ＳＳＴ−ＲＥＸ法を用いた新規のがん抗原特異的抗体遺伝子スクリーニング方法
【課題】がん患者由来のＢ細胞に発現する抗体遺伝子を、培養がん細胞由来のがん抗原ライブラリーを用いてスクリーニングすることにより、Ｂ細胞の採取源に限定されない、より普遍的な新規のがん抗原に対する抗体遺伝子を同定すること。
【解決手段】がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を用いて作製したがん抗原ライブラリー細胞とを接触させ、ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する。この複合体から、抗原タンパクの遺伝子配列を同定して組換え抗原タンパク質を作製し、このｒ抗原タンパク質で標識したＢ細胞を１細胞ずつ分取する。１細胞から全ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子の塩基配列を解析する。
【解決手段】がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を用いて作製したがん抗原ライブラリー細胞とを接触させ、ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する。この複合体から、抗原タンパクの遺伝子配列を同定して組換え抗原タンパク質を作製し、このｒ抗原タンパク質で標識したＢ細胞を１細胞ずつ分取する。１細胞から全ＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子の塩基配列を解析する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を用いたヒト抗体遺伝子スクリーニング方法に関し、より詳しくは、ＳＳＴ−ＲＥＸ法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞を用いて、がん患者由来の血清又はＢ細胞のスクリーニングを行い、得られたがん抗原に対する新規の抗体を産生するＢ細胞の１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法や、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法や、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間などの高等脊椎動物の体には、体外から侵入する細菌・ウイルスなどの病原体や、危険物質、がん細胞などの異物から生命を守るために獲得免疫系が存在する。抗体はタンパク質等の相互に類似した物質を特異的に識別できる免疫グロブリンというタンパク質であり、生体内では抗原特異的液性免疫に関与している。抗体は、無数の異物を認識するために、抗体の一部（可変領域）をコードする遺伝子では、ＤＮＡレベルでの再編成が起き、多様な抗体遺伝子配列を持つＢリンパ球の集団が生じている。このＤＮＡ再編成を通じた遺伝子多様化の仕組みは、生物が子孫の遺伝子を多様化しつつ、環境変動に適応して生き残ろうとする性の過程にも見られる。また、それぞれのＢリンパ球細胞１個からは必ず一種類の抗体遺伝子がコードする一種類の免疫グロブリンが産生されることが知られている。
【０００３】
従来、抗体遺伝子を取得する方法等としては、ヒト末梢血リンパ球を分離後、ＣＤ１１ｃ特異的抗体及びマグネチックビーズを用いＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去し、体外免疫を行い、抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導し、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、この抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨ及びＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行う抗原特異的抗体遺伝子の取得方法（例えば、特許文献１参照）や、目的の抗体が認識する抗原を標識化してなる標識化抗原を、前記抗体を産生するターゲット細胞を含む細胞集団に接触させ、前記標識化抗原を前記ターゲット細胞に結合させ、得られる標識化ターゲット細胞を分離し、分離した標識化ターゲット細胞を用いて、それが保有する抗体遺伝子を調製し、調製した抗体遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させる抗体作製方法（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
【０００４】
株式会社ＡＣＴＧｅｎ社は、分泌タンパク質及び膜タンパク質をコードするＤＮＡを選択的に包含する優れたｃＤＮＡライブラリー作製技術（特許文献３及び４）と、シグナルシークエンスを持つタンパク質を特異的に細胞に発現させる技術（特許文献５及び６）を組み合わせた、ＳＳＴ−ＲＥＸ（signal sequence trap by retrovirus-mediated expression screening）法を確立している。図１に示すように、このＳＳＴ−ＲＥＸ法では、目的の遺伝子ライブラリーをトロンボポエチン受容体の部分長(ＭＰＬ)との融合蛋白質として発現するよう設計したレトロウイルスベクターを、インターロイキン（ＩＬ−３）依存的に増殖するＢａ／Ｆ３細胞に導入することにより、ＩＬ−３非依存性細胞増殖を指標してシグナルシークエンスを持つ分泌蛋白質および膜蛋白質の遺伝子を選択的に同定することができる。
【特許文献１】特開２００４−１２１２３７号公報
【特許文献２】特開２００６−１８０７０８号公報
【特許文献３】特許第２８７９３０３号明細書
【特許文献４】特許第３２２９５９０号明細書
【特許文献５】特許第３９０４４５１号明細書
【特許文献６】特許第３４９９５２８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年、がんや自己免疫疾患という病態での免疫細胞の異常クローンが注目されているが、免疫のダイナミックな順応メカニズムを考えれば、個々の細胞の機能的性格が異なることは容易に想像できる。免疫応答の観点からしてもＴ細胞受容体や抗体遺伝子の変異も最初は１個の細胞から始まる現象であり、免疫細胞の機能研究においては、１細胞レベルでの研究はもはや避けては通れない時代である。特に、がんという病態下での個々の免疫細胞の動態については、未だ詳細な検討はなされておらず、新しい治療を考える上で重要な研究課題となりうる。本発明者らは、ワクチン治療後（特願２００７−１４７５２５）、又はワクチン治療前（特願２００８−１４６９６４）のがん患者から採取した末梢血単核球からＢ細胞を単離し、１細胞ごとにＲＮＡを抽出することにより、Ｂ細胞１細胞レベルでのがん特異的な抗体遺伝子について解析・同定する方法を既に提案している。しかし、これらの方法で得られる抗体遺伝子の種類は、Ｂ細胞の採取源である患者により限定されるため、普遍的で、より幅広いがん種に対応する抗体遺伝子を得ることは困難であった。
【０００６】
本発明の課題は、がん患者由来のＢ細胞に発現する抗体遺伝子を、培養がん細胞由来のがん抗原ライブラリーを用いてスクリーニングすることにより、Ｂ細胞の採取源に限定されない、より普遍的な新規のがん抗原に対する抗体遺伝子を同定する方法や、該がん抗原に対する抗体を製造する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、既に、がん患者由来の末梢血単球から作製した不死化Ｂ細胞を用いて、ＭＡＧＥ１等の公知のがん抗原に対する抗体を産生するＢ細胞を１細胞ずつ分取し、その遺伝子解析を行うことにより、抗体遺伝子を効率的にクローニングする実用化技術を確立している。本発明では、培養がん細胞由来のｃＤＮＡのうち分泌シグナルを有する遺伝子を選択的に発現させたライブラリー細胞（自己増殖性Ｂａ／Ｆ３）を、ＡＣＴＧｅｎ社のシグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を用いて作製し、上述の抗体遺伝子クローニング技術と組み合わせて用いることにより、より普遍的、かつ網羅的な抗体遺伝子のスクリーニングを行うことができることを見い出した。
【０００８】
すなわち本発明は、［１］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｉ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［２］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を回収する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［３］末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の解析・同定方法や、［４］ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする上記［１］〜［３］記載の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［５］がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする上記［４］記載の抗体遺伝子の解析・同定方法に関する。
【０００９】
また本発明は、［６］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｊ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、［７］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を回収する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、［８］末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする上記［６］又は［７］記載の抗体を製造する方法や、［９］ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする上記［６］〜［８］記載の抗体を製造する方法や、［１０］がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする上記［９］記載の抗体を製造する方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、［１１］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；及び（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法や、［１２］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を回収する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；及び（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法や、［１３］末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする上記［１１］又は［１２］記載の抗体遺伝子を調製する方法や、［１４］ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする上記［１１］〜［１３］記載の抗体遺伝子を調製する方法や、［１５］がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする上記［１４］記載の抗体遺伝子を調製する方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、より普遍的、かつ網羅的ながん抗原に対する抗体遺伝子のスクリーニングを行うことができるため、新たながん治療のターゲットのスクリーニングや、がん治療薬の開発、さらに、今後のがんのテーラーメイド医療や診断に非常に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法に関し、上記３方法（以下、「本発明の方法」ということがある）においては、血清中の抗体をスクリーニングする方法（以下、「方法Ｉ」ということがある）と、末梢血単核球由来のＢ細胞をスクリーニングする方法（以下、「方法II」ということがある）に大別することができる。
【００１３】
本発明の方法において、末梢血の採取源となるがん患者は、担がん状態にある患者であればどのような患者であってもよく、上記がんとしては、固形がんであっても、血液がんであってもよい。ここで固形がんとは、肉腫および癌腫を含むものであり、具体的には、メラノーマ（黒色腫）、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢腺がん、骨髄がん、気管支原性がん、腎細胞がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、子宮内膜がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、頭蓋咽頭がん、喉頭がん、舌がん、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、腹膜播腫、奇形腫、神経芽細胞腫、髄芽腫および網膜芽細胞腫等が挙げられ、また、上記血液がんとは、骨髄腫およびリンパ腫が含まれるものであり、具体的には、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法に用いる、抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞集団としては、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を利用して作製されたＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団であれば特に制限されるものではなく、各種のがん細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、様々ながん抗原タンパク質を細胞膜上に発現させたライブラリーを構築することができる。図１に示すように、上記ＳＳＴ−ＲＥＸ法とは、細胞表面で二量体を形成することにより細胞増殖を誘導する能力を有するペプチドを利用した分泌ペプチドをコードするｃＤＮＡを検出・単離する方法であり、より具体的には、タンパク質を分泌シグナルと細胞外領域を除去した恒常活性型トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）ＤＮＡと被検タンパク質をコードするｃＤＮＡとを挿入したレトロウイルスベクターを、ＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞に感染させることにより、該Ｂａ／Ｆ３細胞膜上に分泌シグナルを有する被検タンパク質のみを発現させることができる。
【００１５】
本発明の方法においては、末梢血単核球から単離した正常（プライマリー）Ｂ細胞をそのまま用いることも、末梢血単核球から単離したＢ細胞をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化して用いることもできる。不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を作製するには、末梢血単核球とＥＢＶをフィーダー細胞の共存下で培養し、末梢血単核球を不死化すればよく、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体に加えて、標識化抗原ペプチドを用いて、目的とする抗原特異的抗体産生ＥＢＶ−Ｂ細胞株の存在を確認することもできる。
【００１６】
本発明の方法において、患者末梢血由来の抗体又はＢ細胞と、ＳＳＴ細胞との結合を検出する方法としては、ＳＳＴ細胞膜上の抗原タンパク質と抗体との特異的な結合を検出することのできる方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、ＭＰＬを認識しうる標識化抗体及びヒト抗体を認識しうる標識化抗体を用いた２重染色により、抗体−ＳＳＴ細胞複合体又はＢ細胞−ＳＳＴ細胞を検出する方法や、蛍光物質等の標識物質をコードする遺伝子を導入することにより予めＳＳＴ細胞を標識化し、ヒト抗体を認識しうる標識化抗体による染色を組み合わせて行うことによりＳＳＴ細胞と抗体又はＢ細胞との結合を検出する方法や、予め標識化したＳＳＴ細胞とヒト抗体を認識しうる標識化抗体との共鳴による励起エネルギーの移動（ＦＲＥＴ）等の１以上の方法を利用して複合体形成を確認する方法を例として挙げることができる。
【００１７】
本発明の方法に用いる標識物質としては、公知の標識物質であれば特に制限されるものではなく、Alexa Fluor 488、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム誘導体などの化学発光物質、ビオチン、マグネットビーズを挙げることができるほか、例えば、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ等のエピトープタグを挙げることができ、これらの標識物質による標識化は常法で行うことができ、例えばMolecular Cloning, Third Edition,ColdSpringHarbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる。
【００１８】
上記方法Ｉの工程（Ｅ）「標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程」において、末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する方法としては、所定の抗原タンパク質に対する抗体タンパク質を発現するＢ細胞を標識化する方法であれば特に制限されるものではないが、標識物質により標識された抗原タンパク質を用いて標識する方法が好ましく、標識物質により標識された抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とを組み合わせて、末梢血単核球由来のＢ細胞を２重に標識する方法や、あらかじめＣＤ１９等の細胞表面特異マーカーに対する抗体を用いてＢ細胞を分離し、分離したＢ細胞に標識物質により標識された抗原タンパク質を用いてＢ細胞を標識する方法や、分離したＢ細胞に標識物質により標識された抗原タンパク質と、標識されたヒト抗体を認識しうる抗体とを組み合わせて、Ｂ細胞を２重に標識する方法がより好ましい。
【００１９】
上記方法Ｉの工程（Ｆ）「工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程」及び方法IIの工程（Ｄ）「工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程」において、抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を、１個ずつ分取するには、上記Ｂ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞の標識化に使用した標識物質の種類に応じて適切な手法が用いられる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、Ｂ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を１個ずつ分取することが好ましい。フローサイトメトリーによれば効率的かつ高精度の細胞分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用してＢ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を１個ずつ分取することができる。マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いた良好な分離が可能である。さらに、マイクロマニピュレーターやマイクロメッシュフィルターを用いてＢ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を１個ずつ分取することもできる。
【００２０】
上記方法Ｉの工程（Ｇ）「１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程」及び方法IIの工程（Ｅ）「回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程」における、全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、逆転写反応によるｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.参照）に従って実施することができ、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とを行うことにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する。ヒト抗体重鎖領域遺伝子、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては、それぞれの領域遺伝子配列に特異的なプライマー対であれば特に制限されないが、例えば、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号１〜２４に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号２５又は２６に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号２７〜３７に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号３８に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、また、ヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号３９〜６１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号６２及び６３に示される塩基配列の１種又は２種の配列とからなるプライマー対を挙げることができる。増幅された遺伝子断片の塩基配列は常法により解析・決定することができる。
【００２１】
上記増幅された遺伝子断片を用いて、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製することができる。すなわち、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖遺伝子を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体軽鎖遺伝子を調製することができる。さらに、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。これら調製されたヒト抗体遺伝子をサブクローニングして増幅させることもできる。なお、ゲノムＤＮＡを鋳型にする場合、エクソンが離れているためいるため効果的な増幅が期待できない。
【００２２】
また、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片（重鎖断片）及びヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片（軽鎖断片）をＰＣＲ法により増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片をＰＣＲ法によりそれぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒト一本鎖抗体遺伝子（ＳｃＦｖ）断片としてＰＣＲ法により増幅する本発明者らによる方法（特願２００７−９２９６８）を用いると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく製造することができる。
【００２３】
上記増幅された遺伝子断片である、ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させ、１個のＢ細胞由来の抗体を製造することができる。発現ベクターとしては、抗体遺伝子の発現に適したものであれば特に限定されず、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology,158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクターを挙げることができる。これらのウイルスベクターには、発現効率を高めるためにプロモータ配列、エンハンサー配列などの制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへの抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
【００２４】
上記ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子は、通常、それぞれ別の発現ベクターに挿入され、これら２つの組換えベクターで宿主を共形質転換し、同一細胞内で重鎖及び軽鎖を発現させることが好ましい。上記宿主としては、組換えベクターで形質転換されることにより、導入された抗体遺伝子を発現可能な状態に保有できるものであれば特に制限されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞等を挙げることができる。組換えベクターにより宿主を形質転換する方法としては、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を例示することができる。このようにして、ハイブリドーマを用いることなく、１個のＢ細胞から、モノクローナル抗体を製造することができる。また、上記ヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターにより大腸菌を形質転換し、この形質転換大腸菌を用いてファージディスプレイヒト一本鎖抗体を作製することもできる。
【００２５】
本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法によって、がん患者の抗体遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的抗体の種類の全体像に関する情報を得ることができる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法によって、がん抗原特異的抗体を大量に得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断や治療が可能となる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法によって得られる抗体遺伝子は、がん抗原特異的抗体を大量に製造する場合に有利に用いられる他、テイラーメイド的な患者個人の診断にも利用することができる。特に、従来マウスで免疫してハイブリドーマを作製して得られていた部分的なヒトの抗体を、実際にヒトの体内で増幅した形で、１００％ヒトの抗体として獲ることができるという大きな利点がある。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
［末梢血単核球の採取と不死化Ｂ細胞株の作製］
樹状細胞ワクチン投与前及び／又は投与後のメラノーマ患者（ワクチン投与前後の同一患者を含む）から末梢血を採取し、血清及び末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell;ＰＢＭＣ)を調製した。なお、治療に使用される樹状細胞ワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、及びTyrosinaseの５種類のペプチド、又はＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１及びTyrosinaseの５種類のペプチドで処理されたものである。
【００２８】
［不死化Ｂ細胞株の作製］
採取したＰＢＭＣの一部から、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞株（EBV-transformed B cell line；以下ＥＢＶ−Ｂ細胞株という）を作製した。具体的には、フィーダーであるヒト繊維芽細胞株（ＭＲＣ−５；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＣＣＬ−１７１）を、２５ｃｍ２フラスコにて９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙまで増殖させ（培地：ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、３０−４０Ｇｙのirradiationを実施した。２４時間後、実施例１で採取したＰＢＭＣを１〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／４ｍｌとなるように培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳ）に懸濁し、上記の培養ＭＲＣ−５に加えた。その後、１ｍｌのＥＢＶ溶液（ＥＢＶ strain Ｂ９５−８、ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＶＲ−１４９２）を２５ｍｌフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の気相条件下で培養した。培養開始から４８時間後に培地を交換した後、４日ごとに培地交換を行った。３〜４週間後に、Ｂ細胞の増殖を確認し、ＥＢＶにより不死化したＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を回収した。
【００２９】
さらに、脳腫瘍, 大腸がん患者からも末梢血を採取し、同様に血清及びＢ細胞を調整する。なお、以上の臨床検体の使用に関しては、臨床研究「悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法」、「特異的ＣＴＬ誘導活性を指標としたＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４拘束性ＣＥＡエピトープペプチドの同定」および「悪性グリオーマに対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法」において静岡がんセンター倫理審査委員会にて研究の承認を受けている。
【実施例２】
【００３０】
［ライブラリー細胞］
ＡＣＴＧｅｎ社のシグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を使用したメラノーマ培養細胞由来のｃＤＮＡを網羅的に発現させたライブラリー細胞（自己増殖性Ｂａ／Ｆ３）を新たに作製する（図１及び２）。また、すでに作製済みであるヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）および大腸がん培養細胞由来のｃＤＮＡを発現するＢａ／Ｆ３細胞も抗体遺伝子のスクリーニングに提供される。
【００３１】
［血清を用いたライブラリー発現細胞のスクリーニング］
適度に希釈した患者由来の血清を１次抗体、標識マウス抗ヒトＭｏＡｂを２次抗体として使用する。同時に標識抗ＭＰＬ抗体を用いて染色を行い、ｃＤＮＡ発現細胞であることも確認する。陽性に染色された細胞を回収して、ＰＣＲクローニング法にてｃＤＮＡ配列を同定する。同定された配列を基に、組換えタンパク合成系（大腸菌またはＣＨＯ細胞）にてｃＤＮＡ由来のＧＳＴ融合タンパクを合成し、Ｂ細胞株の染色を施行する。陽性に染色されたＢ細胞をｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇし、抗体遺伝子配列を同定する（図２）。
【００３２】
［不死化または正常Ｂ細胞を用いたスクリーニング］
個々のｃＤＮＡを含むライブラリー細胞のクローンを増やし、プールしておく。同数のライブラリー細胞と不死化Ｂ細胞を混ぜて１−２時間培養を行う。ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体およびＦＩＴＣ標識抗ＭＰＬ抗体にて同時に染色を行い、二重染色にて陽性となる細胞群をソーテイングを実施する。染色された細胞を２分して抗体遺伝子およびｃＤＮＡのクローニング用に使用する（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＳＴ−ＲＥＸ(シグナルトラップシークエンス)技術の概略を示す図である。
【図２】本発明のＳＳＴ−ＲＥＸ法を用いた完全ヒト型抗体の作製方法を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を用いたヒト抗体遺伝子スクリーニング方法に関し、より詳しくは、ＳＳＴ−ＲＥＸ法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞を用いて、がん患者由来の血清又はＢ細胞のスクリーニングを行い、得られたがん抗原に対する新規の抗体を産生するＢ細胞の１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法や、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法や、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間などの高等脊椎動物の体には、体外から侵入する細菌・ウイルスなどの病原体や、危険物質、がん細胞などの異物から生命を守るために獲得免疫系が存在する。抗体はタンパク質等の相互に類似した物質を特異的に識別できる免疫グロブリンというタンパク質であり、生体内では抗原特異的液性免疫に関与している。抗体は、無数の異物を認識するために、抗体の一部（可変領域）をコードする遺伝子では、ＤＮＡレベルでの再編成が起き、多様な抗体遺伝子配列を持つＢリンパ球の集団が生じている。このＤＮＡ再編成を通じた遺伝子多様化の仕組みは、生物が子孫の遺伝子を多様化しつつ、環境変動に適応して生き残ろうとする性の過程にも見られる。また、それぞれのＢリンパ球細胞１個からは必ず一種類の抗体遺伝子がコードする一種類の免疫グロブリンが産生されることが知られている。
【０００３】
従来、抗体遺伝子を取得する方法等としては、ヒト末梢血リンパ球を分離後、ＣＤ１１ｃ特異的抗体及びマグネチックビーズを用いＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去し、体外免疫を行い、抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導し、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、この抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨ及びＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行う抗原特異的抗体遺伝子の取得方法（例えば、特許文献１参照）や、目的の抗体が認識する抗原を標識化してなる標識化抗原を、前記抗体を産生するターゲット細胞を含む細胞集団に接触させ、前記標識化抗原を前記ターゲット細胞に結合させ、得られる標識化ターゲット細胞を分離し、分離した標識化ターゲット細胞を用いて、それが保有する抗体遺伝子を調製し、調製した抗体遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させる抗体作製方法（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
【０００４】
株式会社ＡＣＴＧｅｎ社は、分泌タンパク質及び膜タンパク質をコードするＤＮＡを選択的に包含する優れたｃＤＮＡライブラリー作製技術（特許文献３及び４）と、シグナルシークエンスを持つタンパク質を特異的に細胞に発現させる技術（特許文献５及び６）を組み合わせた、ＳＳＴ−ＲＥＸ（signal sequence trap by retrovirus-mediated expression screening）法を確立している。図１に示すように、このＳＳＴ−ＲＥＸ法では、目的の遺伝子ライブラリーをトロンボポエチン受容体の部分長(ＭＰＬ)との融合蛋白質として発現するよう設計したレトロウイルスベクターを、インターロイキン（ＩＬ−３）依存的に増殖するＢａ／Ｆ３細胞に導入することにより、ＩＬ−３非依存性細胞増殖を指標してシグナルシークエンスを持つ分泌蛋白質および膜蛋白質の遺伝子を選択的に同定することができる。
【特許文献１】特開２００４−１２１２３７号公報
【特許文献２】特開２００６−１８０７０８号公報
【特許文献３】特許第２８７９３０３号明細書
【特許文献４】特許第３２２９５９０号明細書
【特許文献５】特許第３９０４４５１号明細書
【特許文献６】特許第３４９９５２８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年、がんや自己免疫疾患という病態での免疫細胞の異常クローンが注目されているが、免疫のダイナミックな順応メカニズムを考えれば、個々の細胞の機能的性格が異なることは容易に想像できる。免疫応答の観点からしてもＴ細胞受容体や抗体遺伝子の変異も最初は１個の細胞から始まる現象であり、免疫細胞の機能研究においては、１細胞レベルでの研究はもはや避けては通れない時代である。特に、がんという病態下での個々の免疫細胞の動態については、未だ詳細な検討はなされておらず、新しい治療を考える上で重要な研究課題となりうる。本発明者らは、ワクチン治療後（特願２００７−１４７５２５）、又はワクチン治療前（特願２００８−１４６９６４）のがん患者から採取した末梢血単核球からＢ細胞を単離し、１細胞ごとにＲＮＡを抽出することにより、Ｂ細胞１細胞レベルでのがん特異的な抗体遺伝子について解析・同定する方法を既に提案している。しかし、これらの方法で得られる抗体遺伝子の種類は、Ｂ細胞の採取源である患者により限定されるため、普遍的で、より幅広いがん種に対応する抗体遺伝子を得ることは困難であった。
【０００６】
本発明の課題は、がん患者由来のＢ細胞に発現する抗体遺伝子を、培養がん細胞由来のがん抗原ライブラリーを用いてスクリーニングすることにより、Ｂ細胞の採取源に限定されない、より普遍的な新規のがん抗原に対する抗体遺伝子を同定する方法や、該がん抗原に対する抗体を製造する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、既に、がん患者由来の末梢血単球から作製した不死化Ｂ細胞を用いて、ＭＡＧＥ１等の公知のがん抗原に対する抗体を産生するＢ細胞を１細胞ずつ分取し、その遺伝子解析を行うことにより、抗体遺伝子を効率的にクローニングする実用化技術を確立している。本発明では、培養がん細胞由来のｃＤＮＡのうち分泌シグナルを有する遺伝子を選択的に発現させたライブラリー細胞（自己増殖性Ｂａ／Ｆ３）を、ＡＣＴＧｅｎ社のシグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を用いて作製し、上述の抗体遺伝子クローニング技術と組み合わせて用いることにより、より普遍的、かつ網羅的な抗体遺伝子のスクリーニングを行うことができることを見い出した。
【０００８】
すなわち本発明は、［１］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｉ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［２］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を回収する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［３］末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の解析・同定方法や、［４］ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする上記［１］〜［３］記載の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［５］がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする上記［４］記載の抗体遺伝子の解析・同定方法に関する。
【０００９】
また本発明は、［６］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｊ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、［７］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を回収する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；及び（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、［８］末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする上記［６］又は［７］記載の抗体を製造する方法や、［９］ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする上記［６］〜［８］記載の抗体を製造する方法や、［１０］がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする上記［９］記載の抗体を製造する方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、［１１］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；及び（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法や、［１２］（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を回収する工程；（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；及び（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法や、［１３］末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする上記［１１］又は［１２］記載の抗体遺伝子を調製する方法や、［１４］ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする上記［１１］〜［１３］記載の抗体遺伝子を調製する方法や、［１５］がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする上記［１４］記載の抗体遺伝子を調製する方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、より普遍的、かつ網羅的ながん抗原に対する抗体遺伝子のスクリーニングを行うことができるため、新たながん治療のターゲットのスクリーニングや、がん治療薬の開発、さらに、今後のがんのテーラーメイド医療や診断に非常に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法に関し、上記３方法（以下、「本発明の方法」ということがある）においては、血清中の抗体をスクリーニングする方法（以下、「方法Ｉ」ということがある）と、末梢血単核球由来のＢ細胞をスクリーニングする方法（以下、「方法II」ということがある）に大別することができる。
【００１３】
本発明の方法において、末梢血の採取源となるがん患者は、担がん状態にある患者であればどのような患者であってもよく、上記がんとしては、固形がんであっても、血液がんであってもよい。ここで固形がんとは、肉腫および癌腫を含むものであり、具体的には、メラノーマ（黒色腫）、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢腺がん、骨髄がん、気管支原性がん、腎細胞がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、子宮内膜がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、頭蓋咽頭がん、喉頭がん、舌がん、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、腹膜播腫、奇形腫、神経芽細胞腫、髄芽腫および網膜芽細胞腫等が挙げられ、また、上記血液がんとは、骨髄腫およびリンパ腫が含まれるものであり、具体的には、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法に用いる、抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞集団としては、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を利用して作製されたＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団であれば特に制限されるものではなく、各種のがん細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、様々ながん抗原タンパク質を細胞膜上に発現させたライブラリーを構築することができる。図１に示すように、上記ＳＳＴ−ＲＥＸ法とは、細胞表面で二量体を形成することにより細胞増殖を誘導する能力を有するペプチドを利用した分泌ペプチドをコードするｃＤＮＡを検出・単離する方法であり、より具体的には、タンパク質を分泌シグナルと細胞外領域を除去した恒常活性型トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）ＤＮＡと被検タンパク質をコードするｃＤＮＡとを挿入したレトロウイルスベクターを、ＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞に感染させることにより、該Ｂａ／Ｆ３細胞膜上に分泌シグナルを有する被検タンパク質のみを発現させることができる。
【００１５】
本発明の方法においては、末梢血単核球から単離した正常（プライマリー）Ｂ細胞をそのまま用いることも、末梢血単核球から単離したＢ細胞をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化して用いることもできる。不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を作製するには、末梢血単核球とＥＢＶをフィーダー細胞の共存下で培養し、末梢血単核球を不死化すればよく、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体に加えて、標識化抗原ペプチドを用いて、目的とする抗原特異的抗体産生ＥＢＶ−Ｂ細胞株の存在を確認することもできる。
【００１６】
本発明の方法において、患者末梢血由来の抗体又はＢ細胞と、ＳＳＴ細胞との結合を検出する方法としては、ＳＳＴ細胞膜上の抗原タンパク質と抗体との特異的な結合を検出することのできる方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、ＭＰＬを認識しうる標識化抗体及びヒト抗体を認識しうる標識化抗体を用いた２重染色により、抗体−ＳＳＴ細胞複合体又はＢ細胞−ＳＳＴ細胞を検出する方法や、蛍光物質等の標識物質をコードする遺伝子を導入することにより予めＳＳＴ細胞を標識化し、ヒト抗体を認識しうる標識化抗体による染色を組み合わせて行うことによりＳＳＴ細胞と抗体又はＢ細胞との結合を検出する方法や、予め標識化したＳＳＴ細胞とヒト抗体を認識しうる標識化抗体との共鳴による励起エネルギーの移動（ＦＲＥＴ）等の１以上の方法を利用して複合体形成を確認する方法を例として挙げることができる。
【００１７】
本発明の方法に用いる標識物質としては、公知の標識物質であれば特に制限されるものではなく、Alexa Fluor 488、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム誘導体などの化学発光物質、ビオチン、マグネットビーズを挙げることができるほか、例えば、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ等のエピトープタグを挙げることができ、これらの標識物質による標識化は常法で行うことができ、例えばMolecular Cloning, Third Edition,ColdSpringHarbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる。
【００１８】
上記方法Ｉの工程（Ｅ）「標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程」において、末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する方法としては、所定の抗原タンパク質に対する抗体タンパク質を発現するＢ細胞を標識化する方法であれば特に制限されるものではないが、標識物質により標識された抗原タンパク質を用いて標識する方法が好ましく、標識物質により標識された抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とを組み合わせて、末梢血単核球由来のＢ細胞を２重に標識する方法や、あらかじめＣＤ１９等の細胞表面特異マーカーに対する抗体を用いてＢ細胞を分離し、分離したＢ細胞に標識物質により標識された抗原タンパク質を用いてＢ細胞を標識する方法や、分離したＢ細胞に標識物質により標識された抗原タンパク質と、標識されたヒト抗体を認識しうる抗体とを組み合わせて、Ｂ細胞を２重に標識する方法がより好ましい。
【００１９】
上記方法Ｉの工程（Ｆ）「工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程」及び方法IIの工程（Ｄ）「工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程」において、抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を、１個ずつ分取するには、上記Ｂ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞の標識化に使用した標識物質の種類に応じて適切な手法が用いられる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、Ｂ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を１個ずつ分取することが好ましい。フローサイトメトリーによれば効率的かつ高精度の細胞分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用してＢ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を１個ずつ分取することができる。マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いた良好な分離が可能である。さらに、マイクロマニピュレーターやマイクロメッシュフィルターを用いてＢ細胞やＢ細胞−ＳＳＴ細胞を１個ずつ分取することもできる。
【００２０】
上記方法Ｉの工程（Ｇ）「１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程」及び方法IIの工程（Ｅ）「回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程」における、全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、逆転写反応によるｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.参照）に従って実施することができ、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とを行うことにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する。ヒト抗体重鎖領域遺伝子、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては、それぞれの領域遺伝子配列に特異的なプライマー対であれば特に制限されないが、例えば、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号１〜２４に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号２５又は２６に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号２７〜３７に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号３８に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、また、ヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号３９〜６１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号６２及び６３に示される塩基配列の１種又は２種の配列とからなるプライマー対を挙げることができる。増幅された遺伝子断片の塩基配列は常法により解析・決定することができる。
【００２１】
上記増幅された遺伝子断片を用いて、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製することができる。すなわち、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖遺伝子を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体軽鎖遺伝子を調製することができる。さらに、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。これら調製されたヒト抗体遺伝子をサブクローニングして増幅させることもできる。なお、ゲノムＤＮＡを鋳型にする場合、エクソンが離れているためいるため効果的な増幅が期待できない。
【００２２】
また、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片（重鎖断片）及びヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片（軽鎖断片）をＰＣＲ法により増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片をＰＣＲ法によりそれぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒト一本鎖抗体遺伝子（ＳｃＦｖ）断片としてＰＣＲ法により増幅する本発明者らによる方法（特願２００７−９２９６８）を用いると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく製造することができる。
【００２３】
上記増幅された遺伝子断片である、ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させ、１個のＢ細胞由来の抗体を製造することができる。発現ベクターとしては、抗体遺伝子の発現に適したものであれば特に限定されず、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology,158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクターを挙げることができる。これらのウイルスベクターには、発現効率を高めるためにプロモータ配列、エンハンサー配列などの制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへの抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
【００２４】
上記ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子は、通常、それぞれ別の発現ベクターに挿入され、これら２つの組換えベクターで宿主を共形質転換し、同一細胞内で重鎖及び軽鎖を発現させることが好ましい。上記宿主としては、組換えベクターで形質転換されることにより、導入された抗体遺伝子を発現可能な状態に保有できるものであれば特に制限されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞等を挙げることができる。組換えベクターにより宿主を形質転換する方法としては、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を例示することができる。このようにして、ハイブリドーマを用いることなく、１個のＢ細胞から、モノクローナル抗体を製造することができる。また、上記ヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターにより大腸菌を形質転換し、この形質転換大腸菌を用いてファージディスプレイヒト一本鎖抗体を作製することもできる。
【００２５】
本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法によって、がん患者の抗体遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的抗体の種類の全体像に関する情報を得ることができる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法によって、がん抗原特異的抗体を大量に得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断や治療が可能となる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法によって得られる抗体遺伝子は、がん抗原特異的抗体を大量に製造する場合に有利に用いられる他、テイラーメイド的な患者個人の診断にも利用することができる。特に、従来マウスで免疫してハイブリドーマを作製して得られていた部分的なヒトの抗体を、実際にヒトの体内で増幅した形で、１００％ヒトの抗体として獲ることができるという大きな利点がある。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
［末梢血単核球の採取と不死化Ｂ細胞株の作製］
樹状細胞ワクチン投与前及び／又は投与後のメラノーマ患者（ワクチン投与前後の同一患者を含む）から末梢血を採取し、血清及び末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell;ＰＢＭＣ)を調製した。なお、治療に使用される樹状細胞ワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、及びTyrosinaseの５種類のペプチド、又はＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１及びTyrosinaseの５種類のペプチドで処理されたものである。
【００２８】
［不死化Ｂ細胞株の作製］
採取したＰＢＭＣの一部から、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞株（EBV-transformed B cell line；以下ＥＢＶ−Ｂ細胞株という）を作製した。具体的には、フィーダーであるヒト繊維芽細胞株（ＭＲＣ−５；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＣＣＬ−１７１）を、２５ｃｍ２フラスコにて９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙまで増殖させ（培地：ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、３０−４０Ｇｙのirradiationを実施した。２４時間後、実施例１で採取したＰＢＭＣを１〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／４ｍｌとなるように培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳ）に懸濁し、上記の培養ＭＲＣ−５に加えた。その後、１ｍｌのＥＢＶ溶液（ＥＢＶ strain Ｂ９５−８、ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＶＲ−１４９２）を２５ｍｌフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の気相条件下で培養した。培養開始から４８時間後に培地を交換した後、４日ごとに培地交換を行った。３〜４週間後に、Ｂ細胞の増殖を確認し、ＥＢＶにより不死化したＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を回収した。
【００２９】
さらに、脳腫瘍, 大腸がん患者からも末梢血を採取し、同様に血清及びＢ細胞を調整する。なお、以上の臨床検体の使用に関しては、臨床研究「悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法」、「特異的ＣＴＬ誘導活性を指標としたＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４拘束性ＣＥＡエピトープペプチドの同定」および「悪性グリオーマに対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法」において静岡がんセンター倫理審査委員会にて研究の承認を受けている。
【実施例２】
【００３０】
［ライブラリー細胞］
ＡＣＴＧｅｎ社のシグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を使用したメラノーマ培養細胞由来のｃＤＮＡを網羅的に発現させたライブラリー細胞（自己増殖性Ｂａ／Ｆ３）を新たに作製する（図１及び２）。また、すでに作製済みであるヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）および大腸がん培養細胞由来のｃＤＮＡを発現するＢａ／Ｆ３細胞も抗体遺伝子のスクリーニングに提供される。
【００３１】
［血清を用いたライブラリー発現細胞のスクリーニング］
適度に希釈した患者由来の血清を１次抗体、標識マウス抗ヒトＭｏＡｂを２次抗体として使用する。同時に標識抗ＭＰＬ抗体を用いて染色を行い、ｃＤＮＡ発現細胞であることも確認する。陽性に染色された細胞を回収して、ＰＣＲクローニング法にてｃＤＮＡ配列を同定する。同定された配列を基に、組換えタンパク合成系（大腸菌またはＣＨＯ細胞）にてｃＤＮＡ由来のＧＳＴ融合タンパクを合成し、Ｂ細胞株の染色を施行する。陽性に染色されたＢ細胞をｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇし、抗体遺伝子配列を同定する（図２）。
【００３２】
［不死化または正常Ｂ細胞を用いたスクリーニング］
個々のｃＤＮＡを含むライブラリー細胞のクローンを増やし、プールしておく。同数のライブラリー細胞と不死化Ｂ細胞を混ぜて１−２時間培養を行う。ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体およびＦＩＴＣ標識抗ＭＰＬ抗体にて同時に染色を行い、二重染色にて陽性となる細胞群をソーテイングを実施する。染色された細胞を２分して抗体遺伝子およびｃＤＮＡのクローニング用に使用する（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＳＴ−ＲＥＸ(シグナルトラップシークエンス)技術の概略を示す図である。
【図２】本発明のＳＳＴ−ＲＥＸ法を用いた完全ヒト型抗体の作製方法を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）及び（Ｉ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；
（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；
（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｉ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
【請求項２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を検出・回収する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；
（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
【請求項３】
末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする請求項１又は２記載の解析・同定方法。
【請求項４】
ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする請求項１〜３記載の抗体遺伝子の解析・同定方法。
【請求項５】
がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする請求項４記載の抗体遺伝子の解析・同定方法。
【請求項６】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）及び（Ｊ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；
（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；
（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｊ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
【請求項７】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を検出・回収する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；
（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
【請求項８】
末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体を製造する方法。
【請求項９】
ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする請求項６〜８記載の抗体を製造する方法。
【請求項１０】
がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする請求項９記載の抗体を製造する方法。
【請求項１１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；
（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；
（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
【請求項１２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を検出・回収する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；
（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
【請求項１３】
末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の抗体遺伝子を調製する方法。
【請求項１４】
ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする請求項１１〜１３記載の抗体遺伝子を調製する方法。
【請求項１５】
がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする請求項１４記載の抗体遺伝子を調製する方法。
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）及び（Ｉ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；
（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；
（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｉ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
【請求項２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を検出・回収する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；
（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
【請求項３】
末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする請求項１又は２記載の解析・同定方法。
【請求項４】
ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする請求項１〜３記載の抗体遺伝子の解析・同定方法。
【請求項５】
がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする請求項４記載の抗体遺伝子の解析・同定方法。
【請求項６】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）及び（Ｊ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；
（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；
（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｊ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
【請求項７】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を検出・回収する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；
（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
【請求項８】
末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体を製造する方法。
【請求項９】
ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする請求項６〜８記載の抗体を製造する方法。
【請求項１０】
がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする請求項９記載の抗体を製造する方法。
【請求項１１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より血清及び末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された血清と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、この標識化抗体の標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、抗体−ＳＳＴ細胞複合体を検出・回収する工程；
（Ｄ）回収された抗体−ＳＳＴ細胞複合体から、ＳＳＴ細胞表面に発現する抗原タンパクの遺伝子配列を同定し、同定された遺伝子配列に基づき組換え抗原タンパク質を作製する工程；
（Ｅ）標識物質により標識された上記抗原タンパク質と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、工程（Ａ）により採取された末梢血単核球由来のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｆ）工程（Ｅ）で得られた標識化Ｂ細胞である、前記抗原タンパク質を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｇ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｈ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
【請求項１２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、担がん患者由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法。
（Ａ）がん患者から得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）採取された末梢血単核球由来のＢ細胞と、シグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法により細胞膜貫通型抗原タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを発現させた細胞（ＳＳＴ細胞）集団とを接触させ、Ｂ細胞膜上の抗体と、該抗体により認識される抗原タンパク質を発現するＳＳＴ細胞を結合させたＢ細胞−ＳＳＴ細胞群を形成させる工程；
（Ｃ）ヒト抗体を認識しうる標識化抗体と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、トロンボポエチン受容体を認識しうる標識化抗体とを用いた２重染色を行い、Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群を検出・回収する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた標識化Ｂ細胞−ＳＳＴ細胞群から１個ずつＢ細胞−ＳＳＴ細胞を分取する工程；
（Ｅ）回収されたＢ細胞−ＳＳＴ細胞からＢ細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
【請求項１３】
末梢血単核球由来のＢ細胞が、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて不死化されている不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の抗体遺伝子を調製する方法。
【請求項１４】
ＤＮＡライブラリーが、がん細胞のＤＮＡ由来であることを特徴とする請求項１１〜１３記載の抗体遺伝子を調製する方法。
【請求項１５】
がん細胞が、メラノーマ、ヒト脳腫瘍（悪性グリオーマ）又は大腸がん由来の株化培養細胞であることを特徴とする請求項１４記載の抗体遺伝子を調製する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−３５４７２（Ｐ２０１０−３５４７２Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０１３３７（Ｐ２００８−２０１３３７）
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【出願人】（３０６０３７０３４）株式会社ＡＣＴＧｅｎ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月４日（２００８．８．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【出願人】（３０６０３７０３４）株式会社ＡＣＴＧｅｎ (3)
【Ｆターム（参考）】
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