ＲＮＡの検出方法
【課題】微量のＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出する方法であって、かつ、コンタミネーションの危険も低いＲＮＡの検出方法を提供すること。
【解決手段】（ｉ）ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記工程（ｉ）で得た鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅する工程；
を含む核酸の増幅方法。
【解決手段】（ｉ）ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記工程（ｉ）で得た鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅する工程；
を含む核酸の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの検出方法に関する。より詳細には、微量のＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出する方法であって、かつ、コンタミネーションの危険も低いＲＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究や臨床診断において、核酸の増幅方法は微量な核酸を検出するための必須の技術として広範な分野で用いられている。現在、核酸の増幅方法は、微量なＲＮＡの検出方法としても活発に利用されている。ＲＮＡの検出方法として通常使用されるＲＴ−ＰＣＲ法は、まず、ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製し、その後、目的遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって、作製されたＤＮＡを増幅する、という方法をとっている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
【０００３】
そこで、ＰＣＲ法に代わる核酸増幅方法として、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。
【０００４】
SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
【０００５】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
【０００６】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後,RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
【０００７】
特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。
【０００８】
特開２００２−２３３３７９号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特開２００２−２３３３７９号公報に記載の方法では、非特異的な増幅産物の生成が顕著であるという問題があった。
【０００９】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)
【非特許文献２】Bio Industry,第18巻、2号（2001）
【非特許文献３】Nature,350,91〜(1991)
【非特許文献４】J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）
【特許文献１】特開平５−１３０８７０号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９４０６号号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、微量のＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出する方法であって、かつ、コンタミネーションの危険も低いＲＮＡの検出方法を提供することを解決すべき課題とした。さらには、本発明は、より簡単なプライマー設計でＲＮＡを検出する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、まず、標的ＲＮＡに逆転写酵素を作用させることで該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製した後、これをデオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、界面活性剤、オリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液に移し、実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行うことで、核酸を効率的に短時間で増幅し、検出できることを見出した。しかも、本発明で用いられているオリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅法で用いられていたような複雑な構造をしていないことを大きな特徴としている。例えば、ＩＣＡＮ法で用いられるようなキメラ構造やＬＡＭＰ法で用いられるようなループ構造をとらせるような構造を有する必要がない。
【００１２】
さらに、逆転写酵素及び鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが共に活性を有する反応液組成を見出すことで、ＲＮＡを鋳型として相補的なＤＮＡを作製する工程、作製されたＤＮＡを鋳型として核酸増幅を行う工程、及び、増幅産物を検出する工程を一つの反応容器中で連続的に行なうことに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明によれば、（ｉ）ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記工程（ｉ）で得た鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅する工程；
を含む核酸の増幅方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程（ｉ）と、該核酸断片を増幅する工程（ｉｉ）とが、単一の反応容器の中で連続して行われる。
好ましくは、逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来のＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活性の欠失した変異体であるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII、及びラウス関連ウイルス２由来のＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅからなる群から選択される逆転写酵素である。
【００１５】
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価は１２以上である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価は１４以上である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれる。
好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルである。
【００１６】
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、以下の化学式で表される。
【化１】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００１７】
好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートの少なくとも１つから選ばれる。
【００１８】
好ましくは、反応溶液は融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。
好ましくは、反応溶液は、各々１．０ｍＭ以上のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む。
好ましくは、反応溶液は、１μＭ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００１９】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端領域のみが上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と連続した１箇所でのみ実質的に相補的である。
【００２０】
好ましくは、少なくとも１種の鎖置換能を有するポリメラーゼは、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
【００２１】
好ましくは、反応溶液を５０℃以上の実質的に等温でインキュベートする。
好ましくは、上記工程（ii）で、実質的に等温でインキュベートする時間が６０分以内である。
【００２２】
本発明によればさらに、上記した本発明による核酸の増幅方法を行うことを含む、標的ＲＮＡを検出する方法が提供される。
【００２３】
上記の標的ＲＮＡを検出する方法において好ましくは、上記工程（ii）は、以下の工程を含む。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、変異部位を含む少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる標的ＲＮＡ逆転写反応産物を含む核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートする工程；及び
（２）前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応による核酸増幅反応が起きたか否かにより変異の有無を判定する工程：
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、まず、標的ＲＮＡに逆転写酵素を作用させることで該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製した後、これをデオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、界面活性剤、オリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液に移し、実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行うことで、核酸を効率的に短時間で増幅し、検出できることを見出した。
【００２５】
さらに、核酸を増幅する工程を等温で実施可能であるため、温度を周期的に上下させる必要がなく、上記工程を簡便な装置で実施することが可能となった。
【００２６】
しかも、本発明で用いられているオリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅法で用いられていたような複雑な構造をしていないことを大きな特徴としている。（例えば、ＩＣＡＮ法で用いられるようなキメラ構造やＬＡＭＰ法で用いられるようなループ構造をとらせるような構造を有する必要がない。）
【００２７】
その上、上記工程は一つの反応容器内で実施することができ、この場合、さらなる簡便化、迅速化が可能となる。また、コンタミネーションのリスクの低いＲＮＡ検出法となる。そして、そもそも核酸の増幅反応を利用しているため、高感度なＲＮＡ検出法でもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による標的ＲＮＡの検出方法は、まず、標的ＲＮＡに逆転写酵素を作用させることで、該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製した後、これをデオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、界面活性剤、オリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液に移し、実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする。
また、上記工程は一つの反応容器内で実施することも可能である。
【００２９】
以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００３０】
また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。
【００３１】
（２）逆転写酵素
本発明においては、逆転写酵素を用いる。逆転写酵素としては、標的ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
【００３２】
（３）逆転写用オリゴヌクレオチドプライマー
逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは３から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは６から５０ヌクレオチド程度である。
【００３３】
（４）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、好ましくは、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いることができる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
【００３４】
（５）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩、カルシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００３５】
（６）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加する。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという本発明の有利な効果が達成される。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ラウリル硫酸エステル塩（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ等）、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、セチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤、そして、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインのような双性（両性）界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。
【００３６】
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
【００３７】
【化２】
【００３８】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００３９】
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
【化３】
【００４０】
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。
【００４１】
（７）核酸増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー
本発明で核酸増幅反応に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
【００４２】
さらに、前記、オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅反応で用いられるような複雑な設計を必要としない。通常のＰＣＲ反応で用いられる少なくとも一組以上のプライマーを用いて等温増幅反応を行うことを可能にしたことが、本発明の大きな特徴である。詳細には、これらのプライマーは、ＬＡＭＰ法等で用いられるような５’末端が３’末端より伸長した部分と相補的になるループ構造を形成するような構造を持っていない。つまり、プライマーの3'末端の連続した領域が鋳型核酸と相補的である。さらに、ＳＤＡ法やＩＣＡＮ法で用いられるように、反応途上でプライマーが切断され、切断された３‘末端が新たな合成起点になるようなるような複雑な仕組みを持たない。
【００４３】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。
【００４４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。
【００４６】
（８）鋳型となるＲＮＡ
本発明において鋳型となるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスのゲノムＲＮＡなど、いずれでもよい。鋳型となるＲＮＡを含む可能性のある試料から調製したＲＮＡを使用してもよいし、鋳型となるＲＮＡを含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となるＲＮＡを含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、精液、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、スワブ、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のようなＲＮＡ含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料からＲＮＡを調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。ＲＮＡの試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
【００４７】
（９）鋳型となるＲＮＡの前処理
本発明において鋳型となるＲＮＡは、前処理工程を経た後に用いても良い。
前処理用の試薬は、例えば、界面活性剤、血液凝固防止剤、タンパク分解酵素、脂質分解酵素を含んでいてもよい。液性としては、酸性あるいはアルカリ性であってもよい。
前処理工程としては、高温（例えば９８℃）に加熱することや変性処理剤で処理する工程を含んでよい。また、高温に加熱後、４℃以下に急冷する工程を含んでもよい。
【００４８】
（１０）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。
【００４９】
（１１）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。
【００５０】
（１２）蛍光色素
本発明における反応溶液には、蛍光色素を含めることができる。蛍光色素としては、特に限定はないが、例えばSYBR GreenIなどを使用することができる。
【００５１】
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。TaqmanプローブやMolecular Beaconを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、SPRを用いて増幅産物を検出してもよい。
【００５２】
ピロリン酸マグネシウムを検出することによても核酸増幅の検出を行うことができる。この場合、濁度による検出など、その他の当業者に公知の方法により検出できる。
【００５３】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
＜実施例１＞ｔｏｔａｌＲＮＡ中のβアクチンｍＲＮＡの検出
（１）逆転写反応による標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡの作製
Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）０．１μｇ、Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １０ｎｍｏｌに純水を加えて１３μｌとし、６５℃で５分間加熱した。
上記反応液に５倍濃縮した逆転写バッファーを４μｌ、１００ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを２μｌ加え、４２℃で２分間加熱した。
上記反応液にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ加え、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１０分間加熱した。
【００５５】
（２）（１）で作製したＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応
配列特異的な核酸増幅を行うため、以下のプライマーを用いた。
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチンｍＲＮＡより逆転写されたＤＮＡ（及びその相補配列）を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
上記プライマーのβアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補配列）に対する位置関係の詳細を図１に示した。
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
【００５６】
＜反応液の組成＞
１０×Ｂｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ
ＭｇＳＯ4（１００ｍＭ） １．５μＬ
Ｔｗｅｅｎ２０（１０％(ｖ/ｖ)） ０．２５μＬ
ＤＭＳＯ １．２５μＬ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ ｅａｃｈ） １．４μＬ
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎI（２０００倍希釈） ０．５μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（１） １．６μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（２） １．６μＬ
Ｂｓｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０μＬ
（１）で得た反応溶液 １．０μＬ
精製水 １２．４μＬ
２５．０μＬ
【００５７】
（３） 増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図２に示す。
ＲＮＡ試料由来のサンプルから核酸の増幅が起きていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ｃｔ値）を算出したところ、２８．２分、２８．３分であった（ｎ＝２の実験）。
【００５８】
＜実施例２＞一つの反応容器中でのＲＮＡ検出
（１）逆転写反応及び核酸増幅反応
＜標的となるＲＮＡ＞
標的となるＲＮＡとして、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）０．１μｇを用いた。
配列特異的な核酸増幅を行うため、以下のプライマーを用いた。
【００５９】
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補鎖）を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
以下に示す反応液の組成で、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、６０℃で６０分間反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
【００６０】
＜反応液組成＞
鋳型ＲＮＡ（０．１μｇ/μＬ） １．０μＬ
Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ） １．０μＬ
Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（０．１μＭ） ２．０μＬ
１０×Ｂｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ
ＭｇＳＯ4（１００ｍＭ） １．５μＬ
Ｔｗｅｅｎ２０（１０％（ｖ/ｖ）） ０．２５μＬ
ＤＭＳＯ １．２５μＬ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ ｅａｃｈ） １．８μＬ
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎI（２０００倍希釈） ０．５μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（１） １．６μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（２） １．６μＬ
ＲＴａｓｅ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII） １．０μＬ
Ｂｓｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０μＬ
精製水 １７．０μＬ
２５．０μＬ
【００６１】
（２）増幅産物の検出
前記（１）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図３に示す。
ＲＮＡ試料から核酸の増幅が起きていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ｃｔ値）を算出したところ、１８．６分、１９．３分であった（ｎ＝２の実験）。なお、Ｃｔ値は、６０℃で反応を開始した時点を０分としている。
【００６２】
実施例１に比べて、検出にかかる時間を１０分程度短縮できた。
【００６３】
＜比較例＞ ＰＣＲ法を用いたｔｏｔａｌＲＮＡ中のβアクチンｍＲＮＡの検出
（１）逆転写反応による標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡの作製
Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）０．１μｇ、Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １０ｎｍｏｌに純水を加えて１３μｌとし、６５℃で５分間加熱した。
【００６４】
上記反応液に５倍濃縮した逆転写バッファーを４μｌ、１００ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを２μｌ加え、４２℃で２分間加熱した。
上記反応液にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ加え、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１０分間加熱した。
【００６５】
（２）（１）で作製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
配列特異的な核酸増幅を行うため、以下のプライマーを用いた。
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補鎖）を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
ＰＣＲは以下のような反応液組成で行なった。
【００６６】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １０．０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｅａｃｈ ４．０μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（１） ０．２５μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（２） ０．２５μＬ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I（１０００倍希釈） ０．５μＬ
Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
精製水 ３７．５μＬ
５０．０μＬ
【００６７】
ＰＣＲは以下の温度サイクルで行なった。
【００６８】
【化４】
【００６９】
なお、リアルタイム蛍光検出装置にＭｘ３０００ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた場合、この温度サイクルでは、１サイクル当たり２．１分かかる。
【００７０】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図４に示す。
【００７１】
ＲＮＡ試料由来のサンプルから核酸の増幅が起きていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときのサイクル（Ｃｔ値）を算出したところ、１９．７サイクル、１９．７サイクルであった（ｎ＝２の実験）。即ち、時間に直すと、４１．４分、４１．４分であった。
【００７２】
実施例１に対して、検出にかかる時間は１３分程度長かった。また、実施例２に対して、検出にかかる時間は２２分程度長かった。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、実施例で用いたプライマーのβアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補鎖）に対する位置関係の詳細を示す。
【図２】図２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図３】図３は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図４】図４は、比較例での増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの検出方法に関する。より詳細には、微量のＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出する方法であって、かつ、コンタミネーションの危険も低いＲＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究や臨床診断において、核酸の増幅方法は微量な核酸を検出するための必須の技術として広範な分野で用いられている。現在、核酸の増幅方法は、微量なＲＮＡの検出方法としても活発に利用されている。ＲＮＡの検出方法として通常使用されるＲＴ−ＰＣＲ法は、まず、ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製し、その後、目的遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって、作製されたＤＮＡを増幅する、という方法をとっている。ＰＣＲ法では、目的とする標的核酸配列を増幅させるために、鋳型である二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程（変性工程）、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる工程（アニーリング工程）、及びプライマーを起点として相補鎖を伸長する工程（伸長工程）の３つの工程から構成される。通常のＰＣＲ法においては、サーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程はそれぞれ異なる温度で行われている。しかし、３種類の異なる温度で核酸増幅反応を行うことは、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスも増大していくという問題があった。
【０００３】
そこで、ＰＣＲ法に代わる核酸増幅方法として、等温状態で実施することが可能な核酸増幅方法が開発されている。例えば、RCA（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、 ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等が挙げられる。
【０００４】
SDA法（特開平５−１３０８７０号）は、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法であり、ポリメラーゼ伸長反応を利用したターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレア−ゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレア−ゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。しかしながら、ポリメラーゼと共にエクソヌクレアーゼを用いる必要があり、コストがかかると共に、プライマーの設計を工夫する必要があった。
【０００５】
LAMP法は、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも6箇所の特定部位を相補的に認識する少なくとも4種のプライマーと、5’→3’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖DNAを１本鎖DNAとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のBst DNAポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。しかしながら、6箇所の特定部位を認識する少なくとも4種のプライマーを用いる必要があり、プライマー設計が非常に困難であった。
【０００６】
ICAN法も、近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法である。RNA-DNAキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseHを用いる等温の遺伝子増幅方法である。キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNAポリメラーゼにより相補鎖が合成される。その後,RNaseHがキメラプライマー由来のRNA部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起きるこの反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。しかしながら、この方法もキメラプライマーという特殊なプライマーを用いる必要がありプライマー設計が非常に困難である。
【０００７】
特表平１１−５０９４０６号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特表平１１−５０９４０６公報に記載の方法では比較的長い反応時間が必要であるなどの問題がある。
【０００８】
特開２００２−２３３３７９号公報には、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目的とする領域のＤＮＡを等温における反応によって増幅する方法が記載されている。しかしながら、特開２００２−２３３３７９号公報に記載の方法では、非特異的な増幅産物の生成が顕著であるという問題があった。
【０００９】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)
【非特許文献２】Bio Industry,第18巻、2号（2001）
【非特許文献３】Nature,350,91〜(1991)
【非特許文献４】J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）
【特許文献１】特開平５−１３０８７０号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９４０６号号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、微量のＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出する方法であって、かつ、コンタミネーションの危険も低いＲＮＡの検出方法を提供することを解決すべき課題とした。さらには、本発明は、より簡単なプライマー設計でＲＮＡを検出する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、まず、標的ＲＮＡに逆転写酵素を作用させることで該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製した後、これをデオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、界面活性剤、オリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液に移し、実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行うことで、核酸を効率的に短時間で増幅し、検出できることを見出した。しかも、本発明で用いられているオリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅法で用いられていたような複雑な構造をしていないことを大きな特徴としている。例えば、ＩＣＡＮ法で用いられるようなキメラ構造やＬＡＭＰ法で用いられるようなループ構造をとらせるような構造を有する必要がない。
【００１２】
さらに、逆転写酵素及び鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが共に活性を有する反応液組成を見出すことで、ＲＮＡを鋳型として相補的なＤＮＡを作製する工程、作製されたＤＮＡを鋳型として核酸増幅を行う工程、及び、増幅産物を検出する工程を一つの反応容器中で連続的に行なうことに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明によれば、（ｉ）ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記工程（ｉ）で得た鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅する工程；
を含む核酸の増幅方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程（ｉ）と、該核酸断片を増幅する工程（ｉｉ）とが、単一の反応容器の中で連続して行われる。
好ましくは、逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来のＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活性の欠失した変異体であるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII、及びラウス関連ウイルス２由来のＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅからなる群から選択される逆転写酵素である。
【００１５】
好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価は１２以上である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価は１４以上である。
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれる。
好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルである。
【００１６】
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、以下の化学式で表される。
【化１】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００１７】
好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートの少なくとも１つから選ばれる。
【００１８】
好ましくは、反応溶液は融解温度調整剤をさらに含む。
好ましくは、融解温度調整剤は、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である。
好ましくは、反応溶液は、各々１．０ｍＭ以上のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む。
好ましくは、反応溶液は、１μＭ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００１９】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端領域のみが上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と連続した１箇所でのみ実質的に相補的である。
【００２０】
好ましくは、少なくとも１種の鎖置換能を有するポリメラーゼは、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである。
【００２１】
好ましくは、反応溶液を５０℃以上の実質的に等温でインキュベートする。
好ましくは、上記工程（ii）で、実質的に等温でインキュベートする時間が６０分以内である。
【００２２】
本発明によればさらに、上記した本発明による核酸の増幅方法を行うことを含む、標的ＲＮＡを検出する方法が提供される。
【００２３】
上記の標的ＲＮＡを検出する方法において好ましくは、上記工程（ii）は、以下の工程を含む。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、変異部位を含む少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる標的ＲＮＡ逆転写反応産物を含む核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートする工程；及び
（２）前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応による核酸増幅反応が起きたか否かにより変異の有無を判定する工程：
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、まず、標的ＲＮＡに逆転写酵素を作用させることで該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製した後、これをデオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、界面活性剤、オリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液に移し、実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行うことで、核酸を効率的に短時間で増幅し、検出できることを見出した。
【００２５】
さらに、核酸を増幅する工程を等温で実施可能であるため、温度を周期的に上下させる必要がなく、上記工程を簡便な装置で実施することが可能となった。
【００２６】
しかも、本発明で用いられているオリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅法で用いられていたような複雑な構造をしていないことを大きな特徴としている。（例えば、ＩＣＡＮ法で用いられるようなキメラ構造やＬＡＭＰ法で用いられるようなループ構造をとらせるような構造を有する必要がない。）
【００２７】
その上、上記工程は一つの反応容器内で実施することができ、この場合、さらなる簡便化、迅速化が可能となる。また、コンタミネーションのリスクの低いＲＮＡ検出法となる。そして、そもそも核酸の増幅反応を利用しているため、高感度なＲＮＡ検出法でもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による標的ＲＮＡの検出方法は、まず、標的ＲＮＡに逆転写酵素を作用させることで、該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを作製した後、これをデオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、界面活性剤、オリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液に移し、実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行うことを特徴とする。
また、上記工程は一つの反応容器内で実施することも可能である。
【００２９】
以下、本発明で用いる成分について説明する。
（１）デオキシヌクレオチド３リン酸
伸長反応の基質として、デオキシヌクレオチド３リン酸を用いる。具体的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物を使用することが好ましい。デオキシヌクレオチド３リン酸としては、ｄＮＴＰのアナログ（例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００３０】
また、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０ｍＭから２．０ｍＭ、特に好ましくは１．０ｍＭから１．５ｍＭの範囲である。
【００３１】
（２）逆転写酵素
本発明においては、逆転写酵素を用いる。逆転写酵素としては、標的ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）などを使用することができる。また、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
【００３２】
（３）逆転写用オリゴヌクレオチドプライマー
逆転写反応に使用されるプライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーでもよいし、オリゴｄＴプライマーやランダムな配列を有するプライマーでもよい。逆転写用プライマーの長さは好ましくは３から１００ヌクレオチド程度であり、更に好ましくは６から５０ヌクレオチド程度である。
【００３３】
（４）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、好ましくは、鎖置換能を有するポリメラーゼを用いることができる。本明細書において「鎖置換能」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displacement）することができる活性のことをいう。鎖置換能を有するポリメラーゼの具体例としては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鎖置換能を有するポリメラーゼは、天然由来のものでもよいし、遺伝子工学的に製造した組み換え蛋白質でもよい。
【００３４】
（５）２価の陽イオン
本発明では、使用する酵素の金属要求性等に２価の陽イオンを用いる。２価の陽イオンとしては、マグネシウム塩、カルシウム塩やその他の金属塩を使用することができ、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどを使用できる。２価の陽イオンの濃度は最終濃度で、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。
【００３５】
（６）界面活性剤
本発明では、反応溶液中に界面活性剤を添加する。界面活性剤を使用することにより、非特異的な核酸の増幅を防止するという本発明の有利な効果が達成される。本発明で使用できる界面活性剤の種類は、特には限定されないが、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ラウリル硫酸エステル塩（ＳＤＳ）、スルホコハク酸オクチルエステル塩、ステアリン酸石けんなどの陰イオン（アニオン）性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ等）、ＰＯＥアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ等）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテルなどの非イオン（ノニオン）性界面活性剤、セチルピリジニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン（カチオン）性界面活性剤、そして、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインのような双性（両性）界面活性剤などを使用できる。界面活性剤の使用量は本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、通常は１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である。
【００３６】
界面活性剤の中でも、非イオン性界面活性剤を使用することが特に好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水性がより強い界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ価で示すと１２以上が好ましい。より好ましくは１４以上であり、上限は２０まで好ましく用いることができる。さらに好ましくは１７以下であり、より好ましくは１４以上１７以下である。構造的には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることが好ましい。さらに、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの中でも、脂肪酸エステルが一つだけのものが好ましい。例えば、以下の構造式で表すことができる。
【００３７】
【化２】
【００３８】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【００３９】
アルキル基の位置は特に限定されず、以下のような構造でも好ましく用いることができる。
【化３】
【００４０】
このような界面活性剤として、物質名でポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート等が挙げられる。（商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等）の界面活性剤が挙げられる。また、使用量も特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０５％以上、より好ましくは０．１％以上である。
【００４１】
（７）核酸増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー
本発明で核酸増幅反応に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能なものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有することにより、鋳型となるＤＮＡにアニーリングすることができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成されたものを使用することができ、さらに、修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するものでもよい。
【００４２】
さらに、前記、オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の等温増幅反応で用いられるような複雑な設計を必要としない。通常のＰＣＲ反応で用いられる少なくとも一組以上のプライマーを用いて等温増幅反応を行うことを可能にしたことが、本発明の大きな特徴である。詳細には、これらのプライマーは、ＬＡＭＰ法等で用いられるような５’末端が３’末端より伸長した部分と相補的になるループ構造を形成するような構造を持っていない。つまり、プライマーの3'末端の連続した領域が鋳型核酸と相補的である。さらに、ＳＤＡ法やＩＣＡＮ法で用いられるように、反応途上でプライマーが切断され、切断された３‘末端が新たな合成起点になるようなるような複雑な仕組みを持たない。
【００４３】
オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、特に限定されないが、一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度の長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度の長さであり、さらに好ましくは１５〜４０ヌクレオチド程度の長さである。
【００４４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライド バイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型など）を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプライマーの使用量は、反応溶液中において０．１μＭ以上が好ましく、１μＭ以上がさらに好ましく、１．５μＭ以上が特に好ましい。
【００４６】
（８）鋳型となるＲＮＡ
本発明において鋳型となるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスのゲノムＲＮＡなど、いずれでもよい。鋳型となるＲＮＡを含む可能性のある試料から調製したＲＮＡを使用してもよいし、鋳型となるＲＮＡを含む可能性のある試料をそのまま直接使用してもよい。鋳型となるＲＮＡを含む試料の種類は特に限定されず、例えば、体液（例えば、全血、血清、尿、脳脊髄液、精液、唾液など）、組織（例えば、癌組織など）、スワブ、細胞培養物のような生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のようなＲＮＡ含有試料、微生物が混入している可能性のある試料（例えば、食品など）、あるいは土壌、排水のような環境中の試料が挙げられる。上記したような試料からＲＮＡを調製する場合、その調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた精製など当業者に公知の方法を用いることができる。ＲＮＡの試料からの精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などにより行うことができる。
【００４７】
（９）鋳型となるＲＮＡの前処理
本発明において鋳型となるＲＮＡは、前処理工程を経た後に用いても良い。
前処理用の試薬は、例えば、界面活性剤、血液凝固防止剤、タンパク分解酵素、脂質分解酵素を含んでいてもよい。液性としては、酸性あるいはアルカリ性であってもよい。
前処理工程としては、高温（例えば９８℃）に加熱することや変性処理剤で処理する工程を含んでよい。また、高温に加熱後、４℃以下に急冷する工程を含んでもよい。
【００４８】
（１０）融解温度調整剤
本発明における反応溶液には、融解温度調整剤を添加することができる。融解温度調整剤の具体例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、テトラアルキルアンモニウム塩、またはこれらの２種以上の混合物を挙げることができる。融解温度調整の使用量は特に限定されないが、ＤＭＳＯやホルムアミド、グリセロールの場合、通常は反応溶液中に１０％以下の量で含めることができる。
ベタインやテトラアルキルアンモニウム塩は、０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度添加することができる。
【００４９】
（１１）緩衝成分
本発明における反応溶液には、緩衝成分を含めることができる。緩衝成分としては、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）などを使用することができる。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨは、増幅反応に用いられる酵素の至適ｐＨにもよるが、一般的には６．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．０のものを使用できる。
【００５０】
（１２）蛍光色素
本発明における反応溶液には、蛍光色素を含めることができる。蛍光色素としては、特に限定はないが、例えばSYBR GreenIなどを使用することができる。
【００５１】
本発明の核酸の増幅方法により得られる増幅物は、当業者に公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって特定サイズの反応産物を検出することができる。増幅産物を検出するための検出系は、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。TaqmanプローブやMolecular Beaconを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、SPRを用いて増幅産物を検出してもよい。
【００５２】
ピロリン酸マグネシウムを検出することによても核酸増幅の検出を行うことができる。この場合、濁度による検出など、その他の当業者に公知の方法により検出できる。
【００５３】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
＜実施例１＞ｔｏｔａｌＲＮＡ中のβアクチンｍＲＮＡの検出
（１）逆転写反応による標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡの作製
Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）０．１μｇ、Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １０ｎｍｏｌに純水を加えて１３μｌとし、６５℃で５分間加熱した。
上記反応液に５倍濃縮した逆転写バッファーを４μｌ、１００ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを２μｌ加え、４２℃で２分間加熱した。
上記反応液にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ加え、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１０分間加熱した。
【００５５】
（２）（１）で作製したＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応
配列特異的な核酸増幅を行うため、以下のプライマーを用いた。
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチンｍＲＮＡより逆転写されたＤＮＡ（及びその相補配列）を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
上記プライマーのβアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補配列）に対する位置関係の詳細を図１に示した。
以下に示す反応液の組成で、６０℃、６０分反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
【００５６】
＜反応液の組成＞
１０×Ｂｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ
ＭｇＳＯ4（１００ｍＭ） １．５μＬ
Ｔｗｅｅｎ２０（１０％(ｖ/ｖ)） ０．２５μＬ
ＤＭＳＯ １．２５μＬ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ ｅａｃｈ） １．４μＬ
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎI（２０００倍希釈） ０．５μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（１） １．６μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（２） １．６μＬ
Ｂｓｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０μＬ
（１）で得た反応溶液 １．０μＬ
精製水 １２．４μＬ
２５．０μＬ
【００５７】
（３） 増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図２に示す。
ＲＮＡ試料由来のサンプルから核酸の増幅が起きていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ｃｔ値）を算出したところ、２８．２分、２８．３分であった（ｎ＝２の実験）。
【００５８】
＜実施例２＞一つの反応容器中でのＲＮＡ検出
（１）逆転写反応及び核酸増幅反応
＜標的となるＲＮＡ＞
標的となるＲＮＡとして、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）０．１μｇを用いた。
配列特異的な核酸増幅を行うため、以下のプライマーを用いた。
【００５９】
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補鎖）を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
以下に示す反応液の組成で、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、６０℃で６０分間反応させることで増幅反応を実施した。酵素は、ＮＥＢ社のBst.DNA polymeraseを使用した。
【００６０】
＜反応液組成＞
鋳型ＲＮＡ（０．１μｇ/μＬ） １．０μＬ
Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ） １．０μＬ
Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（０．１μＭ） ２．０μＬ
１０×Ｂｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ
ＭｇＳＯ4（１００ｍＭ） １．５μＬ
Ｔｗｅｅｎ２０（１０％（ｖ/ｖ）） ０．２５μＬ
ＤＭＳＯ １．２５μＬ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ ｅａｃｈ） １．８μＬ
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎI（２０００倍希釈） ０．５μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（１） １．６μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（２） １．６μＬ
ＲＴａｓｅ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII） １．０μＬ
Ｂｓｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０μＬ
精製水 １７．０μＬ
２５．０μＬ
【００６１】
（２）増幅産物の検出
前記（１）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図３に示す。
ＲＮＡ試料から核酸の増幅が起きていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ｃｔ値）を算出したところ、１８．６分、１９．３分であった（ｎ＝２の実験）。なお、Ｃｔ値は、６０℃で反応を開始した時点を０分としている。
【００６２】
実施例１に比べて、検出にかかる時間を１０分程度短縮できた。
【００６３】
＜比較例＞ ＰＣＲ法を用いたｔｏｔａｌＲＮＡ中のβアクチンｍＲＮＡの検出
（１）逆転写反応による標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡの作製
Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）０．１μｇ、Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）１００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １０ｎｍｏｌに純水を加えて１３μｌとし、６５℃で５分間加熱した。
【００６４】
上記反応液に５倍濃縮した逆転写バッファーを４μｌ、１００ｍＭのＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを２μｌ加え、４２℃で２分間加熱した。
上記反応液にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μｌ加え、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１０分間加熱した。
【００６５】
（２）（１）で作製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
配列特異的な核酸増幅を行うため、以下のプライマーを用いた。
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補鎖）を標的に設計を行った。各プライマーの配列を以下に示す。
プライマー(1)(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５'−GGGCATGGGTCAGAAGGATT−３'（配列番号１）
プライマー(2)(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５'−CCTCGTCGCCCACATAG−３'（配列番号２）
ＰＣＲは以下のような反応液組成で行なった。
【００６６】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １０．０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｅａｃｈ ４．０μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（１） ０．２５μＬ
５０μＭ ｐｒｉｍｅｒ（２） ０．２５μＬ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ I（１０００倍希釈） ０．５μＬ
Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
精製水 ３７．５μＬ
５０．０μＬ
【００６７】
ＰＣＲは以下の温度サイクルで行なった。
【００６８】
【化４】
【００６９】
なお、リアルタイム蛍光検出装置にＭｘ３０００ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた場合、この温度サイクルでは、１サイクル当たり２．１分かかる。
【００７０】
（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。結果を図４に示す。
【００７１】
ＲＮＡ試料由来のサンプルから核酸の増幅が起きていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときのサイクル（Ｃｔ値）を算出したところ、１９．７サイクル、１９．７サイクルであった（ｎ＝２の実験）。即ち、時間に直すと、４１．４分、４１．４分であった。
【００７２】
実施例１に対して、検出にかかる時間は１３分程度長かった。また、実施例２に対して、検出にかかる時間は２２分程度長かった。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、実施例で用いたプライマーのβアクチンｍＲＮＡより逆転写されるＤＮＡ（及びその相補鎖）に対する位置関係の詳細を示す。
【図２】図２は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図３】図３は、本発明による増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【図４】図４は、比較例での増幅反応で得られた増幅産物についての蛍光検出の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記工程（ｉ）で得た鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅する工程；
を含む核酸の増幅方法。
【請求項２】
ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程（ｉ）と、該核酸断片を増幅する工程（ｉｉ）とが、単一の反応容器の中で連続して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来のＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活性の欠失した変異体であるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII、及びラウス関連ウイルス２由来のＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅからなる群から選択される逆転写酵素であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価が１２以上であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、以下の化学式で表されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【化１】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【請求項８】
反応溶液が融解温度調整剤をさらに含む、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプライマーが上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端領域のみが上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の鎖置換能を有するポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
反応溶液を５０℃以上の実質的に等温でインキュベートする、請求項１から１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
上記工程（ii）で、実質的に等温でインキュベートする時間が６０分以内である、請求項１から１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れかに記載の核酸の増幅方法を行うことを含む、標的ＲＮＡを検出する方法。
【請求項１５】
上記工程（ii）が、以下の工程を含む請求項１４に記載の方法。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、変異部位を含む少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる標的ＲＮＡ逆転写反応産物を含む核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートする工程；及び
（２）前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応による核酸増幅反応が起きたか否かにより変異の有無を判定する工程：
【請求項１】
（ｉ）ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも０．０１％以上の界面活性剤、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記工程（ｉ）で得た鋳型となる核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートすることによって前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応を行い、該核酸断片を増幅する工程；
を含む核酸の増幅方法。
【請求項２】
ＲＮＡに逆転写酵素を作用させて核酸断片を調製する工程（ｉ）と、該核酸断片を増幅する工程（ｉｉ）とが、単一の反応容器の中で連続して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来のＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活性の欠失した変異体であるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII、及びラウス関連ウイルス２由来のＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅからなる群から選択される逆転写酵素であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価が１２以上であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系から選ばれることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、以下の化学式で表されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【化１】
（式中、x + y + z + w = 20 であり、R：炭素数が12〜18のアルキル基であることを示す。）
【請求項８】
反応溶液が融解温度調整剤をさらに含む、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプライマーが上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーの３'末端領域のみが上記工程（ｉ）で得た鋳型核酸断片の一部と実質的に相補的である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の鎖置換能を有するポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ 、サーモコッカス リトラリス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｖｅｎｔ．ＤＮＡポリメラーゼ、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるポリメラーゼである、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
反応溶液を５０℃以上の実質的に等温でインキュベートする、請求項１から１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
上記工程（ii）で、実質的に等温でインキュベートする時間が６０分以内である、請求項１から１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れかに記載の核酸の増幅方法を行うことを含む、標的ＲＮＡを検出する方法。
【請求項１５】
上記工程（ii）が、以下の工程を含む請求項１４に記載の方法。
（１）少なくとも１種のデオキシヌクレオチド３リン酸、少なくとも１種の鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、２価の陽イオン、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、変異部位を含む少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、及び鋳型となる標的ＲＮＡ逆転写反応産物を含む核酸断片を含む反応溶液を実質的に等温でインキュベートする工程；及び
（２）前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ反応による核酸増幅反応が起きたか否かにより変異の有無を判定する工程：
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１３１２５２（Ｐ２００９−１３１２５２Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８５０１９（Ｐ２００８−２８５０１９）
【出願日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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