ＳＡＲＳウイルス抗原の細胞表面発現ベクター及びこのベクターにより形質転換された微生物
本発明は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）誘発コロナウイルスの抗原とポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上を含有するＳＡＲＳコロナウイルス抗原の表面発現ベクター、この表面発現ベクターにより形質転換された微生物及び前記微生物を含有するＳＡＲＳワクチンに関する。本発明によれば、ＳＡＲＳコロナウイルス抗原を表面発現する組換え菌株を用いてＳＡＲＳの治療用または予防用ワクチンを経済的に生産することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ、サーズ）誘発コロナウイルスの抗原を微生物の表面に発現させるベクター、このベクターにより形質転換された微生物及びこの形質転換された微生物またはその抽出精製物を含有するＳＡＲＳ予防用ワクチンに関する。より詳しくは、ＳＡＲＳ誘発コロナウイルスの抗原蛋白質をコードする遺伝子及び、微生物表面発現母体であるポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上を含有する表面発現ベクターと、このベクターにより形質転換された微生物及びこの形質転換された微生物を有効性分として含むＳＡＲＳワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＳＡＲＳ、サーズ）は、２００２年１１月から中国の廣東地域を中心に初めて発生し、香港、シンガポール、カナダのトロントなど世界中に広がった新種伝染病である。３８℃以上の発熱とセキ、呼吸困難、非定型肺炎などの呼吸器症状を示すＳＡＲＳの原因体としては、変種コロナウイルスが病源体であると知られている。
【０００３】
通常、コロナウイルスは極めて大きなＲＮＡウイルスであって、（＋）ＲＮＡを有する。ゲノムは、一般に、約２９Ｋ〜３１Ｋの塩基よりなり、顕微鏡ではクラウン状に観察され、人間の上部呼吸器疾患、動物の呼吸器、肝臓、神経、腸関連の疾患の原因となり、自然系には３グループのコロナウイルスが存在するが、これらの中でグループＩとグループＩＩは哺乳類に、そしてグループＩＩＩは鳥類に感染する。
【０００４】
自然系に知られているコロナウイルスは、時々免疫系が弱まっている人々に肺と関わる疾病を引き起こし、犬、猫、豚、ネズミ、鳥などの動物では深刻な疾病の原因ともなる。さらに、これは、極めて高い突然変異率を示すと共に、組換え率（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）もまたおよそ２５％と極めて高い方である。このような特性が既存のコロナウイルスの変異を起こして変種コロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）となり、動物から人間に伝播されたのではないかと考えられる。
【０００５】
世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）によれば、２００２年１１月から３１ヶ国において７，４４７名のＳＡＲＳ推定患者が発生し、そのうち５５１人が死亡した。２００３年現在、ＳＡＲＳ感染危険地域は、中国の北京、廣東、香港、内モンゴル、山西、天津、シンガポール、カナダのトロント、台湾、モンゴルのウーランバートル、そしてフィリピンなどが対象となっているものの、全世界的に広がる危険性を抱いている。
【０００６】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、２００２年の発生以来、ドイツの熱帯医学研究所が初めてＳＡＲＳウイルスの塩基配列の解読を施した。研究チームは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により遺伝子の増幅が可能な特定の遺伝子部位に対する塩基配列の解読を施した。解読の結果は、ドイツの生命工学企業であるアルツス社に供されてＳＡＲＳ感染検出キットを開発する上で活用され、このキットは、ＳＡＲＳが疑われる患者から検出したウイルス遺伝子を増幅させてＳＡＲＳウイルスの感染有無を知ることができる。
【０００７】
その後、ＳＡＲＳウイルス全長ゲノムの解読作業が行われ、これまで１２個以上の分離株に対する塩基配列が完全に分析されて知られている。この中で、最初に分離されたウルバニ（Ｕｒｂａｎｉ）株［ＳＡＲＳにより感染されて死亡したＷＨＯ派遣医師の名前を取った名］、ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ株（Ｒｏｔａ，ＰＡ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：５９５２，２００３；Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＹ２７８７４１）の全塩基配列がアメリカのＣＤＣ研究チームにより解読され、カナダのブリティッシュ・コロンビア癌研究センターのチームは、４月１２日、カナダのトロントの患者から分離したＳＡＲＳＴｏｒ２ウイルス株（Ｍａｒｒａ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：５９５３，２００３；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ２７４１１９）の全塩基配列を分析した。
【０００８】
両研究チームは、それぞれ異なる場所でＳＡＲＳに感染された患者から分離したコロナウイルスを分析したが、両ウイルスの塩基の違いは、僅か１５個に過ぎなかった。これは、ＳＡＲＳが同じウイルスにより誘発されるということを示唆している。また、ＳＡＲＳコロナウイルスのゲノム分析の結果、既存のコロナウイルスの蛋白質と同じ構成要素を有しているが、ゲノム及びゲノムによるアミノ酸は、わずかな相同性しか示さず、その中で、ネズミの肝炎ウイルスと七面鳥の気管支炎ウイルスに近いということが明らかになった。しかしながら、ＳＡＲＳコロナウイルスと他のコロナウイルスとの相関性は、分子系統の分類学的な分析により明らかになったが、既存のグループとは異なっていることが解った。
【０００９】
現在、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出は、最初にＰＣＲを行い、抗体検査の陽性判定はＥＬＩＳＡやＩＦＡにより行い、さらに、ウイルスの分離に関しては、ＰＣＲにより確診された検体について細胞培養検査によりウイルスを分離してＳＡＲＳコロナウイルスの感染を確定する。
【００１０】
ＳＡＲＳに対する根本的な治療方法はなく、保存的な支持療法があるだけである。現在、新しい伝染病であるＳＡＲＳの原因体としてのＳＡＲＳコロナウイルスに対する研究は初期段階に留まっているため、予防のためのワクチンは開発されておらず、世界的に予防ワクチンを開発するために多角的な研究が進んでいる。
【００１１】
微生物の細胞の表面に所望の蛋白質を付着して発現させる技術を、細胞表面発現（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術と呼んでいる。この細胞表面発現技術は、バクテリアや酵母など微生物の表面蛋白質を表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）として用いて外来蛋白質を表面に発現させる技術であり、組換え生ワクチンの生産、ペプチド／抗体ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の製作及びスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、全細胞吸着剤（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）、全細胞生物転換触媒（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｓｔ）など様々な応用範囲を有している技術である。この技術は、いかなる蛋白質を細胞の表面に発現させるかによってその応用範囲が決められ、この理由から、細胞表面発現技術を用いた産業的な応用潜在力は極めて高いと言える。
【００１２】
細胞表面発現技術を成功させるためには、表面発現母体が最も重要である。いかに効果的に外来蛋白質を細胞の表面に発現可能な母体を選定して開発するかが、この技術の核心となる。
【００１３】
このため、次のような性質を有する表面発現母体を選定する必要がある。
まず、第一に、外来蛋白質を細胞の表面まで送るために、外来蛋白が細胞内膜を通過可能にする分泌信号があること、第二に、細胞外膜の表面に安定的に外来蛋白質を付着可能にするターゲット信号があること、第三に、細胞の表面に多量に発現されるが、細胞の成長にほとんど影響しないこと、第四に、蛋白質の大小とは無関係に、外来蛋白質の３次元構造に変化を起こすことなく安定的に発現されること、などである。しかしながら、これらの条件をいずれも満足する表面発現母体は、まだ開発されていないのが現状である。
【００１４】
今まで知られて用いられている表面発現母体としては、大きく細胞外膜蛋白質、リポ蛋白質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、分泌蛋白質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、鞭毛蛋白質などの表面器官蛋白質の４種類が挙げられる。グラム陰性菌（Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）の場合、ＬａｍＢ，ＰｈｏＥ（Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：１６５８．，１９８７；Ａｇｔｅｒｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：８５，１９９０）、ＯｍｐＡなどの細胞外膜に存在する蛋白質を主として用いていた。加えて、リポ蛋白質であるＴｒａＴ（Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１，１９９１）、ＰＡＬ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９，１９９１）、そしてＬｐｐ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８９：２７１３，１９９２）なども用いられていた。さらに、ＦｉｍＡや１型（ｔｙｐｅ１）線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）のＦｉｍＨ接着因子（ａｄｈｅｓｉｎ）などの線毛蛋白質（Ｈｅｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８５：１１５，１９８９）、ＰａｐＡピル（ｐｉｌｕ）サブユニットなどのピリ（ｐｉｌｉ）蛋白質などを細胞表面発現母体として用い、外来蛋白質の発現を試みることもあった。これらの他にも、氷核活性蛋白質（ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：５７６，１９９８；Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：３４８，１９９８；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：６４５，２０００）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）のプルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）（Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｌ．，４：１１０１，１９９０）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｅｒｉａ）のＩｇＡプロテアーゼ（Ｋｌａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１９９１，１９９０）、大腸菌の接着因子であるＡＩＤＡ−１、赤痢菌のＶｉｒＧ蛋白質、ＬｐｐとＯｍｐＡの溶融蛋白質などが表面発現母体として使用できるという報告がある。グラム陽性菌（Ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）を用いる場合には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ及びＦｎＢＰＢ蛋白質を表面発現母体として用いてマラリア抗原を效果的に発現させた報告があり、乳酸バクテリアの表面コート（ｃｏａｔ）蛋白質を表面発現に用いたという報告と、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＭ６蛋白質（Ｍｅｄａｇｌｉｎｉ，Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２：６８６８，１９９５）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のＳ−ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡ１、枯草菌ＣｏｔＢなどグラム陽性バクテリアの表面蛋白質を母体として用いたという報告がある。
【００１５】
本発明者らは、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を新しい表面発現母体として用い、外来蛋白質を微生物の表面に效果的に発現させる新しいベクターとこのベクターにより形質転換された微生物の表面に外来蛋白質を多量発現させる方法を開発している（大韓民国特許出願番号第１０−２００１−４８３７３号）。
【００１６】
上記で紹介された表面発現母体を用い、病源体の抗原または抗原決定基を遺伝工学的な方法により大量生産が可能な細菌で安定的に発現しようとする研究が盛んに試みられている。特に、非病原性の細菌の表面に外来免疫原を発現させて生きている状態で経口投与する場合、従来の弱毒化された病原性細菌やウイルスを用いたワクチンよりも一層持続的で且つ強い免疫反応を誘導することができると報告されている。このような免疫反応の誘導は、細菌の表面構造物が表面発現された外来蛋白質の抗原性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を高めるアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）として機能するためであり、生きている状態の菌に対する体内の免疫反応によるものであると知られている。このような表面発現システムを用いた非病原性細菌の組換え生ワクチンの開発は、注目を浴びる価値のあるものである。
【００１７】
この理由から、本発明者らは、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を表面発現母体として用い、遺伝子及び蛋白質分析により選定したＳＡＲＳコロナウイルスの抗原を乳酸菌などの非病原性と食品安全性が保証された微生物の表面に多量発現することに成功し、この微生物を経口投与してＳＡＲＳコロナウイルスに対する体内の血中抗体生成能及び粘膜免疫を誘導させる一層経済的でかつ安定した予防ワクチンを開発するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、微生物の表面発現システムを活用してＳＡＲＳコロナウイルス抗原を発現可能なベクター及びこのベクターにより形質転換された微生物を提供するところにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、ＳＡＲＳコロナウイルスの抗原が表面に発現された、形質転換された微生物、この微生物から抽出されたＳＡＲＳコロナウイルス抗原または前記微生物から精製されたＳＡＲＳコロナウイルス抗原を有効性分として含有するＳＡＲＳ予防用ワクチンを提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するために、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上及び、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質をコードする遺伝子と、を含む表面発現ベクターを提供する。
【００２１】
本発明において、前記表面抗原蛋白質遺伝子としては、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質をコードする遺伝子であればいずれも用いることができ、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質遺伝子を単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできる。また、前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子には、ｐｇｓＡが含まれていることが好ましい。前記スパイク抗原蛋白質はＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＢ，ＳＡＲＳＳＣ，ＳＡＲＳＳＤまたはＳＡＲＳＳＢＣであっても良く、ヌクレオカプシド抗原蛋白質はＳＡＲＳＮＡ，ＳＡＲＳＮＢまたはＳＡＲＳＮであっても良い。
【００２２】
また、本発明は、前記発現ベクターにより形質転換された微生物及びこの微生物を培養することを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質の製造方法を提供する。
【００２３】
本発明に用いられる微生物は、生体への適用時に毒性がなく、弱毒化された微生物であれば特に制限がない。例えば、グラム陰性菌として大腸菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ビブリオコレラ、ウシ型結核菌、赤痢菌などを、そして、グラム陽性菌としてバチルス、乳酸菌、乳酸連鎖菌、ブドウ状球菌、リステリア菌及び連鎖球菌などを好適に選択することができる。特に、乳酸菌のように食用可能な微生物を選択することが好ましい。
【００２４】
さらに、本発明は、前記抗原蛋白質が表面に発現された微生物そのものを用いるか、あるいは、前記微生物を破壊して細胞膜成分を粗抽出した物質を用いるか、あるいは、前記微生物から精製された抗原蛋白質を有効性分として含有するＳＡＲＳ予防用ワクチンを提供する。
【００２５】
本発明に係るワクチンは、ＳＡＲＳコロナウイルスにより誘発される重症急性呼吸器症候群の予防用医薬品として用いることができる。
【００２６】
本発明に係るワクチンは、経口用または食用として摂取することもでき、皮下または腹腔に注射することもでき、さらには、鼻腔投与することもできる。
【００２７】
ＳＡＲＳコロナウイルスの感染は、感染性飛沫による呼吸器感染により引き起こされると知られていることから、呼吸器の粘膜組織の表面（ｍｕｃｏｓａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）でおこると考えられる。この理由から、粘膜免疫による感染の防御は極めて重要である。ＳＡＲＳコロナウイルスの抗原を表面に発現する微生物は、粘膜における抗体形成（ｍｕｃｏｓａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を一層効果的に誘導できるという長所を有しており、上記の形質転換された微生物それ自体を用いた経口用ワクチンあるいは鼻腔投与ワクチンが非経口用（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ワクチンよりも、ＳＡＲＳコロナウイルスを防御する上で一層効果的であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の目的及び利点は、添付の図面と併せて、詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【図１】図１は、豚伝染性胃腸炎ウイルスの抗原性４部位（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）とＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質との関係をカイト・ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）方法による親水性プロット（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｐｌｏｔ）、ジェームソン・ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−ｗｏｌｆ）方法による抗原インデックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）、そしてエミニ（Ｅｍｉｎｉ）方法による表面確率プロット（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ）を通じて分析した結果を示すものである。
【図２】図２は、豚伝染性胃腸炎ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質とＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質との関係をカイト・ドゥーリトル方法による親水性プロット、ジェームソン・ウルフ方法による抗原インデックス、そしてエミニ方法による表面確率プロットを通じて分析した結果を示すものである。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明に係るグラム陰性及びグラム陽性微生物を宿主とする表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡの遺伝子マップである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明に係るｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣの遺伝子マップである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明に係るｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣの遺伝子マップである。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明に係る転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを示す遺伝子マップである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明に係るｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮの遺伝子マップである。
【図５Ａ】図５Ａは、乳酸菌において細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＡ抗原の発現を、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との特異的な結合を用いて免疫ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより確認したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、乳酸菌において細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＣ抗原の発現を、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との特異的な結合を用いて免疫ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより確認したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、乳酸菌において細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＢＣ抗原の発現を、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との特異的な結合を用いて免疫ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより確認したものである。
【図６Ａ】図６Ａは、細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＡ抗原の乳酸菌表面発現を、乳酸菌細胞を分画した蛋白質をｐｇｓＡに対する特異抗体に結合させ、免疫ブロットを行うことにより確認したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＢＣ抗原の乳酸菌表面発現を、乳酸菌細胞を分画した蛋白質をｐｇｓＡに対する特異抗体に結合させ、免疫ブロットを行うことにより確認したものである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＳＡＲＳＳＢＣ抗原の乳酸菌表面発現を蛍光活性細胞選別測定法（ＦＡＣＳｃａｎ ａｓｓａｙ）により確認したものである。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＮＢとＳＡＲＳＮ抗原の乳酸菌表面発現を、乳酸菌細胞を分画した蛋白質をｐｇｓＡに対する特異抗体と結合させ、免疫ブロットを行うことにより確認したものである。
【図８】図８は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められた乳酸菌カセイ株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの血清内のＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣ抗原に対するＩｇＧ抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）により測定した結果である。
【図９】図９は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められたカセイ菌株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの腸及び気管支、肺胞洗浄液内のＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣ抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。
【図１０】図１０は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められた乳酸菌カセイ株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの血清内のＳＡＲＳＮＢ抗原基に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。
【図１１】図１１は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められた乳酸菌カセイ株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの腸及び気管支、肺胞洗浄液内のＳＡＲＳＮＢ抗原基に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００３０】
特に、下記の実施例においては、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位の遺伝子及びヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位の遺伝子を適用しているが、これに限定されることなく、いかなる抗原蛋白質遺伝子も単独で、あるいは２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３１】
さらに、下記の実施例においては、バチルスサブチリスチョンククチャン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ；ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ）からポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＢＣＡを得て用いているが、遺伝子はポリ−γ−グルタミン酸を生産するいかなるバチルス属菌株からｐｇｓＢＣＡを得て製造されたベクターまたはこのベクターを用いた形質転換された微生物なども本発明の範囲に含まれると言える。例えば、バチルスサブチリスチョンククチャンに存在するｐｇｓＢＣＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他の菌株由来のｐｇｓＢＣＡ遺伝子を用いてワクチン用ベクターを製造したり、これを用いたりすることも本発明の範囲に含まれるであろう。
【００３２】
また、下記の実施例においては、遺伝子ｐｇｓＢＣＡのうちｐｇｓＡだけを用いて表面発現用ベクターを製作しているが、間接的な実施例から類推できるように、遺伝子ｐｇｓＢＣＡの全部または一部だけを用いてワクチン用ベクターを製作することも本発明の範囲に含まれるであろう。
【００３３】
さらに、下記の実施例においては、前記ベクターに対する宿主として、グラム陰性細菌であるチフス菌とグラム陽性細菌である乳酸菌のみを用いているが、この細菌の他に、いかなるグラム陰性菌またはグラム陽性菌も本発明に係る方法により形質転換させると、同じ結果が得られるということも、当業者にとっては明らかである。
【００３４】
さらに、下記の実施例においては、ワクチン用ベクターにより形質転換された微生物そのものを生ワクチンとして生体に適用した例のみが示してある。しかしながら、ワクチン関係の技術分野の知識からみて、前記微生物から粗抽出された発現蛋白質（ＳＡＲＳコロナウイルスの抗原蛋白質）または精製された発現蛋白質を生体に適用しても同一、あるいは類似の結果が得られるということは言うまでもない。
【００３５】
実施例１：ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位の遺伝子の合成
ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質は、１２５６アミノ酸よりなる糖蛋白質である。多くの研究が進んでいる他のコロナウイルスの場合、スパイク蛋白質のほとんどがウイルス粒子の表面を包んでいる外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質に挿入されて外部に露出されるような構造となっており、このような露出部位及び抗原性部位がウイルス感染を引き起こし、感染を防ぐためのワクチンの目的抗原としてその研究が盛んに行われている。
【００３６】
このため、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質１２５６アミノ酸のうち抗原性を示す部位を選定するために、抗原性に関する多くの研究がなされている他の豚伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ：ＴＧＥコロナウイルス）のスパイク蛋白質との蛋白質の比較分析及び構造的な比較分析を通じて抗原性部位を選定し、これを合成した。具体的に、豚伝染性胃腸炎ウイルスのスパイク蛋白質の抗原性部位は４つの部位（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）であることが良く知られている（Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８３：２２５，１９９１）。これらの部位とＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質との関係を、カイト・ドゥーリトル方法による親水性プロット、ジェームソン・ウルフ方法による抗原インデックス、そしてエミニ方法による表面確率プロットにより分析した後、ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）のスパイク蛋白質塩基配列のうちからＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＢ，ＳＡＲＳＳＣ及びＳＡＲＳＳＤを選定した（図１）。
【００３７】
まず、全ての塩基配列が分析されたＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離物のスパイク蛋白質の塩基配列（２１４９２−２５２５９塩基、１２５５アミノ酸）に基づき、抗原性部位であると予想される２〜１１４のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＡと命名し、３７５〜４７０のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＢと命名し、５１０〜５９６のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＣと命名し、そして、１１１７〜１１９７のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＤと命名した。これらの抗原性部位のうちＳＡＲＳＳＡとＳＡＲＳＳＣ部位の遺伝子を合成した。
まず、ＳＡＲＳＳＡと命名した１１３の長さのアミノ酸に相当する遺伝子を合成するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ないし８のプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅された３３９ｂｐのＳＡＲＳＳＡ遺伝子を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｔａｔｔｔｔｃｔｔａｔｔａｔｔｔｃｔｔａｃｔｃｔｃａｃｔａｇｔｇｇｔａｇｔｇａｃｃｔｔｇａｃｃｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
５’−ｔｇａｇｔｇｔａａｔｔａｇｇａｇｃｔｔｇａａｃａｔｃａｔｃａａａａｇｔｇｇｔａｃａａｃｇｇｔｃａａｇｇｔｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
５’−ａａｔｔａｃａｃｔｃａａｃａｔａｃｔｔｃａｔｃｔａｔｇｃｇｔｇｇｇｇｔｔｔａｃｔａｔｃｃｔｇａｔｇａａａｔｔｔｔｔｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
５’−ａａａａｔｇｇａａｇａａａｔａａａｔｃｃｔｇａｇｔｔａａａｔａａａｇａｇｔｇｔｃｔｇａａｃｇａａａａａｔｔｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
５’−ｃｔｔｃｃａｔｔｔｔａｔｔｃｔａａｔｇｔｔａｃｔｇｇｇｔｔｔｃａｔａｃｔａｔｔａａｔｃａｔａｃｇｔｔｔｇｇｃａａｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
５’−ｇｇｃａｇｃａａａａｔａａａｔａｃｃａｔｃｃｔｔａａａａｇｇａａｔｇａｃａｇｇｇｔｔｇｃｃａａａｃｇｔａｔｇ−５’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
５’−ａｔｔｔａｔｔｔｔｇｃｔｇｃｃａｃａｇａｇａａａｔｃａａａｔｇｔｔｇｔｃｃｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｔｔｔｇｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
５’−ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔａｃａｃａｇａｃｔｇｔｇａｃｔｔｇｔｔｇｔｔｃａｔｇｇｔａｇａａｃｃａａａａａｃｃｃ−３’
【００３８】
ＳＡＲＳＳＣと命名した８７の長さのアミノ酸に相当する遺伝子を合成するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ないし１４の塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅された２６１ｂｐのＳＡＲＳＳＣ遺伝子を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
５’−ｇｇａｔｃｃｇｔｔｔｇｔｇｇｔｃｃａａａａｔｔａｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔａｔｔａａｇａａｃｃａｇｔｇｔｇｔｃａａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
５’−ｇａａｇａａｇｇａｇｔｔａａｃａｃａｃｃａｇｔａｃｃａｇｔｇａｇａｃｃａｔｔａａａａｔｔａａａａｔｔｇａｃａｃａｃｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：
５’−ａａｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃａａａｇｃｇｔｔｔｔｃａａｃｃａｔｔｔｃａａｃａａｔｔｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｇｔｔｔｃｔｇａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：
５’−ｃｔａａａａｔｔｔｃａｇａｔｇｔｔｔｔａｇｇａｔｃａｃｇａａｃａｇａａｔｃａｇｔｇａａａｔｃａｇａａａｃａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：
５’−ｃｔｇａａａｔｔｔｔａｇａｃａｔｔｔｃａｃｃｔｔｇｔｇｃｔｔｔｔｇｇｇｇｇｔｇｔａａｇｔｇｔａａｔｔａｃａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：
５’−ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔａａａｃａｇｃａａｃｔｔｃａｇａｔｇａａｇｃａｔｔｔｇｔａｃｃａｇｇｔｇｔａａｔｔａｃ−３’
【００３９】
合成による抗原部位遺伝子の確保以外に、Ｃａｎａｄａ’ｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから購入したＳＡＲＳスパイクｃＤＮＡクローン（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２）を鋳型として２６４〜５９６のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５及び１６のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させ、９９６ｂｐサイズの遺伝子を確保し、これをＳＡＲＳＳＢＣと命名した［この遺伝子は、中和抗体を生成するための重要な部位を含有している（ＰＮＡＳ，１０１：２５３６，２００４）］。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＢＣｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃｔｃａａｇｔａｔｇａｔｇａａａａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（ＳＢＣａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｔｔａａａｃａｇｃａａｃｔｔｃａｇａ−３’
【００４０】
実施例２：ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位の遺伝子の合成
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質は、４２２アミノ酸よりなる蛋白質である。多くの研究が進んでいる他のコロナウイルスの場合、ヌクレオカプシド蛋白質のほとんどが抗原として作用するという報告があり、この部位をコロナウイルスの感染を防ぐためのワクチンの目的抗原として用いようとする研究が盛んになされている。
【００４１】
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質のアミノ酸のうち抗原性を示す部位を豚伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ、ＴＧＥ コロナウイルス）のヌクレオカプシド蛋白質との比較分析により抗原性部位を選定して合成した。
【００４２】
具体的に、豚伝染性胃腸炎ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質とＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質との関係をカイト・ドゥーリトル方法による親水性プロット、ジェームス・ウルフ方法による抗原インデックス、そしてエミニ方法による表面確率プロットにより分析した後、ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離株のヌクレオカプシド蛋白質の塩基配列のうちからＳＡＲＳＮＡ及びＳＡＲＳＮＢを選定した（図２）。
【００４３】
まず、全ての塩基配列が分析されたＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離株のヌクレオカプシド蛋白質の塩基配列（２８１２０−２９３８８塩基、４２２アミノ酸）に基づき、抗原性部位であると予想される２〜１５７のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＮＡと命名し、１６３〜３０５のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＮＢと命名し、本発明においては、ＳＡＲＳＮＢ部位の遺伝子を合成した。
【００４４】
ＳＡＲＳＮＢと命名した１４３長さのアミノ酸に相当する遺伝子を合成するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ないし２６の塩基配列をプライマーとして用いたＰＣＲを行い、増幅された４２９ｂｐのＳＡＲＳＮＢ遺伝子を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：
５’−ｇｇａｔｃｃｃｃｔｃａａｇｇｔａｃａａｃａｔｔｇｃｃａａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｇｃａｇａｇｇｇｔａｇｃｃｇｔｇｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：
５’−ａｃｃａｃｇａｃｔａｃｇｔｇａｔｇａａｇａａｃｇａｇａａｇａｇｇｃｔｔｇａｃｔｇｃｃｇｃｃａｃｇｇｃｔａｃｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：
５’−ｃａｃｇｔａｇｔｃｇｔｇｇｔａａｔｔｃａｃｇｔａａｔｔｃａａｃｔｃｃｔｇｇｃａｇｃａｇｔｃｇｔｇｇｔａａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：
５’−ｇｃｇａｇｇｇｃａｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｃｔａｇｃｃａｔａｃｇａｇｃａｇｇａｇａａｔｔａｃｃａｃｇａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：
５’−ｇａａａｃｔｇｃｃｃｔｃｇｃａｃｔｔｔｔｇｃｔｇｃｔｔｇａｃｃｇｔｔｔｇａａｃｃａｇｃｔｔｇａｇａｇｃａａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：
５’−ｔａｇｔｇａｃａｇｔｔｔｇａｃｃｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇａａａｃｔｔｔｇｃｔｃｔｃａａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：
５’−ｃａａａｃｔｇｔｃａｃｔａａｇａａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｇｃａｔｃｔａａａａａｇｃｃｔｃｇｔｃａａａａａｃｇｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：
５’−ｇｇａｃｃａｃｇａｃｇｃｃｃａａａｔｇｃｔｔｇａｇｔｇａｃｇｔｔｇｔａｃｔｇｔｔｔｔｇｔｇｇｃａｇｔａｃｇｔｔｔｔｔｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：
５’−ｇｇｇｃｇｔｃｇｔｇｇｔｃｃａｇａａｃａａａｃｃｃａａｇｇｔａａｔｔｔｃｇｇｇｇａｃｃａａｇａｃｃｔｔａｔｃｃｇｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：
５’−ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔａａａｔｔｔｇｃｇｇｃｃａａｔｇｔｔｔｇｔａａｔｃａｇｔａｃｃｔｔｇａｃｇｇａｔａａｇｇ−３’
【００４５】
また、合成による抗原部位遺伝子の確保の以外に、Ｃａｎａｄａ’ｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから購入したＳＡＲＳヌクレオカプシドｃＤＮＡクローン（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２）を鋳型としてヌクレオカプシドの２〜３０５のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させ、９１２ｂｐサイズの遺伝子を確保し、これをＳＡＲＳＮと命名した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７（Ｎｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｃｔｇａｔａａｔｇｇｔｃｃｇｃａａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８（Ｎａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｔｔａａａｔｔｔｇｃｇｇｃｃａａｔｇｔｔｔ−３’
【００４６】
実施例３：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用いてグラム陰性微生物及びグラム陽性微生物を宿主としてＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＳＡ及びＳＣを表面発現可能な表面発現ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣを構築した。
【００４７】
まず、ヒト乳頭腫ウイルスのＬ１抗原を有しグラム陰性及びグラム陽性微生物を宿主とする表面発現用ベクター（グラム陰性及びグラム陽性汎用ベクターであるｐＡＴに恒常的高発現プロモータであるＨＣＥプロモータ、ポリ−γ−グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡ、そしてＨＰＶＬ１を含む転換ベクター）に、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣを導入するために、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１（ＫＣＴＣ１０３４９ＢＰ）をＢａｍＨＩとＫｐｎＩに切断し、ＨＰＶＬ１遺伝子を除去して表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡを用意した。
【００４８】
前記実施例１において合成されたＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣ抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩにそれぞれ切断してあらかじめ用意した表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端部位に翻訳コドンを合わせてそれぞれ連結し、転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣをそれぞれ製作した（図３Ａ及び図３Ｂ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣを用いてグラム陽性細菌である乳酸菌を形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣプラスミドの存在をそれぞれ確認した。
【００４９】
実施例４：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ：ＳＡＲＳＳＢＣの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用い、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＳＢＣを表面発現可能なベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣを構築した。
【００５０】
まず、前記実施例３の方法と同様にしてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ表面発現用ベクターを用意した後、前記実施例１におけるＳＡＲＳコロナウイルスのＳＡＲＳスパイクｃＤＮＡクローンを鋳型として２６４〜５９６のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅させた９９６ｂｐサイズのＳＡＲＳＳＢＣ遺伝子を表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡに挿入し、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣを製作した（図３Ｃ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣを用い、グラム陽性細菌である乳酸菌を形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣプラスミドの存在を確認した。
【００５１】
実施例５：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ：ＳＡＲＳＮＢの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用い、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＮＢを表面発現可能なベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを構築した。
【００５２】
まず、前記実施例３の方法と同様にしてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ表面発現用ベクターを用意した後、前記実施例２において合成されたＳＡＲＳＮＢ抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩに切断して用意した表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ−末端部位に翻訳コドンを合わせて連結し、転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを製作した（図４Ａ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを用いてグラム陽性細菌である乳酸菌を形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢプラスミドの存在を確認した。
【００５３】
実施例６：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用い、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＮを表面発現可能なベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮを構築した。
【００５４】
まず、前記実施例３の方法と同様にしてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ表面発現用ベクターを用意した後、前記実施例２におけるＳＡＲＳコロナウイルスのＳＡＲＳヌクレオカプシドｃＤＮＡクローンを鋳型として２〜３０５のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅させて得られた９１２ｂｐサイズの遺伝子ＳＡＲＳＮを表面発現ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡに挿入してｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮを製作した（図４Ｂ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮを用いてグラム陽性細菌である乳酸菌に形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮプラスミドの存在を確認した。
【００５５】
実施例７：ＳＡＲＳウイルススパイク抗原蛋白質の乳酸菌の表面発現の確認
前記表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣによりそれぞれ乳酸菌を形質転換させた後、それぞれの抗原蛋白質の発現を調べてみた。
【００５６】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端とそれぞれ融合されたＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原内の抗原性部位の発現を、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣで、形質転換することにより誘導し、形質転換された乳酸菌カゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）、３７℃で静置培養、増殖させた。
【００５７】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡに対する特異抗体を用いたウェスタン免疫ブロットを行い、前記それぞれのスパイク抗原発現を確認した。具体的に、発現が誘導された乳酸菌カゼイの全細胞を同じ細胞濃度で得た蛋白質に変性して試料を用意し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後、分画された蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（ポリビニリデン−ジフルオリドメンブレン；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）メンブレンに転写した。蛋白質が移されたＰＶＤＦメンブレンをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５％スキムミルク、ｐＨ８．０）で１時間振ってブロッキングさせた後、ｐｇｓＡに対するウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して１２時間反応させた。
【００５８】
反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、ウサギに対するビオチン結合２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して４時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、アビジン・ビオチン（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）試薬を１時間反応させて再洗浄した。洗浄されたメンブレンに基質と発色試薬としてＨ２０２とＤＡＢ溶液を加えて発色させ、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との間の特異的な結合を確認した（図５）。図５Ａにおいて、レーン１は、形質転換されていない宿主細胞である乳酸菌カゼイであり、レーン２，３及び４は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ／乳酸菌カゼイである。図５Ｂにおいて、レーン１は形質転換されていない宿主細胞である乳酸菌カゼイであり、レーン２，３，４，５及び６は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ／乳酸菌カゼイである。図５Ｃにおいて、レーン１は形質転換されていない宿主細胞である乳酸菌カゼイであり、レーン２は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ／乳酸菌カゼイである。
【００５９】
図５に示すように、それぞれの乳酸菌の全細胞から、特異融合蛋白質［約５４ｋＤａのｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ（図５Ａ）、約５１ｋＤａのｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ（図５Ｂ）及び約７８ｋＤａのｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ（図５Ｃ）］を確認することができた。
【００６０】
また、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳ：ＳＢＣの表面発現ベクターにより形質転換された乳酸菌において、ｐｇｓＡによりそれぞれの抗原蛋白質が乳酸菌の表面に発現されているかどうかを確認するために、それぞれのベクターにより形質転換された乳酸菌を超遠心分離機を用いた細胞分画法により細胞壁と細胞質に分画した後、それぞれの融合蛋白質の位置をｐｇｓＡに対する特異抗体を用いたウェスタン免疫ブロット法により確認した。
【００６１】
具体的に、上記の方法により融合蛋白質の表面発現が誘導された乳酸菌を形質転換されていない乳酸菌と同じ細胞濃度になるように集菌し、細胞をＴＥＳ緩衝溶液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，１ｍＭのＥＤＴＡ、２５％スクロース）で数回洗浄した後、５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１ｍＭのＰＭＳＦ、そして１ｍＭのＥＤＴＡが含まれた蒸溜水で浮遊させ、−６０℃と常温で凍結融解を数回繰り返した後、ＤＮａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍＬ）とＲＮａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、超音波処理して細胞を破壊した。次いで、細胞破砕液を４℃、２０分間１０，０００×ｇ遠心分離して破壊されていない全乳酸菌（ペレット；全細胞分画）と細胞破片（上澄み液）を分離し、分離された細胞破片を４℃、１時間２１，０００×ｇで遠心分離して乳酸菌の細胞質蛋白質を含む上澄液（可溶分画）とペレットを得た。前記得られたペレットを１％ＳＤＳを含むＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍのＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）に浮遊させ、乳酸菌の細胞壁蛋白質（細胞壁の分画）を得た。
【００６２】
それぞれの分画に対し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡ抗原に対する抗体を用いたウェスタン免疫ブロットを行い、それぞれの乳酸菌分画のうちｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原が細胞壁に位置していることを確認した（図６）。図６Ａにおいて、レーン１は、形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。図６Ｂにおいて、レーン１は、形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。
【００６３】
図６に示すように、乳酸菌の全細胞及び細胞壁の分画により、約５４ＫｄａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＡ蛋白質、及び約７８ｋＤａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＢＣ蛋白質を確認することができた。この結果から、ｐｇｓＡと融合されたそれぞれのＳＡＲＳ抗原の蛋白質が発現され、ｐｇｓＡにより乳酸菌の表面へ移動して位置するということを確認することができた。
【００６４】
また、ＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原の抗原基の発現がポリ−γ−グルタミン酸合成蛋白質ｐｇｓＡのＣ末端との融合により乳酸菌の表面に発現されることを蛍光活性細胞選別測定方法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。
【００６５】
免疫蛍光染色のために発現を誘導させた乳酸菌を同じ細胞濃度になるように集菌し、細胞を緩衝溶液（ＰＢＳバッファ、ｐＨ７．４）で数回洗浄した後、１％の牛血清アルブミンを含有する緩衝溶液１ｍＬに浮遊させてＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原に対するマウス由来のポリクローナル１次抗体を１０００倍希釈し、４℃で１２時間反応させた。反応が終わった細胞は緩衝溶液で数回洗浄し、１％の牛血清アルブミンを含有する緩衝溶液１ｍＬに浮遊させた後、ビオチンが結合されている２次抗体を１０００倍希釈して４℃で３時間反応させた。また、反応が終わった細胞は緩衝溶液で数回洗浄し、１％の牛血清アルブミンを含む緩衝溶液０．１ｍＬに浮遊させた後、ビオチンに特異的なストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）染色試薬を１０００倍希釈して結合させた。
【００６６】
反応が終わった乳酸菌を数回洗浄し、蛍光活性細胞選別測定方法により測定した結果、形質転換されていない乳酸菌と比較し、ＳＡＲＳウイルスのＳＢＣスパイク抗原蛋白質が乳酸菌の表面に発現されていることを確認した（図６Ｃ）。図６Ｃにおいて、灰色は形質転換されていない乳酸菌カゼイ由来のものであり、白色は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ／乳酸菌カゼイ由来のものである。図６Ｃに示すように、形質転換されていない乳酸菌カゼイでは蛍光発現が検出されなかったが、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣベクターにより形質転換された乳酸菌では、ＳＢＣスパイク抗原蛋白質が表面発現されていることを明らかに確認することができた。
【００６７】
実施例８：ＳＡＲＳウイルスヌクレオカプシド抗原蛋白質の乳酸菌の表面発現の確認
前記表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮによりそれぞれ乳酸菌を形質転換させた後、それぞれの抗原蛋白質発現を調べてみた。
【００６８】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端とそれぞれ融合されたＳＡＲＳウイルスのヌクレオカプシド抗原の発現を、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮで形質転換することにより誘導し、それぞれ形質転換された乳酸菌カゼイをＭＲＳ培地を使用し、３７℃で静置培養して増殖させた。
【００６９】
ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳ Ｎ表面発現ベクターにより形質転換された乳酸菌において、ｐｇｓＡによりそれぞれの抗原蛋白質が乳酸菌の表面に発現されているかどうかを確認するために、前記実施例７の方法と同様な方法であるそれぞれのベクターにより形質転換された乳酸菌を超音波処理を用いた細胞分画法により細胞壁と細胞質に分画した後、それぞれの融合蛋白質の位置をｐｇｓＡに対する特異抗体をもってウェスタンブロットを行うことにより確認した。
【００７０】
その結果、それぞれの分画に対し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡ抗原に対する抗体を用いたウェスタン免疫ブロットを行い、それぞれの乳酸菌分画のうちｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳウイルスのヌクレオ抗原が細胞壁に位置していることを確認した（図７）。図７Ａにおいて、レーン１は形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。図７Ｂにおいて、レーン１は形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。
【００７１】
図７に示すように、乳酸菌の全細胞と細胞壁の分画に、約５７ｋＤａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＮＢ蛋白質及び約７５ｋＤａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＮ蛋白質を確認することができた。この結果から、ｐｇｓＡと融合されたそれぞれのＳＡＲＳ抗原蛋白質が発現されてｐｇｓＡにより乳酸菌の表面へ移動して位置していることを確認することができた。
【００７２】
実施例９：ＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質が表面発現された乳酸菌のワクチン効果の分析
上記の実施例において得られた表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりグラム陽性菌である乳酸菌カゼイを形質転換させ、前記抗原を乳酸菌カゼイにより表面発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質の抗原性をマウスモデルを用いて調べてみた。
【００７３】
具体的に、本発明の表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを乳酸菌カゼイに形質転換させ、それぞれ同じ細菌濃度になるように集菌した細胞を緩衝溶液（ＰＢＳバッファ、ｐＨ７．４）で数回洗浄を行い、抗原が表面発現された乳酸菌５×１０９菌を４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの口腔に１日置きに３回、そして１週後さらに１日置きに３回、そして同様に、２週後に１日置きに３回投与した後、さらに４週後に１日置きに３回投与した。また、抗原が表面発現された乳酸菌１×１０９菌をマウスの鼻腔に１日置きに３回、そして１週後にさらに１日置きに３回、そして２週後には２日置きに２回投与した後、さらに４週後に２日置きに２回投与した。それぞれの経口と鼻腔投与後、２週置きにそれぞれの（１）マウス群血清を取って血清内のスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質に対するＩｇＧ抗体価、及び（２）マウスの腸の内部を洗った浮遊液内及び気管支と肺胞の内部を洗った浮遊液内におけるスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ方法により抗原に対する抗体価を測定した。
【００７４】
４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス１０頭を１群として定め、ＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣをそれぞれ発現する乳酸菌を混合して１群とし、ＳＡＲＳＮＢを発現する乳酸菌を１群とし、ＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＣ、そしてＳＡＲＳＮＢをそれぞれ発現する乳酸菌を混合して１群とした。これらの３群をさらに経口投与群と鼻腔投与群に分離し、対照群を含んで合計８群をもって実験を行った。
【００７５】
図８は、マウス血清内のＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原蛋白質であるＳＡ及びＳＣ抗原に対するＩｇＧ抗体価を示すものである。図９は、腸の内部を洗った浮遊液及び気管支と肺胞の内部を洗った浮遊液内におけるスパイク抗原蛋白質であるＳＡ及びＳＣ抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により示すものであり、Ａは、経口投与群におけるＩｇＡ抗体価を示し、Ｂは、鼻腔投与群におけるＩｇＡ抗体価を示す。
【００７６】
また、図１０は、マウス血清内のＳＡＲＳウイルスのヌクレオカプシド抗原蛋白質であるＮＢ抗原に対するＩｇＧ抗体価を示すものである。図１１は、腸の内部を洗った浮遊液及び気管支と肺胞の内部を洗った浮遊液におけるヌクレオカプシド抗原蛋白質であるＮＢ抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により示すものであり、Ａは、経口投与群におけるＩｇＡ抗体価を示し、Ｂは、鼻腔投与群におけるＩｇＡ抗体価を示す。
【００７７】
図８ないし図１１に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢにより形質転換させた乳酸菌をそれぞれあるいは混合して投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の血清、腸内洗浄液及び気管支、肺洗浄液においてＳＡＲＳウイルスのスパイク及びヌクレオカプシド抗原蛋白質の抗原基に対するＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価が対照群に比べてかなり高いということを確認することができた。
【００７８】
これより、本発明に係るＳＡＲＳウイルスのスパイク及びヌクレオカプシド抗原蛋白質の抗原基が表面発現された微生物は、生ワクチンとして效果的に作用できたということが分かった。
【００７９】
以上、本発明の特定の部分について詳細に記述したが、前期実施態様により本発明の範囲が制限されるものではなく、添付された請求項によって定義される筈である。この分野における通常の知識を有する者にとって、本発明の範囲及び思想から逸脱することのない実施態様の変更又は改良ができることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
上述したように、本発明に係るＳＡＲＳ誘発コロナウイルスの抗原蛋白質を表面発現する形質転換微生物及び前記微生物から抽出・精製された抗原蛋白質は、ＳＡＲＳの治療用または予防用ワクチンとして用いることができる。特に、本発明に係るＳＡＲＳコロナウイルス抗原を発現する組換え菌株は、経口ワクチンを経済的に生産することができるという長所を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ、サーズ）誘発コロナウイルスの抗原を微生物の表面に発現させるベクター、このベクターにより形質転換された微生物及びこの形質転換された微生物またはその抽出精製物を含有するＳＡＲＳ予防用ワクチンに関する。より詳しくは、ＳＡＲＳ誘発コロナウイルスの抗原蛋白質をコードする遺伝子及び、微生物表面発現母体であるポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上を含有する表面発現ベクターと、このベクターにより形質転換された微生物及びこの形質転換された微生物を有効性分として含むＳＡＲＳワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＳＡＲＳ、サーズ）は、２００２年１１月から中国の廣東地域を中心に初めて発生し、香港、シンガポール、カナダのトロントなど世界中に広がった新種伝染病である。３８℃以上の発熱とセキ、呼吸困難、非定型肺炎などの呼吸器症状を示すＳＡＲＳの原因体としては、変種コロナウイルスが病源体であると知られている。
【０００３】
通常、コロナウイルスは極めて大きなＲＮＡウイルスであって、（＋）ＲＮＡを有する。ゲノムは、一般に、約２９Ｋ〜３１Ｋの塩基よりなり、顕微鏡ではクラウン状に観察され、人間の上部呼吸器疾患、動物の呼吸器、肝臓、神経、腸関連の疾患の原因となり、自然系には３グループのコロナウイルスが存在するが、これらの中でグループＩとグループＩＩは哺乳類に、そしてグループＩＩＩは鳥類に感染する。
【０００４】
自然系に知られているコロナウイルスは、時々免疫系が弱まっている人々に肺と関わる疾病を引き起こし、犬、猫、豚、ネズミ、鳥などの動物では深刻な疾病の原因ともなる。さらに、これは、極めて高い突然変異率を示すと共に、組換え率（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）もまたおよそ２５％と極めて高い方である。このような特性が既存のコロナウイルスの変異を起こして変種コロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）となり、動物から人間に伝播されたのではないかと考えられる。
【０００５】
世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）によれば、２００２年１１月から３１ヶ国において７，４４７名のＳＡＲＳ推定患者が発生し、そのうち５５１人が死亡した。２００３年現在、ＳＡＲＳ感染危険地域は、中国の北京、廣東、香港、内モンゴル、山西、天津、シンガポール、カナダのトロント、台湾、モンゴルのウーランバートル、そしてフィリピンなどが対象となっているものの、全世界的に広がる危険性を抱いている。
【０００６】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、２００２年の発生以来、ドイツの熱帯医学研究所が初めてＳＡＲＳウイルスの塩基配列の解読を施した。研究チームは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により遺伝子の増幅が可能な特定の遺伝子部位に対する塩基配列の解読を施した。解読の結果は、ドイツの生命工学企業であるアルツス社に供されてＳＡＲＳ感染検出キットを開発する上で活用され、このキットは、ＳＡＲＳが疑われる患者から検出したウイルス遺伝子を増幅させてＳＡＲＳウイルスの感染有無を知ることができる。
【０００７】
その後、ＳＡＲＳウイルス全長ゲノムの解読作業が行われ、これまで１２個以上の分離株に対する塩基配列が完全に分析されて知られている。この中で、最初に分離されたウルバニ（Ｕｒｂａｎｉ）株［ＳＡＲＳにより感染されて死亡したＷＨＯ派遣医師の名前を取った名］、ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ株（Ｒｏｔａ，ＰＡ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：５９５２，２００３；Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＹ２７８７４１）の全塩基配列がアメリカのＣＤＣ研究チームにより解読され、カナダのブリティッシュ・コロンビア癌研究センターのチームは、４月１２日、カナダのトロントの患者から分離したＳＡＲＳＴｏｒ２ウイルス株（Ｍａｒｒａ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：５９５３，２００３；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ２７４１１９）の全塩基配列を分析した。
【０００８】
両研究チームは、それぞれ異なる場所でＳＡＲＳに感染された患者から分離したコロナウイルスを分析したが、両ウイルスの塩基の違いは、僅か１５個に過ぎなかった。これは、ＳＡＲＳが同じウイルスにより誘発されるということを示唆している。また、ＳＡＲＳコロナウイルスのゲノム分析の結果、既存のコロナウイルスの蛋白質と同じ構成要素を有しているが、ゲノム及びゲノムによるアミノ酸は、わずかな相同性しか示さず、その中で、ネズミの肝炎ウイルスと七面鳥の気管支炎ウイルスに近いということが明らかになった。しかしながら、ＳＡＲＳコロナウイルスと他のコロナウイルスとの相関性は、分子系統の分類学的な分析により明らかになったが、既存のグループとは異なっていることが解った。
【０００９】
現在、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出は、最初にＰＣＲを行い、抗体検査の陽性判定はＥＬＩＳＡやＩＦＡにより行い、さらに、ウイルスの分離に関しては、ＰＣＲにより確診された検体について細胞培養検査によりウイルスを分離してＳＡＲＳコロナウイルスの感染を確定する。
【００１０】
ＳＡＲＳに対する根本的な治療方法はなく、保存的な支持療法があるだけである。現在、新しい伝染病であるＳＡＲＳの原因体としてのＳＡＲＳコロナウイルスに対する研究は初期段階に留まっているため、予防のためのワクチンは開発されておらず、世界的に予防ワクチンを開発するために多角的な研究が進んでいる。
【００１１】
微生物の細胞の表面に所望の蛋白質を付着して発現させる技術を、細胞表面発現（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術と呼んでいる。この細胞表面発現技術は、バクテリアや酵母など微生物の表面蛋白質を表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）として用いて外来蛋白質を表面に発現させる技術であり、組換え生ワクチンの生産、ペプチド／抗体ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の製作及びスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、全細胞吸着剤（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）、全細胞生物転換触媒（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｓｔ）など様々な応用範囲を有している技術である。この技術は、いかなる蛋白質を細胞の表面に発現させるかによってその応用範囲が決められ、この理由から、細胞表面発現技術を用いた産業的な応用潜在力は極めて高いと言える。
【００１２】
細胞表面発現技術を成功させるためには、表面発現母体が最も重要である。いかに効果的に外来蛋白質を細胞の表面に発現可能な母体を選定して開発するかが、この技術の核心となる。
【００１３】
このため、次のような性質を有する表面発現母体を選定する必要がある。
まず、第一に、外来蛋白質を細胞の表面まで送るために、外来蛋白が細胞内膜を通過可能にする分泌信号があること、第二に、細胞外膜の表面に安定的に外来蛋白質を付着可能にするターゲット信号があること、第三に、細胞の表面に多量に発現されるが、細胞の成長にほとんど影響しないこと、第四に、蛋白質の大小とは無関係に、外来蛋白質の３次元構造に変化を起こすことなく安定的に発現されること、などである。しかしながら、これらの条件をいずれも満足する表面発現母体は、まだ開発されていないのが現状である。
【００１４】
今まで知られて用いられている表面発現母体としては、大きく細胞外膜蛋白質、リポ蛋白質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、分泌蛋白質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、鞭毛蛋白質などの表面器官蛋白質の４種類が挙げられる。グラム陰性菌（Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）の場合、ＬａｍＢ，ＰｈｏＥ（Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：１６５８．，１９８７；Ａｇｔｅｒｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：８５，１９９０）、ＯｍｐＡなどの細胞外膜に存在する蛋白質を主として用いていた。加えて、リポ蛋白質であるＴｒａＴ（Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１，１９９１）、ＰＡＬ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９，１９９１）、そしてＬｐｐ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８９：２７１３，１９９２）なども用いられていた。さらに、ＦｉｍＡや１型（ｔｙｐｅ１）線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）のＦｉｍＨ接着因子（ａｄｈｅｓｉｎ）などの線毛蛋白質（Ｈｅｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８５：１１５，１９８９）、ＰａｐＡピル（ｐｉｌｕ）サブユニットなどのピリ（ｐｉｌｉ）蛋白質などを細胞表面発現母体として用い、外来蛋白質の発現を試みることもあった。これらの他にも、氷核活性蛋白質（ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：５７６，１９９８；Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：３４８，１９９８；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：６４５，２０００）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）のプルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）（Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｌ．，４：１１０１，１９９０）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｅｒｉａ）のＩｇＡプロテアーゼ（Ｋｌａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１９９１，１９９０）、大腸菌の接着因子であるＡＩＤＡ−１、赤痢菌のＶｉｒＧ蛋白質、ＬｐｐとＯｍｐＡの溶融蛋白質などが表面発現母体として使用できるという報告がある。グラム陽性菌（Ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）を用いる場合には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ及びＦｎＢＰＢ蛋白質を表面発現母体として用いてマラリア抗原を效果的に発現させた報告があり、乳酸バクテリアの表面コート（ｃｏａｔ）蛋白質を表面発現に用いたという報告と、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＭ６蛋白質（Ｍｅｄａｇｌｉｎｉ，Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２：６８６８，１９９５）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のＳ−ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡ１、枯草菌ＣｏｔＢなどグラム陽性バクテリアの表面蛋白質を母体として用いたという報告がある。
【００１５】
本発明者らは、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を新しい表面発現母体として用い、外来蛋白質を微生物の表面に效果的に発現させる新しいベクターとこのベクターにより形質転換された微生物の表面に外来蛋白質を多量発現させる方法を開発している（大韓民国特許出願番号第１０−２００１−４８３７３号）。
【００１６】
上記で紹介された表面発現母体を用い、病源体の抗原または抗原決定基を遺伝工学的な方法により大量生産が可能な細菌で安定的に発現しようとする研究が盛んに試みられている。特に、非病原性の細菌の表面に外来免疫原を発現させて生きている状態で経口投与する場合、従来の弱毒化された病原性細菌やウイルスを用いたワクチンよりも一層持続的で且つ強い免疫反応を誘導することができると報告されている。このような免疫反応の誘導は、細菌の表面構造物が表面発現された外来蛋白質の抗原性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を高めるアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）として機能するためであり、生きている状態の菌に対する体内の免疫反応によるものであると知られている。このような表面発現システムを用いた非病原性細菌の組換え生ワクチンの開発は、注目を浴びる価値のあるものである。
【００１７】
この理由から、本発明者らは、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を表面発現母体として用い、遺伝子及び蛋白質分析により選定したＳＡＲＳコロナウイルスの抗原を乳酸菌などの非病原性と食品安全性が保証された微生物の表面に多量発現することに成功し、この微生物を経口投与してＳＡＲＳコロナウイルスに対する体内の血中抗体生成能及び粘膜免疫を誘導させる一層経済的でかつ安定した予防ワクチンを開発するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、微生物の表面発現システムを活用してＳＡＲＳコロナウイルス抗原を発現可能なベクター及びこのベクターにより形質転換された微生物を提供するところにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、ＳＡＲＳコロナウイルスの抗原が表面に発現された、形質転換された微生物、この微生物から抽出されたＳＡＲＳコロナウイルス抗原または前記微生物から精製されたＳＡＲＳコロナウイルス抗原を有効性分として含有するＳＡＲＳ予防用ワクチンを提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するために、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上及び、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質をコードする遺伝子と、を含む表面発現ベクターを提供する。
【００２１】
本発明において、前記表面抗原蛋白質遺伝子としては、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質をコードする遺伝子であればいずれも用いることができ、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質遺伝子を単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできる。また、前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子には、ｐｇｓＡが含まれていることが好ましい。前記スパイク抗原蛋白質はＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＢ，ＳＡＲＳＳＣ，ＳＡＲＳＳＤまたはＳＡＲＳＳＢＣであっても良く、ヌクレオカプシド抗原蛋白質はＳＡＲＳＮＡ，ＳＡＲＳＮＢまたはＳＡＲＳＮであっても良い。
【００２２】
また、本発明は、前記発現ベクターにより形質転換された微生物及びこの微生物を培養することを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質の製造方法を提供する。
【００２３】
本発明に用いられる微生物は、生体への適用時に毒性がなく、弱毒化された微生物であれば特に制限がない。例えば、グラム陰性菌として大腸菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ビブリオコレラ、ウシ型結核菌、赤痢菌などを、そして、グラム陽性菌としてバチルス、乳酸菌、乳酸連鎖菌、ブドウ状球菌、リステリア菌及び連鎖球菌などを好適に選択することができる。特に、乳酸菌のように食用可能な微生物を選択することが好ましい。
【００２４】
さらに、本発明は、前記抗原蛋白質が表面に発現された微生物そのものを用いるか、あるいは、前記微生物を破壊して細胞膜成分を粗抽出した物質を用いるか、あるいは、前記微生物から精製された抗原蛋白質を有効性分として含有するＳＡＲＳ予防用ワクチンを提供する。
【００２５】
本発明に係るワクチンは、ＳＡＲＳコロナウイルスにより誘発される重症急性呼吸器症候群の予防用医薬品として用いることができる。
【００２６】
本発明に係るワクチンは、経口用または食用として摂取することもでき、皮下または腹腔に注射することもでき、さらには、鼻腔投与することもできる。
【００２７】
ＳＡＲＳコロナウイルスの感染は、感染性飛沫による呼吸器感染により引き起こされると知られていることから、呼吸器の粘膜組織の表面（ｍｕｃｏｓａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）でおこると考えられる。この理由から、粘膜免疫による感染の防御は極めて重要である。ＳＡＲＳコロナウイルスの抗原を表面に発現する微生物は、粘膜における抗体形成（ｍｕｃｏｓａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を一層効果的に誘導できるという長所を有しており、上記の形質転換された微生物それ自体を用いた経口用ワクチンあるいは鼻腔投与ワクチンが非経口用（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ワクチンよりも、ＳＡＲＳコロナウイルスを防御する上で一層効果的であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の目的及び利点は、添付の図面と併せて、詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【図１】図１は、豚伝染性胃腸炎ウイルスの抗原性４部位（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）とＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質との関係をカイト・ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）方法による親水性プロット（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｐｌｏｔ）、ジェームソン・ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−ｗｏｌｆ）方法による抗原インデックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）、そしてエミニ（Ｅｍｉｎｉ）方法による表面確率プロット（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｐｌｏｔ）を通じて分析した結果を示すものである。
【図２】図２は、豚伝染性胃腸炎ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質とＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質との関係をカイト・ドゥーリトル方法による親水性プロット、ジェームソン・ウルフ方法による抗原インデックス、そしてエミニ方法による表面確率プロットを通じて分析した結果を示すものである。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明に係るグラム陰性及びグラム陽性微生物を宿主とする表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡの遺伝子マップである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明に係るｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣの遺伝子マップである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明に係るｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣの遺伝子マップである。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明に係る転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを示す遺伝子マップである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明に係るｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮの遺伝子マップである。
【図５Ａ】図５Ａは、乳酸菌において細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＡ抗原の発現を、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との特異的な結合を用いて免疫ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより確認したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、乳酸菌において細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＣ抗原の発現を、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との特異的な結合を用いて免疫ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより確認したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、乳酸菌において細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＢＣ抗原の発現を、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との特異的な結合を用いて免疫ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより確認したものである。
【図６Ａ】図６Ａは、細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＡ抗原の乳酸菌表面発現を、乳酸菌細胞を分画した蛋白質をｐｇｓＡに対する特異抗体に結合させ、免疫ブロットを行うことにより確認したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＢＣ抗原の乳酸菌表面発現を、乳酸菌細胞を分画した蛋白質をｐｇｓＡに対する特異抗体に結合させ、免疫ブロットを行うことにより確認したものである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＳＡＲＳＳＢＣ抗原の乳酸菌表面発現を蛍光活性細胞選別測定法（ＦＡＣＳｃａｎ ａｓｓａｙ）により確認したものである。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＮＢとＳＡＲＳＮ抗原の乳酸菌表面発現を、乳酸菌細胞を分画した蛋白質をｐｇｓＡに対する特異抗体と結合させ、免疫ブロットを行うことにより確認したものである。
【図８】図８は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められた乳酸菌カセイ株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの血清内のＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣ抗原に対するＩｇＧ抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）により測定した結果である。
【図９】図９は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められたカセイ菌株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの腸及び気管支、肺胞洗浄液内のＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣ抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。
【図１０】図１０は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められた乳酸菌カセイ株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの血清内のＳＡＲＳＮＢ抗原基に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。
【図１１】図１１は、本発明に係る表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ１ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりそれぞれ形質転換され、抗原基の表面発現が認められた乳酸菌カセイ株を経口と鼻腔でそれぞれ投与したマウスの腸及び気管支、肺胞洗浄液内のＳＡＲＳＮＢ抗原基に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００３０】
特に、下記の実施例においては、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位の遺伝子及びヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位の遺伝子を適用しているが、これに限定されることなく、いかなる抗原蛋白質遺伝子も単独で、あるいは２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３１】
さらに、下記の実施例においては、バチルスサブチリスチョンククチャン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ；ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ）からポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＢＣＡを得て用いているが、遺伝子はポリ−γ−グルタミン酸を生産するいかなるバチルス属菌株からｐｇｓＢＣＡを得て製造されたベクターまたはこのベクターを用いた形質転換された微生物なども本発明の範囲に含まれると言える。例えば、バチルスサブチリスチョンククチャンに存在するｐｇｓＢＣＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他の菌株由来のｐｇｓＢＣＡ遺伝子を用いてワクチン用ベクターを製造したり、これを用いたりすることも本発明の範囲に含まれるであろう。
【００３２】
また、下記の実施例においては、遺伝子ｐｇｓＢＣＡのうちｐｇｓＡだけを用いて表面発現用ベクターを製作しているが、間接的な実施例から類推できるように、遺伝子ｐｇｓＢＣＡの全部または一部だけを用いてワクチン用ベクターを製作することも本発明の範囲に含まれるであろう。
【００３３】
さらに、下記の実施例においては、前記ベクターに対する宿主として、グラム陰性細菌であるチフス菌とグラム陽性細菌である乳酸菌のみを用いているが、この細菌の他に、いかなるグラム陰性菌またはグラム陽性菌も本発明に係る方法により形質転換させると、同じ結果が得られるということも、当業者にとっては明らかである。
【００３４】
さらに、下記の実施例においては、ワクチン用ベクターにより形質転換された微生物そのものを生ワクチンとして生体に適用した例のみが示してある。しかしながら、ワクチン関係の技術分野の知識からみて、前記微生物から粗抽出された発現蛋白質（ＳＡＲＳコロナウイルスの抗原蛋白質）または精製された発現蛋白質を生体に適用しても同一、あるいは類似の結果が得られるということは言うまでもない。
【００３５】
実施例１：ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位の遺伝子の合成
ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質は、１２５６アミノ酸よりなる糖蛋白質である。多くの研究が進んでいる他のコロナウイルスの場合、スパイク蛋白質のほとんどがウイルス粒子の表面を包んでいる外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質に挿入されて外部に露出されるような構造となっており、このような露出部位及び抗原性部位がウイルス感染を引き起こし、感染を防ぐためのワクチンの目的抗原としてその研究が盛んに行われている。
【００３６】
このため、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質１２５６アミノ酸のうち抗原性を示す部位を選定するために、抗原性に関する多くの研究がなされている他の豚伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ：ＴＧＥコロナウイルス）のスパイク蛋白質との蛋白質の比較分析及び構造的な比較分析を通じて抗原性部位を選定し、これを合成した。具体的に、豚伝染性胃腸炎ウイルスのスパイク蛋白質の抗原性部位は４つの部位（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）であることが良く知られている（Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８３：２２５，１９９１）。これらの部位とＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質との関係を、カイト・ドゥーリトル方法による親水性プロット、ジェームソン・ウルフ方法による抗原インデックス、そしてエミニ方法による表面確率プロットにより分析した後、ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）のスパイク蛋白質塩基配列のうちからＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＢ，ＳＡＲＳＳＣ及びＳＡＲＳＳＤを選定した（図１）。
【００３７】
まず、全ての塩基配列が分析されたＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離物のスパイク蛋白質の塩基配列（２１４９２−２５２５９塩基、１２５５アミノ酸）に基づき、抗原性部位であると予想される２〜１１４のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＡと命名し、３７５〜４７０のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＢと命名し、５１０〜５９６のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＣと命名し、そして、１１１７〜１１９７のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＳＤと命名した。これらの抗原性部位のうちＳＡＲＳＳＡとＳＡＲＳＳＣ部位の遺伝子を合成した。
まず、ＳＡＲＳＳＡと命名した１１３の長さのアミノ酸に相当する遺伝子を合成するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ないし８のプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅された３３９ｂｐのＳＡＲＳＳＡ遺伝子を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｔａｔｔｔｔｃｔｔａｔｔａｔｔｔｃｔｔａｃｔｃｔｃａｃｔａｇｔｇｇｔａｇｔｇａｃｃｔｔｇａｃｃｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
５’−ｔｇａｇｔｇｔａａｔｔａｇｇａｇｃｔｔｇａａｃａｔｃａｔｃａａａａｇｔｇｇｔａｃａａｃｇｇｔｃａａｇｇｔｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
５’−ａａｔｔａｃａｃｔｃａａｃａｔａｃｔｔｃａｔｃｔａｔｇｃｇｔｇｇｇｇｔｔｔａｃｔａｔｃｃｔｇａｔｇａａａｔｔｔｔｔｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
５’−ａａａａｔｇｇａａｇａａａｔａａａｔｃｃｔｇａｇｔｔａａａｔａａａｇａｇｔｇｔｃｔｇａａｃｇａａａａａｔｔｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
５’−ｃｔｔｃｃａｔｔｔｔａｔｔｃｔａａｔｇｔｔａｃｔｇｇｇｔｔｔｃａｔａｃｔａｔｔａａｔｃａｔａｃｇｔｔｔｇｇｃａａｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
５’−ｇｇｃａｇｃａａａａｔａａａｔａｃｃａｔｃｃｔｔａａａａｇｇａａｔｇａｃａｇｇｇｔｔｇｃｃａａａｃｇｔａｔｇ−５’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
５’−ａｔｔｔａｔｔｔｔｇｃｔｇｃｃａｃａｇａｇａａａｔｃａａａｔｇｔｔｇｔｃｃｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｔｔｔｇｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
５’−ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔａｃａｃａｇａｃｔｇｔｇａｃｔｔｇｔｔｇｔｔｃａｔｇｇｔａｇａａｃｃａａａａａｃｃｃ−３’
【００３８】
ＳＡＲＳＳＣと命名した８７の長さのアミノ酸に相当する遺伝子を合成するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ないし１４の塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅された２６１ｂｐのＳＡＲＳＳＣ遺伝子を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
５’−ｇｇａｔｃｃｇｔｔｔｇｔｇｇｔｃｃａａａａｔｔａｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔａｔｔａａｇａａｃｃａｇｔｇｔｇｔｃａａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：
５’−ｇａａｇａａｇｇａｇｔｔａａｃａｃａｃｃａｇｔａｃｃａｇｔｇａｇａｃｃａｔｔａａａａｔｔａａａａｔｔｇａｃａｃａｃｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：
５’−ａａｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃａａａｇｃｇｔｔｔｔｃａａｃｃａｔｔｔｃａａｃａａｔｔｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｇｔｔｔｃｔｇａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：
５’−ｃｔａａａａｔｔｔｃａｇａｔｇｔｔｔｔａｇｇａｔｃａｃｇａａｃａｇａａｔｃａｇｔｇａａａｔｃａｇａａａｃａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：
５’−ｃｔｇａａａｔｔｔｔａｇａｃａｔｔｔｃａｃｃｔｔｇｔｇｃｔｔｔｔｇｇｇｇｇｔｇｔａａｇｔｇｔａａｔｔａｃａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：
５’−ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔａａａｃａｇｃａａｃｔｔｃａｇａｔｇａａｇｃａｔｔｔｇｔａｃｃａｇｇｔｇｔａａｔｔａｃ−３’
【００３９】
合成による抗原部位遺伝子の確保以外に、Ｃａｎａｄａ’ｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから購入したＳＡＲＳスパイクｃＤＮＡクローン（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２）を鋳型として２６４〜５９６のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５及び１６のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させ、９９６ｂｐサイズの遺伝子を確保し、これをＳＡＲＳＳＢＣと命名した［この遺伝子は、中和抗体を生成するための重要な部位を含有している（ＰＮＡＳ，１０１：２５３６，２００４）］。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ＳＢＣｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃｔｃａａｇｔａｔｇａｔｇａａａａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（ＳＢＣａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｔｔａａａｃａｇｃａａｃｔｔｃａｇａ−３’
【００４０】
実施例２：ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位の遺伝子の合成
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質は、４２２アミノ酸よりなる蛋白質である。多くの研究が進んでいる他のコロナウイルスの場合、ヌクレオカプシド蛋白質のほとんどが抗原として作用するという報告があり、この部位をコロナウイルスの感染を防ぐためのワクチンの目的抗原として用いようとする研究が盛んになされている。
【００４１】
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質のアミノ酸のうち抗原性を示す部位を豚伝染性胃腸炎コロナウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ、ＴＧＥ コロナウイルス）のヌクレオカプシド蛋白質との比較分析により抗原性部位を選定して合成した。
【００４２】
具体的に、豚伝染性胃腸炎ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質とＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質との関係をカイト・ドゥーリトル方法による親水性プロット、ジェームス・ウルフ方法による抗原インデックス、そしてエミニ方法による表面確率プロットにより分析した後、ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離株のヌクレオカプシド蛋白質の塩基配列のうちからＳＡＲＳＮＡ及びＳＡＲＳＮＢを選定した（図２）。
【００４３】
まず、全ての塩基配列が分析されたＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２分離株のヌクレオカプシド蛋白質の塩基配列（２８１２０−２９３８８塩基、４２２アミノ酸）に基づき、抗原性部位であると予想される２〜１５７のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＮＡと命名し、１６３〜３０５のアミノ酸部位を選択してＳＡＲＳＮＢと命名し、本発明においては、ＳＡＲＳＮＢ部位の遺伝子を合成した。
【００４４】
ＳＡＲＳＮＢと命名した１４３長さのアミノ酸に相当する遺伝子を合成するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ないし２６の塩基配列をプライマーとして用いたＰＣＲを行い、増幅された４２９ｂｐのＳＡＲＳＮＢ遺伝子を得た。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：
５’−ｇｇａｔｃｃｃｃｔｃａａｇｇｔａｃａａｃａｔｔｇｃｃａａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｇｃａｇａｇｇｇｔａｇｃｃｇｔｇｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：
５’−ａｃｃａｃｇａｃｔａｃｇｔｇａｔｇａａｇａａｃｇａｇａａｇａｇｇｃｔｔｇａｃｔｇｃｃｇｃｃａｃｇｇｃｔａｃｃ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：
５’−ｃａｃｇｔａｇｔｃｇｔｇｇｔａａｔｔｃａｃｇｔａａｔｔｃａａｃｔｃｃｔｇｇｃａｇｃａｇｔｃｇｔｇｇｔａａｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：
５’−ｇｃｇａｇｇｇｃａｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｃｔａｇｃｃａｔａｃｇａｇｃａｇｇａｇａａｔｔａｃｃａｃｇａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：
５’−ｇａａａｃｔｇｃｃｃｔｃｇｃａｃｔｔｔｔｇｃｔｇｃｔｔｇａｃｃｇｔｔｔｇａａｃｃａｇｃｔｔｇａｇａｇｃａａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：
５’−ｔａｇｔｇａｃａｇｔｔｔｇａｃｃｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇａａａｃｔｔｔｇｃｔｃｔｃａａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：
５’−ｃａａａｃｔｇｔｃａｃｔａａｇａａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｇｃａｔｃｔａａａａａｇｃｃｔｃｇｔｃａａａａａｃｇｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：
５’−ｇｇａｃｃａｃｇａｃｇｃｃｃａａａｔｇｃｔｔｇａｇｔｇａｃｇｔｔｇｔａｃｔｇｔｔｔｔｇｔｇｇｃａｇｔａｃｇｔｔｔｔｔｇ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：
５’−ｇｇｇｃｇｔｃｇｔｇｇｔｃｃａｇａａｃａａａｃｃｃａａｇｇｔａａｔｔｔｃｇｇｇｇａｃｃａａｇａｃｃｔｔａｔｃｃｇｔ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：
５’−ｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔａｔｔａａａｔｔｔｇｃｇｇｃｃａａｔｇｔｔｔｇｔａａｔｃａｇｔａｃｃｔｔｇａｃｇｇａｔａａｇｇ−３’
【００４５】
また、合成による抗原部位遺伝子の確保の以外に、Ｃａｎａｄａ’ｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから購入したＳＡＲＳヌクレオカプシドｃＤＮＡクローン（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２）を鋳型としてヌクレオカプシドの２〜３０５のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させ、９１２ｂｐサイズの遺伝子を確保し、これをＳＡＲＳＮと命名した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７（Ｎｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｃｔｇａｔａａｔｇｇｔｃｃｇｃａａ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８（Ｎａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）：５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｔｔａａａｔｔｔｇｃｇｇｃｃａａｔｇｔｔｔ−３’
【００４６】
実施例３：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用いてグラム陰性微生物及びグラム陽性微生物を宿主としてＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＳＡ及びＳＣを表面発現可能な表面発現ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣを構築した。
【００４７】
まず、ヒト乳頭腫ウイルスのＬ１抗原を有しグラム陰性及びグラム陽性微生物を宿主とする表面発現用ベクター（グラム陰性及びグラム陽性汎用ベクターであるｐＡＴに恒常的高発現プロモータであるＨＣＥプロモータ、ポリ−γ−グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡ、そしてＨＰＶＬ１を含む転換ベクター）に、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣを導入するために、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１（ＫＣＴＣ１０３４９ＢＰ）をＢａｍＨＩとＫｐｎＩに切断し、ＨＰＶＬ１遺伝子を除去して表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡを用意した。
【００４８】
前記実施例１において合成されたＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣ抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩにそれぞれ切断してあらかじめ用意した表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端部位に翻訳コドンを合わせてそれぞれ連結し、転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣをそれぞれ製作した（図３Ａ及び図３Ｂ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣを用いてグラム陽性細菌である乳酸菌を形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣプラスミドの存在をそれぞれ確認した。
【００４９】
実施例４：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ：ＳＡＲＳＳＢＣの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用い、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＳＢＣを表面発現可能なベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣを構築した。
【００５０】
まず、前記実施例３の方法と同様にしてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ表面発現用ベクターを用意した後、前記実施例１におけるＳＡＲＳコロナウイルスのＳＡＲＳスパイクｃＤＮＡクローンを鋳型として２６４〜５９６のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅させた９９６ｂｐサイズのＳＡＲＳＳＢＣ遺伝子を表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡに挿入し、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣを製作した（図３Ｃ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣを用い、グラム陽性細菌である乳酸菌を形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣプラスミドの存在を確認した。
【００５１】
実施例５：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ：ＳＡＲＳＮＢの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用い、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＮＢを表面発現可能なベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを構築した。
【００５２】
まず、前記実施例３の方法と同様にしてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ表面発現用ベクターを用意した後、前記実施例２において合成されたＳＡＲＳＮＢ抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩに切断して用意した表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ−末端部位に翻訳コドンを合わせて連結し、転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを製作した（図４Ａ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを用いてグラム陽性細菌である乳酸菌を形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢプラスミドの存在を確認した。
【００５３】
実施例６：表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮの構築
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用い、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質内の抗原性部位ＳＡＲＳＮを表面発現可能なベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮを構築した。
【００５４】
まず、前記実施例３の方法と同様にしてｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ表面発現用ベクターを用意した後、前記実施例２におけるＳＡＲＳコロナウイルスのＳＡＲＳヌクレオカプシドｃＤＮＡクローンを鋳型として２〜３０５のアミノ酸部位をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅させて得られた９１２ｂｐサイズの遺伝子ＳＡＲＳＮを表面発現ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡに挿入してｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮを製作した（図４Ｂ）。製作された表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮを用いてグラム陽性細菌である乳酸菌に形質転換させた後、乳酸菌内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮプラスミドの存在を確認した。
【００５５】
実施例７：ＳＡＲＳウイルススパイク抗原蛋白質の乳酸菌の表面発現の確認
前記表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣによりそれぞれ乳酸菌を形質転換させた後、それぞれの抗原蛋白質の発現を調べてみた。
【００５６】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端とそれぞれ融合されたＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原内の抗原性部位の発現を、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣで、形質転換することにより誘導し、形質転換された乳酸菌カゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）、３７℃で静置培養、増殖させた。
【００５７】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡに対する特異抗体を用いたウェスタン免疫ブロットを行い、前記それぞれのスパイク抗原発現を確認した。具体的に、発現が誘導された乳酸菌カゼイの全細胞を同じ細胞濃度で得た蛋白質に変性して試料を用意し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後、分画された蛋白質をＰＶＤＦメンブレン（ポリビニリデン−ジフルオリドメンブレン；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）メンブレンに転写した。蛋白質が移されたＰＶＤＦメンブレンをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５％スキムミルク、ｐＨ８．０）で１時間振ってブロッキングさせた後、ｐｇｓＡに対するウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して１２時間反応させた。
【００５８】
反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、ウサギに対するビオチン結合２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して４時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、アビジン・ビオチン（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）試薬を１時間反応させて再洗浄した。洗浄されたメンブレンに基質と発色試薬としてＨ２０２とＤＡＢ溶液を加えて発色させ、ｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との間の特異的な結合を確認した（図５）。図５Ａにおいて、レーン１は、形質転換されていない宿主細胞である乳酸菌カゼイであり、レーン２，３及び４は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ／乳酸菌カゼイである。図５Ｂにおいて、レーン１は形質転換されていない宿主細胞である乳酸菌カゼイであり、レーン２，３，４，５及び６は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ／乳酸菌カゼイである。図５Ｃにおいて、レーン１は形質転換されていない宿主細胞である乳酸菌カゼイであり、レーン２は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ／乳酸菌カゼイである。
【００５９】
図５に示すように、それぞれの乳酸菌の全細胞から、特異融合蛋白質［約５４ｋＤａのｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ（図５Ａ）、約５１ｋＤａのｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ（図５Ｂ）及び約７８ｋＤａのｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ（図５Ｃ）］を確認することができた。
【００６０】
また、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳ：ＳＢＣの表面発現ベクターにより形質転換された乳酸菌において、ｐｇｓＡによりそれぞれの抗原蛋白質が乳酸菌の表面に発現されているかどうかを確認するために、それぞれのベクターにより形質転換された乳酸菌を超遠心分離機を用いた細胞分画法により細胞壁と細胞質に分画した後、それぞれの融合蛋白質の位置をｐｇｓＡに対する特異抗体を用いたウェスタン免疫ブロット法により確認した。
【００６１】
具体的に、上記の方法により融合蛋白質の表面発現が誘導された乳酸菌を形質転換されていない乳酸菌と同じ細胞濃度になるように集菌し、細胞をＴＥＳ緩衝溶液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，１ｍＭのＥＤＴＡ、２５％スクロース）で数回洗浄した後、５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１ｍＭのＰＭＳＦ、そして１ｍＭのＥＤＴＡが含まれた蒸溜水で浮遊させ、−６０℃と常温で凍結融解を数回繰り返した後、ＤＮａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍＬ）とＲＮａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、超音波処理して細胞を破壊した。次いで、細胞破砕液を４℃、２０分間１０，０００×ｇ遠心分離して破壊されていない全乳酸菌（ペレット；全細胞分画）と細胞破片（上澄み液）を分離し、分離された細胞破片を４℃、１時間２１，０００×ｇで遠心分離して乳酸菌の細胞質蛋白質を含む上澄液（可溶分画）とペレットを得た。前記得られたペレットを１％ＳＤＳを含むＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍのＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）に浮遊させ、乳酸菌の細胞壁蛋白質（細胞壁の分画）を得た。
【００６２】
それぞれの分画に対し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡ抗原に対する抗体を用いたウェスタン免疫ブロットを行い、それぞれの乳酸菌分画のうちｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原が細胞壁に位置していることを確認した（図６）。図６Ａにおいて、レーン１は、形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。図６Ｂにおいて、レーン１は、形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。
【００６３】
図６に示すように、乳酸菌の全細胞及び細胞壁の分画により、約５４ＫｄａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＡ蛋白質、及び約７８ｋＤａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＳＢＣ蛋白質を確認することができた。この結果から、ｐｇｓＡと融合されたそれぞれのＳＡＲＳ抗原の蛋白質が発現され、ｐｇｓＡにより乳酸菌の表面へ移動して位置するということを確認することができた。
【００６４】
また、ＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原の抗原基の発現がポリ−γ−グルタミン酸合成蛋白質ｐｇｓＡのＣ末端との融合により乳酸菌の表面に発現されることを蛍光活性細胞選別測定方法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認した。
【００６５】
免疫蛍光染色のために発現を誘導させた乳酸菌を同じ細胞濃度になるように集菌し、細胞を緩衝溶液（ＰＢＳバッファ、ｐＨ７．４）で数回洗浄した後、１％の牛血清アルブミンを含有する緩衝溶液１ｍＬに浮遊させてＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原に対するマウス由来のポリクローナル１次抗体を１０００倍希釈し、４℃で１２時間反応させた。反応が終わった細胞は緩衝溶液で数回洗浄し、１％の牛血清アルブミンを含有する緩衝溶液１ｍＬに浮遊させた後、ビオチンが結合されている２次抗体を１０００倍希釈して４℃で３時間反応させた。また、反応が終わった細胞は緩衝溶液で数回洗浄し、１％の牛血清アルブミンを含む緩衝溶液０．１ｍＬに浮遊させた後、ビオチンに特異的なストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）染色試薬を１０００倍希釈して結合させた。
【００６６】
反応が終わった乳酸菌を数回洗浄し、蛍光活性細胞選別測定方法により測定した結果、形質転換されていない乳酸菌と比較し、ＳＡＲＳウイルスのＳＢＣスパイク抗原蛋白質が乳酸菌の表面に発現されていることを確認した（図６Ｃ）。図６Ｃにおいて、灰色は形質転換されていない乳酸菌カゼイ由来のものであり、白色は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣ／乳酸菌カゼイ由来のものである。図６Ｃに示すように、形質転換されていない乳酸菌カゼイでは蛍光発現が検出されなかったが、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣベクターにより形質転換された乳酸菌では、ＳＢＣスパイク抗原蛋白質が表面発現されていることを明らかに確認することができた。
【００６７】
実施例８：ＳＡＲＳウイルスヌクレオカプシド抗原蛋白質の乳酸菌の表面発現の確認
前記表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮによりそれぞれ乳酸菌を形質転換させた後、それぞれの抗原蛋白質発現を調べてみた。
【００６８】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端とそれぞれ融合されたＳＡＲＳウイルスのヌクレオカプシド抗原の発現を、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮで形質転換することにより誘導し、それぞれ形質転換された乳酸菌カゼイをＭＲＳ培地を使用し、３７℃で静置培養して増殖させた。
【００６９】
ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳ Ｎ表面発現ベクターにより形質転換された乳酸菌において、ｐｇｓＡによりそれぞれの抗原蛋白質が乳酸菌の表面に発現されているかどうかを確認するために、前記実施例７の方法と同様な方法であるそれぞれのベクターにより形質転換された乳酸菌を超音波処理を用いた細胞分画法により細胞壁と細胞質に分画した後、それぞれの融合蛋白質の位置をｐｇｓＡに対する特異抗体をもってウェスタンブロットを行うことにより確認した。
【００７０】
その結果、それぞれの分画に対し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡ抗原に対する抗体を用いたウェスタン免疫ブロットを行い、それぞれの乳酸菌分画のうちｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳウイルスのヌクレオ抗原が細胞壁に位置していることを確認した（図７）。図７Ａにおいて、レーン１は形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。図７Ｂにおいて、レーン１は形質転換されていない乳酸菌カゼイであり、レーン２は、形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮ／乳酸菌カゼイの全細胞であり、レーン３及び４はそれぞれ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮにより形質転換された菌株の可溶分画及び細胞壁の分画である。
【００７１】
図７に示すように、乳酸菌の全細胞と細胞壁の分画に、約５７ｋＤａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＮＢ蛋白質及び約７５ｋＤａのｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳＮ蛋白質を確認することができた。この結果から、ｐｇｓＡと融合されたそれぞれのＳＡＲＳ抗原蛋白質が発現されてｐｇｓＡにより乳酸菌の表面へ移動して位置していることを確認することができた。
【００７２】
実施例９：ＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質が表面発現された乳酸菌のワクチン効果の分析
上記の実施例において得られた表面発現用転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢによりグラム陽性菌である乳酸菌カゼイを形質転換させ、前記抗原を乳酸菌カゼイにより表面発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜蛋白質ｐｇｓＡと融合されたＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質の抗原性をマウスモデルを用いて調べてみた。
【００７３】
具体的に、本発明の表面発現転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢを乳酸菌カゼイに形質転換させ、それぞれ同じ細菌濃度になるように集菌した細胞を緩衝溶液（ＰＢＳバッファ、ｐＨ７．４）で数回洗浄を行い、抗原が表面発現された乳酸菌５×１０９菌を４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの口腔に１日置きに３回、そして１週後さらに１日置きに３回、そして同様に、２週後に１日置きに３回投与した後、さらに４週後に１日置きに３回投与した。また、抗原が表面発現された乳酸菌１×１０９菌をマウスの鼻腔に１日置きに３回、そして１週後にさらに１日置きに３回、そして２週後には２日置きに２回投与した後、さらに４週後に２日置きに２回投与した。それぞれの経口と鼻腔投与後、２週置きにそれぞれの（１）マウス群血清を取って血清内のスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質に対するＩｇＧ抗体価、及び（２）マウスの腸の内部を洗った浮遊液内及び気管支と肺胞の内部を洗った浮遊液内におけるスパイク抗原蛋白質及びヌクレオカプシド抗原蛋白質に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ方法により抗原に対する抗体価を測定した。
【００７４】
４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス１０頭を１群として定め、ＳＡＲＳＳＡ及びＳＡＲＳＳＣをそれぞれ発現する乳酸菌を混合して１群とし、ＳＡＲＳＮＢを発現する乳酸菌を１群とし、ＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＣ、そしてＳＡＲＳＮＢをそれぞれ発現する乳酸菌を混合して１群とした。これらの３群をさらに経口投与群と鼻腔投与群に分離し、対照群を含んで合計８群をもって実験を行った。
【００７５】
図８は、マウス血清内のＳＡＲＳウイルスのスパイク抗原蛋白質であるＳＡ及びＳＣ抗原に対するＩｇＧ抗体価を示すものである。図９は、腸の内部を洗った浮遊液及び気管支と肺胞の内部を洗った浮遊液内におけるスパイク抗原蛋白質であるＳＡ及びＳＣ抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により示すものであり、Ａは、経口投与群におけるＩｇＡ抗体価を示し、Ｂは、鼻腔投与群におけるＩｇＡ抗体価を示す。
【００７６】
また、図１０は、マウス血清内のＳＡＲＳウイルスのヌクレオカプシド抗原蛋白質であるＮＢ抗原に対するＩｇＧ抗体価を示すものである。図１１は、腸の内部を洗った浮遊液及び気管支と肺胞の内部を洗った浮遊液におけるヌクレオカプシド抗原蛋白質であるＮＢ抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により示すものであり、Ａは、経口投与群におけるＩｇＡ抗体価を示し、Ｂは、鼻腔投与群におけるＩｇＡ抗体価を示す。
【００７７】
図８ないし図１１に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣ及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢにより形質転換させた乳酸菌をそれぞれあるいは混合して投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の血清、腸内洗浄液及び気管支、肺洗浄液においてＳＡＲＳウイルスのスパイク及びヌクレオカプシド抗原蛋白質の抗原基に対するＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価が対照群に比べてかなり高いということを確認することができた。
【００７８】
これより、本発明に係るＳＡＲＳウイルスのスパイク及びヌクレオカプシド抗原蛋白質の抗原基が表面発現された微生物は、生ワクチンとして效果的に作用できたということが分かった。
【００７９】
以上、本発明の特定の部分について詳細に記述したが、前期実施態様により本発明の範囲が制限されるものではなく、添付された請求項によって定義される筈である。この分野における通常の知識を有する者にとって、本発明の範囲及び思想から逸脱することのない実施態様の変更又は改良ができることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
上述したように、本発明に係るＳＡＲＳ誘発コロナウイルスの抗原蛋白質を表面発現する形質転換微生物及び前記微生物から抽出・精製された抗原蛋白質は、ＳＡＲＳの治療用または予防用ワクチンとして用いることができる。特に、本発明に係るＳＡＲＳコロナウイルス抗原を発現する組換え菌株は、経口ワクチンを経済的に生産することができるという長所を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上、及びＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質をコードする遺伝子と、を含む表面発現ベクター。
【請求項２】
前記スパイク抗原蛋白質は、ＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＢ，ＳＡＲＳＳＣ，ＳＡＲＳＳＤまたはＳＡＲＳＳＢＣである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ヌクレオカプシド抗原蛋白質は、ＳＡＲＳＮＡ，ＳＡＲＳＮＢまたはＳＡＲＳＮである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣまたはｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣである請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢまたはｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮである請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換された微生物。
【請求項７】
前記微生物は、大腸菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ビブリオコレラ、ウシ型結核菌、赤痢菌、バチルス、乳酸菌、ブドウ状球菌、リステリア菌及び連鎖球菌よりなる群から選ばれる請求項６に記載の形質転換された微生物。
【請求項８】
請求項６に記載の微生物を培養することを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる抗原蛋白質を有効性分として含有するＳＡＲＳウイルス予防用ワクチン。
【請求項１０】
前記抗原蛋白質は、微生物の表面に発現された形であるか、粗抽出された形であるか、または精製された形である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
経口用投与または食用摂取が可能である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
皮下または腹腔注射用である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
鼻腔投与用である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記微生物は、乳酸菌である請求項８記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により得られ、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質が表面に発現された乳酸菌。
【請求項１６】
請求項１５に記載の乳酸菌、前記乳酸菌から抽出された抗原蛋白質または前記乳酸菌から精製された抗原蛋白質を有効性分として含有するＳＡＲＳ予防用ワクチン。
【請求項１７】
経口用投与または食用摂取が可能である請求項１６記載のワクチン。
【請求項１８】
皮下または腹腔注射用である請求項１６記載のワクチン。
【請求項１９】
鼻腔投与用である請求項１６記載のワクチン。
【請求項１】
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡのいずれか１種または２種以上、及びＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質をコードする遺伝子と、を含む表面発現ベクター。
【請求項２】
前記スパイク抗原蛋白質は、ＳＡＲＳＳＡ，ＳＡＲＳＳＢ，ＳＡＲＳＳＣ，ＳＡＲＳＳＤまたはＳＡＲＳＳＢＣである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ヌクレオカプシド抗原蛋白質は、ＳＡＲＳＮＡ，ＳＡＲＳＮＢまたはＳＡＲＳＮである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＡ，ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＣまたはｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＳＢＣである請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮＢまたはｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＳＡＲＳＮである請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換された微生物。
【請求項７】
前記微生物は、大腸菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ビブリオコレラ、ウシ型結核菌、赤痢菌、バチルス、乳酸菌、ブドウ状球菌、リステリア菌及び連鎖球菌よりなる群から選ばれる請求項６に記載の形質転換された微生物。
【請求項８】
請求項６に記載の微生物を培養することを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる抗原蛋白質を有効性分として含有するＳＡＲＳウイルス予防用ワクチン。
【請求項１０】
前記抗原蛋白質は、微生物の表面に発現された形であるか、粗抽出された形であるか、または精製された形である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
経口用投与または食用摂取が可能である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
皮下または腹腔注射用である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
鼻腔投与用である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記微生物は、乳酸菌である請求項８記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により得られ、ＳＡＲＳコロナウイルスのスパイク抗原蛋白質またはヌクレオカプシド抗原蛋白質が表面に発現された乳酸菌。
【請求項１６】
請求項１５に記載の乳酸菌、前記乳酸菌から抽出された抗原蛋白質または前記乳酸菌から精製された抗原蛋白質を有効性分として含有するＳＡＲＳ予防用ワクチン。
【請求項１７】
経口用投与または食用摂取が可能である請求項１６記載のワクチン。
【請求項１８】
皮下または腹腔注射用である請求項１６記載のワクチン。
【請求項１９】
鼻腔投与用である請求項１６記載のワクチン。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５２６４０３（Ｐ２００６−５２６４０３Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８５３９（Ｐ２００６−５０８５３９）
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１３４１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８９３７
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０５４４８８３３）バイオリーダーズ コーポレーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＬＥＡＤＥＲＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【出願人】（５０５４４８８４４）
【氏名又は名称原語表記】Ｍ． Ｄ． ＬＡＢ
【出願人】（５０５４４９５２０）株式会社 ジェノラック ＢＬ (5)
【出願人】（５０５４４８８５５）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１３４１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８９３７
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０５４４８８３３）バイオリーダーズ コーポレーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＬＥＡＤＥＲＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【出願人】（５０５４４８８４４）
【氏名又は名称原語表記】Ｍ． Ｄ． ＬＡＢ
【出願人】（５０５４４９５２０）株式会社 ジェノラック ＢＬ (5)
【出願人】（５０５４４８８５５）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
【Ｆターム（参考）】
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