Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ５型および８型の莢膜糖の精製
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を放出させるための方法であって、前記細胞を酸で処理するステップを含む方法を提供する。本発明は、この方法を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を精製するためのプロセスもさらに提供する。例えば核酸、タンパク質および／またはペプチドグリカン混入物を除去するための酵素処理；例えば低分子量混入物を除去するためのダイアフィルトレーション；例えば残存タンパク質を除去するためのアニオン交換クロマトグラフィー；ならびに濃縮のようなその他の処理ステップが、プロセスに含まれてよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年１０月３０日に出願された米国仮出願第６１／２５６，９０５号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、細菌の莢膜多糖、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ５型および８型のもの、ならびに特にワクチンの調製に用いるためのものの精製の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
細菌の莢膜糖は、莢膜細菌（ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するワクチンにおいて長年用いられている。しかし、糖類は、Ｔ非依存性抗原であるので、これらは免疫原性に乏しい。担体へのコンジュゲーションは、Ｔ非依存性抗原をＴ依存性抗原に変換でき、このことにより記憶応答が増進され、防御免疫が発達することが可能になる。最も効果的な糖ワクチンは、よって、複合糖質に基づき、原型のコンジュゲートワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するものであった［例えばｒｅｆ．９６の第１４章を参照されたい］。
【０００４】
それに対するコンジュゲートワクチンが記載されている別の細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。様々な多糖が、複合糖質で用いるためにＳ．ａｕｒｅｕｓから単離されている。特に対象となる２つの多糖は、５型および８型莢膜多糖である。ヒトＳ．ａｕｒｅｕｓ株のおよそ６０％が８型であり、およそ３０％が５型である。５型および８型コンジュゲートに対する研究の多くはＦａｔｔｏｍらにより行われ、参考文献１〜９のような文書に記載されている。
【０００５】
多糖ベースワクチンについての開始点は多糖自体であり、これは、通常、標的細菌から精製される。Ｆａｔｔｏｍらは、５型および８型莢膜多糖の精製のための複雑なプロセスを開発し、これは、参考文献１に詳細に記載されており、細菌培養の後に以下の鍵となるステップを含む：緩衝液中での細菌細胞の懸濁、リソスタフィンでの処理、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼでの処理、遠心分離、緩衝液に対する透析、プロテアーゼでの処理、さらなる透析、ろ過、混入物を沈殿させるための塩化カルシウムと一緒に２５％までのエタノールの添加、多糖を沈殿させるための７５％までのエタノールのさらなる添加、沈殿物の回収および乾燥、アニオン交換クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィー、透析ならびに最後の凍結乾燥。
【０００６】
Ｆａｔｔｏｍプロセスは、細菌細胞壁を溶解し、そのことにより莢膜多糖を放出させるためにリソスタフィンの使用を含む。しかし、このステップは時間がかかり、プロセスを工業的な設定までスケールアップすることを困難にする。これは、プロセスの全体的な費用および複雑さも増加させる。他の研究者らは、このステップを省き、より単純でより効率的な多糖精製方法を開発することを試みている。例えば、参考文献［１０］は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞のオートクレーブ処理、多糖含有上清の限外ろ過、濃縮、凍結乾燥、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理、さらなる限外ろ過、ダイアフィルトレーション、高性能サイズ排除液体クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥を含む代替プロセスについて記載している。著者らは、この方法が良好な収率をもたらし、多糖の大規模生成に適切であることを示唆している。この方法では、リソスタフィン処理は、莢膜多糖を放出させるためのオートクレーブ処理で置き換えられている。この方法は、参考文献［１１］でさらに進展した。これらの代替法で重要なステップは、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理である。このステップは、莢膜多糖のテイコ酸混入を除去するために行われる。しかし、再度、このステップは、プロセスの持続期間、複雑さおよび全体的な費用を増加させる。参考文献［１２］は、これもまた、莢膜多糖を放出させるためのオートクレーブ処理と、テイコ酸を除去するためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理とを含む同様のプロセスを記載している。対照的に、他のグループのほとんどは、リソスタフィン処理を保持し（例えば参考文献１３、参考文献１４（特許文献１）、参考文献１５（特許文献２）、参考文献１６（特許文献３）、参考文献１７（特許文献４）および参考文献１８（特許文献５）を参照されたい）、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理を時に含む（例えば参考文献１３および参考文献１４（特許文献１）において）プロセスを用いている。
【０００７】
上記の方法は複雑であり、得られる多糖に混入を残すことがある。よって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を精製するためのさらなる改善されたプロセス、特により少ない混入をもたらすあまり複雑でないプロセスが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０８０４９０号
【特許文献２】国際公開第２００６／０３２４７５号
【特許文献３】国際公開第２００６／０３２５００号
【特許文献４】国際公開第２００６／０６５５５３号
【特許文献５】国際公開第２００６／１１４５００号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、多糖が、細菌細胞から、酸での処理により初期に放出される精製プロセスに基づく。このステップは、リソスタフィン処理の必要性を除き、上記のプロセスと同様にオートクレーブ処理の代替として用いることができる。本発明者らは、このプロセスが、テイコ酸混入が低い精製多糖をもたらすことを見出した。このことは、多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理する必要がないことを意味する。この精製多糖は、ペプチドグリカン混入も低く、このことにより、それは医療への使用のために特に適切になる。本発明者らのプロセスは、迅速で単純になることができる。なぜなら、以前のプロセスにおける面倒なステップが必要ないからである。
【００１０】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を放出させるための方法であって、前記細胞を酸で処理するステップを含む方法を提供する。本発明は、この方法を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を精製するためのプロセスもさらに提供する。例えば核酸、タンパク質および／またはペプチドグリカン混入物を除去するための酵素処理、例えば低分子量混入物を除去するためのダイアフィルトレーション、例えば残存タンパク質を除去するためのアニオン交換クロマトグラフィーならびに濃縮のようなその他の処理ステップが、プロセスに含まれてよい。
【００１１】
したがって、本発明は、多糖を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から、前記細胞を酸で処理することにより放出させるステップを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスを提供する。同様に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスにおいて、細胞から多糖を放出させるためのＳ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞の酸処理の使用からなる改善を提供する。酸処理による放出は、多糖を放出させるためのリソスタフィン処理またはオートクレーブ処理の必要性を除く。
【００１２】
本発明は、リソスタフィン処理のステップを含まない、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスも提供する。同様に、本発明は、メタ過ヨウ素酸ナトリウム処理のステップを含まない、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスを提供する。典型的には、プロセスは、これらのステップの一方または両方を含まない。
【００１３】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、多糖と、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％など）のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入とを含む組成物を提供するプロセスも提供する。典型的に、組成物は、４重量％未満、特に３重量％未満のペプチドグリカンを含む。本発明者らは、本発明の方法を用いて、約２％または約１％のレベルさえ得ることができることを見出した。本発明者らは、このレベルのペプチドグリカンを有する組成物は、ワクチン製造において有用であることを見出した。対照的に、参考文献１７は、５％を上回るレベルをこの目的のために用いるべきであることを教示している。ペプチドグリカン混入のレベルは、本明細書で記載する方法を用いて測定できる。
【００１４】
同様に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、多糖と、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％など）のタンパク質であるレベルのタンパク質混入とを含む組成物を提供するプロセスを提供する。典型的に、組成物は、３重量％未満、特に約２．４重量％のタンパク質を含む。タンパク質混入のレベルは、ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定できる。
【００１５】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、多糖と、多糖の全重量に対して１重量％未満（例えば≦０．７５％、≦０．５０％、≦０．２５％、≦０．１０％、≦０．０１％など）の核酸であるレベルの核酸混入とを含む組成物を提供するプロセスも提供する。典型的に、組成物は、０．２５重量％未満、特に約０．０９重量％の核酸を含む。核酸混入のレベルは、分光光度計における２６０ｎｍでの吸収により測定できる。
【００１６】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスも提供し、ここで（ａ）ペプチドグリカン酸混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｂ）タンパク質混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｃ）核酸混入のレベルが１％未満（上記のとおり）である。
【００１７】
本発明は、本発明のプロセスのいずれかにより得ることができる、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物も提供する。
【００１８】
特に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％など）のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入を含む組成物を提供する。典型的に、組成物は、３重量％未満、特に２重量％未満のペプチドグリカンを含む。約２％または約１％のレベルさえ有する組成物が、本発明により具体的に提供される。
【００１９】
同様に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％など）のタンパク質であるレベルのタンパク質混入を含む組成物を提供する。典型的に、組成物は、３重量％未満、特に約２．４重量％のタンパク質を含む。
【００２０】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、多糖の全重量に対して１重量％未満（例えば≦０．７５％、≦０．５０％、≦０．２５％、≦０．１０％、≦０．０１％など）の核酸であるレベルの核酸混入を含む組成物も提供する。典型的に、組成物は、０．２５重量％未満、特に約０．０９重量％の核酸を含む。
【００２１】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、ａ）ペプチドグリカン酸混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｂ）タンパク質混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｃ）核酸混入のレベルが１％未満（上記のとおり）である組成物も提供する。
【００２２】
莢膜多糖
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型の莢膜多糖に基づく。５型および８型莢膜多糖の構造は、参考文献１９および２０に：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（３ＯＡｃ）−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
のように記載された。
【００２３】
最近のＮＭＲ分光法データ［２１］は、これらの構造を：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３ＯＡｃ）−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ（１→
のように改訂している。
【００２４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から放出された後に、多糖は、天然で見出される莢膜多糖と比較して化学的に改変されることがある。例えば、多糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的または完全に）、脱Ｎ−アセチル化（部分的または完全に）、Ｎ−プロピオン化（Ｎ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的または完全に）などされることがある。脱アセチル化は、その他の処理ステップの前、処理ステップ中または処理ステップの後に行ってもよいが、典型的に、任意のコンジュゲーションステップの前に行う。具体的な多糖に依存して、脱アセチル化は、免疫原性に影響することがあるかまたは影響しないことがあり、例えばＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）ワクチンは脱Ｏ−アセチル化多糖を用いる一方、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）はアセチル化されているが、これらのワクチンはともに有効である。脱アセチル化などの効果は、日常的なアッセイにより評価できる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖に対するＯ−アセチル化に関して、参考文献６で議論される。天然の多糖は、この文書において７５％がＯ−アセチル化されていると言われている。これらの多糖は、多糖主鎖およびＯ−アセチル基の両方に対する抗体を誘導した。０％のＯ−アセチル化を有する多糖は、多糖主鎖に対する抗体を依然として誘発した。両方のタイプの抗体は、それらのＯ−アセチル含量が変動しているＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対してオプソニン性であった。したがって、本発明で用いる５型または８型莢膜多糖は、０から１００％までの間のＯ−アセチル化を有してよい。例えば、５型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０％〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であってよい。代わりに、０％Ｏ−アセチル化５型莢膜多糖を用いてよい。同様に、８型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０％〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であってよい。代わりに、０％Ｏ−アセチル化８型莢膜多糖を用いてよい。一実施形態では、５型および８型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０％〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であってよい。他の実施形態では、０％Ｏ−アセチル化５型および８型莢膜多糖が用いられる。本発明で用いる５型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であってよい。典型的に、５型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、１００％である。同様に、本発明で用いる８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であってよい。典型的に、８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、１００％である。一実施形態では、５型および８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であってよい。典型的に、５型および８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、１００％である。
【００２５】
多糖のＯ−アセチル化の程度は、当該技術において公知の任意の方法、例えばプロトンＮＭＲ（例えば参考文献２２、２３、２４または２５に記載されるとおり）により決定できる。さらなる方法は、参考文献２６に記載されている。同様の方法を用いて、多糖のＮ−アセチル化の程度を決定してよい。Ｏ−アセチル基は、加水分解により、例えば、無水ヒドラジン［２７］またはＮａＯＨ［６］のような塩基での処理により除去できる。同様の方法を用いて、Ｎ−アセチル基を除去してよい。５型および／または８型莢膜多糖上の高いレベルのＯ−アセチル化を維持するために、Ｏ−アセチル基の加水分解を導く処理、例えば極端なｐＨでの処理は最小限にする。
【００２６】
出発物質
本発明のプロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞を用いて開始する。典型的に、細胞は、発酵により成長した後に莢膜多糖を放出する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞を培養する適切な方法は、当業者に周知であり、例えば参考文献１〜２１およびそこで引用される参考文献に開示される。細胞成長の後に、細胞は、通常、不活性化される。不活性化のための適切な方法は、例えば参考文献１に記載されるようなフェノール：エタノールでの処理である。
【００２７】
細胞は、莢膜多糖の放出前に遠心分離してよい。プロセスは、よって、湿潤細胞ペーストの形の細胞を用いて開始してよい。典型的には、しかし、細胞は、プロセスの次のステップに適切な水性媒体、例えば緩衝液または蒸留水中に再懸濁される。細胞は、再懸濁の前にこの媒体で洗浄してよい。別の実施形態では、細胞は、それらの元の培養培地中に懸濁して処理してよい。代わりに、細胞は、乾燥された形で処理される。
【００２８】
酸処理
本発明の方法では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞を酸で処理する。このステップは、細胞からの莢膜多糖の放出をもたらす。対照的に、以前の方法は、多糖を放出させるためにリソスタフィン処理またはオートクレーブ処理を用いていた。本発明の酸処理は、多糖に対する損傷を最小限にするために、穏やかな酸、例えば酢酸を用いて行うことが好ましい。当業者は、多糖の放出のための適切な酸および（例えば濃度、温度および／または時間の）条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、蒸留水中に約０．５ｍｇ／ｍｌにて懸濁された細胞を、１％酢酸（ｖ／ｖ）で１００℃にて２時間処理することが適切であることを見出した。その他の酸、例えばトリフルオロ酢酸またはその他の有機酸での処理も適切であり得る。
【００２９】
異なる酸処理の効力は、日常的な方法を用いて試験してよい。例えば、酸処理の後に、細胞を単離し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖放出の公知の方法（例えば参考文献１のリソスタフィンベースの方法）を用いて処理して、追加の莢膜多糖が放出され得るかを見ることができる。追加の莢膜多糖が放出されるならば、酸処理中により大きい割合の莢膜糖が放出されるように、酸処理条件を変更してよい。この方法で、最適量の莢膜糖が放出されるように酸処理条件を最適化することが可能である。例えば、本発明者らは、蒸留水中に約０．５ｍｇ／ｍｌにて懸濁された細胞を１％酢酸（ｖ／ｖ）で１００℃にて２時間処理した後に、その後のリソスタフィン処理によりほとんど追加の莢膜糖が細胞から放出され得ないことを見出した。
【００３０】
本発明者らは、酸処理の後に、５型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％の間であり得ることを見出した。特に、Ｏ−アセチル化の程度は、６５〜９５％、特に７０〜９０％の間であり得る。典型的に、Ｏ−アセチル化の程度は、７５〜８５％の間、例えば約８０％である。同様の値を８型莢膜糖について得ることができる。所望により、莢膜糖のＯ−アセチル化の程度は、上で論じたさらなる処理ステップにより、次いで、変更してよい。
【００３１】
酸処理の後に、反応混合物は、典型的に中和される。このことは、塩基、例えばＮａＯＨを加えることにより達成してよい。細胞は遠心分離し、多糖含有上清を、貯蔵および／または追加の処理のために回収してよい。
【００３２】
酵素処理
酸処理の後に得られる多糖は、純粋でなく、細菌の核酸およびタンパク質が混入していることがある。これらの混入物は、酵素処理により除去できる。例えば、ＲＮＡはＲＮアーゼでの、ＤＮＡはＤＮアーゼでの、そしてタンパク質はプロテアーゼ（例えばプロナーゼ）での処理により除去できる。当業者は、混入物の除去のための適切な酵素および条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、多糖含有上清を、各５０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼおよびＲＮアーゼで、３７℃にて６〜８時間処理することが適切であることを見出した。その他の適切な条件は、文献、例えば参考文献１に開示されている。
【００３３】
酸処理の後に得られる多糖は、ペプチドグリカンもまたは代わりにペプチドグリカンが混入していることがある。この混入物も、酵素処理により除去できる。本発明者らは、ムタノリシンでの処理が、ペプチドグリカン混入を除去するのに有効であることを見出した。当業者は、ムタノリシンを用いてペプチドグリカンを除去するための適切な条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、多糖含有上清を、各１８０Ｕ／ｍｌのムタノリシンで、３７℃にて１６時間処理することが適切であることを見出した。処理の後に、懸濁物を遠心分離により清澄化し、多糖含有上清を、貯蔵および／または追加の処理のために回収してよい。
【００３４】
ダイアフィルトレーション
本発明のプロセスは、ダイアフィルトレーションのステップを含んでよい。このステップは、典型的には、上で論じた酸処理および／または酵素処理の後に行われる。本発明者らは、特にタンジェンシャルフローろ過によるダイアフィルトレーションステップが、多糖から不純物を除去するために特に有効であることを見出した。不純物は、典型的には、テイコ酸および／またはペプチドグリカンの断片のような低分子量混入物である。タンジェンシャルフローろ過は、１Ｍ ＮａＣｌ（例えば約１０容量に対して）、および次いでＮａＰｉ １０ｍＭ ｐＨ７．２緩衝液（例えば別の１０容量に対して）に対して適切に行われる。ろ過膜は、よって、莢膜多糖を保持しながら小分子量混入物の通過を可能にするものであるべきである。１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲のカットオフが典型的である。本発明者らは、３０ｋＤａカットオフ膜を用いるタンジェンシャルフローろ過が、大規模プロセスのために特に適切であることを見出した。
【００３５】
少なくとも５サイクル、例えば６、７、８、９、１０、１１またはそれより多いタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションを、通常行う。
【００３６】
ダイアフィルトレーションからの多糖含有保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、貯蔵および／または追加の処理のために回収する。
【００３７】
アニオン交換クロマトグラフィー
多糖は、アニオン交換クロマトグラフィーのステップによりさらに精製してよい。本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーが、多糖の良好な収率を維持しながら残存タンパク質および核酸の混入を除去するのに特に有効であることを見出した。
【００３８】
アニオン交換クロマトグラフィーステップは、上で論じた酸処理、酵素処理および／またはダイアフィルトレーションステップの後に行ってよい。
【００３９】
アニオン交換クロマトグラフィーは、任意の適切なアニオン交換マトリクスを用いて行ってよい。一般的に用いられるアニオン交換マトリクスは、Ｑ−樹脂（第４級アミンに基づく）およびＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエタンに基づく）のような樹脂である。本発明者らは、ＤＥＡＥ樹脂（例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が特に適切であることを見出したが、その他の樹脂も用い得る。
【００４０】
アニオン交換クロマトグラフィーのための適当な開始緩衝液および移動相緩衝液も、過度の負担なく日常的な実験により決定できる。アニオン交換クロマトグラフィーで用いるための典型的な緩衝液は、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ−ヒスチジン、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペリジン、塩化ナトリウムおよびリン酸塩の緩衝液を含む。本発明者らは、リン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液が、アニオン交換クロマトグラフィーのための開始緩衝液として適切であることを見出した。緩衝液は、任意の適切な濃度であってよい。例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウムが適切であると見出された。アニオン交換樹脂と結合する物質は、適切な緩衝液を用いて溶出できる。本発明者らは、ＮａＣｌ １Ｍの勾配が適切であることを見出した。
【００４１】
多糖を含有する溶離液画分は、２１５ｎｍにてＵＶ吸収を測定することにより決定できる。多糖を含有する画分は、貯蔵および／または追加の処理のために回収され、通常一緒に併せられる。
【００４２】
アニオン交換クロマトグラフィーステップは、例えば１、２、３、４または５回繰り返してよい。典型的に、アニオン交換クロマトグラフィーステップは、１回行われる。
【００４３】
ゲルろ過
本発明のプロセスは、ゲルろ過の１またはそれより多いステップ（複数可）を含み得る。このゲルろ過は、特定の長さの多糖分子を選択し、特にタンパク質による混入をさらに低減するために用いる。しかし、本発明者らは、参考文献１〜９のもののような以前の方法とは対照的に、ゲルろ過ステップが、高純度の多糖を得るために要求されないことを見出した。したがって、このステップは、本発明のプロセスから省いてよい。このステップを省くことは、プロセスを単純化し、全体的な費用を低減するので、有利である。
【００４４】
存在する場合、ゲルろ過ステップ（複数可）は、上で論じた酸処理、酵素処理、ダイアフィルトレーションおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーステップの後に行ってよい。典型的に、いずれのゲルろ過ステップ（複数可）も、上で論じたアニオン交換クロマトグラフィーステップの後に行う。
【００４５】
ゲルろ過ステップ（複数可）は、任意の適切なゲルろ過マトリクスを用いて行ってよい。一般的に用いられるゲルろ過マトリクスは、デキストランゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリアクリロイルモルホリンゲルおよびポリスチレンゲルなどに基づく。架橋デキストランゲルおよび混合ポリアクリルアミド／アガロースゲルも用いてよい。本発明者らは、デキストランゲル（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ３００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が特に適切であることを見出したが、その他のゲルも用い得る。
【００４６】
ゲルろ過のための適当な移動相緩衝液は、過度の負担なく日常的な実験により決定できる。ゲルろ過で用いるための典型的な緩衝液は、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ−ヒスチジン、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペリジン、塩化ナトリウムおよびリン酸塩の緩衝液を含む。例えば、塩化ナトリウム緩衝液が適切であり得る。緩衝液は、任意の適切な濃度であってよい。例えば５０ｍＭ塩化ナトリウムを移動相のために用いてよい。
【００４７】
多糖を含有する溶離液画分は、２１５ｎｍにてＵＶ吸収を測定することにより決定できる。多糖を含有する画分は、貯蔵および／または追加の処理のために回収され、通常一緒に併せられる。
【００４８】
濃縮
ゲルろ過の１もしくは複数のステップ（複数可）に加えてまたはその代わりに、本発明のプロセスは、多糖を濃縮する１またはそれより多いステップを含んでよい。この濃縮は、以下に記載するような担体分子への多糖の任意の後続のコンジュゲーションのための正確な濃度の試料を得るために有用である。しかし、本発明者らは、この濃縮ステップが、高純度の多糖を得るために要求されないことを見出した。したがって、このステップは、本発明のプロセスから省いてよい。
【００４９】
存在する場合、濃縮ステップ（複数可）は、上で論じた酸処理、酵素処理、ダイアフィルトレーション、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過ステップの後に行ってよい。典型的に、いずれの濃縮ステップ（複数可）も、上で論じたアニオン交換クロマトグラフィーステップの後に行う。上で論じたゲルろ過ステップ（複数可）に加えて用いるならば、濃縮ステップ（複数可）は、上で論じたゲルろ過ステップ（複数可）の前または後に行ってよい。しかし、典型的には、濃縮ステップ（複数可）は、ゲルろ過ステップ（複数可）の代わりに用いる。
【００５０】
濃縮ステップ（複数可）は、任意の適切な方法により行ってよい。例えば、本発明者らは、濃縮ステップ（複数可）が、上記のダイアフィルトレーションステップ（複数可）、例えば３０ｋＤａカットオフ膜を用いるタンジェンシャルフローろ過であってよいことを見出した。例えば、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（商標）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）３０ｋＤａカットオフ膜（２００ｃｍ２膜面積を有する）を用いてよい。
【００５１】
濃縮多糖試料を、貯蔵および／または追加の処理のために回収する。
【００５２】
莢膜多糖のさらなる処理
精製の後に、多糖は、混入物を除去するためにさらに処理してよい。これは、わずかな混入さえ許容できない（例えばヒトワクチン生成のため）状況において特に重要である。
【００５３】
精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖の分子質量は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なもののような［２８］プルラン標準物質に対するゲルろ過により測定できる。典型的に、精製多糖は、ある範囲内の値の質量を有する多糖の混合物である。５型莢膜多糖について、精製多糖の分子質量は、典型的に、２〜３５００ｋＤａの間、例えば１０〜２０００ｋＤａの間、特に２０〜１０００ｋＤａの間、より特に１００〜６００ｋＤａの間である。同様に、８型莢膜多糖について、精製多糖の分子質量は、２〜３５００ｋＤａの間、例えば１０〜２０００ｋＤａの間、特に２０〜１０００ｋＤａの間、より特に１００〜６００ｋＤａの間であってよい。
【００５４】
精製多糖は、解重合してオリゴ糖を形成してよい。オリゴ糖は、ワクチンにおいて用いるために好ましいことがある。オリゴ糖への解重合は、上記の任意のステップの前または後に生じてよい。典型的に、解重合は、上記のアニオン交換クロマトグラフィーの後に起こる。多糖がこのクロマトグラフィーの後に濃縮されるならば、解重合は、典型的に、この濃縮の後に起こる。本発明の組成物が解重合された多糖を含む場合、解重合は、任意のコンジュゲーションに先行することが好ましい。
【００５５】
全長多糖は、様々な方法により解重合して、本発明で用いるためのより短い断片を得てよい。好ましくは、参考文献２９に記載される方法を用いる。代わりに、多糖の解重合のためのその他の方法を用いてよい。例えば、多糖を加熱するかまたは顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）［３０］もしくは音波照射（ｓｏｎｉｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）［３］に供してよい。代わりに、酸化−還元［３１］またはオゾン分解［３２］による解重合を用いてよい。
【００５６】
オリゴ糖は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより同定できる。生成物を、長さが短いオリゴ糖を除去するために分類（ｓｉｚｅ）してよい。このことは、ゲルろ過のような様々な方法で達成できる。比分子質量（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ）は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なもののような［３３］プルラン標準物質に対するゲルろ過により測定できる。
【００５７】
天然莢膜多糖中のＮ−アセチル基が脱Ｎ−アセチル化されているならば、本発明のプロセスは、再Ｎ−アセチル化のステップを含んでよい。制御された再Ｎ−アセチル化は、例えば５％重炭酸アンモニウム中の無水酢酸（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏのような試薬を用いて簡便に行うことができる［３４］。
【００５８】
さらなる回のろ過、例えば滅菌ろ過も行うことができる。
【００５９】
これらの追加のステップは、一般的に、室温で行うことができる。
【００６０】
貯蔵
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖調製物は、精製プロセス中の任意の段階での貯蔵のために、例えば真空下での凍結乾燥または溶液中での凍結（例えば、含まれるならば最終濃縮ステップからの溶離液として）により凍結乾燥してよい。したがって、調製物は、プロセスのあるステップから別のステップへすぐに移す必要がない。例えば、多糖調製物をダイアフィルトレーションにより精製する場合、これは、この精製の前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。同様に、多糖は、アニオン交換クロマトグラフィーステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。多糖調製物がゲルろ過により精製されるならば、これは、このステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。同様に、多糖調製物が濃縮されるならば、これは、このステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。凍結乾燥調製物は、適当な溶液中で、さらなる処理の前に再構成される。同様に、凍結溶液は、さらなる処理の前に解凍される。
【００６１】
本発明のプロセスにより得られる精製多糖は、任意の適切な方法で貯蔵のために処理してよい。例えば、多糖は、上記のように凍結乾燥してよい。代わりに、多糖は、水溶液中で、典型的には低温、例えば−２０℃にて貯蔵してよい。簡便には、多糖は、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過または濃縮ステップからの溶離液として貯蔵してよい。
【００６２】
コンジュゲーション
本発明の最終的な精製莢膜多糖は、さらなる改変なしで、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイで用いるため、免疫化で用いるためなどの抗原として用いることができる。
【００６３】
免疫化の目的のために、しかし、多糖を、タンパク質のような担体分子にコンジュゲートすることが好ましい。一般的に、担体に多糖を共有結合的にコンジュゲーションすることは、多糖の免疫原性を増進する。なぜなら、このことにより、多糖がＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換し、よって、免疫学的な記憶のために初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）することが可能になるからである。コンジュゲーションは、小児科ワクチン［例えばｒｅｆ．３５］のために特に有用であり、周知の技術である［例えばｒｅｆ．３６〜４４において概説されている］。よって、本発明のプロセスは、精製多糖を担体分子にコンジュゲートするさらなるステップを含み得る。
【００６４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖のコンジュゲーションは、広く報告されており、例えば参考文献１〜９を参照されたい。コンジュゲーションのための文献で用いられている典型的なプロセスは、シスタミンを用いる精製多糖のチオール化を含む。この反応は、莢膜多糖中のカルボキシレート基の存在に依存する。これらの基は、シスタミンと、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣの存在下で反応する。誘導体化された多糖は、次いで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ内毒素Ａ（ＥＴＡ）のような担体タンパク質に、典型的にはリンカーを介してコンジュゲートする［２］。この様式で調製されるコンジュゲートワクチンは、ヒトにおいて安全で免疫原性であることが示されている［５］。他の研究者らは、還元的アミノ化［４５および１２］；グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｄｅｈｙｄｅ）カップリング［４５］；または多糖上のヒドロキシル基とＣＤＡＰ［４６］もしくは三塩化シアヌル［１１］のようなシアニル化剤との反応による精製５型および８型莢膜多糖のコンジュゲーションを行った。好ましくは、参考文献２９に記載されるプロセスを用いる。
【００６５】
好ましい担体タンパク質は、ジフテリアもしくは破傷風毒素のような細菌毒素、またはそのトキソイドもしくは変異体である。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［４７］が適切であることを見出した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＴＡ）およびその非毒性変異体組換えエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖のための担体タンパク質として用いられている（［１］および［２］）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓα−ヘモリシン（α−毒素）（［４５］および［４８］）、オボアルブミン［１１］およびヒト血清アルブミン［１２］も用いられている。これらの担体は、本発明で用いてよい。
【００６６】
その他の適切な担体タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［４９］、合成ペプチド［５０、５１］、熱ショックタンパク質［５２、５３］、百日咳タンパク質［５４、５５］、サイトカイン［５６］、リンホカイン［５６］、ホルモン［５６］、増殖因子［５６］、ヒト血清アルブミン（典型的には組換え）、Ｎ１９［５８］などのような様々な病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［５７］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのタンパク質Ｄ［５９〜６１］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［６２］、ニューモリシン［６３］もしくはその非毒性誘導体［６４］、鉄取り込みタンパク質［６５］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの毒素ＡもしくはＢ［６６］、ＧＢＳタンパク質［６７］、ＧＡＳタンパク質［６８］を含む。
【００６７】
その他の適切な担体タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原、例えば以下に示すＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原を含む。
【００６８】
担体との付着は、好ましくは、例えば担体タンパク質のリシン残基またはアルギニン残基の側鎖中の−ＮＨ２基を介する。付着は、例えばシステイン残基の側鎖中の−ＳＨ基を介してもよい。
【００６９】
例えば担体抑制（ｃａｒｒｉｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）の危険性を低減するために、１より多い担体タンパク質を用いることができる。つまり、異なる担体タンパク質を、５型および８型莢膜多糖のために用いることができ、例えば５型多糖をＣＲＭ１９７にコンジュゲートし、８型多糖をｒＥＰＡにコンジュゲートする。特定の多糖抗原について１より多い担体タンパク質を用いることもでき、例えば５型多糖が２つの群にあり、一方の群がＣＲＭ１９７にコンジュゲートし、他方がｒＥＰＡにコンジュゲートする。典型的には、しかし、同じ担体タンパク質を全ての多糖について用いる。
【００７０】
単一の担体タンパク質は、１より多い多糖抗原を持つことがある［６９、７０］。例えば単一の担体タンパク質は、５型および８型莢膜多糖にコンジュゲートされることがある。この目的を達成するために、異なる多糖を、コンジュゲーションプロセスの前に混合できる。典型的には、しかし、各多糖について別々のコンジュゲートがあり、異なる多糖はコンジュゲーションの後に混合される。別々のコンジュゲートは、同じ担体に基づいてよい。
【００７１】
１：２０（すなわち過剰のタンパク質）から２０：１（すなわち過剰の多糖）までの間の多糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）を有するコンジュゲートを、典型的に用いる。１：１０〜１：１の比、特に１：５から１：２までの間の比が好ましく、最も好ましくは約１：３である。対照的に、文献において用いられる５型および８型莢膜多糖コンジュゲートは、より高い比、例えば参考文献１、２および３における０．７３から１．０８までの間を有する傾向にある。本発明の特定の実施形態では、５型莢膜多糖コンジュゲートについての多糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、１：１０から１：２までの間であり、かつ／または８型莢膜多糖コンジュゲートについての多糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、１：５から７：１０までの間である。
【００７２】
コンジュゲートは、遊離担体とともに用いてよい［７１］。所定の担体タンパク質が、本発明の組成物において遊離およびコンジュゲートの形の両方で存在する場合、コンジュゲートしていない形は、好ましくは、組成物における全体としての担体タンパク質の合計量の５％以下であり、より好ましくは２重量％未満で存在する。
【００７３】
コンジュゲーションの後に、遊離多糖とコンジュゲート多糖とを分離できる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外ろ過、ダイアフィルトレーションなどを含む多くの適切な方法がある［ｒｅｆ．７２および７３なども参照されたい］。
【００７４】
コンジュゲートとその他の抗原との組み合わせ
本発明の方法により調製された多糖（特に上記のコンジュゲーションの後）は、例えば互いにおよび／またはその他の抗原と混合できる。よって、本発明のプロセスは、多糖を、１またはそれより多いさらなる抗原と混合するさらなるステップを含み得る。本発明は、よって、本発明の方法により調製された多糖と、１またはそれより多いさらなる抗原とを含む組成物を提供する。組成物は、典型的に、免疫原性組成物である。
【００７５】
さらなる抗原（複数可）は、本発明の方法により調製されたさらなる多糖を含んでよく、よって、本発明は、本発明の１より多い多糖を含む組成物を提供する。特に、本発明は、本発明の５型莢膜多糖と、本発明の８型莢膜多糖とを含む組成物を提供する。代わりに、さらなる抗原（複数可）は、本発明のもの以外の方法、例えば上記の参考文献１〜１８の方法により調製された５型または８型莢膜多糖であってよい。したがって、本発明は、５型莢膜多糖と８型莢膜多糖とを含む組成物であって、多糖の一方（５型多糖または８型多糖）が本発明の多糖であり、他方の多糖が本発明の多糖でない組成物を提供する。
【００７６】
複数の異なるＳ．ａｕｒｅｕｓコンジュゲートを混合する場合、これらは、同じＳ．ａｕｒｅｕｓ血清型からの異なるタイプのコンジュゲートおよび／または異なるＳ．ａｕｒｅｕｓ血清型からのコンジュゲートを含み得る。例えば、コンジュゲートは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型からであってよい。組成物は、別々のコンジュゲートを調製し（例えば各血清型について異なるコンジュゲート）、次いで、コンジュゲートを組み合わせることにより生成される。
【００７７】
さらなる抗原（複数可）は、以下に示す糖およびタンパク質抗原を含むその他のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を含んでよい。
【００７８】
さらなる抗原（複数可）は、非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体からの抗原を含んでよい。よって、本発明の組成物は、追加の細菌抗原、ウイルス抗原もしくは寄生生物抗原を含む１またはそれより多い非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原をさらに含んでよい。これらは、以下から選択してよい：
− ｒｅｆ．７４〜８０におけるもののようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂからのタンパク質抗原、タンパク質「２８７」（以下を参照されたい）および誘導体（例えば「ΔＧ２８７」）が特に好ましい。
− ｒｅｆ．８１、８２、８３、８４などに開示されるもののようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂからの外膜小胞（ＯＭＶ）調製物。
− 血清群Ｃからのｒｅｆ．８５に開示されるオリゴ糖またはｒｅｆ．８６のオリゴ糖のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの糖抗原。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原［例えばｒｅｆ．８７〜８９；ｒｅｆ．９６の第２２および２３章］。
− 不活化ウイルス［例えば９０、９１；ｒｅｆ．９６の第１５章］のようなＡ型肝炎ウイルスからの抗原。
− 表面および／またはコア抗原［例えば９１、９２；ｒｅｆ．９６の第１６章］のようなＢ型肝炎ウイルスからの抗原。
− Ｃ型肝炎ウイルスからの抗原［例えば９３］。
− パータクチンならびに／または凝集原２および３とも場合によって組み合わされた［例えばｒｅｆ．９４および９５；ｒｅｆ．９６の第２１章］Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）のようなＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの抗原。
− ジフテリアトキソイド［例えばｒｅｆ．９６の第１３章］のようなジフテリア抗原。
− 破傷風トキソイド［例えばｒｅｆ．９６の第２７章］のような破傷風抗原。
− Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂからの糖抗原［例えばｒｅｆ．９６の第１４章］。
− Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの抗原［例えば７４、７５、７６］。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの抗原［例えば９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３］。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓからの抗原［例えば１０４］。
− Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからの抗原［例えば１０５］。
− ＩＰＶのようなポリオ抗原（複数可）［例えば１０６、１０７；ｒｅｆ．９６の第２４章］。
− 凍結乾燥不活化ウイルス［例えば１０９、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］のような狂犬病抗原（複数可）［例えば１０８］。
− 麻疹、耳下腺炎および／または風疹抗原［例えばｒｅｆ．９６の第１９、２０および２６章］。
− ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原（複数可）［例えばｒｅｆ．９６の第１７および１８章］。
− Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからの抗原［例えば１１０］。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）からの抗原［例えば１１１、１１２、１１３］。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からの抗原［例えば６８、１１４〜１１６］。
− Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの抗原［例えばｒｅｆ．１１７、１１８および１１９に記載されるようなＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株およびＳＥ−１０株から得ることができるＩ、ＩＩおよび／またはＩＩＩ型莢膜多糖］。
【００７９】
糖または炭水化物抗原を用いる場合、これは、免疫原性を増進するために、担体にコンジュゲートするのが好ましい。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、髄膜炎菌および肺炎球菌の糖抗原のコンジュゲーションは、周知である。
【００８０】
毒性タンパク質抗原は、必要であれば解毒化してよい（例えば、化学的および／または遺伝子的手段による百日咳毒素の解毒化［９５］）。
【００８１】
ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も含むことが好ましい。
【００８２】
抗原は、アルミニウム塩に吸着されてよい。
【００８３】
１つのタイプの好ましい組成物は、免疫無防備状態に影響するさらなる抗原を含み、よって、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ多糖は、以下の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体からの１またはそれより多い抗原と組み合わせることができる：Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、インフルエンザウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびパラインフルエンザウイルス。
【００８４】
別のタイプの好ましい組成物は、院内感染と関連する細菌からのさらなる抗原を含み、よって、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ多糖は、以下の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体からの１またはそれより多い抗原と組み合わせることができる：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよび腸外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。
【００８５】
組成物中の抗原は、典型的に、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分である。
【００８６】
本発明の組成物においてタンパク質抗原を用いる代わりに、抗原をコードする核酸を用いてよい［例えばｒｅｆ．１２０〜１２８］。本発明の組成物のタンパク質成分は、よって、タンパク質をコードする核酸（好ましくは例えばプラスミドの形のＤＮＡ）により置き換えることができる。
【００８７】
実際上の状況では、本発明の組成物に含まれる抗原の数に上限があることがある。本発明の組成物中の抗原の数（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原を含む）は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満または３未満であり得る。本発明の組成物中のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原の数は、６未満、５未満または４未満であり得る。
【００８８】
薬学的組成物および方法
本発明は、（ａ）本発明の多糖（場合によってコンジュゲートの形）を（ｂ）薬学的に許容される担体と混合するステップを含む、薬学的組成物を調製するためのプロセスを提供する。典型的な「薬学的に許容される担体」は、それ自体が、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意の担体を含む。適切な担体は、典型的に、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ラクトースおよび脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）のような大きく、緩慢に代謝される高分子である。このような担体は、当業者に周知である。ワクチンは、水、食塩水、グリセロールなどのような希釈剤も含有してよい。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が存在してよい。発熱物質を含まない滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水が典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤についての詳細な議論は、参考文献１２９で入手可能である。
【００８９】
本発明の組成物は、水性の形（すなわち溶液または懸濁液）または乾燥された形（例えば凍結乾燥された）であってよい。乾燥ワクチンを用いるならば、これは、注射の前に液体媒体中で再構成される。コンジュゲートワクチンの凍結乾燥は、当該技術において公知であり、例えばＭｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）製品は凍結乾燥された形であり、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）は、水性の形で提示される。凍結乾燥中にコンジュゲートを安定化するために、組成物中に糖アルコール（例えばマンニトール）または二糖（例えばスクロースまたはトレハロース）を、例えば１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌまでの間で（例えば約２５ｍｇ／ｍｌ）含むことが典型的であることがある。
【００９０】
薬学的組成物は、バイアルまたはシリンジに包装してよい。シリンジは、針とともにまたは針なしで供給してよい。シリンジは、組成物の単回用量を含むが、バイアルは単回用量または複数回用量を含み得る。
【００９１】
本発明の多糖の水性組成物は、凍結乾燥された形からの他のワクチンを再構成するために適切である。本発明の組成物をこのような即時再構成のために用いる場合、本発明は、凍結乾燥された物質を本発明の水性組成物と混合するステップを含む、このような凍結乾燥されたワクチンを再構成するためのプロセスを提供する。再構成された物質は、注射のために用いることができる。
【００９２】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原
上記のように、１またはそれより多いさらなるＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を、本発明の組成物に含めることができる。抗原は、タンパク質または糖抗原であってよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、本発明のコンジュゲートのための担体タンパク質、他のコンジュゲートのための担体タンパク質、またはコンジュゲートしていないタンパク質抗原として用いてよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、他のコンジュゲートのための糖として、またはコンジュゲートしていない糖抗原として用いてよい。
【００９３】
適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）であるＳ．ａｕｒｅｕｓの菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む。この多糖は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方に存在し、いずれの供給源からでも単離できる［１３０、１３１］。例えば、ＰＮＡＧは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＭＮ８ｍ株から単離できる［１３２］。糖抗原は、細菌からの菌体外多糖の精製中に現れるサイズを有する多糖であってよいか、またはこれは、このような多糖の断片化により達成される多糖であってよく、例えばサイズは４００ｋＤａを超えるものから、７５から４００ｋＤａまでの間または１０から７５ｋＤａまでの間または３０反復単位まで変動し得る。糖抗原は、様々なＮ−アセチル化の程度を有することができ、参考文献１３３に記載されるように、ＰＮＡＧは、４０％より少なくＮ−アセチル化されていることがある（例えば３５、３０、２０、１５、１０または５％未満のＮ−アセチル化；脱アセチル化ＰＮＡＧは、ｄＰＮＡＧとしても公知である）。ＰＮＡＧの脱アセチル化されたエピトープは、オプソニン性の殺傷を媒介できる抗体を誘発できる。ｄＰＮＡＧの調製は、参考文献１３４に記載されている。ＰＮＡＧは、Ｏ−スクシニル化されていることがあるかまたはされていないことがあり、例えば、これは、２５、２０、１５、１０、５、２、１または０．１％未満の残基でＯ−スクシニル化されてよい。ＰＮＡＧは、上記の担体分子にコンジュゲートしているか、または代わりにコンジュゲートしていないことがある。
【００９４】
別の適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、３３６型抗原であり、これは、Ｏ−アセチル化がないβ−連結ヘキソサミンである［１３５、１３６］。３３６型抗原は、３３６株（ＡＴＣＣ５５８０４）に対して産生された抗体と交差反応性である。３３６型抗原は、上記の担体分子にコンジュゲートしているか、または代わりにコンジュゲートしていないことがある。
【００９５】
適切なＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、以下のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原（またはその免疫原性断片（複数可）を含む抗原）を含む［例えば参考文献１３７〜１４４を参照されたい］：ＡｈｐＣ、ＡｈｐＦ、自己溶解素アミダーゼ、自己溶解素グルコサミニダーゼ、コラーゲン結合タンパク質ＣＡＮ、ＥｂｈＢ、ＧｅｈＤリパーゼ、ヘパリン結合タンパク質ＨＢＰ（１７ｋＤａ）、ラミニン受容体、ＭＡＰ、ＭｎｔＣ（ＳｉｔＣとしても公知）、ＭＲＰＩＩ、Ｎｐａｓｅ、ＯＲＦ０５９４、ＯＲＦ０６５７ｎ、ＯＲＦ０８２６、ＰＢＰ４、ＲＡＰ（ＲＮＡＩＩＩ活性化タンパク質）、Ｓａｉ−１、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２およびビトロネクチン結合タンパク質。
【００９６】
さらに適切なＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、以下に記載するようなｃｌｆＡ抗原；ｃｌｆＢ抗原；ｓｄｒＥ２抗原；ｓｄｒＣ抗原；ｓａｓＦ抗原、ｅｍｐ抗原；ｓｄｒＤ抗原；ｓｐａ抗原；ｅｓａＣ抗原；ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；ｉｓｄＣ抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；ｉｓｄＡ抗原；ｉｓｄＢ抗原；およびｓｔａ０７３抗原を含む。これらの抗原の１または複数（すなわち１、２、３、４、５、６またはそれより多い）が、本発明の組成物に存在してよい。これらの抗原のうち、ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；および／またはｓｔａ０７３抗原の１または複数（すなわち１、２、３、４、５、６またはそれより多い）の使用が特に構想される。
【００９７】
例えば、本発明の組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原の以下の組み合わせの１つを含んでよい：
（１）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびＨｌａ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばｅｓｘＢ抗原がｅｓｘＡ抗原の下流にあるＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（２）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせてよい。
（３）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（４）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせてよい。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（５）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびＨｌａ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（６）Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（７）ｅｓｘＡ抗原およびｅｓｘＢ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（８）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ００６抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（９）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせてよい。
（１０）ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。
【００９８】
さらなるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原は、参考文献１４５に開示されている。
【００９９】
ｃｌｆＡ
「ｃｌｆＡ」抗原は、「凝集因子（ｃｌｕｍｐｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）Ａ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｃｌｆＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿００８１２であり、配列番号１のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４５７２）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿０７５６（ＧＩ：１５１２２０９６８）である。
【０１００】
有用なｃｌｆＡ抗原は、配列番号１を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｃｌｆＡタンパク質は、配列番号１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１の最後の３６８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１の最初の３９のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１０１】
配列番号２は、配列番号１の有用な断片である（「ＣｌｆＡ４０−５５９」）。この断片は、配列番号１のＣ末端に向かう長い反復領域が省かれる。
【０１０２】
ｃｌｆＢ
「ｃｌｆＢ」抗原は、「凝集因子Ｂ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｃｌｆＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿０２９６３であり、配列番号３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９６５８５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿２５２９（ＧＩ：１５１２２２７４１）である。
【０１０３】
有用なｃｌｆＢ抗原は、配列番号３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｃｌｆＢタンパク質は、配列番号３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号３の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号３の最後の４０のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号３の最初の４４のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ＣｌｆＢは、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために助けとなる。
【０１０４】
配列番号４は、配列番号３の有用な断片である（「ＣｌｆＢ４５−５５２」）。この断片は、ＣｌｆＢの最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。ＣｌｆＢの３ドメインモデルに基づくその他の有用な断片は、ＣｌｆＢ４５−３６０（ＣＬｆＢ−Ｎ１２としても公知；配列番号５）；ＣｌｆＢ２１２−５４２（ＣＬｆＢ−Ｎ２３としても公知；配列番号６）；およびＣｌｆＢ３６０−５４２（ＣＬｆＢ−Ｎ３としても公知；配列番号７）を含む。
【０１０５】
ｓｄｒＥ２
「ｓｄｒＥ２」抗原は、「Ｓｅｒ−Ａｓｐリッチフィブリノゲン／骨シアロタンパク質結合タンパク質ＳｄｒＥ」と注釈されている。Ｎｅｗｍａｎ株では、ｓｄｒＥ２はＮＷＭＮ＿０５２５であり、配列番号８のアミノ酸配列（ＧＩ：１５１２２０７３７）を有する。
【０１０６】
有用なｓｄｒＥ２抗原は、配列番号８を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号８と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＥ２タンパク質は、配列番号８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号８のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号８の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号８の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号８の最初の５２のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｄｒＥ２は、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために大いに助けとなる。
【０１０７】
配列番号９は、配列番号８の有用な断片である（「ＳｄｒＥ５３−６３２」）。この断片は、ＳｄｒＥ２の最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。
【０１０８】
ｓｄｒＣ
「ｓｄｒＣ」抗原は、「ｓｄｒＣタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｄｒＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿００５４４であり、配列番号１０のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４３２４）を有する。
【０１０９】
有用なｓｄｒＣ抗原は、配列番号１０を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１０と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＣタンパク質は、配列番号１０の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１０のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１０の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１０の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１０の最初の５０のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｄｒＣは、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために助けとなる。
【０１１０】
配列番号１１は、配列番号１０の有用な断片である（「ＳｄｒＣ５１−５１８」）。この断片は、ＳｄｒＣの最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。
【０１１１】
ｓａｓＦ
「ｓａｓＦ」抗原は、「ｓａｓＦタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓａｓＦはＳＡＯＵＨＳＣ＿０２９８２であり、配列番号１２のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９６６０１）を有する。
【０１１２】
有用なｓａｓＦ抗原は、配列番号１２を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１２と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓａｓＦタンパク質は、配列番号１２の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１２のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１２の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１２の最後の３９のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１２の最初の３７のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１１３】
ｅｍｐ
「ｅｍｐ」抗原は、「細胞外基質および血漿結合タンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｍｐはＳＡＯＵＨＳＣ＿００８１６であり、配列番号１３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４５７５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿０７５８（ＧＩ：１５１２２０９７０）である。
【０１１４】
有用なｅｍｐ抗原は、配列番号１３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｍｐタンパク質は、配列番号１３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１３の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１３の最初の２６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１１５】
配列番号１４、１５、１６および１７は、配列番号１３の有用な断片である（それぞれ、「Ｅｍｐ３５−３４０」、「Ｅｍｐ２７−３３４」、「Ｅｍｐ３５−３３４」および「Ｅｍｐ２７−１４７」）。
【０１１６】
ｓｄｒＤ
「ｓｄｒＤ」抗原は、「ｓｄｒＤタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｄｒＤはＳＡＯＵＨＳＣ＿００５４５であり、配列番号１８のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４３２５）を有する。
【０１１７】
有用なｓｄｒＤ抗原は、配列番号１８を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１８と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＤタンパク質は、配列番号１８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１８からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１８のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１８の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１８の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１８の最初の５２のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｄｒＤは、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために大いに助けとなる。
【０１１８】
配列番号１９は、配列番号１８の有用な断片である（「ＳｄｒＤ５３−５９２」）。この断片は、ＳｄｒＤの最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。同じＣ末端残基を有する別の有用な断片は、ＳｄｒＤ３９４−５９２（ＳｄｒＤ−Ｎ３としても公知；配列番号２０）である。
【０１１９】
ｓｐａ
「ｓｐａ」抗原は、「プロテインＡ」または「ＳｐＡ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｐａはＳＡＯＵＨＳＣ＿０００６９であり、配列番号２１のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９３８８５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿００５５（ＧＩ：１５１２２０２６７）である。全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株は、その細胞壁に繋留された表面タンパク質生成物がＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣとよばれる５つの高度に相同性の免疫グロブリン結合ドメインを有する［１４６］、詳細に特徴づけられた毒性因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ）であるｓｐａについての構造遺伝子を発現する。これらのドメインは、アミノ酸レベルで約８０％の同一性を示し、５６〜６１残基の長さであり、タンデムリピートとして組織化されている［１４７］。ＳｐＡは、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端局在化シグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）とを有する前駆体タンパク質として合成される［１４８、１４９］。細胞壁に繋留されたｓｐａは、ブドウ球菌表面上で非常に豊富に提示される［１５０、１５１］。その免疫グロブリン結合ドメインのそれぞれは、３ヘリックスの束に組み立てられる逆平行α−ヘリックスで構成され、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメイン［１５２、１５３］、ＩｇＭのＶＨ３重鎖（Ｆａｂ）（すなわちＢ細胞受容体）［１５４］、そのＡ１ドメインにてフォンウィルブランド因子［１５５］および／または気道上皮の表面上に提示されるＴＮＦ−α受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）［１５６］と結合できる。
【０１２０】
有用なｓｐａ抗原は、配列番号２１を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２１と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２１の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｐａタンパク質は、配列番号２１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２１からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２１のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２１の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２１の最後の３５のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号２１の最初の３６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。参考文献１５７は、個別のＩｇＧ結合ドメインが、単独または組み合わせて有用な免疫原である可能性があることを示唆している。
【０１２１】
配列番号２２は、配列番号２１の有用な断片である（「Ｓｐａ３７−３２５」）。この断片は、５つのＳｐＡ Ｉｇ結合ドメイン全てを含有し、ＳｐＡの最も曝露されるドメインを含む。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。その他の有用な断片は、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥドメインの１、２、３または４つを省いてよい。参考文献１５７に報告されるように、その他の有用な断片は、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥドメインの１、２、３または４つだけを含んでよく、例えばＳｐＡ（Ａ）ドメインのみを含むがＢ〜Ｅを含まないか、またはＳｐＡ（Ｄ）ドメインのみを含むがＡもＢもＣもＥも含まないなどである。よって、本発明で有用なｓｐａ抗原は、１、２、３、４または５つのＩｇＧ結合ドメインを含み得るが、理想的には４つ以下を有する。抗原が、ｓｐａドメインのうち１つの型のみ（例えばＳｐａ（Ａ）またはＳｐＡ（Ｄ）ドメインだけ）を含むならば、これは、このドメインの１より多いコピー、例えば単一ポリペプチド鎖中に複数のＳｐＡ（Ｄ）ドメインを含んでよい。抗原内の個別のドメインは、配列番号２１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸にて変異され得る（例えば、ドメインＤの残基３および／または２４、ドメインＡの残基４６および／または５３などでの変異を開示する参考文献１５７を参照されたい）。このような変異体は、配列番号２１を認識する抗体を誘発する抗原の能力を除去すべきではないが、ＩｇＧとの抗原の結合を除去し得る。いくつかの態様では、ｓｐａ抗原は、（ａ）ＩｇＧ Ｆｃとの結合を破壊するかもしくは減少させる、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥのＩｇＧ Ｆｃ結合サブドメインにおける１またはそれより多いアミノ酸置換と、（ｂ）ＶＨ３との結合を破壊するかもしくは減少させる、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥのＶＨ３結合サブドメインにおける１またはそれより多いアミノ酸置換とでの置換を含む。いくつかの実施形態では、改変体ＳｐＡは、少なくともまたは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い改変体ＳｐＡドメインＤペプチドを含む。
【０１２２】
ｅｓａＣ
「ｅｓａＣ」抗原は、「ｅｓａＣ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｓａＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６４であり、配列番号２３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４０６９）を有する。
【０１２３】
有用なｅｓａＣ抗原は、配列番号２３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓａＣタンパク質は、配列番号２３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２３の少なくとも１つのエピトープを保持している。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１２４】
ｅｓｘＡ
「ｅｓｘＡ」抗原は、「タンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｓｘＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２５７であり、配列番号２４のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４０６３）を有する。
【０１２５】
有用なｅｓｘＡ抗原は、配列番号２４を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２４と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２４の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓｘＡタンパク質は、配列番号２４の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２４からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２４のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２４の少なくとも１つのエピトープを保持している。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１２６】
ｅｓｘＢ
「ｅｓｘＢ」抗原は、「ｅｓｘＢ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｓｘＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６５であり、配列番号２５のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４０７０）を有する。
【０１２７】
有用なｅｓｘＢ抗原は、配列番号２５を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２５と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２５の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓｘＢタンパク質は、配列番号２５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２５からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２５のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２５の少なくとも１つのエピトープを保持している。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１２８】
ｓｔａ００６
「ｓｔａ００６」抗原は、「フェリクローム結合タンパク質」と注釈され、文献中で「ＦｈｕＤ２」ともよばれている［１５８］。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｔａ００６はＳＡＯＵＨＳＣ＿０２５５４であり、配列番号２６のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９６１９９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿２１８５（ＧＩ：１５１２２２３９７）である。
【０１２９】
有用なｓｔａ００６抗原は、配列番号２６を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２６と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２６の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ００６タンパク質は、配列番号２６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２６からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２６のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２６の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２６の最初の１７のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｔａ００６の変異体形態は、参考文献１５９で報告されている。ｓｔａ００６抗原は、例えばアシル化Ｎ末端システインで脂質化されてよい。
【０１３０】
ｉｓｄＣ
「ｉｓｄＣ」抗原は、「タンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｉｓｄＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０８２であり、配列番号２７のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８３０）を有する。
【０１３１】
有用なｉｓｄＣ抗原は、配列番号２７を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２７と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２７の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＣタンパク質は、配列番号２７の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２７からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２７のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２７の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２７の最後の３９のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号２７の最初の２８のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ＩｓｄＢの有用な断片は、参考文献１６５に開示されている。参考文献１６０は、ＩｓｄＢおよびＩｓｄＨの両方からのエピトープを有用に含む抗原を開示している。
【０１３２】
Ｈｌａ
「Ｈｌａ」抗原は、「アルファ毒素」または単に「溶血素」としても公知の「アルファ溶血素前駆体」である。ＮＣＴＣ８３２５株では、ＨｌａはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１１２１であり、配列番号２８のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８６５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿１０７３（ＧＩ：１５１２２１２８５）である。Ｈｌａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのほとんどの株により生成される重要な病毒性決定基であり、孔形成および溶血活性を有する。抗Ｈｌａ抗体は、動物モデルにおける毒素の有害な影響を中和でき、Ｈｌａは、肺炎に対する防御のために特に有用である。
【０１３３】
有用なＨｌａ抗原は、配列番号２８を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２８と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのＨｌａタンパク質は、配列番号２８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２８からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２８のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２８の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２８の最初の２６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。Ｃ末端での切断を用いて、例えば５０アミノ酸だけ（配列番号２８の残基２７〜７６）を残すこともできる［１６１］。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１３４】
Ｈｌａの毒性は、本発明の組成物において、化学的不活化（例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはその他の架橋試薬を用いて）により回避できる。しかし、代わりに、その免疫原性を保持しながら毒性活性が除去されたＨｌａの変異体形態を用いることが好ましい。このような解毒化変異体は、当該技術において既に公知である。ある有用なＨｌａ抗原は、配列番号２８の残基６１（これは、成熟抗原の残基３５である（すなわち、最初の２６のＮ末端アミノ酸を省いた後））にて変異を有する。よって、残基６１はヒスチジンではないことがあり、代わりに例えばＩｌｅ、Ｖａｌまたは好ましくはＬｅｕであり得る。この位置でのＨｉｓ−Ａｒｇ変異を用いることもできる。例えば、配列番号２９は、成熟変異体Ｈｌａ−Ｈ３５Ｌ配列であり、有用なＨｌａ抗原は、配列番号２９を含む。別の有用な変異は、長いループを短い配列で置き換えて、例えば配列番号２８の残基１３６〜１７４での３９マーを、配列番号３１（Ｈ３５Ｌ変異も含む）および配列番号３２（Ｈ３５Ｌ変異を含まない）でのようにＰＳＧＳ（配列番号３０）のようなテトラマーで置き換える。
【０１３５】
さらに有用なＨｌａ抗原は、参考文献１６２および１６３に開示されている。
【０１３６】
配列番号３３、３４および３５は、配列番号２８の３つの有用な断片である（それぞれ「Ｈｌａ２７−７６」、「Ｈｌａ２７−８９」および「Ｈｌａ２７−７９」）。配列番号３６、３７および３８は、配列番号２９からの対応する断片である。
【０１３７】
ｓｔａ０１１
「ｓｔａ０１１」抗原は、「リポタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｔａ０１１はＳＡＯＵＨＳＣ＿０００５２であり、配列番号３９のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９３８７２）を有する。
【０１３８】
有用なｓｔａ０１１抗原は、配列番号３９を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号３９と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号３９の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ０１１タンパク質は、配列番号３９の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３９からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３９のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号３９の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号３９の最初の２３のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｔａ００６抗原は、例えばアシル化Ｎ末端システインで脂質化されてよい。
【０１３９】
ｓｔａ０１１抗原を調製するために用い得る配列番号３９の改変体形は、それらに限定されないが、様々なＩｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ置換を有する配列番号４０、４１および４２を含む。
【０１４０】
ｉｓｄＡ
「ｉｓｄＡ」抗原は、「ＩｓｄＡタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｉｓｄＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０８１であり、配列番号４３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８２９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿１０４１（ＧＩ：１５１２２１２５３）である。
【０１４１】
有用なｉｓｄＡ抗原は、配列番号４３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号４３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号４３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＡタンパク質は、配列番号４３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号４３の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号４３の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号４３の最初の４６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号４３のＣ末端３８マー（ＬＰＫＴＧモチーフで始まる）を排除するための切断も有用である。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１４２】
配列番号４４は、配列番号４３の有用な断片であり（配列番号４３のアミノ酸４０〜１８４；「ＩｓｄＡ４０−１８４」）、これは、天然タンパク質のヘム結合部位を含み、抗原の最も曝露されるドメインを含む。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。その他の有用な断片は、参考文献１６４および１６５に開示されている。
【０１４３】
ＩｓｄＡは、水酸化アルミニウムアジュバントに良好に吸着しないので、組成物に存在するＩｓｄＡは、吸着されないでよいか、または代替アジュバント、例えばリン酸アルミニウムに吸着されてよい。
【０１４４】
ｉｓｄＢ
「ｉｓｄＢ」抗原は、「神経フィラメントタンパク質ｉｓｄＢ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｉｓｄＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０７９であり、配列番号４５のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８２８）を有する。ＩｓｄＢは、それ自体でワクチン抗原として用いることが提案されているが［１６６］、これは、肺炎を予防しないことがある。
【０１４５】
有用なｉｓｄＢ抗原は、配列番号４５を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号４５と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号４５の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＢタンパク質は、配列番号４５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４５からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４５のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号４５の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号４５の最後の３６のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号４５の最初の４０のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ＩｓｄＢの有用な断片は、参考文献１６５および１６７に開示され、例えば配列番号４５の３７の内部アミノ酸を欠失している。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｉｓｄＢ抗原を含まない。
【０１４７】
ｓｔａ０７３
「ｓｔａ０７３」抗原は、「二機能性自己溶解素前駆体」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｔａ０７３はＳＡＯＵＨＳＣ＿００９９４であり、配列番号４６のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４７５０）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿０９２２（ＧＩ：１５１２２１１３４）である。プロテオミクス解析により、このタンパク質は、分泌されるかまたは表面に曝露されることが明らかになっている。
【０１４８】
有用なｓｔａ０７３抗原は、配列番号４６を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号４６と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号４６の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ０７３タンパク質は、配列番号４６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４６からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４６のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号４６の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号４６の最初の２４のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１４９】
ｓｔａ０７３は、水酸化アルミニウムアジュバントに良好に吸着しないので、組成物に存在するＳｔａ０７３は、吸着されないでよいか、または代替アジュバント、例えばリン酸アルミニウムに吸着されてよい。
【０１５０】
ハイブリッドポリペプチド
本発明で用いられるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、個別の分離したポリペプチドとして組成物に存在してよい。１より多い抗原を用いる場合、しかし、これらは、分離したポリペプチドとして提示される必要はない。代わりに、少なくとも２（例えば２、３、４、５またはそれより多い）の抗原は、単一ポリペプチド鎖として発現され得る（「ハイブリッド」ポリペプチド）。ハイブリッドポリペプチドは、２つの主な利点を提供する。第１に、それ自体では不安定または発現が乏しいことがあるポリペプチドが、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することにより援助され得る。第２に、商業的な製造が単純化される。なぜなら、ともに抗原的に有用な２つのポリペプチドを生成するために、１回だけの発現および精製の使用しか必要としないからである。
【０１５１】
ハイブリッドポリペプチドは、上に列挙した抗原のそれぞれからの２またはそれより多いポリペプチド配列、または配列が株間で部分的に変動している場合は同じ抗原の２またはそれより多い改変体を含んでよい。
【０１５２】
２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗原からのアミノ酸配列からなるハイブリッドが有用である。特に、２もしくは３の抗原のような２、３、４または５の抗原からのアミノ酸配列からなるハイブリッドが好ましい。
【０１５３】
異なるハイブリッドポリペプチドを、単一製剤中に一緒に混合してよい。ハイブリッドは、第１、第２または第３抗原群より選択される非ハイブリッド抗原と組み合わせてよい。このような組み合わせのうち、抗原は、１より多いハイブリッドポリペプチド中に、および／または非ハイブリッドポリペプチドとして存在してよい。しかし、抗原が、ハイブリッドまたは非ハイブリッドのいずれかとして存在するが、これらの両方として存在しないことが好ましい。
【０１５４】
ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、上記のようなＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原のアミノ酸配列であり、Ｌは、場合によって存在するリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、場合によって存在するＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、場合によって存在するＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２またはそれより大きい整数（例えば２、３、４、５、６など）である）で表すことができる。通常、ｎは２または３である。
【０１５５】
−Ｘ−部分がこの野生型の形においてリーダーペプチド配列を有するならば、これは、ハイブリッドタンパク質に含めてよいか、またはハイブリッドタンパク質から省いてよい。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端にある−Ｘ−部分のものを除いて削除され、すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２・・・Ｘｎのリーダーペプチドは省かれる。このことは、全てのリーダーペプチドを削除し、Ｘ１のリーダーペプチドを−Ａ−部分として用いることと等価である。
【０１５６】
｛−Ｘ−Ｌ−｝のｎの場合のそれぞれについて、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してよいかまたは存在しなくてよい。例えば、ｎ＝２である場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであってよい。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、典型的には短い（例えば２０以下のアミノ酸、すなわち２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわちＧｌｙｎ（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）を含む）およびヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い））が含まれる。その他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号４７）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号４８）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成されるので、クローニングおよび操作の助けとなり、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドが、典型的なポリ−グリシンリンカーである。特に最後のＬｎとして用いるためのその他の適切なリンカーは、ＡＳＧＧＧＳ（例えば配列番号５０によりコードされる配列番号４９）またはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。
【０１５７】
−Ａ−は、場合によって存在するＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０またはそれより少ないアミノ酸、すなわち４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を誘導するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い））が含まれる。その他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠失している場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または単一Ｍｅｔ残基である。
【０１５８】
−Ｂ−は、場合によって存在するＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０またはそれより少ないアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を誘導する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）を含む、例えば配列番号５１）、またはタンパク質安定性を増進する配列が含まれる。その他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【０１５９】
本発明のあるハイブリッドポリペプチドは、ＥｓｘＡ抗原およびＥｓｘＢ抗原をともに含んでよい。これらは、Ｎ末端からＣ末端のいずれの順序でもよい。配列番号５２（「ＥｓｘＡＢ」；配列番号５３によりコードされる）および５４（「ＥｓｘＢＡ」）は、このようなハイブリッドの例であり、これらはともにヘキサペプチドリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号４９）を有する。
【０１６０】
一般
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の技量内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば参考文献１６８〜１７５などを参照されたい。
【０１６１】
「ＧＩ」番号付けを上記で用いている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」は、そのデータベースに配列が加えられた場合に、ＮＣＢＩにより処理されるそれぞれの記録された配列に連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、記録された配列の受託番号に似ていない。配列がアップデートされたとき（例えば修正のため、またはさらなる注釈もしくは情報を加えるため）に、新しいＧＩ番号が与えられる。よって、所与のＧＩ番号に付随する配列は、決して変更されない。
【０１６２】
２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、整列させたときに、アミノ酸のそのパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術において公知のソフトウェアプログラム、例えばｒｅｆ．１７６の７．７．１８節に記載されるものを用いて決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップ開始ペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティでのアフィンギャップ検索、６２のＢＬＯＳＵＭ行列を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ｒｅｆ．１７７に開示されている。
【０１６３】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであってよい。このようなエピトープは、経験的に同定できる（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［１７８、１７９］または類似の方法を用いて）か、またはこれらは予想できる（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）［１８０］、行列に基づくアプローチ［１８１］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［１８２］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１８３、１８４］、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）［１８５］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［１８６、１８７］、ＡＤＥＰＴ［１８８］、Ｔｓｉｔｅｓ［１８９］、親水性［１９０］、抗原インデックス［１９１］または参考文献１９２〜１９６に開示される方法などを用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位により認識され、それと結合する抗原の部分であり、これらは、「抗原決定基」とよぶこともできる。
【０１６４】
抗原「ドメイン」が省かれる場合、このことは、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインなどが省かれることを含み得る。
【０１６５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または何か追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【０１６６】
数値ｘに関する「約」との用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１６７】
「実質的に」との語句は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことがある。必要であれば、「実質的に」との語を、本発明の定義から省くことができる。
【０１６８】
本発明が複数の逐次的なステップを含むプロセスを提供する場合、本発明は、ステップの合計数より少ないものを含むプロセスも提供することができる。異なるステップは、非常に異なる回数で異なる人により異なる場所（例えば異なる国）で行うことができる。
【０１６９】
糖の環は、開放または閉鎖された形で存在でき、閉鎖形を本明細書において構造式で示すが、開放形も本発明に包含されることが認識される。同様に、糖は、ピラノースおよびフラノース形で存在でき、ピラノース形を本明細書において構造式で示すが、フラノース形も包含されることが認識される。糖の異なるアノマー形も包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、参考文献１３の方法に基づくＳ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を精製するためのプロセスを示す図である。
【図２】図２は、莢膜多糖のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラムおよび図１の方法に従って調製した莢膜多糖含有画分（画分６８〜８０）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】図３は、莢膜多糖のＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌクロマトグラムおよび図１の方法に従って調製した莢膜多糖含有画分（画分２２〜４４）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】図４は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を精製するための本発明の例示的なプロセスを示す図である。
【図５】図５は、本発明の方法に従って調製した莢膜多糖のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６は、精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図７】図７は、参考文献１９７、１９８、１９９および２００に基づくＳ．ａｕｒｅｕｓのペプチドグリカンの化学構造を示す図である。反復単位を強調する。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
Ａ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖の精製（比較例）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を、参考文献１３の方法に基づく図１に示すスキームに従って精製した。この方法の様々なステップについての条件および原理的説明を、表１に記載する。
【０１７２】
【表１】
細菌ペレット遠心分離および酵素反応（リソスタフィンおよびＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを固体培地で成長させて、６００〜８００ｍｌの細菌懸濁物を得た。８０００ｒｐｍにて遠心分離することにより採集した湿潤細胞ペレットは、約３０〜５０ｇの質量を有した。採集したペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ｐＨ７．５で３回洗浄し、次いで、１ｍｌあたり０．２５〜０．５ｇにて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ｐＨ７．５に懸濁し、０．１〜０．１３ｍｇ／ｍｌのリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。反応混合物は、３７℃にて１６時間（ＯＮ）穏やかに撹拌しながらインキュベートした。０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を懸濁物に加え、３７℃にて５〜７時間インキュベートした。懸濁物を、次いで、遠心分離により清澄化した。
【０１７３】
ＮａＩＯ４との反応
物質を、５０ｍＭ ＮａＩＯ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、暗所にて５〜７時間インキュベートした。ＮａＩＯ４を、次いで、過剰のグリセロールを明所にて撹拌しながら３０分間加えることにより除去した。
【０１７４】
３０ｋＤａタンジェンシャルフローろ過
タンジェンシャルフローろ過を、表２に示すようにして行った。
【０１７５】
【表２】
タンジェンシャルフローろ過は、０．１ｍ２カセットのためのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ホルダーにおいて、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｎ（商標）蠕動ポンプを用いて行った。その後、膜をＮａＯＨ １Ｍで洗浄し、ＮａＯＨ ０．１Ｍ中で＋２〜８℃にて貯蔵した。
【０１７６】
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
残存タンパク質、核酸およびその他の不純物を、表３に従って行ったアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
【０１７７】
【表３】
クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ（商標）システム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、莢膜多糖を、ＵＶ吸収を２１５ｎｍにて測定することにより検出した。莢膜多糖溶液をまず、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２に加えて、１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．２の最終緩衝液濃度を得た。ＤＥＡＥ樹脂を、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２でｐＨ７．２に予め平衡化し、次いで、１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２で平衡化して、示す伝導率（１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２伝導率）を達成した。得られた画分をＮＭＲにより分析し、莢膜多糖を含有するものを一緒に貯留した（図２）。
【０１７８】
Ｓ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌクロマトグラフィー
多糖を、表４に従って行ったゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０１７９】
【表４】
クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ（商標）システム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行い、莢膜多糖を、ＵＶ吸収を２１５ｎｍにて測定することにより検出した。得られた画分をＮＭＲにより分析し、莢膜多糖を含有するものを一緒に貯留した（図３）。
【０１８０】
Ｂ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖の精製（実施例）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を、図４に示すスキームに従って精製した。この方法の様々なステップについての条件および原理的説明を、表５に記載する。
【０１８１】
【表５】
細菌ペレット遠心分離ならびに酸および酵素反応（酢酸、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼおよびムタノリシン）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを固体培地で成長させて、６００〜８００ｍｌの細菌懸濁物を得た。８０００ｒｐｍにて遠心分離することにより採集した湿潤細胞ペレットは、約３０〜５０ｇの質量を有した。採集したペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ｐＨ７．５で３回洗浄し、次いで、１ｍｌあたり０．５〜０．６ｇにて蒸留水に懸濁し、激しく撹拌しながら温度を１００℃まで上昇させた。次いで、酢酸を１％の最終濃度まで加え、混合物を１００℃にて２時間保った。混合物をＮａＯＨ １Ｍで中和し、８０００ｒｐｍにて遠心分離した。
【０１８２】
上清をペレットからデカントし、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を組み合わせた。混合物を、次いで、３７℃にて５〜７時間インキュベートし、その後、遠心分離により清澄化した。１８０Ｕ／ｍｌのムタノリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を次いで懸濁物に加え、混合物を１晩（１６時間）、３７℃にて穏やかに撹拌しながらインキュベートした。懸濁物を、次いで、遠心分離により再び清澄化した。
【０１８３】
３０ｋＤａタンジェンシャルフローろ過
タンジェンシャルフローろ過を、表６に示すようにして行った。
【０１８４】
【表６】
タンジェンシャルフローろ過は、０．２ｍ２カセットのためのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ホルダーにおいて、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｎ（商標）蠕動ポンプを用いて行った。その後、膜をＮａＯＨ １Ｍで洗浄し、ＮａＯＨ ０．１Ｍ中で＋２〜８℃にて貯蔵した。
【０１８５】
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
残存タンパク質、核酸およびその他の不純物を、表７に従って行ったアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
【０１８６】
【表７】
クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ（商標）システム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、莢膜多糖を、ＵＶ吸収を２１５ｎｍにて測定することにより検出した。莢膜多糖溶液をまず、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２に加えて、１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．２の最終緩衝液濃度を得た。ＤＥＡＥ樹脂を、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２でｐＨ７．２に予め平衡化し、次いで、１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２で平衡化して、示す伝導率（１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２伝導率）を達成した。得られた画分をＮＭＲにより分析し、莢膜多糖を含有するものを一緒に貯留した（図５）。
【０１８７】
３０ｋＤａタンジェンシャルフローろ過
タンジェンシャルフローろ過を、アニオン交換クロマトグラフィーから残されたＮａＣｌを除去し、精製多糖を濃縮するために行った。ろ過は、表８に示すようにして行った。
【０１８８】
【表８】
タンジェンシャルフローろ過は、０．２ｍ２カセットのためのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ホルダーにおいて、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｎ（商標）蠕動ポンプを用いて行った。その後、膜をＮａＯＨ １Ｍで洗浄し、ＮａＯＨ ０．１Ｍ中で＋２〜８℃にて貯蔵した。精製多糖をＮＭＲにより分析した（例えば５型莢膜多糖について図６）。
【０１８９】
Ｃ．精製多糖中のペプチドグリカン混入の決定
上記のＡおよびＢ節における方法に従って得られた精製５型多糖のペプチドグリカン（図７）含量を、製造者の使用説明に従ってＤｉｏｎｅｘ ＡＡＡ−Ｄｉｒｅｃｔ（商標）システム（ＡｍｉｎｏＰａｃ（商標）ＰＡ１０ ＡＡＡ−Ｄｉｒｅｃｔ（商標）、Ｄｉｏｎｅｘ）によりＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを用いるアミノ酸分析により決定した。簡単に述べると、２０μＬの１００μＭノルロイシンを、水中で２５０μｇ／ｍＬの２００μＬの多糖に、４００℃処理ガラスチューブ中で加え、Ｓｐｅｅｄｖａｃシステムを用いて乾燥した。ノルロイシンは、内部標準として役立つ。残存タンパク質およびペプチドグリカン混入からの遊離アミノ酸を得るために、試料を、減圧下で沸騰塩化水素酸／フェノールの蒸気を用いて加水分解した。遊離アミノ酸の分離は、ＡｍｉｎｏＰａｃ（商標）ＰＡ１０ガードカラム（２×５０ｍｍ）を備えたＡｍｉｎｏＰａｃ（商標）ＰＡ１０カラム（２×２５０ｍｍ）で、製造者の推奨に従うアミノ酸および炭水化物の勾配条件を用いて行った。これらの勾配条件を、表９にまとめる。
【０１９０】
【表９】
検出は、ＡＡＡ−Ｄｉｒｅｃｔ波形電位を用いて行った（表１０）。
【０１９１】
【表１０】
定量は、非加水分解１７アミノ酸標準溶液（Ｆｌｕｋａ Ｐ／Ｎ ０９４２８）を２．５〜５０μＭの範囲で用いて行った。標準試料は、ノルロイシンとともにおよびノルロイシンなしで、同じ試料濃度にて分析した。試料中のノルロイシンピーク面積を標準物質中の平均ノルロイシンピーク面積で除した比を、加水分解ステップにおける可能性のあるアミノ酸喪失についての補正係数として用いた。ＢＳＡ試料を対照試料として用いた。
【０１９２】
ペプチドグリカン含量の見積り
ペプチドグリカン含量は、２つの異なる方法を用いて見積もった。第１の方法（方法１）は、参考文献１７で用いられた方法に基づき、これは、リシン、アラニン、グリシンおよびグルタミン酸含量の総和を含む。第２の方法（方法２）では、以下の式に従って各アミノ酸についての変換係数を計算する。
（アミノ酸の分子質量）×（ペプチドグリカン構造における残基の数）／（ペプチドグリカンの反復単位の分子質量） 。
【０１９３】
ペプチドグリカンの反復単位の分子質量は、１２３３．２７Ｄａである（図７）。ペプチドグリカン含量は、よって、アミノ酸濃度と変換係数の比を計算することにより得られる平均ペプチドグリカン濃度として計算した。
【０１９４】
アニオン交換クロマトグラフィー後の精製５型莢膜多糖のペプチドグリカン含量を表１１に示す。
【０１９５】
【表１１】
本発明の方法は、精製多糖中の非常に低い含量のペプチドグリカンをもたらす。
【０１９６】
Ｄ．精製多糖のコンジュゲーションおよび免疫原性
上記のＡおよびＢ節の方法から得られた精製５型多糖を、ＣＲＭ１９７に、参考文献２９の方法に従ってコンジュゲートした。コンジュゲート中の糖の合計を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により、そしてタンパク質含量をＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより決定した（表１２）。
【０１９７】
【表１２】
本発明の方法により精製された多糖を用いて調製されたコンジュゲート（ロット４および５）は、より高い多糖：タンパク質の比を有した。
【０１９８】
ロット５の免疫原性を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染のマウス致死モデルにおいて試験した。簡単に述べると、ＣＤ１マウスを、腹腔内注射により、２μｇ用量の抗原で、２００μｌの注射容量で免疫化した。免疫化は、以下のスキームに従って１２匹のマウスの群で行い、その後、５×１０８ＣＦＵの５型Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細菌懸濁物の腹腔内注射により攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養物を遠心分離し、２回洗浄し、攻撃の前にＰＢＳで希釈した。さらなる希釈が、所望の接種材料について必要であり、これは、寒天播種およびコロニー形成により実験的に確認した。動物を１４日間監視し、致死疾患を記録した。
群１−ＰＢＳとミョウバン
群２−５型莢膜多糖−ＣＲＭコンジュゲート（ロット５）とミョウバン
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭコンジュゲート（ロット５）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにミョウバン
群５−５型莢膜多糖−ＣＲＭコンジュゲート（ロット５）とＨｌａＨ３５Ｌ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにミョウバン 。
【０１９９】
生存データを表１３に示す。
【０２００】
【表１３】
本発明の方法により精製された多糖を用いて調製されたコンジュゲートは、高いレベルの生存をもたらした。生存は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原の添加により増進された。
【０２０１】
本発明が例によってのみ記載され、本発明の範囲および精神内にとどまったまま改変を行うことができることが理解される。
【０２０２】
【化１】
【０２０３】
【化２】
【０２０４】
【化３】
【０２０５】
【化４】
【０２０６】
【化５】
【０２０７】
【化６】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年１０月３０日に出願された米国仮出願第６１／２５６，９０５号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、細菌の莢膜多糖、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ５型および８型のもの、ならびに特にワクチンの調製に用いるためのものの精製の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
細菌の莢膜糖は、莢膜細菌（ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するワクチンにおいて長年用いられている。しかし、糖類は、Ｔ非依存性抗原であるので、これらは免疫原性に乏しい。担体へのコンジュゲーションは、Ｔ非依存性抗原をＴ依存性抗原に変換でき、このことにより記憶応答が増進され、防御免疫が発達することが可能になる。最も効果的な糖ワクチンは、よって、複合糖質に基づき、原型のコンジュゲートワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するものであった［例えばｒｅｆ．９６の第１４章を参照されたい］。
【０００４】
それに対するコンジュゲートワクチンが記載されている別の細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。様々な多糖が、複合糖質で用いるためにＳ．ａｕｒｅｕｓから単離されている。特に対象となる２つの多糖は、５型および８型莢膜多糖である。ヒトＳ．ａｕｒｅｕｓ株のおよそ６０％が８型であり、およそ３０％が５型である。５型および８型コンジュゲートに対する研究の多くはＦａｔｔｏｍらにより行われ、参考文献１〜９のような文書に記載されている。
【０００５】
多糖ベースワクチンについての開始点は多糖自体であり、これは、通常、標的細菌から精製される。Ｆａｔｔｏｍらは、５型および８型莢膜多糖の精製のための複雑なプロセスを開発し、これは、参考文献１に詳細に記載されており、細菌培養の後に以下の鍵となるステップを含む：緩衝液中での細菌細胞の懸濁、リソスタフィンでの処理、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼでの処理、遠心分離、緩衝液に対する透析、プロテアーゼでの処理、さらなる透析、ろ過、混入物を沈殿させるための塩化カルシウムと一緒に２５％までのエタノールの添加、多糖を沈殿させるための７５％までのエタノールのさらなる添加、沈殿物の回収および乾燥、アニオン交換クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィー、透析ならびに最後の凍結乾燥。
【０００６】
Ｆａｔｔｏｍプロセスは、細菌細胞壁を溶解し、そのことにより莢膜多糖を放出させるためにリソスタフィンの使用を含む。しかし、このステップは時間がかかり、プロセスを工業的な設定までスケールアップすることを困難にする。これは、プロセスの全体的な費用および複雑さも増加させる。他の研究者らは、このステップを省き、より単純でより効率的な多糖精製方法を開発することを試みている。例えば、参考文献［１０］は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞のオートクレーブ処理、多糖含有上清の限外ろ過、濃縮、凍結乾燥、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理、さらなる限外ろ過、ダイアフィルトレーション、高性能サイズ排除液体クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥を含む代替プロセスについて記載している。著者らは、この方法が良好な収率をもたらし、多糖の大規模生成に適切であることを示唆している。この方法では、リソスタフィン処理は、莢膜多糖を放出させるためのオートクレーブ処理で置き換えられている。この方法は、参考文献［１１］でさらに進展した。これらの代替法で重要なステップは、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理である。このステップは、莢膜多糖のテイコ酸混入を除去するために行われる。しかし、再度、このステップは、プロセスの持続期間、複雑さおよび全体的な費用を増加させる。参考文献［１２］は、これもまた、莢膜多糖を放出させるためのオートクレーブ処理と、テイコ酸を除去するためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理とを含む同様のプロセスを記載している。対照的に、他のグループのほとんどは、リソスタフィン処理を保持し（例えば参考文献１３、参考文献１４（特許文献１）、参考文献１５（特許文献２）、参考文献１６（特許文献３）、参考文献１７（特許文献４）および参考文献１８（特許文献５）を参照されたい）、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理を時に含む（例えば参考文献１３および参考文献１４（特許文献１）において）プロセスを用いている。
【０００７】
上記の方法は複雑であり、得られる多糖に混入を残すことがある。よって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を精製するためのさらなる改善されたプロセス、特により少ない混入をもたらすあまり複雑でないプロセスが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０８０４９０号
【特許文献２】国際公開第２００６／０３２４７５号
【特許文献３】国際公開第２００６／０３２５００号
【特許文献４】国際公開第２００６／０６５５５３号
【特許文献５】国際公開第２００６／１１４５００号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、多糖が、細菌細胞から、酸での処理により初期に放出される精製プロセスに基づく。このステップは、リソスタフィン処理の必要性を除き、上記のプロセスと同様にオートクレーブ処理の代替として用いることができる。本発明者らは、このプロセスが、テイコ酸混入が低い精製多糖をもたらすことを見出した。このことは、多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理する必要がないことを意味する。この精製多糖は、ペプチドグリカン混入も低く、このことにより、それは医療への使用のために特に適切になる。本発明者らのプロセスは、迅速で単純になることができる。なぜなら、以前のプロセスにおける面倒なステップが必要ないからである。
【００１０】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を放出させるための方法であって、前記細胞を酸で処理するステップを含む方法を提供する。本発明は、この方法を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を精製するためのプロセスもさらに提供する。例えば核酸、タンパク質および／またはペプチドグリカン混入物を除去するための酵素処理、例えば低分子量混入物を除去するためのダイアフィルトレーション、例えば残存タンパク質を除去するためのアニオン交換クロマトグラフィーならびに濃縮のようなその他の処理ステップが、プロセスに含まれてよい。
【００１１】
したがって、本発明は、多糖を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から、前記細胞を酸で処理することにより放出させるステップを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスを提供する。同様に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスにおいて、細胞から多糖を放出させるためのＳ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞の酸処理の使用からなる改善を提供する。酸処理による放出は、多糖を放出させるためのリソスタフィン処理またはオートクレーブ処理の必要性を除く。
【００１２】
本発明は、リソスタフィン処理のステップを含まない、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスも提供する。同様に、本発明は、メタ過ヨウ素酸ナトリウム処理のステップを含まない、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスを提供する。典型的には、プロセスは、これらのステップの一方または両方を含まない。
【００１３】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、多糖と、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％など）のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入とを含む組成物を提供するプロセスも提供する。典型的に、組成物は、４重量％未満、特に３重量％未満のペプチドグリカンを含む。本発明者らは、本発明の方法を用いて、約２％または約１％のレベルさえ得ることができることを見出した。本発明者らは、このレベルのペプチドグリカンを有する組成物は、ワクチン製造において有用であることを見出した。対照的に、参考文献１７は、５％を上回るレベルをこの目的のために用いるべきであることを教示している。ペプチドグリカン混入のレベルは、本明細書で記載する方法を用いて測定できる。
【００１４】
同様に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、多糖と、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％など）のタンパク質であるレベルのタンパク質混入とを含む組成物を提供するプロセスを提供する。典型的に、組成物は、３重量％未満、特に約２．４重量％のタンパク質を含む。タンパク質混入のレベルは、ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定できる。
【００１５】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、多糖と、多糖の全重量に対して１重量％未満（例えば≦０．７５％、≦０．５０％、≦０．２５％、≦０．１０％、≦０．０１％など）の核酸であるレベルの核酸混入とを含む組成物を提供するプロセスも提供する。典型的に、組成物は、０．２５重量％未満、特に約０．０９重量％の核酸を含む。核酸混入のレベルは、分光光度計における２６０ｎｍでの吸収により測定できる。
【００１６】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を精製するためのプロセスも提供し、ここで（ａ）ペプチドグリカン酸混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｂ）タンパク質混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｃ）核酸混入のレベルが１％未満（上記のとおり）である。
【００１７】
本発明は、本発明のプロセスのいずれかにより得ることができる、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物も提供する。
【００１８】
特に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％など）のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入を含む組成物を提供する。典型的に、組成物は、３重量％未満、特に２重量％未満のペプチドグリカンを含む。約２％または約１％のレベルさえ有する組成物が、本発明により具体的に提供される。
【００１９】
同様に、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、多糖の全重量に対して５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％など）のタンパク質であるレベルのタンパク質混入を含む組成物を提供する。典型的に、組成物は、３重量％未満、特に約２．４重量％のタンパク質を含む。
【００２０】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、多糖の全重量に対して１重量％未満（例えば≦０．７５％、≦０．５０％、≦０．２５％、≦０．１０％、≦０．０１％など）の核酸であるレベルの核酸混入を含む組成物も提供する。典型的に、組成物は、０．２５重量％未満、特に約０．０９重量％の核酸を含む。
【００２１】
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を含む組成物であって、ａ）ペプチドグリカン酸混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｂ）タンパク質混入のレベルが５％未満（上記のとおり）であり、（ｃ）核酸混入のレベルが１％未満（上記のとおり）である組成物も提供する。
【００２２】
莢膜多糖
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型の莢膜多糖に基づく。５型および８型莢膜多糖の構造は、参考文献１９および２０に：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（３ＯＡｃ）−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
のように記載された。
【００２３】
最近のＮＭＲ分光法データ［２１］は、これらの構造を：
５型
→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３ＯＡｃ）−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→
８型
→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（１→３）−α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ（１→
のように改訂している。
【００２４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から放出された後に、多糖は、天然で見出される莢膜多糖と比較して化学的に改変されることがある。例えば、多糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的または完全に）、脱Ｎ−アセチル化（部分的または完全に）、Ｎ−プロピオン化（Ｎ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的または完全に）などされることがある。脱アセチル化は、その他の処理ステップの前、処理ステップ中または処理ステップの後に行ってもよいが、典型的に、任意のコンジュゲーションステップの前に行う。具体的な多糖に依存して、脱アセチル化は、免疫原性に影響することがあるかまたは影響しないことがあり、例えばＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）ワクチンは脱Ｏ−アセチル化多糖を用いる一方、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）はアセチル化されているが、これらのワクチンはともに有効である。脱アセチル化などの効果は、日常的なアッセイにより評価できる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖に対するＯ−アセチル化に関して、参考文献６で議論される。天然の多糖は、この文書において７５％がＯ−アセチル化されていると言われている。これらの多糖は、多糖主鎖およびＯ−アセチル基の両方に対する抗体を誘導した。０％のＯ−アセチル化を有する多糖は、多糖主鎖に対する抗体を依然として誘発した。両方のタイプの抗体は、それらのＯ−アセチル含量が変動しているＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対してオプソニン性であった。したがって、本発明で用いる５型または８型莢膜多糖は、０から１００％までの間のＯ−アセチル化を有してよい。例えば、５型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０％〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であってよい。代わりに、０％Ｏ−アセチル化５型莢膜多糖を用いてよい。同様に、８型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０％〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であってよい。代わりに、０％Ｏ−アセチル化８型莢膜多糖を用いてよい。一実施形態では、５型および８型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０％〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であってよい。他の実施形態では、０％Ｏ−アセチル化５型および８型莢膜多糖が用いられる。本発明で用いる５型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であってよい。典型的に、５型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、１００％である。同様に、本発明で用いる８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であってよい。典型的に、８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、１００％である。一実施形態では、５型および８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であってよい。典型的に、５型および８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、１００％である。
【００２５】
多糖のＯ−アセチル化の程度は、当該技術において公知の任意の方法、例えばプロトンＮＭＲ（例えば参考文献２２、２３、２４または２５に記載されるとおり）により決定できる。さらなる方法は、参考文献２６に記載されている。同様の方法を用いて、多糖のＮ−アセチル化の程度を決定してよい。Ｏ−アセチル基は、加水分解により、例えば、無水ヒドラジン［２７］またはＮａＯＨ［６］のような塩基での処理により除去できる。同様の方法を用いて、Ｎ−アセチル基を除去してよい。５型および／または８型莢膜多糖上の高いレベルのＯ−アセチル化を維持するために、Ｏ−アセチル基の加水分解を導く処理、例えば極端なｐＨでの処理は最小限にする。
【００２６】
出発物質
本発明のプロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞を用いて開始する。典型的に、細胞は、発酵により成長した後に莢膜多糖を放出する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞を培養する適切な方法は、当業者に周知であり、例えば参考文献１〜２１およびそこで引用される参考文献に開示される。細胞成長の後に、細胞は、通常、不活性化される。不活性化のための適切な方法は、例えば参考文献１に記載されるようなフェノール：エタノールでの処理である。
【００２７】
細胞は、莢膜多糖の放出前に遠心分離してよい。プロセスは、よって、湿潤細胞ペーストの形の細胞を用いて開始してよい。典型的には、しかし、細胞は、プロセスの次のステップに適切な水性媒体、例えば緩衝液または蒸留水中に再懸濁される。細胞は、再懸濁の前にこの媒体で洗浄してよい。別の実施形態では、細胞は、それらの元の培養培地中に懸濁して処理してよい。代わりに、細胞は、乾燥された形で処理される。
【００２８】
酸処理
本発明の方法では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞を酸で処理する。このステップは、細胞からの莢膜多糖の放出をもたらす。対照的に、以前の方法は、多糖を放出させるためにリソスタフィン処理またはオートクレーブ処理を用いていた。本発明の酸処理は、多糖に対する損傷を最小限にするために、穏やかな酸、例えば酢酸を用いて行うことが好ましい。当業者は、多糖の放出のための適切な酸および（例えば濃度、温度および／または時間の）条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、蒸留水中に約０．５ｍｇ／ｍｌにて懸濁された細胞を、１％酢酸（ｖ／ｖ）で１００℃にて２時間処理することが適切であることを見出した。その他の酸、例えばトリフルオロ酢酸またはその他の有機酸での処理も適切であり得る。
【００２９】
異なる酸処理の効力は、日常的な方法を用いて試験してよい。例えば、酸処理の後に、細胞を単離し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖放出の公知の方法（例えば参考文献１のリソスタフィンベースの方法）を用いて処理して、追加の莢膜多糖が放出され得るかを見ることができる。追加の莢膜多糖が放出されるならば、酸処理中により大きい割合の莢膜糖が放出されるように、酸処理条件を変更してよい。この方法で、最適量の莢膜糖が放出されるように酸処理条件を最適化することが可能である。例えば、本発明者らは、蒸留水中に約０．５ｍｇ／ｍｌにて懸濁された細胞を１％酢酸（ｖ／ｖ）で１００℃にて２時間処理した後に、その後のリソスタフィン処理によりほとんど追加の莢膜糖が細胞から放出され得ないことを見出した。
【００３０】
本発明者らは、酸処理の後に、５型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％の間であり得ることを見出した。特に、Ｏ−アセチル化の程度は、６５〜９５％、特に７０〜９０％の間であり得る。典型的に、Ｏ−アセチル化の程度は、７５〜８５％の間、例えば約８０％である。同様の値を８型莢膜糖について得ることができる。所望により、莢膜糖のＯ−アセチル化の程度は、上で論じたさらなる処理ステップにより、次いで、変更してよい。
【００３１】
酸処理の後に、反応混合物は、典型的に中和される。このことは、塩基、例えばＮａＯＨを加えることにより達成してよい。細胞は遠心分離し、多糖含有上清を、貯蔵および／または追加の処理のために回収してよい。
【００３２】
酵素処理
酸処理の後に得られる多糖は、純粋でなく、細菌の核酸およびタンパク質が混入していることがある。これらの混入物は、酵素処理により除去できる。例えば、ＲＮＡはＲＮアーゼでの、ＤＮＡはＤＮアーゼでの、そしてタンパク質はプロテアーゼ（例えばプロナーゼ）での処理により除去できる。当業者は、混入物の除去のための適切な酵素および条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、多糖含有上清を、各５０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼおよびＲＮアーゼで、３７℃にて６〜８時間処理することが適切であることを見出した。その他の適切な条件は、文献、例えば参考文献１に開示されている。
【００３３】
酸処理の後に得られる多糖は、ペプチドグリカンもまたは代わりにペプチドグリカンが混入していることがある。この混入物も、酵素処理により除去できる。本発明者らは、ムタノリシンでの処理が、ペプチドグリカン混入を除去するのに有効であることを見出した。当業者は、ムタノリシンを用いてペプチドグリカンを除去するための適切な条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、多糖含有上清を、各１８０Ｕ／ｍｌのムタノリシンで、３７℃にて１６時間処理することが適切であることを見出した。処理の後に、懸濁物を遠心分離により清澄化し、多糖含有上清を、貯蔵および／または追加の処理のために回収してよい。
【００３４】
ダイアフィルトレーション
本発明のプロセスは、ダイアフィルトレーションのステップを含んでよい。このステップは、典型的には、上で論じた酸処理および／または酵素処理の後に行われる。本発明者らは、特にタンジェンシャルフローろ過によるダイアフィルトレーションステップが、多糖から不純物を除去するために特に有効であることを見出した。不純物は、典型的には、テイコ酸および／またはペプチドグリカンの断片のような低分子量混入物である。タンジェンシャルフローろ過は、１Ｍ ＮａＣｌ（例えば約１０容量に対して）、および次いでＮａＰｉ １０ｍＭ ｐＨ７．２緩衝液（例えば別の１０容量に対して）に対して適切に行われる。ろ過膜は、よって、莢膜多糖を保持しながら小分子量混入物の通過を可能にするものであるべきである。１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲のカットオフが典型的である。本発明者らは、３０ｋＤａカットオフ膜を用いるタンジェンシャルフローろ過が、大規模プロセスのために特に適切であることを見出した。
【００３５】
少なくとも５サイクル、例えば６、７、８、９、１０、１１またはそれより多いタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションを、通常行う。
【００３６】
ダイアフィルトレーションからの多糖含有保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、貯蔵および／または追加の処理のために回収する。
【００３７】
アニオン交換クロマトグラフィー
多糖は、アニオン交換クロマトグラフィーのステップによりさらに精製してよい。本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーが、多糖の良好な収率を維持しながら残存タンパク質および核酸の混入を除去するのに特に有効であることを見出した。
【００３８】
アニオン交換クロマトグラフィーステップは、上で論じた酸処理、酵素処理および／またはダイアフィルトレーションステップの後に行ってよい。
【００３９】
アニオン交換クロマトグラフィーは、任意の適切なアニオン交換マトリクスを用いて行ってよい。一般的に用いられるアニオン交換マトリクスは、Ｑ−樹脂（第４級アミンに基づく）およびＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエタンに基づく）のような樹脂である。本発明者らは、ＤＥＡＥ樹脂（例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が特に適切であることを見出したが、その他の樹脂も用い得る。
【００４０】
アニオン交換クロマトグラフィーのための適当な開始緩衝液および移動相緩衝液も、過度の負担なく日常的な実験により決定できる。アニオン交換クロマトグラフィーで用いるための典型的な緩衝液は、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ−ヒスチジン、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペリジン、塩化ナトリウムおよびリン酸塩の緩衝液を含む。本発明者らは、リン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液が、アニオン交換クロマトグラフィーのための開始緩衝液として適切であることを見出した。緩衝液は、任意の適切な濃度であってよい。例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウムが適切であると見出された。アニオン交換樹脂と結合する物質は、適切な緩衝液を用いて溶出できる。本発明者らは、ＮａＣｌ １Ｍの勾配が適切であることを見出した。
【００４１】
多糖を含有する溶離液画分は、２１５ｎｍにてＵＶ吸収を測定することにより決定できる。多糖を含有する画分は、貯蔵および／または追加の処理のために回収され、通常一緒に併せられる。
【００４２】
アニオン交換クロマトグラフィーステップは、例えば１、２、３、４または５回繰り返してよい。典型的に、アニオン交換クロマトグラフィーステップは、１回行われる。
【００４３】
ゲルろ過
本発明のプロセスは、ゲルろ過の１またはそれより多いステップ（複数可）を含み得る。このゲルろ過は、特定の長さの多糖分子を選択し、特にタンパク質による混入をさらに低減するために用いる。しかし、本発明者らは、参考文献１〜９のもののような以前の方法とは対照的に、ゲルろ過ステップが、高純度の多糖を得るために要求されないことを見出した。したがって、このステップは、本発明のプロセスから省いてよい。このステップを省くことは、プロセスを単純化し、全体的な費用を低減するので、有利である。
【００４４】
存在する場合、ゲルろ過ステップ（複数可）は、上で論じた酸処理、酵素処理、ダイアフィルトレーションおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーステップの後に行ってよい。典型的に、いずれのゲルろ過ステップ（複数可）も、上で論じたアニオン交換クロマトグラフィーステップの後に行う。
【００４５】
ゲルろ過ステップ（複数可）は、任意の適切なゲルろ過マトリクスを用いて行ってよい。一般的に用いられるゲルろ過マトリクスは、デキストランゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリアクリロイルモルホリンゲルおよびポリスチレンゲルなどに基づく。架橋デキストランゲルおよび混合ポリアクリルアミド／アガロースゲルも用いてよい。本発明者らは、デキストランゲル（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ３００ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が特に適切であることを見出したが、その他のゲルも用い得る。
【００４６】
ゲルろ過のための適当な移動相緩衝液は、過度の負担なく日常的な実験により決定できる。ゲルろ過で用いるための典型的な緩衝液は、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ−ヒスチジン、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペリジン、塩化ナトリウムおよびリン酸塩の緩衝液を含む。例えば、塩化ナトリウム緩衝液が適切であり得る。緩衝液は、任意の適切な濃度であってよい。例えば５０ｍＭ塩化ナトリウムを移動相のために用いてよい。
【００４７】
多糖を含有する溶離液画分は、２１５ｎｍにてＵＶ吸収を測定することにより決定できる。多糖を含有する画分は、貯蔵および／または追加の処理のために回収され、通常一緒に併せられる。
【００４８】
濃縮
ゲルろ過の１もしくは複数のステップ（複数可）に加えてまたはその代わりに、本発明のプロセスは、多糖を濃縮する１またはそれより多いステップを含んでよい。この濃縮は、以下に記載するような担体分子への多糖の任意の後続のコンジュゲーションのための正確な濃度の試料を得るために有用である。しかし、本発明者らは、この濃縮ステップが、高純度の多糖を得るために要求されないことを見出した。したがって、このステップは、本発明のプロセスから省いてよい。
【００４９】
存在する場合、濃縮ステップ（複数可）は、上で論じた酸処理、酵素処理、ダイアフィルトレーション、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過ステップの後に行ってよい。典型的に、いずれの濃縮ステップ（複数可）も、上で論じたアニオン交換クロマトグラフィーステップの後に行う。上で論じたゲルろ過ステップ（複数可）に加えて用いるならば、濃縮ステップ（複数可）は、上で論じたゲルろ過ステップ（複数可）の前または後に行ってよい。しかし、典型的には、濃縮ステップ（複数可）は、ゲルろ過ステップ（複数可）の代わりに用いる。
【００５０】
濃縮ステップ（複数可）は、任意の適切な方法により行ってよい。例えば、本発明者らは、濃縮ステップ（複数可）が、上記のダイアフィルトレーションステップ（複数可）、例えば３０ｋＤａカットオフ膜を用いるタンジェンシャルフローろ過であってよいことを見出した。例えば、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（商標）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）３０ｋＤａカットオフ膜（２００ｃｍ２膜面積を有する）を用いてよい。
【００５１】
濃縮多糖試料を、貯蔵および／または追加の処理のために回収する。
【００５２】
莢膜多糖のさらなる処理
精製の後に、多糖は、混入物を除去するためにさらに処理してよい。これは、わずかな混入さえ許容できない（例えばヒトワクチン生成のため）状況において特に重要である。
【００５３】
精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖の分子質量は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なもののような［２８］プルラン標準物質に対するゲルろ過により測定できる。典型的に、精製多糖は、ある範囲内の値の質量を有する多糖の混合物である。５型莢膜多糖について、精製多糖の分子質量は、典型的に、２〜３５００ｋＤａの間、例えば１０〜２０００ｋＤａの間、特に２０〜１０００ｋＤａの間、より特に１００〜６００ｋＤａの間である。同様に、８型莢膜多糖について、精製多糖の分子質量は、２〜３５００ｋＤａの間、例えば１０〜２０００ｋＤａの間、特に２０〜１０００ｋＤａの間、より特に１００〜６００ｋＤａの間であってよい。
【００５４】
精製多糖は、解重合してオリゴ糖を形成してよい。オリゴ糖は、ワクチンにおいて用いるために好ましいことがある。オリゴ糖への解重合は、上記の任意のステップの前または後に生じてよい。典型的に、解重合は、上記のアニオン交換クロマトグラフィーの後に起こる。多糖がこのクロマトグラフィーの後に濃縮されるならば、解重合は、典型的に、この濃縮の後に起こる。本発明の組成物が解重合された多糖を含む場合、解重合は、任意のコンジュゲーションに先行することが好ましい。
【００５５】
全長多糖は、様々な方法により解重合して、本発明で用いるためのより短い断片を得てよい。好ましくは、参考文献２９に記載される方法を用いる。代わりに、多糖の解重合のためのその他の方法を用いてよい。例えば、多糖を加熱するかまたは顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）［３０］もしくは音波照射（ｓｏｎｉｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）［３］に供してよい。代わりに、酸化−還元［３１］またはオゾン分解［３２］による解重合を用いてよい。
【００５６】
オリゴ糖は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより同定できる。生成物を、長さが短いオリゴ糖を除去するために分類（ｓｉｚｅ）してよい。このことは、ゲルろ過のような様々な方法で達成できる。比分子質量（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ）は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なもののような［３３］プルラン標準物質に対するゲルろ過により測定できる。
【００５７】
天然莢膜多糖中のＮ−アセチル基が脱Ｎ−アセチル化されているならば、本発明のプロセスは、再Ｎ−アセチル化のステップを含んでよい。制御された再Ｎ−アセチル化は、例えば５％重炭酸アンモニウム中の無水酢酸（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏのような試薬を用いて簡便に行うことができる［３４］。
【００５８】
さらなる回のろ過、例えば滅菌ろ過も行うことができる。
【００５９】
これらの追加のステップは、一般的に、室温で行うことができる。
【００６０】
貯蔵
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖調製物は、精製プロセス中の任意の段階での貯蔵のために、例えば真空下での凍結乾燥または溶液中での凍結（例えば、含まれるならば最終濃縮ステップからの溶離液として）により凍結乾燥してよい。したがって、調製物は、プロセスのあるステップから別のステップへすぐに移す必要がない。例えば、多糖調製物をダイアフィルトレーションにより精製する場合、これは、この精製の前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。同様に、多糖は、アニオン交換クロマトグラフィーステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。多糖調製物がゲルろ過により精製されるならば、これは、このステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。同様に、多糖調製物が濃縮されるならば、これは、このステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。凍結乾燥調製物は、適当な溶液中で、さらなる処理の前に再構成される。同様に、凍結溶液は、さらなる処理の前に解凍される。
【００６１】
本発明のプロセスにより得られる精製多糖は、任意の適切な方法で貯蔵のために処理してよい。例えば、多糖は、上記のように凍結乾燥してよい。代わりに、多糖は、水溶液中で、典型的には低温、例えば−２０℃にて貯蔵してよい。簡便には、多糖は、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過または濃縮ステップからの溶離液として貯蔵してよい。
【００６２】
コンジュゲーション
本発明の最終的な精製莢膜多糖は、さらなる改変なしで、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイで用いるため、免疫化で用いるためなどの抗原として用いることができる。
【００６３】
免疫化の目的のために、しかし、多糖を、タンパク質のような担体分子にコンジュゲートすることが好ましい。一般的に、担体に多糖を共有結合的にコンジュゲーションすることは、多糖の免疫原性を増進する。なぜなら、このことにより、多糖がＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換し、よって、免疫学的な記憶のために初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）することが可能になるからである。コンジュゲーションは、小児科ワクチン［例えばｒｅｆ．３５］のために特に有用であり、周知の技術である［例えばｒｅｆ．３６〜４４において概説されている］。よって、本発明のプロセスは、精製多糖を担体分子にコンジュゲートするさらなるステップを含み得る。
【００６４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖のコンジュゲーションは、広く報告されており、例えば参考文献１〜９を参照されたい。コンジュゲーションのための文献で用いられている典型的なプロセスは、シスタミンを用いる精製多糖のチオール化を含む。この反応は、莢膜多糖中のカルボキシレート基の存在に依存する。これらの基は、シスタミンと、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣの存在下で反応する。誘導体化された多糖は、次いで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ内毒素Ａ（ＥＴＡ）のような担体タンパク質に、典型的にはリンカーを介してコンジュゲートする［２］。この様式で調製されるコンジュゲートワクチンは、ヒトにおいて安全で免疫原性であることが示されている［５］。他の研究者らは、還元的アミノ化［４５および１２］；グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｄｅｈｙｄｅ）カップリング［４５］；または多糖上のヒドロキシル基とＣＤＡＰ［４６］もしくは三塩化シアヌル［１１］のようなシアニル化剤との反応による精製５型および８型莢膜多糖のコンジュゲーションを行った。好ましくは、参考文献２９に記載されるプロセスを用いる。
【００６５】
好ましい担体タンパク質は、ジフテリアもしくは破傷風毒素のような細菌毒素、またはそのトキソイドもしくは変異体である。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［４７］が適切であることを見出した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＴＡ）およびその非毒性変異体組換えエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖のための担体タンパク質として用いられている（［１］および［２］）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓα−ヘモリシン（α−毒素）（［４５］および［４８］）、オボアルブミン［１１］およびヒト血清アルブミン［１２］も用いられている。これらの担体は、本発明で用いてよい。
【００６６】
その他の適切な担体タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［４９］、合成ペプチド［５０、５１］、熱ショックタンパク質［５２、５３］、百日咳タンパク質［５４、５５］、サイトカイン［５６］、リンホカイン［５６］、ホルモン［５６］、増殖因子［５６］、ヒト血清アルブミン（典型的には組換え）、Ｎ１９［５８］などのような様々な病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［５７］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのタンパク質Ｄ［５９〜６１］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［６２］、ニューモリシン［６３］もしくはその非毒性誘導体［６４］、鉄取り込みタンパク質［６５］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの毒素ＡもしくはＢ［６６］、ＧＢＳタンパク質［６７］、ＧＡＳタンパク質［６８］を含む。
【００６７】
その他の適切な担体タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原、例えば以下に示すＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原を含む。
【００６８】
担体との付着は、好ましくは、例えば担体タンパク質のリシン残基またはアルギニン残基の側鎖中の−ＮＨ２基を介する。付着は、例えばシステイン残基の側鎖中の−ＳＨ基を介してもよい。
【００６９】
例えば担体抑制（ｃａｒｒｉｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）の危険性を低減するために、１より多い担体タンパク質を用いることができる。つまり、異なる担体タンパク質を、５型および８型莢膜多糖のために用いることができ、例えば５型多糖をＣＲＭ１９７にコンジュゲートし、８型多糖をｒＥＰＡにコンジュゲートする。特定の多糖抗原について１より多い担体タンパク質を用いることもでき、例えば５型多糖が２つの群にあり、一方の群がＣＲＭ１９７にコンジュゲートし、他方がｒＥＰＡにコンジュゲートする。典型的には、しかし、同じ担体タンパク質を全ての多糖について用いる。
【００７０】
単一の担体タンパク質は、１より多い多糖抗原を持つことがある［６９、７０］。例えば単一の担体タンパク質は、５型および８型莢膜多糖にコンジュゲートされることがある。この目的を達成するために、異なる多糖を、コンジュゲーションプロセスの前に混合できる。典型的には、しかし、各多糖について別々のコンジュゲートがあり、異なる多糖はコンジュゲーションの後に混合される。別々のコンジュゲートは、同じ担体に基づいてよい。
【００７１】
１：２０（すなわち過剰のタンパク質）から２０：１（すなわち過剰の多糖）までの間の多糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）を有するコンジュゲートを、典型的に用いる。１：１０〜１：１の比、特に１：５から１：２までの間の比が好ましく、最も好ましくは約１：３である。対照的に、文献において用いられる５型および８型莢膜多糖コンジュゲートは、より高い比、例えば参考文献１、２および３における０．７３から１．０８までの間を有する傾向にある。本発明の特定の実施形態では、５型莢膜多糖コンジュゲートについての多糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、１：１０から１：２までの間であり、かつ／または８型莢膜多糖コンジュゲートについての多糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、１：５から７：１０までの間である。
【００７２】
コンジュゲートは、遊離担体とともに用いてよい［７１］。所定の担体タンパク質が、本発明の組成物において遊離およびコンジュゲートの形の両方で存在する場合、コンジュゲートしていない形は、好ましくは、組成物における全体としての担体タンパク質の合計量の５％以下であり、より好ましくは２重量％未満で存在する。
【００７３】
コンジュゲーションの後に、遊離多糖とコンジュゲート多糖とを分離できる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外ろ過、ダイアフィルトレーションなどを含む多くの適切な方法がある［ｒｅｆ．７２および７３なども参照されたい］。
【００７４】
コンジュゲートとその他の抗原との組み合わせ
本発明の方法により調製された多糖（特に上記のコンジュゲーションの後）は、例えば互いにおよび／またはその他の抗原と混合できる。よって、本発明のプロセスは、多糖を、１またはそれより多いさらなる抗原と混合するさらなるステップを含み得る。本発明は、よって、本発明の方法により調製された多糖と、１またはそれより多いさらなる抗原とを含む組成物を提供する。組成物は、典型的に、免疫原性組成物である。
【００７５】
さらなる抗原（複数可）は、本発明の方法により調製されたさらなる多糖を含んでよく、よって、本発明は、本発明の１より多い多糖を含む組成物を提供する。特に、本発明は、本発明の５型莢膜多糖と、本発明の８型莢膜多糖とを含む組成物を提供する。代わりに、さらなる抗原（複数可）は、本発明のもの以外の方法、例えば上記の参考文献１〜１８の方法により調製された５型または８型莢膜多糖であってよい。したがって、本発明は、５型莢膜多糖と８型莢膜多糖とを含む組成物であって、多糖の一方（５型多糖または８型多糖）が本発明の多糖であり、他方の多糖が本発明の多糖でない組成物を提供する。
【００７６】
複数の異なるＳ．ａｕｒｅｕｓコンジュゲートを混合する場合、これらは、同じＳ．ａｕｒｅｕｓ血清型からの異なるタイプのコンジュゲートおよび／または異なるＳ．ａｕｒｅｕｓ血清型からのコンジュゲートを含み得る。例えば、コンジュゲートは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型からであってよい。組成物は、別々のコンジュゲートを調製し（例えば各血清型について異なるコンジュゲート）、次いで、コンジュゲートを組み合わせることにより生成される。
【００７７】
さらなる抗原（複数可）は、以下に示す糖およびタンパク質抗原を含むその他のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を含んでよい。
【００７８】
さらなる抗原（複数可）は、非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体からの抗原を含んでよい。よって、本発明の組成物は、追加の細菌抗原、ウイルス抗原もしくは寄生生物抗原を含む１またはそれより多い非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原をさらに含んでよい。これらは、以下から選択してよい：
− ｒｅｆ．７４〜８０におけるもののようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂからのタンパク質抗原、タンパク質「２８７」（以下を参照されたい）および誘導体（例えば「ΔＧ２８７」）が特に好ましい。
− ｒｅｆ．８１、８２、８３、８４などに開示されるもののようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂからの外膜小胞（ＯＭＶ）調製物。
− 血清群Ｃからのｒｅｆ．８５に開示されるオリゴ糖またはｒｅｆ．８６のオリゴ糖のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの糖抗原。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原［例えばｒｅｆ．８７〜８９；ｒｅｆ．９６の第２２および２３章］。
− 不活化ウイルス［例えば９０、９１；ｒｅｆ．９６の第１５章］のようなＡ型肝炎ウイルスからの抗原。
− 表面および／またはコア抗原［例えば９１、９２；ｒｅｆ．９６の第１６章］のようなＢ型肝炎ウイルスからの抗原。
− Ｃ型肝炎ウイルスからの抗原［例えば９３］。
− パータクチンならびに／または凝集原２および３とも場合によって組み合わされた［例えばｒｅｆ．９４および９５；ｒｅｆ．９６の第２１章］Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）のようなＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの抗原。
− ジフテリアトキソイド［例えばｒｅｆ．９６の第１３章］のようなジフテリア抗原。
− 破傷風トキソイド［例えばｒｅｆ．９６の第２７章］のような破傷風抗原。
− Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂからの糖抗原［例えばｒｅｆ．９６の第１４章］。
− Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの抗原［例えば７４、７５、７６］。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの抗原［例えば９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３］。
− Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓからの抗原［例えば１０４］。
− Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからの抗原［例えば１０５］。
− ＩＰＶのようなポリオ抗原（複数可）［例えば１０６、１０７；ｒｅｆ．９６の第２４章］。
− 凍結乾燥不活化ウイルス［例えば１０９、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］のような狂犬病抗原（複数可）［例えば１０８］。
− 麻疹、耳下腺炎および／または風疹抗原［例えばｒｅｆ．９６の第１９、２０および２６章］。
− ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原（複数可）［例えばｒｅｆ．９６の第１７および１８章］。
− Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからの抗原［例えば１１０］。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）からの抗原［例えば１１１、１１２、１１３］。
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からの抗原［例えば６８、１１４〜１１６］。
− Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの抗原［例えばｒｅｆ．１１７、１１８および１１９に記載されるようなＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株およびＳＥ−１０株から得ることができるＩ、ＩＩおよび／またはＩＩＩ型莢膜多糖］。
【００７９】
糖または炭水化物抗原を用いる場合、これは、免疫原性を増進するために、担体にコンジュゲートするのが好ましい。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、髄膜炎菌および肺炎球菌の糖抗原のコンジュゲーションは、周知である。
【００８０】
毒性タンパク質抗原は、必要であれば解毒化してよい（例えば、化学的および／または遺伝子的手段による百日咳毒素の解毒化［９５］）。
【００８１】
ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も含むことが好ましい。
【００８２】
抗原は、アルミニウム塩に吸着されてよい。
【００８３】
１つのタイプの好ましい組成物は、免疫無防備状態に影響するさらなる抗原を含み、よって、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ多糖は、以下の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体からの１またはそれより多い抗原と組み合わせることができる：Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、インフルエンザウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびパラインフルエンザウイルス。
【００８４】
別のタイプの好ましい組成物は、院内感染と関連する細菌からのさらなる抗原を含み、よって、本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ多糖は、以下の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体からの１またはそれより多い抗原と組み合わせることができる：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよび腸外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。
【００８５】
組成物中の抗原は、典型的に、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分である。
【００８６】
本発明の組成物においてタンパク質抗原を用いる代わりに、抗原をコードする核酸を用いてよい［例えばｒｅｆ．１２０〜１２８］。本発明の組成物のタンパク質成分は、よって、タンパク質をコードする核酸（好ましくは例えばプラスミドの形のＤＮＡ）により置き換えることができる。
【００８７】
実際上の状況では、本発明の組成物に含まれる抗原の数に上限があることがある。本発明の組成物中の抗原の数（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原を含む）は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満または３未満であり得る。本発明の組成物中のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原の数は、６未満、５未満または４未満であり得る。
【００８８】
薬学的組成物および方法
本発明は、（ａ）本発明の多糖（場合によってコンジュゲートの形）を（ｂ）薬学的に許容される担体と混合するステップを含む、薬学的組成物を調製するためのプロセスを提供する。典型的な「薬学的に許容される担体」は、それ自体が、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意の担体を含む。適切な担体は、典型的に、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ラクトースおよび脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）のような大きく、緩慢に代謝される高分子である。このような担体は、当業者に周知である。ワクチンは、水、食塩水、グリセロールなどのような希釈剤も含有してよい。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が存在してよい。発熱物質を含まない滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水が典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤についての詳細な議論は、参考文献１２９で入手可能である。
【００８９】
本発明の組成物は、水性の形（すなわち溶液または懸濁液）または乾燥された形（例えば凍結乾燥された）であってよい。乾燥ワクチンを用いるならば、これは、注射の前に液体媒体中で再構成される。コンジュゲートワクチンの凍結乾燥は、当該技術において公知であり、例えばＭｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）製品は凍結乾燥された形であり、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）は、水性の形で提示される。凍結乾燥中にコンジュゲートを安定化するために、組成物中に糖アルコール（例えばマンニトール）または二糖（例えばスクロースまたはトレハロース）を、例えば１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌまでの間で（例えば約２５ｍｇ／ｍｌ）含むことが典型的であることがある。
【００９０】
薬学的組成物は、バイアルまたはシリンジに包装してよい。シリンジは、針とともにまたは針なしで供給してよい。シリンジは、組成物の単回用量を含むが、バイアルは単回用量または複数回用量を含み得る。
【００９１】
本発明の多糖の水性組成物は、凍結乾燥された形からの他のワクチンを再構成するために適切である。本発明の組成物をこのような即時再構成のために用いる場合、本発明は、凍結乾燥された物質を本発明の水性組成物と混合するステップを含む、このような凍結乾燥されたワクチンを再構成するためのプロセスを提供する。再構成された物質は、注射のために用いることができる。
【００９２】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原
上記のように、１またはそれより多いさらなるＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を、本発明の組成物に含めることができる。抗原は、タンパク質または糖抗原であってよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、本発明のコンジュゲートのための担体タンパク質、他のコンジュゲートのための担体タンパク質、またはコンジュゲートしていないタンパク質抗原として用いてよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、他のコンジュゲートのための糖として、またはコンジュゲートしていない糖抗原として用いてよい。
【００９３】
適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）であるＳ．ａｕｒｅｕｓの菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む。この多糖は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方に存在し、いずれの供給源からでも単離できる［１３０、１３１］。例えば、ＰＮＡＧは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＭＮ８ｍ株から単離できる［１３２］。糖抗原は、細菌からの菌体外多糖の精製中に現れるサイズを有する多糖であってよいか、またはこれは、このような多糖の断片化により達成される多糖であってよく、例えばサイズは４００ｋＤａを超えるものから、７５から４００ｋＤａまでの間または１０から７５ｋＤａまでの間または３０反復単位まで変動し得る。糖抗原は、様々なＮ−アセチル化の程度を有することができ、参考文献１３３に記載されるように、ＰＮＡＧは、４０％より少なくＮ−アセチル化されていることがある（例えば３５、３０、２０、１５、１０または５％未満のＮ−アセチル化；脱アセチル化ＰＮＡＧは、ｄＰＮＡＧとしても公知である）。ＰＮＡＧの脱アセチル化されたエピトープは、オプソニン性の殺傷を媒介できる抗体を誘発できる。ｄＰＮＡＧの調製は、参考文献１３４に記載されている。ＰＮＡＧは、Ｏ−スクシニル化されていることがあるかまたはされていないことがあり、例えば、これは、２５、２０、１５、１０、５、２、１または０．１％未満の残基でＯ−スクシニル化されてよい。ＰＮＡＧは、上記の担体分子にコンジュゲートしているか、または代わりにコンジュゲートしていないことがある。
【００９４】
別の適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、３３６型抗原であり、これは、Ｏ−アセチル化がないβ−連結ヘキソサミンである［１３５、１３６］。３３６型抗原は、３３６株（ＡＴＣＣ５５８０４）に対して産生された抗体と交差反応性である。３３６型抗原は、上記の担体分子にコンジュゲートしているか、または代わりにコンジュゲートしていないことがある。
【００９５】
適切なＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、以下のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原（またはその免疫原性断片（複数可）を含む抗原）を含む［例えば参考文献１３７〜１４４を参照されたい］：ＡｈｐＣ、ＡｈｐＦ、自己溶解素アミダーゼ、自己溶解素グルコサミニダーゼ、コラーゲン結合タンパク質ＣＡＮ、ＥｂｈＢ、ＧｅｈＤリパーゼ、ヘパリン結合タンパク質ＨＢＰ（１７ｋＤａ）、ラミニン受容体、ＭＡＰ、ＭｎｔＣ（ＳｉｔＣとしても公知）、ＭＲＰＩＩ、Ｎｐａｓｅ、ＯＲＦ０５９４、ＯＲＦ０６５７ｎ、ＯＲＦ０８２６、ＰＢＰ４、ＲＡＰ（ＲＮＡＩＩＩ活性化タンパク質）、Ｓａｉ−１、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２およびビトロネクチン結合タンパク質。
【００９６】
さらに適切なＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、以下に記載するようなｃｌｆＡ抗原；ｃｌｆＢ抗原；ｓｄｒＥ２抗原；ｓｄｒＣ抗原；ｓａｓＦ抗原、ｅｍｐ抗原；ｓｄｒＤ抗原；ｓｐａ抗原；ｅｓａＣ抗原；ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；ｉｓｄＣ抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；ｉｓｄＡ抗原；ｉｓｄＢ抗原；およびｓｔａ０７３抗原を含む。これらの抗原の１または複数（すなわち１、２、３、４、５、６またはそれより多い）が、本発明の組成物に存在してよい。これらの抗原のうち、ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；および／またはｓｔａ０７３抗原の１または複数（すなわち１、２、３、４、５、６またはそれより多い）の使用が特に構想される。
【００９７】
例えば、本発明の組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原の以下の組み合わせの１つを含んでよい：
（１）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびＨｌａ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばｅｓｘＢ抗原がｅｓｘＡ抗原の下流にあるＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（２）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせてよい。
（３）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（４）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせてよい。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（５）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびＨｌａ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（６）Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異を含む解毒化変異体であってよい。
（７）ｅｓｘＡ抗原およびｅｓｘＢ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（８）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ００６抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（９）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせてよい。
（１０）ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。
【００９８】
さらなるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原は、参考文献１４５に開示されている。
【００９９】
ｃｌｆＡ
「ｃｌｆＡ」抗原は、「凝集因子（ｃｌｕｍｐｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）Ａ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｃｌｆＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿００８１２であり、配列番号１のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４５７２）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿０７５６（ＧＩ：１５１２２０９６８）である。
【０１００】
有用なｃｌｆＡ抗原は、配列番号１を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｃｌｆＡタンパク質は、配列番号１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１の最後の３６８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１の最初の３９のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１０１】
配列番号２は、配列番号１の有用な断片である（「ＣｌｆＡ４０−５５９」）。この断片は、配列番号１のＣ末端に向かう長い反復領域が省かれる。
【０１０２】
ｃｌｆＢ
「ｃｌｆＢ」抗原は、「凝集因子Ｂ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｃｌｆＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿０２９６３であり、配列番号３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９６５８５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿２５２９（ＧＩ：１５１２２２７４１）である。
【０１０３】
有用なｃｌｆＢ抗原は、配列番号３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｃｌｆＢタンパク質は、配列番号３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号３の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号３の最後の４０のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号３の最初の４４のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ＣｌｆＢは、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために助けとなる。
【０１０４】
配列番号４は、配列番号３の有用な断片である（「ＣｌｆＢ４５−５５２」）。この断片は、ＣｌｆＢの最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。ＣｌｆＢの３ドメインモデルに基づくその他の有用な断片は、ＣｌｆＢ４５−３６０（ＣＬｆＢ−Ｎ１２としても公知；配列番号５）；ＣｌｆＢ２１２−５４２（ＣＬｆＢ−Ｎ２３としても公知；配列番号６）；およびＣｌｆＢ３６０−５４２（ＣＬｆＢ−Ｎ３としても公知；配列番号７）を含む。
【０１０５】
ｓｄｒＥ２
「ｓｄｒＥ２」抗原は、「Ｓｅｒ−Ａｓｐリッチフィブリノゲン／骨シアロタンパク質結合タンパク質ＳｄｒＥ」と注釈されている。Ｎｅｗｍａｎ株では、ｓｄｒＥ２はＮＷＭＮ＿０５２５であり、配列番号８のアミノ酸配列（ＧＩ：１５１２２０７３７）を有する。
【０１０６】
有用なｓｄｒＥ２抗原は、配列番号８を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号８と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＥ２タンパク質は、配列番号８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号８のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号８の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号８の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号８の最初の５２のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｄｒＥ２は、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために大いに助けとなる。
【０１０７】
配列番号９は、配列番号８の有用な断片である（「ＳｄｒＥ５３−６３２」）。この断片は、ＳｄｒＥ２の最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。
【０１０８】
ｓｄｒＣ
「ｓｄｒＣ」抗原は、「ｓｄｒＣタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｄｒＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿００５４４であり、配列番号１０のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４３２４）を有する。
【０１０９】
有用なｓｄｒＣ抗原は、配列番号１０を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１０と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＣタンパク質は、配列番号１０の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１０のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１０の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１０の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１０の最初の５０のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｄｒＣは、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために助けとなる。
【０１１０】
配列番号１１は、配列番号１０の有用な断片である（「ＳｄｒＣ５１−５１８」）。この断片は、ＳｄｒＣの最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。
【０１１１】
ｓａｓＦ
「ｓａｓＦ」抗原は、「ｓａｓＦタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓａｓＦはＳＡＯＵＨＳＣ＿０２９８２であり、配列番号１２のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９６６０１）を有する。
【０１１２】
有用なｓａｓＦ抗原は、配列番号１２を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１２と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓａｓＦタンパク質は、配列番号１２の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１２のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１２の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１２の最後の３９のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１２の最初の３７のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１１３】
ｅｍｐ
「ｅｍｐ」抗原は、「細胞外基質および血漿結合タンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｍｐはＳＡＯＵＨＳＣ＿００８１６であり、配列番号１３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４５７５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿０７５８（ＧＩ：１５１２２０９７０）である。
【０１１４】
有用なｅｍｐ抗原は、配列番号１３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｍｐタンパク質は、配列番号１３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１３の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１３の最初の２６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１１５】
配列番号１４、１５、１６および１７は、配列番号１３の有用な断片である（それぞれ、「Ｅｍｐ３５−３４０」、「Ｅｍｐ２７−３３４」、「Ｅｍｐ３５−３３４」および「Ｅｍｐ２７−１４７」）。
【０１１６】
ｓｄｒＤ
「ｓｄｒＤ」抗原は、「ｓｄｒＤタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｄｒＤはＳＡＯＵＨＳＣ＿００５４５であり、配列番号１８のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４３２５）を有する。
【０１１７】
有用なｓｄｒＤ抗原は、配列番号１８を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号１８と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号１８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＤタンパク質は、配列番号１８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１８からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１８のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号１８の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号１８の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号１８の最初の５２のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｄｒＤは、天然で、長いタンパク質であるので、断片の使用が、例えば精製、取り扱い、融合、発現などのために大いに助けとなる。
【０１１８】
配列番号１９は、配列番号１８の有用な断片である（「ＳｄｒＤ５３−５９２」）。この断片は、ＳｄｒＤの最も曝露されるドメインを含み、工業的な規模でより容易に用いられる。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。同じＣ末端残基を有する別の有用な断片は、ＳｄｒＤ３９４−５９２（ＳｄｒＤ−Ｎ３としても公知；配列番号２０）である。
【０１１９】
ｓｐａ
「ｓｐａ」抗原は、「プロテインＡ」または「ＳｐＡ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｐａはＳＡＯＵＨＳＣ＿０００６９であり、配列番号２１のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９３８８５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿００５５（ＧＩ：１５１２２０２６７）である。全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株は、その細胞壁に繋留された表面タンパク質生成物がＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣとよばれる５つの高度に相同性の免疫グロブリン結合ドメインを有する［１４６］、詳細に特徴づけられた毒性因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ）であるｓｐａについての構造遺伝子を発現する。これらのドメインは、アミノ酸レベルで約８０％の同一性を示し、５６〜６１残基の長さであり、タンデムリピートとして組織化されている［１４７］。ＳｐＡは、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端局在化シグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）とを有する前駆体タンパク質として合成される［１４８、１４９］。細胞壁に繋留されたｓｐａは、ブドウ球菌表面上で非常に豊富に提示される［１５０、１５１］。その免疫グロブリン結合ドメインのそれぞれは、３ヘリックスの束に組み立てられる逆平行α−ヘリックスで構成され、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメイン［１５２、１５３］、ＩｇＭのＶＨ３重鎖（Ｆａｂ）（すなわちＢ細胞受容体）［１５４］、そのＡ１ドメインにてフォンウィルブランド因子［１５５］および／または気道上皮の表面上に提示されるＴＮＦ−α受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）［１５６］と結合できる。
【０１２０】
有用なｓｐａ抗原は、配列番号２１を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２１と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２１の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｐａタンパク質は、配列番号２１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２１からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２１のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２１の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２１の最後の３５のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号２１の最初の３６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。参考文献１５７は、個別のＩｇＧ結合ドメインが、単独または組み合わせて有用な免疫原である可能性があることを示唆している。
【０１２１】
配列番号２２は、配列番号２１の有用な断片である（「Ｓｐａ３７−３２５」）。この断片は、５つのＳｐＡ Ｉｇ結合ドメイン全てを含有し、ＳｐＡの最も曝露されるドメインを含む。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。その他の有用な断片は、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥドメインの１、２、３または４つを省いてよい。参考文献１５７に報告されるように、その他の有用な断片は、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥドメインの１、２、３または４つだけを含んでよく、例えばＳｐＡ（Ａ）ドメインのみを含むがＢ〜Ｅを含まないか、またはＳｐＡ（Ｄ）ドメインのみを含むがＡもＢもＣもＥも含まないなどである。よって、本発明で有用なｓｐａ抗原は、１、２、３、４または５つのＩｇＧ結合ドメインを含み得るが、理想的には４つ以下を有する。抗原が、ｓｐａドメインのうち１つの型のみ（例えばＳｐａ（Ａ）またはＳｐＡ（Ｄ）ドメインだけ）を含むならば、これは、このドメインの１より多いコピー、例えば単一ポリペプチド鎖中に複数のＳｐＡ（Ｄ）ドメインを含んでよい。抗原内の個別のドメインは、配列番号２１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸にて変異され得る（例えば、ドメインＤの残基３および／または２４、ドメインＡの残基４６および／または５３などでの変異を開示する参考文献１５７を参照されたい）。このような変異体は、配列番号２１を認識する抗体を誘発する抗原の能力を除去すべきではないが、ＩｇＧとの抗原の結合を除去し得る。いくつかの態様では、ｓｐａ抗原は、（ａ）ＩｇＧ Ｆｃとの結合を破壊するかもしくは減少させる、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥのＩｇＧ Ｆｃ結合サブドメインにおける１またはそれより多いアミノ酸置換と、（ｂ）ＶＨ３との結合を破壊するかもしくは減少させる、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥのＶＨ３結合サブドメインにおける１またはそれより多いアミノ酸置換とでの置換を含む。いくつかの実施形態では、改変体ＳｐＡは、少なくともまたは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い改変体ＳｐＡドメインＤペプチドを含む。
【０１２２】
ｅｓａＣ
「ｅｓａＣ」抗原は、「ｅｓａＣ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｓａＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６４であり、配列番号２３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４０６９）を有する。
【０１２３】
有用なｅｓａＣ抗原は、配列番号２３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓａＣタンパク質は、配列番号２３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２３の少なくとも１つのエピトープを保持している。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１２４】
ｅｓｘＡ
「ｅｓｘＡ」抗原は、「タンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｓｘＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２５７であり、配列番号２４のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４０６３）を有する。
【０１２５】
有用なｅｓｘＡ抗原は、配列番号２４を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２４と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２４の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓｘＡタンパク質は、配列番号２４の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２４からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２４のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２４の少なくとも１つのエピトープを保持している。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１２６】
ｅｓｘＢ
「ｅｓｘＢ」抗原は、「ｅｓｘＢ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｅｓｘＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６５であり、配列番号２５のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４０７０）を有する。
【０１２７】
有用なｅｓｘＢ抗原は、配列番号２５を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２５と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２５の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓｘＢタンパク質は、配列番号２５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２５からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２５のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２５の少なくとも１つのエピトープを保持している。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１２８】
ｓｔａ００６
「ｓｔａ００６」抗原は、「フェリクローム結合タンパク質」と注釈され、文献中で「ＦｈｕＤ２」ともよばれている［１５８］。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｔａ００６はＳＡＯＵＨＳＣ＿０２５５４であり、配列番号２６のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９６１９９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿２１８５（ＧＩ：１５１２２２３９７）である。
【０１２９】
有用なｓｔａ００６抗原は、配列番号２６を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２６と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２６の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ００６タンパク質は、配列番号２６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２６からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２６のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２６の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２６の最初の１７のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｔａ００６の変異体形態は、参考文献１５９で報告されている。ｓｔａ００６抗原は、例えばアシル化Ｎ末端システインで脂質化されてよい。
【０１３０】
ｉｓｄＣ
「ｉｓｄＣ」抗原は、「タンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｉｓｄＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０８２であり、配列番号２７のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８３０）を有する。
【０１３１】
有用なｉｓｄＣ抗原は、配列番号２７を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２７と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２７の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＣタンパク質は、配列番号２７の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２７からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２７のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２７の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２７の最後の３９のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号２７の最初の２８のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ＩｓｄＢの有用な断片は、参考文献１６５に開示されている。参考文献１６０は、ＩｓｄＢおよびＩｓｄＨの両方からのエピトープを有用に含む抗原を開示している。
【０１３２】
Ｈｌａ
「Ｈｌａ」抗原は、「アルファ毒素」または単に「溶血素」としても公知の「アルファ溶血素前駆体」である。ＮＣＴＣ８３２５株では、ＨｌａはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１１２１であり、配列番号２８のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８６５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿１０７３（ＧＩ：１５１２２１２８５）である。Ｈｌａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのほとんどの株により生成される重要な病毒性決定基であり、孔形成および溶血活性を有する。抗Ｈｌａ抗体は、動物モデルにおける毒素の有害な影響を中和でき、Ｈｌａは、肺炎に対する防御のために特に有用である。
【０１３３】
有用なＨｌａ抗原は、配列番号２８を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号２８と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号２８の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのＨｌａタンパク質は、配列番号２８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２８からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２８のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号２８の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号２８の最初の２６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。Ｃ末端での切断を用いて、例えば５０アミノ酸だけ（配列番号２８の残基２７〜７６）を残すこともできる［１６１］。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１３４】
Ｈｌａの毒性は、本発明の組成物において、化学的不活化（例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはその他の架橋試薬を用いて）により回避できる。しかし、代わりに、その免疫原性を保持しながら毒性活性が除去されたＨｌａの変異体形態を用いることが好ましい。このような解毒化変異体は、当該技術において既に公知である。ある有用なＨｌａ抗原は、配列番号２８の残基６１（これは、成熟抗原の残基３５である（すなわち、最初の２６のＮ末端アミノ酸を省いた後））にて変異を有する。よって、残基６１はヒスチジンではないことがあり、代わりに例えばＩｌｅ、Ｖａｌまたは好ましくはＬｅｕであり得る。この位置でのＨｉｓ−Ａｒｇ変異を用いることもできる。例えば、配列番号２９は、成熟変異体Ｈｌａ−Ｈ３５Ｌ配列であり、有用なＨｌａ抗原は、配列番号２９を含む。別の有用な変異は、長いループを短い配列で置き換えて、例えば配列番号２８の残基１３６〜１７４での３９マーを、配列番号３１（Ｈ３５Ｌ変異も含む）および配列番号３２（Ｈ３５Ｌ変異を含まない）でのようにＰＳＧＳ（配列番号３０）のようなテトラマーで置き換える。
【０１３５】
さらに有用なＨｌａ抗原は、参考文献１６２および１６３に開示されている。
【０１３６】
配列番号３３、３４および３５は、配列番号２８の３つの有用な断片である（それぞれ「Ｈｌａ２７−７６」、「Ｈｌａ２７−８９」および「Ｈｌａ２７−７９」）。配列番号３６、３７および３８は、配列番号２９からの対応する断片である。
【０１３７】
ｓｔａ０１１
「ｓｔａ０１１」抗原は、「リポタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｔａ０１１はＳＡＯＵＨＳＣ＿０００５２であり、配列番号３９のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９３８７２）を有する。
【０１３８】
有用なｓｔａ０１１抗原は、配列番号３９を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号３９と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号３９の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ０１１タンパク質は、配列番号３９の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３９からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３９のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号３９の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号３９の最初の２３のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ｓｔａ００６抗原は、例えばアシル化Ｎ末端システインで脂質化されてよい。
【０１３９】
ｓｔａ０１１抗原を調製するために用い得る配列番号３９の改変体形は、それらに限定されないが、様々なＩｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ置換を有する配列番号４０、４１および４２を含む。
【０１４０】
ｉｓｄＡ
「ｉｓｄＡ」抗原は、「ＩｓｄＡタンパク質」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｉｓｄＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０８１であり、配列番号４３のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８２９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿１０４１（ＧＩ：１５１２２１２５３）である。
【０１４１】
有用なｉｓｄＡ抗原は、配列番号４３を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号４３と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号４３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＡタンパク質は、配列番号４３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４３からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４３のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号４３の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号４３の最後の３８のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号４３の最初の４６のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号４３のＣ末端３８マー（ＬＰＫＴＧモチーフで始まる）を排除するための切断も有用である。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１４２】
配列番号４４は、配列番号４３の有用な断片であり（配列番号４３のアミノ酸４０〜１８４；「ＩｓｄＡ４０−１８４」）、これは、天然タンパク質のヘム結合部位を含み、抗原の最も曝露されるドメインを含む。これは、ヒトタンパク質との抗原の類似性も低減する。その他の有用な断片は、参考文献１６４および１６５に開示されている。
【０１４３】
ＩｓｄＡは、水酸化アルミニウムアジュバントに良好に吸着しないので、組成物に存在するＩｓｄＡは、吸着されないでよいか、または代替アジュバント、例えばリン酸アルミニウムに吸着されてよい。
【０１４４】
ｉｓｄＢ
「ｉｓｄＢ」抗原は、「神経フィラメントタンパク質ｉｓｄＢ」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｉｓｄＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０７９であり、配列番号４５のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４８２８）を有する。ＩｓｄＢは、それ自体でワクチン抗原として用いることが提案されているが［１６６］、これは、肺炎を予防しないことがある。
【０１４５】
有用なｉｓｄＢ抗原は、配列番号４５を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号４５と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号４５の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＢタンパク質は、配列番号４５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４５からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４５のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号４５の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号４５の最後の３６のＣ末端アミノ酸を有用に省くことができる。配列番号４５の最初の４０のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。ＩｓｄＢの有用な断片は、参考文献１６５および１６７に開示され、例えば配列番号４５の３７の内部アミノ酸を欠失している。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｉｓｄＢ抗原を含まない。
【０１４７】
ｓｔａ０７３
「ｓｔａ０７３」抗原は、「二機能性自己溶解素前駆体」と注釈されている。ＮＣＴＣ８３２５株では、ｓｔａ０７３はＳＡＯＵＨＳＣ＿００９９４であり、配列番号４６のアミノ酸配列（ＧＩ：８８１９４７５０）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株では、これはｎｗｍｎ＿０９２２（ＧＩ：１５１２２１１３４）である。プロテオミクス解析により、このタンパク質は、分泌されるかまたは表面に曝露されることが明らかになっている。
【０１４８】
有用なｓｔａ０７３抗原は、配列番号４６を認識する抗体（例えばヒトに投与された場合）を誘発でき、かつ／または（ａ）配列番号４６と５０％またはそれより高い同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有し、かつ／もしくは（ｂ）配列番号４６の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ０７３タンパク質は、配列番号４６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４６からのエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４６のＣ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１またはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、配列番号４６の少なくとも１つのエピトープを保持している。配列番号４６の最初の２４のＮ末端アミノ酸を有用に省くことができる。その他の断片は、１またはそれより多いタンパク質ドメインが省かれる。
【０１４９】
ｓｔａ０７３は、水酸化アルミニウムアジュバントに良好に吸着しないので、組成物に存在するＳｔａ０７３は、吸着されないでよいか、または代替アジュバント、例えばリン酸アルミニウムに吸着されてよい。
【０１５０】
ハイブリッドポリペプチド
本発明で用いられるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、個別の分離したポリペプチドとして組成物に存在してよい。１より多い抗原を用いる場合、しかし、これらは、分離したポリペプチドとして提示される必要はない。代わりに、少なくとも２（例えば２、３、４、５またはそれより多い）の抗原は、単一ポリペプチド鎖として発現され得る（「ハイブリッド」ポリペプチド）。ハイブリッドポリペプチドは、２つの主な利点を提供する。第１に、それ自体では不安定または発現が乏しいことがあるポリペプチドが、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することにより援助され得る。第２に、商業的な製造が単純化される。なぜなら、ともに抗原的に有用な２つのポリペプチドを生成するために、１回だけの発現および精製の使用しか必要としないからである。
【０１５１】
ハイブリッドポリペプチドは、上に列挙した抗原のそれぞれからの２またはそれより多いポリペプチド配列、または配列が株間で部分的に変動している場合は同じ抗原の２またはそれより多い改変体を含んでよい。
【０１５２】
２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗原からのアミノ酸配列からなるハイブリッドが有用である。特に、２もしくは３の抗原のような２、３、４または５の抗原からのアミノ酸配列からなるハイブリッドが好ましい。
【０１５３】
異なるハイブリッドポリペプチドを、単一製剤中に一緒に混合してよい。ハイブリッドは、第１、第２または第３抗原群より選択される非ハイブリッド抗原と組み合わせてよい。このような組み合わせのうち、抗原は、１より多いハイブリッドポリペプチド中に、および／または非ハイブリッドポリペプチドとして存在してよい。しかし、抗原が、ハイブリッドまたは非ハイブリッドのいずれかとして存在するが、これらの両方として存在しないことが好ましい。
【０１５４】
ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、上記のようなＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原のアミノ酸配列であり、Ｌは、場合によって存在するリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、場合によって存在するＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、場合によって存在するＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２またはそれより大きい整数（例えば２、３、４、５、６など）である）で表すことができる。通常、ｎは２または３である。
【０１５５】
−Ｘ−部分がこの野生型の形においてリーダーペプチド配列を有するならば、これは、ハイブリッドタンパク質に含めてよいか、またはハイブリッドタンパク質から省いてよい。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端にある−Ｘ−部分のものを除いて削除され、すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２・・・Ｘｎのリーダーペプチドは省かれる。このことは、全てのリーダーペプチドを削除し、Ｘ１のリーダーペプチドを−Ａ−部分として用いることと等価である。
【０１５６】
｛−Ｘ−Ｌ−｝のｎの場合のそれぞれについて、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してよいかまたは存在しなくてよい。例えば、ｎ＝２である場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであってよい。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、典型的には短い（例えば２０以下のアミノ酸、すなわち２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわちＧｌｙｎ（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）を含む）およびヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い））が含まれる。その他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号４７）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号４８）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成されるので、クローニングおよび操作の助けとなり、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドが、典型的なポリ−グリシンリンカーである。特に最後のＬｎとして用いるためのその他の適切なリンカーは、ＡＳＧＧＧＳ（例えば配列番号５０によりコードされる配列番号４９）またはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。
【０１５７】
−Ａ−は、場合によって存在するＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０またはそれより少ないアミノ酸、すなわち４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を誘導するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い））が含まれる。その他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠失している場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または単一Ｍｅｔ残基である。
【０１５８】
−Ｂ−は、場合によって存在するＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０またはそれより少ないアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を誘導する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）を含む、例えば配列番号５１）、またはタンパク質安定性を増進する配列が含まれる。その他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【０１５９】
本発明のあるハイブリッドポリペプチドは、ＥｓｘＡ抗原およびＥｓｘＢ抗原をともに含んでよい。これらは、Ｎ末端からＣ末端のいずれの順序でもよい。配列番号５２（「ＥｓｘＡＢ」；配列番号５３によりコードされる）および５４（「ＥｓｘＢＡ」）は、このようなハイブリッドの例であり、これらはともにヘキサペプチドリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号４９）を有する。
【０１６０】
一般
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の技量内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば参考文献１６８〜１７５などを参照されたい。
【０１６１】
「ＧＩ」番号付けを上記で用いている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」は、そのデータベースに配列が加えられた場合に、ＮＣＢＩにより処理されるそれぞれの記録された配列に連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、記録された配列の受託番号に似ていない。配列がアップデートされたとき（例えば修正のため、またはさらなる注釈もしくは情報を加えるため）に、新しいＧＩ番号が与えられる。よって、所与のＧＩ番号に付随する配列は、決して変更されない。
【０１６２】
２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、整列させたときに、アミノ酸のそのパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術において公知のソフトウェアプログラム、例えばｒｅｆ．１７６の７．７．１８節に記載されるものを用いて決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップ開始ペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティでのアフィンギャップ検索、６２のＢＬＯＳＵＭ行列を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ｒｅｆ．１７７に開示されている。
【０１６３】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであってよい。このようなエピトープは、経験的に同定できる（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［１７８、１７９］または類似の方法を用いて）か、またはこれらは予想できる（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）［１８０］、行列に基づくアプローチ［１８１］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［１８２］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１８３、１８４］、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）［１８５］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［１８６、１８７］、ＡＤＥＰＴ［１８８］、Ｔｓｉｔｅｓ［１８９］、親水性［１９０］、抗原インデックス［１９１］または参考文献１９２〜１９６に開示される方法などを用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位により認識され、それと結合する抗原の部分であり、これらは、「抗原決定基」とよぶこともできる。
【０１６４】
抗原「ドメイン」が省かれる場合、このことは、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインなどが省かれることを含み得る。
【０１６５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または何か追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【０１６６】
数値ｘに関する「約」との用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１６７】
「実質的に」との語句は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことがある。必要であれば、「実質的に」との語を、本発明の定義から省くことができる。
【０１６８】
本発明が複数の逐次的なステップを含むプロセスを提供する場合、本発明は、ステップの合計数より少ないものを含むプロセスも提供することができる。異なるステップは、非常に異なる回数で異なる人により異なる場所（例えば異なる国）で行うことができる。
【０１６９】
糖の環は、開放または閉鎖された形で存在でき、閉鎖形を本明細書において構造式で示すが、開放形も本発明に包含されることが認識される。同様に、糖は、ピラノースおよびフラノース形で存在でき、ピラノース形を本明細書において構造式で示すが、フラノース形も包含されることが認識される。糖の異なるアノマー形も包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、参考文献１３の方法に基づくＳ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を精製するためのプロセスを示す図である。
【図２】図２は、莢膜多糖のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラムおよび図１の方法に従って調製した莢膜多糖含有画分（画分６８〜８０）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】図３は、莢膜多糖のＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌクロマトグラムおよび図１の方法に従って調製した莢膜多糖含有画分（画分２２〜４４）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】図４は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を精製するための本発明の例示的なプロセスを示す図である。
【図５】図５は、本発明の方法に従って調製した莢膜多糖のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６は、精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図７】図７は、参考文献１９７、１９８、１９９および２００に基づくＳ．ａｕｒｅｕｓのペプチドグリカンの化学構造を示す図である。反復単位を強調する。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
Ａ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖の精製（比較例）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を、参考文献１３の方法に基づく図１に示すスキームに従って精製した。この方法の様々なステップについての条件および原理的説明を、表１に記載する。
【０１７２】
【表１】
細菌ペレット遠心分離および酵素反応（リソスタフィンおよびＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを固体培地で成長させて、６００〜８００ｍｌの細菌懸濁物を得た。８０００ｒｐｍにて遠心分離することにより採集した湿潤細胞ペレットは、約３０〜５０ｇの質量を有した。採集したペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ｐＨ７．５で３回洗浄し、次いで、１ｍｌあたり０．２５〜０．５ｇにて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ｐＨ７．５に懸濁し、０．１〜０．１３ｍｇ／ｍｌのリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。反応混合物は、３７℃にて１６時間（ＯＮ）穏やかに撹拌しながらインキュベートした。０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を懸濁物に加え、３７℃にて５〜７時間インキュベートした。懸濁物を、次いで、遠心分離により清澄化した。
【０１７３】
ＮａＩＯ４との反応
物質を、５０ｍＭ ＮａＩＯ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、暗所にて５〜７時間インキュベートした。ＮａＩＯ４を、次いで、過剰のグリセロールを明所にて撹拌しながら３０分間加えることにより除去した。
【０１７４】
３０ｋＤａタンジェンシャルフローろ過
タンジェンシャルフローろ過を、表２に示すようにして行った。
【０１７５】
【表２】
タンジェンシャルフローろ過は、０．１ｍ２カセットのためのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ホルダーにおいて、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｎ（商標）蠕動ポンプを用いて行った。その後、膜をＮａＯＨ １Ｍで洗浄し、ＮａＯＨ ０．１Ｍ中で＋２〜８℃にて貯蔵した。
【０１７６】
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
残存タンパク質、核酸およびその他の不純物を、表３に従って行ったアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
【０１７７】
【表３】
クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ（商標）システム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、莢膜多糖を、ＵＶ吸収を２１５ｎｍにて測定することにより検出した。莢膜多糖溶液をまず、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２に加えて、１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．２の最終緩衝液濃度を得た。ＤＥＡＥ樹脂を、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２でｐＨ７．２に予め平衡化し、次いで、１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２で平衡化して、示す伝導率（１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２伝導率）を達成した。得られた画分をＮＭＲにより分析し、莢膜多糖を含有するものを一緒に貯留した（図２）。
【０１７８】
Ｓ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌクロマトグラフィー
多糖を、表４に従って行ったゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０１７９】
【表４】
クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ（商標）システム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行い、莢膜多糖を、ＵＶ吸収を２１５ｎｍにて測定することにより検出した。得られた画分をＮＭＲにより分析し、莢膜多糖を含有するものを一緒に貯留した（図３）。
【０１８０】
Ｂ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖の精製（実施例）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を、図４に示すスキームに従って精製した。この方法の様々なステップについての条件および原理的説明を、表５に記載する。
【０１８１】
【表５】
細菌ペレット遠心分離ならびに酸および酵素反応（酢酸、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼおよびムタノリシン）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを固体培地で成長させて、６００〜８００ｍｌの細菌懸濁物を得た。８０００ｒｐｍにて遠心分離することにより採集した湿潤細胞ペレットは、約３０〜５０ｇの質量を有した。採集したペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ｐＨ７．５で３回洗浄し、次いで、１ｍｌあたり０．５〜０．６ｇにて蒸留水に懸濁し、激しく撹拌しながら温度を１００℃まで上昇させた。次いで、酢酸を１％の最終濃度まで加え、混合物を１００℃にて２時間保った。混合物をＮａＯＨ １Ｍで中和し、８０００ｒｐｍにて遠心分離した。
【０１８２】
上清をペレットからデカントし、０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を組み合わせた。混合物を、次いで、３７℃にて５〜７時間インキュベートし、その後、遠心分離により清澄化した。１８０Ｕ／ｍｌのムタノリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を次いで懸濁物に加え、混合物を１晩（１６時間）、３７℃にて穏やかに撹拌しながらインキュベートした。懸濁物を、次いで、遠心分離により再び清澄化した。
【０１８３】
３０ｋＤａタンジェンシャルフローろ過
タンジェンシャルフローろ過を、表６に示すようにして行った。
【０１８４】
【表６】
タンジェンシャルフローろ過は、０．２ｍ２カセットのためのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ホルダーにおいて、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｎ（商標）蠕動ポンプを用いて行った。その後、膜をＮａＯＨ １Ｍで洗浄し、ＮａＯＨ ０．１Ｍ中で＋２〜８℃にて貯蔵した。
【０１８５】
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
残存タンパク質、核酸およびその他の不純物を、表７に従って行ったアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
【０１８６】
【表７】
クロマトグラフィーを、Ａｋｔａ（商標）システム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、莢膜多糖を、ＵＶ吸収を２１５ｎｍにて測定することにより検出した。莢膜多糖溶液をまず、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２に加えて、１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．２の最終緩衝液濃度を得た。ＤＥＡＥ樹脂を、１００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２でｐＨ７．２に予め平衡化し、次いで、１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２で平衡化して、示す伝導率（１０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液ｐＨ７．２伝導率）を達成した。得られた画分をＮＭＲにより分析し、莢膜多糖を含有するものを一緒に貯留した（図５）。
【０１８７】
３０ｋＤａタンジェンシャルフローろ過
タンジェンシャルフローろ過を、アニオン交換クロマトグラフィーから残されたＮａＣｌを除去し、精製多糖を濃縮するために行った。ろ過は、表８に示すようにして行った。
【０１８８】
【表８】
タンジェンシャルフローろ過は、０．２ｍ２カセットのためのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ホルダーにおいて、ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｎ（商標）蠕動ポンプを用いて行った。その後、膜をＮａＯＨ １Ｍで洗浄し、ＮａＯＨ ０．１Ｍ中で＋２〜８℃にて貯蔵した。精製多糖をＮＭＲにより分析した（例えば５型莢膜多糖について図６）。
【０１８９】
Ｃ．精製多糖中のペプチドグリカン混入の決定
上記のＡおよびＢ節における方法に従って得られた精製５型多糖のペプチドグリカン（図７）含量を、製造者の使用説明に従ってＤｉｏｎｅｘ ＡＡＡ−Ｄｉｒｅｃｔ（商標）システム（ＡｍｉｎｏＰａｃ（商標）ＰＡ１０ ＡＡＡ−Ｄｉｒｅｃｔ（商標）、Ｄｉｏｎｅｘ）によりＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを用いるアミノ酸分析により決定した。簡単に述べると、２０μＬの１００μＭノルロイシンを、水中で２５０μｇ／ｍＬの２００μＬの多糖に、４００℃処理ガラスチューブ中で加え、Ｓｐｅｅｄｖａｃシステムを用いて乾燥した。ノルロイシンは、内部標準として役立つ。残存タンパク質およびペプチドグリカン混入からの遊離アミノ酸を得るために、試料を、減圧下で沸騰塩化水素酸／フェノールの蒸気を用いて加水分解した。遊離アミノ酸の分離は、ＡｍｉｎｏＰａｃ（商標）ＰＡ１０ガードカラム（２×５０ｍｍ）を備えたＡｍｉｎｏＰａｃ（商標）ＰＡ１０カラム（２×２５０ｍｍ）で、製造者の推奨に従うアミノ酸および炭水化物の勾配条件を用いて行った。これらの勾配条件を、表９にまとめる。
【０１９０】
【表９】
検出は、ＡＡＡ−Ｄｉｒｅｃｔ波形電位を用いて行った（表１０）。
【０１９１】
【表１０】
定量は、非加水分解１７アミノ酸標準溶液（Ｆｌｕｋａ Ｐ／Ｎ ０９４２８）を２．５〜５０μＭの範囲で用いて行った。標準試料は、ノルロイシンとともにおよびノルロイシンなしで、同じ試料濃度にて分析した。試料中のノルロイシンピーク面積を標準物質中の平均ノルロイシンピーク面積で除した比を、加水分解ステップにおける可能性のあるアミノ酸喪失についての補正係数として用いた。ＢＳＡ試料を対照試料として用いた。
【０１９２】
ペプチドグリカン含量の見積り
ペプチドグリカン含量は、２つの異なる方法を用いて見積もった。第１の方法（方法１）は、参考文献１７で用いられた方法に基づき、これは、リシン、アラニン、グリシンおよびグルタミン酸含量の総和を含む。第２の方法（方法２）では、以下の式に従って各アミノ酸についての変換係数を計算する。
（アミノ酸の分子質量）×（ペプチドグリカン構造における残基の数）／（ペプチドグリカンの反復単位の分子質量） 。
【０１９３】
ペプチドグリカンの反復単位の分子質量は、１２３３．２７Ｄａである（図７）。ペプチドグリカン含量は、よって、アミノ酸濃度と変換係数の比を計算することにより得られる平均ペプチドグリカン濃度として計算した。
【０１９４】
アニオン交換クロマトグラフィー後の精製５型莢膜多糖のペプチドグリカン含量を表１１に示す。
【０１９５】
【表１１】
本発明の方法は、精製多糖中の非常に低い含量のペプチドグリカンをもたらす。
【０１９６】
Ｄ．精製多糖のコンジュゲーションおよび免疫原性
上記のＡおよびＢ節の方法から得られた精製５型多糖を、ＣＲＭ１９７に、参考文献２９の方法に従ってコンジュゲートした。コンジュゲート中の糖の合計を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により、そしてタンパク質含量をＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより決定した（表１２）。
【０１９７】
【表１２】
本発明の方法により精製された多糖を用いて調製されたコンジュゲート（ロット４および５）は、より高い多糖：タンパク質の比を有した。
【０１９８】
ロット５の免疫原性を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染のマウス致死モデルにおいて試験した。簡単に述べると、ＣＤ１マウスを、腹腔内注射により、２μｇ用量の抗原で、２００μｌの注射容量で免疫化した。免疫化は、以下のスキームに従って１２匹のマウスの群で行い、その後、５×１０８ＣＦＵの５型Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細菌懸濁物の腹腔内注射により攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養物を遠心分離し、２回洗浄し、攻撃の前にＰＢＳで希釈した。さらなる希釈が、所望の接種材料について必要であり、これは、寒天播種およびコロニー形成により実験的に確認した。動物を１４日間監視し、致死疾患を記録した。
群１−ＰＢＳとミョウバン
群２−５型莢膜多糖−ＣＲＭコンジュゲート（ロット５）とミョウバン
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭコンジュゲート（ロット５）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにミョウバン
群５−５型莢膜多糖−ＣＲＭコンジュゲート（ロット５）とＨｌａＨ３５Ｌ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにミョウバン 。
【０１９９】
生存データを表１３に示す。
【０２００】
【表１３】
本発明の方法により精製された多糖を用いて調製されたコンジュゲートは、高いレベルの生存をもたらした。生存は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原の添加により増進された。
【０２０１】
本発明が例によってのみ記載され、本発明の範囲および精神内にとどまったまま改変を行うことができることが理解される。
【０２０２】
【化１】
【０２０３】
【化２】
【０２０４】
【化３】
【０２０５】
【化４】
【０２０６】
【化５】
【０２０７】
【化６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を放出させるための方法であって、前記細胞を酸で処理するステップを含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、湿潤細胞ペーストの形であるか、または水性媒体に懸濁されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酸処理が、酢酸を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酸処理が、Ｏ−アセチル化の程度が６０％〜１００％の間である前記莢膜多糖をもたらす、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
中和するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞を遠心分離し、前記多糖を含有する上清を回収するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を精製するためのプロセス。
【請求項１０】
前記莢膜多糖をＤＮアーゼおよび／またはＲＮアーゼで処理するステップをさらに含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記莢膜多糖をムタノリシンで処理するステップをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
ダイアフィルトレーションのステップをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローろ過である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
アニオン交換クロマトグラフィーのステップをさらに含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
ゲルろ過のステップをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記多糖を濃縮するステップをさらに含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
精製された前記多糖の分子質量が、２〜３５００ｋＤａの間である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記精製多糖を解重合してオリゴ糖を形成するステップをさらに含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
滅菌ろ過のステップをさらに含む、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して５重量％未満のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入とを含む組成物を提供する、請求項９〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
ペプチドグリカン混入の前記レベルが、約２％である、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して５重量％未満のタンパク質であるレベルのタンパク質混入とを含む組成物を提供する、請求項９〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して１重量％未満の核酸であるレベルの核酸混入とを含む組成物を提供する、請求項９〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
担体分子へのコンジュゲーションのステップをさらに含む、請求項９〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
請求項９〜２３のいずれか一項に記載のプロセスにより得ることができるＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖もしくはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖または請求項２４に記載のプロセスにより得ることができるコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２６】
ｃｌｆＡ抗原；ｃｌｆＢ抗原；ｓｄｒＥ２抗原；ｓｄｒＣ抗原；ｓａｓＦ抗原；ｅｍｐ抗原；ｓｄｒＤ抗原；ｓｐａ抗原；ｅｓａＣ抗原；ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；ｉｓｄＣ抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；ｉｓｄＡ抗原；ｉｓｄＢ抗原；およびｓｔａ０７３抗原からなる群より選択される１またはそれより多いＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原（複数可）をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
１またはそれより多い前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原（複数可）が、ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；およびｓｔａ０７３抗原からなる群より選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
以下：
（１）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびＨｌａ抗原；
（２）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（３）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（４）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（５）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびＨｌａ抗原；
（６）Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（７）ｅｓｘＡ抗原およびｅｓｘＢ抗原；
（８）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ００６抗原；
（９）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原；ならびに
（１０）ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原
の（１）〜（１０）の組み合わせの１つに従うＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を放出させるための方法であって、前記細胞を酸で処理するステップを含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、湿潤細胞ペーストの形であるか、または水性媒体に懸濁されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酸処理が、酢酸を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酸処理が、Ｏ−アセチル化の程度が６０％〜１００％の間である前記莢膜多糖をもたらす、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
中和するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞を遠心分離し、前記多糖を含有する上清を回収するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型細胞またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型細胞から莢膜多糖を精製するためのプロセス。
【請求項１０】
前記莢膜多糖をＤＮアーゼおよび／またはＲＮアーゼで処理するステップをさらに含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記莢膜多糖をムタノリシンで処理するステップをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
ダイアフィルトレーションのステップをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローろ過である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
アニオン交換クロマトグラフィーのステップをさらに含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
ゲルろ過のステップをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記多糖を濃縮するステップをさらに含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
精製された前記多糖の分子質量が、２〜３５００ｋＤａの間である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記精製多糖を解重合してオリゴ糖を形成するステップをさらに含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
滅菌ろ過のステップをさらに含む、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して５重量％未満のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入とを含む組成物を提供する、請求項９〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
ペプチドグリカン混入の前記レベルが、約２％である、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して５重量％未満のタンパク質であるレベルのタンパク質混入とを含む組成物を提供する、請求項９〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して１重量％未満の核酸であるレベルの核酸混入とを含む組成物を提供する、請求項９〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
担体分子へのコンジュゲーションのステップをさらに含む、請求項９〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
請求項９〜２３のいずれか一項に記載のプロセスにより得ることができるＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖もしくはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖または請求項２４に記載のプロセスにより得ることができるコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２６】
ｃｌｆＡ抗原；ｃｌｆＢ抗原；ｓｄｒＥ２抗原；ｓｄｒＣ抗原；ｓａｓＦ抗原；ｅｍｐ抗原；ｓｄｒＤ抗原；ｓｐａ抗原；ｅｓａＣ抗原；ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；ｉｓｄＣ抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；ｉｓｄＡ抗原；ｉｓｄＢ抗原；およびｓｔａ０７３抗原からなる群より選択される１またはそれより多いＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原（複数可）をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
１またはそれより多い前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原（複数可）が、ｅｓｘＡ抗原；ｅｓｘＢ抗原；ｓｔａ００６抗原；Ｈｌａ抗原；ｓｔａ０１１抗原；およびｓｔａ０７３抗原からなる群より選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
以下：
（１）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびＨｌａ抗原；
（２）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（３）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（４）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（５）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびＨｌａ抗原；
（６）Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原；
（７）ｅｓｘＡ抗原およびｅｓｘＢ抗原；
（８）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ００６抗原；
（９）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原；ならびに
（１０）ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原
の（１）〜（１０）の組み合わせの１つに従うＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原を含む、請求項２７に記載の組成物。
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０９３９７（Ｐ２０１３−５０９３９７Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６００６（Ｐ２０１２−５３６００６）
【出願日】平成２２年１１月１日（２０１０．１１．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４９３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１９１７
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１日（２０１０．１１．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４９３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１９１７
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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