ＲＮＡ干渉によりラブドウイルスに対して抵抗性を得るためのウイルス遺伝子の同定
【課題】実用化に結びつく、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物の作出方法および抵抗性型品種を提供する。
【解決手段】ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科のウイルス病に抵抗性を付与するための組成物、ならびに、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、Ａ）ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を提供する工程；Ｂ）該発現抑制剤を該植物の細胞に導入する工程；Ｃ）該発現抑制剤が導入された植物の細胞を選択する工程；およびＤ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；を包含する方法。
【解決手段】ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科のウイルス病に抵抗性を付与するための組成物、ならびに、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、Ａ）ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を提供する工程；Ｂ）該発現抑制剤を該植物の細胞に導入する工程；Ｃ）該発現抑制剤が導入された植物の細胞を選択する工程；およびＤ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物を作出する方法に関する。より具体的には、ラブドウイルス科のウイルスのヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）およびＰ６タンパク質等の遺伝子をコードする核酸分子を用いた、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、植物ウイルス病の防除には抵抗性品種の利用が最も有効な方法のひとつであるが、抵抗性遺伝子源には限りがあり、また、特定の遺伝子を長期間使用するとそれを侵すウイルス系統の出現によって導入遺伝子の有効性がやがて失われ、結果的にその抵抗性が崩壊してしまうというケースがしばしば起こる。
【０００３】
ラブドウイルス科のウイルスには、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）などの重要ウイルスが含まれ、特に東南アジアの米の生産に多大な被害を及ぼし、脅威となっている。
【０００４】
このような状況の突破口として、植物自身が生来有するＲＮＡ干渉能に関する知見の集積とその応用を可能にした遺伝子工学技術を駆使して、しばしば大発生して食料安定供給を脅かすラブドウイルス科のウイルスに対して強力な抵抗性を発揮するイネ品種の開発が望まれている。
【０００５】
特許文献１は、イネ萎縮ウイルス（ＲＤＶ）を標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いたウイルス抵抗性を開示する。
【０００６】
特許文献２は、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）を標的としたＲＮＡｉを用いたウイルス抵抗性を開示する。
【０００７】
非特許文献１は、植物でヌクレオキャプシドタンパク質、移行タンパク質を標的としたＲＮＡｉを用いたウイルス抵抗性を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２０２３７号パンフレット
【特許文献２】特開２０１１−６７１１５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shimizu T,Nakazono-Nagaoka E, Uehara-Ichiki T, Sasaya T, Omura T. (2011) Targeting specific genes for RNA interference is crucial to the development of strong resistance to Rice stripe virus. Plant Biotechnol J. 2011 May;9(4):503-12.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意研究した結果、ラブドウイルス科に属するウイルス（例えば、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ））のゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する抵抗性を付与するための組成物が、予想外に、完全な抵抗性を付与することを見出したことにより実用化に結びつく、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物の作出方法および抵抗性型品種を得ることに成功した。
【００１１】
一般に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では遺伝子の発現を完全に抑制することができないという共通認識が存在する（ＲＮＡｉ実験なるほどＱ ＆ Ａ，羊土社，２００６年、ｐｐ．４）。
【００１２】
ＲＴＹＶは、他のイネ病変の原因となるウイルスであるイネ萎縮病ウイルス（ＲＤＶ）やイネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）とは違い、１本のマイナス鎖ＲＮＡのゲノムの中に７つの遺伝子（ＮＰ，Ｐ，Ｐ３，Ｍ，Ｇ，Ｐ６，Ｌ）が存在し、その部分からＣＡＰおよびｐｏｌｙ（Ａ）を持つｍＲＮＡが転写される。また、そのゲノムの両末端付近にｌｅａｄｅｒ配列、ｔｒａｉｌｅｒ配列と呼ばれる領域があり、その部分からはＣＡＰおよびｐｏｌｙ（Ａ）を持たないＲＮＡが転写されているとされる。
【００１３】
そこで、イネ黄葉ウイルスがコードする全遺伝子について個々の遺伝子を、従来ラブドウイルスに対する抵抗性付与に関する研究で通常行われている２０数塩基で比較する方法ではなく、５００塩基程度の長さで各遺伝子についてＲＮＡ干渉で発現抑制を試みたところ、ＮＰ、Ｐ、Ｐ３およびＰ６等を発現抑制させるとイネに抵抗性が付与されることが判明した。
【００１４】
また本発明は、以下の項目を提供する。
（１）ラブドウイルス科に属するウイルスのヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）またはＰ６タンパク質をコードする核酸配列の、ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
（２）前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、項目１に記載に記載の使用。
（３）前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、項目１または２に記載の使用。
（４）前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、項目１〜３のいずれかに記載の使用。
（５）前記抵抗性はイネに対して付与される、項目１〜４のいずれかに記載の使用。
（６）ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための組成物。
（７）前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、項目６に記載に記載の組成物。
（８）前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、項目６または７に記載に記載の組成物。
（９）前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、項目６〜８のいずれかに記載に記載の組成物。
（１０）前記抵抗性はイネに対して付与される、項目６〜９のいずれかに記載に記載の組成物。
（１１）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションを行うものか、前記遺伝子産物に対する抗体である、項目６〜１０のいずれかに記載の組成物。
（１２）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであって、２０塩基以上の長さを有する、項目１１に記載の組成物。
（１２Ａ）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであって、３０塩基以上の長さを有する、項目１１に記載の組成物。
（１３）前記ＲＮＡｉの長さは約５００塩基である、項目１２に記載の組成物。
（１４）前記ＲＮＡｉは、配列番号１６、１７、１８、１９および２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変配列を有する、項目１３に記載の組成物。
（１５）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであり
（ａ）配列番号４６に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４５に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目６〜１４のいずれかに記載の組成物。
（１６）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための、ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤。
（１７）項目１６に記載の発現抑制剤を含む、ベクター。
（１８）項目１７に記載のベクターを含む、植物細胞。
（１９）項目１７に記載のベクターを含む、植物体。
（２０）項目１７に記載のベクターを含む、種子。
（２１）ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を示す、項目１９に記載の植物体。
（２２）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を生産する方法であって、
Ａ）項目１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
（２３）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得る植物のイネ属植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）項目１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
（２４）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を再生産する方法であって、
Ａ）項目１７に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
（２５）項目１６に記載の発現抑制剤を含む植物体または種子、あるいはその加工品。
【００１５】
上記のように、本発明によって、ラブドウイルス科のウイルスの、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）またはＰ６タンパク質の遺伝子をコードする分節ゲノムを標的とした発現抑制剤を含む組成物が提供され、好ましくは、完全抵抗性を持つ集団（ラブドウイルス科のウイルス感染植物体の個体数総計に対して１００％が抵抗性を示す）、少なくとも、部分的な抵抗性を持つ集団（ラブドウイルス科のウイルス感染率が野生型の植物と比較して低下する）が提供され、また、安定した抵抗性が付与されたラブドウイルス科のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、よりウイルス感染抑制あるいは無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、または安定した抵抗性が付与されたラブドウイルス科のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）の標的遺伝子領域を含むゲノム構造（上パネル）および各遺伝子を発現抑制するためのＲＮＡｉ誘起ベクターの構築模式図（下パネル）を示す。
【図２】図２は、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）の各遺伝子標的ＲＮＡｉイネにおける導入遺伝子由来ｓｉＲＮＡの検出を示す図である。ＲＮＡｉが誘導されると２４、２２および２１塩基のＲＮＡ断片が蓄積する。Ｃはコントロール（日本晴）を示す。
【図３】図３は、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）の各遺伝子標的ＲＮＡｉイネにおけるウイルス病抵抗性の付与を示す図である。ＲＴＹＶ接種後約６０日のイネ葉を用いた感染を検定し、日本晴れを１００としたときの感染率を計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２０】
本明細書において「イネ黄葉ウイルス」とは、ＲＴＹＶともいわれ、ラブドウイルス科に属するウイルスのメンバーである。このウイルス粒子の形状は、幅が１００ｎｍで長さが１８０〜２１０ｎｍの弾丸状粒子である。また、このウイルスは１本のマイナス鎖ＲＮＡをゲノムとし、（そのゲノム配列は配列番号２５に示す。）、このマイナス鎖に７種のタンパク質（ＮＰ、Ｐ、Ｐ３、Ｍ、Ｇ、Ｐ６およびＬ）をコードしている。ＲＴＹＶ粒子は、ゲノムＲＮＡ、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｐ６およびＬから成るとされている。このウイルスは、イネ科の植物に分布している。また、本発明において例示され実施例１において使用したＲＴＹＶ（日本株）とは別に、中国で分離された同種のウイルス株はＲｉｃｅｙｅｌｌｏｗ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ＲＹＳＶ）と命名されており(ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＮＣ＿００３７４６)（以下中国株（ＲＹＳＶ）とする）、同様にＲＴＹＶには多くの系統および変種系統が存在することが予想される。従って、本明細書において使用される場合、用語「ＲＴＹＶ」は、当然のことながら、この用語がＲＴＹＶの種々の系統および変種系統も意図していることは、当業者であれば容易に明らかである。ＲＴＹＶ日本株全長の標的配列と中国株（ＲＹＳＶ）全長の塩基配列を比較したところ、１．５％の違いが認められた。この程度の置換があるとしても、最低限発現抑制が起こる塩基長、すなわち、２４ヌクレオチド以上実質的に一致した部分塩基配列が他の系統もしくは変異株間に存在していれば、ある１種の系統に由来する分節ゲノムを含む本発明の発現抑制剤は、別の１種の系統においても、その効果を発揮し得る。他方、ＲＴＹＶのどの株由来の配列を用いたとしても、当業者は本明細書の記載に基づいて他の株に対しても効果を有するｓｉＲＮＡなどの発現抑制剤を製造することができることが理解される。
【００２１】
本明細書においてウイルスの「系統」および「株」は、同じウイルス種内でのバリエーションをいうために使用され得るが、これらの用語は、交換可能に使用され得ることが理解される。
【００２２】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「ＮＰ」とは、（１）配列番号１に示される核酸配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＮＰをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＮＰによってコードされるタンパク質は、ゲノムＲＮＡと結合しヌクレオキャプシド構造をつくる（ヌクレオタンパク質）。また、ＮＰによってコードされるタンパク質は、ＲＮＡ合成において、複製酵素と相互作用し、その役割を果たす。
【００２３】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｐ」とは、（１）配列番号３に示される核酸配列または配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＰをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｐによってコードされるタンパク質は、構造タンパク質（ホスホタンパク質）として機能する。また、Ｐによってコードされるタンパク質は、ＲＮＡ合成において、複製酵素と相互作用し、その役割を果たす。
【００２４】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｐ３」とは、（１）配列番号５に示される核酸配列または配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＰ３をコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｐ３によってコードされるタンパク質は、移行タンパク質として機能し、ＲＴＹＶの感染細胞に隣接する細胞への移行において、その役割を果たす。
【００２５】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｍ」とは、（１）配列番号７に示される核酸配列または配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＭをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｍによってコードされるタンパク質は、構造タンパク質として機能し、粒子の形を形成する過程において、その役割を果たす。
【００２６】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｇ」とは、（１）配列番号９に示される核酸配列または配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＧをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｇによってコードされるタンパク質は、構造タンパク質として機能する。また、Ｇによってコードされるタンパク質は、粒子形成、およびウイルスの宿主細胞への侵入において、その役割を果たす。
【００２７】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｐ６」とは、（１）配列番号１１に示される核酸配列または配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＰ６をコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｐ６によってコードされるタンパク質は、構造タンパク質として機能するが、その役割は不明である。
【００２８】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｌ」とは、（１）配列番号１３に示される核酸配列または配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＬをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｌによってコードされるタンパク質は、ＲＴＹＶの粒子に付随されるタンパク質である。また、Ｌによってコードされるタンパク質は、ＲＮＡ複製酵素として機能し、ＲＴＹＶのＲＮＡ合成において、その主たる役割を果たす。
【００２９】
本明細書において、ウイルス（例えば、ＲＴＹＶ等のラブドウイルス科のウイルス）等に対する「抵抗性」または「耐性」とは、ウイルス等が侵入しようとする宿主生体（本明細書では、植物）が、ウイルス等の侵入に対して抵抗力を持つことをいう。本明細書では、抵抗力とは、宿主生体の通常の生存・増殖が維持される程度の性質のことをいう。その評価手法は、本明細書において以下に規定され、本明細書では特に断らない限り、この評価手法によって抵抗性かどうかが判断される。
【００３０】
本明細書において、病害（例えば、ラブドウイルス科のウイルス病としてイネ黄葉病（イネトランジトリーイエローイング病）等）に対する「耐性」または「抵抗性」とは、その病害に対して宿主生体（本明細書では、植物）が抵抗力を持つことをいう。従って、ウイルスの侵入の如何にかかわらず、植物体の生長、目的物質の収量において、変化が見られない限り、病害に対する耐性はあるといえる。病害についてもその評価手法は、本明細書において以下に規定され、本明細書では特に断らない限り、この評価手法によって抵抗性かどうかが判断される。
【００３１】
本明細書において、病害に対する「抵抗性」は、病害を引き起こす原因因子（例えば、ＲＴＹＶ）に感染する機会が与えられた場合において、その原因因子の感染または増殖が認められず、その原因因子の感染していない植物体（非感染植物体）と比較して、植物体の生長（例えば、分けつ、伸長）、目的物質の収量において、非感染生物体と何ら変化が見られないことを検定および観察することによって判定することができる。さらに「感受性」は、目的の植物体に上記病原体を感染させたときに、野生型の感染植物体との違いが認められないことを検定および観察することによって判定することができる。
【００３２】
病害に対する「完全抵抗性」とは、目的の植物集団に対して上記病原体に感染する機会が与えられた場合において、その全てが「抵抗性」であった場合をいう。
【００３３】
また、「部分的な抵抗性」とは、目的の植物集団に対して上記病原体に感染する機会が与えられた場合において、野生型植物集団に対して同様に上記病原体に感染する機会が与えられた場合と比較して、「感受性」が出現する割合が低くなる事をいう。本明細書では、感染に失敗した個体（すなわち、ツマグロヨコバイが吸汁したにも拘わらず、発病に至らなかったもの）を除くことによって病原体に対する抵抗性を正しく評価するために、野生型植物集団において「感受性」が出現する率を１００とした時の目的の植物集団における「感受性」が出現する率を計算し、この率が１００以下のＸとなる場合、目的の植物集団はＸ％の「部分的な抵抗性」を持つという。
【００３４】
本明細書において、「安定した抵抗性」とは、複数の世代において保持される抵抗性をいう。複数の世代において保持されるとは、好ましくは３世代、より好ましくは５世代、さらにより好ましくは７世代、最も好ましくは永久に保持されることを意味する。
【００３５】
本明細書では、特に言及するときは、抵抗性は、ウイルスに対する性質をいい、耐性は病害に対する性質をいうが、交換可能に使用され得ることが理解される。
【００３６】
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。通常、本明細書では、ＲＴＹＶが感染する植物を指す。好ましい植物は、イネ科に属する単子葉植物であり、本発明にとって最も好ましい植物は、イネである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００３７】
本明細書において「野生型」植物とは、形質転換などの人為的手段による遺伝的改変がなされていない天然に存在する植物をいう。
【００３８】
本明細書において生物の「器官」とは、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。例えば、茎、根、葉、花、種子などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００３９】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【００４０】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res．19：5081(1991)；Ohtsukaら、J．Biol．Chem．260：2605-2608(1985)；Rossoliniら、Mol．Cell．Probes 8：91-98(1994)）。
【００４１】
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子などを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。
【００４２】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常ゲノム上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現されたタンパク質、ポリペプチド等のほか、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００４３】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
【００４５】
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能、特にＲＮＡｉの機能を果たす限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
【００４６】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００４７】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００４８】
本明細書において、「対応する」ヌクレオチドとは、ある核酸分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となる核酸分子またはポリヌクレオチドにおける所定のヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチドをいい、ＲＮＡｉにあっては、ＲＮＡ干渉作用において、同様の寄与をするヌクレオチドをいう。アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
【００４９】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＲＴＹＶのＮＰ、Ｐ、Ｐ３、Ｐ６等）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ウイルスの遺伝子に対応する遺伝子は、他のウイルス（ラブドウイルス科の他のウイルスなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、あるウイルスにおける対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてそのウイルス（例えば、ラブドウイルス科の他のウイルス）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５０】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００５１】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、これらのタンパク質自体の機能のほか、例えば、植物におけるラブドウイルス科のウイルスの増殖への関与、ラブドウイルス科のウイルスに対する抵抗性または感受性への関与、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性、これらの具体的な機能について直接的または間接的に関連する機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００５２】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【００５３】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼし合うこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「調節する（modulate）」または「改変する（modify）」は、特定の活性、因子またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
【００５６】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列の全部または一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５００の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。１つの好ましい実施形態では、本発明の発現抑制剤において使用されるアンチセンス核酸は、その長さの下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記アンチセンス核酸は、その長さの上限においては、たとえば、約１０５０ヌクレオチドまで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くアンチセンス現象に基づく遺伝子発現抑制効果を誘起させることができると考えられるからである。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５７】
本明細書において「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ（RNA interference）」とは、交換可能に使用され、二本鎖ＲＮＡ（double stranded RNA：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。遺伝子発現抑制手法としての植物におけるＲＮＡｉについての総説は、例えば、三木ら、「植物におけるＲＮＡｉの分子機構とその応用」（実験医学 Vol．22 No．4(3月号)2004）（本明細書中で、参考として援用される）などが挙げられる。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において用語「ＲＮＡｉ」はまた、文脈に応じて、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。ＲＮＡｉが因子を示すときは、例えば、２０塩基以上であり、通常２５塩基以上であり、好ましくは、３０塩基以上でありうる。
【００５８】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００５９】
本明細書において「トリミング配列」とは、センス配列およびアンチセンス配列に相当する配列とそれら二つの配列の間に位置する配列（スペーサー、ヘアピン、トリミング等と呼ばれている）ものをいう。下記のような構造：
センス配列−トリミング配列−アンチセンス配列；または
アンチセンス配列−トリミング配列−センス配列
を有する核酸分子が導入され得たベクターで細胞が形質転換されると、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成し、それら二つの鎖の間に位置する部分はループまたはヘアピン部分として保持された、その一部にループ又はヘアピン構造の一本鎖部分を含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が形成される。このトリミング配列の長さは、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成するときに、このトリミング配列の構成する一本鎖部分がループまたはヘアピン構造をとる限りにおいてどのような長さのものであってもよい。上記ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に移動し、その導入された細胞内でＤｉｃｅｒによって切断されてｓｉＲＮＡとなり、ＲＮＡ干渉を引き起こす。トリミング配列の例としては、例えば、配列番号４５に示すものが挙げられる。
【００６０】
１つの実施形態では、ＲＮＡｉを引き起こす因子において使用されるセンス配列またはアンチセンス配列の長さは、その下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記センス配列またはアンチセンス配列の長さは、その上限においては、たとえば、約１０５０まで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くRNAiを誘起させることができると考えられるからである。
【００６１】
本明細書において第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して、第２の物質または因子以外の物質または因子（特に、第２の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００６２】
本明細書において「発現抑制剤」とは、広義には、遺伝子の細胞内における発現、すなわち、ゲノムの複製、転写、翻訳を抑制することができるあらゆる因子をいう。
【００６３】
本明細書において「因子」（agent）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などであって、代表的には分子量約１０，０００以下のもの（例えば、約１，０００以下のもの）を指すがそれらに限定されない）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６４】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、ラブドウイルス科のウイルスの増殖に関与する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
【００６５】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００６６】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味し、その対象物を天然物から区別するために用いられる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「外来」の核酸分子とは、ある対象核酸分子内に含まれるその対象核酸分子以外の起源の核酸分子などをいう。この外来の核酸分子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。
【００７２】
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来の核酸分子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、目的（例えば、ＲＮＡ干渉）を果たす核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【００７３】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」または「抑制」とは、交換可能に使用され、ある因子（すなわち、発現抑制剤）を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。
【００７４】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００７５】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物等の生物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「ジーンサイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制現象を意味する。「ジーンサイレンシング」と呼ばれる現象としては、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、ＰＥＶ（position effect variegation）、トウモロコシのパラミューテションなどが挙げられる。植物におけるトランスジーン（導入遺伝子）の不活性化の一つとして、相同性依存型ジーンサイレンシング（Homology-dependent gene silencing；HDGS）があり、そのＨＤＧＳ様の現象は、植物内在性遺伝子、植物以外のトランスジェニックにおいても見られており、生物のなんらかの遺伝子制御機構であると考えられる。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「相同性依存型ジーンサイレンシング」または「ＨＤＧＳ」は、複数の遺伝子が、その塩基配列の相同性またはその配列の類似性に依存して起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。特に、特定の導入された遺伝子（導入遺伝子）を過剰発現させると、その導入遺伝子とともに本来ゲノムに存在していた（すなわち、内在的な）同一または相同な遺伝子が抑制される現象をいう。「ＨＤＧＳ」としては、例えば、「ＰＴＧＳ」が挙げられる。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「転写後型ジーンサイレンシング」または「ＰＴＧＳ」は、転写後に起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。ＲＮＡｉもＰＴＧＳの一種である。
【００７９】
本明細書中において使用される場合、「コサプレッション」、「コーサプレッション」および「共抑制」は、同意義語として使用され得る。「コサプレッション」とは、導入遺伝子を含む植物において、その導入遺伝子と相同な配列を有する内在性の遺伝子（その植物において、その植物のゲノム上の存在していた、その導入遺伝子と同一であるかまたは相同である遺伝子）の両方の発現が抑制される現象をいう。この現象は、ペチュニアの花の色素合成にかかる遺伝子の発現機構を研究している過程に発見された（Napoli，C．，Lemieux，C．＆Joergensen，R．：Plant Cell 2，291-299(1990)；ならびにvan der Krol，R et al：Plant Cell 2，291-299(1990)）。その後、植物のみでなくアカパンカビ、ショウジョウバエ、線虫、哺乳動物細胞などにおいてもそれらの同様の現象が発見されている。このような「コサプレッション」を、育種目的に利用した例は、SCIENCE Vol．309 29 July 2005 p．741-745などに記載されている。
【００８０】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（RNA-induced-silencing-complex）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【００８１】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【００８２】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【００８３】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態をとっていてもよい。
【００８４】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；short hairpin RNA）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００８５】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【００８６】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００８７】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の方法および組成物において有用である。
【００８８】
本明細書において、ＲＴＹＶについて、配列番号２（ＮＰ）、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）等、好ましくは配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１（ＮＰコード領域）、配列番号３（Ｐコード領域）、配列番号５（Ｐ３コード領域）または配列番号１１（Ｐ６コード領域）等、好ましくは、配列番号３（Ｐコード領域）、配列番号５（Ｐ３コード領域）または配列番号１１（Ｐ６コード領域）に示される核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。
【００８９】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Tijssen(Tijssen(1993)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第２章 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier，New York）に見出される。
【００９０】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【００９１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning 2nd ed．，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1〜38、DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University Press(1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９２】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Sambrook et al．，Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor，N，Y．1989)；およびAnderson et al．、Nucleic Acid Hybridization：a Practical approach、IV、IRL Press Limited(Oxford，England)．Limited，Oxford，Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Anderson et al．，Nucleic Acid Hybridization：a Practical Approach、第４章、IRL Press Limited（Oxford，England）を参照のこと。
【００９３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝81.5＋16.6（log[Na+]）＋0.41（％G+C）−600/N-0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００９４】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００９５】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００９６】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Suggsら、Developmental Biology Using Purified Genes、683頁、BrownおよびFox(編)(1981)を参照のこと)。
【００９７】
配列番号２（ＮＰ）、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）等、好ましくは、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下で、配列番号１（ＮＰ）、配列番号３（Ｐ）、配列番号５（Ｐ３）または配列番号１１（Ｐ６）等、好ましくは、配列番号３（Ｐ）、配列番号５（Ｐ３）または配列番号１１（Ｐ６）に示す核酸配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００９８】
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
【００９９】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【０１００】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
【０１０１】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、挿入改変体、欠失改変体、短縮（truncated）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加、挿入および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加、挿入および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。「オルソログ（ortholog）」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous gene）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。オルソログは、通常別のウイルス株において、もとのウイルス株と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１０２】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Mark Zoller and Michael Smith，Methods in Enzymology，100，468-500(1983)）が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【０１０３】
本明細書において使用される核酸分子は、目的とする遺伝子の発現を抑制する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１０４】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１０５】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加、挿入および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、挿入されること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加、挿入および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１０６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J．et al．(1989)．Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harborおよびその3rd Ed．(2001)；Ausubel，F．M．(1987)．Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience；Ausubel，F．M．(1989)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience;Innis，M．A．(1990)．PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press；Ausubel，F．M．(1992)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates;Ausubel，F．M．(1995)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates;Innis，M．A．et al．(1995)．PCR Strategies，Academic Press;Ausubel，F．M．(1999)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，and annual updates;Sninsky，J．J．et al．(1999)．PCR Applications：Protocols for Functional Genomics，Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１０７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait，M．J．(1985)．Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRLPress；Gait，M．J．(1990)．Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein，F．(1991)．Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approac，IRL Press;Adams，R．L．et al．(1992)．The Biochemistry of the Nucleic Acids，Chapman&Hall;Shabarova，Z．et al．(1994)．Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，Weinheim;Blackburn，G．M．et al．(1996)．Nucleic Acids in Chemistry and Biology，Oxford University Press;Hermanson，G．T．(I996)．Bioconjugate Techniques，Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１０８】
（遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２（ＮＰ）、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）等、好ましくは、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【０１０９】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
【０１１１】
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１１２】
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pcDNA3(+)、pBluescript-SK(+/-)、pGEM-T、pEF-BOS、pEGFP、pHAT、pUC18、pFT-DESTTM42GATEWAY、pENTRTM/D-TOPO（Invitrogen）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
【０１１３】
本明細書において用いられ得る植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pANDA（奈良先端大学院大学島本教授より分譲、Miki D, Itoh R,and Shimamoto K (2005) RNA Silencing of Single and Multiple Members in a GeneFamily of Rice. Plant Physiol. 138: 1903-1913）、pBE7133-GUS-Hygro（pE7ΩIGUS-Hygro）、pPZP2H-lacを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１１４】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、CaMV35Sターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１１６】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１１７】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。部位特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え植物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。部位特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。
【０１１８】
本明細書において、「部位特異的発現プロモーター」とは、器官（例えば、根、茎、葉、果実、種子ならびにそれらの組合せなど）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、ならびにそれらの組合せなど）、発達段階（例えば、発芽期、生長期、開花期、登期ならびにそれらの組み合わせなど）などにおいて、特異的なプロモーターである。原理的には、個体において特異的に発現している遺伝子を単離し、そのプロモーター、発現制御シス領域を単離することによって得られる。
【０１１９】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
【０１２１】
本明細書において「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【０１２２】
本明細書において「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Langridge，1985，Plant Cell Rep．4，355)、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Guilley，1982，Cell 30，763）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Odell，1985，Nature 313，810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang，1991，Plant Cell 3，1155）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Cornejo 1993，Plant Mol．Biol．23，567）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Mitsuhara，1996，Plant Cell Physiol．37，49）などを用いることができる。
【０１２３】
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Fluhr，1986，Pro．Natl．Acad．Sci．USA 83，2358）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Aguan，1993，Mol．Gen．Genet．240，1）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Van Breusegem，1994，Planta 193，57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Nundy，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，1406）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert，1989，EMBO J．8，651）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【０１２４】
本明細書において「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。これらの薬剤耐性遺伝子は、本発明においてスクリーニング技術などにおいて用いられる。
【０１２５】
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
【０１２７】
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Nagelらの方法（Microbiol．Lett．，67，325(1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【０１２８】
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Fujimura，1995，Plant Tissue CultureLett．2，74）、トウモロコシ（Shillito，1989，Bio/Technol．7，581、Gorden-Kamm，1990，Plant Cell 2，603）、ジャガイモ（Visser，1989，Theor．Appl．Genet．78，594）、タバコ（Nagata，1971，Planta 99，12）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
【０１３０】
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。
【０１３１】
本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。
【０１３２】
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【０１３３】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
【０１３４】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。例えば、エンハンサーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が用いられるが、これらに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１３５】
本発明において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
【０１３６】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１３７】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F．A．ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY；Sambrook Jら(1987)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed．およびその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１３８】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１３９】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１４０】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Escherichia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属などに属する原核生物細胞、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1が例示される。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Methods．Enzymol．，194，182(1990)］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，1929(1978)］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
【０１４２】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet．2002 Dec;32 Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１４３】
（抵抗性の評価）
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、病徴の観察および病原体感染の可否の検定で確認し得る。例えば、ラブドウイルス科のウイルス病の場合は、特定のイネ品種にツマグロヨコバイなどのＲＴＹＶを媒介する昆虫を温室中で放飼してウイルス感染させた場合、病斑形成やイネの背丈などを、原品種または野生型と組換え体とを比較すること、およびＥＬＩＳＡ法によりウイルス感染の可否を検定することが可能であるが、これに限定されることはない。
【０１４４】
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１４５】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
【０１４６】
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
【０１４７】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【０１４８】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０１４９】
ＲＴＹＶがコードする各タンパク質の感染細胞内での挙動について、ほとんど解析がなされていないことから、個々に標的遺伝子を設定して発現抑制剤を作製し、ＲＴＹＶ抵抗性イネの作出を試みた。また、本発明では、コンストラクトの対象として従来の２０数塩基のものではなく５００塩基程度の長い配列を目的として上記抵抗性イネの作出を試みた。
【０１５０】
一局面において、本発明は、ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科のウイルス病に抵抗性を付与するための組成物を提供する。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号１（ＮＰ）、配列番号３（Ｐ）、配列番号５（Ｐ３）または配列番号１１（Ｐ６）からなる群より選択され得る。
【０１５２】
一実施形態において、好ましいアンチセンス配列は、配列番号１６(Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ）、配列番号１７（Trigger ＮＰ）、配列番号１８（Trigger Ｐ）、配列番号１９（Trigger Ｐ３）、配列番号２０（Trigger Ｍ）、配列番号２２（Trigger Ｐ６）または配列番号２４（Trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌ）に相補的な配列であり得る。より好ましいアンチセンス配列は、配列番号１６(Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ）、配列番号１７（Trigger ＮＰ）、配列番号１８（Trigger Ｐ）、配列番号１９（Trigger Ｐ３）または配列番号２２（Trigger Ｐ６）に相補的な配列であり得る。さらにより好ましいアンチセンス配列は、配列番号１８（Trigger Ｐ）、配列番号１９（Trigger Ｐ３）または配列番号２２（Trigger Ｐ６）に相補的な配列であり得る。
【０１５３】
一実施形態において、トリミング配列は、５〜３２個またはそれ以上のヌクレオチド配列を有し得る。好ましいトリミング配列としては、ＧＵＳ配列、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ(pyruvate orthophosphate dikinase)イントロン、dof affecting germination(DAG1)イントロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本発明のプロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、好ましいプロモーターとしては、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、ストレス誘導性プロモーター（例えば、感染誘導性プロモーター）が好ましい。恒常性プロモーターとしては、ユビキチンプロモーター（例えば、配列番号４６のユビキチンプロモーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ４５２７３６由来））、アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。感染誘導性プロモーターとしては、ＷＲＫＹ転写因子プロモーター、ＰＲ１プロモーター、ＰＢＺ１遺伝子プロモーター、ペルオキシダーゼプロモーター、マイトジェン活性化プロモーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。
【０１５５】
本発明は、一局面において、ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセットを提供する。
【０１５６】
別の好ましい実施形態において、使用されるアンチセンス配列は、例えば、Invitrogenのウェブサイトにおいて利用可能なrnai_designer（http：//www．invitrogen．co．jp/rnai/rnai_designer．shtml/）、Promegaのウェブサイトにおいて利用可能なsiRNADesigner（http：//www．promega．com．siRNADesigner/）、AmbionのウェブサイトのsiRNA Target Finder、DharmaconのsiDESIGN Center、GenScriptのsiRNA Target Finder、およびGene specific siRNA selector（これらの方法に限定されない）を使用することによって容易に設計可能である。
【０１５７】
本発明は、一局面において、上記発現カセットを含むベクターを提供する。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
【０１５８】
本発明のベクターは、目的の細胞に導入された否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子を含み得る。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【０１５９】
本発明は、一局面において、上記ベクターを含む植物細胞、植物体、種子を提供する。
【０１６０】
このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）などのラブドウイルス科のウイルスに罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
【０１６１】
一実施形態において、本発明の植物体は、ラブドウイルス科のウイルスに対する完全抵抗性を示す。
【０１６２】
（抵抗性・耐性植物の作出）
本発明は、一局面において、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法；ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法；およびラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得る植物を再生産する方法を提供する。
【０１６３】
上記に示される方法は、本発明の発現抑制剤を、イネ科植物の細胞に導入する工程を包含する。一般的に、本発明のベクターは、種々の慣用的技術を用いて所望の植物宿主（例えば、イネ科植物の細胞）のゲノムに導入することができる。好ましい導入法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられるが、これらに限定されない。上記方法はさらに、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する。このような選択は、抵抗性を有するトランスジェニック植物を選択することができる限り、どのような方法を用いてもよく、細胞レベルの選択でもよいし、植物体レベルの選択でもよい。
【０１６４】
本発明のベクターが導入されたか否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子）を含むベクターの場合、上記の導入工程後に得られた細胞は、その薬剤耐性遺伝子が細胞中で発現したか否かを検出するための薬剤（例えば、ハイグロマイシン）を含む選択培地中で増殖させることによって選択される。当然のことながら、このような選択培地中に含まれる薬剤は、上記ベクター中に含まれる薬剤耐性遺伝子に依存して変更され得る。
【０１６５】
上記のようにして選択された細胞を、当該分野で一般的に使用される再生培地中で培養することにより、例えば、根およびシュートが確認できるまで再分化させる。このような再生培地としては、以下の実施例に記載されるような再分化培地（ＭＳＲＥ）などのような当該分野で公知の培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
上記のようにして再分化させることによって得られた根およびシュートは、鉢上げされ、試験に適した時期（例えば、９葉期）まで、または成熟期まで生長させられることによって、トランスジェニック植物（Ｔ０）が作出される。
【０１６７】
さらに、このようにして得られたトランスジェニック植物中に本発明のベクターが含まれているか否かについては、上記植物から細胞を採取して全細胞ＤＮＡを得、ゲノムに組み込まれた薬剤耐性遺伝子をサザンブロットなどで、得られたトランスジェニック植物中に実際に本発明のベクターが含まれているか否かを確認できる。また、低分子ＲＮＡを得、Trigger領域をプローブにノザンブロットを行うことで、トランスジェニック植物中で実際にＲＮＡｉを誘起できていることも確認できる。さらには、得られたトランスジェニック植物に、実際にＲＴＹＶを感染させて、感染トランスジェニック植物とコントロール野生型植物とを比較することによって、本発明のベクターが含まれているか否かを検出することもできる。
【０１６８】
さらに、本発明のトランスジェニック植物は、Ｔ０植物から得られた種子、さらに後代のＴ１植物、Ｔ２植物、Ｔ３植物などから得ることもできる。
【０１６９】
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明の発現抑制剤の、ラブドウイルス科のウイルスに対する抵抗性、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性を付与するための、またはその耐性もしくは抵抗性を付与する農薬を製造するための使用を提供する。ここで使用される核酸分子および因子は、本明細書において上記される任意の核酸分子であり得ることが理解される。
【０１７０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１７１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１７２】
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
【０１７３】
１．イネの生育
実験系統として、イネ（Oryza sativa cv．Nipponbare）を使用した。イネ植物を温室（２０℃〜３２℃）において栽培し、９葉期まで生育させてから、以下の実験に使用した。イネへのＲＴＹＶ接種試験においては、各形質転換体系統およびコントロールの野生型イネのいずれも、２〜３葉期まで生育させてから使用した。なぜなら、ＲＴＹＶの病徴は新しく展開した葉において観察される、すなわち、イネの生育期において、２〜３葉期がＲＴＹＶに対する感受性が最も高いと考えられるからである。
【０１７４】
２．培地および試薬
（０）Ｎ６−ビタミン １．２Ｌ
グリシン ２ｇ
ニコチン酸 ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ １ｇ
ミオイノシトール １００ｇ
蒸留水で１．２Ｌにする。
【０１７５】
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
【０１７６】
（１）ＭＳ−ビタミン １．２Ｌ
ニコチン酸 ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ ０．１ｇ
ミオイノシトール １００ｇ
蒸留水で１．２Ｌにする。
【０１７７】
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
【０１７８】
（２）カルス誘導培地（Ｎ６Ｄ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
カザミノ酸 ０．３ｇ
Chu(N6) Basal Salt Mixture Powder （Sigma社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１７９】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
【０１８０】
（３）共存培養培地（Ｎ６ＣＯ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
グルコース １０ｇ
カザミノ酸 ０．３ｇ
Chu(N6) Basal Salt Mixture Powder (Sigma社から購入)
３．９８１ｇ
Ｎ６−ビタミン １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．２に調節し、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８１】
ゲルライト ４ｇを加えてオートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、アセトシリンゴン（５０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加える。
【０１８２】
（４）選抜培地（Ｎ６ＳＥ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
カザミノ酸 ０．３ｇ
Chu(N6) Basal Salt Mixture Powder（Sigma社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８３】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ） ０．５ｍｌを添加する。
【０１８４】
（５）再分化培地（ＭＳＲＥ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
Ｄ−ソルビトール ３０ｇ
カザミノ酸 ２ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入） ４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン １．２ｍｌ
カイネチン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ） ０．２ｍｌ
α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ） ０．２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８５】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ） １ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ） ０．５ｍｌを添加する。
【０１８６】
（６）ホルモンフリー（ＨＦ）培地 １Ｌ
スクロース ３０ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入）４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン １．２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８７】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、ハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ） ０．５ｍｌを添加する。
【０１８８】
実施例１：ＲＴＹＶのｌｅａｄｅｒ配列、ｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｐ３遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｇ遺伝子、Ｐ６遺伝子、Ｌ遺伝子およびＬ遺伝子＋ｔｒａｉｌｅｒ配列を用いたＲＮＡｉ誘起ベクターの構築
（１）ＲＴＹＶのｌｅａｄｅｒ配列、ｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｐ３遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｇ遺伝子、Ｐ６遺伝子、Ｌ遺伝子およびＬ遺伝子＋ｔｒａｉｌｅｒ配列を、特異的なプライマーセットを用いて増幅する：
ＲＴＹＶ感染イネの葉から、定法に従って総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を使用して、添付の説明書に従って行った。総ＲＮＡ １μｇを用いて、SuperScriptIII（Invitrogen）のマニュアルに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセット：
trigger ｌｅａｄｅｒについてプライマーセット１：
フォワードプライマー：CACCACACCACCAGATACATTC（配列番号２６）；と
リバースプライマー：TTTTTAAATCCTATCTCTTATTGACAT（配列番号２７）、
trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰについてプライマーセット２：
フォワードプライマー：CACCACACCACCAGATACATTC（配列番号２６）；と
リバースプライマー：GCATGCTATCTTTACGATGCTTC（配列番号２８）、
Trigger ＮＰについてプライマーセット３：
フォワードプライマー：CACCAACACCACATTAATCATG（配列番号２９）；と
リバースプライマー：ACATATAAACGCAATGGCGCG（配列番号３０）、
Trigger Ｐについてプライマーセット４：
フォワードプライマー：CACCAACACCTCATCACAAC（配列番号３１）；と
リバースプライマー：CTATGTTGGTACATTCGGCC（配列番号３２）、
Trigger Ｐ３についてプライマーセット５：
フォワードプライマー：CACCAACTCCACATAGAAGG（配列番号３３）；と
リバースプライマー：TGTCTTGTATAAACCCGCCC（配列番号３４）、
trigger Ｍについてプライマーセット６：
フォワードプライマー：CACCAACACCACATAATAAACA（配列番号３５）；と
リバースプライマー：TATACTGTGGTAATGATCTCTC（配列番号３６）、
trigger Ｇについてプライマーセット７：
フォワードプライマー：CACCAACAACATCATACGTATC（配列番号３７）；と
リバースプライマー： GACTGTGCTGTTTATGGCCC（配列番号３８）
trigger Ｐ６についてプライマーセット８：
フォワードプライマー：CACCAATACCTCAACATTCTCAA（配列番号３９）；と
リバースプライマー： TTATTTAATATACCAAGTCTTATGC（配列番号４０）
trigger Ｌについてプライマーセット９：
フォワードプライマー：CACCAACATATCCATTTTTCATTTC（配列番号４１）；と
リバースプライマー： AAAGAAGTGATATGCACCTGCG（配列番号４２）
trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌについてプライマーセット１０：
フォワードプライマー：CACCCTGGACTGTGACGAGA（配列番号４３）；と
リバースプライマー： ACACCACCATATCCAAAGCCG（配列番号４４）
を用いてそれぞれＰＣＲを行う。Trigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、およびTrigger Ｌ（配列番号２３）については、ＰＣＲを行った結果、核酸配列の各増幅産物を得た。Trigger Ｍ（配列番号２０）、およびTrigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌ（配列番号２４）についても、同様に増幅産物を得ることができる。
【０１８９】
（２）制限酵素またはGateway（Invitrogen）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する：
上記（１）で得た各増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/trigger ｌｅａｄｅｒ、pENTR/trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ、pENTR/trigger ＮＰ、pENTR/trigger Ｐ、pENTR/trigger Ｐ３、pENTR/trigger Ｇ、pENTR/trigger Ｐ６、およびpENTR/trigger Ｌを得た。pENTR/trigger Ｍ、およびpENTR/trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌについても、同様の操作でこれらを得ることができる。
【０１９０】
このクローニングベクターを、キットに付属のE．coli株に形質転換し、同様に、製造業者の説明書に従って、適切な条件下で、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。単一のコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む１〜２ｍｌのＬＢ培地中に接種し、定法に従って、このクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させた。定法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認した。
【０１９１】
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする：
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化し、pANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ、pANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ、pANDA/trigger ＮＰ、pANDA/trigger Ｐ、pANDA/trigger Ｐ３、pANDA/trigger Ｇ、pANDA/trigger Ｐ６、およびpANDA/trigger Ｌを得た。pANDA/trigger Ｍ、およびpANDA/trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌについても、同様の操作で得ることができる。簡潔にいうと、２μｌ ＬＲ反応緩衝液（５×）、１００〜３００ｎｇの上記エントリーベクター、３００ｎｇ pANDAベクター、ＴＥを添加して総容積８μｌにした。２μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen cat．11791-019）を加えて攪拌し、２５℃で一晩インキュベートした。その後、プロテイナーゼＫ溶液を１μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。得られたベクターをE．coli ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシンを含む培地中で増殖させた。
【０１９２】
実施例２：ＲＴＹＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネの作出
（１）実施例１において作製した上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する：
上記各ベクターを、エレクトロポレーション法によってGenePulser（BioRad）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入した。アグロバクテリウムの系統は、EHA101（Hood，1986，J．Bacteriol．168，1291）を用いた。実施例１で構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置はGENE PULSER（登録商標）II（BIO-RAD）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。増殖させた形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＰ培地に播種して、一晩インキュベートし、この培養液と等量のグリセロールを入れてボルテックスミキサーで十分に混合し、−８０℃で使用時までストック溶液として保存した。
【０１９３】
（２）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、アルカリＳＤＳ法（Molecular Cloning 第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
【０１９４】
（３）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＲＴＹＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出する；
ＲＴＹＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出するために、カルス化したイネを作製した。簡潔には、イネの完熟種子を小型籾すり機にかけ、籾を除去した種子１００〜１５０粒を５０ｍｌの使い捨て遠心管に入れた。７０％ エタノールを遠心管に入れて、数秒間種子を滅菌し、滅菌水で種子をすすいだ。滅菌水を吸引した後、４０ｍｌの２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を上記遠心管に入れ、振盪機で２０分間、１５０ｒｐｍで振盪して滅菌した。滅菌水を除去して、蒸留水で３回洗浄した。ピンセットで種子をカルス誘導培地（Ｎ６Ｄ培地）に２５種子／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールした。６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において１８〜２１日間培養することによってカルス誘導した。カルス誘導の間、培地を、７〜１０日毎に新しいＮ６Ｄ培地と交換した。
【０１９５】
誘導して３週間後の種子の胚乳とシュート部分をメスで切り取るか、あるいはピンセットでもぎ取り、胚盤由来カルスのみを新しいカルス誘導培地Ｎ６Ｄ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールして、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において３日間、カルスを前培養した。カルスの前培養を始めるのと並行して、上記（１）において得られたアグロバクテリウムのストック溶液から滅菌した爪楊枝で菌体を採取し、ＡＢ培地に塗布した。塗布した菌体を滅菌した白金耳で培地全体に拡げ、３日間２８℃において遮光して前培養した。
【０１９６】
ＡＢ培地で増殖したアグロバクテリウムを滅菌した小さい薬さじで掻き取り、１０ｍｌの水に１０ｍｇ／ｍｌのアセトシリンゴンを５μｌ入れ、この溶液にアグロバクテリウムをＯＤ６００＝０．０１になるように懸濁した。懸濁液を滅菌シャーレに入れた。１シャーレ分の前培養したカルスを、一方の端をメッシュで覆った筒状のガラス管の中に入れ、ときどき軽く振って、１．５〜２分間メッシュ付きのガラス管ごと、上記懸濁液中に浸漬した。浸漬後、メッシュ付きのガラス管を滅菌ペーパータオルの上に置いて余分な水分を除去した。Ｎ６ＣＯ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレをテープでシールして、２３℃において遮光して３日間培養した。
【０１９７】
培養後、全てのカルスをＮ６ＳＥ培地に、９カルス／シャーレで移植し、３０〜３３℃において２４時間明期の条件下で、１４日間培養した。その間、カルスを、１回だけ新しいシャーレに移した。選択されたカルスをＲＥ培地に移し、３０〜３３℃において再分化してくるまで培養した。その間、７〜１０日間毎に、新しい培地を入れたシャーレにカルスを移した。再分化したイネをＨＦ培地に移し、２〜３週間培養した後、鉢上げした。
【０１９８】
（４）形質転換体当代（Ｔ０）株における導入遺伝子の確認
上記（３）において作出した形質転換体当代（Ｔ０）株において目的の遺伝子が導入されているか否かを確認するために、Ｔ０株からＣＴＡＢ法により調製したＤＮＡを鋳型に形質転換ベクター内のＧｕｓ−ｌｉｎｋｅｒ特異的プライマーおよび内在コントロールとしてアクチン特異的プライマーの４種混合プライマーでＰＣＲを行い、アガロース電気泳動にて２本のＤＮＡバンドが増幅されることにより行った。Ｔ０株における導入遺伝子の転写産物の断片化によるｓｉＲＮＡの検出は、低分子ＲＮＡを抽出（基本的に、Hamilton，1999，Science．286，950に従った）した後、Trigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、Trigger Ｌ（配列番号２３）の核酸配列をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションすることにより行った。その結果を図２に示す。示されるように、目的の遺伝子がＴ０株において導入され、かつ導入された配列が切断されたことが明らかになった。
【０１９９】
実施例３：形質転換体Ｔ１におけるＲＴＹＶ抵抗性検定
（１）実施例１で作製したpANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ、pANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ、pANDA/trigger ＮＰ、pANDA/trigger Ｐ、pANDA/trigger Ｐ３、pANDA/trigger Ｇ、pANDA/trigger Ｐ６、pANDA/trigger Ｌで形質転換したＴ１植物へのＲＴＹＶ感染；
得られたＴ０イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＴ１種子を回収した。イネへのＲＴＹＶの接種は、２〜３葉期まで生育させた各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１５株に対して、約２０％がＲＴＹＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行った。
【０２００】
（２）感染後のTrigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、Trigger Ｌ（配列番号２３）の核酸配列を導入したＴ１植物の抵抗性検定；
（１）で接種したTrigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、Trigger Ｌ（配列番号２３）の核酸配列のいずれかで形質転換したＴ１植物から（１）のＲＴＹＶ接種検定約６０日後においてイネ葉を採取し、ＥＬＩＳＡ法によってＲＴＹＶ感染の有無を検定し、スコアリングを行った。なお、ＣＴＡＢ法によりＴ１植物から調製したＤＮＡを鋳型にして、植物形質転換ベクター内のＧＵＳ配列をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、導入遺伝子が後代Ｔ１に受け継がれなかった個体はスコアリングから除外した。接種試験のスコアリングの結果から、日本晴を１００とした時の感染率を計算し、まとめた結果を以下の図３および表１に示す。
【０２０１】
表１：ＲＴＹＶ各遺伝子標的形質転換イネ自殖第１代（Ｔ１）のＲＴＹＶ接種検定
【表１】
【０２０２】
Ｐを標的とした形質転換イネは、全てＲＴＹＶ抵抗性であった（すなわち、「完全抵抗性」集団を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全２２株のうち４株が感染に失敗したが、残りの１８株は全てＲＴＹＶに感染した。
【０２０３】
Ｐ３を標的とした形質転換イネは、全てＲＴＹＶ抵抗性であった（すなわち、「完全抵抗性」集団を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１４株のうち１２株が感染に失敗したが、残りの２株は全てＲＴＹＶに感染した。
【０２０４】
Ｐ６を標的とした形質転換イネは、全てＲＴＹＶ抵抗性であった（すなわち、「完全抵抗性」集団を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１７株のうち５株が感染に失敗したが、残りの１２株は全てＲＴＹＶに感染した。
【０２０５】
ＮＰを標的とした形質転換イネは、全１３株のうち８株が抵抗性、５株が感受性であり、全体の３８％が感染した。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１４株のうち２株が感染に失敗したが、残りの１２株は全てＲＴＹＶに感染し、感染率は８６％であった。すなわち、野生型イネの感染率を１００とすると、ＮＰを標的とした形質転換イネは４５％の「部分的な抵抗性」を持つことが分かった。
【０２０６】
ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰを標的とした形質転換イネは、全１２株のうち１１株が抵抗性、１株が感受性であり、全体の８％が感染した。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１４株のうち１２株が感染に失敗したが、残りの２株は全てＲＴＹＶに感染し、感染率は１４％であった。すなわち、野生型イネの感染率を１００とすると、ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰを標的とした形質転換イネは５８％の「部分的な抵抗性」を持つことが分かった。
【０２０７】
ｌｅａｄｅｒ、Ｇ、Ｌを標的とした形質転換イネは、コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）に比べ、感染率の低下は見られなかった。
【０２０８】
Ｐを標的とした形質転換イネは、完全抵抗性を示した。Ｐは、複製酵素と相互作用し、ＲＮＡ合成において、役割を果たすと考えられているため、Ｐの発現を抑制すると、ウイルスの複製が阻害され、結果的にウイルスの活動を静止することができ、完全型抵抗性の表現型を示したと考えられる。以上の事から、Ｐが植物に対する感染および植物中での増殖において特に重要な働きを担っている可能性が示された。
【０２０９】
Ｐ３を標的とした形質転換イネは、完全抵抗性を示した。Ｐ３は、ウイルスの細胞間移行タンパク質であることから、おそらくＰ３の発現を抑制すると、感染細胞から隣り合った未感染細胞へのウイルスの拡がりが効果的に阻害され、結果的にウイルスの活動を静止することができ、完全型抵抗性の表現型を示したと考えられる。以上の事から、Ｐ３は植物に対する感染および植物中での増殖において特に重要な働きを担っている可能性が示された。
【０２１０】
Ｐ６を標的とした形質転換イネは、完全抵抗性を示した。現段階でＰ６は、ウイルス粒子に含まれること以外は機能未知であるが、本結果から、Ｐ６は、おそらく植物での感染および（あるいは）増殖に必須であり、特に重要なタンパク質であることが予想できる。また、１本のマイナス鎖ＲＮＡをゲノムとする他のウイルスにおいて、ゲノム上同様な場所に位置する遺伝子がコードするタンパク質は生体膜と直接相互作用することが知られており、ＲＴＹＶにおいてもＰ６は感染・増殖の過程で核膜もしくは細胞膜と相互作用する重要な働きを持っている可能性が考えられる。
【０２１１】
ＮＰを標的とした形質転換イネおよびｌｅａｄｅｒ＋ＮＰを標的とした形質転換イネは、約５０％の部分的な抵抗性を示した。ＮＰは、ウイルスのヌクレオタンパク質であることから、おそらくＮＰの発現を抑制すると、ヌクレオキャプシド構造の形成が阻害され、結果的にウイルスの活動を抑制することができ、部分的な抵抗性の表現型を示したと考えられる。
【０２１２】
上記の結果から、本発明の形質転換イネ、すなわちＰ、Ｐ３およびＰ６の発現を抑制させたイネは、ＲＴＹＶに対する完全抵抗性を、ＮＰの発現を抑制させたイネは、ＲＴＹＶに対する部分的な抵抗性を示すことが明らかになった。
【０２１３】
（３）作出されたＲＴＹＶ抵抗性イネの後代Ｔ３植物における接種検定；
後代植物においてもＲＴＹＶ抵抗性が受け継がれているか否かを確認するために、Ｔ１植物からＴ２種子を取得して、Ｔ２植物を生育させる。このＴ２植物からＴ３種子を得、９葉期まで生育させて、試験用Ｔ３植物を得る。得られたＴ３植物において、上記（２）と同様に、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約２０％がＲＴＹＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり５頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。上記（２）と同様に接種検定を行うと、Ｔ３植物においても、ＲＴＹＶ抵抗性ないし発病遅延型抵抗性が受け継がれていることが確認できる。
【０２１４】
上記の結果から、本発明の形質転換イネが、ＲＴＹＶに対する抵抗性を示すことが明らかになる。
【０２１５】
実施例４：形質転換体Ｔ１における他のＲＴＹＶ株感染とＲＮＡｉ誘導の確認
（１）Ｔ１植物への他のＲＴＹＶ株感染；
実施例１において得られたベクターを使用して、実施例２に記載されるようにＲＴＹＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約２０％がＲＴＹＶ各株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、日本株に基づく発現抑制剤がＲＴＹＶの日本株感染に対する抵抗性のみならず、日本株以外のＲＴＹＶ株の感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２１６】
実施例５：中国株（ＲＹＳＶ）のタンパク質（Ｐ、Ｐ３、Ｐ６、ＮＰ等）の発現抑制イネの作出およびＲＮＡｉ誘導の確認
（中国株（ＲＹＳＶ）株）
ＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）感染イネの葉から、実施例１に記載されるように、配列情報としては、アクセッション番号NC_003746を用いて、定法に従って総ＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、目的の領域（Trigger P(中国株（ＲＹＳＶ）)、Trigger P3(中国株（ＲＹＳＶ）)あるいはTrigger P6(中国株（ＲＹＳＶ）)）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、目的の領域の増幅産物を得る。
【０２１７】
上記実施例１（２）に記載されるように、上記で得た増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/Trigger P(中国株（ＲＹＳＶ）)、pENTR/Trigger P3(中国株（ＲＹＳＶ）)あるいはpENTR/Trigger P6(中国株（ＲＹＳＶ）)を得る。
【０２１８】
このクローニングベクターを、同様に上記実施例１（２）に記載されるようにE．coli株に形質転換し、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択する。定法に従って、単一のコロニーを単離してこのクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させる。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認する。
【０２１９】
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、上記実施例１に記載されるように、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。
【０２２０】
実施例２に記載されるようにＲＴＹＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＴＹＶの日本株および中国株（ＲＹＳＶ）の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約２０％がＲＴＹＶ各株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、中国株（ＲＹＳＶ）株の情報に基づいて設計したTrigger P(中国株（ＲＹＳＶ）)、Trigger P3(中国株（ＲＹＳＶ）)あるいはTrigger P6(中国株（ＲＹＳＶ）)を含む発現抑制剤は、ＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）感染に対する抵抗性のみならず、ＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２２１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０２２２】
本発明により、よりウイルス感染抑制あるいは無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、安定した抵抗性が付与されたラブドウイルス科のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供され、ラブドウイルス病の防除対策手段のひとつとして活用される。
【配列表フリーテキスト】
【０２２３】
配列番号１は、ＲＴＹＶのＮＰ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号２は、ＲＴＹＶのＮＰ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＲＴＹＶのＰ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号４は、ＲＴＹＶのＰ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＲＴＹＶのＰ３遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号６は、ＲＴＹＶのＰ３遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＲＴＹＶのＭ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号８は、ＲＴＹＶのＭ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＲＴＹＶのＧ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号１０は、ＲＴＹＶのＧ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＲＴＹＶのＰ６遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号１２は、ＲＴＹＶのＰ６遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＲＴＹＶのＬ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号１４は、ＲＴＹＶのＬ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、実施例で用いたｌｅａｄｅｒ配列領域の核酸配列である。(Trigger ｌｅａｄｅｒ）
配列番号１６は、実施例で用いたｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子領域の核酸配列である。(Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ）
配列番号１７は、実施例で用いたＮＰ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger ＮＰ）
配列番号１８は、実施例で用いたＰ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｐ）
配列番号１９は、実施例で用いたＰ３遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｐ３）
配列番号２０は、実施例で用いたＭ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｍ）
配列番号２１は、実施例で用いたＧ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｇ）
配列番号２２は、実施例で用いたＰ６遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｐ６）
配列番号２３は、実施例で用いたＬ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｌ）
配列番号２４は、実施例で用いたｔｒａｉｌｅｒ配列＋Ｌ遺伝子領域の核酸配列である。
配列番号２５は、ＲＴＹＶのゲノム配列である（Rice yellow stunt virus viral cRNA, complete genome,country: Japan:Okinawa, ishigaki；GenBank accession No. AB516283）。
配列番号２６は、ｌｅａｄｅｒ配列の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号２７は、ｌｅａｄｅｒ配列の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号２８は、ｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号２９は、ＮＰ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３０は、ＮＰ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３１は、Ｐ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３２は、Ｐ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３３は、Ｐ３遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３４は、Ｐ３遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３５は、Ｍ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３６は、Ｍ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３７は、Ｇ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３８は、Ｇ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３９は、Ｐ６遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号４０は、Ｐ６遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号４１は、Ｌ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号４２は、Ｌ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号４３は、ｔｒａｉｌｅｒ配列＋Ｌ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号４４は、ｔｒａｉｌｅｒ配列＋Ｌ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号４５は、トリミング配列である。
配列番号４６は、ユビキチンプロモーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ４５２７３６由来）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物を作出する方法に関する。より具体的には、ラブドウイルス科のウイルスのヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）およびＰ６タンパク質等の遺伝子をコードする核酸分子を用いた、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、植物ウイルス病の防除には抵抗性品種の利用が最も有効な方法のひとつであるが、抵抗性遺伝子源には限りがあり、また、特定の遺伝子を長期間使用するとそれを侵すウイルス系統の出現によって導入遺伝子の有効性がやがて失われ、結果的にその抵抗性が崩壊してしまうというケースがしばしば起こる。
【０００３】
ラブドウイルス科のウイルスには、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）などの重要ウイルスが含まれ、特に東南アジアの米の生産に多大な被害を及ぼし、脅威となっている。
【０００４】
このような状況の突破口として、植物自身が生来有するＲＮＡ干渉能に関する知見の集積とその応用を可能にした遺伝子工学技術を駆使して、しばしば大発生して食料安定供給を脅かすラブドウイルス科のウイルスに対して強力な抵抗性を発揮するイネ品種の開発が望まれている。
【０００５】
特許文献１は、イネ萎縮ウイルス（ＲＤＶ）を標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いたウイルス抵抗性を開示する。
【０００６】
特許文献２は、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）を標的としたＲＮＡｉを用いたウイルス抵抗性を開示する。
【０００７】
非特許文献１は、植物でヌクレオキャプシドタンパク質、移行タンパク質を標的としたＲＮＡｉを用いたウイルス抵抗性を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２０２３７号パンフレット
【特許文献２】特開２０１１−６７１１５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shimizu T,Nakazono-Nagaoka E, Uehara-Ichiki T, Sasaya T, Omura T. (2011) Targeting specific genes for RNA interference is crucial to the development of strong resistance to Rice stripe virus. Plant Biotechnol J. 2011 May;9(4):503-12.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意研究した結果、ラブドウイルス科に属するウイルス（例えば、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ））のゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する抵抗性を付与するための組成物が、予想外に、完全な抵抗性を付与することを見出したことにより実用化に結びつく、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性植物の作出方法および抵抗性型品種を得ることに成功した。
【００１１】
一般に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では遺伝子の発現を完全に抑制することができないという共通認識が存在する（ＲＮＡｉ実験なるほどＱ ＆ Ａ，羊土社，２００６年、ｐｐ．４）。
【００１２】
ＲＴＹＶは、他のイネ病変の原因となるウイルスであるイネ萎縮病ウイルス（ＲＤＶ）やイネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）とは違い、１本のマイナス鎖ＲＮＡのゲノムの中に７つの遺伝子（ＮＰ，Ｐ，Ｐ３，Ｍ，Ｇ，Ｐ６，Ｌ）が存在し、その部分からＣＡＰおよびｐｏｌｙ（Ａ）を持つｍＲＮＡが転写される。また、そのゲノムの両末端付近にｌｅａｄｅｒ配列、ｔｒａｉｌｅｒ配列と呼ばれる領域があり、その部分からはＣＡＰおよびｐｏｌｙ（Ａ）を持たないＲＮＡが転写されているとされる。
【００１３】
そこで、イネ黄葉ウイルスがコードする全遺伝子について個々の遺伝子を、従来ラブドウイルスに対する抵抗性付与に関する研究で通常行われている２０数塩基で比較する方法ではなく、５００塩基程度の長さで各遺伝子についてＲＮＡ干渉で発現抑制を試みたところ、ＮＰ、Ｐ、Ｐ３およびＰ６等を発現抑制させるとイネに抵抗性が付与されることが判明した。
【００１４】
また本発明は、以下の項目を提供する。
（１）ラブドウイルス科に属するウイルスのヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）またはＰ６タンパク質をコードする核酸配列の、ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
（２）前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、項目１に記載に記載の使用。
（３）前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、項目１または２に記載の使用。
（４）前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、項目１〜３のいずれかに記載の使用。
（５）前記抵抗性はイネに対して付与される、項目１〜４のいずれかに記載の使用。
（６）ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための組成物。
（７）前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、項目６に記載に記載の組成物。
（８）前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、項目６または７に記載に記載の組成物。
（９）前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、項目６〜８のいずれかに記載に記載の組成物。
（１０）前記抵抗性はイネに対して付与される、項目６〜９のいずれかに記載に記載の組成物。
（１１）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションを行うものか、前記遺伝子産物に対する抗体である、項目６〜１０のいずれかに記載の組成物。
（１２）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであって、２０塩基以上の長さを有する、項目１１に記載の組成物。
（１２Ａ）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであって、３０塩基以上の長さを有する、項目１１に記載の組成物。
（１３）前記ＲＮＡｉの長さは約５００塩基である、項目１２に記載の組成物。
（１４）前記ＲＮＡｉは、配列番号１６、１７、１８、１９および２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変配列を有する、項目１３に記載の組成物。
（１５）前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであり
（ａ）配列番号４６に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４５に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目６〜１４のいずれかに記載の組成物。
（１６）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための、ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤。
（１７）項目１６に記載の発現抑制剤を含む、ベクター。
（１８）項目１７に記載のベクターを含む、植物細胞。
（１９）項目１７に記載のベクターを含む、植物体。
（２０）項目１７に記載のベクターを含む、種子。
（２１）ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を示す、項目１９に記載の植物体。
（２２）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を生産する方法であって、
Ａ）項目１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
（２３）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得る植物のイネ属植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）項目１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
（２４）ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を再生産する方法であって、
Ａ）項目１７に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
（２５）項目１６に記載の発現抑制剤を含む植物体または種子、あるいはその加工品。
【００１５】
上記のように、本発明によって、ラブドウイルス科のウイルスの、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）またはＰ６タンパク質の遺伝子をコードする分節ゲノムを標的とした発現抑制剤を含む組成物が提供され、好ましくは、完全抵抗性を持つ集団（ラブドウイルス科のウイルス感染植物体の個体数総計に対して１００％が抵抗性を示す）、少なくとも、部分的な抵抗性を持つ集団（ラブドウイルス科のウイルス感染率が野生型の植物と比較して低下する）が提供され、また、安定した抵抗性が付与されたラブドウイルス科のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、よりウイルス感染抑制あるいは無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、または安定した抵抗性が付与されたラブドウイルス科のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）の標的遺伝子領域を含むゲノム構造（上パネル）および各遺伝子を発現抑制するためのＲＮＡｉ誘起ベクターの構築模式図（下パネル）を示す。
【図２】図２は、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）の各遺伝子標的ＲＮＡｉイネにおける導入遺伝子由来ｓｉＲＮＡの検出を示す図である。ＲＮＡｉが誘導されると２４、２２および２１塩基のＲＮＡ断片が蓄積する。Ｃはコントロール（日本晴）を示す。
【図３】図３は、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）の各遺伝子標的ＲＮＡｉイネにおけるウイルス病抵抗性の付与を示す図である。ＲＴＹＶ接種後約６０日のイネ葉を用いた感染を検定し、日本晴れを１００としたときの感染率を計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２０】
本明細書において「イネ黄葉ウイルス」とは、ＲＴＹＶともいわれ、ラブドウイルス科に属するウイルスのメンバーである。このウイルス粒子の形状は、幅が１００ｎｍで長さが１８０〜２１０ｎｍの弾丸状粒子である。また、このウイルスは１本のマイナス鎖ＲＮＡをゲノムとし、（そのゲノム配列は配列番号２５に示す。）、このマイナス鎖に７種のタンパク質（ＮＰ、Ｐ、Ｐ３、Ｍ、Ｇ、Ｐ６およびＬ）をコードしている。ＲＴＹＶ粒子は、ゲノムＲＮＡ、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｐ６およびＬから成るとされている。このウイルスは、イネ科の植物に分布している。また、本発明において例示され実施例１において使用したＲＴＹＶ（日本株）とは別に、中国で分離された同種のウイルス株はＲｉｃｅｙｅｌｌｏｗ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ＲＹＳＶ）と命名されており(ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＮＣ＿００３７４６)（以下中国株（ＲＹＳＶ）とする）、同様にＲＴＹＶには多くの系統および変種系統が存在することが予想される。従って、本明細書において使用される場合、用語「ＲＴＹＶ」は、当然のことながら、この用語がＲＴＹＶの種々の系統および変種系統も意図していることは、当業者であれば容易に明らかである。ＲＴＹＶ日本株全長の標的配列と中国株（ＲＹＳＶ）全長の塩基配列を比較したところ、１．５％の違いが認められた。この程度の置換があるとしても、最低限発現抑制が起こる塩基長、すなわち、２４ヌクレオチド以上実質的に一致した部分塩基配列が他の系統もしくは変異株間に存在していれば、ある１種の系統に由来する分節ゲノムを含む本発明の発現抑制剤は、別の１種の系統においても、その効果を発揮し得る。他方、ＲＴＹＶのどの株由来の配列を用いたとしても、当業者は本明細書の記載に基づいて他の株に対しても効果を有するｓｉＲＮＡなどの発現抑制剤を製造することができることが理解される。
【００２１】
本明細書においてウイルスの「系統」および「株」は、同じウイルス種内でのバリエーションをいうために使用され得るが、これらの用語は、交換可能に使用され得ることが理解される。
【００２２】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「ＮＰ」とは、（１）配列番号１に示される核酸配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＮＰをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＮＰによってコードされるタンパク質は、ゲノムＲＮＡと結合しヌクレオキャプシド構造をつくる（ヌクレオタンパク質）。また、ＮＰによってコードされるタンパク質は、ＲＮＡ合成において、複製酵素と相互作用し、その役割を果たす。
【００２３】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｐ」とは、（１）配列番号３に示される核酸配列または配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＰをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｐによってコードされるタンパク質は、構造タンパク質（ホスホタンパク質）として機能する。また、Ｐによってコードされるタンパク質は、ＲＮＡ合成において、複製酵素と相互作用し、その役割を果たす。
【００２４】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｐ３」とは、（１）配列番号５に示される核酸配列または配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＰ３をコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｐ３によってコードされるタンパク質は、移行タンパク質として機能し、ＲＴＹＶの感染細胞に隣接する細胞への移行において、その役割を果たす。
【００２５】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｍ」とは、（１）配列番号７に示される核酸配列または配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＭをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｍによってコードされるタンパク質は、構造タンパク質として機能し、粒子の形を形成する過程において、その役割を果たす。
【００２６】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｇ」とは、（１）配列番号９に示される核酸配列または配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＧをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｇによってコードされるタンパク質は、構造タンパク質として機能する。また、Ｇによってコードされるタンパク質は、粒子形成、およびウイルスの宿主細胞への侵入において、その役割を果たす。
【００２７】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｐ６」とは、（１）配列番号１１に示される核酸配列または配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＰ６をコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｐ６によってコードされるタンパク質は、構造タンパク質として機能するが、その役割は不明である。
【００２８】
ＲＴＹＶについて、本明細書において「Ｌ」とは、（１）配列番号１３に示される核酸配列または配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体または上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＴＹＶの他の系統もしくは変種株に由来するＬをコードする核酸配列によって示される、マイナス鎖のＲＴＹＶゲノム上に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（例えば、BLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｌによってコードされるタンパク質は、ＲＴＹＶの粒子に付随されるタンパク質である。また、Ｌによってコードされるタンパク質は、ＲＮＡ複製酵素として機能し、ＲＴＹＶのＲＮＡ合成において、その主たる役割を果たす。
【００２９】
本明細書において、ウイルス（例えば、ＲＴＹＶ等のラブドウイルス科のウイルス）等に対する「抵抗性」または「耐性」とは、ウイルス等が侵入しようとする宿主生体（本明細書では、植物）が、ウイルス等の侵入に対して抵抗力を持つことをいう。本明細書では、抵抗力とは、宿主生体の通常の生存・増殖が維持される程度の性質のことをいう。その評価手法は、本明細書において以下に規定され、本明細書では特に断らない限り、この評価手法によって抵抗性かどうかが判断される。
【００３０】
本明細書において、病害（例えば、ラブドウイルス科のウイルス病としてイネ黄葉病（イネトランジトリーイエローイング病）等）に対する「耐性」または「抵抗性」とは、その病害に対して宿主生体（本明細書では、植物）が抵抗力を持つことをいう。従って、ウイルスの侵入の如何にかかわらず、植物体の生長、目的物質の収量において、変化が見られない限り、病害に対する耐性はあるといえる。病害についてもその評価手法は、本明細書において以下に規定され、本明細書では特に断らない限り、この評価手法によって抵抗性かどうかが判断される。
【００３１】
本明細書において、病害に対する「抵抗性」は、病害を引き起こす原因因子（例えば、ＲＴＹＶ）に感染する機会が与えられた場合において、その原因因子の感染または増殖が認められず、その原因因子の感染していない植物体（非感染植物体）と比較して、植物体の生長（例えば、分けつ、伸長）、目的物質の収量において、非感染生物体と何ら変化が見られないことを検定および観察することによって判定することができる。さらに「感受性」は、目的の植物体に上記病原体を感染させたときに、野生型の感染植物体との違いが認められないことを検定および観察することによって判定することができる。
【００３２】
病害に対する「完全抵抗性」とは、目的の植物集団に対して上記病原体に感染する機会が与えられた場合において、その全てが「抵抗性」であった場合をいう。
【００３３】
また、「部分的な抵抗性」とは、目的の植物集団に対して上記病原体に感染する機会が与えられた場合において、野生型植物集団に対して同様に上記病原体に感染する機会が与えられた場合と比較して、「感受性」が出現する割合が低くなる事をいう。本明細書では、感染に失敗した個体（すなわち、ツマグロヨコバイが吸汁したにも拘わらず、発病に至らなかったもの）を除くことによって病原体に対する抵抗性を正しく評価するために、野生型植物集団において「感受性」が出現する率を１００とした時の目的の植物集団における「感受性」が出現する率を計算し、この率が１００以下のＸとなる場合、目的の植物集団はＸ％の「部分的な抵抗性」を持つという。
【００３４】
本明細書において、「安定した抵抗性」とは、複数の世代において保持される抵抗性をいう。複数の世代において保持されるとは、好ましくは３世代、より好ましくは５世代、さらにより好ましくは７世代、最も好ましくは永久に保持されることを意味する。
【００３５】
本明細書では、特に言及するときは、抵抗性は、ウイルスに対する性質をいい、耐性は病害に対する性質をいうが、交換可能に使用され得ることが理解される。
【００３６】
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。通常、本明細書では、ＲＴＹＶが感染する植物を指す。好ましい植物は、イネ科に属する単子葉植物であり、本発明にとって最も好ましい植物は、イネである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００３７】
本明細書において「野生型」植物とは、形質転換などの人為的手段による遺伝的改変がなされていない天然に存在する植物をいう。
【００３８】
本明細書において生物の「器官」とは、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。例えば、茎、根、葉、花、種子などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００３９】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【００４０】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res．19：5081(1991)；Ohtsukaら、J．Biol．Chem．260：2605-2608(1985)；Rossoliniら、Mol．Cell．Probes 8：91-98(1994)）。
【００４１】
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子などを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。
【００４２】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常ゲノム上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現されたタンパク質、ポリペプチド等のほか、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００４３】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
【００４５】
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能、特にＲＮＡｉの機能を果たす限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
【００４６】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００４７】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST 2．2．9 （2004．5．12 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００４８】
本明細書において、「対応する」ヌクレオチドとは、ある核酸分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となる核酸分子またはポリヌクレオチドにおける所定のヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチドをいい、ＲＮＡｉにあっては、ＲＮＡ干渉作用において、同様の寄与をするヌクレオチドをいう。アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
【００４９】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＲＴＹＶのＮＰ、Ｐ、Ｐ３、Ｐ６等）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ウイルスの遺伝子に対応する遺伝子は、他のウイルス（ラブドウイルス科の他のウイルスなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、あるウイルスにおける対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてそのウイルス（例えば、ラブドウイルス科の他のウイルス）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５０】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００５１】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、これらのタンパク質自体の機能のほか、例えば、植物におけるラブドウイルス科のウイルスの増殖への関与、ラブドウイルス科のウイルスに対する抵抗性または感受性への関与、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性、これらの具体的な機能について直接的または間接的に関連する機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００５２】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【００５３】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼし合うこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「調節する（modulate）」または「改変する（modify）」は、特定の活性、因子またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
【００５６】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列の全部または一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４００の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５００の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。１つの好ましい実施形態では、本発明の発現抑制剤において使用されるアンチセンス核酸は、その長さの下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記アンチセンス核酸は、その長さの上限においては、たとえば、約１０５０ヌクレオチドまで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くアンチセンス現象に基づく遺伝子発現抑制効果を誘起させることができると考えられるからである。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５７】
本明細書において「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ（RNA interference）」とは、交換可能に使用され、二本鎖ＲＮＡ（double stranded RNA：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。遺伝子発現抑制手法としての植物におけるＲＮＡｉについての総説は、例えば、三木ら、「植物におけるＲＮＡｉの分子機構とその応用」（実験医学 Vol．22 No．4(3月号)2004）（本明細書中で、参考として援用される）などが挙げられる。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において用語「ＲＮＡｉ」はまた、文脈に応じて、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。ＲＮＡｉが因子を示すときは、例えば、２０塩基以上であり、通常２５塩基以上であり、好ましくは、３０塩基以上でありうる。
【００５８】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００５９】
本明細書において「トリミング配列」とは、センス配列およびアンチセンス配列に相当する配列とそれら二つの配列の間に位置する配列（スペーサー、ヘアピン、トリミング等と呼ばれている）ものをいう。下記のような構造：
センス配列−トリミング配列−アンチセンス配列；または
アンチセンス配列−トリミング配列−センス配列
を有する核酸分子が導入され得たベクターで細胞が形質転換されると、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成し、それら二つの鎖の間に位置する部分はループまたはヘアピン部分として保持された、その一部にループ又はヘアピン構造の一本鎖部分を含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が形成される。このトリミング配列の長さは、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成するときに、このトリミング配列の構成する一本鎖部分がループまたはヘアピン構造をとる限りにおいてどのような長さのものであってもよい。上記ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に移動し、その導入された細胞内でＤｉｃｅｒによって切断されてｓｉＲＮＡとなり、ＲＮＡ干渉を引き起こす。トリミング配列の例としては、例えば、配列番号４５に示すものが挙げられる。
【００６０】
１つの実施形態では、ＲＮＡｉを引き起こす因子において使用されるセンス配列またはアンチセンス配列の長さは、その下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記センス配列またはアンチセンス配列の長さは、その上限においては、たとえば、約１０５０まで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くRNAiを誘起させることができると考えられるからである。
【００６１】
本明細書において第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して、第２の物質または因子以外の物質または因子（特に、第２の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００６２】
本明細書において「発現抑制剤」とは、広義には、遺伝子の細胞内における発現、すなわち、ゲノムの複製、転写、翻訳を抑制することができるあらゆる因子をいう。
【００６３】
本明細書において「因子」（agent）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などであって、代表的には分子量約１０，０００以下のもの（例えば、約１，０００以下のもの）を指すがそれらに限定されない）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６４】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、ラブドウイルス科のウイルスの増殖に関与する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
【００６５】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００６６】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味し、その対象物を天然物から区別するために用いられる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「外来」の核酸分子とは、ある対象核酸分子内に含まれるその対象核酸分子以外の起源の核酸分子などをいう。この外来の核酸分子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。
【００７２】
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来の核酸分子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、目的（例えば、ＲＮＡ干渉）を果たす核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【００７３】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」または「抑制」とは、交換可能に使用され、ある因子（すなわち、発現抑制剤）を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。
【００７４】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００７５】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物等の生物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「ジーンサイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制現象を意味する。「ジーンサイレンシング」と呼ばれる現象としては、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、ＰＥＶ（position effect variegation）、トウモロコシのパラミューテションなどが挙げられる。植物におけるトランスジーン（導入遺伝子）の不活性化の一つとして、相同性依存型ジーンサイレンシング（Homology-dependent gene silencing；HDGS）があり、そのＨＤＧＳ様の現象は、植物内在性遺伝子、植物以外のトランスジェニックにおいても見られており、生物のなんらかの遺伝子制御機構であると考えられる。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「相同性依存型ジーンサイレンシング」または「ＨＤＧＳ」は、複数の遺伝子が、その塩基配列の相同性またはその配列の類似性に依存して起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。特に、特定の導入された遺伝子（導入遺伝子）を過剰発現させると、その導入遺伝子とともに本来ゲノムに存在していた（すなわち、内在的な）同一または相同な遺伝子が抑制される現象をいう。「ＨＤＧＳ」としては、例えば、「ＰＴＧＳ」が挙げられる。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「転写後型ジーンサイレンシング」または「ＰＴＧＳ」は、転写後に起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。ＲＮＡｉもＰＴＧＳの一種である。
【００７９】
本明細書中において使用される場合、「コサプレッション」、「コーサプレッション」および「共抑制」は、同意義語として使用され得る。「コサプレッション」とは、導入遺伝子を含む植物において、その導入遺伝子と相同な配列を有する内在性の遺伝子（その植物において、その植物のゲノム上の存在していた、その導入遺伝子と同一であるかまたは相同である遺伝子）の両方の発現が抑制される現象をいう。この現象は、ペチュニアの花の色素合成にかかる遺伝子の発現機構を研究している過程に発見された（Napoli，C．，Lemieux，C．＆Joergensen，R．：Plant Cell 2，291-299(1990)；ならびにvan der Krol，R et al：Plant Cell 2，291-299(1990)）。その後、植物のみでなくアカパンカビ、ショウジョウバエ、線虫、哺乳動物細胞などにおいてもそれらの同様の現象が発見されている。このような「コサプレッション」を、育種目的に利用した例は、SCIENCE Vol．309 29 July 2005 p．741-745などに記載されている。
【００８０】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（RNA-induced-silencing-complex）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【００８１】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【００８２】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【００８３】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態をとっていてもよい。
【００８４】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；short hairpin RNA）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００８５】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【００８６】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００８７】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の方法および組成物において有用である。
【００８８】
本明細書において、ＲＴＹＶについて、配列番号２（ＮＰ）、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）等、好ましくは配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１（ＮＰコード領域）、配列番号３（Ｐコード領域）、配列番号５（Ｐ３コード領域）または配列番号１１（Ｐ６コード領域）等、好ましくは、配列番号３（Ｐコード領域）、配列番号５（Ｐ３コード領域）または配列番号１１（Ｐ６コード領域）に示される核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。
【００８９】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Tijssen(Tijssen(1993)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第２章 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier，New York）に見出される。
【００９０】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【００９１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning 2nd ed．，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1〜38、DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University Press(1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９２】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Sambrook et al．，Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor，N，Y．1989)；およびAnderson et al．、Nucleic Acid Hybridization：a Practical approach、IV、IRL Press Limited(Oxford，England)．Limited，Oxford，Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Anderson et al．，Nucleic Acid Hybridization：a Practical Approach、第４章、IRL Press Limited（Oxford，England）を参照のこと。
【００９３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝81.5＋16.6（log[Na+]）＋0.41（％G+C）−600/N-0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００９４】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００９５】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００９６】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Suggsら、Developmental Biology Using Purified Genes、683頁、BrownおよびFox(編)(1981)を参照のこと)。
【００９７】
配列番号２（ＮＰ）、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）等、好ましくは、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下で、配列番号１（ＮＰ）、配列番号３（Ｐ）、配列番号５（Ｐ３）または配列番号１１（Ｐ６）等、好ましくは、配列番号３（Ｐ）、配列番号５（Ｐ３）または配列番号１１（Ｐ６）に示す核酸配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００９８】
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
【００９９】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【０１００】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
【０１０１】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、挿入改変体、欠失改変体、短縮（truncated）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加、挿入および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加、挿入および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。「オルソログ（ortholog）」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous gene）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。オルソログは、通常別のウイルス株において、もとのウイルス株と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１０２】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Mark Zoller and Michael Smith，Methods in Enzymology，100，468-500(1983)）が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【０１０３】
本明細書において使用される核酸分子は、目的とする遺伝子の発現を抑制する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１０４】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１０５】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加、挿入および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、挿入されること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加、挿入および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１０６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J．et al．(1989)．Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harborおよびその3rd Ed．(2001)；Ausubel，F．M．(1987)．Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience；Ausubel，F．M．(1989)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience;Innis，M．A．(1990)．PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press；Ausubel，F．M．(1992)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates;Ausubel，F．M．(1995)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates;Innis，M．A．et al．(1995)．PCR Strategies，Academic Press;Ausubel，F．M．(1999)．Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，and annual updates;Sninsky，J．J．et al．(1999)．PCR Applications：Protocols for Functional Genomics，Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１０７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait，M．J．(1985)．Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRLPress；Gait，M．J．(1990)．Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein，F．(1991)．Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approac，IRL Press;Adams，R．L．et al．(1992)．The Biochemistry of the Nucleic Acids，Chapman&Hall;Shabarova，Z．et al．(1994)．Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，Weinheim;Blackburn，G．M．et al．(1996)．Nucleic Acids in Chemistry and Biology，Oxford University Press;Hermanson，G．T．(I996)．Bioconjugate Techniques，Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１０８】
（遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２（ＮＰ）、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）等、好ましくは、配列番号４（Ｐ）、配列番号６（Ｐ３）または配列番号１２（Ｐ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【０１０９】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
【０１１１】
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１１２】
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pcDNA3(+)、pBluescript-SK(+/-)、pGEM-T、pEF-BOS、pEGFP、pHAT、pUC18、pFT-DESTTM42GATEWAY、pENTRTM/D-TOPO（Invitrogen）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
【０１１３】
本明細書において用いられ得る植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pANDA（奈良先端大学院大学島本教授より分譲、Miki D, Itoh R,and Shimamoto K (2005) RNA Silencing of Single and Multiple Members in a GeneFamily of Rice. Plant Physiol. 138: 1903-1913）、pBE7133-GUS-Hygro（pE7ΩIGUS-Hygro）、pPZP2H-lacを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１１４】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、CaMV35Sターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１１６】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１１７】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。部位特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え植物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。部位特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。
【０１１８】
本明細書において、「部位特異的発現プロモーター」とは、器官（例えば、根、茎、葉、果実、種子ならびにそれらの組合せなど）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、ならびにそれらの組合せなど）、発達段階（例えば、発芽期、生長期、開花期、登期ならびにそれらの組み合わせなど）などにおいて、特異的なプロモーターである。原理的には、個体において特異的に発現している遺伝子を単離し、そのプロモーター、発現制御シス領域を単離することによって得られる。
【０１１９】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
【０１２１】
本明細書において「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【０１２２】
本明細書において「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Langridge，1985，Plant Cell Rep．4，355)、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Guilley，1982，Cell 30，763）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Odell，1985，Nature 313，810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang，1991，Plant Cell 3，1155）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Cornejo 1993，Plant Mol．Biol．23，567）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Mitsuhara，1996，Plant Cell Physiol．37，49）などを用いることができる。
【０１２３】
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Fluhr，1986，Pro．Natl．Acad．Sci．USA 83，2358）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Aguan，1993，Mol．Gen．Genet．240，1）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Van Breusegem，1994，Planta 193，57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Nundy，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，1406）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert，1989，EMBO J．8，651）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【０１２４】
本明細書において「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。これらの薬剤耐性遺伝子は、本発明においてスクリーニング技術などにおいて用いられる。
【０１２５】
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
【０１２７】
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Nagelらの方法（Microbiol．Lett．，67，325(1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【０１２８】
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Fujimura，1995，Plant Tissue CultureLett．2，74）、トウモロコシ（Shillito，1989，Bio/Technol．7，581、Gorden-Kamm，1990，Plant Cell 2，603）、ジャガイモ（Visser，1989，Theor．Appl．Genet．78，594）、タバコ（Nagata，1971，Planta 99，12）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
【０１３０】
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。
【０１３１】
本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。
【０１３２】
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【０１３３】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
【０１３４】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。例えば、エンハンサーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が用いられるが、これらに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１３５】
本発明において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
【０１３６】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１３７】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F．A．ら編(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY；Sambrook Jら(1987)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed．およびその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１３８】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１３９】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１４０】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Escherichia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属などに属する原核生物細胞、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1が例示される。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Methods．Enzymol．，194，182(1990)］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，1929(1978)］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
【０１４２】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat Genet．2002 Dec;32 Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１４３】
（抵抗性の評価）
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、病徴の観察および病原体感染の可否の検定で確認し得る。例えば、ラブドウイルス科のウイルス病の場合は、特定のイネ品種にツマグロヨコバイなどのＲＴＹＶを媒介する昆虫を温室中で放飼してウイルス感染させた場合、病斑形成やイネの背丈などを、原品種または野生型と組換え体とを比較すること、およびＥＬＩＳＡ法によりウイルス感染の可否を検定することが可能であるが、これに限定されることはない。
【０１４４】
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１４５】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
【０１４６】
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
【０１４７】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【０１４８】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０１４９】
ＲＴＹＶがコードする各タンパク質の感染細胞内での挙動について、ほとんど解析がなされていないことから、個々に標的遺伝子を設定して発現抑制剤を作製し、ＲＴＹＶ抵抗性イネの作出を試みた。また、本発明では、コンストラクトの対象として従来の２０数塩基のものではなく５００塩基程度の長い配列を目的として上記抵抗性イネの作出を試みた。
【０１５０】
一局面において、本発明は、ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科のウイルス病に抵抗性を付与するための組成物を提供する。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号１（ＮＰ）、配列番号３（Ｐ）、配列番号５（Ｐ３）または配列番号１１（Ｐ６）からなる群より選択され得る。
【０１５２】
一実施形態において、好ましいアンチセンス配列は、配列番号１６(Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ）、配列番号１７（Trigger ＮＰ）、配列番号１８（Trigger Ｐ）、配列番号１９（Trigger Ｐ３）、配列番号２０（Trigger Ｍ）、配列番号２２（Trigger Ｐ６）または配列番号２４（Trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌ）に相補的な配列であり得る。より好ましいアンチセンス配列は、配列番号１６(Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ）、配列番号１７（Trigger ＮＰ）、配列番号１８（Trigger Ｐ）、配列番号１９（Trigger Ｐ３）または配列番号２２（Trigger Ｐ６）に相補的な配列であり得る。さらにより好ましいアンチセンス配列は、配列番号１８（Trigger Ｐ）、配列番号１９（Trigger Ｐ３）または配列番号２２（Trigger Ｐ６）に相補的な配列であり得る。
【０１５３】
一実施形態において、トリミング配列は、５〜３２個またはそれ以上のヌクレオチド配列を有し得る。好ましいトリミング配列としては、ＧＵＳ配列、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ(pyruvate orthophosphate dikinase)イントロン、dof affecting germination(DAG1)イントロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本発明のプロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、好ましいプロモーターとしては、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、ストレス誘導性プロモーター（例えば、感染誘導性プロモーター）が好ましい。恒常性プロモーターとしては、ユビキチンプロモーター（例えば、配列番号４６のユビキチンプロモーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ４５２７３６由来））、アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。感染誘導性プロモーターとしては、ＷＲＫＹ転写因子プロモーター、ＰＲ１プロモーター、ＰＢＺ１遺伝子プロモーター、ペルオキシダーゼプロモーター、マイトジェン活性化プロモーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。
【０１５５】
本発明は、一局面において、ラブドウイルス科のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセットを提供する。
【０１５６】
別の好ましい実施形態において、使用されるアンチセンス配列は、例えば、Invitrogenのウェブサイトにおいて利用可能なrnai_designer（http：//www．invitrogen．co．jp/rnai/rnai_designer．shtml/）、Promegaのウェブサイトにおいて利用可能なsiRNADesigner（http：//www．promega．com．siRNADesigner/）、AmbionのウェブサイトのsiRNA Target Finder、DharmaconのsiDESIGN Center、GenScriptのsiRNA Target Finder、およびGene specific siRNA selector（これらの方法に限定されない）を使用することによって容易に設計可能である。
【０１５７】
本発明は、一局面において、上記発現カセットを含むベクターを提供する。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
【０１５８】
本発明のベクターは、目的の細胞に導入された否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子を含み得る。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【０１５９】
本発明は、一局面において、上記ベクターを含む植物細胞、植物体、種子を提供する。
【０１６０】
このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）などのラブドウイルス科のウイルスに罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
【０１６１】
一実施形態において、本発明の植物体は、ラブドウイルス科のウイルスに対する完全抵抗性を示す。
【０１６２】
（抵抗性・耐性植物の作出）
本発明は、一局面において、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法；ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法；およびラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科のウイルスに感染し得る植物を再生産する方法を提供する。
【０１６３】
上記に示される方法は、本発明の発現抑制剤を、イネ科植物の細胞に導入する工程を包含する。一般的に、本発明のベクターは、種々の慣用的技術を用いて所望の植物宿主（例えば、イネ科植物の細胞）のゲノムに導入することができる。好ましい導入法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられるが、これらに限定されない。上記方法はさらに、ラブドウイルス科のウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する。このような選択は、抵抗性を有するトランスジェニック植物を選択することができる限り、どのような方法を用いてもよく、細胞レベルの選択でもよいし、植物体レベルの選択でもよい。
【０１６４】
本発明のベクターが導入されたか否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子）を含むベクターの場合、上記の導入工程後に得られた細胞は、その薬剤耐性遺伝子が細胞中で発現したか否かを検出するための薬剤（例えば、ハイグロマイシン）を含む選択培地中で増殖させることによって選択される。当然のことながら、このような選択培地中に含まれる薬剤は、上記ベクター中に含まれる薬剤耐性遺伝子に依存して変更され得る。
【０１６５】
上記のようにして選択された細胞を、当該分野で一般的に使用される再生培地中で培養することにより、例えば、根およびシュートが確認できるまで再分化させる。このような再生培地としては、以下の実施例に記載されるような再分化培地（ＭＳＲＥ）などのような当該分野で公知の培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
上記のようにして再分化させることによって得られた根およびシュートは、鉢上げされ、試験に適した時期（例えば、９葉期）まで、または成熟期まで生長させられることによって、トランスジェニック植物（Ｔ０）が作出される。
【０１６７】
さらに、このようにして得られたトランスジェニック植物中に本発明のベクターが含まれているか否かについては、上記植物から細胞を採取して全細胞ＤＮＡを得、ゲノムに組み込まれた薬剤耐性遺伝子をサザンブロットなどで、得られたトランスジェニック植物中に実際に本発明のベクターが含まれているか否かを確認できる。また、低分子ＲＮＡを得、Trigger領域をプローブにノザンブロットを行うことで、トランスジェニック植物中で実際にＲＮＡｉを誘起できていることも確認できる。さらには、得られたトランスジェニック植物に、実際にＲＴＹＶを感染させて、感染トランスジェニック植物とコントロール野生型植物とを比較することによって、本発明のベクターが含まれているか否かを検出することもできる。
【０１６８】
さらに、本発明のトランスジェニック植物は、Ｔ０植物から得られた種子、さらに後代のＴ１植物、Ｔ２植物、Ｔ３植物などから得ることもできる。
【０１６９】
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明の発現抑制剤の、ラブドウイルス科のウイルスに対する抵抗性、ラブドウイルス科のウイルス病に対する耐性を付与するための、またはその耐性もしくは抵抗性を付与する農薬を製造するための使用を提供する。ここで使用される核酸分子および因子は、本明細書において上記される任意の核酸分子であり得ることが理解される。
【０１７０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１７１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１７２】
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
【０１７３】
１．イネの生育
実験系統として、イネ（Oryza sativa cv．Nipponbare）を使用した。イネ植物を温室（２０℃〜３２℃）において栽培し、９葉期まで生育させてから、以下の実験に使用した。イネへのＲＴＹＶ接種試験においては、各形質転換体系統およびコントロールの野生型イネのいずれも、２〜３葉期まで生育させてから使用した。なぜなら、ＲＴＹＶの病徴は新しく展開した葉において観察される、すなわち、イネの生育期において、２〜３葉期がＲＴＹＶに対する感受性が最も高いと考えられるからである。
【０１７４】
２．培地および試薬
（０）Ｎ６−ビタミン １．２Ｌ
グリシン ２ｇ
ニコチン酸 ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ １ｇ
ミオイノシトール １００ｇ
蒸留水で１．２Ｌにする。
【０１７５】
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
【０１７６】
（１）ＭＳ−ビタミン １．２Ｌ
ニコチン酸 ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ ０．１ｇ
ミオイノシトール １００ｇ
蒸留水で１．２Ｌにする。
【０１７７】
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
【０１７８】
（２）カルス誘導培地（Ｎ６Ｄ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
カザミノ酸 ０．３ｇ
Chu(N6) Basal Salt Mixture Powder （Sigma社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１７９】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
【０１８０】
（３）共存培養培地（Ｎ６ＣＯ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
グルコース １０ｇ
カザミノ酸 ０．３ｇ
Chu(N6) Basal Salt Mixture Powder (Sigma社から購入)
３．９８１ｇ
Ｎ６−ビタミン １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．２に調節し、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８１】
ゲルライト ４ｇを加えてオートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、アセトシリンゴン（５０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加える。
【０１８２】
（４）選抜培地（Ｎ６ＳＥ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
カザミノ酸 ０．３ｇ
Chu(N6) Basal Salt Mixture Powder（Sigma社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８３】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ） ２ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ） ０．５ｍｌを添加する。
【０１８４】
（５）再分化培地（ＭＳＲＥ） １Ｌ
スクロース ３０ｇ
Ｄ−ソルビトール ３０ｇ
カザミノ酸 ２ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入） ４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン １．２ｍｌ
カイネチン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ） ０．２ｍｌ
α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ） ０．２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８５】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ） １ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ） ０．５ｍｌを添加する。
【０１８６】
（６）ホルモンフリー（ＨＦ）培地 １Ｌ
スクロース ３０ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入）４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン １．２ｍｌ
１Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０１８７】
ゲルライト ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、ハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ） ０．５ｍｌを添加する。
【０１８８】
実施例１：ＲＴＹＶのｌｅａｄｅｒ配列、ｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｐ３遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｇ遺伝子、Ｐ６遺伝子、Ｌ遺伝子およびＬ遺伝子＋ｔｒａｉｌｅｒ配列を用いたＲＮＡｉ誘起ベクターの構築
（１）ＲＴＹＶのｌｅａｄｅｒ配列、ｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｐ３遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｇ遺伝子、Ｐ６遺伝子、Ｌ遺伝子およびＬ遺伝子＋ｔｒａｉｌｅｒ配列を、特異的なプライマーセットを用いて増幅する：
ＲＴＹＶ感染イネの葉から、定法に従って総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を使用して、添付の説明書に従って行った。総ＲＮＡ １μｇを用いて、SuperScriptIII（Invitrogen）のマニュアルに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセット：
trigger ｌｅａｄｅｒについてプライマーセット１：
フォワードプライマー：CACCACACCACCAGATACATTC（配列番号２６）；と
リバースプライマー：TTTTTAAATCCTATCTCTTATTGACAT（配列番号２７）、
trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰについてプライマーセット２：
フォワードプライマー：CACCACACCACCAGATACATTC（配列番号２６）；と
リバースプライマー：GCATGCTATCTTTACGATGCTTC（配列番号２８）、
Trigger ＮＰについてプライマーセット３：
フォワードプライマー：CACCAACACCACATTAATCATG（配列番号２９）；と
リバースプライマー：ACATATAAACGCAATGGCGCG（配列番号３０）、
Trigger Ｐについてプライマーセット４：
フォワードプライマー：CACCAACACCTCATCACAAC（配列番号３１）；と
リバースプライマー：CTATGTTGGTACATTCGGCC（配列番号３２）、
Trigger Ｐ３についてプライマーセット５：
フォワードプライマー：CACCAACTCCACATAGAAGG（配列番号３３）；と
リバースプライマー：TGTCTTGTATAAACCCGCCC（配列番号３４）、
trigger Ｍについてプライマーセット６：
フォワードプライマー：CACCAACACCACATAATAAACA（配列番号３５）；と
リバースプライマー：TATACTGTGGTAATGATCTCTC（配列番号３６）、
trigger Ｇについてプライマーセット７：
フォワードプライマー：CACCAACAACATCATACGTATC（配列番号３７）；と
リバースプライマー： GACTGTGCTGTTTATGGCCC（配列番号３８）
trigger Ｐ６についてプライマーセット８：
フォワードプライマー：CACCAATACCTCAACATTCTCAA（配列番号３９）；と
リバースプライマー： TTATTTAATATACCAAGTCTTATGC（配列番号４０）
trigger Ｌについてプライマーセット９：
フォワードプライマー：CACCAACATATCCATTTTTCATTTC（配列番号４１）；と
リバースプライマー： AAAGAAGTGATATGCACCTGCG（配列番号４２）
trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌについてプライマーセット１０：
フォワードプライマー：CACCCTGGACTGTGACGAGA（配列番号４３）；と
リバースプライマー： ACACCACCATATCCAAAGCCG（配列番号４４）
を用いてそれぞれＰＣＲを行う。Trigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、およびTrigger Ｌ（配列番号２３）については、ＰＣＲを行った結果、核酸配列の各増幅産物を得た。Trigger Ｍ（配列番号２０）、およびTrigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌ（配列番号２４）についても、同様に増幅産物を得ることができる。
【０１８９】
（２）制限酵素またはGateway（Invitrogen）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する：
上記（１）で得た各増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/trigger ｌｅａｄｅｒ、pENTR/trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ、pENTR/trigger ＮＰ、pENTR/trigger Ｐ、pENTR/trigger Ｐ３、pENTR/trigger Ｇ、pENTR/trigger Ｐ６、およびpENTR/trigger Ｌを得た。pENTR/trigger Ｍ、およびpENTR/trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌについても、同様の操作でこれらを得ることができる。
【０１９０】
このクローニングベクターを、キットに付属のE．coli株に形質転換し、同様に、製造業者の説明書に従って、適切な条件下で、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。単一のコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む１〜２ｍｌのＬＢ培地中に接種し、定法に従って、このクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させた。定法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認した。
【０１９１】
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする：
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化し、pANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ、pANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ、pANDA/trigger ＮＰ、pANDA/trigger Ｐ、pANDA/trigger Ｐ３、pANDA/trigger Ｇ、pANDA/trigger Ｐ６、およびpANDA/trigger Ｌを得た。pANDA/trigger Ｍ、およびpANDA/trigger ｔｒａｉｌｅｒ＋Ｌについても、同様の操作で得ることができる。簡潔にいうと、２μｌ ＬＲ反応緩衝液（５×）、１００〜３００ｎｇの上記エントリーベクター、３００ｎｇ pANDAベクター、ＴＥを添加して総容積８μｌにした。２μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen cat．11791-019）を加えて攪拌し、２５℃で一晩インキュベートした。その後、プロテイナーゼＫ溶液を１μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。得られたベクターをE．coli ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシンを含む培地中で増殖させた。
【０１９２】
実施例２：ＲＴＹＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネの作出
（１）実施例１において作製した上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する：
上記各ベクターを、エレクトロポレーション法によってGenePulser（BioRad）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入した。アグロバクテリウムの系統は、EHA101（Hood，1986，J．Bacteriol．168，1291）を用いた。実施例１で構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置はGENE PULSER（登録商標）II（BIO-RAD）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。増殖させた形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＰ培地に播種して、一晩インキュベートし、この培養液と等量のグリセロールを入れてボルテックスミキサーで十分に混合し、−８０℃で使用時までストック溶液として保存した。
【０１９３】
（２）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、アルカリＳＤＳ法（Molecular Cloning 第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
【０１９４】
（３）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＲＴＹＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出する；
ＲＴＹＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出するために、カルス化したイネを作製した。簡潔には、イネの完熟種子を小型籾すり機にかけ、籾を除去した種子１００〜１５０粒を５０ｍｌの使い捨て遠心管に入れた。７０％ エタノールを遠心管に入れて、数秒間種子を滅菌し、滅菌水で種子をすすいだ。滅菌水を吸引した後、４０ｍｌの２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を上記遠心管に入れ、振盪機で２０分間、１５０ｒｐｍで振盪して滅菌した。滅菌水を除去して、蒸留水で３回洗浄した。ピンセットで種子をカルス誘導培地（Ｎ６Ｄ培地）に２５種子／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールした。６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において１８〜２１日間培養することによってカルス誘導した。カルス誘導の間、培地を、７〜１０日毎に新しいＮ６Ｄ培地と交換した。
【０１９５】
誘導して３週間後の種子の胚乳とシュート部分をメスで切り取るか、あるいはピンセットでもぎ取り、胚盤由来カルスのみを新しいカルス誘導培地Ｎ６Ｄ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールして、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において３日間、カルスを前培養した。カルスの前培養を始めるのと並行して、上記（１）において得られたアグロバクテリウムのストック溶液から滅菌した爪楊枝で菌体を採取し、ＡＢ培地に塗布した。塗布した菌体を滅菌した白金耳で培地全体に拡げ、３日間２８℃において遮光して前培養した。
【０１９６】
ＡＢ培地で増殖したアグロバクテリウムを滅菌した小さい薬さじで掻き取り、１０ｍｌの水に１０ｍｇ／ｍｌのアセトシリンゴンを５μｌ入れ、この溶液にアグロバクテリウムをＯＤ６００＝０．０１になるように懸濁した。懸濁液を滅菌シャーレに入れた。１シャーレ分の前培養したカルスを、一方の端をメッシュで覆った筒状のガラス管の中に入れ、ときどき軽く振って、１．５〜２分間メッシュ付きのガラス管ごと、上記懸濁液中に浸漬した。浸漬後、メッシュ付きのガラス管を滅菌ペーパータオルの上に置いて余分な水分を除去した。Ｎ６ＣＯ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレをテープでシールして、２３℃において遮光して３日間培養した。
【０１９７】
培養後、全てのカルスをＮ６ＳＥ培地に、９カルス／シャーレで移植し、３０〜３３℃において２４時間明期の条件下で、１４日間培養した。その間、カルスを、１回だけ新しいシャーレに移した。選択されたカルスをＲＥ培地に移し、３０〜３３℃において再分化してくるまで培養した。その間、７〜１０日間毎に、新しい培地を入れたシャーレにカルスを移した。再分化したイネをＨＦ培地に移し、２〜３週間培養した後、鉢上げした。
【０１９８】
（４）形質転換体当代（Ｔ０）株における導入遺伝子の確認
上記（３）において作出した形質転換体当代（Ｔ０）株において目的の遺伝子が導入されているか否かを確認するために、Ｔ０株からＣＴＡＢ法により調製したＤＮＡを鋳型に形質転換ベクター内のＧｕｓ−ｌｉｎｋｅｒ特異的プライマーおよび内在コントロールとしてアクチン特異的プライマーの４種混合プライマーでＰＣＲを行い、アガロース電気泳動にて２本のＤＮＡバンドが増幅されることにより行った。Ｔ０株における導入遺伝子の転写産物の断片化によるｓｉＲＮＡの検出は、低分子ＲＮＡを抽出（基本的に、Hamilton，1999，Science．286，950に従った）した後、Trigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、Trigger Ｌ（配列番号２３）の核酸配列をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションすることにより行った。その結果を図２に示す。示されるように、目的の遺伝子がＴ０株において導入され、かつ導入された配列が切断されたことが明らかになった。
【０１９９】
実施例３：形質転換体Ｔ１におけるＲＴＹＶ抵抗性検定
（１）実施例１で作製したpANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ、pANDA/trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ、pANDA/trigger ＮＰ、pANDA/trigger Ｐ、pANDA/trigger Ｐ３、pANDA/trigger Ｇ、pANDA/trigger Ｐ６、pANDA/trigger Ｌで形質転換したＴ１植物へのＲＴＹＶ感染；
得られたＴ０イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＴ１種子を回収した。イネへのＲＴＹＶの接種は、２〜３葉期まで生育させた各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１５株に対して、約２０％がＲＴＹＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行った。
【０２００】
（２）感染後のTrigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、Trigger Ｌ（配列番号２３）の核酸配列を導入したＴ１植物の抵抗性検定；
（１）で接種したTrigger ｌｅａｄｅｒ(配列番号１５）、Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ(配列番号１６）、Trigger ＮＰ（配列番号１７）、Trigger Ｐ（配列番号１８）、Trigger Ｐ３（配列番号１９）、Trigger Ｇ（配列番号２１）、Trigger Ｐ６（配列番号２２）、Trigger Ｌ（配列番号２３）の核酸配列のいずれかで形質転換したＴ１植物から（１）のＲＴＹＶ接種検定約６０日後においてイネ葉を採取し、ＥＬＩＳＡ法によってＲＴＹＶ感染の有無を検定し、スコアリングを行った。なお、ＣＴＡＢ法によりＴ１植物から調製したＤＮＡを鋳型にして、植物形質転換ベクター内のＧＵＳ配列をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、導入遺伝子が後代Ｔ１に受け継がれなかった個体はスコアリングから除外した。接種試験のスコアリングの結果から、日本晴を１００とした時の感染率を計算し、まとめた結果を以下の図３および表１に示す。
【０２０１】
表１：ＲＴＹＶ各遺伝子標的形質転換イネ自殖第１代（Ｔ１）のＲＴＹＶ接種検定
【表１】
【０２０２】
Ｐを標的とした形質転換イネは、全てＲＴＹＶ抵抗性であった（すなわち、「完全抵抗性」集団を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全２２株のうち４株が感染に失敗したが、残りの１８株は全てＲＴＹＶに感染した。
【０２０３】
Ｐ３を標的とした形質転換イネは、全てＲＴＹＶ抵抗性であった（すなわち、「完全抵抗性」集団を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１４株のうち１２株が感染に失敗したが、残りの２株は全てＲＴＹＶに感染した。
【０２０４】
Ｐ６を標的とした形質転換イネは、全てＲＴＹＶ抵抗性であった（すなわち、「完全抵抗性」集団を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１７株のうち５株が感染に失敗したが、残りの１２株は全てＲＴＹＶに感染した。
【０２０５】
ＮＰを標的とした形質転換イネは、全１３株のうち８株が抵抗性、５株が感受性であり、全体の３８％が感染した。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１４株のうち２株が感染に失敗したが、残りの１２株は全てＲＴＹＶに感染し、感染率は８６％であった。すなわち、野生型イネの感染率を１００とすると、ＮＰを標的とした形質転換イネは４５％の「部分的な抵抗性」を持つことが分かった。
【０２０６】
ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰを標的とした形質転換イネは、全１２株のうち１１株が抵抗性、１株が感受性であり、全体の８％が感染した。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全１４株のうち１２株が感染に失敗したが、残りの２株は全てＲＴＹＶに感染し、感染率は１４％であった。すなわち、野生型イネの感染率を１００とすると、ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰを標的とした形質転換イネは５８％の「部分的な抵抗性」を持つことが分かった。
【０２０７】
ｌｅａｄｅｒ、Ｇ、Ｌを標的とした形質転換イネは、コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）に比べ、感染率の低下は見られなかった。
【０２０８】
Ｐを標的とした形質転換イネは、完全抵抗性を示した。Ｐは、複製酵素と相互作用し、ＲＮＡ合成において、役割を果たすと考えられているため、Ｐの発現を抑制すると、ウイルスの複製が阻害され、結果的にウイルスの活動を静止することができ、完全型抵抗性の表現型を示したと考えられる。以上の事から、Ｐが植物に対する感染および植物中での増殖において特に重要な働きを担っている可能性が示された。
【０２０９】
Ｐ３を標的とした形質転換イネは、完全抵抗性を示した。Ｐ３は、ウイルスの細胞間移行タンパク質であることから、おそらくＰ３の発現を抑制すると、感染細胞から隣り合った未感染細胞へのウイルスの拡がりが効果的に阻害され、結果的にウイルスの活動を静止することができ、完全型抵抗性の表現型を示したと考えられる。以上の事から、Ｐ３は植物に対する感染および植物中での増殖において特に重要な働きを担っている可能性が示された。
【０２１０】
Ｐ６を標的とした形質転換イネは、完全抵抗性を示した。現段階でＰ６は、ウイルス粒子に含まれること以外は機能未知であるが、本結果から、Ｐ６は、おそらく植物での感染および（あるいは）増殖に必須であり、特に重要なタンパク質であることが予想できる。また、１本のマイナス鎖ＲＮＡをゲノムとする他のウイルスにおいて、ゲノム上同様な場所に位置する遺伝子がコードするタンパク質は生体膜と直接相互作用することが知られており、ＲＴＹＶにおいてもＰ６は感染・増殖の過程で核膜もしくは細胞膜と相互作用する重要な働きを持っている可能性が考えられる。
【０２１１】
ＮＰを標的とした形質転換イネおよびｌｅａｄｅｒ＋ＮＰを標的とした形質転換イネは、約５０％の部分的な抵抗性を示した。ＮＰは、ウイルスのヌクレオタンパク質であることから、おそらくＮＰの発現を抑制すると、ヌクレオキャプシド構造の形成が阻害され、結果的にウイルスの活動を抑制することができ、部分的な抵抗性の表現型を示したと考えられる。
【０２１２】
上記の結果から、本発明の形質転換イネ、すなわちＰ、Ｐ３およびＰ６の発現を抑制させたイネは、ＲＴＹＶに対する完全抵抗性を、ＮＰの発現を抑制させたイネは、ＲＴＹＶに対する部分的な抵抗性を示すことが明らかになった。
【０２１３】
（３）作出されたＲＴＹＶ抵抗性イネの後代Ｔ３植物における接種検定；
後代植物においてもＲＴＹＶ抵抗性が受け継がれているか否かを確認するために、Ｔ１植物からＴ２種子を取得して、Ｔ２植物を生育させる。このＴ２植物からＴ３種子を得、９葉期まで生育させて、試験用Ｔ３植物を得る。得られたＴ３植物において、上記（２）と同様に、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約２０％がＲＴＹＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり５頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。上記（２）と同様に接種検定を行うと、Ｔ３植物においても、ＲＴＹＶ抵抗性ないし発病遅延型抵抗性が受け継がれていることが確認できる。
【０２１４】
上記の結果から、本発明の形質転換イネが、ＲＴＹＶに対する抵抗性を示すことが明らかになる。
【０２１５】
実施例４：形質転換体Ｔ１における他のＲＴＹＶ株感染とＲＮＡｉ誘導の確認
（１）Ｔ１植物への他のＲＴＹＶ株感染；
実施例１において得られたベクターを使用して、実施例２に記載されるようにＲＴＹＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約２０％がＲＴＹＶ各株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、日本株に基づく発現抑制剤がＲＴＹＶの日本株感染に対する抵抗性のみならず、日本株以外のＲＴＹＶ株の感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２１６】
実施例５：中国株（ＲＹＳＶ）のタンパク質（Ｐ、Ｐ３、Ｐ６、ＮＰ等）の発現抑制イネの作出およびＲＮＡｉ誘導の確認
（中国株（ＲＹＳＶ）株）
ＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）感染イネの葉から、実施例１に記載されるように、配列情報としては、アクセッション番号NC_003746を用いて、定法に従って総ＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、目的の領域（Trigger P(中国株（ＲＹＳＶ）)、Trigger P3(中国株（ＲＹＳＶ）)あるいはTrigger P6(中国株（ＲＹＳＶ）)）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、目的の領域の増幅産物を得る。
【０２１７】
上記実施例１（２）に記載されるように、上記で得た増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/Trigger P(中国株（ＲＹＳＶ）)、pENTR/Trigger P3(中国株（ＲＹＳＶ）)あるいはpENTR/Trigger P6(中国株（ＲＹＳＶ）)を得る。
【０２１８】
このクローニングベクターを、同様に上記実施例１（２）に記載されるようにE．coli株に形質転換し、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択する。定法に従って、単一のコロニーを単離してこのクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させる。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認する。
【０２１９】
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、上記実施例１に記載されるように、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。
【０２２０】
実施例２に記載されるようにＲＴＹＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＴＹＶの日本株および中国株（ＲＹＳＶ）の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約２０％がＲＴＹＶ各株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、中国株（ＲＹＳＶ）株の情報に基づいて設計したTrigger P(中国株（ＲＹＳＶ）)、Trigger P3(中国株（ＲＹＳＶ）)あるいはTrigger P6(中国株（ＲＹＳＶ）)を含む発現抑制剤は、ＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）感染に対する抵抗性のみならず、ＲＴＹＶの中国株（ＲＹＳＶ）以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２２１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０２２２】
本発明により、よりウイルス感染抑制あるいは無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、安定した抵抗性が付与されたラブドウイルス科のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供され、ラブドウイルス病の防除対策手段のひとつとして活用される。
【配列表フリーテキスト】
【０２２３】
配列番号１は、ＲＴＹＶのＮＰ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号２は、ＲＴＹＶのＮＰ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＲＴＹＶのＰ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号４は、ＲＴＹＶのＰ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＲＴＹＶのＰ３遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号６は、ＲＴＹＶのＰ３遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＲＴＹＶのＭ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号８は、ＲＴＹＶのＭ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＲＴＹＶのＧ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号１０は、ＲＴＹＶのＧ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＲＴＹＶのＰ６遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号１２は、ＲＴＹＶのＰ６遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＲＴＹＶのＬ遺伝子をコードする核酸配列である。
配列番号１４は、ＲＴＹＶのＬ遺伝子のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、実施例で用いたｌｅａｄｅｒ配列領域の核酸配列である。(Trigger ｌｅａｄｅｒ）
配列番号１６は、実施例で用いたｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子領域の核酸配列である。(Trigger ｌｅａｄｅｒ＋ＮＰ）
配列番号１７は、実施例で用いたＮＰ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger ＮＰ）
配列番号１８は、実施例で用いたＰ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｐ）
配列番号１９は、実施例で用いたＰ３遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｐ３）
配列番号２０は、実施例で用いたＭ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｍ）
配列番号２１は、実施例で用いたＧ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｇ）
配列番号２２は、実施例で用いたＰ６遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｐ６）
配列番号２３は、実施例で用いたＬ遺伝子領域の核酸配列である。（Trigger Ｌ）
配列番号２４は、実施例で用いたｔｒａｉｌｅｒ配列＋Ｌ遺伝子領域の核酸配列である。
配列番号２５は、ＲＴＹＶのゲノム配列である（Rice yellow stunt virus viral cRNA, complete genome,country: Japan:Okinawa, ishigaki；GenBank accession No. AB516283）。
配列番号２６は、ｌｅａｄｅｒ配列の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号２７は、ｌｅａｄｅｒ配列の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号２８は、ｌｅａｄｅｒ配列＋ＮＰ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号２９は、ＮＰ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３０は、ＮＰ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３１は、Ｐ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３２は、Ｐ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３３は、Ｐ３遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３４は、Ｐ３遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３５は、Ｍ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３６は、Ｍ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３７は、Ｇ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号３８は、Ｇ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号３９は、Ｐ６遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号４０は、Ｐ６遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号４１は、Ｌ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号４２は、Ｌ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号４３は、ｔｒａｉｌｅｒ配列＋Ｌ遺伝子の確認用のフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号４４は、ｔｒａｉｌｅｒ配列＋Ｌ遺伝子の確認用のリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号４５は、トリミング配列である。
配列番号４６は、ユビキチンプロモーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ４５２７３６由来）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラブドウイルス科に属するウイルスのヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）またはＰ６タンパク質をコードする核酸配列の、ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
【請求項２】
前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載に記載の使用。
【請求項３】
前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記抵抗性はイネに対して付与される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための組成物。
【請求項７】
前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項８】
前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項９】
前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抵抗性はイネに対して付与される、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションを行うものか、前記遺伝子産物に対する抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであって、２０塩基以上の長さを有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉの長さは約５００塩基である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡｉは、配列番号１６、１７、１８、１９および２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであり
（ａ）配列番号４６に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４５に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための、ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現抑制剤を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む、植物細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載のベクターを含む、植物体。
【請求項２０】
請求項１７に記載のベクターを含む、種子。
【請求項２１】
ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を示す、請求項１９に記載の植物体。
【請求項２２】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を生産する方法であって、
Ａ）請求項１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得る植物のイネ属植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）請求項１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を再生産する方法であって、
Ａ）請求項１７に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の発現抑制剤を含む植物体または種子、あるいはその加工品。
【請求項１】
ラブドウイルス科に属するウイルスのヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、移行タンパク質（Ｐ３）またはＰ６タンパク質をコードする核酸配列の、ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
【請求項２】
前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載に記載の使用。
【請求項３】
前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記抵抗性はイネに対して付与される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための組成物。
【請求項７】
前記ＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６は、それぞれ配列番号１、３、５もしくは１１に示すヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むか、あるいはそれぞれ配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入、および／もしくは欠失を有する改変配列を含むアミノ酸配列をコードする、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項８】
前記ウイルスは、イネ黄葉ウイルス（ＲＴＹＶ）である、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項９】
前記抵抗性はイネ属植物に対して付与される、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抵抗性はイネに対して付与される、請求項６に記載に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションを行うものか、前記遺伝子産物に対する抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであって、２０塩基以上の長さを有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉの長さは約５００塩基である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡｉは、配列番号１６、１７、１８、１９および２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変配列を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記発現抑制剤は、前記遺伝子のＲＮＡｉであり
（ａ）配列番号４６に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４５に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列か、または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１、３、５または１１に示される核酸配列または配列番号２、４、６もしくは１２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる病変または疾患に対する抵抗性を付与するための、ラブドウイルス科に属するウイルスのゲノムに存在するＮＰ、Ｐ、Ｐ３またはＰ６のうち少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現抑制剤を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む、植物細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載のベクターを含む、植物体。
【請求項２０】
請求項１７に記載のベクターを含む、種子。
【請求項２１】
ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抵抗性を示す、請求項１９に記載の植物体。
【請求項２２】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を生産する方法であって、
Ａ）請求項１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得る植物のイネ属植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）請求項１７に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
ラブドウイルス科に属するウイルスまたはラブドウイルス科に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、ラブドウイルス科に属するウイルスに感染し得るイネ属植物を再生産する方法であって、
Ａ）請求項１７に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の発現抑制剤を含む植物体または種子、あるいはその加工品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−３９０６６（Ｐ２０１３−３９０６６Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７７３４２（Ｐ２０１１−１７７３４２）
【出願日】平成２３年８月１２日（２０１１．８．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター、新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業「植物ウイルスの媒介昆虫・植物間応答機構の解明と制御技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１２日（２０１１．８．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター、新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業「植物ウイルスの媒介昆虫・植物間応答機構の解明と制御技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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