ＲＮＡの直接検出法
【課題】新規な簡便迅速で実用的な、試料中のＲＮＡを検出する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、生物由来の夾雑物を含む試料中のＲＮＡの検出方法であって、（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する工程、（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程、（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしてローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）により一本鎖ＤＮＡを合成する工程、（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する工程、さらに任意に前記（２）の後に（５）ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程を含む、前記方法に関する。
【解決手段】本発明は、生物由来の夾雑物を含む試料中のＲＮＡの検出方法であって、（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する工程、（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程、（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしてローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）により一本鎖ＤＮＡを合成する工程、（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する工程、さらに任意に前記（２）の後に（５）ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程を含む、前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＲＮＡを直接検出する方法、より具体的には、検出対象のＲＮＡをプライマーとして、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によってＤＮＡを増幅するローリングサークル増幅法（RNA-Primed Rolling Circle Amplification；ＲＰＲＣＡ）を用いたＲＮＡの直接検出法およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品のような複雑なサンプルから僅かな微生物を検出し、サンプルに存在する生きた微生物の有無を検査することを目的とする場合、一般的には培養法が用いられる。しかし培養法による微生物の検出には、選択培地によるところが大きく、しかも数日の培養期間が必要であるため、迅速性が求められる食中毒検査や臨床診断等には向いていない。一方、微生物の迅速な検出には、微生物等が有する固有のＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応（polymerarse chain reaction；ＰＣＲ）を利用して検出する方法が知られている。しかし、ＤＮＡは化学的に安定な化合物であるため、ＰＣＲによって微生物等に固有なＤＮＡ配列が検出されたとしても、当該微生物等の生死を判別するには至らない。
【０００３】
細胞内のＲＮＡは細胞が死滅すると速やかに分解されるため、ＲＮＡを検出することによって微生物などの生きた細胞の検出および生死判別を行う方法が開発されている。特に、ＲＮＡを逆転写反応（ＲＴ（reverse transcription）反応）によってＤＮＡに変換した後にＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲ法はよく知られている（例えば、非特許文献１）。しかし、ＰＣＲ法はその反応のシステムのため、反応温度を変化させることが可能なサーマルサイクラーなどの高価な装置を必要としており、一般的なＰＣＲにかかる時間は少なくとも２〜３時間程度を必要としている。また、増幅と検出を同時に行うことのできるリアルタイム検出法が可能であるが、かかる検出法には、サーマルサイクラーに検出装置が組み込まれている必要があり、サーマルサイクラーよりもさらに費用が嵩むことになる。
【０００４】
一方で、ＲＮＡを逆転写した後に、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を利用したＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）によってＲＮＡを迅速に検出するＲＴ−ＬＡＭＰ法も開発されている（非特許文献２）。ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、およそ１〜２時間程度での検出が可能であるが、その反応システムは複雑で汎用性に乏しく、また反応システム上、比較的高温（６５℃）を維持できる機械を必要としている。ＰＣＲ法と比較して、低価格の装置でリアルタイム検出も可能であるが、その反応システムは、特殊なプライマー設計の複雑さなどのために現時点では汎用されていない。
【０００５】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＲＮＡ検出では、最終的な増幅反応に至るまでに生成するＤＮＡが、次の反応ステップに混入して非特異的な逐次反応を誘発する、いわゆるキャリーオーバーによるクロスコンタミネーションが常に問題となる。そのため、試料中の夾雑物、特にゲノム由来のＤＮＡが微量でも混入した場合には偽陽性の結果を生じやすく、目的となるＲＮＡの検出を困難にするため、ＤＮＡ分解処理などのＲＮＡを精製する工程を必要とする。したがって、追加の工程や専用の設備等が必要となり、さらには高度に訓練された人員が必要となるため、初期導入コストのみならずランニングコストも高額になる傾向がある。その結果、畜産産業や食品産業のみならず、臨床検査の現場においても、核酸増幅による微生物検出法の採用が忌避される傾向にある。
【０００６】
一方、反応装置が簡素なＲＮＡ検出方法も開発されており、ＲＴ反応を経たあと、ＲＴ反応に用いたプライマー領域に設定したバクテリオファージプロモーター領域から、再度バクテリオファージＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡを増幅する転写媒介増幅法（Transcription-mediated amplification；ＴＭＡ）（非特許文献３）や、ＴＭＡ法にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）を組み合わせたＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequence-based amplification；ＮＡＳＢＡ）がＲＮＡ増幅・検出方法として利用されている（非特許文献４）。これらは低温（３７℃）における反応であるため、サーマルサイクラー等の特別高価な装置は不要である。しかし、反応生成物がＲＮＡであるため検出には特殊なゲル電気泳動装置等を用いるか、あるいは反応後にＲＴ−ＰＣＲ法を行う必要があり、操作が煩雑である。
【０００７】
上述のように、既存のＲＮＡの増幅・検出法はすべて逆転写反応を経由して行われるため、実験操作の簡素化や反応条件の最適化を行ったとしても、逆転写反応そのものにかかる時間は短縮できないため、検出までに概ね２時間以上の時間を必要とし、検出速度の向上は困難である。かかる問題点は、一層の高速化が求められているＲＮＡ検出法の開発、例えば、病原性大腸菌Ｏ１５７や高病原性インフルエンザウイルスのような病原性ＲＮＡウイルスの検出法の開発などにおいても大きな障害となっていた。
【０００８】
近年、これらの問題を解決する核酸増幅方法として、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification；ＲＣＡ）法が検討されている。ＲＣＡ法は、一本鎖環状ＤＮＡプローブを該ＤＮＡプローブに相補的な配列を持つＤＮＡプライマーでハイブリダイズさせた後、該ＤＮＡプローブを鋳型とした鎖置換型ＤＮＡ合成反応によって一本鎖ＤＮＡを連続的に生成する反応である。したがって、ＲＣＡ法ではＤＮＡ合成反応後に生成する一本鎖ＤＮＡを検出することによって、ＤＮＡプライマーもしくはＤＮＡプローブの存在を判定することができる。
【０００９】
そしてＲＮＡ検出方法として、ＲＮＡ−プライムドローリングサークル型増幅（RNA-Primed Rolling Circle Amplification；ＲＰＲＣＡ）法が、新たなＲＮＡ検出法として注目を浴びている。ＲＰＲＣＡは標的ＲＮＡ分子の３’側配列と相補的配列を有する環状ＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせた後、当該ＲＮＡ分子の３’末端をＤＮＡ合成の開始点として利用し、一本鎖ＤＮＡをＲＣＡ法により連続的に合成する。これにより合成された一本鎖または二本鎖ＤＮＡを検出することにより、逆転写反応を行わずに目的のＲＮＡ、特に原核微生物由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）や、真核生物のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を短時間で検出することが可能となる。
【００１０】
これまでに、ＲＣＡ法を利用したＲＮＡの検出方法として、真核生物のｍｉＲＮＡとハイブリッド形成させた一本鎖環状ＤＮＡプローブを用いて、当該ＲＮＡをＲＣＡ法によって検出する方法が検討されている（特許文献１）。しかしながら、このＲＣＡ法には、非特異的に合成されるＤＮＡ副生成物によって検出時のシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低下するという問題がある。非特異的なＤＮＡ副生成物に起因するシグナルノイズ比の低下を回避するために、特許文献１では、複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを介して予め環状ＤＮＡを作成し、未反応の一本鎖ＤＮＡの除去を試みているが、複数であるが故に部分的な二本差を形成しやすくなり、二本鎖を形成したオリゴヌクレオチドはエクソヌクレアーゼのみでは除けないため、この方法では困難である。
【００１１】
また、特許文献２では環状化反応およびＤＮＡ合成において、耐熱性酵素を利用して反応温度を上昇させることにより、非特異的なＤＮＡ合成の原因となる非特異的な二本鎖形成の抑制を検討している。しかし、耐熱性酵素のために、非耐熱性酵素に比べてシグナル検出速度は低下する。
【００１２】
特許文献３では、直鎖状パドロックＤＮＡプローブ（非特許文献５）を検出対象のＲＮＡとハイブリッド形成させた上で、該パドロックＤＮＡプローブを環状化させ、一本鎖環状ＤＮＡプローブを形成させる方法を開示している。同様に、特許文献４および非特許文献６においても、パドロックＤＮＡプローブと検出対象のＲＮＡとのハイブリッドを形成させた後、パドロックＤＮＡプローブの環状化反応を行い、さらに検出用ＤＮＡプライマーを用いて、検出対象のＲＮＡの有無が検証可能な方法を報告している。
【００１３】
しかしながら、直鎖状パドロックＤＮＡプローブを環状化させる際、反応溶液中の直鎖状パドロックＤＮＡプローブが全て環状化されることはなく、未反応の直鎖状パドロックＤＮＡプローブ自身が非特異的な二本鎖核酸を形成する。また、検出用ＤＮＡプライマーの使用は、さらに非特異的なＤＮＡの副生成物を生じさせるため、検出時のＳ／Ｎ比が大きく低下するという問題がある。
【００１４】
非特異的な副生成物に由来するＳ／Ｎ比の低下は、検出感度を下げるのみならず、目的ＲＮＡの検出においては、偽陽性の結果を生じることにより、不正確な判断を引き起こしかねない。この不正確な判断材料は、特にウイルスを含む感染性微生物の臨床検出において被験者の「生活の質」（Quality Of Life；QOL）の低下を引き起こす可能性がある。
【００１５】
さらに、パドロックＤＮＡプローブを用いたＲＰＲＣＡ法においては、目的のＲＮＡ上におけるパドロックＤＮＡプローブのＴ４ ＤＮＡライゲースによる環状化は、僅か２．５％程度であり、ＤＮＡ上で起こるそれと比べ著しく効率が悪化していると報告されている（非特許文献７）。使用するライゲースをＴ４ ＲＮＡライゲースに変更しても、環状化反応は全体の２０％程度しか起きないため、ＲＮＡのパドロックＤＮＡプローブによる検出効率は、非常に悪いことが明らかにされた。
【００１６】
また、従来のＲＰＲＣＡ法の多くは検出対象となるＲＮＡの３’末端側配列をプライマーとして利用するため、検出可能なＲＮＡ分子種は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）やリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、および原核生物のｍＲＮＡや、真核生物のｓＲＮＡ、あるいは一部のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に限定されていた。特に、ＲＰＲＣＡ法による真核生物のｍＲＮＡの特異的な検出は、全てのｍＲＮＡの３’末端にポリＡ配列が存在するため、原理的に不可能であった。
【００１７】
特許文献４では、多様なＲＮＡ種の３’末端側配列、特にｍＲＮＡの３’末端側配列をプライマーとして利用するため、ポリＡ配列をリボザイムによって除去する方法や、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅ Ｈ処理をしてニックを導入することによって、ｍＲＮＡの３’末端をプライマーとして伸長可能にする方法が記載されている。しかしながら、同文献中、単に手法が記述されているに過ぎず、実際に反応産物を得たものでも、例えば、ゲル中でバンドとして検出したものでもなかった。したがって、同文献に記載の方法では、上述のＳ／Ｎ比の問題を認識していないため、目的物と非特異的な産物との区別ができず、偽陽性の結果を生じる危険性を包含するものであった。さらにまた、同文献における環状化ＤＮＡプローブの作製工程は、極めて煩雑であり、実用に耐えるものではなかった。
【００１８】
一方で、検出対象のＲＮＡとパドロックＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた後、当該パドロックＤＮＡプローブをＴ４ ＤＮＡライゲースにより環状化し、ＤＮＡ合成酵素の、特にphi29ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソリボヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしていない検出対象のＲＮＡの３’末端配列をハイブリダイズしている位置まで除去した後、ハイブリダイズしたＲＮＡ部分をプライマーとしてＤＮＡ合成を開始する方法が開発された（非特許文献８）。さらに、二本鎖ＲＮＡ特異的分解酵素であるＲＮａｓｅ ＩＩＩを反応液に加えることにより、二次構造（二本鎖領域）を取っているであろう非ハイブリダイズ領域のＲＮＡ部分を分解・除去し、ＲＣＡ反応の向上が認められたことを報告している（非特許文献９）。
【００１９】
しかしながら、phi29ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソリボヌクレアーゼ活性は非常に弱いため、除去できるＲＮＡの長さが制限される。さらに、phi29ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソリボヌクレアーゼ活性は、ＲＮＡの二次構造を破壊できず、二次構造を取りやすいＲＮＡ分子ではほとんど分解されないため、ハイブリダイズさせるＲＮＡ領域は３’末端側に限定されてしまい、例えば、５’ＥＳＴ配列は現実的に利用できなかった（非特許文献１０）。
【００２０】
また、非特許文献１０においては、ＲＮＡの直接検出を断念し、代替方法として逆転写反応時に利用する標的ＲＮＡ特異的なＤＮＡプライマーの構成残基の一部にLocked nucleic acid （ＬＮＡ）を使用することにより、ハイブリダイゼーション効率を高めて逆転写効率を向上させ、検出対象のＲＮＡ特異的な逆転写産物によるＲＣＡ反応を行うことにより、検出感度上昇が可能であることを報告している。
【００２１】
しかしながら、この方法は、複数のエクソンで構成されている真核生物のｍＲＮＡでは有効であるが、１エクソンで構成されている酵母や原核微生物においては、残存していたゲノムＤＮＡとの区別が厳密にはできない。さらに、非特許文献１０では最終的にｃＤＮＡではあるが、ＤＮＡをプライマーとして用いるために、非特異的なＤＮＡ副生成物が生じる。したがって，パドロックＤＮＡプローブと相補性のある検出用ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションによってのみ、増幅・検出の特異性が保証されるため、煩雑な操作手順を捨て切れていない。
【００２２】
さらに、従来技術においては、上記の低いＳ／Ｎ比の問題からも、ＲＮＡ試料中に混入するＤＮＡ等の夾雑物によるノイズを防ぐ必要があると考えられており、目的のＲＮＡを検出するために、ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅで処理したり、精製されたＲＮＡ試料を用意する等、利用できる試料が制限されていた（特許文献４、非特許文献８および９）。
【００２３】
以上のように、これまで検討されてきた方法は、ＰＣＲ反応の温度サイクルを管理する装置が必要であったり、検出対象のＲＮＡを逆転写によってＤＮＡ化したり、設備面に止まらず、検出精度においてもコンタミネーションなどによる増幅反応における副生成物の問題などがあった。
【００２４】
一方で、ＲＰＲＣＡ法においては、検出対象のＲＮＡの種類および由来によっては検出用プローブの構築ができず、簡便な手順のＲＰＲＣＡ法を実行できないＲＮＡ分子種のほうが多く存在していた。さらに、非特異的な副生成物に由来するＳ／Ｎ比の低下によって、目的のＲＮＡ検出において不正確な判断を引き起こしかねないため、実用段階には至っていない。
【００２５】
したがって、ＲＮＡを検出する方法として、高額な装置を必要とせず、ゲノム配列等の配列の一部でも既知であれば、特異的な検出が可能となり、さらに簡便でありながら迅速で、かつ高感度の検出方法の構築が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１８１３９０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１８８８９３号明細書
【特許文献３】特表２００３−５３４７８２号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０１１２６３９号明細書
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Selvaratnam S, Schoedel BA, McFarland BL, Kulpa CF. Application of reverse transcriptase PCR for monitoring expression of the catabolic dmpN gene in a phenol-degrading sequencing batch reactor. Appl. Environ. Microbiol. 61:3981-3985. (1995).
【非特許文献２】Fukuta S, Iida T, Mizukami Y, Ishida A, Ueda J, Kanbe M, Ishimoto Y. Detection of Japanese yam mosaic virus by RT-LAMP. Arch. Virol. 148:1713-20 (2003).
【非特許文献３】Kwoh DY, Davis GR, Whitfield KM, Chappelle HL, DiMichele LJ, Gingeras TR. Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1173-7 (1989).
【非特許文献４】Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richman DD, Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:1874-1878 (1990).
【非特許文献５】Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary B.P., and Landegren U. Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science 265 2085-8 (1994).
【００２８】
【非特許文献６】Wang B, Potter SJ, Lin Y, Cunningham AL, Dwyer DE, Su Y, Ma X, Hou Y, Saksena NK. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. J. Clin. Microbiol. 43(5):2339-44 (2005)
【非特許文献７】Li N, Jablonowski C, Jin H, Zhong W. Stand-Alone Rolling Circle Amplification Combined with Capillary Electrophoresis for Specific Detection of Small RNA. Anal. Chem. 81, 4906-4913 (2009)
【非特許文献８】Lagunavicius A, Merkiene E, Kiveryte Z, Savaneviciute A, Zimbaite-Ruskuliene V, Radzvilavicius T, Janulaitis A Novel application of Phi29 DNA polymerase: RNA detection and analysis in vitro and in situ by target RNA-primed RCA. RNA 15:765-771 (2009).
【非特許文献９】Merkiene E, Gaidamaviciute E, Riauba L, Lagunavicius A. Direct detection of RNA in vitro and in situ by target-primed RCA: the impact of E. coli RNase III on the detection efficiency of RNA sequences distanced far from the 39-end. RNA Published online June 28 (2010)
【非特許文献１０】Larsson C, Grundberg I, Soderberg O, Nilsson M. In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules. Nat. Methods 7: 395-397 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明の課題は、高度な設備を必要とせず、簡便な操作で、実用的な感度を有しながら迅速に行うことができる、ＲＮＡの検出方法であって、生物由来の夾雑物を含む試料中、特にＤＮＡが混入した試料においても、特異的な検出を可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、検出対象とする目的ＲＮＡの３’末端部分配列と相補的なＤＮＡを合成し、一本鎖ＤＮＡ連結酵素により自己環状化させて、得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブを目的ＲＮＡとハイブリッド形成させ、さらに目的ＲＮＡをプライマーとして一本鎖ＤＮＡを合成させると、予め反応系に一本鎖ＤＮＡ特異的な蛍光色素を添加しておくことにより、目的ＲＮＡのリアルタイム検出が可能となることを見出した。
【００３１】
また、ＲＮａｓｅ Ｈ処理の工程を加えることにより、３’末端にＤＮＡプローブとの相補配列を有さないＲＮＡであっても検出可能となり、ウイルスや原核生物のみならず真核生物由来の多様なＲＮＡの検出が可能となった。
【００３２】
さらに、本発明者らは、本発明のＲＰＲＣＡ法によって、細胞から実際に得られた試料中から目的ＲＮＡを検出した知見に基づき、生物由来の夾雑物を含む試料中、例えば、ＤＮＡが混入した試料であっても、特異的な目的ＲＮＡの検出が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３３】
すなわち本発明は、以下の方法およびキットに関する。
［１］ 生物由来の夾雑物を含む試料中のＲＮＡの検出方法であって、
（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する工程、
（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程、
（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしてローリングサークル増幅法（ＲＣＡ；Rolling Circle Amplification）により一本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する工程
を含む、前記方法。
［２］ 生物由来の夾雑物が、ＤＮＡを含む、［１］に記載の方法。
［３］ 試料が、核酸試料である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 試料中のＤＮＡが、分解処理されていない、［２］または［３］に記載の方法。
［５］ 前記（１）において、環状化していない未反応の一本鎖ＤＮＡを分解することを含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、検出対象のＲＮＡに相補的な配列のみからなる、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］ 環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、３０塩基長〜４５００塩基長である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］ 前記（２）の後に、
（５）ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程
をさらに含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］ 前記（３）および／または（５）が、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度で行われる、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−４〜１０ユニット／反応で用いる、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］ 前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−７〜０．１ユニット／μｌで用いる、［８］または［９］に記載の方法。
［１２］ ＲＮＡが、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイド由来である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］ ＲＮＡが、ポリＡ配列を有する、［１２］に記載の方法。
［１４］ ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡである、［１２］に記載の方法。
［１５］ ［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法を含む、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法。
［１６］ 微生物を検出する、［１５］に記載の方法。
［１７］ ［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法、および／または［１５］に記載の真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法、および／または［１６］に記載の微生物の検出方法のために用いるキットであって、検出対象のＲＮＡに相補的な配列を含む環状化一本鎖ＤＮＡプローブを含むキット。
［１８］ アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンからなるデオキシヌクレオチド、反応用緩衝液および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素からなる群から選択される１種または２種以上をさらに含む、［１７］に記載のキット。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、ＲＮＡの検出の際に検出対象である目的ＲＮＡに対して逆転写反応を行う必要がなく、直接ＲＮＡをプライマーとして用いてＤＮＡを合成させ、かつ合成された一本鎖ＤＮＡに一本鎖特異的蛍光色素を反応させることにより、極めて簡便に、リアルタイム検出が可能である。
また、未反応の一本鎖ＤＮＡに由来する非特異的なＤＮＡ合成を完全に抑制することが可能となり、高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を実現し、さらに、過去の増幅産物のキャリーオーバーによるクロスコンタミネーションリスクが、他の核酸増幅法に比べ著しく低いため、ＲＮＡを簡便な操作で、実用的な感度を有しながら、また高度な設備を必要せず、安価な装置で、短時間で迅速に検出することが可能となる。
【００３５】
また、ＲＮａｓｅ Ｈ処理の工程を加えることにより、検出対象となるＲＮＡの３’末端の配列に依存せずに、部分的にでも既知であれば、様々な種類のＲＮＡの検出が可能となり、ウイルスや原核生物由来のＲＮＡだけでなく、真核生物由来のＲＮＡおよびそれら生物自身の検出も可能となった。
【００３６】
さらに、本発明によれば、検出感度がよいため、試料中に生物由来の夾雑物を含んでいてもＲＮＡの検出が可能である。また、試料中にＤＮＡを含む場合であっても、ＤＮＡの分解処理を要しない。このため本発明の方法は、従来のＲＮＡ検出法と比較して、迅速かつ簡便に試料中のＲＮＡを検出することができる。これは、夾雑ＤＮＡが、環状化一本鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズしても、その３’末端がプライマーとして利用されることが確率的にほとんどありえないことによる。
【００３７】
このことは、ＲＮＡを特異的に検出するためには試料中の夾雑ＤＮＡを除去するという当該分野の技術常識に反する驚くべき知見であり、これによって、生きている細胞由来のＲＮＡの検出が容易になり、実用に十分な感度を有しながらも、簡便でありながら迅速で、かつ特異的なＲＮＡの検出が可能となった。したがって、医学、薬学、農学、食品学などの研究に止まらず、臨床検査などの医療分野や、食品産業における簡便な生菌検査や食中毒における迅速検査など、簡便さ、省力化、迅速さが求められる様々な基礎および応用分野において、とくに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出を示す概略図である。
【図２】図２は、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡの特異的検出を示す：（Ａ）in vitroで転写されたＧＦＰｍＲＮＡの３’末端配列を示す。ＧＦＰｍＲＮＡは、ＮｏｔＩ消化後のＧＦＰ遺伝子のin vitro転写により調製した。下線およびイタリック文字は、夫々、ＧＦＰ遺伝子の終止コドンおよびＮｏｔＩ制限酵素サイトを示す。配列中の大文字および小文字は、夫々、ＤＮＡ残基およびＲＮＡ残基を示す。（Ｂ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡのリアルタイム検出を示す。ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる蛍光は、夫々、以下の記号で示す：白丸はｍＲＮＡもＤＮＡプローブもなし、黒丸はｍＲＮＡ単独、白四角はＰ１（配列番号１で表されるプローブ、表１）単独、黒四角はＰ１とｍＲＮＡ、白三角はＰ２（配列番号２で表されるプローブ、表１）単独、黒三角はＰ２とｍＲＮＡ。（Ｃ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡの電気泳動による検出を示す。１５時間のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを分子量マーカー（キロベースラダーマーカー）とともにアガロースゲルで泳動した。（Ｄ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにおけるプローブの長さの効果を示す。ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる蛍光は、夫々、以下の記号で示す：白丸はｍＲＮＡもＤＮＡプローブもなし、黒丸はｍＲＮＡ単独、白四角はＰ１単独、黒四角はＰ１とｍＲＮＡ、白三角はＰ３（配列番号３で表されるプローブ、表１）単独、黒三角はＰ３とｍＲＮＡ。
【図３】図３は、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡの感度を示す：（Ａ）プライマーとしてのin vitro転写ＧＦＰとのＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにおけるphi29ＤＮＡポリメラーゼの濃度の効果。酵素濃度は、夫々、以下の記号で示す：白丸は０ユニット、黒丸は１０ユニット、白四角は２０ユニット、黒四角は４０ユニット、白三角は６０ユニット、黒三角は８０ユニット、白菱形は１００ユニット。（Ｂ）段階希釈したin vitro転写ＧＦＰによるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡの滴定分析。用いたＧＦＰｍＲＮＡの量は、０ｐｇ（白丸）、３２ｐｇ（黒丸）、３２０ｐｇ（白四角）、３．２ｎｇ（黒四角）、３２ｎｇ（白三角）。
【図４】図４は、大腸菌から単離された全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの特異的検出を示す：（Ａ）pET-AcGFPを保有する大腸菌におけるＧＦＰの発現。自己誘導ありまたはなしのＧＦＰ発現をブルーライト下で可視化した。（Ｂ）大腸菌において転写されたＧＦＰｍＲＮＡの３’末端配列。ＧＦＰｍＲＮＡはＴ７プロモーターの制御下で転写され、かかる転写は、Ｔ７ターミネーターで終了した。下線は、環状化プローブＰ４（配列番号４で表されるプローブ、表１）に対して相補的な配列を示す。（Ｃ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる自己誘導ありまたはなしの大腸菌から単離された全ＲＮＡに存在するＧＦＰｍＲＮＡのリアルタイム検出。ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる蛍光は、以下の記号で示す：（１）白丸はｍＲＮＡもＤＮＡプローブもなし、（２）灰丸は誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（３）黒丸は誘導ありの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（４）白四角はＰ４単独、（５）灰四角はＰ４と誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（６）黒四角はＰ４と誘導ありの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（７）白三角はＰ３単独、（８）灰三角はＰ３と誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（９）黒三角はＰ４と誘導ありの大腸菌由来の全ＲＮＡ。（Ｄ）誘導した大腸菌から得られた全ＲＮＡの段階希釈したものによるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡの滴定分析。用いた全ＲＮＡの量は、０ｎｇ（白丸）、２ｎｇ（黒丸）、１０ｎｇ（白四角）、２０ｎｇ（黒四角）、４０ｎｇ（白三角）および８０ｎｇ（黒三角）。
【００３９】
【図５】図５は、ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程をさらに含む、本発明のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出を示す概略図である。（Ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡの下流（３’末端）は環状化ＤＮＡプローブと相補鎖形成しないため、ＤＮＡの合成反応が開始しない。（Ｂ）標的遺伝子のｍＲＮＡと環状化ＤＮＡプローブが相補鎖形成した後、ＲＮａｓｅ Ｈで処理することによりニックが導入され、ＲＣＡ反応が開始する。
【図６】図６は、pET-21dにクローン化したＧＦＰ遺伝子の全配列を示す。ＧＦＰｍＲＮＡは、ＮｏｔＩ消化後のpET-AcGFPおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してin vitro転写により調製した。下線（太字）は、ＧＦＰｍＲＮＡ内部領域にて相補鎖形成するように設計された環状化ＤＮＡプローブ（Ｐ５）の位置を示す。下線のＡＴＧおよびＴＧＡは、夫々開始コドンおよび終止コドンを示す。
【図７】図７は、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡの検出における、ＲＮａｓｅ Ｈ処理の効果を示す。１５時間のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを分子量マーカー（キロベースラダーマーカー）とともにアガロースゲルで泳動した。また、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ反応におけるＲＮａｓｅ Ｈの濃度依存性について検討した結果を示す。
【００４０】
【図８】図８は、ＰＣＲによるＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡ（pET-AcGFP）の検出結果を示す。中段のＤＮａｓｅ（＋）およびＤＮａｓｅ（−）は、ＤＮａｓｅ処理有りおよび無しをそれぞれ示し、下段の（＋）および（−）は発現誘導した菌体および発現誘導していない菌体由来の全ＲＮＡをそれぞれ示す。ＰＣＲ産物は、分子量マーカー（１００ｂｐラダー）とともにアガロースゲルで泳動した。
【図９】図９は、夾雑ＤＮＡが混入した試料中における、本発明のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる標的ＲＮＡの特異的検出を示す。４時間のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを、アガロースゲルで泳動した。ＤＮａｓｅ処理の有無は、全ＲＮＡ試料中のＧＦＰｍＲＮＡの検出結果に影響を与えない。Ｎはネガティブコントロールを示し、（＋）および（−）はそれぞれ発現誘導した菌体および発現誘導していない菌体由来の全ＲＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明のＲＮＡの検出方法は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を利用したローリングサークル型ＤＮＡ複製法（Rolling circle amplification；ＲＣＡ）を利用し、応用した技術を用いる。
したがって、先ず、（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する。
検出対象のＲＮＡ（目的ＲＮＡ）に相補的な配列としては、目的ＲＮＡ特異的検出の観点から、目的ＲＮＡの３’末端側の部分の、例えば、２０〜１００塩基、とくに、２５〜４０塩基に相補的な配列が好ましい。ＲＮａｓｅ Ｈ処理によって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド上のＲＮＡ鎖にニックを導入する工程を含む場合、検出対象の目的ＲＮＡに相補的な配列は、ＲＮＡのいずれの位置からも任意に設定することが可能である。
【００４２】
相補鎖を形成するｓｓＤＮＡは、１００塩基以下の場合は核酸合成機によるＤＮＡ合成が好ましいが、１００塩基以上の場合は、ＰＣＲ等により目的ＤＮＡを増幅後、公知の方法、例えば熱変性により一本鎖化した後、環状化反応に使用することもできる。例えば、３０〜４，５００塩基、とくに、５０〜７００塩基に相当する相補的な配列が好ましい。検出感度はプローブの長さが長い程上昇し、短ければ短いほど減少する。また、非特異的な反応をさらに抑えるために、プローブは検出対象のＲＮＡとハイブリダイズ可能な相補配列のみから構成されてもよい。
【００４３】
一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。環状化は、分子内ライゲーションにより環状化してもよいし、また複数の一本鎖ＤＮＡが分子間ライゲーションにより、タンデムに配した状態で環状化してもよい。好ましくは、部分的な二本鎖形成による不完全なエクソヌクレアーゼ処理を防ぐために、環状化反応においてＤＮＡプローブにガイド配列を必要としない種類の一本鎖ＤＮＡリガーゼが用いられる。
高いＳ／Ｎ比を得るためにも、環状化していない未反応の一本鎖ＤＮＡを分解することが好ましく、とくに好ましくは、エクソヌクレアーゼＩ(各社)、T5エクソヌクレアーゼ（Epicentre社）、エクソヌクレアーゼVI（Epicentre社）、RecJエクソヌクレアーゼ（Epicentre社）等の一本鎖オリゴヌクレオチドをモノヌクレオチドまで分解可能なエクソヌクレアーゼによる酵素分解が好ましい。ただし、エクソヌクレアーゼIIIは、作成された一本鎖環状ＤＮＡを基質とするため使用できない。
【００４４】
次に、（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる。かかるハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、環状化一本鎖ＤＮＡプローブと目的ＲＮＡとの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
本発明に用いる試料は、標的となるＲＮＡを含有していれば、特に限定されないが、かかるＲＮＡが精製されていても、精製されていなくても用いることができる。目的ＲＮＡの分解を避けるため、リボヌクレアーゼ活性の低減した試料であってもよい。例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理し、リボヌクレアーゼ活性を抑制させた試料であってもよい。
【００４５】
典型的には、生物由来の夾雑物を含んでいてもよい。生物由来の夾雑物としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡなどの各種のＤＮＡ、タンパク質、脂質、多糖類などが挙げられる。
また、試料中にＤＮＡが含まれている場合、ＤＮａｓｅなどのＤＮＡ分解酵素や、他のＤＮＡ分解処理がされていないものであってもよい。特に、本発明は、ＤＮＡ分解処理を必要としないため、ＤＮＡを含む試料に対してむしろ好適に実施することができる。
【００４６】
任意に、前記（２）において得られた目的ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド上で、ＲＮａｓｅ Ｈによって目的ＲＮＡ鎖のみにニックを形成させる工程（５）を含むことができる。ＲＮａｓｅ Ｈは一般に用いられている中温性のRNase HI（各社）やRNase HII（NEB社）の他に、Hybridase（登録商標）、Thermostable RNase H（Epicentre社）、Tth RNase H（東洋紡社）等の耐熱をＲＮａｓｅ Ｈを用いることでも行うことができる。ＲＮａｓｅ Ｈは反応の初期段階において必要であり、反応中期から後期には必要ないため必要な量はごく少量でもよい。ＤＮＡの伸長反応において使用されるＲＮａｓｅ Ｈの量（濃度）は、好ましくは終濃度約１×１０−４〜１０ユニット／反応、より好ましくは終濃度約１×１０−４〜１ユニット／反応で使用する。
または、本発明の方法において、ＲＮａｓｅ Ｈは、好ましくは１×１０−７〜０．１ユニット／μl、より好ましくは１×１０−７〜１×１０−２ユニット／μlの範囲において好適に用いられる。
【００４７】
さらに、（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしたローリングサークル増幅法（ＲＣＡ；Rolling Circle Amplification）を行う。ＲＣＡは、例えば、phi29 polymerase（各社）、Klenow DNA Polymerase (5’-3’, 3’-5’ exo minus) （各社）、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) (各社)、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社) 、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることでも行うことができる。
【００４８】
本発明の方法によるＤＮＡの伸長反応は、好ましくは、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃〜４２℃、より好ましくは約３０℃で反応する。
【００４９】
そして、（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する。 このような標識としては、例えば、放射線（３２Ｐなど）標識、蛍光標識など、検知可能な種々の標識を用いることができるが、とくに、検知の容易さ、安全性およびＬＥＤ使用等による検出機作成時の簡便さなどの観点から、蛍光標識であることが好ましい。また、一本鎖ＤＮＡが部分的に二本鎖を形成するため、一般的な二本鎖ＤＮＡ検出に利用されるエチジウムブロマイドも、増幅産物の検出に使用できることは、当業者であれば理解できるだろう。
【００５０】
標識は、合成された一本鎖ＤＮＡに結合すれば、検出対象配列に特異的であっても、特異的でなくてもよい。配列に特異的に結合する標識としては、例えば、放射線標識されたＤＮＡ断片やメチル化等の修飾を含むＲＮＡ断片、ペプチド核酸（ＰＮＡ）断片、ＤＮＡ配列特異的に結合する抗体や金属ナノ粒子などが挙げられる。標識の標的となる特異的なＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ配列は、検出対象のＲＮＡの配列に相補的な配列であってもよいが、例えば、環状化一本鎖ＤＮＡプローブに標識の標的となる配列の相補的な配列を組み込んでおくことも可能である。
また配列に特異的でなくても、ＤＮＡに特異的に結合する標識を用いることも可能であり、例えば、SYBR GreenII（Invitrogen社）などの蛍光色素をもちいることができる。
【００５１】
標識の検知方法は、標識の種類に応じて適宜選択し得る。例えば、抗体を標識に用いた場合は、二次抗体やカップリング反応を用いて検知すること、また金属ナノ粒子を用いた場合には、粒子間相互作用の変化に伴う物性変化を計測することによる検知が可能である。さらに、クロマトグラフィーや電気泳動などを用いて検知することも可能である。
本発明のＲＮＡの検出方法において、検出対象となるＲＮＡはとくに限定されず、例えば、各種細胞におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現をリアルタイム検出することや、微生物やウイルス由来のＲＮＡを検出対象とすることも可能である。
【００５２】
本発明の一態様においては、本明細書に記載するＲＮＡ検出方法のための反応試薬および組成物を含む、ＲＮＡ検出のためのキットとすることができる。本発明のキットには、本明細書に記載するＲＮＡ検出反応のための鋳型となる環状化一本鎖ＤＮＡプローブ、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ＲＮａｓｅ Ｈ、ｄＮＴＰ混合物、反応用緩衝液、および検出用蛍光色素などを含むことができる。
【００５３】
本発明の検出するＲＮＡは、とくに限定されることなく、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含むあらゆる種類のＲＮＡを検出することが可能である。検出対象のｍＲＮＡは、ポリＡ配列を有していても、有していなくてもよい。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡを含むノンコーディングＲＮＡであってもよく、さらに、ウイルスなどのゲノムＲＮＡであってもよい。また、検出対象のＲＮＡの形状は、直鎖状または環状のどちらでも可能である。
【００５４】
本発明のＲＮＡ検出の一態様においては、検出対象となるＲＮＡはあらゆる生物種由来の試料から調製または単離されたものでもよい。そのようなＲＮＡを含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物の個体そのもの、あるいはその一部が使用できる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調整したＲＮＡ含有調整物であってもよい。また、前記試料をさらに分画して、その一部を取り出したものから調製したＲＮＡ含有調製物であってもよい。
【００５５】
本発明はまた、生物の検出方法に関する。
本発明において、生物は、原核生物、真核生物、ウイルス、およびウイロイドを含み、それに由来するＲＮＡを検出することによって検出することができる。検出可能な生物種は、ＲＮＡを有するものであればとくに限定されず、ＲＮＡの種類も問わない。例えば、ウイルス、細菌、カビ、酵母、昆虫、植物および動物のような生物を対象とすることができる。
【００５６】
さらに、本発明の一態様は、微生物の検出方法に関する。
本発明において、微生物は、それに由来するＲＮＡを検出することによって検出することができる。微生物は、構成単位が肉眼では観察できない微小な生物をいい、ウイルスや多細胞の生物も含む。検出可能な微生物としては、例えば、ポリＡ配列を持たないｍＲＮＡを産生する細菌、およびゲノムがＲＮＡであるウイルスまたはウイロイドなどが挙げられる。また、原生動物、およびカビや酵母などの真菌を含む真核微生物を対象とすることもできる。
【００５７】
以下に実施例によって本発明を詳述するが、本発明は、各実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
〔材料および方法〕
１．鋳型オリゴヌクレオチドの環状化
表１に示すオリゴヌクレオチドを、１ｍＭ ＡＴＰを含む１×Ｔ４ライゲースバッファー中、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。リン酸化したオリゴヌクレオチドを、１０ユニットのCircLigase（登録商標）ssDNA Ligase（Epicentre社）を用い、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２の１×CircLigaseバッファー中、６５℃、１時間で環状化した。環状化されていないオリゴヌクレオチドは、１０ユニットのエクソヌクレアーゼＩで３７℃１時間消化し、続いて８０℃２０分間処理し、酵素を不活性化した。環状化したオリゴヌクレオチドは、BioSpin（BioRad社）で精製し、濃度をQuant-iT ssDNA BR Assay Kit（Invitrogen社）およびQubit fluorometer（Invitrogen社）を用いて測定した。環状化オリゴヌクレオチドのエクソヌクレアーゼによる消化率と直鎖状のオリゴヌクレオチドのものとの比較をアガロースゲル電気泳動（２．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）により分析し、CircLigaseの反応による環状化が行われたことを確認した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
２．Ｔ７発現ベクターpET-21dへのＧＦＰ遺伝子のクローニング
２μｇのpAcGFP1（Clontech社）からそれぞれ５０ユニットのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（タカラバイオ社）で同時に消化し、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＰ）遺伝子を単離した。ＧＦＰ遺伝子はアガロースゲル電気泳動により精製し、Wizard（登録商標）SV GelおよびPCR Clean-Up Systems（Promega社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの濃度は、Quant-iT dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen社）およびQubit fluorometer（Invitrogen社）を用いて測定した。精製したＧＦＰ遺伝子をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断したＴ７発現ベクターpET-21d（Novagen社）に連結し、組み換えプラスミドpET-AcGFPを作製した。大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α株に形質転換した後、プラスミドＤＮＡを選択したコロニーから精製し、制限酵素処理の後、アガロースゲル電気泳動で確認した。精製したpET-AcGFPの濃度をQuant-iT dsDNA HS Assay KitおよびQubit fluorometerを用いて測定した。
【００６１】
３．ＧＦＰｍＲＮＡのin vitroでの転写
ＧＦＰｍＲＮＡのin vitroでの転写は、MEGAscript（登録商標）T7 Kit（Ambion社）を用いて行った。１μｇのpET-AcGFPをＮｏｔＩで消化して得られた直鎖状の鋳型ＤＮＡを転写反応液に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＤＮａｓｅＩ処理により鋳型ＤＮＡを除去した後、転写したｍＲＮＡをMEGAclear（登録商標）Kit（Ambion社）を用いて精製し、濃度を分光分析法により測定した。転写したｍＲＮＡを用時まで−８０℃で保存した。
【００６２】
４．ＧＦＰｍＲＮＡのin vivoでの発現およびＲＮＡの抽出
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen社）をpET-AcGFPで形質転換し、pET-AcGFPの選択のため５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌおよび１．５％寒天）で培養した。大腸菌はＬＢ培地で３０℃８時間培養した。培養物をOvernight Express（登録商標）Autoinduction System（Novagen社）を含むフレッシュなＬＢ培地で１：１０００に希釈し、３０℃で１６時間振とう培養し、ＤＥ３にコードされるＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりＧＦＰｍＲＮＡの転写を誘導した。大腸菌は、３，５００ｒｐｍで４℃２０分間の遠心分離により５０ｍｌのコニカルチューブに回収した。全ＲＮＡをTrizol（登録商標）Max Bacterial RNA Isolation kit（Invitrogen社）を用いて単離した。調製した全ＲＮＡは、混入したゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡなどの夾雑ＤＮＡを除去するためのＤＮａｓｅ処理（例えば、ＤＮａｓｅＩによる処理）を行うことなく試料として供した。当該試料中、微量の夾雑ＤＮＡが含まれていることをアガロースゲル電気泳動（1.5%、Tris-borate-EDTA緩衝液）によって確認した。なお、全ＲＮＡの濃度は分光分析法により測定した。
【００６３】
５．ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ検出
in vitroで転写したＧＦＰｍＲＮＡまたはpET-AcGFPを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から単離した全ＲＮＡを、１０ｐｍｏｌの環状化オリゴヌクレオチド（表１のＰ１（配列番号１）、Ｐ２（配列番号２）、Ｐ３（配列番号３）またはＰ４（配列番号４））とともに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー中に混合し、１００μｌの反応混合物を得た。ｍＲＮＡと環状化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを９５℃５分間のインキュベーションにより促進し、その後３０℃に急冷した。ＲＣＡ反応は、１００μｌのハイブリダイゼーションした混合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、８ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、SYBR GreenII（Invitrogen社）および適切なユニットのRepliPHI phi29ポリメラーゼ（Epicentre社）を含む１００μｌの反応液とを混合することで開始した。phi29ポリメラーゼにより合成されたｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）に結合した際のSYBR GreenIIの蛍光を１５分毎にQubit fluorometerで検出した。３０℃、１５時間のインキュベーションの後の合成ＤＮＡ１５μｌを、２０ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）で３７℃、３０分間消化し、アガロースゲル電気泳動（１．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【００６４】
６．ＲＮａｓｅ Ｈを利用したＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ検出
in vitroで転写したＧＦＰｍＲＮＡを、１０ｐｍｏｌの環状化オリゴヌクレオチド（表１のＰ５、配列番号５）とともに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー中に混合し、１００μＬの反応混合物を得た。ｍＲＮＡと環状化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを９５℃、５分間のインキュベーションにより促進し、その後３０℃に急冷した。ＲＣＡ反応は、１００μＬのハイブリダイゼーションした混合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、８ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、さらに適切なユニット数のＲＮａｓｅ ＨおよびRepliPHI phi29ポリメラーゼ（Epicentre社）を含む１００μＬの反応液を混合することで開始した。３０℃、１５時間のインキュベーションの後の合成ＤＮＡ１５μＬを、２０ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）で３７℃、３０分間消化し、アガロースゲル電気泳動（１．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した
【００６５】
７．ＰＣＲによるＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡの検出
pET-AcGFPを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から、全ＲＮＡの抽出を行った。この際、ＧＦＰの発現を自動誘導により制御し、発現誘導した菌体および発現誘導してない菌体から、Trizol（登録商標）Max Bacterial RNA Isolation kit（Invitrogen社）を用いて、２種類の全ＲＮＡをそれぞれ調整した。また、得られた全ＲＮＡ試料の一部（１０μｇ）について、ＤＮａｓｅ処理を以下の手順で行った。１０μｇの全ＲＮＡ試料を１×ＤＮａｓｅ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２）中で、１０ユニットのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社）で３７℃、３０分間消化後、フェノールクロロホルム抽出によってＤＮａｓｅ画分と核酸画分に分離し、エタノール沈殿によってＲＮＡを沈澱物として回収した。回収したＲＮＡはジエチルピロカーボネート処理された滅菌蒸留水で溶解後、ＲＮＡ濃度をQuant-iT RNA BR Assay Kitで決定した。
【００６６】
ＰＣＲによる夾雑ＤＮＡ（pET-AcGFP）の検出は、以下の手順で行った。各ＲＮＡ試料２０ｎｇ、１×AmpliTaq Goldバッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１μＭの各プライマーの組み合わせ（表２）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．６２５ユニットのAmpliTaq Goldポリメラーゼを含む反応液を調製し、９５℃で１０分間の予備加熱後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で７分間の予備伸長を経たのち、４℃で保持した。各プライマーの組み合わせにおけるポジティブコントロール（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）として、ＲＮＡ試料の代わりに、１ｎｇのpAcGFP-1（Clontech社）を鋳型として用いた。各ＰＣＲ産物２μＬは、アガロースゲル電気泳動（２．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【表２】
【００６７】
８．夾雑ＤＮＡ含有試料におけるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出
上記（７）のＰＣＲによって夾雑ＤＮＡの存在が確認されたＲＮＡ試料を用いて、本発明のＲＰＲＣＡによるＧＦＰｍＲＮＡの検出を以下のように行った。各ＲＮＡ試料２０ｎｇを１０ｐｍｏｌの環状化オリゴヌクレオチド（表１のＰ４（配列番号４））とともに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー中に混合し、１０μｌの反応混合物を得た。ネガティブコントロール（Ｎ）として、ＲＮＡ試料を含まない反応混合物を用意した。ｍＲＮＡと環状化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを９５℃で５分間のインキュベーションにより促進し、その後３０℃に急冷した。ＲＣＡ反応は、ハイブリダイゼーションした混合物１０μｌを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、８ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１０ユニットのRepliPHI phi29ポリメラーゼ（Epicentre社）を含む１０μｌの反応液とを混合することで開始した。反応は３０℃、４時間のインキュベーションで行い、その後の合成ＤＮＡ２０μｌを、２４ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）を用いて３７℃、３０分間消化し、消化液のうち１０μｌをアガロースゲル電気泳動（１．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【００６８】
〔実験結果のまとめ〕
１．環状化プローブでのＲＣＡを利用したｍＲＮＡのリアルタイム検出のためのストラテジー
図１は、ＲＣＡによるｍＲＮＡ検出の基本的なスキームを示す。かかるスキームは、以下の５つの工程を含む：
（１）目的ｍＲＮＡに相補的な配列を有するｓｓＤＮＡプローブを、CricLigaseなどを用いて、分子内ライゲーションにより環状化する工程、
（２）連続的なＲＣＡ反応における非特異的な副生成のＤＮＡ合成を避けるため、ライゲーションしていないｓｓＤＮＡプローブをエクソヌクレアーゼＩを用いた分解により除去する工程、
（３）環状ｓｓＤＮＡプローブを目的ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズさせる工程、
（４）phi29ＤＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ（ＲＮＡをプライマーとしたＲＣＡ；ＲＰＲＣＡ）を行う工程、
（５）SYBR GreenIIなどのｓｓＤＮＡに対する蛍光色素によって、ＲＣＡによって合成された結果物であるｓｓＤＮＡの結合による蛍光を得る工程。
これにより、ＲＰＲＣＡを介したｍＲＮＡのリアルタイム検出が達成される。
【００６９】
２．in vitroで転写されたｍＲＮＡのリアルタイム検出
まず最初に、phi29ＤＮＡポリメラーゼが、長い配列を有するｍＲＮＡをＲＣＡ反応のプライマーとして適合させ得るのかについて検討した。プラスミドpET-AcGFPをＮｏｔＩで、Ｔ７ターミネーターとＧＦＰ遺伝子の終止コドンの間の領域を消化し、対応するｍＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼでin vitroでの転写によって調製した（図２Ａ）。環状ｓｓＤＮＡプローブ（Ｐ１またはＰ２）もＲＰＲＣＡ用のin vitro転写ｍＲＮＡと併せて用いた。Ｐ１のＤＮＡ配列は、ＧＦＰの３’末端配列と相補的である（表１）。他方、Ｐ２の配列は、Ｐ１と長さとＧＣ含量とが同じであるが、配列上、ＧＦＰのｍＲＮＡと異なるものである（表１）。
【００７０】
phi29ＤＮＡポリメラーゼによるＲＣＡ反応は、Ｐ１またはＰ２を有しないｍＲＮＡからは開始せず、反応バッファーにおけるＰ２のインキュベーションによっても、ｍＲＮＡが存在してもしなくても、ＲＣＡ反応を起こすことはなかった（図２ＢおよびＣ）。しかしながら、Ｐ１単独ではＲＣＡ反応に影響しないのに拘らず、ｍＲＮＡとＰ１との組み合わせによってＲＣＡ反応が促進された。このことから、ＲＰＲＣＡによって、in vitro転写ｍＲＮＡの３’末端に特異的なｓｓＤＮＡプローブを用いる目的ｍＲＮＡのリアルタイム検出が行い得ること、および、非特異的環状プローブがＲＰＲＣＡに影響しないこと判明した（図２ＢおよびＣ）。これらのことは、phi29ポリメラーゼが、適切な環状ｓｓＤＮＡプローブの存在下、ｍＲＮＡをプライマーとして用いるＲＣＡ反応を特異的に作用し得ることを示唆している。さらに、エクソヌクレアーゼＩで処理した環状ｓｓＤＮＡプローブは、ＲＰＲＣＡにおける長時間の反応期間の後に非特異的な副生成物を産生しなかった。これは、環状プローブの調製におけるエクソヌクレアーゼＩ処理が特異的で信頼できるＲＰＲＣＡによる増幅に寄与していることを示す。
【００７１】
ＲＰＲＣＡにおける環状ｓｓＤＮＡプローブの長さの効果を、ＧＦＰｍＲＮＡの３’末端に相補的なＤＮＡ領域をカバーするｓｓＤＮＡプローブＰ３（表１）を用いて行った。図２Ｄに示すとおり、興味深いことに、同じ長さのＧＦＰｍＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ配列を有するにも拘らず、短いプローブ（Ｐ３）ではなく、長いプローブ（Ｐ１）で十分なＲＣＡ反応が観察された。このことは、プローブの長さが、ｍＲＮＡと環状プローブとの最初のハイブリダイゼーションに関係し、ＲＰＲＣＡの効率に影響を与えることを示している。
【００７２】
まとめると、上記の証拠は、本発明のＲＰＲＣＡが、適切な環状プローブを用いることで、不規則なＤＮＡ増幅副生成物を生成することなく、目的ｍＲＮＡのリアルタイム検出を可能とすることを示している。
【００７３】
３．ＲＰＲＣＡの感度
感度とphi29ＤＮＡポリメラーゼの濃度との間の相関関係を明確にするため、ＲＰＲＣＡ反応における濃度の影響を調べた。ＲＣＡ反応は、phi29ＤＮＡポリメラーゼの濃度を変化させた条件下で、各サンプルについて、３．２ｎｇのin vitro転写ｍＲＮＡをプライマーとして添加した場合を観測した。ＲＣＡ反応は、濃度依存的に促進されることが確認された（図３Ａ）。次いで、図３Ａにおいて試験した最も高い酵素濃度（１反応当たり１００ユニット）でのＲＰＲＣＡによるｍＲＮＡ検出の感度を測定した。その結果、ＲＰＲＣＡは、２時間で３２０ｐｇのin vitro転写ｍＲＮＡを検出することができた。
【００７４】
４．生きた微生物由来の目的ｍＲＮＡの特異的検出
ＲＰＲＣＡによって、生きた微生物のｍＲＮＡを目的として検出できるかについて検討した。誘導したＧＦＰ発現が容易に観察できるため（図４Ａ）、pET-AcGFPで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をＲＰＲＣＡのモデルとして用いた。生きた細胞において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＧＦＰｍＲＮＡの一次構造は、７塩基の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＧＦＰｍＲＮＡ、およびそれに続く３’ＵＴＲの４８塩基の隣接残基から構成される（図４Ｂ）。この実験においては、ｓｓＤＮＡプローブＰ４を合成した。前記Ｐ４は、図４Ｂに下線で示した３’末端に対応するＤＮＡ配列が含まれるように合成されている（表１）。栄養増殖している大腸菌において全ＲＮＡの大部分はｒＲＮＡおよびｔＲＮＡが占めているので、両ＲＮＡともＲＰＲＣＡに影響を及ぼし得る。どの程度の量のｒＲＮＡおよびｔＲＮＡがＲＰＲＣＡに影響したかを調べるため、誘導した大腸菌および誘導していない大腸菌の両方から抽出した後、全ＲＮＡをＲＰＲＣＡに用いた。誘導ありまたは誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ２００ｎｇをＰ２またはＰ４とともにインキュベートした場合、誘導した大腸菌由来の全ＲＮＡと環状プローブＰ４とを組み合わせたものだけ、十分なＲＰＲＣＡが観察された（図４Ｃ）。全ＲＮＡ単独または環状プローブ単独ではＲＣＡ反応は起きなかった。さらに、段階希釈した全ＲＮＡを用いた２時間のＲＰＲＣＡによって、ＧＦＰｍＲＮＡが１０ｎｇの全ＲＮＡから検出可能であることが明らかになった（図４Ｄ）。ＲＮＡの全量（４００μｇ）が１．５×１０１０細胞の密度の大腸菌から抽出されたことを考慮すると、１０ｎｇの全ＲＮＡは、およそ４×１０５細胞に相当する。これらの結果は、細菌性全ＲＮＡと適切なｓｓＤＮＡプローブとの組合せを用いたＲＰＲＣＡは、in vitro転写ｍＲＮＡの場合（図２）と同様に、ＧＦＰｍＲＮＡを特異的に検出できるばかりでなく、発現したＧＦＰｍＲＮＡと全ＲＮＡの大部分を構成するｒＲＮＡやｔＲＮＡのような他のＲＮＡ種とを明確に区別することができることが示された。
【００７５】
また、試料中に夾雑ＤＮＡが含まれていても（試料中のＤＮＡの分解処理をしていなくても）、良好にＲＮＡの検出ができたことを示すものであった。すなわち、試料中のＤＮＡの分解処理を行わなくても、目的ＲＮＡが発現していない試料（図４の「−」（ネガティブコントロール））においては夾雑ＤＮＡによる不規則なＤＮＡ増幅生成物を生成することがなかったことからも明らかなとおり、本方法においては高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を実現することができた。
【００７６】
５．ＲＰＲＣＡのＲＮａｓｅ Ｈを利用したＲＮＡ検出のためのストラテジー
図５は、ＲＮａｓｅ Ｈ処理工程を含むＲＣＡによるＲＮＡ検出の基本的なスキームを示す。かかるスキームは、以下の6つの工程を含む：
（１）目的ｍＲＮＡに相補的な配列を有するｓｓＤＮＡプローブを、CricLigaseなどを用いて、分子内ライゲーションにより環状化する工程、
（２）連続的なＲＣＡ反応における非特異的な副生成のＤＮＡ合成を避けるため、ライゲーションしていないｓｓＤＮＡプローブをエクソヌクレアーゼＩによる分解・除去する工程、
（３）環状ｓｓＤＮＡプローブに目的ＲＮＡをハイブリダイズさせる工程、
（４）環状ｓｓＤＮＡプローブにハイブリダイズした領域の目的ＲＮＡに、ＲＮａｓｅ Ｈにより、ニックサイトを形成させる工程、
（５）phi29ＤＮＡポリメラーゼによって、ニッキングサイトのＲＮＡの3‘末端からＲＰＲＣＡを行う工程、
（６）ＲＣＡによって合成された結果物であるｓｓＤＮＡを検出する工程。
【００７７】
６．ＲＮＡａｓｅ Ｈを利用したＲＰＲＣＡによるin vitroで転写されたｍＲＮＡの検出
ＧＦＰｍＲＮＡの内部領域と相補性のあるＤＮＡプローブを利用した場合、ＲＰＲＣＡ反応が起こりえるかどうか検討した。プラスミドpET-AcGFPをＮｏｔＩで、Ｔ７ターミネーターとＧＦＰ遺伝子の終止コドンの間の領域を消化し、対応するｍＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるin vitro転写によって調製した（図６）。転写したＧＦＰｍＲＮＡは環状ｓｓＤＮＡプローブ（Ｐ５）と併せて用いた。プローブＰ１のＤＮＡ配列は、ＧＦＰの内部領域と相補的である（図６）。
【００７８】
環状化一本鎖プローブが存在しない場合、phi29ＤＮＡポリメラーゼによるＲＣＡ反応は、促進されず一切のＤＮＡ産物が確認できなかった(図７)。プローブＰ５を利用した場合、ＲＮａｓｅ Ｈを添加しない条件のＲＰＲＣＡ反応では非特許文献８の報告とは異なり、一切のＤＮＡ産物は確認できなかった(図７)。このことから、本願のＲＮａｓｅ Ｈ処理工程を含むＲＰＲＣＡ法では、目的ＲＮＡの内部配列をＤＮＡプローブとハイブリダイズさせても、目的ＲＮＡを検出できることを示している。さらに、特許文献４とは異なり、ゲル中で単一のバンドとして検出される本願発明は、非特異的な副産物が生じていないことを確認し、その検出精度の高さが認められる。
また、添加するＲＮａｓｅ Ｈの濃度依存性についても検討した結果、ＲＮａｓｅ Ｈの添加によってＲＰＲＣＡ反応が促進されることが示された。
【００７９】
上記の証拠は、本発明のＲＮＡ検出方法は、ＲＰＲＣＡの工程において、適切な濃度のＲＮａｓｅ Ｈで処理することによって、目的ＲＮＡの３’末端配列の情報に依存せずに、非特異的なＤＮＡ増幅副生成物を生成しないで特異的な検出が可能であることを示している。
【００８０】
７．ＰＣＲによるＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡの検出
ＧＦＰ遺伝子に特異的なプライマー３セット（表２）を使用して、ＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡをＰＣＲにより検出した。その際、ＧＦＰの発現を自動誘導により制御し、発現誘導した菌体から調整した全ＲＮＡ（＋）と、発現誘導していない菌体から調整した全ＲＮＡ（−）の２種類を得た。さらに、その一部をそれぞれＤＮａｓｅ Ｉを用いてＤＮＡ分解処理をし、発現誘導有りまたは無しの全ＲＮＡであって、ＤＮａｓｅ処理有りまたは無しの合計４種類の全ＲＮＡを得た。そして、各全ＲＮＡを用いて夾雑ＤＮＡの検出を試みた。
【００８１】
ＤＮａｓｅ処理を行っていないＲＮＡ試料からは、いずれのプライマーセットにおいても、ＧＦＰの誘導・非誘導にかかわらず目的ＤＮＡ増幅産物が、各プライマーセットのポジティブコントロール（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）と同様に確認された（図８）。一方で、ＤＮａｓｅ処理を行ったＲＮＡ試料からは、誘導・非誘導で共に目的ＤＮＡ増幅産物が明らかに減少した（図８）。以上のことから、ＤＮａｓｅ処理によって夾雑ＤＮＡの大部分を除去することが可能であることが示された。しかし、ＤＮａｓｅ処理を行っても、わずかにバンドが検出されたことから、一般的なＤＮａｓｅ処理だけでは、ＲＮＡ試料から完全に夾雑ＤＮＡを取り除くことが難しいことも同時に示された。この夾雑ＤＮＡがＲＴ−ＰＣＲにおいても同様に、ノイズとして検出される可能性が高いことは、当業者であれば理解できる。
【００８２】
８．夾雑ＤＮＡ含有試料におけるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出
上記（７）のＤＮａｓｅ処理有りまたは処理無しのＲＮＡ試料を用いて、ＲＰＲＣＡによるＧＦＰｍＲＮＡの検出を試みた。その結果、ＤＮａｓｅ処理の有無、すなわち夾雑ＤＮＡの量に拘わらず、発現誘導した菌体から調整したＲＮＡ試料から、ＲＰＲＣＡにより増幅したＤＮＡが十分な量で確認された（図９）。また、ＤＮａｓｅ処理の有無に拘わらず、発現誘導していない菌体から調整したＲＮＡ試料では、ＲＰＲＣＡによるＤＮＡの増幅は認められなかった（図９）。以上のことから、本発明のＲＰＲＣＡにおいては、ＲＮＡ試料から夾雑ＤＮＡを除去することなく、また、ＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡ量の影響を受けることなく、目的ＲＮＡのみを高いＳ／Ｎ比で検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を利用したＲＮＡプライムドローリングサークル型ＤＮＡ複製法（RNA-Primed Rolling circle amplification；RPRCA）を応用し、ＲＮＡの種類、３’末端配列情報等に影響を受けずに、簡便な操作で、逆転写反応を経由せずに、生物由来の夾雑物を含む試料中から直接ＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕやリアルタイムで検出可能な方法に関するものであり、研究、医療・臨床検査、食品産業など幅広い応用範囲において貢献するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＲＮＡを直接検出する方法、より具体的には、検出対象のＲＮＡをプライマーとして、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によってＤＮＡを増幅するローリングサークル増幅法（RNA-Primed Rolling Circle Amplification；ＲＰＲＣＡ）を用いたＲＮＡの直接検出法およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品のような複雑なサンプルから僅かな微生物を検出し、サンプルに存在する生きた微生物の有無を検査することを目的とする場合、一般的には培養法が用いられる。しかし培養法による微生物の検出には、選択培地によるところが大きく、しかも数日の培養期間が必要であるため、迅速性が求められる食中毒検査や臨床診断等には向いていない。一方、微生物の迅速な検出には、微生物等が有する固有のＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応（polymerarse chain reaction；ＰＣＲ）を利用して検出する方法が知られている。しかし、ＤＮＡは化学的に安定な化合物であるため、ＰＣＲによって微生物等に固有なＤＮＡ配列が検出されたとしても、当該微生物等の生死を判別するには至らない。
【０００３】
細胞内のＲＮＡは細胞が死滅すると速やかに分解されるため、ＲＮＡを検出することによって微生物などの生きた細胞の検出および生死判別を行う方法が開発されている。特に、ＲＮＡを逆転写反応（ＲＴ（reverse transcription）反応）によってＤＮＡに変換した後にＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲ法はよく知られている（例えば、非特許文献１）。しかし、ＰＣＲ法はその反応のシステムのため、反応温度を変化させることが可能なサーマルサイクラーなどの高価な装置を必要としており、一般的なＰＣＲにかかる時間は少なくとも２〜３時間程度を必要としている。また、増幅と検出を同時に行うことのできるリアルタイム検出法が可能であるが、かかる検出法には、サーマルサイクラーに検出装置が組み込まれている必要があり、サーマルサイクラーよりもさらに費用が嵩むことになる。
【０００４】
一方で、ＲＮＡを逆転写した後に、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を利用したＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）によってＲＮＡを迅速に検出するＲＴ−ＬＡＭＰ法も開発されている（非特許文献２）。ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、およそ１〜２時間程度での検出が可能であるが、その反応システムは複雑で汎用性に乏しく、また反応システム上、比較的高温（６５℃）を維持できる機械を必要としている。ＰＣＲ法と比較して、低価格の装置でリアルタイム検出も可能であるが、その反応システムは、特殊なプライマー設計の複雑さなどのために現時点では汎用されていない。
【０００５】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＲＮＡ検出では、最終的な増幅反応に至るまでに生成するＤＮＡが、次の反応ステップに混入して非特異的な逐次反応を誘発する、いわゆるキャリーオーバーによるクロスコンタミネーションが常に問題となる。そのため、試料中の夾雑物、特にゲノム由来のＤＮＡが微量でも混入した場合には偽陽性の結果を生じやすく、目的となるＲＮＡの検出を困難にするため、ＤＮＡ分解処理などのＲＮＡを精製する工程を必要とする。したがって、追加の工程や専用の設備等が必要となり、さらには高度に訓練された人員が必要となるため、初期導入コストのみならずランニングコストも高額になる傾向がある。その結果、畜産産業や食品産業のみならず、臨床検査の現場においても、核酸増幅による微生物検出法の採用が忌避される傾向にある。
【０００６】
一方、反応装置が簡素なＲＮＡ検出方法も開発されており、ＲＴ反応を経たあと、ＲＴ反応に用いたプライマー領域に設定したバクテリオファージプロモーター領域から、再度バクテリオファージＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡを増幅する転写媒介増幅法（Transcription-mediated amplification；ＴＭＡ）（非特許文献３）や、ＴＭＡ法にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）を組み合わせたＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequence-based amplification；ＮＡＳＢＡ）がＲＮＡ増幅・検出方法として利用されている（非特許文献４）。これらは低温（３７℃）における反応であるため、サーマルサイクラー等の特別高価な装置は不要である。しかし、反応生成物がＲＮＡであるため検出には特殊なゲル電気泳動装置等を用いるか、あるいは反応後にＲＴ−ＰＣＲ法を行う必要があり、操作が煩雑である。
【０００７】
上述のように、既存のＲＮＡの増幅・検出法はすべて逆転写反応を経由して行われるため、実験操作の簡素化や反応条件の最適化を行ったとしても、逆転写反応そのものにかかる時間は短縮できないため、検出までに概ね２時間以上の時間を必要とし、検出速度の向上は困難である。かかる問題点は、一層の高速化が求められているＲＮＡ検出法の開発、例えば、病原性大腸菌Ｏ１５７や高病原性インフルエンザウイルスのような病原性ＲＮＡウイルスの検出法の開発などにおいても大きな障害となっていた。
【０００８】
近年、これらの問題を解決する核酸増幅方法として、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification；ＲＣＡ）法が検討されている。ＲＣＡ法は、一本鎖環状ＤＮＡプローブを該ＤＮＡプローブに相補的な配列を持つＤＮＡプライマーでハイブリダイズさせた後、該ＤＮＡプローブを鋳型とした鎖置換型ＤＮＡ合成反応によって一本鎖ＤＮＡを連続的に生成する反応である。したがって、ＲＣＡ法ではＤＮＡ合成反応後に生成する一本鎖ＤＮＡを検出することによって、ＤＮＡプライマーもしくはＤＮＡプローブの存在を判定することができる。
【０００９】
そしてＲＮＡ検出方法として、ＲＮＡ−プライムドローリングサークル型増幅（RNA-Primed Rolling Circle Amplification；ＲＰＲＣＡ）法が、新たなＲＮＡ検出法として注目を浴びている。ＲＰＲＣＡは標的ＲＮＡ分子の３’側配列と相補的配列を有する環状ＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせた後、当該ＲＮＡ分子の３’末端をＤＮＡ合成の開始点として利用し、一本鎖ＤＮＡをＲＣＡ法により連続的に合成する。これにより合成された一本鎖または二本鎖ＤＮＡを検出することにより、逆転写反応を行わずに目的のＲＮＡ、特に原核微生物由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）や、真核生物のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を短時間で検出することが可能となる。
【００１０】
これまでに、ＲＣＡ法を利用したＲＮＡの検出方法として、真核生物のｍｉＲＮＡとハイブリッド形成させた一本鎖環状ＤＮＡプローブを用いて、当該ＲＮＡをＲＣＡ法によって検出する方法が検討されている（特許文献１）。しかしながら、このＲＣＡ法には、非特異的に合成されるＤＮＡ副生成物によって検出時のシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低下するという問題がある。非特異的なＤＮＡ副生成物に起因するシグナルノイズ比の低下を回避するために、特許文献１では、複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを介して予め環状ＤＮＡを作成し、未反応の一本鎖ＤＮＡの除去を試みているが、複数であるが故に部分的な二本差を形成しやすくなり、二本鎖を形成したオリゴヌクレオチドはエクソヌクレアーゼのみでは除けないため、この方法では困難である。
【００１１】
また、特許文献２では環状化反応およびＤＮＡ合成において、耐熱性酵素を利用して反応温度を上昇させることにより、非特異的なＤＮＡ合成の原因となる非特異的な二本鎖形成の抑制を検討している。しかし、耐熱性酵素のために、非耐熱性酵素に比べてシグナル検出速度は低下する。
【００１２】
特許文献３では、直鎖状パドロックＤＮＡプローブ（非特許文献５）を検出対象のＲＮＡとハイブリッド形成させた上で、該パドロックＤＮＡプローブを環状化させ、一本鎖環状ＤＮＡプローブを形成させる方法を開示している。同様に、特許文献４および非特許文献６においても、パドロックＤＮＡプローブと検出対象のＲＮＡとのハイブリッドを形成させた後、パドロックＤＮＡプローブの環状化反応を行い、さらに検出用ＤＮＡプライマーを用いて、検出対象のＲＮＡの有無が検証可能な方法を報告している。
【００１３】
しかしながら、直鎖状パドロックＤＮＡプローブを環状化させる際、反応溶液中の直鎖状パドロックＤＮＡプローブが全て環状化されることはなく、未反応の直鎖状パドロックＤＮＡプローブ自身が非特異的な二本鎖核酸を形成する。また、検出用ＤＮＡプライマーの使用は、さらに非特異的なＤＮＡの副生成物を生じさせるため、検出時のＳ／Ｎ比が大きく低下するという問題がある。
【００１４】
非特異的な副生成物に由来するＳ／Ｎ比の低下は、検出感度を下げるのみならず、目的ＲＮＡの検出においては、偽陽性の結果を生じることにより、不正確な判断を引き起こしかねない。この不正確な判断材料は、特にウイルスを含む感染性微生物の臨床検出において被験者の「生活の質」（Quality Of Life；QOL）の低下を引き起こす可能性がある。
【００１５】
さらに、パドロックＤＮＡプローブを用いたＲＰＲＣＡ法においては、目的のＲＮＡ上におけるパドロックＤＮＡプローブのＴ４ ＤＮＡライゲースによる環状化は、僅か２．５％程度であり、ＤＮＡ上で起こるそれと比べ著しく効率が悪化していると報告されている（非特許文献７）。使用するライゲースをＴ４ ＲＮＡライゲースに変更しても、環状化反応は全体の２０％程度しか起きないため、ＲＮＡのパドロックＤＮＡプローブによる検出効率は、非常に悪いことが明らかにされた。
【００１６】
また、従来のＲＰＲＣＡ法の多くは検出対象となるＲＮＡの３’末端側配列をプライマーとして利用するため、検出可能なＲＮＡ分子種は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）やリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、および原核生物のｍＲＮＡや、真核生物のｓＲＮＡ、あるいは一部のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に限定されていた。特に、ＲＰＲＣＡ法による真核生物のｍＲＮＡの特異的な検出は、全てのｍＲＮＡの３’末端にポリＡ配列が存在するため、原理的に不可能であった。
【００１７】
特許文献４では、多様なＲＮＡ種の３’末端側配列、特にｍＲＮＡの３’末端側配列をプライマーとして利用するため、ポリＡ配列をリボザイムによって除去する方法や、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅ Ｈ処理をしてニックを導入することによって、ｍＲＮＡの３’末端をプライマーとして伸長可能にする方法が記載されている。しかしながら、同文献中、単に手法が記述されているに過ぎず、実際に反応産物を得たものでも、例えば、ゲル中でバンドとして検出したものでもなかった。したがって、同文献に記載の方法では、上述のＳ／Ｎ比の問題を認識していないため、目的物と非特異的な産物との区別ができず、偽陽性の結果を生じる危険性を包含するものであった。さらにまた、同文献における環状化ＤＮＡプローブの作製工程は、極めて煩雑であり、実用に耐えるものではなかった。
【００１８】
一方で、検出対象のＲＮＡとパドロックＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた後、当該パドロックＤＮＡプローブをＴ４ ＤＮＡライゲースにより環状化し、ＤＮＡ合成酵素の、特にphi29ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソリボヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしていない検出対象のＲＮＡの３’末端配列をハイブリダイズしている位置まで除去した後、ハイブリダイズしたＲＮＡ部分をプライマーとしてＤＮＡ合成を開始する方法が開発された（非特許文献８）。さらに、二本鎖ＲＮＡ特異的分解酵素であるＲＮａｓｅ ＩＩＩを反応液に加えることにより、二次構造（二本鎖領域）を取っているであろう非ハイブリダイズ領域のＲＮＡ部分を分解・除去し、ＲＣＡ反応の向上が認められたことを報告している（非特許文献９）。
【００１９】
しかしながら、phi29ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソリボヌクレアーゼ活性は非常に弱いため、除去できるＲＮＡの長さが制限される。さらに、phi29ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソリボヌクレアーゼ活性は、ＲＮＡの二次構造を破壊できず、二次構造を取りやすいＲＮＡ分子ではほとんど分解されないため、ハイブリダイズさせるＲＮＡ領域は３’末端側に限定されてしまい、例えば、５’ＥＳＴ配列は現実的に利用できなかった（非特許文献１０）。
【００２０】
また、非特許文献１０においては、ＲＮＡの直接検出を断念し、代替方法として逆転写反応時に利用する標的ＲＮＡ特異的なＤＮＡプライマーの構成残基の一部にLocked nucleic acid （ＬＮＡ）を使用することにより、ハイブリダイゼーション効率を高めて逆転写効率を向上させ、検出対象のＲＮＡ特異的な逆転写産物によるＲＣＡ反応を行うことにより、検出感度上昇が可能であることを報告している。
【００２１】
しかしながら、この方法は、複数のエクソンで構成されている真核生物のｍＲＮＡでは有効であるが、１エクソンで構成されている酵母や原核微生物においては、残存していたゲノムＤＮＡとの区別が厳密にはできない。さらに、非特許文献１０では最終的にｃＤＮＡではあるが、ＤＮＡをプライマーとして用いるために、非特異的なＤＮＡ副生成物が生じる。したがって，パドロックＤＮＡプローブと相補性のある検出用ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションによってのみ、増幅・検出の特異性が保証されるため、煩雑な操作手順を捨て切れていない。
【００２２】
さらに、従来技術においては、上記の低いＳ／Ｎ比の問題からも、ＲＮＡ試料中に混入するＤＮＡ等の夾雑物によるノイズを防ぐ必要があると考えられており、目的のＲＮＡを検出するために、ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅで処理したり、精製されたＲＮＡ試料を用意する等、利用できる試料が制限されていた（特許文献４、非特許文献８および９）。
【００２３】
以上のように、これまで検討されてきた方法は、ＰＣＲ反応の温度サイクルを管理する装置が必要であったり、検出対象のＲＮＡを逆転写によってＤＮＡ化したり、設備面に止まらず、検出精度においてもコンタミネーションなどによる増幅反応における副生成物の問題などがあった。
【００２４】
一方で、ＲＰＲＣＡ法においては、検出対象のＲＮＡの種類および由来によっては検出用プローブの構築ができず、簡便な手順のＲＰＲＣＡ法を実行できないＲＮＡ分子種のほうが多く存在していた。さらに、非特異的な副生成物に由来するＳ／Ｎ比の低下によって、目的のＲＮＡ検出において不正確な判断を引き起こしかねないため、実用段階には至っていない。
【００２５】
したがって、ＲＮＡを検出する方法として、高額な装置を必要とせず、ゲノム配列等の配列の一部でも既知であれば、特異的な検出が可能となり、さらに簡便でありながら迅速で、かつ高感度の検出方法の構築が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１８１３９０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１８８８９３号明細書
【特許文献３】特表２００３−５３４７８２号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０１１２６３９号明細書
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Selvaratnam S, Schoedel BA, McFarland BL, Kulpa CF. Application of reverse transcriptase PCR for monitoring expression of the catabolic dmpN gene in a phenol-degrading sequencing batch reactor. Appl. Environ. Microbiol. 61:3981-3985. (1995).
【非特許文献２】Fukuta S, Iida T, Mizukami Y, Ishida A, Ueda J, Kanbe M, Ishimoto Y. Detection of Japanese yam mosaic virus by RT-LAMP. Arch. Virol. 148:1713-20 (2003).
【非特許文献３】Kwoh DY, Davis GR, Whitfield KM, Chappelle HL, DiMichele LJ, Gingeras TR. Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1173-7 (1989).
【非特許文献４】Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richman DD, Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:1874-1878 (1990).
【非特許文献５】Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary B.P., and Landegren U. Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science 265 2085-8 (1994).
【００２８】
【非特許文献６】Wang B, Potter SJ, Lin Y, Cunningham AL, Dwyer DE, Su Y, Ma X, Hou Y, Saksena NK. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. J. Clin. Microbiol. 43(5):2339-44 (2005)
【非特許文献７】Li N, Jablonowski C, Jin H, Zhong W. Stand-Alone Rolling Circle Amplification Combined with Capillary Electrophoresis for Specific Detection of Small RNA. Anal. Chem. 81, 4906-4913 (2009)
【非特許文献８】Lagunavicius A, Merkiene E, Kiveryte Z, Savaneviciute A, Zimbaite-Ruskuliene V, Radzvilavicius T, Janulaitis A Novel application of Phi29 DNA polymerase: RNA detection and analysis in vitro and in situ by target RNA-primed RCA. RNA 15:765-771 (2009).
【非特許文献９】Merkiene E, Gaidamaviciute E, Riauba L, Lagunavicius A. Direct detection of RNA in vitro and in situ by target-primed RCA: the impact of E. coli RNase III on the detection efficiency of RNA sequences distanced far from the 39-end. RNA Published online June 28 (2010)
【非特許文献１０】Larsson C, Grundberg I, Soderberg O, Nilsson M. In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules. Nat. Methods 7: 395-397 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明の課題は、高度な設備を必要とせず、簡便な操作で、実用的な感度を有しながら迅速に行うことができる、ＲＮＡの検出方法であって、生物由来の夾雑物を含む試料中、特にＤＮＡが混入した試料においても、特異的な検出を可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、検出対象とする目的ＲＮＡの３’末端部分配列と相補的なＤＮＡを合成し、一本鎖ＤＮＡ連結酵素により自己環状化させて、得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブを目的ＲＮＡとハイブリッド形成させ、さらに目的ＲＮＡをプライマーとして一本鎖ＤＮＡを合成させると、予め反応系に一本鎖ＤＮＡ特異的な蛍光色素を添加しておくことにより、目的ＲＮＡのリアルタイム検出が可能となることを見出した。
【００３１】
また、ＲＮａｓｅ Ｈ処理の工程を加えることにより、３’末端にＤＮＡプローブとの相補配列を有さないＲＮＡであっても検出可能となり、ウイルスや原核生物のみならず真核生物由来の多様なＲＮＡの検出が可能となった。
【００３２】
さらに、本発明者らは、本発明のＲＰＲＣＡ法によって、細胞から実際に得られた試料中から目的ＲＮＡを検出した知見に基づき、生物由来の夾雑物を含む試料中、例えば、ＤＮＡが混入した試料であっても、特異的な目的ＲＮＡの検出が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３３】
すなわち本発明は、以下の方法およびキットに関する。
［１］ 生物由来の夾雑物を含む試料中のＲＮＡの検出方法であって、
（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する工程、
（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程、
（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしてローリングサークル増幅法（ＲＣＡ；Rolling Circle Amplification）により一本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する工程
を含む、前記方法。
［２］ 生物由来の夾雑物が、ＤＮＡを含む、［１］に記載の方法。
［３］ 試料が、核酸試料である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 試料中のＤＮＡが、分解処理されていない、［２］または［３］に記載の方法。
［５］ 前記（１）において、環状化していない未反応の一本鎖ＤＮＡを分解することを含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、検出対象のＲＮＡに相補的な配列のみからなる、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］ 環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、３０塩基長〜４５００塩基長である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］ 前記（２）の後に、
（５）ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程
をさらに含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］ 前記（３）および／または（５）が、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度で行われる、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−４〜１０ユニット／反応で用いる、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］ 前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−７〜０．１ユニット／μｌで用いる、［８］または［９］に記載の方法。
［１２］ ＲＮＡが、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイド由来である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］ ＲＮＡが、ポリＡ配列を有する、［１２］に記載の方法。
［１４］ ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡである、［１２］に記載の方法。
［１５］ ［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法を含む、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法。
［１６］ 微生物を検出する、［１５］に記載の方法。
［１７］ ［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法、および／または［１５］に記載の真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法、および／または［１６］に記載の微生物の検出方法のために用いるキットであって、検出対象のＲＮＡに相補的な配列を含む環状化一本鎖ＤＮＡプローブを含むキット。
［１８］ アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンからなるデオキシヌクレオチド、反応用緩衝液および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素からなる群から選択される１種または２種以上をさらに含む、［１７］に記載のキット。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、ＲＮＡの検出の際に検出対象である目的ＲＮＡに対して逆転写反応を行う必要がなく、直接ＲＮＡをプライマーとして用いてＤＮＡを合成させ、かつ合成された一本鎖ＤＮＡに一本鎖特異的蛍光色素を反応させることにより、極めて簡便に、リアルタイム検出が可能である。
また、未反応の一本鎖ＤＮＡに由来する非特異的なＤＮＡ合成を完全に抑制することが可能となり、高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を実現し、さらに、過去の増幅産物のキャリーオーバーによるクロスコンタミネーションリスクが、他の核酸増幅法に比べ著しく低いため、ＲＮＡを簡便な操作で、実用的な感度を有しながら、また高度な設備を必要せず、安価な装置で、短時間で迅速に検出することが可能となる。
【００３５】
また、ＲＮａｓｅ Ｈ処理の工程を加えることにより、検出対象となるＲＮＡの３’末端の配列に依存せずに、部分的にでも既知であれば、様々な種類のＲＮＡの検出が可能となり、ウイルスや原核生物由来のＲＮＡだけでなく、真核生物由来のＲＮＡおよびそれら生物自身の検出も可能となった。
【００３６】
さらに、本発明によれば、検出感度がよいため、試料中に生物由来の夾雑物を含んでいてもＲＮＡの検出が可能である。また、試料中にＤＮＡを含む場合であっても、ＤＮＡの分解処理を要しない。このため本発明の方法は、従来のＲＮＡ検出法と比較して、迅速かつ簡便に試料中のＲＮＡを検出することができる。これは、夾雑ＤＮＡが、環状化一本鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズしても、その３’末端がプライマーとして利用されることが確率的にほとんどありえないことによる。
【００３７】
このことは、ＲＮＡを特異的に検出するためには試料中の夾雑ＤＮＡを除去するという当該分野の技術常識に反する驚くべき知見であり、これによって、生きている細胞由来のＲＮＡの検出が容易になり、実用に十分な感度を有しながらも、簡便でありながら迅速で、かつ特異的なＲＮＡの検出が可能となった。したがって、医学、薬学、農学、食品学などの研究に止まらず、臨床検査などの医療分野や、食品産業における簡便な生菌検査や食中毒における迅速検査など、簡便さ、省力化、迅速さが求められる様々な基礎および応用分野において、とくに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出を示す概略図である。
【図２】図２は、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡの特異的検出を示す：（Ａ）in vitroで転写されたＧＦＰｍＲＮＡの３’末端配列を示す。ＧＦＰｍＲＮＡは、ＮｏｔＩ消化後のＧＦＰ遺伝子のin vitro転写により調製した。下線およびイタリック文字は、夫々、ＧＦＰ遺伝子の終止コドンおよびＮｏｔＩ制限酵素サイトを示す。配列中の大文字および小文字は、夫々、ＤＮＡ残基およびＲＮＡ残基を示す。（Ｂ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡのリアルタイム検出を示す。ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる蛍光は、夫々、以下の記号で示す：白丸はｍＲＮＡもＤＮＡプローブもなし、黒丸はｍＲＮＡ単独、白四角はＰ１（配列番号１で表されるプローブ、表１）単独、黒四角はＰ１とｍＲＮＡ、白三角はＰ２（配列番号２で表されるプローブ、表１）単独、黒三角はＰ２とｍＲＮＡ。（Ｃ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡの電気泳動による検出を示す。１５時間のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを分子量マーカー（キロベースラダーマーカー）とともにアガロースゲルで泳動した。（Ｄ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにおけるプローブの長さの効果を示す。ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる蛍光は、夫々、以下の記号で示す：白丸はｍＲＮＡもＤＮＡプローブもなし、黒丸はｍＲＮＡ単独、白四角はＰ１単独、黒四角はＰ１とｍＲＮＡ、白三角はＰ３（配列番号３で表されるプローブ、表１）単独、黒三角はＰ３とｍＲＮＡ。
【図３】図３は、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡの感度を示す：（Ａ）プライマーとしてのin vitro転写ＧＦＰとのＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにおけるphi29ＤＮＡポリメラーゼの濃度の効果。酵素濃度は、夫々、以下の記号で示す：白丸は０ユニット、黒丸は１０ユニット、白四角は２０ユニット、黒四角は４０ユニット、白三角は６０ユニット、黒三角は８０ユニット、白菱形は１００ユニット。（Ｂ）段階希釈したin vitro転写ＧＦＰによるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡの滴定分析。用いたＧＦＰｍＲＮＡの量は、０ｐｇ（白丸）、３２ｐｇ（黒丸）、３２０ｐｇ（白四角）、３．２ｎｇ（黒四角）、３２ｎｇ（白三角）。
【図４】図４は、大腸菌から単離された全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの特異的検出を示す：（Ａ）pET-AcGFPを保有する大腸菌におけるＧＦＰの発現。自己誘導ありまたはなしのＧＦＰ発現をブルーライト下で可視化した。（Ｂ）大腸菌において転写されたＧＦＰｍＲＮＡの３’末端配列。ＧＦＰｍＲＮＡはＴ７プロモーターの制御下で転写され、かかる転写は、Ｔ７ターミネーターで終了した。下線は、環状化プローブＰ４（配列番号４で表されるプローブ、表１）に対して相補的な配列を示す。（Ｃ）ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる自己誘導ありまたはなしの大腸菌から単離された全ＲＮＡに存在するＧＦＰｍＲＮＡのリアルタイム検出。ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる蛍光は、以下の記号で示す：（１）白丸はｍＲＮＡもＤＮＡプローブもなし、（２）灰丸は誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（３）黒丸は誘導ありの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（４）白四角はＰ４単独、（５）灰四角はＰ４と誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（６）黒四角はＰ４と誘導ありの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（７）白三角はＰ３単独、（８）灰三角はＰ３と誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ、（９）黒三角はＰ４と誘導ありの大腸菌由来の全ＲＮＡ。（Ｄ）誘導した大腸菌から得られた全ＲＮＡの段階希釈したものによるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡの滴定分析。用いた全ＲＮＡの量は、０ｎｇ（白丸）、２ｎｇ（黒丸）、１０ｎｇ（白四角）、２０ｎｇ（黒四角）、４０ｎｇ（白三角）および８０ｎｇ（黒三角）。
【００３９】
【図５】図５は、ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程をさらに含む、本発明のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出を示す概略図である。（Ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡの下流（３’末端）は環状化ＤＮＡプローブと相補鎖形成しないため、ＤＮＡの合成反応が開始しない。（Ｂ）標的遺伝子のｍＲＮＡと環状化ＤＮＡプローブが相補鎖形成した後、ＲＮａｓｅ Ｈで処理することによりニックが導入され、ＲＣＡ反応が開始する。
【図６】図６は、pET-21dにクローン化したＧＦＰ遺伝子の全配列を示す。ＧＦＰｍＲＮＡは、ＮｏｔＩ消化後のpET-AcGFPおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してin vitro転写により調製した。下線（太字）は、ＧＦＰｍＲＮＡ内部領域にて相補鎖形成するように設計された環状化ＤＮＡプローブ（Ｐ５）の位置を示す。下線のＡＴＧおよびＴＧＡは、夫々開始コドンおよび終止コドンを示す。
【図７】図７は、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるin vitro転写ｍＲＮＡの検出における、ＲＮａｓｅ Ｈ処理の効果を示す。１５時間のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを分子量マーカー（キロベースラダーマーカー）とともにアガロースゲルで泳動した。また、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ反応におけるＲＮａｓｅ Ｈの濃度依存性について検討した結果を示す。
【００４０】
【図８】図８は、ＰＣＲによるＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡ（pET-AcGFP）の検出結果を示す。中段のＤＮａｓｅ（＋）およびＤＮａｓｅ（−）は、ＤＮａｓｅ処理有りおよび無しをそれぞれ示し、下段の（＋）および（−）は発現誘導した菌体および発現誘導していない菌体由来の全ＲＮＡをそれぞれ示す。ＰＣＲ産物は、分子量マーカー（１００ｂｐラダー）とともにアガロースゲルで泳動した。
【図９】図９は、夾雑ＤＮＡが混入した試料中における、本発明のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによる標的ＲＮＡの特異的検出を示す。４時間のＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを、アガロースゲルで泳動した。ＤＮａｓｅ処理の有無は、全ＲＮＡ試料中のＧＦＰｍＲＮＡの検出結果に影響を与えない。Ｎはネガティブコントロールを示し、（＋）および（−）はそれぞれ発現誘導した菌体および発現誘導していない菌体由来の全ＲＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明のＲＮＡの検出方法は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を利用したローリングサークル型ＤＮＡ複製法（Rolling circle amplification；ＲＣＡ）を利用し、応用した技術を用いる。
したがって、先ず、（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する。
検出対象のＲＮＡ（目的ＲＮＡ）に相補的な配列としては、目的ＲＮＡ特異的検出の観点から、目的ＲＮＡの３’末端側の部分の、例えば、２０〜１００塩基、とくに、２５〜４０塩基に相補的な配列が好ましい。ＲＮａｓｅ Ｈ処理によって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド上のＲＮＡ鎖にニックを導入する工程を含む場合、検出対象の目的ＲＮＡに相補的な配列は、ＲＮＡのいずれの位置からも任意に設定することが可能である。
【００４２】
相補鎖を形成するｓｓＤＮＡは、１００塩基以下の場合は核酸合成機によるＤＮＡ合成が好ましいが、１００塩基以上の場合は、ＰＣＲ等により目的ＤＮＡを増幅後、公知の方法、例えば熱変性により一本鎖化した後、環状化反応に使用することもできる。例えば、３０〜４，５００塩基、とくに、５０〜７００塩基に相当する相補的な配列が好ましい。検出感度はプローブの長さが長い程上昇し、短ければ短いほど減少する。また、非特異的な反応をさらに抑えるために、プローブは検出対象のＲＮＡとハイブリダイズ可能な相補配列のみから構成されてもよい。
【００４３】
一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。環状化は、分子内ライゲーションにより環状化してもよいし、また複数の一本鎖ＤＮＡが分子間ライゲーションにより、タンデムに配した状態で環状化してもよい。好ましくは、部分的な二本鎖形成による不完全なエクソヌクレアーゼ処理を防ぐために、環状化反応においてＤＮＡプローブにガイド配列を必要としない種類の一本鎖ＤＮＡリガーゼが用いられる。
高いＳ／Ｎ比を得るためにも、環状化していない未反応の一本鎖ＤＮＡを分解することが好ましく、とくに好ましくは、エクソヌクレアーゼＩ(各社)、T5エクソヌクレアーゼ（Epicentre社）、エクソヌクレアーゼVI（Epicentre社）、RecJエクソヌクレアーゼ（Epicentre社）等の一本鎖オリゴヌクレオチドをモノヌクレオチドまで分解可能なエクソヌクレアーゼによる酵素分解が好ましい。ただし、エクソヌクレアーゼIIIは、作成された一本鎖環状ＤＮＡを基質とするため使用できない。
【００４４】
次に、（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる。かかるハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、環状化一本鎖ＤＮＡプローブと目的ＲＮＡとの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
本発明に用いる試料は、標的となるＲＮＡを含有していれば、特に限定されないが、かかるＲＮＡが精製されていても、精製されていなくても用いることができる。目的ＲＮＡの分解を避けるため、リボヌクレアーゼ活性の低減した試料であってもよい。例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理し、リボヌクレアーゼ活性を抑制させた試料であってもよい。
【００４５】
典型的には、生物由来の夾雑物を含んでいてもよい。生物由来の夾雑物としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡなどの各種のＤＮＡ、タンパク質、脂質、多糖類などが挙げられる。
また、試料中にＤＮＡが含まれている場合、ＤＮａｓｅなどのＤＮＡ分解酵素や、他のＤＮＡ分解処理がされていないものであってもよい。特に、本発明は、ＤＮＡ分解処理を必要としないため、ＤＮＡを含む試料に対してむしろ好適に実施することができる。
【００４６】
任意に、前記（２）において得られた目的ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド上で、ＲＮａｓｅ Ｈによって目的ＲＮＡ鎖のみにニックを形成させる工程（５）を含むことができる。ＲＮａｓｅ Ｈは一般に用いられている中温性のRNase HI（各社）やRNase HII（NEB社）の他に、Hybridase（登録商標）、Thermostable RNase H（Epicentre社）、Tth RNase H（東洋紡社）等の耐熱をＲＮａｓｅ Ｈを用いることでも行うことができる。ＲＮａｓｅ Ｈは反応の初期段階において必要であり、反応中期から後期には必要ないため必要な量はごく少量でもよい。ＤＮＡの伸長反応において使用されるＲＮａｓｅ Ｈの量（濃度）は、好ましくは終濃度約１×１０−４〜１０ユニット／反応、より好ましくは終濃度約１×１０−４〜１ユニット／反応で使用する。
または、本発明の方法において、ＲＮａｓｅ Ｈは、好ましくは１×１０−７〜０．１ユニット／μl、より好ましくは１×１０−７〜１×１０−２ユニット／μlの範囲において好適に用いられる。
【００４７】
さらに、（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしたローリングサークル増幅法（ＲＣＡ；Rolling Circle Amplification）を行う。ＲＣＡは、例えば、phi29 polymerase（各社）、Klenow DNA Polymerase (5’-3’, 3’-5’ exo minus) （各社）、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) (各社)、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社) 、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることでも行うことができる。
【００４８】
本発明の方法によるＤＮＡの伸長反応は、好ましくは、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃〜４２℃、より好ましくは約３０℃で反応する。
【００４９】
そして、（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する。 このような標識としては、例えば、放射線（３２Ｐなど）標識、蛍光標識など、検知可能な種々の標識を用いることができるが、とくに、検知の容易さ、安全性およびＬＥＤ使用等による検出機作成時の簡便さなどの観点から、蛍光標識であることが好ましい。また、一本鎖ＤＮＡが部分的に二本鎖を形成するため、一般的な二本鎖ＤＮＡ検出に利用されるエチジウムブロマイドも、増幅産物の検出に使用できることは、当業者であれば理解できるだろう。
【００５０】
標識は、合成された一本鎖ＤＮＡに結合すれば、検出対象配列に特異的であっても、特異的でなくてもよい。配列に特異的に結合する標識としては、例えば、放射線標識されたＤＮＡ断片やメチル化等の修飾を含むＲＮＡ断片、ペプチド核酸（ＰＮＡ）断片、ＤＮＡ配列特異的に結合する抗体や金属ナノ粒子などが挙げられる。標識の標的となる特異的なＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ配列は、検出対象のＲＮＡの配列に相補的な配列であってもよいが、例えば、環状化一本鎖ＤＮＡプローブに標識の標的となる配列の相補的な配列を組み込んでおくことも可能である。
また配列に特異的でなくても、ＤＮＡに特異的に結合する標識を用いることも可能であり、例えば、SYBR GreenII（Invitrogen社）などの蛍光色素をもちいることができる。
【００５１】
標識の検知方法は、標識の種類に応じて適宜選択し得る。例えば、抗体を標識に用いた場合は、二次抗体やカップリング反応を用いて検知すること、また金属ナノ粒子を用いた場合には、粒子間相互作用の変化に伴う物性変化を計測することによる検知が可能である。さらに、クロマトグラフィーや電気泳動などを用いて検知することも可能である。
本発明のＲＮＡの検出方法において、検出対象となるＲＮＡはとくに限定されず、例えば、各種細胞におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現をリアルタイム検出することや、微生物やウイルス由来のＲＮＡを検出対象とすることも可能である。
【００５２】
本発明の一態様においては、本明細書に記載するＲＮＡ検出方法のための反応試薬および組成物を含む、ＲＮＡ検出のためのキットとすることができる。本発明のキットには、本明細書に記載するＲＮＡ検出反応のための鋳型となる環状化一本鎖ＤＮＡプローブ、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ＲＮａｓｅ Ｈ、ｄＮＴＰ混合物、反応用緩衝液、および検出用蛍光色素などを含むことができる。
【００５３】
本発明の検出するＲＮＡは、とくに限定されることなく、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含むあらゆる種類のＲＮＡを検出することが可能である。検出対象のｍＲＮＡは、ポリＡ配列を有していても、有していなくてもよい。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡを含むノンコーディングＲＮＡであってもよく、さらに、ウイルスなどのゲノムＲＮＡであってもよい。また、検出対象のＲＮＡの形状は、直鎖状または環状のどちらでも可能である。
【００５４】
本発明のＲＮＡ検出の一態様においては、検出対象となるＲＮＡはあらゆる生物種由来の試料から調製または単離されたものでもよい。そのようなＲＮＡを含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物の個体そのもの、あるいはその一部が使用できる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調整したＲＮＡ含有調整物であってもよい。また、前記試料をさらに分画して、その一部を取り出したものから調製したＲＮＡ含有調製物であってもよい。
【００５５】
本発明はまた、生物の検出方法に関する。
本発明において、生物は、原核生物、真核生物、ウイルス、およびウイロイドを含み、それに由来するＲＮＡを検出することによって検出することができる。検出可能な生物種は、ＲＮＡを有するものであればとくに限定されず、ＲＮＡの種類も問わない。例えば、ウイルス、細菌、カビ、酵母、昆虫、植物および動物のような生物を対象とすることができる。
【００５６】
さらに、本発明の一態様は、微生物の検出方法に関する。
本発明において、微生物は、それに由来するＲＮＡを検出することによって検出することができる。微生物は、構成単位が肉眼では観察できない微小な生物をいい、ウイルスや多細胞の生物も含む。検出可能な微生物としては、例えば、ポリＡ配列を持たないｍＲＮＡを産生する細菌、およびゲノムがＲＮＡであるウイルスまたはウイロイドなどが挙げられる。また、原生動物、およびカビや酵母などの真菌を含む真核微生物を対象とすることもできる。
【００５７】
以下に実施例によって本発明を詳述するが、本発明は、各実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
〔材料および方法〕
１．鋳型オリゴヌクレオチドの環状化
表１に示すオリゴヌクレオチドを、１ｍＭ ＡＴＰを含む１×Ｔ４ライゲースバッファー中、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。リン酸化したオリゴヌクレオチドを、１０ユニットのCircLigase（登録商標）ssDNA Ligase（Epicentre社）を用い、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２の１×CircLigaseバッファー中、６５℃、１時間で環状化した。環状化されていないオリゴヌクレオチドは、１０ユニットのエクソヌクレアーゼＩで３７℃１時間消化し、続いて８０℃２０分間処理し、酵素を不活性化した。環状化したオリゴヌクレオチドは、BioSpin（BioRad社）で精製し、濃度をQuant-iT ssDNA BR Assay Kit（Invitrogen社）およびQubit fluorometer（Invitrogen社）を用いて測定した。環状化オリゴヌクレオチドのエクソヌクレアーゼによる消化率と直鎖状のオリゴヌクレオチドのものとの比較をアガロースゲル電気泳動（２．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）により分析し、CircLigaseの反応による環状化が行われたことを確認した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
２．Ｔ７発現ベクターpET-21dへのＧＦＰ遺伝子のクローニング
２μｇのpAcGFP1（Clontech社）からそれぞれ５０ユニットのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（タカラバイオ社）で同時に消化し、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＰ）遺伝子を単離した。ＧＦＰ遺伝子はアガロースゲル電気泳動により精製し、Wizard（登録商標）SV GelおよびPCR Clean-Up Systems（Promega社）を用いて精製した。精製したＤＮＡの濃度は、Quant-iT dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen社）およびQubit fluorometer（Invitrogen社）を用いて測定した。精製したＧＦＰ遺伝子をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断したＴ７発現ベクターpET-21d（Novagen社）に連結し、組み換えプラスミドpET-AcGFPを作製した。大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α株に形質転換した後、プラスミドＤＮＡを選択したコロニーから精製し、制限酵素処理の後、アガロースゲル電気泳動で確認した。精製したpET-AcGFPの濃度をQuant-iT dsDNA HS Assay KitおよびQubit fluorometerを用いて測定した。
【００６１】
３．ＧＦＰｍＲＮＡのin vitroでの転写
ＧＦＰｍＲＮＡのin vitroでの転写は、MEGAscript（登録商標）T7 Kit（Ambion社）を用いて行った。１μｇのpET-AcGFPをＮｏｔＩで消化して得られた直鎖状の鋳型ＤＮＡを転写反応液に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＤＮａｓｅＩ処理により鋳型ＤＮＡを除去した後、転写したｍＲＮＡをMEGAclear（登録商標）Kit（Ambion社）を用いて精製し、濃度を分光分析法により測定した。転写したｍＲＮＡを用時まで−８０℃で保存した。
【００６２】
４．ＧＦＰｍＲＮＡのin vivoでの発現およびＲＮＡの抽出
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen社）をpET-AcGFPで形質転換し、pET-AcGFPの選択のため５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌおよび１．５％寒天）で培養した。大腸菌はＬＢ培地で３０℃８時間培養した。培養物をOvernight Express（登録商標）Autoinduction System（Novagen社）を含むフレッシュなＬＢ培地で１：１０００に希釈し、３０℃で１６時間振とう培養し、ＤＥ３にコードされるＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりＧＦＰｍＲＮＡの転写を誘導した。大腸菌は、３，５００ｒｐｍで４℃２０分間の遠心分離により５０ｍｌのコニカルチューブに回収した。全ＲＮＡをTrizol（登録商標）Max Bacterial RNA Isolation kit（Invitrogen社）を用いて単離した。調製した全ＲＮＡは、混入したゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡなどの夾雑ＤＮＡを除去するためのＤＮａｓｅ処理（例えば、ＤＮａｓｅＩによる処理）を行うことなく試料として供した。当該試料中、微量の夾雑ＤＮＡが含まれていることをアガロースゲル電気泳動（1.5%、Tris-borate-EDTA緩衝液）によって確認した。なお、全ＲＮＡの濃度は分光分析法により測定した。
【００６３】
５．ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ検出
in vitroで転写したＧＦＰｍＲＮＡまたはpET-AcGFPを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から単離した全ＲＮＡを、１０ｐｍｏｌの環状化オリゴヌクレオチド（表１のＰ１（配列番号１）、Ｐ２（配列番号２）、Ｐ３（配列番号３）またはＰ４（配列番号４））とともに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー中に混合し、１００μｌの反応混合物を得た。ｍＲＮＡと環状化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを９５℃５分間のインキュベーションにより促進し、その後３０℃に急冷した。ＲＣＡ反応は、１００μｌのハイブリダイゼーションした混合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、８ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、SYBR GreenII（Invitrogen社）および適切なユニットのRepliPHI phi29ポリメラーゼ（Epicentre社）を含む１００μｌの反応液とを混合することで開始した。phi29ポリメラーゼにより合成されたｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）に結合した際のSYBR GreenIIの蛍光を１５分毎にQubit fluorometerで検出した。３０℃、１５時間のインキュベーションの後の合成ＤＮＡ１５μｌを、２０ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）で３７℃、３０分間消化し、アガロースゲル電気泳動（１．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【００６４】
６．ＲＮａｓｅ Ｈを利用したＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ検出
in vitroで転写したＧＦＰｍＲＮＡを、１０ｐｍｏｌの環状化オリゴヌクレオチド（表１のＰ５、配列番号５）とともに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー中に混合し、１００μＬの反応混合物を得た。ｍＲＮＡと環状化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを９５℃、５分間のインキュベーションにより促進し、その後３０℃に急冷した。ＲＣＡ反応は、１００μＬのハイブリダイゼーションした混合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、８ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、さらに適切なユニット数のＲＮａｓｅ ＨおよびRepliPHI phi29ポリメラーゼ（Epicentre社）を含む１００μＬの反応液を混合することで開始した。３０℃、１５時間のインキュベーションの後の合成ＤＮＡ１５μＬを、２０ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）で３７℃、３０分間消化し、アガロースゲル電気泳動（１．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した
【００６５】
７．ＰＣＲによるＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡの検出
pET-AcGFPを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から、全ＲＮＡの抽出を行った。この際、ＧＦＰの発現を自動誘導により制御し、発現誘導した菌体および発現誘導してない菌体から、Trizol（登録商標）Max Bacterial RNA Isolation kit（Invitrogen社）を用いて、２種類の全ＲＮＡをそれぞれ調整した。また、得られた全ＲＮＡ試料の一部（１０μｇ）について、ＤＮａｓｅ処理を以下の手順で行った。１０μｇの全ＲＮＡ試料を１×ＤＮａｓｅ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２）中で、１０ユニットのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社）で３７℃、３０分間消化後、フェノールクロロホルム抽出によってＤＮａｓｅ画分と核酸画分に分離し、エタノール沈殿によってＲＮＡを沈澱物として回収した。回収したＲＮＡはジエチルピロカーボネート処理された滅菌蒸留水で溶解後、ＲＮＡ濃度をQuant-iT RNA BR Assay Kitで決定した。
【００６６】
ＰＣＲによる夾雑ＤＮＡ（pET-AcGFP）の検出は、以下の手順で行った。各ＲＮＡ試料２０ｎｇ、１×AmpliTaq Goldバッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１μＭの各プライマーの組み合わせ（表２）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．６２５ユニットのAmpliTaq Goldポリメラーゼを含む反応液を調製し、９５℃で１０分間の予備加熱後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で７分間の予備伸長を経たのち、４℃で保持した。各プライマーの組み合わせにおけるポジティブコントロール（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）として、ＲＮＡ試料の代わりに、１ｎｇのpAcGFP-1（Clontech社）を鋳型として用いた。各ＰＣＲ産物２μＬは、アガロースゲル電気泳動（２．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【表２】
【００６７】
８．夾雑ＤＮＡ含有試料におけるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出
上記（７）のＰＣＲによって夾雑ＤＮＡの存在が確認されたＲＮＡ試料を用いて、本発明のＲＰＲＣＡによるＧＦＰｍＲＮＡの検出を以下のように行った。各ＲＮＡ試料２０ｎｇを１０ｐｍｏｌの環状化オリゴヌクレオチド（表１のＰ４（配列番号４））とともに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および１０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー中に混合し、１０μｌの反応混合物を得た。ネガティブコントロール（Ｎ）として、ＲＮＡ試料を含まない反応混合物を用意した。ｍＲＮＡと環状化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを９５℃で５分間のインキュベーションにより促進し、その後３０℃に急冷した。ＲＣＡ反応は、ハイブリダイゼーションした混合物１０μｌを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、８ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１０ユニットのRepliPHI phi29ポリメラーゼ（Epicentre社）を含む１０μｌの反応液とを混合することで開始した。反応は３０℃、４時間のインキュベーションで行い、その後の合成ＤＮＡ２０μｌを、２４ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社）を用いて３７℃、３０分間消化し、消化液のうち１０μｌをアガロースゲル電気泳動（１．０％、Tris-Borate-EDTAバッファー）を用いて連続的に分析し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
【００６８】
〔実験結果のまとめ〕
１．環状化プローブでのＲＣＡを利用したｍＲＮＡのリアルタイム検出のためのストラテジー
図１は、ＲＣＡによるｍＲＮＡ検出の基本的なスキームを示す。かかるスキームは、以下の５つの工程を含む：
（１）目的ｍＲＮＡに相補的な配列を有するｓｓＤＮＡプローブを、CricLigaseなどを用いて、分子内ライゲーションにより環状化する工程、
（２）連続的なＲＣＡ反応における非特異的な副生成のＤＮＡ合成を避けるため、ライゲーションしていないｓｓＤＮＡプローブをエクソヌクレアーゼＩを用いた分解により除去する工程、
（３）環状ｓｓＤＮＡプローブを目的ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズさせる工程、
（４）phi29ＤＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡ（ＲＮＡをプライマーとしたＲＣＡ；ＲＰＲＣＡ）を行う工程、
（５）SYBR GreenIIなどのｓｓＤＮＡに対する蛍光色素によって、ＲＣＡによって合成された結果物であるｓｓＤＮＡの結合による蛍光を得る工程。
これにより、ＲＰＲＣＡを介したｍＲＮＡのリアルタイム検出が達成される。
【００６９】
２．in vitroで転写されたｍＲＮＡのリアルタイム検出
まず最初に、phi29ＤＮＡポリメラーゼが、長い配列を有するｍＲＮＡをＲＣＡ反応のプライマーとして適合させ得るのかについて検討した。プラスミドpET-AcGFPをＮｏｔＩで、Ｔ７ターミネーターとＧＦＰ遺伝子の終止コドンの間の領域を消化し、対応するｍＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼでin vitroでの転写によって調製した（図２Ａ）。環状ｓｓＤＮＡプローブ（Ｐ１またはＰ２）もＲＰＲＣＡ用のin vitro転写ｍＲＮＡと併せて用いた。Ｐ１のＤＮＡ配列は、ＧＦＰの３’末端配列と相補的である（表１）。他方、Ｐ２の配列は、Ｐ１と長さとＧＣ含量とが同じであるが、配列上、ＧＦＰのｍＲＮＡと異なるものである（表１）。
【００７０】
phi29ＤＮＡポリメラーゼによるＲＣＡ反応は、Ｐ１またはＰ２を有しないｍＲＮＡからは開始せず、反応バッファーにおけるＰ２のインキュベーションによっても、ｍＲＮＡが存在してもしなくても、ＲＣＡ反応を起こすことはなかった（図２ＢおよびＣ）。しかしながら、Ｐ１単独ではＲＣＡ反応に影響しないのに拘らず、ｍＲＮＡとＰ１との組み合わせによってＲＣＡ反応が促進された。このことから、ＲＰＲＣＡによって、in vitro転写ｍＲＮＡの３’末端に特異的なｓｓＤＮＡプローブを用いる目的ｍＲＮＡのリアルタイム検出が行い得ること、および、非特異的環状プローブがＲＰＲＣＡに影響しないこと判明した（図２ＢおよびＣ）。これらのことは、phi29ポリメラーゼが、適切な環状ｓｓＤＮＡプローブの存在下、ｍＲＮＡをプライマーとして用いるＲＣＡ反応を特異的に作用し得ることを示唆している。さらに、エクソヌクレアーゼＩで処理した環状ｓｓＤＮＡプローブは、ＲＰＲＣＡにおける長時間の反応期間の後に非特異的な副生成物を産生しなかった。これは、環状プローブの調製におけるエクソヌクレアーゼＩ処理が特異的で信頼できるＲＰＲＣＡによる増幅に寄与していることを示す。
【００７１】
ＲＰＲＣＡにおける環状ｓｓＤＮＡプローブの長さの効果を、ＧＦＰｍＲＮＡの３’末端に相補的なＤＮＡ領域をカバーするｓｓＤＮＡプローブＰ３（表１）を用いて行った。図２Ｄに示すとおり、興味深いことに、同じ長さのＧＦＰｍＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ配列を有するにも拘らず、短いプローブ（Ｐ３）ではなく、長いプローブ（Ｐ１）で十分なＲＣＡ反応が観察された。このことは、プローブの長さが、ｍＲＮＡと環状プローブとの最初のハイブリダイゼーションに関係し、ＲＰＲＣＡの効率に影響を与えることを示している。
【００７２】
まとめると、上記の証拠は、本発明のＲＰＲＣＡが、適切な環状プローブを用いることで、不規則なＤＮＡ増幅副生成物を生成することなく、目的ｍＲＮＡのリアルタイム検出を可能とすることを示している。
【００７３】
３．ＲＰＲＣＡの感度
感度とphi29ＤＮＡポリメラーゼの濃度との間の相関関係を明確にするため、ＲＰＲＣＡ反応における濃度の影響を調べた。ＲＣＡ反応は、phi29ＤＮＡポリメラーゼの濃度を変化させた条件下で、各サンプルについて、３．２ｎｇのin vitro転写ｍＲＮＡをプライマーとして添加した場合を観測した。ＲＣＡ反応は、濃度依存的に促進されることが確認された（図３Ａ）。次いで、図３Ａにおいて試験した最も高い酵素濃度（１反応当たり１００ユニット）でのＲＰＲＣＡによるｍＲＮＡ検出の感度を測定した。その結果、ＲＰＲＣＡは、２時間で３２０ｐｇのin vitro転写ｍＲＮＡを検出することができた。
【００７４】
４．生きた微生物由来の目的ｍＲＮＡの特異的検出
ＲＰＲＣＡによって、生きた微生物のｍＲＮＡを目的として検出できるかについて検討した。誘導したＧＦＰ発現が容易に観察できるため（図４Ａ）、pET-AcGFPで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をＲＰＲＣＡのモデルとして用いた。生きた細胞において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＧＦＰｍＲＮＡの一次構造は、７塩基の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＧＦＰｍＲＮＡ、およびそれに続く３’ＵＴＲの４８塩基の隣接残基から構成される（図４Ｂ）。この実験においては、ｓｓＤＮＡプローブＰ４を合成した。前記Ｐ４は、図４Ｂに下線で示した３’末端に対応するＤＮＡ配列が含まれるように合成されている（表１）。栄養増殖している大腸菌において全ＲＮＡの大部分はｒＲＮＡおよびｔＲＮＡが占めているので、両ＲＮＡともＲＰＲＣＡに影響を及ぼし得る。どの程度の量のｒＲＮＡおよびｔＲＮＡがＲＰＲＣＡに影響したかを調べるため、誘導した大腸菌および誘導していない大腸菌の両方から抽出した後、全ＲＮＡをＲＰＲＣＡに用いた。誘導ありまたは誘導なしの大腸菌由来の全ＲＮＡ２００ｎｇをＰ２またはＰ４とともにインキュベートした場合、誘導した大腸菌由来の全ＲＮＡと環状プローブＰ４とを組み合わせたものだけ、十分なＲＰＲＣＡが観察された（図４Ｃ）。全ＲＮＡ単独または環状プローブ単独ではＲＣＡ反応は起きなかった。さらに、段階希釈した全ＲＮＡを用いた２時間のＲＰＲＣＡによって、ＧＦＰｍＲＮＡが１０ｎｇの全ＲＮＡから検出可能であることが明らかになった（図４Ｄ）。ＲＮＡの全量（４００μｇ）が１．５×１０１０細胞の密度の大腸菌から抽出されたことを考慮すると、１０ｎｇの全ＲＮＡは、およそ４×１０５細胞に相当する。これらの結果は、細菌性全ＲＮＡと適切なｓｓＤＮＡプローブとの組合せを用いたＲＰＲＣＡは、in vitro転写ｍＲＮＡの場合（図２）と同様に、ＧＦＰｍＲＮＡを特異的に検出できるばかりでなく、発現したＧＦＰｍＲＮＡと全ＲＮＡの大部分を構成するｒＲＮＡやｔＲＮＡのような他のＲＮＡ種とを明確に区別することができることが示された。
【００７５】
また、試料中に夾雑ＤＮＡが含まれていても（試料中のＤＮＡの分解処理をしていなくても）、良好にＲＮＡの検出ができたことを示すものであった。すなわち、試料中のＤＮＡの分解処理を行わなくても、目的ＲＮＡが発現していない試料（図４の「−」（ネガティブコントロール））においては夾雑ＤＮＡによる不規則なＤＮＡ増幅生成物を生成することがなかったことからも明らかなとおり、本方法においては高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を実現することができた。
【００７６】
５．ＲＰＲＣＡのＲＮａｓｅ Ｈを利用したＲＮＡ検出のためのストラテジー
図５は、ＲＮａｓｅ Ｈ処理工程を含むＲＣＡによるＲＮＡ検出の基本的なスキームを示す。かかるスキームは、以下の6つの工程を含む：
（１）目的ｍＲＮＡに相補的な配列を有するｓｓＤＮＡプローブを、CricLigaseなどを用いて、分子内ライゲーションにより環状化する工程、
（２）連続的なＲＣＡ反応における非特異的な副生成のＤＮＡ合成を避けるため、ライゲーションしていないｓｓＤＮＡプローブをエクソヌクレアーゼＩによる分解・除去する工程、
（３）環状ｓｓＤＮＡプローブに目的ＲＮＡをハイブリダイズさせる工程、
（４）環状ｓｓＤＮＡプローブにハイブリダイズした領域の目的ＲＮＡに、ＲＮａｓｅ Ｈにより、ニックサイトを形成させる工程、
（５）phi29ＤＮＡポリメラーゼによって、ニッキングサイトのＲＮＡの3‘末端からＲＰＲＣＡを行う工程、
（６）ＲＣＡによって合成された結果物であるｓｓＤＮＡを検出する工程。
【００７７】
６．ＲＮＡａｓｅ Ｈを利用したＲＰＲＣＡによるin vitroで転写されたｍＲＮＡの検出
ＧＦＰｍＲＮＡの内部領域と相補性のあるＤＮＡプローブを利用した場合、ＲＰＲＣＡ反応が起こりえるかどうか検討した。プラスミドpET-AcGFPをＮｏｔＩで、Ｔ７ターミネーターとＧＦＰ遺伝子の終止コドンの間の領域を消化し、対応するｍＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるin vitro転写によって調製した（図６）。転写したＧＦＰｍＲＮＡは環状ｓｓＤＮＡプローブ（Ｐ５）と併せて用いた。プローブＰ１のＤＮＡ配列は、ＧＦＰの内部領域と相補的である（図６）。
【００７８】
環状化一本鎖プローブが存在しない場合、phi29ＤＮＡポリメラーゼによるＲＣＡ反応は、促進されず一切のＤＮＡ産物が確認できなかった(図７)。プローブＰ５を利用した場合、ＲＮａｓｅ Ｈを添加しない条件のＲＰＲＣＡ反応では非特許文献８の報告とは異なり、一切のＤＮＡ産物は確認できなかった(図７)。このことから、本願のＲＮａｓｅ Ｈ処理工程を含むＲＰＲＣＡ法では、目的ＲＮＡの内部配列をＤＮＡプローブとハイブリダイズさせても、目的ＲＮＡを検出できることを示している。さらに、特許文献４とは異なり、ゲル中で単一のバンドとして検出される本願発明は、非特異的な副産物が生じていないことを確認し、その検出精度の高さが認められる。
また、添加するＲＮａｓｅ Ｈの濃度依存性についても検討した結果、ＲＮａｓｅ Ｈの添加によってＲＰＲＣＡ反応が促進されることが示された。
【００７９】
上記の証拠は、本発明のＲＮＡ検出方法は、ＲＰＲＣＡの工程において、適切な濃度のＲＮａｓｅ Ｈで処理することによって、目的ＲＮＡの３’末端配列の情報に依存せずに、非特異的なＤＮＡ増幅副生成物を生成しないで特異的な検出が可能であることを示している。
【００８０】
７．ＰＣＲによるＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡの検出
ＧＦＰ遺伝子に特異的なプライマー３セット（表２）を使用して、ＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡをＰＣＲにより検出した。その際、ＧＦＰの発現を自動誘導により制御し、発現誘導した菌体から調整した全ＲＮＡ（＋）と、発現誘導していない菌体から調整した全ＲＮＡ（−）の２種類を得た。さらに、その一部をそれぞれＤＮａｓｅ Ｉを用いてＤＮＡ分解処理をし、発現誘導有りまたは無しの全ＲＮＡであって、ＤＮａｓｅ処理有りまたは無しの合計４種類の全ＲＮＡを得た。そして、各全ＲＮＡを用いて夾雑ＤＮＡの検出を試みた。
【００８１】
ＤＮａｓｅ処理を行っていないＲＮＡ試料からは、いずれのプライマーセットにおいても、ＧＦＰの誘導・非誘導にかかわらず目的ＤＮＡ増幅産物が、各プライマーセットのポジティブコントロール（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）と同様に確認された（図８）。一方で、ＤＮａｓｅ処理を行ったＲＮＡ試料からは、誘導・非誘導で共に目的ＤＮＡ増幅産物が明らかに減少した（図８）。以上のことから、ＤＮａｓｅ処理によって夾雑ＤＮＡの大部分を除去することが可能であることが示された。しかし、ＤＮａｓｅ処理を行っても、わずかにバンドが検出されたことから、一般的なＤＮａｓｅ処理だけでは、ＲＮＡ試料から完全に夾雑ＤＮＡを取り除くことが難しいことも同時に示された。この夾雑ＤＮＡがＲＴ−ＰＣＲにおいても同様に、ノイズとして検出される可能性が高いことは、当業者であれば理解できる。
【００８２】
８．夾雑ＤＮＡ含有試料におけるＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｄ ＲＣＡによるＲＮＡの検出
上記（７）のＤＮａｓｅ処理有りまたは処理無しのＲＮＡ試料を用いて、ＲＰＲＣＡによるＧＦＰｍＲＮＡの検出を試みた。その結果、ＤＮａｓｅ処理の有無、すなわち夾雑ＤＮＡの量に拘わらず、発現誘導した菌体から調整したＲＮＡ試料から、ＲＰＲＣＡにより増幅したＤＮＡが十分な量で確認された（図９）。また、ＤＮａｓｅ処理の有無に拘わらず、発現誘導していない菌体から調整したＲＮＡ試料では、ＲＰＲＣＡによるＤＮＡの増幅は認められなかった（図９）。以上のことから、本発明のＲＰＲＣＡにおいては、ＲＮＡ試料から夾雑ＤＮＡを除去することなく、また、ＲＮＡ試料中の夾雑ＤＮＡ量の影響を受けることなく、目的ＲＮＡのみを高いＳ／Ｎ比で検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を利用したＲＮＡプライムドローリングサークル型ＤＮＡ複製法（RNA-Primed Rolling circle amplification；RPRCA）を応用し、ＲＮＡの種類、３’末端配列情報等に影響を受けずに、簡便な操作で、逆転写反応を経由せずに、生物由来の夾雑物を含む試料中から直接ＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕやリアルタイムで検出可能な方法に関するものであり、研究、医療・臨床検査、食品産業など幅広い応用範囲において貢献するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来の夾雑物を含む試料中のＲＮＡの検出方法であって、
（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する工程、
（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程、
（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしてローリングサークル増幅法（ＲＣＡ；Rolling Circle Amplification）により一本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
生物由来の夾雑物が、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、核酸試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のＤＮＡが、分解処理されていない、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記（１）において、環状化していない未反応の一本鎖ＤＮＡを分解することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、検出対象のＲＮＡに相補的な配列のみからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、３０塩基長〜４５００塩基長である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（２）の後に、
（５）ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記（３）および／または（５）が、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−４〜１０ユニット／反応で用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−７〜０．１ユニット／μｌで用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡが、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイド由来である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡが、ポリＡ配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法を含む、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法。
【請求項１６】
微生物を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法、および／または請求項１５に記載の真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法、および／または請求項１６に記載の微生物の検出方法のために用いるキットであって、検出対象のＲＮＡに相補的な配列を含む環状化一本鎖ＤＮＡプローブを含むキット。
【請求項１８】
アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンからなるデオキシヌクレオチド、反応用緩衝液および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素からなる群から選択される１種または２種以上をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１】
生物由来の夾雑物を含む試料中のＲＮＡの検出方法であって、
（１）検出対象のＲＮＡに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを環状化し、環状化一本鎖ＤＮＡプローブを作製する工程、
（２）前記（１）において得られた環状化一本鎖ＤＮＡプローブと、試料中のＲＮＡとをハイブリダイズさせる工程、
（３）前記（２）において得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡをプライマーとしてローリングサークル増幅法（ＲＣＡ；Rolling Circle Amplification）により一本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（４）前記（３）において合成された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を添加し、当該標識を検知することによって検出対象のＲＮＡを検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
生物由来の夾雑物が、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、核酸試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のＤＮＡが、分解処理されていない、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記（１）において、環状化していない未反応の一本鎖ＤＮＡを分解することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、検出対象のＲＮＡに相補的な配列のみからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
環状化一本鎖ＤＮＡプローブが、３０塩基長〜４５００塩基長である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（２）の後に、
（５）ＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみにニックを形成する工程
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記（３）および／または（５）が、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−４〜１０ユニット／反応で用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記（５）において、ＲＮａｓｅ Ｈを終濃度１×１０−７〜０．１ユニット／μｌで用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡが、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイド由来である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡが、ポリＡ配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法を含む、真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法。
【請求項１６】
微生物を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＲＮＡの検出方法、および／または請求項１５に記載の真核生物、原核生物、ウイルスまたはウイロイドの検出方法、および／または請求項１６に記載の微生物の検出方法のために用いるキットであって、検出対象のＲＮＡに相補的な配列を含む環状化一本鎖ＤＮＡプローブを含むキット。
【請求項１８】
アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンからなるデオキシヌクレオチド、反応用緩衝液および鎖置換型ＤＮＡ合成酵素からなる群から選択される１種または２種以上をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−８０８７１（Ｐ２０１２−８０８７１Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７１８４２（Ｐ２０１０−２７１８４２）
【出願日】平成２２年１２月６日（２０１０．１２．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ４０１，Ｉｓｓｕｅ ２，２４２−２４９
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月６日（２０１０．１２．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ４０１，Ｉｓｓｕｅ ２，２４２−２４９
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]