Ｒａｓ変異並びにこれに関連する組成物及び方法
本発明は、新たに見出されたＲａｓ変異及び変異の組合せ、これらの変異を含むタンパク質及びペプチド及び融合タンパク質、このようなタンパク質、ペプチド及び融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにこのような変異の利用に関連付けられた様々な技術、及び診断、治療及びスクリーニング方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個の隣接するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質の第７６位の位置のアミノ酸を含み、かつ、当該第７６位の位置のアミノ酸は上記野生型タンパク質と比較して変異している、単離された核酸分子。
【請求項２】
上記第７６位の位置のアミノ酸は、グルタミン酸塩が、グリシン、リシン及びグルタミンからなる群より選択されるグルタミン酸塩以外のアミノ酸残基に変異したものである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
上記グルタミン酸塩以外のアミノ酸残基がグリシンである、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
上記アミノ酸配列は、配列番号３、５、７、９、１１、又は１３の第７６位におけるグルタミン酸塩のグルタミン酸塩以外のアミノ酸への置換によって、上記配列番号３、５、７、９、１１、又は１３のいずれか１つと異なっている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
上記アミノ酸配列はさらに、変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基を含み、当該アミノ酸配列は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質の第１２位、第１３位、第５９位及び第６１位からなる群より選択される位置のアミノ酸を含み、さらに、当該位置のアミノ酸は、上記野生型タンパク質と比較して変異している、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
上記アミノ酸配列はさらに、変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基を含み、当該アミノ酸配列は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質の第１２位の位置のアミノ酸を含み、さらに、当該第１２位の位置のアミノ酸は、上記野生型タンパク質と比較して変異している、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
第１２位又は第１３位の位置のアミノ酸が、グリシンからグリシン以外のアミノ酸残基に変異している、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
第１２位の位置のアミノ酸が、グリシンからグリシン以外のアミノ酸残基に変異している、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
上記グリシン以外のアミノ酸残基が、バリン、システイン、アスパラギン酸塩、アルギニン、セリン及びアラニンからなる群より選択される、請求項７又は８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
上記核酸配列は２個以上のドメインを含む融合タンパク質をコードし、上記ドメインの１個が、第７６位の位置に変異を含む変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個のアミノ酸を含み、さらに他の各ドメインは免疫原からなる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
上記免疫原は腫瘍抗原である、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
上記腫瘍抗原は、野生型Ｒａｓアミノ酸配列に関連して少なくとも１個の変異を含む、Ｒａｓタンパク質又はその免疫原性フラグメントである、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
上記腫瘍抗原は、上記野生型Ｒａｓアミノ酸配列に関する第１２位又は第１３位の位置を含むＲａｓタンパク質又はその免疫原性フラグメントであり、上記第１２位又は第１３位の位置のアミノ酸は、グリシン残基からグリシン以外の残基に変異している、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
上記腫瘍抗原は、（ａ）Ｒａｓタンパク質の第８位〜第１６位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第１２位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｂ）Ｒａｓタンパク質の第９位〜第１７位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第１３位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｃ）Ｒａｓタンパク質の第５５位〜第６３位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第５９位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｄ）Ｒａｓタンパク質の第５７位〜第６５位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第６１位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｅ）Ｒａｓタンパク質の第６９位〜第７７位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７３位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｆ）Ｒａｓタンパク質の第７０位〜第７８位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７４位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｇ）Ｒａｓタンパク質の第７１位〜第７９位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７５位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｈ）Ｒａｓタンパク質の第７３位〜第８１位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７７位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；及び（ｉ）Ｒａｓタンパク質の第７４位〜第８２位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７８位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチドからなる群より選択される、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
上記核酸配列は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードしている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
上記核酸配列は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードしている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の上記核酸配列に完全に相補的である、単離された核酸分子。
【請求項１８】
上記核酸分子は、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む、組み換え核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組み換え核酸分子を用いてトランスフェクトした、組み換え細胞。
【請求項２１】
上記細胞が酵母である、請求項２０に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされた、単離されたタンパク質又はペプチド。
【請求項２３】
上記単離されたタンパク質又はペプチドは融合タンパク質の一部である、請求項２２に記載の単離されたタンパク質又はペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ワクチン。
【請求項２５】
請求項２２に記載のタンパク質又はペプチドを含む、ワクチン。
【請求項２６】
上記ワクチンはさらに酵母運搬体を含む、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
上記酵母運搬体は、上記タンパク質又はペプチドを組み換え的に発現する、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】
上記ワクチンはさらに樹状細胞を含み、当該樹状細胞は細胞内に上記酵母運搬体及び上記タンパク質又はペプチドを搭載している、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２９】
ａ）酵母運搬体と、
ｂ）変異Ｒａｓタンパク質又はその断片を含む融合タンパク質であって、当該タンパク質又はその断片はＫ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第７６位の位置のアミノ酸を含み、さらに当該第７６位の位置のアミノ酸は上記野生型タンパク質と比較して変異した融合タンパク質と
を含むワクチンであって、
上記融合タンパク質はＣｕｐ１プロモータによって制御されており、上記融合タンパク質は上記酵母運搬体によって発現される、ワクチン。
【請求項３０】
上記融合タンパク質はさらに第２の変異Ｒａｓタンパク質又はその断片を含み、当該第２の変異Ｒａｓタンパク質又はその断片はＫ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、さらに当該第１２位の位置のアミノ酸は上記野生型タンパク質と比較して変異している、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
上記融合タンパク質は、フレーム単位で融合した以下のタンパク質又は断片を含む、請求項２９に記載のワクチン：
ｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがシステインに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第６１位の位置のアミノ酸を含み、上記第６１位の位置のグルタミンがアルギニンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｉｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがアスパラギン酸塩に置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｖ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがバリンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｖ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがアルギニンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；及び
ｖｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第７６位の位置のアミノ酸を含み、上記第７６位の位置のグルタミン酸塩がグリシンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片。
【請求項３２】
上記融合タンパク質は、フレーム単位で融合した以下のタンパク質又は断片を含む、請求項２９に記載のワクチン：
ｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがアルギニンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第７６位の位置のアミノ酸を含み、上記第７６位の位置のグルタミン酸塩がグリシンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片。
【請求項３３】
上記融合タンパク質は配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３４】
上記融合タンパク質は配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３５】
請求項２２に記載の単離されたタンパク質又はペプチドに選択的に結合する、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３６】
請求項２２に記載の単離されたタンパク質又はペプチドに選択的に結合する、アプタマー。
【請求項３７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子によって転写されたＲＮＡ又は変異Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子によって転写されたＲＮＡ、の選択的な切断を触媒するｓｉＲＮＡであって、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型アミノ酸配列に関して少なくとも第７６位の位置の変異によって、上記野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列含む、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又は変異Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子、の不活性化を選択的に触媒するリボザイムであって、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型アミノ酸配列に関して少なくとも第７６位の位置の変異によって、上記野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列含む、リボザイム。
【請求項３９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又は変異Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子、に非常に高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ発現を抑制する、アンチセンス核酸分子であって、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型アミノ酸配列に関して少なくとも第７６位の位置の変異によって、上記野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列含む、リボザイム。
【請求項４０】
癌の予防又は治療のための組成物の調製における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２２若しくは２３に記載のタンパク質若しくはペプチドの使用。
【請求項４１】
癌の予防又は治療のための医薬の調整における、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
【請求項４２】
癌の予防又は治療のための医薬の調整における、請求項３６に記載のアプタマー、請求項２７に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３８に記載のリボザイム、又は請求項３９に記載のアンチセンス核酸分子の使用。
【請求項４３】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、請求項２４〜３４のいずれか1項に記載のワクチンを投与する工程を包含する、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４４】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、請求項３６に記載のアプタマー、請求項２７に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３８に記載のリボザイム、又は請求項３９に記載のアンチセンス核酸分子を投与する工程を包含する、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４５】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、変異Ｒａｓタンパク質の発現を抑制する化合物を投与する工程を包含し、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型のアミノ酸配列に関して第７６位において少なくとも変異することによって、上記野生型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４６】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、変異Ｒａｓタンパク質のＧＴＰ加水分解を先導する又は誘発する化合物を投与する工程を包含し、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型のアミノ酸配列に関して第７６位において少なくとも変異することによって、上記野生型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４７】
診断する患者からの試験サンプルにおけるＲａｓタンパク質の発現若しくは活性、又は上記Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列を検出する検出工程を包含し、上記Ｒａｓタンパク質は野生型の上記Ｒａｓのアミノ酸配列に関して第７６位の位置に変異を含み、
上記試験サンプル中における上記変異Ｒａｓタンパク質又は上記Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列の検出が、試験サンプル中における癌細胞の存在又はその可能性を示す、腫瘍の診断のための方法。
【請求項４８】
上記Ｒａｓタンパク質は、野生型タンパク質の第７６位におけるグルタミン酸塩のグリシンへの置換を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒａｓタンパク質が、野生型Ｒａｓアミノ酸配列に関して第１２位の位置にも変異を有するか否かを検出する検出工程をさらに包含し、第７６位及び第１２位の位置の変異の検出が、試験サンプル中における腫瘍細胞の存在又はその可能性を示し、さらに、これらの位置の１個のみが変異した又はいずれも変異していないＲａｓタンパク質が潜む腫瘍細胞と比較して、上記患者においてより悪性の腫瘍であることを示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
上記検出工程は、上記試験サンプル中における、Ｒａｓ変異をコードする核酸配列の検出を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
上記検出工程は、変異をコードするゲノムＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅、又は変異をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ増幅を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記検出工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、配列分析、遺伝子マイクロアレイ分析、及びレポーター遺伝子の検出からなる群より選択される方法により行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
上記試験サンプルから単離された核酸配列を、上記変異Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列に選択的に結合するプライマー又はプローブに接触させ、かつ上記変異Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列が上記プライマー又はプローブに結合するか否かを検出することによって、上記変異Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列のレベルを決定する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
上記試験サンプルを、上記変異Ｒａｓタンパク質に特異的に選択的に結合する抗体若しくはその断片又はアプタマーに接触させ、かつ上記抗体若しくはその断片又は上記アプタマーが変異Ｒａｓタンパク質に結合するか否かを検出することによって、上記変異Ｒａｓタンパク質のレベルを決定する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
上記試験サンプルは、癌を診断する患者からのものであり、上記試験サンプルをネガティブコントロールサンプルと比較する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
上記試験サンプルを基板上に固定している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
患者において癌を診断するために用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
患者において癌の予後を決定するために用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
治療上の処置のための患者の感受性の決定するために用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
標的Ｒａｓタンパク質又は標的Ｒａｓタンパク質をコードする核酸分子の阻害物質を同定する同定工程を包含し、上記標的Ｒａｓタンパク質は、野生型Ｒａｓタンパク質に関連する第７６位の位置のアミノ酸に変異を含む、癌を予防又は治療するための化合物を同定するための方法。
【請求項６１】
上記変異は、野生型の上記タンパク質における第７６位のグルタミン酸塩の、グリシン、リシン及びグルタミンからなる群より選択されるグルタミン酸塩以外のアミノ酸への置換である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
上記同定工程は、上記標的Ｒａｓタンパク質の発現又は活性の阻害物質の同定を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
上記工程は、推定される調節化合物の存在下おける、上記標的Ｒａｓタンパク質の翻訳又は活性の検出、及び推定される調節化合物の存在下における、上記標的Ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子の発現の検出から選択される検出をする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ａ）宿主細胞を推定される調節化合物に接触させる接触工程であって、上記宿主細胞が上記標的Ｒａｓタンパク質又はその生物学的活性断片を発現している工程、及び
ｂ）上記推定される調節化合物が上記標的Ｒａｓタンパク質又はその生物学的活性断片のＧＴＰ加水分解を誘発するか否かを検出する検出工程であって、推定される調節化合物が、その不在下と比較して上記標的Ｒａｓタンパク質のＧＴＰ加水分解を誘発するとき、当該化合物が癌の予防又は治療のための化合物の候補であることを示す工程
を包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
上記宿主細胞は腫瘍細胞株である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
標的変異Ｒａｓタンパク質を発現するが、野生型Ｒａｓタンパク質を発現しない細胞におけるＧＴＰ加水分解を誘発する化合物を同定する同定工程を包含し、上記標的変異Ｒａｓタンパク質は、野生型Ｒａｓタンパク質に関する第７６位の位置のアミノ酸に変異を含む、癌を予防又は治療するための化合物を同定するための方法。
【請求項６７】
上記推定される調節化合物は、アプタマー、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス核酸分子、リボザイム、抗体若しくはその抗原結合断片、立体配座アンタゴニスト及び低分子インヒビターからなる群より選択される、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個の隣接するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質の第７６位の位置のアミノ酸を含み、かつ、当該第７６位の位置のアミノ酸は上記野生型タンパク質と比較して変異している、単離された核酸分子。
【請求項２】
上記第７６位の位置のアミノ酸は、グルタミン酸塩が、グリシン、リシン及びグルタミンからなる群より選択されるグルタミン酸塩以外のアミノ酸残基に変異したものである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
上記グルタミン酸塩以外のアミノ酸残基がグリシンである、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
上記アミノ酸配列は、配列番号３、５、７、９、１１、又は１３の第７６位におけるグルタミン酸塩のグルタミン酸塩以外のアミノ酸への置換によって、上記配列番号３、５、７、９、１１、又は１３のいずれか１つと異なっている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
上記アミノ酸配列はさらに、変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基を含み、当該アミノ酸配列は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質の第１２位、第１３位、第５９位及び第６１位からなる群より選択される位置のアミノ酸を含み、さらに、当該位置のアミノ酸は、上記野生型タンパク質と比較して変異している、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
上記アミノ酸配列はさらに、変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基を含み、当該アミノ酸配列は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質の第１２位の位置のアミノ酸を含み、さらに、当該第１２位の位置のアミノ酸は、上記野生型タンパク質と比較して変異している、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
第１２位又は第１３位の位置のアミノ酸が、グリシンからグリシン以外のアミノ酸残基に変異している、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
第１２位の位置のアミノ酸が、グリシンからグリシン以外のアミノ酸残基に変異している、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
上記グリシン以外のアミノ酸残基が、バリン、システイン、アスパラギン酸塩、アルギニン、セリン及びアラニンからなる群より選択される、請求項７又は８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
上記核酸配列は２個以上のドメインを含む融合タンパク質をコードし、上記ドメインの１個が、第７６位の位置に変異を含む変異Ｒａｓタンパク質の少なくとも５個のアミノ酸を含み、さらに他の各ドメインは免疫原からなる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
上記免疫原は腫瘍抗原である、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
上記腫瘍抗原は、野生型Ｒａｓアミノ酸配列に関連して少なくとも１個の変異を含む、Ｒａｓタンパク質又はその免疫原性フラグメントである、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
上記腫瘍抗原は、上記野生型Ｒａｓアミノ酸配列に関する第１２位又は第１３位の位置を含むＲａｓタンパク質又はその免疫原性フラグメントであり、上記第１２位又は第１３位の位置のアミノ酸は、グリシン残基からグリシン以外の残基に変異している、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
上記腫瘍抗原は、（ａ）Ｒａｓタンパク質の第８位〜第１６位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第１２位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｂ）Ｒａｓタンパク質の第９位〜第１７位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第１３位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｃ）Ｒａｓタンパク質の第５５位〜第６３位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第５９位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｄ）Ｒａｓタンパク質の第５７位〜第６５位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第６１位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｅ）Ｒａｓタンパク質の第６９位〜第７７位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７３位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｆ）Ｒａｓタンパク質の第７０位〜第７８位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７４位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｇ）Ｒａｓタンパク質の第７１位〜第７９位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７５位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；（ｈ）Ｒａｓタンパク質の第７３位〜第８１位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７７位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチド；及び（ｉ）Ｒａｓタンパク質の第７４位〜第８２位の位置のアミノ酸残基を少なくとも含み、野生型の上記Ｒａｓタンパク質に関して第７８位の位置の上記アミノ酸残基が変異したペプチドからなる群より選択される、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
上記核酸配列は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードしている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
上記核酸配列は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードしている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の上記核酸配列に完全に相補的である、単離された核酸分子。
【請求項１８】
上記核酸分子は、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む、組み換え核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組み換え核酸分子を用いてトランスフェクトした、組み換え細胞。
【請求項２１】
上記細胞が酵母である、請求項２０に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされた、単離されたタンパク質又はペプチド。
【請求項２３】
上記単離されたタンパク質又はペプチドは融合タンパク質の一部である、請求項２２に記載の単離されたタンパク質又はペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ワクチン。
【請求項２５】
請求項２２に記載のタンパク質又はペプチドを含む、ワクチン。
【請求項２６】
上記ワクチンはさらに酵母運搬体を含む、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
上記酵母運搬体は、上記タンパク質又はペプチドを組み換え的に発現する、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】
上記ワクチンはさらに樹状細胞を含み、当該樹状細胞は細胞内に上記酵母運搬体及び上記タンパク質又はペプチドを搭載している、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２９】
ａ）酵母運搬体と、
ｂ）変異Ｒａｓタンパク質又はその断片を含む融合タンパク質であって、当該タンパク質又はその断片はＫ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第７６位の位置のアミノ酸を含み、さらに当該第７６位の位置のアミノ酸は上記野生型タンパク質と比較して変異した融合タンパク質と
を含むワクチンであって、
上記融合タンパク質はＣｕｐ１プロモータによって制御されており、上記融合タンパク質は上記酵母運搬体によって発現される、ワクチン。
【請求項３０】
上記融合タンパク質はさらに第２の変異Ｒａｓタンパク質又はその断片を含み、当該第２の変異Ｒａｓタンパク質又はその断片はＫ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、さらに当該第１２位の位置のアミノ酸は上記野生型タンパク質と比較して変異している、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
上記融合タンパク質は、フレーム単位で融合した以下のタンパク質又は断片を含む、請求項２９に記載のワクチン：
ｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがシステインに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第６１位の位置のアミノ酸を含み、上記第６１位の位置のグルタミンがアルギニンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｉｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがアスパラギン酸塩に置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｖ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがバリンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｖ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがアルギニンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；及び
ｖｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第７６位の位置のアミノ酸を含み、上記第７６位の位置のグルタミン酸塩がグリシンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片。
【請求項３２】
上記融合タンパク質は、フレーム単位で融合した以下のタンパク質又は断片を含む、請求項２９に記載のワクチン：
ｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第１２位の位置のアミノ酸を含み、上記第１２位の位置のグリシンがアルギニンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片；
ｉｉ）Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型タンパク質に関して第７６位の位置のアミノ酸を含み、上記第７６位の位置のグルタミン酸塩がグリシンに置換されている、変異Ｒａｓタンパク質又はその断片。
【請求項３３】
上記融合タンパク質は配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３４】
上記融合タンパク質は配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３５】
請求項２２に記載の単離されたタンパク質又はペプチドに選択的に結合する、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３６】
請求項２２に記載の単離されたタンパク質又はペプチドに選択的に結合する、アプタマー。
【請求項３７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子によって転写されたＲＮＡ又は変異Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子によって転写されたＲＮＡ、の選択的な切断を触媒するｓｉＲＮＡであって、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型アミノ酸配列に関して少なくとも第７６位の位置の変異によって、上記野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列含む、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又は変異Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子、の不活性化を選択的に触媒するリボザイムであって、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型アミノ酸配列に関して少なくとも第７６位の位置の変異によって、上記野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列含む、リボザイム。
【請求項３９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又は変異Ｒａｓタンパク質をコードするｒａｓ遺伝子、に非常に高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ発現を抑制する、アンチセンス核酸分子であって、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型アミノ酸配列に関して少なくとも第７６位の位置の変異によって、上記野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列含む、リボザイム。
【請求項４０】
癌の予防又は治療のための組成物の調製における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２２若しくは２３に記載のタンパク質若しくはペプチドの使用。
【請求項４１】
癌の予防又は治療のための医薬の調整における、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
【請求項４２】
癌の予防又は治療のための医薬の調整における、請求項３６に記載のアプタマー、請求項２７に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３８に記載のリボザイム、又は請求項３９に記載のアンチセンス核酸分子の使用。
【請求項４３】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、請求項２４〜３４のいずれか1項に記載のワクチンを投与する工程を包含する、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４４】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、請求項３６に記載のアプタマー、請求項２７に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３８に記載のリボザイム、又は請求項３９に記載のアンチセンス核酸分子を投与する工程を包含する、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４５】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、変異Ｒａｓタンパク質の発現を抑制する化合物を投与する工程を包含し、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型のアミノ酸配列に関して第７６位において少なくとも変異することによって、上記野生型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４６】
癌を有する又は癌が進行する危険性のある動物に、変異Ｒａｓタンパク質のＧＴＰ加水分解を先導する又は誘発する化合物を投与する工程を包含し、上記変異Ｒａｓタンパク質は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ又はＨ−ｒａｓの野生型のアミノ酸配列に関して第７６位において少なくとも変異することによって、上記野生型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、癌を予防又は治療する方法。
【請求項４７】
診断する患者からの試験サンプルにおけるＲａｓタンパク質の発現若しくは活性、又は上記Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列を検出する検出工程を包含し、上記Ｒａｓタンパク質は野生型の上記Ｒａｓのアミノ酸配列に関して第７６位の位置に変異を含み、
上記試験サンプル中における上記変異Ｒａｓタンパク質又は上記Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列の検出が、試験サンプル中における癌細胞の存在又はその可能性を示す、腫瘍の診断のための方法。
【請求項４８】
上記Ｒａｓタンパク質は、野生型タンパク質の第７６位におけるグルタミン酸塩のグリシンへの置換を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒａｓタンパク質が、野生型Ｒａｓアミノ酸配列に関して第１２位の位置にも変異を有するか否かを検出する検出工程をさらに包含し、第７６位及び第１２位の位置の変異の検出が、試験サンプル中における腫瘍細胞の存在又はその可能性を示し、さらに、これらの位置の１個のみが変異した又はいずれも変異していないＲａｓタンパク質が潜む腫瘍細胞と比較して、上記患者においてより悪性の腫瘍であることを示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
上記検出工程は、上記試験サンプル中における、Ｒａｓ変異をコードする核酸配列の検出を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
上記検出工程は、変異をコードするゲノムＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅、又は変異をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ増幅を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記検出工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、配列分析、遺伝子マイクロアレイ分析、及びレポーター遺伝子の検出からなる群より選択される方法により行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
上記試験サンプルから単離された核酸配列を、上記変異Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列に選択的に結合するプライマー又はプローブに接触させ、かつ上記変異Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列が上記プライマー又はプローブに結合するか否かを検出することによって、上記変異Ｒａｓタンパク質をコードする核酸配列のレベルを決定する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
上記試験サンプルを、上記変異Ｒａｓタンパク質に特異的に選択的に結合する抗体若しくはその断片又はアプタマーに接触させ、かつ上記抗体若しくはその断片又は上記アプタマーが変異Ｒａｓタンパク質に結合するか否かを検出することによって、上記変異Ｒａｓタンパク質のレベルを決定する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
上記試験サンプルは、癌を診断する患者からのものであり、上記試験サンプルをネガティブコントロールサンプルと比較する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
上記試験サンプルを基板上に固定している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
患者において癌を診断するために用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
患者において癌の予後を決定するために用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
治療上の処置のための患者の感受性の決定するために用いられる、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
標的Ｒａｓタンパク質又は標的Ｒａｓタンパク質をコードする核酸分子の阻害物質を同定する同定工程を包含し、上記標的Ｒａｓタンパク質は、野生型Ｒａｓタンパク質に関連する第７６位の位置のアミノ酸に変異を含む、癌を予防又は治療するための化合物を同定するための方法。
【請求項６１】
上記変異は、野生型の上記タンパク質における第７６位のグルタミン酸塩の、グリシン、リシン及びグルタミンからなる群より選択されるグルタミン酸塩以外のアミノ酸への置換である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
上記同定工程は、上記標的Ｒａｓタンパク質の発現又は活性の阻害物質の同定を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
上記工程は、推定される調節化合物の存在下おける、上記標的Ｒａｓタンパク質の翻訳又は活性の検出、及び推定される調節化合物の存在下における、上記標的Ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子の発現の検出から選択される検出をする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ａ）宿主細胞を推定される調節化合物に接触させる接触工程であって、上記宿主細胞が上記標的Ｒａｓタンパク質又はその生物学的活性断片を発現している工程、及び
ｂ）上記推定される調節化合物が上記標的Ｒａｓタンパク質又はその生物学的活性断片のＧＴＰ加水分解を誘発するか否かを検出する検出工程であって、推定される調節化合物が、その不在下と比較して上記標的Ｒａｓタンパク質のＧＴＰ加水分解を誘発するとき、当該化合物が癌の予防又は治療のための化合物の候補であることを示す工程
を包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
上記宿主細胞は腫瘍細胞株である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
標的変異Ｒａｓタンパク質を発現するが、野生型Ｒａｓタンパク質を発現しない細胞におけるＧＴＰ加水分解を誘発する化合物を同定する同定工程を包含し、上記標的変異Ｒａｓタンパク質は、野生型Ｒａｓタンパク質に関する第７６位の位置のアミノ酸に変異を含む、癌を予防又は治療するための化合物を同定するための方法。
【請求項６７】
上記推定される調節化合物は、アプタマー、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス核酸分子、リボザイム、抗体若しくはその抗原結合断片、立体配座アンタゴニスト及び低分子インヒビターからなる群より選択される、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５３１０６８（Ｐ２００９−５３１０６８Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０３１２６（Ｐ２００９−５０３１２６）
【出願日】平成１９年３月９日（２００７．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３３８３５
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５０５２２６４３７）グローブイミューン，インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月９日（２００７．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３３８３５
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５０５２２６４３７）グローブイミューン，インコーポレイテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
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