ＳＯＤおよびプロラミン系ペプチドフラグメントを含む医薬組成
【課題】医薬投与用に適合された医薬組成を提供する。この医薬組成は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）および少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントの機能的に活性な組み合わせを含む。
【解決手段】本発明は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントを含む医薬投与用に適合された医薬組成に関する。本発明はまた、特定のスーパーオキシドジスムターゼおよびプロラミン系ペプチドフラグメントに関する。
【解決手段】本発明は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントを含む医薬投与用に適合された医薬組成に関する。本発明はまた、特定のスーパーオキシドジスムターゼおよびプロラミン系ペプチドフラグメントに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼを含む医薬組成に関し、特に、他の化合物と関連する、スーパーオキシドジスムターゼを含む医薬組成に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドジスムターゼ（E.C.l.15.1.1.）またはＳＯＤという名称は、スーパーオキシド（Ｏ２〜°）アニオンの不均化において関与する普遍的金属酵素の仲間である。ラジカル種の蓄積または過度量のラジカル種の生成は、ほとんどの生物にとって有害である。この状態は、酸化ストレスとして未だ知られており、多様な病理学的過程（例えば、発癌現象、アテローム性動脈硬化、加齢および炎症疾患（例えば、セリアック病（グルテン不耐性としても知られる））において発生する多数の代謝異常と関連する。
【０００３】
その発展または細胞局在の程度と別に、ＳＯＤは、主に３つの形態で存在する。これら３つの形態は、分子内に含まれる金属イオン（すなわち、銅亜鉛またはＣｕＺｎ−ＳＯＤ、マンガンまたはＭｎ〜ＳＯＤおよび鉄またはＦｅ〜ＳＯＤ）によって区別される。ＣｕＺｎ−ＳＯＤおよびＭｎ〜ＳＯＤはまた、より特殊な細胞組織（例えば、ペルオキシソームまたは植物中の葉緑体）においても見られ、一方哺乳類において、細胞外ＣｕＺｎ−ＳＯＤまたはＥｃ−ＳＯＤが、細胞外区画において特異的に発見されている。より最近では、その他の公知のＳＯＤに対して弱い相同性しか持たないＮｉ〜ＳＯＤが、ストレプトミセスにおいて特定されている。
【０００４】
多数の実験において、全ＳＯＤが同一抗ラジカル活性を持っていても、その有効生物活性は、所与の治療指標および標的生物に対して同一ではないことが示されている。詳細には、ラット中のカラギーナンまたはアドリアマイシンによって誘発される脚部浮腫中の相同ＳＯＤの抗炎症活動は、異種由来のＳＯＤのものと比較すると、非機能性である。異種ＳＯＤの有効性は、活性部位に存在する金属の種類または酵素の全体的分子量よりも、わずかであっても酵素のアミノ酸の変動により高く依存するように見える。
【０００５】
それにもかかわらず、用いられる異種文脈に応じて、異種ＳＯＤと免疫原性ＳＯＤとの間の境界をそれぞれについて決定する必要がある。実際、ラットにおける研究により、以下が示唆されている。
（ａ）相同ラットＣｕＺｎ−ＳＯＤまたは特定の異種ＳＯＤ（例えば、ヒトＭｎ〜ＳＯＤ）は抗炎症活動を持たず、
（ｂ）特定の異種ＳＯＤ（例えば、ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤ）はこのような抗炎症活動を持ち、さらに他のもの（とりわけイーストＣｕＺｎ−ＳＯＤ）は、炎症性活動も持ち得る。
【０００６】
実施された多様な異なる研究から、臨床用量であっても、相同型酵素の有効性が低いため、ヒトＳＯＤは、ヒトにおける特定の抗炎症適応用の異種ＳＯＤよりも有効性が極めて低いことが分かっている。特にこれらの理由のため、ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤは、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）発病前に投与した場合に臨床試験において有利な効果を示すことが分かっている。
【０００７】
ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤとヒトＣｕＺｎ−ＳＯＤとの間には１８．３％の相違が存在し、また多数回の注入が必要なことにも関わらず、アレルギーまたはアナフィラキシーショックの例はほとんど観察されていない。後になっても継続されているいくつかの初期研究によれば、抗ＳＯＤ抗体循環率を増加させることにより、異種ＳＯＤの薬理活動を漸進的に抑制させることが可能であることが提案されている。他のより最近の報告では、異種ＳＯＤの提示および内在化を容易化する過程においてこれらの循環抗体が関与することがより多く示されている。
【０００８】
ＳＯＤを経口投与した場合も、胃腸管中において急速劣化することが多いため、バイオアベイラビリティおよび有効性の低減に繋がる点において、問題である。この問題は、ＳＯＤの有効性が最も高い特定の細胞位置までＳＯＤを到達させることが困難であることにより、悪化する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
出願人は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントを含む医薬組成は、特に上記問題を解消し、また、この結合により、細胞遺伝子座に対するＳＯＤの細胞ターゲティングを容易化して有効性を最適化することができる、ことを発見した。
【００１０】
従って、本発明の目的は、医薬投与用に適合された医薬組成を提供することである。この医薬組成は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）および少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントの機能的に活性な組み合わせを含む。「機能的に活性な組み合わせ」という用語により、上述した２つの成分（これらの成分は、いずれかが結び付けられているかまたは相互に物理的または化学的に結合している）は成分の蓄積効果を越える相乗効果を生成するように共に作用することが、理解される。詳細には、本発明において、ＳＯＤとプロラミン系ペプチドフラグメントとの結合は、ＳＯＤの存在可能時間を向上させると同時に、プロラミン系ペプチドフラグメントによって場合によって発生する炎症反応を顕著に低減させることが分かっている。
【００１１】
本発明の他の目的は、本記載全体から明らかになるが、特に好適な目的としては、上記医薬組成中で採用されるアミノ酸分子、そのためのまたはハイブリダイゼーションを通じて得られる任意の核酸配列コーディング、このようなアミノ酸分子の薬剤、抗細胞ストレス剤としての使用、または炎症病理の治療における薬剤の調合のためのこのようなアミノ酸分子の使用がある。本発明は、特定のプロラミン系ペプチドフラグメントの存在あるいはその少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼとの化学的または物理的組み合わせを検出するために用いられる特定の抗体も網羅する。請求項または記載中で「キメラ」という用語について言及がある場合、この用語は、当該分子が２つ以上の別個の遺伝源から由来する成分を含むことを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［適切なプロラミン］
好適には、上記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンのフラグメントあるいは誘導体、類似体、塩またはその代謝体である。さらに好適には、上記プロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンの非免疫原性類似体である。最も好適な実施形態において、上記プロラミン系ペプチドフラグメントは、免疫原性プロラミン系ペプチドに対して競合的抑制活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である。
【００１３】
本発明の別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、完全に加水分解されたか、実質的に加水分解されたかまたは若干加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメントからなる群から選択される。しかし、一般的には、上記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、胃腸加水分解過程を模倣するＰＴＣ（パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン）加水分解されたプロラミンから得られたフラグメントからなる群から選択される。
【００１４】
代替的であるが好適な実施形態において、少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、腸管内においてターゲティング信号として機能する範囲において、加水分解される。
【００１５】
［適切なＳＯＤ］
スーパーオキシドジスムターゼは、当業者に一般的に公知のものから選択でき、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、動物スーパーオキシドジスムターゼ、バクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、イーストスーパーオキシドジスムターゼおよび植物スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択され得る。しかし、好適には、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、ＮｉスーパーオキシドジスムターゼおよびＦｅスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される。本発明の１つの好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは相同スーパーオキシドジスムターゼである。本発明の別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種スーパーオキシドジスムターゼである。「相同」という用語は、当該分子の任意の所与の標的宿主中の未変性分子と同一由来のＳＯＤを指し、「異種」という用語は、当該分子の任意の所与の標的宿主中の未変性分子と異なる由来のＳＯＤを指す。最も好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼである。
【００１６】
上述したように、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは好適には、植物スーパーオキシドジスムターゼ、さらにより好適には異種ＣｕＺｎ植物スーパーオキシドジスムターゼである。このようなスーパーオキシドジスムターゼは、多くの任意の異なる様式で入手または生成可能である。例えば、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、植物から抽出可能である。上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼの抽出および生成に植物を用いる場合、これらの植物は、ウリ科のものでよく、好適にはメロンからなる群から選択され、あるいは、ナス科からなる群から選択され、好適にはトマトからなる群から選択される。
【００１７】
利用可能な多様な植物スーパーオキシドジスムターゼのうち、本発明によるスーパーオキシドジスムターゼは好適には、ペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼ、葉緑体スーパーオキシドジスムターゼおよび細胞質スーパーオキシドジスムターゼからなる植物スーパーオキシドジスムターゼの群から選択される。
【００１８】
別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、組換えスーパーオキシドジスムターゼである。上記組換えスーパーオキシドジスムターゼは、上記ＳＯＤの核酸コーディングで形質転換された宿主細胞中の遺伝工学および発現を通じて、得ることができる。詳細には、出願人らは、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼが修飾葉緑体、ペルオキソームまたは細胞質ＣｕＺｎ組換えスーパーオキシドジスムターゼである場合に特に好ましいことを発見した。さらに別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、雑種異種／相同スーパーオキシドジスムターゼ（好適には、雑種植物／ヒトスーパーオキシドジスムターゼ）である。
【００１９】
一般的な組換えタンパク質の発現と同様に、異質または未変性遺伝子を宿主細胞ゲノム中に導入する技術も当業者に周知である。従って、本発明の１つの好適な実施形態において、上記修飾葉緑体スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼまたは細胞質スーパーオキシドジスムターゼは、宿主細胞中で発現された修飾核酸配列によってコードされる。これらの修飾コーディング配列を得るために必要なＰＣＲ増幅遺伝子技術も当業者に公知であり、ここでの説明は不要である。
【００２０】
本発明の最も好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、以下によってコードされる組換えスーパーオキシドジスムターゼである。
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうちの任意の１つによる核酸配列
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうち任意のものに対して厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される配列のうちの任意の１つと少なくとも７０％ＢＬＡＳＴ同一の相同性を有する核酸配列
【００２１】
厳密な条件下でハイブリダイジングすることにより、当該核酸が、以下の条件６５℃におけるＳＳＰＥ×０．２下で述べられた配列にハイブリダイズすることが理解される。
【００２２】
最後に、本発明の別の目的は、酸化および炎症病理または疾患の治療のための薬剤（特に、任意のほとんどの病気（グルテン不耐性、および好適にはセリアック病）に伴う病理または疾患のための薬剤）の製造のための、上述したような医薬組成の使用に関する。
【００２３】
［異種植物ＳＯＤ］
出願人は、植物由来のＳＯＤは本発明において極めて有利であることを発見した。ＣｕＺｎ−ＳＯＤは、高等植物の光合成細胞のいくつかの形態において存在する。これらは、主に葉緑体中そしてより低い程度において細胞質およびペルオキシソーム中で見受けられる。これらは、アミノ酸組成、分子量、等電点およびその重合レベルにおいて、相互に異なる。
【００２４】
これらのうち多くは、生化学的にまたは遺伝子的に特徴付けられる。葉緑体またはペルオキソーム植物ＳＯＤが、先ずタンパク質のＮ末端においてリーダー配列または信号ペプチドを含む前駆体として、生成される。この前駆体は、葉緑体またはペルオキシソーム中への転位後、余分なＮ末端部分の削除において行われる機能性成熟を経験する。
【００２５】
この特異性に加えて、上記ペルオキソームＳＯＤ（特に、メロンのもの）または葉緑体ＳＯＤ（特にトマトのもの）は、（ａ）細胞質ＳＯＤ中の７０％保存領域に対して葉緑体およびペルオキソームＳＯＤ中の約９０％保存領域において、細胞質ＳＯＤよりもこれらの間においてより良好に保存され、（ｂ）他の植物ＣｕＺｎ−ＳＯＤよりも熱および過酸化水素不活性化に対して高い耐性を持つのにもかかわらず、経腸または非経口投与のいずれにおける治療用途候補として考えられてこられなかった。
【００２６】
しかし、出願人の配列アライメントにより、葉緑体またはペルオキソームＳＯＤは、その等価な細胞質ゾル由来植物ＳＯＤよりも２〜４％少なくヒトまたはウシＳＯＤと異なることが明らかになった。
【００２７】
本発明の好適な実施形態のうちの１つにおいて、例えばメロンからの葉緑体ＣｕＺｎ−ＳＯＤの選択は、出願人によって保持された。なぜならば、細胞質形態に豊富な植物由来の特定のコドンがバクテリアにおいて稀であることが特定され、また、この理由のため、発現レベルと、これらを豊富にまたは活性部位において含む生合成酵素の特定活動とが有意に変化する。
【００２８】
出願人は好適には、バクテリアシステムを生合成ＳＯＤの組換え発現のための宿主細胞として用いることを選択し、これにより、これら２つの局面が確認される。
【００２９】
出願人のバクテリアシステムにおいてヒトＣｕＺｎ−ＳＯＤは発現され、機能性であった。これは上記稀なコドンのうち少なくとも２つを含むものの、そこから形成された２つのアルギニン残留物は、Ｎ末端領域において発見可能であり、ヒトＳＯＤの酵素的機能に関与しているように見えない。
【００３０】
一方、細胞質トマトＳＯＤにおいて、上記稀なコドンから得られた２つのアルギニン残留物は、上記酵素のＣ末端部分中に配置され、そのうちの１つは、スーパーオキシドアニオンの誘引に関する酵素的機能に関与する。
【００３１】
この場合、このシステム中で発現される生合成トマト細胞質ＳＯＤは、活性がずっと低い。葉緑体トマトＳＯＤ上について他の研究が行われたが、このような稀なコドンが存在せず、バクテリア中でのその発現により完全な機能性の生合成ＳＯＤが得られ、このＳＯＤが完全に活性であることが示されている。
【００３２】
このバクテリアシステム中でクローニングおよび発現された第１の２個のメロンＳＯＤは、得られる精製レベルにおける細胞質トマトと同様の特定の活動を持つことが分かっている。この場合、上記稀なコドンは、細胞質トマトＳＯＤ中で特定されたのと同じ位置を網羅し、上記アルギニンのうち１つは、上記スーパーオキシドの誘引機能を持つ。
【００３３】
よって、現在用いられている宿主株を、Ｅｃｏｌｉ（すなわち、アルギニンＡＧＧまたはＡＧＡ）において稀に用いられるコドン向けのさらなるｔＲＮＡｓを含む株と代替すると、有利であった。この特定の株は、バクテリア中の機能的に活性な植物タンパク質の発現を向上させるように、設計される。
【００３４】
従って、植物由来の成熟ＳＯＤは、その抽出された形態においておよび好適には組換え酵素として、経口投与と組み合わされると、異種活性および免疫耐性双方を調和させることができ、そのため、病理学的炎症過程の治療におけるウシＳＯＤの代替物として機能可能である。
【００３５】
［ＳＯＤの経口投与および細胞ターゲティング］
治療的に受容可能なＳＯＤの活性を増加させるために、いくつかの異なる処方が考えられた（すなわち、リポソームカプセル封入、アルブミン共役、またはポリエチレングリコールとの結合、またはヘパリン親和性ペプチドとの雑種としての結合）。
【００３６】
リポソームまたはセラミドを用いた経口投与された異種ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤの抗炎症活性は、先ず、カラギーナンによって誘発されるラット下肢浮腫の低減において示された。また、セラミドをグリアジンのような植物プロラミンと代替し、非組換えウシＳＯＤを非組換え植物ＳＯＤと代替した場合、注入可能なウシＳＯＤと比較可能な治療活動により、ラット中で誘発される認知疾患の発病を遅延させることが分かった。
【００３７】
［グリアジン使用における副作用］
しかし、この種の経口投与の場合、限られてはいるが無視できない数の人数に有意の多くの副作用が発生している。上記修飾処方中で用いられた特定の物質（特に、グリアジンのような植物プロラミン）は、胃腸管中でのペプシン−トリプシン加水分解後に耐性の低い生成物を発生させ得、その結果、グルテンアレルギーまたはさらにはセリアック病の場合のような毒性となり得ることが周知である。このヒトのみに発生する疾病は、ヒト腸細胞の刷毛状縁部の特定容量にリンクし、これにより、ＨＬＡクラスＩＩ分子が発現する。いくつかのハプロタイプ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ）は、グリアジン〜特異Ｔ細胞の活性化に密接に関連することが分かっている。グリアジンペプチドのこの有毒処理は、以下の３つの連続工程が関与すると考えられている。
ａ）グリアジンの有毒フラグメントがＨＬＡ受容体に結合し、腸管微絨毛縁部上の腸細胞へ輸送される。
ｂ）これらが固有層中のＣＤ４＋型上皮内細胞へ提示された場合、上記腸細胞側底レベルへ輸送される。
ｃ）最後に、無傷のまたは部分加水分解されたポリペプチドが、上記腸細胞側底膜から上記固有層中のＡＰＣ細胞（抗原提示細胞）へと解放される。
【００３８】
小麦胚芽油中に存在するグリアジンペプチドおよび胃腸管中での加水分解によって生成されるものにより、負の反応（すなわち、炎症反応）が発生し、一方、酵素的に活性のＳＯＤと結び付けられると、このようなペプチドの負の効果は大幅に低減される。
【００３９】
加えて、上記負の副作用を除いて小麦胚芽油中に存在するものと同様の挙動を示す二粒系コムギ中に存在するグリアジンの結合が、酵素的に活性のＳＯＤと結び付けられた場合に、酸化ストレスに関連する欠乏の治療にとって最も好適であることが分かっている。
【００４０】
生理的条件下において、上皮細胞によって提示される抗原に対する反応をＴＨ２型Ｔ細胞によって仲介する。これらの細胞は、ＩｇＡ生成に起因し、とりわけ、食物抗原に関する免疫耐性に起因する。グルテン不耐性またはそのより深刻な形態であるセリアック病の場合、グリアジン由来のペプチドは、すでに酸化促進性であるためグリアジンに対して一層感受性の高い酸化ストレスの状態を生成することにより、腸細胞の酸化代謝を変化させることができる。
【００４１】
この炎症状態は、サイトカインおよび一酸化窒素（ＮＯ）の生成における重要な変化と関連する、ＴＨｌ細胞型に対する細胞反応の転換により、特徴付けられる。これらの条件下において、脂質過酸化反応の増加および酸化および低減した形態のグルタチオン（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）の比の増加は、抗酸化物質をグリアジンと融合させるとこの治療指標において有利な効果が得られるはずであるという出願人の仮説を補強した。
【００４２】
結果として、そのグリアジンとの組み合わせから得られる経口経路によるＳＯＤ抗炎症活性の増強が、細胞膜の親和性増加および関連する代謝経路の基礎制御に起因して、現れることとなる。
【００４３】
よって、これらの効果を実証するために、酵素的に活性の異種ＳＯＤを先ず小麦胚芽油プロラミンの加水分解物の誘導体（詳細にはＶｕｌグリアジン）と結合させ、そのアミノ酸配列がＮｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）であることを確認した。その後、二粒系コムギプロラミンの加水分解物のその無毒類似性誘導体（詳細にはＤｕｒグリアジン）と結合させ、そのアミノ酸配列がＮｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）であることを確認した。この類似体は、グリアジンの有毒誘導体の競合的抑制物質であり、腸細胞との相互作用サイトのターゲティングが可能である。
【００４４】
プロラミン（詳細にはグリアジン）は、胃腸管移行時において自身が包囲している活性成分を保護するという積極的役割を果たし、その加水分解された形態において、腸管粘膜内の細胞における活性成分のターゲティングおよび連続的放出を助ける。これらの誘導体をタンパク質Ｎ末端部分に追加された無毒類似体（例えば、異種ＳＯＤ）と代替した場合、上記誘導体ペプチドフラグメントの腸細胞ターゲッターとしての役割を維持すると同時に、プロラミンの抗原誘導体の有害な効果を回避することができる。
【００４５】
いくつかの治療指標における注入可能なウシＳＯＤによって実証される薬理有効性と、ＢＳＥおよびＣＦＪＤの出現によって発生した公的安全の問題とを鑑みて、上記した本発明の目的は、以下の利点を持つことであることが分かった。
１．レシピエントの遺伝的バックグラウンドに関係なく、異種非免疫原性ＳＯＤまたは免疫耐性の誘発のみを行うもの。
２．植物由来の（有利には食物由来の）ＳＯＤ。
３．このようなＳＯＤの場合に従来では有効ではなかった投与経路を通じて異種ＳＯＤを薬理的に活性させる処方。
４．この異種ＳＯＤを無毒腸管ターゲティングペプチドと結合させることで、経口投与されたこれらのＳＯＤの異種活性を増強させ、治療法が未だない適応（詳細にはオーファンドラッグ適応）における代替的治療を示すこと。
【００４６】
本発明のこれらのおよび他の実施形態について、以下詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
［例］
（例１）
銅亜鉛ペルオキソームまたはメロン「キューカミスメロＬ」から得られた葉緑体スーパーオキシドジスムターゼについてコーディングするメッセンジャーＲＮＡのクローニングと、その完全な核酸配列（コーディングおよび非翻訳配列双方）の決定とを、逐次ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって行った。図２中に示すような偽細胞質という名称の第１のタンパク質変異体を得るために、コーディング配列のみを含む第１のクローンを遺伝工学によって改変した。
【００４８】
この第１のタンパク質変異体は、メロン葉緑体ＳＯＤの遺伝子改変の一般図を示す。この第１の変異体は、未変性信号ペプチドに対応するＮ末端における第１の６５個のアミノ酸の置換を示し、上記アミノ酸対メチオニン−バリンは、細胞質植物ＳＯＤのＮ末端の特性である。この技術によって改変された過程により、植物細胞中においてＳＯＤが経験する葉緑体成熟工程が得られ、その後、図示の２つのアミノ酸が付加される。第２および第３の変異体は、このメチオニン−バリンアミノ酸対に加えて、胃腸管ターゲティングのためのグリアジンペプチド配列（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）、ＶｕＩと呼ぶ）をそれぞれ含む。その由来は小麦胚芽油であり、そのペプチド配列により、感作反応を生成することなく、以下のような、腸細胞と相互作用するグリアジンペプチドの再生が可能となる（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）、Ｄｕｒと呼ぶ）。その由来は二粒系コムギである。
【００４９】
（例２）
コーディング配列全体の直接的ＲＴ−ＰＣＲ増幅により、トマト葉アカナス（ＰｕｂＭｅｄＢｌａｓｔ受入番号Ｘ１４０４０）から、銅亜鉛ＳＯＤ細胞質スーパーオキシドジスムターゼをコードするメッセンジャーＲＮＡのクローニングが得られ、これにより、細胞質という名称の第１のトマト変異体が得られた。第２の変異体および第３の変異体も、胃腸管ターゲティング（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）、ＶｕＩと呼ぶ））のためのグリアジンペプチド配列の付加により、遺伝子操作された。その由来は小麦胚芽油であり、上記ペプチド配列により、感作反応を生成することなく、以下のような腸細胞上でのグリアジンペプチド相互作用の再生が可能となる（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）、Ｄｕｒと呼ぶ）。その由来は二粒系コムギである。
【００５０】
（例３）
コーディング配列全体の直接的ＲＴ−ＰＣＲ増幅により、ヒト血液細胞ホモサピエンス（ＰｕｂＭｅｄ／Ｂｌａｓｔ受入番号Ｋ０００６５）から得られた銅亜鉛ＳＯＤ細胞質スーパーオキシドジスムターゼについてコードするメッセンジャーＲＮＡのクローニングを得、これにより、細胞質という名称の第１のヒト変異体を得た。第２変異体および第３の変異体についても、胃腸管ターゲティング（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）、ＶｕＩと呼ぶ））のためのグリアジンペプチド配列の付加により、遺伝子操作を行った。上記ペプチド配列により、感作反応を生成することなく、以下のような腸細胞上でのグリアジンペプチド相互作用の再生が可能となる（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）、Ｄｕｒと呼ぶ））。
【００５１】
（例４）
各種類の構成の第１の変異体の発現物を用いて、得られた多様な生合成ＳＯＤの抗ラジカル活性を検証した。これらの活性について、未変性ＰＡＧＥ上のＮＢＴの還元により、確認した。その結果、上記組換え生合成タンパク質の活性が、現在最も用いられているバクテリア宿主株中に稀に存在するコドンの植物ｃＤＮＡ中の存在に密接にリンクすることが分かった。
【００５２】
現在用いられている株中に発現する３つのｃＤＮＡからの低い発現率または活性率については、バクテリア株（とりわけコドンＡＧＡ、ＡＧＧ（アルギニン）およびより低い範囲ではコドンＣＣＣ（プロリン）、ＧＧＡ（グリシン）ＣＴＡ（ロイシン）、およびＡＴＡ（イソロイシン））によって稀に用いられるコドンの存在によって説明することができる。この問題を回避するために、上記ｃＤＮＡをｐＥＴ３０ａ＋（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）として特定される別の発現ベクターシステムに移行させ、これを用いて、これらの稀なアミノ酸用の適切なｔＲＮＡを含むＲｏｓｅｔｔａＤＥ３ｐＬｙｓＳ（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）として特定される許容バクテリア株を形質転換した。
【００５３】
［本発明の詳細なプロトコル］
（キューカミスメロＬＳＯＤのクローニングプロトコルおよび遺伝子改変）
変種キューカミスメロＬ（ＶＩＬＭＯＲＩＮ−ＧＮＩＳ−２２５１０２９として登録されている市販の変種）または上記変種キューカミスメロＬＣ（ＡＳＬ−ＮＣＩＭＳ−４０３１０として登録されている変種）のいずれかから、真核細胞に使用されるものと同一の技術［ＴＲＩｚｏｌ−ＴＭキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス］を用いて窒素凍結保存されたキューカミスメロＬメロン葉から全ＲＮＡを抽出した。
【００５４】
（メロンＳＯＤの３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）
２５μｌの反応緩衝液中の修飾オリゴｄＴプライマーAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０３）［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｍａｒｔ ｃＤＮＡ ｒｅｆ：ｋ１０５１］から、メッセンジャーＲＮＡの単鎖ＤＮＡマトリックス中への転写を実施した：トリスＨＣｌ２０ｍＭ ｐＨ８．３、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび４００μＭの各ｄＮＴＰを２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下で４２℃で１時間。
【００５５】
補体としていくつかの単鎖プライマー対（例えば、ＥｎｄプライマーAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０４）を修飾オリゴｄＴプライマーならびにメロンコーディング領域のためのMelcyt5F1 GGTGAYACMACMAATGGYTG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０５）およびMelcyt5S2 CATGCKGGKGAYCTDGG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０６）それぞれと組み合わせることにより、ＳＯＤのためのメッセンジャーＲＮＡコーディングの３’末端の増幅を実施した。アンプライマー配列は、いくつかの植物種のペルオキソーム、葉緑体および細胞質ＣｕＺｎ−ＳＯＤの保存領域に基づくものであるため、本質的に極めて縮重するものである。
【００５６】
（メロンＳＯＤの５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）
バクテリアベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａから市販）中へのクローニング後、７個の独立クローンを配列し、コンセンサス配列を用いて、３つの新規の特定のプライマーVed3R3 ACAAAGGCTCTTCCAACTACAG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０７）、Ved3R2 GCCGCTAAGAGGAATCTG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０８）およびVed3R1 TGGTTGCCTCTGCTACTCCATC（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０９）を構築した。この特定のプライマーＶｅｄ３Ｒ３を用いて、メッセンジャーＲＮＡをｄＣＴＰホモポリマー伸長（５’ＲＡＣＥシステム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｒｅｆ：１８２７４−０５８）によって終端された単鎖ＤＮＡマトリックス中に転写した。このマトリックスの増幅は、プライマーAAPP GGCCAGGCGTCGACTA GTACGGGGGGGGGGGGGGGG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°１０）およびプレ増幅工程のためのＶｅｄ３Ｒ２およびAAP GGCCAGGCGTCGACTAGTAC（ＳＥＱ．ＩＤＮ°１１）および特定のメッセンジャーＲＮＡの５’末端の最終増幅のためのＶｅｄ３Ｒ１の連続的組み合わせにより、得た。
【００５７】
（３つのＳＯＤ変異体の増幅および遺伝子改変）
各種（ヒト、トマトおよびメロン）からの異なるＳＯＤ変異体の増幅を、３つの単鎖５’アンプライマーを以下のような各種のためのユニークな単鎖３’アンプライマーと組み合わせることにより、可能にした。
【００５８】
名称 サイト 配列
Hum5Cyt NcoI atcggatccATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(SEQ.IDN°12)
Hum5Dur NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(SEQ.IDN°13)
Hum5Vul NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(SEQ.IDN°14)
Hum3Rfw HindIII ctcgagaaqcttTTATTGGGCGATCCCAATTAC(SEQ.IDN°15)
【００５９】
名称 サイト 配列
Tom5Cyt NcoI atcggatccATGGTGAAGGCCGTCGCCGTCCTT(SEQ.IDN°16)
Tom5Dur NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGTGAAGGCCGTCGCCGTCCTT(SEQ.IDN°17)
Tom5Vul NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGTGAAGGCCGTCGCCGTCCTT(SEQ.IDN°18)
Tom3Rfw HindIII ctcgagaagcttTAACCCTGGAGGCCAATAAT(SEQ.IDN°19)
【００６０】
名称 サイト 配列
Mel5pCyt NcoI atcggatccATGGTGAAAGCTGTCGCTGTCCTC(SEQ.IDN°20)
Mel5Dur NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGTGAAAGCTGTCGCTGTCCTC(SEQ.IDN°21)
Mel5Vul NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGTGAAAGCTGTCGCTGTCCTC(SEQ.IDN°22)
Mel3Rfw HindIII ctcgagaagcttCACACAGGAGTCAGACCGAC(SEQ.IDN°23)
【００６１】
ここで、Ｃｙｔは、オリジナルの６５アミノ酸配列の代わりにさらなる２個のアミノ酸を含むメロン偽細胞質形態を指定し、ヒトおよびトマト中の細胞質形態については、参照符号ＤｕｒおよびＶｕｌがそれぞれ以下を示す。
【００６２】
ＤＵＲは、二粒系コムギから得られた胃腸管ターゲティング信号ペプチドを含む細胞質形態を示す。
【００６３】
ＶＵＬは、小麦胚芽油から得られた胃腸管ターゲティング信号ペプチドを含む細胞質形態を示す。
【００６４】
これらのプライマーは、５’ＢａｍＨＩまたはＮｃｏｌサイトおよび３’Ｈｉｎｄｌｌｌサイトのいずれかにおける同相でのバクテリア発現ベクターｐＥＴ３０ａ＋（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）中へのその導入を可能にする必要な合成配列を含むように、構築された。これらの増幅および遺伝子改変のためのグローバルプロシージャを図１中に報告する。
【００６５】
バクテリア発現システムにより、クローンｃＤＮＡのハイブリドタンパク質としての発現が可能となり、ＳＯＤまたはタンパク質変異体がそのＮ末端を介してＨｉｓ−Ｔａｇ配列へとリンクされる。
【００６６】
全ての増幅は、ＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）を２５ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、ＭｇＣＩ２を１．５ｍＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、各プライマーを１０μＭ、プラスミドＤＮＡを１０ｎｇ、ゴールドスターＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を２．０単位を含む５０μｌの反応体積中において行った。各使用サーモサイクリングプログラムを以下の表に示し、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲサーモサイクルシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上で実施した。
【００６７】
［ＲＴ−ＰＣＲ増幅サイクルの表］
（メロン３’ＲＡＣＥ）
９５℃、３分
９５℃、２５秒
５５℃、３０秒
７２℃、４０秒
９５℃、２５秒
５８℃、３０秒
７２℃、４０秒
（メロン５’ＲＡＣＥ）
９５℃、３分
９５℃、３０秒
５５℃、３０秒
７２℃、６０秒
９５℃、３０秒
６１℃、４０秒
７２℃、５０秒
（メロンクロロ）
９５℃、３分
９５℃、４０秒
５７℃、４０秒
７２℃、４０秒
９５℃、４０秒
６０℃、４０秒
７２℃、５０秒
（メロン偽Ｃｙｔ）
９５℃、３分
９５℃、４０秒
５７℃、４０秒
７２℃、４０秒
９５℃、４０秒
６０℃、４０秒
７２℃、５０秒
【００６８】
ヒト、トマトおよびメロンＳＯＤについてエンコーディングする３つのタンパク質変異体「Ｃｙｔ、Ｄｕｒ、およびＶｕｌ」の増幅を５’オリゴヌクレオチドプライマーのサイズ差を考慮した同一プロトコルに従って行った。先ず、反応物を９４℃で５分間加熱した後、以下のような５回の予備サイクル（９４℃での変性を０．４５分、５６℃でのアニーリングを０．５５分および７２℃での伸展を０．５５分）に暴露した後、さらなる２５サイクル（９４℃での変性を０．４５分、５９℃でのアニーリングを０．５５分および７２°Ｃでの伸展を０．５５分）に暴露した。
【００６９】
事前クローンされたＣｕ−ＺｎＳＯＤ ＣＤＮＡのコーディング領域をＰＣＲによって増幅し、増幅された４５９ｂｐおよび４９５ｂｐ生成物をその後適切な制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌ〜５’端部およびＨｉｎｄｌｌｌ〜３’端部によって消化し、その結果、同相でのバクテリア発現ｐＥＴ３０ａ＋（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）中へのその導入を可能とした。
【００７０】
各種（ヒト、トマト、およびメロン）のための３つのクローンのヌクレオチド配列を決定し、事前取得された配列と同一であることが分かり、以下に示す。
【００７１】
［葉緑体またはペルオキソームＣｕＺｎ−ＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４）］
【００７２】
［メロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２５）］
【００７３】
［二粒系コムギペプチドによるメロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２６）］
【００７４】
［小麦胚芽油ペプチドによるメロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２７）］
【００７５】
［トマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２８）］
【００７６】
［二粒系コムギペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２９）］
【００７７】
小麦胚芽油ペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３０）
【００７８】
［ヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３１）］
【００７９】
二粒系コムギペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３２）
【００８０】
［小麦胚芽油ペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３）］
【００８１】
公知の植物スーパーオキシドジスムターゼによるＯＲＦおよび配列アライメントの決定のためのコンピュータソフトウェアを用いた核酸配列の分析により、要求に匹敵するペプチド配列の決定と、上記した遺伝子改変から得られた変異体のペプチド配列の決定とが可能となった。
【００８２】
［メロン葉緑体ＣｕＺｎ−ＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４）］
【００８３】
［メロン偽細胞質ＣｕＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５）］
【００８４】
［メロン偽細胞質ＣｕＺｎＳＯＤ形態＋二粒系コムギペプチドの場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６）］
【００８５】
［メロン偽細胞質ＣｕＺｎＳＯＤ形態＋小麦胚芽油ペプチドの場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７）］
【００８６】
［トマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８）］
【００８７】
［二粒系コムギペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９）］
【００８８】
［小麦胚芽油ペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０）］
【００８９】
［ヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１）］
【００９０】
［二粒系コムギペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２）］
【００９１】
［小麦胚芽油ペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４３）］
【００９２】
バクテリア発現システムｐＥＴ３０ａにより、クローンＣＤＮＡをハイブリッドタンパク質として発現させることが可能となり、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳバクテリア株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中への発現後、ＳＯＤが切断可能なＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）が融合される。
【００９３】
ＯＤ６００ｎｍの値が０．６まで上昇するまで、生成されたＣｕ−ＺｎＳＯＤの変異体形態それぞれについて入手および選択された組換えクローンを、適切な抗生物質（３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび／または３４μｇ／ｍｌのカナマイシンが補充された１リットルのリッチメディア（トリプトンを１０ｇ／ｌ、イースト抽出物を５ｇ／ｌ、ＮａＣｌを５ｇ／ｌ）中で再懸濁した。その後、３７°Ｃでのインキュベーションを少なくとも３時間行い、この時点において、タンパク質の発現を制御するラックプロモーター誘導物質であるイソプロピルチオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を追加して最終濃度１ｍＭを得、さらに４〜６時間インキュベートした。
【００９４】
各調製のための２個のバクテリアペレットを（１）５０ｍｌの寒冷ＰＢＳ緩衝液または（２）５０ｍｌの添加液（Ｎｏｖａｇｅｎから市販）中で再懸濁し、その後、４℃で各３０秒の４連続サイクル（Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ４０Ｗ〜２０ＫＨｚ）において、超音波処理緩衝液（トリスＨＣｌ ｐＨ７．４を１０ｍＭ、ＥＤＴＡを１ｍＭ、ＮａＣｌを１５０ｍＭ）に暴露した。遠心分離を13000ｇで２０分間行うことにより、細胞質内タンパク質抽出物を単離した。
【００９５】
粗タンパク質抽出物から開始して、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄクイックカートリッジ（ＮＯＶＡＧＥＮからｒｅｆ７０１５５として市販）上で、多様なＨｉｓ−ＴａｇＳＯＤ融合タンパク質を単離した。その後、組換えエンテロキナーゼ（ｒｅｆ６９０６６、ＮＯＶＡＧＥＮ）でのハイブリドタンパク質の加水分解後、多様なＳＯＤおよびその特定の変異体を新規精製工程によってＨｉｓ−Ｂｉｎｄクイックカートリッジ上で精製した。
【００９６】
（例５）
［メロン抗ｒｅｃＳＯＤ抗体］
組換えメロンＳＯＤのアミノ酸配列を得た後、スイスプロットアライメントを用いて他の植物ＳＯＤとの比較分析を実施し、メロン特異ポリクローナル抗体（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）を得るためにウサギの免疫化を行うために、２個のペプチド配列１４−２７（ＥＰ１６６８−ＧＶＶＴＬＴＱＥＤＤＧＰＴＳ、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４４））および１１７−１３１（ＥＰ１６６９−ＨＥＬＡＤＤＬＧＫＧＧＨＥＬＳ、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４５）を選択した。抗体ＥＰ１６６９をイムノアブソープションによる親和性カラム上で精製しウエスタンブロット分析中で１／2000において用いて、生成されたメロン組換えＳＯＤに対する抗体の特異性を確認した。
【００９７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、タンパク質抽出物を９５℃で５分間加熱した後、電気泳動を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で実施した。分離されたタンパク質を免疫ブロットＰＶＤＦ膜（ＢＩＯＲＡＤ）上に移行させた。上記抗体の任意のポテンシャルクロス特異性が、上記増幅されたＯｐｔｉ４ＣＮヤギ抗ウサギ検出キット（ＢＩＯＲＡＤ）により、明らかとなった。
【００９８】
ＥＰ１６６９抗体は、免疫化ペプチド由来の完全な組換えメロンＳＯＤタンパク質に対して良好な特異性を示した。ＥＰ１６６９抗体はまた、組換えヒトおよびトマトＳＯＤならびに天然ウシＳＯＤまたはヒトＳＯＤに対してクロス特異性を示した。従って、この抗体は、本発明の組換えＳＯＤタンパク質の薬理活動の検証に必要な実験のための検出ツールとして有用であった。
【００９９】
（例６）
［抗ラジカル活性］
メロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤおよびヒトまたはトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤならびにその２つの異なるグリアジンペプチドを支持する等価物をその抗ラジカル活性について分析した。これらの活性は、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動上でのＮＢＴ光還元に従って確認される（BeauchampsおよびFridovitch、1971）。
【０１００】
（例７）
［細胞ターゲティング］
標的薬剤として用いられるグリアジンペプチドが先に示したようにＨＬＡ−ＤＱ２と相互作用してヒト腸細胞中に進入可能なだけでなく、それと物理的にまたは化学的に結合するタンパク質の併用ターゲティングを容易化することも可能であることを実証するために、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ）中の１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）およびＣａｃｏ−２（ＡＴＣＣＨＴＢ−３７）を成長させる。いくつかの場合において、細胞を１００ｌＵ／ｍｌのＩＦＮ―γ（Ｒ＆Ｄシステムズ）で４８時間インキュベートし、ＨＬＡクラスＩｌ発現を誘発する。
【０１０１】
［グリアジンペプチド提示分析およびフローサイトメトリ］
およそ２×１０5個の細胞を、３７℃で組換えＳＯＤで１ｍｇ／ｍｌまでの濃度で１〜２０時間インキュベートする。０．２μｍミリポア膜での濾過により、試験されたＳＯＤ化合物を殺菌する。これらの細胞を回収し、Ｌ２４３ｍＡｂ（抗ＨＬＡ ＤＲ、ＡＴＣＣ ＨＢ−５５）を用いてＨＬＡクラスＩＩ発現用のフローサイトメトリによって分析し、その後、ＦＩＴＣ結合型ヤギ抗マウスｌｇＧ（ＩＣＮ−Ｃａｐｐｅｌ）を行う。
【０１０２】
細胞表面におけるＳＯＤ化合物を検出するために、これらの細胞をＥＰ−１６６９抗体またはＥＰ−１６６８抗体（ＩＳＯ細胞）でインキュベートし、ＦＩＴＣ結合型ヤギ抗ウサギｌｇＧで明らかにする。４°Ｃで６０分間インキュベーションを行い、その後、ＦＢＳを１０％およびアジ化ナトリウムを０．１％含むＰＢＳ中で、これらの細胞を３回洗浄する。その後、これらの細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で分析する。
【０１０３】
（例８）
［アネキシンＶ陽性細胞の検出］
この部分中で報告される実験全てにおいて、４８時間の暴露時間が用いられた。アポトーシス接着細胞の検出は、フルオレセインイソチオシアネートでラベルされたアネキシンＶ〜ＰＳ（Martinら、1995）の結合を用いたフローサイトメトリにより、行った。インキュベーション期間後、上記したようなトリプシンおよびＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で細胞単層を脱離させ、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、１×１０6個の細胞を遠心分離によって収集して、接着細胞中のアポトーシスを評価した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性細胞の評価は、ＡｐｏＡｌｅｒｔアネキシンＶアポトーシスキット（Clontech Laboratories、Palo Alto、ＣＡ、米国）を用いて行った。暗所において２００μｌの結合緩衝液中で１０μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（最終濃度：０．５μｇ／ｍｌ）および０．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムによって細胞を再懸濁させ、１５分間インキュベートして、壊死細胞を排除した。４８８ｎｍでチューニングされたアルゴンイオンレーザでＣｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ細胞分取器（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）上で、二色サイトメトリ（蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ））分析を行った（Koopmanら、1994）。
【０１０４】
（例９）
［細胞浸透］
上記したように処理された第２のフラクションの細胞を用いて、ＥＰ１６６９抗体およびＥＰ−１６６８抗体によるウエスタンブロット分析を用いて試験された異なる細胞区画（すなわち、膜、細胞質）のタンパク質抽出物を調製し、これにより、ターゲティング信号ペプチドによりこれらが上記細胞中へ（詳細には上記細胞区画中へ）転位置していることを示す。
【０１０５】
（例１０）
［細胞内レドックス状態上で異なった挙動を示すＳＯＤ化合物］
制御および処理された細胞（５×１０5個）を回収し、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素およびＧＳＨそれぞれの検出のために、ハイドロエチジン（ＨＥ；分子プローブ）、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ１２３；分子プローブ）または５−クロロメチル−２’、７’−ジクロロ−ジヒドロフルオレセインジアセタート（ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ、分子プローブ）で、４９５μｌのハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）中でインキュベートする。３７℃１５分間後、上述したような血球計算器上でサンプルを分析する。
【０１０６】
（例１１）
［細胞活性］
ＳＯＤはその高分子量に起因して細胞膜に浸透しなかったと長く考えられてきたが、２４時間後に外因的に付加された有意な量の無担体のＣｕＺｎＳＯＤが細胞膜をマーク付けすることができたことを実証する試みはわずかしか行われていない（Ｅｄｅａｓ ＭＡら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．1996、ｖｏｌ．４２、ｐ１１３７）。
【０１０７】
それにもかかわらず、細胞外的に付加された時に上記ＳＯＤ酵素によって細胞内ＲＯＳの解毒をより効率的に行うために、細胞に浸透可能な組換えＳＯＤタンパク質が生成されている。ヒトＣｕＺｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）遺伝子を、ＨＩＶ−１の９アミノ酸Ｔａｔタンパク質伝達ドメイン（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をエンコードする遺伝子フラグメントと融合した。このＴａｔ−ＳＯＤ融合タンパク質は、外因的に培地中に付加された際に時間（１０〜６０分）内に用量依存的（０．２〜２μＭ）にＨｅＬａ細胞中に進入することが分かった。一旦上記細胞中に入ると、伝達したＴａｔ−ＳＯＤタンパク質は酵素的に活性であり、かつ、２４時間安定であった。パラコートで処理されたＨｅＬａ細胞（細胞内スーパーオキシドアニオン発生装置）の細胞バイアビリティーは、伝達したＴａｔ−ＳＯＤによって増加する（Ｋｗｏｎ ＨＹら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.２０００、ｖｏｌ４８５、ｐ１６３）。しかし、この場合、ＨＩＶ−１Ｔａｔ伝達タンパク質が多様な細胞型におけるＭｎＳＯＤ発現の低減の原因であることが分かっことは、注目すべきである（MareckiＪＣら、2004 Free Radic Biol Ｍｅｄ、ｖｏｌ３７、ｐ８６９／PorntadavityＳら、ＤＮＡｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、2005、ｖｏｌ２４、ｐ２９９）。
【０１０８】
上記ヒトＣｕＺｎ〜スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）遺伝子をリジンに富んだペプチド（ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ）の９アミノ酸をエンコードする遺伝子フラグメントと融合させた場合、９Ｌｙｓ−ＳＯＤの伝達有効性は、Ｔａｔ−ＳＯＤよりも高効率であった（Park Ｊら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ、2002、ｖｏｌ１３、ｐ２０２）。
【０１０９】
多様なグリアジン鎖由来のタンパク質ペプチドは、ａ）その相対的消化性（タンパク質抵抗）、ｂ）その相対的サイズまたは配列（高プロリン領域、ｃ）細胞培養物中でのその相対的濃度（凝集またはアポトーシス）、ｄ）ＨＬＡクラスＩＩ分子によるその相対的認識（ＨＬＡ ＤＱ２またはＤＲ３）、ｅ）ゾヌリン誘導のその相対的可能性に応じて、腸管細胞の有意な修飾および／または変更を生成する能力を有すると認識されている。
【０１１０】
少なくとも１つ（ただし、これに１つに限定されない）特定のグリアジン由来ペプチド（１９〜２０アミノ酸残留物−ＬＧＱＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−）の場合、ＨＬＡ ＤＲ３分子と直面すると、ＨＬＡＤＱ２分子液滴に効率的に結合可能であることが分かっている（Shidrawi.ＲＧら、1998、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｖｏｌ１１、ｐ１５８）。グリアジン鎖から単離された他の多くのペプチドが、ＨＬＡ ＤＱ２またはＤＲ３に対して同様の能力を有する（Qiao.ＳＷら、2004、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｖｏｌ１７３、ｐ１７５７）が、正常クラスＩＩ ＨＬＡとのグリアジンペプチド相互作用については、ほとんど知られていない。
【０１１１】
グリアジンが腸管バリアを通過することを可能にする早期工程は、先ずラット上皮腸管細胞ＩＥＣ−６上で確立される。グリアジンによるＩＥＣ−６細胞のインキュベーションにより、細胞内アクチンフィラメントの再構築が起こるが、この再構築は、グリアジンインキュベーションのわずか１５分後に視認可能となり、６０分後にピークとなり、２．５時間後にベースライン値に戻った。＋４℃の温度ではグリアジンによって誘発されたＦアクチン変化を抑制できず、その結果、アクチン重合がグリアジンエンドサイトーシスと関連するという可能性が除外される（KwiatkowskaＫら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、1999、ｖｏｌ２１ｐ４２２）。
【０１１２】
グリアジンは、腸細胞からのゾヌリン放出を含む別の経路を用い得る。ゾヌリン生成は、グリアジン濃度に依存し、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌのグリアジンでのインキュベーション後１５分経過後に早くも細胞培養物上清中で検出可能であった。その後、３０分においてピークに達し、６０分後にベースラインに戻った。Ｕｓｓｉｎｇチャンバ中に取り付けられたウサギ腸管粘膜にグリアジンを付加すると、Ｒｔ（抵抗力）が低減し、この抵抗力低減は、インキュベーション３０分経過後に有意となった。他の著者は、グリアジンペプチド誘導体ゾヌリン放出および腸管浸透性の同時増加の強力な誘導物質であると推測している（ClementeＭＧら、Ｇｕｔ．2003、ｖｏｌ５２、ｐ２１８）。
【０１１３】
腸管上皮とのグリアジン相互作用によりゾヌリン放出を通じて腸管浸透性が上昇し、その結果、グリアジンの傍細胞転位およびその腸管粘膜下層内でのマクロファージとの後続相互作用が可能となり、その結果、炎症性反応およびフリーラジカル生成が発生する（ThomasＫＥら、2006、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｖｏｌ１７６、ｐ２５１２）ことが後に実証された。
【０１１４】
上述したような組換えメロンＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子が、Ａグリアジンの１０アミノ酸ペプチドをエンコードする遺伝子フラグメントと融合された（ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ、ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１、以下ペプチド９８２と示す）。Ｇｌｉ−ＳＯＤ融合タンパク質が発現し、エシェリキアコリ中で精製された。
【０１１５】
［バクテリアクローン培養物からのタグ付けされた組換えキューカミスメロタンパク質（ＳＯＤおよびＧｌｉ−ＳＯＤ）の生成および精製］
バクテリア発現システムｐＥＴ３０ａにより、クローンされたｃＤＮＡのハイブリドタンパク質としての発現が可能となった。このハイブリドタンパク質において、組換えメロンＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤ（ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−ＳＯＤ）は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳバクテリア株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中での発現後、切断可能なＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列（ポリペプチド−Ｈｉｓ6−エンテロキナーゼ開裂配列−５ｋＤａ）と融合された。
【０１１６】
［発酵過程および誘導過程］
吸光度Ａ600が１単位の値に達するまで、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補充された２リットルのＹＥＳ培地中で３７℃で発酵を行う。その後、ＩＰＴＧを誘発タンパク質発現に最終濃度０．５ｍＭまで付加した。一晩成長させた後、遠心分離によって細胞を収集して、高圧において細胞切断を実施した（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ、２サイクル：Ｐ＞８００バール）。
【０１１７】
［変性工程］
その後、尿素の連続的付加によりバルクを変性させ、その結果、トリス２０ｍＭを有する８Ｍの緩衝液の最終濃度がｐＨ８．０となる。完全溶解後、室温における完全なタンパク質可溶化にβメルカプトエタノールを付加（最終濃度１０ｍＭ）する。17000ｇにおける遠心分離により１５分間行い、可溶性タンパク質を回収した。
【０１１８】
［精製工程］
金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＮｉＣｌ2０．２５Ｍ、Ｎｉ2+イオンで活性化されたキレート化セファロース）によるアフィニティー精製により、組換えタグ付けされたタンパク質を単離し、先ず平衡緩衝液中のカラム中にロードした：トリス２０ｍＭ、尿素８Ｍ、βメルカプトエタノール１０ｍＭ（ｐＨ８．０）。
【０１１９】
［インカラムリフォールディング工程］
固定化組換えタンパク質を大量に洗浄し、尿素量増加により部分的にリフォールディングし、カラム尿素８Ｍ〜１．５Ｍの勾配（緩衝液中、トリス２０ｍＭ、βメルカプトエタノール１０ｍＭ、ｐＨ８．０）に付加した。
【０１２０】
その抗酸化物質活性を取り出すため、スーパーオキシドジスムターゼは、再生工程時、その天然補助因子を回復しなければならない。これは、ＮａＡｃ５０ｍＭ、尿素１．５Ｍ、ＣｕＣｌ2０．１ｍＭ、ＺｎＣｌ2０．１ｍＭおよびβメルカプトエタノール１０ｍＭ（ｐＨ５．０）からなる緩衝液中のＣｕ／Ｚｎの連続的固定により、行われる。
【０１２１】
組換えＳＯＤフォールディングの安定化は、トリス２０ｍＭ、尿素１．５Ｍ、ＣｕＣｌ2０．１ｍＭ、ＺｎＣｌ2０．１ｍＭ、ＧＳＨ１ｍＭ、ＧＳＳＧ４ｍＭおよびｐＨ８．０からなる緩衝液中のシステインアミノ酸間の分子内ジスルフィド架橋の形成により、有利に行われる。
【０１２２】
［溶出工程］
トリス２０ｍＭ、尿素１．５Ｍ、イミダゾール０．５ＭおよびｐＨ８．０からなる緩衝液により、上記親和性カラムからの濃縮されたタグ付けされた組換えタンパク質の溶出を得る。その後、これらをトリス２０ｍＭ、ＣｕＣｌ2０．１ｍＭ、ＺｎＣｌ2０．１ｍＭおよびｐＨ８．０中で一晩透析した後、０．２２μｍフィルタによって最終濾過を行って、消化時の微生物成長を回避する。タンパク質内容物推定は、μＢＣＡ方法による上清中で評価した。
【０１２３】
［タグ開裂］
組換えタンパク質をハイブリドタンパク質として発現させる。このハイブリドタンパク質中、ＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤがそのＮ末端部分において少量の切断可能なリンカーを介してＨｉｓ−Ｔａｇ配列（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を含む少量のタンパク質に融合している。
【０１２４】
この開裂は、２．０％エンテロキナーゼでのインキュベーションを室温において４４時間行うことにより、達成される。
【０１２５】
［フォールディングされかつ無菌の組換えＳＯＤの精製］
放出後、最終精製工程により、トリス−ＨＣｌ２０ｍＭ、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化されかつトリス−ＨＣｌ２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ８．０の溶出緩衝液で溶出されたＭｏｎｏＱカラム上で、少量のタギングタンパク質を組換えＳＯＤから除去した。
【０１２６】
消化時の微生物成長を回避するための０．２２μｍでの濾過を行った。タンパク質内容物推定は、μＢＣＡ方法により上清中で評価した。
【０１２７】
上記精製から得られた結果を図５中に示す。
【０１２８】
［組換えリフォールディングされたキューカミスＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤの抗酸化物質活動］
多工程変性／再生プロトコルに従って、キューカミス組換えＳＯＤおよびグリアジンペプチド（Ｇｌｉ−ＳＯＤ）を支持するその等価物を生成および精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、有意な程度の精製が明らかとなり、その抗酸化物質活動の回復に基づいて、上記リフォールディング過程の有効性を評価する。組換えタンパク質（キューカミスメロＳＯＤおよびＧｌｉ−ＳＯＤ）双方のＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動上でのＮＢＴを低減させる可能性（ＮＢＴ光還元、ＢｅａｕｃｈａｍｐｓおよびＦｒｉｄｏｖｉｔｃｈ、1971）を評価し、天然キューカミスメロ抽出物の可能性と比較した。
【０１２９】
ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動上で得られた遊走プロファイルおよびＮＢＴ低減は、組換えタンパク質、ＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤ（4000〜10000ＵＮＢＴ／ｍｇタンパク質）双方の正確かつ高効率のリフォールディングを裏付けており、これは、その抗酸化物質活動を示すために必須のイベントである。
【０１３０】
ここから得られた結果を図６中に示す。
【０１３１】
［メロン抗ｒｅｃＳＯＤ抗体］
上記組換えメロンＳＯＤのアミノ酸配列を得た後、Ｓｗｉｓｓ Ｐｌｏｔアライメントを用いて他の植物ＳＯＤとの比較分析を行って、２つの相対的に保存されたペプチド配列１４−２７（ＥＰ１６６８−ＧＶＶＴＬＴＱＥＤＤＧＰＴＳ）および１１７−１３１（ＥＰ１６６９−ＨＥＬＡＤＤＬＧＫＧＧＨＥＬＳ）を選択した。これらのペプチド双方を合成し、ウサギの免疫化のための適切なキャリア（ＫＬＨ）と結合させて、植物特異ポリクローナル抗体を得た（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）。抗体ＥＰ１６６９を免疫吸着によって親和性カラム上で精製し、ウエスタンブロット分析中で１／２０００で用いて、天然およびメロン組換えＳＯＤならびに精製ウシＳＯＤに対するこの抗体の特異性を確認した。
【０１３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、これらのタンパク質を９５℃まで５分加熱した後、電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル上で１２％で行った。分離されたタンパク質を免疫ブロットＰＶＤＦ膜（ＢＩＯＲＡＤ）上に移行させた。抗体の任意のポテンシャルクロス特異性が、増幅Ｏｐｔｉ４ＣＮヤギ抗ウサギ検出キット（ＢＩＯＲＡＤ）によって明らかとなった。
【０１３３】
ＥＰ１６６９抗体は、上記天然メロン抽出物中に含まれる２個のＳＯＤとのクロス特異性そして精製ウシＳＯＤとのクロス特異性を示した。
【０１３４】
さらに、ＥＰ１６６９抗体は、上記免疫化ペプチドの由来元である完全な組換えメロンＳＯＤタンパク質との良好な特異性を示した。よって、抗体は、上記天然抽出物中に存在する反応性ＳＯＤのうちの少なくとも１つとの相同性だけでなく、多様な種間のＳＯＤ科内に存在し得る相同性（完全な相同性）も示すことが確認された。この抗体は、本発明の組換えＳＯＤタンパク質の薬理活動の検証に必要な検出実験において有用なツールである。
【０１３５】
上記抗体結合試験の結果を図７に示す。
【０１３６】
［細胞培養物］
ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を、ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、４．５ｇ／Ｌ Ｄグルコース、ピルビン酸ナトリウムおよび１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中の１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で、成長させる。各実験（ｎ＝４）において、およそ２×１０4個の細胞／ウェルを５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。任意の実験の前に、既存の培地を新規培地と交換した。上記インキュベーション期間後、０．０５％トリプシンおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で細胞単層を脱離させ、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、遠心分離によって回収した。その後、ＧＵＡＶＡ ＰＣ Ｖｉａｃｏｕｎｔ Ｆｌｅｘキットを用いて血球計算器中で細胞をカウントし、細胞数／ｍｌで報告して、細胞増殖を推定した。
【０１３７】
［グリアジンペプチドの無毒濃度の効果］
グリアジン治療は、濃度に依存する様式で、細胞成長に多様な効果を及ぼすことが以前から分かっている。５０〜２００μｇ／ｍｌの濃度は細胞成長を抑制する一方、５００μｇ／ｍｌまでの濃度は深刻な細胞破壊の原因となり得る。グリアジンペプチドは、先ずヒト腸管細胞の酸化バランスを変更することにより、その効果を開始し得ることが知られている（Dolfiniら、2002、Ｔｏｘｉｃｏｌ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、ｖｏｌ１６、ｐ３３１）。
【０１３８】
現在の実験において、７２時間にわたって培養物を定期的にサンプリングして、多様な成分への暴露を行った場合および行わなかった場合のＨＴ−２９細胞の増殖率およびバイアビリティーを評価した。（ａ）１０μＭのグリアジンペプチド９８２（小麦胚芽油、ＱＱＰＹＰＯＰＱＰＦ．ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）は、有意な腸細胞凝集（De Vicenzi.Ｍら、１９９７、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ１２０、ｐ２０７）または腸細胞アポトーシス（Giovanniniら、2000、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ１４５、ｐ６３）を誘発するように事前に関連付けられた濃度よりも少なくとも１００倍小さい。
【０１３９】
我々が試験したこのような低い濃度において、グリアジンペプチドがＨＴ−２９細胞株増殖に主な効果を発揮する能力を持つが、この能力を持つのは、培養物の２４時間においてのみである。この効果は、４８時間後に急速に消え去る。なぜならば、この４８時間経過後において、増殖がその基底レベルに戻り、おそらくはペプチド内部移行に起因してペプチドの存在から完全に独立するように見えるからである。グリアジンペプチドは、濃度閾値を越えかつ／またはヒト腸管細胞培養物上の十分な濃度を維持して、凝集またはさらなるアポトーシスをもたらさなければならないように見える。これは、高濃度のグリアジンペプチドで腸管細胞を２４時間暴露した後、有意なＯ20−およびＨ2Ｏ2生成の増加および抗酸化物質酵素の低減が観察された実験によって裏付けられ、上記グリアジンペプチド誘発アポトーシスに先行する（Giovannini.Ｃら、2003、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ５４０、ｐ１１７）。
【０１４０】
上記した試験の結果を図８の図解中に示す。
【０１４１】
［組換えＳＯＤの最小活性用量］
組換えタンパク質用量反応実験のため、組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤ（０〜５０ＮＢＴ単位）の濃度をさらに４８時間増加させて、ＨＴ−２９細胞をインキュベートした。
【０１４２】
この実験において、２つの異なる平行な挙動について、低用量または高用量を付加して、４８時間でのＨＴ−２９成長における組換えＳＯＤおよびＧｌｉ−ＳＯＤ双方について観察した。
【０１４３】
ＨＴ−２９細胞株の成長は、１０単位用量の組換えＳＯＤまたは５単位用量の組換えＧｌｉ−ＳＯＤのいずれかにより変化するが、これらの値未満の値の場合、ＨＴ−２９の成長は若干減速する。組換えＳＯＤおよび組換えＧｌｉ−ＳＯＤの用量を増加させると、ＨＴ−２９成長誘導のその相対レベルは同一レベルに留まり、これは、どんなに高用量であっても、誘導閾値が達成可能であることを示している。
【０１４４】
これらの結果に従って、最適な用量が、組換えＧｌｉ−ＳＯＤの場合に５〜１０単位および組換えＳＯＤの場合に１０〜２５単位で区切られ得る。
【０１４５】
上記実験の結果を図９に示す。
【０１４６】
［本発明の組換えＳＯＤは、「ペプチド効果」の補正を操作する］
培養物を定期的に７２時間サンプリングして、多様な成分への暴露を行ったかまたは行わなかった以下の場合において、ＨＴ−２９細胞の増殖率およびバイアビリティーを評価した。（ａ）１０単位の組換えＳＯＤまたは（ｂ）１０μＭのペプチド９８２と結合された１０単位の組換えＳＯＤまたは最後に（ｃ）１０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤ（グリアジンペプチド９８２に物理的にリンクしたＳＯＤ）
【０１４７】
この濃度において、ＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのいずれも任意の有毒効果を発揮しない。
【０１４８】
なぜならば、これらの増殖曲線は厳密に基底曲線に適合しかつ平行に構成されているからである。さらに、組換えＧｌｉ−ＳＯＤのＮ末端部分におけるペプチド９８２の存在にもかかわらず、期待されたような「ペプチド効果」は２４時間の培養物において発生しない。我々は、グリアジンペプチドが組換えＳＯＤ（Ｇｌｉ−ＳＯＤ）と関連付けられるかまたは結合し、その結果、グリアジンペプチドによって仲介されるフリーラジカル生成および／または抗酸化物質酵素の障害の一時的増加と相互作用することができる場合、上記にて証明されたグリアジンペプチドのＨＴ−２９増殖に対する効果が、２４時間の培養物において存在しないことに気がついた（RivabeneＲら、1999、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃａｔ、ｖｏｌ１４５３、ｐ１５２）。
【０１４９】
この驚くべき相乗効果は、上記グリアジンペプチドおよび上記ＳＯＤの結合あるいは物理的または化学的結合があろうとなかろうと、機能性組み合わせを含む治療組成および治療的組成において極めて有用な結果を持つ。なぜならば、これは、炎症ペプチドが投与形態中に意図的に存在する場合でも、期待された炎症反応を軽減さらには解消することができることを示すからである。
【０１５０】
この実験の結果の概要を図１０中に示す。
【０１５１】
［細胞アポトーシス］
２つの基礎的な経路が、アポトーシスを実行し得る。第１の経路において、デスリガンドはその受容体（Ｆａｓ／ＦａｓＬｉｇａｎｄ）を活性化させ、その結果、デスコンプレックスが形成される。その後、このデスコンプレックスは、カスパーゼ８を活性化させる。
【０１５２】
第２の経路において、細胞ストレスに起因して、細胞質中へのチトクロムＣの放出によってミトコンドリア機能障害が発生し、その結果、アポトーシスタンパク質因子−１およびカスパーゼ９との活性化複合体が形成される。その後、これらの複合体は、下流効果またはカスパーゼ３、６および７を活性化させ、その結果、最終アポトーシス変化が実行される。
【０１５３】
コムギグリアジンからの消化されたペプチドはＣＤ９５／Ｆａｓアポトーシス経路を介して腸管上皮細胞のアポトーシスを誘発することが知られているが（GiovanniniＣら、2003、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ５４０、ｐ１１７）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼの混合物によって生成されたＲＯＳ（活性酸素種）は、チトクロムＣの細胞質中への放出と共に、カスパーゼ−３を活性化させる（HiguchiＭら、1998、ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｖｏｌ１７、ｐ２７５３）。
【０１５４】
第１にニューロペプチドとして特徴付けられて、オレキシンだけでなくその受容体も、胃腸管（VoisinＴら2000、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、ｖｏｌ２９２、ｐ６３８）を含むいくつかの末梢組織中に発現することが分かった（Voisin Ｔら、2003、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、ｖｏｌ６０、ｐ７２）。オレキシンは、ミトコンドリアおよびカスパーゼ活性化からのチトクロムＣ放出を通じてアポトーシスを促進することにより、２４時間後にヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞の成長を全体的に抑制する能力を有する（Rouet-Benzineb Ｐら、2004、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ２７９、Ｐ４６８７５）。
【０１５５】
本発明の組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤから期待される細胞ストレスおよびミトコンドリア機能障害と戦う特定の活性により、このような誘発性システムにおけるその強力な抗アポトーシス効率を確認するために、実験を行った。上記組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのために用いられた濃度は、増殖曲線に従って規定した。基底アポトーシス過程との相互作用に十分と思われる１０単位の組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのみを用い、一方、オレキシンまたはキサンチン／キサンチンオキシダーゼによって（Ｘ／ＸＯ）誘発されたＨＴ−２９細胞上でのアポトーシスには、５０単位の組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤがより適しているように見える。
【０１５６】
［組換えＳＯＤは、オレキシン誘発アポトーシスを抑制した］
アポトーシス細胞と非アポトーシス細胞とを区別するＧＵＡＶＡ Ｎｅｘｉｎキットを用いて、ＨＴ−２９細胞株中においてアポトーシスを分析した。この方法では、アネキシンＶフィコエリトリンを用いて、アポトーシス細胞の外膜上のｐｈｏｐｓｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ（ＰＳ）を検出する（Martinら、1995、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、ｖｏｌ１８２、ｐ１５４５）。
【０１５７】
２４時間後、トリプシンを０．０５％およびＥＤＴＡを０．５ｍＭ含むＰＢＳ溶液によって細胞単層を脱離させ、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、アポトーシス細胞染色を行い、ＧＵＡＶＡＰＣＡシステムで分析する。
【０１５８】
基底アポトーシス抑制（部分Ａ）については、１０単位の双方の組換えＳＯＤ（ＮＢＴ単位）を含むかまたは含まない新規培地と培地を交換した。オレキシン誘発アポトーシス抑制（部分Ｂ）については、１μＭのオレキシンおよび／または５０単位の各組換えＳＯＤ（ＮＢＴ単位）を含む新規培地と培地を効果した。その結果をアポトーシスアネキシンＶ−ＰＥ陽性細胞の百分率として表し、それは４点の平均である。
【０１５９】
通常条件下において、外膜ＰＳのアネキシンＶラベル付けによって示すように、アポトーシスは２０％（２０．５）のＨＴ−２９細胞中において同時発生した。
【０１６０】
この速度は、ＨＴ−２９細胞の培養時において１０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤが存在した場合に１０単位の組換えメロンＳＯＤが存在して１６．８％まで到達した際に（１８．１％抑制）、１８％まで低下した（１２．２％抑制）。
【０１６１】
第２の実験において、ＨＴ−２９細胞培地へのオレキシンの補充を介してアポトーシスを誘発した際に、組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤの強力な抗アポトーシス効果を確認した。この場合において、ＨＴ−２９細胞がアポトーシスとなる速度は、オレキシンを１μＭ培地中に付加することにより、基底レベルで評価した２０％から４０％まで向上され得る。オレキシン誘発アポトーシスの速度は、ＨＴ−２９細胞の培養時において５０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤが存在した際に５０単位の組換えメロンＳＯＤが存在して最終的に２８．７％に達した際に（５４．７％抑制）、３４．４％まで低下した（２６％抑制）。
【０１６２】
この実験の結果の概要を図１２中に示す。
【０１６３】
［組換えＳＯＤは、Ｘ／ＸＯ誘発アポトーシスを抑制した］
腸管上皮細胞機能は、活性酸素種ＲＯＳの生成を通じて、活性マクロファージ（腸疾患）などの局所免疫細胞および炎症細胞によって構成され得る。従って、ＲＯＳは、腸管上皮細胞アポトーシスと関連するＦａｓおよびＦａｓＬ発現を誘発し得る（DenningＴＬら、2002、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ｖｏｌ３３、ｐ１６４１）。
【０１６４】
キサンチン存在下のキサンチンオキシダーゼは、主にＯ２−°を生成する（これは、小腸中の活性酸素の代表であり、膜浸透性移行、カルシウム流入、脂質過酸化反応およびミトコンドリア中の膜流動性変化を誘発し得る）（AnupＲら、1999；Ｉｎｄｉａｎ Ｊ ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｖｏｌ３６、ｐ２６６およびAnupＲら、2000、ＢｒＪ Ｓｕｒｇ、ｖｏｌ８７、ｐ１０９４）。
【０１６５】
この第３の実験において、本発明による組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤの強力な抗アポトーシス効果の試験を、ＨＴ−２９細胞培地中でのキサンチン／キサンチンオキシダーゼ誘導を介した可能なＦａｓ／ＦａｓＬ経路上で行った。
【０１６６】
この場合、ＨＴ−２９細胞がアポトーシスとなる速度は、培地中に１０ｍＵのＸ／ＸＯ複合体を付加することにより、基底レベルについて評価した２０％から３０％まで向上され得る。５０単位の組換えメロンＳＯＤまたはやはり５０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤを培地に付加すると、ＨＴ−２９細胞中でのＸ／ＸＯ誘発アポトーシス経路がそれぞれ７１％および８６％だけ回避された。
【０１６７】
この実験の結果を図１３のグラフに示す。
【０１６８】
［組換えＧｌｉ−ＳＯＤの結合］
各実験（ｎ＝４）において、およそ１５×１０3個の細胞／ラメラ層を５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。全実験の前に、既存の培地を新規培地と交換した。
【０１６９】
その後、細胞単層を新規培地中で５０単位のＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤを用いてまたは用いずにさらに２４時間インキュベートし、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、その後、免疫組織化学によって分析した。ＥＰ−１６６９を第１の抗体（ウサギｌｇＧ抗ＳＯＤ、希釈１／2000°）を用いて３０分間Ｇｌｉ−ＳＯＤのＨＴ−２９細胞への結合を分析した。その後、第２のＦＩＴＣ結合抗体（ヤギ抗ウサギ抗体、希釈１／１００）をさらに３０分間分析した。
【０１７０】
フローサイトメトリではなくこの方法を選択した理由は、フローサイトメトリ技術の場合、トリプシン治療によって細胞を回収し、分析前に収集しなければならず、このような治療は、Ｇｌｉ−ＳＯＤ分子と細胞表面との間の相互作用に悪影響を与える可能性があるためである。
【０１７１】
上記ＦＩＴＣ蛍光実験の結果を図１１中に示す。図１１において、細胞近隣のＳＯＤの存在がＳＯＤ双方において明確に視認され、また、Ｇｌｉ−ＳＯＤの場合にも、より広範囲で明確に視認される。
【０１７２】
上記実験は、本発明による、そのＮ末端において小麦胚芽油グリアジンペプチド配列を持つかまたは持たないキューカミスメロＳＯＤをエンコードする遺伝子操作されたｃＤＮＡｓは、エシェリキアコリ中で効率的に発現され得、抗酸化物質活動を持つ活性の分子として生成され得ることを実証した。加えて、消化されたグリアジン−ペプチドのみが腸管細胞凝集または特定状況の細胞アポトーシスを誘発することで知られているが、本発明者らは、これらの負の効果を回避するより短いグリアジンペプチドを選択する。また、本発明のＳＯＤを選択されたグリアジンペプチドと物理的に組み合わせるかまたは単に結合させることで、グリアジンペプチドの確実な炎症効果と相互作用が可能になることも示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】キューカミスメロからのＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼのためのｃＤＮＡコーディングを得るために用いられるクローニング方法の模式図である。
【図２】本発明の組換えおよびキメラＳＯＤ分子を生成するために用いられる遺伝工学の一般図の模式図である。
【図３】本発明による多様なメロンＣｕ−ＺｎＳＯＤ変異体のＲＴ−ＰＣＲ増幅から得られるアガロースゲル電気泳動を示す。詳細には、ランＡは組換え葉緑体メロンＣｕ−ＺｎＳＯＤであり、ランＢは組換えメロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤであり、ランＣは、グリアジンペプチドへのＮ末端融合を支持するランＢの組換え偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤである。
【図４】異なる由来（詳細には、トマト細胞質ＳＯＤ（線１）、ヒトＳＯＤ（線２）およびメロン葉緑体ＳＯＤ（線３））からの３つの異なるＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸アライメントを示す。これらの配列間のアミノ酸残留物の同一性は、円を通じて３つのＳＯＤの各群の下側に示される。
【図５】組換えＳＯＤ（レーン１〜７）または組換え融合Ｇｌｉ〜ＳＯＤ（レーンＡ〜Ｆ）の精製過程のクマシーブルー染色ゲルである。図５において、 レーン１およびＡは、インビトロジェンから市販されているベンチマークタンパク質ラダーとして公知の分子量マーカである。 レーン２およびＢは、Ｈｉｓ−Ｔａｇの開裂を示す。 レーン３、４、５、６およびＣ、Ｄ、Ｅは、連続精製工程時における本発明による組換えＳＯＤおよび組換えＧｌｉ−ＳＯＤを示す。 レーン７およびＦは、ＭｏｎｏＱカラム上の治療後に残っているバンドである。
【図６】ＮＢＴ還元ゲル電気泳動を用いた組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤそれぞれのフォールディングを示す。 Ａは、１２５μｇの天然メロン抽出物（９０Ｕ／ｍｇに等価）でロードされたレーンＡおよびＡ’と、０．９２μｇの未変性ＳＯＤでロードされたレーン１、１’、および１’’’を有するｒｅｃＳＯＤを示す。Ｂは、本発明によるｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤを示し、レーンＡおよびＡ’は、１２５μｇの天然メロン抽出物（９０Ｕ／ｍｇに等価）でロードされ、レーン１および１’は１．８４μｇの組換えＧｌｉ−ＳＯＤでロードされ、レーン２および２’は、０．９２μｇの組換えＧｌｉ−ＳＯＤでロードされる。
【図７】以下のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。 Ａは、以下のクーマシー青色顕色を示す。 レーン１中の５０μｇの天然キューカミスメロ抽出物 レーン２中のタンパク質マーカ（６．６、１４．１、２１．１、３１、４５および６７ＫＤａ） レーン３中の２．５μｇのウシＳＯＤ（シグマ） Ｂは、以下のＥＰ１６６９抗体顕色を示す。 レーン４中の５０μｇの天然キューカミスメロ抽出物 レーン５中のタンパク質マーカ（６．６、１４．１、２１．１、３１、４５、６７ＫＤａ） レーン６中の２．５μｇのウシＳＯＤ（シグマ）
【図８】ＨＴ２９細胞株の増殖曲線上のグリアジンペプチドの効果のグラフであり、ここでＮ＝４である。
【図９】本発明によるｒｅｃＳＯＤまたはｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤの最小有効量の図解比較であり、Ｎ＝４である。
【図１０】本発明によるｒｅｃＳＯＤまたはｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤのＨＴ２９細胞株の増殖曲線上への効果のグラフであり、Ｎ＝４である。
【図１１】ＥＰ１６６９抗ＳＯＤ抗体を用いたＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのＨＴ２９細胞上への細胞結合を示す１組のＦＩＴＣ画像であり、Ａは負の制御であり、白色エリアは、細胞近隣のＳＯＤの存在を示し、ＢはｒｅｃＳＯＤでの治療後であり、白色エリアは、細胞近隣のＳＯＤの存在を示し、ＣはｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤでの治療後であり、白色エリアは、細胞近隣のＳＯＤの存在を示す。
【図１２】アネキシンＶ試験を用いた、本発明によるＳＯＤの基底（Ａ）またはオレキシンによって誘発された（Ｂ）ＨＴ−２９アポトーシスに対する効果を図解表示したものであり、Ｎ＝４である。Ａは、１ＯＵを用いて得られた結果を示し、Ｂは、ｒｅｃＳＯＤおよびｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤそれぞれの５０Ｕを用いて得られた結果である。
【図１３】ヒポキサンチン／キサンチンオキシダーゼによって誘発されたＨＴ−２９アポトーシスにおける組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤに対する効果のグラフを示す（Ｎ＝４、アネキシンＶ試験）。
【０１７４】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼを含む医薬組成に関し、特に、他の化合物と関連する、スーパーオキシドジスムターゼを含む医薬組成に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドジスムターゼ（E.C.l.15.1.1.）またはＳＯＤという名称は、スーパーオキシド（Ｏ２〜°）アニオンの不均化において関与する普遍的金属酵素の仲間である。ラジカル種の蓄積または過度量のラジカル種の生成は、ほとんどの生物にとって有害である。この状態は、酸化ストレスとして未だ知られており、多様な病理学的過程（例えば、発癌現象、アテローム性動脈硬化、加齢および炎症疾患（例えば、セリアック病（グルテン不耐性としても知られる））において発生する多数の代謝異常と関連する。
【０００３】
その発展または細胞局在の程度と別に、ＳＯＤは、主に３つの形態で存在する。これら３つの形態は、分子内に含まれる金属イオン（すなわち、銅亜鉛またはＣｕＺｎ−ＳＯＤ、マンガンまたはＭｎ〜ＳＯＤおよび鉄またはＦｅ〜ＳＯＤ）によって区別される。ＣｕＺｎ−ＳＯＤおよびＭｎ〜ＳＯＤはまた、より特殊な細胞組織（例えば、ペルオキシソームまたは植物中の葉緑体）においても見られ、一方哺乳類において、細胞外ＣｕＺｎ−ＳＯＤまたはＥｃ−ＳＯＤが、細胞外区画において特異的に発見されている。より最近では、その他の公知のＳＯＤに対して弱い相同性しか持たないＮｉ〜ＳＯＤが、ストレプトミセスにおいて特定されている。
【０００４】
多数の実験において、全ＳＯＤが同一抗ラジカル活性を持っていても、その有効生物活性は、所与の治療指標および標的生物に対して同一ではないことが示されている。詳細には、ラット中のカラギーナンまたはアドリアマイシンによって誘発される脚部浮腫中の相同ＳＯＤの抗炎症活動は、異種由来のＳＯＤのものと比較すると、非機能性である。異種ＳＯＤの有効性は、活性部位に存在する金属の種類または酵素の全体的分子量よりも、わずかであっても酵素のアミノ酸の変動により高く依存するように見える。
【０００５】
それにもかかわらず、用いられる異種文脈に応じて、異種ＳＯＤと免疫原性ＳＯＤとの間の境界をそれぞれについて決定する必要がある。実際、ラットにおける研究により、以下が示唆されている。
（ａ）相同ラットＣｕＺｎ−ＳＯＤまたは特定の異種ＳＯＤ（例えば、ヒトＭｎ〜ＳＯＤ）は抗炎症活動を持たず、
（ｂ）特定の異種ＳＯＤ（例えば、ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤ）はこのような抗炎症活動を持ち、さらに他のもの（とりわけイーストＣｕＺｎ−ＳＯＤ）は、炎症性活動も持ち得る。
【０００６】
実施された多様な異なる研究から、臨床用量であっても、相同型酵素の有効性が低いため、ヒトＳＯＤは、ヒトにおける特定の抗炎症適応用の異種ＳＯＤよりも有効性が極めて低いことが分かっている。特にこれらの理由のため、ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤは、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）発病前に投与した場合に臨床試験において有利な効果を示すことが分かっている。
【０００７】
ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤとヒトＣｕＺｎ−ＳＯＤとの間には１８．３％の相違が存在し、また多数回の注入が必要なことにも関わらず、アレルギーまたはアナフィラキシーショックの例はほとんど観察されていない。後になっても継続されているいくつかの初期研究によれば、抗ＳＯＤ抗体循環率を増加させることにより、異種ＳＯＤの薬理活動を漸進的に抑制させることが可能であることが提案されている。他のより最近の報告では、異種ＳＯＤの提示および内在化を容易化する過程においてこれらの循環抗体が関与することがより多く示されている。
【０００８】
ＳＯＤを経口投与した場合も、胃腸管中において急速劣化することが多いため、バイオアベイラビリティおよび有効性の低減に繋がる点において、問題である。この問題は、ＳＯＤの有効性が最も高い特定の細胞位置までＳＯＤを到達させることが困難であることにより、悪化する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
出願人は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントを含む医薬組成は、特に上記問題を解消し、また、この結合により、細胞遺伝子座に対するＳＯＤの細胞ターゲティングを容易化して有効性を最適化することができる、ことを発見した。
【００１０】
従って、本発明の目的は、医薬投与用に適合された医薬組成を提供することである。この医薬組成は、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）および少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントの機能的に活性な組み合わせを含む。「機能的に活性な組み合わせ」という用語により、上述した２つの成分（これらの成分は、いずれかが結び付けられているかまたは相互に物理的または化学的に結合している）は成分の蓄積効果を越える相乗効果を生成するように共に作用することが、理解される。詳細には、本発明において、ＳＯＤとプロラミン系ペプチドフラグメントとの結合は、ＳＯＤの存在可能時間を向上させると同時に、プロラミン系ペプチドフラグメントによって場合によって発生する炎症反応を顕著に低減させることが分かっている。
【００１１】
本発明の他の目的は、本記載全体から明らかになるが、特に好適な目的としては、上記医薬組成中で採用されるアミノ酸分子、そのためのまたはハイブリダイゼーションを通じて得られる任意の核酸配列コーディング、このようなアミノ酸分子の薬剤、抗細胞ストレス剤としての使用、または炎症病理の治療における薬剤の調合のためのこのようなアミノ酸分子の使用がある。本発明は、特定のプロラミン系ペプチドフラグメントの存在あるいはその少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼとの化学的または物理的組み合わせを検出するために用いられる特定の抗体も網羅する。請求項または記載中で「キメラ」という用語について言及がある場合、この用語は、当該分子が２つ以上の別個の遺伝源から由来する成分を含むことを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［適切なプロラミン］
好適には、上記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンのフラグメントあるいは誘導体、類似体、塩またはその代謝体である。さらに好適には、上記プロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンの非免疫原性類似体である。最も好適な実施形態において、上記プロラミン系ペプチドフラグメントは、免疫原性プロラミン系ペプチドに対して競合的抑制活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である。
【００１３】
本発明の別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、完全に加水分解されたか、実質的に加水分解されたかまたは若干加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメントからなる群から選択される。しかし、一般的には、上記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、胃腸加水分解過程を模倣するＰＴＣ（パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン）加水分解されたプロラミンから得られたフラグメントからなる群から選択される。
【００１４】
代替的であるが好適な実施形態において、少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、腸管内においてターゲティング信号として機能する範囲において、加水分解される。
【００１５】
［適切なＳＯＤ］
スーパーオキシドジスムターゼは、当業者に一般的に公知のものから選択でき、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、動物スーパーオキシドジスムターゼ、バクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、イーストスーパーオキシドジスムターゼおよび植物スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択され得る。しかし、好適には、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、ＮｉスーパーオキシドジスムターゼおよびＦｅスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される。本発明の１つの好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは相同スーパーオキシドジスムターゼである。本発明の別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種スーパーオキシドジスムターゼである。「相同」という用語は、当該分子の任意の所与の標的宿主中の未変性分子と同一由来のＳＯＤを指し、「異種」という用語は、当該分子の任意の所与の標的宿主中の未変性分子と異なる由来のＳＯＤを指す。最も好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼである。
【００１６】
上述したように、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは好適には、植物スーパーオキシドジスムターゼ、さらにより好適には異種ＣｕＺｎ植物スーパーオキシドジスムターゼである。このようなスーパーオキシドジスムターゼは、多くの任意の異なる様式で入手または生成可能である。例えば、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、植物から抽出可能である。上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼの抽出および生成に植物を用いる場合、これらの植物は、ウリ科のものでよく、好適にはメロンからなる群から選択され、あるいは、ナス科からなる群から選択され、好適にはトマトからなる群から選択される。
【００１７】
利用可能な多様な植物スーパーオキシドジスムターゼのうち、本発明によるスーパーオキシドジスムターゼは好適には、ペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼ、葉緑体スーパーオキシドジスムターゼおよび細胞質スーパーオキシドジスムターゼからなる植物スーパーオキシドジスムターゼの群から選択される。
【００１８】
別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、組換えスーパーオキシドジスムターゼである。上記組換えスーパーオキシドジスムターゼは、上記ＳＯＤの核酸コーディングで形質転換された宿主細胞中の遺伝工学および発現を通じて、得ることができる。詳細には、出願人らは、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼが修飾葉緑体、ペルオキソームまたは細胞質ＣｕＺｎ組換えスーパーオキシドジスムターゼである場合に特に好ましいことを発見した。さらに別の好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、雑種異種／相同スーパーオキシドジスムターゼ（好適には、雑種植物／ヒトスーパーオキシドジスムターゼ）である。
【００１９】
一般的な組換えタンパク質の発現と同様に、異質または未変性遺伝子を宿主細胞ゲノム中に導入する技術も当業者に周知である。従って、本発明の１つの好適な実施形態において、上記修飾葉緑体スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼまたは細胞質スーパーオキシドジスムターゼは、宿主細胞中で発現された修飾核酸配列によってコードされる。これらの修飾コーディング配列を得るために必要なＰＣＲ増幅遺伝子技術も当業者に公知であり、ここでの説明は不要である。
【００２０】
本発明の最も好適な実施形態において、上記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、以下によってコードされる組換えスーパーオキシドジスムターゼである。
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうちの任意の１つによる核酸配列
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうち任意のものに対して厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される配列のうちの任意の１つと少なくとも７０％ＢＬＡＳＴ同一の相同性を有する核酸配列
【００２１】
厳密な条件下でハイブリダイジングすることにより、当該核酸が、以下の条件６５℃におけるＳＳＰＥ×０．２下で述べられた配列にハイブリダイズすることが理解される。
【００２２】
最後に、本発明の別の目的は、酸化および炎症病理または疾患の治療のための薬剤（特に、任意のほとんどの病気（グルテン不耐性、および好適にはセリアック病）に伴う病理または疾患のための薬剤）の製造のための、上述したような医薬組成の使用に関する。
【００２３】
［異種植物ＳＯＤ］
出願人は、植物由来のＳＯＤは本発明において極めて有利であることを発見した。ＣｕＺｎ−ＳＯＤは、高等植物の光合成細胞のいくつかの形態において存在する。これらは、主に葉緑体中そしてより低い程度において細胞質およびペルオキシソーム中で見受けられる。これらは、アミノ酸組成、分子量、等電点およびその重合レベルにおいて、相互に異なる。
【００２４】
これらのうち多くは、生化学的にまたは遺伝子的に特徴付けられる。葉緑体またはペルオキソーム植物ＳＯＤが、先ずタンパク質のＮ末端においてリーダー配列または信号ペプチドを含む前駆体として、生成される。この前駆体は、葉緑体またはペルオキシソーム中への転位後、余分なＮ末端部分の削除において行われる機能性成熟を経験する。
【００２５】
この特異性に加えて、上記ペルオキソームＳＯＤ（特に、メロンのもの）または葉緑体ＳＯＤ（特にトマトのもの）は、（ａ）細胞質ＳＯＤ中の７０％保存領域に対して葉緑体およびペルオキソームＳＯＤ中の約９０％保存領域において、細胞質ＳＯＤよりもこれらの間においてより良好に保存され、（ｂ）他の植物ＣｕＺｎ−ＳＯＤよりも熱および過酸化水素不活性化に対して高い耐性を持つのにもかかわらず、経腸または非経口投与のいずれにおける治療用途候補として考えられてこられなかった。
【００２６】
しかし、出願人の配列アライメントにより、葉緑体またはペルオキソームＳＯＤは、その等価な細胞質ゾル由来植物ＳＯＤよりも２〜４％少なくヒトまたはウシＳＯＤと異なることが明らかになった。
【００２７】
本発明の好適な実施形態のうちの１つにおいて、例えばメロンからの葉緑体ＣｕＺｎ−ＳＯＤの選択は、出願人によって保持された。なぜならば、細胞質形態に豊富な植物由来の特定のコドンがバクテリアにおいて稀であることが特定され、また、この理由のため、発現レベルと、これらを豊富にまたは活性部位において含む生合成酵素の特定活動とが有意に変化する。
【００２８】
出願人は好適には、バクテリアシステムを生合成ＳＯＤの組換え発現のための宿主細胞として用いることを選択し、これにより、これら２つの局面が確認される。
【００２９】
出願人のバクテリアシステムにおいてヒトＣｕＺｎ−ＳＯＤは発現され、機能性であった。これは上記稀なコドンのうち少なくとも２つを含むものの、そこから形成された２つのアルギニン残留物は、Ｎ末端領域において発見可能であり、ヒトＳＯＤの酵素的機能に関与しているように見えない。
【００３０】
一方、細胞質トマトＳＯＤにおいて、上記稀なコドンから得られた２つのアルギニン残留物は、上記酵素のＣ末端部分中に配置され、そのうちの１つは、スーパーオキシドアニオンの誘引に関する酵素的機能に関与する。
【００３１】
この場合、このシステム中で発現される生合成トマト細胞質ＳＯＤは、活性がずっと低い。葉緑体トマトＳＯＤ上について他の研究が行われたが、このような稀なコドンが存在せず、バクテリア中でのその発現により完全な機能性の生合成ＳＯＤが得られ、このＳＯＤが完全に活性であることが示されている。
【００３２】
このバクテリアシステム中でクローニングおよび発現された第１の２個のメロンＳＯＤは、得られる精製レベルにおける細胞質トマトと同様の特定の活動を持つことが分かっている。この場合、上記稀なコドンは、細胞質トマトＳＯＤ中で特定されたのと同じ位置を網羅し、上記アルギニンのうち１つは、上記スーパーオキシドの誘引機能を持つ。
【００３３】
よって、現在用いられている宿主株を、Ｅｃｏｌｉ（すなわち、アルギニンＡＧＧまたはＡＧＡ）において稀に用いられるコドン向けのさらなるｔＲＮＡｓを含む株と代替すると、有利であった。この特定の株は、バクテリア中の機能的に活性な植物タンパク質の発現を向上させるように、設計される。
【００３４】
従って、植物由来の成熟ＳＯＤは、その抽出された形態においておよび好適には組換え酵素として、経口投与と組み合わされると、異種活性および免疫耐性双方を調和させることができ、そのため、病理学的炎症過程の治療におけるウシＳＯＤの代替物として機能可能である。
【００３５】
［ＳＯＤの経口投与および細胞ターゲティング］
治療的に受容可能なＳＯＤの活性を増加させるために、いくつかの異なる処方が考えられた（すなわち、リポソームカプセル封入、アルブミン共役、またはポリエチレングリコールとの結合、またはヘパリン親和性ペプチドとの雑種としての結合）。
【００３６】
リポソームまたはセラミドを用いた経口投与された異種ウシＣｕＺｎ−ＳＯＤの抗炎症活性は、先ず、カラギーナンによって誘発されるラット下肢浮腫の低減において示された。また、セラミドをグリアジンのような植物プロラミンと代替し、非組換えウシＳＯＤを非組換え植物ＳＯＤと代替した場合、注入可能なウシＳＯＤと比較可能な治療活動により、ラット中で誘発される認知疾患の発病を遅延させることが分かった。
【００３７】
［グリアジン使用における副作用］
しかし、この種の経口投与の場合、限られてはいるが無視できない数の人数に有意の多くの副作用が発生している。上記修飾処方中で用いられた特定の物質（特に、グリアジンのような植物プロラミン）は、胃腸管中でのペプシン−トリプシン加水分解後に耐性の低い生成物を発生させ得、その結果、グルテンアレルギーまたはさらにはセリアック病の場合のような毒性となり得ることが周知である。このヒトのみに発生する疾病は、ヒト腸細胞の刷毛状縁部の特定容量にリンクし、これにより、ＨＬＡクラスＩＩ分子が発現する。いくつかのハプロタイプ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ）は、グリアジン〜特異Ｔ細胞の活性化に密接に関連することが分かっている。グリアジンペプチドのこの有毒処理は、以下の３つの連続工程が関与すると考えられている。
ａ）グリアジンの有毒フラグメントがＨＬＡ受容体に結合し、腸管微絨毛縁部上の腸細胞へ輸送される。
ｂ）これらが固有層中のＣＤ４＋型上皮内細胞へ提示された場合、上記腸細胞側底レベルへ輸送される。
ｃ）最後に、無傷のまたは部分加水分解されたポリペプチドが、上記腸細胞側底膜から上記固有層中のＡＰＣ細胞（抗原提示細胞）へと解放される。
【００３８】
小麦胚芽油中に存在するグリアジンペプチドおよび胃腸管中での加水分解によって生成されるものにより、負の反応（すなわち、炎症反応）が発生し、一方、酵素的に活性のＳＯＤと結び付けられると、このようなペプチドの負の効果は大幅に低減される。
【００３９】
加えて、上記負の副作用を除いて小麦胚芽油中に存在するものと同様の挙動を示す二粒系コムギ中に存在するグリアジンの結合が、酵素的に活性のＳＯＤと結び付けられた場合に、酸化ストレスに関連する欠乏の治療にとって最も好適であることが分かっている。
【００４０】
生理的条件下において、上皮細胞によって提示される抗原に対する反応をＴＨ２型Ｔ細胞によって仲介する。これらの細胞は、ＩｇＡ生成に起因し、とりわけ、食物抗原に関する免疫耐性に起因する。グルテン不耐性またはそのより深刻な形態であるセリアック病の場合、グリアジン由来のペプチドは、すでに酸化促進性であるためグリアジンに対して一層感受性の高い酸化ストレスの状態を生成することにより、腸細胞の酸化代謝を変化させることができる。
【００４１】
この炎症状態は、サイトカインおよび一酸化窒素（ＮＯ）の生成における重要な変化と関連する、ＴＨｌ細胞型に対する細胞反応の転換により、特徴付けられる。これらの条件下において、脂質過酸化反応の増加および酸化および低減した形態のグルタチオン（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）の比の増加は、抗酸化物質をグリアジンと融合させるとこの治療指標において有利な効果が得られるはずであるという出願人の仮説を補強した。
【００４２】
結果として、そのグリアジンとの組み合わせから得られる経口経路によるＳＯＤ抗炎症活性の増強が、細胞膜の親和性増加および関連する代謝経路の基礎制御に起因して、現れることとなる。
【００４３】
よって、これらの効果を実証するために、酵素的に活性の異種ＳＯＤを先ず小麦胚芽油プロラミンの加水分解物の誘導体（詳細にはＶｕｌグリアジン）と結合させ、そのアミノ酸配列がＮｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）であることを確認した。その後、二粒系コムギプロラミンの加水分解物のその無毒類似性誘導体（詳細にはＤｕｒグリアジン）と結合させ、そのアミノ酸配列がＮｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）であることを確認した。この類似体は、グリアジンの有毒誘導体の競合的抑制物質であり、腸細胞との相互作用サイトのターゲティングが可能である。
【００４４】
プロラミン（詳細にはグリアジン）は、胃腸管移行時において自身が包囲している活性成分を保護するという積極的役割を果たし、その加水分解された形態において、腸管粘膜内の細胞における活性成分のターゲティングおよび連続的放出を助ける。これらの誘導体をタンパク質Ｎ末端部分に追加された無毒類似体（例えば、異種ＳＯＤ）と代替した場合、上記誘導体ペプチドフラグメントの腸細胞ターゲッターとしての役割を維持すると同時に、プロラミンの抗原誘導体の有害な効果を回避することができる。
【００４５】
いくつかの治療指標における注入可能なウシＳＯＤによって実証される薬理有効性と、ＢＳＥおよびＣＦＪＤの出現によって発生した公的安全の問題とを鑑みて、上記した本発明の目的は、以下の利点を持つことであることが分かった。
１．レシピエントの遺伝的バックグラウンドに関係なく、異種非免疫原性ＳＯＤまたは免疫耐性の誘発のみを行うもの。
２．植物由来の（有利には食物由来の）ＳＯＤ。
３．このようなＳＯＤの場合に従来では有効ではなかった投与経路を通じて異種ＳＯＤを薬理的に活性させる処方。
４．この異種ＳＯＤを無毒腸管ターゲティングペプチドと結合させることで、経口投与されたこれらのＳＯＤの異種活性を増強させ、治療法が未だない適応（詳細にはオーファンドラッグ適応）における代替的治療を示すこと。
【００４６】
本発明のこれらのおよび他の実施形態について、以下詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
［例］
（例１）
銅亜鉛ペルオキソームまたはメロン「キューカミスメロＬ」から得られた葉緑体スーパーオキシドジスムターゼについてコーディングするメッセンジャーＲＮＡのクローニングと、その完全な核酸配列（コーディングおよび非翻訳配列双方）の決定とを、逐次ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって行った。図２中に示すような偽細胞質という名称の第１のタンパク質変異体を得るために、コーディング配列のみを含む第１のクローンを遺伝工学によって改変した。
【００４８】
この第１のタンパク質変異体は、メロン葉緑体ＳＯＤの遺伝子改変の一般図を示す。この第１の変異体は、未変性信号ペプチドに対応するＮ末端における第１の６５個のアミノ酸の置換を示し、上記アミノ酸対メチオニン−バリンは、細胞質植物ＳＯＤのＮ末端の特性である。この技術によって改変された過程により、植物細胞中においてＳＯＤが経験する葉緑体成熟工程が得られ、その後、図示の２つのアミノ酸が付加される。第２および第３の変異体は、このメチオニン−バリンアミノ酸対に加えて、胃腸管ターゲティングのためのグリアジンペプチド配列（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）、ＶｕＩと呼ぶ）をそれぞれ含む。その由来は小麦胚芽油であり、そのペプチド配列により、感作反応を生成することなく、以下のような、腸細胞と相互作用するグリアジンペプチドの再生が可能となる（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）、Ｄｕｒと呼ぶ）。その由来は二粒系コムギである。
【００４９】
（例２）
コーディング配列全体の直接的ＲＴ−ＰＣＲ増幅により、トマト葉アカナス（ＰｕｂＭｅｄＢｌａｓｔ受入番号Ｘ１４０４０）から、銅亜鉛ＳＯＤ細胞質スーパーオキシドジスムターゼをコードするメッセンジャーＲＮＡのクローニングが得られ、これにより、細胞質という名称の第１のトマト変異体が得られた。第２の変異体および第３の変異体も、胃腸管ターゲティング（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）、ＶｕＩと呼ぶ））のためのグリアジンペプチド配列の付加により、遺伝子操作された。その由来は小麦胚芽油であり、上記ペプチド配列により、感作反応を生成することなく、以下のような腸細胞上でのグリアジンペプチド相互作用の再生が可能となる（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）、Ｄｕｒと呼ぶ）。その由来は二粒系コムギである。
【００５０】
（例３）
コーディング配列全体の直接的ＲＴ−ＰＣＲ増幅により、ヒト血液細胞ホモサピエンス（ＰｕｂＭｅｄ／Ｂｌａｓｔ受入番号Ｋ０００６５）から得られた銅亜鉛ＳＯＤ細胞質スーパーオキシドジスムターゼについてコードするメッセンジャーＲＮＡのクローニングを得、これにより、細胞質という名称の第１のヒト変異体を得た。第２変異体および第３の変異体についても、胃腸管ターゲティング（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）、ＶｕＩと呼ぶ））のためのグリアジンペプチド配列の付加により、遺伝子操作を行った。上記ペプチド配列により、感作反応を生成することなく、以下のような腸細胞上でのグリアジンペプチド相互作用の再生が可能となる（Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０２）、Ｄｕｒと呼ぶ））。
【００５１】
（例４）
各種類の構成の第１の変異体の発現物を用いて、得られた多様な生合成ＳＯＤの抗ラジカル活性を検証した。これらの活性について、未変性ＰＡＧＥ上のＮＢＴの還元により、確認した。その結果、上記組換え生合成タンパク質の活性が、現在最も用いられているバクテリア宿主株中に稀に存在するコドンの植物ｃＤＮＡ中の存在に密接にリンクすることが分かった。
【００５２】
現在用いられている株中に発現する３つのｃＤＮＡからの低い発現率または活性率については、バクテリア株（とりわけコドンＡＧＡ、ＡＧＧ（アルギニン）およびより低い範囲ではコドンＣＣＣ（プロリン）、ＧＧＡ（グリシン）ＣＴＡ（ロイシン）、およびＡＴＡ（イソロイシン））によって稀に用いられるコドンの存在によって説明することができる。この問題を回避するために、上記ｃＤＮＡをｐＥＴ３０ａ＋（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）として特定される別の発現ベクターシステムに移行させ、これを用いて、これらの稀なアミノ酸用の適切なｔＲＮＡを含むＲｏｓｅｔｔａＤＥ３ｐＬｙｓＳ（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）として特定される許容バクテリア株を形質転換した。
【００５３】
［本発明の詳細なプロトコル］
（キューカミスメロＬＳＯＤのクローニングプロトコルおよび遺伝子改変）
変種キューカミスメロＬ（ＶＩＬＭＯＲＩＮ−ＧＮＩＳ−２２５１０２９として登録されている市販の変種）または上記変種キューカミスメロＬＣ（ＡＳＬ−ＮＣＩＭＳ−４０３１０として登録されている変種）のいずれかから、真核細胞に使用されるものと同一の技術［ＴＲＩｚｏｌ−ＴＭキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス］を用いて窒素凍結保存されたキューカミスメロＬメロン葉から全ＲＮＡを抽出した。
【００５４】
（メロンＳＯＤの３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）
２５μｌの反応緩衝液中の修飾オリゴｄＴプライマーAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０３）［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｍａｒｔ ｃＤＮＡ ｒｅｆ：ｋ１０５１］から、メッセンジャーＲＮＡの単鎖ＤＮＡマトリックス中への転写を実施した：トリスＨＣｌ２０ｍＭ ｐＨ８．３、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび４００μＭの各ｄＮＴＰを２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下で４２℃で１時間。
【００５５】
補体としていくつかの単鎖プライマー対（例えば、ＥｎｄプライマーAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０４）を修飾オリゴｄＴプライマーならびにメロンコーディング領域のためのMelcyt5F1 GGTGAYACMACMAATGGYTG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０５）およびMelcyt5S2 CATGCKGGKGAYCTDGG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０６）それぞれと組み合わせることにより、ＳＯＤのためのメッセンジャーＲＮＡコーディングの３’末端の増幅を実施した。アンプライマー配列は、いくつかの植物種のペルオキソーム、葉緑体および細胞質ＣｕＺｎ−ＳＯＤの保存領域に基づくものであるため、本質的に極めて縮重するものである。
【００５６】
（メロンＳＯＤの５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）
バクテリアベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａから市販）中へのクローニング後、７個の独立クローンを配列し、コンセンサス配列を用いて、３つの新規の特定のプライマーVed3R3 ACAAAGGCTCTTCCAACTACAG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０７）、Ved3R2 GCCGCTAAGAGGAATCTG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０８）およびVed3R1 TGGTTGCCTCTGCTACTCCATC（ＳＥＱ．ＩＤＮ°０９）を構築した。この特定のプライマーＶｅｄ３Ｒ３を用いて、メッセンジャーＲＮＡをｄＣＴＰホモポリマー伸長（５’ＲＡＣＥシステム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｒｅｆ：１８２７４−０５８）によって終端された単鎖ＤＮＡマトリックス中に転写した。このマトリックスの増幅は、プライマーAAPP GGCCAGGCGTCGACTA GTACGGGGGGGGGGGGGGGG（ＳＥＱ．ＩＤＮ°１０）およびプレ増幅工程のためのＶｅｄ３Ｒ２およびAAP GGCCAGGCGTCGACTAGTAC（ＳＥＱ．ＩＤＮ°１１）および特定のメッセンジャーＲＮＡの５’末端の最終増幅のためのＶｅｄ３Ｒ１の連続的組み合わせにより、得た。
【００５７】
（３つのＳＯＤ変異体の増幅および遺伝子改変）
各種（ヒト、トマトおよびメロン）からの異なるＳＯＤ変異体の増幅を、３つの単鎖５’アンプライマーを以下のような各種のためのユニークな単鎖３’アンプライマーと組み合わせることにより、可能にした。
【００５８】
名称 サイト 配列
Hum5Cyt NcoI atcggatccATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(SEQ.IDN°12)
Hum5Dur NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(SEQ.IDN°13)
Hum5Vul NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(SEQ.IDN°14)
Hum3Rfw HindIII ctcgagaaqcttTTATTGGGCGATCCCAATTAC(SEQ.IDN°15)
【００５９】
名称 サイト 配列
Tom5Cyt NcoI atcggatccATGGTGAAGGCCGTCGCCGTCCTT(SEQ.IDN°16)
Tom5Dur NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGTGAAGGCCGTCGCCGTCCTT(SEQ.IDN°17)
Tom5Vul NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGTGAAGGCCGTCGCCGTCCTT(SEQ.IDN°18)
Tom3Rfw HindIII ctcgagaagcttTAACCCTGGAGGCCAATAAT(SEQ.IDN°19)
【００６０】
名称 サイト 配列
Mel5pCyt NcoI atcggatccATGGTGAAAGCTGTCGCTGTCCTC(SEQ.IDN°20)
Mel5Dur NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGTGAAAGCTGTCGCTGTCCTC(SEQ.IDN°21)
Mel5Vul NcoI atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGTGAAAGCTGTCGCTGTCCTC(SEQ.IDN°22)
Mel3Rfw HindIII ctcgagaagcttCACACAGGAGTCAGACCGAC(SEQ.IDN°23)
【００６１】
ここで、Ｃｙｔは、オリジナルの６５アミノ酸配列の代わりにさらなる２個のアミノ酸を含むメロン偽細胞質形態を指定し、ヒトおよびトマト中の細胞質形態については、参照符号ＤｕｒおよびＶｕｌがそれぞれ以下を示す。
【００６２】
ＤＵＲは、二粒系コムギから得られた胃腸管ターゲティング信号ペプチドを含む細胞質形態を示す。
【００６３】
ＶＵＬは、小麦胚芽油から得られた胃腸管ターゲティング信号ペプチドを含む細胞質形態を示す。
【００６４】
これらのプライマーは、５’ＢａｍＨＩまたはＮｃｏｌサイトおよび３’Ｈｉｎｄｌｌｌサイトのいずれかにおける同相でのバクテリア発現ベクターｐＥＴ３０ａ＋（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）中へのその導入を可能にする必要な合成配列を含むように、構築された。これらの増幅および遺伝子改変のためのグローバルプロシージャを図１中に報告する。
【００６５】
バクテリア発現システムにより、クローンｃＤＮＡのハイブリドタンパク質としての発現が可能となり、ＳＯＤまたはタンパク質変異体がそのＮ末端を介してＨｉｓ−Ｔａｇ配列へとリンクされる。
【００６６】
全ての増幅は、ＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）を２５ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、ＭｇＣＩ２を１．５ｍＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、各プライマーを１０μＭ、プラスミドＤＮＡを１０ｎｇ、ゴールドスターＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を２．０単位を含む５０μｌの反応体積中において行った。各使用サーモサイクリングプログラムを以下の表に示し、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲサーモサイクルシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上で実施した。
【００６７】
［ＲＴ−ＰＣＲ増幅サイクルの表］
（メロン３’ＲＡＣＥ）
９５℃、３分
９５℃、２５秒
５５℃、３０秒
７２℃、４０秒
９５℃、２５秒
５８℃、３０秒
７２℃、４０秒
（メロン５’ＲＡＣＥ）
９５℃、３分
９５℃、３０秒
５５℃、３０秒
７２℃、６０秒
９５℃、３０秒
６１℃、４０秒
７２℃、５０秒
（メロンクロロ）
９５℃、３分
９５℃、４０秒
５７℃、４０秒
７２℃、４０秒
９５℃、４０秒
６０℃、４０秒
７２℃、５０秒
（メロン偽Ｃｙｔ）
９５℃、３分
９５℃、４０秒
５７℃、４０秒
７２℃、４０秒
９５℃、４０秒
６０℃、４０秒
７２℃、５０秒
【００６８】
ヒト、トマトおよびメロンＳＯＤについてエンコーディングする３つのタンパク質変異体「Ｃｙｔ、Ｄｕｒ、およびＶｕｌ」の増幅を５’オリゴヌクレオチドプライマーのサイズ差を考慮した同一プロトコルに従って行った。先ず、反応物を９４℃で５分間加熱した後、以下のような５回の予備サイクル（９４℃での変性を０．４５分、５６℃でのアニーリングを０．５５分および７２℃での伸展を０．５５分）に暴露した後、さらなる２５サイクル（９４℃での変性を０．４５分、５９℃でのアニーリングを０．５５分および７２°Ｃでの伸展を０．５５分）に暴露した。
【００６９】
事前クローンされたＣｕ−ＺｎＳＯＤ ＣＤＮＡのコーディング領域をＰＣＲによって増幅し、増幅された４５９ｂｐおよび４９５ｂｐ生成物をその後適切な制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌ〜５’端部およびＨｉｎｄｌｌｌ〜３’端部によって消化し、その結果、同相でのバクテリア発現ｐＥＴ３０ａ＋（ＮＯＶＡＧＥＮから市販）中へのその導入を可能とした。
【００７０】
各種（ヒト、トマト、およびメロン）のための３つのクローンのヌクレオチド配列を決定し、事前取得された配列と同一であることが分かり、以下に示す。
【００７１】
［葉緑体またはペルオキソームＣｕＺｎ−ＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４）］
【００７２】
［メロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２５）］
【００７３】
［二粒系コムギペプチドによるメロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２６）］
【００７４】
［小麦胚芽油ペプチドによるメロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２７）］
【００７５】
［トマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２８）］
【００７６】
［二粒系コムギペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°２９）］
【００７７】
小麦胚芽油ペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３０）
【００７８】
［ヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３１）］
【００７９】
二粒系コムギペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３２）
【００８０】
［小麦胚芽油ペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３）］
【００８１】
公知の植物スーパーオキシドジスムターゼによるＯＲＦおよび配列アライメントの決定のためのコンピュータソフトウェアを用いた核酸配列の分析により、要求に匹敵するペプチド配列の決定と、上記した遺伝子改変から得られた変異体のペプチド配列の決定とが可能となった。
【００８２】
［メロン葉緑体ＣｕＺｎ−ＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４）］
【００８３】
［メロン偽細胞質ＣｕＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５）］
【００８４】
［メロン偽細胞質ＣｕＺｎＳＯＤ形態＋二粒系コムギペプチドの場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６）］
【００８５】
［メロン偽細胞質ＣｕＺｎＳＯＤ形態＋小麦胚芽油ペプチドの場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７）］
【００８６】
［トマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８）］
【００８７】
［二粒系コムギペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９）］
【００８８】
［小麦胚芽油ペプチドによるトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０）］
【００８９】
［ヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１）］
【００９０】
［二粒系コムギペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２）］
【００９１】
［小麦胚芽油ペプチドによるヒト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ形態の場合（ＳＥＱ．ＩＤＮ°４３）］
【００９２】
バクテリア発現システムｐＥＴ３０ａにより、クローンＣＤＮＡをハイブリッドタンパク質として発現させることが可能となり、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳバクテリア株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中への発現後、ＳＯＤが切断可能なＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）が融合される。
【００９３】
ＯＤ６００ｎｍの値が０．６まで上昇するまで、生成されたＣｕ−ＺｎＳＯＤの変異体形態それぞれについて入手および選択された組換えクローンを、適切な抗生物質（３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび／または３４μｇ／ｍｌのカナマイシンが補充された１リットルのリッチメディア（トリプトンを１０ｇ／ｌ、イースト抽出物を５ｇ／ｌ、ＮａＣｌを５ｇ／ｌ）中で再懸濁した。その後、３７°Ｃでのインキュベーションを少なくとも３時間行い、この時点において、タンパク質の発現を制御するラックプロモーター誘導物質であるイソプロピルチオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を追加して最終濃度１ｍＭを得、さらに４〜６時間インキュベートした。
【００９４】
各調製のための２個のバクテリアペレットを（１）５０ｍｌの寒冷ＰＢＳ緩衝液または（２）５０ｍｌの添加液（Ｎｏｖａｇｅｎから市販）中で再懸濁し、その後、４℃で各３０秒の４連続サイクル（Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ４０Ｗ〜２０ＫＨｚ）において、超音波処理緩衝液（トリスＨＣｌ ｐＨ７．４を１０ｍＭ、ＥＤＴＡを１ｍＭ、ＮａＣｌを１５０ｍＭ）に暴露した。遠心分離を13000ｇで２０分間行うことにより、細胞質内タンパク質抽出物を単離した。
【００９５】
粗タンパク質抽出物から開始して、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄクイックカートリッジ（ＮＯＶＡＧＥＮからｒｅｆ７０１５５として市販）上で、多様なＨｉｓ−ＴａｇＳＯＤ融合タンパク質を単離した。その後、組換えエンテロキナーゼ（ｒｅｆ６９０６６、ＮＯＶＡＧＥＮ）でのハイブリドタンパク質の加水分解後、多様なＳＯＤおよびその特定の変異体を新規精製工程によってＨｉｓ−Ｂｉｎｄクイックカートリッジ上で精製した。
【００９６】
（例５）
［メロン抗ｒｅｃＳＯＤ抗体］
組換えメロンＳＯＤのアミノ酸配列を得た後、スイスプロットアライメントを用いて他の植物ＳＯＤとの比較分析を実施し、メロン特異ポリクローナル抗体（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）を得るためにウサギの免疫化を行うために、２個のペプチド配列１４−２７（ＥＰ１６６８−ＧＶＶＴＬＴＱＥＤＤＧＰＴＳ、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４４））および１１７−１３１（ＥＰ１６６９−ＨＥＬＡＤＤＬＧＫＧＧＨＥＬＳ、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４５）を選択した。抗体ＥＰ１６６９をイムノアブソープションによる親和性カラム上で精製しウエスタンブロット分析中で１／2000において用いて、生成されたメロン組換えＳＯＤに対する抗体の特異性を確認した。
【００９７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、タンパク質抽出物を９５℃で５分間加熱した後、電気泳動を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で実施した。分離されたタンパク質を免疫ブロットＰＶＤＦ膜（ＢＩＯＲＡＤ）上に移行させた。上記抗体の任意のポテンシャルクロス特異性が、上記増幅されたＯｐｔｉ４ＣＮヤギ抗ウサギ検出キット（ＢＩＯＲＡＤ）により、明らかとなった。
【００９８】
ＥＰ１６６９抗体は、免疫化ペプチド由来の完全な組換えメロンＳＯＤタンパク質に対して良好な特異性を示した。ＥＰ１６６９抗体はまた、組換えヒトおよびトマトＳＯＤならびに天然ウシＳＯＤまたはヒトＳＯＤに対してクロス特異性を示した。従って、この抗体は、本発明の組換えＳＯＤタンパク質の薬理活動の検証に必要な実験のための検出ツールとして有用であった。
【００９９】
（例６）
［抗ラジカル活性］
メロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤおよびヒトまたはトマト細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤならびにその２つの異なるグリアジンペプチドを支持する等価物をその抗ラジカル活性について分析した。これらの活性は、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動上でのＮＢＴ光還元に従って確認される（BeauchampsおよびFridovitch、1971）。
【０１００】
（例７）
［細胞ターゲティング］
標的薬剤として用いられるグリアジンペプチドが先に示したようにＨＬＡ−ＤＱ２と相互作用してヒト腸細胞中に進入可能なだけでなく、それと物理的にまたは化学的に結合するタンパク質の併用ターゲティングを容易化することも可能であることを実証するために、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ）中の１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）およびＣａｃｏ−２（ＡＴＣＣＨＴＢ−３７）を成長させる。いくつかの場合において、細胞を１００ｌＵ／ｍｌのＩＦＮ―γ（Ｒ＆Ｄシステムズ）で４８時間インキュベートし、ＨＬＡクラスＩｌ発現を誘発する。
【０１０１】
［グリアジンペプチド提示分析およびフローサイトメトリ］
およそ２×１０5個の細胞を、３７℃で組換えＳＯＤで１ｍｇ／ｍｌまでの濃度で１〜２０時間インキュベートする。０．２μｍミリポア膜での濾過により、試験されたＳＯＤ化合物を殺菌する。これらの細胞を回収し、Ｌ２４３ｍＡｂ（抗ＨＬＡ ＤＲ、ＡＴＣＣ ＨＢ−５５）を用いてＨＬＡクラスＩＩ発現用のフローサイトメトリによって分析し、その後、ＦＩＴＣ結合型ヤギ抗マウスｌｇＧ（ＩＣＮ−Ｃａｐｐｅｌ）を行う。
【０１０２】
細胞表面におけるＳＯＤ化合物を検出するために、これらの細胞をＥＰ−１６６９抗体またはＥＰ−１６６８抗体（ＩＳＯ細胞）でインキュベートし、ＦＩＴＣ結合型ヤギ抗ウサギｌｇＧで明らかにする。４°Ｃで６０分間インキュベーションを行い、その後、ＦＢＳを１０％およびアジ化ナトリウムを０．１％含むＰＢＳ中で、これらの細胞を３回洗浄する。その後、これらの細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で分析する。
【０１０３】
（例８）
［アネキシンＶ陽性細胞の検出］
この部分中で報告される実験全てにおいて、４８時間の暴露時間が用いられた。アポトーシス接着細胞の検出は、フルオレセインイソチオシアネートでラベルされたアネキシンＶ〜ＰＳ（Martinら、1995）の結合を用いたフローサイトメトリにより、行った。インキュベーション期間後、上記したようなトリプシンおよびＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で細胞単層を脱離させ、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、１×１０6個の細胞を遠心分離によって収集して、接着細胞中のアポトーシスを評価した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性細胞の評価は、ＡｐｏＡｌｅｒｔアネキシンＶアポトーシスキット（Clontech Laboratories、Palo Alto、ＣＡ、米国）を用いて行った。暗所において２００μｌの結合緩衝液中で１０μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（最終濃度：０．５μｇ／ｍｌ）および０．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムによって細胞を再懸濁させ、１５分間インキュベートして、壊死細胞を排除した。４８８ｎｍでチューニングされたアルゴンイオンレーザでＣｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ細胞分取器（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）上で、二色サイトメトリ（蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ））分析を行った（Koopmanら、1994）。
【０１０４】
（例９）
［細胞浸透］
上記したように処理された第２のフラクションの細胞を用いて、ＥＰ１６６９抗体およびＥＰ−１６６８抗体によるウエスタンブロット分析を用いて試験された異なる細胞区画（すなわち、膜、細胞質）のタンパク質抽出物を調製し、これにより、ターゲティング信号ペプチドによりこれらが上記細胞中へ（詳細には上記細胞区画中へ）転位置していることを示す。
【０１０５】
（例１０）
［細胞内レドックス状態上で異なった挙動を示すＳＯＤ化合物］
制御および処理された細胞（５×１０5個）を回収し、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素およびＧＳＨそれぞれの検出のために、ハイドロエチジン（ＨＥ；分子プローブ）、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ１２３；分子プローブ）または５−クロロメチル−２’、７’−ジクロロ−ジヒドロフルオレセインジアセタート（ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ、分子プローブ）で、４９５μｌのハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）中でインキュベートする。３７℃１５分間後、上述したような血球計算器上でサンプルを分析する。
【０１０６】
（例１１）
［細胞活性］
ＳＯＤはその高分子量に起因して細胞膜に浸透しなかったと長く考えられてきたが、２４時間後に外因的に付加された有意な量の無担体のＣｕＺｎＳＯＤが細胞膜をマーク付けすることができたことを実証する試みはわずかしか行われていない（Ｅｄｅａｓ ＭＡら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．1996、ｖｏｌ．４２、ｐ１１３７）。
【０１０７】
それにもかかわらず、細胞外的に付加された時に上記ＳＯＤ酵素によって細胞内ＲＯＳの解毒をより効率的に行うために、細胞に浸透可能な組換えＳＯＤタンパク質が生成されている。ヒトＣｕＺｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）遺伝子を、ＨＩＶ−１の９アミノ酸Ｔａｔタンパク質伝達ドメイン（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をエンコードする遺伝子フラグメントと融合した。このＴａｔ−ＳＯＤ融合タンパク質は、外因的に培地中に付加された際に時間（１０〜６０分）内に用量依存的（０．２〜２μＭ）にＨｅＬａ細胞中に進入することが分かった。一旦上記細胞中に入ると、伝達したＴａｔ−ＳＯＤタンパク質は酵素的に活性であり、かつ、２４時間安定であった。パラコートで処理されたＨｅＬａ細胞（細胞内スーパーオキシドアニオン発生装置）の細胞バイアビリティーは、伝達したＴａｔ−ＳＯＤによって増加する（Ｋｗｏｎ ＨＹら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.２０００、ｖｏｌ４８５、ｐ１６３）。しかし、この場合、ＨＩＶ−１Ｔａｔ伝達タンパク質が多様な細胞型におけるＭｎＳＯＤ発現の低減の原因であることが分かっことは、注目すべきである（MareckiＪＣら、2004 Free Radic Biol Ｍｅｄ、ｖｏｌ３７、ｐ８６９／PorntadavityＳら、ＤＮＡｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、2005、ｖｏｌ２４、ｐ２９９）。
【０１０８】
上記ヒトＣｕＺｎ〜スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）遺伝子をリジンに富んだペプチド（ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ）の９アミノ酸をエンコードする遺伝子フラグメントと融合させた場合、９Ｌｙｓ−ＳＯＤの伝達有効性は、Ｔａｔ−ＳＯＤよりも高効率であった（Park Ｊら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ、2002、ｖｏｌ１３、ｐ２０２）。
【０１０９】
多様なグリアジン鎖由来のタンパク質ペプチドは、ａ）その相対的消化性（タンパク質抵抗）、ｂ）その相対的サイズまたは配列（高プロリン領域、ｃ）細胞培養物中でのその相対的濃度（凝集またはアポトーシス）、ｄ）ＨＬＡクラスＩＩ分子によるその相対的認識（ＨＬＡ ＤＱ２またはＤＲ３）、ｅ）ゾヌリン誘導のその相対的可能性に応じて、腸管細胞の有意な修飾および／または変更を生成する能力を有すると認識されている。
【０１１０】
少なくとも１つ（ただし、これに１つに限定されない）特定のグリアジン由来ペプチド（１９〜２０アミノ酸残留物−ＬＧＱＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−）の場合、ＨＬＡ ＤＲ３分子と直面すると、ＨＬＡＤＱ２分子液滴に効率的に結合可能であることが分かっている（Shidrawi.ＲＧら、1998、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｖｏｌ１１、ｐ１５８）。グリアジン鎖から単離された他の多くのペプチドが、ＨＬＡ ＤＱ２またはＤＲ３に対して同様の能力を有する（Qiao.ＳＷら、2004、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｖｏｌ１７３、ｐ１７５７）が、正常クラスＩＩ ＨＬＡとのグリアジンペプチド相互作用については、ほとんど知られていない。
【０１１１】
グリアジンが腸管バリアを通過することを可能にする早期工程は、先ずラット上皮腸管細胞ＩＥＣ−６上で確立される。グリアジンによるＩＥＣ−６細胞のインキュベーションにより、細胞内アクチンフィラメントの再構築が起こるが、この再構築は、グリアジンインキュベーションのわずか１５分後に視認可能となり、６０分後にピークとなり、２．５時間後にベースライン値に戻った。＋４℃の温度ではグリアジンによって誘発されたＦアクチン変化を抑制できず、その結果、アクチン重合がグリアジンエンドサイトーシスと関連するという可能性が除外される（KwiatkowskaＫら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、1999、ｖｏｌ２１ｐ４２２）。
【０１１２】
グリアジンは、腸細胞からのゾヌリン放出を含む別の経路を用い得る。ゾヌリン生成は、グリアジン濃度に依存し、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌのグリアジンでのインキュベーション後１５分経過後に早くも細胞培養物上清中で検出可能であった。その後、３０分においてピークに達し、６０分後にベースラインに戻った。Ｕｓｓｉｎｇチャンバ中に取り付けられたウサギ腸管粘膜にグリアジンを付加すると、Ｒｔ（抵抗力）が低減し、この抵抗力低減は、インキュベーション３０分経過後に有意となった。他の著者は、グリアジンペプチド誘導体ゾヌリン放出および腸管浸透性の同時増加の強力な誘導物質であると推測している（ClementeＭＧら、Ｇｕｔ．2003、ｖｏｌ５２、ｐ２１８）。
【０１１３】
腸管上皮とのグリアジン相互作用によりゾヌリン放出を通じて腸管浸透性が上昇し、その結果、グリアジンの傍細胞転位およびその腸管粘膜下層内でのマクロファージとの後続相互作用が可能となり、その結果、炎症性反応およびフリーラジカル生成が発生する（ThomasＫＥら、2006、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｖｏｌ１７６、ｐ２５１２）ことが後に実証された。
【０１１４】
上述したような組換えメロンＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子が、Ａグリアジンの１０アミノ酸ペプチドをエンコードする遺伝子フラグメントと融合された（ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ、ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１、以下ペプチド９８２と示す）。Ｇｌｉ−ＳＯＤ融合タンパク質が発現し、エシェリキアコリ中で精製された。
【０１１５】
［バクテリアクローン培養物からのタグ付けされた組換えキューカミスメロタンパク質（ＳＯＤおよびＧｌｉ−ＳＯＤ）の生成および精製］
バクテリア発現システムｐＥＴ３０ａにより、クローンされたｃＤＮＡのハイブリドタンパク質としての発現が可能となった。このハイブリドタンパク質において、組換えメロンＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤ（ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−ＳＯＤ）は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳバクテリア株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中での発現後、切断可能なＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列（ポリペプチド−Ｈｉｓ6−エンテロキナーゼ開裂配列−５ｋＤａ）と融合された。
【０１１６】
［発酵過程および誘導過程］
吸光度Ａ600が１単位の値に達するまで、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補充された２リットルのＹＥＳ培地中で３７℃で発酵を行う。その後、ＩＰＴＧを誘発タンパク質発現に最終濃度０．５ｍＭまで付加した。一晩成長させた後、遠心分離によって細胞を収集して、高圧において細胞切断を実施した（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ、２サイクル：Ｐ＞８００バール）。
【０１１７】
［変性工程］
その後、尿素の連続的付加によりバルクを変性させ、その結果、トリス２０ｍＭを有する８Ｍの緩衝液の最終濃度がｐＨ８．０となる。完全溶解後、室温における完全なタンパク質可溶化にβメルカプトエタノールを付加（最終濃度１０ｍＭ）する。17000ｇにおける遠心分離により１５分間行い、可溶性タンパク質を回収した。
【０１１８】
［精製工程］
金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＮｉＣｌ2０．２５Ｍ、Ｎｉ2+イオンで活性化されたキレート化セファロース）によるアフィニティー精製により、組換えタグ付けされたタンパク質を単離し、先ず平衡緩衝液中のカラム中にロードした：トリス２０ｍＭ、尿素８Ｍ、βメルカプトエタノール１０ｍＭ（ｐＨ８．０）。
【０１１９】
［インカラムリフォールディング工程］
固定化組換えタンパク質を大量に洗浄し、尿素量増加により部分的にリフォールディングし、カラム尿素８Ｍ〜１．５Ｍの勾配（緩衝液中、トリス２０ｍＭ、βメルカプトエタノール１０ｍＭ、ｐＨ８．０）に付加した。
【０１２０】
その抗酸化物質活性を取り出すため、スーパーオキシドジスムターゼは、再生工程時、その天然補助因子を回復しなければならない。これは、ＮａＡｃ５０ｍＭ、尿素１．５Ｍ、ＣｕＣｌ2０．１ｍＭ、ＺｎＣｌ2０．１ｍＭおよびβメルカプトエタノール１０ｍＭ（ｐＨ５．０）からなる緩衝液中のＣｕ／Ｚｎの連続的固定により、行われる。
【０１２１】
組換えＳＯＤフォールディングの安定化は、トリス２０ｍＭ、尿素１．５Ｍ、ＣｕＣｌ2０．１ｍＭ、ＺｎＣｌ2０．１ｍＭ、ＧＳＨ１ｍＭ、ＧＳＳＧ４ｍＭおよびｐＨ８．０からなる緩衝液中のシステインアミノ酸間の分子内ジスルフィド架橋の形成により、有利に行われる。
【０１２２】
［溶出工程］
トリス２０ｍＭ、尿素１．５Ｍ、イミダゾール０．５ＭおよびｐＨ８．０からなる緩衝液により、上記親和性カラムからの濃縮されたタグ付けされた組換えタンパク質の溶出を得る。その後、これらをトリス２０ｍＭ、ＣｕＣｌ2０．１ｍＭ、ＺｎＣｌ2０．１ｍＭおよびｐＨ８．０中で一晩透析した後、０．２２μｍフィルタによって最終濾過を行って、消化時の微生物成長を回避する。タンパク質内容物推定は、μＢＣＡ方法による上清中で評価した。
【０１２３】
［タグ開裂］
組換えタンパク質をハイブリドタンパク質として発現させる。このハイブリドタンパク質中、ＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤがそのＮ末端部分において少量の切断可能なリンカーを介してＨｉｓ−Ｔａｇ配列（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を含む少量のタンパク質に融合している。
【０１２４】
この開裂は、２．０％エンテロキナーゼでのインキュベーションを室温において４４時間行うことにより、達成される。
【０１２５】
［フォールディングされかつ無菌の組換えＳＯＤの精製］
放出後、最終精製工程により、トリス−ＨＣｌ２０ｍＭ、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化されかつトリス−ＨＣｌ２０ｍＭ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ８．０の溶出緩衝液で溶出されたＭｏｎｏＱカラム上で、少量のタギングタンパク質を組換えＳＯＤから除去した。
【０１２６】
消化時の微生物成長を回避するための０．２２μｍでの濾過を行った。タンパク質内容物推定は、μＢＣＡ方法により上清中で評価した。
【０１２７】
上記精製から得られた結果を図５中に示す。
【０１２８】
［組換えリフォールディングされたキューカミスＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤの抗酸化物質活動］
多工程変性／再生プロトコルに従って、キューカミス組換えＳＯＤおよびグリアジンペプチド（Ｇｌｉ−ＳＯＤ）を支持するその等価物を生成および精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、有意な程度の精製が明らかとなり、その抗酸化物質活動の回復に基づいて、上記リフォールディング過程の有効性を評価する。組換えタンパク質（キューカミスメロＳＯＤおよびＧｌｉ−ＳＯＤ）双方のＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動上でのＮＢＴを低減させる可能性（ＮＢＴ光還元、ＢｅａｕｃｈａｍｐｓおよびＦｒｉｄｏｖｉｔｃｈ、1971）を評価し、天然キューカミスメロ抽出物の可能性と比較した。
【０１２９】
ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動上で得られた遊走プロファイルおよびＮＢＴ低減は、組換えタンパク質、ＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤ（4000〜10000ＵＮＢＴ／ｍｇタンパク質）双方の正確かつ高効率のリフォールディングを裏付けており、これは、その抗酸化物質活動を示すために必須のイベントである。
【０１３０】
ここから得られた結果を図６中に示す。
【０１３１】
［メロン抗ｒｅｃＳＯＤ抗体］
上記組換えメロンＳＯＤのアミノ酸配列を得た後、Ｓｗｉｓｓ Ｐｌｏｔアライメントを用いて他の植物ＳＯＤとの比較分析を行って、２つの相対的に保存されたペプチド配列１４−２７（ＥＰ１６６８−ＧＶＶＴＬＴＱＥＤＤＧＰＴＳ）および１１７−１３１（ＥＰ１６６９−ＨＥＬＡＤＤＬＧＫＧＧＨＥＬＳ）を選択した。これらのペプチド双方を合成し、ウサギの免疫化のための適切なキャリア（ＫＬＨ）と結合させて、植物特異ポリクローナル抗体を得た（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）。抗体ＥＰ１６６９を免疫吸着によって親和性カラム上で精製し、ウエスタンブロット分析中で１／２０００で用いて、天然およびメロン組換えＳＯＤならびに精製ウシＳＯＤに対するこの抗体の特異性を確認した。
【０１３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、これらのタンパク質を９５℃まで５分加熱した後、電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル上で１２％で行った。分離されたタンパク質を免疫ブロットＰＶＤＦ膜（ＢＩＯＲＡＤ）上に移行させた。抗体の任意のポテンシャルクロス特異性が、増幅Ｏｐｔｉ４ＣＮヤギ抗ウサギ検出キット（ＢＩＯＲＡＤ）によって明らかとなった。
【０１３３】
ＥＰ１６６９抗体は、上記天然メロン抽出物中に含まれる２個のＳＯＤとのクロス特異性そして精製ウシＳＯＤとのクロス特異性を示した。
【０１３４】
さらに、ＥＰ１６６９抗体は、上記免疫化ペプチドの由来元である完全な組換えメロンＳＯＤタンパク質との良好な特異性を示した。よって、抗体は、上記天然抽出物中に存在する反応性ＳＯＤのうちの少なくとも１つとの相同性だけでなく、多様な種間のＳＯＤ科内に存在し得る相同性（完全な相同性）も示すことが確認された。この抗体は、本発明の組換えＳＯＤタンパク質の薬理活動の検証に必要な検出実験において有用なツールである。
【０１３５】
上記抗体結合試験の結果を図７に示す。
【０１３６】
［細胞培養物］
ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）を、ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、４．５ｇ／Ｌ Ｄグルコース、ピルビン酸ナトリウムおよび１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中の１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で、成長させる。各実験（ｎ＝４）において、およそ２×１０4個の細胞／ウェルを５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。任意の実験の前に、既存の培地を新規培地と交換した。上記インキュベーション期間後、０．０５％トリプシンおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液で細胞単層を脱離させ、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、遠心分離によって回収した。その後、ＧＵＡＶＡ ＰＣ Ｖｉａｃｏｕｎｔ Ｆｌｅｘキットを用いて血球計算器中で細胞をカウントし、細胞数／ｍｌで報告して、細胞増殖を推定した。
【０１３７】
［グリアジンペプチドの無毒濃度の効果］
グリアジン治療は、濃度に依存する様式で、細胞成長に多様な効果を及ぼすことが以前から分かっている。５０〜２００μｇ／ｍｌの濃度は細胞成長を抑制する一方、５００μｇ／ｍｌまでの濃度は深刻な細胞破壊の原因となり得る。グリアジンペプチドは、先ずヒト腸管細胞の酸化バランスを変更することにより、その効果を開始し得ることが知られている（Dolfiniら、2002、Ｔｏｘｉｃｏｌ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、ｖｏｌ１６、ｐ３３１）。
【０１３８】
現在の実験において、７２時間にわたって培養物を定期的にサンプリングして、多様な成分への暴露を行った場合および行わなかった場合のＨＴ−２９細胞の増殖率およびバイアビリティーを評価した。（ａ）１０μＭのグリアジンペプチド９８２（小麦胚芽油、ＱＱＰＹＰＯＰＱＰＦ．ＳＥＱ．ＩＤＮ°０１）は、有意な腸細胞凝集（De Vicenzi.Ｍら、１９９７、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ１２０、ｐ２０７）または腸細胞アポトーシス（Giovanniniら、2000、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ１４５、ｐ６３）を誘発するように事前に関連付けられた濃度よりも少なくとも１００倍小さい。
【０１３９】
我々が試験したこのような低い濃度において、グリアジンペプチドがＨＴ−２９細胞株増殖に主な効果を発揮する能力を持つが、この能力を持つのは、培養物の２４時間においてのみである。この効果は、４８時間後に急速に消え去る。なぜならば、この４８時間経過後において、増殖がその基底レベルに戻り、おそらくはペプチド内部移行に起因してペプチドの存在から完全に独立するように見えるからである。グリアジンペプチドは、濃度閾値を越えかつ／またはヒト腸管細胞培養物上の十分な濃度を維持して、凝集またはさらなるアポトーシスをもたらさなければならないように見える。これは、高濃度のグリアジンペプチドで腸管細胞を２４時間暴露した後、有意なＯ20−およびＨ2Ｏ2生成の増加および抗酸化物質酵素の低減が観察された実験によって裏付けられ、上記グリアジンペプチド誘発アポトーシスに先行する（Giovannini.Ｃら、2003、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ５４０、ｐ１１７）。
【０１４０】
上記した試験の結果を図８の図解中に示す。
【０１４１】
［組換えＳＯＤの最小活性用量］
組換えタンパク質用量反応実験のため、組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤ（０〜５０ＮＢＴ単位）の濃度をさらに４８時間増加させて、ＨＴ−２９細胞をインキュベートした。
【０１４２】
この実験において、２つの異なる平行な挙動について、低用量または高用量を付加して、４８時間でのＨＴ−２９成長における組換えＳＯＤおよびＧｌｉ−ＳＯＤ双方について観察した。
【０１４３】
ＨＴ−２９細胞株の成長は、１０単位用量の組換えＳＯＤまたは５単位用量の組換えＧｌｉ−ＳＯＤのいずれかにより変化するが、これらの値未満の値の場合、ＨＴ−２９の成長は若干減速する。組換えＳＯＤおよび組換えＧｌｉ−ＳＯＤの用量を増加させると、ＨＴ−２９成長誘導のその相対レベルは同一レベルに留まり、これは、どんなに高用量であっても、誘導閾値が達成可能であることを示している。
【０１４４】
これらの結果に従って、最適な用量が、組換えＧｌｉ−ＳＯＤの場合に５〜１０単位および組換えＳＯＤの場合に１０〜２５単位で区切られ得る。
【０１４５】
上記実験の結果を図９に示す。
【０１４６】
［本発明の組換えＳＯＤは、「ペプチド効果」の補正を操作する］
培養物を定期的に７２時間サンプリングして、多様な成分への暴露を行ったかまたは行わなかった以下の場合において、ＨＴ−２９細胞の増殖率およびバイアビリティーを評価した。（ａ）１０単位の組換えＳＯＤまたは（ｂ）１０μＭのペプチド９８２と結合された１０単位の組換えＳＯＤまたは最後に（ｃ）１０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤ（グリアジンペプチド９８２に物理的にリンクしたＳＯＤ）
【０１４７】
この濃度において、ＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのいずれも任意の有毒効果を発揮しない。
【０１４８】
なぜならば、これらの増殖曲線は厳密に基底曲線に適合しかつ平行に構成されているからである。さらに、組換えＧｌｉ−ＳＯＤのＮ末端部分におけるペプチド９８２の存在にもかかわらず、期待されたような「ペプチド効果」は２４時間の培養物において発生しない。我々は、グリアジンペプチドが組換えＳＯＤ（Ｇｌｉ−ＳＯＤ）と関連付けられるかまたは結合し、その結果、グリアジンペプチドによって仲介されるフリーラジカル生成および／または抗酸化物質酵素の障害の一時的増加と相互作用することができる場合、上記にて証明されたグリアジンペプチドのＨＴ−２９増殖に対する効果が、２４時間の培養物において存在しないことに気がついた（RivabeneＲら、1999、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃａｔ、ｖｏｌ１４５３、ｐ１５２）。
【０１４９】
この驚くべき相乗効果は、上記グリアジンペプチドおよび上記ＳＯＤの結合あるいは物理的または化学的結合があろうとなかろうと、機能性組み合わせを含む治療組成および治療的組成において極めて有用な結果を持つ。なぜならば、これは、炎症ペプチドが投与形態中に意図的に存在する場合でも、期待された炎症反応を軽減さらには解消することができることを示すからである。
【０１５０】
この実験の結果の概要を図１０中に示す。
【０１５１】
［細胞アポトーシス］
２つの基礎的な経路が、アポトーシスを実行し得る。第１の経路において、デスリガンドはその受容体（Ｆａｓ／ＦａｓＬｉｇａｎｄ）を活性化させ、その結果、デスコンプレックスが形成される。その後、このデスコンプレックスは、カスパーゼ８を活性化させる。
【０１５２】
第２の経路において、細胞ストレスに起因して、細胞質中へのチトクロムＣの放出によってミトコンドリア機能障害が発生し、その結果、アポトーシスタンパク質因子−１およびカスパーゼ９との活性化複合体が形成される。その後、これらの複合体は、下流効果またはカスパーゼ３、６および７を活性化させ、その結果、最終アポトーシス変化が実行される。
【０１５３】
コムギグリアジンからの消化されたペプチドはＣＤ９５／Ｆａｓアポトーシス経路を介して腸管上皮細胞のアポトーシスを誘発することが知られているが（GiovanniniＣら、2003、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ５４０、ｐ１１７）、キサンチン／キサンチンオキシダーゼの混合物によって生成されたＲＯＳ（活性酸素種）は、チトクロムＣの細胞質中への放出と共に、カスパーゼ−３を活性化させる（HiguchiＭら、1998、ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｖｏｌ１７、ｐ２７５３）。
【０１５４】
第１にニューロペプチドとして特徴付けられて、オレキシンだけでなくその受容体も、胃腸管（VoisinＴら2000、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、ｖｏｌ２９２、ｐ６３８）を含むいくつかの末梢組織中に発現することが分かった（Voisin Ｔら、2003、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、ｖｏｌ６０、ｐ７２）。オレキシンは、ミトコンドリアおよびカスパーゼ活性化からのチトクロムＣ放出を通じてアポトーシスを促進することにより、２４時間後にヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞の成長を全体的に抑制する能力を有する（Rouet-Benzineb Ｐら、2004、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ２７９、Ｐ４６８７５）。
【０１５５】
本発明の組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤから期待される細胞ストレスおよびミトコンドリア機能障害と戦う特定の活性により、このような誘発性システムにおけるその強力な抗アポトーシス効率を確認するために、実験を行った。上記組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのために用いられた濃度は、増殖曲線に従って規定した。基底アポトーシス過程との相互作用に十分と思われる１０単位の組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのみを用い、一方、オレキシンまたはキサンチン／キサンチンオキシダーゼによって（Ｘ／ＸＯ）誘発されたＨＴ−２９細胞上でのアポトーシスには、５０単位の組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤがより適しているように見える。
【０１５６】
［組換えＳＯＤは、オレキシン誘発アポトーシスを抑制した］
アポトーシス細胞と非アポトーシス細胞とを区別するＧＵＡＶＡ Ｎｅｘｉｎキットを用いて、ＨＴ−２９細胞株中においてアポトーシスを分析した。この方法では、アネキシンＶフィコエリトリンを用いて、アポトーシス細胞の外膜上のｐｈｏｐｓｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ（ＰＳ）を検出する（Martinら、1995、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、ｖｏｌ１８２、ｐ１５４５）。
【０１５７】
２４時間後、トリプシンを０．０５％およびＥＤＴＡを０．５ｍＭ含むＰＢＳ溶液によって細胞単層を脱離させ、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、アポトーシス細胞染色を行い、ＧＵＡＶＡＰＣＡシステムで分析する。
【０１５８】
基底アポトーシス抑制（部分Ａ）については、１０単位の双方の組換えＳＯＤ（ＮＢＴ単位）を含むかまたは含まない新規培地と培地を交換した。オレキシン誘発アポトーシス抑制（部分Ｂ）については、１μＭのオレキシンおよび／または５０単位の各組換えＳＯＤ（ＮＢＴ単位）を含む新規培地と培地を効果した。その結果をアポトーシスアネキシンＶ−ＰＥ陽性細胞の百分率として表し、それは４点の平均である。
【０１５９】
通常条件下において、外膜ＰＳのアネキシンＶラベル付けによって示すように、アポトーシスは２０％（２０．５）のＨＴ−２９細胞中において同時発生した。
【０１６０】
この速度は、ＨＴ−２９細胞の培養時において１０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤが存在した場合に１０単位の組換えメロンＳＯＤが存在して１６．８％まで到達した際に（１８．１％抑制）、１８％まで低下した（１２．２％抑制）。
【０１６１】
第２の実験において、ＨＴ−２９細胞培地へのオレキシンの補充を介してアポトーシスを誘発した際に、組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤの強力な抗アポトーシス効果を確認した。この場合において、ＨＴ−２９細胞がアポトーシスとなる速度は、オレキシンを１μＭ培地中に付加することにより、基底レベルで評価した２０％から４０％まで向上され得る。オレキシン誘発アポトーシスの速度は、ＨＴ−２９細胞の培養時において５０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤが存在した際に５０単位の組換えメロンＳＯＤが存在して最終的に２８．７％に達した際に（５４．７％抑制）、３４．４％まで低下した（２６％抑制）。
【０１６２】
この実験の結果の概要を図１２中に示す。
【０１６３】
［組換えＳＯＤは、Ｘ／ＸＯ誘発アポトーシスを抑制した］
腸管上皮細胞機能は、活性酸素種ＲＯＳの生成を通じて、活性マクロファージ（腸疾患）などの局所免疫細胞および炎症細胞によって構成され得る。従って、ＲＯＳは、腸管上皮細胞アポトーシスと関連するＦａｓおよびＦａｓＬ発現を誘発し得る（DenningＴＬら、2002、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ｖｏｌ３３、ｐ１６４１）。
【０１６４】
キサンチン存在下のキサンチンオキシダーゼは、主にＯ２−°を生成する（これは、小腸中の活性酸素の代表であり、膜浸透性移行、カルシウム流入、脂質過酸化反応およびミトコンドリア中の膜流動性変化を誘発し得る）（AnupＲら、1999；Ｉｎｄｉａｎ Ｊ ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｖｏｌ３６、ｐ２６６およびAnupＲら、2000、ＢｒＪ Ｓｕｒｇ、ｖｏｌ８７、ｐ１０９４）。
【０１６５】
この第３の実験において、本発明による組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤの強力な抗アポトーシス効果の試験を、ＨＴ−２９細胞培地中でのキサンチン／キサンチンオキシダーゼ誘導を介した可能なＦａｓ／ＦａｓＬ経路上で行った。
【０１６６】
この場合、ＨＴ−２９細胞がアポトーシスとなる速度は、培地中に１０ｍＵのＸ／ＸＯ複合体を付加することにより、基底レベルについて評価した２０％から３０％まで向上され得る。５０単位の組換えメロンＳＯＤまたはやはり５０単位の組換えＧｌｉ−ＳＯＤを培地に付加すると、ＨＴ−２９細胞中でのＸ／ＸＯ誘発アポトーシス経路がそれぞれ７１％および８６％だけ回避された。
【０１６７】
この実験の結果を図１３のグラフに示す。
【０１６８】
［組換えＧｌｉ−ＳＯＤの結合］
各実験（ｎ＝４）において、およそ１５×１０3個の細胞／ラメラ層を５％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。全実験の前に、既存の培地を新規培地と交換した。
【０１６９】
その後、細胞単層を新規培地中で５０単位のＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤを用いてまたは用いずにさらに２４時間インキュベートし、カルシウムを含まずかつマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、その後、免疫組織化学によって分析した。ＥＰ−１６６９を第１の抗体（ウサギｌｇＧ抗ＳＯＤ、希釈１／2000°）を用いて３０分間Ｇｌｉ−ＳＯＤのＨＴ−２９細胞への結合を分析した。その後、第２のＦＩＴＣ結合抗体（ヤギ抗ウサギ抗体、希釈１／１００）をさらに３０分間分析した。
【０１７０】
フローサイトメトリではなくこの方法を選択した理由は、フローサイトメトリ技術の場合、トリプシン治療によって細胞を回収し、分析前に収集しなければならず、このような治療は、Ｇｌｉ−ＳＯＤ分子と細胞表面との間の相互作用に悪影響を与える可能性があるためである。
【０１７１】
上記ＦＩＴＣ蛍光実験の結果を図１１中に示す。図１１において、細胞近隣のＳＯＤの存在がＳＯＤ双方において明確に視認され、また、Ｇｌｉ−ＳＯＤの場合にも、より広範囲で明確に視認される。
【０１７２】
上記実験は、本発明による、そのＮ末端において小麦胚芽油グリアジンペプチド配列を持つかまたは持たないキューカミスメロＳＯＤをエンコードする遺伝子操作されたｃＤＮＡｓは、エシェリキアコリ中で効率的に発現され得、抗酸化物質活動を持つ活性の分子として生成され得ることを実証した。加えて、消化されたグリアジン−ペプチドのみが腸管細胞凝集または特定状況の細胞アポトーシスを誘発することで知られているが、本発明者らは、これらの負の効果を回避するより短いグリアジンペプチドを選択する。また、本発明のＳＯＤを選択されたグリアジンペプチドと物理的に組み合わせるかまたは単に結合させることで、グリアジンペプチドの確実な炎症効果と相互作用が可能になることも示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】キューカミスメロからのＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼのためのｃＤＮＡコーディングを得るために用いられるクローニング方法の模式図である。
【図２】本発明の組換えおよびキメラＳＯＤ分子を生成するために用いられる遺伝工学の一般図の模式図である。
【図３】本発明による多様なメロンＣｕ−ＺｎＳＯＤ変異体のＲＴ−ＰＣＲ増幅から得られるアガロースゲル電気泳動を示す。詳細には、ランＡは組換え葉緑体メロンＣｕ−ＺｎＳＯＤであり、ランＢは組換えメロン偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤであり、ランＣは、グリアジンペプチドへのＮ末端融合を支持するランＢの組換え偽細胞質Ｃｕ−ＺｎＳＯＤである。
【図４】異なる由来（詳細には、トマト細胞質ＳＯＤ（線１）、ヒトＳＯＤ（線２）およびメロン葉緑体ＳＯＤ（線３））からの３つの異なるＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸アライメントを示す。これらの配列間のアミノ酸残留物の同一性は、円を通じて３つのＳＯＤの各群の下側に示される。
【図５】組換えＳＯＤ（レーン１〜７）または組換え融合Ｇｌｉ〜ＳＯＤ（レーンＡ〜Ｆ）の精製過程のクマシーブルー染色ゲルである。図５において、 レーン１およびＡは、インビトロジェンから市販されているベンチマークタンパク質ラダーとして公知の分子量マーカである。 レーン２およびＢは、Ｈｉｓ−Ｔａｇの開裂を示す。 レーン３、４、５、６およびＣ、Ｄ、Ｅは、連続精製工程時における本発明による組換えＳＯＤおよび組換えＧｌｉ−ＳＯＤを示す。 レーン７およびＦは、ＭｏｎｏＱカラム上の治療後に残っているバンドである。
【図６】ＮＢＴ還元ゲル電気泳動を用いた組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤそれぞれのフォールディングを示す。 Ａは、１２５μｇの天然メロン抽出物（９０Ｕ／ｍｇに等価）でロードされたレーンＡおよびＡ’と、０．９２μｇの未変性ＳＯＤでロードされたレーン１、１’、および１’’’を有するｒｅｃＳＯＤを示す。Ｂは、本発明によるｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤを示し、レーンＡおよびＡ’は、１２５μｇの天然メロン抽出物（９０Ｕ／ｍｇに等価）でロードされ、レーン１および１’は１．８４μｇの組換えＧｌｉ−ＳＯＤでロードされ、レーン２および２’は、０．９２μｇの組換えＧｌｉ−ＳＯＤでロードされる。
【図７】以下のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。 Ａは、以下のクーマシー青色顕色を示す。 レーン１中の５０μｇの天然キューカミスメロ抽出物 レーン２中のタンパク質マーカ（６．６、１４．１、２１．１、３１、４５および６７ＫＤａ） レーン３中の２．５μｇのウシＳＯＤ（シグマ） Ｂは、以下のＥＰ１６６９抗体顕色を示す。 レーン４中の５０μｇの天然キューカミスメロ抽出物 レーン５中のタンパク質マーカ（６．６、１４．１、２１．１、３１、４５、６７ＫＤａ） レーン６中の２．５μｇのウシＳＯＤ（シグマ）
【図８】ＨＴ２９細胞株の増殖曲線上のグリアジンペプチドの効果のグラフであり、ここでＮ＝４である。
【図９】本発明によるｒｅｃＳＯＤまたはｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤの最小有効量の図解比較であり、Ｎ＝４である。
【図１０】本発明によるｒｅｃＳＯＤまたはｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤのＨＴ２９細胞株の増殖曲線上への効果のグラフであり、Ｎ＝４である。
【図１１】ＥＰ１６６９抗ＳＯＤ抗体を用いたＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤのＨＴ２９細胞上への細胞結合を示す１組のＦＩＴＣ画像であり、Ａは負の制御であり、白色エリアは、細胞近隣のＳＯＤの存在を示し、ＢはｒｅｃＳＯＤでの治療後であり、白色エリアは、細胞近隣のＳＯＤの存在を示し、ＣはｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤでの治療後であり、白色エリアは、細胞近隣のＳＯＤの存在を示す。
【図１２】アネキシンＶ試験を用いた、本発明によるＳＯＤの基底（Ａ）またはオレキシンによって誘発された（Ｂ）ＨＴ−２９アポトーシスに対する効果を図解表示したものであり、Ｎ＝４である。Ａは、１ＯＵを用いて得られた結果を示し、Ｂは、ｒｅｃＳＯＤおよびｒｅｃＧｌｉ−ＳＯＤそれぞれの５０Ｕを用いて得られた結果である。
【図１３】ヒポキサンチン／キサンチンオキシダーゼによって誘発されたＨＴ−２９アポトーシスにおける組換えＳＯＤまたはＧｌｉ−ＳＯＤに対する効果のグラフを示す（Ｎ＝４、アネキシンＶ試験）。
【０１７４】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬投与用に適合された医薬組成であって、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントの機能的に活性な組み合わせを含む、医薬組成。
【請求項２】
医薬的に受容可能な賦形剤も含む、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項３】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンまたは誘導体、類似体、塩またはその代謝体のフラグメントである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項４】
前記プロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項５】
前記プロラミン系ペプチドフラグメントは、免疫原性プロラミン系ペプチドに対して競合的抑制活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項６】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、ＮｉスーパーオキシドジスムターゼおよびＦｅスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項７】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは相同スーパーオキシドジスムターゼである、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項８】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種スーパーオキシドジスムターゼである、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項９】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、雑種異種／相同スーパーオキシドジスムターゼであり、好適には雑種植物／ヒトスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、動物スーパーオキシドジスムターゼ、バクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、イーストスーパーオキシドジスムターゼおよび植物スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは植物スーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種ＣｕＺｎ植物スーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは植物から抽出される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ウリ科に属する植物から抽出され、好適にはメロンから抽出され、ナス科に属する植物から抽出され、トマトから抽出される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼ、葉緑体スーパーオキシドジスムターゼおよび細胞質スーパーオキシドジスムターゼからなる植物スーパーオキシドジスムターゼの群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは組換えスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、修飾葉緑体またはペルオキソームＣｕＺｎ組換えスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１９】
前記修飾葉緑体またはペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼは、遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、前記核酸配列によって転換された宿主細胞形質中で発現される、請求項１８に記載の医薬組成。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは組換えスーパーオキシドジスムターゼであり、前記組換えスーパーオキシドジスムターゼは、
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうちの任意の１つによる核酸配列と、
厳密な条件下でＳＥＱ．ＩＤ２4〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうちの任意のものをハイブリダイジングする核酸と、
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される配列のうちの任意の１つと少なくとも７０％のＢＬＡＳＴ同一相同性を有する核酸と、
によってコードされる、
請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、完全に加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメント、実質的に加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメントまたは若干加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記胃腸加水分解過程を模倣するＰＴＣ（パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン）加水分解されたプロラミンから得られたフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記胃腸管のターゲティング信号として機能する範囲まで加水分解される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、免疫原性プロラミン系ペプチドに対して競合的抑制活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記アミノ酸配列Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒを有する、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記アミノ酸配列Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒを有する、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２およびＳＥＱ．ＩＤＮ°４３からなるアミノ酸配列の群から選択される単一ペプチドを形成する、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２９】
組換えスーパーオキシドジスムターゼであって、
ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３として特定される核酸配列のうちの任意の１つによる核酸配列と、
厳密な条件下でＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３として特定される核酸配列のうちの任意にハイブリダイジングする核酸と、
ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３として特定される配列のうちの任意の１つに対して少なくとも７０％ＢＬＡＳＴ同一相同性を有する核酸と、
のうちの１つによってコードされる、組換えスーパーオキシドジスムターゼ。
【請求項３０】
そのＮ末端においてリンカーアミノ酸配列に融合する植物スーパーオキシドジスムターゼからのアミノ酸配列を含むスーパーオキシドジスムターゼ活性を有するキメラ組換え分子。
【請求項３１】
前記リンカーアミノ配列は、前記アミノ酸メチオニンおよびバリンを含む、請求項３０に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３２】
前記キメラ組換え分子は、前記リンカーアミノ酸配列の前記Ｎ末端に融合されたプロラミン系ペプチドフラグメントをさらに含む、請求項３０または３１に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３３】
前記分子は、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２およびＳＥＱ．ＩＤＮ°４３からなるアミノ酸配列の群から選択される、請求項３０〜３２うちのいずれかの請求項に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３４】
前記組換えスーパーオキシドジスムターゼは、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２およびＳＥＱ．ＩＤＮ°４３からなるアミノ酸配列の群から選択される、請求項３０に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３５】
ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３によって特定される核酸配列からなる群から選択される単離核酸。
【請求項３６】
請求項２９〜３４のうちの任意の１つに記載の組換えスーパーオキシドジスムターゼの薬剤としての使用。
【請求項３７】
請求項２９〜３４のうちの任意の１つに記載の組換えスーパーオキシドジスムターゼの抗細胞ストレス剤としての使用。
【請求項３８】
請求項１〜２８のうちの任意の１つに記載の医薬組成、あるいは請求項２９〜３４のうちの任意の１つに記載の組換えスーパーオキシドジスムターゼの炎症病理薬の製造への使用。
【請求項３９】
ＳＥＱ．ＩＤＮ°４４またはＳＥＱ．ＩＤＮ°４５の数字下で特定される配列の群から対応して選択される抗組換えスーパーオキシドジスムターゼ抗体。
【請求項１】
医薬投与用に適合された医薬組成であって、少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントの機能的に活性な組み合わせを含む、医薬組成。
【請求項２】
医薬的に受容可能な賦形剤も含む、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項３】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンまたは誘導体、類似体、塩またはその代謝体のフラグメントである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項４】
前記プロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項５】
前記プロラミン系ペプチドフラグメントは、免疫原性プロラミン系ペプチドに対して競合的抑制活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項６】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、ＮｉスーパーオキシドジスムターゼおよびＦｅスーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項７】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは相同スーパーオキシドジスムターゼである、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項８】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種スーパーオキシドジスムターゼである、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項９】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、雑種異種／相同スーパーオキシドジスムターゼであり、好適には雑種植物／ヒトスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、動物スーパーオキシドジスムターゼ、バクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、イーストスーパーオキシドジスムターゼおよび植物スーパーオキシドジスムターゼからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは植物スーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは異種ＣｕＺｎ植物スーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは植物から抽出される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ウリ科に属する植物から抽出され、好適にはメロンから抽出され、ナス科に属する植物から抽出され、トマトから抽出される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、ペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼ、葉緑体スーパーオキシドジスムターゼおよび細胞質スーパーオキシドジスムターゼからなる植物スーパーオキシドジスムターゼの群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは組換えスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは、修飾葉緑体またはペルオキソームＣｕＺｎ組換えスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項１９】
前記修飾葉緑体またはペルオキソームスーパーオキシドジスムターゼは、遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、前記核酸配列によって転換された宿主細胞形質中で発現される、請求項１８に記載の医薬組成。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼは組換えスーパーオキシドジスムターゼであり、前記組換えスーパーオキシドジスムターゼは、
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうちの任意の１つによる核酸配列と、
厳密な条件下でＳＥＱ．ＩＤ２4〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される核酸配列のうちの任意のものをハイブリダイジングする核酸と、
ＳＥＱ．ＩＤ２４〜ＳＥＱ．ＩＤ３３として特定される配列のうちの任意の１つと少なくとも７０％のＢＬＡＳＴ同一相同性を有する核酸と、
によってコードされる、
請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、完全に加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメント、実質的に加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメントまたは若干加水分解されたプロラミン系ペプチドフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記胃腸加水分解過程を模倣するＰＴＣ（パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン）加水分解されたプロラミンから得られたフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記胃腸管のターゲティング信号として機能する範囲まで加水分解される、請求項１に記載の医薬組成。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、グリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、免疫原性プロラミン系ペプチドに対して競合的抑制活性を有するグリアジンの非免疫原性類似体である、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記アミノ酸配列Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ−Ｃｔｅｒを有する、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、前記アミノ酸配列Ｎｔｅｒ−ＱＱＰＱＤＡＶＱＰＦ−Ｃｔｅｒを有する、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのスーパーオキシドジスムターゼおよび少なくとも１つのプロラミン系ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２およびＳＥＱ．ＩＤＮ°４３からなるアミノ酸配列の群から選択される単一ペプチドを形成する、前記請求項のうち任意の請求項に記載の医薬組成。
【請求項２９】
組換えスーパーオキシドジスムターゼであって、
ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３として特定される核酸配列のうちの任意の１つによる核酸配列と、
厳密な条件下でＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３として特定される核酸配列のうちの任意にハイブリダイジングする核酸と、
ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３として特定される配列のうちの任意の１つに対して少なくとも７０％ＢＬＡＳＴ同一相同性を有する核酸と、
のうちの１つによってコードされる、組換えスーパーオキシドジスムターゼ。
【請求項３０】
そのＮ末端においてリンカーアミノ酸配列に融合する植物スーパーオキシドジスムターゼからのアミノ酸配列を含むスーパーオキシドジスムターゼ活性を有するキメラ組換え分子。
【請求項３１】
前記リンカーアミノ配列は、前記アミノ酸メチオニンおよびバリンを含む、請求項３０に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３２】
前記キメラ組換え分子は、前記リンカーアミノ酸配列の前記Ｎ末端に融合されたプロラミン系ペプチドフラグメントをさらに含む、請求項３０または３１に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３３】
前記分子は、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２およびＳＥＱ．ＩＤＮ°４３からなるアミノ酸配列の群から選択される、請求項３０〜３２うちのいずれかの請求項に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３４】
前記組換えスーパーオキシドジスムターゼは、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３４、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３５、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３６、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３７、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３８、ＳＥＱ．ＩＤＮ°３９、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４０、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４１、ＳＥＱ．ＩＤＮ°４２およびＳＥＱ．ＩＤＮ°４３からなるアミノ酸配列の群から選択される、請求項３０に記載のキメラ組換え分子。
【請求項３５】
ＳＥＱ．ＩＤＮ°２４〜ＳＥＱ．ＩＤＮ°３３によって特定される核酸配列からなる群から選択される単離核酸。
【請求項３６】
請求項２９〜３４のうちの任意の１つに記載の組換えスーパーオキシドジスムターゼの薬剤としての使用。
【請求項３７】
請求項２９〜３４のうちの任意の１つに記載の組換えスーパーオキシドジスムターゼの抗細胞ストレス剤としての使用。
【請求項３８】
請求項１〜２８のうちの任意の１つに記載の医薬組成、あるいは請求項２９〜３４のうちの任意の１つに記載の組換えスーパーオキシドジスムターゼの炎症病理薬の製造への使用。
【請求項３９】
ＳＥＱ．ＩＤＮ°４４またはＳＥＱ．ＩＤＮ°４５の数字下で特定される配列の群から対応して選択される抗組換えスーパーオキシドジスムターゼ抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００９−５３１３１１（Ｐ２００９−５３１３１１Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８９１７（Ｐ２００８−５５８９１７）
【出願日】平成１８年３月１５日（２００６．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００５７７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０５０２４
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２６８１０４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１５日（２００６．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００５７７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０５０２４
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２６８１０４）
【Ｆターム（参考）】
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