ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途
【課題】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の新規用途を提供する。
【解決手段】
本発明は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤である。
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の新規用途を提供する。
【解決手段】
本発明は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途、すなわちガン細胞増殖抑制剤、このガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤、およびＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＳＭＡ７は巨大な酵素複合体であるプロテアソーム（proteasome）を構成する複数のタンパク質の１つである。プロテアソームは、非常に規則正しい環の形の２０Ｓコア構造をもち、そのコア構造は２８個の非同一サブユニットの４つの環で構成されており（２つの環は７個のαサブユニット、もう２つの環は７個のβサブユニットで構成される）、ＰＳＭＡ７はαサブユニットを構成する複数のタンパク質の１つである。プロテアソームは真核細胞中に高濃度で分布し、非リソソーム経路のＡＴＰ／ユビキチン依存過程でペプチドを切断する（非特許文献１）。２０Ｓコアのαサブユニットは、ウイルスの複製に重要なタンパク質であるＢ型肝炎ウイルスＸタンパク質と特異的に相互作用することが示されている。また、このαサブユニットは、酸素分圧への細胞応答に重要な転写因子である、ＨＩＦ−１αの調節にも関与している。
【０００３】
ＮＥＤＤ１はマウスの中枢神経系において個体の発生に係わる遺伝子として同定された。多くの生物種でＮＥＤＤ１は存在し、動物種間の相同性が高いことが知られている。ヒトにおいてはＮＥＤＤ１が細胞の中心体（centrosome）や紡錘体（mitotic spindle）に存在することが最近明らかになり、中心体（centrosome）や紡錘体（mitotic spindle）におけるγ−チューブリン環状複合体（gamma-tubulin ring complex）を形成する因子の１つではないかと推測されている。実際、ＮＥＤＤ１の消去により微小管の核形成（microtubule nucleation）や紡錘体の集合（spindle assembly）過程に異常が生じること、また、細胞分裂中のＮＥＤＤ１のリン酸化がγ−チューブリンとの結合を介した紡錘体形成（targeting gamma-tubulin to the spindle）に重要であることなどが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＲＡＥ１（RNA export 1 homolog）は、核質、nuclear rim、および細胞質を貫通する網様構造に、それぞれ集中して（distinct foci in the nucleoplasm, to the nuclear rim, and to meshwork-like structures throughout the cytoplasm）存在しており、ＲＮＡの輸送に係わっていることが示唆されている。さらに、ＲＡＥ１ノックアウトマウスについては、体節形成前に胚性致死となること、細胞周期チェックポイントの異常が生じることが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Elenich LAら, Immunogenetics Volume:49 Issue: 10 Date: 1999 Sep ,Pages: 835-42
【非特許文献２】Manning J.ら, Int J Biochem Cell Biol. 2007 39:7-11.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子のそれぞれとヒトを含むほ乳類の病気との関係は知られていない。
【０００７】
そこで、本発明者等は、ガン細胞において高発現している遺伝子の発現抑制が、ガン細胞の増殖に及ぼす影響を調べたところ、特定の遺伝子の発現抑制を行うことで、ガン細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２１）を提供する。
（１）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤。
（２）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（３）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（４）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（３）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（５）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（４）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（６）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（５）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（７）ガンが大腸ガン又は食道ガンである（２）〜（６）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（８）ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（９）ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（８）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１０）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（９）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１１）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（１０）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（１２）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（１１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１３）ガンが胃ガンである（８）〜（１２）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１４）ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１５）ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（１４）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１６）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（１５）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１７）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（１６）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（１８）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（１７）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１９）ガンが食道ガンである（１４）〜（１８）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（２０）（１）から（１９）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。
（２１）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の新規用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】大腸ガン組織で高発現している９７遺伝子に対するsiRNAを大腸ガン細胞に導入した際の細胞のアポトーシス誘導量を示すグラフである。
【図２】ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたアポトーシス誘導試験の結果を示す図である。
【図３】ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン効率試験の結果を示すグラフである。
【図４】ＰＳＭＡ７に対するｓｉＲＮＡのノックダウン効率試験に用いた塩基配列を示す図である。
【図５】ＰＳＭＡ７に対するｓｉＲＮＡのノックダウン効率試験の結果を示すグラフである。
【図６】様々な大腸ガン細胞株におけるＰＳＭＡ７の発現試験の結果を示すグラフである。
【図７】図５にて行った試験に用いるＲＴ−ＰＣＲ試験に用いる内部標準のプライマー配列およびＰＳＭＡ７のプライマー配列を示す図である。
【図８】各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量の結果を示すグラフである。
【図９】動物モデルを用いたＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの大腸ガン皮下移植腫瘍に及ぼす影響試験の手順を示す図である。
【図１０】ヌードマウスにおける大腸ガン皮下移植腫瘍でのｍＲＮＡ発現抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１１】ヌードマウスにおける大腸ガン皮下移植腫瘍でのアポトーシス誘導試験の結果を示す図である。
【図１２】食道ガン細胞におけるＰＳＭＡ７遺伝子の発現試験の結果を示す図である。
【図１３】食道ガン細胞におけるＲＡＥ１遺伝子の発現試験の結果を示す図である。
【図１４】ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡによる食道ガン細胞の増殖抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１５】胃ガン細胞におけるＮＥＤＤ１遺伝子の発現試験の結果を示す図である。
【図１６】ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる胃ガン細胞の増殖抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１７】ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸ガン肝転移抑制実験の観察結果を模式的に示す図である。
【図１８】ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの腹腔内投与によるｉｎ ｖｉｖｏ腹膜再発抑制の結果を説明するグラフである。
【図１９】ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる腹膜再発モデルマウスの延命効果を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
「ストリンジェントな条件」としては、例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃」、「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」、「０．５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」等の条件が挙げられる。
【００１２】
塩基配列について「相同性」とは、比較される配列間において、各々の下位列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。このときギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ（Peasron, Methods in Enzymology 183:63-69 (1990)）等を用いることができる。相同性の数値は、例えば全米バイオテクノロジー（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ (Basic local alignment search tool、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において算出することができる。本発明における相同性を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には配列番号１（または３または５）で示される塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１３】
「ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）遺伝子の発現を抑制する」とは、ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上低下させることを意味する。特定遺伝子の発現を抑制するメカニズムは、詳細には一つには特定されないが、例えば転写開始抑制、mRNAの伸長抑制、mRNAの分解、翻訳抑制などが挙げられる。
【００１４】
「ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）遺伝子の発現を抑制する物質」とは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、非ペプチド性化合物、合成化合物などが挙げられる。より好ましくはポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００１５】
本発明における「二本鎖ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉を起こしてｍＲＮＡを分解することにより、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１又はＲＡＥ１遺伝子の発現を抑制するものである。ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１又はＲＡＥ１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡは、それぞれの遺伝子に対して完全に相補的である必要はなく、それぞれの発現を効果的に抑制できるものであればよい。「効果的に抑制」とは、未処置またはコントロール配列の二本鎖ＲＮＡを加えた細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現量に対して、それぞれの遺伝に対する二本鎖ＲＮＡを加えた細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現量が、少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、抑制されるものをいう。また、「効果的に抑制」されるかぎり、ＲＮＡ鎖の一部が修飾されていてもよい。
また、本発明における「干渉配列」とは、標的ＲＮＡと実際に結合して当該標的ＲＮＡの機能を抑制する機能を有する配列をいう。干渉配列およびその相補的な配列は、その両端または一端に干渉配列を保護するための保護配列を有していてもよい。保護配列としては、たとえばdTdT,dUdU等があげられる。
【００１６】
このような二本鎖ＲＮＡは、化学的に合成することができ、例えばＤＮＡ化学合成でも使用されるホスホアミダイト法により、３'末端から５'末端に向かって一塩基ずつ順番に縮合反応させることにより得られる。ただし、合成過程でＲＮａｓｅによる分解を防ぐために、個々のリボヌクレオチドの２'末端の水酸基を保護して行う。この保護基としては、2'-O-t-butyldimethylsilyl（2'-tBDMS）基、2'-O-triisopropylsilyloxymethyl（2'-TOM）基、5'-silyl-2'-acetoxyethoxy（2'-ACE）基などが挙げられる。
【００１７】
また、遺伝子の発現抑制は、二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡ干渉により生じることが考えられる。ここで、ＲＮＡ干渉とは、低分子のnon-coding二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子により配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいい、例えばｓｉ（small interfering）ＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断、ｓｉＲＮＡによる標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシング、ｍｉ（micro）ＲＮＡによる翻訳抑制、転写抑制、ｍＲＮＡの分解等を指す。
【００１８】
従来より、ｍＲＮＡに作用し、遺伝子発現を抑制する方法として、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖を結合させ、タンパク質への翻訳を阻害するアンチセンス法が知られているが、人工アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの高次構造の影響により標的部位に有効に結合できない場合があるため活性が弱いという問題点があった。
【００１９】
一方、二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉の場合には、ｍＲＮＡの高次構造に無関係に作用することで、ｍＲＮＡの局所的な構造に依存して活性が弱くなるという問題が低減される。
【００２０】
（ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤）
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤は、ＰＳＭＡ７遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＰＳＭＡ７の生成を抑制する。
このようなＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００２１】
ここで、「ＰＳＭＡ７」とは、配列番号２（GenBankアクセッション番号：NP_002783.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２２】
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＰＳＭＡ７と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号２の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００２３】
また、ＰＳＭＡ７には配列番号１（GenBankアクセッション番号：NM_002792.2）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号１で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００２４】
ＰＳＭＡ７に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。
【００２５】
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【００２６】
（ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤）
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤は、ＮＥＤＤ１遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＮＥＤＤ１の生成を抑制する。
このようなＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００２７】
ここで、ＮＥＤＤ１とは、配列番号４（GenBankアクセッション番号：NP_690869.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２８】
「配列番号４で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＮＥＤＤ１と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号４の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００２９】
また、ＮＥＤＤ１には配列番号３（GenBankアクセッション番号：NM_152905.2）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号３で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号３で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００３０】
ＮＥＤＤ１に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。
【００３１】
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【００３２】
（ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤）
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤は、ＲＡＥ１遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＲＡＥ１の生成を抑制する。
このようなＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００３３】
ここで、ＲＡＥ１とは、配列番号６（GenBankアクセッション番号：NP_001015885.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３４】
「配列番号６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＥ１と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号６の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００３５】
また、ＲＡＥ１には配列番号５（GenBankアクセッション番号：NM_001015885.1）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号５で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号５で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００３６】
ＲＡＥ１に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。
【００３７】
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【００３８】
（ガン細胞増殖抑制剤）
本発明のガン細胞増殖抑制剤は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むものである。なお、ガン細胞増殖抑制により、ガン細胞数の減少、他の臓器へのガンの転移の防止などの効果が期待される。
【００３９】
ここでいうガンとは、大腸ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、小腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、舌ガン、脳腫瘍、喉頭ガン、卵巣ガン、急性白血病、慢性白血病、リンパ腫等が含まれる。ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは大腸ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、小腸ガンに作用するものであり、より好ましくは大腸ガン、食道ガンに作用するものであり、さらに好ましくは大腸ガンに作用するものである。ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは胃ガンに作用するものである。ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは食道ガンに作用するものである。
【００４０】
（遺伝子発現抑制剤の用途）
別の観点から、本発明は、前述したＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途を提供する。
例えば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤は、必要に応じてアテロコラーゲンとともに、ガン患者に投与され、ガン化された細胞のアポトーシスを促進させる抗ガン剤として用いることができる。なお、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の細胞への作用はアポトーシスの促進に限られるものではなく、最終的に細胞死を誘発したり、細胞増殖を抑制することができれば、ガン細胞増殖抑制剤として有用である。ここで、アテロコラーゲンとは、酵素可溶化コラーゲンおよびその修飾物のことをいい、例えばＷＯ０１／０９７８５７に記載されている。
【００４１】
すなわち、本発明は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法を提供する。また、さらなる観点から、本発明は、前述したガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤を提供する。
【００４２】
このような用途において、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の使用量は、投与方法、腫瘍の種類、大きさによって異なるが、例えばＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤については局所投与では１ｎｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。また、アテロコラーゲンと併用する場合には、このアテロコラーゲンの濃度は例えば局所投与では０．１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上３０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下、全身投与では１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上５０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下が望ましく、その使用量はＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤との混合後、局所投与で５ｍｌ以上１００ｍｌ以下、全身投与で１０ｍｌ以上５００ｍｌ以下が望ましい。
【００４３】
このような用途によれば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を、ガン化細胞のアポトーシスを促進させる等の機序で細胞死を誘発させ、又は細胞増殖を抑制させることにより、結果としてガンの治療を行うことが可能になる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を試験例に基づいて説明するが、本発明はこれら試験例に限定されることはない。
（試験例１）大腸ガン細胞の増殖抑制試験
大腸ガン組織で高発現している９７遺伝子（以下の表）に対するｓｉＲＮＡを大腸ガン細胞に導入し、各遺伝子の発現抑制が細胞のアポトーシス誘導に及ぼす影響を調べた。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
（１）アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイの作製
以下のようにして、ｓｉＲＮＡおよびアテロコラーゲンの混合物を、９６穴マイクロプレートにコーティングし、ｓｉＲＮＡをリバーストランスフェクションできるアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。
すなわち、アテロコラーゲン（ＰＢＳ中で１６０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）とｓｉＲＮＡ希釈液（ＰＢＳ中で０．４ｍＭ）を１：１の割合で混合、４℃で２０分間、転倒混和し、ｓｉＲＮＡとアテロコラーゲンのコンプレックスを調製した。アテロコラーゲンの最終濃度は８０ｍｇ／ｍｌ、ｓｉＲＮＡの最終濃度は０．２ｍＭとなる。ｓｉＲＮＡ／アテロコラーゲン−コンプレックス５０ｍｌを９６穴プレートの各ウェルに添加、ウェル底面をコーティングして、ｓｉＲＮＡ／アテロコラーゲン−コンプレックスをアレイ化し（ｓｉＲＮＡ １０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）、アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。そこに培養細胞を播種し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
【００４８】
（２）増殖細胞数の測定
作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイに、ＨＴ−２９大腸ガン細胞(The American Type Culture Collection (以下「ATCC」という)より入手)を５×１０3細胞／ｗｅｌｌ播種し、３日間培養した。増殖した細胞数を、プロメガ社推奨のCellTiter-Blue Reagentのプロトコールにしたがって測定した。すなわち、CellTiter-Blue Reagent（プロメガ社製）をＰＢＳ（−）で４倍に希釈し、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で１時間インキュベート後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製）で蛍光値（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）を測定した。
【００４９】
（３）機能的スクリーニング試験
細胞増殖測定後、プロメガ社推奨のCaspase-Glo 3/7 ReagentのプロトコールにしたがってCaspase-3/7活性測定試薬（プロメガ社製）を添加して、室温で６０分間インキュベート後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製）で発光値を測定し、Caspase活性を測定した。
【００５０】
Caspase-3/7活性値を細胞増殖値で除し、コントロールｓｉＲＮＡとして下記の配列（siCONTROL Non-targeting siRNA #1：Dharmacon社、以下の試験例において特筆しない限り、コントロールｓｉＲＮＡとして全て同じものを使用した）を用い、コントロールｓｉＲＮＡの値を１００％としたときの細胞あたりのCaspase-3/7活性の上昇を解析した。
センス鎖 ：5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3'（配列表の配列番号７）
アンチセンス鎖：5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3'（配列表の配列番号８）
上記の各遺伝子のノックダウンによりアポトーシス誘導を指標とした機能的スクリーニング試験（functional screening）の結果、特にＰＳＭＡ７のノックダウンにより、ＨＴ−２９大腸ガン細胞において、他の遺伝子のノックダウンと比較して、アポトーシスが著しく誘導されることが明らかになった（図１）。このことは、ＰＳＭＡ７が大腸ガンにおけるアポトース抑制因子である可能性を示唆している。
【００５１】
（試験例２）ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたアポトーシス誘導試験
試験例１にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを用い、ＨＴ−２９細胞にＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（図４に示した配列＃１〜＃４（それぞれ配列表の配列番号９〜１６）のｓｉＲＮＡの混合物；SMARTpool、Dharmacon社）またはコントロールｓｉＲＮＡを導入し、３日間培養後、ヘキスト染色を行い、細胞核の凝縮や断片化にみられる核形態の変化を観察して、各ｓｉＲＮＡを導入した系におけるアポトーシス誘導を調べた。試験結果を図２に示す。
なお、ヘキスト染色を行った観察とは、細胞をＰＢＳ（−）（phosphate buffered saline (-)；(-)はCaイオン及びMgイオンが成分として入っていないことを示す）で洗浄後、４％ＰＦＡ(paraformaldehyde)、０．１％Triton X-100（シグマ社）、１ｍｇ／ｍｌ Hoechst 33342（ＰＢＳ（−）中）を添加し、室温で２０分間固定し、染色した後に、ＰＢＳ（−）で洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察することをいう。
【００５２】
図２によれば、ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９細胞では、図中の矢印に示したように、多くのアポトーシス細胞が確認された。一方、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９細胞では、ほとんどアポトーシス細胞は認められなかった。
Caspase-3/7の活性化と同様に、ヘキスト染色による観察結果は、ＰＳＭＡ７のノックダウンにより、ＨＴ−２９細胞においてアポトーシスが誘導されることを示し、ＰＳＭＡ７が、大腸ガンにおいてアポトーシス抑制的に働くことを裏付けている。
【００５３】
（試験例３）ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン効率
試験例１にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを用い、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（図４に示した配列＃１〜＃４（それぞれ配列表の配列番号９〜１６）のｓｉＲＮＡの混合物；SMARTpool、Dharmacon社）またはコントロールｓｉＲＮＡを導入したときにおけるｍＲＮＡのノックダウン効率を調べた。ｍＲＮＡの発現量は、FastLane Cell cDNA Kit （キアゲン社）およびQuantiTect SYBR Green PCR Kit （キアゲン社）のプロトコールにしたがい、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）を使用し測定した。内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。結果を図３に示す。
図３によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡをＨＴ−２９細胞に導入したとき、コントロールｓｉＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡの８０％が発現抑制されていたことがわかった。
【００５４】
（試験例４）ＰＳＭＡ７に対する４配列のｓｉＲＮＡのノックダウン効率
ＨＴ−２９細胞にLipofectAmine 2000（Invitrogen社）を用いて、図４に示した各配列のｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、３日後にトータルＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ発現量をSYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II（TaKaRa社）のプロトコールにしたがい、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）で測定した。内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞における発現量を１００％として表す。結果を図５に示す。
図５によれば、４種のＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡうち、図４の配列＃２（配列表の配列番号１１，１２）の配列がノックダウン効率約７０％を示し、その他の３種のｓｉＲＮＡと比較して、最も高い発現抑制を示すことがわかる。以後、配列＃２のｓｉＲＮＡを大腸ガン皮下腫瘍モデル（ヌードマウス）での実験に用いた。
【００５５】
（試験例５）大腸ガン細胞株におけるＰＳＭＡ７の発現
大腸ガン細胞株５種（CaCo2：ヒト結腸腺ガン、HCT116：ヒト結腸腺ガン、HT-29：ヒト結腸腺ガン、LoVo：ヒト結腸腺ガン（鎖骨リンパ節転移巣）、T84：ヒト結腸ガン：肺転移巣；全てATCCより入手）と、正常大腸組織におけるＰＳＭＡ７の発現量を比較した。
ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）により測定した。ＰＳＭＡ７遺伝子のプライマー（配列表の配列番号１７、１８）を用いるとともに、１８ｓ ｒＲＮＡ（配列表の配列番号１９、２０）の発現を内部標準として補正した。正常大腸組織試料１、２の平均値を１とした。結果を図６に示す。配列表の配列番号１７〜２０の配列を、図７に示す。
図６によれば、５種類すべての大腸ガン細胞株で、正常大腸組織よりも高いＰＳＭＡ７の発現が認められた。
【００５６】
（試験例６）各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量の比較
腫瘍とその隣接正常組織とから抽出したＲＮＡセット（FirstChoice Tumor/Normal Adjacent Tissue RNA: Ambion社）を用い、各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量を比較した。ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）により測定した。１８ｓ ｒＲＮＡの発現を内部標準として補正した。正常大腸組織試料１、２の平均値を１とした。結果を図８に示す。
図８によれば、大腸ガン組織およびその他のガン組織（乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、胃ガン、リンフォーマ、小腸ガン）において、ＰＳＭＡ７の発現の亢進が認められた。よって、ＰＳＭＡ７は、これらのガン種において、腫瘍のガン化、悪性化に関与すると考えられる。
【００５７】
（試験例７）動物モデルを用いたＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの大腸ガン皮下移植腫瘍に及ぼす影響
図９は、本試験の手順の概略を示す。
図９に示したように、４週齢のメスのヌードマウス後背部皮下にＨＴ−２９細胞（5x106 細胞／部位）を移植し、腫瘍径が約５−６ｍｍに達した７日後に、図４の配列＃２（配列表の配列番号１１、１２）のｓｉＲＮＡ（１ｎｍｏｌ／部位）を、アテロコラーゲン（最終濃度:０．５％）を導入担体として腫瘍内投与した。
【００５８】
（ｍＲＮＡの発現抑制）
ｓｉＲＮＡの投与２４時間後に腫瘍を採取し、ｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）。内部標準遺伝子には、ＧＡＰＤＨを用いた。コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞における発現量を１００％として表す。結果を図１０に示す。
図１０によれば、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比較し、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与群はＰＳＭＡ７のｍＲＮＡの発現が約３５％減少していることがわかった。大腸ガン皮下移植腫瘍組織においても、ｓｉＲＮＡの投与によりＰＳＭＡ７の発現が抑制されることが示された。
【００５９】
（アポトーシス誘導）
ｓｉＲＮＡの投与７２時間後に腫瘍を採取し、凍結組織切片を作製し、TUNEL染色（In Situ Cell Death Detection Kit: Roche社）した。結果を図１１に示す。なお、図１１において明確に示されていないが、核はＤＡＰＩ染色で青色に、TUNEL陽性細胞はフルオレセイン標識による緑色に染色される。
図１１によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡを投与したＨＴ−２９腫瘍では、多くのTUNEL陽性細胞が観察された。一方、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９腫瘍では、ほとんどTUNEL陽性細胞は認められなかった。よって、ＰＳＭＡ７の発現抑制により、大腸ガン皮下移植腫瘍組織においてもアポトーシスが誘導されることが確認された。
【００６０】
（試験例８）食道ガン細胞におけるＰＳＭＡ７遺伝子の発現試験
図１２は、ＰＳＭＡ７遺伝子について、食道ガンの患者から採取した４２サンプルにおいて行った発現試験の結果を示す。この発現試験は、食道ガン非ガン部および４２症例の食道ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。
図１２によれば、コントロールのβ−アクチン（Operon社、以下の試験例においてコントロールのβ−アクチンとして全て同じものを使用した）の発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、食道非ガン部からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン細胞からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＰＳＭＡ７遺伝子が発現していることがわかる。
【００６１】
（試験例９）食道ガン細胞におけるＲＡＥ１遺伝子の発現試験
図１３は、ＲＡＥ１遺伝子について、食道ガンの患者から採取した４２サンプルにおいて行った発現試験の結果を示す。この発現試験は、食道ガン非ガン部および４２症例の食道ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア社）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。
図１３によれば、コントロールのβ−アクチンの発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、食道非ガン部からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン細胞からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＲＡＥ１遺伝子が発現していることがわかる。
【００６２】
（試験例１０）ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡによる食道ガン細胞の増殖抑制試験
この増殖抑制試験は、TE3(食道扁平上皮ガン由来)細胞にDhamaFECT(Dharmacon社)を用いて、以下の各配列のsiRNAをトランスフェクションし、３日後に細胞数を血球計算盤を用いて計測することによって行った。コントロールsiRNA（QIAGEN社）導入時の細胞数を１００として、ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１siRNA導入時の細胞数を図１４に示した。以下の各配列中の小文字のt、c、gはそれぞれ保護配列としてのデオキシチミン、デオキシシトシン、デオキシグアニンを示す。
PSMA7のsiRNA（Ambion, siRNAID#11945）:
センス鎖 ：5'-GGAAGAGACAUUGUUGUUCtt -3'（配列表の配列番号２１）
アンチセンス鎖：5'-GAACAACAAUGUCUCUUCCtc-3'（配列表の配列番号２２）
RAE1のsiRNA（Ambion, siRNAID#139221）:
センス鎖 ：5'-GCUAGAGAAUCAACCUUCUtt-3'（配列表の配列番号２３）
アンチセンス鎖：5'-AGAAGGUUGAUUCUCUAGCtg-3'（配列表の配列番号２４）
コントロールのsiRNA(QIUAGEN, 1022076):
センス鎖 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3'（配列表の配列番号２５）
アンチセンス鎖：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3'（配列表の配列番号２６）
図１４によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡおよびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡを投与することにより、食道ガン細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
【００６３】
（試験例１１）胃ガン細胞におけるＮＥＤＤ１遺伝子の発現試験
図１５は、ＮＥＤＤ１遺伝子について、胃ガンの患者から採取したサンプルにおいて行った発現検査の結果を示す。この発現試験は、非ガン部胃粘膜の３層（pit, neck, gland）、８症例の分化型胃ガン部および１０症例の未分化型胃ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。非ガン部胃粘膜３層の鋳型cDNAの合成は、Fukaya M et al., Gastroenterology 2006; 131: 14-29に記載されている。
図１５によれば、コントロールのβ−アクチンの発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、非ガン部（Normal）からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン組織からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＮＥＤＤ１遺伝子が発現していることがわかる。
【００６４】
（試験例１２）ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる胃ガン細胞の増殖抑制試験
この増殖抑制試験は、HSC60(未分化胃ガン由来)細胞にDhamaFECT(Dharmacon社)を用いて、以下の配列のsiRNAをトランスフェクションし、2日間、細胞数を血球計算板を用いて計測することによって行った。コントロールsiRNAは前記試験例１０に記載したQIAGEN，１０２２０７６を用いた。
NEDD1のsiRNA（Ambion, siRNAID#122064）:
センス鎖 ：5'-CGAAGUGUUAAUGUGAAUGtt-3'（配列表の配列番号２７）
アンチセンス鎖：5'-CAUUCACAUUAACACUUCGtt-3'（配列表の配列番号２８）
図１６によれば、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを投与することにより、特に投与後二日目にて胃ガン細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
【００６５】
（試験例１３）ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸ガン肝転移抑制実験
ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）６週齢のオスに、2x106個のヒト大腸ガン細胞HT-29-P-VLを脾臓に注入した。ガン細胞の注入から５日後および１０日後のそれぞれにおいて計２回、ネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ（AllStars, Qiagen）またはＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（SIGMA）をＪｅｔＰＥＩ（6.4mL, Poly-plus transfection)と混合し、2.5mg/kg、200μL/mouseで尾静脈より投与した。ガンの転移の有無を、ガン細胞の注入から１５日後における、イメージング画像により評価した。
図１７に、得られた画像を模式的に示した図を示す。図１７において、左側にネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ投与マウスで得られた評価画像を示し、右側のＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与マウスで得られた評価画像を示す。
図１７によれば、ネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ投与マウスでは、肝臓にガン細胞由来のシグナルが検出されたのに対し、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与マウスではそのようなガン細胞由来のシグナルは検出されず、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの投与により肝臓への転移抑制効果が認められたことがわかる。
【００６６】
（試験例１４）マウス腹腔内ヒト移植腫瘍増殖に対するＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの抑制試験
４０万個のルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒト未分化胃ガン由来６０Ａｓ６細胞をC,B17/lcr-scidマウスの腹腔に投与後、１日目から１４日目までに、５０μｇのＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを０．５％アテロコラーゲン（株式会社高研）および１０μｌのDharmaFECT（Dharmacon社）を混合して得られた混合物を合計６回腹腔内に投与した６匹、およびｓｉＲＮＡを含まない混合物を投与した６匹のそれぞれのマウスを、ＩＶＩＳ（Xenogen社）によってイメージングし、腹腔内での６０Ａｓ６細胞の増殖を、ルシフェラーゼが発する光（光子）を計数（測定）することによって見積もった。
図１８に、このＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの腹腔内投与によるin vivo腹膜再発抑制の結果を経時的なガン細胞の増殖抑制の観点から説明するグラフを示す。
図１８によれば、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡをマウス腹腔内に投与することによって、６０Ａｓ６細胞の増殖が有意に抑えられていることがわかる。
【００６７】
（試験例１５）マウス腹腔内ヒト移植腫瘍増殖に対するＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの抑制試験
１０万個のヒト未分化胃ガン由来６０Ａｓ６細胞をC,B17/lcr-scidマウスの腹腔に投与後、１日目から２２日目までに、５０μｇのＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを０．５％アテロコラーゲン（株式会社高研）および１０μｌのDharmaFECT（Dharmacon社）を混合して得られた混合物を合計９回腹腔内に投与した８匹、およびｓｉＲＮＡを含まない混合物を投与した９匹のそれぞれのマウスの生存状態を約１００日間観察した。
図１９に、ｓｉＲＮＡを投与したグループと、投与しなかったグループとにおけるマウスの生存率の変化を説明するグラフを示す。
図１９によれば、ｓｉＲＮＡを投与したグループと、投与しなかったグループとで比較すると、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡをマウス腹腔内に投与することによって、有為に延命できたことがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途、すなわちガン細胞増殖抑制剤、このガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤、およびＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＳＭＡ７は巨大な酵素複合体であるプロテアソーム（proteasome）を構成する複数のタンパク質の１つである。プロテアソームは、非常に規則正しい環の形の２０Ｓコア構造をもち、そのコア構造は２８個の非同一サブユニットの４つの環で構成されており（２つの環は７個のαサブユニット、もう２つの環は７個のβサブユニットで構成される）、ＰＳＭＡ７はαサブユニットを構成する複数のタンパク質の１つである。プロテアソームは真核細胞中に高濃度で分布し、非リソソーム経路のＡＴＰ／ユビキチン依存過程でペプチドを切断する（非特許文献１）。２０Ｓコアのαサブユニットは、ウイルスの複製に重要なタンパク質であるＢ型肝炎ウイルスＸタンパク質と特異的に相互作用することが示されている。また、このαサブユニットは、酸素分圧への細胞応答に重要な転写因子である、ＨＩＦ−１αの調節にも関与している。
【０００３】
ＮＥＤＤ１はマウスの中枢神経系において個体の発生に係わる遺伝子として同定された。多くの生物種でＮＥＤＤ１は存在し、動物種間の相同性が高いことが知られている。ヒトにおいてはＮＥＤＤ１が細胞の中心体（centrosome）や紡錘体（mitotic spindle）に存在することが最近明らかになり、中心体（centrosome）や紡錘体（mitotic spindle）におけるγ−チューブリン環状複合体（gamma-tubulin ring complex）を形成する因子の１つではないかと推測されている。実際、ＮＥＤＤ１の消去により微小管の核形成（microtubule nucleation）や紡錘体の集合（spindle assembly）過程に異常が生じること、また、細胞分裂中のＮＥＤＤ１のリン酸化がγ−チューブリンとの結合を介した紡錘体形成（targeting gamma-tubulin to the spindle）に重要であることなどが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＲＡＥ１（RNA export 1 homolog）は、核質、nuclear rim、および細胞質を貫通する網様構造に、それぞれ集中して（distinct foci in the nucleoplasm, to the nuclear rim, and to meshwork-like structures throughout the cytoplasm）存在しており、ＲＮＡの輸送に係わっていることが示唆されている。さらに、ＲＡＥ１ノックアウトマウスについては、体節形成前に胚性致死となること、細胞周期チェックポイントの異常が生じることが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Elenich LAら, Immunogenetics Volume:49 Issue: 10 Date: 1999 Sep ,Pages: 835-42
【非特許文献２】Manning J.ら, Int J Biochem Cell Biol. 2007 39:7-11.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子のそれぞれとヒトを含むほ乳類の病気との関係は知られていない。
【０００７】
そこで、本発明者等は、ガン細胞において高発現している遺伝子の発現抑制が、ガン細胞の増殖に及ぼす影響を調べたところ、特定の遺伝子の発現抑制を行うことで、ガン細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２１）を提供する。
（１）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤。
（２）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（３）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（４）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（３）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（５）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（４）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（６）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（５）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（７）ガンが大腸ガン又は食道ガンである（２）〜（６）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（８）ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（９）ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（８）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１０）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（９）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１１）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（１０）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（１２）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（１１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１３）ガンが胃ガンである（８）〜（１２）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１４）ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１５）ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（１４）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１６）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（１５）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１７）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（１６）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（１８）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（１７）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１９）ガンが食道ガンである（１４）〜（１８）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（２０）（１）から（１９）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。
（２１）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の新規用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】大腸ガン組織で高発現している９７遺伝子に対するsiRNAを大腸ガン細胞に導入した際の細胞のアポトーシス誘導量を示すグラフである。
【図２】ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたアポトーシス誘導試験の結果を示す図である。
【図３】ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン効率試験の結果を示すグラフである。
【図４】ＰＳＭＡ７に対するｓｉＲＮＡのノックダウン効率試験に用いた塩基配列を示す図である。
【図５】ＰＳＭＡ７に対するｓｉＲＮＡのノックダウン効率試験の結果を示すグラフである。
【図６】様々な大腸ガン細胞株におけるＰＳＭＡ７の発現試験の結果を示すグラフである。
【図７】図５にて行った試験に用いるＲＴ−ＰＣＲ試験に用いる内部標準のプライマー配列およびＰＳＭＡ７のプライマー配列を示す図である。
【図８】各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量の結果を示すグラフである。
【図９】動物モデルを用いたＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの大腸ガン皮下移植腫瘍に及ぼす影響試験の手順を示す図である。
【図１０】ヌードマウスにおける大腸ガン皮下移植腫瘍でのｍＲＮＡ発現抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１１】ヌードマウスにおける大腸ガン皮下移植腫瘍でのアポトーシス誘導試験の結果を示す図である。
【図１２】食道ガン細胞におけるＰＳＭＡ７遺伝子の発現試験の結果を示す図である。
【図１３】食道ガン細胞におけるＲＡＥ１遺伝子の発現試験の結果を示す図である。
【図１４】ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡによる食道ガン細胞の増殖抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１５】胃ガン細胞におけるＮＥＤＤ１遺伝子の発現試験の結果を示す図である。
【図１６】ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる胃ガン細胞の増殖抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１７】ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸ガン肝転移抑制実験の観察結果を模式的に示す図である。
【図１８】ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの腹腔内投与によるｉｎ ｖｉｖｏ腹膜再発抑制の結果を説明するグラフである。
【図１９】ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる腹膜再発モデルマウスの延命効果を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
「ストリンジェントな条件」としては、例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃」、「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」、「０．５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」等の条件が挙げられる。
【００１２】
塩基配列について「相同性」とは、比較される配列間において、各々の下位列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。このときギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ（Peasron, Methods in Enzymology 183:63-69 (1990)）等を用いることができる。相同性の数値は、例えば全米バイオテクノロジー（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ (Basic local alignment search tool、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において算出することができる。本発明における相同性を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には配列番号１（または３または５）で示される塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１３】
「ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）遺伝子の発現を抑制する」とは、ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上低下させることを意味する。特定遺伝子の発現を抑制するメカニズムは、詳細には一つには特定されないが、例えば転写開始抑制、mRNAの伸長抑制、mRNAの分解、翻訳抑制などが挙げられる。
【００１４】
「ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）遺伝子の発現を抑制する物質」とは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、非ペプチド性化合物、合成化合物などが挙げられる。より好ましくはポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００１５】
本発明における「二本鎖ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉を起こしてｍＲＮＡを分解することにより、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１又はＲＡＥ１遺伝子の発現を抑制するものである。ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１又はＲＡＥ１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡは、それぞれの遺伝子に対して完全に相補的である必要はなく、それぞれの発現を効果的に抑制できるものであればよい。「効果的に抑制」とは、未処置またはコントロール配列の二本鎖ＲＮＡを加えた細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現量に対して、それぞれの遺伝に対する二本鎖ＲＮＡを加えた細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現量が、少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、抑制されるものをいう。また、「効果的に抑制」されるかぎり、ＲＮＡ鎖の一部が修飾されていてもよい。
また、本発明における「干渉配列」とは、標的ＲＮＡと実際に結合して当該標的ＲＮＡの機能を抑制する機能を有する配列をいう。干渉配列およびその相補的な配列は、その両端または一端に干渉配列を保護するための保護配列を有していてもよい。保護配列としては、たとえばdTdT,dUdU等があげられる。
【００１６】
このような二本鎖ＲＮＡは、化学的に合成することができ、例えばＤＮＡ化学合成でも使用されるホスホアミダイト法により、３'末端から５'末端に向かって一塩基ずつ順番に縮合反応させることにより得られる。ただし、合成過程でＲＮａｓｅによる分解を防ぐために、個々のリボヌクレオチドの２'末端の水酸基を保護して行う。この保護基としては、2'-O-t-butyldimethylsilyl（2'-tBDMS）基、2'-O-triisopropylsilyloxymethyl（2'-TOM）基、5'-silyl-2'-acetoxyethoxy（2'-ACE）基などが挙げられる。
【００１７】
また、遺伝子の発現抑制は、二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡ干渉により生じることが考えられる。ここで、ＲＮＡ干渉とは、低分子のnon-coding二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子により配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいい、例えばｓｉ（small interfering）ＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断、ｓｉＲＮＡによる標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシング、ｍｉ（micro）ＲＮＡによる翻訳抑制、転写抑制、ｍＲＮＡの分解等を指す。
【００１８】
従来より、ｍＲＮＡに作用し、遺伝子発現を抑制する方法として、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖を結合させ、タンパク質への翻訳を阻害するアンチセンス法が知られているが、人工アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの高次構造の影響により標的部位に有効に結合できない場合があるため活性が弱いという問題点があった。
【００１９】
一方、二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉の場合には、ｍＲＮＡの高次構造に無関係に作用することで、ｍＲＮＡの局所的な構造に依存して活性が弱くなるという問題が低減される。
【００２０】
（ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤）
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤は、ＰＳＭＡ７遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＰＳＭＡ７の生成を抑制する。
このようなＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００２１】
ここで、「ＰＳＭＡ７」とは、配列番号２（GenBankアクセッション番号：NP_002783.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２２】
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＰＳＭＡ７と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号２の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００２３】
また、ＰＳＭＡ７には配列番号１（GenBankアクセッション番号：NM_002792.2）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号１で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００２４】
ＰＳＭＡ７に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。
【００２５】
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【００２６】
（ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤）
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤は、ＮＥＤＤ１遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＮＥＤＤ１の生成を抑制する。
このようなＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００２７】
ここで、ＮＥＤＤ１とは、配列番号４（GenBankアクセッション番号：NP_690869.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２８】
「配列番号４で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＮＥＤＤ１と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号４の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００２９】
また、ＮＥＤＤ１には配列番号３（GenBankアクセッション番号：NM_152905.2）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号３で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号３で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００３０】
ＮＥＤＤ１に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。
【００３１】
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【００３２】
（ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤）
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤は、ＲＡＥ１遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＲＡＥ１の生成を抑制する。
このようなＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
【００３３】
ここで、ＲＡＥ１とは、配列番号６（GenBankアクセッション番号：NP_001015885.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３４】
「配列番号６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＥ１と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号６の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００３５】
また、ＲＡＥ１には配列番号５（GenBankアクセッション番号：NM_001015885.1）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号５で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号５で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００３６】
ＲＡＥ１に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。
【００３７】
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【００３８】
（ガン細胞増殖抑制剤）
本発明のガン細胞増殖抑制剤は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むものである。なお、ガン細胞増殖抑制により、ガン細胞数の減少、他の臓器へのガンの転移の防止などの効果が期待される。
【００３９】
ここでいうガンとは、大腸ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、小腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、舌ガン、脳腫瘍、喉頭ガン、卵巣ガン、急性白血病、慢性白血病、リンパ腫等が含まれる。ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは大腸ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、小腸ガンに作用するものであり、より好ましくは大腸ガン、食道ガンに作用するものであり、さらに好ましくは大腸ガンに作用するものである。ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは胃ガンに作用するものである。ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは食道ガンに作用するものである。
【００４０】
（遺伝子発現抑制剤の用途）
別の観点から、本発明は、前述したＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途を提供する。
例えば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤は、必要に応じてアテロコラーゲンとともに、ガン患者に投与され、ガン化された細胞のアポトーシスを促進させる抗ガン剤として用いることができる。なお、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の細胞への作用はアポトーシスの促進に限られるものではなく、最終的に細胞死を誘発したり、細胞増殖を抑制することができれば、ガン細胞増殖抑制剤として有用である。ここで、アテロコラーゲンとは、酵素可溶化コラーゲンおよびその修飾物のことをいい、例えばＷＯ０１／０９７８５７に記載されている。
【００４１】
すなわち、本発明は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法を提供する。また、さらなる観点から、本発明は、前述したガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤を提供する。
【００４２】
このような用途において、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の使用量は、投与方法、腫瘍の種類、大きさによって異なるが、例えばＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤については局所投与では１ｎｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。また、アテロコラーゲンと併用する場合には、このアテロコラーゲンの濃度は例えば局所投与では０．１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上３０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下、全身投与では１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上５０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下が望ましく、その使用量はＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤との混合後、局所投与で５ｍｌ以上１００ｍｌ以下、全身投与で１０ｍｌ以上５００ｍｌ以下が望ましい。
【００４３】
このような用途によれば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を、ガン化細胞のアポトーシスを促進させる等の機序で細胞死を誘発させ、又は細胞増殖を抑制させることにより、結果としてガンの治療を行うことが可能になる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を試験例に基づいて説明するが、本発明はこれら試験例に限定されることはない。
（試験例１）大腸ガン細胞の増殖抑制試験
大腸ガン組織で高発現している９７遺伝子（以下の表）に対するｓｉＲＮＡを大腸ガン細胞に導入し、各遺伝子の発現抑制が細胞のアポトーシス誘導に及ぼす影響を調べた。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
（１）アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイの作製
以下のようにして、ｓｉＲＮＡおよびアテロコラーゲンの混合物を、９６穴マイクロプレートにコーティングし、ｓｉＲＮＡをリバーストランスフェクションできるアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。
すなわち、アテロコラーゲン（ＰＢＳ中で１６０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）とｓｉＲＮＡ希釈液（ＰＢＳ中で０．４ｍＭ）を１：１の割合で混合、４℃で２０分間、転倒混和し、ｓｉＲＮＡとアテロコラーゲンのコンプレックスを調製した。アテロコラーゲンの最終濃度は８０ｍｇ／ｍｌ、ｓｉＲＮＡの最終濃度は０．２ｍＭとなる。ｓｉＲＮＡ／アテロコラーゲン−コンプレックス５０ｍｌを９６穴プレートの各ウェルに添加、ウェル底面をコーティングして、ｓｉＲＮＡ／アテロコラーゲン−コンプレックスをアレイ化し（ｓｉＲＮＡ １０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）、アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。そこに培養細胞を播種し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
【００４８】
（２）増殖細胞数の測定
作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイに、ＨＴ−２９大腸ガン細胞(The American Type Culture Collection (以下「ATCC」という)より入手)を５×１０3細胞／ｗｅｌｌ播種し、３日間培養した。増殖した細胞数を、プロメガ社推奨のCellTiter-Blue Reagentのプロトコールにしたがって測定した。すなわち、CellTiter-Blue Reagent（プロメガ社製）をＰＢＳ（−）で４倍に希釈し、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で１時間インキュベート後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製）で蛍光値（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）を測定した。
【００４９】
（３）機能的スクリーニング試験
細胞増殖測定後、プロメガ社推奨のCaspase-Glo 3/7 ReagentのプロトコールにしたがってCaspase-3/7活性測定試薬（プロメガ社製）を添加して、室温で６０分間インキュベート後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製）で発光値を測定し、Caspase活性を測定した。
【００５０】
Caspase-3/7活性値を細胞増殖値で除し、コントロールｓｉＲＮＡとして下記の配列（siCONTROL Non-targeting siRNA #1：Dharmacon社、以下の試験例において特筆しない限り、コントロールｓｉＲＮＡとして全て同じものを使用した）を用い、コントロールｓｉＲＮＡの値を１００％としたときの細胞あたりのCaspase-3/7活性の上昇を解析した。
センス鎖 ：5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3'（配列表の配列番号７）
アンチセンス鎖：5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3'（配列表の配列番号８）
上記の各遺伝子のノックダウンによりアポトーシス誘導を指標とした機能的スクリーニング試験（functional screening）の結果、特にＰＳＭＡ７のノックダウンにより、ＨＴ−２９大腸ガン細胞において、他の遺伝子のノックダウンと比較して、アポトーシスが著しく誘導されることが明らかになった（図１）。このことは、ＰＳＭＡ７が大腸ガンにおけるアポトース抑制因子である可能性を示唆している。
【００５１】
（試験例２）ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたアポトーシス誘導試験
試験例１にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを用い、ＨＴ−２９細胞にＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（図４に示した配列＃１〜＃４（それぞれ配列表の配列番号９〜１６）のｓｉＲＮＡの混合物；SMARTpool、Dharmacon社）またはコントロールｓｉＲＮＡを導入し、３日間培養後、ヘキスト染色を行い、細胞核の凝縮や断片化にみられる核形態の変化を観察して、各ｓｉＲＮＡを導入した系におけるアポトーシス誘導を調べた。試験結果を図２に示す。
なお、ヘキスト染色を行った観察とは、細胞をＰＢＳ（−）（phosphate buffered saline (-)；(-)はCaイオン及びMgイオンが成分として入っていないことを示す）で洗浄後、４％ＰＦＡ(paraformaldehyde)、０．１％Triton X-100（シグマ社）、１ｍｇ／ｍｌ Hoechst 33342（ＰＢＳ（−）中）を添加し、室温で２０分間固定し、染色した後に、ＰＢＳ（−）で洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察することをいう。
【００５２】
図２によれば、ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９細胞では、図中の矢印に示したように、多くのアポトーシス細胞が確認された。一方、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９細胞では、ほとんどアポトーシス細胞は認められなかった。
Caspase-3/7の活性化と同様に、ヘキスト染色による観察結果は、ＰＳＭＡ７のノックダウンにより、ＨＴ−２９細胞においてアポトーシスが誘導されることを示し、ＰＳＭＡ７が、大腸ガンにおいてアポトーシス抑制的に働くことを裏付けている。
【００５３】
（試験例３）ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン効率
試験例１にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを用い、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（図４に示した配列＃１〜＃４（それぞれ配列表の配列番号９〜１６）のｓｉＲＮＡの混合物；SMARTpool、Dharmacon社）またはコントロールｓｉＲＮＡを導入したときにおけるｍＲＮＡのノックダウン効率を調べた。ｍＲＮＡの発現量は、FastLane Cell cDNA Kit （キアゲン社）およびQuantiTect SYBR Green PCR Kit （キアゲン社）のプロトコールにしたがい、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）を使用し測定した。内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。結果を図３に示す。
図３によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡをＨＴ−２９細胞に導入したとき、コントロールｓｉＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡの８０％が発現抑制されていたことがわかった。
【００５４】
（試験例４）ＰＳＭＡ７に対する４配列のｓｉＲＮＡのノックダウン効率
ＨＴ−２９細胞にLipofectAmine 2000（Invitrogen社）を用いて、図４に示した各配列のｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、３日後にトータルＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ発現量をSYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II（TaKaRa社）のプロトコールにしたがい、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）で測定した。内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞における発現量を１００％として表す。結果を図５に示す。
図５によれば、４種のＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡうち、図４の配列＃２（配列表の配列番号１１，１２）の配列がノックダウン効率約７０％を示し、その他の３種のｓｉＲＮＡと比較して、最も高い発現抑制を示すことがわかる。以後、配列＃２のｓｉＲＮＡを大腸ガン皮下腫瘍モデル（ヌードマウス）での実験に用いた。
【００５５】
（試験例５）大腸ガン細胞株におけるＰＳＭＡ７の発現
大腸ガン細胞株５種（CaCo2：ヒト結腸腺ガン、HCT116：ヒト結腸腺ガン、HT-29：ヒト結腸腺ガン、LoVo：ヒト結腸腺ガン（鎖骨リンパ節転移巣）、T84：ヒト結腸ガン：肺転移巣；全てATCCより入手）と、正常大腸組織におけるＰＳＭＡ７の発現量を比較した。
ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）により測定した。ＰＳＭＡ７遺伝子のプライマー（配列表の配列番号１７、１８）を用いるとともに、１８ｓ ｒＲＮＡ（配列表の配列番号１９、２０）の発現を内部標準として補正した。正常大腸組織試料１、２の平均値を１とした。結果を図６に示す。配列表の配列番号１７〜２０の配列を、図７に示す。
図６によれば、５種類すべての大腸ガン細胞株で、正常大腸組織よりも高いＰＳＭＡ７の発現が認められた。
【００５６】
（試験例６）各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量の比較
腫瘍とその隣接正常組織とから抽出したＲＮＡセット（FirstChoice Tumor/Normal Adjacent Tissue RNA: Ambion社）を用い、各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量を比較した。ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）により測定した。１８ｓ ｒＲＮＡの発現を内部標準として補正した。正常大腸組織試料１、２の平均値を１とした。結果を図８に示す。
図８によれば、大腸ガン組織およびその他のガン組織（乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、胃ガン、リンフォーマ、小腸ガン）において、ＰＳＭＡ７の発現の亢進が認められた。よって、ＰＳＭＡ７は、これらのガン種において、腫瘍のガン化、悪性化に関与すると考えられる。
【００５７】
（試験例７）動物モデルを用いたＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの大腸ガン皮下移植腫瘍に及ぼす影響
図９は、本試験の手順の概略を示す。
図９に示したように、４週齢のメスのヌードマウス後背部皮下にＨＴ−２９細胞（5x106 細胞／部位）を移植し、腫瘍径が約５−６ｍｍに達した７日後に、図４の配列＃２（配列表の配列番号１１、１２）のｓｉＲＮＡ（１ｎｍｏｌ／部位）を、アテロコラーゲン（最終濃度:０．５％）を導入担体として腫瘍内投与した。
【００５８】
（ｍＲＮＡの発現抑制）
ｓｉＲＮＡの投与２４時間後に腫瘍を採取し、ｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）。内部標準遺伝子には、ＧＡＰＤＨを用いた。コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞における発現量を１００％として表す。結果を図１０に示す。
図１０によれば、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比較し、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与群はＰＳＭＡ７のｍＲＮＡの発現が約３５％減少していることがわかった。大腸ガン皮下移植腫瘍組織においても、ｓｉＲＮＡの投与によりＰＳＭＡ７の発現が抑制されることが示された。
【００５９】
（アポトーシス誘導）
ｓｉＲＮＡの投与７２時間後に腫瘍を採取し、凍結組織切片を作製し、TUNEL染色（In Situ Cell Death Detection Kit: Roche社）した。結果を図１１に示す。なお、図１１において明確に示されていないが、核はＤＡＰＩ染色で青色に、TUNEL陽性細胞はフルオレセイン標識による緑色に染色される。
図１１によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡを投与したＨＴ−２９腫瘍では、多くのTUNEL陽性細胞が観察された。一方、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９腫瘍では、ほとんどTUNEL陽性細胞は認められなかった。よって、ＰＳＭＡ７の発現抑制により、大腸ガン皮下移植腫瘍組織においてもアポトーシスが誘導されることが確認された。
【００６０】
（試験例８）食道ガン細胞におけるＰＳＭＡ７遺伝子の発現試験
図１２は、ＰＳＭＡ７遺伝子について、食道ガンの患者から採取した４２サンプルにおいて行った発現試験の結果を示す。この発現試験は、食道ガン非ガン部および４２症例の食道ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。
図１２によれば、コントロールのβ−アクチン（Operon社、以下の試験例においてコントロールのβ−アクチンとして全て同じものを使用した）の発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、食道非ガン部からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン細胞からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＰＳＭＡ７遺伝子が発現していることがわかる。
【００６１】
（試験例９）食道ガン細胞におけるＲＡＥ１遺伝子の発現試験
図１３は、ＲＡＥ１遺伝子について、食道ガンの患者から採取した４２サンプルにおいて行った発現試験の結果を示す。この発現試験は、食道ガン非ガン部および４２症例の食道ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア社）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。
図１３によれば、コントロールのβ−アクチンの発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、食道非ガン部からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン細胞からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＲＡＥ１遺伝子が発現していることがわかる。
【００６２】
（試験例１０）ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡによる食道ガン細胞の増殖抑制試験
この増殖抑制試験は、TE3(食道扁平上皮ガン由来)細胞にDhamaFECT(Dharmacon社)を用いて、以下の各配列のsiRNAをトランスフェクションし、３日後に細胞数を血球計算盤を用いて計測することによって行った。コントロールsiRNA（QIAGEN社）導入時の細胞数を１００として、ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１siRNA導入時の細胞数を図１４に示した。以下の各配列中の小文字のt、c、gはそれぞれ保護配列としてのデオキシチミン、デオキシシトシン、デオキシグアニンを示す。
PSMA7のsiRNA（Ambion, siRNAID#11945）:
センス鎖 ：5'-GGAAGAGACAUUGUUGUUCtt -3'（配列表の配列番号２１）
アンチセンス鎖：5'-GAACAACAAUGUCUCUUCCtc-3'（配列表の配列番号２２）
RAE1のsiRNA（Ambion, siRNAID#139221）:
センス鎖 ：5'-GCUAGAGAAUCAACCUUCUtt-3'（配列表の配列番号２３）
アンチセンス鎖：5'-AGAAGGUUGAUUCUCUAGCtg-3'（配列表の配列番号２４）
コントロールのsiRNA(QIUAGEN, 1022076):
センス鎖 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3'（配列表の配列番号２５）
アンチセンス鎖：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3'（配列表の配列番号２６）
図１４によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡおよびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡを投与することにより、食道ガン細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
【００６３】
（試験例１１）胃ガン細胞におけるＮＥＤＤ１遺伝子の発現試験
図１５は、ＮＥＤＤ１遺伝子について、胃ガンの患者から採取したサンプルにおいて行った発現検査の結果を示す。この発現試験は、非ガン部胃粘膜の３層（pit, neck, gland）、８症例の分化型胃ガン部および１０症例の未分化型胃ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。非ガン部胃粘膜３層の鋳型cDNAの合成は、Fukaya M et al., Gastroenterology 2006; 131: 14-29に記載されている。
図１５によれば、コントロールのβ−アクチンの発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、非ガン部（Normal）からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン組織からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＮＥＤＤ１遺伝子が発現していることがわかる。
【００６４】
（試験例１２）ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる胃ガン細胞の増殖抑制試験
この増殖抑制試験は、HSC60(未分化胃ガン由来)細胞にDhamaFECT(Dharmacon社)を用いて、以下の配列のsiRNAをトランスフェクションし、2日間、細胞数を血球計算板を用いて計測することによって行った。コントロールsiRNAは前記試験例１０に記載したQIAGEN，１０２２０７６を用いた。
NEDD1のsiRNA（Ambion, siRNAID#122064）:
センス鎖 ：5'-CGAAGUGUUAAUGUGAAUGtt-3'（配列表の配列番号２７）
アンチセンス鎖：5'-CAUUCACAUUAACACUUCGtt-3'（配列表の配列番号２８）
図１６によれば、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを投与することにより、特に投与後二日目にて胃ガン細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
【００６５】
（試験例１３）ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸ガン肝転移抑制実験
ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）６週齢のオスに、2x106個のヒト大腸ガン細胞HT-29-P-VLを脾臓に注入した。ガン細胞の注入から５日後および１０日後のそれぞれにおいて計２回、ネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ（AllStars, Qiagen）またはＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（SIGMA）をＪｅｔＰＥＩ（6.4mL, Poly-plus transfection)と混合し、2.5mg/kg、200μL/mouseで尾静脈より投与した。ガンの転移の有無を、ガン細胞の注入から１５日後における、イメージング画像により評価した。
図１７に、得られた画像を模式的に示した図を示す。図１７において、左側にネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ投与マウスで得られた評価画像を示し、右側のＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与マウスで得られた評価画像を示す。
図１７によれば、ネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ投与マウスでは、肝臓にガン細胞由来のシグナルが検出されたのに対し、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与マウスではそのようなガン細胞由来のシグナルは検出されず、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの投与により肝臓への転移抑制効果が認められたことがわかる。
【００６６】
（試験例１４）マウス腹腔内ヒト移植腫瘍増殖に対するＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの抑制試験
４０万個のルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒト未分化胃ガン由来６０Ａｓ６細胞をC,B17/lcr-scidマウスの腹腔に投与後、１日目から１４日目までに、５０μｇのＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを０．５％アテロコラーゲン（株式会社高研）および１０μｌのDharmaFECT（Dharmacon社）を混合して得られた混合物を合計６回腹腔内に投与した６匹、およびｓｉＲＮＡを含まない混合物を投与した６匹のそれぞれのマウスを、ＩＶＩＳ（Xenogen社）によってイメージングし、腹腔内での６０Ａｓ６細胞の増殖を、ルシフェラーゼが発する光（光子）を計数（測定）することによって見積もった。
図１８に、このＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの腹腔内投与によるin vivo腹膜再発抑制の結果を経時的なガン細胞の増殖抑制の観点から説明するグラフを示す。
図１８によれば、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡをマウス腹腔内に投与することによって、６０Ａｓ６細胞の増殖が有意に抑えられていることがわかる。
【００６７】
（試験例１５）マウス腹腔内ヒト移植腫瘍増殖に対するＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの抑制試験
１０万個のヒト未分化胃ガン由来６０Ａｓ６細胞をC,B17/lcr-scidマウスの腹腔に投与後、１日目から２２日目までに、５０μｇのＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを０．５％アテロコラーゲン（株式会社高研）および１０μｌのDharmaFECT（Dharmacon社）を混合して得られた混合物を合計９回腹腔内に投与した８匹、およびｓｉＲＮＡを含まない混合物を投与した９匹のそれぞれのマウスの生存状態を約１００日間観察した。
図１９に、ｓｉＲＮＡを投与したグループと、投与しなかったグループとにおけるマウスの生存率の変化を説明するグラフを示す。
図１９によれば、ｓｉＲＮＡを投与したグループと、投与しなかったグループとで比較すると、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡをマウス腹腔内に投与することによって、有為に延命できたことがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する請求項１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである請求項２に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである請求項３に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、請求項４に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【請求項６】
二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである請求項５に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
ガンが大腸ガン又は食道ガンである請求項２〜６のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する請求項１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである請求項８に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである請求項９に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、請求項１０に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【請求項１２】
二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである請求項１１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
ガンが胃ガンである請求項８〜１２のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する請求項１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１５】
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである請求項１４に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである請求項１５に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１７】
二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、請求項１６に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【請求項１８】
二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである請求項１７に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１９】
ガンが食道ガンである請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。
【請求項２１】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
【請求項１】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する請求項１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである請求項２に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである請求項３に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、請求項４に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【請求項６】
二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである請求項５に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
ガンが大腸ガン又は食道ガンである請求項２〜６のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する請求項１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである請求項８に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである請求項９に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、請求項１０に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【請求項１２】
二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである請求項１１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
ガンが胃ガンである請求項８〜１２のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する請求項１に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１５】
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである請求項１４に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである請求項１５に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１７】
二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、請求項１６に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
【請求項１８】
二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである請求項１７に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項１９】
ガンが食道ガンである請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。
【請求項２１】
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１７】
【公開番号】特開２０１０−１６８３６８（Ｐ２０１０−１６８３６８Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９２５２５（Ｐ２００９−２９２５２５）
【出願日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年８月３１日 日本癌学会発行の「第６８回日本癌学会学術総会」に発表
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年８月３１日 日本癌学会発行の「第６８回日本癌学会学術総会」に発表
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
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