ＰＲＥＱ１リボスイッチならびにＰＲＥＱ１リボスイッチの使用のための、およびＰＲＥＱ１リボスイッチを用いる使用のための方法および組成物
ｐｒｅＱ１リボスイッチは、抗生物質および他の小分子療法の標的である。ｐｒｅＱ１リボスイッチおよびその一部を使用して、ＲＮＡ分子ならびに他のエレメントおよび分子の発現または機能を調節することができる。ｐｒｅＱ１リボスイッチおよびその一部を、例えば、化合物を同定または検出するための種々の他の方法で使用することができる。化合物を使用して、ｐｒｅＱ１リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および／または不活化することができる。ｐｒｅＱ１リボスイッチおよびその一部のみおよび他の核酸と組み合わせて、種々の構築物およびＲＮＡ分子で使用することができ、核酸によってコードすることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コード領域に作動可能に連結されたｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、該リボスイッチが該ＲＮＡの発現を調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同である、構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチが２つ以上のアプタマードメインおよび１つの発現プラットフォームドメインを含み、少なくとも１つの該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
少なくとも２つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
天然に存在するｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの非天然誘導体である、リボスイッチ。
【請求項６】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項７】
前記リボスイッチが１つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含む、請求項６に記載のリボスイッチ。
【請求項８】
少なくとも２つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項７に記載のリボスイッチ。
【請求項９】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該トリガー分子によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成する、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項１０】
目的の化合物を検出する方法であって、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化され、該目的の化合物によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該サンプルが該目的の化合物を含む場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【請求項１１】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって該リボスイッチに連結したＲＮＡの発現が変化し、該発現の変化によってシグナルを生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナルが、前記リボスイッチに連結した前記ＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験する工程、
（ｂ）工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、該細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、阻害工程
を含む、方法。
【請求項１５】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを同定する方法であって、該方法が、
ｐｒｅＱ１の存在下および非存在下でのＲＮＡ分子のインライン自発切断（ｉｎ−ｌｉｎｅ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｌｅａｖａｇｅ）を評価する工程であって、該ＲＮＡ分子が該ｐｒｅＱ１によって調節される遺伝子によってコードされ、
該ＲＮＡ分子のインライン自発切断パターンの変化が該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを示す、工程
を含む、方法。
【請求項１６】
遺伝子発現を阻害する方法であって、
（ａ）化合物を細胞と接触させる工程を含み、
（ｂ）該化合物が式Ｉ：
【化１９】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体である）
の構造を有し、
該細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が、該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が遺伝子発現の阻害が必要であると同定されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が前記細菌細胞を死滅させるか前記細菌細胞の増殖を阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物および前記細胞が被験体への該化合物の投与によって接触する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が細菌感染を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物がバイオフィルム中の細菌増殖を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
ｐｒｅＱ１の産生方法であって、該方法は、
（ａ）該ｐｒｅＱ１を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、該変異細菌細胞が前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含み、該変異を持たない細胞と比較して、該変異が、該変異細菌細胞による該ｐｒｅＱ１産生を増加させる、培養工程、
（ｂ）該細胞培養物から該ｐｒｅＱ１を単離し、それにより、該ｐｒｅＱ１を産生する工程、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも１０％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも１０％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも２５％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異がノックアウト変異である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含む細菌細胞であって、該変異を持たない細胞と比較した場合に、該変異が、該変異を含む細胞によるｐｒｅＱ１産生を測定可能な程度に増加させる、細菌細胞。
【請求項３２】
細菌細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞をｐｒｅＱ１応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程であって、該細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって該細菌細胞増殖を阻害し、それにより、ｐｒｅＱ１産生が制限される、工程を含む方法。
【請求項３３】
前記化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖が少なくとも１０％減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
被験体への前記化合物の投与によって、該化合物および前記細胞を接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体が細菌感染を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のｐｒｅＱ１を検出する方法であって、該方法は、
ａ．ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを該サンプルと接触させる工程、および
ｂ．該ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程であって、該ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用が該ｐｒｅＱ１の存在を示す、検出工程、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを標識する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって該遺伝子の該遺伝子発現を阻害する該化合物として同定された該化合物と細胞との接触によってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含む方法であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【請求項１】
コード領域に作動可能に連結されたｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、該リボスイッチが該ＲＮＡの発現を調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同である、構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチが２つ以上のアプタマードメインおよび１つの発現プラットフォームドメインを含み、少なくとも１つの該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
少なくとも２つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
天然に存在するｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの非天然誘導体である、リボスイッチ。
【請求項６】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項７】
前記リボスイッチが１つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含む、請求項６に記載のリボスイッチ。
【請求項８】
少なくとも２つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項７に記載のリボスイッチ。
【請求項９】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該トリガー分子によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成する、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項１０】
目的の化合物を検出する方法であって、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化され、該目的の化合物によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該サンプルが該目的の化合物を含む場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【請求項１１】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって該リボスイッチに連結したＲＮＡの発現が変化し、該発現の変化によってシグナルを生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナルが、前記リボスイッチに連結した前記ＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験する工程、
（ｂ）工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、該細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、阻害工程
を含む、方法。
【請求項１５】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを同定する方法であって、該方法が、
ｐｒｅＱ１の存在下および非存在下でのＲＮＡ分子のインライン自発切断（ｉｎ−ｌｉｎｅ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｌｅａｖａｇｅ）を評価する工程であって、該ＲＮＡ分子が該ｐｒｅＱ１によって調節される遺伝子によってコードされ、
該ＲＮＡ分子のインライン自発切断パターンの変化が該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを示す、工程
を含む、方法。
【請求項１６】
遺伝子発現を阻害する方法であって、
（ａ）化合物を細胞と接触させる工程を含み、
（ｂ）該化合物が式Ｉ：
【化１９】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体である）
の構造を有し、
該細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が、該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が遺伝子発現の阻害が必要であると同定されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が前記細菌細胞を死滅させるか前記細菌細胞の増殖を阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物および前記細胞が被験体への該化合物の投与によって接触する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が細菌感染を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物がバイオフィルム中の細菌増殖を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
ｐｒｅＱ１の産生方法であって、該方法は、
（ａ）該ｐｒｅＱ１を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、該変異細菌細胞が前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含み、該変異を持たない細胞と比較して、該変異が、該変異細菌細胞による該ｐｒｅＱ１産生を増加させる、培養工程、
（ｂ）該細胞培養物から該ｐｒｅＱ１を単離し、それにより、該ｐｒｅＱ１を産生する工程、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも１０％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも１０％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも２５％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異がノックアウト変異である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含む細菌細胞であって、該変異を持たない細胞と比較した場合に、該変異が、該変異を含む細胞によるｐｒｅＱ１産生を測定可能な程度に増加させる、細菌細胞。
【請求項３２】
細菌細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞をｐｒｅＱ１応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程であって、該細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって該細菌細胞増殖を阻害し、それにより、ｐｒｅＱ１産生が制限される、工程を含む方法。
【請求項３３】
前記化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖が少なくとも１０％減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
被験体への前記化合物の投与によって、該化合物および前記細胞を接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体が細菌感染を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のｐｒｅＱ１を検出する方法であって、該方法は、
ａ．ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを該サンプルと接触させる工程、および
ｂ．該ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程であって、該ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用が該ｐｒｅＱ１の存在を示す、検出工程、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを標識する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって該遺伝子の該遺伝子発現を阻害する該化合物として同定された該化合物と細胞との接触によってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含む方法であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５２１９７８（Ｐ２０１０−５２１９７８Ａ）
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５４７９２（Ｐ２００９−５５４７９２）
【出願日】平成２０年３月２４日（２００８．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８０５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６２２３
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（３９２０１９３５２）イェール ユニバーシティー (38)
【氏名又は名称原語表記】ＹＡＬＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２４日（２００８．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８０５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６２２３
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（３９２０１９３５２）イェール ユニバーシティー (38)
【氏名又は名称原語表記】ＹＡＬＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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