ＰＲＬＲの変化した発現に関連する癌における新規組成物および方法
【課題】癌腫（特に乳癌）を調節する組成物のスクリーニングの方法を提供すること。細胞（好ましくは乳癌細胞）の増殖を阻害する方法もまた、提供すること。癌腫を処置する方法（診断を含む）を提供すること。
【解決手段】特定の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。薬剤候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：ａ）該配列またはそのフラグメントからなる群より選択された核酸配列を含む、癌関連性（ＣＡ）遺伝子を発現する細胞を提供する工程；ｂ）薬剤候補を該細胞に添加する工程；およびｃ）該ＣＡ遺伝子の発現に対する該薬剤候補の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【解決手段】特定の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。薬剤候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：ａ）該配列またはそのフラグメントからなる群より選択された核酸配列を含む、癌関連性（ＣＡ）遺伝子を発現する細胞を提供する工程；ｂ）薬剤候補を該細胞に添加する工程；およびｃ）該ＣＡ遺伝子の発現に対する該薬剤候補の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第０９／７４７，３７７号（２０００年１２月２２日出願）お
よび同第０９／７９８，５８６号（２００１年３月２日出願）、ならびに同第１０／０５
２，４８２号（２００１年１１月８日出願）の継続出願であり、これら全ての出願は、本
明細書中に参考として明示的に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、癌（特に、乳癌を含む、癌腫）の診断および処置における使用のための新規
配列、ならびにスクリーニング方法における新規組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌遺伝子は、癌を生じさせ得る遺伝子である。発癌は、広範な種々の機構（細胞の、癌
遺伝子を含むウイルスによる感染、宿主ゲノムにおける癌原遺伝子の活性化、ならびに癌
原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変異を含む）によって、起こり得る。
【０００４】
動物の癌と同様、ヒト癌に関係することが公知である、多くのウイルスが存在する。こ
こで特に興味深いのは、それ自体に癌遺伝子を含まないウイルスである；これらは、遅性
トランスフォーミングレトロウイルス（ｓｌｏｗ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒｕｓ）である。これは、宿主ゲノム内への組込みおよび種々の方法（プロモータ
ー挿入、エンハンサー挿入、および／または癌原遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子の切断を
含む）で近隣の癌原遺伝子に影響することにより、腫瘍を誘導する。挿入部位またはその
近くにおける配列の分析は、多くの新たな癌原遺伝子の同定を導いた。
【０００５】
リンパ腫および白血病に関して、マウス白血病レトロウイルス（ＭｕＬＶ）（例えば、
ＳＬ３−３またはＡｋｖなど）は、感染しやすい新生児マウスに接種される場合か、また
は生殖系列内で運ばれる場合、腫瘍の強力な誘発因子である。多くの配列が、リンパ腫お
よび白血病の誘発において、挿入部位の分析により、関連する配列として同定されている
；以下を参照のこと：非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６；これらの全ては、本明細書中で参考として明示的に援用される。
【０００６】
乳癌は、女性に罹患する最も重大な疾患のうちの１つである。現在の割合では、米国人
女性が９５歳までに乳癌を発症する危険性は、８人に１人である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９２）。後の段階での乳癌の処置は、効果がなく効力
がない（ｄｉｓｆｉｇｕｒｉｎｇ）ことがしばしばであり、このことが、この疾患の医療
的管理において、早期検出を最優先にしている。
【０００７】
ＰＲＬＲは、プロラクチンレセプターである、ＰＲＬＲは、サイトカインクラス１レセ
プタースーパーファミリーとして公知であるより大きなファミリーのメンバーである。こ
のスーパーファミリーは、現在、２０個を超える種々のメンバーを有する。ＰＲＬＲは、
身体全体に広範に分布している。多数の疾患状態（種々の形態の癌の増殖および種々の自
己免疫疾患を含む）が、ＰＲＬの過剰生成に関連しているようである。ＰＲＬは、内分泌
様式、オートクライン様式、もしくはプロクライン様式でか、またはそのホルモンに対す
る感受性の増加を介して、作用し得る。
【０００８】
ＰＲＬの作用機構における第１段階は、細胞表面レセプターへの結合である。このＲＰ
ＬＲは、内因性チロシンキナーゼ細胞質ドメインを含まないが、細胞質チロシンキナーゼ
であるＪＡＫ２と結合する。このレセプターの二量体化は、ＪＡＫキナーゼのチロシンリ
ン酸化および活性化、その後のこのレセプターのリン酸化を誘導する。Ｓｒｃファミリー
の他のレセプター関連キナーゼもまた、ＰＲＬにより活性化されることが示されている。
あるシグナル伝達経路は、細胞質Ｓｔａｔタンパク質のリン酸化を含む。この細胞質Ｓｔ
ａｔタンパク質は、それら自体が二量体化して核にトランスロケートし、ＰＲＬ応答性遺
伝子上の特定のプロモーターエレメントに結合する。さらに、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキ
ナーゼ経路もまた、ＰＲＬにより活性化され、そしてそのモルモンの増殖効果に関与し得
る。
【０００９】
従って、癌（特に発癌および乳癌）に関係する配列を提供することが、本発明の目的で
ある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）７４：２１６１
【非特許文献２】Ｈａｎｓｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０００）１０（２）：２３７−４３
【非特許文献３】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０：４０６３
【非特許文献４】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）６７：７１１８
【非特許文献５】Ｊｏｏｓｔｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）２６８：３０８
【非特許文献６】Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２３：３４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
上で概略を述べた目的に従い、本発明は、癌腫（特に乳癌）を調節する組成物のスクリ
ーニングの方法を提供する。本明細書中で、細胞（好ましくは乳癌細胞）の増殖を阻害す
る方法もまた、提供される。癌腫を処置する方法（診断を含む）もまた、本明細書中で提
供される。
【００１２】
一局面において、薬物候補をスクリーニングする方法は、ＰＲＬＲのような癌腫関連遺
伝子（ＣＡ遺伝子）またはそのフラグメントを発現する細胞を提供する工程を包含する。
ＣＡ遺伝子の好ましい実施形態は、癌細胞（好ましくはリンパ細胞、乳房細胞、前立腺細
胞または上皮細胞）において、他の細胞と比較して差次的に発現される遺伝子である。本
明細書中の方法において使用されるＣＡ遺伝子の好ましい実施形態としては、表１から選
択される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、細胞へ薬物候補を添
加する工程、およびＣＡ遺伝子の発現に対する薬物候補の効果を決定する工程を、さらに
包含する。
【００１３】
一実施形態において、薬物候補をスクリーニングする方法は、薬物候補の非存在下にお
ける発現のレベルを、薬物候補の存在における発現のレベルと比較する工程を包含する。
【００１４】
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）に結合し得る生物活性薬剤をスクリーニングする方法もまた
、本明細書中で提供され、この方法は、ＣＡＰと候補生物活性薬剤とを合わせる工程、お
よび候補薬剤のＣＡＰへの結合を決定する工程を包含する。
【００１５】
ＣＡＰの活性を調節し得る生物活性薬剤をスクリーニングする方法が、本明細書中でさ
らに提供される。一実施形態において、この方法は、ＣＡＰと候補生物活性薬剤とを合わ
せる工程、およびＣＡＰの生物活性に対する薬物候補の効果を決定する工程を、包含する
。
【００１６】
患者に薬物を投与する工程、および患者から細胞サンプルを採取する工程を包含する、
候補癌腫薬物の効果を評価する方法もまた、提供される。細胞の発現プロファイルが、次
いで、決定される。この方法は、患者の発現プロファイルを、健常な個体の発現プロファ
イルと比較する工程を、さらに包含し得る。
【００１７】
さらなる局面において、ＣＡタンパク質の活性を阻害する方法が、提供される。一実施
形態において、この方法は、表１において概略を示される配列またはその相補体からなる
群から好ましくは選択されるＣＡタンパク質の阻害剤を、患者に投与する工程を包含する
。
【００１８】
ＣＡタンパク質（好ましくは表１において概略を示される配列の群から選択される核酸
にコードされるタンパク質）の効果を中和する方法もまた、提供される。好ましくは、こ
の方法は、上述のタンパク質に特異的な薬剤を、中和をもたらすのに充分な量で、上述の
タンパク質に接触させる工程を包含する。
【００１９】
その上、ＣＡタンパク質をコードする核酸セグメント（好ましくは表１において概略を
示される配列から選択される）を含むバイオチップが、本明細書中で提供される。
【００２０】
癌腫（特に乳癌）に対する素因（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を、ある個体の少なくとも１
つの癌腫または乳癌の遺伝子を配列決定することにより、診断または決定する方法もまた
、本明細書中で提供される。本発明のさらに別の局面において、癌腫（個体における乳癌
の遺伝子コピー数を含む）を決定する方法が、提供される。
【００２１】
新規配列もまた、本明細書中で提供される。本発明の他の局面は、本発明の以下の説明
によって、当業者にとって明確である。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
表１に概説された配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。
・（項目２）
項目１に記載の組換え核酸を含む、宿主細胞。
・（項目３）
項目２に記載の組換え核酸を含む、発現ベクター。
・（項目４）
項目３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
・（項目５）
表１に概説された配列からなる群から選択された配列を含む核酸配列によりコードされた
アミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
・（項目６）
薬剤候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）表１に概説された配列またはそのフラグメントからなる群より選択された核酸配列
を含む、癌関連性（ＣＡ）遺伝子を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）薬剤候補を該細胞に添加する工程；および
ｃ）該ＣＡ遺伝子の発現に対する該薬剤候補の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目７）
前記決定する工程は、前記薬剤候補の非存在下における発現レベルと、該薬剤候補の存在
下における発現レベルとを比較する工程を包含する、項目６に記載の方法。
・（項目８）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）に結合し得る生物活性因子をスクリーニングする方法であって
、該ＣＡＰは、表１に概説された配列からなる群より選択された核酸配列を含む核酸によ
りコードされ、該方法は、以下：
ａ）該ＣＡＰと候補生物活性因子とを合わせる工程；および
ｂ）該候補因子と該ＣＡＰとの結合を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目９）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の活性を調節し得る生物活性因子をスクリーニングする方法で
あって、該ＣＡＰは、表１に概説された配列からなる群から選択された核酸配列を含む核
酸によりコードされ、該方法は、以下：
ａ）該ＣＡＰと候補生物活性因子とを合わせる工程；および
ｂ）該ＣＡＰの該生物活性に対する該候補因子の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目１０）
候補癌薬剤の効果を評価する方法であって、該方法は、以下：
ａ）患者に該薬剤を投与する工程；
ｂ）該患者から細胞サンプルを取り出す工程；および
ｃ）表１に概説された前記配列からなる群より選択された核酸配列を含む遺伝子の、発
現または活性の変化を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目１１）
癌腫を診断する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第１の個体の第１の組織型における、表１に概説された配列からなる群より選択さ
れた核酸配列を含む一つ以上の遺伝子の発現を決定する工程；および
ｂ）該遺伝子の発現と、該第１の個体または第２の罹患していない個体に由来する第２
の正常な組織型とを比較する工程；
を包含し、
該発現の相違は、該第１の個体が癌腫を有することを表す、方法。
・（項目１２）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の活性を阻害する方法であって、該ＣＡＰは、表１に概説され
た配列からなる群より選択された核酸配列を含む核酸によりコードされ、該方法は、阻害
因子を該ＣＡＰに結合させる工程を包含する、方法。
・（項目１３）
癌腫を処置する方法であって、該方法は、ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の阻害因子を患者に
投与することを包含し、該ＣＡＰは、表１に概説された配列からなる群から選択された核
酸配列を含む核酸によってコードされる、方法。
・（項目１４）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の効果を中和する方法であって、該ＣＡＰは、表１に概説され
た配列からなる群から選択された核酸配列を含む核酸によりコードされ、該方法は、中和
をもたらすのに十分な量で該ＣＡＰタンパク質と該ＣＡＰタンパク質に特異的な因子とを
接触させる工程を包含する、方法。
・（項目１５）
表１に概説された配列からなる群から選択された核酸配列を含む核酸によりコードされた
タンパク質と特異的に結合する、ポリペプチド。
・（項目１６）
表１に概説された配列からなる群より選択された核酸配列を含む核酸によりコードされた
タンパク質と特異的に結合する抗体を含む、項目１５に記載のポリペプチド。
・（項目１７）
表１に概説された配列またはそれらのフラグメントの核酸からなる群より選択される一つ
以上の核酸セグメントを含む、バイオチップ。
・（項目１８）
個体の少なくとも一つのＣＡ遺伝子を配列決定することにより、癌腫または癌腫になる傾
向を診断する方法。
・（項目１９）
ＣＡ遺伝子コピー数を決定する方法であって、該方法は、ハイブリダイゼーションに適し
た条件下で、個体に由来するゲノムＤＮＡサンプルにＣＡ遺伝子プローブを添加する工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、正常組織における発現と比較した、乳癌組織におけるＰＲＬＲのｍＲＮＡ発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常組織である。バーは、平均発現レベルを示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、癌腫（特にリンパ腫、乳癌または前立腺癌）に関連する多くの配列に関連す
る。クローン的に組み込まれたプロウイルス（ｃｌｏｎａｌｌｙ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｐｒｏｖｉｒｕｓ）と癌原遺伝子との間の比較的緊密な連結は、「プロウイルスタギン
グ（ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｔａｇｇｉｎｇ）」を形成し、ここで、挿入変異メカニズム（ｉ
ｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）により作用する遅性トラン
スフォーミングレトロウイルスが、癌原遺伝子を単離するために使用される。いくつかの
モデルにおいて、非感染動物は、低い癌比率を有し、そして感染動物は、高い癌比率を有
する。関係するレトロウイルスの多くは、形質導入された宿主癌原遺伝子も病原性トラン
ス作用性（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）ウイルス遺伝子も持たないため、癌発生率は、宿
主癌原遺伝子に影響を及ぼすプロウイルスの組み込みの直接的な結果であるに違いないこ
とは、公知である。プロウイルスの組み込みはランダムであるため、極少数の組み込み体
（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）しか、選択的増殖有利性を提供する宿主癌原細胞を「活性化」し
ない。この稀な出来事は、腫瘍においてクローン化学量論で新しいプロウイルスを生じる
。
【００２４】
腫瘍形成レトロウイルス（宿主生物のゲノムにその配列が挿入されて癌腫を生じる）の
使用によって、癌腫に関係する宿主配列が、同定される。これらの配列は、次いで、多く
の異なった方法（診断、予後、調節因子（アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む
）のスクリーニング、抗体産生（免疫療法および画像化のため）、などが挙げられる）に
おいて、使用され得る。しかし、当業者に理解されるように、１種類の癌（乳癌など）に
おいて同定される癌遺伝子は、同様に、他の種類の癌に関わる可能性が強い。従って、本
明細書中で概略が示される配列は、最初に、乳癌と相関すると同定されるが、以下で概略
を示されるように、他の種類の癌においてもまた、見出され得る。
【００２５】
従って、本発明は、癌腫に関連する核酸およびタンパク質の配列（本明細書中で「癌腫
関連」配列または「ＣＡ」配列と名付ける）を、提供する。好ましい実施形態において、
本発明は、乳癌組織を起源とする癌腫に関連する核酸およびタンパク質の配列（「乳癌関
連」配列または「ＢＡ」配列として公知である）を、提供する。
【００２６】
本発明の方法を使用して診断され得るか、またはスクリーニングされ得る適切な癌とし
ては、部位によってかまたは組織学的型によって分類される、癌が挙げられる。部位によ
って分類される癌としては、以下が挙げられる：口腔および咽頭（唇、舌、唾液腺、口の
床、歯肉および他の口腔、鼻咽頭、扁桃、口腔咽頭部、下咽頭、他の口／他の咽頭）の癌
；消化系（食道；胃；小腸；結腸および直腸；肛門、肛門管、および肛門直腸；肝臓；肝
臓内胆汁管；胆嚢；他の胆管；膵臓；腹膜後腔；腹膜、網、および腸間膜、他の消化系）
の癌；呼吸系（鼻腔、中耳、および洞；喉頭；肺および気管支；胸膜；気管；縦隔；なら
びに他の呼吸系）の癌；中皮腫；骨および関節の癌；および軟組織（心臓を含む）の癌；
皮膚癌（黒色腫および他の非上皮性皮膚癌を含む）；カポージ肉腫および乳癌；女性生殖
系（子宮頸；子宮体；子宮（ｎｏｓ）；卵巣；膣；外陰；および他の女性生殖器）の癌；
男性生殖系（前立腺；精巣；陰茎；および他の男性生殖器）の癌；泌尿系（膀胱；腎臓お
よび腎盤；尿管；および他の泌尿器）の癌；眼および眼窩の癌；脳および神経系（脳；お
よび他の神経系）の癌；内分泌系（甲状腺、および胸腺を含む他の内分泌腺）の癌；リン
パ腫の癌（ホジキン病リンパ腫および非ホジキン性リンパ腫）、多発性骨髄腫、ならびに
白血病（リンパ性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；および他の白血病）。
【００２７】
本発明の配列に関連し得る他の癌（組織学的型によって分類される）としては、以下が
挙げられるが、これらに限定はされない：新生物（悪性）；癌腫（ＮＯＳ）；癌腫（未分
化、ＮＯＳ）；巨細胞癌腫および紡錘体細胞癌；小細胞癌（ＮＯＳ）；乳頭状癌（ＮＯＳ
）；扁平上皮癌（ＮＯＳ）；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌（ＮＯＳ）；毛質癌腫；移行上
皮癌（ＮＯＳ）；乳頭状移行上皮癌；腺癌（ＮＯＳ）；ガストリノーマ（悪性）；胆管癌
；肝細胞癌（ＮＯＳ）；肝細胞癌および胆管癌の複合；メルケル細胞腺腫；腺様嚢胞癌；
腺腫様ポリープにおける腺癌；腺癌（大腸家族性ポリポシス）；固形癌腫（ＮＯＳ）；カ
ルチノイド腫瘍（悪性）；気管支槽腺癌；乳頭状腺癌（ＮＯＳ）；色素嫌性癌腫；好酸性
（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉ）癌腫；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｃ）腺癌；好塩基性癌腫；明細
胞腺癌（ＮＯＳ）；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状かつ濾胞状の腺癌；非
被包硬化癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；脂腺腺癌；
耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状漿液
嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤腺管癌；髄様癌（
ＮＯＳ）；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット疾患（乳房）；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌
；扁平化生を伴う腺癌；胸腺腫（悪性）；卵巣間質腫瘍（悪性）；莢膜腫（悪性）；顆粒
膜細胞腫（悪性）；男性ホルモン産生細胞腫（悪性）；セルトーリ細胞癌腫；ライディッ
ヒ細胞腫（悪性）；脂質細胞腫瘍（悪性）；パラガングリオーマ（悪性）；乳房外パラガ
ングリオーマ（悪性）；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫（ＮＯＳ）；メラニ
ン欠乏症黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒
色腫；青色母斑（悪性）；肉腫（ＮＯＳ）；線維肉腫（ＮＯＳ）；線維性組織球腫（悪性
）；粘液肉腫；脂肪肉腫（ＮＯＳ）；平滑筋肉腫（ＮＯＳ）；横紋筋肉腫（ＮＯＳ）；胎
児性横紋筋肉腫；槽横紋筋肉腫；間質肉腫（ＮＯＳ）；複合腫瘍（悪性、ＮＯＳ）；ミュ
ラー複合腫瘍；腎臓芽細胞腫；肝臓芽細胞腫；癌肉腫（ＮＯＳ）；間葉腫（悪性）；ブレ
ンナー腫（悪性）；葉状腫瘍（悪性）；滑膜肉腫（ＮＯＳ）；中皮腫（悪性）；未分化胚
細胞腫；胎生期癌（ＮＯＳ）；奇形腫（悪性、ＮＯＳ）；卵巣甲状腺腫（悪性）；絨毛癌
；中腎腫（悪性）；血管肉腫；血管内皮腫（悪性）；カポージ肉腫；血管周囲細胞腫（悪
性）；リンパ管肉腫；骨肉腫（ＮＯＳ）；皮質近接部骨肉腫；軟骨肉腫（ＮＯＳ）；軟骨
芽細胞腫（悪性）；間葉軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍（悪性）；
エナメル上皮歯原性肉腫；エナメル上皮腫（悪性）；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫（
悪性）；脊索腫；神経膠腫（悪性）；上衣腫（ＮＯＳ）；星状細胞腫（ＮＯＳ）；原型質
性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫（ＮＯＳ）；希突起膠腫（
ＮＯＳ）；希突起膠細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫（ＮＯＳ）；神経節芽細
胞腫；神経芽細胞腫（ＮＯＳ）；網膜芽腫（ＮＯＳ）；嗅神経神経原性腫瘍；髄膜腫（悪
性）；神経線維肉腫；神経鞘腫（悪性）；顆粒細胞腫瘍（悪性）；悪性リンパ腫（ＮＯＳ
）；ホジキン病（ＮＯＳ）；ホジキン性病側肉芽種（ＮＯＳ）；悪性リンパ腫（小リンパ
球性）；悪性リンパ腫（大細胞、散在性）；悪性リンパ腫（濾胞状、ＮＯＳ）；菌状息肉
腫；他の特定の非ホジキン性リンパ腫；悪性組織球増殖；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；
免疫増殖性小腸疾患；白血病（ＮＯＳ）；リンパ性白血病（ＮＯＳ）；形質細胞性白血病
；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病（ＮＯＳ）；好塩基球性白血病；好酸
球性白血病；単球性白血病（ＮＯＳ）；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉
腫；およびヘアリーセル白血病。
【００２８】
さらに、このＣＡ遺伝子は、加齢に関連する疾患または神経変性疾患などの他の疾患（
しかしこれらに限定はされない）に関与し得る。
【００２９】
この文脈において、「関連」とは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が、癌腫に
おいて、正常な細胞と比較して差次的に発現されるか、活性化されるか、不活化されるか
または改変されるかのいずれかであることを意味する。以下で概略を示すように、ＣＡ配
列としては、癌腫において、アップレギュレーションされる（すなわち、より高レベルで
発現する）配列、ならびにダウンレギュレーションされる（すなわち、より低レベルで発
現する）配列が、挙げられる。ＣＡ配列としてはまた、改変された配列（すなわち、切断
された配列、または置換、欠失、もしくは挿入（点変異を含む）を有する配列）もまた挙
げられ、同じ発現プロファイルまたは改変されたプロファイルのどちらかを示す。好まし
い実施形態において、ＣＡ配列は、ヒト由来である；しかし、当業者によって理解される
ように、他の生物由来のＣＡ配列は、疾患の動物モデルおよび薬物評価の動物モデルにお
いて、有用であり得る。従って、他のＣＡ配列は、哺乳類（げっ歯類（ラット、マウス、
ハムスター、モルモット、など）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、な
どが挙げられる）を含む）を含む、脊椎動物から、提供される。いくつかの場合において
、原核生物のＣＡ配列は、有用であり得る。他の生物由来のＣＡ配列は、以下で概要を示
す技術を使用して、得られ得る。
【００３０】
ＣＡ配列は、核酸配列とアミノ酸配列との両方を含み得る。好ましい実施形態において
、ＣＡ配列は、組換え核酸である。本明細書中の用語「組換え核酸」によって、一般的に
ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、本来はインビトロで、
自然界で普通には見出されない形態に形成される核酸が、意味される。従って、直鎖形態
で単離された核酸、または普通は結合していないＤＮＡ分子の連結によってインビトロで
形成された発現ベクターは、両方とも、本発明の目的のための組換え体と考えられる。一
旦、組換え核酸が作られ、そして宿主細胞または宿主生物に再導入されれば、組換え核酸
は、非組換え的に（すなわち、インビトロ操作よりむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を
使用して）複製することが、理解される；しかし、このような核酸は、一旦組換え的に生
産されれば、その後、実質的に非組換え的に複製されても、やはり、本発明の目的のため
には組換え体と考えられる。
【００３１】
同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して（すなわち、上で示されるよ
うな組換え核酸の発現を通して）作られる、タンパク質である。組換えタンパク質は、少
なくとも１つ以上の特徴により、天然に存在するタンパク質から区別される。例えば、タ
ンパク質は、通常は野生型の宿主において会合しているタンパク質および化合物のいくら
かのまたは全てから、単離され得るか、または精製され得、従って、実質的に純粋であり
得る。例えば、単離されたタンパク質は、通常は天然の状態において会合している物質の
少なくともいくつかを付随しない（与えられたサンプルの総タンパク質重量に対し、好ま
しくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する）。
実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量に対し少なくとも約７５重量％（好まし
くは少なくとも約８０重量％、そして特に好ましくは少なくとも約９０重量％）を構成す
る。この定義は、異なった生物または宿主細胞における、ある生物由来のＣＡタンパク質
の産生を含む。あるいは、このタンパク質は、タンパク質が増加した濃度レベルで生成さ
れるような、誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通して、通常に見られ
るより有意により高い濃度において、生成され得る。あるいは、このタンパク質は、自然
界で通常に見出されない形態（以下に考察されるような、エピトープタグの付加またはア
ミノ酸の置換、挿入および欠失のような）であり得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、核酸である。当業者に理解されるように、そ
して以下により完全に概略が示されるように、ＣＡ配列は、種々の適用において有用であ
る。ここで適用としては、診断の適用（天然に存在する核酸を検出する）ならびにスクリ
ーニングの適用が挙げられる；例えば、ＣＡ配列に対する核酸プローブを含むバイオチッ
プが、生産され得る。最も広い意味においては、本明細書中の「核酸」もしくは「オリゴ
ヌクレオチド」または文法的同義語は、互いに共有結合する少なくとも２つのヌクレオチ
ドを、意味する。本発明の核酸は、一般にはリン酸ジエステル結合を含むが、以下で概略
を示されるようないくつかの場合（例えば、アンチセンス適用または候補薬剤が核酸であ
る場合）において、代替の骨格（例えば、以下が挙げられる：ホスホロアミデート（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（
１０）：１９２５（１９９３）およびこの中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１
９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１
９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１
９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジ
チオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９）
、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、ならびにペプチド核酸の骨格お
よび結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）
；Ｍｅｉｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎ
ｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３８０：２０７（１９９６）（全ては参考として援用される）を含む）を有す
る核酸アナログが、使用され得る。他のアナログ核酸としては、陽性の骨格（Ｄｅｎｐｃ
ｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７（１９９５））
；非イオン化骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第
５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋ
ｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０
：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：
４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１９９４）；第２章および第３章，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ
およびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０
３３号および第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章，ＡＳＣ Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉお
よびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編）に記載されるものを含む）を有する、アナログ核酸が挙げ
られる。１つ以上の炭素環状糖を含む核酸もまた、１つの核酸の定義（Ｊｅｎｋｉｎｓら
，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７６）の範囲内に、含まれる
。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ ６月２日（１９９７
）３５頁において、記載される。これらの参考文献の全ては、ここで、明示的に参考とし
て援用される。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は、種々の理由のため（例えば、ア
ンチセンス適用における使用またはバイオチップ上のプローブとしての使用についての生
理学的環境における、このような分子の安定性および半減期を増加させるため）に、なさ
れ得る。
【００３３】
当業者に理解されるように、これらの核酸アナログの全ては、本発明における用途を見
出し得る。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物も、生成され得る；あるい
は、異なった核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸とアナログとの混合物が
、生成され得る。
【００３４】
核酸は、特定されるように、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖配列もし
くは一本鎖配列の両方の部分を含み得る。当業者に理解されるように、一本鎖「ワトソン
」の描写はまた、もう一方の鎖「クリック」の配列を定義する；従って、本明細書中で記
載される配列はまた、この配列の相補鎖を含む。核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤ
ＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッド（核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニ
ン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどが挙げら
れる塩基の任意の組合せを含む）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレ
オシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびにヌクレオチドアナログ、ならびに
改変されたヌクレオシド（アミノ改変されたヌクレオシドなど）を含む。さらに、「ヌク
レオシド」は、天然に存在しないアナログ構造を含む。従って、例えば、ペプチド核酸の
個々のユニット（それぞれ塩基を含む）は、本明細書中でヌクレオシドと呼ばれる。
【００３５】
ＣＡ配列は、本明細書中で概略を示されるＣＡ配列に対する実質的な核酸および／また
はアミノ酸の配列相同性により、最初に同定され得る。このような相同性は、核酸または
アミノ酸の配列全体に基づき得、一般に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーショ
ン条件のどちらかを使用して、以下で概略を示したように、決定される。
【００３６】
本発明のＣＡ配列は、本明細書中で記載されるように、最初に同定され得る；本来、マ
ウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）によるマウスの感染は、リンパ腫を生じさせる。配列を乳
癌細胞サンプルにおける遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）の発現レベルを決定すること
によって引き続き検証した。
【００３７】
本明細書中で概略を示されるＣＡ配列は、ウイルスの挿入部位を含む。一般に、レトロ
ウイルスは、３つの基本的な方法で、癌腫を引き起こし得る：まず、通常はサイレントな
宿主遺伝子の上流への挿入およびその活性化（例えば、プロモーター挿入）による方法；
第二に、腫瘍形成を導く宿主遺伝子の切断による方法；または隣接遺伝子の転写の増大に
よる方法。例えば、レトロウイルスエンハンサー（ＳＬ３−３を含む）は、挿入部位のお
よそ２００キロベースまで、遺伝子に対して作用することが、公知である。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、癌腫においてアップレギュレーションされる
ＣＡ配列である；つまり、癌腫組織において（同じ分化段階の正常組織と比較して）、こ
れらの遺伝子の発現は、より強い。「アップレギュレーション」は、本明細書中で使用さ
れる場合、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは
少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％を意味し、３００％から少
なくとも１０００％が特に好ましい。
【００３９】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、癌腫においてダウンレギュレーションされる
ＣＡ配列である；つまり、癌腫組織において（同じ分化段階の正常組織と比較して）、こ
れらの遺伝子の発現は、より弱い。「ダウンレギュレーション」は、本明細書中で使用さ
れる場合、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは
少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％を意味し、３００％から少
なくとも１０００％が特に好ましい。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、改変されたＣＡ配列であるが、この改変ＣＡ
配列は、同じ分化段階の正常リンパ組織と比較して、同じ発現プロファイルを示すか、ま
たは改変されたプロファイルを示す。「改変ＣＡ配列」は、本明細書中で使用される場合
、短縮された配列、挿入を含む配列、または点変異を含む配列をいう。
【００４１】
本発明のＣＡタンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパ
ク質として分類され得る。
【００４２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、細胞内タンパク質である。細胞内タン
パク質は、細胞質および／または核において見出され得る。細胞内タンパク質は、細胞機
能および複製（例えば、シグナル伝達経路が挙げられる）の全ての局面に関与する；この
ようなタンパク質の異常な発現は、無制御または非制御の細胞プロセスを生じさせる。例
えば、多くの細胞内タンパク質は、酵素的活性（例えば、プロテインキナーゼ活性、タン
パク質ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラ
ーゼ活性など）を有する。細胞内タンパク質はまた、ドッキングタンパク質（タンパク質
の複合体を組織することまたは種々の亜細胞位置へとタンパク質を標的化することに関与
する）として働き、そしてオルガネラの構造的完全性を維持することに関与する。
【００４３】
細胞内タンパク質の特徴付けにおいてますます理解される概念は、規定された機能の原
因とされている、１つ以上のモチーフがそのタンパク質において存在することである。タ
ンパク質の酵素的ドメインにおいて見出される高度に保存された配列に加えて、タンパク
質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質において、高度に保存された配列が、同定
されている。例えば、Ｓｒｃ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２（ＳＨ２）ドメインは、チロシンリ
ン酸化標的を、配列依存的様式において結合する。ＳＨ２ドメインとは異なったＰＴＢド
メインもまた、チロシンリン酸化標的を結合する。ＳＨ３ドメインは、高プロリン標的に
結合する。さらに、ごくわずかに挙げると、ＰＨドメイン、テトラトリコペプチド反復お
よびＷＤドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが示されている。
これらのいくつかはまた、リン脂質または他のセカンドメッセンジャーとの結合に、関与
し得る。当業者に理解されるように、これらのモチーフは、一次配列に基づいて、同定さ
れ得る；従って、タンパク質の配列の分析は、分子の酵素的可能性および／またはそのタ
ンパク質が結合し得る分子の両方への洞察を、提供し得る。
【００４４】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質
は、細胞のリン脂質二重層にまたがる分子である。これらは細胞内ドメイン、細胞外ドメ
イン、または両方を有し得る。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内タンパ
ク質について既に記載された機能を含む多くの機能を、有し得る。例えば、細胞内ドメイ
ンは、酵素的活性を有し得、かつ／またはさらなるタンパク質の結合部位として働き得る
。膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは、両役割を果たすことが多い。例えば、特定のレ
セプターチロシンキナーゼは、プロテインキナーゼ活性およびＳＨ２ドメインの両方を有
する。その上、レセプター分子自体におけるチロシンの自己リン酸化は、さらなるＳＨ２
ドメイン含有タンパク質に対する結合部位を作り出す。
【００４５】
膜貫通タンパク質は、１個〜多数の膜貫通ドメインを含み得る。例えば、レセプターチ
ロシンキナーゼ、特定のサイトカインレセプター、レセプターグアニリルシクラーゼおよ
びレセプターセリン／トレオニンプロテインキナーゼは、１つの膜貫通ドメインを含む。
しかし、チャネルおよびアデニリルシクラーゼを含む種々の他のタンパク質は、多くの膜
貫通ドメインを含む。多くの重要な細胞表面レセプターは、７つの膜にまたがる領域を含
むため、「７回膜貫通ドメイン」タンパク質として分類される。重要な膜貫通タンパク質
レセプターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：インスリンレセプ
ター、インスリン様成長因子レセプター、ヒト成長ホルモンレセプター、グルコーストラ
ンスポーター、トランスフェリンレセプター、上皮成長因子レセプター、低密度リポタン
パク質レセプター、上皮成長因子レセプター、レプチンレセプター、インターロイキンレ
セプター（例えば、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−２レセプターなど）。
【００４６】
膜貫通ドメインの特徴としては、その後に荷電アミノ酸が続き得るおよそ２０個連続す
る疎水アミノ酸を含む。従って、特定のタンパク質のアミノ酸配列の分析において、タン
パク質内における膜貫通ドメインの位置決定および数は、予測され得る。
【００４７】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、様々である；しかし、保存されたモチーフは、
種々の細胞外ドメインの間で、くり返し見出される。保存的な構造および／または機能は
、異なった細胞外モチーフに帰せられている。例えば、サイトカインレセプターは、シス
テインクラスターおよびＷＳＸＷＳ（Ｗ＝トリプトファン、Ｓ＝セリン、Ｘ＝任意のアミ
ノ酸）（配列番号７）モチーフによって特徴付けられる。免疫グロブリン様ドメインは、
高度に保存的である。ムチン様ドメインは、細胞接着に関与し得、そして高ロイシン反復
は、タンパク質−タンパク質相互作用に関連し得る。
【００４８】
多くの細胞外ドメインは、他の分子への結合に関与する。一局面において、細胞外ドメ
インは、レセプターである。レセプタードメインを結合する因子は、循環型リガンド（ペ
プチド、タンパク質、またはアデノシンのような低分子などであり得る）を含む。例えば
、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦなど）は、同族のレセプターに結合して種々
の細胞応答を開始する、循環型成長因子である。他の因子としては、サイトカイン、マイ
トジェン因子、神経栄養因子などが挙げられる。細胞外ドメインは、細胞結合分子にもま
た、結合する。この点において、細胞外ドメインは、細胞間相互作用を媒介する。細胞結
合リガンドは、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによ
り細胞に係留され得るか、または、それ自体が膜貫通タンパク質であり得る。細胞外ドメ
インは、細胞外マトリックスにもまた結合し、細胞構造の保持に貢献する。
【００４９】
本発明において、膜貫通のＣＡタンパク質が、特に好ましい。なぜなら、膜貫通ＣＡタ
ンパク質は、本明細書中で記載されるように、免疫療法の良い標的であるからである。さ
らに、以下で概略を示されるように、膜貫通タンパク質はまたは、画像化様式において、
有用であり得る。
【００５０】
膜貫通タンパク質は、（例えば、組換え方法を介する）膜貫通配列の除去により、可溶
性にされ得ることもまた、当業者に理解される。さらに、可溶性にされている膜貫通タン
パク質は、適切なシグナル配列の付加により、組換え手法を通して生成され得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、分泌タンパク質である；その分泌は、
構成的分泌または制御される分泌の、どちらかであり得る。これらのタンパク質は、分泌
経路へその分子を標的化する、シグナルペプチドまたはシグナル配列を有する。分泌タン
パク質は、多くの生理学的事象に関する；その循環する性質のために、分泌タンパク質は
、種々の他の細胞型に、シグナルを伝達するために働く。分泌タンパク質は、オートクラ
イン様式（因子を分泌した細胞に対して作用する）、パラクライン様式（因子を分泌した
細胞に近い細胞に対して作用する）またはエンドクライン様式（遠くの細胞で作用する）
で、機能し得る。従って分泌分子は、多くの生理学の局面の調節または改変において、用
途を見出す。分泌タンパク質であるＣＡタンパク質が、診断マーカーに対する良い標的と
して働く（例えば、血液検査のため）ので、本発明において特に好ましい
ＣＡ配列は、本明細書中で概略を示されるＣＡ配列に対する実質的な核酸および／また
はアミノ酸の配列相同性により、最初に同定される。このような相同性は、核酸またはア
ミノ酸の配列全体に基づき得、一般に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション
条件のどちらかを使用して、以下で概略を示したように、決定される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、この核酸配列と表１の核酸の１つとの全体的相同性が、
好ましくは約７５％より高く、より好ましくは約８０％より高く、さらにより好ましくは
約８５％より高く、そして最も好ましくは約９０％より高い場合、核酸は「ＣＡ核酸」で
ある。いくつかの実施形態において、相同性は、約９３％から９５％または９８％までと
同じくらいの高さである。好ましい実施形態において、配列の同一性または類似性を決定
するために使用される配列は、表１の核酸配列から選択される。別の実施形態において、
この配列は、表１の核酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体である。別の実施形態に
おいて、この配列は、本明細書中でさらに記載される配列改変体である。
【００５３】
この文脈における相同性は、配列類似性または配列同一性を意味する（同一性が好まし
い）。相同性の目的のために好ましい比較は、配列決定エラーを含む配列を正しい配列に
対して比較することである。この相同性は、当該分野に公知である標準的技術を使用して
決定される。この標準的技術としては以下が挙げられるが、これらに限定はされない：局
所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔ
ｈ．２：４８２（１９８１））、相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａ
ｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））、類似性探
索法（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８
８））、これらのアルゴリズムの電算化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およ
びＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム（Ｄｅ
ｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）に記
載）（好ましくはデフォルト設定を使用する）、または検査。
【００５４】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連配列の群か
ら、進行的対合（ｐａｉｒｗｉｓｅ）アラインメントを使用して、多重配列アラインメン
トを生成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントの生成に使用されるクラスター関係（ｃ
ｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を示すツリー（ｔｒｅｅ）もまた、プ
ロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、進行的アラインメント法（Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７））の単純化を使用し
た。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３
（１９８９）に記載される方法と類似である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、
デフォルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）３．００、デフォル
トギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）０．１０、
および重み付けエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）が挙げられる。
【００５５】
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら
，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら，
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）において記載）。特に有用な
ＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら
，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）
；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌから得られた）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、い
くつかの探索パラメータを使用する。パラメータの殆どは、デフォルト値に設定される。
調節性パラメータは、以下の値と共に設定される：重複範囲（ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ
）＝１、重複画分（ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、ワード閾値（ｗ
ｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳパラメータおよびＨＳＰ Ｓ２
パラメータは、動値（ｄｙｎａｍｉｃ ｖａｌｕｅ）であり、そして特定の配列の組成、
および目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自体に
よって確立される；しかし、この値は、感度を上げるために調節され得る。アミノ酸配列
同一性％値は、整列された領域の「長い方の」配列の残基の総数によって除算された一致
する同一残基の数によって決定される。「長い方の」配列は、整列された領域において最
も多くの実際の残基を有する配列である（ＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により、アラインメント
スコアを最大にするために導入されるギャップは無視される）。
【００５６】
従って、「核酸配列同一性百分率（％）」は、表１の核酸のヌクレオチド残基と同一で
ある候補配列におけるヌクレオチド残基の百分率として、定義される。好ましい方法は、
デフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを、
重複範囲および重複画分（それぞれ１および０．１２５に設定される）と共に利用する。
【００５７】
アラインメントは、整列される配列におけるギャップの導入を含み得る。さらに、表１
の核酸のヌクレオチドより多いかより少ないかどちらかのヌクレオチドを含む配列につい
て、相同性の百分率は、相同なヌクレオチドの数に基づいて（ヌクレオチドの総数と関係
して）決定されることが理解される。従って、例えば、本明細書中で同定され以下で議論
される配列より短い配列の相同性は、短い方の配列におけるヌクレオシドの数を使用して
、決定される。
【００５８】
一実施形態において、核酸の相同性は、ハイブリダイゼーション研究を通して決定され
る。従って、例えば、図面において同定される核酸またはその相補鎖に、高ストリンジェ
ンシー下でハイブリダイズする核酸は、ＣＡ配列と考えられる。高ストリンジェンシー条
件は、当該分野に公知である；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９
８９およびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編を参照のこと。これらは両方、本明細書において参考として援用
される。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なった環境において異なる。よ
り長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイ
ゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ
ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓ
ｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）におい
て見出される。一般に、ストリンジェント条件は、規定されるイオン化強度ｐＨにおいて
、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように、選択される。Ｔｍは
、（規定されるイオン化強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０
％が、標的配列とハイブリダイズし、平衡になる温度である（標的配列が過剰に存在する
場合、Ｔｍでプローブのうちの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェント条件
は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満（代表的には、約０．０１Ｍから１．０Ｍ
ナトリウムイオン濃度（または他の塩））、ｐＨ７．０からｐＨ８．３、ならびに温度が
、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、お
よび長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド以上）について少なくとも約６０℃の条件
である。ストリンジェント条件は、不安定化剤（ホルムアミドなど）の添加によってもま
た、達成され得る。
【００５９】
別の実施形態において、より低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件が、使
用される；当該分野で公知であるように、例えば、中程度ストリンジェンシー条件または
低いストリンジェンシー条件が、使用され得る；ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｕｓｕｂｅｌ
（既出）およびＴｉｊｓｓｅｎ（既出）を参照のこと。
【００６０】
さらに、本発明のＣＡ核酸配列は、より大きい遺伝子の断片である（すなわち、本発明
のＣＡ配列ば、核酸セグメントである）。あるいは、ＣＡ核酸配列は、癌遺伝子位置のイ
ンジケーターとして働き得る。例えば、ＣＡ配列は、癌原遺伝子を活性化させるエンハン
サーであり得る。この文脈における「遺伝子」は、コード領域、非コード領域、およびコ
ード領域と非コード領域の混合を含む。従って、当業者に理解されるように、本明細書中
で提供される配列を使用し、より長い配列または全長配列のどちらかのクローニングのた
めの当該分野で周知である技術（ＭａｎｉａｔｉｓらおよびＡｕｓｕｂｅｌら（既出）（
本明細書で参考として明示的に援用される）を参照）を使用して、ＣＡ遺伝子のさらなる
配列が、得られ得る。一般に、これは、ＰＣＲ（例えば、キネティック（ｋｉｎｅｔｉｃ
）ＰＣＲ）を使用して行われる。
【００６１】
一旦ＣＡ核酸が同定されれば、これは、クローン化され得、必要な場合、その構成部分
は、ＣＡ核酸全体を形成するように組換えられる。一旦天然の供給源から単離される（例
えば、プラスミドもしくは他のベクターの中に含まれるか、またはこれらから直鎖状核酸
セグメントとして切り出される）場合、組換えＣＡ核酸は、他のＣＡ核酸（例えば、さら
なるコード領域）を同定および単離するためのプローブとして、さらに使用され得る。こ
れは、修飾ＣＡ核酸または改変体ＣＡ核酸および修飾ＣＡタンパク質および改変体ＣＡタ
ンパク質を生成するための「前駆体」核酸としてもまた、使用され得る。
【００６２】
本発明のＣＡ核酸は、いくつかの方法で使用される。最初の実施形態において、ＣＡ核
酸に対する核酸プローブが、生成され、そして、バイオチップに結合される。このバイオ
チップは、スクリーニングおよび診断方法において（以下で概略が示されるように）使用
されるか、または投与のため（例えば、遺伝子療法および／またはアンチセンス適用のた
め）に使用される。あるいは、ＣＡタンパク質のコード領域を含むＣＡ核酸は、ＣＡタン
パク質発現のための発現ベクターに入れられ得る。この発現は、やはり、スクリーニング
目的または患者への投与の目的のためのどちらかである。
【００６３】
好ましい実施形態において、ＣＡ核酸に対する核酸プローブ（図面において概略が示さ
れる核酸配列および／またはその相補配列の両方）が、生成される。バイオチップに結合
される核酸プローブは、ＣＡ核酸（すなわち、標的配列（サンプルの標的配列または（例
えばサンドイッチアッセイにおける）他のプローブ配列のどちらか））に対し、実質的に
相補的であるように設計され、その結果、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイ
ゼーションが起こる。以下で概略が示されるように、この相補性は、完全である必要はな
い；任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハ
イブリダイゼーションを妨げる。しかし、変異の数があまりにも多いために、最低にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下ですら、ハイブリダイゼーションが起こら
ない場合、この配列は、相補的標的配列ではない。従って、本明細書中で「実質的に相補
的」は、本明細書中で概略を示されるように、プローブが、標的配列に対し、通常の反応
条件（特に高いストリンジェンシー条件）下でハイブリダイズするのに充分に相補的であ
ることを意味する。
【００６４】
核酸プローブは、一般に一本鎖であるが、部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であり
得る。プローブの鎖状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の構造、組成、およ
び特性によって述べられる。一般に、核酸プローブは、約８塩基から約１００塩基長まで
の範囲におよぶ（約１０塩基から約８０塩基までが好ましく、約３０塩基から約５０塩基
までが特に好ましい）。つまり、一般に、遺伝子全体は使用されない。いくつかの実施形
態において、数百塩基までの、ずっと長い核酸が、使用され得る。
【００６５】
好ましい実施形態において、１つの配列につき、１つより多くのプローブが使用され、
重複するプローブまたは標的の異なったセクションに対するプローブのどちらかが、使用
される。つまり、２つ、３つ、４つ以上（３つが好ましい）のプローブが、特定の標的に
ついての冗長性を形成するために使用される。これらのプローブは、重複し得る（つまり
、配列のいくらかが共通である）か、または分離しており得る。
【００６６】
当業者に理解されるように、核酸は、広汎な種々の方法によって、固体保持体に結合さ
れ得るか、または固定化され得る。本明細書中の「固定化された」および文法的同義語に
より、核酸プローブと固体支持体との間の接着または結合が、以下で概略を示すような、
結合、洗浄、分析、および除去の条件下で、十分に安定であることが、意味される。結合
は、共有結合または非共有結合であり得る。本明細書中の「非共有結合」および文法的同
義語により、静電的相互作用、親水性相互作用、および疎水性相互作用のいずれか１つ以
上を意味する。非共有結合には、分子（ストレプトアビジンなど）の支持体への共有結合
およびビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有結合が、含まれる。本明細書
中の「共有結合」および文法的同義語は、固体支持体およびプローブという２つの部分が
、少なくとも１つの結合（σ結合、π結合、および配位結合が挙げられる）により、結合
していることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体との間に直接形成され得る
か、またはクロスリンカーにより、あるいは固体支持体もしくはプローブまたは両分子の
いずれかに特定の反応基を含めることにより、形成され得る。固定化はまた、共有的相互
作用と非共有的相互作用との組合せを含み得る。
【００６７】
一般に、プローブは、（当業者が理解するように）バイオチップに、広汎な種々の方法
で結合する。本明細書中に記載されるように、核酸は、最初に合成され、その後にバイオ
チップに結合し得るか、または直接バイオチップ上に合成され得るかのいずれかである。
【００６８】
バイオチップは、適切な固体基材を含む。本明細書中の「基材」もしくは「固体支持体
」または他の文法的同義語は、核酸プローブの結合または接着に適切な別個のそれぞれの
部位を含むように改変され得る、任意の物質であり、少なくとも１つの検出方法に適合し
得る。当業者に理解されるように、可能性のある基材の数は、非常に大きく、そして、以
下が挙げられるが、これらに限定はされない：ガラスおよび改変ガラスまたは官能化ガラ
ス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他の物質とのコポリマー
、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）
、など）、ポリサッカライド、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくは
シリカベース物質（シリコンおよび改変されたシリコンを含む）、炭素、金属、無機ガラ
ス、など。一般にこの基材は、光学的検出を可能にし、感知される蛍光を発さない。
【００６９】
好ましい実施形態において、バイオチップの表面およびプローブは、この２つの後の結
合のために化学官能基により誘導体化され得る。従って、例えば、バイオチップは、化学
官能基を用いて誘導体化され、この化学官能基としては、アミノ基、カルボキシ基、オキ
ソ基およびチオール基が挙げられる（アミノ基が特に好ましい）が、これらに限定されな
い。これらの官能基を使用して、プローブは、プローブ上の官能基を使用して結合され得
る。例えば、アミノ基を含む核酸は、アミノ基を含む表面に、例えば（当該分野で公知で
あるように）リンカーを使用して、結合され得る；例えば、ホモ二官能性リンカーまたは
ヘテロ二官能性リンカーが、周知である（（１９９４）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒ
ｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，１５５−２００ページを、参照のこと（本明細書中に参考とし
て援用される））。さらに、ある場合は、アルキル基のようなさらなるリンカー（置換さ
れた基およびヘテロアルキル基を含む）が、使用され得る。
【００７０】
この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、当該分野に公知であるように合成され
、次いで固体支持層の表面上に結合される。当業者に理解されるように、５’末端または
３’末端のどちらかが固体支持体に結合され得るか、またはこの結合は、内在性ヌクレオ
シドを介し得る。
【００７１】
さらなる実施形態において、固体支持体への固定化は、非共有的であるのに、とても強
くあり得る。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコートされた表面に結合して結
合を生じるビオチン化オリゴヌクレオチドが、生成され得る。
【００７２】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、当該分野で公知であるように、表面上で合成され得
る。例えば、光重合体形成化合物および光重合体形成技術を利用する光活性化技術が、使
用される。好ましい実施形態において、核酸は、周知のフォトリソグラフィー技術（ＷＯ
９５／２５１１６；ＷＯ９５／３５５０５；米国特許第５，７００，６３７号および同第
５，４４５，９３４号ならびにこの中の参考文献に記載される（これら全ては参考として
明示的に援用される））を使用して、インサイチュで合成され得る；これらの結合の方法
は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術の基礎を形成する。
【００７３】
バイオチップアレイに代表される固相技術に加えて、遺伝子発現はまた、液相アレイを
使用して定量し得る。このような系の１つは、キネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）である。キネティックＰＣＲは、特異的核酸配列の同時の増幅および定量を可能にす
る。この特異性は、標的部位をまとめた一本鎖核酸配列に優先的に接着するように設計さ
れた、合成オリゴヌクレオチドプライマーに由来する。このオリゴヌクレオチドプライマ
ー対は、標的配列のそれぞれの鎖に、特異的非共有結合複合体を形成する。これらの複合
体は、逆方向の二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写を容易にする。反応混合物の温度サイクリ
ングは、プライマー結合、転写、および核酸から個々の鎖への再融解という、連続サイク
ルを作り出す。この結果は、標的ｄｓＤＮＡ産物の指数関数的増加である。この産物は、
インターカレート色素または配列特異的プローブのどちらかの使用を通してリアルタイム
で定量され得る。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉは、インターカレート色素の例で
あり、ｄｓＤＮＡに優先的に結合し、蛍光シグナルの同時増加を生じる。ＴａｑＭａｎ（
登録商標）技術に使用されるような配列特異的プローブは、オリゴヌクレオチドの対向末
端に共有的に結合する蛍光色素およびクエンチング分子からなる。このプローブは、２つ
のプライマーの間で標的ＤＮＡ配列に選択的に結合するように設計される。ＰＣＲ反応の
間にＤＮＡ鎖が合成される場合、発蛍光団は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
よりプローブから切り離され、シグナルの脱クエンチングを生じる。プローブシグナル伝
達方法は、インターカレート色素法より特異的であり得るが、それぞれの場合において、
シグナル強度は、産生されるｄｓＤＮＡ産物に比例する。定量方法のそれぞれの種類は、
マルチウェル液相アレイにおいて使用され得、このマルチウェル液相アレイは、それぞれ
のウェルが、目的の核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブを示す。組織
または細胞株のメッセンジャーＲＮＡ調製物を用いて使用される場合、プローブ／プライ
マー反応のアレイは、同時に複数の目的の遺伝子産物発現を定量し得る。Ｇｅｒｍｅｒ，
Ｓ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：２５８−２６６（２０００）；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ
．ら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６，９８６−９９４（１９９６）を、参照のこと。
【００７４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質をコードするＣＡ核酸は、ＣＡタンパク質
を発現する種々の発現ベクター（以下で記載されるようにスクリーニングアッセイにおい
て使用され得る）を生成するために使用される。発現ベクターは、自己複製染色体外ベク
ターまたは宿主遺伝子に組み込まれるベクターのどちらかであり得る。一般に、これらの
発現ベクターは、転写調節核酸および翻訳調節核酸（ＣＡタンパク質をコードする核酸に
作動可能に連結される）を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能
に連結されたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列を言う。原核生物に対して適切な制
御配列としては、例えば、プロモーター、（必要に応じて）オペレーター配列、およびリ
ボソーム結合部位が、挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグ
ナル、およびエンハンサーを利用することが、公知である。
【００７５】
核酸が、別の核酸配列との機能的関係の中に配置される場合、「作動可能に連結される
」。例えば、ポリペプチドの分泌に関わるプレタンパク質として発現する場合、プレ配列
または分泌リーダーのＤＮＡは、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている
；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、この配列に、
作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置
された場合、コード配列に、作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結され
ている」とは、連結されるＤＮＡ配列が、連続し、分泌リーダーの場合は、連続し、リー
ディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続する必要はない
。連結は、都合の良い制限部位で結合することによって、達成される。このような部位が
存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来技術の実施
に従って使用される。転写調節核酸および翻訳調節核酸は、一般に、ＣＡタンパク質を発
現させるために使用される宿主細胞に、適切である；例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の転
写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列は、好ましくは、ＢａｃｉｌｌｕｓにおいてＣＡ
タンパク質を発現するために使用される。多くの種類の適切な発現ベクターおよび適切な
調節配列が、種々の宿主細胞について、当該分野で公知である。
【００７６】
一般に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結
合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびに
エンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーターならびに転写開始配列および転写
終結配列を含む。
【００７７】
プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのどちらかをコー
ドする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーター
のどちらかであり得る。１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッド
プロモーターもまた、当該分野で公知であり、本発明において有用である。
【００７８】
さらに、発現ベクターは、さらなる要素を含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの
複製系を有し得、これによって２種の生物（例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆
虫細胞、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主）において維持される。
さらに、発現ベクターの組み込みのために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少
なくとも１つの配列（好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列）を含む。組込み
ベクターは、ベクター内に含めるために適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞
における特定の遺伝子座に指向され得る。組み込みベクターの構築物は、当該分野で周知
である。
【００７９】
さらに、好ましい実施形態において、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含み、形
質転換された宿主細胞の選択を可能にする。選択遺伝子は、当該分野で周知であり、使用
する宿主細胞によって変化する。
【００８０】
本発明のＣＡタンパク質は、ＣＡタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターによ
って形質転換された宿主細胞を、ＣＡタンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こすの
に適切な条件下で培養することによって、産生される。ＣＡタンパク質発現に適切な条件
は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、当業者により、慣用的実験を通
して容易に確かめられる。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、
宿主細胞の生育および増殖の最適化を必要とし、一方、誘導性プロモーターの使用は、誘
導に適切な成育条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形態において、収集のタイミ
ングは、重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるバキュロウイルス系は、
溶解性のウイルスであり、従って、収集時間選択は、産物収量にとって重要であり得る。
【００８１】
適切な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、および昆虫細
胞、植物細胞ならびに動物細胞（哺乳動物細胞を含む）が挙げられる。特に重要なのは、
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ細胞
、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞株（マクロファー
ジ細胞株）およびヒト細胞ならびにヒト細胞株である。
【００８２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、哺乳動物細胞において発現される。哺
乳動物発現系はまた、当該分野において公知であり、それにはレトロウイルス系が挙げら
れる。好ましい発現ベクター系は、例えば、一般的にＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およ
びＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８（いずれも本明細書中で参照として明示的に援用される
）において記載されるレトロウイルスベクター系である。哺乳動物プロモーターとして特
に有用であるのは、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。なぜなら、この
ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして幅広い宿主範囲を有するからである
。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、ア
デノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶ
プロモーターが挙げられる。代表的に、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列お
よびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って
プロモーターエレメントとともにコード配列の側に隣接する。転写ターミネーターおよび
ポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０に由来するものを含む。
【００８３】
哺乳動物宿主および他の宿主内に外来核酸を導入する方法は、当該分野において周知で
あり、そして使用される宿主細胞とともに変化する。技術は、デキストラン媒介性トラン
スフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性トラ
ンスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポ
ソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接微量注入を包
含する。
【００８４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、細菌系において発現される。細菌性発
現系は、当該分野において周知である。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた、
使用され得、そして当該分野において公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイ
ブリッドプロモーターもまた、有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロ
モーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、細菌プロモー
ターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する、天然に存在
する非細菌起源のプロモーターを含み得る。機能性プロモーター配列に加えて、効率的な
リボソーム結合部位が望ましい。発現ベクターはまた、細菌中でのＣＡタンパク質の分泌
を提供するシグナルペプチド配列を含み得る。このタンパク質は、増殖培地内に分泌され
るか（グラム陽性細菌）、または細胞膜周辺腔（細胞の内膜と外膜との間に位置する）内
に分泌される（グラム陰性細菌）かのいずれかである。細菌発現ベクターはまた、形質転
換された細菌株の選択を可能にするような選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺
伝子は、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシ
ン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬物に対して耐性にする遺伝子を含む
。選択マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン生合成経路、トリプトファン
生合成経路およびロイシン生合成経路におけるもの）を含む。これらの成分は、発現ベク
ター中で構築される。細菌のための発現ベクターは当該分野において周知であり、とりわ
け、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのためのベ
クターが挙げられる。細菌性発現ベクターは、当該分野において周知の技術（例えば、塩
化カルシウム処理、エレクトロポレーションなど）を使用して細菌宿主細胞内に形質転換
される。
【００８５】
１つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、昆虫細胞中で産生される。昆虫細胞の形
質転換のための発現ベクター、および特にバキュロウイルスをベースにした発現ベクター
は、当該分野において周知である。
【００８６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、酵母細胞中で産生される。酵母発現系
は、当該分野において周知であり、それとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅのための発現ベクター、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのための発現
ベクターおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａのための発現ベクター、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａのための発現ベクター、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ
のための発現ベクターおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのための発現ベクター、Ｐｉｃｈｉａ ｇ
ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉのための発現ベクターおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための
発現ベクター、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのための発現ベク
ターおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのための発現ベクターが挙げられる
。
【００８７】
ＣＡタンパク質はまた、当該分野で周知の技術を使用して融合タンパク質として作られ
得る。従って、例えば、モノクローナル抗体生成のためである。所望のエピトープが小さ
い場合、ＣＡタンパク質は、免疫原を形成するためにキャリアタンパク質に対して融合さ
れ得る。あるいは、ＣＡタンパク質は、発現を増強するために、または他の理由のために
融合タンパク質として作られ得る。例えば、ＣＡタンパク質がＣＡペプチドである場合、
このペプチドをコードする核酸は、発現目的のために、他の核酸に結合され得る。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明のＣＡ核酸、ＣＡタンパク質およびＣＡ抗体は、標識
される。本明細書中の「標識される」によって、化合物は、その化合物の検出を可能にす
るために結合する少なくとも１つの元素、同位体または化学化合物を有することが意味さ
れる。一般的に、標識は、３つのクラスに分類される：ａ）同位体標識であり、これは放
射性同位体または重同位体であり得る；ｂ）免疫標識であり、これは、抗体または抗原で
あり得る；およびｃ）有色色素または蛍光色素である。標識は、ＣＡ核酸、ＣＡタンパク
質およびＣＡ抗体内に任意の位置で組み込まれ得る。例えば、標識は、直接的または間接
的のいずれかで検出可能なシグナルを産生し得るべきである。検出可能な部分は、例えば
、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位体、例えば、フル
オレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光化合物
または化学発光化合物、あるいは、例えば、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダー
ゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。抗体を標識に結合体化す
るための当該分野で公知の任意の方法が使用され得、これは、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：
１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０：２１９（
１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
．、３０：４０７（１９８２）によって記載される方法を含む。
【００８９】
従って、本発明はまた、ＣＡタンパク質配列を提供する。本発明のＣＡタンパク質は、
いくつかの方法で同定され得る。この意味における「タンパク質」とは、タンパク質、ポ
リペプチド、およびペプチドを包含する。当業者によって理解されるように、本発明の核
酸配列は、タンパク質配列を生成するために使用され得る。タンパク質配列生成を行なう
ための種々の方法があり、これには、遺伝子全体をクローニングすること、ならびにその
フレームおよびアミノ酸配列を改変すること、またはＣＡタンパク質が、使用されるデー
タベース中のいくつかのタンパク質との相同性を有すると仮定して、フレームを提供する
ための相同性を検索するために公知の配列とアミノ酸配列を比較することが挙げられる。
概して、核酸配列は、相同性について３つすべてのフレームを検索するプログラムに入力
される。これは、以下のＮＣＢＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴパラメータを使用する
好ましい実施形態において行なわれる。このプログラムは、ｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓ
ｔｎである。データベースは、ｎｒである。入力データは、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ
ＦＡＳＴＡ ｆｏｒｍａｔ」としてある。生物リストは、「ｎｏｎｅ」である。「ｅｘｐ
ｅｃｔ」は１０であり；フィルターはデフォルトである。「ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ」
は５００であり、「ａｌｉｇｈｍｅｎｔｓ」は５００であり、そして「ａｌｉｇｈｍｅｎ
ｔ ｖｉｅｗ」は２つ１組である。「ｑｕｅｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅｓ」は標準
（１）である。マトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり；ギャップ存在コストは１１で
あり、残基ギャップあたりのコストは１であり；そしてλ比は、０．８５デフォルトであ
る。これは、推定タンパク質配列の生成を生じる。
【００９０】
本明細書中で決定されたような天然に存在する配列のアミノ酸改変体がまた、ＣＡタン
パク質の１つの実施形態内に含まれる。改変体は、好ましくは、野生型配列に対して、好
ましくは約７５％より大きい、より好ましくは約８０％より大きい、さらにより好ましく
は約８５％より大きい、そして最も好ましくは９０％より大きい相同性を有する。いくつ
かの実施形態において、相同性は、約９３〜９５または９８％ほど高い。核酸に関する限
りでは、このような状況における相同性は、配列類似性または配列同一性（同一性が好ま
しい）を意味する。この相同性は、核酸相同性に関して上で略述されるように、当該分野
において公知の標準的技術を使用して決定される。
【００９１】
本発明のＣＡタンパク質は、野生型アミノ酸配列より短くても長くてもよい。従って、
好ましい実施形態において、本明細書中の野生型配列の部分またはフラグメントが、ＣＡ
タンパク質の定義内に含まれる。さらに、上で略述されるように、本発明のＣＡ核酸は、
さらなるコード領域、およびさらなるタンパク質配列を、当該分野において公知の技術を
使用して得るために使用され得る。
【００９２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、野生型配列と比較して誘導体ＣＡタン
パク質または改変ＣＡタンパク質である。つまり、以下に、より十分に略述されるように
、誘導体ＣＡペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入（アミノ酸置
換が特に好ましい）を含む。アミノ酸置換、挿入または欠失は、ＣＡペプチド内の任意の
残基で生じ得る。
【００９３】
本発明のＣＡタンパク質の１つの実施形態において、アミノ酸配列改変体もまた含まれ
る。これらの改変体は、以下の３つのクラスのうちの１つ以上に含まれる：置換改変体、
挿入改変体または欠失改変体。これらの改変体は、通常、改変体をコードするＤＮＡを産
生するために、当該分野において周知のカセット式変異誘発またはＰＣＲ変異誘発あるい
は他の技術を使用して、ＣＡタンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位
特異性変異誘発、そしてその後、上で略述されるように組換え細胞培養においてＤＮＡを
発現することによって、調製される。しかし、約１００〜１５０残基までを有する改変体
ＣＡタンパク質フラグメントは、確立された技術を使用するインビトロ合成によって調製
され得る。アミノ酸配列改変体は、改変体の前もって決定された性質（ＣＡタンパク質の
アミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子バリエーションまたは種間バリエーションとそ
の改変体を区別する特徴）によって特徴付けられる。代表的に改変体は、天然に存在する
アナログと同じ定性的生物活性を示すが、より十分に以下に略述されるように、改変され
た特徴を有する改変体もまた、選択され得る。
【００９４】
アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位または領域が前もって決定される一
方で、変異自体は、前もって決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の実行
を最適化にするために、ランダムな変異誘発が、標的コドンまたは領域で実行され得、そ
して発現したＣＡ改変体は、所望される活性の最良の組み合わせについてスクリーニング
される。公知の配列を有するＤＮＡにおける前もって決定された部位での置換変異を起こ
すための技術は、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＬＡＲ変異誘発
）。変異体のスクリーニングは、ＣＡタンパク質活性のアッセイを使用して行なわれる。
【００９５】
アミノ酸置換は、代表的に、単一残基である；挿入は、通常約１〜２０個のアミノ酸で
あるが、かなり大きな挿入が許容され得る。欠失は、約１〜約２０残基の範囲であるが、
いくつかの場合において、欠失はより大きくあり得る。
【００９６】
置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが、最終的な誘導体に到達するため
に使用され得る。概してこれらの変化は、分子の変化を最小にするために２〜３個のアミ
ノ酸に対して行なわれる。しかし、より大きな変化が、特定の状況において許容され得る
。ＣＡタンパク質の特徴における小さい変化が所望される場合、置換は、概して以下のチ
ャートに従って行なわれる。
【表Ａ−１】
【００９７】
【表Ａ−２】
【００９８】
機能または免疫学的同一性における本質的な変化は、チャートＩに示されるものより保
存的でない置換を選択することによって、行なわれる。例えば：変更領域におけるポリペ
プチドの骨格構造（例えば、α−ヘリックス構造またはβシート構造）；標的部位におけ
る分子の電荷または疎水性；あるいは側鎖のかさ高さ、により著しい影響を及ぼす置換が
行なわれ得る。一般的にポリペプチド特性における最大の変化を産生することが予測され
る置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル（ｔｈｒｅｏｎｙｌ））
は、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはア
ラニル）と（またはこれらによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンは、
任意の他の残基と（またはこれらによって）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残
基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）は、電気陰性残基（例えば、グル
タミルまたはアスパルチル）と（またはこれらによって）置換される；または（ｄ）かさ
高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）は、側鎖をもたないもの（例えば、
グリシン）と（またはこれらによって）置換されるものである。
【００９９】
代表的に、改変体は、天然に存在するアナログと同じ定性的生物学的活性を示し、そし
て同じ免疫応答を惹起させるが、必要とされる場合、改変体はまた、ＣＡタンパク質の特
徴を改変するように選択される。あるいは、改変体は、ＣＡタンパク質の生物学的活性が
変更されるように設計され得る。例えば、グリコシル化部位は、変更され得るか、または
除去され得、ドミナントネガティブ変異が生成され得る、など。
【０１００】
ＣＡポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内（例えば、スクリーニングにおい
て使用するために）に含まれる。共有結合修飾の１つの型は、ＣＡポリペプチドの標的化
アミノ酸残基と、ＣＡポリペプチドの選択された側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残
基と反応し得る有機誘導体化剤との反応工程を包含する。以下でより十分に記載されるよ
うに、二官能性薬剤を用いる誘導体化は、例えば、ＣＡポリペプチドと水不溶性支持マト
リックスあるいは抗ＣＡ抗体の精製またはスクリーニングアッセイのための方法において
使用するための表面を架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例
えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホ
モ二官能性イミドエステル）が挙げられ、そしてジスクシンイミジルエステル（例えば、
３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、二官能性マレイミド（例
えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）および薬剤（例えば、メチル−３−［
（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート）が挙げられる。
【０１０１】
他の改変としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応する
グルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロ
キシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン
、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈ
ｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
７９〜８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキ
シル基のアミド化が挙げられる。
【０１０２】
本発明の範囲内に含まれるＣＡポリペプチドの別の型の共有結合修飾は、ポリペプチド
のネイティブのグリコシル化パターンの変更を含む。「ネイティブのグリコシル化パター
ンの変更」は、本明細書における目的のために、ネイティブ配列ＣＡポリペプチドにおい
て見出される１つ以上の糖質部分の欠失、および／またはネイティブ配列ＣＡポリペプチ
ド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。
【０１０３】
ＣＡポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列の変更によっ
て達成され得る。例えば、この変更は、ネイティブ配列ＣＡポリペプチドに対する（Ｏ結
合型グリコシル化部位について）１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加、ま
たはこれらによる置換によってなされ得る。ＣＡアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化
を介して（特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、ＣＡポリペプ
チドをコードするＤＮＡを前もって選択された塩基で変異させることによって）必要に応
じて変化され得る。
【０１０４】
ＣＡポリペプチド上の糖質部分の数を増加する別の方法は、グリコシドをポリペプチド
に対して化学的または酵素的に結合することによる。そのような方法は、当該分野におい
て記載される（例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０、な
らびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＬＡ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２５９〜３０６頁（１９８１））。
【０１０５】
ＣＡポリペプチド上に存在する糖質部分の除去は、グリコシル化のための標的として作
用するアミノ酸残基をコードするコドンの、化学的置換または酵素的置換あるいは変異性
置換によって達成され得る。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野において公知であり
、そして例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．、２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１
８：１３１（１９８１）によって記載される。ポリペプチド上の糖質部分の酵素切断は、
Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０（１９８７）によ
って記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用
によって達成され得る。
【０１０６】
ＣＡの共有結合修飾の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，
６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１
９２号または同第４，１７９，３３７号において示される様式で、ＣＡポリペプチドと種
々の非タンパク性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコー
ル、またはポリオキシアルキレン）の１つとを連結することを含む。
【０１０７】
本発明のＣＡポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合し
たＣＡポリペプチドを含むキメラ分子を形成するために、ある方法において改変され得る
。１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、ＣＡポリペプチドと、抗タグ抗体
が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。一般的に
エピトープタグは、ＣＡポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される
が、内部融合がまた、いくつかの実施例において許容され得る。ＣＡポリペプチドのこの
ようなエピトープ−タグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体の使用によって
検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ＣＡポリペプチドが、抗タグ抗体、また
はエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの他の型を使用するアフィニテ
ィー精製によって容易に精製されることを可能にする。代替の実施形態において、キメラ
分子は、ＣＡポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合
を含み得る。キメラ分子の二価形態について、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域
に対してであり得る。
【０１０８】
種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該分野において周知であ
る。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリ−ヒスチジン−
グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその
抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９〜２１６
５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４
、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０〜３６１６（１９８５））；ならびに単純ヘルペスウ
イルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他
のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，６：１２０４〜１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉ
ｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２〜１９４（１９９２））；チューブリンエピトー
プペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３〜１５
１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒ
ｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３
〜６３９７（１９９０））が挙げられる。
【０１０９】
１つの実施形態において、ＣＡタンパク質の定義を用いると、ＣＡファミリーの他のＣ
Ａンパク質、および他の生物由来のＣＡタンパク質もまた含まれ、これらは以下に略述さ
れるようにクローン化され、そして発現される。従って、プローブまたは縮重ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が、ヒトまたは他の生物由来の他の関連ＣＡタンパ
ク質を見出すために使用され得る。当業者によって理解されるように、特に有用なプロー
ブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、ＣＡ核酸配列の独特の領域を含む。一般的に
当該分野で公知であるように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチ
ド長（約２０〜約３０が好ましい）であり、そして必要であるならばイノシンを含み得る
。ＰＣＲ反応のための条件は、当該分野において周知である。
【０１１０】
さらに、本明細書中で略述されるように、図面の核酸によってコードされるものより長
いＣＡタンパク質が（例えば、付加配列の解明、エピトープまたは精製タグの付加、他の
融合配列の付加、などによって）作られ得る。
【０１１１】
ＣＡタンパク質はまた、ＣＡ核酸によってコードされるタンパク質として同定され得る
。従って、本明細書中で略述されるように、ＣＡタンパク質は、配列表の配列またはその
相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされる。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明は、ＣＡ抗体を提供する。好ましい実施形態におい
て、ＣＡタンパク質が、例えば、免疫療法のために、抗体を生成するために使用され得る
場合、ＣＡタンパク質は、少なくとも１つのエピトープまたは決定基を全長のタンパク質
と共有するべきである。ＭＨＣの場合、本明細書中での「エピトープ」または「決定因子
」によって、抗体またはＴ細胞レセプターを生成しそして／またはそれに結合するタンパ
ク質の部分が意味される。従って、ほとんどの例において、より小さいＣＡタンパク質に
対して作られた抗体は、全長のタンパク質に結合し得る。好ましい実施形態において、エ
ピトープは独特である；つまり、独特のエピトープに対して生成された抗体は、ほとんど
かまたは全く交差反応を示さない。
【０１１３】
１つの実施形態において、用語「抗体」は、抗体フラグメント（当該分野で公知である
ような抗体全体の改変によって産生されるか、または組み換えＤＮＡ技術を使用して新規
に合成されたもののいずれかである、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えば、Ｆｖ）、キ
メラ抗体、などを含む）を含む。
【０１１４】
ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者によって公知である。ポリクローナル抗体は
、例えば、免疫剤、および望ましくは、アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動
物中で惹起され得る。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下
注射または腹腔内注射によって哺乳動物内へ注射される。免疫剤としては、図面の核酸に
よってコードされるタンパク質もしくはそのフラグメントまたはそれらに融合タンパク質
が挙げられ得る。免疫される哺乳動物において免疫原であることが公知のタンパク質を免
疫剤に結合体化することが有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例としては
、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および
ダイズトリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバ
ントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モ
ノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃ
ｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫プロトコルは、過度の実験をすることなく、当業者に
よって選択され得る。
【０１１５】
あるいは、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４
９５（１９７５）によって記載される）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法に
おいて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、特異的に免疫剤
に結合する抗体を産生するかまたは産生し得る、リンパ球を惹起するために免疫剤で免疫
される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。代表的に、免疫剤としては
、表１の核酸によってコードされるポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはそれ
らの融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血
リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合
、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞
（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９〜１０
３頁）を形成するために、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して
不死化細胞株と融合される。不死化細胞株は、通常形質転換された哺乳動物細胞（特にげ
っ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細
胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の成長また
は生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、その
親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰ
ＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、代表的に、ハイブリドーマのための培養培地は、
ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、この物質
は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１１６】
１つの実施形態において、抗体は、二重特異的抗体である。二重特異的抗体は、少なく
とも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル（好ましくは、ヒトま
たはヒト化）抗体である。本発明の場合において、結合特異性の１つは、表１の核酸によ
ってコードされるタンパク質またはそれらのフラグメントについてであり、他方は、任意
の他の抗原についてであり、そして好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターも
しくはレセプターサブユニット（好ましくは、腫瘍特異的であるもの）についてである。
【０１１７】
好ましい実施形態において、以下に記載されるように、ＣＡに対する抗体は、ＣＡの生
物学的機能を減少し得るか、または除去し得る。つまり、ＣＡ（またはＣＡを含む細胞）
への抗ＣＡ抗体（ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナルのいずれか）の添加は
、ＣＡ活性を減少し得るかまたは除去し得る。一般的に、活性の少なくとも２５％の減少
が好まれ、さらに、少なくとも約５０％の減少が特に好ましく、そして約９５〜１００％
の減少が特に好ましい。
【０１１８】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質に対する抗体は、ヒト化抗体である。非ヒ
ト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列
を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）のキメラ分子で
ある。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、ここで、レシピ
エントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基は、所望の特異性、親和性および能力
を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残
基によって置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワー
ク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗
体においてもインポートＣＤＲのいずれにおいても見出されない残基あるいはフレームワ
ーク配列を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび代表的には２つの
可変ドメインの実質的に全てを含み、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するＣＤ
Ｒ領域の全てまたは実質上全ておよびフレームワーク残基（ＦＲ）領域の全てまたは実質
上全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要
に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的にヒト免疫グロブリンの定常領域）
の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９
８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９（１９８８）；
およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６
（１９９２））。
【０１１９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般的に、ヒト
化抗体は、ヒトではない供給源からヒト抗体へ導入された１つ以上のアミノ酸残基を有す
る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と称され、これは、代表的
にインポート可変ドメインから得られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共同研究者
らの方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙ
ｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って（げっ歯
類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列で置換することによって）本質的に実行
され得る。従って、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６
，５６７号）、ここで実質的にほとんどインタクトではないヒト可変ドメインは、非ヒト
種由来の対応配列によって置換されている。実際問題として、ヒト化抗体は、代表的にい
くつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似
部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１２０】
ヒト抗体はまた、当該分野において公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラ
リーを含む）を使用して産生され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた
、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用できる（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，７７頁（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（
１）：８６〜９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座をトラン
スジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化
されているマウス）内へ導入することによって作られ得る。チャレンジの際に、ヒト抗体
産生が観察され、このヒト抗体は、遺伝子の再配列、集合、および抗体レパートリーを含
む、全ての点で、ヒトにおいて見出されるものと密接に似ている。このアプローチは、例
えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，
８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０
１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０
，７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６〜８
５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２〜１３（１９９４
）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５〜
５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１４，８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５〜９３（１９９５）において記載される。
【０１２１】
免疫治療によって、ＣＡタンパク質に対して惹起された抗体での癌腫の処置が意味され
る。本明細書中で使用される場合、免疫治療は、受動的であってもまたは能動的でもあっ
てもよい。本明細書中で定義される受動免疫治療は、レシピエント（患者）への抗体の受
動移送である。能動免疫は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞応
答の誘導である。免疫応答の誘導は、レシピエントに、抗体が惹起される抗原を提供する
ことの結果である。当業者によって理解されるように、抗原は、抗体が惹起されることが
望ましいポリペプチドをレシピエントに注射すること、または抗原の発現のための条件下
でレシピエントと、抗原を発現し得る核酸とを接触させることによって、提供され得る。
【０１２２】
好ましい実施形態において、分泌された成長因子をコードする癌遺伝子は、上述される
ように分泌タンパク質であるＣＡタンパク質に対して抗体を惹起することによって阻害さ
れ得る。理論によって束縛されないが、処置のために使用される抗体が分泌タンパク質に
結合し、そして分泌されたタンパク質がそのレセプターに結合することを防止し、それに
よって分泌ＣＡタンパク質を不活化する。
【０１２３】
別の好ましい実施形態において、抗体が惹起されるＣＡタンパク質は、膜貫通タンパク
質である。理論によって束縛されないが、処置のために使用される抗体は、ＣＡタンパク
質の細胞外ドメインに結合し、そしてＣＡタンパク質が他のタンパク質（例えば、循環リ
ガンドまたは細胞結合分子）に結合することを防止する。抗体は、膜貫通ＣＡタンパク質
のダウンレギュレートを引き起こし得る。当業者によって理解されるように、抗体は、競
合的、非競合的であり得るか、またはＣＡタンパク質の細胞外ドメインに結合するタンパ
ク質の非競合的阻害剤であり得る。抗体はまた、ＣＡタンパク質のアンタゴニストである
。さらに、抗体は、膜貫通ＣＡタンパク質の活性化を防止する。１つの局面において、抗
体がＣＡタンパク質への他の分子の結合を防止する場合、抗体は、細胞の成長を防止する
。抗体はまた、細胞傷害性剤（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γおよびＩ
Ｌ−２が挙げられるがこれらに限定されない）、または化学治療剤（５ＦＵ、ビンブラス
チン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどを含む）に対して細胞
を感作し得る。いくつかの例において、抗体が膜貫通タンパク質と複合体化し、それによ
って細胞傷害性を媒介する場合、抗体は、血清補体を活性化するサブタイプに属する。従
って、癌は、患者に膜貫通ＣＡタンパク質に対して指向される抗体を投与することによっ
て処置され得る。
【０１２４】
別の好ましい実施形態において、抗体は、治療部分と結合体化される。１つの局面にお
いて、治療部分は、ＣＡタンパク質の活性を調節する低分子である。別の局面で、治療部
分は、ＣＡタンパク質と関連するか、またはＣＡタンパク質と密接に近位にある分子の活
性化を調節する。この治療部分は、癌と関連するプロテアーゼ活性またはプロテインキナ
ーゼ活性のような酵素活性を阻害し得る。
【０１２５】
好ましい実施形態において、治療部分はまた、細胞傷害性の薬剤であり得る。この方法
において、細胞傷害性薬剤を腫瘍組織または細胞に対して標的化することは、罹患細胞の
数の減少を生じ、それゆえ、癌（リンパ腫または乳癌を含む）に関連する症状を減少させ
る。細胞傷害性薬剤は、多数および多様であり、そして細胞傷害性薬剤としては、細胞傷
害性薬物または毒素あるいはそのような毒素の活性フラグメントが挙げられるが、これら
に限定されない。適切な毒素およびその対応フラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、エ
キソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（
ｃｒｏｔｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙ
ｃｉｎ）などが挙げられる。細胞傷害性薬剤はまた、ＣＡタンパク質に対して惹起される
抗体に放射性同位体を結合体化すること、または抗体と共有結合するキレート剤に放射性
核種を結合することによって作られる、放射化学物質を含む。治療部分の膜貫通ＣＡタン
パク質への標的化は、目的の癌（すなわち、リンパ腫または乳癌）における治療部分の局
所濃度を増加するばかりでなく、治療部分と関連し得る有害な副作用を減少するように作
用する。
【０１２６】
別の好ましい実施形態において、抗体が惹起されるＣＡタンパク質は、細胞内タンパク
質である。この場合において、抗体は、細胞内への侵入を促進するタンパク質に結合体化
され得る。１つの場合において、抗体は、エンドサイトーシスによって細胞へ入る。別の
実施形態において、抗体をコードする核酸は、個体または細胞に投与される。そのうえ、
ここでＣＡタンパク質は、細胞内で（すなわち、核に）標的化され得、これに対する抗体
は、局在を標的にするためのシグナル（すなわち、核局在シグナル）を含む。
【０１２７】
本発明のＣＡ抗体は、特異的にＣＡタンパク質に結合する。本明細書中の「特異的結合
」によって、抗体は、少なくとも１０−４〜１０−６Ｍ−１の範囲にある結合定数（好ま
しくは、１０−７〜１０−９Ｍ−１）でタンパク質と結合することが意味される。
【０１２８】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、発現後に精製されるかまたは単離され
る。ＣＡタンパク質は、どのような他の成分がサンプル中に存在するかに依存して、当業
者に公知の種々の方法で単離されるかまたは精製され得る。標準的な精製方法としては、
電気泳動的技術、分子的技術、免疫学的技術およびクロマトグラフィー技術（イオン交換
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む）ならびに等電点電気泳動が挙げられる。
例えば、ＣＡタンパク質は、標準的な抗ＣＡ抗体カラムを使用して精製され得る。タンパ
ク質濃度に関連して、限外濾過技術およびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ）技術もまた、有用である。適切な精製技術における一般的な指針については
、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）を参照のこと。必要な精製の程度は、ＣＡタンパクの
使用に依存して変化する。いくつかの例において、精製は必要ない。
【０１２９】
一旦発現され、そして必要に応じて精製されたならば、ＣＡタンパク質およびＣＡ核酸
は、多くの適用において有用である。
【０１３０】
１つの局面において、遺伝子の発現レベルは、癌腫表現型における異なる細胞状態につ
いて決定される；つまり、正常な組織および癌組織における遺伝子発現のレベル（以下で
略述されるように、いくつかの場合において、予後と関係するリンパ腫または乳癌の重症
度を変えるために）は、発現プロファイルを提供するために評価される。特定の細胞状態
または発生点での発現プロファイルは、本質的にその状態の「フィンガープリント」であ
り；２つの状態が、類似して発現した任意の特定の遺伝子を有し得る一方で、多くの遺伝
子の評価は、細胞の状態に独特である遺伝子発現プロファイルの生成を同時に可能にする
。異なる状態における細胞の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態の
各々においてどの遺伝子が重要である（遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレ
ギュレーションの両方を含む）かに関する情報が得られる。次いで、診断がなされ得るか
、または確認され得る：特定の患者由来の組織は、正常組織または癌腫組織の遺伝子発現
プロファイルを有する。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、「差示的発現」または文法的に等価なものは、細胞内お
よび細胞間での、遺伝子の一時的発現パターンおよび／または細胞性発現パターンにおけ
る定性的差異ならびに定量的差異の両方をいう。従って、差示的に発現した遺伝子は、定
性的に発現を変化させ得、この変化としては、例えば、正常組織 対 癌腫組織における
活性化または不活化を含む。つまり、遺伝子は、他の状態と比較して、特定の状態におい
てスイッチが入り得るか、または切れ得る。当業者によって理解されるように、２つ以上
の状態の任意の比較が行われ得る。そのように定性的に調節される遺伝子は、１つの状態
または細胞型において標準的な技術によって検出可能であるが両方では検出不可能である
１つのそのような状態または細胞型内における発現パターンを示す。あるいは、発現が増
加するまたは減少するという点で、この決定は、定量的である：つまり、遺伝子発現はア
ップレギュレートされ、転写物の量の増加を生じるか、またはダウンレギュレートされ、
転写物の量の減少を生じるかのいずれかである。発現の差異の程度としては、以下に略述
されるように、標準的な特徴付け技術を介して（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ（登録商標）発現分析（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，１４：１６７５〜１６８０（１９９６））（本明細書中で参照として明示的
に援用される）の使用によって）定量するために十分大きいことのみが必要である。他の
技術としては、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析およびＲＮアーゼプロテクション
が挙げられるが、これらに限定されない。上で略述されるように、好ましくは、発現にお
ける変化（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）は、少な
くとも約５０％であり、より好ましくは少なくとも約１００％であり、より好ましくは少
なくとも約１５０％であり、より好ましくは、少なくとも約２００％であり、３００％か
ら少なくとも１０００％までが特に好ましい。
【０１３２】
当業者によって理解されるように、これは、遺伝子転写またはタンパク質レベルのいず
れかでの評価によってなされ得る；つまり、遺伝子発現量は、遺伝子転写物のＤＮＡ等価
物またはＲＮＡ等価物に対する核酸プローブを使用することでモニターされ得、そして遺
伝子発現レベルの定量、あるいは最終遺伝子産物自体（タンパク質）は、例えば、ＣＡタ
ンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）の使用または他の
技術（質量分光計アッセイ、２Ｄゲル電気泳動アッセイなどを含む）の使用を介してモニ
ターされ得る。従って、ＣＡ遺伝子に対応するタンパク質（すなわち、特定の癌腫表現型
（すなわち、乳癌またはリンパ腫）において重要であるとして同定されたもの）は、その
癌腫に特異的な診断試験において評価され得る。
【０１３３】
好ましい実施形態において、遺伝子発現モニタリングが行われ、そして多くの遺伝子（
すなわち、発現プロファイル）が、同時にモニターされるが、複数のタンパク質発現モニ
タリングもまた、行われ得る。同様に、これらのアッセイはまた、個体ベースで行われ得
る。
【０１３４】
この実施形態において、ＣＡ核酸プローブは、本明細書中で略述されるように、特定の
細胞におけるＣＡ配列の検出および定量のためにバイオチップに結合され得る。アッセイ
は、当該分野で公知のように行われる。当業者によって理解されるように、任意の数の異
なるＣＡ配列が、プローブとして使用され得、いくつかのケースにおいて、単一配列アッ
セイが使用され、そして本明細書中で記載される複数の配列が他の実施形態において使用
される。さらに、固相アッセイが記載されているが、任意の数の溶液ベースアッセイもま
た、行われ得る。
【０１３５】
好ましい実施形態において、固相ベースアッセイおよび溶液ベースのアッセイの両方が
、正常組織と比較された場合に、癌腫においてアップレギュレートされるかまたはダウン
レギュレートされるＣＡ配列を検出するために使用され得る。ＣＡ配列は変性されるが、
同じ発現プロファイルまたは変化した発現プロファイルを示す場合において、このタンパ
ク質は、本明細書中で略述されるように検出される。
【０１３６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質をコードする核酸が検出される。ＣＡタン
パク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが検出され得るが、ＣＡタンパク質をコードする
ｍＲＮＡを検出する方法が、特に興味深い。サンプルにおけるｍＲＮＡの存在は、ＰＲＬ
ＲのようなＣＡ遺伝子がｍＲＮＡを形成するために転写されることの指標であり、そして
このタンパク質が発現されることを示唆する。ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、ｍ
ＲＮＡと相補的でありかつこのｍＲＮＡとの塩基対形成する任意のヌクレオチド／デオキ
シヌクレオチドプローブであり得、そしてこのプローブとしては、オリゴヌクレオチド、
ｃＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。プローブはまた、本明細
書中で規定されるような検出可能な標識を含むべきである。１つの方法において、ｍＲＮ
Ａは、試験されるべき核酸を固体支持体上（例えば、ナイロン膜）に固定化し、そしてプ
ローブをサンプルにハイブリダイズした後に、検出される。洗浄して非特異的に結合した
プローブを除去した後、標識が検出される。別の方法において、ｍＲＮＡの検出は、イン
サイチュで実行される。この方法において、透過処理された細胞または組織サンプルは、
プローブを標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために十分な時間の間、検出可能に標識
された核酸プローブと接触される。洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後、
標識が検出される。例えば、ＣＡタンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的なジゴキシゲ
ニン標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）は、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン二次抗
体の結合によって検出され、そしてニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドイルホスフェートで発色される。
【０１３７】
好ましい実施形態において、本明細書中で記載されるような３つのクラスのタンパク質
（分泌性タンパク質、膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質）のうちのいずれかが、
診断アッセイにおいて使用される。ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、ＣＡ配列を含
む改変タンパク質および細胞が、診断アッセイにおいて使用される。この診断アッセイは
、個々の遺伝子または対応するポリペプチドレベルについて行われるか、またはアッセイ
のセットとして行われる。
【０１３８】
本明細書中で記載されそして定義されるように、ＣＡタンパク質は、癌腫（例えば、乳
癌、またはホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫が含まれるが、
これに限定されない）のマーカーとしての使用を見出す。癌腫と推定される組織または患
者におけるこれらのタンパク質の検出は、癌腫の型の決定または診断を可能にする。当業
者に公知の多くの方法は、癌腫を検出する際の使用を見出す。１つの実施形態において、
抗体は、ＣＡタンパク質を検出するために使用される。好ましい方法は、ゲル（代表的に
は、変性および還元タンパク質ゲルであるが、等電点電気泳動ゲルなどを含む任意の他の
型のゲルでもあり得る）上での電気泳動によって、サンプルまたは患者由来のタンパク質
を分離する。タンパク質を分離した後、ＣＡタンパク質は、このＣＡタンパク質に対して
惹起された抗体を用いる免疫ブロッティングによって検出される。免疫ブロッティングの
方法は、当業者に周知である。
【０１３９】
別の好ましい方法において、ＣＡタンパク質に対する抗体は、インサイチュでの画像化
技術における使用を見出す。この方法において、細胞は、ＣＡタンパク質に対する１個〜
多くの抗体と接触される。洗浄して非特異的抗体結合を除去した後、抗体の存在が検出さ
れる。１つの実施形態において、抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体とともにインキ
ュベートすることによって検出される。別の方法において、ＣＡタンパク質に対する一次
抗体は、検出可能な標識を含む。別の好ましい実施形態において、複数の一次抗体のうち
のそれぞれ１つは、別個の検出可能な標識を含む。この方法は、複数のＣＡタンパク質に
ついての同時スクリーニングにおける特定の使用を見出す。当業者によって理解されるよ
うに、多くの他の組織学的画像化技術は、本発明において有用である。
【０１４０】
好ましい実施形態において、標識は、異なる波長の放出を検出しそして区別する能力を
有する蛍光計で、検出される。さらに、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が、本方法
において使用され得る。
【０１４１】
別の好ましい実施形態において、抗体は、血液サンプルから癌腫を診断する際の使用を
見出す。以前に記載されたように、特定のＣＡタンパク質は、分泌分子／循環分子である
。それゆえ、血液サンプルは、プローブされるべきサンプルとして有用であるか、または
分泌ＣＡタンパク質の存在について試験される。抗体は、以前に記載された免疫アッセイ
技術（当業者によって理解される、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウエスタンブロッ
ト）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥ技術などが含まれる）のいずれかによってＣＡタンパク
質を検出するために使用され得る。
【０１４２】
好ましい実施形態において、標識されたＣＡ核酸プローブの組織アレイとのインサイチ
ュハイブリダイゼーションが行われる。例えば、組織サンプル（ＣＡ組織および／または
正常組織を含む）のアレイが生成される。次いで、当該分野において公知のインサイチュ
ハイブリダイゼーションが行われ得る。
【０１４３】
個体と標準との間の発現フィンガープリントが比較される場合、当業者は、診断および
予後を行い得ることが理解される。さらに、診断を示す遺伝子は、予後を示す遺伝子とは
異なり得ることが理解される。
【０１４４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、ＣＡ配列を含む改
変タンパク質および細胞は、予後アッセイにおいて使用される。上記のように、癌腫（特
に、乳癌またはリンパ腫）の長期予後の点からみた重症度に関連する遺伝子発現プロファ
イルが生成され得る。さらに、これは、タンパク質レベルまたは遺伝子レベルのいずれか
で行われ得る（遺伝子の使用が、好ましい）。上記のように、ＣＡプローブは、組織また
は患者内でのＣＡ配列の検出および定量化のためにバイオチップに結合される。このアッ
セイは、診断のために略述されるように行われる。
【０１４５】
好ましい実施形態において、本明細書中で記載されるようなＣＡ配列のいずれかが、薬
物スクリーニングアッセイにおいて使用される。ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、
ＣＡ配列を含む改変タンパク質および細胞が、薬剤スクリーニングアッセイにおいて、ま
たは「遺伝子発現プロファイル」もしくはポリペプチドの発現プロファイルに対する薬物
候補の効果を評価することによって、使用される。１つの実施形態において、好ましくは
、候補薬剤で処置した後の発現プロファイル遺伝子に関するモニタリングを可能にするた
めの高スループットスクリーニング技術（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
９，８４〜８（１９９８），Ｈｅｉｄら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６：９８６〜９９４
（１９９６））と併用して、発現プロファイルが使用される。
【０１４６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、改変ＣＡタンパク
質、およびネイティブのＣＡタンパク質または改変ＣＡタンパク質を含む細胞が、スクリ
ーニングアッセイにおいて使用される。つまり、本発明は、癌腫表現型を調節する組成物
についてのスクリーニングのための新規の方法を提供する。上記のように、これは、遺伝
子発現のための調節因子またはタンパク質活性の調節因子についてのスクリーニングによ
って行われ得る。同様に、これは、個々の遺伝子レベルまたはタンパク質レベルについて
、あるいは「遺伝子発現プロファイル」に対する薬物候補の効果を評価することによって
、行われ得る。好ましい実施形態において、好ましくは、候補薬剤で処置した後に発現プ
ロファイル遺伝子に関するモニタリングを可能にするための高スループットスクリーニン
グ技術（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，前出を参照のこと）と併用して、発現プロファイルが使用
される。
【０１４７】
本明細書でＣＡ遺伝子を同定して、遺伝子発現に対する薬剤の効果を評価するために多
様なアッセイが実施され得る。好ましい実施形態において、アッセイは、個々の遺伝子レ
ベルまたはタンパク質レベルに対して実行され得る。すなわち、癌腫において異常に調節
される遺伝子として、特定の遺伝子を同定すると、その遺伝子応答を調節する候補生物活
性薬剤が、スクリーニングされ得る。このように「調節」は、遺伝子発現または遺伝子活
性における増加および減少の両方を包含する。好ましい調節量は、正常組織 対 腫瘍組
織における遺伝子発現の最初の変化に依存し、少なくとも１０％、好ましくは５０％、さ
らに好ましくは１００〜３００％の変化を有し、そしてある実施形態においては３００〜
１０００％以上の変化を有する。このように、ある遺伝子が正常組織と比較して腫瘍組織
では４倍の増加を表す場合、約４分の１への減少が所望される；正常組織と比較して、腫
瘍組織では１０分の１への減少は、候補薬剤の発現において１０倍の増加を与えることが
所望される、など。あるいは、ＣＡ配列が改変されているが同一の発現プロファイルまた
は変化した発現プロファイルを示す場合、本明細書で概要を述べられるように、このタン
パク質は検出され得る。
【０１４８】
当業者により理解されるように、これは、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいず
れかでの評価により実施され得る；すなわち遺伝子発現量は、核酸プローブおよび遺伝子
発現レベルの定量化を用いてモニターされ得、あるいは、遺伝子産物それ自身のレベルが
モニターされ得る（例えば、ＣＡタンパク質に対する抗体および標準的な免疫学的検定法
の使用によって）。あるいは、このタンパク質を用いた結合アッセイおよび生物活性アッ
セイが、以下に概要を述べられているように実施され得る。
【０１４９】
好ましい実施形態において、遺伝子発現のモニタリングが実施され、多くの遺伝子、す
なわち発現プロファイルが同時にモニターされるが、多くのタンパク質の発現をモニター
することが、同様に実施され得る。
【０１５０】
本実施形態において、特定の細胞におけるＣＡ配列の検出および定量化のために、ＣＡ
核酸プローブは、本明細書中に概要を述べられるようなバイオチップに結合される。この
アッセイは、さらに以下に記述される。
【０１５１】
概して、好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、分析前に細胞に添加される
。さらに、スクリーニングは、特定の癌腫の型を調節するか、ＣＡタンパク質を調節する
か、ＣＡタンパク質に結合するか、またはＣＡタンパク質と抗体との結合の間で干渉する
、候補生物活性薬剤を同定するように提供される。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、「候補生物活性薬剤」または「薬物候補」という用語ま
たは文法的な同義語は、癌腫表現型（ＣＡタンパク質に結合し、そして／またはＣＡタン
パク質の生物活性を調節する）またはＣＡ配列の発現（核酸配列およびタンパク質配列の
両方の発現を含む）のいずれかを直接的にもしくは間接的に変え得る、生物活性薬剤につ
いて試験されるべき任意の分子（例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機低分子また
は無機低分子、多糖類、ポリヌクレオチドなど）を記載する。特に好ましい実施形態にお
いて、候補薬剤は、例えば正常組織フィンガープリントに対して、ＣＡ表現型を抑制する
。同様に、候補薬剤は、好ましくは重症ＣＡ表現型を抑制する。概して、複数のアッセイ
混合物は、種々の濃度に対して異なる応答を得るため、異なる薬剤の濃度で平行して実施
される。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃
度または検出レベル未満で）としての役割を果たす。
【０１５３】
一つの局面において、候補薬剤は、ＣＡタンパク質の効果を中和にする。「中和する」
は、細胞に実質的な効果を与えないように、タンパク質の活性が、阻害されるか、または
反対に作用されるかのいずれかを意味する。
【０１５４】
候補薬剤は、多くの化学的分類（代表的にそれらは有機分子または無機分子であるが、
好ましくは１００ダルトンを超え約２，５００ダルトン未満である分子量を有する有機低
分子化合物）を包含する。好ましい低分子は、２０００Ｄ未満または１５００Ｄ未満また
は１０００Ｄ未満または５００Ｄ未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造相互作用
（特に水素結合）に必要な官能基を含み、この官能基としては、代表的には少なくとも一
つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基が挙げられ、好まし
くはこれらの化学官能基のうちの少なくとも二つが挙げられる。候補薬剤は、しばしば、
一つ以上の上記の官能基で置換された環式炭素構造または複素環式構造、および／あるい
は芳香族構造または多芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪
酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、これらの構造アナログまたはそれらの組
み合わせを含む生体分子の中から見出される。ペプチドが、特に、好ましい。
【０１５５】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範囲の多様な供給
源から得られる。例えば、多くの手段が、広範囲の多様な有機化合物および生体分子のラ
ンダム合成そして指向的合成（ランダム化したオリゴヌクレオチドの発現を含む）のため
に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物
のライブラリーが、入手可能であるかまたは容易に生成される。さらに、天然にかまたは
合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および
生物化学的手段により、容易に改変される。公知の薬理学的な薬剤は、構造的アナログを
生成するために、指向的またはランダムな化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化
、アミド化のような）に供され得る。
【０１５６】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤はタンパク質である。本明細書において
「タンパク質」は、少なくとも二つの共有結合されたアミノ酸（それは、タンパク質、ポ
リペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する）を意味する。タンパク質は、天
然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造から構成され得
る。このように、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、
天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルア
ラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考慮される
。「アミノ酸」はまた、イミノ酸残基（プロリンおよびヒドロキシプロリンのような）も
包含する。側鎖は、（Ｒ）体または（Ｓ）体のいずれかであり得る。好ましい実施形態に
おいて、アミノ酸は、（Ｓ）体または（Ｌ）体である。天然に存在しない側鎖が使用され
る場合、非アミノ酸置換基が、例えば、インビボでの分解を妨げるかもしくは遅らせるた
めに使用され得る。
【０１５７】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、天然に存在するタンパク質または天
然に存在するタンパク質のフラグメントである。このように、例えば、タンパク質を含有
する細胞抽出物、またはタンパク様の細胞抽出物のランダム消化物もしくは指向的な消化
物が使用され得る。この方法において、原核生物タンパク質および真核生物タンパク質の
ライブラリーは、本発明の方法でスクリーニングするために生成され得る。本実施形態に
おいて、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類のタンパク質のライブラリーが特に好ましく
、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０１５８】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、約５〜約３０アミノ酸のペプチドであり
、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５アミノ酸が特に好ましい。そのペプチ
ドは、上記に概要を述べられているような、天然に存在するタンパク質、ランダムなペプ
チド、または「偏った（ｂｉａｓｅｄ）」ランダムなペプチドの消化物であり得る。本明
細書中の「ランダム化」または文法的な同義語は、本質的にランダムなヌクレオチドおよ
びアミノ酸からなる、それぞれ核酸およびペプチドのいずれかを意味する。概して、これ
らのランダムなペプチド（または核酸、以下に検討される）は、化学的に合成されるので
、それらは、任意の位置で、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込み得る。合成プ
ロセスは、ランダム化されたタンパク質または核酸を生成するように設計され、配列の長
さにわたる全てのまたはほとんどの可能な組み合わせの形成を可能にし、従ってランダム
化された候補生物活性タンパク様薬剤のライブラリーを形成し得る。
【０１５９】
１つの実施形態において、ライブラリーは、どの位置にも配列優先性または一定配列を
有さずに、十分にランダム化される。好ましい実施形態において、ライブラリーは偏って
いる。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定配列を保持されるか、または限られた
数の可能性から選択されるかのいずれかである。例えば、好ましい実施形態において、ヌ
クレオチドまたはアミノ酸残基は、規定された種類（例えば、疎水性アミノ酸、親水性残
基、立体的に偏った（小さいかまたは大きいかのいずれか）残基、核酸結合ドメインの生
成について、システインの生成、架橋について、ＳＨ−３ドメインについてのプロリン、
リン酸化部位についてのセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジンなど、または、
プリンなど）内でランダム化される。
【０１６０】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、上記で規定されるような核酸である
。
【０１６１】
タンパク質について概して上で記述されるように、核酸候補生物活性薬剤は、天然に存
在する核酸、ランダムな核酸、または「偏った」ランダムな核酸であり得る。例えば、原
核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質について上記に概要を述べら
れたように使用され得る。
【０１６２】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、有機化学的部分であり、その広い範
囲は文献において入手可能である。
【０１６３】
一つ以上のＣＡ遺伝子の発現プロファイルを変更するためのアッセイにおいて、候補薬
剤が添加され、細胞がしばらくの間インキュベートされた後、分析される標的配列を含む
サンプルは、バイオチップに添加される。必要な場合、標的配列は、公知技術を用いて調
製される。例えば、公知の溶解緩衝液、エレクトロポレーションなどを用いて、当業者に
理解されるような精製および／または必要に応じて生じるＰＣＲのような増幅を用いて、
サンプルは細胞を溶解するように処理され得る。例えば、ヌクレオシドに共有結合された
標識を用いてインビトロの転写が行われる。概して、核酸は、本明細書中で規定されるよ
うに、標識（ビオチン−ＦＩＴＣまたはＰＥ、ｃｙ３およびｃｙ５が特に好ましい）を用
いて標識化される。
【０１６４】
好ましい実施形態において、標的配列は、プローブに対する標的配列の特異的な結合を
検出する手段を与えるために、例えば、蛍光シグナル、化学発光シグナル、化学シグナル
もしくは放射線シグナルを用いて標識される。標識はまた、検出され得る生成物を適切な
基質が生成するのであれば、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュペルオ
キシダーゼのような酵素であり得る。あるいは、標識は、標識化合物または標識低分子（
酵素阻害剤のような）であり得、それは、酵素に結合するが、触媒も変化もされない。標
識はまた、部分または化合物（例えば、エピトープタグ、もしくはストレプトアビジンに
特異的に結合するビオチン）であり得る。ビオチンの例について、ストレプトアビジンは
、上記に記述されたように標識化され、それにより、結合された標的配列に検出可能なシ
グナルを提供する。当該分野で公知のように、非結合標識ストレプトアビジンは、分析前
に除去される。
【０１６５】
当業者に理解されるように、これらのアッセイは、直接的なハイブリダイゼーションア
ッセイであり得るか、または「サンドイッチアッセイ」（それは多くのプローブの使用を
含み、概して米国特許第５,６８１,７０２号、同第５,５９７,９０９号、同第５,５４５,
７３０号、同第５,５９４,１１７号、同第５,５９１,５８４号、同第５,５７１,６７０号
、同第５,５８０,７３１号、同第５,５７１,６７０号、同第５,５９１,５８４号、同第５
,６２４,８０２号、同第５,６３５,３５２号、同第５,５９４,１１８号、同第５,３５９,
１００号、同第５,１２４,２４６号および同第５,６８１,６９７号（これらの全てが本明
細書中で参考として援用される）に概要が述べられている）を包含し得る。本実施形態に
おいて、一般的に、標的核酸は、上記に概要が述べられているように調製され、次いで、
ハイブリダイゼーション複合体を形成をさせる条件下で、複数の核酸プローブを含むバイ
オチップに添加される。
【０１６６】
多様なハイブリダイゼーションの条件が、本発明で使用され得、上記に概要が述べられ
ているような高ストリンジェンシー条件、中程度ストリンジェンシー条件および低いスト
リンジェンシー条件を包含する。アッセイは、概してストリンジェンシー条件下で実施さ
れ、これは、標的の存在下のみで標識プローブハイブリダイゼーション複合体を形成させ
る。ストリンジェンシーは、工程パラメータ（熱力学的変数であり、温度、ホルムアミド
濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度等が挙げられるが、これらに限
定されない）を変えることにより制御され得る。
【０１６７】
これらのパラメータはまた、概して米国特許第５,６８１,６９７号に概要が述べられて
いるように、非特異的な結合を制御するために使用され得る。従って、非特異的な結合を
減少するため、より高いストリンジェンシー条件で特定の工程を実施することが望ましく
あり得る。
【０１６８】
本明細書中で概要が述べられた反応は、当業者に理解されるように、多様な方法で達成
され得る。反応の構成要素は、任意の順序で、同時にまたは連続的に添加され得、好まし
い実施形態は、以下に概要を述べられる。さらに、反応は、アッセイに含有され得る多く
の他の試薬を含有し得る。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン
）、界面活性剤等の様な試薬を含み、これらは最適なハイブリダイゼーションおよび検出
を容易にするために使用され得、そして／または非特異的な相互作用もしくはバックグラ
ウンドの相互作用を減少するために使用され得る。また、アッセイの効率を別な方法で改
善する試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などのような）が使
用され得、それはサンプル調製法および標的の純度に依存する。さらに、固相または液体
ベースの（すなわちキネティックＰＣＲ）いずれかのアッセイが使用され得る。
【０１６９】
一度そのアッセイが実施されると、データは、個々の遺伝子の発現レベル、および状態
の間の発現レベルの変化を決定するために分析され、遺伝子発現プロファイルを形成する
。
【０１７０】
好ましい実施形態において、診断用途および予後用途に関しては、任意の一つの状態で
重要な差次的に発現された遺伝子または変異遺伝子を同定した後、スクリーニングが、遺
伝子個々の発現を変えるために実施され得る。すなわち、単一遺伝子発現の制御を調節す
るためのスクリーニングが行われ得る。このように、例えば、特にその存在または非存在
が２つの状態の間で独特である標的遺伝子の場合において、スクリーニングは標的遺伝子
発現の調節因子に対して行われる。
【０１７１】
さらに、スクリーニングは、候補因子に応答して誘導される新規遺伝子について行われ
得る。正常な発現パターンを導くＣＡ発現パターンを抑制する能力または正常組織からの
遺伝子発現を模倣するように１つのＣＡ遺伝子発現プロファイルを調節するその能力に基
づいて候補因子を同定した後、上記に記述されるようなスクリーニングが、その因子に応
答して特に調節される遺伝子を同定するために実施され得る。正常組織と因子で処理され
たＣＡ組織との間で発現プロファイルを比較することは、正常組織またはＣＡ組織で発現
されないが因子で処理された組織で発現される遺伝子を明らかにする。これらの因子特異
的な配列は、同定され得、そしてＣＡ遺伝子またはＣＡタンパク質について本明細書で記
述された任意の方法により使用され得る。特に、これらの配列およびそれらがコードする
タンパク質は、因子で処理された細胞に目印をつけるかまたは同定することにおける用途
を発見する。さらに、抗体が、因子誘導タンパク質に対して惹起され得、そして、処理さ
れたＣＡ組織サンプルに対して新規治療薬を標的化するために使用され得る。
【０１７２】
このように、一つの実施形態において、このように関連したＣＡ発現プロファイルを有
する候補因子が、ＣＡ細胞集団に対して投与される。本明細書中の「投与」または「接触
」は、候補因子が、摂取および細胞内作用、または細胞表面での作用のいずれかにより、
因子が細胞に作用するようにする様式で細胞に添加されることを意味する。ある実施形態
において、タンパク質様候補因子（すなわちペプチド）をコードする核酸は、ウイルス構
築物（例えば、レトロウイルス構築物）に入れられ得、そして、細胞に添加され、その結
果、ペプチド因子の発現が達成される（ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９を参照のこと、本
明細書中で参考として明示的に援用される）。
【０１７３】
一旦、候補因子が細胞に投与されると、所望される場合に細胞は洗浄され得、そして、
いくらかの期間好ましい生理条件下でインキュベートされる。次いで、本明細書で概要を
述べたように、細胞が回収され、新しい遺伝子発現プロファイルが生成される。
【０１７４】
このように、例えば、ＣＡ組織は、ＣＡ表現型を減少するかまたは抑制する因子につい
てスクリーニングされ得る。少なくとも一つの遺伝子の発現プロファイルの変化は、因子
がＣＡ活性に対する効果を有すことを示す。ＣＡ表現型に対するこのようなサイン（ｓｉ
ｇｎａｔｕｒｅ）を規定することにより、その表現型を変える新しい薬物のスクリーニン
グが考案され得る。このアプローチの場合、薬物の標的は公知である必要はなく、元々の
発現スクリーニングプラットフォームにおいて示される必要もなく、標的タンパク質につ
いての転写レベルが変化する必要もない。
【０１７５】
好ましい実施形態において、上記で概要を述べたように、スクリーニングは個々の遺伝
子および遺伝子産物（タンパク質）に対して実施され得る。すなわち、特定の状態におい
て重要であるような特に差次的に発現される遺伝子が同定された後、その遺伝子または遺
伝子産物それ自身の発現のいずれかの調節因子のスクリーニングが行われ得る。差次的に
発現された遺伝子の遺伝子産物は、時々、本明細書中で「ＣＡタンパク質」または「ＣＡ
Ｐ」といわれる。ＣＡＰは、フラグメントであり得るか、あるいは、表１の核酸によりコ
ードされる全長タンパク質またはフラグメントであり得る。好ましくは、ＣＡＰは、フラ
グメントである。別の実施形態において、配列は、さらに本明細書に記述されているよう
な配列改変体である。
【０１７６】
好ましくは、ＣＡＰは、約１４〜２４のアミノ酸長のフラグメントである。さらに好ま
しくは、フラグメントは可溶性フラグメントである。好ましくは、フラグメントは、非膜
貫通領域を含む。好ましい実施形態において、フラグメントは、溶解性を補助するために
Ｎ末端にＣｙｓを有する。一つの実施形態において、フラグメントのｃ末端は、遊離酸と
して保たれ、Ｎ末端は、（例えば、システインに対する）結合を補助するための遊離アミ
ンである。
【０１７７】
一つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、本明細書中で検討されているように、免
疫原性因子に結合体化される。一つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、ＢＳＡに結
合体化される。
【０１７８】
好ましい実施形態において、スクリーニングは、ＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝子の発現産
物の生物学的機能を変えるために実施される。また、特定の状態にある遺伝子の重要性を
同定された後、遺伝子産物を結合し、そして／または遺伝子産物の生物学的活性を調節す
る因子についてのスクリーニングは、以下にさらに十分に概要を述べるように実行され得
る。
【０１７９】
好ましい実施形態において、スクリーニングは、ＣＡタンパク質に結合し得る候補因子
をまず見つけるように設計され、次いで、これらの因子は、ＣＡＰ活性および癌腫表現型
を調節する候補因子の能力を評価するアッセイにおいて使用され得る。このように、当業
者に理解されるように、実施され得る多くの様々なアッセイ（結合アッセイおよび活性ア
ッセイ）が存在する。
【０１８０】
好ましい実施形態において、結合アッセイが実施される。一般的に、精製または単離さ
れた遺伝子産物が使用される；すなわち、一つ以上のＣＡ核酸の遺伝子産物が生成される
。一般的に、これは、当該分野に公知であるように実施される。例えば、抗体が、タンパ
ク質遺伝子産物に対して産生され、標準免疫アッセイは、存在するタンパク質量を決定す
るために実行される。あるいは、ＣＡタンパク質を含む細胞が、アッセイに使用され得る
。
【０１８１】
このように、好ましい実施形態において、方法は、ＣＡタンパク質と候補生物活性因子
とを合わせる工程、およびＣＡタンパク質への候補因子の結合を決定する工程を包含する
。好ましい実施形態はヒトまたはマウスのＣＡタンパク質を利用するが、他の哺乳動物タ
ンパク質をまた、例えば、ヒト疾患の動物モデルの開発のために使用され得る。いくつか
の実施形態において、本明細書に概要が述べられるように、改変体または誘導体のＣＡタ
ンパク質が使用され得る。
【０１８２】
概して、本明細書中の方法の好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質または候補因
子は、単離されたサンプル受容領域（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）
を有する、不溶性支持体に非拡散的に結合される。この不溶性支持体は、任意の組成物か
ら生成され得、これらの組成物は、この支持体に結合され得、可溶性物質から容易に分離
され、そうでなければ、全般的なスクリーニング方法と適合性である。このような支持体
の表面は、中実または多孔性であり得、任意の都合のよい形状である。適切な不溶性支持
体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げら
れる。これらは、代表的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類
、ナイロンもしくはニトロセルロース、ＴｅｆｌｏｎＴＭなどから生成される。マイクロ
タイタープレートおよびアレイは、特に都合がよい。なぜなら、少量の試薬およびサンプ
ルを用いて、膨大な数のアッセイが同時に実行され得るからである。組成物の特定の結合
様式は、本発明の試薬および全般的な方法と適合性であり、組成物の活性を維持し、そし
て、非拡散性である限り、重要ではない。好ましい結合方法としては、抗体（タンパク質
が支持体に結合される場合、リガンド結合部位または活性化配列のいずれも立体的にブロ
ックしない）、「粘着性」支持体またはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、表面
上でのタンパク質または因子の合成などの使用が挙げられる。タンパク質または因子の結
合後、過剰の非結合性材料は洗浄により除去される。次いで、サンプル受容領域は、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害なタンパク質もしくは他の成分との
インキュベーションによりブロック化され得る。
【０１８３】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は支持体に結合され、そして候補生物活性
因子は、アッセイに添加される。あるいは、候補因子は、支持体に結合され、ＣＡタンパ
ク質が添加される。新規結合因子としては、特定の抗体、化学ライブラリーのスクリーニ
ングで同定された非天然の結合因子、ペプチドアナログなどが挙げられる。ヒト細胞に対
して低い毒性を有する因子についてのスクリーニングアッセイは特に興味深い。広範囲の
多様なアッセイが、この目的のために使用され得、このアッセイとしては、標識化インビ
トロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質
結合についての免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などが挙げられ
る。
【０１８４】
ＣＡタンパク質への候補生物活性因子の結合の決定は、多くの方法で実施され得る。好
ましい実施形態において、候補生物活性因子は標識され、結合が直接的に決定される。例
えば、これは、固体支持体にＣＡタンパク質の全てまたは一部を結合することにより、標
識化候補因子（例えば、蛍光標識）を添加すること、過剰な試薬を洗い流すこと、そして
標識が固体支持体上に存在するかどうかを決定することにより、実施され得る。多様なブ
ロッキング工程および洗浄工程が、当該分野で公知であるように利用され得る。
【０１８５】
本明細書中の「標識化」は、検出可能なシグナルを提供する標識（例えば、放射線同位
体、蛍光体、酵素、抗体、磁気粒子のような粒子、化学発光体または特異的な結合分子な
ど）を用いて、化合物が直接的または間接的のいずれかで標識化されることを意味する。
特異的な結合分子は、ビオチンとストレプトアビジンや、ジゴキシンと抗ジゴキシンなど
のような対を含む。特異的な結合メンバーについて、相補的なメンバーは、通常、上に概
要を述べたように、公知の手順に従って、検出を提供する分子を用いて標識化される。標
識は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に与え得る。
【０１８６】
ある実施形態において、構成要素の一つのみが標識化される。例えば、タンパク質（ま
たはタンパク様候補因子）は、１２５Ｉまたは発蛍光団を用いてチロシン位で標識され得
る。あるいは、１個より多くの成分が、異なる標識を用いて（例えば、タンパク質につい
て１２５Ｉを用いて、そして候補因子について蛍光体を用いて）標識され得る。
【０１８７】
好ましい実施形態において、候補生物活性因子の結合は、競合結合アッセイの使用によ
り決定される。この実施形態において、競合剤は、標的分子（すなわち、ＣＡタンパク質
）に結合することが公知の結合部分（例えば、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガン
ドなど）である。特定の状況下で、生物活性因子と結合部分との間で生物活性因子を置換
する結合部分との競合的結合が存在し得る。
【０１８８】
ある実施形態において、候補生物活性因子は標識される。候補生物活性因子または競合
剤のいずれか、あるいはその両方が、存在する場合には結合させるのに十分な時間の間、
タンパク質にまず添加される。インキュベーションは、最適の活性を容易にする任意の温
度（代表的には４℃〜４０℃の間）で実施され得る。インキュベーション期間は、最適の
活性について選択されるが、また、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にする
ために最適化もされ得る。代表的に、０．１〜１時間の間が十分である。過剰の試薬は、
概して除去されるかもしくは洗い流される。次いで、第２番目の成分要素が添加され、標
識された成分の存在もしくは非存在が追跡され、結合を示す。
【０１８９】
好ましい実施形態において、競合剤が、まず添加され、その後、候補生物活性因子が添
加される。競合剤の置換は、候補生物活性因子がＣＡタンパク質に結合していることを示
し、従って、ＣＡタンパク質に結合し得、ＣＡタンパク質の活性を潜在的に調節し得る。
この実施形態において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競合剤が標識
化される場合、洗浄溶液中の標識の存在は、その因子による置換を表す。あるいは、候補
生物活性因子が標識される場合、支持体上の標識の存在は、置換を表す。
【０１９０】
代替的な実施形態において、候補生物活性因子がまず添加され、インキュベーションお
よび洗浄を行い、その後、競合剤が添加される。競合剤による結合の非存在は、生物活性
因子がより高い親和性でＣＡタンパク質と結合される、ということを表し得る。従って、
候補生物活性因子が標識される場合、支持体上の標識の存在は、競合剤結合の欠如と合わ
せて、候補因子がＣＡタンパク質に結合し得ることを表し得る。
【０１９１】
好ましい実施形態において、この方法は、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性
因子を同定するために、差次的スクリーニング工程を包含する。この実施形態において、
この方法は、第１サンプル中の、ＣＡタンパク質と競合剤とを組み合わせる工程を包含す
る。第２サンプルは、候補生物活性因子、ＣＡタンパク質および競合剤を含む。競合剤の
結合が、両サンプルについて決定され、そして２つのサンプル間の結合の変化または相違
は、ＣＡタンパク質に結合し得る因子の存在、およびその活性を潜在的に調節することを
表す。すなわち、競合剤の結合が、第１サンプルに比べて第２サンプルにおいて異なる場
合、その因子は、ＣＡタンパク質に結合し得る。
【０１９２】
あるいは、好ましい実施形態は、ネイティブなＣＡタンパク質に結合するが改変された
ＣＡタンパク質に結合し得ない、薬物候補を同定するために差次的スクリーニングを利用
する。ＣＡタンパク質の構造は、モデル化され得、その部位と相互作用する因子を合成す
るために、合理的な薬物設計において使用され得る。ＣＡ生物活性に影響を及ぼす薬物候
補はまた、タンパク質の活性を増強または減少のいずれかをする能力について、薬物をス
クリーニングすることにより同定される。
【０１９３】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、アッセイにおいて使用され
得る。好ましくは、全てのコントロールおよび試験サンプルは、統計上有意な結果を得る
ために、少なくとも三連で実施される。全てのサンプルのインキュベーションは、タンパ
ク質に因子を結合するために十分な時間の間である。インキュベーション後、全てのサン
プルは、非特異的に結合された材料を含まないように洗浄され、そして結合された（概し
て、標識された因子）量が決定される。例えば、放射標識が使用される場合で、サンプル
は、結合化合物量を決定するために、シンチレーションカウンターで計数され得る。
【０１９４】
多様な他の試薬は、スクリーニングアッセイにおいて包まれ得る。これらは、試薬（塩
、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤など）を含み、それは、最適なタ
ンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的な相互作用もしくはバッ
クグラウンド相互作用を減らすために使用され得る。そうでなければ、アッセイの効率を
改善する試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤など）もまた、使
用され得る。成分の混合物は、必須の結合を提供する任意の順番で添加され得る。
【０１９５】
ＣＡタンパク質の活性を調節する因子のスクリーニングもまた、実施され得る。好まし
い実施形態において、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性因子をスクリーニング
する方法は、上述のように、ＣＡタンパク質のサンプルに候補生物活性因子を添加する工
程およびＣＡタンパク質の生物学的活性の変化を決定する工程を包含する。「ＣＡタンパ
ク質の活性を調節する」ことは、活性の増大；活性の減少、または存在する活性の型もし
くは種類の変化を包含する。このように、この実施形態において、候補因子は、ＣＡタン
パク質と結合すること（これは必要というわけではないが）および本明細書中に規定され
るその生物学的活性または生化学的な活性を変えること、の両方をすべきである。この方
法は、ＣＡタンパクの存在、分布、活性または量の変化について、インビトロのスクリー
ニング方法（概して上に概要が述べられるように）およびインビボの細胞スクリーニング
の両方を包含する。
【０１９６】
従って、この実施形態において、この方法は、ＣＡサンプルと候補生物活性因子とを組
み合わせる工程、およびＣＡ活性に対する効果を評価する工程を包含する。本明細書中に
おいて「ＣＡ活性」または文法的な同義語は、ＣＡタンパク質の生物学的活性（腫瘍形成
（細胞分裂、好ましくはリンパ組織における細胞分裂、細胞増殖、腫瘍増殖および細胞の
形質転換を包含する）が挙げられるがこれらに限定されない）におけるその役割のうちの
一つを意味する。一つの実施形態において、ＣＡ活性は、表１の核酸によりコードされる
タンパク質の活性化、または、表１の核酸によりコード化されたタンパク質による活性化
を包含する。ＣＡ活性の阻害剤は、任意の一つ以上のＣＡ活性の阻害である。
【０１９７】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質の活性は増大される；別の好ましい実施形
態において、ＣＡタンパク質の活性は減少される。従って、アンダゴニストである生物活
性因子は、いくつかの実施形態において好ましく、アゴニストである生物活性因子は、他
の実施形態において好ましくあり得る。
【０１９８】
好ましい実施形態において、本発明は、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性因
子をスクリーニングするための方法を提供する。本方法は、ＣＡタンパク質を含む細胞に
、上に規定されるような候補生物活性因子を添加する工程を包含する。好ましい細胞型は
、ほとんどの任意の細胞を含む。この細胞は、ＣＡタンパク質をコードする組換え核酸を
含む。好ましい実施形態において、候補因子のライブラリーは、複数の細胞に対して試験
される。
【０１９９】
一つの局面において、このアッセイは、生理学的なシグナル（例えば、ホルモン、抗体
、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法剤を包含する薬理学的
な因子、放射線、発癌剤、または他の細胞（すなわち、細胞と細胞との接触））の存在下
または非存在下、あるいはこれらの生理学的なシグナルの曝露前または曝露後で評価され
る。別の実施例において、決定因子は、細胞周期過程の異なる段階で決定される。
【０２００】
このようにして、生物活性因子は同定される。薬理学的な活性を有する化合物は、ＣＡ
タンパク質の活性を増強し得るか、または妨害し得る。
【０２０１】
一つの実施形態において、癌腫癌細胞分裂を阻害する方法が提供される。本方法は、癌
腫癌阻害剤の投与を包含する。
【０２０２】
好ましい実施形態において、リンパ腫癌腫細胞分裂を阻害する方法を提供し、この方法
は、リンパ腫癌腫阻害剤の投与を包含する。
【０２０３】
好ましい実施形態において、乳癌癌腫細胞分裂を阻害する方法を提供し、この方法は、
乳癌癌腫阻害剤の投与を包含する。
【０２０４】
別の実施形態において、腫瘍増殖を阻害する方法が提供される。本方法は、癌腫癌阻害
剤の投与を包含する。特に好ましい実施形態において、リンパ組織において腫瘍増殖を阻
害する方法を提供し、この方法は、リンパ腫阻害剤の投与を包含する。
【０２０５】
別の実施形態において、腫瘍増殖を阻害する方法が提供される。本方法は、癌腫癌阻害
剤の投与を包含する。特に好ましい実施形態において、哺乳動物組織において腫瘍増殖を
阻害する方法を提供し、この方法は、乳癌阻害剤の投与を包含する。
【０２０６】
さらなる実施形態において、細胞を処理する方法または癌を有する個体を処置する方法
が提供される。本方法は、癌腫癌阻害剤の投与を包含する。一つの実施形態において、癌
腫は乳癌癌腫である。代替の実施形態において、癌腫はリンパ腫である。
【０２０７】
一つの実施形態において、癌腫性癌阻害剤は、上記で検討されたような抗体である。別
の実施形態において、癌腫癌阻害剤は、アンチセンス分子である。本明細書中で使用され
る場合、アンチセンス分子は、癌腫性癌分子についての標的ｍＲＮＡ（センス）配列また
は標的ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの
いずれか）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを
含む。本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは
、概して、少なくとも約１４ヌクレオチドのフラグメント、好ましくは約１４〜３０ヌク
レオチドのフラグメントを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、以
下に記述される：例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
４８：２６５９，（１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ６：９５８，（１９８８）。
【０２０８】
アンチセンス分子は、リガンド結合分子を用いた結合体形成により、標的ヌクレオチド
配列を含む細胞に導入され得る（ＷＯ９１／０４７５３に記載）。適切なリガンド結合分
子は、限定されないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞
表面レセプターに結合する他のリガンドを包含する。好ましくは、リガンド結合分子の結
合体は、リガンド結合分子が、その対応する分子もしくはレセプターに結合する能力を実
質的に妨げないか、または、センスセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド、もしくはその結合体バージョンの細胞への進入をブロックしない。ある
いは、センスセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリ
ゴヌクレオチド脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞へ導入され得る（ＷＯ
９０／１０４４８に記載）。アンチセンス分子またはノックアウトモデルおよびノックイ
ンモデルの使用はまた、処理方法に加えて、上記で検討されているような、スクリーニン
グアッセイで使用され得ることが理解される。
【０２０９】
所望の薬理活性を有する化合物は、前述したように、宿主に対して生理学的に受容可能
なキャリア中で投与され得る。薬剤は、多様な方法、経口、非経口（例えば、皮下、腹腔
内、脈管内など）で投与され得る。導入方法により、化合物は、多様な方法で処方され得
る。処方物中の、治療活性化合物の濃度は、約０．１〜１００％（重量／体積）で変動し
得る。薬剤は、単独、または他の処置（すなわち、放射線）と組み合わせて投与され得る
。
【０２１０】
薬学的組成物は、多様な形態（例えば、顆粒、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル、懸濁剤、
軟膏剤、ローション剤など）で調製され得る。経口および局所の使用に適した、医薬品等
級の有機または無機のキャリアおよび／または希釈剤は、治療活性化合物を含む組成物を
構成するために使用され得る。当該分野に公知の希釈剤としては、水性媒体、植物および
動物油、および脂肪が挙げられる。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変える塩、
または適切なｐＨ値に安定化するための緩衝液および皮膚浸透増強剤は、補助剤として使
用され得る。
【０２１１】
理論に束縛されないが、種々のＣＡ配列は、癌腫において重要であるようである。従っ
て、変異体または改変体のＣＡ遺伝子に基づいた障害が、決定され得る。一つの実施形態
において、本発明は、細胞において少なくとも一つの内因性ＣＡ遺伝子の配列の全部また
は一部を決定することを包含する、改変体ＣＡ遺伝子を含む細胞を同定するための方法を
提供する。当業者により理解されるように、これは、任意の数の配列決定の技術を使用し
て行われ得る。好ましい実施形態において、本発明は、個体の少なくとも一つのＣＡ遺伝
子（例えば、ＰＲＬＲ）の配列の全部または一部を決定することを包含する、個体のＣＡ
遺伝子型を同定する方法を提供する。これは、概して、少なくとも一つの個体組織におい
て実施され、多くの組織または同一組織の異なるサンプルの評価を包含し得る。この方法
は、配列決定されたＣＡ遺伝子の配列と公知のＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝子（すなわち、
野生型遺伝子）とを比較することを包含し得る。当業者により理解されるように、ある癌
遺伝子の配列における変化は、疾患の存在または疾患を発生する傾向、または予後評価の
いずれかの指標であり得る。
【０２１２】
次いで、ＣＡ遺伝子（例えば、ＰＲＬＲ）の全部または一部の配列は、なんらかの相違
が存在するか否かを決定するために公知のＣＡ遺伝子の配列と比較され得る。これは、任
意の数の公知の相同性プログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔなど）を用いて、実施され得
る。好ましい実施形態において、患者のＣＡ遺伝子（例えば、ＰＲＬＲ）と公知ＣＡ遺伝
子との間の配列における相違の存在は、本明細書で概要が述べられているように、疾患状
態の指標または疾患状態についての傾向の指標である。
【０２１３】
好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ゲノムにおけるＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝
子のコピー数を決定するためのプローブとして使用され得る。例えば、いくつかの癌は、
染色体欠失または染色体挿入を呈し、その結果、遺伝子のコピー数が変化する。
【０２１４】
別の好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ＣＡ遺伝子の染色体位置を決定するた
めのプローブとして使用される。特に染色体異常（例えば、転座など）などがＣＡ遺伝子
座（例えば、ＰＲＬＲ遺伝子座）で同定された際、染色体位置のような情報は、診断また
は予後診断を提供する有効性を見出す。
【０２１５】
このように、一つの実施形態において、細胞または生物でのＣＡを調節する方法を提供
する。一つの実施形態において、この方法は、内因性ＣＡタンパク質の生物学的活性を減
少または排除する抗ＣＡ抗体を細胞に投与することを包含する。あるいは、この方法は、
ＣＡタンパク質をコードする組換え核酸を、細胞または生物に投与することを包含する。
当業者により理解されるように、これは、任意の数の方法で実行され得る。好ましい実施
形態において、例えば、ＣＡ配列が癌腫においてダウンレギュレーションされた際、例え
ば、公知の遺伝子治療技術を用いて、細胞内のＣＡ量の増加（例えば、内因性ＣＡを過剰
発現することにより、またはＣＡ配列をコードする遺伝子を投与することにより）により
、ＣＡ遺伝子の活性は増大される。好ましい実施形態において、遺伝子治療技術は、増強
された相同組換え（ＥＨＲ）（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８（本明細書中で全
体が参考として援用される）に記述されるような）を用いる外因性遺伝子の組み込みを包
含する。あるいは、例えばＣＡ配列が癌腫においてアップレギュレーションされる際、内
因性ＣＡ遺伝子の活性は、例えば、ＣＡアンチセンス核酸の投与により減少される。
【０２１６】
一つの実施形態において、本発明のＣＡタンパク質は、ＣＡタンパク質に対するポリク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するために使用され得、それらの抗体は、
本明細書に記載されるように有用である。同様に、ＣＡタンパク質は、標準技術を用いて
、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合され得る。次いで、これらのカラムは
、ＣＡ抗体を精製するために使用され得る。好ましい実施形態において、この抗体は、Ｃ
Ａタンパク質に特有のエピトープに対して生成される；すなわち、抗体は、他のタンパク
質に対して、ほとんどもしくは全く交差反応を示さない。これらの抗体は、多くの適用に
おいて有用性を見出す。例えば、ＣＡ抗体は、標準アフィニティークロマトグラフィーカ
ラムに結合され得、ＣＡタンパク質を精製するために使用され得る。抗体はまた、ＣＡタ
ンパク質に特異的に結合するので、上に概要が述べられているように、ポリペプチドをブ
ロッキングするために使用され得る。
【０２１７】
一つの実施形態において、治療有効用量のＣＡまたはその調節因子は、患者に投与され
る。本明細書中の「治療有効用量」は、投与される効果を生じる用量を意味する。正確な
用量は、処置目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確かめられ得る。当該分野
で公知なように、ＣＡ分解、全身送達 対 局所送達および新しいプロテアーゼ合成速度
、ならびに年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与回数、薬物相互作用および状態
の重症度についての調整が必要であり得、当業者により慣用的な実験により確かめられ得
る。
【０２１８】
本発明の目的のための「患者」は、ヒトならびに他の動物（特に哺乳動物）および生物
の双方を包含する。このように、この方法は、ヒト治療および獣医学の適用の双方に適用
可能である。好ましい実施形態において、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態
では、患者はヒトである。
【０２１９】
本発明のＣＡタンパク質および調節因子の投与は、上で検討されたように、多様な方法
（限定されていないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、
膣的、直腸的または眼内を包含する）において実施され得る。いくつかの例において、例
えば、創傷および炎症の処置において、ＣＡタンパク質および調節因子が、溶液またはス
プレーとして、直接適用され得る。
【０２２０】
本発明の薬学的組成物は、患者への投与に適切な形態でＣＡタンパク質を含む。好まし
い実施形態において、薬学的組成物は、水溶性形態（例えば、薬学的に受容可能な塩とし
て存在する）であり、これは、酸および塩基の双方の付加塩を包含することを意味する。
「薬学的に受容可能な酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的効果を保持し、そして以下の酸
と生物学的には形成されず、他の点では所望される塩をいい、酸としては、無機酸（例え
ば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）および有機酸（例えば、酢酸、プロピ
オン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマ
ル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンス
ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）である。「薬学的に受容可能な塩
基付加塩」としては、無機塩基の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニ
ウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウ
ム塩など）から誘導される塩が挙げられる。特に好ましくは、アンモニウム塩、カリウム
塩、ナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩である。薬学的に受容可能な有機
非毒性塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミンの塩、置換アミン（
天然に存在する置換アミンを包含する）、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（例え
ば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリ
プロピルアミンおよびエタノールアミン）が挙げられる。
【０２２１】
薬学的組成物はまた、以下の一つ以上を含み得る：血清アルブミンのような、キャリア
タンパク質；緩衝剤；微晶性セルロース、乳糖、トウモロコシデンプンおよび他のデンプ
ンのような、充填剤；結合剤；甘味料および他の矯味矯臭剤；着色剤；およびポリエチレ
ングルコール。添加剤は、当該分野に周知であり、多様な処方物で使用される。
【０２２２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質および調節因子は、治療薬として投与され
、上に概要が述べられているように、処方され得る。同様に、ＣＡ遺伝子（全長配列、部
分配列の両方またはＣＡコード領域の調節配列を含む）は、当該分野に公知なように、遺
伝子治療の適用において投与され得る。これらのＣＡ遺伝子は、当業者により理解される
ように、遺伝子治療（すなわち、ゲノムへの組み込み）として、またはアンチセンス組成
物としてのいずれかで、アンチセンスの適用を包含し得る。
【０２２３】
好ましい実施形態において、ＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝子は、ＤＮＡワクチン（単一遺
伝子またはＣＡ遺伝子の組み合わせのいずれか）として投与される。裸のＤＮＡワクチン
は、概して当該分野で公知である、Ｂｒｏｗｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，１６：１３０４〜１３０５（１９９８）。
【０２２４】
一つの実施形態において、本発明のＣＡ遺伝子は、ＤＮＡワクチンとして使用される。
ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用のための方法は、当業者に対して周知であり、癌腫
を有する患者における発現のためのプロモーターの制御下に、ＣＡ遺伝子またはＣＡ遺伝
子の一部を配置することを包含する。ＤＮＡワクチンで使用されるＣＡ遺伝子は、全長Ｃ
Ａタンパク質をコードし得るが、さらに好ましくは、ＣＡタンパク質由来のペプチドを含
むＣＡタンパク質の一部をコードし得る。好ましい実施形態において、患者は、ＣＡ遺伝
子由来の複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫される。同様に、本明細書
で定義されるような、複数のＣＡ遺伝子またはその部分を用いて、患者を免疫することが
可能である。理論に束縛されないが、ＣＡタンパク質を発現する細胞を認識しそして破壊
もしくは除去する、ＤＮＡワクチンによりコードされるポリペプチドの発現、細胞傷害性
Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および抗体が、誘導される。
【０２２５】
好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンとともに、アジュバン
ト分子をコード化する遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、サイトカイン（Ｄ
ＮＡワクチンによりコードされるＣＡポリペプチドに対する免疫原性応答を増大する）を
含む。さらなるアジュバントまたは代替的なアジュバントは、当業者に公知であり、発明
での有用性を見出す。
【０２２６】
別の好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、癌腫（特に乳癌またはリンパ腫性癌腫
）の動物モデルを生成する有用性を見出す。当業者により理解されるように、同定された
ＣＡ遺伝子が、ＣＡ組織内で抑制または減少される際、アンチセンスＲＮＡがＣＡ遺伝子
に指向された遺伝子治療技術はまた、遺伝子の発現を減少または抑制する。そのように生
成された動物は、生物活性薬剤候補のスクリーニングにおける有用性を見出すＣＡの動物
モデルとして機能する。同様に、遺伝子ノックアウト技術は、例えば、適切な遺伝子標的
化ベクターを用いた相同性組換えの結果として、ＣＡタンパク質の非存在という結果をも
たらす。所望ならば、ＣＡタンパク質の組織特異的な発現またはノックアウトは、必要で
あり得る。
【０２２７】
ＣＡタンパク質が、癌腫において過剰に発現されることもまた、可能である。従って、
ＣＡタンパク質を過剰に発現するトランスジェニック動物が生成され得る。所望の発現レ
ベルに依存して、種々の強度のプロモーターが、トランスジーンを発現するために使用さ
れ得る。また、組み込まれたトランスジーンのコピー数は、トランスジーンの発現レベル
の決定のために、決定および比較され得る。このような方法により生成された動物は、Ｃ
Ａの動物モデルとしての有用性を見出し、癌腫の処置のための生物活性分子のスクリーニ
ングにおいてさらに有用である。
【０２２８】
本発明のＣＡ核酸配列は、表１に示される。各表における配列は、マウスならびにヒト
の双方についての、ゲノム配列、ｍＲＮＡ、およびコード配列を含む。Ｎ／Ａは、同定さ
れているが、名称が割り当てられていない遺伝子を示す。異なる配列は、以下の配列番号
が割り当てられている：
表１：（マウス遺伝子：Ｐｒｌｒ；ヒト遺伝子ＰＲＬＲ）
マウスゲノム配列（配列番号１）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号２）
マウスコード配列（配列番号３）
ヒトゲノム配列（配列番号４）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号５）
ヒトコード配列（配列番号６）
【０２２９】
【表１−１】
【０２３０】
【表１−２】
【０２３１】
【表１−３】
【０２３２】
【表１−４】
【０２３３】
【表１−５】
【０２３４】
【表１−６】
【０２３５】
【表１−７】
【０２３６】
【表１−８】
【０２３７】
【表１−９】
【０２３８】
【表１−１０】
【０２３９】
【表１−１１】
【０２４０】
【表１−１２】
【０２４１】
【表１−１３】
【０２４２】
【表１−１４】
【０２４３】
【表１−１５】
【０２４４】
【表１−１６】
【０２４５】
【表１−１７】
【０２４６】
【表１−１８】
【０２４７】
【表１−１９】
【０２４８】
【表１−２０】
【０２４９】
【表１−２１】
【０２５０】
【表１−２２】
【０２５１】
【表１−２３】
【０２５２】
【表１−２４】
【０２５３】
【表１−２５】
【０２５４】
【表１−２６】
【０２５５】
【表１−２７】
【０２５６】
【表１−２８】
【０２５７】
【表１−２９】
【０２５８】
【表１−３０】
【実施例】
【０２５９】
（実施例１：乳癌サンプルにおけるＰＲＬＲのｍＲＮＡ発現分析）
ｍＲＮＡを、当該分野で公知の標準的手順によって、乳癌サンプルから調製した。遺伝
子発現を、５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）化学を使用して、ＡＢＩ７９００ＨＴ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおける定量的ＰＣＲによって、測
定した。この化学は、２つのＰＣＲプライマー間でアニールする二重標識（レポーターお
よびクエンチャー）蛍光プローブの添加により、標準的ＰＣＲとは異なる。レポーター色
素の蛍光を、近接するクエンチャーによってクエンチする。熱サイクリングの間に、Ｔａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、アニールしたプローブが切断さ
れ、レポーターとクエンチャー色素とが遊離する。蛍光の増加が観察され、その蛍光がバ
ックグラウンドよりも増加するサイクル数は、対数線形様式で開始テンプレート濃度に関
連する。
【０２６０】
データ分析のために、標的遺伝子の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子の発現レベ
ルを用いて正規化した。そのハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルを、標的遺伝子の
平均発現レベルから差引いた。その後、標準偏差を決定した。さらに、癌組織における標
的遺伝子の発現レベルを、正常組織中の標的遺伝子の発現レベルと比較する。
【０２６１】
図１に示されるように、ＰＲＬＲは、試験した乳癌サンプルの約２１％においてアップ
レギュレートされた。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第０９／７４７，３７７号（２０００年１２月２２日出願）お
よび同第０９／７９８，５８６号（２００１年３月２日出願）、ならびに同第１０／０５
２，４８２号（２００１年１１月８日出願）の継続出願であり、これら全ての出願は、本
明細書中に参考として明示的に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、癌（特に、乳癌を含む、癌腫）の診断および処置における使用のための新規
配列、ならびにスクリーニング方法における新規組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌遺伝子は、癌を生じさせ得る遺伝子である。発癌は、広範な種々の機構（細胞の、癌
遺伝子を含むウイルスによる感染、宿主ゲノムにおける癌原遺伝子の活性化、ならびに癌
原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変異を含む）によって、起こり得る。
【０００４】
動物の癌と同様、ヒト癌に関係することが公知である、多くのウイルスが存在する。こ
こで特に興味深いのは、それ自体に癌遺伝子を含まないウイルスである；これらは、遅性
トランスフォーミングレトロウイルス（ｓｌｏｗ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒｕｓ）である。これは、宿主ゲノム内への組込みおよび種々の方法（プロモータ
ー挿入、エンハンサー挿入、および／または癌原遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子の切断を
含む）で近隣の癌原遺伝子に影響することにより、腫瘍を誘導する。挿入部位またはその
近くにおける配列の分析は、多くの新たな癌原遺伝子の同定を導いた。
【０００５】
リンパ腫および白血病に関して、マウス白血病レトロウイルス（ＭｕＬＶ）（例えば、
ＳＬ３−３またはＡｋｖなど）は、感染しやすい新生児マウスに接種される場合か、また
は生殖系列内で運ばれる場合、腫瘍の強力な誘発因子である。多くの配列が、リンパ腫お
よび白血病の誘発において、挿入部位の分析により、関連する配列として同定されている
；以下を参照のこと：非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６；これらの全ては、本明細書中で参考として明示的に援用される。
【０００６】
乳癌は、女性に罹患する最も重大な疾患のうちの１つである。現在の割合では、米国人
女性が９５歳までに乳癌を発症する危険性は、８人に１人である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９２）。後の段階での乳癌の処置は、効果がなく効力
がない（ｄｉｓｆｉｇｕｒｉｎｇ）ことがしばしばであり、このことが、この疾患の医療
的管理において、早期検出を最優先にしている。
【０００７】
ＰＲＬＲは、プロラクチンレセプターである、ＰＲＬＲは、サイトカインクラス１レセ
プタースーパーファミリーとして公知であるより大きなファミリーのメンバーである。こ
のスーパーファミリーは、現在、２０個を超える種々のメンバーを有する。ＰＲＬＲは、
身体全体に広範に分布している。多数の疾患状態（種々の形態の癌の増殖および種々の自
己免疫疾患を含む）が、ＰＲＬの過剰生成に関連しているようである。ＰＲＬは、内分泌
様式、オートクライン様式、もしくはプロクライン様式でか、またはそのホルモンに対す
る感受性の増加を介して、作用し得る。
【０００８】
ＰＲＬの作用機構における第１段階は、細胞表面レセプターへの結合である。このＲＰ
ＬＲは、内因性チロシンキナーゼ細胞質ドメインを含まないが、細胞質チロシンキナーゼ
であるＪＡＫ２と結合する。このレセプターの二量体化は、ＪＡＫキナーゼのチロシンリ
ン酸化および活性化、その後のこのレセプターのリン酸化を誘導する。Ｓｒｃファミリー
の他のレセプター関連キナーゼもまた、ＰＲＬにより活性化されることが示されている。
あるシグナル伝達経路は、細胞質Ｓｔａｔタンパク質のリン酸化を含む。この細胞質Ｓｔ
ａｔタンパク質は、それら自体が二量体化して核にトランスロケートし、ＰＲＬ応答性遺
伝子上の特定のプロモーターエレメントに結合する。さらに、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキ
ナーゼ経路もまた、ＰＲＬにより活性化され、そしてそのモルモンの増殖効果に関与し得
る。
【０００９】
従って、癌（特に発癌および乳癌）に関係する配列を提供することが、本発明の目的で
ある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）７４：２１６１
【非特許文献２】Ｈａｎｓｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０００）１０（２）：２３７−４３
【非特許文献３】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０：４０６３
【非特許文献４】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）６７：７１１８
【非特許文献５】Ｊｏｏｓｔｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）２６８：３０８
【非特許文献６】Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２３：３４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
上で概略を述べた目的に従い、本発明は、癌腫（特に乳癌）を調節する組成物のスクリ
ーニングの方法を提供する。本明細書中で、細胞（好ましくは乳癌細胞）の増殖を阻害す
る方法もまた、提供される。癌腫を処置する方法（診断を含む）もまた、本明細書中で提
供される。
【００１２】
一局面において、薬物候補をスクリーニングする方法は、ＰＲＬＲのような癌腫関連遺
伝子（ＣＡ遺伝子）またはそのフラグメントを発現する細胞を提供する工程を包含する。
ＣＡ遺伝子の好ましい実施形態は、癌細胞（好ましくはリンパ細胞、乳房細胞、前立腺細
胞または上皮細胞）において、他の細胞と比較して差次的に発現される遺伝子である。本
明細書中の方法において使用されるＣＡ遺伝子の好ましい実施形態としては、表１から選
択される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、細胞へ薬物候補を添
加する工程、およびＣＡ遺伝子の発現に対する薬物候補の効果を決定する工程を、さらに
包含する。
【００１３】
一実施形態において、薬物候補をスクリーニングする方法は、薬物候補の非存在下にお
ける発現のレベルを、薬物候補の存在における発現のレベルと比較する工程を包含する。
【００１４】
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）に結合し得る生物活性薬剤をスクリーニングする方法もまた
、本明細書中で提供され、この方法は、ＣＡＰと候補生物活性薬剤とを合わせる工程、お
よび候補薬剤のＣＡＰへの結合を決定する工程を包含する。
【００１５】
ＣＡＰの活性を調節し得る生物活性薬剤をスクリーニングする方法が、本明細書中でさ
らに提供される。一実施形態において、この方法は、ＣＡＰと候補生物活性薬剤とを合わ
せる工程、およびＣＡＰの生物活性に対する薬物候補の効果を決定する工程を、包含する
。
【００１６】
患者に薬物を投与する工程、および患者から細胞サンプルを採取する工程を包含する、
候補癌腫薬物の効果を評価する方法もまた、提供される。細胞の発現プロファイルが、次
いで、決定される。この方法は、患者の発現プロファイルを、健常な個体の発現プロファ
イルと比較する工程を、さらに包含し得る。
【００１７】
さらなる局面において、ＣＡタンパク質の活性を阻害する方法が、提供される。一実施
形態において、この方法は、表１において概略を示される配列またはその相補体からなる
群から好ましくは選択されるＣＡタンパク質の阻害剤を、患者に投与する工程を包含する
。
【００１８】
ＣＡタンパク質（好ましくは表１において概略を示される配列の群から選択される核酸
にコードされるタンパク質）の効果を中和する方法もまた、提供される。好ましくは、こ
の方法は、上述のタンパク質に特異的な薬剤を、中和をもたらすのに充分な量で、上述の
タンパク質に接触させる工程を包含する。
【００１９】
その上、ＣＡタンパク質をコードする核酸セグメント（好ましくは表１において概略を
示される配列から選択される）を含むバイオチップが、本明細書中で提供される。
【００２０】
癌腫（特に乳癌）に対する素因（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を、ある個体の少なくとも１
つの癌腫または乳癌の遺伝子を配列決定することにより、診断または決定する方法もまた
、本明細書中で提供される。本発明のさらに別の局面において、癌腫（個体における乳癌
の遺伝子コピー数を含む）を決定する方法が、提供される。
【００２１】
新規配列もまた、本明細書中で提供される。本発明の他の局面は、本発明の以下の説明
によって、当業者にとって明確である。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
表１に概説された配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。
・（項目２）
項目１に記載の組換え核酸を含む、宿主細胞。
・（項目３）
項目２に記載の組換え核酸を含む、発現ベクター。
・（項目４）
項目３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
・（項目５）
表１に概説された配列からなる群から選択された配列を含む核酸配列によりコードされた
アミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
・（項目６）
薬剤候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）表１に概説された配列またはそのフラグメントからなる群より選択された核酸配列
を含む、癌関連性（ＣＡ）遺伝子を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）薬剤候補を該細胞に添加する工程；および
ｃ）該ＣＡ遺伝子の発現に対する該薬剤候補の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目７）
前記決定する工程は、前記薬剤候補の非存在下における発現レベルと、該薬剤候補の存在
下における発現レベルとを比較する工程を包含する、項目６に記載の方法。
・（項目８）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）に結合し得る生物活性因子をスクリーニングする方法であって
、該ＣＡＰは、表１に概説された配列からなる群より選択された核酸配列を含む核酸によ
りコードされ、該方法は、以下：
ａ）該ＣＡＰと候補生物活性因子とを合わせる工程；および
ｂ）該候補因子と該ＣＡＰとの結合を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目９）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の活性を調節し得る生物活性因子をスクリーニングする方法で
あって、該ＣＡＰは、表１に概説された配列からなる群から選択された核酸配列を含む核
酸によりコードされ、該方法は、以下：
ａ）該ＣＡＰと候補生物活性因子とを合わせる工程；および
ｂ）該ＣＡＰの該生物活性に対する該候補因子の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目１０）
候補癌薬剤の効果を評価する方法であって、該方法は、以下：
ａ）患者に該薬剤を投与する工程；
ｂ）該患者から細胞サンプルを取り出す工程；および
ｃ）表１に概説された前記配列からなる群より選択された核酸配列を含む遺伝子の、発
現または活性の変化を決定する工程、
を包含する、方法。
・（項目１１）
癌腫を診断する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第１の個体の第１の組織型における、表１に概説された配列からなる群より選択さ
れた核酸配列を含む一つ以上の遺伝子の発現を決定する工程；および
ｂ）該遺伝子の発現と、該第１の個体または第２の罹患していない個体に由来する第２
の正常な組織型とを比較する工程；
を包含し、
該発現の相違は、該第１の個体が癌腫を有することを表す、方法。
・（項目１２）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の活性を阻害する方法であって、該ＣＡＰは、表１に概説され
た配列からなる群より選択された核酸配列を含む核酸によりコードされ、該方法は、阻害
因子を該ＣＡＰに結合させる工程を包含する、方法。
・（項目１３）
癌腫を処置する方法であって、該方法は、ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の阻害因子を患者に
投与することを包含し、該ＣＡＰは、表１に概説された配列からなる群から選択された核
酸配列を含む核酸によってコードされる、方法。
・（項目１４）
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の効果を中和する方法であって、該ＣＡＰは、表１に概説され
た配列からなる群から選択された核酸配列を含む核酸によりコードされ、該方法は、中和
をもたらすのに十分な量で該ＣＡＰタンパク質と該ＣＡＰタンパク質に特異的な因子とを
接触させる工程を包含する、方法。
・（項目１５）
表１に概説された配列からなる群から選択された核酸配列を含む核酸によりコードされた
タンパク質と特異的に結合する、ポリペプチド。
・（項目１６）
表１に概説された配列からなる群より選択された核酸配列を含む核酸によりコードされた
タンパク質と特異的に結合する抗体を含む、項目１５に記載のポリペプチド。
・（項目１７）
表１に概説された配列またはそれらのフラグメントの核酸からなる群より選択される一つ
以上の核酸セグメントを含む、バイオチップ。
・（項目１８）
個体の少なくとも一つのＣＡ遺伝子を配列決定することにより、癌腫または癌腫になる傾
向を診断する方法。
・（項目１９）
ＣＡ遺伝子コピー数を決定する方法であって、該方法は、ハイブリダイゼーションに適し
た条件下で、個体に由来するゲノムＤＮＡサンプルにＣＡ遺伝子プローブを添加する工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、正常組織における発現と比較した、乳癌組織におけるＰＲＬＲのｍＲＮＡ発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常組織である。バーは、平均発現レベルを示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、癌腫（特にリンパ腫、乳癌または前立腺癌）に関連する多くの配列に関連す
る。クローン的に組み込まれたプロウイルス（ｃｌｏｎａｌｌｙ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｐｒｏｖｉｒｕｓ）と癌原遺伝子との間の比較的緊密な連結は、「プロウイルスタギン
グ（ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｔａｇｇｉｎｇ）」を形成し、ここで、挿入変異メカニズム（ｉ
ｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）により作用する遅性トラン
スフォーミングレトロウイルスが、癌原遺伝子を単離するために使用される。いくつかの
モデルにおいて、非感染動物は、低い癌比率を有し、そして感染動物は、高い癌比率を有
する。関係するレトロウイルスの多くは、形質導入された宿主癌原遺伝子も病原性トラン
ス作用性（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）ウイルス遺伝子も持たないため、癌発生率は、宿
主癌原遺伝子に影響を及ぼすプロウイルスの組み込みの直接的な結果であるに違いないこ
とは、公知である。プロウイルスの組み込みはランダムであるため、極少数の組み込み体
（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）しか、選択的増殖有利性を提供する宿主癌原細胞を「活性化」し
ない。この稀な出来事は、腫瘍においてクローン化学量論で新しいプロウイルスを生じる
。
【００２４】
腫瘍形成レトロウイルス（宿主生物のゲノムにその配列が挿入されて癌腫を生じる）の
使用によって、癌腫に関係する宿主配列が、同定される。これらの配列は、次いで、多く
の異なった方法（診断、予後、調節因子（アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む
）のスクリーニング、抗体産生（免疫療法および画像化のため）、などが挙げられる）に
おいて、使用され得る。しかし、当業者に理解されるように、１種類の癌（乳癌など）に
おいて同定される癌遺伝子は、同様に、他の種類の癌に関わる可能性が強い。従って、本
明細書中で概略が示される配列は、最初に、乳癌と相関すると同定されるが、以下で概略
を示されるように、他の種類の癌においてもまた、見出され得る。
【００２５】
従って、本発明は、癌腫に関連する核酸およびタンパク質の配列（本明細書中で「癌腫
関連」配列または「ＣＡ」配列と名付ける）を、提供する。好ましい実施形態において、
本発明は、乳癌組織を起源とする癌腫に関連する核酸およびタンパク質の配列（「乳癌関
連」配列または「ＢＡ」配列として公知である）を、提供する。
【００２６】
本発明の方法を使用して診断され得るか、またはスクリーニングされ得る適切な癌とし
ては、部位によってかまたは組織学的型によって分類される、癌が挙げられる。部位によ
って分類される癌としては、以下が挙げられる：口腔および咽頭（唇、舌、唾液腺、口の
床、歯肉および他の口腔、鼻咽頭、扁桃、口腔咽頭部、下咽頭、他の口／他の咽頭）の癌
；消化系（食道；胃；小腸；結腸および直腸；肛門、肛門管、および肛門直腸；肝臓；肝
臓内胆汁管；胆嚢；他の胆管；膵臓；腹膜後腔；腹膜、網、および腸間膜、他の消化系）
の癌；呼吸系（鼻腔、中耳、および洞；喉頭；肺および気管支；胸膜；気管；縦隔；なら
びに他の呼吸系）の癌；中皮腫；骨および関節の癌；および軟組織（心臓を含む）の癌；
皮膚癌（黒色腫および他の非上皮性皮膚癌を含む）；カポージ肉腫および乳癌；女性生殖
系（子宮頸；子宮体；子宮（ｎｏｓ）；卵巣；膣；外陰；および他の女性生殖器）の癌；
男性生殖系（前立腺；精巣；陰茎；および他の男性生殖器）の癌；泌尿系（膀胱；腎臓お
よび腎盤；尿管；および他の泌尿器）の癌；眼および眼窩の癌；脳および神経系（脳；お
よび他の神経系）の癌；内分泌系（甲状腺、および胸腺を含む他の内分泌腺）の癌；リン
パ腫の癌（ホジキン病リンパ腫および非ホジキン性リンパ腫）、多発性骨髄腫、ならびに
白血病（リンパ性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；および他の白血病）。
【００２７】
本発明の配列に関連し得る他の癌（組織学的型によって分類される）としては、以下が
挙げられるが、これらに限定はされない：新生物（悪性）；癌腫（ＮＯＳ）；癌腫（未分
化、ＮＯＳ）；巨細胞癌腫および紡錘体細胞癌；小細胞癌（ＮＯＳ）；乳頭状癌（ＮＯＳ
）；扁平上皮癌（ＮＯＳ）；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌（ＮＯＳ）；毛質癌腫；移行上
皮癌（ＮＯＳ）；乳頭状移行上皮癌；腺癌（ＮＯＳ）；ガストリノーマ（悪性）；胆管癌
；肝細胞癌（ＮＯＳ）；肝細胞癌および胆管癌の複合；メルケル細胞腺腫；腺様嚢胞癌；
腺腫様ポリープにおける腺癌；腺癌（大腸家族性ポリポシス）；固形癌腫（ＮＯＳ）；カ
ルチノイド腫瘍（悪性）；気管支槽腺癌；乳頭状腺癌（ＮＯＳ）；色素嫌性癌腫；好酸性
（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉ）癌腫；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｃ）腺癌；好塩基性癌腫；明細
胞腺癌（ＮＯＳ）；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状かつ濾胞状の腺癌；非
被包硬化癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；脂腺腺癌；
耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状漿液
嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤腺管癌；髄様癌（
ＮＯＳ）；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット疾患（乳房）；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌
；扁平化生を伴う腺癌；胸腺腫（悪性）；卵巣間質腫瘍（悪性）；莢膜腫（悪性）；顆粒
膜細胞腫（悪性）；男性ホルモン産生細胞腫（悪性）；セルトーリ細胞癌腫；ライディッ
ヒ細胞腫（悪性）；脂質細胞腫瘍（悪性）；パラガングリオーマ（悪性）；乳房外パラガ
ングリオーマ（悪性）；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫（ＮＯＳ）；メラニ
ン欠乏症黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒
色腫；青色母斑（悪性）；肉腫（ＮＯＳ）；線維肉腫（ＮＯＳ）；線維性組織球腫（悪性
）；粘液肉腫；脂肪肉腫（ＮＯＳ）；平滑筋肉腫（ＮＯＳ）；横紋筋肉腫（ＮＯＳ）；胎
児性横紋筋肉腫；槽横紋筋肉腫；間質肉腫（ＮＯＳ）；複合腫瘍（悪性、ＮＯＳ）；ミュ
ラー複合腫瘍；腎臓芽細胞腫；肝臓芽細胞腫；癌肉腫（ＮＯＳ）；間葉腫（悪性）；ブレ
ンナー腫（悪性）；葉状腫瘍（悪性）；滑膜肉腫（ＮＯＳ）；中皮腫（悪性）；未分化胚
細胞腫；胎生期癌（ＮＯＳ）；奇形腫（悪性、ＮＯＳ）；卵巣甲状腺腫（悪性）；絨毛癌
；中腎腫（悪性）；血管肉腫；血管内皮腫（悪性）；カポージ肉腫；血管周囲細胞腫（悪
性）；リンパ管肉腫；骨肉腫（ＮＯＳ）；皮質近接部骨肉腫；軟骨肉腫（ＮＯＳ）；軟骨
芽細胞腫（悪性）；間葉軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍（悪性）；
エナメル上皮歯原性肉腫；エナメル上皮腫（悪性）；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫（
悪性）；脊索腫；神経膠腫（悪性）；上衣腫（ＮＯＳ）；星状細胞腫（ＮＯＳ）；原型質
性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫（ＮＯＳ）；希突起膠腫（
ＮＯＳ）；希突起膠細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫（ＮＯＳ）；神経節芽細
胞腫；神経芽細胞腫（ＮＯＳ）；網膜芽腫（ＮＯＳ）；嗅神経神経原性腫瘍；髄膜腫（悪
性）；神経線維肉腫；神経鞘腫（悪性）；顆粒細胞腫瘍（悪性）；悪性リンパ腫（ＮＯＳ
）；ホジキン病（ＮＯＳ）；ホジキン性病側肉芽種（ＮＯＳ）；悪性リンパ腫（小リンパ
球性）；悪性リンパ腫（大細胞、散在性）；悪性リンパ腫（濾胞状、ＮＯＳ）；菌状息肉
腫；他の特定の非ホジキン性リンパ腫；悪性組織球増殖；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；
免疫増殖性小腸疾患；白血病（ＮＯＳ）；リンパ性白血病（ＮＯＳ）；形質細胞性白血病
；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病（ＮＯＳ）；好塩基球性白血病；好酸
球性白血病；単球性白血病（ＮＯＳ）；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉
腫；およびヘアリーセル白血病。
【００２８】
さらに、このＣＡ遺伝子は、加齢に関連する疾患または神経変性疾患などの他の疾患（
しかしこれらに限定はされない）に関与し得る。
【００２９】
この文脈において、「関連」とは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が、癌腫に
おいて、正常な細胞と比較して差次的に発現されるか、活性化されるか、不活化されるか
または改変されるかのいずれかであることを意味する。以下で概略を示すように、ＣＡ配
列としては、癌腫において、アップレギュレーションされる（すなわち、より高レベルで
発現する）配列、ならびにダウンレギュレーションされる（すなわち、より低レベルで発
現する）配列が、挙げられる。ＣＡ配列としてはまた、改変された配列（すなわち、切断
された配列、または置換、欠失、もしくは挿入（点変異を含む）を有する配列）もまた挙
げられ、同じ発現プロファイルまたは改変されたプロファイルのどちらかを示す。好まし
い実施形態において、ＣＡ配列は、ヒト由来である；しかし、当業者によって理解される
ように、他の生物由来のＣＡ配列は、疾患の動物モデルおよび薬物評価の動物モデルにお
いて、有用であり得る。従って、他のＣＡ配列は、哺乳類（げっ歯類（ラット、マウス、
ハムスター、モルモット、など）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、な
どが挙げられる）を含む）を含む、脊椎動物から、提供される。いくつかの場合において
、原核生物のＣＡ配列は、有用であり得る。他の生物由来のＣＡ配列は、以下で概要を示
す技術を使用して、得られ得る。
【００３０】
ＣＡ配列は、核酸配列とアミノ酸配列との両方を含み得る。好ましい実施形態において
、ＣＡ配列は、組換え核酸である。本明細書中の用語「組換え核酸」によって、一般的に
ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、本来はインビトロで、
自然界で普通には見出されない形態に形成される核酸が、意味される。従って、直鎖形態
で単離された核酸、または普通は結合していないＤＮＡ分子の連結によってインビトロで
形成された発現ベクターは、両方とも、本発明の目的のための組換え体と考えられる。一
旦、組換え核酸が作られ、そして宿主細胞または宿主生物に再導入されれば、組換え核酸
は、非組換え的に（すなわち、インビトロ操作よりむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を
使用して）複製することが、理解される；しかし、このような核酸は、一旦組換え的に生
産されれば、その後、実質的に非組換え的に複製されても、やはり、本発明の目的のため
には組換え体と考えられる。
【００３１】
同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して（すなわち、上で示されるよ
うな組換え核酸の発現を通して）作られる、タンパク質である。組換えタンパク質は、少
なくとも１つ以上の特徴により、天然に存在するタンパク質から区別される。例えば、タ
ンパク質は、通常は野生型の宿主において会合しているタンパク質および化合物のいくら
かのまたは全てから、単離され得るか、または精製され得、従って、実質的に純粋であり
得る。例えば、単離されたタンパク質は、通常は天然の状態において会合している物質の
少なくともいくつかを付随しない（与えられたサンプルの総タンパク質重量に対し、好ま
しくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する）。
実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量に対し少なくとも約７５重量％（好まし
くは少なくとも約８０重量％、そして特に好ましくは少なくとも約９０重量％）を構成す
る。この定義は、異なった生物または宿主細胞における、ある生物由来のＣＡタンパク質
の産生を含む。あるいは、このタンパク質は、タンパク質が増加した濃度レベルで生成さ
れるような、誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通して、通常に見られ
るより有意により高い濃度において、生成され得る。あるいは、このタンパク質は、自然
界で通常に見出されない形態（以下に考察されるような、エピトープタグの付加またはア
ミノ酸の置換、挿入および欠失のような）であり得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、核酸である。当業者に理解されるように、そ
して以下により完全に概略が示されるように、ＣＡ配列は、種々の適用において有用であ
る。ここで適用としては、診断の適用（天然に存在する核酸を検出する）ならびにスクリ
ーニングの適用が挙げられる；例えば、ＣＡ配列に対する核酸プローブを含むバイオチッ
プが、生産され得る。最も広い意味においては、本明細書中の「核酸」もしくは「オリゴ
ヌクレオチド」または文法的同義語は、互いに共有結合する少なくとも２つのヌクレオチ
ドを、意味する。本発明の核酸は、一般にはリン酸ジエステル結合を含むが、以下で概略
を示されるようないくつかの場合（例えば、アンチセンス適用または候補薬剤が核酸であ
る場合）において、代替の骨格（例えば、以下が挙げられる：ホスホロアミデート（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（
１０）：１９２５（１９９３）およびこの中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１
９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１
９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１
９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジ
チオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９）
、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、ならびにペプチド核酸の骨格お
よび結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）
；Ｍｅｉｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎ
ｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３８０：２０７（１９９６）（全ては参考として援用される）を含む）を有す
る核酸アナログが、使用され得る。他のアナログ核酸としては、陽性の骨格（Ｄｅｎｐｃ
ｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７（１９９５））
；非イオン化骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第
５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋ
ｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０
：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：
４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１９９４）；第２章および第３章，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ
およびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０
３３号および第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章，ＡＳＣ Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉお
よびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編）に記載されるものを含む）を有する、アナログ核酸が挙げ
られる。１つ以上の炭素環状糖を含む核酸もまた、１つの核酸の定義（Ｊｅｎｋｉｎｓら
，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７６）の範囲内に、含まれる
。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ ６月２日（１９９７
）３５頁において、記載される。これらの参考文献の全ては、ここで、明示的に参考とし
て援用される。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は、種々の理由のため（例えば、ア
ンチセンス適用における使用またはバイオチップ上のプローブとしての使用についての生
理学的環境における、このような分子の安定性および半減期を増加させるため）に、なさ
れ得る。
【００３３】
当業者に理解されるように、これらの核酸アナログの全ては、本発明における用途を見
出し得る。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物も、生成され得る；あるい
は、異なった核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸とアナログとの混合物が
、生成され得る。
【００３４】
核酸は、特定されるように、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖配列もし
くは一本鎖配列の両方の部分を含み得る。当業者に理解されるように、一本鎖「ワトソン
」の描写はまた、もう一方の鎖「クリック」の配列を定義する；従って、本明細書中で記
載される配列はまた、この配列の相補鎖を含む。核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤ
ＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッド（核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニ
ン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどが挙げら
れる塩基の任意の組合せを含む）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレ
オシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびにヌクレオチドアナログ、ならびに
改変されたヌクレオシド（アミノ改変されたヌクレオシドなど）を含む。さらに、「ヌク
レオシド」は、天然に存在しないアナログ構造を含む。従って、例えば、ペプチド核酸の
個々のユニット（それぞれ塩基を含む）は、本明細書中でヌクレオシドと呼ばれる。
【００３５】
ＣＡ配列は、本明細書中で概略を示されるＣＡ配列に対する実質的な核酸および／また
はアミノ酸の配列相同性により、最初に同定され得る。このような相同性は、核酸または
アミノ酸の配列全体に基づき得、一般に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーショ
ン条件のどちらかを使用して、以下で概略を示したように、決定される。
【００３６】
本発明のＣＡ配列は、本明細書中で記載されるように、最初に同定され得る；本来、マ
ウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）によるマウスの感染は、リンパ腫を生じさせる。配列を乳
癌細胞サンプルにおける遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ）の発現レベルを決定すること
によって引き続き検証した。
【００３７】
本明細書中で概略を示されるＣＡ配列は、ウイルスの挿入部位を含む。一般に、レトロ
ウイルスは、３つの基本的な方法で、癌腫を引き起こし得る：まず、通常はサイレントな
宿主遺伝子の上流への挿入およびその活性化（例えば、プロモーター挿入）による方法；
第二に、腫瘍形成を導く宿主遺伝子の切断による方法；または隣接遺伝子の転写の増大に
よる方法。例えば、レトロウイルスエンハンサー（ＳＬ３−３を含む）は、挿入部位のお
よそ２００キロベースまで、遺伝子に対して作用することが、公知である。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、癌腫においてアップレギュレーションされる
ＣＡ配列である；つまり、癌腫組織において（同じ分化段階の正常組織と比較して）、こ
れらの遺伝子の発現は、より強い。「アップレギュレーション」は、本明細書中で使用さ
れる場合、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは
少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％を意味し、３００％から少
なくとも１０００％が特に好ましい。
【００３９】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、癌腫においてダウンレギュレーションされる
ＣＡ配列である；つまり、癌腫組織において（同じ分化段階の正常組織と比較して）、こ
れらの遺伝子の発現は、より弱い。「ダウンレギュレーション」は、本明細書中で使用さ
れる場合、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは
少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％を意味し、３００％から少
なくとも１０００％が特に好ましい。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、改変されたＣＡ配列であるが、この改変ＣＡ
配列は、同じ分化段階の正常リンパ組織と比較して、同じ発現プロファイルを示すか、ま
たは改変されたプロファイルを示す。「改変ＣＡ配列」は、本明細書中で使用される場合
、短縮された配列、挿入を含む配列、または点変異を含む配列をいう。
【００４１】
本発明のＣＡタンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパ
ク質として分類され得る。
【００４２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、細胞内タンパク質である。細胞内タン
パク質は、細胞質および／または核において見出され得る。細胞内タンパク質は、細胞機
能および複製（例えば、シグナル伝達経路が挙げられる）の全ての局面に関与する；この
ようなタンパク質の異常な発現は、無制御または非制御の細胞プロセスを生じさせる。例
えば、多くの細胞内タンパク質は、酵素的活性（例えば、プロテインキナーゼ活性、タン
パク質ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラ
ーゼ活性など）を有する。細胞内タンパク質はまた、ドッキングタンパク質（タンパク質
の複合体を組織することまたは種々の亜細胞位置へとタンパク質を標的化することに関与
する）として働き、そしてオルガネラの構造的完全性を維持することに関与する。
【００４３】
細胞内タンパク質の特徴付けにおいてますます理解される概念は、規定された機能の原
因とされている、１つ以上のモチーフがそのタンパク質において存在することである。タ
ンパク質の酵素的ドメインにおいて見出される高度に保存された配列に加えて、タンパク
質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質において、高度に保存された配列が、同定
されている。例えば、Ｓｒｃ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２（ＳＨ２）ドメインは、チロシンリ
ン酸化標的を、配列依存的様式において結合する。ＳＨ２ドメインとは異なったＰＴＢド
メインもまた、チロシンリン酸化標的を結合する。ＳＨ３ドメインは、高プロリン標的に
結合する。さらに、ごくわずかに挙げると、ＰＨドメイン、テトラトリコペプチド反復お
よびＷＤドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが示されている。
これらのいくつかはまた、リン脂質または他のセカンドメッセンジャーとの結合に、関与
し得る。当業者に理解されるように、これらのモチーフは、一次配列に基づいて、同定さ
れ得る；従って、タンパク質の配列の分析は、分子の酵素的可能性および／またはそのタ
ンパク質が結合し得る分子の両方への洞察を、提供し得る。
【００４４】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質
は、細胞のリン脂質二重層にまたがる分子である。これらは細胞内ドメイン、細胞外ドメ
イン、または両方を有し得る。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内タンパ
ク質について既に記載された機能を含む多くの機能を、有し得る。例えば、細胞内ドメイ
ンは、酵素的活性を有し得、かつ／またはさらなるタンパク質の結合部位として働き得る
。膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは、両役割を果たすことが多い。例えば、特定のレ
セプターチロシンキナーゼは、プロテインキナーゼ活性およびＳＨ２ドメインの両方を有
する。その上、レセプター分子自体におけるチロシンの自己リン酸化は、さらなるＳＨ２
ドメイン含有タンパク質に対する結合部位を作り出す。
【００４５】
膜貫通タンパク質は、１個〜多数の膜貫通ドメインを含み得る。例えば、レセプターチ
ロシンキナーゼ、特定のサイトカインレセプター、レセプターグアニリルシクラーゼおよ
びレセプターセリン／トレオニンプロテインキナーゼは、１つの膜貫通ドメインを含む。
しかし、チャネルおよびアデニリルシクラーゼを含む種々の他のタンパク質は、多くの膜
貫通ドメインを含む。多くの重要な細胞表面レセプターは、７つの膜にまたがる領域を含
むため、「７回膜貫通ドメイン」タンパク質として分類される。重要な膜貫通タンパク質
レセプターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：インスリンレセプ
ター、インスリン様成長因子レセプター、ヒト成長ホルモンレセプター、グルコーストラ
ンスポーター、トランスフェリンレセプター、上皮成長因子レセプター、低密度リポタン
パク質レセプター、上皮成長因子レセプター、レプチンレセプター、インターロイキンレ
セプター（例えば、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−２レセプターなど）。
【００４６】
膜貫通ドメインの特徴としては、その後に荷電アミノ酸が続き得るおよそ２０個連続す
る疎水アミノ酸を含む。従って、特定のタンパク質のアミノ酸配列の分析において、タン
パク質内における膜貫通ドメインの位置決定および数は、予測され得る。
【００４７】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、様々である；しかし、保存されたモチーフは、
種々の細胞外ドメインの間で、くり返し見出される。保存的な構造および／または機能は
、異なった細胞外モチーフに帰せられている。例えば、サイトカインレセプターは、シス
テインクラスターおよびＷＳＸＷＳ（Ｗ＝トリプトファン、Ｓ＝セリン、Ｘ＝任意のアミ
ノ酸）（配列番号７）モチーフによって特徴付けられる。免疫グロブリン様ドメインは、
高度に保存的である。ムチン様ドメインは、細胞接着に関与し得、そして高ロイシン反復
は、タンパク質−タンパク質相互作用に関連し得る。
【００４８】
多くの細胞外ドメインは、他の分子への結合に関与する。一局面において、細胞外ドメ
インは、レセプターである。レセプタードメインを結合する因子は、循環型リガンド（ペ
プチド、タンパク質、またはアデノシンのような低分子などであり得る）を含む。例えば
、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦなど）は、同族のレセプターに結合して種々
の細胞応答を開始する、循環型成長因子である。他の因子としては、サイトカイン、マイ
トジェン因子、神経栄養因子などが挙げられる。細胞外ドメインは、細胞結合分子にもま
た、結合する。この点において、細胞外ドメインは、細胞間相互作用を媒介する。細胞結
合リガンドは、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによ
り細胞に係留され得るか、または、それ自体が膜貫通タンパク質であり得る。細胞外ドメ
インは、細胞外マトリックスにもまた結合し、細胞構造の保持に貢献する。
【００４９】
本発明において、膜貫通のＣＡタンパク質が、特に好ましい。なぜなら、膜貫通ＣＡタ
ンパク質は、本明細書中で記載されるように、免疫療法の良い標的であるからである。さ
らに、以下で概略を示されるように、膜貫通タンパク質はまたは、画像化様式において、
有用であり得る。
【００５０】
膜貫通タンパク質は、（例えば、組換え方法を介する）膜貫通配列の除去により、可溶
性にされ得ることもまた、当業者に理解される。さらに、可溶性にされている膜貫通タン
パク質は、適切なシグナル配列の付加により、組換え手法を通して生成され得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、分泌タンパク質である；その分泌は、
構成的分泌または制御される分泌の、どちらかであり得る。これらのタンパク質は、分泌
経路へその分子を標的化する、シグナルペプチドまたはシグナル配列を有する。分泌タン
パク質は、多くの生理学的事象に関する；その循環する性質のために、分泌タンパク質は
、種々の他の細胞型に、シグナルを伝達するために働く。分泌タンパク質は、オートクラ
イン様式（因子を分泌した細胞に対して作用する）、パラクライン様式（因子を分泌した
細胞に近い細胞に対して作用する）またはエンドクライン様式（遠くの細胞で作用する）
で、機能し得る。従って分泌分子は、多くの生理学の局面の調節または改変において、用
途を見出す。分泌タンパク質であるＣＡタンパク質が、診断マーカーに対する良い標的と
して働く（例えば、血液検査のため）ので、本発明において特に好ましい
ＣＡ配列は、本明細書中で概略を示されるＣＡ配列に対する実質的な核酸および／また
はアミノ酸の配列相同性により、最初に同定される。このような相同性は、核酸またはア
ミノ酸の配列全体に基づき得、一般に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション
条件のどちらかを使用して、以下で概略を示したように、決定される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、この核酸配列と表１の核酸の１つとの全体的相同性が、
好ましくは約７５％より高く、より好ましくは約８０％より高く、さらにより好ましくは
約８５％より高く、そして最も好ましくは約９０％より高い場合、核酸は「ＣＡ核酸」で
ある。いくつかの実施形態において、相同性は、約９３％から９５％または９８％までと
同じくらいの高さである。好ましい実施形態において、配列の同一性または類似性を決定
するために使用される配列は、表１の核酸配列から選択される。別の実施形態において、
この配列は、表１の核酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体である。別の実施形態に
おいて、この配列は、本明細書中でさらに記載される配列改変体である。
【００５３】
この文脈における相同性は、配列類似性または配列同一性を意味する（同一性が好まし
い）。相同性の目的のために好ましい比較は、配列決定エラーを含む配列を正しい配列に
対して比較することである。この相同性は、当該分野に公知である標準的技術を使用して
決定される。この標準的技術としては以下が挙げられるが、これらに限定はされない：局
所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔ
ｈ．２：４８２（１９８１））、相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａ
ｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））、類似性探
索法（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８
８））、これらのアルゴリズムの電算化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およ
びＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム（Ｄｅ
ｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）に記
載）（好ましくはデフォルト設定を使用する）、または検査。
【００５４】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連配列の群か
ら、進行的対合（ｐａｉｒｗｉｓｅ）アラインメントを使用して、多重配列アラインメン
トを生成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントの生成に使用されるクラスター関係（ｃ
ｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を示すツリー（ｔｒｅｅ）もまた、プ
ロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、進行的アラインメント法（Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７））の単純化を使用し
た。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３
（１９８９）に記載される方法と類似である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、
デフォルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）３．００、デフォル
トギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）０．１０、
および重み付けエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）が挙げられる。
【００５５】
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら
，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら，
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）において記載）。特に有用な
ＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら
，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）
；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌから得られた）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、い
くつかの探索パラメータを使用する。パラメータの殆どは、デフォルト値に設定される。
調節性パラメータは、以下の値と共に設定される：重複範囲（ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ
）＝１、重複画分（ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、ワード閾値（ｗ
ｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳパラメータおよびＨＳＰ Ｓ２
パラメータは、動値（ｄｙｎａｍｉｃ ｖａｌｕｅ）であり、そして特定の配列の組成、
および目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自体に
よって確立される；しかし、この値は、感度を上げるために調節され得る。アミノ酸配列
同一性％値は、整列された領域の「長い方の」配列の残基の総数によって除算された一致
する同一残基の数によって決定される。「長い方の」配列は、整列された領域において最
も多くの実際の残基を有する配列である（ＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により、アラインメント
スコアを最大にするために導入されるギャップは無視される）。
【００５６】
従って、「核酸配列同一性百分率（％）」は、表１の核酸のヌクレオチド残基と同一で
ある候補配列におけるヌクレオチド残基の百分率として、定義される。好ましい方法は、
デフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを、
重複範囲および重複画分（それぞれ１および０．１２５に設定される）と共に利用する。
【００５７】
アラインメントは、整列される配列におけるギャップの導入を含み得る。さらに、表１
の核酸のヌクレオチドより多いかより少ないかどちらかのヌクレオチドを含む配列につい
て、相同性の百分率は、相同なヌクレオチドの数に基づいて（ヌクレオチドの総数と関係
して）決定されることが理解される。従って、例えば、本明細書中で同定され以下で議論
される配列より短い配列の相同性は、短い方の配列におけるヌクレオシドの数を使用して
、決定される。
【００５８】
一実施形態において、核酸の相同性は、ハイブリダイゼーション研究を通して決定され
る。従って、例えば、図面において同定される核酸またはその相補鎖に、高ストリンジェ
ンシー下でハイブリダイズする核酸は、ＣＡ配列と考えられる。高ストリンジェンシー条
件は、当該分野に公知である；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９
８９およびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編を参照のこと。これらは両方、本明細書において参考として援用
される。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なった環境において異なる。よ
り長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイ
ゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ
ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓ
ｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）におい
て見出される。一般に、ストリンジェント条件は、規定されるイオン化強度ｐＨにおいて
、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように、選択される。Ｔｍは
、（規定されるイオン化強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０
％が、標的配列とハイブリダイズし、平衡になる温度である（標的配列が過剰に存在する
場合、Ｔｍでプローブのうちの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェント条件
は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満（代表的には、約０．０１Ｍから１．０Ｍ
ナトリウムイオン濃度（または他の塩））、ｐＨ７．０からｐＨ８．３、ならびに温度が
、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、お
よび長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド以上）について少なくとも約６０℃の条件
である。ストリンジェント条件は、不安定化剤（ホルムアミドなど）の添加によってもま
た、達成され得る。
【００５９】
別の実施形態において、より低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件が、使
用される；当該分野で公知であるように、例えば、中程度ストリンジェンシー条件または
低いストリンジェンシー条件が、使用され得る；ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｕｓｕｂｅｌ
（既出）およびＴｉｊｓｓｅｎ（既出）を参照のこと。
【００６０】
さらに、本発明のＣＡ核酸配列は、より大きい遺伝子の断片である（すなわち、本発明
のＣＡ配列ば、核酸セグメントである）。あるいは、ＣＡ核酸配列は、癌遺伝子位置のイ
ンジケーターとして働き得る。例えば、ＣＡ配列は、癌原遺伝子を活性化させるエンハン
サーであり得る。この文脈における「遺伝子」は、コード領域、非コード領域、およびコ
ード領域と非コード領域の混合を含む。従って、当業者に理解されるように、本明細書中
で提供される配列を使用し、より長い配列または全長配列のどちらかのクローニングのた
めの当該分野で周知である技術（ＭａｎｉａｔｉｓらおよびＡｕｓｕｂｅｌら（既出）（
本明細書で参考として明示的に援用される）を参照）を使用して、ＣＡ遺伝子のさらなる
配列が、得られ得る。一般に、これは、ＰＣＲ（例えば、キネティック（ｋｉｎｅｔｉｃ
）ＰＣＲ）を使用して行われる。
【００６１】
一旦ＣＡ核酸が同定されれば、これは、クローン化され得、必要な場合、その構成部分
は、ＣＡ核酸全体を形成するように組換えられる。一旦天然の供給源から単離される（例
えば、プラスミドもしくは他のベクターの中に含まれるか、またはこれらから直鎖状核酸
セグメントとして切り出される）場合、組換えＣＡ核酸は、他のＣＡ核酸（例えば、さら
なるコード領域）を同定および単離するためのプローブとして、さらに使用され得る。こ
れは、修飾ＣＡ核酸または改変体ＣＡ核酸および修飾ＣＡタンパク質および改変体ＣＡタ
ンパク質を生成するための「前駆体」核酸としてもまた、使用され得る。
【００６２】
本発明のＣＡ核酸は、いくつかの方法で使用される。最初の実施形態において、ＣＡ核
酸に対する核酸プローブが、生成され、そして、バイオチップに結合される。このバイオ
チップは、スクリーニングおよび診断方法において（以下で概略が示されるように）使用
されるか、または投与のため（例えば、遺伝子療法および／またはアンチセンス適用のた
め）に使用される。あるいは、ＣＡタンパク質のコード領域を含むＣＡ核酸は、ＣＡタン
パク質発現のための発現ベクターに入れられ得る。この発現は、やはり、スクリーニング
目的または患者への投与の目的のためのどちらかである。
【００６３】
好ましい実施形態において、ＣＡ核酸に対する核酸プローブ（図面において概略が示さ
れる核酸配列および／またはその相補配列の両方）が、生成される。バイオチップに結合
される核酸プローブは、ＣＡ核酸（すなわち、標的配列（サンプルの標的配列または（例
えばサンドイッチアッセイにおける）他のプローブ配列のどちらか））に対し、実質的に
相補的であるように設計され、その結果、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイ
ゼーションが起こる。以下で概略が示されるように、この相補性は、完全である必要はな
い；任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハ
イブリダイゼーションを妨げる。しかし、変異の数があまりにも多いために、最低にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下ですら、ハイブリダイゼーションが起こら
ない場合、この配列は、相補的標的配列ではない。従って、本明細書中で「実質的に相補
的」は、本明細書中で概略を示されるように、プローブが、標的配列に対し、通常の反応
条件（特に高いストリンジェンシー条件）下でハイブリダイズするのに充分に相補的であ
ることを意味する。
【００６４】
核酸プローブは、一般に一本鎖であるが、部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であり
得る。プローブの鎖状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の構造、組成、およ
び特性によって述べられる。一般に、核酸プローブは、約８塩基から約１００塩基長まで
の範囲におよぶ（約１０塩基から約８０塩基までが好ましく、約３０塩基から約５０塩基
までが特に好ましい）。つまり、一般に、遺伝子全体は使用されない。いくつかの実施形
態において、数百塩基までの、ずっと長い核酸が、使用され得る。
【００６５】
好ましい実施形態において、１つの配列につき、１つより多くのプローブが使用され、
重複するプローブまたは標的の異なったセクションに対するプローブのどちらかが、使用
される。つまり、２つ、３つ、４つ以上（３つが好ましい）のプローブが、特定の標的に
ついての冗長性を形成するために使用される。これらのプローブは、重複し得る（つまり
、配列のいくらかが共通である）か、または分離しており得る。
【００６６】
当業者に理解されるように、核酸は、広汎な種々の方法によって、固体保持体に結合さ
れ得るか、または固定化され得る。本明細書中の「固定化された」および文法的同義語に
より、核酸プローブと固体支持体との間の接着または結合が、以下で概略を示すような、
結合、洗浄、分析、および除去の条件下で、十分に安定であることが、意味される。結合
は、共有結合または非共有結合であり得る。本明細書中の「非共有結合」および文法的同
義語により、静電的相互作用、親水性相互作用、および疎水性相互作用のいずれか１つ以
上を意味する。非共有結合には、分子（ストレプトアビジンなど）の支持体への共有結合
およびビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有結合が、含まれる。本明細書
中の「共有結合」および文法的同義語は、固体支持体およびプローブという２つの部分が
、少なくとも１つの結合（σ結合、π結合、および配位結合が挙げられる）により、結合
していることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体との間に直接形成され得る
か、またはクロスリンカーにより、あるいは固体支持体もしくはプローブまたは両分子の
いずれかに特定の反応基を含めることにより、形成され得る。固定化はまた、共有的相互
作用と非共有的相互作用との組合せを含み得る。
【００６７】
一般に、プローブは、（当業者が理解するように）バイオチップに、広汎な種々の方法
で結合する。本明細書中に記載されるように、核酸は、最初に合成され、その後にバイオ
チップに結合し得るか、または直接バイオチップ上に合成され得るかのいずれかである。
【００６８】
バイオチップは、適切な固体基材を含む。本明細書中の「基材」もしくは「固体支持体
」または他の文法的同義語は、核酸プローブの結合または接着に適切な別個のそれぞれの
部位を含むように改変され得る、任意の物質であり、少なくとも１つの検出方法に適合し
得る。当業者に理解されるように、可能性のある基材の数は、非常に大きく、そして、以
下が挙げられるが、これらに限定はされない：ガラスおよび改変ガラスまたは官能化ガラ
ス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他の物質とのコポリマー
、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）
、など）、ポリサッカライド、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくは
シリカベース物質（シリコンおよび改変されたシリコンを含む）、炭素、金属、無機ガラ
ス、など。一般にこの基材は、光学的検出を可能にし、感知される蛍光を発さない。
【００６９】
好ましい実施形態において、バイオチップの表面およびプローブは、この２つの後の結
合のために化学官能基により誘導体化され得る。従って、例えば、バイオチップは、化学
官能基を用いて誘導体化され、この化学官能基としては、アミノ基、カルボキシ基、オキ
ソ基およびチオール基が挙げられる（アミノ基が特に好ましい）が、これらに限定されな
い。これらの官能基を使用して、プローブは、プローブ上の官能基を使用して結合され得
る。例えば、アミノ基を含む核酸は、アミノ基を含む表面に、例えば（当該分野で公知で
あるように）リンカーを使用して、結合され得る；例えば、ホモ二官能性リンカーまたは
ヘテロ二官能性リンカーが、周知である（（１９９４）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒ
ｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，１５５−２００ページを、参照のこと（本明細書中に参考とし
て援用される））。さらに、ある場合は、アルキル基のようなさらなるリンカー（置換さ
れた基およびヘテロアルキル基を含む）が、使用され得る。
【００７０】
この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、当該分野に公知であるように合成され
、次いで固体支持層の表面上に結合される。当業者に理解されるように、５’末端または
３’末端のどちらかが固体支持体に結合され得るか、またはこの結合は、内在性ヌクレオ
シドを介し得る。
【００７１】
さらなる実施形態において、固体支持体への固定化は、非共有的であるのに、とても強
くあり得る。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコートされた表面に結合して結
合を生じるビオチン化オリゴヌクレオチドが、生成され得る。
【００７２】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、当該分野で公知であるように、表面上で合成され得
る。例えば、光重合体形成化合物および光重合体形成技術を利用する光活性化技術が、使
用される。好ましい実施形態において、核酸は、周知のフォトリソグラフィー技術（ＷＯ
９５／２５１１６；ＷＯ９５／３５５０５；米国特許第５，７００，６３７号および同第
５，４４５，９３４号ならびにこの中の参考文献に記載される（これら全ては参考として
明示的に援用される））を使用して、インサイチュで合成され得る；これらの結合の方法
は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術の基礎を形成する。
【００７３】
バイオチップアレイに代表される固相技術に加えて、遺伝子発現はまた、液相アレイを
使用して定量し得る。このような系の１つは、キネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）である。キネティックＰＣＲは、特異的核酸配列の同時の増幅および定量を可能にす
る。この特異性は、標的部位をまとめた一本鎖核酸配列に優先的に接着するように設計さ
れた、合成オリゴヌクレオチドプライマーに由来する。このオリゴヌクレオチドプライマ
ー対は、標的配列のそれぞれの鎖に、特異的非共有結合複合体を形成する。これらの複合
体は、逆方向の二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写を容易にする。反応混合物の温度サイクリ
ングは、プライマー結合、転写、および核酸から個々の鎖への再融解という、連続サイク
ルを作り出す。この結果は、標的ｄｓＤＮＡ産物の指数関数的増加である。この産物は、
インターカレート色素または配列特異的プローブのどちらかの使用を通してリアルタイム
で定量され得る。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉは、インターカレート色素の例で
あり、ｄｓＤＮＡに優先的に結合し、蛍光シグナルの同時増加を生じる。ＴａｑＭａｎ（
登録商標）技術に使用されるような配列特異的プローブは、オリゴヌクレオチドの対向末
端に共有的に結合する蛍光色素およびクエンチング分子からなる。このプローブは、２つ
のプライマーの間で標的ＤＮＡ配列に選択的に結合するように設計される。ＰＣＲ反応の
間にＤＮＡ鎖が合成される場合、発蛍光団は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
よりプローブから切り離され、シグナルの脱クエンチングを生じる。プローブシグナル伝
達方法は、インターカレート色素法より特異的であり得るが、それぞれの場合において、
シグナル強度は、産生されるｄｓＤＮＡ産物に比例する。定量方法のそれぞれの種類は、
マルチウェル液相アレイにおいて使用され得、このマルチウェル液相アレイは、それぞれ
のウェルが、目的の核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブを示す。組織
または細胞株のメッセンジャーＲＮＡ調製物を用いて使用される場合、プローブ／プライ
マー反応のアレイは、同時に複数の目的の遺伝子産物発現を定量し得る。Ｇｅｒｍｅｒ，
Ｓ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：２５８−２６６（２０００）；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ
．ら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６，９８６−９９４（１９９６）を、参照のこと。
【００７４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質をコードするＣＡ核酸は、ＣＡタンパク質
を発現する種々の発現ベクター（以下で記載されるようにスクリーニングアッセイにおい
て使用され得る）を生成するために使用される。発現ベクターは、自己複製染色体外ベク
ターまたは宿主遺伝子に組み込まれるベクターのどちらかであり得る。一般に、これらの
発現ベクターは、転写調節核酸および翻訳調節核酸（ＣＡタンパク質をコードする核酸に
作動可能に連結される）を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能
に連結されたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列を言う。原核生物に対して適切な制
御配列としては、例えば、プロモーター、（必要に応じて）オペレーター配列、およびリ
ボソーム結合部位が、挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグ
ナル、およびエンハンサーを利用することが、公知である。
【００７５】
核酸が、別の核酸配列との機能的関係の中に配置される場合、「作動可能に連結される
」。例えば、ポリペプチドの分泌に関わるプレタンパク質として発現する場合、プレ配列
または分泌リーダーのＤＮＡは、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている
；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、この配列に、
作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置
された場合、コード配列に、作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結され
ている」とは、連結されるＤＮＡ配列が、連続し、分泌リーダーの場合は、連続し、リー
ディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続する必要はない
。連結は、都合の良い制限部位で結合することによって、達成される。このような部位が
存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来技術の実施
に従って使用される。転写調節核酸および翻訳調節核酸は、一般に、ＣＡタンパク質を発
現させるために使用される宿主細胞に、適切である；例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の転
写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列は、好ましくは、ＢａｃｉｌｌｕｓにおいてＣＡ
タンパク質を発現するために使用される。多くの種類の適切な発現ベクターおよび適切な
調節配列が、種々の宿主細胞について、当該分野で公知である。
【００７６】
一般に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結
合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびに
エンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーターならびに転写開始配列および転写
終結配列を含む。
【００７７】
プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのどちらかをコー
ドする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーター
のどちらかであり得る。１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッド
プロモーターもまた、当該分野で公知であり、本発明において有用である。
【００７８】
さらに、発現ベクターは、さらなる要素を含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの
複製系を有し得、これによって２種の生物（例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆
虫細胞、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主）において維持される。
さらに、発現ベクターの組み込みのために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少
なくとも１つの配列（好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列）を含む。組込み
ベクターは、ベクター内に含めるために適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞
における特定の遺伝子座に指向され得る。組み込みベクターの構築物は、当該分野で周知
である。
【００７９】
さらに、好ましい実施形態において、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含み、形
質転換された宿主細胞の選択を可能にする。選択遺伝子は、当該分野で周知であり、使用
する宿主細胞によって変化する。
【００８０】
本発明のＣＡタンパク質は、ＣＡタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターによ
って形質転換された宿主細胞を、ＣＡタンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こすの
に適切な条件下で培養することによって、産生される。ＣＡタンパク質発現に適切な条件
は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、当業者により、慣用的実験を通
して容易に確かめられる。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、
宿主細胞の生育および増殖の最適化を必要とし、一方、誘導性プロモーターの使用は、誘
導に適切な成育条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形態において、収集のタイミ
ングは、重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるバキュロウイルス系は、
溶解性のウイルスであり、従って、収集時間選択は、産物収量にとって重要であり得る。
【００８１】
適切な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、および昆虫細
胞、植物細胞ならびに動物細胞（哺乳動物細胞を含む）が挙げられる。特に重要なのは、
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ細胞
、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞株（マクロファー
ジ細胞株）およびヒト細胞ならびにヒト細胞株である。
【００８２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、哺乳動物細胞において発現される。哺
乳動物発現系はまた、当該分野において公知であり、それにはレトロウイルス系が挙げら
れる。好ましい発現ベクター系は、例えば、一般的にＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およ
びＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８（いずれも本明細書中で参照として明示的に援用される
）において記載されるレトロウイルスベクター系である。哺乳動物プロモーターとして特
に有用であるのは、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。なぜなら、この
ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして幅広い宿主範囲を有するからである
。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、ア
デノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶ
プロモーターが挙げられる。代表的に、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列お
よびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って
プロモーターエレメントとともにコード配列の側に隣接する。転写ターミネーターおよび
ポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０に由来するものを含む。
【００８３】
哺乳動物宿主および他の宿主内に外来核酸を導入する方法は、当該分野において周知で
あり、そして使用される宿主細胞とともに変化する。技術は、デキストラン媒介性トラン
スフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性トラ
ンスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポ
ソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接微量注入を包
含する。
【００８４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、細菌系において発現される。細菌性発
現系は、当該分野において周知である。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた、
使用され得、そして当該分野において公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイ
ブリッドプロモーターもまた、有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロ
モーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、細菌プロモー
ターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する、天然に存在
する非細菌起源のプロモーターを含み得る。機能性プロモーター配列に加えて、効率的な
リボソーム結合部位が望ましい。発現ベクターはまた、細菌中でのＣＡタンパク質の分泌
を提供するシグナルペプチド配列を含み得る。このタンパク質は、増殖培地内に分泌され
るか（グラム陽性細菌）、または細胞膜周辺腔（細胞の内膜と外膜との間に位置する）内
に分泌される（グラム陰性細菌）かのいずれかである。細菌発現ベクターはまた、形質転
換された細菌株の選択を可能にするような選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺
伝子は、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシ
ン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬物に対して耐性にする遺伝子を含む
。選択マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン生合成経路、トリプトファン
生合成経路およびロイシン生合成経路におけるもの）を含む。これらの成分は、発現ベク
ター中で構築される。細菌のための発現ベクターは当該分野において周知であり、とりわ
け、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのためのベ
クターが挙げられる。細菌性発現ベクターは、当該分野において周知の技術（例えば、塩
化カルシウム処理、エレクトロポレーションなど）を使用して細菌宿主細胞内に形質転換
される。
【００８５】
１つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、昆虫細胞中で産生される。昆虫細胞の形
質転換のための発現ベクター、および特にバキュロウイルスをベースにした発現ベクター
は、当該分野において周知である。
【００８６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、酵母細胞中で産生される。酵母発現系
は、当該分野において周知であり、それとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅのための発現ベクター、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのための発現
ベクターおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａのための発現ベクター、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａのための発現ベクター、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ
のための発現ベクターおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのための発現ベクター、Ｐｉｃｈｉａ ｇ
ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉのための発現ベクターおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための
発現ベクター、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのための発現ベク
ターおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのための発現ベクターが挙げられる
。
【００８７】
ＣＡタンパク質はまた、当該分野で周知の技術を使用して融合タンパク質として作られ
得る。従って、例えば、モノクローナル抗体生成のためである。所望のエピトープが小さ
い場合、ＣＡタンパク質は、免疫原を形成するためにキャリアタンパク質に対して融合さ
れ得る。あるいは、ＣＡタンパク質は、発現を増強するために、または他の理由のために
融合タンパク質として作られ得る。例えば、ＣＡタンパク質がＣＡペプチドである場合、
このペプチドをコードする核酸は、発現目的のために、他の核酸に結合され得る。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明のＣＡ核酸、ＣＡタンパク質およびＣＡ抗体は、標識
される。本明細書中の「標識される」によって、化合物は、その化合物の検出を可能にす
るために結合する少なくとも１つの元素、同位体または化学化合物を有することが意味さ
れる。一般的に、標識は、３つのクラスに分類される：ａ）同位体標識であり、これは放
射性同位体または重同位体であり得る；ｂ）免疫標識であり、これは、抗体または抗原で
あり得る；およびｃ）有色色素または蛍光色素である。標識は、ＣＡ核酸、ＣＡタンパク
質およびＣＡ抗体内に任意の位置で組み込まれ得る。例えば、標識は、直接的または間接
的のいずれかで検出可能なシグナルを産生し得るべきである。検出可能な部分は、例えば
、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位体、例えば、フル
オレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光化合物
または化学発光化合物、あるいは、例えば、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダー
ゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。抗体を標識に結合体化す
るための当該分野で公知の任意の方法が使用され得、これは、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：
１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０：２１９（
１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
．、３０：４０７（１９８２）によって記載される方法を含む。
【００８９】
従って、本発明はまた、ＣＡタンパク質配列を提供する。本発明のＣＡタンパク質は、
いくつかの方法で同定され得る。この意味における「タンパク質」とは、タンパク質、ポ
リペプチド、およびペプチドを包含する。当業者によって理解されるように、本発明の核
酸配列は、タンパク質配列を生成するために使用され得る。タンパク質配列生成を行なう
ための種々の方法があり、これには、遺伝子全体をクローニングすること、ならびにその
フレームおよびアミノ酸配列を改変すること、またはＣＡタンパク質が、使用されるデー
タベース中のいくつかのタンパク質との相同性を有すると仮定して、フレームを提供する
ための相同性を検索するために公知の配列とアミノ酸配列を比較することが挙げられる。
概して、核酸配列は、相同性について３つすべてのフレームを検索するプログラムに入力
される。これは、以下のＮＣＢＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴパラメータを使用する
好ましい実施形態において行なわれる。このプログラムは、ｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓ
ｔｎである。データベースは、ｎｒである。入力データは、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ
ＦＡＳＴＡ ｆｏｒｍａｔ」としてある。生物リストは、「ｎｏｎｅ」である。「ｅｘｐ
ｅｃｔ」は１０であり；フィルターはデフォルトである。「ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ」
は５００であり、「ａｌｉｇｈｍｅｎｔｓ」は５００であり、そして「ａｌｉｇｈｍｅｎ
ｔ ｖｉｅｗ」は２つ１組である。「ｑｕｅｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅｓ」は標準
（１）である。マトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり；ギャップ存在コストは１１で
あり、残基ギャップあたりのコストは１であり；そしてλ比は、０．８５デフォルトであ
る。これは、推定タンパク質配列の生成を生じる。
【００９０】
本明細書中で決定されたような天然に存在する配列のアミノ酸改変体がまた、ＣＡタン
パク質の１つの実施形態内に含まれる。改変体は、好ましくは、野生型配列に対して、好
ましくは約７５％より大きい、より好ましくは約８０％より大きい、さらにより好ましく
は約８５％より大きい、そして最も好ましくは９０％より大きい相同性を有する。いくつ
かの実施形態において、相同性は、約９３〜９５または９８％ほど高い。核酸に関する限
りでは、このような状況における相同性は、配列類似性または配列同一性（同一性が好ま
しい）を意味する。この相同性は、核酸相同性に関して上で略述されるように、当該分野
において公知の標準的技術を使用して決定される。
【００９１】
本発明のＣＡタンパク質は、野生型アミノ酸配列より短くても長くてもよい。従って、
好ましい実施形態において、本明細書中の野生型配列の部分またはフラグメントが、ＣＡ
タンパク質の定義内に含まれる。さらに、上で略述されるように、本発明のＣＡ核酸は、
さらなるコード領域、およびさらなるタンパク質配列を、当該分野において公知の技術を
使用して得るために使用され得る。
【００９２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、野生型配列と比較して誘導体ＣＡタン
パク質または改変ＣＡタンパク質である。つまり、以下に、より十分に略述されるように
、誘導体ＣＡペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入（アミノ酸置
換が特に好ましい）を含む。アミノ酸置換、挿入または欠失は、ＣＡペプチド内の任意の
残基で生じ得る。
【００９３】
本発明のＣＡタンパク質の１つの実施形態において、アミノ酸配列改変体もまた含まれ
る。これらの改変体は、以下の３つのクラスのうちの１つ以上に含まれる：置換改変体、
挿入改変体または欠失改変体。これらの改変体は、通常、改変体をコードするＤＮＡを産
生するために、当該分野において周知のカセット式変異誘発またはＰＣＲ変異誘発あるい
は他の技術を使用して、ＣＡタンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位
特異性変異誘発、そしてその後、上で略述されるように組換え細胞培養においてＤＮＡを
発現することによって、調製される。しかし、約１００〜１５０残基までを有する改変体
ＣＡタンパク質フラグメントは、確立された技術を使用するインビトロ合成によって調製
され得る。アミノ酸配列改変体は、改変体の前もって決定された性質（ＣＡタンパク質の
アミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子バリエーションまたは種間バリエーションとそ
の改変体を区別する特徴）によって特徴付けられる。代表的に改変体は、天然に存在する
アナログと同じ定性的生物活性を示すが、より十分に以下に略述されるように、改変され
た特徴を有する改変体もまた、選択され得る。
【００９４】
アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位または領域が前もって決定される一
方で、変異自体は、前もって決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の実行
を最適化にするために、ランダムな変異誘発が、標的コドンまたは領域で実行され得、そ
して発現したＣＡ改変体は、所望される活性の最良の組み合わせについてスクリーニング
される。公知の配列を有するＤＮＡにおける前もって決定された部位での置換変異を起こ
すための技術は、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＬＡＲ変異誘発
）。変異体のスクリーニングは、ＣＡタンパク質活性のアッセイを使用して行なわれる。
【００９５】
アミノ酸置換は、代表的に、単一残基である；挿入は、通常約１〜２０個のアミノ酸で
あるが、かなり大きな挿入が許容され得る。欠失は、約１〜約２０残基の範囲であるが、
いくつかの場合において、欠失はより大きくあり得る。
【００９６】
置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが、最終的な誘導体に到達するため
に使用され得る。概してこれらの変化は、分子の変化を最小にするために２〜３個のアミ
ノ酸に対して行なわれる。しかし、より大きな変化が、特定の状況において許容され得る
。ＣＡタンパク質の特徴における小さい変化が所望される場合、置換は、概して以下のチ
ャートに従って行なわれる。
【表Ａ−１】
【００９７】
【表Ａ−２】
【００９８】
機能または免疫学的同一性における本質的な変化は、チャートＩに示されるものより保
存的でない置換を選択することによって、行なわれる。例えば：変更領域におけるポリペ
プチドの骨格構造（例えば、α−ヘリックス構造またはβシート構造）；標的部位におけ
る分子の電荷または疎水性；あるいは側鎖のかさ高さ、により著しい影響を及ぼす置換が
行なわれ得る。一般的にポリペプチド特性における最大の変化を産生することが予測され
る置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル（ｔｈｒｅｏｎｙｌ））
は、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはア
ラニル）と（またはこれらによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンは、
任意の他の残基と（またはこれらによって）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残
基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）は、電気陰性残基（例えば、グル
タミルまたはアスパルチル）と（またはこれらによって）置換される；または（ｄ）かさ
高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）は、側鎖をもたないもの（例えば、
グリシン）と（またはこれらによって）置換されるものである。
【００９９】
代表的に、改変体は、天然に存在するアナログと同じ定性的生物学的活性を示し、そし
て同じ免疫応答を惹起させるが、必要とされる場合、改変体はまた、ＣＡタンパク質の特
徴を改変するように選択される。あるいは、改変体は、ＣＡタンパク質の生物学的活性が
変更されるように設計され得る。例えば、グリコシル化部位は、変更され得るか、または
除去され得、ドミナントネガティブ変異が生成され得る、など。
【０１００】
ＣＡポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内（例えば、スクリーニングにおい
て使用するために）に含まれる。共有結合修飾の１つの型は、ＣＡポリペプチドの標的化
アミノ酸残基と、ＣＡポリペプチドの選択された側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残
基と反応し得る有機誘導体化剤との反応工程を包含する。以下でより十分に記載されるよ
うに、二官能性薬剤を用いる誘導体化は、例えば、ＣＡポリペプチドと水不溶性支持マト
リックスあるいは抗ＣＡ抗体の精製またはスクリーニングアッセイのための方法において
使用するための表面を架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例
えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホ
モ二官能性イミドエステル）が挙げられ、そしてジスクシンイミジルエステル（例えば、
３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、二官能性マレイミド（例
えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）および薬剤（例えば、メチル−３−［
（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート）が挙げられる。
【０１０１】
他の改変としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応する
グルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロ
キシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン
、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈ
ｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
７９〜８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキ
シル基のアミド化が挙げられる。
【０１０２】
本発明の範囲内に含まれるＣＡポリペプチドの別の型の共有結合修飾は、ポリペプチド
のネイティブのグリコシル化パターンの変更を含む。「ネイティブのグリコシル化パター
ンの変更」は、本明細書における目的のために、ネイティブ配列ＣＡポリペプチドにおい
て見出される１つ以上の糖質部分の欠失、および／またはネイティブ配列ＣＡポリペプチ
ド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。
【０１０３】
ＣＡポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列の変更によっ
て達成され得る。例えば、この変更は、ネイティブ配列ＣＡポリペプチドに対する（Ｏ結
合型グリコシル化部位について）１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加、ま
たはこれらによる置換によってなされ得る。ＣＡアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化
を介して（特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、ＣＡポリペプ
チドをコードするＤＮＡを前もって選択された塩基で変異させることによって）必要に応
じて変化され得る。
【０１０４】
ＣＡポリペプチド上の糖質部分の数を増加する別の方法は、グリコシドをポリペプチド
に対して化学的または酵素的に結合することによる。そのような方法は、当該分野におい
て記載される（例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０、な
らびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＬＡ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２５９〜３０６頁（１９８１））。
【０１０５】
ＣＡポリペプチド上に存在する糖質部分の除去は、グリコシル化のための標的として作
用するアミノ酸残基をコードするコドンの、化学的置換または酵素的置換あるいは変異性
置換によって達成され得る。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野において公知であり
、そして例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．、２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１
８：１３１（１９８１）によって記載される。ポリペプチド上の糖質部分の酵素切断は、
Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０（１９８７）によ
って記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用
によって達成され得る。
【０１０６】
ＣＡの共有結合修飾の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，
６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１
９２号または同第４，１７９，３３７号において示される様式で、ＣＡポリペプチドと種
々の非タンパク性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコー
ル、またはポリオキシアルキレン）の１つとを連結することを含む。
【０１０７】
本発明のＣＡポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合し
たＣＡポリペプチドを含むキメラ分子を形成するために、ある方法において改変され得る
。１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、ＣＡポリペプチドと、抗タグ抗体
が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。一般的に
エピトープタグは、ＣＡポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される
が、内部融合がまた、いくつかの実施例において許容され得る。ＣＡポリペプチドのこの
ようなエピトープ−タグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体の使用によって
検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ＣＡポリペプチドが、抗タグ抗体、また
はエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの他の型を使用するアフィニテ
ィー精製によって容易に精製されることを可能にする。代替の実施形態において、キメラ
分子は、ＣＡポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合
を含み得る。キメラ分子の二価形態について、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域
に対してであり得る。
【０１０８】
種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該分野において周知であ
る。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリ−ヒスチジン−
グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその
抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９〜２１６
５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４
、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０〜３６１６（１９８５））；ならびに単純ヘルペスウ
イルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他
のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，６：１２０４〜１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉ
ｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２〜１９４（１９９２））；チューブリンエピトー
プペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３〜１５
１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒ
ｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３
〜６３９７（１９９０））が挙げられる。
【０１０９】
１つの実施形態において、ＣＡタンパク質の定義を用いると、ＣＡファミリーの他のＣ
Ａンパク質、および他の生物由来のＣＡタンパク質もまた含まれ、これらは以下に略述さ
れるようにクローン化され、そして発現される。従って、プローブまたは縮重ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が、ヒトまたは他の生物由来の他の関連ＣＡタンパ
ク質を見出すために使用され得る。当業者によって理解されるように、特に有用なプロー
ブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、ＣＡ核酸配列の独特の領域を含む。一般的に
当該分野で公知であるように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチ
ド長（約２０〜約３０が好ましい）であり、そして必要であるならばイノシンを含み得る
。ＰＣＲ反応のための条件は、当該分野において周知である。
【０１１０】
さらに、本明細書中で略述されるように、図面の核酸によってコードされるものより長
いＣＡタンパク質が（例えば、付加配列の解明、エピトープまたは精製タグの付加、他の
融合配列の付加、などによって）作られ得る。
【０１１１】
ＣＡタンパク質はまた、ＣＡ核酸によってコードされるタンパク質として同定され得る
。従って、本明細書中で略述されるように、ＣＡタンパク質は、配列表の配列またはその
相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされる。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明は、ＣＡ抗体を提供する。好ましい実施形態におい
て、ＣＡタンパク質が、例えば、免疫療法のために、抗体を生成するために使用され得る
場合、ＣＡタンパク質は、少なくとも１つのエピトープまたは決定基を全長のタンパク質
と共有するべきである。ＭＨＣの場合、本明細書中での「エピトープ」または「決定因子
」によって、抗体またはＴ細胞レセプターを生成しそして／またはそれに結合するタンパ
ク質の部分が意味される。従って、ほとんどの例において、より小さいＣＡタンパク質に
対して作られた抗体は、全長のタンパク質に結合し得る。好ましい実施形態において、エ
ピトープは独特である；つまり、独特のエピトープに対して生成された抗体は、ほとんど
かまたは全く交差反応を示さない。
【０１１３】
１つの実施形態において、用語「抗体」は、抗体フラグメント（当該分野で公知である
ような抗体全体の改変によって産生されるか、または組み換えＤＮＡ技術を使用して新規
に合成されたもののいずれかである、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えば、Ｆｖ）、キ
メラ抗体、などを含む）を含む。
【０１１４】
ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者によって公知である。ポリクローナル抗体は
、例えば、免疫剤、および望ましくは、アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動
物中で惹起され得る。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下
注射または腹腔内注射によって哺乳動物内へ注射される。免疫剤としては、図面の核酸に
よってコードされるタンパク質もしくはそのフラグメントまたはそれらに融合タンパク質
が挙げられ得る。免疫される哺乳動物において免疫原であることが公知のタンパク質を免
疫剤に結合体化することが有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例としては
、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および
ダイズトリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバ
ントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モ
ノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃ
ｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫プロトコルは、過度の実験をすることなく、当業者に
よって選択され得る。
【０１１５】
あるいは、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４
９５（１９７５）によって記載される）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法に
おいて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、特異的に免疫剤
に結合する抗体を産生するかまたは産生し得る、リンパ球を惹起するために免疫剤で免疫
される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。代表的に、免疫剤としては
、表１の核酸によってコードされるポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはそれ
らの融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血
リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合
、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞
（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９〜１０
３頁）を形成するために、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して
不死化細胞株と融合される。不死化細胞株は、通常形質転換された哺乳動物細胞（特にげ
っ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細
胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の成長また
は生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、その
親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰ
ＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、代表的に、ハイブリドーマのための培養培地は、
ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、この物質
は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１１６】
１つの実施形態において、抗体は、二重特異的抗体である。二重特異的抗体は、少なく
とも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル（好ましくは、ヒトま
たはヒト化）抗体である。本発明の場合において、結合特異性の１つは、表１の核酸によ
ってコードされるタンパク質またはそれらのフラグメントについてであり、他方は、任意
の他の抗原についてであり、そして好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターも
しくはレセプターサブユニット（好ましくは、腫瘍特異的であるもの）についてである。
【０１１７】
好ましい実施形態において、以下に記載されるように、ＣＡに対する抗体は、ＣＡの生
物学的機能を減少し得るか、または除去し得る。つまり、ＣＡ（またはＣＡを含む細胞）
への抗ＣＡ抗体（ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナルのいずれか）の添加は
、ＣＡ活性を減少し得るかまたは除去し得る。一般的に、活性の少なくとも２５％の減少
が好まれ、さらに、少なくとも約５０％の減少が特に好ましく、そして約９５〜１００％
の減少が特に好ましい。
【０１１８】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質に対する抗体は、ヒト化抗体である。非ヒ
ト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列
を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）のキメラ分子で
ある。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、ここで、レシピ
エントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基は、所望の特異性、親和性および能力
を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残
基によって置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワー
ク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗
体においてもインポートＣＤＲのいずれにおいても見出されない残基あるいはフレームワ
ーク配列を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび代表的には２つの
可変ドメインの実質的に全てを含み、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するＣＤ
Ｒ領域の全てまたは実質上全ておよびフレームワーク残基（ＦＲ）領域の全てまたは実質
上全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要
に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的にヒト免疫グロブリンの定常領域）
の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９
８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９（１９８８）；
およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６
（１９９２））。
【０１１９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般的に、ヒト
化抗体は、ヒトではない供給源からヒト抗体へ導入された１つ以上のアミノ酸残基を有す
る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と称され、これは、代表的
にインポート可変ドメインから得られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共同研究者
らの方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙ
ｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って（げっ歯
類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列で置換することによって）本質的に実行
され得る。従って、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６
，５６７号）、ここで実質的にほとんどインタクトではないヒト可変ドメインは、非ヒト
種由来の対応配列によって置換されている。実際問題として、ヒト化抗体は、代表的にい
くつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似
部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１２０】
ヒト抗体はまた、当該分野において公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラ
リーを含む）を使用して産生され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた
、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用できる（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，７７頁（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（
１）：８６〜９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座をトラン
スジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化
されているマウス）内へ導入することによって作られ得る。チャレンジの際に、ヒト抗体
産生が観察され、このヒト抗体は、遺伝子の再配列、集合、および抗体レパートリーを含
む、全ての点で、ヒトにおいて見出されるものと密接に似ている。このアプローチは、例
えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，
８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０
１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０
，７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６〜８
５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２〜１３（１９９４
）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５〜
５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１４，８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５〜９３（１９９５）において記載される。
【０１２１】
免疫治療によって、ＣＡタンパク質に対して惹起された抗体での癌腫の処置が意味され
る。本明細書中で使用される場合、免疫治療は、受動的であってもまたは能動的でもあっ
てもよい。本明細書中で定義される受動免疫治療は、レシピエント（患者）への抗体の受
動移送である。能動免疫は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞応
答の誘導である。免疫応答の誘導は、レシピエントに、抗体が惹起される抗原を提供する
ことの結果である。当業者によって理解されるように、抗原は、抗体が惹起されることが
望ましいポリペプチドをレシピエントに注射すること、または抗原の発現のための条件下
でレシピエントと、抗原を発現し得る核酸とを接触させることによって、提供され得る。
【０１２２】
好ましい実施形態において、分泌された成長因子をコードする癌遺伝子は、上述される
ように分泌タンパク質であるＣＡタンパク質に対して抗体を惹起することによって阻害さ
れ得る。理論によって束縛されないが、処置のために使用される抗体が分泌タンパク質に
結合し、そして分泌されたタンパク質がそのレセプターに結合することを防止し、それに
よって分泌ＣＡタンパク質を不活化する。
【０１２３】
別の好ましい実施形態において、抗体が惹起されるＣＡタンパク質は、膜貫通タンパク
質である。理論によって束縛されないが、処置のために使用される抗体は、ＣＡタンパク
質の細胞外ドメインに結合し、そしてＣＡタンパク質が他のタンパク質（例えば、循環リ
ガンドまたは細胞結合分子）に結合することを防止する。抗体は、膜貫通ＣＡタンパク質
のダウンレギュレートを引き起こし得る。当業者によって理解されるように、抗体は、競
合的、非競合的であり得るか、またはＣＡタンパク質の細胞外ドメインに結合するタンパ
ク質の非競合的阻害剤であり得る。抗体はまた、ＣＡタンパク質のアンタゴニストである
。さらに、抗体は、膜貫通ＣＡタンパク質の活性化を防止する。１つの局面において、抗
体がＣＡタンパク質への他の分子の結合を防止する場合、抗体は、細胞の成長を防止する
。抗体はまた、細胞傷害性剤（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γおよびＩ
Ｌ−２が挙げられるがこれらに限定されない）、または化学治療剤（５ＦＵ、ビンブラス
チン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどを含む）に対して細胞
を感作し得る。いくつかの例において、抗体が膜貫通タンパク質と複合体化し、それによ
って細胞傷害性を媒介する場合、抗体は、血清補体を活性化するサブタイプに属する。従
って、癌は、患者に膜貫通ＣＡタンパク質に対して指向される抗体を投与することによっ
て処置され得る。
【０１２４】
別の好ましい実施形態において、抗体は、治療部分と結合体化される。１つの局面にお
いて、治療部分は、ＣＡタンパク質の活性を調節する低分子である。別の局面で、治療部
分は、ＣＡタンパク質と関連するか、またはＣＡタンパク質と密接に近位にある分子の活
性化を調節する。この治療部分は、癌と関連するプロテアーゼ活性またはプロテインキナ
ーゼ活性のような酵素活性を阻害し得る。
【０１２５】
好ましい実施形態において、治療部分はまた、細胞傷害性の薬剤であり得る。この方法
において、細胞傷害性薬剤を腫瘍組織または細胞に対して標的化することは、罹患細胞の
数の減少を生じ、それゆえ、癌（リンパ腫または乳癌を含む）に関連する症状を減少させ
る。細胞傷害性薬剤は、多数および多様であり、そして細胞傷害性薬剤としては、細胞傷
害性薬物または毒素あるいはそのような毒素の活性フラグメントが挙げられるが、これら
に限定されない。適切な毒素およびその対応フラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、エ
キソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（
ｃｒｏｔｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙ
ｃｉｎ）などが挙げられる。細胞傷害性薬剤はまた、ＣＡタンパク質に対して惹起される
抗体に放射性同位体を結合体化すること、または抗体と共有結合するキレート剤に放射性
核種を結合することによって作られる、放射化学物質を含む。治療部分の膜貫通ＣＡタン
パク質への標的化は、目的の癌（すなわち、リンパ腫または乳癌）における治療部分の局
所濃度を増加するばかりでなく、治療部分と関連し得る有害な副作用を減少するように作
用する。
【０１２６】
別の好ましい実施形態において、抗体が惹起されるＣＡタンパク質は、細胞内タンパク
質である。この場合において、抗体は、細胞内への侵入を促進するタンパク質に結合体化
され得る。１つの場合において、抗体は、エンドサイトーシスによって細胞へ入る。別の
実施形態において、抗体をコードする核酸は、個体または細胞に投与される。そのうえ、
ここでＣＡタンパク質は、細胞内で（すなわち、核に）標的化され得、これに対する抗体
は、局在を標的にするためのシグナル（すなわち、核局在シグナル）を含む。
【０１２７】
本発明のＣＡ抗体は、特異的にＣＡタンパク質に結合する。本明細書中の「特異的結合
」によって、抗体は、少なくとも１０−４〜１０−６Ｍ−１の範囲にある結合定数（好ま
しくは、１０−７〜１０−９Ｍ−１）でタンパク質と結合することが意味される。
【０１２８】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、発現後に精製されるかまたは単離され
る。ＣＡタンパク質は、どのような他の成分がサンプル中に存在するかに依存して、当業
者に公知の種々の方法で単離されるかまたは精製され得る。標準的な精製方法としては、
電気泳動的技術、分子的技術、免疫学的技術およびクロマトグラフィー技術（イオン交換
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む）ならびに等電点電気泳動が挙げられる。
例えば、ＣＡタンパク質は、標準的な抗ＣＡ抗体カラムを使用して精製され得る。タンパ
ク質濃度に関連して、限外濾過技術およびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ）技術もまた、有用である。適切な精製技術における一般的な指針については
、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）を参照のこと。必要な精製の程度は、ＣＡタンパクの
使用に依存して変化する。いくつかの例において、精製は必要ない。
【０１２９】
一旦発現され、そして必要に応じて精製されたならば、ＣＡタンパク質およびＣＡ核酸
は、多くの適用において有用である。
【０１３０】
１つの局面において、遺伝子の発現レベルは、癌腫表現型における異なる細胞状態につ
いて決定される；つまり、正常な組織および癌組織における遺伝子発現のレベル（以下で
略述されるように、いくつかの場合において、予後と関係するリンパ腫または乳癌の重症
度を変えるために）は、発現プロファイルを提供するために評価される。特定の細胞状態
または発生点での発現プロファイルは、本質的にその状態の「フィンガープリント」であ
り；２つの状態が、類似して発現した任意の特定の遺伝子を有し得る一方で、多くの遺伝
子の評価は、細胞の状態に独特である遺伝子発現プロファイルの生成を同時に可能にする
。異なる状態における細胞の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態の
各々においてどの遺伝子が重要である（遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレ
ギュレーションの両方を含む）かに関する情報が得られる。次いで、診断がなされ得るか
、または確認され得る：特定の患者由来の組織は、正常組織または癌腫組織の遺伝子発現
プロファイルを有する。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、「差示的発現」または文法的に等価なものは、細胞内お
よび細胞間での、遺伝子の一時的発現パターンおよび／または細胞性発現パターンにおけ
る定性的差異ならびに定量的差異の両方をいう。従って、差示的に発現した遺伝子は、定
性的に発現を変化させ得、この変化としては、例えば、正常組織 対 癌腫組織における
活性化または不活化を含む。つまり、遺伝子は、他の状態と比較して、特定の状態におい
てスイッチが入り得るか、または切れ得る。当業者によって理解されるように、２つ以上
の状態の任意の比較が行われ得る。そのように定性的に調節される遺伝子は、１つの状態
または細胞型において標準的な技術によって検出可能であるが両方では検出不可能である
１つのそのような状態または細胞型内における発現パターンを示す。あるいは、発現が増
加するまたは減少するという点で、この決定は、定量的である：つまり、遺伝子発現はア
ップレギュレートされ、転写物の量の増加を生じるか、またはダウンレギュレートされ、
転写物の量の減少を生じるかのいずれかである。発現の差異の程度としては、以下に略述
されるように、標準的な特徴付け技術を介して（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ（登録商標）発現分析（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，１４：１６７５〜１６８０（１９９６））（本明細書中で参照として明示的
に援用される）の使用によって）定量するために十分大きいことのみが必要である。他の
技術としては、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析およびＲＮアーゼプロテクション
が挙げられるが、これらに限定されない。上で略述されるように、好ましくは、発現にお
ける変化（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）は、少な
くとも約５０％であり、より好ましくは少なくとも約１００％であり、より好ましくは少
なくとも約１５０％であり、より好ましくは、少なくとも約２００％であり、３００％か
ら少なくとも１０００％までが特に好ましい。
【０１３２】
当業者によって理解されるように、これは、遺伝子転写またはタンパク質レベルのいず
れかでの評価によってなされ得る；つまり、遺伝子発現量は、遺伝子転写物のＤＮＡ等価
物またはＲＮＡ等価物に対する核酸プローブを使用することでモニターされ得、そして遺
伝子発現レベルの定量、あるいは最終遺伝子産物自体（タンパク質）は、例えば、ＣＡタ
ンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）の使用または他の
技術（質量分光計アッセイ、２Ｄゲル電気泳動アッセイなどを含む）の使用を介してモニ
ターされ得る。従って、ＣＡ遺伝子に対応するタンパク質（すなわち、特定の癌腫表現型
（すなわち、乳癌またはリンパ腫）において重要であるとして同定されたもの）は、その
癌腫に特異的な診断試験において評価され得る。
【０１３３】
好ましい実施形態において、遺伝子発現モニタリングが行われ、そして多くの遺伝子（
すなわち、発現プロファイル）が、同時にモニターされるが、複数のタンパク質発現モニ
タリングもまた、行われ得る。同様に、これらのアッセイはまた、個体ベースで行われ得
る。
【０１３４】
この実施形態において、ＣＡ核酸プローブは、本明細書中で略述されるように、特定の
細胞におけるＣＡ配列の検出および定量のためにバイオチップに結合され得る。アッセイ
は、当該分野で公知のように行われる。当業者によって理解されるように、任意の数の異
なるＣＡ配列が、プローブとして使用され得、いくつかのケースにおいて、単一配列アッ
セイが使用され、そして本明細書中で記載される複数の配列が他の実施形態において使用
される。さらに、固相アッセイが記載されているが、任意の数の溶液ベースアッセイもま
た、行われ得る。
【０１３５】
好ましい実施形態において、固相ベースアッセイおよび溶液ベースのアッセイの両方が
、正常組織と比較された場合に、癌腫においてアップレギュレートされるかまたはダウン
レギュレートされるＣＡ配列を検出するために使用され得る。ＣＡ配列は変性されるが、
同じ発現プロファイルまたは変化した発現プロファイルを示す場合において、このタンパ
ク質は、本明細書中で略述されるように検出される。
【０１３６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質をコードする核酸が検出される。ＣＡタン
パク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが検出され得るが、ＣＡタンパク質をコードする
ｍＲＮＡを検出する方法が、特に興味深い。サンプルにおけるｍＲＮＡの存在は、ＰＲＬ
ＲのようなＣＡ遺伝子がｍＲＮＡを形成するために転写されることの指標であり、そして
このタンパク質が発現されることを示唆する。ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、ｍ
ＲＮＡと相補的でありかつこのｍＲＮＡとの塩基対形成する任意のヌクレオチド／デオキ
シヌクレオチドプローブであり得、そしてこのプローブとしては、オリゴヌクレオチド、
ｃＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。プローブはまた、本明細
書中で規定されるような検出可能な標識を含むべきである。１つの方法において、ｍＲＮ
Ａは、試験されるべき核酸を固体支持体上（例えば、ナイロン膜）に固定化し、そしてプ
ローブをサンプルにハイブリダイズした後に、検出される。洗浄して非特異的に結合した
プローブを除去した後、標識が検出される。別の方法において、ｍＲＮＡの検出は、イン
サイチュで実行される。この方法において、透過処理された細胞または組織サンプルは、
プローブを標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために十分な時間の間、検出可能に標識
された核酸プローブと接触される。洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後、
標識が検出される。例えば、ＣＡタンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的なジゴキシゲ
ニン標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）は、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン二次抗
体の結合によって検出され、そしてニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドイルホスフェートで発色される。
【０１３７】
好ましい実施形態において、本明細書中で記載されるような３つのクラスのタンパク質
（分泌性タンパク質、膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質）のうちのいずれかが、
診断アッセイにおいて使用される。ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、ＣＡ配列を含
む改変タンパク質および細胞が、診断アッセイにおいて使用される。この診断アッセイは
、個々の遺伝子または対応するポリペプチドレベルについて行われるか、またはアッセイ
のセットとして行われる。
【０１３８】
本明細書中で記載されそして定義されるように、ＣＡタンパク質は、癌腫（例えば、乳
癌、またはホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫が含まれるが、
これに限定されない）のマーカーとしての使用を見出す。癌腫と推定される組織または患
者におけるこれらのタンパク質の検出は、癌腫の型の決定または診断を可能にする。当業
者に公知の多くの方法は、癌腫を検出する際の使用を見出す。１つの実施形態において、
抗体は、ＣＡタンパク質を検出するために使用される。好ましい方法は、ゲル（代表的に
は、変性および還元タンパク質ゲルであるが、等電点電気泳動ゲルなどを含む任意の他の
型のゲルでもあり得る）上での電気泳動によって、サンプルまたは患者由来のタンパク質
を分離する。タンパク質を分離した後、ＣＡタンパク質は、このＣＡタンパク質に対して
惹起された抗体を用いる免疫ブロッティングによって検出される。免疫ブロッティングの
方法は、当業者に周知である。
【０１３９】
別の好ましい方法において、ＣＡタンパク質に対する抗体は、インサイチュでの画像化
技術における使用を見出す。この方法において、細胞は、ＣＡタンパク質に対する１個〜
多くの抗体と接触される。洗浄して非特異的抗体結合を除去した後、抗体の存在が検出さ
れる。１つの実施形態において、抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体とともにインキ
ュベートすることによって検出される。別の方法において、ＣＡタンパク質に対する一次
抗体は、検出可能な標識を含む。別の好ましい実施形態において、複数の一次抗体のうち
のそれぞれ１つは、別個の検出可能な標識を含む。この方法は、複数のＣＡタンパク質に
ついての同時スクリーニングにおける特定の使用を見出す。当業者によって理解されるよ
うに、多くの他の組織学的画像化技術は、本発明において有用である。
【０１４０】
好ましい実施形態において、標識は、異なる波長の放出を検出しそして区別する能力を
有する蛍光計で、検出される。さらに、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が、本方法
において使用され得る。
【０１４１】
別の好ましい実施形態において、抗体は、血液サンプルから癌腫を診断する際の使用を
見出す。以前に記載されたように、特定のＣＡタンパク質は、分泌分子／循環分子である
。それゆえ、血液サンプルは、プローブされるべきサンプルとして有用であるか、または
分泌ＣＡタンパク質の存在について試験される。抗体は、以前に記載された免疫アッセイ
技術（当業者によって理解される、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウエスタンブロッ
ト）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥ技術などが含まれる）のいずれかによってＣＡタンパク
質を検出するために使用され得る。
【０１４２】
好ましい実施形態において、標識されたＣＡ核酸プローブの組織アレイとのインサイチ
ュハイブリダイゼーションが行われる。例えば、組織サンプル（ＣＡ組織および／または
正常組織を含む）のアレイが生成される。次いで、当該分野において公知のインサイチュ
ハイブリダイゼーションが行われ得る。
【０１４３】
個体と標準との間の発現フィンガープリントが比較される場合、当業者は、診断および
予後を行い得ることが理解される。さらに、診断を示す遺伝子は、予後を示す遺伝子とは
異なり得ることが理解される。
【０１４４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、ＣＡ配列を含む改
変タンパク質および細胞は、予後アッセイにおいて使用される。上記のように、癌腫（特
に、乳癌またはリンパ腫）の長期予後の点からみた重症度に関連する遺伝子発現プロファ
イルが生成され得る。さらに、これは、タンパク質レベルまたは遺伝子レベルのいずれか
で行われ得る（遺伝子の使用が、好ましい）。上記のように、ＣＡプローブは、組織また
は患者内でのＣＡ配列の検出および定量化のためにバイオチップに結合される。このアッ
セイは、診断のために略述されるように行われる。
【０１４５】
好ましい実施形態において、本明細書中で記載されるようなＣＡ配列のいずれかが、薬
物スクリーニングアッセイにおいて使用される。ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、
ＣＡ配列を含む改変タンパク質および細胞が、薬剤スクリーニングアッセイにおいて、ま
たは「遺伝子発現プロファイル」もしくはポリペプチドの発現プロファイルに対する薬物
候補の効果を評価することによって、使用される。１つの実施形態において、好ましくは
、候補薬剤で処置した後の発現プロファイル遺伝子に関するモニタリングを可能にするた
めの高スループットスクリーニング技術（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
９，８４〜８（１９９８），Ｈｅｉｄら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６：９８６〜９９４
（１９９６））と併用して、発現プロファイルが使用される。
【０１４６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質、ＣＡ抗体、ＣＡ核酸、改変ＣＡタンパク
質、およびネイティブのＣＡタンパク質または改変ＣＡタンパク質を含む細胞が、スクリ
ーニングアッセイにおいて使用される。つまり、本発明は、癌腫表現型を調節する組成物
についてのスクリーニングのための新規の方法を提供する。上記のように、これは、遺伝
子発現のための調節因子またはタンパク質活性の調節因子についてのスクリーニングによ
って行われ得る。同様に、これは、個々の遺伝子レベルまたはタンパク質レベルについて
、あるいは「遺伝子発現プロファイル」に対する薬物候補の効果を評価することによって
、行われ得る。好ましい実施形態において、好ましくは、候補薬剤で処置した後に発現プ
ロファイル遺伝子に関するモニタリングを可能にするための高スループットスクリーニン
グ技術（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，前出を参照のこと）と併用して、発現プロファイルが使用
される。
【０１４７】
本明細書でＣＡ遺伝子を同定して、遺伝子発現に対する薬剤の効果を評価するために多
様なアッセイが実施され得る。好ましい実施形態において、アッセイは、個々の遺伝子レ
ベルまたはタンパク質レベルに対して実行され得る。すなわち、癌腫において異常に調節
される遺伝子として、特定の遺伝子を同定すると、その遺伝子応答を調節する候補生物活
性薬剤が、スクリーニングされ得る。このように「調節」は、遺伝子発現または遺伝子活
性における増加および減少の両方を包含する。好ましい調節量は、正常組織 対 腫瘍組
織における遺伝子発現の最初の変化に依存し、少なくとも１０％、好ましくは５０％、さ
らに好ましくは１００〜３００％の変化を有し、そしてある実施形態においては３００〜
１０００％以上の変化を有する。このように、ある遺伝子が正常組織と比較して腫瘍組織
では４倍の増加を表す場合、約４分の１への減少が所望される；正常組織と比較して、腫
瘍組織では１０分の１への減少は、候補薬剤の発現において１０倍の増加を与えることが
所望される、など。あるいは、ＣＡ配列が改変されているが同一の発現プロファイルまた
は変化した発現プロファイルを示す場合、本明細書で概要を述べられるように、このタン
パク質は検出され得る。
【０１４８】
当業者により理解されるように、これは、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいず
れかでの評価により実施され得る；すなわち遺伝子発現量は、核酸プローブおよび遺伝子
発現レベルの定量化を用いてモニターされ得、あるいは、遺伝子産物それ自身のレベルが
モニターされ得る（例えば、ＣＡタンパク質に対する抗体および標準的な免疫学的検定法
の使用によって）。あるいは、このタンパク質を用いた結合アッセイおよび生物活性アッ
セイが、以下に概要を述べられているように実施され得る。
【０１４９】
好ましい実施形態において、遺伝子発現のモニタリングが実施され、多くの遺伝子、す
なわち発現プロファイルが同時にモニターされるが、多くのタンパク質の発現をモニター
することが、同様に実施され得る。
【０１５０】
本実施形態において、特定の細胞におけるＣＡ配列の検出および定量化のために、ＣＡ
核酸プローブは、本明細書中に概要を述べられるようなバイオチップに結合される。この
アッセイは、さらに以下に記述される。
【０１５１】
概して、好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、分析前に細胞に添加される
。さらに、スクリーニングは、特定の癌腫の型を調節するか、ＣＡタンパク質を調節する
か、ＣＡタンパク質に結合するか、またはＣＡタンパク質と抗体との結合の間で干渉する
、候補生物活性薬剤を同定するように提供される。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、「候補生物活性薬剤」または「薬物候補」という用語ま
たは文法的な同義語は、癌腫表現型（ＣＡタンパク質に結合し、そして／またはＣＡタン
パク質の生物活性を調節する）またはＣＡ配列の発現（核酸配列およびタンパク質配列の
両方の発現を含む）のいずれかを直接的にもしくは間接的に変え得る、生物活性薬剤につ
いて試験されるべき任意の分子（例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機低分子また
は無機低分子、多糖類、ポリヌクレオチドなど）を記載する。特に好ましい実施形態にお
いて、候補薬剤は、例えば正常組織フィンガープリントに対して、ＣＡ表現型を抑制する
。同様に、候補薬剤は、好ましくは重症ＣＡ表現型を抑制する。概して、複数のアッセイ
混合物は、種々の濃度に対して異なる応答を得るため、異なる薬剤の濃度で平行して実施
される。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃
度または検出レベル未満で）としての役割を果たす。
【０１５３】
一つの局面において、候補薬剤は、ＣＡタンパク質の効果を中和にする。「中和する」
は、細胞に実質的な効果を与えないように、タンパク質の活性が、阻害されるか、または
反対に作用されるかのいずれかを意味する。
【０１５４】
候補薬剤は、多くの化学的分類（代表的にそれらは有機分子または無機分子であるが、
好ましくは１００ダルトンを超え約２，５００ダルトン未満である分子量を有する有機低
分子化合物）を包含する。好ましい低分子は、２０００Ｄ未満または１５００Ｄ未満また
は１０００Ｄ未満または５００Ｄ未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造相互作用
（特に水素結合）に必要な官能基を含み、この官能基としては、代表的には少なくとも一
つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基が挙げられ、好まし
くはこれらの化学官能基のうちの少なくとも二つが挙げられる。候補薬剤は、しばしば、
一つ以上の上記の官能基で置換された環式炭素構造または複素環式構造、および／あるい
は芳香族構造または多芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪
酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、これらの構造アナログまたはそれらの組
み合わせを含む生体分子の中から見出される。ペプチドが、特に、好ましい。
【０１５５】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範囲の多様な供給
源から得られる。例えば、多くの手段が、広範囲の多様な有機化合物および生体分子のラ
ンダム合成そして指向的合成（ランダム化したオリゴヌクレオチドの発現を含む）のため
に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物
のライブラリーが、入手可能であるかまたは容易に生成される。さらに、天然にかまたは
合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および
生物化学的手段により、容易に改変される。公知の薬理学的な薬剤は、構造的アナログを
生成するために、指向的またはランダムな化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化
、アミド化のような）に供され得る。
【０１５６】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤はタンパク質である。本明細書において
「タンパク質」は、少なくとも二つの共有結合されたアミノ酸（それは、タンパク質、ポ
リペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する）を意味する。タンパク質は、天
然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造から構成され得
る。このように、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、
天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルア
ラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考慮される
。「アミノ酸」はまた、イミノ酸残基（プロリンおよびヒドロキシプロリンのような）も
包含する。側鎖は、（Ｒ）体または（Ｓ）体のいずれかであり得る。好ましい実施形態に
おいて、アミノ酸は、（Ｓ）体または（Ｌ）体である。天然に存在しない側鎖が使用され
る場合、非アミノ酸置換基が、例えば、インビボでの分解を妨げるかもしくは遅らせるた
めに使用され得る。
【０１５７】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、天然に存在するタンパク質または天
然に存在するタンパク質のフラグメントである。このように、例えば、タンパク質を含有
する細胞抽出物、またはタンパク様の細胞抽出物のランダム消化物もしくは指向的な消化
物が使用され得る。この方法において、原核生物タンパク質および真核生物タンパク質の
ライブラリーは、本発明の方法でスクリーニングするために生成され得る。本実施形態に
おいて、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類のタンパク質のライブラリーが特に好ましく
、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０１５８】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、約５〜約３０アミノ酸のペプチドであり
、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５アミノ酸が特に好ましい。そのペプチ
ドは、上記に概要を述べられているような、天然に存在するタンパク質、ランダムなペプ
チド、または「偏った（ｂｉａｓｅｄ）」ランダムなペプチドの消化物であり得る。本明
細書中の「ランダム化」または文法的な同義語は、本質的にランダムなヌクレオチドおよ
びアミノ酸からなる、それぞれ核酸およびペプチドのいずれかを意味する。概して、これ
らのランダムなペプチド（または核酸、以下に検討される）は、化学的に合成されるので
、それらは、任意の位置で、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込み得る。合成プ
ロセスは、ランダム化されたタンパク質または核酸を生成するように設計され、配列の長
さにわたる全てのまたはほとんどの可能な組み合わせの形成を可能にし、従ってランダム
化された候補生物活性タンパク様薬剤のライブラリーを形成し得る。
【０１５９】
１つの実施形態において、ライブラリーは、どの位置にも配列優先性または一定配列を
有さずに、十分にランダム化される。好ましい実施形態において、ライブラリーは偏って
いる。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定配列を保持されるか、または限られた
数の可能性から選択されるかのいずれかである。例えば、好ましい実施形態において、ヌ
クレオチドまたはアミノ酸残基は、規定された種類（例えば、疎水性アミノ酸、親水性残
基、立体的に偏った（小さいかまたは大きいかのいずれか）残基、核酸結合ドメインの生
成について、システインの生成、架橋について、ＳＨ−３ドメインについてのプロリン、
リン酸化部位についてのセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジンなど、または、
プリンなど）内でランダム化される。
【０１６０】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、上記で規定されるような核酸である
。
【０１６１】
タンパク質について概して上で記述されるように、核酸候補生物活性薬剤は、天然に存
在する核酸、ランダムな核酸、または「偏った」ランダムな核酸であり得る。例えば、原
核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質について上記に概要を述べら
れたように使用され得る。
【０１６２】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、有機化学的部分であり、その広い範
囲は文献において入手可能である。
【０１６３】
一つ以上のＣＡ遺伝子の発現プロファイルを変更するためのアッセイにおいて、候補薬
剤が添加され、細胞がしばらくの間インキュベートされた後、分析される標的配列を含む
サンプルは、バイオチップに添加される。必要な場合、標的配列は、公知技術を用いて調
製される。例えば、公知の溶解緩衝液、エレクトロポレーションなどを用いて、当業者に
理解されるような精製および／または必要に応じて生じるＰＣＲのような増幅を用いて、
サンプルは細胞を溶解するように処理され得る。例えば、ヌクレオシドに共有結合された
標識を用いてインビトロの転写が行われる。概して、核酸は、本明細書中で規定されるよ
うに、標識（ビオチン−ＦＩＴＣまたはＰＥ、ｃｙ３およびｃｙ５が特に好ましい）を用
いて標識化される。
【０１６４】
好ましい実施形態において、標的配列は、プローブに対する標的配列の特異的な結合を
検出する手段を与えるために、例えば、蛍光シグナル、化学発光シグナル、化学シグナル
もしくは放射線シグナルを用いて標識される。標識はまた、検出され得る生成物を適切な
基質が生成するのであれば、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュペルオ
キシダーゼのような酵素であり得る。あるいは、標識は、標識化合物または標識低分子（
酵素阻害剤のような）であり得、それは、酵素に結合するが、触媒も変化もされない。標
識はまた、部分または化合物（例えば、エピトープタグ、もしくはストレプトアビジンに
特異的に結合するビオチン）であり得る。ビオチンの例について、ストレプトアビジンは
、上記に記述されたように標識化され、それにより、結合された標的配列に検出可能なシ
グナルを提供する。当該分野で公知のように、非結合標識ストレプトアビジンは、分析前
に除去される。
【０１６５】
当業者に理解されるように、これらのアッセイは、直接的なハイブリダイゼーションア
ッセイであり得るか、または「サンドイッチアッセイ」（それは多くのプローブの使用を
含み、概して米国特許第５,６８１,７０２号、同第５,５９７,９０９号、同第５,５４５,
７３０号、同第５,５９４,１１７号、同第５,５９１,５８４号、同第５,５７１,６７０号
、同第５,５８０,７３１号、同第５,５７１,６７０号、同第５,５９１,５８４号、同第５
,６２４,８０２号、同第５,６３５,３５２号、同第５,５９４,１１８号、同第５,３５９,
１００号、同第５,１２４,２４６号および同第５,６８１,６９７号（これらの全てが本明
細書中で参考として援用される）に概要が述べられている）を包含し得る。本実施形態に
おいて、一般的に、標的核酸は、上記に概要が述べられているように調製され、次いで、
ハイブリダイゼーション複合体を形成をさせる条件下で、複数の核酸プローブを含むバイ
オチップに添加される。
【０１６６】
多様なハイブリダイゼーションの条件が、本発明で使用され得、上記に概要が述べられ
ているような高ストリンジェンシー条件、中程度ストリンジェンシー条件および低いスト
リンジェンシー条件を包含する。アッセイは、概してストリンジェンシー条件下で実施さ
れ、これは、標的の存在下のみで標識プローブハイブリダイゼーション複合体を形成させ
る。ストリンジェンシーは、工程パラメータ（熱力学的変数であり、温度、ホルムアミド
濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度等が挙げられるが、これらに限
定されない）を変えることにより制御され得る。
【０１６７】
これらのパラメータはまた、概して米国特許第５,６８１,６９７号に概要が述べられて
いるように、非特異的な結合を制御するために使用され得る。従って、非特異的な結合を
減少するため、より高いストリンジェンシー条件で特定の工程を実施することが望ましく
あり得る。
【０１６８】
本明細書中で概要が述べられた反応は、当業者に理解されるように、多様な方法で達成
され得る。反応の構成要素は、任意の順序で、同時にまたは連続的に添加され得、好まし
い実施形態は、以下に概要を述べられる。さらに、反応は、アッセイに含有され得る多く
の他の試薬を含有し得る。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン
）、界面活性剤等の様な試薬を含み、これらは最適なハイブリダイゼーションおよび検出
を容易にするために使用され得、そして／または非特異的な相互作用もしくはバックグラ
ウンドの相互作用を減少するために使用され得る。また、アッセイの効率を別な方法で改
善する試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などのような）が使
用され得、それはサンプル調製法および標的の純度に依存する。さらに、固相または液体
ベースの（すなわちキネティックＰＣＲ）いずれかのアッセイが使用され得る。
【０１６９】
一度そのアッセイが実施されると、データは、個々の遺伝子の発現レベル、および状態
の間の発現レベルの変化を決定するために分析され、遺伝子発現プロファイルを形成する
。
【０１７０】
好ましい実施形態において、診断用途および予後用途に関しては、任意の一つの状態で
重要な差次的に発現された遺伝子または変異遺伝子を同定した後、スクリーニングが、遺
伝子個々の発現を変えるために実施され得る。すなわち、単一遺伝子発現の制御を調節す
るためのスクリーニングが行われ得る。このように、例えば、特にその存在または非存在
が２つの状態の間で独特である標的遺伝子の場合において、スクリーニングは標的遺伝子
発現の調節因子に対して行われる。
【０１７１】
さらに、スクリーニングは、候補因子に応答して誘導される新規遺伝子について行われ
得る。正常な発現パターンを導くＣＡ発現パターンを抑制する能力または正常組織からの
遺伝子発現を模倣するように１つのＣＡ遺伝子発現プロファイルを調節するその能力に基
づいて候補因子を同定した後、上記に記述されるようなスクリーニングが、その因子に応
答して特に調節される遺伝子を同定するために実施され得る。正常組織と因子で処理され
たＣＡ組織との間で発現プロファイルを比較することは、正常組織またはＣＡ組織で発現
されないが因子で処理された組織で発現される遺伝子を明らかにする。これらの因子特異
的な配列は、同定され得、そしてＣＡ遺伝子またはＣＡタンパク質について本明細書で記
述された任意の方法により使用され得る。特に、これらの配列およびそれらがコードする
タンパク質は、因子で処理された細胞に目印をつけるかまたは同定することにおける用途
を発見する。さらに、抗体が、因子誘導タンパク質に対して惹起され得、そして、処理さ
れたＣＡ組織サンプルに対して新規治療薬を標的化するために使用され得る。
【０１７２】
このように、一つの実施形態において、このように関連したＣＡ発現プロファイルを有
する候補因子が、ＣＡ細胞集団に対して投与される。本明細書中の「投与」または「接触
」は、候補因子が、摂取および細胞内作用、または細胞表面での作用のいずれかにより、
因子が細胞に作用するようにする様式で細胞に添加されることを意味する。ある実施形態
において、タンパク質様候補因子（すなわちペプチド）をコードする核酸は、ウイルス構
築物（例えば、レトロウイルス構築物）に入れられ得、そして、細胞に添加され、その結
果、ペプチド因子の発現が達成される（ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９を参照のこと、本
明細書中で参考として明示的に援用される）。
【０１７３】
一旦、候補因子が細胞に投与されると、所望される場合に細胞は洗浄され得、そして、
いくらかの期間好ましい生理条件下でインキュベートされる。次いで、本明細書で概要を
述べたように、細胞が回収され、新しい遺伝子発現プロファイルが生成される。
【０１７４】
このように、例えば、ＣＡ組織は、ＣＡ表現型を減少するかまたは抑制する因子につい
てスクリーニングされ得る。少なくとも一つの遺伝子の発現プロファイルの変化は、因子
がＣＡ活性に対する効果を有すことを示す。ＣＡ表現型に対するこのようなサイン（ｓｉ
ｇｎａｔｕｒｅ）を規定することにより、その表現型を変える新しい薬物のスクリーニン
グが考案され得る。このアプローチの場合、薬物の標的は公知である必要はなく、元々の
発現スクリーニングプラットフォームにおいて示される必要もなく、標的タンパク質につ
いての転写レベルが変化する必要もない。
【０１７５】
好ましい実施形態において、上記で概要を述べたように、スクリーニングは個々の遺伝
子および遺伝子産物（タンパク質）に対して実施され得る。すなわち、特定の状態におい
て重要であるような特に差次的に発現される遺伝子が同定された後、その遺伝子または遺
伝子産物それ自身の発現のいずれかの調節因子のスクリーニングが行われ得る。差次的に
発現された遺伝子の遺伝子産物は、時々、本明細書中で「ＣＡタンパク質」または「ＣＡ
Ｐ」といわれる。ＣＡＰは、フラグメントであり得るか、あるいは、表１の核酸によりコ
ードされる全長タンパク質またはフラグメントであり得る。好ましくは、ＣＡＰは、フラ
グメントである。別の実施形態において、配列は、さらに本明細書に記述されているよう
な配列改変体である。
【０１７６】
好ましくは、ＣＡＰは、約１４〜２４のアミノ酸長のフラグメントである。さらに好ま
しくは、フラグメントは可溶性フラグメントである。好ましくは、フラグメントは、非膜
貫通領域を含む。好ましい実施形態において、フラグメントは、溶解性を補助するために
Ｎ末端にＣｙｓを有する。一つの実施形態において、フラグメントのｃ末端は、遊離酸と
して保たれ、Ｎ末端は、（例えば、システインに対する）結合を補助するための遊離アミ
ンである。
【０１７７】
一つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、本明細書中で検討されているように、免
疫原性因子に結合体化される。一つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、ＢＳＡに結
合体化される。
【０１７８】
好ましい実施形態において、スクリーニングは、ＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝子の発現産
物の生物学的機能を変えるために実施される。また、特定の状態にある遺伝子の重要性を
同定された後、遺伝子産物を結合し、そして／または遺伝子産物の生物学的活性を調節す
る因子についてのスクリーニングは、以下にさらに十分に概要を述べるように実行され得
る。
【０１７９】
好ましい実施形態において、スクリーニングは、ＣＡタンパク質に結合し得る候補因子
をまず見つけるように設計され、次いで、これらの因子は、ＣＡＰ活性および癌腫表現型
を調節する候補因子の能力を評価するアッセイにおいて使用され得る。このように、当業
者に理解されるように、実施され得る多くの様々なアッセイ（結合アッセイおよび活性ア
ッセイ）が存在する。
【０１８０】
好ましい実施形態において、結合アッセイが実施される。一般的に、精製または単離さ
れた遺伝子産物が使用される；すなわち、一つ以上のＣＡ核酸の遺伝子産物が生成される
。一般的に、これは、当該分野に公知であるように実施される。例えば、抗体が、タンパ
ク質遺伝子産物に対して産生され、標準免疫アッセイは、存在するタンパク質量を決定す
るために実行される。あるいは、ＣＡタンパク質を含む細胞が、アッセイに使用され得る
。
【０１８１】
このように、好ましい実施形態において、方法は、ＣＡタンパク質と候補生物活性因子
とを合わせる工程、およびＣＡタンパク質への候補因子の結合を決定する工程を包含する
。好ましい実施形態はヒトまたはマウスのＣＡタンパク質を利用するが、他の哺乳動物タ
ンパク質をまた、例えば、ヒト疾患の動物モデルの開発のために使用され得る。いくつか
の実施形態において、本明細書に概要が述べられるように、改変体または誘導体のＣＡタ
ンパク質が使用され得る。
【０１８２】
概して、本明細書中の方法の好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質または候補因
子は、単離されたサンプル受容領域（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）
を有する、不溶性支持体に非拡散的に結合される。この不溶性支持体は、任意の組成物か
ら生成され得、これらの組成物は、この支持体に結合され得、可溶性物質から容易に分離
され、そうでなければ、全般的なスクリーニング方法と適合性である。このような支持体
の表面は、中実または多孔性であり得、任意の都合のよい形状である。適切な不溶性支持
体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げら
れる。これらは、代表的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類
、ナイロンもしくはニトロセルロース、ＴｅｆｌｏｎＴＭなどから生成される。マイクロ
タイタープレートおよびアレイは、特に都合がよい。なぜなら、少量の試薬およびサンプ
ルを用いて、膨大な数のアッセイが同時に実行され得るからである。組成物の特定の結合
様式は、本発明の試薬および全般的な方法と適合性であり、組成物の活性を維持し、そし
て、非拡散性である限り、重要ではない。好ましい結合方法としては、抗体（タンパク質
が支持体に結合される場合、リガンド結合部位または活性化配列のいずれも立体的にブロ
ックしない）、「粘着性」支持体またはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、表面
上でのタンパク質または因子の合成などの使用が挙げられる。タンパク質または因子の結
合後、過剰の非結合性材料は洗浄により除去される。次いで、サンプル受容領域は、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害なタンパク質もしくは他の成分との
インキュベーションによりブロック化され得る。
【０１８３】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は支持体に結合され、そして候補生物活性
因子は、アッセイに添加される。あるいは、候補因子は、支持体に結合され、ＣＡタンパ
ク質が添加される。新規結合因子としては、特定の抗体、化学ライブラリーのスクリーニ
ングで同定された非天然の結合因子、ペプチドアナログなどが挙げられる。ヒト細胞に対
して低い毒性を有する因子についてのスクリーニングアッセイは特に興味深い。広範囲の
多様なアッセイが、この目的のために使用され得、このアッセイとしては、標識化インビ
トロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質
結合についての免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などが挙げられ
る。
【０１８４】
ＣＡタンパク質への候補生物活性因子の結合の決定は、多くの方法で実施され得る。好
ましい実施形態において、候補生物活性因子は標識され、結合が直接的に決定される。例
えば、これは、固体支持体にＣＡタンパク質の全てまたは一部を結合することにより、標
識化候補因子（例えば、蛍光標識）を添加すること、過剰な試薬を洗い流すこと、そして
標識が固体支持体上に存在するかどうかを決定することにより、実施され得る。多様なブ
ロッキング工程および洗浄工程が、当該分野で公知であるように利用され得る。
【０１８５】
本明細書中の「標識化」は、検出可能なシグナルを提供する標識（例えば、放射線同位
体、蛍光体、酵素、抗体、磁気粒子のような粒子、化学発光体または特異的な結合分子な
ど）を用いて、化合物が直接的または間接的のいずれかで標識化されることを意味する。
特異的な結合分子は、ビオチンとストレプトアビジンや、ジゴキシンと抗ジゴキシンなど
のような対を含む。特異的な結合メンバーについて、相補的なメンバーは、通常、上に概
要を述べたように、公知の手順に従って、検出を提供する分子を用いて標識化される。標
識は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に与え得る。
【０１８６】
ある実施形態において、構成要素の一つのみが標識化される。例えば、タンパク質（ま
たはタンパク様候補因子）は、１２５Ｉまたは発蛍光団を用いてチロシン位で標識され得
る。あるいは、１個より多くの成分が、異なる標識を用いて（例えば、タンパク質につい
て１２５Ｉを用いて、そして候補因子について蛍光体を用いて）標識され得る。
【０１８７】
好ましい実施形態において、候補生物活性因子の結合は、競合結合アッセイの使用によ
り決定される。この実施形態において、競合剤は、標的分子（すなわち、ＣＡタンパク質
）に結合することが公知の結合部分（例えば、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガン
ドなど）である。特定の状況下で、生物活性因子と結合部分との間で生物活性因子を置換
する結合部分との競合的結合が存在し得る。
【０１８８】
ある実施形態において、候補生物活性因子は標識される。候補生物活性因子または競合
剤のいずれか、あるいはその両方が、存在する場合には結合させるのに十分な時間の間、
タンパク質にまず添加される。インキュベーションは、最適の活性を容易にする任意の温
度（代表的には４℃〜４０℃の間）で実施され得る。インキュベーション期間は、最適の
活性について選択されるが、また、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にする
ために最適化もされ得る。代表的に、０．１〜１時間の間が十分である。過剰の試薬は、
概して除去されるかもしくは洗い流される。次いで、第２番目の成分要素が添加され、標
識された成分の存在もしくは非存在が追跡され、結合を示す。
【０１８９】
好ましい実施形態において、競合剤が、まず添加され、その後、候補生物活性因子が添
加される。競合剤の置換は、候補生物活性因子がＣＡタンパク質に結合していることを示
し、従って、ＣＡタンパク質に結合し得、ＣＡタンパク質の活性を潜在的に調節し得る。
この実施形態において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競合剤が標識
化される場合、洗浄溶液中の標識の存在は、その因子による置換を表す。あるいは、候補
生物活性因子が標識される場合、支持体上の標識の存在は、置換を表す。
【０１９０】
代替的な実施形態において、候補生物活性因子がまず添加され、インキュベーションお
よび洗浄を行い、その後、競合剤が添加される。競合剤による結合の非存在は、生物活性
因子がより高い親和性でＣＡタンパク質と結合される、ということを表し得る。従って、
候補生物活性因子が標識される場合、支持体上の標識の存在は、競合剤結合の欠如と合わ
せて、候補因子がＣＡタンパク質に結合し得ることを表し得る。
【０１９１】
好ましい実施形態において、この方法は、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性
因子を同定するために、差次的スクリーニング工程を包含する。この実施形態において、
この方法は、第１サンプル中の、ＣＡタンパク質と競合剤とを組み合わせる工程を包含す
る。第２サンプルは、候補生物活性因子、ＣＡタンパク質および競合剤を含む。競合剤の
結合が、両サンプルについて決定され、そして２つのサンプル間の結合の変化または相違
は、ＣＡタンパク質に結合し得る因子の存在、およびその活性を潜在的に調節することを
表す。すなわち、競合剤の結合が、第１サンプルに比べて第２サンプルにおいて異なる場
合、その因子は、ＣＡタンパク質に結合し得る。
【０１９２】
あるいは、好ましい実施形態は、ネイティブなＣＡタンパク質に結合するが改変された
ＣＡタンパク質に結合し得ない、薬物候補を同定するために差次的スクリーニングを利用
する。ＣＡタンパク質の構造は、モデル化され得、その部位と相互作用する因子を合成す
るために、合理的な薬物設計において使用され得る。ＣＡ生物活性に影響を及ぼす薬物候
補はまた、タンパク質の活性を増強または減少のいずれかをする能力について、薬物をス
クリーニングすることにより同定される。
【０１９３】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、アッセイにおいて使用され
得る。好ましくは、全てのコントロールおよび試験サンプルは、統計上有意な結果を得る
ために、少なくとも三連で実施される。全てのサンプルのインキュベーションは、タンパ
ク質に因子を結合するために十分な時間の間である。インキュベーション後、全てのサン
プルは、非特異的に結合された材料を含まないように洗浄され、そして結合された（概し
て、標識された因子）量が決定される。例えば、放射標識が使用される場合で、サンプル
は、結合化合物量を決定するために、シンチレーションカウンターで計数され得る。
【０１９４】
多様な他の試薬は、スクリーニングアッセイにおいて包まれ得る。これらは、試薬（塩
、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤など）を含み、それは、最適なタ
ンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的な相互作用もしくはバッ
クグラウンド相互作用を減らすために使用され得る。そうでなければ、アッセイの効率を
改善する試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤など）もまた、使
用され得る。成分の混合物は、必須の結合を提供する任意の順番で添加され得る。
【０１９５】
ＣＡタンパク質の活性を調節する因子のスクリーニングもまた、実施され得る。好まし
い実施形態において、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性因子をスクリーニング
する方法は、上述のように、ＣＡタンパク質のサンプルに候補生物活性因子を添加する工
程およびＣＡタンパク質の生物学的活性の変化を決定する工程を包含する。「ＣＡタンパ
ク質の活性を調節する」ことは、活性の増大；活性の減少、または存在する活性の型もし
くは種類の変化を包含する。このように、この実施形態において、候補因子は、ＣＡタン
パク質と結合すること（これは必要というわけではないが）および本明細書中に規定され
るその生物学的活性または生化学的な活性を変えること、の両方をすべきである。この方
法は、ＣＡタンパクの存在、分布、活性または量の変化について、インビトロのスクリー
ニング方法（概して上に概要が述べられるように）およびインビボの細胞スクリーニング
の両方を包含する。
【０１９６】
従って、この実施形態において、この方法は、ＣＡサンプルと候補生物活性因子とを組
み合わせる工程、およびＣＡ活性に対する効果を評価する工程を包含する。本明細書中に
おいて「ＣＡ活性」または文法的な同義語は、ＣＡタンパク質の生物学的活性（腫瘍形成
（細胞分裂、好ましくはリンパ組織における細胞分裂、細胞増殖、腫瘍増殖および細胞の
形質転換を包含する）が挙げられるがこれらに限定されない）におけるその役割のうちの
一つを意味する。一つの実施形態において、ＣＡ活性は、表１の核酸によりコードされる
タンパク質の活性化、または、表１の核酸によりコード化されたタンパク質による活性化
を包含する。ＣＡ活性の阻害剤は、任意の一つ以上のＣＡ活性の阻害である。
【０１９７】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質の活性は増大される；別の好ましい実施形
態において、ＣＡタンパク質の活性は減少される。従って、アンダゴニストである生物活
性因子は、いくつかの実施形態において好ましく、アゴニストである生物活性因子は、他
の実施形態において好ましくあり得る。
【０１９８】
好ましい実施形態において、本発明は、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性因
子をスクリーニングするための方法を提供する。本方法は、ＣＡタンパク質を含む細胞に
、上に規定されるような候補生物活性因子を添加する工程を包含する。好ましい細胞型は
、ほとんどの任意の細胞を含む。この細胞は、ＣＡタンパク質をコードする組換え核酸を
含む。好ましい実施形態において、候補因子のライブラリーは、複数の細胞に対して試験
される。
【０１９９】
一つの局面において、このアッセイは、生理学的なシグナル（例えば、ホルモン、抗体
、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法剤を包含する薬理学的
な因子、放射線、発癌剤、または他の細胞（すなわち、細胞と細胞との接触））の存在下
または非存在下、あるいはこれらの生理学的なシグナルの曝露前または曝露後で評価され
る。別の実施例において、決定因子は、細胞周期過程の異なる段階で決定される。
【０２００】
このようにして、生物活性因子は同定される。薬理学的な活性を有する化合物は、ＣＡ
タンパク質の活性を増強し得るか、または妨害し得る。
【０２０１】
一つの実施形態において、癌腫癌細胞分裂を阻害する方法が提供される。本方法は、癌
腫癌阻害剤の投与を包含する。
【０２０２】
好ましい実施形態において、リンパ腫癌腫細胞分裂を阻害する方法を提供し、この方法
は、リンパ腫癌腫阻害剤の投与を包含する。
【０２０３】
好ましい実施形態において、乳癌癌腫細胞分裂を阻害する方法を提供し、この方法は、
乳癌癌腫阻害剤の投与を包含する。
【０２０４】
別の実施形態において、腫瘍増殖を阻害する方法が提供される。本方法は、癌腫癌阻害
剤の投与を包含する。特に好ましい実施形態において、リンパ組織において腫瘍増殖を阻
害する方法を提供し、この方法は、リンパ腫阻害剤の投与を包含する。
【０２０５】
別の実施形態において、腫瘍増殖を阻害する方法が提供される。本方法は、癌腫癌阻害
剤の投与を包含する。特に好ましい実施形態において、哺乳動物組織において腫瘍増殖を
阻害する方法を提供し、この方法は、乳癌阻害剤の投与を包含する。
【０２０６】
さらなる実施形態において、細胞を処理する方法または癌を有する個体を処置する方法
が提供される。本方法は、癌腫癌阻害剤の投与を包含する。一つの実施形態において、癌
腫は乳癌癌腫である。代替の実施形態において、癌腫はリンパ腫である。
【０２０７】
一つの実施形態において、癌腫性癌阻害剤は、上記で検討されたような抗体である。別
の実施形態において、癌腫癌阻害剤は、アンチセンス分子である。本明細書中で使用され
る場合、アンチセンス分子は、癌腫性癌分子についての標的ｍＲＮＡ（センス）配列また
は標的ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの
いずれか）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを
含む。本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは
、概して、少なくとも約１４ヌクレオチドのフラグメント、好ましくは約１４〜３０ヌク
レオチドのフラグメントを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、以
下に記述される：例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
４８：２６５９，（１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ６：９５８，（１９８８）。
【０２０８】
アンチセンス分子は、リガンド結合分子を用いた結合体形成により、標的ヌクレオチド
配列を含む細胞に導入され得る（ＷＯ９１／０４７５３に記載）。適切なリガンド結合分
子は、限定されないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞
表面レセプターに結合する他のリガンドを包含する。好ましくは、リガンド結合分子の結
合体は、リガンド結合分子が、その対応する分子もしくはレセプターに結合する能力を実
質的に妨げないか、または、センスセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド、もしくはその結合体バージョンの細胞への進入をブロックしない。ある
いは、センスセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリ
ゴヌクレオチド脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞へ導入され得る（ＷＯ
９０／１０４４８に記載）。アンチセンス分子またはノックアウトモデルおよびノックイ
ンモデルの使用はまた、処理方法に加えて、上記で検討されているような、スクリーニン
グアッセイで使用され得ることが理解される。
【０２０９】
所望の薬理活性を有する化合物は、前述したように、宿主に対して生理学的に受容可能
なキャリア中で投与され得る。薬剤は、多様な方法、経口、非経口（例えば、皮下、腹腔
内、脈管内など）で投与され得る。導入方法により、化合物は、多様な方法で処方され得
る。処方物中の、治療活性化合物の濃度は、約０．１〜１００％（重量／体積）で変動し
得る。薬剤は、単独、または他の処置（すなわち、放射線）と組み合わせて投与され得る
。
【０２１０】
薬学的組成物は、多様な形態（例えば、顆粒、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル、懸濁剤、
軟膏剤、ローション剤など）で調製され得る。経口および局所の使用に適した、医薬品等
級の有機または無機のキャリアおよび／または希釈剤は、治療活性化合物を含む組成物を
構成するために使用され得る。当該分野に公知の希釈剤としては、水性媒体、植物および
動物油、および脂肪が挙げられる。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変える塩、
または適切なｐＨ値に安定化するための緩衝液および皮膚浸透増強剤は、補助剤として使
用され得る。
【０２１１】
理論に束縛されないが、種々のＣＡ配列は、癌腫において重要であるようである。従っ
て、変異体または改変体のＣＡ遺伝子に基づいた障害が、決定され得る。一つの実施形態
において、本発明は、細胞において少なくとも一つの内因性ＣＡ遺伝子の配列の全部また
は一部を決定することを包含する、改変体ＣＡ遺伝子を含む細胞を同定するための方法を
提供する。当業者により理解されるように、これは、任意の数の配列決定の技術を使用し
て行われ得る。好ましい実施形態において、本発明は、個体の少なくとも一つのＣＡ遺伝
子（例えば、ＰＲＬＲ）の配列の全部または一部を決定することを包含する、個体のＣＡ
遺伝子型を同定する方法を提供する。これは、概して、少なくとも一つの個体組織におい
て実施され、多くの組織または同一組織の異なるサンプルの評価を包含し得る。この方法
は、配列決定されたＣＡ遺伝子の配列と公知のＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝子（すなわち、
野生型遺伝子）とを比較することを包含し得る。当業者により理解されるように、ある癌
遺伝子の配列における変化は、疾患の存在または疾患を発生する傾向、または予後評価の
いずれかの指標であり得る。
【０２１２】
次いで、ＣＡ遺伝子（例えば、ＰＲＬＲ）の全部または一部の配列は、なんらかの相違
が存在するか否かを決定するために公知のＣＡ遺伝子の配列と比較され得る。これは、任
意の数の公知の相同性プログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔなど）を用いて、実施され得
る。好ましい実施形態において、患者のＣＡ遺伝子（例えば、ＰＲＬＲ）と公知ＣＡ遺伝
子との間の配列における相違の存在は、本明細書で概要が述べられているように、疾患状
態の指標または疾患状態についての傾向の指標である。
【０２１３】
好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ゲノムにおけるＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝
子のコピー数を決定するためのプローブとして使用され得る。例えば、いくつかの癌は、
染色体欠失または染色体挿入を呈し、その結果、遺伝子のコピー数が変化する。
【０２１４】
別の好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ＣＡ遺伝子の染色体位置を決定するた
めのプローブとして使用される。特に染色体異常（例えば、転座など）などがＣＡ遺伝子
座（例えば、ＰＲＬＲ遺伝子座）で同定された際、染色体位置のような情報は、診断また
は予後診断を提供する有効性を見出す。
【０２１５】
このように、一つの実施形態において、細胞または生物でのＣＡを調節する方法を提供
する。一つの実施形態において、この方法は、内因性ＣＡタンパク質の生物学的活性を減
少または排除する抗ＣＡ抗体を細胞に投与することを包含する。あるいは、この方法は、
ＣＡタンパク質をコードする組換え核酸を、細胞または生物に投与することを包含する。
当業者により理解されるように、これは、任意の数の方法で実行され得る。好ましい実施
形態において、例えば、ＣＡ配列が癌腫においてダウンレギュレーションされた際、例え
ば、公知の遺伝子治療技術を用いて、細胞内のＣＡ量の増加（例えば、内因性ＣＡを過剰
発現することにより、またはＣＡ配列をコードする遺伝子を投与することにより）により
、ＣＡ遺伝子の活性は増大される。好ましい実施形態において、遺伝子治療技術は、増強
された相同組換え（ＥＨＲ）（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８（本明細書中で全
体が参考として援用される）に記述されるような）を用いる外因性遺伝子の組み込みを包
含する。あるいは、例えばＣＡ配列が癌腫においてアップレギュレーションされる際、内
因性ＣＡ遺伝子の活性は、例えば、ＣＡアンチセンス核酸の投与により減少される。
【０２１６】
一つの実施形態において、本発明のＣＡタンパク質は、ＣＡタンパク質に対するポリク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するために使用され得、それらの抗体は、
本明細書に記載されるように有用である。同様に、ＣＡタンパク質は、標準技術を用いて
、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合され得る。次いで、これらのカラムは
、ＣＡ抗体を精製するために使用され得る。好ましい実施形態において、この抗体は、Ｃ
Ａタンパク質に特有のエピトープに対して生成される；すなわち、抗体は、他のタンパク
質に対して、ほとんどもしくは全く交差反応を示さない。これらの抗体は、多くの適用に
おいて有用性を見出す。例えば、ＣＡ抗体は、標準アフィニティークロマトグラフィーカ
ラムに結合され得、ＣＡタンパク質を精製するために使用され得る。抗体はまた、ＣＡタ
ンパク質に特異的に結合するので、上に概要が述べられているように、ポリペプチドをブ
ロッキングするために使用され得る。
【０２１７】
一つの実施形態において、治療有効用量のＣＡまたはその調節因子は、患者に投与され
る。本明細書中の「治療有効用量」は、投与される効果を生じる用量を意味する。正確な
用量は、処置目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確かめられ得る。当該分野
で公知なように、ＣＡ分解、全身送達 対 局所送達および新しいプロテアーゼ合成速度
、ならびに年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与回数、薬物相互作用および状態
の重症度についての調整が必要であり得、当業者により慣用的な実験により確かめられ得
る。
【０２１８】
本発明の目的のための「患者」は、ヒトならびに他の動物（特に哺乳動物）および生物
の双方を包含する。このように、この方法は、ヒト治療および獣医学の適用の双方に適用
可能である。好ましい実施形態において、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態
では、患者はヒトである。
【０２１９】
本発明のＣＡタンパク質および調節因子の投与は、上で検討されたように、多様な方法
（限定されていないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、
膣的、直腸的または眼内を包含する）において実施され得る。いくつかの例において、例
えば、創傷および炎症の処置において、ＣＡタンパク質および調節因子が、溶液またはス
プレーとして、直接適用され得る。
【０２２０】
本発明の薬学的組成物は、患者への投与に適切な形態でＣＡタンパク質を含む。好まし
い実施形態において、薬学的組成物は、水溶性形態（例えば、薬学的に受容可能な塩とし
て存在する）であり、これは、酸および塩基の双方の付加塩を包含することを意味する。
「薬学的に受容可能な酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的効果を保持し、そして以下の酸
と生物学的には形成されず、他の点では所望される塩をいい、酸としては、無機酸（例え
ば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）および有機酸（例えば、酢酸、プロピ
オン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマ
ル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンス
ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）である。「薬学的に受容可能な塩
基付加塩」としては、無機塩基の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニ
ウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウ
ム塩など）から誘導される塩が挙げられる。特に好ましくは、アンモニウム塩、カリウム
塩、ナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩である。薬学的に受容可能な有機
非毒性塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミンの塩、置換アミン（
天然に存在する置換アミンを包含する）、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（例え
ば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリ
プロピルアミンおよびエタノールアミン）が挙げられる。
【０２２１】
薬学的組成物はまた、以下の一つ以上を含み得る：血清アルブミンのような、キャリア
タンパク質；緩衝剤；微晶性セルロース、乳糖、トウモロコシデンプンおよび他のデンプ
ンのような、充填剤；結合剤；甘味料および他の矯味矯臭剤；着色剤；およびポリエチレ
ングルコール。添加剤は、当該分野に周知であり、多様な処方物で使用される。
【０２２２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質および調節因子は、治療薬として投与され
、上に概要が述べられているように、処方され得る。同様に、ＣＡ遺伝子（全長配列、部
分配列の両方またはＣＡコード領域の調節配列を含む）は、当該分野に公知なように、遺
伝子治療の適用において投与され得る。これらのＣＡ遺伝子は、当業者により理解される
ように、遺伝子治療（すなわち、ゲノムへの組み込み）として、またはアンチセンス組成
物としてのいずれかで、アンチセンスの適用を包含し得る。
【０２２３】
好ましい実施形態において、ＰＲＬＲのようなＣＡ遺伝子は、ＤＮＡワクチン（単一遺
伝子またはＣＡ遺伝子の組み合わせのいずれか）として投与される。裸のＤＮＡワクチン
は、概して当該分野で公知である、Ｂｒｏｗｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，１６：１３０４〜１３０５（１９９８）。
【０２２４】
一つの実施形態において、本発明のＣＡ遺伝子は、ＤＮＡワクチンとして使用される。
ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用のための方法は、当業者に対して周知であり、癌腫
を有する患者における発現のためのプロモーターの制御下に、ＣＡ遺伝子またはＣＡ遺伝
子の一部を配置することを包含する。ＤＮＡワクチンで使用されるＣＡ遺伝子は、全長Ｃ
Ａタンパク質をコードし得るが、さらに好ましくは、ＣＡタンパク質由来のペプチドを含
むＣＡタンパク質の一部をコードし得る。好ましい実施形態において、患者は、ＣＡ遺伝
子由来の複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫される。同様に、本明細書
で定義されるような、複数のＣＡ遺伝子またはその部分を用いて、患者を免疫することが
可能である。理論に束縛されないが、ＣＡタンパク質を発現する細胞を認識しそして破壊
もしくは除去する、ＤＮＡワクチンによりコードされるポリペプチドの発現、細胞傷害性
Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および抗体が、誘導される。
【０２２５】
好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンとともに、アジュバン
ト分子をコード化する遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、サイトカイン（Ｄ
ＮＡワクチンによりコードされるＣＡポリペプチドに対する免疫原性応答を増大する）を
含む。さらなるアジュバントまたは代替的なアジュバントは、当業者に公知であり、発明
での有用性を見出す。
【０２２６】
別の好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、癌腫（特に乳癌またはリンパ腫性癌腫
）の動物モデルを生成する有用性を見出す。当業者により理解されるように、同定された
ＣＡ遺伝子が、ＣＡ組織内で抑制または減少される際、アンチセンスＲＮＡがＣＡ遺伝子
に指向された遺伝子治療技術はまた、遺伝子の発現を減少または抑制する。そのように生
成された動物は、生物活性薬剤候補のスクリーニングにおける有用性を見出すＣＡの動物
モデルとして機能する。同様に、遺伝子ノックアウト技術は、例えば、適切な遺伝子標的
化ベクターを用いた相同性組換えの結果として、ＣＡタンパク質の非存在という結果をも
たらす。所望ならば、ＣＡタンパク質の組織特異的な発現またはノックアウトは、必要で
あり得る。
【０２２７】
ＣＡタンパク質が、癌腫において過剰に発現されることもまた、可能である。従って、
ＣＡタンパク質を過剰に発現するトランスジェニック動物が生成され得る。所望の発現レ
ベルに依存して、種々の強度のプロモーターが、トランスジーンを発現するために使用さ
れ得る。また、組み込まれたトランスジーンのコピー数は、トランスジーンの発現レベル
の決定のために、決定および比較され得る。このような方法により生成された動物は、Ｃ
Ａの動物モデルとしての有用性を見出し、癌腫の処置のための生物活性分子のスクリーニ
ングにおいてさらに有用である。
【０２２８】
本発明のＣＡ核酸配列は、表１に示される。各表における配列は、マウスならびにヒト
の双方についての、ゲノム配列、ｍＲＮＡ、およびコード配列を含む。Ｎ／Ａは、同定さ
れているが、名称が割り当てられていない遺伝子を示す。異なる配列は、以下の配列番号
が割り当てられている：
表１：（マウス遺伝子：Ｐｒｌｒ；ヒト遺伝子ＰＲＬＲ）
マウスゲノム配列（配列番号１）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号２）
マウスコード配列（配列番号３）
ヒトゲノム配列（配列番号４）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号５）
ヒトコード配列（配列番号６）
【０２２９】
【表１−１】
【０２３０】
【表１−２】
【０２３１】
【表１−３】
【０２３２】
【表１−４】
【０２３３】
【表１−５】
【０２３４】
【表１−６】
【０２３５】
【表１−７】
【０２３６】
【表１−８】
【０２３７】
【表１−９】
【０２３８】
【表１−１０】
【０２３９】
【表１−１１】
【０２４０】
【表１−１２】
【０２４１】
【表１−１３】
【０２４２】
【表１−１４】
【０２４３】
【表１−１５】
【０２４４】
【表１−１６】
【０２４５】
【表１−１７】
【０２４６】
【表１−１８】
【０２４７】
【表１−１９】
【０２４８】
【表１−２０】
【０２４９】
【表１−２１】
【０２５０】
【表１−２２】
【０２５１】
【表１−２３】
【０２５２】
【表１−２４】
【０２５３】
【表１−２５】
【０２５４】
【表１−２６】
【０２５５】
【表１−２７】
【０２５６】
【表１−２８】
【０２５７】
【表１−２９】
【０２５８】
【表１−３０】
【実施例】
【０２５９】
（実施例１：乳癌サンプルにおけるＰＲＬＲのｍＲＮＡ発現分析）
ｍＲＮＡを、当該分野で公知の標準的手順によって、乳癌サンプルから調製した。遺伝
子発現を、５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）化学を使用して、ＡＢＩ７９００ＨＴ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおける定量的ＰＣＲによって、測
定した。この化学は、２つのＰＣＲプライマー間でアニールする二重標識（レポーターお
よびクエンチャー）蛍光プローブの添加により、標準的ＰＣＲとは異なる。レポーター色
素の蛍光を、近接するクエンチャーによってクエンチする。熱サイクリングの間に、Ｔａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、アニールしたプローブが切断さ
れ、レポーターとクエンチャー色素とが遊離する。蛍光の増加が観察され、その蛍光がバ
ックグラウンドよりも増加するサイクル数は、対数線形様式で開始テンプレート濃度に関
連する。
【０２６０】
データ分析のために、標的遺伝子の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子の発現レベ
ルを用いて正規化した。そのハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルを、標的遺伝子の
平均発現レベルから差引いた。その後、標準偏差を決定した。さらに、癌組織における標
的遺伝子の発現レベルを、正常組織中の標的遺伝子の発現レベルと比較する。
【０２６１】
図１に示されるように、ＰＲＬＲは、試験した乳癌サンプルの約２１％においてアップ
レギュレートされた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるような発明。
【請求項１】
本明細書に記載されるような発明。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２２５８０７（Ｐ２００９−２２５８０７Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３３８０６（Ｐ２００９−１３３８０６）
【出願日】平成２１年６月３日（２００９．６．３）
【分割の表示】特願２００３−５７８９３３（Ｐ２００３−５７８９３３）の分割
【原出願日】平成１５年３月１２日（２００３．３．１２）
【出願人】（５０４１７７２１７）サイグレス ディスカバリー， インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３日（２００９．６．３）
【分割の表示】特願２００３−５７８９３３（Ｐ２００３−５７８９３３）の分割
【原出願日】平成１５年３月１２日（２００３．３．１２）
【出願人】（５０４１７７２１７）サイグレス ディスカバリー， インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
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