ＰＴＥＮ阻害剤またはＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー
【課題】新規なＰＴＥＮ阻害剤または大きな伝導性のＣａ２＋で活性化されるＫ＋チャンネル（Ｍａｘｉ−Ｋチャンネル）の新規なオープナーであり、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、及び皮膚の生存を促進し、更にＰＴＥＮの阻害によるグラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害する薬物として有用であり、更に神経系障害の治療に有用な治療剤の提供。
【解決手段】式（Ｉ）：
［式中、Ｒはシクロアルキルであり、Ａは低級アルキレンであり、及びカルボスチリル環の３および４位の間の結合は単結合または二重結合である］のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、及び該化合物を活性成分として含む治療剤。
【解決手段】式（Ｉ）：
［式中、Ｒはシクロアルキルであり、Ａは低級アルキレンであり、及びカルボスチリル環の３および４位の間の結合は単結合または二重結合である］のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、及び該化合物を活性成分として含む治療剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は新規なＰＴＥＮ阻害剤または新規なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー（開口剤）に関する。より具体的には式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、Ａは低級アルキレン基であり、およびカルボスチリル環の３および４位の結合は単結合または二重結合を意味する］
のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩を活性成分として含むＰＴＥＮ阻害剤または新規なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーに関する。
【０００２】
（背景技術）
ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよび染色体Ｔｅｎで欠失されるテンシン類似体：Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten）は、１９９７年に癌抑制遺伝子として単離され、以来その生理的機能は様々な観点から分析されてきている。ＰＴＥＮ遺伝子生成物が新たなホスファターゼ活性を示すこと、すなわち脂質二次メッセンジャーであるフォスファチジルイノシトール ３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）基質をそのＤ３位で脱リン酸化できることが、１９９８年に報告されている（参照：Beitner-Johnson D, Millhorn DE, J. Biol. Chem., 273: pp. 13375-13378, 1998）。
【０００３】
ＰＴＥＮの機能の観点から、ＰＴＥＮの阻害が、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、および皮膚の生存を促進するのに効果的である場合、更にグラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害するのに効果的であることが期待される。
【０００４】
また、カリウムチャンネルの開口が細胞内陰性電位を生じた細胞からの細胞内カリウムイオンの流出を誘発することは知られており、そして該カリウムチャンネルが電位依存性であり、細胞内カルシウム濃度および細胞内ＡＴＰで制御されることも知られている。Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルはある種の大きな伝導性のカルシウム感受性カリウムチャンネルであり、該Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの活性は細胞内カルシウム濃度および膜電位などによって制御される。Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルは神経細胞、心臓細胞、平滑筋細胞のような生体内に広く分布しており、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口は細胞の過分極を誘発する。該Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口は神経系障害の治療に、例えば以下のような薬物として有用であることも知られている。
（１）抗痙攣剤
（２）局所脳浮腫および神経性運動障害、認知障害、外傷性脳傷害、パーキンソン病、てんかん、片頭痛、およびアルツハイマー病の治療用神経保護剤
（３）痛みを制御するための薬物
（４）切迫性尿失禁、腸管の過剰運動、子宮収縮、不安症、およびうつ病の治療剤。
【０００５】
（発明の開示）
ＰＴＥＮの研究の中で、本発明者は上記で述べたような式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、特に血小板凝集阻害活性および血管拡張活性を有することが知られている６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルまたはその塩がＰＴＥＮを阻害する活性を示し、これによってＰＴＥＮ阻害剤として有用であることを見出し、次いで本発明を完成するに至った。
【０００６】
更に、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの機能解析の研究の中で、本発明者は、上記で述べたような式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、特に６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩が血小板凝集阻害活性および血管拡張活性を有することは知られていたが、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口活性を示すことを新たに見出し、次いで本発明を完成するに至った。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、活性成分として式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシカルボスチリル化合物またはその塩を含む新規なＰＴＥＮ阻害剤または新規なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーを提供する。本発明は更に、テトラゾリルアルコキシカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩をかかる治療が必要な患者に投与することからなる、ＰＴＥＮを阻害する方法およびＭａｘｉ−Ｋチャンネルを開口する方法を提供し、更に、ＰＴＥＮの阻害のための、並びにＭａｘｉ−Ｋチャンネルの開口のための、テトラゾリルアルコキシカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の使用を提供する。
【０００８】
式（Ｉ）の化合物またはその塩は優れたＰＴＥＮ阻害効果を有し、これにより活性成分として式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む本発明のＰＴＥＮ阻害剤は、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、および皮膚の生存を促進し、更にＰＴＥＮの阻害による副作用も全くなく、グラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害する薬物として有用である。
【０００９】
更に、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、大きな伝導性を持つカルシウムで活性化されるＫ＋チャンネル（Ｍａｘｉ−Ｋチャンネル）の開口に優れた効果を有し、これにより活性成分として式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む本発明のＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーは、神経系障害の治療剤、例えば、抗痙攣剤、神経保護剤、局所脳浮腫および神経性運動障害、認知障害、外傷性脳傷害、パーキンソン病、てんかん、片頭痛、およびアルツハイマー病、痛み、切迫性尿失禁、腸管の過剰運動、子宮収縮、不安症、およびうつ病の治療剤として有用である。
【００１０】
式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物およびその製造方法はJP-63-20235に開示されている。
【００１１】
式（Ｉ）において、「シクロアルキル基」には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどのようなＣ３−８シクロアルキル基が含まれ、好ましくはシクロヘキシルである。「低級アルキレン基」には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなどのようなＣ１−６アルキレン基が含まれ、好ましくはブチレンである。
【００１２】
特に好ましい化合物は、６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルであり、シロスタゾールの商品名の下、血管拡張剤として販売されている。
【００１３】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、バルクで、または好ましくは通常の医薬担体もしくは希釈剤で医薬製剤の形態で用いられ得る。投与形態は特定の形態に制限されないが、いずれの通常の投与形態、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤のような経口投与の製剤、経口投与に適した様々な液体製剤、または注射剤、坐剤のような非経口投与用製剤であってもよい。用量は特定の範囲に制限されないが、通常、成人（体重５０ｋｇ）で１００〜４００ ｍｇ／日の範囲にあり、１回または１〜数回に分けて投与される。活性化合物は好ましくは、投与単位あたり５０〜１００ ｍｇの量で製剤中含まれる。
【００１４】
注射用製剤は通常、液剤、乳濁液、または懸濁液の形態で調製され、無菌化し、更に好ましくは血液に対して等張にされる。液体、乳濁液または懸濁液の形態の製剤は一般的に、通常の医薬希釈剤、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを用いて調製される。これらの製剤には、塩化ナトリウム、ブドウ糖、グリセリンのような等張剤と、等張にするのに十分な量で混合してもよく、更に通常の可溶化剤、緩衝剤、麻酔剤、および適宜、着色剤、保存剤、芳香物質、香料、甘味料、および他の薬剤で混合してもよい。
【００１５】
錠剤、カプセル剤、経口投与用液剤のような製剤は、通常の方法で調製され得る。錠剤は、ゼラチン、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガムなどのような通常の医薬担体と混合して調製され得る。カプセル剤は、不活性な医薬充填剤または希釈剤と共に混合して調製し、硬ゼラチンカプセルまたは軟カプセルに詰められ得る。シロップ剤またはエリキシル剤のような経口液体製剤は、活性化合物と、甘味料（例えば、ショ糖）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、着色料、香料などとを混合して調製する。非経口投与用製剤はまた、通常の方法、例えば本発明の化合物（Ｉ）を無菌の水性担体、好ましくは水または生理食塩水溶液に溶解しても調製され得る。非経口投与に適した好ましい液体製剤は、約５０〜１００ ｍｇの活性化合物（Ｉ）を、水および有機溶媒中に、更に分子量３００〜５０００を有するポリエチレングリコール中に溶解して調製し、好ましくは、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルアルコールのような滑沢剤と混合される。上記の液体製剤には好ましくは更に、消毒剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサール）、殺菌剤、および更に適宜、等張剤（例えば、ショ糖、塩化ナトリウム）、局所麻酔剤、安定化剤、緩衝剤などを加えてよい。安定性を保つために、非経口投与用製剤は、小さな容器に充填し、続いて通常の凍結乾燥技術で水性溶媒を除いてもよく、これを使用に際して水性溶媒に溶解して液体製剤に戻す。
【００１６】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は以下の製造例、およびＴＮＦ−αによって刺激されるＰＴＥＮリン酸化の増大またはＭａｘｉ−Ｋ＋チャンネル開口における化合物の抑制効果の実験によって説明されるが、本発明はこれらに限定して解釈されない。
【００１７】
製造１
注射製剤の製造：
【００１８】
上記のパラベン、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを、８０℃で攪拌しながら上記蒸留水の半分の量に溶かす。該混合物を４０℃に冷却し、そこに活性化合物、および更にポリエチレングリコールおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを溶かす。残っている注射用蒸留水を該混合物に加え、濾紙で濾過して滅菌し、目的の注射製剤を得る。
【００１９】
製造２
錠剤の製造：
【００２０】
上記の本発明の化合物、乳糖、トウモロコシデンプンおよび結晶セルロースをよく混ぜ、該混合物を５％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液で造粒し、造粒した混合物を２００メッシュで篩にかけ、得られた造粒物を注意深く乾燥し、次いで造粒物を通常の方法で打錠し、錠剤（１０００錠）を得る。
【００２１】
薬理実験
ＴＮＦ−αの刺激により増加するＰＴＥＮリン酸化レベルが、本発明の代表的な化合物：シロスタゾールによって抑制される効果を試験した。
更に、本発明の代表的な化合物：シロスタゾールおよびいくつかの市販品として入手可能なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーまたは遮断薬によるＭａｘｉ−Ｋチャンネルの開口の効果を試験した。
【００２２】
実験１
ＴＮＦ−αよって刺激されるＰＴＥＮリン酸化レベルの増大におけるシロスタゾールの抑制効果：
物質：
細胞培養：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＫＣＬＢ ３００１１，ヒト脳神経芽細胞腫）細胞は、２ ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１.０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含み、熱で不活性化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたイーグルの基礎培地（ＭＥＭ）中で培養した。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で集密に増殖し、２０継代未満で実験に用いた。
ＴＮＦ−α溶液の調製：ＴＮＦ−α（アップステイト バイオテクノロジー社，ニューヨーク州レークプラシッド）をリン酸緩衝された生理食塩水に溶解し、１０μｇ／ｍｌ ストック溶液とした。
【００２３】
方法：
ウェスタンブロット分析法：集密的に培養された細胞を、ＴＮＦ−αでの刺激の３時間前に、シロスタゾールを加えたＦＢＳを１％含むＭＥＭ培地に交換し、次いで１時間ＴＮＦ−αに曝した。
該細胞を５０ ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ ８.０）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０.０２％ アジ化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌ アプロチニンおよび１％トライトンＸ−１００を含む溶解緩衝液に溶解した。１２，０００ｒｐｍでの遠心分離に続いて、全タンパク質の５０μｇを８または１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷して、ニトロセルロース膜（アメルシャム ファルマシア バイオテック、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に移した。ブロックされた膜は次いで指示抗体と共にインキュベートし、免疫反応性のバンドは、スーパーシグナル ウェスト ドゥラ エクステンディド デュレーション サブストレート キット(Supersignal West Dura Extended Duration Substrate Kit)（ピアス社、イリノイ州ロックフォード）で勧められているような化学発光剤を用いて可視化された。該バンドのシグナルはＧＳ−７１０校正された画像デンシトメーター（バイオ ラド ラボラトリィズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。結果は相対密度として表した。ＰＴＥＮ、リン酸化−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０／Ｔｈｒ３８２／３８３）に対するポリクローナル抗体は、セル シグナリング テクノロジー（マサチューセッツ州ベヴァリー）から得た。
統計解析：結果は平均±ＳＥＭとして表す。グループ間の統計的な差はスチューデントのｔ検定で決定した。ｐ＜０.０５は有意であると考えた。
【００２４】
結果：
ウェウタンブロットおよびデンシトメーターによる濃度測定解析は添付の図１に示す。
図１からわかるように、シロスタゾール（１、１０および１００μＭ）濃度に依存してＴＮＦ−α （５０ ｎｇ／ｍｌ）で刺激される増大したＰＴＥＮリン酸化レベルを抑制した。
上記の実験の結果から、シロスタゾールがＰＴＥＮリン酸化を阻害する強い活性を示すことは明らかである。
【００２５】
実験２
物質：
細胞培養：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＫＣＬＢ ３００１１，ヒト脳神経芽細胞腫）細胞は、２ ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１.０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含み、熱で不活性化された１０％ウシ胎児血清で補充されたイーグルの基礎培地（ＭＥＭ）中で培養した。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で集密に増殖し、２０継代未満で実験に用いた。
【００２６】
試験薬物：
（１）シロスタゾール（本発明の化合物、６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルの商品名）
（２）グリベンクラミド（「ＧＢＣ」と略される。一般名：グリブリド，化学名：５−クロロ−Ｎ−［２−［４−［［［（シクロヘキシルアミノ）カルボニル］アミノ］スルホニル］フェニル］エチル］−２−メトキシベンズアミド，市販品として入手可能な抗糖尿病薬，ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの遮断薬である。）
（３）イベリオトキシン（「Ｉｂｔｘ」と略される。Ｍａｘｉ−Ｋ+チャンネル遮断薬として知られている。）
【００２７】
方法：
細胞全体のＫ＋電流の記録：実験は倒立顕微鏡（ニコン製 ＴＥ３００モデル，日本、東京）のステージ上に据え付けられ、１ ｍｌ／分の流速で絶えず灌流された小さな槽（０.５ ｍＬ）の中で行った。パッチクランプ技術の細胞全体の立体配置を用いて、Ｋ＋電流を室温で（２０〜２２℃）アキソパッチ(Axopatch)−２００Ｂ パッチクランプ増幅器（アクソン機器社(Axon Instruments)， カリフォルニア州フォスターシティ）で記録した。０.５〜５ｋＨｚでアンチエイリアスフィルター処理した後、１〜１０ ｋＨｚで電流を採取した。データの取得および命令の電位は、ｐＣｌａｍｐ ６.０.３ソフトウェア（アクソン機器社(Axon Instruments)， カリフォルニア州フォスターシティ）で制御した。電圧クランプの品質を保証するために、電極抵抗を３ＭΩ以下に保った。接合部電位は標準槽溶液中の電極でゼロにした。ギガオームシール形成(Gigaohm seal formation)は吸引によって行われ、細胞全体の立体構造を確立した後、-８０ｍＶから対称的１０ｍＶ電位固定過程によって導かれた容量性過電流を、細胞電気容量の計算のため５０ｋＨｚで記録した。細胞全体の記録用の通常の槽溶液は、１３０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１.２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.８ ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５.２ ｍＭ ブドウ糖であり、ｐＨはＮａＯＨで７.４に調整された。ピペットは１４０ ｍＭ ＫＣｌ、０.５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.１ ｍＭ ＣａＣｌ２、０.０９ ｍＭ エチレンビス（オキソニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭ ブドウ糖で満たし、ｐＨはＫＯＨで７.４に調整した。
細胞全体の記録を確立し、脱分極で導かれた電流が安定化するまで約５分間コントロール対照の記録を収集した後、シロスタゾールを該槽に適用した。グリベンクラミドまたはイベリオトキシンを用いる実験においては、シロスタゾールはグリベンクラミドまたはイベリオトキシンを投与した後約２０分に該槽に適用した。
【００２８】
結果：
試験結果は添付の図２に示す。この中で図２Ａはシロスタゾールの効果を示し、図２Ｂはシロスタゾールおよび／またはグリベンクラミド（「ＧＢＣ」，Ｍａｘｉ−Ｋ＋チャンネルの開口を示唆）の効果を示し、および図２Ｃはシロスタゾールおよび／またはイベリオトキシン（「Ｉｂｔｘ」，Ｍａｘｉ−Ｋ＋チャンネル遮断薬）の効果を示す
図２からわかるように、電流はシロスタゾールによって有意に増加したが、一方、イベリオトキシン（１００ｎＭ）の該槽への添加によって可逆的にブロックされたが、グリベンクラミド（１０μＭ）ではブロックされなかった。Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルで媒介される電流の増加は、グリベンクラミドの共存下でさえシロスタゾールによって得られ、一方、グリベンクラミド単独ではＭａｘｉ−Ｋチャンネルで媒介される電流は増加し得なかった。シロスタゾールがＭａｘｉ−Ｋチャンネル遮断薬であるイベリオトキシンと共に細胞に加えられた場合、電流の増加はイベリオトキシン単独よりやや少なかった。
【００２９】
実験３
１．化合物の調製
ベヒクル対照；０.５％ カルボキシメチルセルロース、毎日２回（ｎ＝１０）
シロスタゾール；１００ ｍｇ／ｋｇ、毎日２回（ｎ＝１０）
少量の粉末（シロスタゾール）をメノウ乳鉢ですりつぶす。０.５％ カルボキシ−メチルセルロース（ＣＭＣ）を２、３滴加え、よくすりつぶす。４〜５ｍｌの０.５％ＣＭＣを加え、懸濁したシロスタゾールを遮光された瓶に戻す。
１０００ ｍｇ／５０ｍｌの濃度で毎週の試験化合物を調製し、および４℃での遮光下保存する。
化合物の投与：
投与前、超音波ソニケーターで試験化合物のストック瓶を超音波処理し、よく混ぜる。
化合物は各群毎に毎日２回経口で強制投与。
ベヒクル対照（０.５％ カルボキシメチルセルロース：ＣＭＣ； １ｋｇ／５ｍｌ）は毎日２回強制投与。試験化合物（シロスタゾール； １００ ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌ）は毎日２回強制投与。
【００３０】
２．観察、試験および測定方法
ａ．動物（８週齢，変異体ヒトＡＰＰＫ６７０Ｎ，Ｍ６７１１／系 Ｔｇ２５７６を発現する半接合性遺伝子組み換えマウス）を、２群の二重の遺伝子組み換えＡＰＰ／ＰＳ１マウス（対照群およびシロスタゾール群，全数＝２０マウス）にランダムに分けた。以下の表に示すように、各マウスに６週間強制投与法で毎日２回投与した。
ｂ．マウスは試験の開始時と終了時に遺伝子型を同定した。
ｃ．マウスは生存期が完了する前までＹ字型迷路行動試験を受けさせた。
ｄ．マウスは１４週齢で屠殺した。
ｅ．屠殺後、１ ｍＬの血液をシロスタゾールの血中濃度測定用に集め、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスを生理食塩水で灌流した。脳は二等分し、一方の半球は固定し、他方の半球は凍結した。
ｆ．凍結した半球はホモジネートし、ＥＬＩＳＡで全アミロイドベータ濃度を分析した。
マウスの脳における全Ａ−ベータ４０および全Ａ−ベータ４２レベルを、対照群とシロスタゾール処置群で測定した。結果は添付の図３に示す。
【００３１】
３．方法
以下の方法は「Ｙ字型迷路における自発的交替」の試験を行うのに取られる過程を概説する。マウスは周りを探し回る生来の性質を有する。探索が成功するかは、短時間前に訪れた場所（食物が枯渇または存在しない）を避ける能力に依存する（「自発的交替」）。Ｙ字型迷路は報酬の引渡しを含まない行動学に基づく試験である。損なわれた「作業記憶」機能を有するマウスは、作業記憶内に、今まさに訪れた場所に関する情報を保持することができない。従って自発的交替の減少を示す。
開示した結果では、自発的交替の減少と、ある遺伝子組み換えマウスの系統、例えばＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける探索の増加を示している。
シロスタゾールは抗血小板および血管拡張活性を有し、ＡＳＯの適用を有し、二次的脳梗塞を予防する。
これらのシロスタゾールの活性は、アミロイドベータタンパク質の析出を減少させるのに寄与し得、アルツハイマー病の痴呆の行動を改善し得る。
【００３２】
ｉ．試験室に試験されるマウスを持ってくる。マウスの行動に影響を与え得るので、一度に試験場所に多くのマウス（３ケージ以上）を持ってくるのを避ける。（適宜、別の方法、例えばトランスポンダーまたははっきり見える入れ墨でマークしていないときだけ行うが）以下の順で無毒性の色マーカーで尾にマークする。
１：赤
２：緑
３：青
４：黒
【００３３】
ii．実験はビデオに記録してもよい。これは永久の記録を行い、調査者になんらかの疑問があれば実験を再考させるものである。
【００３４】
iii．ホームケージから試験される最初のマウスを尾に基づいて取り出し、重さを量る。Ｙ字型迷路データスプレッドシート中の重さを量る。マウスをケージに戻す。（あるいは、実験開始前、例えば前日にマウスの重さを量ってもよい。）
【００３５】
iv．マウスを試験室に順応させるために、試験の開始前１時間平静にしておいた。ついでに注意しておくべき事として、例えばにおいがマウスの単一アームに入るのに影響を与え得るので、ケージを１つの特定のアームに隣接して置かないようにすることである。従って、ケージを器具から離して置くか、またはケージを試験室の周りに均等に配置（例えば、１つのアームに１つずつ各アームの近接に３つのケージを導入してもよい）するようにする。試験室には技術者は居てもよいが、マウスに刺激を与えてはいけない。
【００３６】
ｖ．試験開始前に、イソプロパノールでＹ字型迷路の内部を拭く。
【００３７】
vi．マウスを優しく扱い、尾をつかんでアームに静止させ、迷路に最初マウスの頭を突っ込ませないように注意する。マウスは個々に、３つのアーム（アームＡ、アームＢおよびアームＣ）すべてで８分間の探索が可能であるＹ字型迷路の中央に置く。
【００３８】
vii．すべての選択行使をＹ字型迷路のデータシートのプリントアウトに記録する。もしマウスが完全にアームＡに入ったなら、ＡＲＭ ＥＮＴＥＲＥＤ欄に「Ａ」が入る等である。同じ列において、もしマウスが終わりまでアームを探索したなら、ＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳに「終わり」が入り、マウスが後ろ足で立つ（前足を自由にして後ろ足に座る）度毎に「Ｒ」、またはもたれる（前足で壁に触って「壁を徹底的に探索する」）場合は「Ｌ」、およびじっとしている（５秒以上静止のまま）であれば「Ｆ」が入る。もしマウスがアームＡに中で前後したなら、同列でＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳに別の「ｂｆ」が入る。全テキストにいずれの他の観察結果も入る。もし観察結果を入れるのに十分な時間がないときは、それらは飛ばされる。マウスが中央に戻れば新たな列が始まる。もしマウスがアームＡに戻ったなら新たな列に「Ａ」が入り、アームＢなら「Ｂ」、またはアームＣなら「Ｃ」が入る。
【００３９】
viii．８分後、尾でマウスを除き、ホームケージにマウスを戻す。糞の数を記録し、Ｙ字型迷路のスプレッドシートに排尿したかどうか記録する。イソプロパノールでＹ字型迷路の内部を拭う。ブラシを用いて隅に入れて、壁も床もきれいにした。Ｙ字型迷路がきれいであり、先のマウスが迷路に持ち込んでいるかも知れないあらゆるにおい、床敷または食物がないことを確認する。Ｙ字型迷路がアルコールで清掃後乾燥していることを確認する。清掃用の物質（例えばティッシュペーパー）が迷路に残っていないことを確認する。
【００４０】
ix．試験されるすべてのマウスに過程を繰り返す。
【００４１】
ｘ．試験後、データをハードコピーからエクセルスプレッドシートに移す。
Ｙ字型迷路行動パラダイムから得られた結果を添付の図４にまとめる。
【００４２】
xi．データ解析：交替は再進入（選択）することなく３つのアームすべてへの訪問として定義される（ＡＢＣ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、ＢＣＡ、ＣＡＢまたはＣＢＡ）。アームへの進入（選択）の各々を別々に解析し、交替が完了したかどうか決定する。順序ＡＢＣＡＢＣは４つの交替を有し、最初がＣで終了し、次がＡで、次いでＢ、次いでＣである。順序ＡＢＣＢＡＣは３つだけの交代で、最初がＣで終了し、第二がＡで終了し、第三がＣである。交代の％は（観察された交替の数）／（可能な交替の数）である。ｎ回アームを訪れたなら、交替の最も高い可能性のある数はｎ−２である。動物がランダムに動くなら、２２％の交替が期待される（３×２×１／３×３×３）。全体的な活性は異なるアームに訪問した全数において反映される。活性は従って、（アーム進入（選択）の全数）／（観察の時間（分））である。
【００４３】
このように、本発明のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩は、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口に効果があり、神経系障害の治療、特にアルツハイマー病の治療に有用である。
【００４４】
（産業上の利用可能性）
本発明は、テトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩を活性成分として含む組成物を提供し、これは優れたＰＴＥＮ阻害効果を有し、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、および皮膚の生存を促進し、更にＰＴＥＮの阻害による副作用も全くなく、グラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害する薬物として有用である。本発明の組成物は大きな伝導性のＣａ２＋で活性化されたＫ＋チャンネル（Ｍａｘｉ−Ｋチャンネル）のオープナー（開口剤）として更に有用であり、これにより神経系障害の治療剤、例えば、抗痙攣剤、神経保護剤、局所脳浮腫および神経性運動障害、認知障害、外傷性脳傷害、パーキンソン病、てんかん、片頭痛、およびアルツハイマー病などの治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＴＮＦ−α（５０ ｎｇ／ｍｌ）によって刺激される増加したＰＴＥＮリン酸化レベルの、シロスタゾール（６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルの商品名）による抑制を示す。
【図２】図２はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞でのカルシウムで活性化されたＫ＋電流の開口における薬物の効果を示し、図２Ａはシロスタゾール（６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルの商品名）の効果を示し、図２Ｂはシロスタゾールおよび／またはグリベンクラミド（「ＧＢＣ」と略される。市販品として入手可能な抗糖尿病薬，ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの開口の非存在を示唆するものである）の効果を示し、図２Ｃはシロスタゾールおよび／またはイベリオトキシン（「Ｉｂｔｘ」，Ｍａｘｉ−Ｋ＋チャンネル遮断薬として知られ、Ｍａｘｉ−Ｋ+チャンネルの開口を示唆）の効果を示す。
【図３】図３は、対照群とシロスタゾール処置群での、マウスの脳中の全アミロイドベータ濃度（Ａ−ベータ４０およびＡ−ベータ４２レベル）ＥＬＩＳＡ測定を示す。
【図４】図４は、本発明の化合物のアルツハイマー病における効果を試験するために行ったＹ字型迷路行動の指標から得られた実験結果の概要を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は新規なＰＴＥＮ阻害剤または新規なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー（開口剤）に関する。より具体的には式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、Ａは低級アルキレン基であり、およびカルボスチリル環の３および４位の結合は単結合または二重結合を意味する］
のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩を活性成分として含むＰＴＥＮ阻害剤または新規なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーに関する。
【０００２】
（背景技術）
ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよび染色体Ｔｅｎで欠失されるテンシン類似体：Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten）は、１９９７年に癌抑制遺伝子として単離され、以来その生理的機能は様々な観点から分析されてきている。ＰＴＥＮ遺伝子生成物が新たなホスファターゼ活性を示すこと、すなわち脂質二次メッセンジャーであるフォスファチジルイノシトール ３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）基質をそのＤ３位で脱リン酸化できることが、１９９８年に報告されている（参照：Beitner-Johnson D, Millhorn DE, J. Biol. Chem., 273: pp. 13375-13378, 1998）。
【０００３】
ＰＴＥＮの機能の観点から、ＰＴＥＮの阻害が、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、および皮膚の生存を促進するのに効果的である場合、更にグラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害するのに効果的であることが期待される。
【０００４】
また、カリウムチャンネルの開口が細胞内陰性電位を生じた細胞からの細胞内カリウムイオンの流出を誘発することは知られており、そして該カリウムチャンネルが電位依存性であり、細胞内カルシウム濃度および細胞内ＡＴＰで制御されることも知られている。Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルはある種の大きな伝導性のカルシウム感受性カリウムチャンネルであり、該Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの活性は細胞内カルシウム濃度および膜電位などによって制御される。Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルは神経細胞、心臓細胞、平滑筋細胞のような生体内に広く分布しており、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口は細胞の過分極を誘発する。該Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口は神経系障害の治療に、例えば以下のような薬物として有用であることも知られている。
（１）抗痙攣剤
（２）局所脳浮腫および神経性運動障害、認知障害、外傷性脳傷害、パーキンソン病、てんかん、片頭痛、およびアルツハイマー病の治療用神経保護剤
（３）痛みを制御するための薬物
（４）切迫性尿失禁、腸管の過剰運動、子宮収縮、不安症、およびうつ病の治療剤。
【０００５】
（発明の開示）
ＰＴＥＮの研究の中で、本発明者は上記で述べたような式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、特に血小板凝集阻害活性および血管拡張活性を有することが知られている６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルまたはその塩がＰＴＥＮを阻害する活性を示し、これによってＰＴＥＮ阻害剤として有用であることを見出し、次いで本発明を完成するに至った。
【０００６】
更に、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの機能解析の研究の中で、本発明者は、上記で述べたような式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、特に６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩が血小板凝集阻害活性および血管拡張活性を有することは知られていたが、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口活性を示すことを新たに見出し、次いで本発明を完成するに至った。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、活性成分として式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシカルボスチリル化合物またはその塩を含む新規なＰＴＥＮ阻害剤または新規なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーを提供する。本発明は更に、テトラゾリルアルコキシカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩をかかる治療が必要な患者に投与することからなる、ＰＴＥＮを阻害する方法およびＭａｘｉ−Ｋチャンネルを開口する方法を提供し、更に、ＰＴＥＮの阻害のための、並びにＭａｘｉ−Ｋチャンネルの開口のための、テトラゾリルアルコキシカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の使用を提供する。
【０００８】
式（Ｉ）の化合物またはその塩は優れたＰＴＥＮ阻害効果を有し、これにより活性成分として式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む本発明のＰＴＥＮ阻害剤は、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、および皮膚の生存を促進し、更にＰＴＥＮの阻害による副作用も全くなく、グラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害する薬物として有用である。
【０００９】
更に、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、大きな伝導性を持つカルシウムで活性化されるＫ＋チャンネル（Ｍａｘｉ−Ｋチャンネル）の開口に優れた効果を有し、これにより活性成分として式（Ｉ）の化合物またはその塩を含む本発明のＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーは、神経系障害の治療剤、例えば、抗痙攣剤、神経保護剤、局所脳浮腫および神経性運動障害、認知障害、外傷性脳傷害、パーキンソン病、てんかん、片頭痛、およびアルツハイマー病、痛み、切迫性尿失禁、腸管の過剰運動、子宮収縮、不安症、およびうつ病の治療剤として有用である。
【００１０】
式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物およびその製造方法はJP-63-20235に開示されている。
【００１１】
式（Ｉ）において、「シクロアルキル基」には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどのようなＣ３−８シクロアルキル基が含まれ、好ましくはシクロヘキシルである。「低級アルキレン基」には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなどのようなＣ１−６アルキレン基が含まれ、好ましくはブチレンである。
【００１２】
特に好ましい化合物は、６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルであり、シロスタゾールの商品名の下、血管拡張剤として販売されている。
【００１３】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、バルクで、または好ましくは通常の医薬担体もしくは希釈剤で医薬製剤の形態で用いられ得る。投与形態は特定の形態に制限されないが、いずれの通常の投与形態、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤のような経口投与の製剤、経口投与に適した様々な液体製剤、または注射剤、坐剤のような非経口投与用製剤であってもよい。用量は特定の範囲に制限されないが、通常、成人（体重５０ｋｇ）で１００〜４００ ｍｇ／日の範囲にあり、１回または１〜数回に分けて投与される。活性化合物は好ましくは、投与単位あたり５０〜１００ ｍｇの量で製剤中含まれる。
【００１４】
注射用製剤は通常、液剤、乳濁液、または懸濁液の形態で調製され、無菌化し、更に好ましくは血液に対して等張にされる。液体、乳濁液または懸濁液の形態の製剤は一般的に、通常の医薬希釈剤、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを用いて調製される。これらの製剤には、塩化ナトリウム、ブドウ糖、グリセリンのような等張剤と、等張にするのに十分な量で混合してもよく、更に通常の可溶化剤、緩衝剤、麻酔剤、および適宜、着色剤、保存剤、芳香物質、香料、甘味料、および他の薬剤で混合してもよい。
【００１５】
錠剤、カプセル剤、経口投与用液剤のような製剤は、通常の方法で調製され得る。錠剤は、ゼラチン、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガムなどのような通常の医薬担体と混合して調製され得る。カプセル剤は、不活性な医薬充填剤または希釈剤と共に混合して調製し、硬ゼラチンカプセルまたは軟カプセルに詰められ得る。シロップ剤またはエリキシル剤のような経口液体製剤は、活性化合物と、甘味料（例えば、ショ糖）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、着色料、香料などとを混合して調製する。非経口投与用製剤はまた、通常の方法、例えば本発明の化合物（Ｉ）を無菌の水性担体、好ましくは水または生理食塩水溶液に溶解しても調製され得る。非経口投与に適した好ましい液体製剤は、約５０〜１００ ｍｇの活性化合物（Ｉ）を、水および有機溶媒中に、更に分子量３００〜５０００を有するポリエチレングリコール中に溶解して調製し、好ましくは、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルアルコールのような滑沢剤と混合される。上記の液体製剤には好ましくは更に、消毒剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサール）、殺菌剤、および更に適宜、等張剤（例えば、ショ糖、塩化ナトリウム）、局所麻酔剤、安定化剤、緩衝剤などを加えてよい。安定性を保つために、非経口投与用製剤は、小さな容器に充填し、続いて通常の凍結乾燥技術で水性溶媒を除いてもよく、これを使用に際して水性溶媒に溶解して液体製剤に戻す。
【００１６】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は以下の製造例、およびＴＮＦ−αによって刺激されるＰＴＥＮリン酸化の増大またはＭａｘｉ−Ｋ＋チャンネル開口における化合物の抑制効果の実験によって説明されるが、本発明はこれらに限定して解釈されない。
【００１７】
製造１
注射製剤の製造：
【００１８】
上記のパラベン、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを、８０℃で攪拌しながら上記蒸留水の半分の量に溶かす。該混合物を４０℃に冷却し、そこに活性化合物、および更にポリエチレングリコールおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを溶かす。残っている注射用蒸留水を該混合物に加え、濾紙で濾過して滅菌し、目的の注射製剤を得る。
【００１９】
製造２
錠剤の製造：
【００２０】
上記の本発明の化合物、乳糖、トウモロコシデンプンおよび結晶セルロースをよく混ぜ、該混合物を５％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液で造粒し、造粒した混合物を２００メッシュで篩にかけ、得られた造粒物を注意深く乾燥し、次いで造粒物を通常の方法で打錠し、錠剤（１０００錠）を得る。
【００２１】
薬理実験
ＴＮＦ−αの刺激により増加するＰＴＥＮリン酸化レベルが、本発明の代表的な化合物：シロスタゾールによって抑制される効果を試験した。
更に、本発明の代表的な化合物：シロスタゾールおよびいくつかの市販品として入手可能なＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナーまたは遮断薬によるＭａｘｉ−Ｋチャンネルの開口の効果を試験した。
【００２２】
実験１
ＴＮＦ−αよって刺激されるＰＴＥＮリン酸化レベルの増大におけるシロスタゾールの抑制効果：
物質：
細胞培養：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＫＣＬＢ ３００１１，ヒト脳神経芽細胞腫）細胞は、２ ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１.０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含み、熱で不活性化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたイーグルの基礎培地（ＭＥＭ）中で培養した。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で集密に増殖し、２０継代未満で実験に用いた。
ＴＮＦ−α溶液の調製：ＴＮＦ−α（アップステイト バイオテクノロジー社，ニューヨーク州レークプラシッド）をリン酸緩衝された生理食塩水に溶解し、１０μｇ／ｍｌ ストック溶液とした。
【００２３】
方法：
ウェスタンブロット分析法：集密的に培養された細胞を、ＴＮＦ−αでの刺激の３時間前に、シロスタゾールを加えたＦＢＳを１％含むＭＥＭ培地に交換し、次いで１時間ＴＮＦ−αに曝した。
該細胞を５０ ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ ８.０）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０.０２％ アジ化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌ アプロチニンおよび１％トライトンＸ−１００を含む溶解緩衝液に溶解した。１２，０００ｒｐｍでの遠心分離に続いて、全タンパク質の５０μｇを８または１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷して、ニトロセルロース膜（アメルシャム ファルマシア バイオテック、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に移した。ブロックされた膜は次いで指示抗体と共にインキュベートし、免疫反応性のバンドは、スーパーシグナル ウェスト ドゥラ エクステンディド デュレーション サブストレート キット(Supersignal West Dura Extended Duration Substrate Kit)（ピアス社、イリノイ州ロックフォード）で勧められているような化学発光剤を用いて可視化された。該バンドのシグナルはＧＳ−７１０校正された画像デンシトメーター（バイオ ラド ラボラトリィズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。結果は相対密度として表した。ＰＴＥＮ、リン酸化−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０／Ｔｈｒ３８２／３８３）に対するポリクローナル抗体は、セル シグナリング テクノロジー（マサチューセッツ州ベヴァリー）から得た。
統計解析：結果は平均±ＳＥＭとして表す。グループ間の統計的な差はスチューデントのｔ検定で決定した。ｐ＜０.０５は有意であると考えた。
【００２４】
結果：
ウェウタンブロットおよびデンシトメーターによる濃度測定解析は添付の図１に示す。
図１からわかるように、シロスタゾール（１、１０および１００μＭ）濃度に依存してＴＮＦ−α （５０ ｎｇ／ｍｌ）で刺激される増大したＰＴＥＮリン酸化レベルを抑制した。
上記の実験の結果から、シロスタゾールがＰＴＥＮリン酸化を阻害する強い活性を示すことは明らかである。
【００２５】
実験２
物質：
細胞培養：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＫＣＬＢ ３００１１，ヒト脳神経芽細胞腫）細胞は、２ ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１.０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含み、熱で不活性化された１０％ウシ胎児血清で補充されたイーグルの基礎培地（ＭＥＭ）中で培養した。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で集密に増殖し、２０継代未満で実験に用いた。
【００２６】
試験薬物：
（１）シロスタゾール（本発明の化合物、６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルの商品名）
（２）グリベンクラミド（「ＧＢＣ」と略される。一般名：グリブリド，化学名：５−クロロ−Ｎ−［２−［４−［［［（シクロヘキシルアミノ）カルボニル］アミノ］スルホニル］フェニル］エチル］−２−メトキシベンズアミド，市販品として入手可能な抗糖尿病薬，ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの遮断薬である。）
（３）イベリオトキシン（「Ｉｂｔｘ」と略される。Ｍａｘｉ−Ｋ+チャンネル遮断薬として知られている。）
【００２７】
方法：
細胞全体のＫ＋電流の記録：実験は倒立顕微鏡（ニコン製 ＴＥ３００モデル，日本、東京）のステージ上に据え付けられ、１ ｍｌ／分の流速で絶えず灌流された小さな槽（０.５ ｍＬ）の中で行った。パッチクランプ技術の細胞全体の立体配置を用いて、Ｋ＋電流を室温で（２０〜２２℃）アキソパッチ(Axopatch)−２００Ｂ パッチクランプ増幅器（アクソン機器社(Axon Instruments)， カリフォルニア州フォスターシティ）で記録した。０.５〜５ｋＨｚでアンチエイリアスフィルター処理した後、１〜１０ ｋＨｚで電流を採取した。データの取得および命令の電位は、ｐＣｌａｍｐ ６.０.３ソフトウェア（アクソン機器社(Axon Instruments)， カリフォルニア州フォスターシティ）で制御した。電圧クランプの品質を保証するために、電極抵抗を３ＭΩ以下に保った。接合部電位は標準槽溶液中の電極でゼロにした。ギガオームシール形成(Gigaohm seal formation)は吸引によって行われ、細胞全体の立体構造を確立した後、-８０ｍＶから対称的１０ｍＶ電位固定過程によって導かれた容量性過電流を、細胞電気容量の計算のため５０ｋＨｚで記録した。細胞全体の記録用の通常の槽溶液は、１３０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１.２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.８ ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５.２ ｍＭ ブドウ糖であり、ｐＨはＮａＯＨで７.４に調整された。ピペットは１４０ ｍＭ ＫＣｌ、０.５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.１ ｍＭ ＣａＣｌ２、０.０９ ｍＭ エチレンビス（オキソニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭ ブドウ糖で満たし、ｐＨはＫＯＨで７.４に調整した。
細胞全体の記録を確立し、脱分極で導かれた電流が安定化するまで約５分間コントロール対照の記録を収集した後、シロスタゾールを該槽に適用した。グリベンクラミドまたはイベリオトキシンを用いる実験においては、シロスタゾールはグリベンクラミドまたはイベリオトキシンを投与した後約２０分に該槽に適用した。
【００２８】
結果：
試験結果は添付の図２に示す。この中で図２Ａはシロスタゾールの効果を示し、図２Ｂはシロスタゾールおよび／またはグリベンクラミド（「ＧＢＣ」，Ｍａｘｉ−Ｋ＋チャンネルの開口を示唆）の効果を示し、および図２Ｃはシロスタゾールおよび／またはイベリオトキシン（「Ｉｂｔｘ」，Ｍａｘｉ−Ｋ＋チャンネル遮断薬）の効果を示す
図２からわかるように、電流はシロスタゾールによって有意に増加したが、一方、イベリオトキシン（１００ｎＭ）の該槽への添加によって可逆的にブロックされたが、グリベンクラミド（１０μＭ）ではブロックされなかった。Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルで媒介される電流の増加は、グリベンクラミドの共存下でさえシロスタゾールによって得られ、一方、グリベンクラミド単独ではＭａｘｉ−Ｋチャンネルで媒介される電流は増加し得なかった。シロスタゾールがＭａｘｉ−Ｋチャンネル遮断薬であるイベリオトキシンと共に細胞に加えられた場合、電流の増加はイベリオトキシン単独よりやや少なかった。
【００２９】
実験３
１．化合物の調製
ベヒクル対照；０.５％ カルボキシメチルセルロース、毎日２回（ｎ＝１０）
シロスタゾール；１００ ｍｇ／ｋｇ、毎日２回（ｎ＝１０）
少量の粉末（シロスタゾール）をメノウ乳鉢ですりつぶす。０.５％ カルボキシ−メチルセルロース（ＣＭＣ）を２、３滴加え、よくすりつぶす。４〜５ｍｌの０.５％ＣＭＣを加え、懸濁したシロスタゾールを遮光された瓶に戻す。
１０００ ｍｇ／５０ｍｌの濃度で毎週の試験化合物を調製し、および４℃での遮光下保存する。
化合物の投与：
投与前、超音波ソニケーターで試験化合物のストック瓶を超音波処理し、よく混ぜる。
化合物は各群毎に毎日２回経口で強制投与。
ベヒクル対照（０.５％ カルボキシメチルセルロース：ＣＭＣ； １ｋｇ／５ｍｌ）は毎日２回強制投与。試験化合物（シロスタゾール； １００ ｍｇ／ｋｇ／５ｍｌ）は毎日２回強制投与。
【００３０】
２．観察、試験および測定方法
ａ．動物（８週齢，変異体ヒトＡＰＰＫ６７０Ｎ，Ｍ６７１１／系 Ｔｇ２５７６を発現する半接合性遺伝子組み換えマウス）を、２群の二重の遺伝子組み換えＡＰＰ／ＰＳ１マウス（対照群およびシロスタゾール群，全数＝２０マウス）にランダムに分けた。以下の表に示すように、各マウスに６週間強制投与法で毎日２回投与した。
ｂ．マウスは試験の開始時と終了時に遺伝子型を同定した。
ｃ．マウスは生存期が完了する前までＹ字型迷路行動試験を受けさせた。
ｄ．マウスは１４週齢で屠殺した。
ｅ．屠殺後、１ ｍＬの血液をシロスタゾールの血中濃度測定用に集め、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスを生理食塩水で灌流した。脳は二等分し、一方の半球は固定し、他方の半球は凍結した。
ｆ．凍結した半球はホモジネートし、ＥＬＩＳＡで全アミロイドベータ濃度を分析した。
マウスの脳における全Ａ−ベータ４０および全Ａ−ベータ４２レベルを、対照群とシロスタゾール処置群で測定した。結果は添付の図３に示す。
【００３１】
３．方法
以下の方法は「Ｙ字型迷路における自発的交替」の試験を行うのに取られる過程を概説する。マウスは周りを探し回る生来の性質を有する。探索が成功するかは、短時間前に訪れた場所（食物が枯渇または存在しない）を避ける能力に依存する（「自発的交替」）。Ｙ字型迷路は報酬の引渡しを含まない行動学に基づく試験である。損なわれた「作業記憶」機能を有するマウスは、作業記憶内に、今まさに訪れた場所に関する情報を保持することができない。従って自発的交替の減少を示す。
開示した結果では、自発的交替の減少と、ある遺伝子組み換えマウスの系統、例えばＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける探索の増加を示している。
シロスタゾールは抗血小板および血管拡張活性を有し、ＡＳＯの適用を有し、二次的脳梗塞を予防する。
これらのシロスタゾールの活性は、アミロイドベータタンパク質の析出を減少させるのに寄与し得、アルツハイマー病の痴呆の行動を改善し得る。
【００３２】
ｉ．試験室に試験されるマウスを持ってくる。マウスの行動に影響を与え得るので、一度に試験場所に多くのマウス（３ケージ以上）を持ってくるのを避ける。（適宜、別の方法、例えばトランスポンダーまたははっきり見える入れ墨でマークしていないときだけ行うが）以下の順で無毒性の色マーカーで尾にマークする。
１：赤
２：緑
３：青
４：黒
【００３３】
ii．実験はビデオに記録してもよい。これは永久の記録を行い、調査者になんらかの疑問があれば実験を再考させるものである。
【００３４】
iii．ホームケージから試験される最初のマウスを尾に基づいて取り出し、重さを量る。Ｙ字型迷路データスプレッドシート中の重さを量る。マウスをケージに戻す。（あるいは、実験開始前、例えば前日にマウスの重さを量ってもよい。）
【００３５】
iv．マウスを試験室に順応させるために、試験の開始前１時間平静にしておいた。ついでに注意しておくべき事として、例えばにおいがマウスの単一アームに入るのに影響を与え得るので、ケージを１つの特定のアームに隣接して置かないようにすることである。従って、ケージを器具から離して置くか、またはケージを試験室の周りに均等に配置（例えば、１つのアームに１つずつ各アームの近接に３つのケージを導入してもよい）するようにする。試験室には技術者は居てもよいが、マウスに刺激を与えてはいけない。
【００３６】
ｖ．試験開始前に、イソプロパノールでＹ字型迷路の内部を拭く。
【００３７】
vi．マウスを優しく扱い、尾をつかんでアームに静止させ、迷路に最初マウスの頭を突っ込ませないように注意する。マウスは個々に、３つのアーム（アームＡ、アームＢおよびアームＣ）すべてで８分間の探索が可能であるＹ字型迷路の中央に置く。
【００３８】
vii．すべての選択行使をＹ字型迷路のデータシートのプリントアウトに記録する。もしマウスが完全にアームＡに入ったなら、ＡＲＭ ＥＮＴＥＲＥＤ欄に「Ａ」が入る等である。同じ列において、もしマウスが終わりまでアームを探索したなら、ＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳに「終わり」が入り、マウスが後ろ足で立つ（前足を自由にして後ろ足に座る）度毎に「Ｒ」、またはもたれる（前足で壁に触って「壁を徹底的に探索する」）場合は「Ｌ」、およびじっとしている（５秒以上静止のまま）であれば「Ｆ」が入る。もしマウスがアームＡに中で前後したなら、同列でＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳに別の「ｂｆ」が入る。全テキストにいずれの他の観察結果も入る。もし観察結果を入れるのに十分な時間がないときは、それらは飛ばされる。マウスが中央に戻れば新たな列が始まる。もしマウスがアームＡに戻ったなら新たな列に「Ａ」が入り、アームＢなら「Ｂ」、またはアームＣなら「Ｃ」が入る。
【００３９】
viii．８分後、尾でマウスを除き、ホームケージにマウスを戻す。糞の数を記録し、Ｙ字型迷路のスプレッドシートに排尿したかどうか記録する。イソプロパノールでＹ字型迷路の内部を拭う。ブラシを用いて隅に入れて、壁も床もきれいにした。Ｙ字型迷路がきれいであり、先のマウスが迷路に持ち込んでいるかも知れないあらゆるにおい、床敷または食物がないことを確認する。Ｙ字型迷路がアルコールで清掃後乾燥していることを確認する。清掃用の物質（例えばティッシュペーパー）が迷路に残っていないことを確認する。
【００４０】
ix．試験されるすべてのマウスに過程を繰り返す。
【００４１】
ｘ．試験後、データをハードコピーからエクセルスプレッドシートに移す。
Ｙ字型迷路行動パラダイムから得られた結果を添付の図４にまとめる。
【００４２】
xi．データ解析：交替は再進入（選択）することなく３つのアームすべてへの訪問として定義される（ＡＢＣ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、ＢＣＡ、ＣＡＢまたはＣＢＡ）。アームへの進入（選択）の各々を別々に解析し、交替が完了したかどうか決定する。順序ＡＢＣＡＢＣは４つの交替を有し、最初がＣで終了し、次がＡで、次いでＢ、次いでＣである。順序ＡＢＣＢＡＣは３つだけの交代で、最初がＣで終了し、第二がＡで終了し、第三がＣである。交代の％は（観察された交替の数）／（可能な交替の数）である。ｎ回アームを訪れたなら、交替の最も高い可能性のある数はｎ−２である。動物がランダムに動くなら、２２％の交替が期待される（３×２×１／３×３×３）。全体的な活性は異なるアームに訪問した全数において反映される。活性は従って、（アーム進入（選択）の全数）／（観察の時間（分））である。
【００４３】
このように、本発明のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩は、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口に効果があり、神経系障害の治療、特にアルツハイマー病の治療に有用である。
【００４４】
（産業上の利用可能性）
本発明は、テトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩を活性成分として含む組成物を提供し、これは優れたＰＴＥＮ阻害効果を有し、正常の細胞、脳細胞、心臓細胞、および皮膚の生存を促進し、更にＰＴＥＮの阻害による副作用も全くなく、グラム陰性敗血症並びに細胞遊走および細胞浸潤を阻害する薬物として有用である。本発明の組成物は大きな伝導性のＣａ２＋で活性化されたＫ＋チャンネル（Ｍａｘｉ−Ｋチャンネル）のオープナー（開口剤）として更に有用であり、これにより神経系障害の治療剤、例えば、抗痙攣剤、神経保護剤、局所脳浮腫および神経性運動障害、認知障害、外傷性脳傷害、パーキンソン病、てんかん、片頭痛、およびアルツハイマー病などの治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＴＮＦ−α（５０ ｎｇ／ｍｌ）によって刺激される増加したＰＴＥＮリン酸化レベルの、シロスタゾール（６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−カルボスチリルの商品名）による抑制を示す。
【図２】図２はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞でのカルシウムで活性化されたＫ＋電流の開口における薬物の効果を示し、図２Ａはシロスタゾール（６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルの商品名）の効果を示し、図２Ｂはシロスタゾールおよび／またはグリベンクラミド（「ＧＢＣ」と略される。市販品として入手可能な抗糖尿病薬，ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの開口の非存在を示唆するものである）の効果を示し、図２Ｃはシロスタゾールおよび／またはイベリオトキシン（「Ｉｂｔｘ」，Ｍａｘｉ−Ｋ＋チャンネル遮断薬として知られ、Ｍａｘｉ−Ｋ+チャンネルの開口を示唆）の効果を示す。
【図３】図３は、対照群とシロスタゾール処置群での、マウスの脳中の全アミロイドベータ濃度（Ａ−ベータ４０およびＡ−ベータ４２レベル）ＥＬＩＳＡ測定を示す。
【図４】図４は、本発明の化合物のアルツハイマー病における効果を試験するために行ったＹ字型迷路行動の指標から得られた実験結果の概要を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、Ａは低級アルキレン基であり、およびカルボスチリル環の３および４位の間の結合は単結合または二重結合を意味する］
のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩を活性成分として含むＰＴＥＮ阻害剤。
【請求項２】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１のＰＴＥＮ阻害剤。
【請求項３】
活性成分の請求項１に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩、および通常の医薬的に許容される担体または希釈剤からなるＰＴＥＮを阻害するための医薬組成物。
【請求項４】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項３の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の有効量を、治療が必要な患者に投与することからなる、ＰＴＥＮの阻害方法。
【請求項６】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項５の方法。
【請求項７】
ＰＴＥＮ阻害剤を製造するための、請求項１に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の使用。
【請求項８】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項７の使用。
【請求項９】
式（Ｉ）：
【化２】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、Ａは低級アルキレン基であり、およびカルボスチリル環の３および４位の間の結合は単結合または二重結合を意味する］
のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩を活性成分として含むＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー。
【請求項１０】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項９のＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー。
【請求項１１】
活性成分として請求項９に示す式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、および通常の医薬的に許容される担体または希釈剤からなるＭａｘｉ−Ｋチャンネルを開口するための医薬組成物。
【請求項１２】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
神経系障害の治療用である、請求項１１または１２の医薬組成物。
【請求項１４】
該神経系障害がアルツハイマー病である、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項９に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の有効量を、治療が必要な患者に投与することからなる、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口方法。
【請求項１６】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
神経系障害の治療のための請求項１５または１６の方法。
【請求項１８】
該神経系障害がアルツハイマー病である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口用薬剤の製造のための、請求項９に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の使用。
【請求項２０】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１９の使用。
【請求項２１】
神経系障害の治療剤の製造のための、請求項１９または２０の使用。
【請求項２２】
該神経系障害がアルツハイマー病である、請求項２１の使用。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、Ａは低級アルキレン基であり、およびカルボスチリル環の３および４位の間の結合は単結合または二重結合を意味する］
のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩を活性成分として含むＰＴＥＮ阻害剤。
【請求項２】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１のＰＴＥＮ阻害剤。
【請求項３】
活性成分の請求項１に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩、および通常の医薬的に許容される担体または希釈剤からなるＰＴＥＮを阻害するための医薬組成物。
【請求項４】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項３の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の有効量を、治療が必要な患者に投与することからなる、ＰＴＥＮの阻害方法。
【請求項６】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項５の方法。
【請求項７】
ＰＴＥＮ阻害剤を製造するための、請求項１に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の使用。
【請求項８】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項７の使用。
【請求項９】
式（Ｉ）：
【化２】
［式中、
Ｒはシクロアルキル基であり、Ａは低級アルキレン基であり、およびカルボスチリル環の３および４位の間の結合は単結合または二重結合を意味する］
のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩を活性成分として含むＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー。
【請求項１０】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項９のＭａｘｉ−Ｋチャンネルオープナー。
【請求項１１】
活性成分として請求項９に示す式（Ｉ）のテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物またはその塩、および通常の医薬的に許容される担体または希釈剤からなるＭａｘｉ−Ｋチャンネルを開口するための医薬組成物。
【請求項１２】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
神経系障害の治療用である、請求項１１または１２の医薬組成物。
【請求項１４】
該神経系障害がアルツハイマー病である、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項９に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の有効量を、治療が必要な患者に投与することからなる、Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口方法。
【請求項１６】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
神経系障害の治療のための請求項１５または１６の方法。
【請求項１８】
該神経系障害がアルツハイマー病である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｍａｘｉ−Ｋチャンネルの開口用薬剤の製造のための、請求項９に示すテトラゾリルアルコキシジヒドロカルボスチリル化合物（Ｉ）またはその塩の使用。
【請求項２０】
該活性成分が６−［４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ブトキシ］−３，４−ジヒドロカルボスチリルまたはその塩である、請求項１９の使用。
【請求項２１】
神経系障害の治療剤の製造のための、請求項１９または２０の使用。
【請求項２２】
該神経系障害がアルツハイマー病である、請求項２１の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２８５４５６（Ｐ２０１０−２８５４５６Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１８０６６１（Ｐ２０１０−１８０６６１）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【分割の表示】特願２００６−５０２６８３（Ｐ２００６−５０２６８３）の分割
【原出願日】平成１６年２月２４日（２００４．２．２４）
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８０６６１（Ｐ２０１０−１８０６６１）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【分割の表示】特願２００６−５０２６８３（Ｐ２００６−５０２６８３）の分割
【原出願日】平成１６年２月２４日（２００４．２．２４）
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
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