ＲＮアーゼＨ２複合体およびその遺伝子
ＲＮアーゼＩＩ２、即ち、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ及びＲＮＡＳＥＨ２Ｃのコンポーネントに関する遺伝子とともに、当該遺伝子にコードされるタンパク質を提供する。これらの遺伝子を含む組み換えポリヌクレオチドを、場合によってはベクターとして記載する。組み換えＲＮａｓｅＨ２も、試験物質又は修飾した（変異した）ＲＮａｓｅＨ２のコンポーネントの活性に対する影響を評価するアッセイとともに記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）Ｈ２のコンポーネントをコードする遺伝子、組み換えＲＮアーゼＨ２ならびにウイルス感染症や自己免疫疾患等を治療する目的により免疫反応を操作する上で有益なアゴニスト、アンタゴニストおよび調節因子を特定するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のリボヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ的切断を行う酵素複合体である。ＲＮアーゼＨは、分子生物学において頻繁に用いられており、ｃＤＮＡの逆転写を行った後にＲＮＡテンプレートの分解を行うために使用する。
【０００３】
ＲＮアーゼＨには、生化学的特徴が異なる２種類のクラス（１／Ｉおよび２／ＩＩ）が存在する。ＲＮアーゼＨ２は、ヒトおよび酵母のいずれにおいても細胞性ＲＮアーゼＨ活性の主要な働きを担っている。ＲＮアーゼＨ２は、ＤＮＡ複製におけるラギング鎖上の岡崎フラグメントからＲＮＡプライマーを除去する作用やＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖の単一リボヌクレオチドの切除に関わっていると考えられている。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、Ｒｎｈ２ＢｐとＲｎｈ２Ｃｐは、触媒サブユニットＲｎｈ２Ａｐと共精製し、両者があれば十分にＲＮアーゼＨ２活性を再構成することができる。ヒトでは、ＲＮアーゼＨ２の触媒サブユニットであるＲＮＡＳＥＨ２Ａが、生化学的精製法により特定されており、酵母オルソログと明確な配列相同性を有している。しかし、別のヒトタンパクであるＡＹＰ１（現在ではＲＮＡＳＥＨ２Ｃと呼ばれる。）がＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパクと共精製したものの（Frank et al., PNAS USA 95:12872-7, 1998）、酵母以外ではＲｎｈ２ＢｐおよびＲｎｈ２Ｃｐサブユニットのオルソログは、特定されていない。
【０００４】
アイカルディ・ゴーシェ症候群（ＡＧＳ）は、病因不明の常染色体遺伝性疾患である。ＡＧＳは、臨床的には、重度の神経障害、進行性小頭症、痙攣、ジストニア姿勢および精神運動発達遅滞として現れる。小児では、しばしば死に至る（Goutieres, Brain Dev 27:201-206, 2005）。ＡＧＳは、先天性脳ウイルス感染症と形質的に強い類似性を示し（Aicardi & Goutieres, Ann Neurol 15:49-54, 1984）、ＡＧＳで見られるＩＦＮ−αレベルの上昇も、ウイルス感染によりホストが示す免疫反応と類似している。そのため、文献ではＡＧＳの病因論に関し、見解の一致を見ていない。特に、ＡＧＳがウイルス性病原体に対する遺伝的感受性に起因するものであるのか、あるいはホストにおける免疫反応の調節機能の変異によるものであるのかという点では意見が分かれる。
【０００５】
Crowら（Am J Hum Genet 67:213-221, 2000およびJ Med Genet 4O:183-187, 2003）は、２つのＡＧＳ遺伝子座を特定したが、それは染色体３ｐ２１上のＡＧＳ１と染色体１３ｑ１４．３上のＡＧＳ２である（Ali et al., J Med Genet 43(5):444-50, May 2006. Epub 20th May 2005）。
【０００６】
本願発明者らは、ＡＧＳ２がヒトＲＮアーゼＨ２複合体のコンポーネントであることを発見し、この遺伝子を完全に特定した。ＡＧＳ２は、ユビキタスな発現パターンを示し、予測できるドメイン構造や機能が類推できるヒトパラログは見当たらなかった。離れたオルソログがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同定された（アミノ酸配列の相同性＜５％）。発明者らは、ＡＧＳ３およびＡＧＳ４遺伝子も特定した。この３種類のＡＧＳ遺伝子から発現したタンパク質は、合わせてＲＮアーゼＨ２複合体の一部分を構成する。
【０００７】
ＡＧＳは、ウイルス感染症と形質的な類似性が高いが、この類似性は脳に限らない。症例の中には、神経学的特徴以外の症状（血小板減少症、肝脾腫大、肝トランスアミナーゼ値の上昇）を示す場合もあり、ウイルス感染症と類似の症状を呈するその他の遺伝病と共通する部分のあることが示唆されている。
【０００８】
ＡＧＳと全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）との類似性も指摘されている（Alarcan-Riquelme, Nat Genet 38:866-867, 27th July 2006参照）。特に、ＳＬＥでは先端部に血管炎型の皮膚病変を呈するが、この場合、真皮表皮接合部には免疫グロブリンの沈着が見られる（Crow et al., Nat Genet 38:917-920, 2006参照）。最近報告された家族性皮膚エリテマトーデス症患者で同一の皮膚病変を示した症例では、共通してＡＧＳ１遺伝子に変化が見られた（Lee-Kirsch et al., Am J Hum Genet 79:731-737, 19 July 2006参照）。また、ＡＧＳでは、高ガンマグロブリン血症および自己抗体が報告されている（Crow et al., Nat Genet 38:917-920, 2006参照）。更に、ＳＬＥでは、ＣＳＦインターフェロンαレベルが上昇していることが、ループス脳炎および全身で認められている。頭蓋内基底核石灰化も、中枢神経ＳＬＥ患者の３０％ほどで起こっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明者らによる観察の結果、ＡＧＳ、ＳＬＥおよびウイルス感染症には、ＲＮアーゼＨ２に関係する病因が共通して存在する可能性が初めて考えられた。
【００１０】
重要なこととして、発明者らは、ＡＧＳ４遺伝子がＦ３９ファミリーにＧ３７Ｓ変異を起こしていることを特定した。この場合、患者はｐｓｅｕｄｏ−ＴＯＲＣＨ症候群およびＡＧＳ両方の病態を示し、これらの疾患には共通の分子的原因があることが示されている。（ｐｓｅｕｄｏ−ＴＯＲＣＨ症候群とは、小児がトキソプラズマ症、風疹、ＣＭＶおよびＨＳＶ感染症と類似した症状を呈する遺伝性疾患である。）それゆえ、ＲＮアーゼＨ２複合体の変異に起因する病態形質は、従来のＡＧＳよりもはるかに広いと考えられ、「先天性ウイルス感染症」を有する多くの症例に存在する遺伝的な原因が現在のところ認識されてない可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明は、配列番号１、３もしくは５の塩基配列またはそのホモログからなるポリヌクレオチドを提供するものである。配列番号１はＡＧＳ２（ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ）の塩基配列を示し、配列番号３は、ＡＧＳ３（ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ）の塩基配列を示し、ＳＥＱ ＩＮ Ｎｏ：５はＡＧＳ４（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）の塩基配列を示す。
これらのポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩに対して、ＮＭ＿０２４５７０（ＡＧＳ２／ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、従来はＦＬＪ１１７１２と命名されていた。）、ＡＦ３１２０３４（ＡＧＳ３／ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、従来はＡＹＰ１と命名されていた。）、ＮＭ＿００６３９７（ＡＧＳ４／ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）のアクセッション番号で報告されている（機能については不明）。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アイカルディ・ゴーシェ症候群における神経画像および臨床所見（ａ）基底核の石灰化を示す軸位ＣＴ像。（ｂ）白質、特に前頭葉に影響を及ぼす高シグナル強度を示すＭＲＩＴ２強調軸位像。比較用として、（ｃ）基底核の石灰化を示す先天性ＨＩＶ患者の軸位ＣＴ像（Belman et al., Neurology 36: 11 92-1 199 (1 986)より）。
【図２】ＡＧＳ２の必須領域およびＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（従来はＦＬＪ１１７１２と呼ばれた。）遺伝子の特定された突然変異の位置を示す図。（ａ）ＡＧＳ２遺伝子座を示す染色体１３ｑ１４.１の遺伝子地図。この遺伝子座は、非同族家系の同型接合染色体セグメントを重ね合わせることによって特定され、マイクロサテライトマーカーであるＡＣ１３７８８０ＴＧ１９とＤ１３Ｓ７８８との間に位置する。（ｂ）５７１ｋｂｐの必須領域の物理地図には、注釈情報の付いた４個の遺伝子が含まれる（UCSC Genome Browser May 2004アセンブリ）。（ｃ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪｌｌ７１２）は、１１個のエクソンを含む４７ｋｂｐの塩基配列により構成され、３０８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。コーディング領域を斜線で示す。突然変異の位置は、矢印で表示し、翻訳開始部位から数えた相対位置により示す。対応するアミノ酸の変化は、太字で示した。
【図３Ａ】ＡＧＳ３領域、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）遺伝子、その突然変異および他の種における配列の保存を示す図。（ａ）染色体１１ｑ１３．１の遺伝子地図。必須領域は、パキスタン人家族における連鎖不平衡データにより特定され、Ｄ１１Ｓ４２０５からＤ１１Ｓ９８７の間に位置する。ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）遺伝子は、マイナス鎖上のテロメアからセントロメアに向かうゲノム配列の６５．２Ｍｂｐの位置から１．４ｋｂｐの範囲にある。（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）遺伝子は、４個のエクソン（コーディング領域を斜線で表示。）を含み、１６４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。突然変異の位置は、矢印で表示し、翻訳開始部位から数えた相対位置により示す。対応するアミノ酸の変化は、太字で示した。（ｃ）両突然変異は、ほ乳類で保存されている残基で起こる。ほ乳類ＲＮＡＳＥＨ２Ｃタンパク質の領域中、変異部位近傍の配列。Hs, Homo sapiens（ヒト）; Bt, Bos Taurus（ウシ）; Cf Canis familiaris（イヌ）; Mm, Mus musculus（ハツカネズミ）; Rn, Rattus nowegicus（ラット）。 置換アミノ酸を配列の上に示す。
【図３Ｂ】（ｄ、ｅ）電気泳動法によるＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）突然変異部位の配列決定。（ｄ）ｃ．４２８Ａ＞Ｔ（ｅ）ｃ．２０５Ｃ＞Ｔ。
【図４Ａ】図４ ＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子、ゲノムの位置、ゲノム構造および突然変異の位置。（ａ）染色体１９ｐ１３．１３の遺伝子地図。ＲＮＡＳＥＨ２Ａは、同族の又いとこの親から生まれた２人の子どもの患者（ファミリーＦ３９）が同型接合ＳＮＰｓ（ＳＮＰ Ａ−１５０９３６１、１６０６３２７、ｌ６０６３２５）を有する領域にあり、ＳＮＰ Ａ−１５１５９５０およびＡ−１５０８０１８と遺伝的に関連する可能性がある領域を規定する。（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａの遺伝子構造。ＲＮＡＳＥＨ２Ａは、ゲノム配列の１２．８Ｍｂｐの位置（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｍａｙ ２００４アセンブリ）から７ｋｂｐにわたって存在する。８個のエクソンを含み、２９９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。（ｃ）Ｇ３７Ｓ変異は、バクテリアからヒトにいたるまで広範囲に保存されている残基で発生する。Hs, Homo sapiens（ヒト）; Bt, Bos Taurus（ウシ）; Cf Canis familiaris（イヌ）; Mm, Mus musculus（ハツカネズミ）; Rn, Rattus nowegicus（ラット）；Ce, Caenorhabditis elegans（カンセンチュウ）; Sp, Schizosaccharomyces pombe（分裂酵母）; Sc, Saccharomyces cerevisiae（出芽酵母）; Ec, Escherichia coli（大腸菌）; Ph, Pyrococcus horikoshii（超好熱菌）。
【図４Ｂ】（ｄ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａ突然変異部位の電気泳動結果。（ｅ）２型ＲＮアーゼＨタンパク質の決定した結晶構造をモデルにして推定したＲＮＡＳＥＨ２Ａ触媒部位の三次元構造。突然変異を起こしたＧ３７残基（中心）は、活性部位および基質結合部位と考えられるアミノ酸残基の近傍に位置する（Chapados et al., J Mol Biol 307:541-556 (2001 )）。
【図５Ａ】ヒトＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＹＪ１１１７１２）、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）およびＲＮＡＳＥＨ２Ａは、ほ乳類細胞中で発現すると、酵素活性を有するＩＩ型リボヌクレアーゼＨ複合体を形成する。（ａ）ヒトＲＮアーゼＨ２複合体およびそれに対応するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの複合体の模式図。（ｂ）Ｔ７エピトープのタグを付けたＦＹＪ１１７１２およびＡＹＰ１は、ｍｙｃタグが付いたＲＮＡＳＥＨ２Ａと免疫共沈降（ＩＰ）する。（ｃ，ｄ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａ／Ｂ／Ｃ複合体は、リボヌクレアーゼＨ活性を示す。
【図５Ｂ】（ｃ）３種類のオリゴヌクレオチドのヘテロ二本鎖により、酵素活性を調べた。オリゴＣは、３’末端蛍光タグ付きＲＮＡオリゴヌクレオチドと、それに相補的な５’末端ＤＡＢＣＹＬ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしたもので、いかなるリボヌクレアーゼＨでも分解可能な基質である（ＤＡＢＣＹＬは、酵素により分解され、蛍光標識した３’末端フラグメントと分離するまで、蛍光を消光する。）。オリゴＢは、ＩＩ型リボヌクレアーゼＨのみが分解可能な基質である。これは、３’末端蛍光標識したオリゴヌクレオチド鎖の１５番目が１個のリボヌクレオチドに置き換わっているＤＮＡ二重鎖である。オリゴＡは、オリゴＣ同様のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであるが、酵素による分解を受けない。３’末端蛍光標識オリゴヌクレオチドが２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチドにより合成されているからである。
【図５Ｃ】（ｄ）ＩＩ型リボヌクレアーゼＨ活性は、エピトープタグの付いたＲＮＡＳＥＨ２Ａ／Ｂ／Ｃを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液を用いた免疫沈降により測定することができる。ｍｙｃ ＩＰは、マウス抗ｍｙｃ抗体により測定し、免疫沈降の対照として、ＩｇＧ ＩＰを正常なマウスＩｇＧ免疫グロブリンを用いて行った。ベクターとは、ｐＣＧＴ−ＤｅｓｔおよびｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓベクターにより形質導入を行った細胞を言う。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図６】ＲＮＡＳＥＨ２Ａの突然変異は、ＲＮアーゼＨ活性を低下させる。（ａ）野生型タグの付いたＲＮＡＳＥＨ２ＢとＲＮＡＳＥＨ２Ｃとを組み合わせて、ＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパク質変異体による共導入を行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したＲＮアーゼＨ２複合体の免疫沈降結果。ＲＮＡＳＥＨ２ＡのＧ３７Ｓ突然変異は、複合体形成の障害とはならないことが示される。Ｉｎは「インプット」、ＩＰは「免疫沈降」、ＷＴは「野生型」を表す。（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａの突然変異は、酵素活性を低下する。（ａ）に示した免疫沈降複合体と同じサンプルに対する蛍光ＲＮアーゼＨ活性アッセイ。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図７】非同族の２家族におけるマイクロサテライトジェノタイピングにより、ＡＧＳ２必須区間を限定する。同型接合マーカー領域を線で囲んである。
【図８Ａ】代表的な真核生物の（ａ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ／Ｒｎｈ２Ｂｐホモログの配列。ＡＧＳ患者において置換されたアミノ酸は、黒地に白抜きの文字で示し、置換したアミノ酸をその上方に示す。ヒトＡＹＰ１とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｈ２Ｃｐとの相同性を調べるために用いたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ のアミノ酸配列は、（ｂ）に示した。アラインメントは、ＣＨＲＯＭＡソフトウェア（Goodstadt et al., Bioinformatics 17:845-846 (2001)）を用いて行い、真核生物におけるコンセンサスシークエンスの割合を８０％とした。アラインメントから除外された残基は、カッコで示した。ハイフン（−）は、配列表示の目的で使用しており、欠落しているアミノ酸を示すものではない。ＧＩ番号を配列の右に示す。コンセンサス配列の記号は、以下の通りである。ａ：芳香族（ＦＨＷＹ）、ｂ：大きい（ＥＦＨＩＫＬＭＱＲＷＹ）、ｃ：有電荷（ＤＥＨＫＲ）、ｈ：疎水性（ＡＣＦＧＨＩＬＭＴＶＷＹ）、ｌ：脂肪族（ＩＬＶ）、ｐ：極性（ＣＤＥＨＫＮＱＲＳＴ）、ｓ：小さい（ＡＣＤＧＮＰＳＴＶ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＳＴ）、＋：プラスに帯電（ＨＫＲ）、−：マイナスに帯電（ＤＥ）。種の略号は、以下の通りである。Ａｇ：Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、Ａｍ：Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ、Ａｎ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｂｔ：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｃａ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｅ：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃｆ：Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｃｇ：Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃｐ：Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｄｄ：Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｄｈ：Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄｍ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｄｒ：Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、Ｅｇ：Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｇｚ：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ、Ｈｓ：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ＫＩ：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｗ：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ、Ｍｍ：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｎｃ：Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｏｓ：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｒｎ：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｓｂ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｓｃａ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ、Ｓｃｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｋｌ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｋｕ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｓｍ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ、Ｓｐａ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓｐｏ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｔｂ：Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｃ：Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｔｎ：Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｘｔ：Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＹＩ：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ。
【図８Ｂ】代表的な真核生物の（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ／Ｒｎｈ２Ｃｐホモログの配列。その他は図８Ａと同様。
【図９】染色体１１ｑ１３．２のＡＧＳ３遺伝子地図。アジア系６家族におけるマイクロサテライトジェノタイピング結果。先祖のハプロタイプと考えられるものを太字で示し、同型接合マーカー領域を線で囲んだ。
【図１０】ポリイノシン−ポリシトシン（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））処理したＨＣＴ１１６細胞のＲＮアーゼＨ活性アッセイ。Ａ：酵素耐性のあるオリゴヌクレオチド基質、Ｂ：ＲＮアーゼＨ２特異的基質、Ｃ：リボヌクレアーゼＨ基質。
【図１１】ヒツジ由来の抗ＲＮアーゼＨ２Ａ／Ｂ／Ｃ複合体に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体をＨｅＫ２９３細胞溶解物に反応させたウェスタンブロッティング。ここで、ＲＮアーゼＨ２Ａ／Ｂ．Ｃ複合体タンパク質は、エピトープタグ付きベクターにより過剰発現させてある。抗体により、過剰発現したタグ付きほ乳類ＲＮアーゼＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ２Ｃ（下の方に見える２本の線）の検出が可能である。＊は内因性物質によると思われるバンドである。
【図１２】ＥＳ細胞に導入したＲＮＡＳＥＨ２ＢＡ１７７Ｔ ターゲティングコンストラクトの模式図。ターゲティングコンストラクトは、ＲＮアーゼＨ２Ｂ遺伝子座由来の同型配列の２．５ｋｂアームの他、エクソン６と７の間にＬｏｘＰ配列（三角で表示）に挟まれたネオマイシン抵抗遺伝子カセットが挿入されてできている。ヌクレオチドの変化（矢印で表示）が導入されたことにより、ＡＧＳ患者によく見られるコドン１７７におけるアラニンからトレオニンへの変異が生じる。このコンストラクトは、ＡＧＳのノックインマウスモデルを作成するために行う胚盤胞移植に現在用いられているＥＳ細胞株を作成するための相同組換えに用いられている。
【図１３】ＡＧＳ患者の不死化リンパ芽球様細胞株の野生型ＬＣＬ（ＷＴ ＬＣＬ）、ＲＮアーゼＨ２Ａ Ｇ３７ＳおよびＲＮアーゼＨ２Ｂ Ａ１７７Ｔに対するＲＮアーゼＨ２活性キネティックアッセイ。ＲＮアーゼＨ２サブユニットに同型接合性変異を示す細胞株では、野生型リンパ芽球様細胞株（ＷＴ）と比較して、酵素活性が弱くなっている。
【図１４】ＡＧＳ患者のリンパ芽球様細胞株においてＲＮアーゼＨ２酵素活性が低下していることを示すエンドポイント蛍光ＲＮアーゼＨアッセイ。
【図１５】ａ：可溶性組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質複合体のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法。ｂ：組換えＧＳＴ、野生型ＧＳＴ−ＲＮアーゼＨ２複合体およびＡサブユニットにＧ３７Ｓ変異を有するＧＳＴ−ＲＮアーゼＨ２複合体による酵素活性。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ここで、ポリヌクレオチドの「ホモログ」とは、ポリヌクレオチドに対して核酸の欠失、置換または付加による修飾を行い、配列番号１、３または５に示す塩基配列に対して、少なくとも６５％以上の相同性、例えば、少なくとも７０％や、例えば、少なくとも７４％の相同性を有するものを言う。一つの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５に示す塩基配列に対し、７５％や８０％以上の相同性を有し、好ましくは８５％の相同性を有する。「ホモログ」には、オーソロガス遺伝子を含む。この遺伝子は、異なる種属における等価な遺伝子を言う。
【００１４】
一つの実施態様では、ホモログは、配列番号１、３または５に示す塩基配列に対し、ダイレクトシークエンスや配列比較で評価した場合、９０％以上の相同性を有し、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する。
【００１５】
配列の相同性は、ダイレクトベストフィットシークエンスアラインメント比較法やＢＬＡＳＴなどの任意の相同性検索アルゴリズムによって、決定することができる。ＢＬＡＳＴの解説は、Altschul et al., in J Mol Biol 25:403 (1990)に記載されている。アラインメントの相同性スコアＳは、置換スコアとギャップスコアの和として計算される。「実質的な相同性」とは、ＢＬＡＳＴで評価した場合に、期待値（Ｅ）が低い場合を言う。期待値とは、Ｓと同等以上のスコアを有するアラインメントであって、データベース検索を行った場合偶然に検出されるアラインメントの数を示す。Ｅ値が低いほど、重大な意味を持つ。
【００１６】
特に、発現するアミノ酸に影響を及ぼさない塩基配列への修飾（遺伝子コードの重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）によるもの）は、「ホモログ」の定義に該当する。また、「ホモログ」には、配列番号１、３または５の任意の配列のうちの１５個の連続した塩基を有するポリヌクレオチドと、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが該当する。一つの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５の任意の配列のうちの２０個以上の連続した塩基（例えば、２５〜５０の連続した塩基）を有するポリヌクレオチドと、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする。
【００１７】
ポリ核酸の安定なハイブリダイゼーションは、水素結合による塩基対形成によって起こる。水素結合による塩基対形成は、二本鎖構造に含まれる２本のポリヌクレオチド鎖の相補性の程度およびハイブリダイゼーションが起こる条件によって、影響を受ける。特に、塩濃度および温度は、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす。当業者であれば、ポリヌクレオチド二重鎖の有効な溶融温度（Ｅ Ｔｍ）は、以下の式で示されることは自明であろう。
ＥＴｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇＭ［Ｎａ＋］）＋
０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ホルムアミド）
【００１８】
ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下で行われる場合、相補性が高い塩基対の配列のみが二重鎖として残る。ここで、ハイブリダーゼーションに関して「ストリンジェントな条件」とは、６０℃から６８℃の０．１×ＳＳＣで洗浄することを言う。洗浄条件には、適切な濃度のＳＤＳを任意に加えて良く、例えば、０．１％ＳＤＳを加えて良い。
【００１９】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一重鎖であっても二重鎖であってもよい。二重鎖ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）は、ほとんどの場合において、通常便宜良く応用することができる。ポリヌクレオチドは、ベクターの形であってよく、例えば発現ベクターであってよい。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、分離したポリヌクレオチドであっても、組換えポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、発現ベクターやクローニングベクターに取り込むことができる。このようなベクターは、宿主細胞の形質移入や形質転換を行うために用いることができ、宿主細胞は、従来の培養培地を用いて、公知の方法に従い、培養されたものであってよい。
【００２１】
クローンＤＮＡを適切なベクターに取り込む方法、宿主細胞の形質移入や形質転換の方法および形質移入や形質転換を行った細胞の選別方法は、すべて当業者には公知であり、多数の適切な方法が、文献に記載されている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001参照）。
【００２２】
適切な宿主細胞には、バクテリア、酵母、昆虫、ほ乳類および植物の細胞が含まれる。通常、宿主細胞には、使用するベクターに適合性のものが選択される。
【００２３】
一つの実施態様では、宿主細胞は、ヒトまたはヒト以外のＥＳ細胞であってよい。
別の態様では、本発明は、変異型ＲＮアーゼＨ２を発現するリンパ芽球様細胞株を提供する。
【００２４】
タンパク質（例えば、ＲＮアーゼＨ２Ａ、ＲＮアーゼＨ２Ｂ、ＲＮアーゼＨ２Ｃ）に関し「変異型」とは、野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を言う。ＲＮアーゼＨ２Ｂの野生型配列は配列番号２に、ＲＮアーゼＨ２Ｃの野生型配列は配列番号４に、ＲＮアーゼＨ２Ａの野生型配列は配列番号６に示してある。
【００２５】
変異型タンパク質は、野生型タンパク質とは異なる機能や活性を示すことができるが、これは本質的なことではない。タンパク質複合体（例えば、ＲＮアーゼＨ２）に関し「変異型」とは、複合体を構成するタンパク質のうち少なくとも１つが先に定めた変異型タンパク質である複合体を言う。変異型タンパク質複合体は、野生型複合体とは異なる機能や活性を示すことができるが、これは本質的なことではない。
【００２６】
一つの実施態様では、本発明は、配列番号１に示す塩基配列またはそのホモログからなる組換えポリヌクレオチドおよびその配列によりコードされるタンパク質を提供する。
【００２７】
一つの実施態様では、本発明は、配列番号３に示す塩基配列またはそのホモログからなる組換えポリヌクレオチドおよびその配列によりコードされるタンパク質を提供する。
【００２８】
一つの実施態様では、本発明は、配列番号５に示す塩基配列またはそのホモログからなる組換えポリヌクレオチドおよびその配列によりコードされるタンパク質を提供する。
更に別の態様では、本発明は、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
【００２９】
ここで、タンパク質の「ホモログ」とは、タンパク質に対してアミノ酸の欠失、置換または付加による修飾を行い、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％以上の相同性、例えば、少なくとも６６％や、例えば、少なくとも７０％の相同性を有するものを言う。一つの実施態様では、タンパク質は配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％の相同性または８０％の相同性、好ましくは８５％の相同性を有する。一つの実施態様では、ホモログは、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列に対し、９０％以上の相同性を有し、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する。「ホモログ」には、異なる種属由来のオーソロガスタンパク質を含む。
【００３０】
また、本発明は、配列番号１、３もしくは５のうちの任意の塩基配列またはそのホモログによってコードされるタンパク質を提供する。塩基配列は、ポリヌクレオチドの一部であってよく、そのポリヌクレオチドは任意の組換えポリヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドの一部を形成することができ、更にベクターの一部を形成することができる。
【００３１】
一つ実施態様では、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
一つ実施態様では、本発明は、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
【００３２】
一つ実施態様では、本発明は、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
一つの実施態様では、本発明のタンパク質は、キメラ（融合）タンパク質の一部を形成することができる。
【００３３】
明確にしておくが、本明細書で使用される「タンパク質」とは、ペプチドまたはポリペプチドも意味し、ポリマーの特定の大きさについて示すものではない。
【００３４】
更に別の態様では、本発明は、ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５の塩基配列によってコードされるタンパク質またはそのホモログと
ｉｉ）配列番号２、配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログとからなる
ことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体を提供する。
【００３５】
一つの態様では、本発明は、ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号1の塩基配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｂまたは配列番号２のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、
ｉｉ）配列番号３の塩基配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｃまたは配列番号４のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、
ｉｉｉ）配列番号５の塩基配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ａまたは配列番号６のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ａのうち少なくとも１つを含む
ことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体を提供する。
【００３６】
一つの実施態様では、コンポーネントｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）のうち、少なくとも２つが含まれる（例えば、ｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｉ）、あるいはｉｉ）とｉｉｉ））。一つの実施態様では、３つのコンポーネントｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）がすべて含まれる。複合体の他のコンポーネントも任意に含まれてよい。
【００３７】
組換えＲＮアーゼＨ２複合体は、分子生物学で有用であり、特にｃＤＮＡ生産その他のプロセスでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを分解したり抑制するプロセスにおいて有用である。また、単一または複数のリボヌクレオチドが埋め込まれたＤＮＡ二重鎖を開裂する場合にも有用である。組換えＲＮアーゼＨ２複合体は、複合体の基質特異性や活性を変化させることができる化合物を特定するアッセイにも有用である。複合体の活性を変化させることができる化合物は、コンポーネントの任意の一つまたは複合体全体に対して作用する活性化因子（アゴニスト）や不活性化因子（アンタゴニスト）である場合がある。あるいは、酵素活性を変化させることができる化合物は、ＲＮアーゼＨ２の上流調節因子に対して作用する場合がある。アッセイは、細胞アッセイであってもよく、タンパク質アッセイであってもよい。複合体の１以上のコンポーネントは、例えば、ＡＧＳ４遺伝子のＧ３７Ｓのように、野生型から任意に突然変異を起こしていてもよい。このような突然変異が複合体の活性やその基質特異性に対して及ぼす影響については、アッセイにより評価することができる。
【００３８】
また、コンポーネントｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）のうちの任意の１つは、分子生物学やアッセイにおいて、残りの２つのコンポーネントのうちの１つまたは両方とは独立して使用することができる。
【００３９】
ＲＮアーゼＨ２は、細胞中においてＲＮアーゼＨ活性の主要な働きを担っているため、この酵素の活性が低下することによって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの代謝に依存する細胞プロセスに対して重大な影響を及ぼし、自己免疫疾患の病因を引き起こす原因となっていると考えられる。そのような自己免疫疾患には、ＡＧＳやＳＬＥの他、細菌感染症、特にウイルス感染症が含まれるが、それに限定されるものではない。細菌感染症には、その他、バクテリア感染症や真菌感染症がある。ウイルス感染症に関しては、特に、パンデミックウイルス感染症について言及する必要がある。例えば、インフルエンザウイルスによるパンデミックがあり、先天性免疫反応が不適切な不活性化作用を受けることにより、高い死亡率につながる。
【００４０】
ＲＮアーゼＨ２は、ラギング鎖のＤＮＡ複製過程において、岡崎フラグメントのＲＮＡプライマーを除去する働きに関与していると提唱されている。Ｒｎｈ２を欠失したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、生存能力に影響は生じないものの、ヒドロキシウレアに対する感受性が高くなる。
【００４１】
ＲＮアーゼＨ２は、１型ＲＮアーゼＨと異なり、ＤＮＡ中に埋め込まれた単一リボヌクレオチドを認識することができる。それゆえ、この酵素は、ゲノムＤＮＡ中に不適切に取り込まれたリボヌクレオチドを認識し、処理する上で重要である。このような誤った取り込みは、ｄＮＴＰが欠損した状態で頻繁に起こるが、このことは、Ｒｎｈ２突然変異株でヒドロキシウレアに対する感受性が高いことに対する別の説明を提供している。
【００４２】
一本鎖ＲＮＡが二重鎖ＤＮＡのうちの１本と結合すると、もう１本のＤＮＡ鎖は、一重鎖ＤＮＡの「Ｒ−ループ」を形成して移動する。このようなループは、真核細胞における転写後にＲＮＡ結合タンパク質の機能が阻害されたときにも起こる。ＲＮアーゼＨには、このような構造が起こることを抑制するとともに、その結果生じるゲノムＤＮＡの不安定性を抑制する働きがあると考えられている。
【００４３】
それゆえ、ＲＮアーゼＨ活性が失活することは、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ中に誤って取り込んだリボヌクレオチドの除去やＲ−ループ形成の抑制に関して、重大な結果をもたらす可能性がある。
【００４４】
逆転写は、ＨＩＶその他のレトロウイルスの複製に不可欠なプロセスであり、抗ウイルス療法の重要な薬剤標的である。このプロセスで形成するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、内因性ＲＮアーゼＨによる崩壊を起こす可能性があるため、抗ウイルス作用において重要な働きをすることができる。よって、ＲＮアーゼＨ２の突然変異により、ホストの抗ウイルス防御反応に障害が生じ、通常のウイルス病原菌の結果としてＡＧＳが引き起こされる場合が考えられる。
【００４５】
あるいは、免疫不全がＡＧＳ、ＳＬＥの原因であることも考えられ、細胞性ＲＮアーゼＨ活性の低下により内因性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドレベルが上昇している場合には、免疫不全が、自己免疫疾患や細菌感染症に関して重要な作用を及ぼしている可能性がある。ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡは、自然免疫の活性因子であって、Ｉ型インターフェロンの生産を活性化する（Kawai et al., Nat lmmunol 7:131-137, 2006およびKrieg et al., Annu Rev lmmunol 20:709-760, 2002を参照）。その他のヌクレアーゼが損傷を受け、死細胞から細胞外に放出される核酸を除去する機能が低下することにより核酸が循環する結果として、多系統自己免疫疾患が引き起こされる可能性が考えられている。これを支持する証拠としては、ＳＬＥ患者にはＤＮアーゼ１に異型接合突然変異が見られる場合があることや、ＤＮアーゼ１-/-マウスが紅斑様表現型を示すことが挙げられる（Napirei et al., Nat Genet 25:177-181, 2000参照）。更に、ＤＮアーゼＩＩ-/-|ｆｎＲ-/-マウスが関節リウマチに似た慢性多発性関節炎を示すことが最近報告されており（Kawane et al., Nature 443:998-1002, October 2006参照）、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが自然免疫を刺激し、ＡＧＳの診断に有用な高インターフェロンα濃度が上昇する理由の説明を示すと考えられている。ＲＮアーゼＨ２機能の障害も同様に、内因性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの濃度を上昇させ、その濃度上昇がｄｓＲＮＡやｄｓＤＮＡの場合と同様の機序によりインターフェロンαの産生を刺激することがある。以上のことから、中枢神経系に過剰に生産されたインターフェロンαによって、ＡＧＳの神経病理上の特徴を説明することができるが、それはトランスジェニックマウスモデルで示されており、このモデルでは神経膠細胞にインターフェロンαが常に発現している（Campbell et al., Brain Res 835146-61, 1999参照）。
【００４６】
ＳＬＥと自己免疫疾患との関連性は、最近の研究において示されており、例えば、Kelly et al., Arthritis Rheum 54:1557-1567, 2006では、ｄｓＲＮＡがＴＬＲに結合することによってＩＦＮの産生が起こることを示し、Lovgren et al., Arthritis Rheum 50:1861-1872, 2004では、ａｎｔｉ−ＲＮＡ ＡｂがＩＦＮ誘導に必要なことをｉｎ ｖｉｔｒｏＳＬＥアッセイで示しており、Sigurdsson et al. Am J Hum. Genet. 76:528-537, 2005においては、ＳＬＥがＩＦＮ経路の機能障害により生じること、そしてGraham et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 104:6758-6763, 2007では、ＩＦＮ調節因子の突然変異とＳＬＥリスク増加との関連性を示している。
【００４７】
最近の説では、インフルエンザに対する自然免疫反応にＳＬＥと共通の病因が見られることが報告されている。例えば、Cheung et al., Lancet 360:1831-1837, 2002では、ＴＮＦ―αの上昇はＨ５Ｎ１／９７型による病態の悪化に関連していることを示しており、Kobasa et al., Nature 445:3l9-323, 2007では、非ヒト霊長類において１９１８年型インフルエンザウイルスに対して非定型自然免疫反応が見られたことが報告され、Lipatov et al., Journal of General Virology 86:1121-1130, 2005は、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザに感染させた９種類のモデルにおいてサイトカインのバランスが崩れたことを示している。
【００４８】
従って、ＲＮアーゼＨ２の活性や基質特異性を変化させることができる化合物を提供することは、以下の目的において有益である：
ａ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、ＡＧＳの症状を抑えること。
ｂ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、微生物感染症を抑えること。なかでもバクテリア感染症やウイルス感染症があるが、これに限定されるものではない。レトロウイルス感染（ＨＩＶ感染等）については、特段の言及を要するが、この場合には、宿主細胞でウイルス複製が起こる際にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成される。また、インフルエンザのパンデミック株についても言及を要するが、例えば１９１８年型インフルエンザウイルス株やＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルス株のような死亡率が高いウイルス株では、自然免疫反応の活性化が不十分であることが示唆されている（Cheung et al., The Lancet 360:1831-1837, 2002およびLipatov et al., Journal of General Virology 86: 1121-1130, 2005参照）。
ｃ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、ゲノムＤＮＡの不安定度を低くすること、特にＲ−ループ形成を抑制すること。
ｄ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、自己免疫疾患を抑えること。自己免疫疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、セリアック病、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、アジソン病、関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症があるが、これらに限定するものではない。
ｅ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、ｃＤＮＡの生産等、複合体による分子生物学的反応の効率を高めること。
ｆ）ＲＮアーゼＨ２活性を下げて、ウイルスを用いた遺伝子治療の効率を高めること。（ＲＮアーゼＨ２活性は、この治療法の有用性を阻害するホスト応答の一部を形成する。ＲＮアーゼＨ２活性を下げることにより、このホスト応答を少なくとも一部分抑制することにつながる。）
ｇ）ＲＮアーゼＨ２活性を下げて、ウイルス感染に対するホスト免疫反応を刺激すること（Akwa et al., J. Immunol 161:5016-26, 1998参照）。
【００４９】
更に、本発明では、ＲＮアーゼＨ２もしくはそのコンポーネントの活性化因子もしくは不活性化因子またはＲＮアーゼＨ２基質特異性の調節因子を特定するアッセイを提供し、当該アッセイは：
ｉ）被験物質とＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントと接触させ、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａまたはその任意の組み合わせである；
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、該被験物質存在下任意の時間にわたって測定する；及び
ｉｉｉ）該被験物質のＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントに対する活性を測ることを含む。
【００５０】
このアッセイは全てのＲＮアーゼＨ２複合体に対して実施することができ、その複合体は、上述の組換え複合体であってもよい。あるいは、このアッセイを修正して、ＲＮアーゼＨ２複合体のコンポーネントに対して実施することができ、そのコンポーネントは、例えば組換え体であるＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａであってもよい。
【００５１】
また、上述のアッセイは、被験物質とＲＮアーゼＨ２の変異体またはその変異コンポーネント（例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢもしくはＲＮＡＳＥＨ２Ｃまたはその組み合わせ）とを接触させて実施してもよい。ＲＮアーゼＨ２の変異体またはそのコンポーネントは、リンパ芽球様細胞株のような細胞株やげっ歯類のような非ヒトトランスジェニック動物で発現してもよい。
【００５２】
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２複合体は、細胞内に存在する。
一実施態様では、アッセイは、炎症調節因子に対して実施してよく、その調節因子は、向炎症性でも抗炎症性でもよい。一実施態様では、アッセイは、抗微生物（例えば、抗ウイルス）因子を特定するために実施してよい。
【００５３】
そのアッセイは、内因性ＲＮアーゼＨ２活性を測定する細胞系アッセイであってよい。このアッセイは、ＲＮアーゼＨ２またはＲＮアーゼＨ２の上流にある経路に対して間接的に作用する調節因子を特定することができる。このアッセイは、ウイルスのＲＮアーゼＨもしくはほ乳類（例えばヒト）のＲＮアーゼＨ２の不活性化因子または阻害因子の作用を測定するうえで有用であるが、それは、このような不活性化因子や阻害因子が、ウイルスＲＮアーゼＨのみに対して特異性があれば、有効な抗ウイルス療法となりうるからである。ここで述べたようなＲＮアーゼＨ２複合体に作用すると推定されるこのような抗ウイルス因子は、その効果、特にほ乳類ホストに対する副作用と考えられる範囲を生体内で測定する上で重要である。
【００５４】
前記アッセイの工程ｉｉ）は、例えば、標識化オリゴヌクレオチド基質を導入することにより、行うことができる。一実施態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２で分解すると、蛍光タグを放出する。分解を受けていないオリゴヌクレオチドは、もう一方の塩基鎖上の近傍にクエンチャ分子が存在するため、蛍光を発しない。このようにして、蛍光強度はＲＮアーゼＨ２活性の指標となる。この実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの基質として作用する。このオリゴヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡであっても、二重鎖ＲＮＡであっても、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子であってもよい。
【００５５】
工程ｉｉｉ）は、被験物質が存在しない同一の条件下におけるＲＮアーゼＨ２活性と比較することによって、行うことができる。
【００５６】
このアッセイは、一定の時間にわたって行うことができ（すなわち、動態アッセイ）、例えば、１０分から６０分間実施することができる。ＲＮアーゼＨ２活性の測定は、測定中、適当な時間間隔（好ましくは、一定の間隔）で行うことができ、例えば、２分から２０分間隔で実施することができる。一実施態様では、アッセイを３０分にわたり実施し、活性測定を５分ごとに行う。
【００５７】
更に、本発明は、ＲＮアーゼＨ２の一以上のコンポーネントにおける修飾（例えば、アミノ酸変異）の影響を測定するアッセイを提供し、当該アッセイは：
ｉ）少なくとも１つのコンポーネントが野生型に対して変異型であるＲＮアーゼＨ２を提供する；
ｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２とそれに対する基質とを接触させる；
ｉｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２の活性を、任意の時間にわたって測定する；及び、
ｉｖ）修飾されたコンポーネントがＲＮアーゼＨ２活性に及ぼす影響を測定すること含む。
【００５８】
一実施態様では、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂの野生型は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃの野生型は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ＲＮＡＳＥＨ２Ａの野生型は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００５９】
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２は、組換え体である。
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２は、リンパ芽球様細胞株のような細胞株で発現する。あるいは、ＲＮアーゼＨ２は、非ヒトトランスジェニック動物で発現することができる。
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２複合体は、細胞内に存在する。
【００６０】
上述アッセイの工程ｉｉ）は、例えば、標識化オリゴヌクレオチド基質を導入することにより、行うことができる。一実施態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２で分解すると、蛍光タグを放出する。分解を受けていないオリゴヌクレオチドは、もう一方の塩基鎖上の近傍にクエンチャ分子が存在するため蛍光を発しない。このようにして、蛍光強度はＲＮアーゼＨ２活性の指標となる。この実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの基質として作用する。このオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドが埋め込まれた二重鎖ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子であってもよい。
【００６１】
工程ｉｉｉ）は、被験物質が存在しない同一の条件下におけるＲＮアーゼＨ２活性と比較することによって、行うことができる。
【００６２】
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２複合体の修飾コンポーネントのアッセイは、その他のコンポーネントの存在下、非存在下で実施する。このような実施態様では、例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ（ＡＧＳ４）Ｇ３７ＳやＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＡＧＳ２）Ａ１７７Ｔのように、機能性に影響を及ぼすＲＮアーゼＨ２コンポーネント変異型を使用することが有益である場合があり、アッセイを実施することにより、ＲＮアーゼＨ２活性の回復を調べることができる。あるいは、アッセイを実施することにより、ＲＮアーゼＨ２活性の低下を調べることができる。あるいは、アッセイにより、ＲＮアーゼＨ２の基質特異性の変化を調べることができる。
【００６３】
このアッセイは、一定の時間にわたって行うことができ（すなわち、動態アッセイ）、例えば、１０から６０分間実施することができる。その場合、ＲＮアーゼＨ２活性の測定は、測定中、適当な時間間隔（好ましくは、一定の間隔）で行うことができ、例えば、２分から２０分間隔で実施することができる。一実施態様では、アッセイを３０分にわたり実施し、活性測定を５分ごとに行う。
【００６４】
ＲＮＡＳＥＨ２ノックアウトマウスを標準的な手法により作成することができる。このようなマウスに対して、Akwa et al., J Immunology 161:5016-5026 (1998) に示すように、ＩＦＮ−αを発現するトランスジェニックマウスで実施する方法に従ってウイルスでチャレンジを行った後、ほ乳類動物ＲＮアーゼＨ２のアゴニストを検査する目的で使用し、任意に上述のアッセイによりｉｎ ｖｉｖｏで検査を行い、ウイルスの作用が改善したかどうかを確認することができる。このようなノックアウトマウスは、本発明の一部分である。
【００６５】
別の態様では、本発明は、患者のゲノム中のＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子における突然変異を検出するアッセイが提供され、当該アッセイは：
ｉ）患者から採取した白血球細胞の溶解を行うこと、及び、
ｉｉ）溶解した白血球細胞のＲＮアーゼＨ２活性を測定することを含む。
【００６６】
検出する突然変異は、ＲＮアーゼＨ２活性に影響を及ぼす突然変異であって、その活性を野生型複合体の通常範囲に対して抑制または亢進するものである。
【００６７】
場合によって、通常範囲と比較してＲＮアーゼＨ２活性の低下または亢進が認められた場合には、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子の配列決定を実施することができる。
【００６８】
このアッセイは、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａの任意の遺伝子に異型または同型接合型突然変異によりＲＮアーゼＨ２活性が低下している患者を特定するので、ＡＧＳの診断上の補助としたり、あるいは子どもがＡＧＳ患者になるリスクがある親に対して適切なカウンセリングを行う上で用いることができる。このアッセイは、自己免疫疾患、先天的ウイルス感染症や（ＲＮアーゼＨ２活性の低下により）ウイルス感染の危険性が高い人に対して、診断治療を行う上でも有益となりうる。
【００６９】
同様に、このアッセイによって、ＳＬＥその他の自己免疫疾患患者や、子どもがＳＬＥその他の自己免疫疾患に罹患するリスクがある患者を特定することもできる。更に、このアッセイは、ウイルス感染症の程度に関する情報を提供したり、ウイルス感染症の診断補助として用いたり、微生物感染症に罹患しやすい患者を特定するために用いることができるが、特にウイルス感染症に限定されるものではない。
【００７０】
別の実施態様では、ＲＮアーゼＨ２活性を測定するこのアッセイは、患者から得られた遺伝子サンプルの遺伝子型を特定することのみによって実施することができ、その方法には、フィンガープリント法やサテライト法、あるいはゲノム中の関連部分の塩基配列を特定する方法がある。得られた遺伝子情報は、ＲＮアーゼＨ２活性が変化している患者を特定し、ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患、細菌感染症に対する罹患しやすさを診断し、または遺伝的リスクやその傾向を特定するための補助として用いることができる。
【００７１】
更に別の態様では、本発明には、配列番号１、３もしくは５のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質もしくはそのホモログ、配列番号２、４もしくは６のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはそのホモログもしくは上述の組換えＲＮアーゼＨ２複合体と特異的に結合することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体が含まれる。ＲＮアーゼＨ２複合体コンポーネントの内の任意の１つの変異体（例えば、ＲＮＡＳＥＨ２ＡのＧ３７Ｓ変異体）に対する抗体も、含まれる。モノクローナル抗体は、例えば、酵素活性を有する組換えＲＮアーゼＨ２複合体でマウスを免疫化した後、既知の方法によりハイブリドーマ融合を行うことにより産生することができる。クローンは、ＥＬＩＳＡ法により、スクリーニングを行い、更にエピトープタグを付けたコンストラクトを発現する細胞を用いた免疫蛍光法およびウエスタンブロットアッセイにより検証することができる。抗体は、分子生物学的手法の補助として、ＲＮアーゼＨ２の精製（例えば、診断テスト用）にまたはＲＮアーゼＨ２複合体もしくはその機能の検査の補助として、用いることができる。
【００７２】
一実施態様では、抗体は治療用抗体であって、ハイブリドーマのような細胞株で産生される(Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975およびGalfre Meth Enzymol 73:3, 1981参照）。適切な治療用抗体には、げっ歯類動物抗体、キメラ抗体、ｓｃＦｖｓ、ヒト型化抗体およびヒト抗体が含まれる。キメラ抗体は、遺伝子工学的に作成した抗体であり、約三分の一が非ヒト由来のタンパク質、約三分の二がヒト由来のタンパク質で構成されている。ヒト型化抗体は、遺伝子工学的に製造され、ヒト抗体中に最低量の非ヒトタンパク質（通常では５から１０％）を含み、有害なホスト免疫反応を最小限に抑えたものである（Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988参照）。
【００７３】
Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦｖフラグメントなど、抗体のフラグメントも「抗体」に該当する。
【００７４】
また、本発明は、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃに対するプライマーを少なくとも１つ含む診断キットを提供する。適切なプライマーには、表１に示したものが含まれ、適切な補助要素と組み合わされる。ここで言う適切な補助要素には、バッファ、ｄＮＴＰ、酵素（例えば、ＴＡＱポリメラーゼ）、標識化化合物等が含まれる。キットは、核酸サンプル中の遺伝子異常を検出するために用いられ、その遺伝子異常は（検出された場合には）、ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患や細菌感染症、特にウイルス感染症（ただし、これに限定されない。）に対する罹患しやすさに関する遺伝的傾向を示すことができる。
【００７５】
一実施態様では、上述したＲＮアーゼＨ２複合体に特異的な抗体を用いて、変異タンパク質を含むＲＮアーゼＨ２を特定することができる。
【００７６】
別の実施態様では、上述したＲＮアーゼＨ２複合体に特異的な抗体を治療に用いることができる。例えば、ウイルスを用いた遺伝子治療の効果を高めたり、ホストの免疫反応を刺激するために、この抗体を使用することが可能である。
【００７７】
本発明は、変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物の製造を提供し、糖が方法は：
ａ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子コンストラクトを非ヒト接合体または非ヒト胚幹細胞に導入すること、
ｂ）該接合体または胚幹細胞から非ヒトトランスジェニック動物を作成すること、
ｃ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を製造することを含む。
【００７８】
変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、タンパク質がトランスジェニック動物で発現されるように、プロモーターと連結する。
【００７９】
変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物は、本発明の更なる一態様である。
【００８０】
非ヒトトランスジェニック動物は、任意の適当な動物であってよく、マウス、ラット、霊長類、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、魚、ウシ、ブタおよびヒツジを適当な例として挙げることができる。しかし、このリストは、網羅したものではなく、他の動物も使用することが可能である。
【００８１】
一実施態様では、非ヒトトランスジェニック動物は、げっ歯類である。適当な例としては、ラットやマウスが含まれる。
【００８２】
本発明の方法において使用してもよい公知の技術で使用されている胚幹細胞には、Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＢＡ／、ＢＡＬＢ／ｃ、ＤＢＡ／２およびＳＶ１２９のマウス系列から得られた胚幹細胞があるが、これに限定されるものではない。好ましくは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚幹細胞を使用する（Seong, E et al., Trends Genet. 20, 59-62, 2004; Wolfer et al., Trends Neurosci. 25:336-340, 2002）。
【００８３】
導入遺伝子（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃのコード遺伝子配列を含む。）は、種々の方法によって、動物の生殖細胞系列に導入することができる。例えば、導入遺伝子は、受精卵の雄性前核に直接インジェクトすることができる（例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press (1994)参照）。その結果１つの遺伝子座には導入遺伝子の異なる数のコピーがランダムに、通常はヘッドツーテール状に、導入されることとなる（例えば、Costantini and Lacy, Nature, 294, 92, 1981参照）。インジェクトした卵は、偽妊娠誘起したレシピエント雌へ移植する。そのようにして生まれる子孫の中には、導入遺伝子のコピーを一以上ゲノムに組み込んでいる場合があり、その部位は通常１つである。これらの創始動物を交配させて、トランスジェニック動物系列を作り、戻し交配を行って選択する遺伝子背景を有する系を作成する。当業者であれば、両染色体に導入遺伝子を導入することの利点を理解できよう。あるいは、導入遺伝子は、胚幹（ＥＳ）細胞における相同組換えなどのジーンターゲッティングにより動物に導入することができる。導入遺伝子を導入する方法として適切な既知の方法には、胚盤胞移植がある。この方法では、導入遺伝子を含むターゲティングコンストラクトは、当該分野で公知の方法により調製される。
【００８４】
導入遺伝子を含むターゲティングコンストラクトは、公知の方法により適当な宿主細胞に導入できる。トランスジェニック胚の生産およびそのスクリーニングは、例えば、Joyner ed., Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University press, 1993に記載されている既知の手法により行うことができる。トランスジェニック動物または胚のＤＮＡのスクリーニングは、サザンブロット法やＲＣＲ法により行うことができる。
【００８５】
非ヒトトランスジェニック動物は、健康な動物であってもよいし、導入遺伝子により導入した突然変異による疾患や障害の徴候を示してもよい。このようなトランスジェニック動物は、薬剤に関する薬理研究に適しており、例えばＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患やウイルス感染症の疾患モデルとして使用可能である。このようなモデルでは、ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患やウイルス感染症に対して罹患しやすくなっている。
【００８６】
本発明について、以下に示す非限定的な実施例や図により更に説明する。
【実施例】
【００８７】
実施例１：患者および被験者
本試験の対象患者は、全員ＡＧＳに関する診断規準を満たしており、早期脳障害を示す神経学的特徴を有し、出産前における一般感染症の感染を示す所見はなく、頭蓋内石灰沈着が典型的な領域に見られ、脳脊髄液（ＣＳＦ）リンパ球増多症（＞５細胞／ｍｍ３）またはＣＳＦ中にＩＦＮ−αが＞２ＩＵ／ｍＬであった。同意を得て、病気の子ども、その親および病気に罹患していない兄弟姉妹から血液サンプルを採取し、標準的な方法によりゲノムＤＮＡを末梢血白血球から抽出した。本試験は、Leeds Health Authority／United Teaching Hospitals NHS Trust Research Ethics CommitteeおよびScottish Multicentre Research Ethics Committee （０４：ＭＲＥ００／１９）の承認を受けて実施した。
【００８８】
ジェノタイピングおよび連鎖解析
ＳＮＰアレイによるゲノムワイドなスキャンをMRC Geneservice（Cambridge、UK）のAffymetrix Human Mapping 10K Xba142 2.0 GeneChipsRを用いて行った。既報の方法（Jackson et al., Am J Hum Genet 63: 541-546 (1998)）に従い、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄの遺伝子地図（http://research.marshfieldclinic.org/genetics）から選んだ確立されたマイクロサテライトマーカーおよびヒトゲノムブラウザ配列（２００４年５月版、http://genome.ucsc.edu/）により特定された新しいマイクロサテライトを用いて、ＡＧＳ２およびＡＧＳ３の座位の高密度ジェノタイピングを行った。連鎖解析は、ＧＥＮＨＵＮＴＥＲ（２．０β）（Kruglyak et al., Am J Hum Genet 56: 1347-1363 (1996)）を用いて、常染色体劣性遺伝モデルにより、疾患アレル頻度を１対１００、浸透率を１とし、マーカーのアレル頻度は等しいと仮定して実施した。
【００８９】
バイオインフォマティクス
データベース検索には、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/、Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用い、Ｅ値の包含閾値を２×１０−３として行ったが、このデータベースは、重複のない（non-redundant）タンパク質配列データベースである。
【００９０】
タンパク質の構造解析は、ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ（Schwede et al. Nucleic Acids Res 31:3381-3385 (2003)）を用いたｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ法により、デフォルト設定を用いて行い、ＷＨＡＴ−ＣＨＥＣＫ（Hooft et al. Nature 381:272 (1996)）により、ＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパク質（ＮＰ−００６３８８）の予測構造の精度を確認した。予測用テンプレートは、入手可能なもののなかでは最善のものである、構造が既知の４種類の古菌類ＲＮアーゼＨ２相同タンパク質１ｕａｘＡ、１ｉｏ２Ａ、１ｘ１ｐＡおよび１ｅｋｅＢを用いた。活性部位および予測される基質結合部位（Chapados et al., J Mol Biol 307: 541 -556 (2001)）は、ＶＭＤ（Ｖ１．８．３）（Humphrey et al., J Mol Graph 14: 33-38, 27-28 (1 996)）を用いて注釈付けを行った。
【００９１】
変異部位の検出
プライマーは、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＲＮＡＳＥＨ２Ａのコーディングエクソンの増幅を行うように設計した（プライマー配列を表１に示す。）。 精製したＰＣＲ増幅産物の配列は、ダイターミネーター（Applied Biosystems）を用い、ABI 3700 キャピラリーシーケンサ（Applied Biosystems）またはMegabace 500 キャピラリーシーケンサ（Amersham Pharmacia）を用いた電気泳動により決定した。変異解析は、Mutation Surveyor（Softgenetics）を使用して行った。
【００９２】
【表１】
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
ベクター作製
ほ乳類発現ベクターの作製には、Gatewayベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） を使用した。ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＲＮＡＳＥＨ２Ａのコーディング領域は、プラズミドクローン（それぞれ、ＣＳＯＤＦ０３１ＹＭ１５、ＣＲ６０２８７２（Iｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクローンＩＲＡＵｐ９６９Ｇ０３６１Ｄ、ＢＣ０１１７４８（ＲＺＰＤ））から増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１?に導入した。ＡＹＰ１は、既製品のｐＥＮＴＲＹベクター（クローンＩＯＨ２７９０７、Human Ultimate? Full ORF Gateway Shuttle Clone、ＮＭ＿０３２１９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ−ＤｅｓｔおよびｐＣＧＴ−Ｄｅｓｔは、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＧａｔｅｗａｙリーディングフレームカセットをｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)およびｐＣＧＴ (Van Aelst et al., Embo J 15:3778-3786 (1 996))のマルチクローニングサイトに挿入して作製した。部位特異的変異処理は、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ ｐＥＮＴＲＹクローンを用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキットをメーカーの指示に従って使用して実施した。
【００９７】
免疫沈降およびウェスタンブロッティング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの指示に従って使用し、各コンストラクト１μｇを一過的に共導入した。２４時間後に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．８）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ４０、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１μＭ ＤＴＴおよび１μＭ ＰＭＳＦにより４℃で１０分間細胞を溶解した。溶解した細胞は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、１０ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロールおよび０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムで１：１に希釈し、１０分後に遠心分離（１５８００ｇ、１０分間、４℃）を行い抽出液を採取した。タンパク質を含む細胞溶解液５００μｇに対して、メーカーの指示に従いＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳアガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて、１μｇのマウス抗−ｍｙｃ 抗体（クローン９Ｂ１１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）または１μｇのマウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）により免疫沈降を行った。ウェスタンブロットには、マウス抗−ｍｙｃモノクローナル抗体を１／１０００、マウス抗−Ｔ７モノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を１／５０００の濃度で使用した。
【００９８】
ＲＮアーゼＨアッセイ
１０μＭのオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に対して６０ｍＭ ＫＣＩ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８中で９５℃で５分間変性行った後徐々に室温に戻すことにより、アニーリングを行った。ＲＮアーゼＨ活性蛍光測定法は、６０ｍＭ ＫＣＩ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣ１２および０．２５μＭオリゴヌクレオチド二重鎖を含有する１００μＬを９６ウェル平底プレートで、オービタルシェーカーにより３７℃で３時間６０ｒｐｍで振とうさせて行った。各反応には、免疫沈降物の１／１０の量を使用し、陽性対照に２．５単位のＥ．ｃｏｌｉＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。蛍光は、ＶＩＣＴＯＲ２ １４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、励起フィルターを４８０ｎｍ、透過フィルターを５３５ｎｍとして１００ｍ秒間測定した。
【００９９】
結果
ＡＧＳ２座位の精査（refinement）およびＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）の同定
マイクロサテライトマーカーの高密度ジェノタイピングを１０家族に対して実施し、ＡＧＳ２座位の精製を行った。非同族の２家族（Ｆ８およびＦ１０、図７）に、同型接合マーカーの重なりを示す小領域が発見された。このような領域は、同質接合を起こした染色体領域を示すと考えられ（Broman et al., Am J Hum Genet 65:1493-1550 (1999) およびGibson et al., Hum Mol Genet 15:789-795 (2006)）、稀な劣性遺伝疾患の場合には疾患遺伝子を含む可能性が極めて高い（Lander et al., Science 265:2049-2054 (1987)）。この同型接合マーカーの重なり領域を用いることによって、ＡＧＳ２必須領域は、染色体１３ｑ１４．３上の遺伝子マーカーＡＣ１３７８８９０ＴＧ１９とＤ１３Ｓ７８８（図２）間の５７１ｋｂｐ領域にまで精製することができた。必須領域にある注釈付き４遺伝子全てのコーディングエクソンについて、配列を特定した。
【０１００】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）はＡＧＳ２遺伝子である
スクリーニングを行った家族中の７家族でＦＬＪ１１７１２のミスセンス変異が発見されたものの、病因変異は、ＤＬＥＵ７、ＧＵＣＹ１Ｂ２やＦＬＪ３０７０７には見られなかった。更に大きなコホートでＦＬＪ１１７１２の変異スクリーニングを実施したところ、この遺伝子の変異を示す家族が合計で１８家族発見された（表２、図２）。変異は、ほとんどがミスセンスであり、２つは異なる民族グループで頻繁に見られた（Ａ１７７Ｔ、Ｖ１８５Ｇ）。ミスセンス変異はすべて、ほ乳類で保存されている残基の非保存的置換であり（図８）、例外は単一の保存的残基変異（Ｙ２１９Ｈ）であって、この残基はＤｉｃｔｏｓｔｅｌｉｕｍにさかのぼるまで保存されている。ナンセンス変異は、２家族で見られ、エクソン２の終止コドン（Ｆ１７）およびイントロン６のスプライス供与部変異であった（Ｆ１５）。この両方のケースとも、疾患のある人は、合成異型接合型であり、二番目の変異はミスセンス変異であった。以上のことから、観察された変異スペクトラムによれば、変異による影響は、ＦＬＪ１１７１２タンパク質の完全な喪失ではなく、ハイポモルフ型（hypomorphic）であると考えられる。全家族において、変異は疾患と関連しており、親は全員この変異に関して異型接合型であった。各変異に対して、少なくとも１６０の対照アレルのジェノタイピングを行った。最も一般的な変異であるＡ１７７Ｔのみは、検査を実施した２４１個のサンプル中異型接合型と判明した人が１例であった。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）はイーストＲｎｈ２Ｂｐのオルソログである
ＦＬＪ１１７１２は、３０８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするが、このタンパク質は、機能がこれまで不明であった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＦＬＪ１１７１２は広範囲のヒト組織中に検出され、ユビキタスに発現することが示唆されている（データ示さず）。
【０１０４】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschuhl et al., Nucleic Acids Res 25:3389-3402 (1997)）を用いたデータベース検索により、４回検索繰り返しを行ったところ、ヒトＦＬＪ１１７１２とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタンパク質であるＲｎｈ２Ｂｐ（Ｒｎｈ２０２）には、かなりの類似性（Ｅ＝４×１０―５）が見られた（図８）。Ｒｎｈ２Ｂｐは、イーストＲＮアーゼＨ２酵素複合体の必須コンポーネントである（Jeong et al., Nucleic Acids Res 32:407-414 (2004)）。この発見からは、ＦＬＪ１１７１２がほ乳類でも同様の複合体で機能していることが考えられ、ＡＧＳの場合別のＲＮアーゼＨコンポーネントにも変異が生じている可能性を示唆する。
【０１０５】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）はＡＧＳ３遺伝子である
ＳＮＰアレイゲノムスキャンを５パキスタン人家族（Ｆ３０−３４）および１バングラデシュ家族（Ｆ３５）からなる非同族の６家族に対して行った。このスキャンとその後に行ったマイクロサテライトジェノタイピング（図９）により、染色体１１ｑ１３．２上のマーカーＤ１１Ｓ４２０５とＤ１１Ｓ９８７間に新規座位ＡＧＳ３を特定したが、これは最大多点ＬＯＤ値が６６．８ｃＭで４．５４であった（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ遺伝子地図）。更に、５パキスタン人家族におけるジェノタイピングにより、祖先ハプロタイプ（太字で示したジェノタイプ、図９）の存在が示唆されたが、これとＦ３０家族における小さな同型接合領域とにより、ＡＧＳ３必須領域をＤ１１Ｓ４２０５とＤ１１Ｓ９８７との間にある４．９ｃｍの区間に精製することができた。
【０１０６】
注目すべきこととして、ヒトＲＮアーゼＨ２Ａと生化学的に共精製されるタンパク質（Frank et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:12872-12877 (1988)）をコードするＡＹＰ１は、この必須領域内に存在する（図３）。そこで、ＡＹＰ１の配列を決定し、これらの６家族における非保存的ミスセンス変異を特定した（表３および図９参照）。コドン６９（Ｒ６９Ｗ）における同型接合性変異が、祖先ハプロタイプと考えられる遺伝子を共有する５パキスタン人家族の全患者に認められた。別の同型接合性変異であるＫ１４３１は、バングラデシュ家族に見られた。この変異は、家族内における疾患と関連しており、いずれの変異も少なくとも１７２個のアジア人対照アレルには見られなかった。ＲＴ−ＰＣＲによるＡＹＰ１の発現プロファイリングからは、ＦＬＪ１１７１２と類似した広範な発現パターンが示された。
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
同時に、発明者らは、ＡＹＰ１がイーストＲＮアーゼＨ２の第２サブユニットであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｈ２Ｃｐ（Jeong et al., Nucleic Acids Res 32:4407-414 (2004)）のオルソログであることを明らかにした。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉオープンリーディングフレームによるデータベース検索の４回の検索繰り返しにより、ヒトＡＹＰ１およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｒｎｈ２Ｃｐを特定した（図８）。
【０１０９】
ＲＮＡＳＥＨ２ＡはＡＧＳ４遺伝子である
ＲＮＡＳＥＨ２Ａは、染色体１９ｐ１３．１３上にある７ｋｂｐのエクソン８遺伝子であり、２９９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＲＮＡＳＥ２Ａは、遺伝子地図が作製されたいずれのＡＧＳ座位とも共局在化しなかった。しかし、ＳＮＰアレイゲノムスキャンデータを精査すると、既報のスペイン系白人の先祖を持つ非同族ＡＧＳ家族（Sanchis et al., J Pediatr 146:701-705, 2005参照）のＲＮＡＳＥ２Ａ座位に同型接合性を有する小さな領域を見出した（図４ａ）。この家族の２人の疾患小児に対して配列を調べると、ｃ．１０９Ｇ→Ａの同型接合性単一塩基転換が見られ、その結果Ｇ３７Ｓの非保存的ミスセンス変異を起こしていた（図４ｂ）。このアミノ酸は、ヒトから古細菌に至るまで広範囲に保存されており（図４ｃ）、基質結合溝の底部にある最初のβシートの終端の曲がった箇所に位置し、ＲＮアーゼＨ活性部位の近傍にある（図４ｄ）（Chapados et al., J Mol Biol 307:541-546, 2001）。この変異は、１７８個の白人対照アレルでは検出されず、両親は、この変異に関して異型接合型であった。
【０１１０】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）およびＲＮＡＳＥＨ２Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮアーゼＨ２活性を有する複合体を形成する
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｈ２Ａｐ−Ｒｎｈ２Ｂｐ−Ｒｎｈ２Ｃｐ複合体との配列相同性に鑑みて、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパク質は、ＲＮアーゼＨ２活性を有するタンパク質複合体を形成すると考えられる（図５ａ）。このことを検証するため、Ｇａｔｅｗａｙシステムを用いて３遺伝子のクローニングを行い、エピトープタグの付いたほ乳類発現ベクター（ｐＣＧＴ−Ｄｅｓｔ（Ｔ７）およびｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ−Ｄｅｓｔ）に導入し、この３種類のコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞に一過的に共導入した。抗ｍｙｃ抗体によるＣ末端タグ付きＦＬＪ１１７１２−ｍｙｃの免疫沈降により、Ｎ末端Ｔ７タグ付きＡＹＰ１およびＴ７タグ付きＲＮＡＳＥ２Ａのプルダウンが認められ（図５ｂ）、この３種類のサブユニットがｉｎ ｖｉｔｒｏで相互作用を有することが確認された。
【０１１１】
既報の蛍光測定法（Parniak et al., Anal Biochem 33-39, 2003）を適用して、この複合体の酵素活性を調べた。蛍光標識オリゴヌクレオチドをＤＡＢＣＹＬ標識化して蛍光を消光する相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングを行った（図５ｃ）。蛍光色素が結合したオリゴヌクレオチドに対して酵素による開裂が起こると、蛍光色素が隣接する消光分子から遊離して、蛍光シグナルが発生する（図５ｃ）。
【０１１２】
発明者らは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖である「オリゴＣ」が免疫沈降を起こした複合体により効果的に開裂することを見出し、この複合体がＲＮアーゼＨ活性を示すことが確認された（図５ｄ）。更に、この免疫沈降を起こした複合体は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中に埋め込まれた単一のリボヌクレオチドを認識し、「１型」ＲＮアーゼＨであるＥ．ｃｏｌｉのＲＮアーゼＨとは対照的に、「オリゴＢ」を効果的に開裂することから、必要とされる「２型」ＲＮアーゼＨ活性を有していることが分かる。想定されたように、「オリゴＡ」は、ヌクレアーゼ抵抗性２−Ｏ’メチルＲＮＡ構造を用いて合成されていることから、開裂を起こさなかった。
【０１１３】
ＲＮアーゼＨ２複合体の変異により酵素活性が低減する
選択した病因変異（ＦＬＪ１１７１２、Ａ１７７Ｔ、Ｔ１６３１；ＡＹＰ１、Ｒ６９Ｗ、Ｋ１４３Ｉ；ＲＮＡＳＥＨ２Ａ Ｇ３７Ｓ）を、各遺伝子の部位特異的変異処理を用いて導入し、ＨＥＫ２９３細胞に一過的に導入し、発現させた。. 免疫沈降を行って複合体の安定性に及ぼす影響を調べるとともに、酵素活性のアッセイを実施した（図６ａおよび６ｂ）。これらの実験により、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ Ｇ３７Ｓ変異は複合体の安定性には影響を及ぼさなかったものの、触媒部位における変異に想定されるように、酵素活性が顕著に低下したことが示された（図６ｂ）。ＡＹＰ１変異の場合には、他のサブユニットと複合体を形成してプルダウンを起こすＡＹＰサブユニット量が低下した。この低下は、酵素活性の低下と関連があった。このことから、酵素活性の低下は、変異によって複合体の形成が阻害された結果であることが示された。
【０１１４】
実施例２：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理したＨＣＴ１１６細胞のＲＮアーゼＨ２活性アッセイ
発明者らの観察によれば、ＡＧＳでは自然免疫が不適切に活性化されており、このことはＲＮアーゼＨ２が自然免疫反応に関与していることを示している。この検証を行うため、ｄｓＲＮＡの合成アナログであるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理したが、この合成アナログはウイルス感染症と関連があり、ｄｓＲＮＡ誘導性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）またはトル様受容体３（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３）を介するサイトカインの生産を誘発することにより自然免疫反応を刺激することが知られている。半密集（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態のＨＣＴ１１６結腸癌細胞に対して、２５μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、アメリカ）により、経時的に１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０培地で処理を行った。細胞からタンパク質を含む細胞溶解液を調製し、ＲＮアーゼＨ２蛍光測定アッセイを行った。
【０１１５】
結果を図１０に示す。２時間後には酵素活性が２倍になったことから、ＲＮアーゼＨ２がこの経路の下流に位置して、自然免疫反応の作動因子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）である可能性が示唆された。
【０１１６】
実施例３：ポリクローナル抗体
ＲＮアーゼＨ２イムノゲン（免疫原）をバクテリア発現タンパク質として発現することにより、ポリクローナル抗体を生成した（"Antibodies: A Laboratory Manual" HarlowおよびLane編集, Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８８年１２月１日発行）ISBN 978-0879693145参照）。この発現タンパク質を、Ｂサブユニットに付けたＧＳＴタグにより精製した。その後、このＧＳＴタグをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により切り離して、得られたタンパク質をヒツジ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に注入した。注入の際には、フロイントアジュバントを使用した。１回目の注入には、完全アジュバントを用い、その後は不完全アジュバントによりブーストを行った。その結果得られたヒツジ血清を抗原複合体が結合したカラムに通し、免疫アフィニティーを利用して精製した。この抗原複合体には、イムノゲンとして用いたものと同じものを使用した。ウェスタンブロット（図１１参照）により、抗体は、過剰発現した適正な分子量のサブユニットを検出可能であることが示されている。すなわち、抗体は、ＲＮアーゼＨ２のＡ、ＢおよびＣサブユニットに対する特異性を有することが示された。別のバンド（＊）は、内因性タンパク質のうちの１つを示している可能性がある。ウェスタンブロット法により得られたバンドについて、抗タグ抗体により再検索（ｒｅｐｒｏｂｉｎｇ）して、同定を行った。
【０１１７】
使用した免疫源配列は、以下のとおりである。
抗ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ用（プロテアーゼ切断から残ったリンカー残基を含む。）
LEVLFQGPLGSPEFPSTSLYKKAGSTMAAGVDCGDGVGARQHVFLVSE YLKDASKKMKNGLMFVKLVNPCSGEGAIYLFNMCLQQLFEVKVFKEKHH SWFINQSVQSGGLLHFATPVDPLFLLLHYLIKADKEGKFQPLDQVVVDNV FPNCILLLKLPGLEKLLHHVTEEKGNPEIDNKKYYKYSKEKTLKWLEKKVN QNAALKTNNVNVSSRVQSTAFFSGDQASTDKEEDYIRYAHGLISDYIPK ELSDDLSKYLKPEPSASLPNPPSKKIKLSDEPVEAKEDYTKFNTKDLKTE KKNSKMTAAQKALAKVDKSGMKSIDTFFGVKNKKKIGKV（配列番号５２）。
【０１１８】
抗ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ用
MESGDEAAIERHRVHLRSATLRDAVPATLHLLPCEVAVDGPAPVGRFFT PAIRQGPEGLEVSFRGRCLRGEEVAVPPGLVGWMVTEEKKVSMGKPD PLRDSGTDDQEEEPLERDFDRFIGATANFSRFTLWGLETIPGPDAKVRG ALTWPSLAAAIHAQVPED（配列番号５３）。
【０１１９】
抗ＲＮＡＳＥＨ２Ａ用
MDLSELERDNTGRCRLSSPVPAVCRKEPCVLGVDEAGRGPVLGPMVYA ICYCPLPRLADLEALKVADSKTLLESERERLFAKMEDTDFVGWALDVLSP NLISTSMLGRVKYNLNSLSHDTATGLIQYALDQGVNVTQVFVDTVGMPE TYQARLQQSFPGI EVNKAKADALYPVVSAASICAKVARDQAVKKWQFV EKLQDLDTDYGSGYPNDPKTKAWLKEHVEPVFGFPQFVRFSWRTAQTIL EKEAEDVIWEDSASENQEGLRKITSYFLNEGSQARPRSSHRYFLERGLE
SATSL（配列番号５４）。
【０１２０】
実施例４：リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）
ＡＧＳ患者の初代Ｂ細胞にＥＢＶを感染させ、継続的に増殖する細胞株として、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を作成した。ＬＣＬを作成する適切な方法は公知であり、例えば、Penno et al., Methods in Cell Science 15(1):43-47, 1993に記載されている。ＬＣＬに対して形質転換を行い、患者のサブユニットに見られる代表的な変異を示すようにした。
【０１２１】
以下のＬＣＬを作成した。
【表８】
【０１２２】
細胞性酵素活性は、すでに述べたＲＮアーゼＨ活性蛍光測定法によりアッセイすることができる。エンドポイントアッセイ（図１３）の他、キネティックアッセイも内蔵型温度制御装置（３７℃に設定）のついたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｉｌｌ型装置により一定の時間間隔（例えば、５分毎）で測定可能である。ＲＮアーゼＨ２変異リンパ芽球様細胞株の活性を調べるアッセイ例を図１３に示した。
【０１２３】
実施例５：組換えＲＮアーゼＨ２
３遺伝子を含むポリシストロン性バクテリア発現コンストラクトを用いて、酵素活性を有する組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質複合体を合成、精製した（図１５ａ参照）。変異型および野生型の複合体の活性は、図１５ｂに示すように、酵素アッセイにより測定することができる。
【０１２４】
実施例６：ウイルス複製を抑制するＲＮアーゼＨ２
ＲＮＡ−ＤＮＡ中間体は、ウイルスの複製に必須である。それゆえ、内因性ＲＮアーゼＨ２活性のアップレギュレーションは、ウイルス複製を抑制するためのホスト反応として有益であることが期待できる。発明者らは、この考えを支持する証拠を得ており、自然免疫シグナルの強力な活性因子であるｄｓＲＮＡ（ｐｏｌｙｌ：Ｃ）によるＨＣＴ１１６細胞処理後数時間内に酵素活性が増大する（図１０参照）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）Ｈ２のコンポーネントをコードする遺伝子、組み換えＲＮアーゼＨ２ならびにウイルス感染症や自己免疫疾患等を治療する目的により免疫反応を操作する上で有益なアゴニスト、アンタゴニストおよび調節因子を特定するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のリボヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ的切断を行う酵素複合体である。ＲＮアーゼＨは、分子生物学において頻繁に用いられており、ｃＤＮＡの逆転写を行った後にＲＮＡテンプレートの分解を行うために使用する。
【０００３】
ＲＮアーゼＨには、生化学的特徴が異なる２種類のクラス（１／Ｉおよび２／ＩＩ）が存在する。ＲＮアーゼＨ２は、ヒトおよび酵母のいずれにおいても細胞性ＲＮアーゼＨ活性の主要な働きを担っている。ＲＮアーゼＨ２は、ＤＮＡ複製におけるラギング鎖上の岡崎フラグメントからＲＮＡプライマーを除去する作用やＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖の単一リボヌクレオチドの切除に関わっていると考えられている。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、Ｒｎｈ２ＢｐとＲｎｈ２Ｃｐは、触媒サブユニットＲｎｈ２Ａｐと共精製し、両者があれば十分にＲＮアーゼＨ２活性を再構成することができる。ヒトでは、ＲＮアーゼＨ２の触媒サブユニットであるＲＮＡＳＥＨ２Ａが、生化学的精製法により特定されており、酵母オルソログと明確な配列相同性を有している。しかし、別のヒトタンパクであるＡＹＰ１（現在ではＲＮＡＳＥＨ２Ｃと呼ばれる。）がＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパクと共精製したものの（Frank et al., PNAS USA 95:12872-7, 1998）、酵母以外ではＲｎｈ２ＢｐおよびＲｎｈ２Ｃｐサブユニットのオルソログは、特定されていない。
【０００４】
アイカルディ・ゴーシェ症候群（ＡＧＳ）は、病因不明の常染色体遺伝性疾患である。ＡＧＳは、臨床的には、重度の神経障害、進行性小頭症、痙攣、ジストニア姿勢および精神運動発達遅滞として現れる。小児では、しばしば死に至る（Goutieres, Brain Dev 27:201-206, 2005）。ＡＧＳは、先天性脳ウイルス感染症と形質的に強い類似性を示し（Aicardi & Goutieres, Ann Neurol 15:49-54, 1984）、ＡＧＳで見られるＩＦＮ−αレベルの上昇も、ウイルス感染によりホストが示す免疫反応と類似している。そのため、文献ではＡＧＳの病因論に関し、見解の一致を見ていない。特に、ＡＧＳがウイルス性病原体に対する遺伝的感受性に起因するものであるのか、あるいはホストにおける免疫反応の調節機能の変異によるものであるのかという点では意見が分かれる。
【０００５】
Crowら（Am J Hum Genet 67:213-221, 2000およびJ Med Genet 4O:183-187, 2003）は、２つのＡＧＳ遺伝子座を特定したが、それは染色体３ｐ２１上のＡＧＳ１と染色体１３ｑ１４．３上のＡＧＳ２である（Ali et al., J Med Genet 43(5):444-50, May 2006. Epub 20th May 2005）。
【０００６】
本願発明者らは、ＡＧＳ２がヒトＲＮアーゼＨ２複合体のコンポーネントであることを発見し、この遺伝子を完全に特定した。ＡＧＳ２は、ユビキタスな発現パターンを示し、予測できるドメイン構造や機能が類推できるヒトパラログは見当たらなかった。離れたオルソログがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同定された（アミノ酸配列の相同性＜５％）。発明者らは、ＡＧＳ３およびＡＧＳ４遺伝子も特定した。この３種類のＡＧＳ遺伝子から発現したタンパク質は、合わせてＲＮアーゼＨ２複合体の一部分を構成する。
【０００７】
ＡＧＳは、ウイルス感染症と形質的な類似性が高いが、この類似性は脳に限らない。症例の中には、神経学的特徴以外の症状（血小板減少症、肝脾腫大、肝トランスアミナーゼ値の上昇）を示す場合もあり、ウイルス感染症と類似の症状を呈するその他の遺伝病と共通する部分のあることが示唆されている。
【０００８】
ＡＧＳと全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）との類似性も指摘されている（Alarcan-Riquelme, Nat Genet 38:866-867, 27th July 2006参照）。特に、ＳＬＥでは先端部に血管炎型の皮膚病変を呈するが、この場合、真皮表皮接合部には免疫グロブリンの沈着が見られる（Crow et al., Nat Genet 38:917-920, 2006参照）。最近報告された家族性皮膚エリテマトーデス症患者で同一の皮膚病変を示した症例では、共通してＡＧＳ１遺伝子に変化が見られた（Lee-Kirsch et al., Am J Hum Genet 79:731-737, 19 July 2006参照）。また、ＡＧＳでは、高ガンマグロブリン血症および自己抗体が報告されている（Crow et al., Nat Genet 38:917-920, 2006参照）。更に、ＳＬＥでは、ＣＳＦインターフェロンαレベルが上昇していることが、ループス脳炎および全身で認められている。頭蓋内基底核石灰化も、中枢神経ＳＬＥ患者の３０％ほどで起こっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明者らによる観察の結果、ＡＧＳ、ＳＬＥおよびウイルス感染症には、ＲＮアーゼＨ２に関係する病因が共通して存在する可能性が初めて考えられた。
【００１０】
重要なこととして、発明者らは、ＡＧＳ４遺伝子がＦ３９ファミリーにＧ３７Ｓ変異を起こしていることを特定した。この場合、患者はｐｓｅｕｄｏ−ＴＯＲＣＨ症候群およびＡＧＳ両方の病態を示し、これらの疾患には共通の分子的原因があることが示されている。（ｐｓｅｕｄｏ−ＴＯＲＣＨ症候群とは、小児がトキソプラズマ症、風疹、ＣＭＶおよびＨＳＶ感染症と類似した症状を呈する遺伝性疾患である。）それゆえ、ＲＮアーゼＨ２複合体の変異に起因する病態形質は、従来のＡＧＳよりもはるかに広いと考えられ、「先天性ウイルス感染症」を有する多くの症例に存在する遺伝的な原因が現在のところ認識されてない可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明は、配列番号１、３もしくは５の塩基配列またはそのホモログからなるポリヌクレオチドを提供するものである。配列番号１はＡＧＳ２（ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ）の塩基配列を示し、配列番号３は、ＡＧＳ３（ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ）の塩基配列を示し、ＳＥＱ ＩＮ Ｎｏ：５はＡＧＳ４（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）の塩基配列を示す。
これらのポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩに対して、ＮＭ＿０２４５７０（ＡＧＳ２／ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、従来はＦＬＪ１１７１２と命名されていた。）、ＡＦ３１２０３４（ＡＧＳ３／ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、従来はＡＹＰ１と命名されていた。）、ＮＭ＿００６３９７（ＡＧＳ４／ＲＮＡＳＥＨ２Ａ）のアクセッション番号で報告されている（機能については不明）。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アイカルディ・ゴーシェ症候群における神経画像および臨床所見（ａ）基底核の石灰化を示す軸位ＣＴ像。（ｂ）白質、特に前頭葉に影響を及ぼす高シグナル強度を示すＭＲＩＴ２強調軸位像。比較用として、（ｃ）基底核の石灰化を示す先天性ＨＩＶ患者の軸位ＣＴ像（Belman et al., Neurology 36: 11 92-1 199 (1 986)より）。
【図２】ＡＧＳ２の必須領域およびＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（従来はＦＬＪ１１７１２と呼ばれた。）遺伝子の特定された突然変異の位置を示す図。（ａ）ＡＧＳ２遺伝子座を示す染色体１３ｑ１４.１の遺伝子地図。この遺伝子座は、非同族家系の同型接合染色体セグメントを重ね合わせることによって特定され、マイクロサテライトマーカーであるＡＣ１３７８８０ＴＧ１９とＤ１３Ｓ７８８との間に位置する。（ｂ）５７１ｋｂｐの必須領域の物理地図には、注釈情報の付いた４個の遺伝子が含まれる（UCSC Genome Browser May 2004アセンブリ）。（ｃ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪｌｌ７１２）は、１１個のエクソンを含む４７ｋｂｐの塩基配列により構成され、３０８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。コーディング領域を斜線で示す。突然変異の位置は、矢印で表示し、翻訳開始部位から数えた相対位置により示す。対応するアミノ酸の変化は、太字で示した。
【図３Ａ】ＡＧＳ３領域、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）遺伝子、その突然変異および他の種における配列の保存を示す図。（ａ）染色体１１ｑ１３．１の遺伝子地図。必須領域は、パキスタン人家族における連鎖不平衡データにより特定され、Ｄ１１Ｓ４２０５からＤ１１Ｓ９８７の間に位置する。ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）遺伝子は、マイナス鎖上のテロメアからセントロメアに向かうゲノム配列の６５．２Ｍｂｐの位置から１．４ｋｂｐの範囲にある。（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）遺伝子は、４個のエクソン（コーディング領域を斜線で表示。）を含み、１６４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。突然変異の位置は、矢印で表示し、翻訳開始部位から数えた相対位置により示す。対応するアミノ酸の変化は、太字で示した。（ｃ）両突然変異は、ほ乳類で保存されている残基で起こる。ほ乳類ＲＮＡＳＥＨ２Ｃタンパク質の領域中、変異部位近傍の配列。Hs, Homo sapiens（ヒト）; Bt, Bos Taurus（ウシ）; Cf Canis familiaris（イヌ）; Mm, Mus musculus（ハツカネズミ）; Rn, Rattus nowegicus（ラット）。 置換アミノ酸を配列の上に示す。
【図３Ｂ】（ｄ、ｅ）電気泳動法によるＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）突然変異部位の配列決定。（ｄ）ｃ．４２８Ａ＞Ｔ（ｅ）ｃ．２０５Ｃ＞Ｔ。
【図４Ａ】図４ ＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子、ゲノムの位置、ゲノム構造および突然変異の位置。（ａ）染色体１９ｐ１３．１３の遺伝子地図。ＲＮＡＳＥＨ２Ａは、同族の又いとこの親から生まれた２人の子どもの患者（ファミリーＦ３９）が同型接合ＳＮＰｓ（ＳＮＰ Ａ−１５０９３６１、１６０６３２７、ｌ６０６３２５）を有する領域にあり、ＳＮＰ Ａ−１５１５９５０およびＡ−１５０８０１８と遺伝的に関連する可能性がある領域を規定する。（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａの遺伝子構造。ＲＮＡＳＥＨ２Ａは、ゲノム配列の１２．８Ｍｂｐの位置（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｍａｙ ２００４アセンブリ）から７ｋｂｐにわたって存在する。８個のエクソンを含み、２９９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。（ｃ）Ｇ３７Ｓ変異は、バクテリアからヒトにいたるまで広範囲に保存されている残基で発生する。Hs, Homo sapiens（ヒト）; Bt, Bos Taurus（ウシ）; Cf Canis familiaris（イヌ）; Mm, Mus musculus（ハツカネズミ）; Rn, Rattus nowegicus（ラット）；Ce, Caenorhabditis elegans（カンセンチュウ）; Sp, Schizosaccharomyces pombe（分裂酵母）; Sc, Saccharomyces cerevisiae（出芽酵母）; Ec, Escherichia coli（大腸菌）; Ph, Pyrococcus horikoshii（超好熱菌）。
【図４Ｂ】（ｄ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａ突然変異部位の電気泳動結果。（ｅ）２型ＲＮアーゼＨタンパク質の決定した結晶構造をモデルにして推定したＲＮＡＳＥＨ２Ａ触媒部位の三次元構造。突然変異を起こしたＧ３７残基（中心）は、活性部位および基質結合部位と考えられるアミノ酸残基の近傍に位置する（Chapados et al., J Mol Biol 307:541-556 (2001 )）。
【図５Ａ】ヒトＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＹＪ１１１７１２）、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）およびＲＮＡＳＥＨ２Ａは、ほ乳類細胞中で発現すると、酵素活性を有するＩＩ型リボヌクレアーゼＨ複合体を形成する。（ａ）ヒトＲＮアーゼＨ２複合体およびそれに対応するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの複合体の模式図。（ｂ）Ｔ７エピトープのタグを付けたＦＹＪ１１７１２およびＡＹＰ１は、ｍｙｃタグが付いたＲＮＡＳＥＨ２Ａと免疫共沈降（ＩＰ）する。（ｃ，ｄ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａ／Ｂ／Ｃ複合体は、リボヌクレアーゼＨ活性を示す。
【図５Ｂ】（ｃ）３種類のオリゴヌクレオチドのヘテロ二本鎖により、酵素活性を調べた。オリゴＣは、３’末端蛍光タグ付きＲＮＡオリゴヌクレオチドと、それに相補的な５’末端ＤＡＢＣＹＬ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしたもので、いかなるリボヌクレアーゼＨでも分解可能な基質である（ＤＡＢＣＹＬは、酵素により分解され、蛍光標識した３’末端フラグメントと分離するまで、蛍光を消光する。）。オリゴＢは、ＩＩ型リボヌクレアーゼＨのみが分解可能な基質である。これは、３’末端蛍光標識したオリゴヌクレオチド鎖の１５番目が１個のリボヌクレオチドに置き換わっているＤＮＡ二重鎖である。オリゴＡは、オリゴＣ同様のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであるが、酵素による分解を受けない。３’末端蛍光標識オリゴヌクレオチドが２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチドにより合成されているからである。
【図５Ｃ】（ｄ）ＩＩ型リボヌクレアーゼＨ活性は、エピトープタグの付いたＲＮＡＳＥＨ２Ａ／Ｂ／Ｃを含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液を用いた免疫沈降により測定することができる。ｍｙｃ ＩＰは、マウス抗ｍｙｃ抗体により測定し、免疫沈降の対照として、ＩｇＧ ＩＰを正常なマウスＩｇＧ免疫グロブリンを用いて行った。ベクターとは、ｐＣＧＴ−ＤｅｓｔおよびｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓベクターにより形質導入を行った細胞を言う。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図６】ＲＮＡＳＥＨ２Ａの突然変異は、ＲＮアーゼＨ活性を低下させる。（ａ）野生型タグの付いたＲＮＡＳＥＨ２ＢとＲＮＡＳＥＨ２Ｃとを組み合わせて、ＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパク質変異体による共導入を行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したＲＮアーゼＨ２複合体の免疫沈降結果。ＲＮＡＳＥＨ２ＡのＧ３７Ｓ突然変異は、複合体形成の障害とはならないことが示される。Ｉｎは「インプット」、ＩＰは「免疫沈降」、ＷＴは「野生型」を表す。（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ａの突然変異は、酵素活性を低下する。（ａ）に示した免疫沈降複合体と同じサンプルに対する蛍光ＲＮアーゼＨ活性アッセイ。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図７】非同族の２家族におけるマイクロサテライトジェノタイピングにより、ＡＧＳ２必須区間を限定する。同型接合マーカー領域を線で囲んである。
【図８Ａ】代表的な真核生物の（ａ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ／Ｒｎｈ２Ｂｐホモログの配列。ＡＧＳ患者において置換されたアミノ酸は、黒地に白抜きの文字で示し、置換したアミノ酸をその上方に示す。ヒトＡＹＰ１とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｈ２Ｃｐとの相同性を調べるために用いたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ のアミノ酸配列は、（ｂ）に示した。アラインメントは、ＣＨＲＯＭＡソフトウェア（Goodstadt et al., Bioinformatics 17:845-846 (2001)）を用いて行い、真核生物におけるコンセンサスシークエンスの割合を８０％とした。アラインメントから除外された残基は、カッコで示した。ハイフン（−）は、配列表示の目的で使用しており、欠落しているアミノ酸を示すものではない。ＧＩ番号を配列の右に示す。コンセンサス配列の記号は、以下の通りである。ａ：芳香族（ＦＨＷＹ）、ｂ：大きい（ＥＦＨＩＫＬＭＱＲＷＹ）、ｃ：有電荷（ＤＥＨＫＲ）、ｈ：疎水性（ＡＣＦＧＨＩＬＭＴＶＷＹ）、ｌ：脂肪族（ＩＬＶ）、ｐ：極性（ＣＤＥＨＫＮＱＲＳＴ）、ｓ：小さい（ＡＣＤＧＮＰＳＴＶ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＳＴ）、＋：プラスに帯電（ＨＫＲ）、−：マイナスに帯電（ＤＥ）。種の略号は、以下の通りである。Ａｇ：Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、Ａｍ：Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ、Ａｎ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｂｔ：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｃａ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｅ：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃｆ：Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｃｇ：Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃｐ：Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｄｄ：Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｄｈ：Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄｍ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｄｒ：Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、Ｅｇ：Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｇｚ：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ、Ｈｓ：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ＫＩ：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｗ：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ、Ｍｍ：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｎｃ：Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｏｓ：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｒｎ：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｓｂ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｓｃａ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ、Ｓｃｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｋｌ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｋｕ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｓｍ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ、Ｓｐａ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓｐｏ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｔｂ：Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｃ：Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｔｎ：Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｘｔ：Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＹＩ：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ。
【図８Ｂ】代表的な真核生物の（ｂ）ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ／Ｒｎｈ２Ｃｐホモログの配列。その他は図８Ａと同様。
【図９】染色体１１ｑ１３．２のＡＧＳ３遺伝子地図。アジア系６家族におけるマイクロサテライトジェノタイピング結果。先祖のハプロタイプと考えられるものを太字で示し、同型接合マーカー領域を線で囲んだ。
【図１０】ポリイノシン−ポリシトシン（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））処理したＨＣＴ１１６細胞のＲＮアーゼＨ活性アッセイ。Ａ：酵素耐性のあるオリゴヌクレオチド基質、Ｂ：ＲＮアーゼＨ２特異的基質、Ｃ：リボヌクレアーゼＨ基質。
【図１１】ヒツジ由来の抗ＲＮアーゼＨ２Ａ／Ｂ／Ｃ複合体に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体をＨｅＫ２９３細胞溶解物に反応させたウェスタンブロッティング。ここで、ＲＮアーゼＨ２Ａ／Ｂ．Ｃ複合体タンパク質は、エピトープタグ付きベクターにより過剰発現させてある。抗体により、過剰発現したタグ付きほ乳類ＲＮアーゼＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ２Ｃ（下の方に見える２本の線）の検出が可能である。＊は内因性物質によると思われるバンドである。
【図１２】ＥＳ細胞に導入したＲＮＡＳＥＨ２ＢＡ１７７Ｔ ターゲティングコンストラクトの模式図。ターゲティングコンストラクトは、ＲＮアーゼＨ２Ｂ遺伝子座由来の同型配列の２．５ｋｂアームの他、エクソン６と７の間にＬｏｘＰ配列（三角で表示）に挟まれたネオマイシン抵抗遺伝子カセットが挿入されてできている。ヌクレオチドの変化（矢印で表示）が導入されたことにより、ＡＧＳ患者によく見られるコドン１７７におけるアラニンからトレオニンへの変異が生じる。このコンストラクトは、ＡＧＳのノックインマウスモデルを作成するために行う胚盤胞移植に現在用いられているＥＳ細胞株を作成するための相同組換えに用いられている。
【図１３】ＡＧＳ患者の不死化リンパ芽球様細胞株の野生型ＬＣＬ（ＷＴ ＬＣＬ）、ＲＮアーゼＨ２Ａ Ｇ３７ＳおよびＲＮアーゼＨ２Ｂ Ａ１７７Ｔに対するＲＮアーゼＨ２活性キネティックアッセイ。ＲＮアーゼＨ２サブユニットに同型接合性変異を示す細胞株では、野生型リンパ芽球様細胞株（ＷＴ）と比較して、酵素活性が弱くなっている。
【図１４】ＡＧＳ患者のリンパ芽球様細胞株においてＲＮアーゼＨ２酵素活性が低下していることを示すエンドポイント蛍光ＲＮアーゼＨアッセイ。
【図１５】ａ：可溶性組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質複合体のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動法。ｂ：組換えＧＳＴ、野生型ＧＳＴ−ＲＮアーゼＨ２複合体およびＡサブユニットにＧ３７Ｓ変異を有するＧＳＴ−ＲＮアーゼＨ２複合体による酵素活性。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ここで、ポリヌクレオチドの「ホモログ」とは、ポリヌクレオチドに対して核酸の欠失、置換または付加による修飾を行い、配列番号１、３または５に示す塩基配列に対して、少なくとも６５％以上の相同性、例えば、少なくとも７０％や、例えば、少なくとも７４％の相同性を有するものを言う。一つの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５に示す塩基配列に対し、７５％や８０％以上の相同性を有し、好ましくは８５％の相同性を有する。「ホモログ」には、オーソロガス遺伝子を含む。この遺伝子は、異なる種属における等価な遺伝子を言う。
【００１４】
一つの実施態様では、ホモログは、配列番号１、３または５に示す塩基配列に対し、ダイレクトシークエンスや配列比較で評価した場合、９０％以上の相同性を有し、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する。
【００１５】
配列の相同性は、ダイレクトベストフィットシークエンスアラインメント比較法やＢＬＡＳＴなどの任意の相同性検索アルゴリズムによって、決定することができる。ＢＬＡＳＴの解説は、Altschul et al., in J Mol Biol 25:403 (1990)に記載されている。アラインメントの相同性スコアＳは、置換スコアとギャップスコアの和として計算される。「実質的な相同性」とは、ＢＬＡＳＴで評価した場合に、期待値（Ｅ）が低い場合を言う。期待値とは、Ｓと同等以上のスコアを有するアラインメントであって、データベース検索を行った場合偶然に検出されるアラインメントの数を示す。Ｅ値が低いほど、重大な意味を持つ。
【００１６】
特に、発現するアミノ酸に影響を及ぼさない塩基配列への修飾（遺伝子コードの重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）によるもの）は、「ホモログ」の定義に該当する。また、「ホモログ」には、配列番号１、３または５の任意の配列のうちの１５個の連続した塩基を有するポリヌクレオチドと、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが該当する。一つの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５の任意の配列のうちの２０個以上の連続した塩基（例えば、２５〜５０の連続した塩基）を有するポリヌクレオチドと、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする。
【００１７】
ポリ核酸の安定なハイブリダイゼーションは、水素結合による塩基対形成によって起こる。水素結合による塩基対形成は、二本鎖構造に含まれる２本のポリヌクレオチド鎖の相補性の程度およびハイブリダイゼーションが起こる条件によって、影響を受ける。特に、塩濃度および温度は、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす。当業者であれば、ポリヌクレオチド二重鎖の有効な溶融温度（Ｅ Ｔｍ）は、以下の式で示されることは自明であろう。
ＥＴｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇＭ［Ｎａ＋］）＋
０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ホルムアミド）
【００１８】
ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下で行われる場合、相補性が高い塩基対の配列のみが二重鎖として残る。ここで、ハイブリダーゼーションに関して「ストリンジェントな条件」とは、６０℃から６８℃の０．１×ＳＳＣで洗浄することを言う。洗浄条件には、適切な濃度のＳＤＳを任意に加えて良く、例えば、０．１％ＳＤＳを加えて良い。
【００１９】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一重鎖であっても二重鎖であってもよい。二重鎖ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）は、ほとんどの場合において、通常便宜良く応用することができる。ポリヌクレオチドは、ベクターの形であってよく、例えば発現ベクターであってよい。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、分離したポリヌクレオチドであっても、組換えポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、発現ベクターやクローニングベクターに取り込むことができる。このようなベクターは、宿主細胞の形質移入や形質転換を行うために用いることができ、宿主細胞は、従来の培養培地を用いて、公知の方法に従い、培養されたものであってよい。
【００２１】
クローンＤＮＡを適切なベクターに取り込む方法、宿主細胞の形質移入や形質転換の方法および形質移入や形質転換を行った細胞の選別方法は、すべて当業者には公知であり、多数の適切な方法が、文献に記載されている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001参照）。
【００２２】
適切な宿主細胞には、バクテリア、酵母、昆虫、ほ乳類および植物の細胞が含まれる。通常、宿主細胞には、使用するベクターに適合性のものが選択される。
【００２３】
一つの実施態様では、宿主細胞は、ヒトまたはヒト以外のＥＳ細胞であってよい。
別の態様では、本発明は、変異型ＲＮアーゼＨ２を発現するリンパ芽球様細胞株を提供する。
【００２４】
タンパク質（例えば、ＲＮアーゼＨ２Ａ、ＲＮアーゼＨ２Ｂ、ＲＮアーゼＨ２Ｃ）に関し「変異型」とは、野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を言う。ＲＮアーゼＨ２Ｂの野生型配列は配列番号２に、ＲＮアーゼＨ２Ｃの野生型配列は配列番号４に、ＲＮアーゼＨ２Ａの野生型配列は配列番号６に示してある。
【００２５】
変異型タンパク質は、野生型タンパク質とは異なる機能や活性を示すことができるが、これは本質的なことではない。タンパク質複合体（例えば、ＲＮアーゼＨ２）に関し「変異型」とは、複合体を構成するタンパク質のうち少なくとも１つが先に定めた変異型タンパク質である複合体を言う。変異型タンパク質複合体は、野生型複合体とは異なる機能や活性を示すことができるが、これは本質的なことではない。
【００２６】
一つの実施態様では、本発明は、配列番号１に示す塩基配列またはそのホモログからなる組換えポリヌクレオチドおよびその配列によりコードされるタンパク質を提供する。
【００２７】
一つの実施態様では、本発明は、配列番号３に示す塩基配列またはそのホモログからなる組換えポリヌクレオチドおよびその配列によりコードされるタンパク質を提供する。
【００２８】
一つの実施態様では、本発明は、配列番号５に示す塩基配列またはそのホモログからなる組換えポリヌクレオチドおよびその配列によりコードされるタンパク質を提供する。
更に別の態様では、本発明は、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
【００２９】
ここで、タンパク質の「ホモログ」とは、タンパク質に対してアミノ酸の欠失、置換または付加による修飾を行い、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％以上の相同性、例えば、少なくとも６６％や、例えば、少なくとも７０％の相同性を有するものを言う。一つの実施態様では、タンパク質は配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％の相同性または８０％の相同性、好ましくは８５％の相同性を有する。一つの実施態様では、ホモログは、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列に対し、９０％以上の相同性を有し、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する。「ホモログ」には、異なる種属由来のオーソロガスタンパク質を含む。
【００３０】
また、本発明は、配列番号１、３もしくは５のうちの任意の塩基配列またはそのホモログによってコードされるタンパク質を提供する。塩基配列は、ポリヌクレオチドの一部であってよく、そのポリヌクレオチドは任意の組換えポリヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドの一部を形成することができ、更にベクターの一部を形成することができる。
【００３１】
一つ実施態様では、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
一つ実施態様では、本発明は、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
【００３２】
一つ実施態様では、本発明は、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを提供する。
一つの実施態様では、本発明のタンパク質は、キメラ（融合）タンパク質の一部を形成することができる。
【００３３】
明確にしておくが、本明細書で使用される「タンパク質」とは、ペプチドまたはポリペプチドも意味し、ポリマーの特定の大きさについて示すものではない。
【００３４】
更に別の態様では、本発明は、ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５の塩基配列によってコードされるタンパク質またはそのホモログと
ｉｉ）配列番号２、配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログとからなる
ことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体を提供する。
【００３５】
一つの態様では、本発明は、ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号1の塩基配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｂまたは配列番号２のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、
ｉｉ）配列番号３の塩基配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｃまたは配列番号４のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、
ｉｉｉ）配列番号５の塩基配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ａまたは配列番号６のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ａのうち少なくとも１つを含む
ことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体を提供する。
【００３６】
一つの実施態様では、コンポーネントｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）のうち、少なくとも２つが含まれる（例えば、ｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｉ）、あるいはｉｉ）とｉｉｉ））。一つの実施態様では、３つのコンポーネントｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）がすべて含まれる。複合体の他のコンポーネントも任意に含まれてよい。
【００３７】
組換えＲＮアーゼＨ２複合体は、分子生物学で有用であり、特にｃＤＮＡ生産その他のプロセスでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを分解したり抑制するプロセスにおいて有用である。また、単一または複数のリボヌクレオチドが埋め込まれたＤＮＡ二重鎖を開裂する場合にも有用である。組換えＲＮアーゼＨ２複合体は、複合体の基質特異性や活性を変化させることができる化合物を特定するアッセイにも有用である。複合体の活性を変化させることができる化合物は、コンポーネントの任意の一つまたは複合体全体に対して作用する活性化因子（アゴニスト）や不活性化因子（アンタゴニスト）である場合がある。あるいは、酵素活性を変化させることができる化合物は、ＲＮアーゼＨ２の上流調節因子に対して作用する場合がある。アッセイは、細胞アッセイであってもよく、タンパク質アッセイであってもよい。複合体の１以上のコンポーネントは、例えば、ＡＧＳ４遺伝子のＧ３７Ｓのように、野生型から任意に突然変異を起こしていてもよい。このような突然変異が複合体の活性やその基質特異性に対して及ぼす影響については、アッセイにより評価することができる。
【００３８】
また、コンポーネントｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）のうちの任意の１つは、分子生物学やアッセイにおいて、残りの２つのコンポーネントのうちの１つまたは両方とは独立して使用することができる。
【００３９】
ＲＮアーゼＨ２は、細胞中においてＲＮアーゼＨ活性の主要な働きを担っているため、この酵素の活性が低下することによって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの代謝に依存する細胞プロセスに対して重大な影響を及ぼし、自己免疫疾患の病因を引き起こす原因となっていると考えられる。そのような自己免疫疾患には、ＡＧＳやＳＬＥの他、細菌感染症、特にウイルス感染症が含まれるが、それに限定されるものではない。細菌感染症には、その他、バクテリア感染症や真菌感染症がある。ウイルス感染症に関しては、特に、パンデミックウイルス感染症について言及する必要がある。例えば、インフルエンザウイルスによるパンデミックがあり、先天性免疫反応が不適切な不活性化作用を受けることにより、高い死亡率につながる。
【００４０】
ＲＮアーゼＨ２は、ラギング鎖のＤＮＡ複製過程において、岡崎フラグメントのＲＮＡプライマーを除去する働きに関与していると提唱されている。Ｒｎｈ２を欠失したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、生存能力に影響は生じないものの、ヒドロキシウレアに対する感受性が高くなる。
【００４１】
ＲＮアーゼＨ２は、１型ＲＮアーゼＨと異なり、ＤＮＡ中に埋め込まれた単一リボヌクレオチドを認識することができる。それゆえ、この酵素は、ゲノムＤＮＡ中に不適切に取り込まれたリボヌクレオチドを認識し、処理する上で重要である。このような誤った取り込みは、ｄＮＴＰが欠損した状態で頻繁に起こるが、このことは、Ｒｎｈ２突然変異株でヒドロキシウレアに対する感受性が高いことに対する別の説明を提供している。
【００４２】
一本鎖ＲＮＡが二重鎖ＤＮＡのうちの１本と結合すると、もう１本のＤＮＡ鎖は、一重鎖ＤＮＡの「Ｒ−ループ」を形成して移動する。このようなループは、真核細胞における転写後にＲＮＡ結合タンパク質の機能が阻害されたときにも起こる。ＲＮアーゼＨには、このような構造が起こることを抑制するとともに、その結果生じるゲノムＤＮＡの不安定性を抑制する働きがあると考えられている。
【００４３】
それゆえ、ＲＮアーゼＨ活性が失活することは、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ中に誤って取り込んだリボヌクレオチドの除去やＲ−ループ形成の抑制に関して、重大な結果をもたらす可能性がある。
【００４４】
逆転写は、ＨＩＶその他のレトロウイルスの複製に不可欠なプロセスであり、抗ウイルス療法の重要な薬剤標的である。このプロセスで形成するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、内因性ＲＮアーゼＨによる崩壊を起こす可能性があるため、抗ウイルス作用において重要な働きをすることができる。よって、ＲＮアーゼＨ２の突然変異により、ホストの抗ウイルス防御反応に障害が生じ、通常のウイルス病原菌の結果としてＡＧＳが引き起こされる場合が考えられる。
【００４５】
あるいは、免疫不全がＡＧＳ、ＳＬＥの原因であることも考えられ、細胞性ＲＮアーゼＨ活性の低下により内因性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドレベルが上昇している場合には、免疫不全が、自己免疫疾患や細菌感染症に関して重要な作用を及ぼしている可能性がある。ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡは、自然免疫の活性因子であって、Ｉ型インターフェロンの生産を活性化する（Kawai et al., Nat lmmunol 7:131-137, 2006およびKrieg et al., Annu Rev lmmunol 20:709-760, 2002を参照）。その他のヌクレアーゼが損傷を受け、死細胞から細胞外に放出される核酸を除去する機能が低下することにより核酸が循環する結果として、多系統自己免疫疾患が引き起こされる可能性が考えられている。これを支持する証拠としては、ＳＬＥ患者にはＤＮアーゼ１に異型接合突然変異が見られる場合があることや、ＤＮアーゼ１-/-マウスが紅斑様表現型を示すことが挙げられる（Napirei et al., Nat Genet 25:177-181, 2000参照）。更に、ＤＮアーゼＩＩ-/-|ｆｎＲ-/-マウスが関節リウマチに似た慢性多発性関節炎を示すことが最近報告されており（Kawane et al., Nature 443:998-1002, October 2006参照）、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが自然免疫を刺激し、ＡＧＳの診断に有用な高インターフェロンα濃度が上昇する理由の説明を示すと考えられている。ＲＮアーゼＨ２機能の障害も同様に、内因性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの濃度を上昇させ、その濃度上昇がｄｓＲＮＡやｄｓＤＮＡの場合と同様の機序によりインターフェロンαの産生を刺激することがある。以上のことから、中枢神経系に過剰に生産されたインターフェロンαによって、ＡＧＳの神経病理上の特徴を説明することができるが、それはトランスジェニックマウスモデルで示されており、このモデルでは神経膠細胞にインターフェロンαが常に発現している（Campbell et al., Brain Res 835146-61, 1999参照）。
【００４６】
ＳＬＥと自己免疫疾患との関連性は、最近の研究において示されており、例えば、Kelly et al., Arthritis Rheum 54:1557-1567, 2006では、ｄｓＲＮＡがＴＬＲに結合することによってＩＦＮの産生が起こることを示し、Lovgren et al., Arthritis Rheum 50:1861-1872, 2004では、ａｎｔｉ−ＲＮＡ ＡｂがＩＦＮ誘導に必要なことをｉｎ ｖｉｔｒｏＳＬＥアッセイで示しており、Sigurdsson et al. Am J Hum. Genet. 76:528-537, 2005においては、ＳＬＥがＩＦＮ経路の機能障害により生じること、そしてGraham et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 104:6758-6763, 2007では、ＩＦＮ調節因子の突然変異とＳＬＥリスク増加との関連性を示している。
【００４７】
最近の説では、インフルエンザに対する自然免疫反応にＳＬＥと共通の病因が見られることが報告されている。例えば、Cheung et al., Lancet 360:1831-1837, 2002では、ＴＮＦ―αの上昇はＨ５Ｎ１／９７型による病態の悪化に関連していることを示しており、Kobasa et al., Nature 445:3l9-323, 2007では、非ヒト霊長類において１９１８年型インフルエンザウイルスに対して非定型自然免疫反応が見られたことが報告され、Lipatov et al., Journal of General Virology 86:1121-1130, 2005は、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザに感染させた９種類のモデルにおいてサイトカインのバランスが崩れたことを示している。
【００４８】
従って、ＲＮアーゼＨ２の活性や基質特異性を変化させることができる化合物を提供することは、以下の目的において有益である：
ａ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、ＡＧＳの症状を抑えること。
ｂ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、微生物感染症を抑えること。なかでもバクテリア感染症やウイルス感染症があるが、これに限定されるものではない。レトロウイルス感染（ＨＩＶ感染等）については、特段の言及を要するが、この場合には、宿主細胞でウイルス複製が起こる際にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成される。また、インフルエンザのパンデミック株についても言及を要するが、例えば１９１８年型インフルエンザウイルス株やＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルス株のような死亡率が高いウイルス株では、自然免疫反応の活性化が不十分であることが示唆されている（Cheung et al., The Lancet 360:1831-1837, 2002およびLipatov et al., Journal of General Virology 86: 1121-1130, 2005参照）。
ｃ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、ゲノムＤＮＡの不安定度を低くすること、特にＲ−ループ形成を抑制すること。
ｄ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、自己免疫疾患を抑えること。自己免疫疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、セリアック病、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、アジソン病、関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症があるが、これらに限定するものではない。
ｅ）ＲＮアーゼＨ２活性を高めて、ｃＤＮＡの生産等、複合体による分子生物学的反応の効率を高めること。
ｆ）ＲＮアーゼＨ２活性を下げて、ウイルスを用いた遺伝子治療の効率を高めること。（ＲＮアーゼＨ２活性は、この治療法の有用性を阻害するホスト応答の一部を形成する。ＲＮアーゼＨ２活性を下げることにより、このホスト応答を少なくとも一部分抑制することにつながる。）
ｇ）ＲＮアーゼＨ２活性を下げて、ウイルス感染に対するホスト免疫反応を刺激すること（Akwa et al., J. Immunol 161:5016-26, 1998参照）。
【００４９】
更に、本発明では、ＲＮアーゼＨ２もしくはそのコンポーネントの活性化因子もしくは不活性化因子またはＲＮアーゼＨ２基質特異性の調節因子を特定するアッセイを提供し、当該アッセイは：
ｉ）被験物質とＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントと接触させ、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａまたはその任意の組み合わせである；
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、該被験物質存在下任意の時間にわたって測定する；及び
ｉｉｉ）該被験物質のＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントに対する活性を測ることを含む。
【００５０】
このアッセイは全てのＲＮアーゼＨ２複合体に対して実施することができ、その複合体は、上述の組換え複合体であってもよい。あるいは、このアッセイを修正して、ＲＮアーゼＨ２複合体のコンポーネントに対して実施することができ、そのコンポーネントは、例えば組換え体であるＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａであってもよい。
【００５１】
また、上述のアッセイは、被験物質とＲＮアーゼＨ２の変異体またはその変異コンポーネント（例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢもしくはＲＮＡＳＥＨ２Ｃまたはその組み合わせ）とを接触させて実施してもよい。ＲＮアーゼＨ２の変異体またはそのコンポーネントは、リンパ芽球様細胞株のような細胞株やげっ歯類のような非ヒトトランスジェニック動物で発現してもよい。
【００５２】
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２複合体は、細胞内に存在する。
一実施態様では、アッセイは、炎症調節因子に対して実施してよく、その調節因子は、向炎症性でも抗炎症性でもよい。一実施態様では、アッセイは、抗微生物（例えば、抗ウイルス）因子を特定するために実施してよい。
【００５３】
そのアッセイは、内因性ＲＮアーゼＨ２活性を測定する細胞系アッセイであってよい。このアッセイは、ＲＮアーゼＨ２またはＲＮアーゼＨ２の上流にある経路に対して間接的に作用する調節因子を特定することができる。このアッセイは、ウイルスのＲＮアーゼＨもしくはほ乳類（例えばヒト）のＲＮアーゼＨ２の不活性化因子または阻害因子の作用を測定するうえで有用であるが、それは、このような不活性化因子や阻害因子が、ウイルスＲＮアーゼＨのみに対して特異性があれば、有効な抗ウイルス療法となりうるからである。ここで述べたようなＲＮアーゼＨ２複合体に作用すると推定されるこのような抗ウイルス因子は、その効果、特にほ乳類ホストに対する副作用と考えられる範囲を生体内で測定する上で重要である。
【００５４】
前記アッセイの工程ｉｉ）は、例えば、標識化オリゴヌクレオチド基質を導入することにより、行うことができる。一実施態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２で分解すると、蛍光タグを放出する。分解を受けていないオリゴヌクレオチドは、もう一方の塩基鎖上の近傍にクエンチャ分子が存在するため、蛍光を発しない。このようにして、蛍光強度はＲＮアーゼＨ２活性の指標となる。この実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの基質として作用する。このオリゴヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡであっても、二重鎖ＲＮＡであっても、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子であってもよい。
【００５５】
工程ｉｉｉ）は、被験物質が存在しない同一の条件下におけるＲＮアーゼＨ２活性と比較することによって、行うことができる。
【００５６】
このアッセイは、一定の時間にわたって行うことができ（すなわち、動態アッセイ）、例えば、１０分から６０分間実施することができる。ＲＮアーゼＨ２活性の測定は、測定中、適当な時間間隔（好ましくは、一定の間隔）で行うことができ、例えば、２分から２０分間隔で実施することができる。一実施態様では、アッセイを３０分にわたり実施し、活性測定を５分ごとに行う。
【００５７】
更に、本発明は、ＲＮアーゼＨ２の一以上のコンポーネントにおける修飾（例えば、アミノ酸変異）の影響を測定するアッセイを提供し、当該アッセイは：
ｉ）少なくとも１つのコンポーネントが野生型に対して変異型であるＲＮアーゼＨ２を提供する；
ｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２とそれに対する基質とを接触させる；
ｉｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２の活性を、任意の時間にわたって測定する；及び、
ｉｖ）修飾されたコンポーネントがＲＮアーゼＨ２活性に及ぼす影響を測定すること含む。
【００５８】
一実施態様では、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂの野生型は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃの野生型は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ＲＮＡＳＥＨ２Ａの野生型は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００５９】
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２は、組換え体である。
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２は、リンパ芽球様細胞株のような細胞株で発現する。あるいは、ＲＮアーゼＨ２は、非ヒトトランスジェニック動物で発現することができる。
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２複合体は、細胞内に存在する。
【００６０】
上述アッセイの工程ｉｉ）は、例えば、標識化オリゴヌクレオチド基質を導入することにより、行うことができる。一実施態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２で分解すると、蛍光タグを放出する。分解を受けていないオリゴヌクレオチドは、もう一方の塩基鎖上の近傍にクエンチャ分子が存在するため蛍光を発しない。このようにして、蛍光強度はＲＮアーゼＨ２活性の指標となる。この実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの基質として作用する。このオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドが埋め込まれた二重鎖ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子であってもよい。
【００６１】
工程ｉｉｉ）は、被験物質が存在しない同一の条件下におけるＲＮアーゼＨ２活性と比較することによって、行うことができる。
【００６２】
一実施態様では、ＲＮアーゼＨ２複合体の修飾コンポーネントのアッセイは、その他のコンポーネントの存在下、非存在下で実施する。このような実施態様では、例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ（ＡＧＳ４）Ｇ３７ＳやＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＡＧＳ２）Ａ１７７Ｔのように、機能性に影響を及ぼすＲＮアーゼＨ２コンポーネント変異型を使用することが有益である場合があり、アッセイを実施することにより、ＲＮアーゼＨ２活性の回復を調べることができる。あるいは、アッセイを実施することにより、ＲＮアーゼＨ２活性の低下を調べることができる。あるいは、アッセイにより、ＲＮアーゼＨ２の基質特異性の変化を調べることができる。
【００６３】
このアッセイは、一定の時間にわたって行うことができ（すなわち、動態アッセイ）、例えば、１０から６０分間実施することができる。その場合、ＲＮアーゼＨ２活性の測定は、測定中、適当な時間間隔（好ましくは、一定の間隔）で行うことができ、例えば、２分から２０分間隔で実施することができる。一実施態様では、アッセイを３０分にわたり実施し、活性測定を５分ごとに行う。
【００６４】
ＲＮＡＳＥＨ２ノックアウトマウスを標準的な手法により作成することができる。このようなマウスに対して、Akwa et al., J Immunology 161:5016-5026 (1998) に示すように、ＩＦＮ−αを発現するトランスジェニックマウスで実施する方法に従ってウイルスでチャレンジを行った後、ほ乳類動物ＲＮアーゼＨ２のアゴニストを検査する目的で使用し、任意に上述のアッセイによりｉｎ ｖｉｖｏで検査を行い、ウイルスの作用が改善したかどうかを確認することができる。このようなノックアウトマウスは、本発明の一部分である。
【００６５】
別の態様では、本発明は、患者のゲノム中のＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子における突然変異を検出するアッセイが提供され、当該アッセイは：
ｉ）患者から採取した白血球細胞の溶解を行うこと、及び、
ｉｉ）溶解した白血球細胞のＲＮアーゼＨ２活性を測定することを含む。
【００６６】
検出する突然変異は、ＲＮアーゼＨ２活性に影響を及ぼす突然変異であって、その活性を野生型複合体の通常範囲に対して抑制または亢進するものである。
【００６７】
場合によって、通常範囲と比較してＲＮアーゼＨ２活性の低下または亢進が認められた場合には、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子の配列決定を実施することができる。
【００６８】
このアッセイは、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａの任意の遺伝子に異型または同型接合型突然変異によりＲＮアーゼＨ２活性が低下している患者を特定するので、ＡＧＳの診断上の補助としたり、あるいは子どもがＡＧＳ患者になるリスクがある親に対して適切なカウンセリングを行う上で用いることができる。このアッセイは、自己免疫疾患、先天的ウイルス感染症や（ＲＮアーゼＨ２活性の低下により）ウイルス感染の危険性が高い人に対して、診断治療を行う上でも有益となりうる。
【００６９】
同様に、このアッセイによって、ＳＬＥその他の自己免疫疾患患者や、子どもがＳＬＥその他の自己免疫疾患に罹患するリスクがある患者を特定することもできる。更に、このアッセイは、ウイルス感染症の程度に関する情報を提供したり、ウイルス感染症の診断補助として用いたり、微生物感染症に罹患しやすい患者を特定するために用いることができるが、特にウイルス感染症に限定されるものではない。
【００７０】
別の実施態様では、ＲＮアーゼＨ２活性を測定するこのアッセイは、患者から得られた遺伝子サンプルの遺伝子型を特定することのみによって実施することができ、その方法には、フィンガープリント法やサテライト法、あるいはゲノム中の関連部分の塩基配列を特定する方法がある。得られた遺伝子情報は、ＲＮアーゼＨ２活性が変化している患者を特定し、ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患、細菌感染症に対する罹患しやすさを診断し、または遺伝的リスクやその傾向を特定するための補助として用いることができる。
【００７１】
更に別の態様では、本発明には、配列番号１、３もしくは５のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質もしくはそのホモログ、配列番号２、４もしくは６のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはそのホモログもしくは上述の組換えＲＮアーゼＨ２複合体と特異的に結合することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体が含まれる。ＲＮアーゼＨ２複合体コンポーネントの内の任意の１つの変異体（例えば、ＲＮＡＳＥＨ２ＡのＧ３７Ｓ変異体）に対する抗体も、含まれる。モノクローナル抗体は、例えば、酵素活性を有する組換えＲＮアーゼＨ２複合体でマウスを免疫化した後、既知の方法によりハイブリドーマ融合を行うことにより産生することができる。クローンは、ＥＬＩＳＡ法により、スクリーニングを行い、更にエピトープタグを付けたコンストラクトを発現する細胞を用いた免疫蛍光法およびウエスタンブロットアッセイにより検証することができる。抗体は、分子生物学的手法の補助として、ＲＮアーゼＨ２の精製（例えば、診断テスト用）にまたはＲＮアーゼＨ２複合体もしくはその機能の検査の補助として、用いることができる。
【００７２】
一実施態様では、抗体は治療用抗体であって、ハイブリドーマのような細胞株で産生される(Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975およびGalfre Meth Enzymol 73:3, 1981参照）。適切な治療用抗体には、げっ歯類動物抗体、キメラ抗体、ｓｃＦｖｓ、ヒト型化抗体およびヒト抗体が含まれる。キメラ抗体は、遺伝子工学的に作成した抗体であり、約三分の一が非ヒト由来のタンパク質、約三分の二がヒト由来のタンパク質で構成されている。ヒト型化抗体は、遺伝子工学的に製造され、ヒト抗体中に最低量の非ヒトタンパク質（通常では５から１０％）を含み、有害なホスト免疫反応を最小限に抑えたものである（Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988参照）。
【００７３】
Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦｖフラグメントなど、抗体のフラグメントも「抗体」に該当する。
【００７４】
また、本発明は、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃに対するプライマーを少なくとも１つ含む診断キットを提供する。適切なプライマーには、表１に示したものが含まれ、適切な補助要素と組み合わされる。ここで言う適切な補助要素には、バッファ、ｄＮＴＰ、酵素（例えば、ＴＡＱポリメラーゼ）、標識化化合物等が含まれる。キットは、核酸サンプル中の遺伝子異常を検出するために用いられ、その遺伝子異常は（検出された場合には）、ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患や細菌感染症、特にウイルス感染症（ただし、これに限定されない。）に対する罹患しやすさに関する遺伝的傾向を示すことができる。
【００７５】
一実施態様では、上述したＲＮアーゼＨ２複合体に特異的な抗体を用いて、変異タンパク質を含むＲＮアーゼＨ２を特定することができる。
【００７６】
別の実施態様では、上述したＲＮアーゼＨ２複合体に特異的な抗体を治療に用いることができる。例えば、ウイルスを用いた遺伝子治療の効果を高めたり、ホストの免疫反応を刺激するために、この抗体を使用することが可能である。
【００７７】
本発明は、変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物の製造を提供し、糖が方法は：
ａ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子コンストラクトを非ヒト接合体または非ヒト胚幹細胞に導入すること、
ｂ）該接合体または胚幹細胞から非ヒトトランスジェニック動物を作成すること、
ｃ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を製造することを含む。
【００７８】
変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、タンパク質がトランスジェニック動物で発現されるように、プロモーターと連結する。
【００７９】
変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物は、本発明の更なる一態様である。
【００８０】
非ヒトトランスジェニック動物は、任意の適当な動物であってよく、マウス、ラット、霊長類、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、魚、ウシ、ブタおよびヒツジを適当な例として挙げることができる。しかし、このリストは、網羅したものではなく、他の動物も使用することが可能である。
【００８１】
一実施態様では、非ヒトトランスジェニック動物は、げっ歯類である。適当な例としては、ラットやマウスが含まれる。
【００８２】
本発明の方法において使用してもよい公知の技術で使用されている胚幹細胞には、Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＢＡ／、ＢＡＬＢ／ｃ、ＤＢＡ／２およびＳＶ１２９のマウス系列から得られた胚幹細胞があるが、これに限定されるものではない。好ましくは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚幹細胞を使用する（Seong, E et al., Trends Genet. 20, 59-62, 2004; Wolfer et al., Trends Neurosci. 25:336-340, 2002）。
【００８３】
導入遺伝子（ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃのコード遺伝子配列を含む。）は、種々の方法によって、動物の生殖細胞系列に導入することができる。例えば、導入遺伝子は、受精卵の雄性前核に直接インジェクトすることができる（例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press (1994)参照）。その結果１つの遺伝子座には導入遺伝子の異なる数のコピーがランダムに、通常はヘッドツーテール状に、導入されることとなる（例えば、Costantini and Lacy, Nature, 294, 92, 1981参照）。インジェクトした卵は、偽妊娠誘起したレシピエント雌へ移植する。そのようにして生まれる子孫の中には、導入遺伝子のコピーを一以上ゲノムに組み込んでいる場合があり、その部位は通常１つである。これらの創始動物を交配させて、トランスジェニック動物系列を作り、戻し交配を行って選択する遺伝子背景を有する系を作成する。当業者であれば、両染色体に導入遺伝子を導入することの利点を理解できよう。あるいは、導入遺伝子は、胚幹（ＥＳ）細胞における相同組換えなどのジーンターゲッティングにより動物に導入することができる。導入遺伝子を導入する方法として適切な既知の方法には、胚盤胞移植がある。この方法では、導入遺伝子を含むターゲティングコンストラクトは、当該分野で公知の方法により調製される。
【００８４】
導入遺伝子を含むターゲティングコンストラクトは、公知の方法により適当な宿主細胞に導入できる。トランスジェニック胚の生産およびそのスクリーニングは、例えば、Joyner ed., Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University press, 1993に記載されている既知の手法により行うことができる。トランスジェニック動物または胚のＤＮＡのスクリーニングは、サザンブロット法やＲＣＲ法により行うことができる。
【００８５】
非ヒトトランスジェニック動物は、健康な動物であってもよいし、導入遺伝子により導入した突然変異による疾患や障害の徴候を示してもよい。このようなトランスジェニック動物は、薬剤に関する薬理研究に適しており、例えばＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患やウイルス感染症の疾患モデルとして使用可能である。このようなモデルでは、ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患やウイルス感染症に対して罹患しやすくなっている。
【００８６】
本発明について、以下に示す非限定的な実施例や図により更に説明する。
【実施例】
【００８７】
実施例１：患者および被験者
本試験の対象患者は、全員ＡＧＳに関する診断規準を満たしており、早期脳障害を示す神経学的特徴を有し、出産前における一般感染症の感染を示す所見はなく、頭蓋内石灰沈着が典型的な領域に見られ、脳脊髄液（ＣＳＦ）リンパ球増多症（＞５細胞／ｍｍ３）またはＣＳＦ中にＩＦＮ−αが＞２ＩＵ／ｍＬであった。同意を得て、病気の子ども、その親および病気に罹患していない兄弟姉妹から血液サンプルを採取し、標準的な方法によりゲノムＤＮＡを末梢血白血球から抽出した。本試験は、Leeds Health Authority／United Teaching Hospitals NHS Trust Research Ethics CommitteeおよびScottish Multicentre Research Ethics Committee （０４：ＭＲＥ００／１９）の承認を受けて実施した。
【００８８】
ジェノタイピングおよび連鎖解析
ＳＮＰアレイによるゲノムワイドなスキャンをMRC Geneservice（Cambridge、UK）のAffymetrix Human Mapping 10K Xba142 2.0 GeneChipsRを用いて行った。既報の方法（Jackson et al., Am J Hum Genet 63: 541-546 (1998)）に従い、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄの遺伝子地図（http://research.marshfieldclinic.org/genetics）から選んだ確立されたマイクロサテライトマーカーおよびヒトゲノムブラウザ配列（２００４年５月版、http://genome.ucsc.edu/）により特定された新しいマイクロサテライトを用いて、ＡＧＳ２およびＡＧＳ３の座位の高密度ジェノタイピングを行った。連鎖解析は、ＧＥＮＨＵＮＴＥＲ（２．０β）（Kruglyak et al., Am J Hum Genet 56: 1347-1363 (1996)）を用いて、常染色体劣性遺伝モデルにより、疾患アレル頻度を１対１００、浸透率を１とし、マーカーのアレル頻度は等しいと仮定して実施した。
【００８９】
バイオインフォマティクス
データベース検索には、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/、Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用い、Ｅ値の包含閾値を２×１０−３として行ったが、このデータベースは、重複のない（non-redundant）タンパク質配列データベースである。
【００９０】
タンパク質の構造解析は、ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ（Schwede et al. Nucleic Acids Res 31:3381-3385 (2003)）を用いたｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ法により、デフォルト設定を用いて行い、ＷＨＡＴ−ＣＨＥＣＫ（Hooft et al. Nature 381:272 (1996)）により、ＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパク質（ＮＰ−００６３８８）の予測構造の精度を確認した。予測用テンプレートは、入手可能なもののなかでは最善のものである、構造が既知の４種類の古菌類ＲＮアーゼＨ２相同タンパク質１ｕａｘＡ、１ｉｏ２Ａ、１ｘ１ｐＡおよび１ｅｋｅＢを用いた。活性部位および予測される基質結合部位（Chapados et al., J Mol Biol 307: 541 -556 (2001)）は、ＶＭＤ（Ｖ１．８．３）（Humphrey et al., J Mol Graph 14: 33-38, 27-28 (1 996)）を用いて注釈付けを行った。
【００９１】
変異部位の検出
プライマーは、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＲＮＡＳＥＨ２Ａのコーディングエクソンの増幅を行うように設計した（プライマー配列を表１に示す。）。 精製したＰＣＲ増幅産物の配列は、ダイターミネーター（Applied Biosystems）を用い、ABI 3700 キャピラリーシーケンサ（Applied Biosystems）またはMegabace 500 キャピラリーシーケンサ（Amersham Pharmacia）を用いた電気泳動により決定した。変異解析は、Mutation Surveyor（Softgenetics）を使用して行った。
【００９２】
【表１】
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
ベクター作製
ほ乳類発現ベクターの作製には、Gatewayベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） を使用した。ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＲＮＡＳＥＨ２Ａのコーディング領域は、プラズミドクローン（それぞれ、ＣＳＯＤＦ０３１ＹＭ１５、ＣＲ６０２８７２（Iｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクローンＩＲＡＵｐ９６９Ｇ０３６１Ｄ、ＢＣ０１１７４８（ＲＺＰＤ））から増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１?に導入した。ＡＹＰ１は、既製品のｐＥＮＴＲＹベクター（クローンＩＯＨ２７９０７、Human Ultimate? Full ORF Gateway Shuttle Clone、ＮＭ＿０３２１９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ−ＤｅｓｔおよびｐＣＧＴ−Ｄｅｓｔは、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＧａｔｅｗａｙリーディングフレームカセットをｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)およびｐＣＧＴ (Van Aelst et al., Embo J 15:3778-3786 (1 996))のマルチクローニングサイトに挿入して作製した。部位特異的変異処理は、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ ｐＥＮＴＲＹクローンを用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキットをメーカーの指示に従って使用して実施した。
【００９７】
免疫沈降およびウェスタンブロッティング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの指示に従って使用し、各コンストラクト１μｇを一過的に共導入した。２４時間後に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．８）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ４０、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１μＭ ＤＴＴおよび１μＭ ＰＭＳＦにより４℃で１０分間細胞を溶解した。溶解した細胞は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．９）、１０ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロールおよび０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムで１：１に希釈し、１０分後に遠心分離（１５８００ｇ、１０分間、４℃）を行い抽出液を採取した。タンパク質を含む細胞溶解液５００μｇに対して、メーカーの指示に従いＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳアガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて、１μｇのマウス抗−ｍｙｃ 抗体（クローン９Ｂ１１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）または１μｇのマウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）により免疫沈降を行った。ウェスタンブロットには、マウス抗−ｍｙｃモノクローナル抗体を１／１０００、マウス抗−Ｔ７モノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を１／５０００の濃度で使用した。
【００９８】
ＲＮアーゼＨアッセイ
１０μＭのオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に対して６０ｍＭ ＫＣＩ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８中で９５℃で５分間変性行った後徐々に室温に戻すことにより、アニーリングを行った。ＲＮアーゼＨ活性蛍光測定法は、６０ｍＭ ＫＣＩ、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣ１２および０．２５μＭオリゴヌクレオチド二重鎖を含有する１００μＬを９６ウェル平底プレートで、オービタルシェーカーにより３７℃で３時間６０ｒｐｍで振とうさせて行った。各反応には、免疫沈降物の１／１０の量を使用し、陽性対照に２．５単位のＥ．ｃｏｌｉＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。蛍光は、ＶＩＣＴＯＲ２ １４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、励起フィルターを４８０ｎｍ、透過フィルターを５３５ｎｍとして１００ｍ秒間測定した。
【００９９】
結果
ＡＧＳ２座位の精査（refinement）およびＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）の同定
マイクロサテライトマーカーの高密度ジェノタイピングを１０家族に対して実施し、ＡＧＳ２座位の精製を行った。非同族の２家族（Ｆ８およびＦ１０、図７）に、同型接合マーカーの重なりを示す小領域が発見された。このような領域は、同質接合を起こした染色体領域を示すと考えられ（Broman et al., Am J Hum Genet 65:1493-1550 (1999) およびGibson et al., Hum Mol Genet 15:789-795 (2006)）、稀な劣性遺伝疾患の場合には疾患遺伝子を含む可能性が極めて高い（Lander et al., Science 265:2049-2054 (1987)）。この同型接合マーカーの重なり領域を用いることによって、ＡＧＳ２必須領域は、染色体１３ｑ１４．３上の遺伝子マーカーＡＣ１３７８８９０ＴＧ１９とＤ１３Ｓ７８８（図２）間の５７１ｋｂｐ領域にまで精製することができた。必須領域にある注釈付き４遺伝子全てのコーディングエクソンについて、配列を特定した。
【０１００】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）はＡＧＳ２遺伝子である
スクリーニングを行った家族中の７家族でＦＬＪ１１７１２のミスセンス変異が発見されたものの、病因変異は、ＤＬＥＵ７、ＧＵＣＹ１Ｂ２やＦＬＪ３０７０７には見られなかった。更に大きなコホートでＦＬＪ１１７１２の変異スクリーニングを実施したところ、この遺伝子の変異を示す家族が合計で１８家族発見された（表２、図２）。変異は、ほとんどがミスセンスであり、２つは異なる民族グループで頻繁に見られた（Ａ１７７Ｔ、Ｖ１８５Ｇ）。ミスセンス変異はすべて、ほ乳類で保存されている残基の非保存的置換であり（図８）、例外は単一の保存的残基変異（Ｙ２１９Ｈ）であって、この残基はＤｉｃｔｏｓｔｅｌｉｕｍにさかのぼるまで保存されている。ナンセンス変異は、２家族で見られ、エクソン２の終止コドン（Ｆ１７）およびイントロン６のスプライス供与部変異であった（Ｆ１５）。この両方のケースとも、疾患のある人は、合成異型接合型であり、二番目の変異はミスセンス変異であった。以上のことから、観察された変異スペクトラムによれば、変異による影響は、ＦＬＪ１１７１２タンパク質の完全な喪失ではなく、ハイポモルフ型（hypomorphic）であると考えられる。全家族において、変異は疾患と関連しており、親は全員この変異に関して異型接合型であった。各変異に対して、少なくとも１６０の対照アレルのジェノタイピングを行った。最も一般的な変異であるＡ１７７Ｔのみは、検査を実施した２４１個のサンプル中異型接合型と判明した人が１例であった。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）はイーストＲｎｈ２Ｂｐのオルソログである
ＦＬＪ１１７１２は、３０８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするが、このタンパク質は、機能がこれまで不明であった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＦＬＪ１１７１２は広範囲のヒト組織中に検出され、ユビキタスに発現することが示唆されている（データ示さず）。
【０１０４】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschuhl et al., Nucleic Acids Res 25:3389-3402 (1997)）を用いたデータベース検索により、４回検索繰り返しを行ったところ、ヒトＦＬＪ１１７１２とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタンパク質であるＲｎｈ２Ｂｐ（Ｒｎｈ２０２）には、かなりの類似性（Ｅ＝４×１０―５）が見られた（図８）。Ｒｎｈ２Ｂｐは、イーストＲＮアーゼＨ２酵素複合体の必須コンポーネントである（Jeong et al., Nucleic Acids Res 32:407-414 (2004)）。この発見からは、ＦＬＪ１１７１２がほ乳類でも同様の複合体で機能していることが考えられ、ＡＧＳの場合別のＲＮアーゼＨコンポーネントにも変異が生じている可能性を示唆する。
【０１０５】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）はＡＧＳ３遺伝子である
ＳＮＰアレイゲノムスキャンを５パキスタン人家族（Ｆ３０−３４）および１バングラデシュ家族（Ｆ３５）からなる非同族の６家族に対して行った。このスキャンとその後に行ったマイクロサテライトジェノタイピング（図９）により、染色体１１ｑ１３．２上のマーカーＤ１１Ｓ４２０５とＤ１１Ｓ９８７間に新規座位ＡＧＳ３を特定したが、これは最大多点ＬＯＤ値が６６．８ｃＭで４．５４であった（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ遺伝子地図）。更に、５パキスタン人家族におけるジェノタイピングにより、祖先ハプロタイプ（太字で示したジェノタイプ、図９）の存在が示唆されたが、これとＦ３０家族における小さな同型接合領域とにより、ＡＧＳ３必須領域をＤ１１Ｓ４２０５とＤ１１Ｓ９８７との間にある４．９ｃｍの区間に精製することができた。
【０１０６】
注目すべきこととして、ヒトＲＮアーゼＨ２Ａと生化学的に共精製されるタンパク質（Frank et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:12872-12877 (1988)）をコードするＡＹＰ１は、この必須領域内に存在する（図３）。そこで、ＡＹＰ１の配列を決定し、これらの６家族における非保存的ミスセンス変異を特定した（表３および図９参照）。コドン６９（Ｒ６９Ｗ）における同型接合性変異が、祖先ハプロタイプと考えられる遺伝子を共有する５パキスタン人家族の全患者に認められた。別の同型接合性変異であるＫ１４３１は、バングラデシュ家族に見られた。この変異は、家族内における疾患と関連しており、いずれの変異も少なくとも１７２個のアジア人対照アレルには見られなかった。ＲＴ−ＰＣＲによるＡＹＰ１の発現プロファイリングからは、ＦＬＪ１１７１２と類似した広範な発現パターンが示された。
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
同時に、発明者らは、ＡＹＰ１がイーストＲＮアーゼＨ２の第２サブユニットであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｈ２Ｃｐ（Jeong et al., Nucleic Acids Res 32:4407-414 (2004)）のオルソログであることを明らかにした。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉオープンリーディングフレームによるデータベース検索の４回の検索繰り返しにより、ヒトＡＹＰ１およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｒｎｈ２Ｃｐを特定した（図８）。
【０１０９】
ＲＮＡＳＥＨ２ＡはＡＧＳ４遺伝子である
ＲＮＡＳＥＨ２Ａは、染色体１９ｐ１３．１３上にある７ｋｂｐのエクソン８遺伝子であり、２９９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＲＮＡＳＥ２Ａは、遺伝子地図が作製されたいずれのＡＧＳ座位とも共局在化しなかった。しかし、ＳＮＰアレイゲノムスキャンデータを精査すると、既報のスペイン系白人の先祖を持つ非同族ＡＧＳ家族（Sanchis et al., J Pediatr 146:701-705, 2005参照）のＲＮＡＳＥ２Ａ座位に同型接合性を有する小さな領域を見出した（図４ａ）。この家族の２人の疾患小児に対して配列を調べると、ｃ．１０９Ｇ→Ａの同型接合性単一塩基転換が見られ、その結果Ｇ３７Ｓの非保存的ミスセンス変異を起こしていた（図４ｂ）。このアミノ酸は、ヒトから古細菌に至るまで広範囲に保存されており（図４ｃ）、基質結合溝の底部にある最初のβシートの終端の曲がった箇所に位置し、ＲＮアーゼＨ活性部位の近傍にある（図４ｄ）（Chapados et al., J Mol Biol 307:541-546, 2001）。この変異は、１７８個の白人対照アレルでは検出されず、両親は、この変異に関して異型接合型であった。
【０１１０】
ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ（ＦＬＪ１１７１２）、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ（ＡＹＰ１）およびＲＮＡＳＥＨ２Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮアーゼＨ２活性を有する複合体を形成する
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｈ２Ａｐ−Ｒｎｈ２Ｂｐ−Ｒｎｈ２Ｃｐ複合体との配列相同性に鑑みて、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＲＮＡＳＥＨ２Ａタンパク質は、ＲＮアーゼＨ２活性を有するタンパク質複合体を形成すると考えられる（図５ａ）。このことを検証するため、Ｇａｔｅｗａｙシステムを用いて３遺伝子のクローニングを行い、エピトープタグの付いたほ乳類発現ベクター（ｐＣＧＴ−Ｄｅｓｔ（Ｔ７）およびｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ−Ｄｅｓｔ）に導入し、この３種類のコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞に一過的に共導入した。抗ｍｙｃ抗体によるＣ末端タグ付きＦＬＪ１１７１２−ｍｙｃの免疫沈降により、Ｎ末端Ｔ７タグ付きＡＹＰ１およびＴ７タグ付きＲＮＡＳＥ２Ａのプルダウンが認められ（図５ｂ）、この３種類のサブユニットがｉｎ ｖｉｔｒｏで相互作用を有することが確認された。
【０１１１】
既報の蛍光測定法（Parniak et al., Anal Biochem 33-39, 2003）を適用して、この複合体の酵素活性を調べた。蛍光標識オリゴヌクレオチドをＤＡＢＣＹＬ標識化して蛍光を消光する相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングを行った（図５ｃ）。蛍光色素が結合したオリゴヌクレオチドに対して酵素による開裂が起こると、蛍光色素が隣接する消光分子から遊離して、蛍光シグナルが発生する（図５ｃ）。
【０１１２】
発明者らは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖である「オリゴＣ」が免疫沈降を起こした複合体により効果的に開裂することを見出し、この複合体がＲＮアーゼＨ活性を示すことが確認された（図５ｄ）。更に、この免疫沈降を起こした複合体は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中に埋め込まれた単一のリボヌクレオチドを認識し、「１型」ＲＮアーゼＨであるＥ．ｃｏｌｉのＲＮアーゼＨとは対照的に、「オリゴＢ」を効果的に開裂することから、必要とされる「２型」ＲＮアーゼＨ活性を有していることが分かる。想定されたように、「オリゴＡ」は、ヌクレアーゼ抵抗性２−Ｏ’メチルＲＮＡ構造を用いて合成されていることから、開裂を起こさなかった。
【０１１３】
ＲＮアーゼＨ２複合体の変異により酵素活性が低減する
選択した病因変異（ＦＬＪ１１７１２、Ａ１７７Ｔ、Ｔ１６３１；ＡＹＰ１、Ｒ６９Ｗ、Ｋ１４３Ｉ；ＲＮＡＳＥＨ２Ａ Ｇ３７Ｓ）を、各遺伝子の部位特異的変異処理を用いて導入し、ＨＥＫ２９３細胞に一過的に導入し、発現させた。. 免疫沈降を行って複合体の安定性に及ぼす影響を調べるとともに、酵素活性のアッセイを実施した（図６ａおよび６ｂ）。これらの実験により、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ Ｇ３７Ｓ変異は複合体の安定性には影響を及ぼさなかったものの、触媒部位における変異に想定されるように、酵素活性が顕著に低下したことが示された（図６ｂ）。ＡＹＰ１変異の場合には、他のサブユニットと複合体を形成してプルダウンを起こすＡＹＰサブユニット量が低下した。この低下は、酵素活性の低下と関連があった。このことから、酵素活性の低下は、変異によって複合体の形成が阻害された結果であることが示された。
【０１１４】
実施例２：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理したＨＣＴ１１６細胞のＲＮアーゼＨ２活性アッセイ
発明者らの観察によれば、ＡＧＳでは自然免疫が不適切に活性化されており、このことはＲＮアーゼＨ２が自然免疫反応に関与していることを示している。この検証を行うため、ｄｓＲＮＡの合成アナログであるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理したが、この合成アナログはウイルス感染症と関連があり、ｄｓＲＮＡ誘導性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）またはトル様受容体３（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３）を介するサイトカインの生産を誘発することにより自然免疫反応を刺激することが知られている。半密集（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態のＨＣＴ１１６結腸癌細胞に対して、２５μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、アメリカ）により、経時的に１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０培地で処理を行った。細胞からタンパク質を含む細胞溶解液を調製し、ＲＮアーゼＨ２蛍光測定アッセイを行った。
【０１１５】
結果を図１０に示す。２時間後には酵素活性が２倍になったことから、ＲＮアーゼＨ２がこの経路の下流に位置して、自然免疫反応の作動因子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）である可能性が示唆された。
【０１１６】
実施例３：ポリクローナル抗体
ＲＮアーゼＨ２イムノゲン（免疫原）をバクテリア発現タンパク質として発現することにより、ポリクローナル抗体を生成した（"Antibodies: A Laboratory Manual" HarlowおよびLane編集, Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８８年１２月１日発行）ISBN 978-0879693145参照）。この発現タンパク質を、Ｂサブユニットに付けたＧＳＴタグにより精製した。その後、このＧＳＴタグをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により切り離して、得られたタンパク質をヒツジ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に注入した。注入の際には、フロイントアジュバントを使用した。１回目の注入には、完全アジュバントを用い、その後は不完全アジュバントによりブーストを行った。その結果得られたヒツジ血清を抗原複合体が結合したカラムに通し、免疫アフィニティーを利用して精製した。この抗原複合体には、イムノゲンとして用いたものと同じものを使用した。ウェスタンブロット（図１１参照）により、抗体は、過剰発現した適正な分子量のサブユニットを検出可能であることが示されている。すなわち、抗体は、ＲＮアーゼＨ２のＡ、ＢおよびＣサブユニットに対する特異性を有することが示された。別のバンド（＊）は、内因性タンパク質のうちの１つを示している可能性がある。ウェスタンブロット法により得られたバンドについて、抗タグ抗体により再検索（ｒｅｐｒｏｂｉｎｇ）して、同定を行った。
【０１１７】
使用した免疫源配列は、以下のとおりである。
抗ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ用（プロテアーゼ切断から残ったリンカー残基を含む。）
LEVLFQGPLGSPEFPSTSLYKKAGSTMAAGVDCGDGVGARQHVFLVSE YLKDASKKMKNGLMFVKLVNPCSGEGAIYLFNMCLQQLFEVKVFKEKHH SWFINQSVQSGGLLHFATPVDPLFLLLHYLIKADKEGKFQPLDQVVVDNV FPNCILLLKLPGLEKLLHHVTEEKGNPEIDNKKYYKYSKEKTLKWLEKKVN QNAALKTNNVNVSSRVQSTAFFSGDQASTDKEEDYIRYAHGLISDYIPK ELSDDLSKYLKPEPSASLPNPPSKKIKLSDEPVEAKEDYTKFNTKDLKTE KKNSKMTAAQKALAKVDKSGMKSIDTFFGVKNKKKIGKV（配列番号５２）。
【０１１８】
抗ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ用
MESGDEAAIERHRVHLRSATLRDAVPATLHLLPCEVAVDGPAPVGRFFT PAIRQGPEGLEVSFRGRCLRGEEVAVPPGLVGWMVTEEKKVSMGKPD PLRDSGTDDQEEEPLERDFDRFIGATANFSRFTLWGLETIPGPDAKVRG ALTWPSLAAAIHAQVPED（配列番号５３）。
【０１１９】
抗ＲＮＡＳＥＨ２Ａ用
MDLSELERDNTGRCRLSSPVPAVCRKEPCVLGVDEAGRGPVLGPMVYA ICYCPLPRLADLEALKVADSKTLLESERERLFAKMEDTDFVGWALDVLSP NLISTSMLGRVKYNLNSLSHDTATGLIQYALDQGVNVTQVFVDTVGMPE TYQARLQQSFPGI EVNKAKADALYPVVSAASICAKVARDQAVKKWQFV EKLQDLDTDYGSGYPNDPKTKAWLKEHVEPVFGFPQFVRFSWRTAQTIL EKEAEDVIWEDSASENQEGLRKITSYFLNEGSQARPRSSHRYFLERGLE
SATSL（配列番号５４）。
【０１２０】
実施例４：リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）
ＡＧＳ患者の初代Ｂ細胞にＥＢＶを感染させ、継続的に増殖する細胞株として、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を作成した。ＬＣＬを作成する適切な方法は公知であり、例えば、Penno et al., Methods in Cell Science 15(1):43-47, 1993に記載されている。ＬＣＬに対して形質転換を行い、患者のサブユニットに見られる代表的な変異を示すようにした。
【０１２１】
以下のＬＣＬを作成した。
【表８】
【０１２２】
細胞性酵素活性は、すでに述べたＲＮアーゼＨ活性蛍光測定法によりアッセイすることができる。エンドポイントアッセイ（図１３）の他、キネティックアッセイも内蔵型温度制御装置（３７℃に設定）のついたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｉｌｌ型装置により一定の時間間隔（例えば、５分毎）で測定可能である。ＲＮアーゼＨ２変異リンパ芽球様細胞株の活性を調べるアッセイ例を図１３に示した。
【０１２３】
実施例５：組換えＲＮアーゼＨ２
３遺伝子を含むポリシストロン性バクテリア発現コンストラクトを用いて、酵素活性を有する組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質複合体を合成、精製した（図１５ａ参照）。変異型および野生型の複合体の活性は、図１５ｂに示すように、酵素アッセイにより測定することができる。
【０１２４】
実施例６：ウイルス複製を抑制するＲＮアーゼＨ２
ＲＮＡ−ＤＮＡ中間体は、ウイルスの複製に必須である。それゆえ、内因性ＲＮアーゼＨ２活性のアップレギュレーションは、ウイルス複製を抑制するためのホスト反応として有益であることが期待できる。発明者らは、この考えを支持する証拠を得ており、自然免疫シグナルの強力な活性因子であるｄｓＲＮＡ（ｐｏｌｙｌ：Ｃ）によるＨＣＴ１１６細胞処理後数時間内に酵素活性が増大する（図１０参照）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のうちの１つからなる塩基配列によってコードされるタンパク質またはそのホモログと、
ｉｉ）配列番号２、配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログとからなる
ことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体。
【請求項２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項３】
配列番号３に示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項４】
配列番号５に示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項５】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項６】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項７】
配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項８】
ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｂまたは配列番号２のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、
ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｃまたは配列番号４のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、および
ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ａまたは配列番号６のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ａのうち少なくとも１つを含むことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体。
【請求項９】
ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）のうち少なくとも２つを含むことを特徴とする請求項８のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項１０】
ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の各コンポーネントを含むことを特徴とする請求項８のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項１１】
配列番号１、３もしくは５のヌクレオチド配列またはそのホモログからなることを特徴とする組換えポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列またはそのホモログからなるタンパク質。
【請求項１４】
請求項１３のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１１または１４のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５のベクターを導入した宿主細胞。
【請求項１７】
ＲＮアーゼＨ２の変異体を発現するリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）。
【請求項１８】
請求項１７の細胞株であって、該ＲＮアーゼＨ２がＲＮアーゼＨ２ＢのＡ１７７Ｔ変異を有することを特徴とする細胞株。
【請求項１９】
請求項１７の細胞株であって、該ＲＮアーゼＨ２がＲＮアーゼＨ２ＡのＧ３７Ｓ変異を有することを特徴とする細胞株。
【請求項２０】
ＥＳ細胞株である請求項１６の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１２および１３のいずれかのタンパク質に特異的な抗体。
【請求項２２】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号１のポリヌクレオチドでコードされるタンパク質に特異的に結合することを特徴とする請求項２１の抗体。
【請求項２３】
配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号３のポリヌクレオチドでコードされるタンパク質に特異的に結合することを特徴とする請求項２１の抗体。
【請求項２４】
配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号５のポリヌクレオチドでコードされるタンパク質に特異的に結合することを特徴とする請求項２１の抗体。
【請求項２５】
ポリクローナル抗体である請求項２１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である請求項２１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
ヒト型化抗体である請求項２１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
治療に使用する請求項２１から２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
ＲＮアーゼＨ２もしくはそのコンポーネントの活性化因子もしくは不活性化因子またはＲＮアーゼＨ２基質特異性の調節因子を特定するアッセイであって、
ｉ）被験物質とＲＮアーゼＨ２組換え体またはそのコンポーネントと接触させる工程であって、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａもしくはその任意の組み合わせである工程、
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、被験物質存在下任意の時間で測定する工程、及び、
ｉｉｉ）該被験物質のＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントに対する活性を測る工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項３０】
ｉｉ）の工程を所定期間行い、ＲＮアーゼＨ２活性をその期間中定期的に測定することを特徴とする請求項２９のアッセイ。
【請求項３１】
組換えＲＮアーゼＨ２複合体がｉ）の工程に存在する請求項２９および３０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３２】
該ＲＮアーゼＨ２複合体が細胞中に存在する請求項３１のアッセイ。
【請求項３３】
ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢおよびＲＮＡＳＥＨ２Ｃのうちの１つがｉ）の工程に存在する請求項２９および３０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３４】
ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、標識化したオリゴヌクレオチドを導入することによって、ｉｉ）の工程で測定する請求項２９から３３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３５】
ＲＮアーゼＨ２もしくはそのコンポーネントの活性化因子もしくは不活性化因子またはＲＮアーゼＨ２基質特異性の調節因子を特定するアッセイであって、
ｉ）被験物質と変異型ＲＮアーゼＨ２またはその変異コンポーネントと接触させる工程であって、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃもしくはその任意の組み合わせである工程、
ｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、該被験物質存在下任意の時間で測定する工程、及び、
ｉｉｉ）該被験物質のＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントに対する活性を測る工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項３６】
ｉｉｉ）の工程を一定期間行い、ＲＮアーゼＨ２活性をその期間中定期的に測定することを特徴とする請求項３５のアッセイ。
【請求項３７】
該ＲＮアーゼＨ２が組換え体である請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３８】
該ＲＮアーゼＨ２がリンパ芽球様細胞株から発現した請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３９】
該ＲＮアーゼＨ２が非ヒトトランスジェニック動物により発現した請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４０】
該ＲＮアーゼＨ２複合体が細胞内に存在する請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４１】
ＲＮアーゼＨ２の１以上のコンポーネントにおける修飾の影響を測定するアッセイであって、
ｉ）少なくとも１つのコンポーネントが野生型に対して変異型であるＲＮアーゼＨ２を提供する工程、
ｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２とそれに対する基質とを接触させる工程、
ｉｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２の活性を、任意の時間にわたって測定する工程、及び、
ｉｖ）修飾されたコンポーネントがＲＮアーゼＨ２活性に及ぼす影響を測定する工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項４２】
ｉｉｉ）の工程を一定期間行い、ＲＮアーゼＨ２活性をその期間中定期的に測定することを特徴とする請求項４１のアッセイ。
【請求項４３】
該ＲＮアーゼＨ２がリンパ芽球様細胞株から発現した請求項４１および４２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４４】
該ＲＮアーゼＨ２が非ヒトトランスジェニック動物により発現した請求項４１および４２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４５】
該ＲＮアーゼＨ２複合体が細胞内に存在する請求項４１および４２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４６】
患者のゲノム中のＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子における突然変異を検出するアッセイであって、
ｉ）患者から採取した白血球の溶解を行う工程、
ｉｉ）溶解した白血球細胞のＲＮアーゼＨ２活性を測定する工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項４７】
ＳＬＥ、ＡＧＳ、自己免疫疾患、細菌感染症に対する罹患しやすさまたはその遺伝的リスクの診断を補助する方法であって、患者のＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃ遺伝子のジェノタイピングを行い、その結果を野生型と比較することを特徴とする方法。
【請求項４８】
該細菌感染症がウイルス感染症である請求項４７の方法。
【請求項４９】
変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を製造する方法であって、
ａ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子コンストラクトを非ヒト接合体または非ヒト胚幹細胞に導入する工程、
ｂ）該接合体または胚幹細胞から非ヒトトランスジェニック動物を作成する工程、及び、
ｃ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を製造する工程を含むことを特徴とするトランスジェニック動物の製造方法。
【請求項５０】
該トランスジェニック動物がげっ歯類である請求項４９の方法。
【請求項５１】
該トランスジェニック動物がマウスまたはラットである請求項５０の方法。
【請求項５２】
ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃの変異遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５３】
ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃを発現する細胞を有する請求項５２のトランスジェニック動物。
【請求項５４】
げっ歯類である請求項５２および５３のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５５】
マウスまたはラットである請求項５４のトランスジェニック動物。
【請求項５６】
ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患または細菌感染症のモデルとしての、請求項５２および５３のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項５７】
患者がＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患もしくは細菌感染症に対する罹患しやすさまたはその傾向もしくはリスクを有するか否かの診断を行う診断キットであって、適切な補助剤と組み合わせた、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃのプライマーを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項５８】
該細菌感染症がウイルス感染症である請求項５７の診断キット。
【請求項５９】
炎症調節活性を有する因子を特定するアッセイであって、
ｉ）被験物質とＲＮアーゼＨ２組換え体またはそのコンポーネントと接触させる工程であって、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａもしくはその任意の組み合わせである工程、及び、
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、被験物質存在下任意の時間で測定する工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項６０】
該因子が抗炎症性因子である請求項６０のアッセイ。
【請求項６１】
該因子が向炎症性因子である請求項６０のアッセイ。
【請求項１】
ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５のうちの１つからなる塩基配列によってコードされるタンパク質またはそのホモログと、
ｉｉ）配列番号２、配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログとからなる
ことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体。
【請求項２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項３】
配列番号３に示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項４】
配列番号５に示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項５】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項６】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項７】
配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのホモログを含むことを特徴とする請求項１のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項８】
ＲＮアーゼＨ２の組換え体であって、
ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｂまたは配列番号２のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、
ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ｃまたは配列番号４のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、および
ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列もしくはそのホモログによってコードされるＲＮＡＳＥＨ２Ａまたは配列番号６のアミノ酸配列もしくはそのホモログを有するＲＮＡＳＥＨ２Ａのうち少なくとも１つを含むことを特徴とするＲＮアーゼＨ２の組換え体。
【請求項９】
ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）のうち少なくとも２つを含むことを特徴とする請求項８のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項１０】
ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の各コンポーネントを含むことを特徴とする請求項８のＲＮアーゼＨ２組換え体。
【請求項１１】
配列番号１、３もしくは５のヌクレオチド配列またはそのホモログからなることを特徴とする組換えポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列またはそのホモログからなるタンパク質。
【請求項１４】
請求項１３のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１１または１４のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５のベクターを導入した宿主細胞。
【請求項１７】
ＲＮアーゼＨ２の変異体を発現するリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）。
【請求項１８】
請求項１７の細胞株であって、該ＲＮアーゼＨ２がＲＮアーゼＨ２ＢのＡ１７７Ｔ変異を有することを特徴とする細胞株。
【請求項１９】
請求項１７の細胞株であって、該ＲＮアーゼＨ２がＲＮアーゼＨ２ＡのＧ３７Ｓ変異を有することを特徴とする細胞株。
【請求項２０】
ＥＳ細胞株である請求項１６の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１２および１３のいずれかのタンパク質に特異的な抗体。
【請求項２２】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号１のポリヌクレオチドでコードされるタンパク質に特異的に結合することを特徴とする請求項２１の抗体。
【請求項２３】
配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号３のポリヌクレオチドでコードされるタンパク質に特異的に結合することを特徴とする請求項２１の抗体。
【請求項２４】
配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号５のポリヌクレオチドでコードされるタンパク質に特異的に結合することを特徴とする請求項２１の抗体。
【請求項２５】
ポリクローナル抗体である請求項２１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である請求項２１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
ヒト型化抗体である請求項２１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
治療に使用する請求項２１から２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
ＲＮアーゼＨ２もしくはそのコンポーネントの活性化因子もしくは不活性化因子またはＲＮアーゼＨ２基質特異性の調節因子を特定するアッセイであって、
ｉ）被験物質とＲＮアーゼＨ２組換え体またはそのコンポーネントと接触させる工程であって、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａもしくはその任意の組み合わせである工程、
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、被験物質存在下任意の時間で測定する工程、及び、
ｉｉｉ）該被験物質のＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントに対する活性を測る工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項３０】
ｉｉ）の工程を所定期間行い、ＲＮアーゼＨ２活性をその期間中定期的に測定することを特徴とする請求項２９のアッセイ。
【請求項３１】
組換えＲＮアーゼＨ２複合体がｉ）の工程に存在する請求項２９および３０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３２】
該ＲＮアーゼＨ２複合体が細胞中に存在する請求項３１のアッセイ。
【請求項３３】
ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢおよびＲＮＡＳＥＨ２Ｃのうちの１つがｉ）の工程に存在する請求項２９および３０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３４】
ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、標識化したオリゴヌクレオチドを導入することによって、ｉｉ）の工程で測定する請求項２９から３３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３５】
ＲＮアーゼＨ２もしくはそのコンポーネントの活性化因子もしくは不活性化因子またはＲＮアーゼＨ２基質特異性の調節因子を特定するアッセイであって、
ｉ）被験物質と変異型ＲＮアーゼＨ２またはその変異コンポーネントと接触させる工程であって、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃもしくはその任意の組み合わせである工程、
ｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、該被験物質存在下任意の時間で測定する工程、及び、
ｉｉｉ）該被験物質のＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントに対する活性を測る工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項３６】
ｉｉｉ）の工程を一定期間行い、ＲＮアーゼＨ２活性をその期間中定期的に測定することを特徴とする請求項３５のアッセイ。
【請求項３７】
該ＲＮアーゼＨ２が組換え体である請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３８】
該ＲＮアーゼＨ２がリンパ芽球様細胞株から発現した請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３９】
該ＲＮアーゼＨ２が非ヒトトランスジェニック動物により発現した請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４０】
該ＲＮアーゼＨ２複合体が細胞内に存在する請求項３５および３６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４１】
ＲＮアーゼＨ２の１以上のコンポーネントにおける修飾の影響を測定するアッセイであって、
ｉ）少なくとも１つのコンポーネントが野生型に対して変異型であるＲＮアーゼＨ２を提供する工程、
ｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２とそれに対する基質とを接触させる工程、
ｉｉｉ）該ＲＮアーゼＨ２の活性を、任意の時間にわたって測定する工程、及び、
ｉｖ）修飾されたコンポーネントがＲＮアーゼＨ２活性に及ぼす影響を測定する工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項４２】
ｉｉｉ）の工程を一定期間行い、ＲＮアーゼＨ２活性をその期間中定期的に測定することを特徴とする請求項４１のアッセイ。
【請求項４３】
該ＲＮアーゼＨ２がリンパ芽球様細胞株から発現した請求項４１および４２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４４】
該ＲＮアーゼＨ２が非ヒトトランスジェニック動物により発現した請求項４１および４２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４５】
該ＲＮアーゼＨ２複合体が細胞内に存在する請求項４１および４２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４６】
患者のゲノム中のＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣまたはＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子における突然変異を検出するアッセイであって、
ｉ）患者から採取した白血球の溶解を行う工程、
ｉｉ）溶解した白血球細胞のＲＮアーゼＨ２活性を測定する工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項４７】
ＳＬＥ、ＡＧＳ、自己免疫疾患、細菌感染症に対する罹患しやすさまたはその遺伝的リスクの診断を補助する方法であって、患者のＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃ遺伝子のジェノタイピングを行い、その結果を野生型と比較することを特徴とする方法。
【請求項４８】
該細菌感染症がウイルス感染症である請求項４７の方法。
【請求項４９】
変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を製造する方法であって、
ａ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子コンストラクトを非ヒト接合体または非ヒト胚幹細胞に導入する工程、
ｂ）該接合体または胚幹細胞から非ヒトトランスジェニック動物を作成する工程、及び、
ｃ）変異型ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃをコードするゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を製造する工程を含むことを特徴とするトランスジェニック動物の製造方法。
【請求項５０】
該トランスジェニック動物がげっ歯類である請求項４９の方法。
【請求項５１】
該トランスジェニック動物がマウスまたはラットである請求項５０の方法。
【請求項５２】
ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃの変異遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５３】
ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＨＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃを発現する細胞を有する請求項５２のトランスジェニック動物。
【請求項５４】
げっ歯類である請求項５２および５３のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５５】
マウスまたはラットである請求項５４のトランスジェニック動物。
【請求項５６】
ＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患または細菌感染症のモデルとしての、請求項５２および５３のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項５７】
患者がＡＧＳ、ＳＬＥ、自己免疫疾患もしくは細菌感染症に対する罹患しやすさまたはその傾向もしくはリスクを有するか否かの診断を行う診断キットであって、適切な補助剤と組み合わせた、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２ＢまたはＲＮＡＳＥＨ２Ｃのプライマーを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項５８】
該細菌感染症がウイルス感染症である請求項５７の診断キット。
【請求項５９】
炎症調節活性を有する因子を特定するアッセイであって、
ｉ）被験物質とＲＮアーゼＨ２組換え体またはそのコンポーネントと接触させる工程であって、該コンポーネントがＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａもしくはその任意の組み合わせである工程、及び、
ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２またはそのコンポーネントの活性を、被験物質存在下任意の時間で測定する工程を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項６０】
該因子が抗炎症性因子である請求項６０のアッセイ。
【請求項６１】
該因子が向炎症性因子である請求項６０のアッセイ。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１０−５２８５８２（Ｐ２０１０−５２８５８２Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３７７４（Ｐ２００９−５１３７７４）
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０５０３３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４１５８０
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル リサーチ カウンシル (60)
【出願人】（５０１３２３５８３）ユニバーシティ オブ リーズ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０５０３３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４１５８０
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル リサーチ カウンシル (60)
【出願人】（５０１３２３５８３）ユニバーシティ オブ リーズ (2)
【Ｆターム（参考）】
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