Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質を含有する抗菌剤
【課題】抗菌活性が高く、種々の細菌に効果を有する、安全な抗菌剤を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。前記α１−酸性糖タンパク質は、α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である。また、前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質は糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されている。本発明は、また、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。前記α１−酸性糖タンパク質は、α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である。また、前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質は糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されている。本発明は、また、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質を有効成分として含有する抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
α１−酸性糖タンパク質は、１８３個のアミノ酸と５本の糖鎖からなる分子量約４４ｋＤａのオロソムコイドとも呼ばれる血清タンパク質である。α１−酸性糖タンパク質の糖鎖含量は分子量の４５％と他のタンパク質の中でも極めて高く、その糖鎖末端にシアル酸残基を有しているために、血清中で最も負に帯電している（ｐＩ値：２．７）。α１−酸性糖タンパク質の血清中濃度は、健常時において０．５〜１．０ｇ／Ｌであるが、感染症、炎症時などに血液および組織中で約２〜４倍に増加し、主に抗炎症および免疫調節分子として機能していると考えられている。しかしながら、その詳細な作用機序については未だ不明な点が残されている。また、このα１−酸性糖タンパク質は「Ｆ１＊Ｓ体」と「Ａ体」という二つのバリアントが生体内に約２〜３：１の割合で存在する。「Ｆ１＊Ｓ体」と「Ａ体」のアミノ酸配列の違いの一つに、Ａ体のみが持つ１４９番目の遊離型システイン（Ｃｙｓ−１４９）残基がある。しかし、その機能的差異に関する報告はリガンド結合能に関するものにとどまっている。
【０００３】
一酸化窒素（ＮＯ）は、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−)となり殺菌作用を示すが、その一方で、一電子酸化されてＮＯ＋となると、グルタチオン（ＧＳＨ）などの低分子やタンパク質のシステイン残基と反応し、化学的に安定なＳ−ニトロソチオール（ＲＳ−ＮＯ）へと変換される。これまでに本発明者らは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのＳ−ニトロソ化体（ＳＮＯ−ＨＳＡ）が、ＮＯ自身や低分子のＲＳ−ＮＯであるＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳ−ＮＯ）と比較して数百倍強力な抗菌活性を示すことをすでに明らかにしている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２０６５７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗菌活性が高く、種々の細菌に効果を有する、安全な抗菌剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【０００７】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である。
【０００８】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体が、１４９位のシステイン残基がニトロソ化されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である。
【０００９】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質である。
【００１０】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質である。
【００１１】
本発明は、また、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体である。
【００１２】
１つの実施形態は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体から、ノイラミニダーゼによってシアル酸が除去されて得られる、上記糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体である。
【００１３】
１つの実施形態では、上記糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体は、１４９位のシステイン残基がＳ−ニトロソ化されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗菌剤は、有効成分であるＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が細菌内へ一酸化窒素（ＮＯ）を効率よく輸送することにより強い抗菌活性を有する。生体内物質であることより安全な薬剤を提供できる。本発明のＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質は、Ｓ−ニトロソ基が凍結乾燥後も安定に存在することから、凍結乾燥による保存が可能である。また、本発明のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質は、特に強い抗菌活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の製造方法を示す工程図である。
【図２】ＨＰＬＣによるＳ−ニトロソ化タンパク質のＮＯ付加率定量法の説明図である。
【図３】α１−酸性糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖の構造を示す図である。
【図４】Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の抗菌活性を示すグラフである。
【図５】Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の抗菌活性を示すグラフである。
【図６】Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の抗菌活性を示すグラフである。
【図７】各種Ｓ−ニトロソ化タンパク質から細菌内へのＮＯ輸送効率を示すグラフである。
【図８】ＮＯ検出プローブであるＤＡＦ−ＦＭの蛍光強度と大腸菌の増殖率の関係を示すグラフである。
【図９】大腸菌の菌体表面の修飾方法と修飾による菌体内へのＮＯ輸送量測定方法を示す図である。
【図１０】大腸菌の菌体表面の修飾による菌体内へのＮＯ輸送量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗菌剤は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する。
【００１７】
上記α１−酸性糖タンパク質（以下、ＡＧＰともいう。）は、その由来については特に限定されない。例えば、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ブタ、マウス由来ＡＧＰが挙げられる。好ましくは、ヒト由来のＡＧＰである。ヒト由来のＡＧＰは、１８３個のアミノ酸残基と５本の糖鎖からなる分子量４４１００の血清タンパク質である。ヒト由来ＡＧＰは２つのバリアント（Ａ体とＦ１＊Ｓ体）が存在し、ＡＧＰバリアントＡ体（以下、ＡＧＰ・Ａ体ともいう。）のアミノ酸配列は配列番号１で示され、バリアントＦ１＊Ｓ体のアミノ酸配列は配列番号２で示される。本発明では、好適にはＡＧＰ・Ａ体が用いられる。ＡＧＰは、血漿から公知の方法により得ることができ、また、遺伝子組換え技術を用いて常法により得ることができる。
配列番号１:QIPLCANLVPVPITNATLDRITGKWFYIASAFRNEEYNKSVQEIQATFFYFTPNKTEDTIFLREYQTRQNQCFYNSSYLNVQRENGTVSRYEGGREHVAHLLFLRDTKTLMFGSYLDDEKNWGLSFYADKPETTKEQLGEFYEALDCLCIPRSDVMYTDWKKDKCEPLEKQHEKERKQEEGES
配列番号２:QIPLCANLVPVPITNATLDQITGKWFYIASAFRNEEYNKSVQEIQATFFYFTPNKTEDTIFLREYQTRQDQCIYNTTYLNVQRENGTISRYVGGQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLSVYADKPETTKEQLGEFYEALDCLRIPKSDVVYTDWKKDKCEPLEKQHEKERKQEEGES
【００１８】
Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰの変異体とは、Ｓ−ニトロソ化されたＡＧＰ変異体である。ＡＧＰ変異体とはアミノ酸残基が置換、欠失、挿入されたＡＧＰであって、ＡＧＰと同様の活性を有する限り、特に限定されるものではない。好適には、ＡＧＰの少なくとも１つのアミノ酸残基がシステインに置換された変異体、または少なくとも１つのシステインが挿入された変異体である。１〜３のシステインが置換または挿入された変異体が好適である。変異体は遺伝子組換え技術を用いて常法により得ることができる。
【００１９】
本発明のＳ−ニトロソ化ＡＧＰまたはその変異体とは、ＡＧＰまたはその変異体の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基にＳ−ニトロソ基（−ＮＯ）が付加され−ＳＮＯとなったＡＧＰまたはその変異体である。システイン残基は天然由来のシステイン残基であっても、挿入または置換されたシステイン残基であってもよい。好適には、ＡＧＰ・Ａ体が有する１４９位のシステイン残基がニトロソ化されたＳ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体が挙げられる。
【００２０】
Ｓ−ニトロソ化は亜硝酸塩と反応させる等の公知の方法によって達成することができる。しかし、ヘモグロビンのようにタンパク質のＳ−ニトロソ化に成功している例もあるが、一般的には、タンパク質にとってＳ−ニトロソ化は厳しい条件での反応である。したがって、より穏和な条件でのチオール基へのＮＯの導入が可能な方法を用いることが好ましく、イソアミルナイトライトを用いた方法（De Master E.G. et al., Biochemistry, 34, p.11494-11499, 1995）やｎ−ブチルナイトライトと反応させる方法（Meyer D.J. et al., FEBS Letters, 345, p.177-180, 1994）を好適に使用することができる。
【００２１】
ＡＧＰまたはその変異体には複数本の糖鎖が付加されており、その糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸を除去することにより、シアル酸が除去されているＡＧＰまたはＡＧＰ変異体が得られる。シアル酸の除去によりガラクトース残基が新たに糖鎖の非還元末端に現われる。複数のシアル酸が除去されることによりα１−酸性糖タンパク質の等電点は上昇し、分子量は減少する。
【００２２】
アシアロα１−酸性糖タンパク質とは、α１−酸性糖タンパク質からシアル酸が95％以上除去されているものであり、好ましくは、すべてのシアル酸が除去されているものである。例えば、α１−酸性糖タンパク質から１４個のシアル酸、１５個のシアル酸が除去されているα１−酸性糖タンパク質が挙げられる。シアル酸が除かれると、代わりに同じ数のガラクトース残基が新たに糖鎖の非還元末端に現われる。
【００２３】
ＡＧＰ・Ａ体には５本の糖鎖が付加されている。具体的には、１５位、３８位、５４位、７５位、８５位の各アスパラギンに糖鎖が付加されている。これら糖鎖は分岐しておりその末端にはシアル酸が存在する。その少なくとも１個のシアル酸を除去することにより、シアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体を得ることができる。５個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは糖鎖末端に存在するシアル酸すべてが除去されているＡＧＰ・Ａ体またはその変異体が好ましい。例えば、１４個または１５個のシアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体が挙げられる。糖鎖末端に存在するシアル酸の９５％以上のシアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体はアシアロＡＧＰ・Ａ体である。
【００２４】
糖鎖の末端のシアル酸の除去方法は限定されない。例えば、酵素による除去などが挙げられる。好適には酵素によって除去される。酵素としては、例えばノイラミニダーゼが挙げられる。
【００２５】
本発明の抗菌剤は、細菌内に一酸化窒素を効率的に輸送することができる。一酸化窒素輸送メカニズムには、Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰから菌体表面のチオール基へのＳ−ニトロソ転移反応が関与すると考えられる。よって、本発明の抗菌剤は、種々の細菌に対して優れた抗菌性を有し、グラム陽性菌感染症、グラム陰性菌感染症など種々の細菌の感染症の治療薬として極めて有用なものである。感染症としては、例えば、レンサ球菌（Ａ群β溶連菌、肺炎球菌など）、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌（０１５７：Ｈ７など）、クレブシエラ（肺炎桿菌）、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クラミジア、クロストリジウムなどによる各種感染症、結核、コレラ、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、トラコーマ、梅毒、破傷風、ハンセン病、レジオネラ、レプトスピラ、ライム病、野兎病、Ｑ熱などが挙げられる。
【００２６】
本発明の抗菌剤は、注射用剤、外用剤、経口剤などの製剤とすることができる。他の抗菌剤と組み合わせて用いることもできる。注射剤の場合は、常法により液剤、凍結乾燥製剤にすることができ、スクロースなどの安定化剤などを含むことができる。
【００２７】
本発明の抗菌剤に含有される有効成分の量、即ち、抗菌活性を有する投与量は、予防または疾患の過程と状態に対して所望の治療効果を発揮するのに充分な量とすべきであり、患者に対する投与量は、処置すべき個々の患者の年齢、および感染症の程度等の条件によって変化するが、一般的には１日あたりの有効成分の投与量１ｍｇ〜１０ｇが、１日に１〜４回予防または治療のために投与される。
【００２８】
本発明は、また、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体（以下シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体ともいう。）またはその変異体に関する。
【００２９】
シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体とは、ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体の糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去され、かつ、少なくとも１つのシステイン残基のチオール基がＳ−ニトロソ化されているＡＧＰ・Ａ体またはその変異体である。
【００３０】
上述したように、ＡＧＰ・Ａ体は１８３個のアミノ酸残基と５本の糖鎖からなる分子量４４１００の血清タンパク質である。ＡＧＰ・Ａ体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているとは、ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体の１５位、３８位、５４位、７５位、８５位の各アスパラギン残基に付加されている糖鎖の末端のシアル酸が少なくとも１個除去されていることであり、好ましくは、５個以上、より好ましくは１０個以上除去されており、さらに好ましくは糖鎖末端に存在するシアル酸の９５％以上が除去されている。例えば、１４個または１５個のシアル酸が除去されている。
【００３２】
Ｓ−ニトロソ化されるとは、ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体の少なくとも１個のシステイン残基のチオール基にＳ−ニトロソ基（−ＮＯ）が付加され−ＳＮＯにされることである。Ｓ−ニトロソ化は、シアル酸の除去前であっても、シアル酸の除去後であってもよい。好ましくは、１４９位のシステインのチオール基がＳ−ニトロソ化される。
【００３３】
ＡＧＰ・Ａ体の変異体とはアミノ酸残基が置換、欠失、挿入されたＡＧＰ・Ａ体である。該アミノ酸残基の置換、欠失、挿入の位置、アミノ酸残基数などは、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体の変異体が、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体と同様の強い抗菌活性を有する限り、特に限定されるものではない。
【００３４】
ＡＧＰ・Ａ体の取得方法、糖鎖末端のシアル酸の除去方法、Ｓ−ニトロソ化方法については、上述した方法と同様の方法を用いることができる。
【００３５】
１つの実施形態では、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、Ｓ−ニトロソ化されたＡＧＰ・Ａ体またはその変異体から、ノイラミニダーゼによってシアル酸が除去されて得られる。他の実施形態では、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、ノイラミニダーゼによって少なくとも１個のシアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体またはその変異体をＳ−ニトロソ化して得られる。ＡＧＰ・Ａ体１〜１００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇをノイラミニダーゼ０．０５〜０．５単位、好ましくは０．２単位と混合し、３７℃にて２〜４８時間、好ましくは２４時間反応させて得られるシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体が好適である。
【００３６】
本発明の好ましいシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体は、１４９位のシステイン残基がＳ−ニトロソ化されたシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体である。また、シアル酸が９５％以上除去されているＳ−ニトロソ化アシアロＡＧＦ・Ａ体である。さらに好ましいシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体は、１４９位のシステイン残基がＳ−ニトロソ化されているＳ−ニトロソ化アシアロＡＧＦ・Ａ体であり、その分子量は約４０，０００である。
【００３７】
本発明のシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、強い抗菌作用を示す。本物質は、細菌内に一酸化窒素を効率的に輸送することができる。一酸化窒素輸送メカニズムには、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体から菌体表面のチオール基へのＳ−ニトロソ転移反応が関与すると考えられる。よって、本発明のシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体は、種々の細菌に対して優れた抗菌性を有し、グラム陽性菌感染症、グラム陰性菌感染症など種々の細菌の感染症の治療薬として極めて有用である。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
ヒト血清から分離精製したＡＧＰ分画は、一般財団法人 化学及血清療法研究所より恵与されたもの、あるいは購入したヒト血清由来のＡＧＰ（Ｇ９８８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。ＡＧＰバリアントそれぞれの分離精製方法は、Ｈｅｒｖｅらの方法に従って行った。すなわち、ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｇｅｌ（１８−８７６９−０１、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）５０ｍＬをイオン交換水で洗浄後、０．２Ｍ ＣｕＣｌ２水溶液を流し、Ｃｕ２＋イオンをキレートした。次に、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を流すことにより過剰なＣｕ２＋イオンを除去した。その後、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．５Ｍ ＮａＣｌの移動相を流速０．４ｍＬ／分で流して安定化し、２０ｍｇのＡＧＰを１ｍＬの移動相に溶解したサンプルをカラムに添加した。添加後、約１．５時間に保持されずに溶出するＦ１＊Ｓ体を分取した。次いで、イミダゾール（最終濃度２０ｍＭ）を加えた移動相を流し、約５時間後に溶出されるＡ体を分取した。分取した各バリアントをイオン交換水にて透析後、凍結乾燥した。さらに、Ｆ１＊Ｓ体およびＡ体の回収率より、ＡＧＰバリアント比を算出した。
【００４０】
得られたＡＧＰ・Ａ体に３倍モル量の１，４−ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（以下、ＤＴＴ）（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加、混合し、ＡＧＰ・Ａ体中に存在する遊離型Ｃｙｓ残基のＳＨ基の還元を行った。これをゲル濾過し、ろ液にその１０倍量のＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳ−ＮＯ）（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ ＤＴＰＡ）を添加、混合し、３７℃にてＳ−ニトロソ化反応を行った。混合物をゲル濾過し、ろ液にＳ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体（以下、ＳＮＯ−ＡＧＰという。）を得た（図１）。
【００４１】
ＳＮＯ−ＡＧＰのＳ−ニトロソ化部位をＨＰＬＣ ｆｌｏｗ ｒｅａｃｔｏｒシステムにより分析した。まず、血漿から精製したＡＧＰバリアントＦ１＊Ｓ体を上記と同様にＳ−ニトロソ化した。また、ＡＧＰバリアントＡ体の１４９位のシステインをＮｉｓｈｉら（Nishi K, et al.，Drug Metab Pharmacokinet，25，200-207，2010）の方法によりアルギニンに変異させたＣ１４９Ｒを得た。得られたＣ１４９Ｒを上記と同様にＳ−ニトロソ化した。そして、それぞれのＮＯ付加率の定量を、Ａｋａｉｋｅら（T. Akaike, et al., J. Biochemistry, 122, 459-466, 1997）の方法により行った。すなわち、図２に示すＨＰＬＣ ｆｌｏｗ ｒｅａｃｔｏｒシステムにおいて、上記ＳＮＯ−ＡＧＰ、Ｆ１＊Ｓ体およびＣ１４９ＲにＨｇ２＋を反応させて生成するＮＯ２−とＧｒｉｅｓｓ試薬との反応生成物であるアゾ色素を５４０ｎｍで測定することにより、各種Ｓ−ニトロソ化タンパク質を分離・定量した。各タンパク質のＮＯ付加率を表１に示す。表１の結果から、ＳＮＯ−ＡＧＰの１４９位のシステインがＳ−ニトロソ化されていることが確認された。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（実施例２）
実施例１で得られたＡＧＰ・Ａ体２０ｍｇにノイラミニダーゼ０．２単位を添加、混合し、３７℃にて２４時間反応させ、糖鎖末端のシアル酸が９５％以上除去されたアシアロＡＧＰ・Ａ体を得た。得られたアシアロＡＧＰ・Ａ体を実施例１に従いＳ−ニトロソ化してＳ−ニトロソ化アシアロＡＧＰ・Ａ体（以下、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰという。）を得た（図３）。得られたＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰは、９５％以上のシアル酸が除去されており、分子量は約４０，０００であった。
【００４４】
(実施例３)
実施例１のゲル濾過で得られたＳＮＯ−ＡＧＰ溶液を常法により凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を得た。また、液状におけるＳＮＯ−ＡＧＰのｐＨ７およびｐＨ５での安定性を評価したところ、ｐＨ７では半減期１３日であり、ｐＨ５では、半減期が２４日であり、非常に安定であることが確認された。
【００４５】
(実施例４)
実施例２で得られたＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰ溶液を常法により凍結乾燥して凍結乾燥製剤を得た。
【００４６】
（比較例１）
Ｓ−ニトロソ化ヒト血清アルブミン（以下、ＳＮＯ−ＨＳＡという。）を特開２００５−２０６５７７号公報に記載の方法によって得た。
【００４７】
（試験例１）
グラム陰性菌である、大腸菌（E. coli）、ネズミチフス菌（S. typhimurium LT2）、緑膿菌（P. aeruginosa）、およびグラム陽性菌である、枯草菌（B. subtilis）、化膿性溶血性連鎖球菌（S. pyogenes）を用いて、ＳＮＯ−ＡＧＰの抗菌活性を調べた。
【００４８】
各菌株を、２０重量％のグルコースを添加した Ｍ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ６４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ ５ｇ／Ｌ）で、１晩培養し、Ｍ９で３回洗浄し、Ｍ９培地中で、菌数をＯＤ６３０＝０．０５±０．０１に調整した。この培地に実施例１で得られたＳＮＯ−ＡＧＰ、比較例で得られたＳＮＯ−ＨＳＡ、コントロールとしてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加し、３７℃にて９時間静置後、ＯＤ６３０を測定した。この値をコントロール群と比較することで増殖率を算出した。
【００４９】
【数１】
【００５０】
ＳＮＯ−ＡＧＰとＳＮＯ−ＨＳＡの大腸菌に対する増殖阻害率を図４に示す。また、種々の細菌に対する５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を表２および図５に示す。図５より明らかなようにＳＮＯ−ＡＧＰは極めて低濃度で菌の増殖を阻害した。ＳＮＯ−ＡＧＰの抗菌活性は既知のＳ−ニトロソ化タンパク質の中では最も強力であった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
（試験例２）
ＳＮＯ−ＡＧＰに代えて実施例２で得られたＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰを用いた以外は試験例１と同様に試験した。結果を図６に示す。５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）はＳＮＯ−ＡＧＰで６５ｎＭであり、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰで８００ｐＭであった。ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰはＳＮＯ−ＡＧＰの８０倍の抗菌活性を有し、さらに極めて低い濃度で菌の増殖を阻害し、非常に高い抗菌活性を有することが明らかとなった。
【００５３】
（試験例３）
ＳＮＯ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰおよびＳＮＯ−ＨＳＡから細菌内へのＮＯ輸送効率について検討した。
【００５４】
大腸菌培養液にＳＮＯ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ＨＳＡを各々添加し、３７℃にて７時間大腸菌を培養した。細胞内ＮＯ検出プローブであるＤｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＦＭ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ）を添加してさらに１時間培養した後、励起波長：４８５ｎｍ、測定波長：５３５ｎｍで大腸菌体内のＮＯ量の指標となる蛍光を測定した。結果を図７および図８に示す。ＳＮＯ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰおよびＳＮＯ−ＨＳＡの抗菌活性は、細菌内へのＮＯ輸送能に依存していた。
【００５５】
（試験例４）
ＳＮＯ−ＡＧＰから細菌へのＮＯ輸送機構について検討した。大腸菌の菌体表面チオール基をＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で修飾して、菌体内へのＮＯの取込み量に変化が生じるかを検討した。方法を図９に示す。結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ＮＥＭで菌体表面のチオール基が修飾された大腸菌ではＮＯの菌体内輸送が阻害された。よって、ＳＮＯ−ＡＧＰのＮＯ輸送機構には、ＳＮＯ−ＡＧＰから菌体表面のチオール基へのＳ−ニトロソ転移反応が関与することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の抗菌剤および本発明のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、抗菌活性が非常に高く、抗菌スペクトルも広いことより、種々の感染症の治療薬として医療分野に貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質を有効成分として含有する抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
α１−酸性糖タンパク質は、１８３個のアミノ酸と５本の糖鎖からなる分子量約４４ｋＤａのオロソムコイドとも呼ばれる血清タンパク質である。α１−酸性糖タンパク質の糖鎖含量は分子量の４５％と他のタンパク質の中でも極めて高く、その糖鎖末端にシアル酸残基を有しているために、血清中で最も負に帯電している（ｐＩ値：２．７）。α１−酸性糖タンパク質の血清中濃度は、健常時において０．５〜１．０ｇ／Ｌであるが、感染症、炎症時などに血液および組織中で約２〜４倍に増加し、主に抗炎症および免疫調節分子として機能していると考えられている。しかしながら、その詳細な作用機序については未だ不明な点が残されている。また、このα１−酸性糖タンパク質は「Ｆ１＊Ｓ体」と「Ａ体」という二つのバリアントが生体内に約２〜３：１の割合で存在する。「Ｆ１＊Ｓ体」と「Ａ体」のアミノ酸配列の違いの一つに、Ａ体のみが持つ１４９番目の遊離型システイン（Ｃｙｓ−１４９）残基がある。しかし、その機能的差異に関する報告はリガンド結合能に関するものにとどまっている。
【０００３】
一酸化窒素（ＮＯ）は、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−)となり殺菌作用を示すが、その一方で、一電子酸化されてＮＯ＋となると、グルタチオン（ＧＳＨ）などの低分子やタンパク質のシステイン残基と反応し、化学的に安定なＳ−ニトロソチオール（ＲＳ−ＮＯ）へと変換される。これまでに本発明者らは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのＳ−ニトロソ化体（ＳＮＯ−ＨＳＡ）が、ＮＯ自身や低分子のＲＳ−ＮＯであるＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳ−ＮＯ）と比較して数百倍強力な抗菌活性を示すことをすでに明らかにしている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２０６５７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗菌活性が高く、種々の細菌に効果を有する、安全な抗菌剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【０００７】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である。
【０００８】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体が、１４９位のシステイン残基がニトロソ化されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である。
【０００９】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質である。
【００１０】
１つの実施形態では、上記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質である。
【００１１】
本発明は、また、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体である。
【００１２】
１つの実施形態は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体から、ノイラミニダーゼによってシアル酸が除去されて得られる、上記糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体である。
【００１３】
１つの実施形態では、上記糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体は、１４９位のシステイン残基がＳ−ニトロソ化されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗菌剤は、有効成分であるＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が細菌内へ一酸化窒素（ＮＯ）を効率よく輸送することにより強い抗菌活性を有する。生体内物質であることより安全な薬剤を提供できる。本発明のＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質は、Ｓ−ニトロソ基が凍結乾燥後も安定に存在することから、凍結乾燥による保存が可能である。また、本発明のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質は、特に強い抗菌活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の製造方法を示す工程図である。
【図２】ＨＰＬＣによるＳ−ニトロソ化タンパク質のＮＯ付加率定量法の説明図である。
【図３】α１−酸性糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖の構造を示す図である。
【図４】Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の抗菌活性を示すグラフである。
【図５】Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の抗菌活性を示すグラフである。
【図６】Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体の抗菌活性を示すグラフである。
【図７】各種Ｓ−ニトロソ化タンパク質から細菌内へのＮＯ輸送効率を示すグラフである。
【図８】ＮＯ検出プローブであるＤＡＦ−ＦＭの蛍光強度と大腸菌の増殖率の関係を示すグラフである。
【図９】大腸菌の菌体表面の修飾方法と修飾による菌体内へのＮＯ輸送量測定方法を示す図である。
【図１０】大腸菌の菌体表面の修飾による菌体内へのＮＯ輸送量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗菌剤は、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する。
【００１７】
上記α１−酸性糖タンパク質（以下、ＡＧＰともいう。）は、その由来については特に限定されない。例えば、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ブタ、マウス由来ＡＧＰが挙げられる。好ましくは、ヒト由来のＡＧＰである。ヒト由来のＡＧＰは、１８３個のアミノ酸残基と５本の糖鎖からなる分子量４４１００の血清タンパク質である。ヒト由来ＡＧＰは２つのバリアント（Ａ体とＦ１＊Ｓ体）が存在し、ＡＧＰバリアントＡ体（以下、ＡＧＰ・Ａ体ともいう。）のアミノ酸配列は配列番号１で示され、バリアントＦ１＊Ｓ体のアミノ酸配列は配列番号２で示される。本発明では、好適にはＡＧＰ・Ａ体が用いられる。ＡＧＰは、血漿から公知の方法により得ることができ、また、遺伝子組換え技術を用いて常法により得ることができる。
配列番号１:QIPLCANLVPVPITNATLDRITGKWFYIASAFRNEEYNKSVQEIQATFFYFTPNKTEDTIFLREYQTRQNQCFYNSSYLNVQRENGTVSRYEGGREHVAHLLFLRDTKTLMFGSYLDDEKNWGLSFYADKPETTKEQLGEFYEALDCLCIPRSDVMYTDWKKDKCEPLEKQHEKERKQEEGES
配列番号２:QIPLCANLVPVPITNATLDQITGKWFYIASAFRNEEYNKSVQEIQATFFYFTPNKTEDTIFLREYQTRQDQCIYNTTYLNVQRENGTISRYVGGQEHFAHLLILRDTKTYMLAFDVNDEKNWGLSVYADKPETTKEQLGEFYEALDCLRIPKSDVVYTDWKKDKCEPLEKQHEKERKQEEGES
【００１８】
Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰの変異体とは、Ｓ−ニトロソ化されたＡＧＰ変異体である。ＡＧＰ変異体とはアミノ酸残基が置換、欠失、挿入されたＡＧＰであって、ＡＧＰと同様の活性を有する限り、特に限定されるものではない。好適には、ＡＧＰの少なくとも１つのアミノ酸残基がシステインに置換された変異体、または少なくとも１つのシステインが挿入された変異体である。１〜３のシステインが置換または挿入された変異体が好適である。変異体は遺伝子組換え技術を用いて常法により得ることができる。
【００１９】
本発明のＳ−ニトロソ化ＡＧＰまたはその変異体とは、ＡＧＰまたはその変異体の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基にＳ−ニトロソ基（−ＮＯ）が付加され−ＳＮＯとなったＡＧＰまたはその変異体である。システイン残基は天然由来のシステイン残基であっても、挿入または置換されたシステイン残基であってもよい。好適には、ＡＧＰ・Ａ体が有する１４９位のシステイン残基がニトロソ化されたＳ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体が挙げられる。
【００２０】
Ｓ−ニトロソ化は亜硝酸塩と反応させる等の公知の方法によって達成することができる。しかし、ヘモグロビンのようにタンパク質のＳ−ニトロソ化に成功している例もあるが、一般的には、タンパク質にとってＳ−ニトロソ化は厳しい条件での反応である。したがって、より穏和な条件でのチオール基へのＮＯの導入が可能な方法を用いることが好ましく、イソアミルナイトライトを用いた方法（De Master E.G. et al., Biochemistry, 34, p.11494-11499, 1995）やｎ−ブチルナイトライトと反応させる方法（Meyer D.J. et al., FEBS Letters, 345, p.177-180, 1994）を好適に使用することができる。
【００２１】
ＡＧＰまたはその変異体には複数本の糖鎖が付加されており、その糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸を除去することにより、シアル酸が除去されているＡＧＰまたはＡＧＰ変異体が得られる。シアル酸の除去によりガラクトース残基が新たに糖鎖の非還元末端に現われる。複数のシアル酸が除去されることによりα１−酸性糖タンパク質の等電点は上昇し、分子量は減少する。
【００２２】
アシアロα１−酸性糖タンパク質とは、α１−酸性糖タンパク質からシアル酸が95％以上除去されているものであり、好ましくは、すべてのシアル酸が除去されているものである。例えば、α１−酸性糖タンパク質から１４個のシアル酸、１５個のシアル酸が除去されているα１−酸性糖タンパク質が挙げられる。シアル酸が除かれると、代わりに同じ数のガラクトース残基が新たに糖鎖の非還元末端に現われる。
【００２３】
ＡＧＰ・Ａ体には５本の糖鎖が付加されている。具体的には、１５位、３８位、５４位、７５位、８５位の各アスパラギンに糖鎖が付加されている。これら糖鎖は分岐しておりその末端にはシアル酸が存在する。その少なくとも１個のシアル酸を除去することにより、シアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体を得ることができる。５個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは糖鎖末端に存在するシアル酸すべてが除去されているＡＧＰ・Ａ体またはその変異体が好ましい。例えば、１４個または１５個のシアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体が挙げられる。糖鎖末端に存在するシアル酸の９５％以上のシアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体はアシアロＡＧＰ・Ａ体である。
【００２４】
糖鎖の末端のシアル酸の除去方法は限定されない。例えば、酵素による除去などが挙げられる。好適には酵素によって除去される。酵素としては、例えばノイラミニダーゼが挙げられる。
【００２５】
本発明の抗菌剤は、細菌内に一酸化窒素を効率的に輸送することができる。一酸化窒素輸送メカニズムには、Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰから菌体表面のチオール基へのＳ−ニトロソ転移反応が関与すると考えられる。よって、本発明の抗菌剤は、種々の細菌に対して優れた抗菌性を有し、グラム陽性菌感染症、グラム陰性菌感染症など種々の細菌の感染症の治療薬として極めて有用なものである。感染症としては、例えば、レンサ球菌（Ａ群β溶連菌、肺炎球菌など）、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌（０１５７：Ｈ７など）、クレブシエラ（肺炎桿菌）、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クラミジア、クロストリジウムなどによる各種感染症、結核、コレラ、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、トラコーマ、梅毒、破傷風、ハンセン病、レジオネラ、レプトスピラ、ライム病、野兎病、Ｑ熱などが挙げられる。
【００２６】
本発明の抗菌剤は、注射用剤、外用剤、経口剤などの製剤とすることができる。他の抗菌剤と組み合わせて用いることもできる。注射剤の場合は、常法により液剤、凍結乾燥製剤にすることができ、スクロースなどの安定化剤などを含むことができる。
【００２７】
本発明の抗菌剤に含有される有効成分の量、即ち、抗菌活性を有する投与量は、予防または疾患の過程と状態に対して所望の治療効果を発揮するのに充分な量とすべきであり、患者に対する投与量は、処置すべき個々の患者の年齢、および感染症の程度等の条件によって変化するが、一般的には１日あたりの有効成分の投与量１ｍｇ〜１０ｇが、１日に１〜４回予防または治療のために投与される。
【００２８】
本発明は、また、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体（以下シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体ともいう。）またはその変異体に関する。
【００２９】
シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体とは、ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体の糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去され、かつ、少なくとも１つのシステイン残基のチオール基がＳ−ニトロソ化されているＡＧＰ・Ａ体またはその変異体である。
【００３０】
上述したように、ＡＧＰ・Ａ体は１８３個のアミノ酸残基と５本の糖鎖からなる分子量４４１００の血清タンパク質である。ＡＧＰ・Ａ体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているとは、ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体の１５位、３８位、５４位、７５位、８５位の各アスパラギン残基に付加されている糖鎖の末端のシアル酸が少なくとも１個除去されていることであり、好ましくは、５個以上、より好ましくは１０個以上除去されており、さらに好ましくは糖鎖末端に存在するシアル酸の９５％以上が除去されている。例えば、１４個または１５個のシアル酸が除去されている。
【００３２】
Ｓ−ニトロソ化されるとは、ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体の少なくとも１個のシステイン残基のチオール基にＳ−ニトロソ基（−ＮＯ）が付加され−ＳＮＯにされることである。Ｓ−ニトロソ化は、シアル酸の除去前であっても、シアル酸の除去後であってもよい。好ましくは、１４９位のシステインのチオール基がＳ−ニトロソ化される。
【００３３】
ＡＧＰ・Ａ体の変異体とはアミノ酸残基が置換、欠失、挿入されたＡＧＰ・Ａ体である。該アミノ酸残基の置換、欠失、挿入の位置、アミノ酸残基数などは、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体の変異体が、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体と同様の強い抗菌活性を有する限り、特に限定されるものではない。
【００３４】
ＡＧＰ・Ａ体の取得方法、糖鎖末端のシアル酸の除去方法、Ｓ−ニトロソ化方法については、上述した方法と同様の方法を用いることができる。
【００３５】
１つの実施形態では、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、Ｓ−ニトロソ化されたＡＧＰ・Ａ体またはその変異体から、ノイラミニダーゼによってシアル酸が除去されて得られる。他の実施形態では、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、ノイラミニダーゼによって少なくとも１個のシアル酸が除去されているＡＧＰ・Ａ体またはその変異体をＳ−ニトロソ化して得られる。ＡＧＰ・Ａ体１〜１００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇをノイラミニダーゼ０．０５〜０．５単位、好ましくは０．２単位と混合し、３７℃にて２〜４８時間、好ましくは２４時間反応させて得られるシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体が好適である。
【００３６】
本発明の好ましいシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体は、１４９位のシステイン残基がＳ−ニトロソ化されたシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体である。また、シアル酸が９５％以上除去されているＳ−ニトロソ化アシアロＡＧＦ・Ａ体である。さらに好ましいシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体は、１４９位のシステイン残基がＳ−ニトロソ化されているＳ−ニトロソ化アシアロＡＧＦ・Ａ体であり、その分子量は約４０，０００である。
【００３７】
本発明のシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、強い抗菌作用を示す。本物質は、細菌内に一酸化窒素を効率的に輸送することができる。一酸化窒素輸送メカニズムには、シアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体から菌体表面のチオール基へのＳ−ニトロソ転移反応が関与すると考えられる。よって、本発明のシアル酸除去Ｓ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体は、種々の細菌に対して優れた抗菌性を有し、グラム陽性菌感染症、グラム陰性菌感染症など種々の細菌の感染症の治療薬として極めて有用である。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
ヒト血清から分離精製したＡＧＰ分画は、一般財団法人 化学及血清療法研究所より恵与されたもの、あるいは購入したヒト血清由来のＡＧＰ（Ｇ９８８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。ＡＧＰバリアントそれぞれの分離精製方法は、Ｈｅｒｖｅらの方法に従って行った。すなわち、ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｇｅｌ（１８−８７６９−０１、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）５０ｍＬをイオン交換水で洗浄後、０．２Ｍ ＣｕＣｌ２水溶液を流し、Ｃｕ２＋イオンをキレートした。次に、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を流すことにより過剰なＣｕ２＋イオンを除去した。その後、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．５Ｍ ＮａＣｌの移動相を流速０．４ｍＬ／分で流して安定化し、２０ｍｇのＡＧＰを１ｍＬの移動相に溶解したサンプルをカラムに添加した。添加後、約１．５時間に保持されずに溶出するＦ１＊Ｓ体を分取した。次いで、イミダゾール（最終濃度２０ｍＭ）を加えた移動相を流し、約５時間後に溶出されるＡ体を分取した。分取した各バリアントをイオン交換水にて透析後、凍結乾燥した。さらに、Ｆ１＊Ｓ体およびＡ体の回収率より、ＡＧＰバリアント比を算出した。
【００４０】
得られたＡＧＰ・Ａ体に３倍モル量の１，４−ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（以下、ＤＴＴ）（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加、混合し、ＡＧＰ・Ａ体中に存在する遊離型Ｃｙｓ残基のＳＨ基の還元を行った。これをゲル濾過し、ろ液にその１０倍量のＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳ−ＮＯ）（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ ＤＴＰＡ）を添加、混合し、３７℃にてＳ−ニトロソ化反応を行った。混合物をゲル濾過し、ろ液にＳ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体（以下、ＳＮＯ−ＡＧＰという。）を得た（図１）。
【００４１】
ＳＮＯ−ＡＧＰのＳ−ニトロソ化部位をＨＰＬＣ ｆｌｏｗ ｒｅａｃｔｏｒシステムにより分析した。まず、血漿から精製したＡＧＰバリアントＦ１＊Ｓ体を上記と同様にＳ−ニトロソ化した。また、ＡＧＰバリアントＡ体の１４９位のシステインをＮｉｓｈｉら（Nishi K, et al.，Drug Metab Pharmacokinet，25，200-207，2010）の方法によりアルギニンに変異させたＣ１４９Ｒを得た。得られたＣ１４９Ｒを上記と同様にＳ−ニトロソ化した。そして、それぞれのＮＯ付加率の定量を、Ａｋａｉｋｅら（T. Akaike, et al., J. Biochemistry, 122, 459-466, 1997）の方法により行った。すなわち、図２に示すＨＰＬＣ ｆｌｏｗ ｒｅａｃｔｏｒシステムにおいて、上記ＳＮＯ−ＡＧＰ、Ｆ１＊Ｓ体およびＣ１４９ＲにＨｇ２＋を反応させて生成するＮＯ２−とＧｒｉｅｓｓ試薬との反応生成物であるアゾ色素を５４０ｎｍで測定することにより、各種Ｓ−ニトロソ化タンパク質を分離・定量した。各タンパク質のＮＯ付加率を表１に示す。表１の結果から、ＳＮＯ−ＡＧＰの１４９位のシステインがＳ−ニトロソ化されていることが確認された。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（実施例２）
実施例１で得られたＡＧＰ・Ａ体２０ｍｇにノイラミニダーゼ０．２単位を添加、混合し、３７℃にて２４時間反応させ、糖鎖末端のシアル酸が９５％以上除去されたアシアロＡＧＰ・Ａ体を得た。得られたアシアロＡＧＰ・Ａ体を実施例１に従いＳ−ニトロソ化してＳ−ニトロソ化アシアロＡＧＰ・Ａ体（以下、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰという。）を得た（図３）。得られたＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰは、９５％以上のシアル酸が除去されており、分子量は約４０，０００であった。
【００４４】
(実施例３)
実施例１のゲル濾過で得られたＳＮＯ−ＡＧＰ溶液を常法により凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を得た。また、液状におけるＳＮＯ−ＡＧＰのｐＨ７およびｐＨ５での安定性を評価したところ、ｐＨ７では半減期１３日であり、ｐＨ５では、半減期が２４日であり、非常に安定であることが確認された。
【００４５】
(実施例４)
実施例２で得られたＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰ溶液を常法により凍結乾燥して凍結乾燥製剤を得た。
【００４６】
（比較例１）
Ｓ−ニトロソ化ヒト血清アルブミン（以下、ＳＮＯ−ＨＳＡという。）を特開２００５−２０６５７７号公報に記載の方法によって得た。
【００４７】
（試験例１）
グラム陰性菌である、大腸菌（E. coli）、ネズミチフス菌（S. typhimurium LT2）、緑膿菌（P. aeruginosa）、およびグラム陽性菌である、枯草菌（B. subtilis）、化膿性溶血性連鎖球菌（S. pyogenes）を用いて、ＳＮＯ−ＡＧＰの抗菌活性を調べた。
【００４８】
各菌株を、２０重量％のグルコースを添加した Ｍ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ６４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ ５ｇ／Ｌ）で、１晩培養し、Ｍ９で３回洗浄し、Ｍ９培地中で、菌数をＯＤ６３０＝０．０５±０．０１に調整した。この培地に実施例１で得られたＳＮＯ−ＡＧＰ、比較例で得られたＳＮＯ−ＨＳＡ、コントロールとしてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加し、３７℃にて９時間静置後、ＯＤ６３０を測定した。この値をコントロール群と比較することで増殖率を算出した。
【００４９】
【数１】
【００５０】
ＳＮＯ−ＡＧＰとＳＮＯ−ＨＳＡの大腸菌に対する増殖阻害率を図４に示す。また、種々の細菌に対する５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を表２および図５に示す。図５より明らかなようにＳＮＯ−ＡＧＰは極めて低濃度で菌の増殖を阻害した。ＳＮＯ−ＡＧＰの抗菌活性は既知のＳ−ニトロソ化タンパク質の中では最も強力であった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
（試験例２）
ＳＮＯ−ＡＧＰに代えて実施例２で得られたＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰを用いた以外は試験例１と同様に試験した。結果を図６に示す。５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）はＳＮＯ−ＡＧＰで６５ｎＭであり、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰで８００ｐＭであった。ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰはＳＮＯ−ＡＧＰの８０倍の抗菌活性を有し、さらに極めて低い濃度で菌の増殖を阻害し、非常に高い抗菌活性を有することが明らかとなった。
【００５３】
（試験例３）
ＳＮＯ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰおよびＳＮＯ−ＨＳＡから細菌内へのＮＯ輸送効率について検討した。
【００５４】
大腸菌培養液にＳＮＯ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ＨＳＡを各々添加し、３７℃にて７時間大腸菌を培養した。細胞内ＮＯ検出プローブであるＤｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＦＭ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ）を添加してさらに１時間培養した後、励起波長：４８５ｎｍ、測定波長：５３５ｎｍで大腸菌体内のＮＯ量の指標となる蛍光を測定した。結果を図７および図８に示す。ＳＮＯ−ＡＧＰ、ＳＮＯ−ａｓｉａｌｏ−ＡＧＰおよびＳＮＯ−ＨＳＡの抗菌活性は、細菌内へのＮＯ輸送能に依存していた。
【００５５】
（試験例４）
ＳＮＯ−ＡＧＰから細菌へのＮＯ輸送機構について検討した。大腸菌の菌体表面チオール基をＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で修飾して、菌体内へのＮＯの取込み量に変化が生じるかを検討した。方法を図９に示す。結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ＮＥＭで菌体表面のチオール基が修飾された大腸菌ではＮＯの菌体内輸送が阻害された。よって、ＳＮＯ−ＡＧＰのＮＯ輸送機構には、ＳＮＯ−ＡＧＰから菌体表面のチオール基へのＳ−ニトロソ転移反応が関与することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の抗菌剤および本発明のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化ＡＧＰ・Ａ体またはその変異体は、抗菌活性が非常に高く、抗菌スペクトルも広いことより、種々の感染症の治療薬として医療分野に貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項２】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である、請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項３】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体が、１４９位のシステイン残基がニトロソ化されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である請求項２に記載の抗菌剤。
【請求項４】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質である、請求項１から３のいずれかの項に記載の抗菌剤。
【請求項５】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質である、請求項４に記載の抗菌剤。
【請求項６】
糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項７】
ノイラミニダーゼによって少なくとも１個のシアル酸が除去されているα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体をＳ−ニトロソ化して得られる、請求項６に記載のα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項８】
１４９位のシステイン残基がニトロソ化されている、請求項６または７に記載のα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項９】
Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である、請求項６から８のいずれかの項に記載のα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項１】
Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質またはその変異体を有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項２】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である、請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項３】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体が、１４９位のシステイン残基がニトロソ化されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である請求項２に記載の抗菌剤。
【請求項４】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質である、請求項１から３のいずれかの項に記載の抗菌剤。
【請求項５】
前記Ｓ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質が、Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質である、請求項４に記載の抗菌剤。
【請求項６】
糖鎖末端の少なくとも１個のシアル酸が除去されているＳ−ニトロソ化α１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項７】
ノイラミニダーゼによって少なくとも１個のシアル酸が除去されているα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体をＳ−ニトロソ化して得られる、請求項６に記載のα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項８】
１４９位のシステイン残基がニトロソ化されている、請求項６または７に記載のα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【請求項９】
Ｓ−ニトロソ化アシアロα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体である、請求項６から８のいずれかの項に記載のα１−酸性糖タンパク質バリアントＡ体またはその変異体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−２４０９８４（Ｐ２０１２−２４０９８４Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１４６６９（Ｐ２０１１−１１４６６９）
【出願日】平成２３年５月２３日（２０１１．５．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１０年１１月２５日 日本薬学会九州支部発行の「第２７回 日本薬学会九州支部大会 講演要旨集」および２０１０年１１月２９日 公益社団法人 日本薬学会発行の「第３２回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム 講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２３日（２０１１．５．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１０年１１月２５日 日本薬学会九州支部発行の「第２７回 日本薬学会九州支部大会 講演要旨集」および２０１０年１１月２９日 公益社団法人 日本薬学会発行の「第３２回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム 講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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