactive protein)、肝細胞癌の腫瘍マーカーであるAFP(Alpha-fetoprotein)を用いた。また、一本鎖DNAランダムライブラリーは18残基のプライマー配列と30残基のランダム配列を有する合計66残基の長さのものを用いた(配列番号1)。
【0057】
具体的な方法について以下に示す。GDHを10mM MOPSで希釈し、任意の濃度の溶液を調製した後に、PQQ、CaClを終濃度1μM、1mMとなるように添加してホロ化をした。その後、ニトロセルロース膜にPQQGDH、CRP、AFPを各々滴下し(表2に示す通り、1ラウンド目は25μg、2ラウンド目は5μgというように各ラウンドにおいて、各タンパク質の固定化量を変化させた)乾燥させ、4%血清を用いて室温で1時間ブロッキングを行った。TBS−T(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05% Tween、1mM EDTA、pH 7.4)で洗浄をし、1μMのFITC修飾した一本鎖DNAランダムライブラリー溶液250μlとインキュベートさせ、再度洗浄した。タンパク質が固定化された膜の一部を切り取り、結合したDNAを回収し、PCR増幅して次のラウンドのライブラリーとした。以上の操作を1ラウンドとし、計7ラウンドを行った。また、各ラウンドにおいて、タンパク質に結合したDNA量を確認するために、上記と同様の方法で検出用の膜を用意し、DNAとインキュベートさせた後に、二次抗体として抗FITC抗体を用いてタンパク質に結合するDNA量を化学発光により確認した。
【0058】
【表2】

【0059】
7ラウンド目において、PQQGDHを固定化した部分にのみ一本鎖DNAの結合が確認された(図6参照)。1ラウンド目に用いた、ラウンドを重ねていないランダムライブラリー(イニシャル)ではPQQGDHに対してDNAの結合が見られないことから、PQQGDHに特異的に結合する一本鎖DNAの濃縮が起こっていると考えられる。
【0060】
実施例2−3 SELEXで得られたPQQGDHに結合する一本鎖DNAの配列解析
本実施例においては、6ラウンド目に回収したDNAの配列の解析を行った。
【0061】
具体的な方法を以下に示す。6ラウンド目に回収した一本鎖DNAをPCR増幅し、DNAの精製を行った。その後、TAクローニング、形質転換、培養を行い、得られた45個の白色コロニーをLB培地で一晩培養した後、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドは、プライマーを用いて目的の断片をPCR増幅し、コロニーPCRで目的の断片を確認した。目的の断片が挿入されていることが確認されたプラスミドは、塩基配列をダイデオキシ法により決定した。
【0062】
配列解析の結果を表3に示す。得られた45本のクローンのうち、重複するものが複数見られ、最終的に13本の配列を得ることが出来た。配列間には、相同的な領域が見られるものもあり、PQQGDHに特異的に結合する配列の濃縮が起こっていたと考えられた。なお、表3中には両末端のプライマー配列を省略したランダム領域の配列のみを示す。
【0063】
【表3】

【0064】
実施例2−4 Aptamer blotting法による13個のアプタマーの結合能評価
本実施例においては、得られた13種類のアプタマーのPQQGDHに対する結合能の評価をAptamer blotting法により行った。
【0065】
具体的な方法を以下に示す。PQQGDH、CRP、AFPをニトロセルロース膜に滴下し固定化させた(PQQGDH:1.25μg、CRP:5μg、AFP:0.35μg)。その後、10%血清を用いて、室温で1時間ブロッキングを行った。TBS−T(20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.05% Tween、1 mM EDTA、pH 7.4)で洗浄を行った後、ビオチン修飾した一本鎖DNA溶液とインキュベートし、さらにHRP修飾したアビジンとインキュベートして、化学発光により蛋白質に結合したDNAを検出した。
【0066】
PQQGDHに対する各アプタマーの検出結果を図7に示す。PGa4アプタマーでは、PQQGDHに対して強度の強いスポットが検出され、競合させたCRP、AFPに対してはDNAの結合が見られなかった。PGa9アプタマーにおいても、PQQGDHに対する強度の強いスポットが検出されたが、CRPに対しても結合が見られた。よって、PGa4、PGa9ともにPQQGDHに結合するが、特異性はPGa4のほうが高いことが明らかになった。残りの11種類の配列については、強度の強いスポットは検出されなかったため、PQQGDHに対する結合能は低いと考えられる。
【0067】
結合が確認されたPGa4、PGa9の二次構造をmfoldを用いて予測したところ、図8(A)、(B)で見られるように、いくつかのステムループを形成していることが分かった。また、プライマー配列も構造の形成には必要であることが明らかになった。
【0068】
実施例2−5 SPRによるアプタマーの結合能評価
本実施例では、実施例2−4においてPQQGDHに高い結合能を有することが明らかになったPGa4について、SPRを用いて解離定数の算出を行った。さらに、PGa4を二つつなげたダイマーアプタマー(D−PGa4、配列番号34)を作製し、結合能がモノマーよりも高くなることを期待して、同様に解離定数の算出を行った。mfoldを用いて予測したD−PGa4の二次構造を図8(C)に示す。
【0069】
以下に詳細な方法を示す。各アプタマーを、TBSバッファー(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 7.4)で 5 pmol/100μLに調製し、95℃で3分間加熱した後、30分間で室温の25℃まで徐冷することにより、フォールディングさせた。調製したアプタマーのうち10μLを流速5μL/minで添加し、Sensor chip SAに固定化した。その後、2μM〜250nMのPQQGDHを調製し、各々をホロ化した後に100μlインジェクトし、アプタマーとPQQGDHの相互作用を観察した。SPRの測定は、室温、流速10μl/minで行い、アプタマーとPQQGDHの調製及びSPRの固定化buffer、Running bufferは、TBS buffer(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 7.4)を、再生化bufferは0.5%SDSを用いた。
【0070】
PGa4を240RU、D−PGa4を296RUセンサーチップ上に固定化し、その後の評価を行った。各アプタマーの測定結果を図9に示す。PGa4−65、D−PGa4ともに、PQQGDH濃度依存的なシグナルの上昇が観察され、この結果をもとにスキャッチャードプロットから解離定数を算出したところ、PGa4は1μM程度であった。一方、D-PGa4については、BIAevaluation 3.1によりグローバルフィッテイングを行い、結合カイネティックパラメーターを算出した(図9参照)。フィッテイングには、1:2(Heteroligand)モードを用いた。D-PGa4では230〜280nM程度の値となり、PGa4の解離定数が1μM程度であることから、アプタマーをダイマー化することで結合能が上がる可能性が示唆された。
【0071】
実施例2−6 PGa4、D-PGa4、PGa9のPQQGDHに対する阻害能の評価
本実施例では、実施例2−5で解離定数を算出したPGa4、D-PGa4、また実施例2−4でPQQGDHへの結合が確認できているPGa9を用い、PQQGDHの活性に与える影響について評価を行った。
【0072】
詳細な実験方法について以下に記載する。酵素活性測定は、TBS中においてmPMS-DCIP系を用いて行った(終濃度1 mM DCIP、6mM m-PMS)。PQQGDHに対して、CaCl、PQQを終濃度1mM、1μMとなるように加え、10μlスケールで5分間インキュベートすることによりホロ化を行った。その後、フォールディングした10μlのアプタマーを添加し、15分間インキュベートした。そこに、活性試薬10μlを添加し、1分間インキュベートした後に、終濃度60mMとなるようにグルコースを添加し、攪拌してインキュベートした。1分後、125μlの8M ureaを添加し、攪拌した後に氷中で酵素反応をとめ、600nmの吸光度を測定することで活性測定を行った。また、アプタマーの代わりにランダムライブラリー(イニシャル)でも同様の実験を行った。
【0073】
各アプタマーの酵素活性に与える影響について図10に示す。なお、アプタマー非存在下におけるPQQGDHの60mMグルコースに対する比活性値を100%とし、各アプタマー存在下における残存活性を示した。結果より、終濃度2.5μMにおいて、PGa4では活性値の若干の上昇が見られた。しかし、ランダムラリブラリーにおいても同程度の上昇が見られたことから、PGa4はPQQGDHの酵素活性に影響を及ぼさないと考えられる。一方、終濃度2.5μMのD-PGa4については、活性値の50%前後の低下が見られ、酵素活性を阻害する可能性が示された。
【0074】
一方、PGa9は終濃度1μMにおいて、活性値の40%程度の上昇が見られた。ランダムラリブラリーでも活性値の上昇が見られたが、20%程度の差があることから、PGa9はPQQGDHの酵素活性を上昇させる作用があることが示唆された。
【0075】
実施例3−1 PQQGDH活性を指標にしたAESセンサーシステムの構築
本願発明者らはトロンビン阻害アプタマーとアデノシンアプタマーを連結させたセンサー素子であるAES(aptameric enzyme subunit)のセンサーシステムを報告している(特許文献1)。本研究ではより高感度なセンサーの構築を目指し、トロンビンよりも酵素活性の高いPQQGDHを用いた系でAESを確立することを試みた。実施例1のスクリーニングの結果得られた、結合能が高く、PQQGDH活性を向上させるMag2をこの新規AESの構築に用いることとした。PQQGDHの活性を指標にしたAESが構築できた場合、市販のグルコースセンサーへ即応用が可能になると考えられるので、血液を一滴採取するだけで、種々の疾患マーカーの検出が行えると期待される。本研究では、構築したAESセンサーシステムでモデル標的分子としてアデノシンの検出が行えるかどうか検討した。
【0076】
Mag2の全長の二次構造予測結果で、ステムループを形成すると考えられる部位のループ領域(配列番号3中の25nt〜39nt)中の31ntと32ntの間でMag2を二分割した。この分割部位にそれぞれアデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結させて分離型のAESを設計することが可能になると考えられる。予想される検出スキームを図11に示す。
【0077】
アデノシンアプタマーとその11merの部分相補鎖を、分割したMag2にそれぞれ連結したサンプルを等量ずつ混合した溶液(この混合溶液をAESとする)を、Binding buffer(10mM MOPS、1mM CaCl、pH7.0)中でフォールディングさせた。PQQGDH 10μl(終濃度 0.4nM)とCaClとPQQの混合液10μlを混合し、10分間室温でインキュベートしてPQQGDHをホロ化した。その後、ホロ化したPQQGDH溶液に、AESを10μl(終濃度 12nM)を加えて、すぐに、アデノシン溶液を10μl(終濃度 500μM)加え、混合溶液40μlとし、これを15分間室温でインキュベートした。インキュベート後の溶液に131μlのBinding buffer(10mM MOPS、1mM CaCl、pH7.0)、9μlの活性試薬(終濃度 0.6mM PMS、0.06mM DCIP)、20μlのグルコース(終濃度 20mM)を加え、30秒間、600nmの吸光度変化を測定した。なお、アデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結していない、分割したMag2の混合サンプル(この混合溶液をdivMag2とする)に関しても、同様の測定を行った。
【0078】
Mag2を用いたAESにアデノシンを加えると、PQQGDH活性が低下する傾向を示した。一方で、アデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結していないMag2の分割体では、AESと比較してアデノシン添加時のPQQGDH活性の減少率が小さかった(図12)。これより、構築したAESを用いて、PQQGDH活性を指標にしたアデノシンの検出が可能であると考えられる。
【0079】
実施例3−2 構築したAESセンサーシグナルの濃度依存性の検討
分割したMag2に、アデノシンアプタマーとその11merの部分相補鎖をそれぞれ連結したサンプルを等量ずつ混合した溶液(この混合溶液をAESとする)をフォールディングさせた。アポ型のPQQGDH溶液をPQQ、CaClと10分間室温でインキュベートして4nMのホロ化PQQGDH溶液を調製し、氷上に静置した。Protein lo bind tubeに、調製したPQQGDH 溶液を20μl(終濃度 0.4nM)、AESdiv2を10μl(終濃度 12nM)、様々な濃度のアデノシンまたはシチジン溶液を10μl(それぞれ終濃度0、0.25、0.35、0.5、1.0、1.25mM)を順次加え、5分間室温でインキュベートした。インキュベート後の溶液に131μlのBinding buffer、9μlの活性試薬(終濃度 0.6mM PMS、0.06mM DCIP)、20μlのグルコース(終濃度 20mM)を加え、20秒間、600nmの吸光度変化を測定した。
【0080】
図13に、アデノシンの添加時のAESシグナル値を同濃度のシチジン添加時のAESシグナル値で割ってノーマライズした、AESシグナルのアデノシン濃度依存性を示す。値のばらつきが大きく、また、AESシグナル強度も小さいが、アデノシン濃度依存的なシグナルが得られていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0081】
【図1】実施例1におけるアプタマーのスクリーニング工程の各ラウンドにおける、PQQGDHに結合したDNAの回収率の変遷を示すグラフである。
【図2】実施例1のスクリーニングで取得した各ssDNAとPQQGDHとの結合反応をアプタマーブロッティングにより測定した結果を示す図である。
【図3】実施例1のスクリーニングで取得したMag2とPQQGDHとの結合反応をSPRで測定した結果を、ランダムライブラリーと比較して示す図である。
【図4】実施例1のスクリーニングで取得したssDNAがPQQGDHの活性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。
【図5】実施例1で取得した(A)Mag1及び(B)Mag2の二次構造を示す図である。
【図6】実施例2におけるアプタマーのスクリーニング工程の7ラウンド目における、PQQGDHに結合するssDNAの検出結果を示す図である。
【図7】実施例2のスクリーニングで取得した各ssDNAとPQQGDHとの結合反応をアプタマーブロッティングにより測定した結果を示す図である。
【図8】実施例2で取得した(A)PGa4及び(B)PGa9、並びにダイマー化により作製した(C)D-PGa4の二次構造を示す図である。
【図9】実施例2で取得したアプタマーとPQQGDHとの結合について、SPRを用いて測定し、解離定数を算出した結果を示す図である。(A)PGa4を用いた際のSPRセンサーグラムとΔRUのPQQGDH濃度依存性曲線、(B)D-PGa4を用いた際のSPRセンサーグラム、ΔRUのPQQGDH濃度依存性曲線、及び算出されたカイネティックパラメーター。
【図10】PGa4、D-PGa4、PGa9がPQQGDHの活性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。(A)イニシャル、(B)PGa4、(C)D-PGa4、(D)PGa9。「-DNA」はDNAを添加していないPQQGDHの活性値を示しており、この値を100%としている。
【図11】実施例3で構築したAESについての図である。(A)用いたアデノシンアプタマーの二次構造、(B)構築したAESの想定されるセンシングスキームを示す。
【図12】実施例3で構築したAESによる、PQQGDH活性を指標としたアデノシン検出の検討結果を示す図である。(A)アデノシンの有無での、想定されるAESの構造(左)とMag2分割体の構造(右)、(B)アデノシン非存在下におけるPQQGDH活性でノーマライズした、アデノシン存在下のPQQGDH活性を示す(左:AES、右:Mag2分割体(divMag2))。a)PQQGDH+AES、b)PQQGDH+AES+アデノシン、c)PQQGDH+Mag2分割体、d)PQQGDH+Mag2分割体+アデノシン。
【図13】実施例3で構築したAESについて、AESシグナルのアデノシン濃度依存性を検討した結果を示す(アデノシンと同濃度のシチジン添加時に得られたバックグラウンドシグナルでノーマライズしたもの)。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の(a)ないし(c)のいずれかの塩基配列から成るアプタマー分子であって、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(PQQGDH)に結合し、PQQGDHの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子。
(a) 配列表の配列番号2、3及び29のいずれかに示される塩基配列。
(b) (a)の塩基配列のうち1ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び/又は挿入された塩基配列。
(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列。
【請求項2】
前記(b)の塩基配列が、(a)の塩基配列のうち1又は2個の塩基が置換し、欠失し及び/又は挿入された塩基配列である請求項1記載のアプタマー分子。
【請求項3】
前記(c)の塩基配列が、(a)又は(b)の塩基配列の一端又は両端に1又は2個の塩基が付加された塩基配列である請求項1又は2記載のアプタマー分子。
【請求項4】
配列番号2、3及び29のいずれかに示される塩基配列、又は該塩基配列を部分配列として含む塩基配列から成る請求項1又は3記載のアプタマー分子。
【請求項5】
配列番号2、3及び29のいずれかに示される塩基配列から成る請求項4記載のアプタマー分子。
【請求項6】
配列番号2、3、11、12、16、18、20、24及び29のいずれかに示される塩基配列から成りPQQGDHに結合する能力を有するアプタマー分子から選択される同一又は異なる2つのアプタマー分子が2つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、PQQGDHに結合し、PQQGDHの酵素活性を変化させる能力を有するアプタマー分子。
【請求項7】
配列番号24に示される塩基配列から成るアプタマー分子が2つ連結された構造を有する請求項6記載のアプタマー分子。
【請求項8】
1mer〜20merの塩基から成るリンカーを介して前記2つのアプタマー分子が連結される請求項6又は7記載のアプタマー分子。
【請求項9】
配列表の配列番号34に示される塩基配列から成る請求項8記載のアプタマー分子。
【請求項10】
請求項1ないし9のいずれか1項に記載のアプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の前記認識アプタマー部位への結合により、前記酵素制御アプタマー部位がPQQGDHの酵素活性を変化させる能力が変化するポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項1ないし9のいずれか1項に記載のアプタマー分子のループ構造内のいずれかの部位で分断して得られる断片をそれぞれ含む2分子のポリヌクレオチド鎖から成り、一方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には前記認識アプタマー部位を形成する認識アプタマー分子がリンカーを介して又は介さずに連結され、他方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には該認識アプタマー分子中の少なくとも一部と相補的な領域がリンカーを介して又は介さずに連結され、2分子のポリヌクレオチド鎖の分子内及び/又は分子間ハイブリダイゼーションにより酵素制御アプタマー部位の二次構造が形成される請求項10記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
配列表の配列番号3に示される塩基配列中の25nt〜39ntの領域で形成されるループ構造内のいずれかの部位で該塩基配列を分断して得られる断片をそれぞれ含む2分子のポリヌクレオチド鎖から成る請求項11記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
分断される前記ループ構造内の部位が、配列番号3に示される塩基配列中の31ntと32ntの間である請求項12記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記認識アプタマー分子は、配列表の配列番号35に示される塩基配列から成るアデノシンアプタマーであり、前記断片の一方とリンカーを介して連結される請求項11ないし13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
配列表の配列番号36に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド鎖と、配列番号37に示される塩基配列から成るポリヌクレオチド鎖から成る請求項14記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項10ないし15のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの前記酵素制御アプタマー部位に結合したPQQGDHとを含む測定試薬。
【請求項17】
請求項16記載の測定試薬を、標的物質を含み得る検体と接触させ、次いで、前記酵素制御アプタマー部位に結合した前記PQQGDHの酵素活性を測定し、該酵素活性を指標として検体中の標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法。

【図1】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図2】
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【図6】
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【図7】
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【公開番号】特開2009−124946(P2009−124946A)
【公開日】平成21年6月11日(2009.6.11)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−299871(P2007−299871)
【出願日】平成19年11月19日(2007.11.19)
【出願人】(504132881)国立大学法人東京農工大学 (595)
【Fターム(参考)】