ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
【課題】ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型を正確に判別することができる多型検出用プローブを提供する。
【解決手段】多型検出用プローブは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる。例えば、（Ｐ１）は、特定の塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
【解決手段】多型検出用プローブは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる。例えば、（Ｐ１）は、特定の塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチドである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸代謝、輸送に関連するＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）２８Ａ遺伝子ファミリー（ＣＮＴ）の多型を検出するためのプローブ、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＬＣ２８Ａ遺伝子ファミリーは、核酸代謝、輸送に関連するトランスポーターであり、薬物動態に関与していることがわかっている（非特許文献１参照）。つまり、細胞膜に存在する膜タンパク質であるトランスポーターのＳＬＣ２８Ａ遺伝子ファミリーが、細胞への薬物吸収および分布、ならびに細胞からの排泄に関わっているということが解明されている。特に、非特許文献２および非特許文献３では、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子についての性質が開示されている。
【０００３】
ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子は、上皮細胞膜のＮａ＋依存インフラックス・トランスポーターであり、３遺伝子とも核酸代謝、輸送に特有の性質を有している。詳細には、ＳＬＣ２８Ａ１遺伝子は、ピリミジンヌクレオシドを選択的に核酸代謝、輸送する。ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子は、プリンヌクレオシドとウリジンとを選択的に核酸代謝、輸送する。ＳＬＣ２８Ａ３遺伝子は、ピリミジンヌクレオシドとプリンヌクレオシド、更に多種の薬剤核種を核酸代謝、輸送する。これらのＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子は、多型を複数有している。例えば、ＳＬＣ２８Ａ１遺伝子ではＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子ではＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）、ＳＬＣ２８Ａ３遺伝子ではＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）を挙げることができる。また、特許文献１には、核酸プローブを用いる方法により、多型を検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｒｌｏｆｆ Ｔ．、２００４ Ｊａｎ．、Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３６９（１）、６９−７７
【非特許文献２】Ｒｙａｎ Ｐ， ｅｔ ａｌ．、２００６ Ｓｅｐ．８、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２８１（３６）、２６６７５−２６６８２
【非特許文献３】Ｍａｒｉａ Ｒｉｕｓ， ｅｔ ａｌ．、２０１０ Ｊｕｌ．、ＤＲＵＧ ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ ＡＮＤ ＤＩＳＰＯＳＩＴＩＯＮ、３８（７）、１０５４−１０６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載のような、多型の有無を判断する際に用いるプローブの塩基配列は、例えば遺伝子多型の場所さえ解明すれば任意に製造可能であるわけではなく、当該多型の変異毎に適当な塩基配列を有するプローブを見出す必要がある。そこで、本発明では、薬物動態に関与する可能性が高い、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型の有無を判断する際に用いる適当な塩基配列を有するプローブを見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）を含む特定の領域に基づいてプローブを設計し、当該プローブを用いるＴｍ解析を行うことにより当該変異部位における多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
そこで、本発明の第１の観点に係る多型検出用プローブは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブであることを特徴とする。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【０００９】
好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、
ことを特徴とする。
【００１０】
より好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端に有する、
ことを特徴とする。
【００１１】
さらに好ましくは、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする。
【００１２】
また、好ましくは、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする。
【００１３】
より好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜２８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜２７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜３１塩基長である、
ことを特徴とする。
【００１４】
さらに好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜１８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜１７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜２１塩基長である、
ことを特徴とする。
【００１５】
また、好ましくは、前記多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする。
【００１６】
本発明の第２の観点に係るＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法は、第１の観点に係る多型検出用プローブを用いることを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、（ｉ）第１の観点に係る多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッド形成体を得ることと、
（ｉｉ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ｉｉｉ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を評価することと、
（ｉｖ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における、多型の存在を評価することと、
を含む。
【００１８】
より好ましくは、さらに、前記（ｉ）の前、または、前記（ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む。
【００１９】
本発明の第３の観点に係る薬剤の評価方法は、（Ｉ）第２の観点に係るＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法により、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出することと、
（ＩＩ）検出されたＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することと、
を含む。
【００２０】
本発明の第４の観点に係るＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、第１の観点に係る多型検出用プローブを含むことを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチド、前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効評価方法、ならびに多型検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例３にかかる試料の微分融解曲線である。
【図５】（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の比較例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図７】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる精製ヒトゲノムを含む試料の微分融解曲線である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる全血を含む試料の微分融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明において、検出する目的の多型とは、基本的に、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を意味する。当該多型は、それぞれ前述した例のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）と、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）と、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）である。これらの詳細は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に開示されており、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）はｄｂＳＮＰ Ｎｏ．ｒｓ２２９０２７２、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）はＮｏ．ｒｓ１１８５４４８４、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）はＮｏ．ｒｓ１０８６８１３８として登録されている。ＮＣＢＩに登録されているこれらの多型の周辺塩基配列について、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の周辺塩基配列を配列番号１に、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）の周辺塩基配列を配列番号２に、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の周辺塩基配列を配列番号３に示す。
【００２５】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブまたはプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列について、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列として、明細書全体を読み替えるものとする。
【００２６】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が隔離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。すなわち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、５０％の塩基が二本鎖を形成し、残る５０％が一本鎖に融解する温度をいう。
【００２７】
本発明において「工程」、「〜すること」または「〜こと」等の所作に係る語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。また、本発明において「変異」とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複または挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。また、「多型」とは、変異によって生じる塩基配列の多型を意味する。
【００２８】
本発明における「塩基番号」とは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示す塩基配列の、５’末端から３’末端方向に数えた当該塩基の番号、すなわち配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれの場合も、塩基番号１〜塩基番号６０１で示される。それぞれの配列番号において、塩基番号３０１が多型となっている。ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の多型は、Ｃが野生型で、Ｔが変異型である。ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）の多型は、Ｃが野生型でＴが変異型である。ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型は、Ｔが野生型でＣが変異型である。
【００２９】
本発明における「標的塩基配列」とは、多型を検出するためにプローブがハイブリダイズする（１本鎖構造の）標的核酸塩基配列を意味する。なお、本発明における「含む」および「有する」は、「からなる」および「から構成される」との意も含むものとする。本発明における「相同性（相同または相同的）」とは、特定の塩基配列において、当該塩基配列に８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の塩基配列が同一であることをいい、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基、または１塩基のみ異なる場合も含む。
【００３０】
以下、本発明について説明する。
【００３１】
〈多型検出用プローブ〉
本発明の多型検出用プローブは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するためのプローブである。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００３２】
本発明における（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドには、当該（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドの塩基配列に相同性が認められる蛍光標識ヌクレオチドも包含される。当該相同性が認められる蛍光標識ヌクレオチドは、（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドと同等程度の作用を示す。また、（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドと同等程度の作用を示すものであれば、（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛍光標識ヌクレオチドも、本発明における（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドに含有される。
【００３３】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｅｓ，１９８９）に記載の方法等に従って行うことができる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９ｍＭ〜約２０ｍＭで、温度が約５０度〜約７０度、好ましくは約６０度〜約６５度の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５度の場合がもっとも好ましい。
【００３４】
これらの蛍光標識オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、標的塩基配列にハイブリダイズしたとき蛍光強度が減少するかまたは増加する。より好ましくは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する。
【００３５】
蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブとしては、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でもオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端がｃとなるように設計し、その末端のｃが、ｇに近づくと蛍光強度が弱くなるような蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３６】
このような蛍光色素は、公知のものを使用することができるが、それに制限されない。例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミンまたはポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、または、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。当該プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定すればよい。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの場合は検出波長４４５〜４８０ｎｍで、ＴＡＭＲＡの場合は検出波長５８５〜７００ｎｍで、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの場合は検出波長５２０〜５５５ｎｍで検出可能である。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３７】
また、本発明の多型検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、標的塩基配列は、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法によって調製することもできる。この際、本発明の多型検出用プローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、多型検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、当該多型検出用プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを充分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。以下に、（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについて詳細に述べる。
【００３８】
まず、（Ｐ１）を再掲する。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００３９】
ここで、（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号２９２に対応する塩基」とは、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２となる塩基「ｇ（グアニン）」に対応する相補塩基「ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列に相同的な塩基配列でもよいが、当該塩基配列は、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるｃの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも３’末端である必要はないが、このｃが３’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。当該（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１０〜２８塩基長、より好ましくは１０〜１８塩基長である。
【００４０】
例えば、具体的な（Ｐ１）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＷＴ（野生型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、１８ｍｅｒ、配列番号４
５’−ｇｃｇｔｇｔｔｃＧｔｃＣｃｔｃｔｃｃ−（蛍光標識）−３’
ＷＴ（野生型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、１０ｍｅｒ、配列番号５
５’−ＧｔｃＣｃｔｃｔｃｃ−（蛍光標識）−３’
ＷＴ（野生型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、４３ｍｅｒ、配列番号６
５’−ｃａａｃｔｇｇｔｇｔｃｃｔｔｃｇｃａｇｇａａｔｃｔｇｃｇｔｇｔｔｃＧｔｃＣｃｔｃｔｃｃ−（蛍光標識）−３’
これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ｇ」が野生型の塩基番号３０１のＣに相補的となっている。これらの「Ｇ」を「Ａ」とすると、変異型の塩基番号３０１のＴに相補的となる。これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ｃ」は目的外多型（ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ Ｎｏ．ｒｓ４５５２３５３２）の影響を回避するためである。
【００４１】
次に、（Ｐ２）を再掲する。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００４２】
ここで、（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号３０９に対応する塩基」とは、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０９となる塩基「ｇ（グアニン）」に対応する相補塩基「ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列に相同的な塩基配列でもよいが、当該塩基配列は、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるｃの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも５’末端である必要はないが、このｃが５’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。当該（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは９〜２７塩基長、より好ましくは９〜１７塩基長である。
【００４３】
例えば、具体的な（Ｐ２）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ｍｔ（変異型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、１７ｍｅｒ、配列番号７
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｇｃｃｃｃＡｇｇｔｔｃａｃｔ−Ｐ−３’
ｍｔ（変異型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、９ｍｅｒ
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｇｃｃｃｃＡ−３’
ｍｔ（変異型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、５２ｍｅｒ、配列番号８
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｇｃｃｃｃＡｇｇｔｔｃａｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃｔｃｃａｃｔｇｔｇｇａｃａｇａｇｃａａｔｇｇａｃｔｇ−３’
これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ａ」が変異型の塩基番号３０１のＴに相補的となっている。これらの「Ａ」を「Ｇ」とすると、野生型の塩基番号３０１のＣに相補的となる。
【００４４】
最後に、（Ｐ３）を再掲する。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００４５】
ここで、（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号２９０に対応する塩基」とは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０となる塩基「ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列以外にも当該塩基配列に相同的な塩基配列でもよいが、当該塩基配列は、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるｃの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも５’末端である必要はないが、このｃが５’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。当該（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１２〜３１塩基長、より好ましくは１２〜２１塩基長である。
【００４６】
例えば、具体的な（Ｐ３）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ｍｔ（変異型）に相同的な塩基配列を有するプローブ、２１ｍｅｒ、配列番号９
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｔａａｃｃａｇａＣａａｃｃｔｇｔｃｃ−Ｐ−３’
ｍｔ（変異型）に相同的な塩基配列を有するプローブ、１２ｍｅｒ、配列番号１０
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｔａａｃｃａｇａＣ−３’
ｍｔ（変異型）に相同的な塩基配列を有するプローブ、５１ｍｅｒ、配列番号１１
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｔａａｃｃａｇａＣａａｃｃｔｇｔｃｃａｇｇａａｇｃａａａａａｃａｇａｃａｃｔｇａａｃａｔｃａｃｔ−３’
これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ｃ」が変異型の塩基番号３０１のＣに相同的となっている。これらの「Ｃ」を「Ｔ」とすると、野生型の塩基番号３０１のＴに相同的となる。
【００４７】
このような（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドのような本発明に係る多型検出用プローブは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の野生型または変異型の多型検出に利用することができる。検出方法は、何ら限定されず、標的塩基配列とこれらの多型検出用プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。例えば、（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる野生型または変異型の多型検出用プローブを用い、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子ファミリーとして、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）から選択される１種以上の多型を同時に検出することも可能である。また、（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）のいずれか１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる野生型または変異型の多型検出用プローブを用い、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）またはＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）のいずれか１種の多型を検出することも可能である。さらに好ましくは、本発明の多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする。このような融解曲線分析による方法も含め、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法の詳細について以下に述べる。
【００４８】
〈ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法〉
本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法は、前述した多型検出用プローブを使用することを特徴とする。すなわち、本発明の多型検出方法は、前述した本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
【００４９】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記工程（ｉ）、工程（ｉｉ）、工程（ｉｉｉ）および工程（ｉｖ）を含む。
（ｉ）前述の多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッド形成体を得る工程。
（ｉｉ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
（ｉｉｉ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を評価する工程。
（ｉｖ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における、多型の存在を評価する工程。
【００５０】
なお、上記工程（ｉｉｉ）において、Ｔｍ値を評価するとは、Ｔｍ値での温度を評価する（決定する）ことだけでもよいし、Ｔｍ解析でのピークの高さ、すなわち単位時間当たりの蛍光強度の変化量のピークを評価する（決定する）ことを含んでも構わない。
【００５１】
より具体的に説明すると、例えば、野生型プローブのみを使用してこのような多型検出法を行う場合、予め野生型１本鎖核酸を用いた場合によるＴｍ値を測定しておく。野生型１本鎖核酸は、例えば、全血等からゲノムＤＮＡを市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて単離して使用する。その後、当該野生型のＴｍ値と、試料のＴｍ値とを比較することによって、試料のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子が多型を有しているか否かを評価することができる。すなわち、Ｔｍ値が野生型の場合と全く同じ値となった場合、試料は野生型プローブとパーフェクトマッチとなっていることが判断される。しかし、Ｔｍ値が野生型よりも小さい場合には、試料の１本鎖核酸と野生型プローブとの解離温度が低いことを意味しているため、この場合には、試料の１本鎖構造の核酸が多型を有しているということがわかる。
【００５２】
また、野生型プローブでなくとも、変異型プローブであってもこのような方法を用い、パーフェクトマッチかミスマッチかを評価し、試料の変異を正確に検出することができる。また、このような種々の多型検出用プローブは、少なくとも１種類を使用すればよく、２種類以上を併用しても構わない。２種類以上の多型検出用プローブを併用し、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（蛍光シグナル）のピークを評価することによって、それぞれの多型検出用プローブにパーフェクトマッチする標的塩基配列の存在比を一度に評価することができる。反応系における本発明の多型検出用プローブの添加濃度は、特に制限されないが、例えば、１種類の多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【００５３】
核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法またはＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブおよびポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を評価できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００５４】
鋳型とする核酸からの増幅産物の生成には、例えば、当該検出目的の多型を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを使用することが好ましい。当該プライマーの増幅領域は、特に制限されず検出目的の多型に応じて適宜設定できる。例えば、前述の（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域が好ましい。また、当該プライマーの塩基配列は、特に制限されず、例えば、検出目的の多型の塩基配列を増幅できればよく、当該検出塩基配列およびその周辺塩基配列等に応じて従来公知の方法により適宜設定できる。さらに、当該プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定可能であり、例えば１０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒが挙げられる。
【００５５】
具体的には、ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さおよびＴｍ値は、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒおよび４０度〜７０度、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒおよび５５度〜６０度である。また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値は、ほぼ同一（または、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５度以内）であることが好ましい。
【００５６】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、血液、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来するまたは由来しうるものを挙げられる。鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００５７】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ ポリメラーゼ等を挙げることができる。ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、好ましくは、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、遺伝子多型の検出感度が高まるなどの利点がある。
【００５８】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）のコピーを検出することができる。
【００５９】
本発明の多形検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００６０】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６１】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００６２】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭであり、好ましくは０．１μＭ〜０．５μＭ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭであり、好ましくは０．００１μＭ〜１μＭである。
【００６３】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ−ｐｒｏｂｅ（登録商標）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５℃〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。
【００６５】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００６６】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００６７】
具体例として、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標））を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッド形成体を形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６８】
〈薬剤の評価方法〉
本発明の薬剤の評価方法は、前述の多型検出方法を利用することにより、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子に関連する薬剤の耐性または薬効を評価することを特徴とする。すなわち、本発明の薬剤の評価方法は、前述のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法を用いて評価することに特徴があり、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
【００６９】
本発明の薬剤の評価方法は、例えば、下記工程（Ｉ）および工程（ＩＩ）を含む。
（Ｉ）前述のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法により、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出する工程。
（ＩＩ）検出されたＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価する工程。
【００７０】
（Ｉ）の検出工程は、前述の多型検出方法と同様である。（ＩＩ）の、検出された多型の有無に基づく薬剤に対する耐性または薬剤の薬効の評価とは、例えば、細胞への薬物吸収および分布、細胞からの排泄等における、変異型および野生型に基づく関連性、評価を行うことも含まれる。このような薬剤の評価方法は、薬剤の投与量の増減、または他の治療薬への変更等の当該ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）またはＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型が原因となる疾患の発見、さらにはその治療方針を決定するのに有用である。
【００７１】
〈ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット〉
本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。すなわち、本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことに特徴があって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。なお、前述の多型検出用プローブの（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマー（プライマーセット）をさらに含むとより好ましい。
【００７２】
本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットの一例について述べる。例えば、本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）および／またはＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型の検出に使用する試薬キットである。試薬キットにおいて、前述の多型検出用プローブは、１種類でもよいし２種類以上であっても構わない。後者の場合、２種類以上の多型検出用プローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、２種類以上の本発明の多型検出用プローブが混合された状態で、本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットに含まれる場合、または、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で各多型検出用プローブと各標的塩基配列とのＴｍ解離分析を行う場合、各多型検出用プローブは、異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの多型検出用プローブについての検出が容易に可能になる。前記蛍光色素としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
【００７３】
前述したように、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子（ＳＬＣ２８Ａ遺伝子ファミリー）は、薬物動態に関与し、細胞への薬物吸収および分布、細胞からの排泄に関わっていることが確認されている。そこで、本発明の多型検出用プローブ、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法およびＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット等によれば、それら薬物動態等に関与する可能性が示唆される当該多型を正確に検出することができるため、今後の薬物動態、細胞への薬物吸収および薬物分布等に関するさらなる研究に繋がる可能性が高い。
【００７４】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例】
【００７５】
ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型を、本発明の多型検出用プローブを使用し評価した実施例、ならびにこれらの多型を検出できなかった比較例について、以下に述べる。
【００７６】
（実施例１）
実施例１では、本発明のＳＬＣ２８Ａ１遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ（前述した配列番号４の蛍光標識（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）オリゴヌクレオチドからなるもの）を利用し、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表１に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表１】
【００７７】
表１に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１〜ＩＤ−１０）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、３’末端に近い大文字のＣまたはＴが目的多型であり、５’末端に近い大文字のＣまたはＡが目的外多型である。
ＩＤ−１、２２ｍｅｒ、配列番号１２
５’−ｇａｇｇａｇａｇＣｇａＣｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−２、２２ｍｅｒ、配列番号１３
５’−ｇａｇｇａｇａｇＡｇａＣｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−３、２２ｍｅｒ、配列番号１４
５’−ｇａｇｇａｇａｇＣｇａＴｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−４、２２ｍｅｒ、配列番号１５
５’−ｇａｇｇａｇａｇＡｇａＴｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−５、配列番号１２と配列番号１３の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−６、配列番号１２と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−７、配列番号１２と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−８、配列番号１３と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−９、配列番号１３と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−１０、配列番号１４と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００７８】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、図１の（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。図２の（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【００７９】
図２の（Ａ）〜（Ｊ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図２の（Ａ）〜（Ｊ）に示すように、目的外多型の有無に関わらず、目的多型の有無を検出できた。遺伝子配列がＣ／ＣのＴｍ値は６０（６１）度で、Ｔ／ＴのＴｍ値は５３（５４）度であり、ＣとＴの区別が付くことが確認できた。また、Ｃ／Ｔ（ヘテロ型）の遺伝子配列を検出した場合には、検出ピークは６０（６１）度と５３（５４）度の２箇所に得られ、遺伝子配列の区別ができることも確認できた。
【００８０】
（実施例２）
実施例２では、本発明のＳＬＣ２８Ａ２遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）ｐｒｏｂｅ（前述した配列番号５の蛍光標識（ＴＡＭＲＡ）オリゴヌクレオチドからなるもの）を利用し、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表２に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表２】
【００８１】
表２に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１１〜ＩＤ−１３）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、大文字のＣまたはＴが目的多型である。
ＩＤ−１１、２６ｍｅｒ、配列番号１６
５’−ｇｃａｃａｇｔｇａａｃｃＣｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｃ−３’
ＩＤ−１２、２６ｍｅｒ、配列番号１７
５’−ｇｃａｃａｇｔｇａａｃｃＴｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｃ−３’
ＩＤ−１３、配列番号１６と配列番号１７の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００８２】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図３の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【００８３】
図３の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図３の（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、遺伝子配列がＣ／ＣのＴｍ値は６０度で、Ｔ／ＴのＴｍ値は６８度であり、ＣとＴの区別が付くことが確認できた。また、Ｃ／Ｔ（ヘテロ型）の遺伝子配列を検出した場合には、検出ピークは６０度と６８度の２箇所に得られ、遺伝子配列の区別ができることも確認できた。
【００８４】
（実施例３）
実施例３では、本発明のＳＬＣ２８Ａ３遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅ（前述した配列番号６の蛍光標識（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）オリゴヌクレオチドからなるもの）を利用し、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表３に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表３】
【００８５】
表３に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１４〜ＩＤ−１６）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、大文字のＧまたはＡが目的多型である。
ＩＤ−１４、２８ｍｅｒ、配列番号１８
５’−ｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔｔＧｔｃｔｇｇｔｔａｔｇｇｔｇａｔ−３’
ＩＤ−１５、２８ｍｅｒ、配列番号１９
５’−ｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔｔＡｔｃｔｇｇｔｔａｔｇｇｔｇａｔ−３’
ＩＤ−１６、配列番号１８と配列番号１９の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００８６】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図４の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例３にかかる試料の微分融解曲線である。
【００８７】
図４の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図４の（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、遺伝子配列がＣ／ＣのＴｍ値は６７度で、Ｔ／ＴのＴｍ値は５８度であり、ＣとＴの区別が付くことが確認できた。また、Ｃ／Ｔ（ヘテロ型）の遺伝子配列を検出した場合には、検出ピークは５８度と６７度の２箇所に得られ、遺伝子配列の区別ができることも確認できた。
【００８８】
（比較例１）
比較例１では、前述した実施例１と比較するために、ＷＴ（野生型）に相補的ではあるが、配列番号１の塩基番号２９２に対応するｃに蛍光標識されていない下記のプローブを利用し、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。なお、プローブの塩基配列の大文字のＧは目的多型であり、プローブの塩基配列の大文字のＴは目的外多型の影響を回避するためである。
ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ２、１７ｍｅｒ、配列番号２０
５’−ｃｔｇｃｇｔｇｔｔｃＧｔｃＴｃｔｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
【００８９】
装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表４に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表４】
【００９０】
表４に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１７〜ＩＤ−２６）は、以下の通り実施例１と同様である。
ＩＤ−１７、配列番号１２
ＩＤ−１８、配列番号１３
ＩＤ−１９、配列番号１４
ＩＤ−２０、配列番号１５
ＩＤ−２１、配列番号１２と配列番号１３の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２２、配列番号１２と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２３、配列番号１２と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２４、配列番号１３と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２５、配列番号１３と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２６、配列番号１４と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００９１】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図５の（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【００９２】
図５の（Ａ）〜（Ｊ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図５の（Ａ）〜（Ｊ）に示すように、目的外多型の有無の影響を受け、目的多型の有無の検出が困難となっている。詳細に言うと、目的多型がＣ／Ｃの際には、Ｔｍ値が５７度または６５度の一つのピークの場合、あるいは５６度および６４度の二つのピークの場合がある。目的多型がＴ／Ｔの際には、Ｔｍ値は４８度または５７度のピークとなる。目的多型がＣ／Ｔ（ヘテロ型）の際には、Ｔｍ値は、５７度の一つのピーク、４８度および５６度の二つのピーク、または５７度および６４度の二つのピークのいずれかとなっている。このような結果から、配列番号２０のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ２を使用するのは困難であると判断した。
【００９３】
（比較例２）
比較例２では、前述した実施例３と比較するために、ＷＴ（野生型）に相補的であり、配列番号３の塩基番号２９０に対応するｃに蛍光標識されていない下記のプローブを利用し、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。プローブの塩基配列の大文字のＡは目的多型である。
ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅ２、１７ｍｅｒ、配列番号２１
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔｔＡｔｃｔｇ−Ｐ−３’
【００９４】
装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表５に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表５】
【００９５】
表５に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−２７〜ＩＤ−２９）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、大文字のＴまたはＣが目的多型である。
ＩＤ−２７、２４ｍｅｒ、配列番号２２
５’−ｔａａｃｃａｇａＴａａｃｃｔｇｔｃｃａｇｇａａｇ−３’
ＩＤ−２８、２４ｍｅｒ、配列番号２３
５’−ｔａａｃｃａｇａＣａａｃｃｔｇｔｃｃａｇｇａａｇ−３’
ＩＤ−２９、配列番号２２と配列番号２３の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００９６】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図６の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の比較例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【００９７】
図６の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。しかし、図６の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの図においてもピーク値が検出できないため、配列番号２１のＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅ２を使用するのは困難であると判断した。
【００９８】
（実施例４）
実施例４では、前述した本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）ｐｒｏｂｅおよびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅを利用し、それぞれの多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用い、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。鋳型として、精製したヒトゲノムを使用する場合と、同一人の全血を使用する場合と、二通り実験を行った。
【００９９】
まず、鋳型として精製したヒトゲノム（全血から一般的な方法を用いて精製したヒトゲノム）を使用した場合について述べる。ＰＣＲおよびＴｍ解析で使用した試料等は下記の表の通りである。
【表６】
【０１００】
表６に示すそれぞれのプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＳＬＣ２８Ａ１−Ｆ、２３ｍｅｒ、配列番号２４
５’−ｃｔｇｃｇｃａａｔｇａｔｇｃｔｔｔｇａｇｃａｇ−３’
ＳＬＣ２８Ａ１−Ｒ、２３ｍｅｒ、配列番号２５
５’−ａａｃｔｇｇｔｇｔｃｃｔｔｃｇｃａｇｇａａｔｃ−３’
ＳＬＣ２８Ａ２−Ｆ、２５ｍｅｒ、配列番号２６
５’−ｇｃａａｇｔｇｇａａｇａｃａｇｔｃｃａｔｔｇｃｔｃ−３’
ＳＬＣ２８Ａ２−Ｒ、３０ｍｅｒ、配列番号２７
５’−ｃｔｇｃａｇａｇａｇａａａｃｔａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔａｃｃ−３’
ＳＬＣ２８Ａ３−Ｆ、２６ｍｅｒ、配列番号２８
５’−ａｇａｇｇａａｇｇｇｃｔｃｔｇｔｇａａａｇｔｔｃａｇ−３’
ＳＬＣ２８Ａ３−Ｒ、２７ｍｅｒ、配列番号２９
５’−ｃｃａｇｔｇｇｔｔａｇｔｇａｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃｔｇ−３’
【０１０１】
ＰＣＲは９５度で６０秒間処理した後、９５度で１秒間および６０度で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１０２】
図７の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる精製ヒトゲノムを含む試料の微分融解曲線である。図７の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。
【０１０３】
図７の（Ａ）に示すように、４９度と５６度とにピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）は、ヘテロ型（Ｇ／Ａ）の多型であることがわかった。図７の（Ｂ）に示すように、５４度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）は、野生型（Ｃ／Ｃ）の多型であることがわかった。図７の（Ｃ）に示すように、５５度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）は、野生型（Ａ／Ａ）の多型であることがわかった。
【０１０４】
次に、鋳型として全血を使用した場合について述べる。使用する全血の前処理として、全血１０μｌを下記の表７に示す「希釈液１」７０μｌに加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを下記の表８に示す「希釈液２」７０μｌに加えた。その後、この混合液１７μｌを９５度で１０分間加熱すると、４μｌの前処理済全血が得られる。これを１回の実験において鋳型として使用した。
【表７】
【表８】
【０１０５】
ＰＣＲおよびＴｍ解析で使用した試料等は下記の表の通りである。表９に示すプライマーおよびプローブの塩基配列は、前述と同様である。
【表９】
【０１０６】
条件についても同様に、ＰＣＲは９５度で６０秒間処理した後、９５度で１秒間および６０度で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１０７】
図８の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる全血を含む試料の微分融解曲線である。図８の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。
【０１０８】
図８の（Ａ）に示すように、４８度と５５度とにピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）はヘテロ型（Ｇ／Ａ）の多型で精製ヒトゲノムを検体とした場合と同様であることがわかった。図８の（Ｂ）に示すように、５４度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）は野生型（Ｃ／Ｃ）の多型で精製ヒトゲノムを検体とした場合と同様であることがわかった。図８の（Ｃ）に示すように、５４度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）は、野生型（Ａ／Ａ）の多型で精製ヒトゲノムを検体とした場合と同様であることがわかった。
【０１０９】
以上のことから、精製ゲノムまたは血液検体を用い、ＰＣＲ増幅してＴｍ解析することによって、容易にＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子多型を同時に検出可能であることが確認された。
【０１１０】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１１１】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸代謝、輸送に関連するＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）２８Ａ遺伝子ファミリー（ＣＮＴ）の多型を検出するためのプローブ、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＬＣ２８Ａ遺伝子ファミリーは、核酸代謝、輸送に関連するトランスポーターであり、薬物動態に関与していることがわかっている（非特許文献１参照）。つまり、細胞膜に存在する膜タンパク質であるトランスポーターのＳＬＣ２８Ａ遺伝子ファミリーが、細胞への薬物吸収および分布、ならびに細胞からの排泄に関わっているということが解明されている。特に、非特許文献２および非特許文献３では、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子についての性質が開示されている。
【０００３】
ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子は、上皮細胞膜のＮａ＋依存インフラックス・トランスポーターであり、３遺伝子とも核酸代謝、輸送に特有の性質を有している。詳細には、ＳＬＣ２８Ａ１遺伝子は、ピリミジンヌクレオシドを選択的に核酸代謝、輸送する。ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子は、プリンヌクレオシドとウリジンとを選択的に核酸代謝、輸送する。ＳＬＣ２８Ａ３遺伝子は、ピリミジンヌクレオシドとプリンヌクレオシド、更に多種の薬剤核種を核酸代謝、輸送する。これらのＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子は、多型を複数有している。例えば、ＳＬＣ２８Ａ１遺伝子ではＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子ではＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）、ＳＬＣ２８Ａ３遺伝子ではＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）を挙げることができる。また、特許文献１には、核酸プローブを用いる方法により、多型を検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｒｌｏｆｆ Ｔ．、２００４ Ｊａｎ．、Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３６９（１）、６９−７７
【非特許文献２】Ｒｙａｎ Ｐ， ｅｔ ａｌ．、２００６ Ｓｅｐ．８、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２８１（３６）、２６６７５−２６６８２
【非特許文献３】Ｍａｒｉａ Ｒｉｕｓ， ｅｔ ａｌ．、２０１０ Ｊｕｌ．、ＤＲＵＧ ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ ＡＮＤ ＤＩＳＰＯＳＩＴＩＯＮ、３８（７）、１０５４−１０６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載のような、多型の有無を判断する際に用いるプローブの塩基配列は、例えば遺伝子多型の場所さえ解明すれば任意に製造可能であるわけではなく、当該多型の変異毎に適当な塩基配列を有するプローブを見出す必要がある。そこで、本発明では、薬物動態に関与する可能性が高い、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型の有無を判断する際に用いる適当な塩基配列を有するプローブを見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）を含む特定の領域に基づいてプローブを設計し、当該プローブを用いるＴｍ解析を行うことにより当該変異部位における多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
そこで、本発明の第１の観点に係る多型検出用プローブは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブであることを特徴とする。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【０００９】
好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、
ことを特徴とする。
【００１０】
より好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端に有する、
ことを特徴とする。
【００１１】
さらに好ましくは、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする。
【００１２】
また、好ましくは、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする。
【００１３】
より好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜２８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜２７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜３１塩基長である、
ことを特徴とする。
【００１４】
さらに好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜１８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜１７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜２１塩基長である、
ことを特徴とする。
【００１５】
また、好ましくは、前記多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする。
【００１６】
本発明の第２の観点に係るＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法は、第１の観点に係る多型検出用プローブを用いることを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、（ｉ）第１の観点に係る多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッド形成体を得ることと、
（ｉｉ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ｉｉｉ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を評価することと、
（ｉｖ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における、多型の存在を評価することと、
を含む。
【００１８】
より好ましくは、さらに、前記（ｉ）の前、または、前記（ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む。
【００１９】
本発明の第３の観点に係る薬剤の評価方法は、（Ｉ）第２の観点に係るＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法により、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出することと、
（ＩＩ）検出されたＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することと、
を含む。
【００２０】
本発明の第４の観点に係るＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、第１の観点に係る多型検出用プローブを含むことを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチド、前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効評価方法、ならびに多型検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例３にかかる試料の微分融解曲線である。
【図５】（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の比較例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図７】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる精製ヒトゲノムを含む試料の微分融解曲線である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる全血を含む試料の微分融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明において、検出する目的の多型とは、基本的に、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を意味する。当該多型は、それぞれ前述した例のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）と、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）と、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）である。これらの詳細は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に開示されており、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）はｄｂＳＮＰ Ｎｏ．ｒｓ２２９０２７２、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）はＮｏ．ｒｓ１１８５４４８４、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）はＮｏ．ｒｓ１０８６８１３８として登録されている。ＮＣＢＩに登録されているこれらの多型の周辺塩基配列について、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の周辺塩基配列を配列番号１に、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）の周辺塩基配列を配列番号２に、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の周辺塩基配列を配列番号３に示す。
【００２５】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブまたはプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列について、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列として、明細書全体を読み替えるものとする。
【００２６】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が隔離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。すなわち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、５０％の塩基が二本鎖を形成し、残る５０％が一本鎖に融解する温度をいう。
【００２７】
本発明において「工程」、「〜すること」または「〜こと」等の所作に係る語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。また、本発明において「変異」とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複または挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。また、「多型」とは、変異によって生じる塩基配列の多型を意味する。
【００２８】
本発明における「塩基番号」とは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示す塩基配列の、５’末端から３’末端方向に数えた当該塩基の番号、すなわち配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれの場合も、塩基番号１〜塩基番号６０１で示される。それぞれの配列番号において、塩基番号３０１が多型となっている。ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の多型は、Ｃが野生型で、Ｔが変異型である。ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）の多型は、Ｃが野生型でＴが変異型である。ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型は、Ｔが野生型でＣが変異型である。
【００２９】
本発明における「標的塩基配列」とは、多型を検出するためにプローブがハイブリダイズする（１本鎖構造の）標的核酸塩基配列を意味する。なお、本発明における「含む」および「有する」は、「からなる」および「から構成される」との意も含むものとする。本発明における「相同性（相同または相同的）」とは、特定の塩基配列において、当該塩基配列に８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の塩基配列が同一であることをいい、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基、または１塩基のみ異なる場合も含む。
【００３０】
以下、本発明について説明する。
【００３１】
〈多型検出用プローブ〉
本発明の多型検出用プローブは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するためのプローブである。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００３２】
本発明における（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドには、当該（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドの塩基配列に相同性が認められる蛍光標識ヌクレオチドも包含される。当該相同性が認められる蛍光標識ヌクレオチドは、（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドと同等程度の作用を示す。また、（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドと同等程度の作用を示すものであれば、（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛍光標識ヌクレオチドも、本発明における（Ｐ１）〜（Ｐ３）の蛍光標識ヌクレオチドに含有される。
【００３３】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｅｓ，１９８９）に記載の方法等に従って行うことができる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９ｍＭ〜約２０ｍＭで、温度が約５０度〜約７０度、好ましくは約６０度〜約６５度の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５度の場合がもっとも好ましい。
【００３４】
これらの蛍光標識オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、標的塩基配列にハイブリダイズしたとき蛍光強度が減少するかまたは増加する。より好ましくは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する。
【００３５】
蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブとしては、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でもオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端がｃとなるように設計し、その末端のｃが、ｇに近づくと蛍光強度が弱くなるような蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３６】
このような蛍光色素は、公知のものを使用することができるが、それに制限されない。例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミンまたはポリメチン色素誘導体等が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、または、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。当該プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定すればよい。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの場合は検出波長４４５〜４８０ｎｍで、ＴＡＭＲＡの場合は検出波長５８５〜７００ｎｍで、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの場合は検出波長５２０〜５５５ｎｍで検出可能である。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３７】
また、本発明の多型検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、標的塩基配列は、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法によって調製することもできる。この際、本発明の多型検出用プローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、多型検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、当該多型検出用プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを充分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。以下に、（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについて詳細に述べる。
【００３８】
まず、（Ｐ１）を再掲する。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００３９】
ここで、（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号２９２に対応する塩基」とは、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２となる塩基「ｇ（グアニン）」に対応する相補塩基「ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列に相同的な塩基配列でもよいが、当該塩基配列は、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるｃの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも３’末端である必要はないが、このｃが３’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが好ましく、このｃが３’末端に存在することがより好ましい。当該（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１０〜２８塩基長、より好ましくは１０〜１８塩基長である。
【００４０】
例えば、具体的な（Ｐ１）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＷＴ（野生型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、１８ｍｅｒ、配列番号４
５’−ｇｃｇｔｇｔｔｃＧｔｃＣｃｔｃｔｃｃ−（蛍光標識）−３’
ＷＴ（野生型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、１０ｍｅｒ、配列番号５
５’−ＧｔｃＣｃｔｃｔｃｃ−（蛍光標識）−３’
ＷＴ（野生型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、４３ｍｅｒ、配列番号６
５’−ｃａａｃｔｇｇｔｇｔｃｃｔｔｃｇｃａｇｇａａｔｃｔｇｃｇｔｇｔｔｃＧｔｃＣｃｔｃｔｃｃ−（蛍光標識）−３’
これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ｇ」が野生型の塩基番号３０１のＣに相補的となっている。これらの「Ｇ」を「Ａ」とすると、変異型の塩基番号３０１のＴに相補的となる。これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ｃ」は目的外多型（ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ Ｎｏ．ｒｓ４５５２３５３２）の影響を回避するためである。
【００４１】
次に、（Ｐ２）を再掲する。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００４２】
ここで、（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号３０９に対応する塩基」とは、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０９となる塩基「ｇ（グアニン）」に対応する相補塩基「ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列に相同的な塩基配列でもよいが、当該塩基配列は、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるｃの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも５’末端である必要はないが、このｃが５’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。当該（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは９〜２７塩基長、より好ましくは９〜１７塩基長である。
【００４３】
例えば、具体的な（Ｐ２）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ｍｔ（変異型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、１７ｍｅｒ、配列番号７
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｇｃｃｃｃＡｇｇｔｔｃａｃｔ−Ｐ−３’
ｍｔ（変異型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、９ｍｅｒ
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｇｃｃｃｃＡ−３’
ｍｔ（変異型）に相補的な塩基配列を有するプローブ、５２ｍｅｒ、配列番号８
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｇｃｃｃｃＡｇｇｔｔｃａｃｔｇｔｇｃｃａｇｔｃｔｃｃａｃｔｇｔｇｇａｃａｇａｇｃａａｔｇｇａｃｔｇ−３’
これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ａ」が変異型の塩基番号３０１のＴに相補的となっている。これらの「Ａ」を「Ｇ」とすると、野生型の塩基番号３０１のＣに相補的となる。
【００４４】
最後に、（Ｐ３）を再掲する。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【００４５】
ここで、（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号２９０に対応する塩基」とは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０となる塩基「ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列以外にも当該塩基配列に相同的な塩基配列でもよいが、当該塩基配列は、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるｃの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも５’末端である必要はないが、このｃが５’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが好ましく、このｃが５’末端に存在することがより好ましい。当該（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１２〜３１塩基長、より好ましくは１２〜２１塩基長である。
【００４６】
例えば、具体的な（Ｐ３）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
ｍｔ（変異型）に相同的な塩基配列を有するプローブ、２１ｍｅｒ、配列番号９
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｔａａｃｃａｇａＣａａｃｃｔｇｔｃｃ−Ｐ−３’
ｍｔ（変異型）に相同的な塩基配列を有するプローブ、１２ｍｅｒ、配列番号１０
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｔａａｃｃａｇａＣ−３’
ｍｔ（変異型）に相同的な塩基配列を有するプローブ、５１ｍｅｒ、配列番号１１
５’−（蛍光標識）−ｃｃａｔａａｃｃａｇａＣａａｃｃｔｇｔｃｃａｇｇａａｇｃａａａａａｃａｇａｃａｃｔｇａａｃａｔｃａｃｔ−３’
これらのプローブの塩基配列の大文字の「Ｃ」が変異型の塩基番号３０１のＣに相同的となっている。これらの「Ｃ」を「Ｔ」とすると、野生型の塩基番号３０１のＴに相同的となる。
【００４７】
このような（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドのような本発明に係る多型検出用プローブは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の野生型または変異型の多型検出に利用することができる。検出方法は、何ら限定されず、標的塩基配列とこれらの多型検出用プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。例えば、（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる野生型または変異型の多型検出用プローブを用い、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子ファミリーとして、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）から選択される１種以上の多型を同時に検出することも可能である。また、（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）のいずれか１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなる野生型または変異型の多型検出用プローブを用い、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）またはＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）のいずれか１種の多型を検出することも可能である。さらに好ましくは、本発明の多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする。このような融解曲線分析による方法も含め、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法の詳細について以下に述べる。
【００４８】
〈ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法〉
本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法は、前述した多型検出用プローブを使用することを特徴とする。すなわち、本発明の多型検出方法は、前述した本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
【００４９】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記工程（ｉ）、工程（ｉｉ）、工程（ｉｉｉ）および工程（ｉｖ）を含む。
（ｉ）前述の多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッド形成体を得る工程。
（ｉｉ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
（ｉｉｉ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を評価する工程。
（ｉｖ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における、多型の存在を評価する工程。
【００５０】
なお、上記工程（ｉｉｉ）において、Ｔｍ値を評価するとは、Ｔｍ値での温度を評価する（決定する）ことだけでもよいし、Ｔｍ解析でのピークの高さ、すなわち単位時間当たりの蛍光強度の変化量のピークを評価する（決定する）ことを含んでも構わない。
【００５１】
より具体的に説明すると、例えば、野生型プローブのみを使用してこのような多型検出法を行う場合、予め野生型１本鎖核酸を用いた場合によるＴｍ値を測定しておく。野生型１本鎖核酸は、例えば、全血等からゲノムＤＮＡを市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて単離して使用する。その後、当該野生型のＴｍ値と、試料のＴｍ値とを比較することによって、試料のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子が多型を有しているか否かを評価することができる。すなわち、Ｔｍ値が野生型の場合と全く同じ値となった場合、試料は野生型プローブとパーフェクトマッチとなっていることが判断される。しかし、Ｔｍ値が野生型よりも小さい場合には、試料の１本鎖核酸と野生型プローブとの解離温度が低いことを意味しているため、この場合には、試料の１本鎖構造の核酸が多型を有しているということがわかる。
【００５２】
また、野生型プローブでなくとも、変異型プローブであってもこのような方法を用い、パーフェクトマッチかミスマッチかを評価し、試料の変異を正確に検出することができる。また、このような種々の多型検出用プローブは、少なくとも１種類を使用すればよく、２種類以上を併用しても構わない。２種類以上の多型検出用プローブを併用し、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（蛍光シグナル）のピークを評価することによって、それぞれの多型検出用プローブにパーフェクトマッチする標的塩基配列の存在比を一度に評価することができる。反応系における本発明の多型検出用プローブの添加濃度は、特に制限されないが、例えば、１種類の多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【００５３】
核酸の増幅方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法またはＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブおよびポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を評価できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００５４】
鋳型とする核酸からの増幅産物の生成には、例えば、当該検出目的の多型を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを使用することが好ましい。当該プライマーの増幅領域は、特に制限されず検出目的の多型に応じて適宜設定できる。例えば、前述の（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域が好ましい。また、当該プライマーの塩基配列は、特に制限されず、例えば、検出目的の多型の塩基配列を増幅できればよく、当該検出塩基配列およびその周辺塩基配列等に応じて従来公知の方法により適宜設定できる。さらに、当該プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定可能であり、例えば１０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒが挙げられる。
【００５５】
具体的には、ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さおよびＴｍ値は、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒおよび４０度〜７０度、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒおよび５５度〜６０度である。また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値は、ほぼ同一（または、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５度以内）であることが好ましい。
【００５６】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、血液、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来するまたは由来しうるものを挙げられる。鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００５７】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ ポリメラーゼ等を挙げることができる。ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、好ましくは、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、遺伝子多型の検出感度が高まるなどの利点がある。
【００５８】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）のコピーを検出することができる。
【００５９】
本発明の多形検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００６０】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６１】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００６２】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭであり、好ましくは０．１μＭ〜０．５μＭ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭであり、好ましくは０．００１μＭ〜１μＭである。
【００６３】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ−ｐｒｏｂｅ（登録商標）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５℃〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。
【００６５】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００６６】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００６７】
具体例として、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標））を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッド形成体を形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６８】
〈薬剤の評価方法〉
本発明の薬剤の評価方法は、前述の多型検出方法を利用することにより、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子に関連する薬剤の耐性または薬効を評価することを特徴とする。すなわち、本発明の薬剤の評価方法は、前述のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法を用いて評価することに特徴があり、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
【００６９】
本発明の薬剤の評価方法は、例えば、下記工程（Ｉ）および工程（ＩＩ）を含む。
（Ｉ）前述のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法により、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出する工程。
（ＩＩ）検出されたＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価する工程。
【００７０】
（Ｉ）の検出工程は、前述の多型検出方法と同様である。（ＩＩ）の、検出された多型の有無に基づく薬剤に対する耐性または薬剤の薬効の評価とは、例えば、細胞への薬物吸収および分布、細胞からの排泄等における、変異型および野生型に基づく関連性、評価を行うことも含まれる。このような薬剤の評価方法は、薬剤の投与量の増減、または他の治療薬への変更等の当該ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）またはＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型が原因となる疾患の発見、さらにはその治療方針を決定するのに有用である。
【００７１】
〈ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット〉
本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。すなわち、本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことに特徴があって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。なお、前述の多型検出用プローブの（Ｐ１）、（Ｐ２）または（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマー（プライマーセット）をさらに含むとより好ましい。
【００７２】
本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットの一例について述べる。例えば、本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットは、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）および／またはＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型の検出に使用する試薬キットである。試薬キットにおいて、前述の多型検出用プローブは、１種類でもよいし２種類以上であっても構わない。後者の場合、２種類以上の多型検出用プローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、２種類以上の本発明の多型検出用プローブが混合された状態で、本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キットに含まれる場合、または、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で各多型検出用プローブと各標的塩基配列とのＴｍ解離分析を行う場合、各多型検出用プローブは、異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの多型検出用プローブについての検出が容易に可能になる。前記蛍光色素としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
【００７３】
前述したように、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子（ＳＬＣ２８Ａ遺伝子ファミリー）は、薬物動態に関与し、細胞への薬物吸収および分布、細胞からの排泄に関わっていることが確認されている。そこで、本発明の多型検出用プローブ、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法およびＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット等によれば、それら薬物動態等に関与する可能性が示唆される当該多型を正確に検出することができるため、今後の薬物動態、細胞への薬物吸収および薬物分布等に関するさらなる研究に繋がる可能性が高い。
【００７４】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例】
【００７５】
ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）およびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型を、本発明の多型検出用プローブを使用し評価した実施例、ならびにこれらの多型を検出できなかった比較例について、以下に述べる。
【００７６】
（実施例１）
実施例１では、本発明のＳＬＣ２８Ａ１遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ（前述した配列番号４の蛍光標識（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）オリゴヌクレオチドからなるもの）を利用し、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表１に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表１】
【００７７】
表１に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１〜ＩＤ−１０）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、３’末端に近い大文字のＣまたはＴが目的多型であり、５’末端に近い大文字のＣまたはＡが目的外多型である。
ＩＤ−１、２２ｍｅｒ、配列番号１２
５’−ｇａｇｇａｇａｇＣｇａＣｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−２、２２ｍｅｒ、配列番号１３
５’−ｇａｇｇａｇａｇＡｇａＣｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−３、２２ｍｅｒ、配列番号１４
５’−ｇａｇｇａｇａｇＣｇａＴｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−４、２２ｍｅｒ、配列番号１５
５’−ｇａｇｇａｇａｇＡｇａＴｇａａｃａｃｇｃａｇ−３’
ＩＤ−５、配列番号１２と配列番号１３の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−６、配列番号１２と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−７、配列番号１２と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−８、配列番号１３と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−９、配列番号１３と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−１０、配列番号１４と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００７８】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、図１の（Ａ）は核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。図２の（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【００７９】
図２の（Ａ）〜（Ｊ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図２の（Ａ）〜（Ｊ）に示すように、目的外多型の有無に関わらず、目的多型の有無を検出できた。遺伝子配列がＣ／ＣのＴｍ値は６０（６１）度で、Ｔ／ＴのＴｍ値は５３（５４）度であり、ＣとＴの区別が付くことが確認できた。また、Ｃ／Ｔ（ヘテロ型）の遺伝子配列を検出した場合には、検出ピークは６０（６１）度と５３（５４）度の２箇所に得られ、遺伝子配列の区別ができることも確認できた。
【００８０】
（実施例２）
実施例２では、本発明のＳＬＣ２８Ａ２遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）ｐｒｏｂｅ（前述した配列番号５の蛍光標識（ＴＡＭＲＡ）オリゴヌクレオチドからなるもの）を利用し、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表２に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表２】
【００８１】
表２に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１１〜ＩＤ−１３）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、大文字のＣまたはＴが目的多型である。
ＩＤ−１１、２６ｍｅｒ、配列番号１６
５’−ｇｃａｃａｇｔｇａａｃｃＣｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｃ−３’
ＩＤ−１２、２６ｍｅｒ、配列番号１７
５’−ｇｃａｃａｇｔｇａａｃｃＴｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｃ−３’
ＩＤ−１３、配列番号１６と配列番号１７の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００８２】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図３の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【００８３】
図３の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図３の（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、遺伝子配列がＣ／ＣのＴｍ値は６０度で、Ｔ／ＴのＴｍ値は６８度であり、ＣとＴの区別が付くことが確認できた。また、Ｃ／Ｔ（ヘテロ型）の遺伝子配列を検出した場合には、検出ピークは６０度と６８度の２箇所に得られ、遺伝子配列の区別ができることも確認できた。
【００８４】
（実施例３）
実施例３では、本発明のＳＬＣ２８Ａ３遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅ（前述した配列番号６の蛍光標識（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）オリゴヌクレオチドからなるもの）を利用し、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表３に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表３】
【００８５】
表３に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１４〜ＩＤ−１６）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、大文字のＧまたはＡが目的多型である。
ＩＤ−１４、２８ｍｅｒ、配列番号１８
５’−ｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔｔＧｔｃｔｇｇｔｔａｔｇｇｔｇａｔ−３’
ＩＤ−１５、２８ｍｅｒ、配列番号１９
５’−ｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔｔＡｔｃｔｇｇｔｔａｔｇｇｔｇａｔ−３’
ＩＤ−１６、配列番号１８と配列番号１９の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００８６】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図４の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例３にかかる試料の微分融解曲線である。
【００８７】
図４の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図４の（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、遺伝子配列がＣ／ＣのＴｍ値は６７度で、Ｔ／ＴのＴｍ値は５８度であり、ＣとＴの区別が付くことが確認できた。また、Ｃ／Ｔ（ヘテロ型）の遺伝子配列を検出した場合には、検出ピークは５８度と６７度の２箇所に得られ、遺伝子配列の区別ができることも確認できた。
【００８８】
（比較例１）
比較例１では、前述した実施例１と比較するために、ＷＴ（野生型）に相補的ではあるが、配列番号１の塩基番号２９２に対応するｃに蛍光標識されていない下記のプローブを利用し、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。なお、プローブの塩基配列の大文字のＧは目的多型であり、プローブの塩基配列の大文字のＴは目的外多型の影響を回避するためである。
ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ２、１７ｍｅｒ、配列番号２０
５’−ｃｔｇｃｇｔｇｔｔｃＧｔｃＴｃｔｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
【００８９】
装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表４に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表４】
【００９０】
表４に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−１７〜ＩＤ−２６）は、以下の通り実施例１と同様である。
ＩＤ−１７、配列番号１２
ＩＤ−１８、配列番号１３
ＩＤ−１９、配列番号１４
ＩＤ−２０、配列番号１５
ＩＤ−２１、配列番号１２と配列番号１３の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２２、配列番号１２と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２３、配列番号１２と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２４、配列番号１３と配列番号１４の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２５、配列番号１３と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
ＩＤ−２６、配列番号１４と配列番号１５の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００９１】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図５の（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【００９２】
図５の（Ａ）〜（Ｊ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図５の（Ａ）〜（Ｊ）に示すように、目的外多型の有無の影響を受け、目的多型の有無の検出が困難となっている。詳細に言うと、目的多型がＣ／Ｃの際には、Ｔｍ値が５７度または６５度の一つのピークの場合、あるいは５６度および６４度の二つのピークの場合がある。目的多型がＴ／Ｔの際には、Ｔｍ値は４８度または５７度のピークとなる。目的多型がＣ／Ｔ（ヘテロ型）の際には、Ｔｍ値は、５７度の一つのピーク、４８度および５６度の二つのピーク、または５７度および６４度の二つのピークのいずれかとなっている。このような結果から、配列番号２０のＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ２を使用するのは困難であると判断した。
【００９３】
（比較例２）
比較例２では、前述した実施例３と比較するために、ＷＴ（野生型）に相補的であり、配列番号３の塩基番号２９０に対応するｃに蛍光標識されていない下記のプローブを利用し、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）の多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置を用いＴｍ解析を行った。プローブの塩基配列の大文字のＡは目的多型である。
ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅ２、１７ｍｅｒ、配列番号２１
５’−（ＴＡＭＲＡ）−ｃｃｔｇｇａｃａｇｇｔｔＡｔｃｔｇ−Ｐ−３’
【００９４】
装置に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。なお、表５に示すＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒはニッポンジーン社製である。
【表５】
【００９５】
表５に示す試料の鋳型の人工オリゴ塩基配列（ＩＤ−２７〜ＩＤ−２９）は、以下の通りである。いずれの人工オリゴ塩基配列も、大文字のＴまたはＣが目的多型である。
ＩＤ−２７、２４ｍｅｒ、配列番号２２
５’−ｔａａｃｃａｇａＴａａｃｃｔｇｔｃｃａｇｇａａｇ−３’
ＩＤ−２８、２４ｍｅｒ、配列番号２３
５’−ｔａａｃｃａｇａＣａａｃｃｔｇｔｃｃａｇｇａａｇ−３’
ＩＤ−２９、配列番号２２と配列番号２３の人工オリゴ塩基配列を１：１で混合
【００９６】
Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。図６の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の比較例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【００９７】
図６の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。しかし、図６の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの図においてもピーク値が検出できないため、配列番号２１のＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅ２を使用するのは困難であると判断した。
【００９８】
（実施例４）
実施例４では、前述した本発明のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型検出用プローブであるＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）ｐｒｏｂｅ、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）ｐｒｏｂｅおよびＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）ｐｒｏｂｅを利用し、それぞれの多型について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用い、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。鋳型として、精製したヒトゲノムを使用する場合と、同一人の全血を使用する場合と、二通り実験を行った。
【００９９】
まず、鋳型として精製したヒトゲノム（全血から一般的な方法を用いて精製したヒトゲノム）を使用した場合について述べる。ＰＣＲおよびＴｍ解析で使用した試料等は下記の表の通りである。
【表６】
【０１００】
表６に示すそれぞれのプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＳＬＣ２８Ａ１−Ｆ、２３ｍｅｒ、配列番号２４
５’−ｃｔｇｃｇｃａａｔｇａｔｇｃｔｔｔｇａｇｃａｇ−３’
ＳＬＣ２８Ａ１−Ｒ、２３ｍｅｒ、配列番号２５
５’−ａａｃｔｇｇｔｇｔｃｃｔｔｃｇｃａｇｇａａｔｃ−３’
ＳＬＣ２８Ａ２−Ｆ、２５ｍｅｒ、配列番号２６
５’−ｇｃａａｇｔｇｇａａｇａｃａｇｔｃｃａｔｔｇｃｔｃ−３’
ＳＬＣ２８Ａ２−Ｒ、３０ｍｅｒ、配列番号２７
５’−ｃｔｇｃａｇａｇａｇａａａｃｔａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔａｃｃ−３’
ＳＬＣ２８Ａ３−Ｆ、２６ｍｅｒ、配列番号２８
５’−ａｇａｇｇａａｇｇｇｃｔｃｔｇｔｇａａａｇｔｔｃａｇ−３’
ＳＬＣ２８Ａ３−Ｒ、２７ｍｅｒ、配列番号２９
５’−ｃｃａｇｔｇｇｔｔａｇｔｇａｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃｔｇ−３’
【０１０１】
ＰＣＲは９５度で６０秒間処理した後、９５度で１秒間および６０度で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１０２】
図７の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる精製ヒトゲノムを含む試料の微分融解曲線である。図７の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。
【０１０３】
図７の（Ａ）に示すように、４９度と５６度とにピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）は、ヘテロ型（Ｇ／Ａ）の多型であることがわかった。図７の（Ｂ）に示すように、５４度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）は、野生型（Ｃ／Ｃ）の多型であることがわかった。図７の（Ｃ）に示すように、５５度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）は、野生型（Ａ／Ａ）の多型であることがわかった。
【０１０４】
次に、鋳型として全血を使用した場合について述べる。使用する全血の前処理として、全血１０μｌを下記の表７に示す「希釈液１」７０μｌに加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを下記の表８に示す「希釈液２」７０μｌに加えた。その後、この混合液１７μｌを９５度で１０分間加熱すると、４μｌの前処理済全血が得られる。これを１回の実験において鋳型として使用した。
【表７】
【表８】
【０１０５】
ＰＣＲおよびＴｍ解析で使用した試料等は下記の表の通りである。表９に示すプライマーおよびプローブの塩基配列は、前述と同様である。
【表９】
【０１０６】
条件についても同様に、ＰＣＲは９５度で６０秒間処理した後、９５度で１秒間および６０度で３０秒間を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。Ｔｍ解析は、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１０７】
図８の（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる全血を含む試料の微分融解曲線である。図８の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれも、横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。
【０１０８】
図８の（Ａ）に示すように、４８度と５５度とにピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ１（Ｇ５６５Ａ）はヘテロ型（Ｇ／Ａ）の多型で精製ヒトゲノムを検体とした場合と同様であることがわかった。図８の（Ｂ）に示すように、５４度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ２（Ｃ６５Ｔ）は野生型（Ｃ／Ｃ）の多型で精製ヒトゲノムを検体とした場合と同様であることがわかった。図８の（Ｃ）に示すように、５４度にピークが検出されているため、ＳＬＣ２８Ａ３（Ａ３３８Ｇ）は、野生型（Ａ／Ａ）の多型で精製ヒトゲノムを検体とした場合と同様であることがわかった。
【０１０９】
以上のことから、精製ゲノムまたは血液検体を用い、ＰＣＲ増幅してＴｍ解析することによって、容易にＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子多型を同時に検出可能であることが確認された。
【０１１０】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１１１】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、
ことを特徴とする、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端に有する、
ことを特徴とする、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする、請求項４に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜２８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜２７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜３１塩基長である、
ことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜１８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜１７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜２１塩基長である、
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いることを特徴とする、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１ないし８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッド形成体を得ることと、
（ｉｉ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ｉｉｉ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を評価することと、
（ｉｖ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における、多型の存在を評価することと、
を含む、請求項９に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法。
【請求項１１】
さらに、前記（ｉ）の前、または、前記（ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、請求項１０に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法。
【請求項１２】
（Ｉ）請求項９ないし１１のいずれか１項に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法により、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出することと、
（ＩＩ）検出されたＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することと、
を含む、薬剤の評価方法。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット。
【請求項１４】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチド、前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット。
【請求項１】
下記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２９２〜３０１を含む１０〜４３塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９２に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において塩基番号３０１〜３０９を含む９〜５２塩基長の塩基配列であり、塩基番号３０９に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２９０〜３０１を含む１２〜５１塩基長の塩基配列であり、塩基番号２９０に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端から数えて１〜３番目の位置に有する、
ことを特徴とする、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９２に対応する塩基のシトシンを３’末端に有し、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号３０９に対応する塩基のシトシンを５’末端に有し、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号２９０に対応する塩基のシトシンを５’末端に有する、
ことを特徴とする、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的塩基配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ前記標的塩基配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする、請求項４に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜２８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜２７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜３１塩基長である、
ことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１０〜１８塩基長であり、
前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは９〜１７塩基長であり、
前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは１２〜２１塩基長である、
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いることを特徴とする、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１ないし８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッド形成体を得ることと、
（ｉｉ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ｉｉｉ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を評価することと、
（ｉｖ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における、多型の存在を評価することと、
を含む、請求項９に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法。
【請求項１１】
さらに、前記（ｉ）の前、または、前記（ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、請求項１０に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法。
【請求項１２】
（Ｉ）請求項９ないし１１のいずれか１項に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出方法により、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子における多型を検出することと、
（ＩＩ）検出されたＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することと、
を含む、薬剤の評価方法。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット。
【請求項１４】
前記（Ｐ１）の蛍光標識オリゴヌクレオチド、前記（Ｐ２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記（Ｐ３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のＳＬＣ２８Ａ１／Ａ２／Ａ３遺伝子の多型検出用キット。
【図１】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−９４１１６（Ｐ２０１３−９４１１６Ａ）
【公開日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３９７５４（Ｐ２０１１−２３９７５４）
【出願日】平成２３年１０月３１日（２０１１．１０．３１）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月３１日（２０１１．１０．３１）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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