説明

RNAの検出法

【課題】核酸を切断および修飾するための新規の切断因子およびポリメラーゼを提供する。
【解決手段】酵素を含む組成物であって、該酵素が異種性の機能ドメインを有し、該異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において改変された機能性を提供する組成物。これらの切断因子およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出し、特徴を調べる上で有用である。いくつかの態様においては、多様な酵素の5'ヌクレアーゼ活性を用いて、標的依存的な切断構造を切断し、それによって、特異的な核酸配列、または特異的な核酸配列変異が存在することが示される。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
酵素を含む組成物であって、該酵素が異種性の機能ドメインを有し、該異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において改変された機能性を提供する組成物。
【請求項2】
酵素が5'ヌクレアーゼを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項3】
5'ヌクレアーゼが熱安定的5'ヌクレアーゼを含む、請求項2記載の組成物。
【請求項4】
酵素がポリメラーゼを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項5】
ポリメラーゼの配列が天然のポリメラーゼ配列に対して変化しているため、天然のポリメラーゼよりも低いDNA合成活性を示す、請求項4記載の組成物。
【請求項6】
ポリメラーゼが熱安定的ポリメラーゼを含む、請求項4記載の組成物。
【請求項7】
熱安定的ポリメラーゼが、サーマス(Thermus)種に由来するポリメラーゼを含む、請求項6記載の組成物。
【請求項8】
サーマス種が、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、サーマス・フラバス(Thermus flavus)、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、サーマス・フィリフォルミス(Thermus filiformus)、およびサーマス・スコトダクタス(Thermus scotoductus)からなる群より選択される、請求項7記載の組成物。
【請求項9】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたヌクレアーゼ活性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項10】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良された基質結合活性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項11】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項12】
異種性機能ドメインが、ポリメラーゼのポリメラーゼドメイン由来のアミノ酸を2個またはそれ以上含む、請求項1記載の組成物。
【請求項13】
2個またはそれ以上のアミノ酸のうち、少なくとも1個がポリメラーゼドメインのパーム(palm)領域に由来するものである、請求項12記載の組成物。
【請求項14】
2個またはそれ以上のアミノ酸のうち、少なくとも1個がポリメラーゼドメインのサム(thumb)領域に由来するものである、請求項12記載の組成物。
【請求項15】
ポリメラーゼが、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)のポリメラーゼである、請求項12記載の組成物。
【請求項16】
ポリメラーゼドメイン由来の2個またはそれ以上のアミノ酸が、配列番号:1の300〜650位のアミノ酸に由来する2個またはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項12記載の組成物。
【請求項17】
酵素が、配列番号:2〜68、341、346、348、351、353、359、365、367、369、374、376、380、384、388、392、396、400、402、406、408、410、412、416、418、420、424、427、429、432、436、440、444、446、448、450、456、460、464、468、472、476、482、485、488、491、494、496、498、500、502、506、510、514、518、522、526、530、534、538、542、544、550、553、560、564、566、568、572、574、576、578、580、582、584、586、588、および590からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項18】
核酸切断アッセイ法が、少なくとも1個のRNA成分を含む基質のDNA部分の切断を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項19】
核酸切断アッセイ法が侵襲的(invasive)切断アッセイ法である、請求項1記載の組成物。
【請求項20】
請求項1記載の酵素をコードする核酸を含む組成物。
【請求項21】
核酸が、配列番号:69〜135、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、および589からなる群より選択される、請求項20記載の組成物。
【請求項22】
請求項20記載の核酸を含む発現ベクターを含む組成物。
【請求項23】
請求項22記載の発現ベクターを含む宿主細胞を含む組成物。
【請求項24】
核酸切断アッセイ法において、改良された機能性をもつ改変酵素を産生する方法であって、
a)酵素および核酸被検基質を提供する工程、
b)異種性機能ドメインを該酵素に導入して改変酵素を産生させる工程、
c)該改変酵素を該核酸被検基質に接触させて切断産物を産生させる工程、および
d)該切断産物を検出する工程
を含む方法。
【請求項25】
異種性機能ドメインの導入工程が、該酵素の1個または複数のアミノ酸を変異させる工程を含む、請求項24記載の方法。
【請求項26】
異種性機能ドメインの酵素への導入工程が、タンパク質の機能ドメインを該酵素に付加する工程を含む、請求項24記載の方法。
【請求項27】
タンパク質の機能ドメインを酵素に付加する工程が、該タンパク質の該機能ドメインを付加する前に該酵素の配列の一部を除去する工程を含む、請求項26記載の方法。
【請求項28】
核酸被検基質が切断構造を含む、請求項24記載の方法。
【請求項29】
切断構造がRNA標的核酸を含む、請求項28記載の方法。
【請求項30】
切断構造が侵襲的切断構造を含む、請求項28記載の方法。
【請求項31】
酵素が5'ヌクレアーゼを含む、請求項24記載の方法。
【請求項32】
5'ヌクレアーゼが熱安定性5'ヌクレアーゼを含む、請求項31記載の方法。
【請求項33】
酵素がポリメラーゼを含む、請求項24記載の方法。
【請求項34】
ポリメラーゼの配列が天然のポリメラーゼ配列に対して変化しているため、天然のポリメラーゼよりも低いDNA合成活性を示す、請求項33記載の方法。
【請求項35】
ポリメラーゼが熱安定的ポリメラーゼを含む、請求項24記載の方法。
【請求項36】
熱安定的ポリメラーゼが、サーマス(Thermus)種に由来するポリメラーゼを含む、請求項35記載の方法。
【請求項37】
サーマス種が、サーマス・アクアティカス、サーマス・フラバス、サーマス・サーモフィラス、サーマス・フィリフォルミス、およびサーマス・スコトダクタスからなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項38】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたヌクレアーゼ活性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項39】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良された基質結合活性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項40】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項41】
異種性機能ドメインが、ポリメラーゼのポリメラーゼドメイン由来の2個またはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項24記載の方法。
【請求項42】
2個またはそれ以上のアミノ酸のうち、少なくとも1個がポリメラーゼドメインのパーム領域に由来するものである、請求項41記載の方法。
【請求項43】
2個またはそれ以上のアミノ酸のうち、少なくとも1個がポリメラーゼドメインのサム領域に由来するものである、請求項41記載の方法。
【請求項44】
ポリメラーゼドメインが、サーマス・サーモフィラスポリメラーゼのポリメラーゼドメインを含む、請求項41記載の方法。
【請求項45】
ポリメラーゼドメイン由来の2個またはそれ以上のアミノ酸が、配列番号:1の300〜650位のアミノ酸に由来する2個またはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項41記載の方法。
【請求項46】
酵素が、配列番号:2〜68、341、346、348、351、353、359、365、367、369、374、376、380、384、388、392、396、400、402、406、408、410、412、416、418、420、424、427、429、432、436、440、444、446、448、450、456、460、464、468、472、476、482、485、488、491、494、496、498、500、502、506、510、514、518、522、526、530、534、538、542、544、550、553、560、564、566、568、572、574、576、578、580、582、584、586、588、および590からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項47】
改変酵素が、配列番号:69〜135、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、および589からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項48】
請求項24記載の方法によって産生される改変酵素。
【請求項49】
請求項48記載の改変酵素を含むキット。
【請求項50】
請求項1記載の組成物を含むキット。
【請求項51】
少なくとも1個の核酸切断基質をさらに含む、請求項50記載のキット。
【請求項52】
核酸切断基質にハイブリダイズすることができる少なくとも1個のRNAをさらに含む、請求項51記載のキット。
【請求項53】
標識されたオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項50記載のキット。
【請求項54】
侵襲性オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項50記載のキット。
【請求項55】
核酸を切断する方法であって、
a)i)請求項1記載の酵素と、
ii)基質核酸を含む試料と
を提供する工程、および
b)該基質核酸を該酵素に曝露する工程
を含む方法。
【請求項56】
基質核酸の酵素への曝露によって、少なくとも1つの切断産物が産生される、請求項55記載の方法。
【請求項57】
c)切断産物を検出する工程をさらに含む、請求項56記載の方法。
【請求項58】
基質核酸を含む試料が細胞可溶化物を含む、請求項55記載の方法。
【請求項59】
標的となる核酸の存在を検出する方法であって、
a)RNA標的核酸を含む侵襲的切断構造を切断する工程、および
b)該侵襲的切断構造の切断を検出する工程
を含む方法。
【請求項60】
切断工程が切断因子によって行われる、請求項59記載の方法。
【請求項61】
標的核酸が、第一の領域および第二の領域を含み、該第二の領域が該第一の領域の下流に連続して存在する、請求項59記載の方法。
【請求項62】
侵襲的切断構造が、RNA標的核酸、第一のオリゴヌクレオチド、および第二のオリゴヌクレオチドを含み、該第一のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、該第一の標的核酸の第一の領域に完全に相補的であり、且つ該第二のオリゴヌクレオチドが3'部位と5'部位を含み、該5'部位が、該標的核酸の第二の領域に完全に相補的である、請求項61記載の方法。
【請求項63】
第一のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、標的核酸の第一の領域にアニーリングし、第二のオリゴヌクレオチドの少なくとも5'部位が、該標的核酸の第二の領域にアニーリングする、請求項62記載の方法。
【請求項64】
切断工程によって非標的切断産物が生成される、請求項59記載の方法。
【請求項65】
侵襲的切断構造の切断の検出工程が、非標的切断産物を検出する工程を含む、請求項64記載の方法。
【請求項66】
第二のオリゴヌクレオチドの3'部位が、標的核酸に相補的ではない3'末端ヌクレオチドを含む、請求項62記載の方法。
【請求項67】
第二のオリゴヌクレオチドの3'部位が、標的核酸に相補的ではない単一ヌクレオチドを含む、請求項62記載の方法。
【請求項68】
侵襲的切断構造の切断の検出工程が、蛍光の検出を含む、請求項59記載の方法。
【請求項69】
侵襲的切断構造の切断の検出工程が、質量の検出を含む、請求項59記載の方法。
【請求項70】
侵襲的切断構造の切断の検出工程が、蛍光エネルギー移動の検出を含む、請求項59記載の方法。
【請求項71】
侵襲的切断構造の切断の検出工程が、放射能、発光、リン光、蛍光偏光、および電荷からなる群より選択される検出を含む、請求項59記載の方法。
【請求項72】
第一のオリゴヌクレオチドが固相支持体に付着している、請求項62記載の方法。
【請求項73】
第二のオリゴヌクレオチドが固相支持体に付着している、請求項62記載の方法。
【請求項74】
切断因子が構造特異的ヌクレアーゼを含む、請求項60記載の方法。
【請求項75】
構造特異的ヌクレアーゼが熱安定性構造特異的ヌクレアーゼを含む、請求項74記載の方法。
【請求項76】
切断因子が酵素を含み、該酵素が異種性機能ドメインを含み、該異種性機能ドメインが核酸切断アッセイ法において改変された機能性を提供する、請求項60記載の方法。
【請求項77】
酵素が5'ヌクレアーゼを含む、請求項76記載の方法。
【請求項78】
5'ヌクレアーゼが熱安定的5'ヌクレアーゼを含む、請求項77記載の方法。
【請求項79】
酵素がポリメラーゼを含む、請求項76記載の方法。
【請求項80】
ポリメラーゼの配列が天然のポリメラーゼ配列に対して変化しているため、天然のポリメラーゼよりも低いDNA合成活性を示す、請求項79記載の方法。
【請求項81】
ポリメラーゼが熱安定的ポリメラーゼを含む、請求項79記載の方法。
【請求項82】
熱安定的ポリメラーゼが、サーマス種に由来するポリメラーゼを含む、請求項81記載の方法。
【請求項83】
サーマス種が、サーマス・アクアティカス、サーマス・フラバス、サーマス・サーモフィラス、サーマス・フィリフォルミス、およびサーマス・スコトダクタスからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項84】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたヌクレアーゼ活性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項76記載の方法。
【請求項85】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良された基質結合活性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項76記載の方法。
【請求項86】
異種性機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列を含む、請求項76記載の方法。
【請求項87】
異種性機能ドメインが、ポリメラーゼのポリメラーゼドメイン由来の2個またはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項76記載の方法。
【請求項88】
2個またはそれ以上のアミノ酸のうち、少なくとも1個がポリメラーゼドメインのパーム領域に由来するものである、請求項87記載の方法。
【請求項89】
2個またはそれ以上のアミノ酸のうち、少なくとも1個がポリメラーゼドメインのサム領域に由来するものである、請求項87記載の方法。
【請求項90】
ポリメラーゼドメインが、サーマス・サーモフィラスポリメラーゼのポリメラーゼドメインを含む、請求項87記載の方法。
【請求項91】
ポリメラーゼドメイン由来の2個またはそれ以上のアミノ酸が、配列番号:1の300〜650位のアミノ酸に由来する2個またはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項87記載の方法。
【請求項92】
酵素が、配列番号:2〜68、341、346、348、351、353、359、365、367、369、374、376、380、384、388、392、396、400、402、406、408、410、412、416、418、420、424、427、429、432、436、440、444、446、448、450、456、460、464、468、472、476、482、485、488、491、494、496、498、500、502、506、510、514、518、522、526、530、534、538、542、544、550、553、560、564、566、568、572、574、576、578、580、582、584、586、588、および590からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項76記載の方法。
【請求項93】
酵素が、配列番号:69〜135、340、345、347、350、352、358、364、366、368、373、375、379、383、387、391、395、399、401、405、407、409、411、415、417、419、423、426、428、431、435、439、443、445、447、449、452、454、455、459、463、467、471、475、481、484、495、497、499、501、505、509、513、517、521、525、529、533、537、541、543、549、552、559、563、565、567、571、573、575、577、579、581、583、585、587、および589からなる群より選択される核酸によってコードされる、請求項76記載の方法。
【請求項94】
非標的切断産物を含む第二の侵襲的切断構造を形成する工程、および該第二の侵襲的切断構造を切断する工程をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項95】
侵襲的切断構造または第二の侵襲的切断構造が、配列番号:709〜2640からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項94記載の方法。
【請求項96】
侵襲的切断構造または第二の侵襲的切断構造が、配列番号:169〜211および619〜706からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項94記載の方法。
【請求項97】
RNA標的核酸がチトクロームP450 RNAを含む、請求項59記載の方法。
【請求項98】
RNA標的核酸がサイトカインRNAを含む、請求項59記載の方法。
【請求項99】
標的核酸の第一の領域および第二の領域を含む標的核酸の一部が、スプライス部位を含む、請求項61記載の方法。
【請求項100】
標的核酸の第一の領域および第二の領域がエクソンを含む、請求項61記載の方法。
【請求項101】
標的核酸の第一の領域および第二の領域がイントロンを含む、請求項61記載の方法。
【請求項102】
RNA標的核酸が細胞可溶化物の中で提供される、請求項59記載の方法。
【請求項103】
第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドに共有結合している、請求項62記載の方法。
【請求項104】
侵襲的切断アッセイ法を行なうためのキットであって、プローブ用オリゴヌクレオチド、およびRNA標的核酸存在下で侵襲的切断構造を形成するよう設計されている侵襲オリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項105】
配列番号:709〜2640からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項104記載のキット。
【請求項106】
配列番号:169〜211および619〜706からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項104記載のキット。
【請求項107】
2個またはそれ以上の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
a)2個またはそれ以上の侵襲的切断構造を切断する工程であって、侵襲的切断構造のそれぞれが、標的配列を有するRNA標的核酸を含み、さまざまなRNA標的配列を含む工程、および
b)該侵襲的切断構造が切断されたことを検出する工程
を含む方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8A】
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【図8B】
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【図8C】
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【図8D】
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【図8E】
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【図8F】
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【図8G】
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【図8H】
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【図9A】
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【図9B】
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【図9C】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18A】
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【図18B】
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【図18C】
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【図18D】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35A】
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【図35B】
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【図35C】
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【図36A】
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【図36B】
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【図37A】
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【図37B】
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【図37C】
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【図38】
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【図39】
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【図40】
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【図41−1】
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【図41−2】
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【図41−3】
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【図41−4】
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【図41−5】
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【図41−6】
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【図41−7】
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【図41−8】
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【図41−9】
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【図42】
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【図43】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47−1】
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【図47−2】
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【図47−3】
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【図47−4】
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【図47−5】
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【図47−6】
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【図47−7】
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【図47−8】
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【図47−9】
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【図47−10】
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【図47−11】
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【図47−12】
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【図47−13】
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【図47−14】
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【図47−15】
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【図47−16】
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【図47−17】
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【図47−18】
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【図47−19】
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【図47−20】
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【図47−21】
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【図47−22】
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【図47−23】
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【図47−24】
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【図47−25】
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【図47−26】
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【図47−27】
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【図47−28】
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【図47−29】
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【図47−30】
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【図47−31】
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【図47−32】
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【図47−33】
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【図47−34】
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【図47−35】
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【図47−36】
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【図47−37】
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【図47−38】
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【図47−39】
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【図47−40】
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【図47−41】
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【図47−42】
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【図47−43】
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【図47−44】
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【図47−45】
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【図47−46】
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【図47−47】
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【図47−48】
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【図47−49】
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【図47−50】
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【図47−51】
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【図47−52】
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【図47−55】
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【図47−56】
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【図47−60】
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【図47−62】
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【図47−63】
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【図47−64】
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【図47−66】
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【図47−70】
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【図47−72】
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【図47−73】
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【図48】
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【公開番号】特開2012−213404(P2012−213404A)
【公開日】平成24年11月8日(2012.11.8)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−155292(P2012−155292)
【出願日】平成24年7月11日(2012.7.11)
【分割の表示】特願2001−587132(P2001−587132)の分割
【原出願日】平成13年5月24日(2001.5.24)
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.UNIX
2.ウィンドウズ
3.WINDOWS
【出願人】(500228791)サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク (10)
【Fターム(参考)】