Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞の発生および機能を調節するための方法および組成物
【課題】ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）活性またはレベルのモジュレーターを用いてＴヘルパー（Ｔｈ）細胞の発達および機能を調節する方法および組成物を提供すること。
【解決手段】ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）活性またはレベルのモジュレーターを用いてＴヘルパー（Ｔｈ）細胞の発達および機能を調節する方法および組成物。本発明は、部分的には、サイトカインインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）がＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセット（Ｔｈ２細胞）によって発現され、そして、Ｔｈ１細胞発生の間に、選択的にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを阻害するという発見に、一部基づく。より具体的には、本明細書において、ＩＬ−２１が、インビトロおよびインビボにおいて生成されたＴｈ２細胞によって優先的に発現されることが、示された。
【解決手段】ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）活性またはレベルのモジュレーターを用いてＴヘルパー（Ｔｈ）細胞の発達および機能を調節する方法および組成物。本発明は、部分的には、サイトカインインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）がＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセット（Ｔｈ２細胞）によって発現され、そして、Ｔｈ１細胞発生の間に、選択的にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを阻害するという発見に、一部基づく。より具体的には、本明細書において、ＩＬ−２１が、インビトロおよびインビボにおいて生成されたＴｈ２細胞によって優先的に発現されることが、示された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−２１、例えば、ヒトＩＬ−２１の活性またはレベルのモジュレーター、および、Ｔ細胞、例えば、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の発生および機能の調節におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）サブセットは、異なるサイトカインパターンを産生し、そして特異的な免疫応答を促進するその能力によって、識別される。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγを産生し、そして、細胞内病原体に対する、細胞媒介性免疫を促進する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生し、そして、肥満細胞および好酸球を活性化して、Ｂ細胞を細胞外病原体に対して指向させる。Ｔｈ応答の調節不全は、免疫病理を生じ得る。免疫病理においては、異常なＴｈ１応答が、器官特異的自己免疫疾患の原因であり得、そして、過大なＴｈ２応答が、アレルギー疾患に関連する。
【０００３】
極性化Ｔｈ細胞によって産生される特異的なサイトカインは、前駆Ｔｈ細胞の分化を促進する主要なエフェクターであるが、これらの細胞はまた、他の機能的活性のサブセットをもまた、交差調節する。例えば、ＩＬ−４は、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２エフェクターへの分化を促進することにおける、強力な因子であることが報告されている。さらに、ＩＬ−４は、ＩＦＮγの産生をアンタゴナイズする。ＩＬ−１０（Ｔｈ２細胞によって産生される別のサイトカイン）もまた、Ｔｈ１発生、およびＩＦＮγ誘導性のマクロファージ機能を阻害することが、記載されている。その逆に、Ｔｈ１細胞によって産生されるＩＦＮγは、Ｔｈ１発生を増幅し、そして、Ｔｈ２細胞の増殖を阻害する。これらのサイトカインが、特異的なＴｈ細胞のサブセットの発生を促進する能力は、同時に、代替的な発生の運命を阻害しながら、次第に、極性化された応答を生じる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、部分的には、サイトカインインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）がＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセット（Ｔｈ２細胞）によって発現され、そして、Ｔｈ１細胞発生の間に、選択的にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを阻害するという発見に、一部基づく。より具体的には、本明細書において、ＩＬ−２１が、インビトロおよびインビボにおいて生成されたＴｈ２細胞によって優先的に発現されることが、示された。１つの実施形態において、発生中のＴｈ細胞のＩＬ−２１への暴露は、発生中のＴｈ１細胞からのＩＦＮγレベルを特異的に減少し、従って、Ｔｈ２応答を増強する。さらに、発生中のＴｈ細胞のＩＬ−２１への暴露は、Ｓｔａｔ４シグナル伝達を減少し（例えば、Ｓｔａｔ４タンパク質および／またはｍＲＮＡ発現を減少することによる）、それによって、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）に対するＴｈ細胞応答を調節する。従って、Ｔｈ細胞発生および活性を調節する方法および組成物が、開示される。本明細書に記載される方法および組成物（例えば、ＩＬ−２１のアゴニストまたはアンタゴニスト）は、Ｔｈ２関連障害のようなＴｈ細胞関連および／またはＩＦＮγ関連障害または状態（例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分と関連する障害（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および狼瘡））；およびＴｈ１関連障害（例えば、自己免疫障害（例えば、とりわけ、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬および重症筋無力症）の、処置（例えば、治癒、寛解、発症の遅延もしくは予防、または、再発予防もしくは置換）、あるいは、予防において有用である。
【０００５】
１つの局面において、本発明の特徴は、Ｔ細胞または細胞集団におけるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルの、阻害（例えば、減少または除去）のための方法である。本発明は、例えば、Ｔ細胞（Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ細胞）またはＴｈ１細胞（例えば、分化するＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）またはそのＴ細胞集団におけるＩＦＮγの活性、発現、分泌、または処理の阻害を提供する。本発明の方法は、Ｔ細胞または細胞集団を、Ｔ細胞または細胞集団中の、ＩＦＮγを阻害（例えば、減少または除去）するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストに接触させ、その結果、アゴニストが、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有するＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして、このＩＬ−２１ポリペプチドがＩＬ−２１Ｒの結合を阻害し得る、工程を包含する。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、ＩＦＮγレベルの阻害が所望されるＴ細胞または細胞集団を同定する工程を包含する。
【０００６】
別の局面において、本方法はＴｈ前駆細胞（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を促進する方法を特徴とする。１つの実施形態において、この方法は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化を誘導するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、このアゴニストが、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして、このポリペプチドは、ＩＬ−２１Ｒへ結合し得る工程、を包含する。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化が所望される、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を同定する工程を、包含する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団の、Ｔｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害する方法を、特徴とする。この方法は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程を包含し、そして、このアゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有するＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして、このポリペプチドは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る。１つの実施形態において、この方法はさらに、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ１細胞または細胞集団への分化の阻害が所望される、Ｔ細胞集団を同定する工程を包含する。
【０００８】
これらの方法のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。これらの方法のいくつかの実施形態において接触工程が、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて行われる。エキソビボまたはインビボの方法における適切な被験体としては、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）が挙げられる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を阻害する方法を、特徴とする。この方法は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）／ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）アゴニストと接触させる工程を、包含する。そして、アゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される。この方法は、必要に応じて、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化の阻害が所望される、Ｔ細胞または細胞集団を同定する工程を、さらに包含する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞集団は、少なくとも１つのＴｈ１細胞を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、ＩＬ−２１レセプターの細胞外領域を含む。例えば、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸２０〜２３５と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含み得、そしてＩＬ−２１に結合し得るか、あるいは、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜２３５を含む。関連する実施形態において、可溶性フラグメントは、さらに、Ｆｃフラグメントを含む。なお別の実施形態において、アンタゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体であるか、または、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメントである。
【００１１】
なお別の実施形態において、接触工程は、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて、行われる。接触工程は、哺乳動物被験体において行われ得、例えば、哺乳動物被験体は、ヒトである。
【００１２】
別の局面において、本発明は、Ｔ細胞または細胞集団中のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを増加する方法に特徴を有する。１つの実施形態におけるこの方法は、Ｔ細胞または細胞集団を、Ｔ細胞または細胞集団中のＩＦＮγレベルを増加するのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒのアゴニストと接触させる工程を包含し、そして、アンタゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される。この方法の実施形態はさらに、ＩＦＮγレベルの増加が所望されるＴ細胞集団を同定する工程を包含する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、ＩＬ−２１レセプターの細胞外領域を含む。例えば、いくつかの実施形態において、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸２０〜２３５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を包含し、ＩＬ−２１に結合し得るか、あるいは、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜２３５を含む。関連する実施形態において、可溶性フラグメントはさらに、Ｆｃフラグメントを含む。なお別の実施形態において、アンタゴニストは、抗ＩＬ−２１抗体または抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメントであり得る。
【００１４】
なお別の関連する実施形態において、接触工程は、エキソビボ、インビトロ、または、インビボにおいて行われる。いくつかの実施形態において、接触工程は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）において行われる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｔ細胞またはＴ細胞集団においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを阻害するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔ細胞または細胞集団を、該Ｔ細胞または細胞集団中においてＩＦＮγを阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％であるアミノ酸を含むＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして該アゴニストは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
ＩＦＮγレベルの阻害が所望されるＴ細胞または細胞集団を同定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を促進するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、該Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化を誘導するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％であるアミノ酸を含むＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして該アゴニストは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る、工程、
を包含する、方法。
（項目４）
さらに、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化が所望されるＴｈｐ細胞または細胞集団を同定する工程を包含する、項目３に記載の方法。
（項目５）
Ｔｈｐ細胞または細胞集団の、Ｔｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、該Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％であるアミノ酸を含むＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして該アゴニストは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る、工程、
を包含する、方法。
（項目６）
さらに、Ｔｈ１細胞または細胞集団への前記Ｔｈｐ細胞または細胞集団の分化の阻害が所望されるＴ細胞集団を同定する工程を包含する、項目５に記載の方法。
（項目７）
項目１、３、または５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目８）
項目１、３、または５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて行われる、方法。
（項目９）
項目１、３、または５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、哺乳動物被験体において行われる、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物被験体がヒトである、方法。
（項目１１）
Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を阻害するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、該Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）／ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）のアンタゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アンタゴニストは、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される、工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
さらに、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化の阻害が所望される、Ｔ細胞または細胞集団を同定する工程を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
Ｔ細胞または細胞集団においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを増加する方法であって、以下：
該Ｔ細胞または細胞集団を、該Ｔ細胞または細胞集団のＩＦＮγレベルを増加するのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アンタゴニストは、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される、工程、
を包含する、方法
（項目１４）
さらに、ＩＦＮγレベルの増加が所望されるＴ細胞集団を同定する工程を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１１または１３に記載の方法であって、ここで、前記ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、ＩＬ−２１レセプターの細胞外領域を含む、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、前記可溶性フラグメントが、配列番号４のアミノ酸２０〜２３５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして、ＩＬ−２１に結合し得る、方法。
（項目１７）
項目１５に記載の方法であって、ここで、前記可溶性フラグメントが、配列番号４のアミノ酸１〜２３５を含む、方法。
（項目１８）
項目１５に記載の方法であって、ここで、前記可溶性フラグメントが、さらにＦｃフラグメントを含む、方法。
（項目１９）
項目１１または１３に記載の方法であって、ここで、前記アンタゴニストが、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントである、方法。
（項目２０）
項目１２に記載の方法であって、ここで、前記Ｔ細胞集団が、少なくとも１つのＴｈ１細胞を含む、方法。
（項目２１）
項目１１または１３に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて行われる、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、哺乳動物被験体において行われる、方法。
（項目２３）
項目２２に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物被験体がヒトである、方法。
【００１５】
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語、および科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般に理解される意味と、同一の意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と、類似または等価の方法および材料は、本明細書の実施または試験において使用されるが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、その全体が、本明細書において参考として援用される。意味が対立する場合は、定義を含む本明細書の意味が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみのためであり、本発明を限定することを意図しない。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および添付の請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、添付の実施例に記載される、種々のＴｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件下での、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、およびβアクチンの発現を試験する、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、初期の刺激および第２の刺激後に、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルと比較した、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＥＬ−４およびＩＦＮγの存在下および非存在下において培養した、初期および第２のＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルと比較した、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｌ．ｍａｊｏｒによる感染後のＣ５７ＢＬ／ｇマウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウス中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対する、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡ、ＩＬ−４ ｍＲＮＡ、およびＩＦＮγ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、中和条件下、またはＴｈ１をゆがめる条件下で培養したＴｈｐ細胞におけるＩＬ−４産生およびＩＬ−２１サイトカイン産生を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＬ−２１処理したＴｈｐ細胞、およびモック（ｍｏｃｋ）処理したＴｈｐ細胞中のＩＦＮγ産生を示す、棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＩＬ−２２の存在下および非存在下での、Ｔｈ１をゆがめる条件下で培養したＴｈｐ細胞中のＥＬ−４産生およびＩＦＮγ産生を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、野生型マウスおよびＳｔａｔ６−／−マウスからの、Ｔｈ１をゆがめる条件下で処理された、ＩＬ−２１処理Ｔｈｐ細胞またはモック（ｍｏｃｋ）処理マウス中の、ＥＬ−４産生およびＩＦＮγ産生を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαの発現を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｔｈ１またはＴｈ２をゆがめる条件下で培養された、Ｔｈｐ細胞中の、Ｔ−ｂｅｔおよびアクチンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｔｈ１細胞中における、レベルに対する、ＩＬ−２１Ｒβ２ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＬ−２１またはモック上清の存在下における、抗ＣＤ−３にて刺激したＴｈｐ細胞中の、リン酸化Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ１、およびＩＬ−２１ポリペプチドレベルのウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＬ−２１存在下、またはモック（ｍｏｃｋ）上清存在下において、４８時間、抗ＣＤ３で刺激した、モック処理Ｔｈｐ細胞およびＩＬ−２１ Ｔｈｐ細胞中のｇＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対する、Ｓｔａｔ４ ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。ＩＬ−４ ｍＲＮＡおよびＩＦＮγ。
【図５Ａ】図５Ａは、その後にＴＮＰ−ＫＬＨまたはＰＢＳを注入した、ＴＮＰ−ＫＬＨ免疫化野生型マウス、およびＩＬ２１−２１Ｒ−／−マウスにおける、特異的膨張を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗原を用いて再度刺激した、ＴＮＰ−ＫＬＨ免疫化野生型マウスおよびＩＬ２１−２１Ｒ−／−マウスの排出されたリンパ節から精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞中のＩＦＮγ産生を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｔヘルパー細胞の分化、発生、および活性を、ＩＬ−２１とＩＬ−２１レセプターとの間の相互作用を調節することによって調節するための方法および、組成物を提供する。細胞集団中のＩＬ−２１、またはＩＬ−２１レベルもしくはＩＬ−２１レセプターレベルを増加する試薬が、Ｔヘルパーの集団に添加されて、Ｔｈｐ細胞またはＴｈ１細胞の集団におけるＩＦＮγレベルを抑制する。ＩＬ−２１、またはＩＬ−２１レベルを増加する試薬をまた使用して、Ｔｈ２発生を促進し得るか、またはＴｈ２媒介性免疫応答を増強し得るか、および／もしくはＴｈ１発生を抑制し得る。
【００１９】
ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レベルを増加する試薬をまた使用して、Ｔヘルパー細胞集団に対するＩＬ−２１の効果を阻害し得る。ＩＬ−２１、またはＩＬ−２１レベルを増加するか、もしくはそうでなければＩＬ−２１アゴニストとして作用する試薬を使用して、Ｔｈ１媒介性疾患（例えば、自己免疫疾患、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、およびＩ型糖尿病）を抑制し得る。
【００２０】
１つの局面において、本発明は、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）内のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の活性またはレベルを、調節（例えば、増加、または減少または阻害）するための方法に特徴がある。例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ細胞）またはＴｈ１細胞（例えば、分化しつつあるＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）、あるいは、そのＴ細胞集団中の、ＩＦＮγ活性、発現、分泌またはプロセッシングの１つ以上を調節する方法が、提供される。本発明の方法は、以下：
（必要に応じて）ＩＦＮγ活性レベルの調節（例えば、増加または減少）が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を同定する工程；および
その細胞または細胞集団を、その細胞または細胞集団中のＩＦＮγの活性またはレベルを調節（例えば、増加または減少）するのに十分な量のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）と接触させる工程、を包含する。
【００２１】
この方法を、培養中の細胞（例えば、インビトロまたはエキソビボ）において使用し得る。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるＴ細胞）を、培養培地でインビトロ培養し得、そして、１つ以上のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）を培養培地に添加することによって、接触工程を行い得る。あるいは、この方法は、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載の免疫細胞またはＴ細胞）において（例えば、インビボプロトコールの一部として（例えば、治療的に、または、予防的に））実施され得る。
【００２２】
１つの実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ）、またはＴｈ１細胞（例えば、分化しつつあるＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）、あるいはその細胞集団）中のＩＦＮγの活性またはレベルを、減少させるか、または阻害する方法が、提供される。この方法は（必要に応じて）、ＩＦＮγの活性またはレベルの減少または阻害が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を同定する工程；およびその細胞または細胞集団を、その細胞または細胞集団中のＩＦＮγの活性またはレベルを減少または阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程、を包含する。好ましくは、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＦＮγレベルまたは活性を、特異的に阻害する（例えば、ＩＬ−２またはＴＮＦαのような他のサイトカインの活性も、レベルも、減少も阻害もしない）。１つの実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＦＮγ産生細胞（例えば、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞）による、ＩＦＮγの産生を阻害する。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、被験体におけるＩＦＮγレベルまたは活性を減少するための方法を提供する。この方法は（必要に応じて）、ＩＦＮγのレベルまたは活性の減少が所望される被験体を同定する工程；および、その被験体に対して、ＩＦＮγのレベルまたは活性を減少するのに十分な量のＩＬ−２１を投与する工程、を包含する。ＩＦＮγは、当該分野において公知の技術（例えば、細胞内サイトカイン染色、または、細胞上清中のレベルを決定する、ＥＬＩＳＡ技術）を使用して、測定し得る。
【００２４】
ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド、またはその活性フラグメント（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはこれらと実質的にホモログである）。他の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）、または別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））と融合したそのフラグメント；ＩＬ−２１レセプターに対するアゴニスト抗体；あるいは、小分子アゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１の活性またはレベルを増加する薬剤である（例えば、ＩＬ−２１の発現、プロセッシング、および／または分泌を増加することによる）。
【００２５】
好ましくは、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト被験体）であって、異常な（例えば、増加したＩＦＮγレベルまたは活性に関連する障害（例えば、免疫障害（例えば、Ｔ細胞媒介性障害））に罹患する被験体であり、その障害を寛解または予防するために十分な量である。
【００２６】
ＩＬ−２１のアゴニストを用いて、処置（例えば、寛解）または予防することができる例示的な免疫障害としては、例えば、Ｔｈ１関連障害（例えば、自己免疫疾患（多発性硬化症、慢性関節リウマチ、およびＩ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬および重症筋無力症が挙げられるが、これらに限定されない））が挙げられる。
【００２７】
本発明はさらに、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（Ｔ細胞集団）においてＩＦＮγのレベルまたは活性を増加する方法に、特徴がある。例えば、本発明は、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ細胞）、またはＴｈ１細胞（例えば、分化しつつあるＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）またはそのＴ細胞集団における、ＩＦＮγ活性、発現、またはプロセシングを増加する方法を包含する。この方法は（必要に応じて）、ＩＦＮγ発現の増加が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を同定する工程；および、その細胞を、ＩＬ−２１の結合または活性を阻害（例えば、ＩＬ−２１のＩＬ−２１レセプターへの結合を阻害し、それによって、その細胞中のＩＦＮγ発現レベルを増加する）するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程を包含する。
【００２８】
ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）、またはＩＬ−２１レセプター（例えば、ヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチド）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体または単一の特異的抗体）であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２１、またはヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロで生成された抗体である。別の実施形態において、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１レセプター結合ドメイン）が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１レセプターポリペプチド（例えば、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニストは、第２の部分（例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖）と融合した、上記のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドあるいはそのフラグメントを含む融合タンパク質である。
【００２９】
別の局面において、本発明は、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を調節（例えば、増加または減少）するための方法に、特徴がある。１つの実施形態において、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆体（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上が、提供される。
【００３０】
（必要に応じて）増殖、生存および／または分化が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ２細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化を調節する（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２細胞への分化を調節する）ために十分な量のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）と接触し、それによって、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を調節する工程、を包含する。
【００３１】
本方法は、培養中の細胞に対して、使用し得る（インビトロまたはエキソビボ）。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるＴ細胞）を培養培地中でインビトロ培養し得、そして、接触工程を、培養培地に１つ以上のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、１つ以上のＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）を添加することによって、行い得る。あるいは、この方法を、被験体中に存在する細胞（例えば、インビボプロトコール（例えば、治療または予防）の一部として）において行い得る。
【００３２】
１つの実施形態において、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を減少または阻害する方法が提供される。例えば、増殖、生存、および／またはＴｈ２細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆体（Ｔｈｐ）の分化）の１つ以上を阻害するか、または減少することによって、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を、減少または阻害し得る。この方法は（必要に応じて）、増殖、生存、および／または分化が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ２細胞））または細胞集団を同定する工程；ならびに、その細胞または細胞集団を、増殖、生存、および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２細胞への分化を阻害または減少する）の１つ以上を阻害または減少し、それによってＴｈ２細胞の活性および／または細胞数を阻害または減少するのに十分な量のＩＬ−２１アンタゴニストと接触させる工程、を包含する。
【００３３】
この方法を、例えば、インビトロまたはエキソビボの、細胞（例えば、培養中のＴ細胞（例えば、Ｔｈｐ細胞またはＴｈ２細胞））に対して、使用し得る。
【００３４】
あるいは、この方法は、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載される、免疫細胞またはＴ細胞）において（例えば、インビボ（例えば、治療的または予防的）プロトコールにおいて）、行い得る。例えば、この方法を、被験体におけるＴｈ２媒介性障害（例えば、喘息およびアレルギー）を処置、または、予防するために、使用し得る。従って、本発明は、本発明は、被験体におけるＴｈ２関連障害を処置（例えば、治癒、抑制、寛解、開始の遅延もしくは予防、または、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）もしくは再発（ｒｅｌａｐｓｅ）の予防）、あるいは予防のための方法を提供する。この方法は、被験体に対して、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を阻害または減少し、それによって、Ｔｈ２関連障害を処置または予防するのに十分な量のＩＬ−２１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００３５】
好ましくは、被験体は、異常なＴｈ２細胞数または活性に関連する障害（例えば、免疫障害（例えば、Ｔｈ２関連障害））に罹患する哺乳動物（例えば、ヒト）である。細胞活性および／または細胞数を阻害または減少するために十分な量は、その障害を寛解するのに十分な量である。
【００３６】
ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）、またはＩＬ−２１レセプター（例えば、ヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチド）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体または単一特異的抗体）であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２１またはヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロにおいて生成された抗体である。他の実施形態において、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１レセプター結合ドメイン）が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニストは、上記のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチド、あるいは、第２の部分（例えば、免疫グロブリン鎖）と融合したそのフラグメントを含む融合タンパク質である。
【００３７】
なお別の実施形態において、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を増加する方法が、提供される。例えば、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数は、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上を増加することによって、増加され得る。この方法は（必要に応じて）、増加した増殖、生存および／または分化が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ２細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化の１つ以上を増加する（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２細胞への分化を増加する）ために十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させ、それによって、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を増加する工程、を包含する。
【００３８】
ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチドもしくはその活性フラグメント（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩＬ−２１ポリペプチド、または配列番号１に示される核酸配列によってコードされるＩＬ−２１ポリペプチド、あるいは、それらに対して実質的に相同な配列）であり得る。他の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）、または、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））と融合されたそのフラグメントを含む融合タンパク質；あるいは、；ＩＬ−２１レセプターに対するアゴニスト抗体；あるいは、低分子アゴニストである。
【００３９】
なお別の局面において、Ｔｈ１細胞数および／または活性を調節（例えば、増加または減少）するための方法が、提供される。１つの実施形態において、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上を調節（例えば、促進または阻害）する方法が、提供される。この方法は、（必要に応じて）増殖、生存および／または分化の調節が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ１細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化の１つ以上を調節し（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ１細胞への分化を調節し）、それによってＴｈ１細胞活性および／または細胞数を調節するために十分な量のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）と接触させる工程、を包含する。
【００４０】
この方法を培養中の細胞（例えば、インビトロまたはエキソビボ）に対して、使用し得る。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるＴ細胞）を、培養培地中でインビトロで培養して、接触させる工程を、１つ以上のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）を、培養培地に添加することによって、実行し得る。あるいは、この方法は、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載される免疫細胞またはＴ細胞）に対して実行し得る（例えば、インビボ（例えば、治療的または予防的）プロトコールの一部として）。
【００４１】
１つの実施形態において、Ｔｈ１細胞の活性および／または細胞数を減少する方法が提供される。例えば、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上を阻害または減少することによって、減少または阻害し得る。この方法は（必要に応じて）、増殖、生存および／または分化の阻害が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＩＦＮγ産生細胞（例えば、Ｔｈ１細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化の１つ以上を阻害または減少し（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ１細胞への分化を阻害または減少し）、それによって、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を阻害または減少するために十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触する工程、を包含する。
【００４２】
この方法は、培養中の細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞））に対して、インビトロまたはエキソビボにおいて使用し得る。
【００４３】
あるいは、この方法を、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載の免疫細胞またはＴ細胞）に対して、実施し得る（例えば、インビボ（例えば、治療または予防）プロトコールの一部として）。例えば、この方法は、被験体におけるＴｈ１媒介性障害（例えば、自己免疫障害（例えば、とりわけ、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬および重症筋無力症）の処置のために使用し得る。従って、本発明は、被験体中のＴｈ１関連障害の処置方法（例えば、治癒、抑制、寛解、発症の遅延もしくは予防、または、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）または再発（ｒｅｌａｐｓｅ）の予防）、あるいは、予防方法を提供する。この方法は、被験体に対して、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を阻害または減少して、それによってＴｈ１関連障害を処置または予防するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストを投与する工程を包含する。
【００４４】
好ましくは、被験体は哺乳動物、例えば、異常なＴｈ１細胞数または活性に関連する障害（例えば、免疫障害（例えば、本明細書に記載されるＴｈ１関連障害））に罹患するヒトである。Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を阻害または減少するために十分な量は、その障害を寛解または予防するのに十分な寮である。
【００４５】
ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）またはその活性フラグメント（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−２１ポリペプチド、または配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ−２１ポリペプチド、あるいは、これらの配列と実質的に相同な配列）であり得る。他の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）または別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））と融合したそのフラグメント；ＩＬ−２１レセプターに対するアゴニスト抗体；あるいは、低分子アゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、例えば、機能的ＩＬ−２１の発現、プロセッシングおよび／または分泌を増加することによって、ＩＬ−２１の活性またはレベルを増加する因子である。
【００４６】
なお別の局面において、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を増加する方法が提供される。例えば、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を、増殖、生存、および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆体（Ｔｈｐ）の分化）の１つ以上を増加することによって、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を、増加し得る。この方法は、以下を包含する：
（必要に応じて）、増殖、生存、および／または分化が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ１細胞））または細胞集団を同定する工程；ならびに、
その細胞または細胞集団を、増殖、生存、および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ１細胞への分化を増加する）の１つ以上を増加し、それによってＴｈ１細胞の活性および／または細胞数を増加するのに十分な量のＩＬ−２１アンタゴニストと接触させる工程。
【００４７】
ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）、またはＩＬ−２１レセプター（例えば、ヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチド）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体または単一特異的抗体）であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２１またはヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロにおいて生成された抗体である。他の実施形態において、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１レセプター結合ドメイン）が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニストは、上記のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチド、あるいは、第２の部分（例えば、免疫グロブリン鎖）と融合したそのフラグメントである。
【００４８】
なお別の局面において、本発明は、細胞、細胞集団または被験体において、インターロイキン１２（ＩＬ−２１）の活性またはレベルを調節（例えば、減少、阻害または増加）する方法において特徴を有する。この方法は、以下を包含する：
（必要に応じて）ＩＬ−２１の調節が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞）、細胞集団、または被験体を同定する工程；および
その細胞または細胞集団とＩＬ−２１モジュレーターを接触させるか、またはＩＬ−２１モジュレーターをその被験体に投与して、その細胞、細胞集団、または被験体におけるＩＬ−２１活性またはレベルを調節する工程。
【００４９】
１つの実施形態において、ＩＬ−２１の活性またはレベルを、その細胞または細胞集団をＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニストを、ＩＬ−２１の活性またはレベルを減少するのに十分な量において）と接触させるか、またはその被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、減少する。
【００５０】
別の実施形態において、ＩＬ−２１の活性またはレベルを、その細胞または細胞集団を、ＩＬ−２１アゴニストと接触させるか、または被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、増加する（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニストを、ＩＬ−２１の活性またはレベルを増加するのに十分な量において）。
【００５１】
なお別の局面において、本発明は、細胞、細胞集団、または被験体におけるＳｔａｔ（例えば、Ｓｔａｔ４）の活性またはレベルを調節（例えば、減少または阻害、あるいは増加）する方法に特徴を有する。この方法は、以下を包含する：
（必要に応じて）Ｓｔａｔ活性またはレベルの調節が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞）細胞集団または被験体を同定する工程、および；
その細胞または細胞集団を、ＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１のアゴニストまたはアンタゴニストを、その細胞、細胞集団、または、被験体において、Ｓｔａｔ活性を調節するのに十分な量において）と接触するか、またはその被験体にＩＬ−２１モジュレーターを投与する工程。
【００５２】
１つの実施形態において、Ｓｔａｔの活性またはレベルを、その細胞または細胞集団とＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニスト（例えば、Ｓｔａｔタンパク質またはｍＲＮＡ）を、Ｓｔａｔの活性またはレベルを減少するのに十分な量において）を接触させるか、あるいは、その被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、減少する。
【００５３】
別の実施形態においてＳｔａｔの活性またはレベルを、その細胞または細胞集団をＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニスト（例えば、Ｓｔａｔタンパク質またはｍＲＮＡ）を、Ｓｔａｔの活性またはレベルを増加するのに十分な量において）と接触させるか、あるいは、被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、増加する。
【００５４】
なお別の局面において、本発明は、被験体において、自己免疫応答（例えば、Ｔｈ１媒介性自己免疫応答）を減少、阻害、抑制、寛解または遅延する方法に特徴がある。この方法は、その投与を必要とする被験体において、ＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニストを、その被験体において自己免疫応答を減少、阻害、抑制、寛解または遅延するのに十分な量において）を投与する工程を包含する。
【００５５】
なお別の局面において、本発明は、被験体におけるＴｈ２関連応答（例えば、アレルギー性応答または喘息性応答）を、減少、阻害、抑制、寛解または遅延する方法に特徴を有する。この方法は、投与を必要とする被験体に対して、ＩＬ−２１アンタゴニストを（例えば、本明細書に記載されるアンタゴニストを、被験体におけるＴｈ２関連応答を、減少、阻害、抑制、寛解または遅延するのに十分な量において）投与する工程を包含する。
【００５６】
別の局面において、本発明は、細胞集団（例えば、Ｔｈ細胞集団）においてＴｈ２細胞手段を選択的に同定する方法に特徴を有し、この方法は、試験サンプル（例えば、Ｔｈ細胞、および参照細胞（例えば、Ｔｈ１細胞））中のＩＬ−２１核酸（例えば、ＩＬ−２１遺伝子産物）またはポリペプチドのレベルを決定する工程；ならびに、その試験サンプル中のそのＩＬ−２１核酸のレベルを、参照サンプル（例えば、Ｔｈ細胞）中のＩＬ−２１核酸のレベルと比較する工程であって、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプル中の、そのＩＬ−２１核酸レベルの増加は、試験サンプルがＴｈ２細胞であることを示す、工程、を包含する。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「Ｔｈ１関連障害」は、参照（例えば、正常コントロール）と比較した、異常な（例えば、増加した、または減少した）Ｔｈ１細胞活性（例えば、増加したか、または減少したＴｈ１細胞応答）、またはＴｈ１細胞数に関連する疾患または状態である。Ｔｈ１関連障害の例としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、とりわけ、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬および重症筋無力症）が挙げられる。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「Ｔｈ２関連障害」は、参照（例えば、正常コントロール）と比較した、異常な（例えば、増加した、または減少した）Ｔｈ２細胞活性（例えば、増加したか、または減少したＴｈ２細胞応答）、またはＴｈ２細胞数に関連する疾患または状態である。Ｔｈ２関連障害の例としては、例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分に関連した障害（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および狼瘡）が挙げられる。
【００５９】
本明細書において記載される方法において使用されるＩＬ−２１ポリペプチドは、例えば、哺乳動物ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、げっ歯類、ヒト、または、非ヒト霊長類）のアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２１のポリペプチドをアミノ酸配列を含み得る。適切なアミノ酸配列は、配列番号２（以下）に示されるＩＬ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００６０】
ＩＬ−２１およびＩＬ−２１レセプターポリペプチド（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む）が、例えば、米国特許第６，０５７，１２８号、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：５７−６３，１５ ２０００；Ｖｏｓｓｈｅｎｒｉｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：Ｒ１５７−７７，２００１，Ａｓａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１−５，２００１；およびＯｚａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１１４３９−４４，２０００に記載される。ＩＬ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列は、公知である。例えば、ヒトＩＬ−２１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ＿０１１０８２において利用可能である。このエントリーにおいて開示されるＩＬ−２１ヌクレオチド配列を、以下に表す：
【００６１】
【化１】
【００６２】
この開示されたＩＬ−２１核酸配列によって開示されたアミノ酸配列を、以下に示す：
【００６３】
【化２】
【００６４】
ヒトＩＬ−２１レセプター核酸のヌクレオチド配列を、以下に示す：
【００６５】
【化３】
【００６６】
開示されたＩＬ−２１レセプター核酸配列は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする：
【００６７】
【化４】
【００６８】
核酸配列の相同性は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野で公知のコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３を参照のこと。核酸配列比較のために、以下の設定：５．０のＧＡＰ生成ペナルティ、および０．３のＧＡＰ伸長ペナルティ、において、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用して、上記にて参照された類似核酸配列のコード領域は、配列番号１または配列番号３において示されたＤＮＡ配列のＣＤＳ（コーディング）部分を用いて、好ましくは、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。同様に、本明細書において言及されるアミノ酸配列は、配列番号５、または、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、９９％の同一性の程度を示す。
【００６９】
用語「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が、比較する特定の領域にわたって、残基と残基との比較において、同一である程度をいう。用語「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を、比較の領域にわたって比較して、両方の配列の生じる同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）の位置の数を決定してマッチした位置の数を生じ、マッチした位置の数を比較の領域の位置の総数で割り算をして、そして結果に１００を掛けて、配列同一性パーセントをもたらすことによって、計算される。本明細書において使用する場合、用語「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドが、比較の領域にわたって参照配列に対して比較した場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８５パーセントの配列同一性、そして、しばしば、９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常は、少なくとも９８または９９パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。用語「ポジティブ残基のパーセント」は、２つの最適に整列された配列を、比較の領域にわたって比較し、上記のように規定された同一性および保存的アミノ酸置換が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、マッチした位置の数を比較の領域の位置の総数で割り算し、そして結果に１００を掛けて、ポジティブ残基のパーセントを生じることによって決定される。
【００７０】
さらに、細胞または細胞集団においてＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターレベルを増加する因子としては、ＩＬ−２１アゴニストまたはＩＬ−２１レセプターアゴニストが挙げられる。そのようなアゴニストは、１つ以上のＩＬ−２１活性がＴヘルパー細胞集団において発揮される試験化合物を同定することによって、同定され得る。
【００７１】
被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタまたはげっ歯類（ラットまたはマウスを含む）であり得る。ＩＬ−２１の任意の所望の投与経路が、使用され得る。適切な投与経路としては、静脈内経路（ボラスおよび注入）、腹腔内、皮下、または筋肉内形態が挙げられ、これら全ては、薬学の分野において当業者に周知の形態を用いる。注入物は、従来の形態（液体溶液または懸濁液のいずれか）において調製され得る。
【００７２】
非経口注入可能な投与は、一般に、皮下、筋肉内、または、静脈内注射および注入のために、使用される。
【００７３】
（ＩＬ−２１アンタゴニスト）
ＩＬ−２１媒介性Ｔヘルパー細胞効果を阻害するために、ＩＬ−２１とＩＬ−２１レセプターとの相互作用をブロックするか、そうでなければ阻害する因子を、Ｔ細胞またはＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞）の集団に添加し得る。便利さのために、これらのインヒビターを本明細書において、「ＩＬ−２１アンタゴニスト」という。ＩＬ−２１アンタゴニストの例としては、例えば、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターの可溶性フラグメント、これらのフラグメントを含む融合タンパク質、およびこれらのフラグメントに対する抗体が挙げられる。ＩＬ−２１アンタゴニストは、Ｔｈ２媒介性疾患（抗体媒介性疾患を含む）におけるＩＬ−２１のブロッキングのために有用である。これらの疾患としては、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および狼瘡が挙げられる。
【００７４】
（ＩＬ−２１およびＩＬ−２１レセプター融合タンパク質）
ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター、あるいはこれらタンパク質の活性フラグメントを、本明細書に記載の方法における使用のために、免疫グロブリンのようなキャリア分子を融合し得る。例えば、ＩＬ−２１レセプターの可溶性形態を、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦｃ部分か、または免疫グロブリンのＦｃ部分に対して融合し得る。他の融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＬｅｘＡ、またはＭＢＰ（すなわち、マルトース結合タンパク質）との融合タンパク質）もまた、使用され得る。
【００７５】
さらなる実施形態において、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター融合タンパク質を、１つ以上のさらなる部分と連結し得る。例えば、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター融合タンパク質を、さらに、ＧＳＴ融合タンパク質と連結し得る（ＩＬ−２１レセプター融合タンパク質配列が、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合する）。そのような融合タンパク質は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター融合タンパク質の精製を容易にし得る。
【００７６】
別の実施形態において、融合タンパク質としては、異種シグナル配列（すなわち、ＩＬ−２１核酸またはＩＬ−２１レセプター核酸によって天然にコードされるポリペプチド中には存在しないポリペプチド配列）を、そのＮ末端において含む。例えば、天然のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターシグナル配列を除去して、別のタンパク質のシグナル配列によって、置換し得る。
【００７７】
本発明のキメラまたは融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術に従って、インフレームでともに連結する（例えば、連結のための平滑末端または粘着末端（ｓｔａｇｇｅｒ）の使用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合に粘着末端を埋めること、望まれない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結による）。別の実施形態において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって、合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続した遺伝子フラグメントの間の相補的な突出を生じるアンカープライマーを用いて、その後、相補的な突出をアニーリングして、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターをコードする核酸を、そのような発現ベクター中にクローニングして、融合部分を、インフレームで、免疫グロブリンタンパク質と連結し得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチド部分を、天然に生じるＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター配列（野生型）中に変異を有する改変体ＩＬ−２１レセプターポリペプチドとして提供して、ＩＬ−２１レセプターに対する高親和性（変異をしていない配列と比較して）結合の改変ＩＬ−２１、または、ＩＬ−２１に対する高親和性（変異をしていない配列と比較して）改変ＩＬ−２１レセプターポリペプチドを生じる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１レセプターポリペプチド部分は、天然に生じるＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター配列（野生型）において変異を有する改変体ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドとして提供され、タンパク分解に対してより耐性な（変異を有さない配列と比較して）、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター配列を生じる。
【００８０】
融合タンパク質中に含むことができるシグナルペプチドは、ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号５）である。所望される場合、１つ以上のアミノ酸を、さらに、第１のポリペプチド部分（ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター部分を含む）と第２のポリペプチド部分との間に挿入し得る。
【００８１】
第２のポリペプチドは、好ましくは、可溶性である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、連結したポリペプチドの半減期（例えば、血清半減期）を増強する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドと第２のＩＬ−２１レセプターポリペプチドとの会合を促進する配列を含む。好ましい実施形態において、第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチド領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃ）を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも、より少ないエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体固定化およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対して低い親和性を有するか、または、親和性を有さない。代替的な実施形態において、第２のポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対して、低い親和性を有するか、または、親和性を有さない。
【００８４】
好ましい第２のポリペプチド配列は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。この配列は、Ｆｃ領域を含む。下線を引いたアミノ酸は、野生型免疫グロブリン配列の対応する位置において見出されるアミノ酸と異なるアミノ酸である。
【００８５】
【化５】
【００８６】
（ＩＬ−２１およびＩＬ−２１レセプター抗体）
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかのクラスに関連し、そして、分子に存在する重鎖の性質によって、お互いに異なる。特定のクラスは、サブクラスも有する（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２および他のサブクラス）。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体に対する言及は、ヒト抗体種の全てのクラス、サブクラス、およびタイプへの言及を含む。ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する抗体は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドあるいはＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質に対する抗体をもまた、含む。
【００８７】
ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１レセプターポリペプチドを、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製の標準的な技術を用いて、抗原、抗原の部分またはフラグメントとして使用し得、そして、さらに、その抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用し得る。免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントは、例えば、アミノ末端領域（例えば、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列）のアミノ酸配列の少なくとも７アミノ酸残基を含み、そして、そのエピトープを含み、その結果、そのペプチドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはエピトープを含む任意のフラグメントとの特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置するタンパク質の領域であり、一般に親水性の領域である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面に位置するＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドの領域（例えば、親水性領域）である。ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドの疎水性分析は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプタータンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って、抗体産生の標的として有用な表面残基をコードする可能性が高いことを示す。抗体産生を標的化する手段として、親水性および疎水性の領域を示すハイドロパシープロットが、当該分野で周知の任意の方法（例えば、フーリエ変換を用いるか、または用いない、Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法）によって作成され得る。例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−４２を参照のこと。抗原タンパク質内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体、あるいは、その誘導体、フラグメント、アナログ、またはホモログがまた、本明細書において提供される。
【００８９】
本発明のタンパク質、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログまたはオルソログを、これらタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成における免疫原として利用し得る。
【００９０】
当該分野で公知の種々の手順を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用し得る。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．を参照のこと。これらの抗体のいくつかが、以下に考察される。
【００９１】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）が、ネイティブタンパク質、その合成改変体、またはそれらの誘導体の１回以上の注射により免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を表す化学合成ポリペプチド、または組み換え発現された免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知の第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。免疫学的応答を増大させるのに使用される種々のアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて有用なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、または同様の免疫刺激因子が挙げられるがこれらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【００９３】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、周知技術（例えば、主に、免疫血清のＩｇＧフラクションを提供する、プロテインＡまたはプロテインＣを用いるアフィニティークロマトグラフィー）によりさらに精製され得る。その後、またはあるいは、探している免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープがカラムに固定され、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体が精製される。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（２０００）Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１４：２５−２８により議論されている。
【００９４】
（モノクローナル抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の軽鎖遺伝子産物および単一の重鎖遺伝子産物からなる１分子種のみの抗体を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定部位（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する固有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
【００９５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載される）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫因子で免疫され、その免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球が惹起される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【００９６】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメント、またはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望の場合、脾臓細胞または末梢血リンパ球が使用され、また、非ヒト哺乳動物起源が所望の場合、リンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される。Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）ｐｐ．５９−１０３。不死化細胞株は通常、形質転換哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００９７】
好ましい不死化細胞株は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、かつＨＡＴ培地のような培地に感受性である細胞株である。より好ましい不死化細胞は、マウス骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手可能）であり得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
【００９８】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は次いで、その抗原に対するモノクローナル抗体抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））により決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体が単離される。
【００９９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ得、標準的な方法により増殖される。この目的にとって適切な培養培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水として、インビボで増殖され得る。
【０１００】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）により培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【０１０１】
モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）により作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として使用できる。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに配置され得、次いで、宿主細胞（例えば、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ得、組み換え宿主細胞において、モノクローナル抗体が合成される。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部をコードする免疫グロブリンに共有結合することにより、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を作製するため、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得、または本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインで置換され得る。
【０１０２】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、ヒトへの投与に適しており、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こさない。抗体のヒト化形態は、主に、ヒト免疫グロブリンの配列で構成され、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）の方法に従い、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列とヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施され得る（米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても移植したＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである少なくとも１つ、および代表的には２つの改変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６）。
【０１０３】
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、軽鎖および重鎖の本質的に全体の配列（ＣＤＲを含む）が、ヒト遺伝子から生じた抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書中で「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）により調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において使用され得、ヒトハイブリドーマを用いることにより（Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）またはエプスタイン−バーウイルスでヒトＢ細胞をインビトロ形質転換することにより（Ｃｏｔｅら（１９８５），ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）生成され得る。
【０１０４】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を用いて生成され得る。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１を参照のこと。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にかまたは完全に不活性化されたマウス）に導入することにより、作製され得る。チャレンジによって、全ての局面（遺伝子配置、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）においてヒトに見られるものと緊密に類似するヒト抗体産物が生成される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６１１，０１６号；およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおｙびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５））に記載されている。
【０１０５】
ヒト抗体はさらに、抗原によるチャレンジに応答して、動物の内因的な抗体ではなく完全ヒト抗体を生成するよう改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて生成され得る。ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。非ヒト宿主において重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は不活性化され、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が、宿主ゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物は、この改変の全部より少数の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交差交配することにより子孫として得られる。このような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に記載されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生成する。この抗体は、目的の免疫原で免疫した後、この動物から、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として直接的に得られるか、あるいは、この動物由来の不死化Ｂ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞）から得られる。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接的に得るために回収および発現されるか、または抗体アナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るためにさらに改変され得る。
【０１０６】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスに代表される）を生成する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。これは、胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖からＪセグメント遺伝子を欠失させて、この遺伝子座の再配置を防止しかつ再配置した免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する工程（欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的化ベクターによりもたらされる）、およびその体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生成する工程、を包含する方法により入手され得る。
【０１０７】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を生成する方法は、米国特許第５，９６１，７７１号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、および２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成する工程を包含する。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１０８】
免疫原上の化学的に関連するエピトープを同定する方法、および高い親和性を有する関連エピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する相関関係のある方法は、ＰＣＴ公報９９／５３０４９に開示されている。
【０１０９】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明によれば、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術が適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築する方法が適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効率的な同定が可能となる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤による抗体分子の処理により生成されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない）は、当該分野で公知の技術により産生され得る。
【０１１０】
（二特異的抗体）
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。本発明においては、結合特異性のうちの１つは、本発明の抗原性タンパク質に対する特異性である。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットが有利である。
【０１１１】
二特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。従来法では、二特異的抗体の組み換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対（ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する）の同時発現に基づいている（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な仕分けが理由で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、これらのうちの１つのみが、二特異的構造を生成する。正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９に記載されている。
【０１１２】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。融合体は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。この融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合部位に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。二特異的抗体作製のさらなる詳細については、Ｓｕｒｅｓｈら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０を参照のこと。
【０１１３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするよう操作され得る。好ましい界面は、抗体定常領域のＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側さ（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。この大きな側さと同一または類似の大きさの補償的「空洞」（Ａｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ “ｃａｖｉｔｙ”）が、大きなアミノ酸側鎖とより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）を置換することによって、第２抗体分子の界面に作製される。これにより、望ましくない最終産物（例えば、ホモダイマー）よりもヘテロダイマーの収率を増大させる機構が提供される。
【０１１４】
二特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二特異的抗体を生成する技術は、文献に記載されている。例えば、二特異的抗体は、化学的連結を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１は、インタクトな抗体をタンパク質分解切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載している。これらのフラグメントは、ビシナルのジチオールを安定化させ、分子内ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、生成されるＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つは、メルカプトエチルアミンによる還元により、Ｆａｂ’−チオールに再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二特異的抗体が形成される。生成された二特異的抗体は、酵素の選択的免疫のための因子として使用され得る。
【０１１５】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収さ得、そして化学的にカップリングされて二特異的抗体が形成される。Ｓｈａｌａｂｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５は、完全ヒト化二特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、そしてインビトロで指向性化学カップリングに供して、二特異的抗体を形成した。このようにして形成された二特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および通常のヒトＴ細胞に結合し得、かつヒト乳癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘導し得る。
【０１１６】
組み換え細胞培養物から直接的に二特異的抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術もまた記載されている。例えば、二特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３．ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。この抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで、再酸化してヘテロダイマーを形成させた。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のためにも使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８によって記載される「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二特異的抗体フラグメントを作製する代替機構を提供する。このフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成され、それによって、２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二特異的抗体フラグメントを作製する別のストラテジーもまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８を参照のこと。
【０１１７】
２価以上を有する抗体が、考慮される。例えば、三価抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０。
【０１１８】
例示の二特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、そのうちの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に由来する。あるいは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に注目するため、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）））と組み合わされ得る。二特異的抗体はまた、細胞障害性因子を、特定の抗原を発現する細胞に向かわせるのに使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞障害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを有する。別の目的の二特異的抗体は、本明細書中に記載されるタンパク質抗原に結合し、かつ組織因子（ＴＦ）にさらに結合する。
【０１１９】
（薬学的組成物）
本明細書中に記載されるＩＬ−２１モジュレーターは、従来法により、薬学的組成物として提供され得る。この組成物は、好ましくは、内部使用に適しており、かつ有効量の薬理学的に活性な本発明の化合物を単独でかまたは１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この化合物は特に、毒性があるとしても非常に低い点で有用である。
【０１２０】
実施する際に、この化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩は、所望の変化（すなわち、ＩＬ−２１レベルの増加または減少）をもたらすのに十分な量で投与され、かつそのような目的に最も適した薬学的形態で使用される。
【０１２１】
例えば、錠剤またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与については、この活性薬物成分は、経口非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と組み合わされ得る。さらに、望ましいかまたは必要とされる場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤もまた、この混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース）、トウモロコシ甘味物質、天然ガムおよび合成ガム（例えば、アカシア、トラガント、またはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックス）などが挙げられる。これらの投薬形態において使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石粉、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または沸騰混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、セルロース、および／またはグリシンが挙げられる。
【０１２２】
注射可能な組成物は、好ましくは、水性の等張溶液または懸濁液であり、脂肪エマルジョンまたは懸濁物から坐薬が有利に調製される。この組成物は、滅菌され得、かつ／または、アジュバント（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節のための塩、および／または緩衝剤）を含む。さらに、これらはまた、他の治療上価値のある物質を含み得る。この組成物は、それぞれ、従来の混合、顆粒化、またはコーティング方法に従って調製され、かつ約０．１〜７５％、好ましくは、約１〜５０％の活性成分を含む。
【０１２３】
本発明の化合物はまた、指定時刻放出および持続放出性の錠剤またはカプセル剤、ピル剤、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁物、シロップ、およびエマルジョンとして、このような経口形態で投与され得る。
【０１２４】
液体、特に、注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散等による調製され得る。活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等）に溶解されるかまたはこれらと混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁液が形成される。さらに、注射前に液体に溶解するのに適した固体形態が処方され得る。注射可能な組成物は、好ましくは、水性等張溶液または懸濁液である。この組成物は、滅菌され得、かつ／またはアジュバント（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節のための塩、および／または緩衝剤）を含む。さらに、これらはまた、他の治療上価値のある物質を含み得る。
【０１２５】
本発明の組成物は、静脈内形態（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内形態、皮下形態、または筋内形態で投与され得る。これらは全て、薬学分野の当業者に周知の形態を用いる。注射可能物質は、液体溶液または懸濁物のいずれかの従来形態で調製され得る。
【０１２６】
非経口注射による投与は、一般的に、皮下、筋内、または静脈内注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）に従って、一定レベルの投薬を維持することを確実にする遅延放出系または持続放出系の移植を用いる。
【０１２７】
さらに、本発明にとって好ましい化合物は、適切な鼻内ビヒクルの使用を通じて、または当業者に周知の経皮用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路を通じて、鼻内形態で投与され得る。経皮送達系の形態で投与するために、用量投与は、当然、投薬レジメンを通じて連続的であり、間欠的ではない。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー、およびゲルが挙げられ、ここで、活性成分の濃度は、０．１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲である。
【０１２８】
固体組成物については、賦形剤として、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられ、使用され得る。上記の活性化合物はまた、例えば、キャリアとしてポリエチレングリコール、例えば、プロピレングリコールを用いて坐薬として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐薬は、脂肪エマルジョンまたは懸濁物から調製されるのが有利である。
【０１２９】
本発明の組成物はまた、リポソーム送達系の形態（例えば、小さな単層ビヒクル、大きな単層ビヒクル、および多層ヒビクル）で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含む、種々のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムは、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物の水性溶液と水和され、薬物を取り囲む脂質層が形成される。
【０１３０】
本発明の化合物はまた、化合物分子とカップリングされる個々のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用により送達され得る。本発明の化合物はまた、標的化薬物キャリアとして可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解ポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）と連結され得る。
【０１３１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、遺伝子療法ベクターとして使用され得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によるか（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射により（例えば、Ｃｈｅｎ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）被験体に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターは、組み換え細胞からインタクトに生成され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じる１つ以上の細胞を含み得る。
【０１３２】
所望の場合、投与される薬学的組成物はまた、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等））を含み得る。
【０１３３】
この化合物を用いる投薬レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；処置される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに用いられる特定の化合物またはその塩を含む、種々の要因に従って選択される。通常の技術を有する医師または獣医は、その状態の進行を予防、抵抗、または休止させるのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、処方し得る。
【０１３４】
本発明の経口用量は、示される効果について使用される場合、約０．０５〜１０００ｍｇ／日の間の範囲（経口）である。この組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０、および１０００．０ｍｇの活性成分を含む等級付けされた錠剤の形態で提供される。本発明の化合物の有効血漿レベルは、０．００２ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【０１３５】
本発明の化合物は、単一の一日用量で投与され得るか、または総一日用量が、一日に２、３、または４回の分割された用量で投与され得る。
【０１３６】
上記薬学的組成物のいずれも、０．１〜９９％、好ましくは、１〜７０％のＩＬ−２１、ＩＬ−２１レセプター、ＩＬ−２１アゴニスト、またはＩＬ−２１アンタゴニストを含み得る。
【０１３７】
所望の場合、この薬学的組成物は、アジュバントと共に提供され得る。アジュバントは、上述されている。いくつかの実施形態において、アジュバントは、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加するために使用され得、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール）、およびヒトにおいて有用なアジュバント（例えば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。一般的には、動物は、連続するいくつかの注射可能物（好ましくは、少なくとも３つのブースター注射を含む）を用いて、抗原を注射される。
【０１３８】
本発明はさらに、以下の非限定的な例において例示される。実施例１〜８は、以下の物質および方法を用いて実施した。
【実施例】
【０１３９】
（マウス）
そうでないことが示されない限り、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを全ての実験に使用した。Ｃ５７ＢＬ／６欠損バックグラウンドのＳｔａｔ６欠損マウスを、Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３１３−９，１９９６に記載されるようにして作製した。
【０１４０】
（リンパ球の調製および培養）
リンパ球を、（Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３１３−９，１９９６）に記載されるように補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。抗ＣＤ４および抗ＣＤ２６Ｌを用いたセルソーティングにより、未処理のＴｈｐ細胞をリンパ節および脾臓から、９５〜９８％純度まで精製した。
【０１４１】
（抗体およびサイトカイン）
Ｔ−ｂｅｔ特異的抗血清を、（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ １００：６５５−６９，２０００）に記載されるようにして調製した。Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ１、およびアクチンに特異的な抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した。リン酸化Ｓｔａｔ４に特異的な抗体を、Ｚｙｍｅｄ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から得た。Ｔｈ分化培養物において使用した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＩＬ−４、およびＩＦＮγに対する抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した。組み換えＩＬ−４を、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈから入手した。組み換えＩＬ−２は、Ｃｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から提供された。組み換えＩＬ−１２は、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）から提供された。ＣＯＳ上清中において発現したマウスＩＬ−２１を調製および濃縮した。１ユニットの活性を、ＩＬ−２１でトランスフェクトしたＢＡＦ３細胞の５０％最大増殖を誘導するのに必要とされる上清濃度と定義した。ＩＬ−２１と平行して調製および濃縮したモックトランスフェクトＣＯＳ上清を、コントロールとして使用した。
【０１４２】
（インビトロＴヘルパー細胞分化）
未処理のＴ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）をコーティングしたプレート上に、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４、１０μｇ／ｍｌ抗ＩＦＮγ（Ｔｈ２条件）、または１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１２、１０μｇ／ｍｌ 抗ＩＬ−４（Ｔｈ１条件）の存在下、１〜２×１０６／ｍｌでプレーティングした。３日後に、細胞をＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）中で拡張した。培養１週間後、細胞を、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎで刺激し、サイトカイン産生を、（Ｂｒｉｄ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：２２９−３７，１９９８）に記載されるような細胞内サイトカイン染色により決定した。
【０１４３】
（ＲＮＡ分析）
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離した。ノザン分析のために、このＲＮＡを、１．５％アガロース／６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎメンブレン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）に移した。このメンブレンを、ＩＬ−２１、Ｉｌ−４、ＩＦＮγ、γ−アクチンに対する放射標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。リアルタイムＰＣＲのために、１μｇのＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）でプライムし、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｃＤＮＡに変換した。２５ｎｇのｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ２×またはＴａｑＭａｎ ２× ＰＣＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いるＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、以下のプライマーを用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。
【０１４４】
【化６】
【０１４５】
ＩＬ−４、ＩＦＮγ、およびＧＡＰＤＨに対するプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、以前から公開されている（Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈ，Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １１：３０５−１２ １９９９）。
【０１４６】
（イムノブロット分析）
細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５％ ＮＰ４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ中に溶解し、溶解物を遠心分離により洗浄することによって、全細胞抽出物を調製した。タンパク質抽出物を、８〜１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｏｐｔｉｔｒａｎメンブレン（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ；Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。イムノブロットを、室温にて１時間、５％ミルクを含有するＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｐｈ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中でブロックし、そして示される抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、抗ウサギＨＲＰ結合抗体（Ｚｙｍｅｄ）と共に室温にてインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄した後、強化化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、販売元の指示に従って検出を実施した。
【０１４７】
（実施例１．ＩＬ−２１は、インビトロでＴｈ２経路に沿って発達するよう誘導されたＴｈ細胞において優先的に発現される）
ＴｈサブセットにおけるＩＬ−２１の発現を決定した。ノザン分析を、１週間かけてＴｈ１またはＴｈ２細胞に分化させ、サイトカイン産生を誘導するため４時間再刺激した未処理のＴｈｐ（Ｔｈ前駆細胞）由来のｍＲＮＡを用いて実施した。その結果を図１Ａ〜１Ｄに示す。図１Ａに示される結果について、Ｔｈｐ細胞は、６日間、Ｔｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件（Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ｓｋｅｗｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で培養した。この細胞を、静止させる（−）か、またはＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｐ＋Ｉ）と共に４時間再刺激した。ＲＮＡを精製し、ノザンブロットによりサイトカイン発現について評価した。示される結果は、３回の独立した実験の代表例である。ＩＬ−２１をコードするメッセージを、刺激したＴｈ２細胞においてのみ検出した。対照的に、ＩＬ−２１メッセージは、Ｔｈ１培養物では検出されなかった。これらの結果は、ＩＬ−２１がＴｈ２特異的サイトカインであることを示している。
【０１４８】
ＩＬ−２１を発現する能力がＴｈ２経路に沿った細胞の発達と共に増加するか否かを決定するため、一次刺激Ｔｈｐ細胞におけるＩＬ−２１発現を、二次刺激Ｔｈ２細胞におけるＩＬ−２１メッセージ発現と比較した。その結果を図１Ｂに示す。示される結果について、Ｔｈｐ細胞は、中立のＴｈ１条件（ｎｅｕｔｒａｌ Ｔｈ１ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）およびＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。ＲＮＡを、一次および二次抗ＣＤ３刺激の２４時間後に精製した。サイトカイン発現を、リアルタイムＰＣＲにより評価し（二連）、ＧＡＰＤＨと比較して示した。ＩＬ−４と同様に、ＩＬ−２１メッセージは、一次刺激後にＴｈｐ細胞において比較的低度で観察された。対照的に、ＩＬ−２１の発現は、細胞がＴｈ２経路に沿って分化した後に顕著に増加した。これらの結果は、ＩＬ−２１遺伝子の発現が、他のＴｈ２特異的サイトカインと同様に調節されることを実証している。
【０１４９】
分化した細胞におけるＩＬ−２１発現に対するサイトカイン環境（ｍｉｌｉｅｕ）の効果を決定した。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を、それぞれ、二次刺激の前にＩＬ−４およびＩＦＮγの存在下で培養した。細胞は、ＩＬ−４およびＩＦＮγによるＳｔａｔ６およびＳｔａｔ１の活性化により証明される通り、これらのサイトカインに応答性であった。
【０１５０】
ＩＬ−２１の発現を回復させるＩＬ−４の能力を試験した。結果を図１Ｃに示す。Ｔｈｐ細胞を、５日間、Ｔｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。ＩＬ−４またはＩＦＮγを、抗ＣＤ３による二次刺激の２４時間前に、示された培養物に添加した。ＲＮＡを、二次刺激の２４時間後に精製し、リアルタイムＰＣＲによりＧＡＰＤＨと比較してＩＬ−２１の発現を評価した（二連）。Ｔｈ１へのＩＬ−４の添加によって、Ｔｈ２細胞に見られるレベルにまでＩＬ−２１発現を回復することはできなかった。さらに、Ｔｈ２培養物へのＩＦＮγの添加は、ＩＬ−２１の発現に対して阻害効果を有さなかった。これらの結果は、Ｔｈ２細胞におけるＩＬ−２１の発現が、Ｔｈ２分化の初期で固定されるようであり、ＩＬ−４またはＩＦＮγによって直接調節されないことを実証している。
【０１５１】
（実施例２．Ｔｈ２細胞は、インビボでのＴｈ２免疫応答の間にＩＬ−２１を発現する）
Ｔｈ２細胞におけるインビボ免疫応答の間のＩＬ−２１の発現を、病原性原生生物モデル系において決定した。原生生物Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒの感染は、Ｔｈ細胞のインビボ応答を研究するための十分に特徴付けられたモデルを提供する（Ｒｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：１５１−７７，１９９５）。Ｌ．ｍａｊｏｒを感染させてた、いつくかの同系交配マウス系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）は、病原体に対する保護的および効果的Ｔｈ１応答を惹起する。逆に、他の同系交配マウス系統（例えば、ＢＡＬＢマウス系統）は、主に、Ｔｈ２応答を生じ、感染を除去できない。
【０１５２】
Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスの両方に、Ｌ．ｍａｊｏｒを感染させた。８匹のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのコホートの後ろ足のフットパッドにＬ．ｍａｊｏｒを感染させた。６週間後、枯渇したリンパ節からのＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、抗ＣＤ３で刺激した。ＲＮＡを刺激６時間後に精製し、サイトカイン発現を、リアルタイムＰＣＲによりＧＡＰＤＨと比較して評価した。
【０１５３】
結果を図１Ｄに示す。予想された通り、Ｃ５７ＢＬ／６感染マウス由来のＣＤ４＋細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ感染マウス由来の細胞よりも多くのＩＦＮγを発現した。優勢Ｔｈ２応答と同じく、感染ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞よりも有意に多くのＩＬ−４を生成した。インビトロＴｈ２をゆがめる条件下で観察されたものと同様に、ＩＬ−２１もまた、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボＴｈ２応答の間に優先的に発現された。これらの結果は、インビトロでの発見（図１）と合わせて、ＩＬ−２１はＴｈ２サイトカインであることを実証している。
【０１５４】
（実施例３．ＩＬ−２１は、Ｔｈ細胞の発達の際にＩＦＮγの産生を特異的に阻害する）
ＩＬ−２１は、ＩＬ−４と、Ｔｈ細胞における類似の発現プロフィールおよび構造的類似性を共有しているので、ＩＬ−４と同様に、Ｔｈ分化に直接影響を及ぼすＩＬ−２１の能力を決定した。
【０１５５】
Ｔｈｐ分化に対するＩＬ−２１の影響を決定するために、Ｔｈｐ細胞を、中立のＴｈ１条件およびＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。
【０１５６】
精製した未処理のＴｈｐ細胞を、中立のＴｈ１条件およびＴｈ２をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下および非存在下でプライムした。これらの細胞のサイトカイン力を、培養１週間後の細胞内サイトカイン染色により評価した。
【０１５７】
結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａに示される結果について、細胞は、ＩＬ−２１の存在下またはモック上清中で１週間培養した。サイトカイン産生を、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎによる再刺激の４時間後の細胞内サイトカイン染色により評価した。結果は、少なくとも１０回の実験の代表例である。
【０１５８】
ＩＬ−４と同様、中性およびＴｈ１培養物へのＩＬ−２１の添加は、ＩＦＮγ産生細胞数を顕著に減少させた（図２Ａ、中性およびＴｈ１条件）。Ｔｈ１細胞における減少した数のＩＦＮγ産生細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析により確認された。しかし、ＩＬ−４を用いて観察されたものと異なり、ＩＬ−２１自体は、ＩＬ−４産生Ｔｈ２細胞の産生を強化できなかった（図２Ａ、中性条件）。ＩＬ−２１処理は、Ｔｈ２をゆがめる条件下でのＩＬ−４産生細胞の発生に対して刺激効果も阻害効果も有さなかった（図２Ａ、Ｔｈ２）。
【０１５９】
最近刺激したＴｈｐ細胞からのＩＦＮγ産生に影響を与えるＩＬ−２１の能力を決定した。精製した未処理のＴｈｐ細胞を、中性およびＴｈ１条件下、ＩＬ−２１の存在下または非存在下で、４８時間培養した。得られた培養上清を、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮγ産生について試験した。ＩＬ−２１は、分化している培養物中で早期に生じるＩＦＮγの量を減少させることが見出された（図２Ｂ）。従って、Ｔｈプライミングの間のＩＬ−２１の存在は、分化Ｔｈ１細胞およびエフェクター細胞の両方がＩＦＮγを産生する能力に影響を及ぼす。
【０１６０】
（実施例４．ＩＬ−２１は、Ｔｈ１エフェクター細胞からのＩＦＮγ産生を直接的に阻害しない）
ＩＬ−２１が、ＩＬ−２１産生を直接的に抑制するか、または代わりに、ＩＦＮγ細胞の分化に影響を与えるかを決定するため、精製した未処理のＴｈｐ細胞を、Ｔｈ１をゆがめる条件下で培養した。ＩＬ−２１またはモック上清を、培養開始時（第０日）または再刺激および分析の２４時間前（第５日）に添加した。サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色により評価した。結果を図３Ａに示す。
【０１６１】
ＩＬ−２１を第０日に添加した際に観察されたものと異なり、分化期間の最後におけるＴｈ１培養物へのＩＬ−２１の添加は、ＩＦＮγ産生に対する効果を有さなかった（Ｔｈ１細胞はＩＬ−２１Ｒを発現し、ＩＬ−２１に対して応答性であるけれども）。この発見は、ＩＬ−２１が、Ｔｈｐ細胞のＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞へと分化する能力に損傷を与えるが、Ｔｈ１エフェクター細胞からのＩＦＮγ産生を直接的に阻害しないことを実証している。
【０１６２】
（実施例５．ＩＦＮγのＩＬ−２１阻害は、Ｓｔａｔ６から独立している）
Ｔｈ１細胞の分化を阻害するＩＬ−４の能力は、Ｓｔａｔ６の発現に依存する（Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．，ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３１３−９，１９９６，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６２７−３０ １９９６，およびＳｈｉｍｏｄａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６３０−３，１９９６）。
【０１６３】
ＩＦＮγのＩＬ−２１媒介阻害もまたＳｔａｔ６に依存するか否かを決定するため、Ｓｔａｔ６欠損細胞におけるＴｈ１分化に影響を与えるＩＬ−２１の能力を決定した。野生型マウスまたはＳｔａｔ６欠損マウスから精製したＴｈｐ細胞を、Ｔｈ１をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下またはモック上清中で１週間培養した。サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色により評価した。
【０１６４】
結果を図３Ｂに示す。Ｓｔａｔ６の非存在下では、Ｉｌ−２１は、Ｓｔａｔ６の存在下の場合とほぼ同じ程度、ＩＦＮγ産生細胞の発生を防止するのに有効であった。従って、ＩＬ−４と異なり、ＩＬ−２１は、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞の発生を防止するのに、Ｓｔａｔ６シグナル伝達に依存しない。さらに、これらの結果は、ＩＬ−２１により誘導されるＩＦＮγの抑制が、直接ＩＬ−４の作用を通じて媒介されないことを実証している。
【０１６５】
（実施例６．ＩＬ−２１は、他のＴｈ１サイトカインを阻害しない）
ＩＬ−２１が、ＩＦＮγ産生を阻害するのに加えて、Ｔｈ１の発達の局面に影響を及ぼすか否かを決定するため、ＩＬ−２１処理したＴｈ１細胞が、他のＴｈ１関連サイトカインを産生する能力を試験した。
【０１６６】
Ｔｈｐ細胞を、Ｔｈ１をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下またはモック上清中で培養し、その後、これらを、二次刺激後に、細胞内サイトカイン染色によりサイトカイン産生について評価した。
【０１６７】
結果を図３Ｃに示す。驚くべきことに、ＩＦＮγ産生細胞の数は、ＩＬ−２１がプライミング条件下で誘導された際に有意に減少したが、同じ細胞集団は、正常な数のＩＬ−２およびＴＮＦα産生細胞を有していた。これらの結果は、ＩＬ−２１が、Ｔｈ１細胞のＩＦＮγ産生能を効果的に抑制するが、同じ細胞は、Ｔｈ１細胞産生能を維持しており、Ｔｈ２サイトカインを産生するように戻らないことを実証している。
【０１６８】
（実施例７．Ｔ−ｂｅｔ発現は、ＩＬ−２１により影響を受けない）
Ｔ−ｂｅｔは、分化Ｔｈ１細胞において特異的に発現され、かつＩＦＮγを強力に誘導することもできる、最近同定された転写因子である。分化Ｔｈ１細胞のＩＬ−２１処理が、Ｔｈ細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現の誘導に影響を及ぼすか否かを決定するため、Ｔｈｐ細胞を、Ｔｈ１またはＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。タンパク質抽出物を、開始時（未処理）および培養４８時間後（Ｔｈ１およびＴｈ２）に回収した。Ｔ−ｂｅｔおよびアクチンの発現を、ウェスタンブロットにより決定した。
【０１６９】
結果を図４Ａに示す。ＩＬ−２１またはモック上清が、示される培養物中に含まれていた。予想された通り、Ｔ−ｂｅｔの発現は、Ｔｈ１培養物において誘導され、Ｔｈ２条件下では低度に維持されていた。ＩＬ−２１の添加は、Ｔｈ１細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現に対して効果を有さなかった。この結果は、ＩＦＮγ発現のＩＬ−２１媒介発現が減少したＴ−ｂｅｔ発現の結果ではないことを示している。
【０１７０】
（実施例８．ＩＬ−２１は、ＩＬ−１２シグナル伝達を阻害する）
ＩＬ−１２シグナル伝達は、Ｔｈ１細胞の発達において重要な役割を果たすことが報告されている。ＩＬ−１２Ｒ欠損Ｔｈ細胞は、ＩＦＮγを生成する能力が大きく損なわれている（Ｗｕ，Ｃ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：１６５８−６５，１９９７）。さらに、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖は、Ｔｈ２細胞の発達において、ＩＬ−４により媒介される効果を特異的に失活させる（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８５：８１７−２４，１９９７）。ＩＬ−２１が、ＩＬ−４と同様に、Ｔｈ１細胞においてＩＬ−１２ｂ２鎖の発現に影響を及ぼすか否かを決定するために、Ｔｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下および非存在下で培養したナイーブＴｈｐ細胞由来のＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって、１２Ｒβ２発現について分析した。Ｔｈｐ細胞を、Ｔｈ１またはＴｈ２をゆがめる条件下で１週間培養した。ＩＬ−２１またはモック上清が、示される培養物中に含まれた。ＲＮＡを、抗ＣＤ３による二次刺激の２４時間後に回収し、リアルタイムＰＣＲによりＩＬ−１２Ｒβ２について評価した。
【０１７１】
結果を図４Ｂに示す。この結果は、３回の独立した実験の代表例である。予想された通り、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現は、Ｔｈ２細胞と比較した場合、Ｔｈ１細胞において高かった。しかし、Ｔｈ１培養物へのＩＬ−２１の添加は、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現に影響を及ぼさなかった。従って、ＩＬ−４について報告された結果と異なり、ＩＬ−２１は、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現の減少を引き起こさなかった。さらに、高いＴＮＦαおよびＩＬ−２レベルと結び付けると、ＩＬ−１２Ｒβ２の高発現は、ＩＬ−２１処理Ｔｈ１細胞が、多くのＴｈ１の特徴を維持している（減少したＩＦＮγ産生を除く）ことを示唆している。
【０１７２】
Ｓｔａｔ４は、ＩＬ−１２により特異的に活性化され、そしてＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞の発生にとって重要なメディエーターであることが報告されている（Ｗｕｒｓｔｅｒ，Ａ．Ｌ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：２５７７−８４，２０００）。ＩＬ−２１が、ＳＴＡＴ−４を活性化するＩＬ−１２の能力に影響を及ぼすか否かを決定するため、未処理のＴｈｐ細胞を、ＩＬ−２１の存在下または非存在下で４８時間活性化した。その後、この細胞をＩＬ−１２で刺激し、Ｓｔａｔ４のリン酸化の程度を、ウェスタンブロット分析によって決定した。Ｔｈｐ細胞を、Ｉｌ−２１の存在下またはモック上清中で、４８時間、抗ＣＤ３を用いて刺激した。タンパク質抽出物を、ウェスタンブロットにより、リン酸化Ｓｔａｔ４（ｐ−Ｓｔａｔ４）、Ｓｔａｔ４、およびＳｔａｔ１について評価した。結果は、４回の独立した実験の代表例である。
【０１７３】
結果を図４Ｃに示す。ＩＬ−２１処理細胞は、通常レベルのＩＬ−１２Ｒβ２を発現することが見出されたが、ＩＬ−１２刺激に応答したＳｔａｔ４のリン酸化は、ＩＬ−１２処理細胞において減少していた。この減少したレベルのリン酸化Ｓｔａｔ４はまた、総Ｓｔａｔ４タンパク質レベルにおける減少により反映された。比較として、Ｓｔａｔ１タンパク質は、ＩＬ−２１処理による影響を受けなかった。
【０１７４】
Ｓｔａｔ４ ＲＮＡレベルもまた試験した。Ｔｈｐ細胞を、図４Ｃに記載されるようにして培養し、その後、ＲＮＡを回収して、リアルタイムＰＣＲによりＳｔａｔ４発現について評価した（二連）。
【０１７５】
結果を図４Ｄに示す。結果は、３回の独立した実験の代表例である。より低レベルのＳｔａｔ４ ＲＮＡレベルを検出した。Ｓｔａｔ４タンパク質レベルにおけるＩＬ−２１により誘導された減少は、Ｓｔａｔ４ ｍＲＮＡの減少に起因する可能性がある。これらの発見は、ＩＬ−２１が、Ｓｔａｔ４遺伝子発現の減少を通じて、ＩＬ−１２に対する発達中のＴｈ１細胞の応答を妨害することを示唆している。
【０１７６】
（実施例９．ＩＬ−２１シグナル伝達は、インビボでのＴｈ１応答を制限するために必要とされる）
内部産生したＩＬ−２１は、インビボでのＴｈ１細胞の機能を制限する上で役割を果たすか否かを決定するため、遅延型過敏応答（ＤＴＨ）の程度を、ＩＬ−２１Ｒ欠損マウスにおいて試験した。ＤＴＨは、古典的なＴｈ１細胞媒介炎症応答である。Ｃ５７ＢＬ／６系に戻し交配したＩＬ−２１Ｒ欠損マウスを、Ｋａｓｉａｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：５５９−６０，２００２に記載されるようにして作製した。１００ｍｇ ＴＮＰ−ＫＬＨ（２，４，６−トリニトロフェニル−キーホールリンペットヘモシアン；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を乳化させたＤＦＡを用いて、８週齢の雌マウスの尻尾の基部を皮下免疫した。６日後に、マウスの一方の後ろ足のフットパッドに５０μｇのＴＮＰ−ＫＬＨを、反対側の後ろ足のフットパッドにＰＢＳをチャレンジした。フットパッドの厚さを、チャレンジの２４時間後に測定した。
【０１７７】
結果を図５Ａに示す。野生型マウスおよびＩＬ−２１Ｒ欠損（ＩＬ−２１Ｒ−／−）マウスの特異的なフットパッドの肥大を、ＴＮＰ−ＫＬＨにより誘導された肥大からＰＢＳを注射したフットパッドの非特異的肥大を差し引くことにより決定した。各々のデータポイントは、１匹のマウスを表している。水平線は、平均を示す。結果は、２回の独立した実験からのデータの蓄積を反映している。この結果は、野生型動物が、抗原チャレンジに応答し、フットバッドが大きく肥大したことを実証している。驚くべきことに、ＩＬ−２１Ｒ欠損マウスは、ずっと強力なＤＴＨ応答（平均２倍の肥大）を惹起した。
【０１７８】
ＩＦＮγ産生をまた、免疫したマウスにおいても試験した。結果を図５Ｂに示す。免疫マウスの枯渇リンパ節から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、２５０ｍｇ／ｍｌ ＴＮＰ−ＫＬＨを用いてインビボで刺激した。上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγレベルについて分析した。示される結果は、二連で実施した各遺伝子型からの２匹のマウスのデータの平均である。ＩＬ−２１Ｒ欠損動物における増加したＤＴＨ応答は、枯渇リンパ節から精製されインビトロで抗原によって再刺激したＣＤ４＋細胞からのＩＦＮγ産生における顕著な増加と相関した。
【０１７９】
これらの結果は、ＩＬ−２１が、ＩＦＮγの産生を抑制することにより、ＴＨ１細胞応答の制限に関与することを実証している。
【０１８０】
さらなる実施形態は、各請求項に示されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−２１、例えば、ヒトＩＬ−２１の活性またはレベルのモジュレーター、および、Ｔ細胞、例えば、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の発生および機能の調節におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）サブセットは、異なるサイトカインパターンを産生し、そして特異的な免疫応答を促進するその能力によって、識別される。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγを産生し、そして、細胞内病原体に対する、細胞媒介性免疫を促進する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生し、そして、肥満細胞および好酸球を活性化して、Ｂ細胞を細胞外病原体に対して指向させる。Ｔｈ応答の調節不全は、免疫病理を生じ得る。免疫病理においては、異常なＴｈ１応答が、器官特異的自己免疫疾患の原因であり得、そして、過大なＴｈ２応答が、アレルギー疾患に関連する。
【０００３】
極性化Ｔｈ細胞によって産生される特異的なサイトカインは、前駆Ｔｈ細胞の分化を促進する主要なエフェクターであるが、これらの細胞はまた、他の機能的活性のサブセットをもまた、交差調節する。例えば、ＩＬ−４は、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２エフェクターへの分化を促進することにおける、強力な因子であることが報告されている。さらに、ＩＬ−４は、ＩＦＮγの産生をアンタゴナイズする。ＩＬ−１０（Ｔｈ２細胞によって産生される別のサイトカイン）もまた、Ｔｈ１発生、およびＩＦＮγ誘導性のマクロファージ機能を阻害することが、記載されている。その逆に、Ｔｈ１細胞によって産生されるＩＦＮγは、Ｔｈ１発生を増幅し、そして、Ｔｈ２細胞の増殖を阻害する。これらのサイトカインが、特異的なＴｈ細胞のサブセットの発生を促進する能力は、同時に、代替的な発生の運命を阻害しながら、次第に、極性化された応答を生じる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、部分的には、サイトカインインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）がＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセット（Ｔｈ２細胞）によって発現され、そして、Ｔｈ１細胞発生の間に、選択的にインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを阻害するという発見に、一部基づく。より具体的には、本明細書において、ＩＬ−２１が、インビトロおよびインビボにおいて生成されたＴｈ２細胞によって優先的に発現されることが、示された。１つの実施形態において、発生中のＴｈ細胞のＩＬ−２１への暴露は、発生中のＴｈ１細胞からのＩＦＮγレベルを特異的に減少し、従って、Ｔｈ２応答を増強する。さらに、発生中のＴｈ細胞のＩＬ−２１への暴露は、Ｓｔａｔ４シグナル伝達を減少し（例えば、Ｓｔａｔ４タンパク質および／またはｍＲＮＡ発現を減少することによる）、それによって、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）に対するＴｈ細胞応答を調節する。従って、Ｔｈ細胞発生および活性を調節する方法および組成物が、開示される。本明細書に記載される方法および組成物（例えば、ＩＬ−２１のアゴニストまたはアンタゴニスト）は、Ｔｈ２関連障害のようなＴｈ細胞関連および／またはＩＦＮγ関連障害または状態（例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分と関連する障害（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および狼瘡））；およびＴｈ１関連障害（例えば、自己免疫障害（例えば、とりわけ、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬および重症筋無力症）の、処置（例えば、治癒、寛解、発症の遅延もしくは予防、または、再発予防もしくは置換）、あるいは、予防において有用である。
【０００５】
１つの局面において、本発明の特徴は、Ｔ細胞または細胞集団におけるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルの、阻害（例えば、減少または除去）のための方法である。本発明は、例えば、Ｔ細胞（Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ細胞）またはＴｈ１細胞（例えば、分化するＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）またはそのＴ細胞集団におけるＩＦＮγの活性、発現、分泌、または処理の阻害を提供する。本発明の方法は、Ｔ細胞または細胞集団を、Ｔ細胞または細胞集団中の、ＩＦＮγを阻害（例えば、減少または除去）するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストに接触させ、その結果、アゴニストが、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有するＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして、このＩＬ−２１ポリペプチドがＩＬ−２１Ｒの結合を阻害し得る、工程を包含する。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、ＩＦＮγレベルの阻害が所望されるＴ細胞または細胞集団を同定する工程を包含する。
【０００６】
別の局面において、本方法はＴｈ前駆細胞（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を促進する方法を特徴とする。１つの実施形態において、この方法は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化を誘導するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、このアゴニストが、配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして、このポリペプチドは、ＩＬ−２１Ｒへ結合し得る工程、を包含する。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化が所望される、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を同定する工程を、包含する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団の、Ｔｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害する方法を、特徴とする。この方法は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程を包含し、そして、このアゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有するＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして、このポリペプチドは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る。１つの実施形態において、この方法はさらに、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ１細胞または細胞集団への分化の阻害が所望される、Ｔ細胞集団を同定する工程を包含する。
【０００８】
これらの方法のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。これらの方法のいくつかの実施形態において接触工程が、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて行われる。エキソビボまたはインビボの方法における適切な被験体としては、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）が挙げられる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を阻害する方法を、特徴とする。この方法は、Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）／ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）アゴニストと接触させる工程を、包含する。そして、アゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される。この方法は、必要に応じて、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化の阻害が所望される、Ｔ細胞または細胞集団を同定する工程を、さらに包含する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞集団は、少なくとも１つのＴｈ１細胞を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、ＩＬ−２１レセプターの細胞外領域を含む。例えば、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸２０〜２３５と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含み得、そしてＩＬ−２１に結合し得るか、あるいは、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜２３５を含む。関連する実施形態において、可溶性フラグメントは、さらに、Ｆｃフラグメントを含む。なお別の実施形態において、アンタゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体であるか、または、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメントである。
【００１１】
なお別の実施形態において、接触工程は、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて、行われる。接触工程は、哺乳動物被験体において行われ得、例えば、哺乳動物被験体は、ヒトである。
【００１２】
別の局面において、本発明は、Ｔ細胞または細胞集団中のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを増加する方法に特徴を有する。１つの実施形態におけるこの方法は、Ｔ細胞または細胞集団を、Ｔ細胞または細胞集団中のＩＦＮγレベルを増加するのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒのアゴニストと接触させる工程を包含し、そして、アンタゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される。この方法の実施形態はさらに、ＩＦＮγレベルの増加が所望されるＴ細胞集団を同定する工程を包含する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、ＩＬ−２１レセプターの細胞外領域を含む。例えば、いくつかの実施形態において、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸２０〜２３５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を包含し、ＩＬ−２１に結合し得るか、あるいは、可溶性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜２３５を含む。関連する実施形態において、可溶性フラグメントはさらに、Ｆｃフラグメントを含む。なお別の実施形態において、アンタゴニストは、抗ＩＬ−２１抗体または抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメントであり得る。
【００１４】
なお別の関連する実施形態において、接触工程は、エキソビボ、インビトロ、または、インビボにおいて行われる。いくつかの実施形態において、接触工程は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）において行われる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｔ細胞またはＴ細胞集団においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを阻害するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔ細胞または細胞集団を、該Ｔ細胞または細胞集団中においてＩＦＮγを阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％であるアミノ酸を含むＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして該アゴニストは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
ＩＦＮγレベルの阻害が所望されるＴ細胞または細胞集団を同定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を促進するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、該Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化を誘導するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％であるアミノ酸を含むＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして該アゴニストは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る、工程、
を包含する、方法。
（項目４）
さらに、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化が所望されるＴｈｐ細胞または細胞集団を同定する工程を包含する、項目３に記載の方法。
（項目５）
Ｔｈｐ細胞または細胞集団の、Ｔｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、該Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ１細胞または細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アゴニストは、配列番号２と少なくとも８５％であるアミノ酸を含むＩＬ−２１ポリペプチドであり、そして該アゴニストは、ＩＬ−２１Ｒに結合し得る、工程、
を包含する、方法。
（項目６）
さらに、Ｔｈ１細胞または細胞集団への前記Ｔｈｐ細胞または細胞集団の分化の阻害が所望されるＴ細胞集団を同定する工程を包含する、項目５に記載の方法。
（項目７）
項目１、３、または５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目８）
項目１、３、または５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて行われる、方法。
（項目９）
項目１、３、または５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、哺乳動物被験体において行われる、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物被験体がヒトである、方法。
（項目１１）
Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）細胞または細胞集団の、Ｔｈ２細胞または細胞集団への分化を阻害するための方法であって、該方法は、以下：
該Ｔｈｐ細胞または細胞集団を、該Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞集団への分化を阻害するのに十分な量のインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）／ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）のアンタゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アンタゴニストは、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される、工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
さらに、Ｔｈｐ細胞または細胞集団のＴｈ２細胞または細胞集団への分化の阻害が所望される、Ｔ細胞または細胞集団を同定する工程を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
Ｔ細胞または細胞集団においてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを増加する方法であって、以下：
該Ｔ細胞または細胞集団を、該Ｔ細胞または細胞集団のＩＦＮγレベルを増加するのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストと接触させる工程であって、ここで、該アンタゴニストは、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体の抗原結合フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群から選択される、工程、
を包含する、方法
（項目１４）
さらに、ＩＦＮγレベルの増加が所望されるＴ細胞集団を同定する工程を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１１または１３に記載の方法であって、ここで、前記ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、ＩＬ−２１レセプターの細胞外領域を含む、方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、前記可溶性フラグメントが、配列番号４のアミノ酸２０〜２３５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして、ＩＬ−２１に結合し得る、方法。
（項目１７）
項目１５に記載の方法であって、ここで、前記可溶性フラグメントが、配列番号４のアミノ酸１〜２３５を含む、方法。
（項目１８）
項目１５に記載の方法であって、ここで、前記可溶性フラグメントが、さらにＦｃフラグメントを含む、方法。
（項目１９）
項目１１または１３に記載の方法であって、ここで、前記アンタゴニストが、抗−ＩＬ２１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントである、方法。
（項目２０）
項目１２に記載の方法であって、ここで、前記Ｔ細胞集団が、少なくとも１つのＴｈ１細胞を含む、方法。
（項目２１）
項目１１または１３に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、エキソビボ、インビトロ、またはインビボにおいて行われる、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、哺乳動物被験体において行われる、方法。
（項目２３）
項目２２に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物被験体がヒトである、方法。
【００１５】
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語、および科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般に理解される意味と、同一の意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と、類似または等価の方法および材料は、本明細書の実施または試験において使用されるが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、その全体が、本明細書において参考として援用される。意味が対立する場合は、定義を含む本明細書の意味が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみのためであり、本発明を限定することを意図しない。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および添付の請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、添付の実施例に記載される、種々のＴｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件下での、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、およびβアクチンの発現を試験する、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、初期の刺激および第２の刺激後に、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルと比較した、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＥＬ−４およびＩＦＮγの存在下および非存在下において培養した、初期および第２のＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルと比較した、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｌ．ｍａｊｏｒによる感染後のＣ５７ＢＬ／ｇマウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウス中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対する、ＩＬ−２１ ｍＲＮＡ、ＩＬ−４ ｍＲＮＡ、およびＩＦＮγ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、中和条件下、またはＴｈ１をゆがめる条件下で培養したＴｈｐ細胞におけるＩＬ−４産生およびＩＬ−２１サイトカイン産生を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＬ−２１処理したＴｈｐ細胞、およびモック（ｍｏｃｋ）処理したＴｈｐ細胞中のＩＦＮγ産生を示す、棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＩＬ−２２の存在下および非存在下での、Ｔｈ１をゆがめる条件下で培養したＴｈｐ細胞中のＥＬ−４産生およびＩＦＮγ産生を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、野生型マウスおよびＳｔａｔ６−／−マウスからの、Ｔｈ１をゆがめる条件下で処理された、ＩＬ−２１処理Ｔｈｐ細胞またはモック（ｍｏｃｋ）処理マウス中の、ＥＬ−４産生およびＩＦＮγ産生を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαの発現を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｔｈ１またはＴｈ２をゆがめる条件下で培養された、Ｔｈｐ細胞中の、Ｔ−ｂｅｔおよびアクチンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｔｈ１細胞中における、レベルに対する、ＩＬ−２１Ｒβ２ ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＬ−２１またはモック上清の存在下における、抗ＣＤ−３にて刺激したＴｈｐ細胞中の、リン酸化Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ１、およびＩＬ−２１ポリペプチドレベルのウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＬ−２１存在下、またはモック（ｍｏｃｋ）上清存在下において、４８時間、抗ＣＤ３で刺激した、モック処理Ｔｈｐ細胞およびＩＬ−２１ Ｔｈｐ細胞中のｇＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対する、Ｓｔａｔ４ ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。ＩＬ−４ ｍＲＮＡおよびＩＦＮγ。
【図５Ａ】図５Ａは、その後にＴＮＰ−ＫＬＨまたはＰＢＳを注入した、ＴＮＰ−ＫＬＨ免疫化野生型マウス、およびＩＬ２１−２１Ｒ−／−マウスにおける、特異的膨張を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗原を用いて再度刺激した、ＴＮＰ−ＫＬＨ免疫化野生型マウスおよびＩＬ２１−２１Ｒ−／−マウスの排出されたリンパ節から精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞中のＩＦＮγ産生を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｔヘルパー細胞の分化、発生、および活性を、ＩＬ−２１とＩＬ−２１レセプターとの間の相互作用を調節することによって調節するための方法および、組成物を提供する。細胞集団中のＩＬ−２１、またはＩＬ−２１レベルもしくはＩＬ−２１レセプターレベルを増加する試薬が、Ｔヘルパーの集団に添加されて、Ｔｈｐ細胞またはＴｈ１細胞の集団におけるＩＦＮγレベルを抑制する。ＩＬ−２１、またはＩＬ−２１レベルを増加する試薬をまた使用して、Ｔｈ２発生を促進し得るか、またはＴｈ２媒介性免疫応答を増強し得るか、および／もしくはＴｈ１発生を抑制し得る。
【００１９】
ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レベルを増加する試薬をまた使用して、Ｔヘルパー細胞集団に対するＩＬ−２１の効果を阻害し得る。ＩＬ−２１、またはＩＬ−２１レベルを増加するか、もしくはそうでなければＩＬ−２１アゴニストとして作用する試薬を使用して、Ｔｈ１媒介性疾患（例えば、自己免疫疾患、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、およびＩ型糖尿病）を抑制し得る。
【００２０】
１つの局面において、本発明は、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）内のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の活性またはレベルを、調節（例えば、増加、または減少または阻害）するための方法に特徴がある。例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ細胞）またはＴｈ１細胞（例えば、分化しつつあるＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）、あるいは、そのＴ細胞集団中の、ＩＦＮγ活性、発現、分泌またはプロセッシングの１つ以上を調節する方法が、提供される。本発明の方法は、以下：
（必要に応じて）ＩＦＮγ活性レベルの調節（例えば、増加または減少）が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を同定する工程；および
その細胞または細胞集団を、その細胞または細胞集団中のＩＦＮγの活性またはレベルを調節（例えば、増加または減少）するのに十分な量のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）と接触させる工程、を包含する。
【００２１】
この方法を、培養中の細胞（例えば、インビトロまたはエキソビボ）において使用し得る。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるＴ細胞）を、培養培地でインビトロ培養し得、そして、１つ以上のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）を培養培地に添加することによって、接触工程を行い得る。あるいは、この方法は、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載の免疫細胞またはＴ細胞）において（例えば、インビボプロトコールの一部として（例えば、治療的に、または、予防的に））実施され得る。
【００２２】
１つの実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ）、またはＴｈ１細胞（例えば、分化しつつあるＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）、あるいはその細胞集団）中のＩＦＮγの活性またはレベルを、減少させるか、または阻害する方法が、提供される。この方法は（必要に応じて）、ＩＦＮγの活性またはレベルの減少または阻害が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を同定する工程；およびその細胞または細胞集団を、その細胞または細胞集団中のＩＦＮγの活性またはレベルを減少または阻害するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程、を包含する。好ましくは、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＦＮγレベルまたは活性を、特異的に阻害する（例えば、ＩＬ−２またはＴＮＦαのような他のサイトカインの活性も、レベルも、減少も阻害もしない）。１つの実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＦＮγ産生細胞（例えば、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞）による、ＩＦＮγの産生を阻害する。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、被験体におけるＩＦＮγレベルまたは活性を減少するための方法を提供する。この方法は（必要に応じて）、ＩＦＮγのレベルまたは活性の減少が所望される被験体を同定する工程；および、その被験体に対して、ＩＦＮγのレベルまたは活性を減少するのに十分な量のＩＬ−２１を投与する工程、を包含する。ＩＦＮγは、当該分野において公知の技術（例えば、細胞内サイトカイン染色、または、細胞上清中のレベルを決定する、ＥＬＩＳＡ技術）を使用して、測定し得る。
【００２４】
ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド、またはその活性フラグメント（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはこれらと実質的にホモログである）。他の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）、または別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））と融合したそのフラグメント；ＩＬ−２１レセプターに対するアゴニスト抗体；あるいは、小分子アゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１の活性またはレベルを増加する薬剤である（例えば、ＩＬ−２１の発現、プロセッシング、および／または分泌を増加することによる）。
【００２５】
好ましくは、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト被験体）であって、異常な（例えば、増加したＩＦＮγレベルまたは活性に関連する障害（例えば、免疫障害（例えば、Ｔ細胞媒介性障害））に罹患する被験体であり、その障害を寛解または予防するために十分な量である。
【００２６】
ＩＬ−２１のアゴニストを用いて、処置（例えば、寛解）または予防することができる例示的な免疫障害としては、例えば、Ｔｈ１関連障害（例えば、自己免疫疾患（多発性硬化症、慢性関節リウマチ、およびＩ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬および重症筋無力症が挙げられるが、これらに限定されない））が挙げられる。
【００２７】
本発明はさらに、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（Ｔ細胞集団）においてＩＦＮγのレベルまたは活性を増加する方法に、特徴がある。例えば、本発明は、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞前駆細胞（Ｔｈｐ細胞）、またはＴｈ１細胞（例えば、分化しつつあるＴｈ１細胞またはエフェクターＴｈ細胞）またはそのＴ細胞集団における、ＩＦＮγ活性、発現、またはプロセシングを増加する方法を包含する。この方法は（必要に応じて）、ＩＦＮγ発現の増加が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞）または細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を同定する工程；および、その細胞を、ＩＬ−２１の結合または活性を阻害（例えば、ＩＬ−２１のＩＬ−２１レセプターへの結合を阻害し、それによって、その細胞中のＩＦＮγ発現レベルを増加する）するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させる工程を包含する。
【００２８】
ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）、またはＩＬ−２１レセプター（例えば、ヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチド）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体または単一の特異的抗体）であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２１、またはヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロで生成された抗体である。別の実施形態において、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１レセプター結合ドメイン）が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１レセプターポリペプチド（例えば、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニストは、第２の部分（例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖）と融合した、上記のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドあるいはそのフラグメントを含む融合タンパク質である。
【００２９】
別の局面において、本発明は、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を調節（例えば、増加または減少）するための方法に、特徴がある。１つの実施形態において、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆体（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上が、提供される。
【００３０】
（必要に応じて）増殖、生存および／または分化が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ２細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化を調節する（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２細胞への分化を調節する）ために十分な量のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）と接触し、それによって、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を調節する工程、を包含する。
【００３１】
本方法は、培養中の細胞に対して、使用し得る（インビトロまたはエキソビボ）。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるＴ細胞）を培養培地中でインビトロ培養し得、そして、接触工程を、培養培地に１つ以上のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、１つ以上のＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）を添加することによって、行い得る。あるいは、この方法を、被験体中に存在する細胞（例えば、インビボプロトコール（例えば、治療または予防）の一部として）において行い得る。
【００３２】
１つの実施形態において、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を減少または阻害する方法が提供される。例えば、増殖、生存、および／またはＴｈ２細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆体（Ｔｈｐ）の分化）の１つ以上を阻害するか、または減少することによって、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を、減少または阻害し得る。この方法は（必要に応じて）、増殖、生存、および／または分化が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ２細胞））または細胞集団を同定する工程；ならびに、その細胞または細胞集団を、増殖、生存、および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２細胞への分化を阻害または減少する）の１つ以上を阻害または減少し、それによってＴｈ２細胞の活性および／または細胞数を阻害または減少するのに十分な量のＩＬ−２１アンタゴニストと接触させる工程、を包含する。
【００３３】
この方法を、例えば、インビトロまたはエキソビボの、細胞（例えば、培養中のＴ細胞（例えば、Ｔｈｐ細胞またはＴｈ２細胞））に対して、使用し得る。
【００３４】
あるいは、この方法は、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載される、免疫細胞またはＴ細胞）において（例えば、インビボ（例えば、治療的または予防的）プロトコールにおいて）、行い得る。例えば、この方法を、被験体におけるＴｈ２媒介性障害（例えば、喘息およびアレルギー）を処置、または、予防するために、使用し得る。従って、本発明は、本発明は、被験体におけるＴｈ２関連障害を処置（例えば、治癒、抑制、寛解、開始の遅延もしくは予防、または、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）もしくは再発（ｒｅｌａｐｓｅ）の予防）、あるいは予防のための方法を提供する。この方法は、被験体に対して、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を阻害または減少し、それによって、Ｔｈ２関連障害を処置または予防するのに十分な量のＩＬ−２１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００３５】
好ましくは、被験体は、異常なＴｈ２細胞数または活性に関連する障害（例えば、免疫障害（例えば、Ｔｈ２関連障害））に罹患する哺乳動物（例えば、ヒト）である。細胞活性および／または細胞数を阻害または減少するために十分な量は、その障害を寛解するのに十分な量である。
【００３６】
ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）、またはＩＬ−２１レセプター（例えば、ヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチド）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体または単一特異的抗体）であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２１またはヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロにおいて生成された抗体である。他の実施形態において、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１レセプター結合ドメイン）が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニストは、上記のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチド、あるいは、第２の部分（例えば、免疫グロブリン鎖）と融合したそのフラグメントを含む融合タンパク質である。
【００３７】
なお別の実施形態において、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を増加する方法が、提供される。例えば、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数は、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上を増加することによって、増加され得る。この方法は（必要に応じて）、増加した増殖、生存および／または分化が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ２細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ２細胞への分化の１つ以上を増加する（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ２細胞への分化を増加する）ために十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触させ、それによって、Ｔｈ２細胞活性および／または細胞数を増加する工程、を包含する。
【００３８】
ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチドもしくはその活性フラグメント（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩＬ−２１ポリペプチド、または配列番号１に示される核酸配列によってコードされるＩＬ−２１ポリペプチド、あるいは、それらに対して実質的に相同な配列）であり得る。他の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）、または、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））と融合されたそのフラグメントを含む融合タンパク質；あるいは、；ＩＬ−２１レセプターに対するアゴニスト抗体；あるいは、低分子アゴニストである。
【００３９】
なお別の局面において、Ｔｈ１細胞数および／または活性を調節（例えば、増加または減少）するための方法が、提供される。１つの実施形態において、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上を調節（例えば、促進または阻害）する方法が、提供される。この方法は、（必要に応じて）増殖、生存および／または分化の調節が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ１細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化の１つ以上を調節し（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ１細胞への分化を調節し）、それによってＴｈ１細胞活性および／または細胞数を調節するために十分な量のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）と接触させる工程、を包含する。
【００４０】
この方法を培養中の細胞（例えば、インビトロまたはエキソビボ）に対して、使用し得る。例えば、免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるＴ細胞）を、培養培地中でインビトロで培養して、接触させる工程を、１つ以上のＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１アゴニストまたはアンタゴニスト）を、培養培地に添加することによって、実行し得る。あるいは、この方法は、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載される免疫細胞またはＴ細胞）に対して実行し得る（例えば、インビボ（例えば、治療的または予防的）プロトコールの一部として）。
【００４１】
１つの実施形態において、Ｔｈ１細胞の活性および／または細胞数を減少する方法が提供される。例えば、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆（Ｔｈｐ）の分化））の１つ以上を阻害または減少することによって、減少または阻害し得る。この方法は（必要に応じて）、増殖、生存および／または分化の阻害が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＩＦＮγ産生細胞（例えば、Ｔｈ１細胞））、または細胞集団を同定する工程；ならびにその細胞または細胞集団を、増殖、生存および／またはＴｈ１細胞への分化の１つ以上を阻害または減少し（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ１細胞への分化を阻害または減少し）、それによって、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を阻害または減少するために十分な量のＩＬ−２１アゴニストと接触する工程、を包含する。
【００４２】
この方法は、培養中の細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞））に対して、インビトロまたはエキソビボにおいて使用し得る。
【００４３】
あるいは、この方法を、被験体中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載の免疫細胞またはＴ細胞）に対して、実施し得る（例えば、インビボ（例えば、治療または予防）プロトコールの一部として）。例えば、この方法は、被験体におけるＴｈ１媒介性障害（例えば、自己免疫障害（例えば、とりわけ、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬および重症筋無力症）の処置のために使用し得る。従って、本発明は、被験体中のＴｈ１関連障害の処置方法（例えば、治癒、抑制、寛解、発症の遅延もしくは予防、または、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）または再発（ｒｅｌａｐｓｅ）の予防）、あるいは、予防方法を提供する。この方法は、被験体に対して、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を阻害または減少して、それによってＴｈ１関連障害を処置または予防するのに十分な量のＩＬ−２１アゴニストを投与する工程を包含する。
【００４４】
好ましくは、被験体は哺乳動物、例えば、異常なＴｈ１細胞数または活性に関連する障害（例えば、免疫障害（例えば、本明細書に記載されるＴｈ１関連障害））に罹患するヒトである。Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を阻害または減少するために十分な量は、その障害を寛解または予防するのに十分な寮である。
【００４５】
ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）またはその活性フラグメント（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−２１ポリペプチド、または配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ−２１ポリペプチド、あるいは、これらの配列と実質的に相同な配列）であり得る。他の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２１ポリペプチド）または別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分（例えば、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域））と融合したそのフラグメント；ＩＬ−２１レセプターに対するアゴニスト抗体；あるいは、低分子アゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ−２１アゴニストは、例えば、機能的ＩＬ−２１の発現、プロセッシングおよび／または分泌を増加することによって、ＩＬ−２１の活性またはレベルを増加する因子である。
【００４６】
なお別の局面において、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を増加する方法が提供される。例えば、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を、増殖、生存、および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔ細胞前駆体（例えば、Ｔｈ前駆体（Ｔｈｐ）の分化）の１つ以上を増加することによって、Ｔｈ１細胞活性および／または細胞数を、増加し得る。この方法は、以下を包含する：
（必要に応じて）、増殖、生存、および／または分化が所望される、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＴｈｐまたはＴｈ１細胞））または細胞集団を同定する工程；ならびに、
その細胞または細胞集団を、増殖、生存、および／またはＴｈ１細胞への分化（例えば、Ｔｈｐ細胞のＴｈ１細胞への分化を増加する）の１つ以上を増加し、それによってＴｈ１細胞の活性および／または細胞数を増加するのに十分な量のＩＬ−２１アンタゴニストと接触させる工程。
【００４７】
ＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１（例えば、ヒトＩＬ−２１）、またはＩＬ−２１レセプター（例えば、ヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチド）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体または単一特異的抗体）であり得る。好ましくは、抗体は、ヒトＩＬ−２１またはヒトＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロにおいて生成された抗体である。他の実施形態において、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１ポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドのＩＬ−２１レセプター結合ドメイン）が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとしては、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのフラグメント（例えば、ＩＬ−２１レセプターポリペプチドのＩＬ−２１結合ドメイン）が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニストは、上記のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチド、あるいは、第２の部分（例えば、免疫グロブリン鎖）と融合したそのフラグメントである。
【００４８】
なお別の局面において、本発明は、細胞、細胞集団または被験体において、インターロイキン１２（ＩＬ−２１）の活性またはレベルを調節（例えば、減少、阻害または増加）する方法において特徴を有する。この方法は、以下を包含する：
（必要に応じて）ＩＬ−２１の調節が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞）、細胞集団、または被験体を同定する工程；および
その細胞または細胞集団とＩＬ−２１モジュレーターを接触させるか、またはＩＬ−２１モジュレーターをその被験体に投与して、その細胞、細胞集団、または被験体におけるＩＬ−２１活性またはレベルを調節する工程。
【００４９】
１つの実施形態において、ＩＬ−２１の活性またはレベルを、その細胞または細胞集団をＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニストを、ＩＬ−２１の活性またはレベルを減少するのに十分な量において）と接触させるか、またはその被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、減少する。
【００５０】
別の実施形態において、ＩＬ−２１の活性またはレベルを、その細胞または細胞集団を、ＩＬ−２１アゴニストと接触させるか、または被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、増加する（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニストを、ＩＬ−２１の活性またはレベルを増加するのに十分な量において）。
【００５１】
なお別の局面において、本発明は、細胞、細胞集団、または被験体におけるＳｔａｔ（例えば、Ｓｔａｔ４）の活性またはレベルを調節（例えば、減少または阻害、あるいは増加）する方法に特徴を有する。この方法は、以下を包含する：
（必要に応じて）Ｓｔａｔ活性またはレベルの調節が所望される細胞（例えば、Ｔ細胞）細胞集団または被験体を同定する工程、および；
その細胞または細胞集団を、ＩＬ−２１モジュレーター（例えば、ＩＬ−２１のアゴニストまたはアンタゴニストを、その細胞、細胞集団、または、被験体において、Ｓｔａｔ活性を調節するのに十分な量において）と接触するか、またはその被験体にＩＬ−２１モジュレーターを投与する工程。
【００５２】
１つの実施形態において、Ｓｔａｔの活性またはレベルを、その細胞または細胞集団とＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニスト（例えば、Ｓｔａｔタンパク質またはｍＲＮＡ）を、Ｓｔａｔの活性またはレベルを減少するのに十分な量において）を接触させるか、あるいは、その被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、減少する。
【００５３】
別の実施形態においてＳｔａｔの活性またはレベルを、その細胞または細胞集団をＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニスト（例えば、Ｓｔａｔタンパク質またはｍＲＮＡ）を、Ｓｔａｔの活性またはレベルを増加するのに十分な量において）と接触させるか、あるいは、被験体にＩＬ−２１アゴニストを投与することによって、増加する。
【００５４】
なお別の局面において、本発明は、被験体において、自己免疫応答（例えば、Ｔｈ１媒介性自己免疫応答）を減少、阻害、抑制、寛解または遅延する方法に特徴がある。この方法は、その投与を必要とする被験体において、ＩＬ−２１アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２１アゴニストを、その被験体において自己免疫応答を減少、阻害、抑制、寛解または遅延するのに十分な量において）を投与する工程を包含する。
【００５５】
なお別の局面において、本発明は、被験体におけるＴｈ２関連応答（例えば、アレルギー性応答または喘息性応答）を、減少、阻害、抑制、寛解または遅延する方法に特徴を有する。この方法は、投与を必要とする被験体に対して、ＩＬ−２１アンタゴニストを（例えば、本明細書に記載されるアンタゴニストを、被験体におけるＴｈ２関連応答を、減少、阻害、抑制、寛解または遅延するのに十分な量において）投与する工程を包含する。
【００５６】
別の局面において、本発明は、細胞集団（例えば、Ｔｈ細胞集団）においてＴｈ２細胞手段を選択的に同定する方法に特徴を有し、この方法は、試験サンプル（例えば、Ｔｈ細胞、および参照細胞（例えば、Ｔｈ１細胞））中のＩＬ−２１核酸（例えば、ＩＬ−２１遺伝子産物）またはポリペプチドのレベルを決定する工程；ならびに、その試験サンプル中のそのＩＬ−２１核酸のレベルを、参照サンプル（例えば、Ｔｈ細胞）中のＩＬ−２１核酸のレベルと比較する工程であって、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプル中の、そのＩＬ−２１核酸レベルの増加は、試験サンプルがＴｈ２細胞であることを示す、工程、を包含する。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「Ｔｈ１関連障害」は、参照（例えば、正常コントロール）と比較した、異常な（例えば、増加した、または減少した）Ｔｈ１細胞活性（例えば、増加したか、または減少したＴｈ１細胞応答）、またはＴｈ１細胞数に関連する疾患または状態である。Ｔｈ１関連障害の例としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、とりわけ、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病、乾癬および重症筋無力症）が挙げられる。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「Ｔｈ２関連障害」は、参照（例えば、正常コントロール）と比較した、異常な（例えば、増加した、または減少した）Ｔｈ２細胞活性（例えば、増加したか、または減少したＴｈ２細胞応答）、またはＴｈ２細胞数に関連する疾患または状態である。Ｔｈ２関連障害の例としては、例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分に関連した障害（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および狼瘡）が挙げられる。
【００５９】
本明細書において記載される方法において使用されるＩＬ−２１ポリペプチドは、例えば、哺乳動物ＩＬ−２１ポリペプチド（例えば、げっ歯類、ヒト、または、非ヒト霊長類）のアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２１のポリペプチドをアミノ酸配列を含み得る。適切なアミノ酸配列は、配列番号２（以下）に示されるＩＬ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００６０】
ＩＬ−２１およびＩＬ−２１レセプターポリペプチド（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む）が、例えば、米国特許第６，０５７，１２８号、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：５７−６３，１５ ２０００；Ｖｏｓｓｈｅｎｒｉｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：Ｒ１５７−７７，２００１，Ａｓａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１−５，２００１；およびＯｚａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１１４３９−４４，２０００に記載される。ＩＬ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列は、公知である。例えば、ヒトＩＬ−２１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ＿０１１０８２において利用可能である。このエントリーにおいて開示されるＩＬ−２１ヌクレオチド配列を、以下に表す：
【００６１】
【化１】
【００６２】
この開示されたＩＬ−２１核酸配列によって開示されたアミノ酸配列を、以下に示す：
【００６３】
【化２】
【００６４】
ヒトＩＬ−２１レセプター核酸のヌクレオチド配列を、以下に示す：
【００６５】
【化３】
【００６６】
開示されたＩＬ−２１レセプター核酸配列は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする：
【００６７】
【化４】
【００６８】
核酸配列の相同性は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野で公知のコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３を参照のこと。核酸配列比較のために、以下の設定：５．０のＧＡＰ生成ペナルティ、および０．３のＧＡＰ伸長ペナルティ、において、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用して、上記にて参照された類似核酸配列のコード領域は、配列番号１または配列番号３において示されたＤＮＡ配列のＣＤＳ（コーディング）部分を用いて、好ましくは、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。同様に、本明細書において言及されるアミノ酸配列は、配列番号５、または、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または、９９％の同一性の程度を示す。
【００６９】
用語「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が、比較する特定の領域にわたって、残基と残基との比較において、同一である程度をいう。用語「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を、比較の領域にわたって比較して、両方の配列の生じる同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）の位置の数を決定してマッチした位置の数を生じ、マッチした位置の数を比較の領域の位置の総数で割り算をして、そして結果に１００を掛けて、配列同一性パーセントをもたらすことによって、計算される。本明細書において使用する場合、用語「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドが、比較の領域にわたって参照配列に対して比較した場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８５パーセントの配列同一性、そして、しばしば、９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常は、少なくとも９８または９９パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。用語「ポジティブ残基のパーセント」は、２つの最適に整列された配列を、比較の領域にわたって比較し、上記のように規定された同一性および保存的アミノ酸置換が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、マッチした位置の数を比較の領域の位置の総数で割り算し、そして結果に１００を掛けて、ポジティブ残基のパーセントを生じることによって決定される。
【００７０】
さらに、細胞または細胞集団においてＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターレベルを増加する因子としては、ＩＬ−２１アゴニストまたはＩＬ−２１レセプターアゴニストが挙げられる。そのようなアゴニストは、１つ以上のＩＬ−２１活性がＴヘルパー細胞集団において発揮される試験化合物を同定することによって、同定され得る。
【００７１】
被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタまたはげっ歯類（ラットまたはマウスを含む）であり得る。ＩＬ−２１の任意の所望の投与経路が、使用され得る。適切な投与経路としては、静脈内経路（ボラスおよび注入）、腹腔内、皮下、または筋肉内形態が挙げられ、これら全ては、薬学の分野において当業者に周知の形態を用いる。注入物は、従来の形態（液体溶液または懸濁液のいずれか）において調製され得る。
【００７２】
非経口注入可能な投与は、一般に、皮下、筋肉内、または、静脈内注射および注入のために、使用される。
【００７３】
（ＩＬ−２１アンタゴニスト）
ＩＬ−２１媒介性Ｔヘルパー細胞効果を阻害するために、ＩＬ−２１とＩＬ−２１レセプターとの相互作用をブロックするか、そうでなければ阻害する因子を、Ｔ細胞またはＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞）の集団に添加し得る。便利さのために、これらのインヒビターを本明細書において、「ＩＬ−２１アンタゴニスト」という。ＩＬ−２１アンタゴニストの例としては、例えば、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターの可溶性フラグメント、これらのフラグメントを含む融合タンパク質、およびこれらのフラグメントに対する抗体が挙げられる。ＩＬ−２１アンタゴニストは、Ｔｈ２媒介性疾患（抗体媒介性疾患を含む）におけるＩＬ−２１のブロッキングのために有用である。これらの疾患としては、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および狼瘡が挙げられる。
【００７４】
（ＩＬ−２１およびＩＬ−２１レセプター融合タンパク質）
ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター、あるいはこれらタンパク質の活性フラグメントを、本明細書に記載の方法における使用のために、免疫グロブリンのようなキャリア分子を融合し得る。例えば、ＩＬ−２１レセプターの可溶性形態を、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦｃ部分か、または免疫グロブリンのＦｃ部分に対して融合し得る。他の融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＬｅｘＡ、またはＭＢＰ（すなわち、マルトース結合タンパク質）との融合タンパク質）もまた、使用され得る。
【００７５】
さらなる実施形態において、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター融合タンパク質を、１つ以上のさらなる部分と連結し得る。例えば、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター融合タンパク質を、さらに、ＧＳＴ融合タンパク質と連結し得る（ＩＬ−２１レセプター融合タンパク質配列が、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合する）。そのような融合タンパク質は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター融合タンパク質の精製を容易にし得る。
【００７６】
別の実施形態において、融合タンパク質としては、異種シグナル配列（すなわち、ＩＬ−２１核酸またはＩＬ−２１レセプター核酸によって天然にコードされるポリペプチド中には存在しないポリペプチド配列）を、そのＮ末端において含む。例えば、天然のＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターシグナル配列を除去して、別のタンパク質のシグナル配列によって、置換し得る。
【００７７】
本発明のキメラまたは融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術に従って、インフレームでともに連結する（例えば、連結のための平滑末端または粘着末端（ｓｔａｇｇｅｒ）の使用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合に粘着末端を埋めること、望まれない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結による）。別の実施形態において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって、合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続した遺伝子フラグメントの間の相補的な突出を生じるアンカープライマーを用いて、その後、相補的な突出をアニーリングして、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターをコードする核酸を、そのような発現ベクター中にクローニングして、融合部分を、インフレームで、免疫グロブリンタンパク質と連結し得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチド部分を、天然に生じるＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター配列（野生型）中に変異を有する改変体ＩＬ−２１レセプターポリペプチドとして提供して、ＩＬ−２１レセプターに対する高親和性（変異をしていない配列と比較して）結合の改変ＩＬ−２１、または、ＩＬ−２１に対する高親和性（変異をしていない配列と比較して）改変ＩＬ−２１レセプターポリペプチドを生じる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１レセプターポリペプチド部分は、天然に生じるＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター配列（野生型）において変異を有する改変体ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドとして提供され、タンパク分解に対してより耐性な（変異を有さない配列と比較して）、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター配列を生じる。
【００８０】
融合タンパク質中に含むことができるシグナルペプチドは、ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号５）である。所望される場合、１つ以上のアミノ酸を、さらに、第１のポリペプチド部分（ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプター部分を含む）と第２のポリペプチド部分との間に挿入し得る。
【００８１】
第２のポリペプチドは、好ましくは、可溶性である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、連結したポリペプチドの半減期（例えば、血清半減期）を増強する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドと第２のＩＬ−２１レセプターポリペプチドとの会合を促進する配列を含む。好ましい実施形態において、第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチド領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃ）を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも、より少ないエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体固定化およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対して低い親和性を有するか、または、親和性を有さない。代替的な実施形態において、第２のポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対して、低い親和性を有するか、または、親和性を有さない。
【００８４】
好ましい第２のポリペプチド配列は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。この配列は、Ｆｃ領域を含む。下線を引いたアミノ酸は、野生型免疫グロブリン配列の対応する位置において見出されるアミノ酸と異なるアミノ酸である。
【００８５】
【化５】
【００８６】
（ＩＬ−２１およびＩＬ−２１レセプター抗体）
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかのクラスに関連し、そして、分子に存在する重鎖の性質によって、お互いに異なる。特定のクラスは、サブクラスも有する（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２および他のサブクラス）。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体に対する言及は、ヒト抗体種の全てのクラス、サブクラス、およびタイプへの言及を含む。ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドに対する抗体は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドあるいはＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質に対する抗体をもまた、含む。
【００８７】
ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１レセプターポリペプチドを、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製の標準的な技術を用いて、抗原、抗原の部分またはフラグメントとして使用し得、そして、さらに、その抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用し得る。免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントは、例えば、アミノ末端領域（例えば、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列）のアミノ酸配列の少なくとも７アミノ酸残基を含み、そして、そのエピトープを含み、その結果、そのペプチドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはエピトープを含む任意のフラグメントとの特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置するタンパク質の領域であり、一般に親水性の領域である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面に位置するＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドの領域（例えば、親水性領域）である。ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプターポリペプチドの疎水性分析は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１レセプタータンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って、抗体産生の標的として有用な表面残基をコードする可能性が高いことを示す。抗体産生を標的化する手段として、親水性および疎水性の領域を示すハイドロパシープロットが、当該分野で周知の任意の方法（例えば、フーリエ変換を用いるか、または用いない、Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法）によって作成され得る。例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−４２を参照のこと。抗原タンパク質内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体、あるいは、その誘導体、フラグメント、アナログ、またはホモログがまた、本明細書において提供される。
【００８９】
本発明のタンパク質、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログまたはオルソログを、これらタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成における免疫原として利用し得る。
【００９０】
当該分野で公知の種々の手順を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用し得る。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．を参照のこと。これらの抗体のいくつかが、以下に考察される。
【００９１】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）が、ネイティブタンパク質、その合成改変体、またはそれらの誘導体の１回以上の注射により免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を表す化学合成ポリペプチド、または組み換え発現された免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知の第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。免疫学的応答を増大させるのに使用される種々のアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて有用なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、または同様の免疫刺激因子が挙げられるがこれらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【００９３】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、周知技術（例えば、主に、免疫血清のＩｇＧフラクションを提供する、プロテインＡまたはプロテインＣを用いるアフィニティークロマトグラフィー）によりさらに精製され得る。その後、またはあるいは、探している免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープがカラムに固定され、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体が精製される。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（２０００）Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１４：２５−２８により議論されている。
【００９４】
（モノクローナル抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の軽鎖遺伝子産物および単一の重鎖遺伝子産物からなる１分子種のみの抗体を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定部位（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する固有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
【００９５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載される）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫因子で免疫され、その免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球が惹起される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【００９６】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメント、またはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望の場合、脾臓細胞または末梢血リンパ球が使用され、また、非ヒト哺乳動物起源が所望の場合、リンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される。Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）ｐｐ．５９−１０３。不死化細胞株は通常、形質転換哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００９７】
好ましい不死化細胞株は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、かつＨＡＴ培地のような培地に感受性である細胞株である。より好ましい不死化細胞は、マウス骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手可能）であり得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
【００９８】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は次いで、その抗原に対するモノクローナル抗体抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））により決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体が単離される。
【００９９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ得、標準的な方法により増殖される。この目的にとって適切な培養培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水として、インビボで増殖され得る。
【０１００】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）により培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【０１０１】
モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）により作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として使用できる。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに配置され得、次いで、宿主細胞（例えば、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ得、組み換え宿主細胞において、モノクローナル抗体が合成される。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部をコードする免疫グロブリンに共有結合することにより、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を作製するため、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得、または本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインで置換され得る。
【０１０２】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、ヒトへの投与に適しており、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こさない。抗体のヒト化形態は、主に、ヒト免疫グロブリンの配列で構成され、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）の方法に従い、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列とヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施され得る（米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても移植したＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである少なくとも１つ、および代表的には２つの改変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６）。
【０１０３】
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、軽鎖および重鎖の本質的に全体の配列（ＣＤＲを含む）が、ヒト遺伝子から生じた抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書中で「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）により調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において使用され得、ヒトハイブリドーマを用いることにより（Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）またはエプスタイン−バーウイルスでヒトＢ細胞をインビトロ形質転換することにより（Ｃｏｔｅら（１９８５），ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）生成され得る。
【０１０４】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を用いて生成され得る。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１を参照のこと。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にかまたは完全に不活性化されたマウス）に導入することにより、作製され得る。チャレンジによって、全ての局面（遺伝子配置、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）においてヒトに見られるものと緊密に類似するヒト抗体産物が生成される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６１１，０１６号；およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおｙびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５））に記載されている。
【０１０５】
ヒト抗体はさらに、抗原によるチャレンジに応答して、動物の内因的な抗体ではなく完全ヒト抗体を生成するよう改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて生成され得る。ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。非ヒト宿主において重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は不活性化され、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が、宿主ゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物は、この改変の全部より少数の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交差交配することにより子孫として得られる。このような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に記載されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生成する。この抗体は、目的の免疫原で免疫した後、この動物から、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として直接的に得られるか、あるいは、この動物由来の不死化Ｂ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞）から得られる。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接的に得るために回収および発現されるか、または抗体アナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るためにさらに改変され得る。
【０１０６】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスに代表される）を生成する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。これは、胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖からＪセグメント遺伝子を欠失させて、この遺伝子座の再配置を防止しかつ再配置した免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する工程（欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的化ベクターによりもたらされる）、およびその体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生成する工程、を包含する方法により入手され得る。
【０１０７】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を生成する方法は、米国特許第５，９６１，７７１号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、および２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成する工程を包含する。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１０８】
免疫原上の化学的に関連するエピトープを同定する方法、および高い親和性を有する関連エピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する相関関係のある方法は、ＰＣＴ公報９９／５３０４９に開示されている。
【０１０９】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明によれば、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術が適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築する方法が適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効率的な同定が可能となる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤による抗体分子の処理により生成されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない）は、当該分野で公知の技術により産生され得る。
【０１１０】
（二特異的抗体）
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。本発明においては、結合特異性のうちの１つは、本発明の抗原性タンパク質に対する特異性である。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットが有利である。
【０１１１】
二特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。従来法では、二特異的抗体の組み換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対（ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する）の同時発現に基づいている（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な仕分けが理由で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、これらのうちの１つのみが、二特異的構造を生成する。正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９に記載されている。
【０１１２】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。融合体は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。この融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合部位に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。二特異的抗体作製のさらなる詳細については、Ｓｕｒｅｓｈら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０を参照のこと。
【０１１３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするよう操作され得る。好ましい界面は、抗体定常領域のＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側さ（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。この大きな側さと同一または類似の大きさの補償的「空洞」（Ａｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ “ｃａｖｉｔｙ”）が、大きなアミノ酸側鎖とより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）を置換することによって、第２抗体分子の界面に作製される。これにより、望ましくない最終産物（例えば、ホモダイマー）よりもヘテロダイマーの収率を増大させる機構が提供される。
【０１１４】
二特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二特異的抗体を生成する技術は、文献に記載されている。例えば、二特異的抗体は、化学的連結を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１は、インタクトな抗体をタンパク質分解切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載している。これらのフラグメントは、ビシナルのジチオールを安定化させ、分子内ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、生成されるＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つは、メルカプトエチルアミンによる還元により、Ｆａｂ’−チオールに再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二特異的抗体が形成される。生成された二特異的抗体は、酵素の選択的免疫のための因子として使用され得る。
【０１１５】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収さ得、そして化学的にカップリングされて二特異的抗体が形成される。Ｓｈａｌａｂｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５は、完全ヒト化二特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、そしてインビトロで指向性化学カップリングに供して、二特異的抗体を形成した。このようにして形成された二特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および通常のヒトＴ細胞に結合し得、かつヒト乳癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘導し得る。
【０１１６】
組み換え細胞培養物から直接的に二特異的抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術もまた記載されている。例えば、二特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３．ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。この抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで、再酸化してヘテロダイマーを形成させた。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のためにも使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８によって記載される「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二特異的抗体フラグメントを作製する代替機構を提供する。このフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成され、それによって、２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二特異的抗体フラグメントを作製する別のストラテジーもまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８を参照のこと。
【０１１７】
２価以上を有する抗体が、考慮される。例えば、三価抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０。
【０１１８】
例示の二特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、そのうちの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に由来する。あるいは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に注目するため、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）））と組み合わされ得る。二特異的抗体はまた、細胞障害性因子を、特定の抗原を発現する細胞に向かわせるのに使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞障害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを有する。別の目的の二特異的抗体は、本明細書中に記載されるタンパク質抗原に結合し、かつ組織因子（ＴＦ）にさらに結合する。
【０１１９】
（薬学的組成物）
本明細書中に記載されるＩＬ−２１モジュレーターは、従来法により、薬学的組成物として提供され得る。この組成物は、好ましくは、内部使用に適しており、かつ有効量の薬理学的に活性な本発明の化合物を単独でかまたは１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この化合物は特に、毒性があるとしても非常に低い点で有用である。
【０１２０】
実施する際に、この化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩は、所望の変化（すなわち、ＩＬ−２１レベルの増加または減少）をもたらすのに十分な量で投与され、かつそのような目的に最も適した薬学的形態で使用される。
【０１２１】
例えば、錠剤またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与については、この活性薬物成分は、経口非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と組み合わされ得る。さらに、望ましいかまたは必要とされる場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤もまた、この混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース）、トウモロコシ甘味物質、天然ガムおよび合成ガム（例えば、アカシア、トラガント、またはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックス）などが挙げられる。これらの投薬形態において使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石粉、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または沸騰混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、セルロース、および／またはグリシンが挙げられる。
【０１２２】
注射可能な組成物は、好ましくは、水性の等張溶液または懸濁液であり、脂肪エマルジョンまたは懸濁物から坐薬が有利に調製される。この組成物は、滅菌され得、かつ／または、アジュバント（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節のための塩、および／または緩衝剤）を含む。さらに、これらはまた、他の治療上価値のある物質を含み得る。この組成物は、それぞれ、従来の混合、顆粒化、またはコーティング方法に従って調製され、かつ約０．１〜７５％、好ましくは、約１〜５０％の活性成分を含む。
【０１２３】
本発明の化合物はまた、指定時刻放出および持続放出性の錠剤またはカプセル剤、ピル剤、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁物、シロップ、およびエマルジョンとして、このような経口形態で投与され得る。
【０１２４】
液体、特に、注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散等による調製され得る。活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等）に溶解されるかまたはこれらと混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁液が形成される。さらに、注射前に液体に溶解するのに適した固体形態が処方され得る。注射可能な組成物は、好ましくは、水性等張溶液または懸濁液である。この組成物は、滅菌され得、かつ／またはアジュバント（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節のための塩、および／または緩衝剤）を含む。さらに、これらはまた、他の治療上価値のある物質を含み得る。
【０１２５】
本発明の組成物は、静脈内形態（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内形態、皮下形態、または筋内形態で投与され得る。これらは全て、薬学分野の当業者に周知の形態を用いる。注射可能物質は、液体溶液または懸濁物のいずれかの従来形態で調製され得る。
【０１２６】
非経口注射による投与は、一般的に、皮下、筋内、または静脈内注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）に従って、一定レベルの投薬を維持することを確実にする遅延放出系または持続放出系の移植を用いる。
【０１２７】
さらに、本発明にとって好ましい化合物は、適切な鼻内ビヒクルの使用を通じて、または当業者に周知の経皮用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路を通じて、鼻内形態で投与され得る。経皮送達系の形態で投与するために、用量投与は、当然、投薬レジメンを通じて連続的であり、間欠的ではない。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー、およびゲルが挙げられ、ここで、活性成分の濃度は、０．１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲である。
【０１２８】
固体組成物については、賦形剤として、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられ、使用され得る。上記の活性化合物はまた、例えば、キャリアとしてポリエチレングリコール、例えば、プロピレングリコールを用いて坐薬として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐薬は、脂肪エマルジョンまたは懸濁物から調製されるのが有利である。
【０１２９】
本発明の組成物はまた、リポソーム送達系の形態（例えば、小さな単層ビヒクル、大きな単層ビヒクル、および多層ヒビクル）で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含む、種々のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムは、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物の水性溶液と水和され、薬物を取り囲む脂質層が形成される。
【０１３０】
本発明の化合物はまた、化合物分子とカップリングされる個々のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用により送達され得る。本発明の化合物はまた、標的化薬物キャリアとして可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解ポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）と連結され得る。
【０１３１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、遺伝子療法ベクターとして使用され得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によるか（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射により（例えば、Ｃｈｅｎ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）被験体に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターは、組み換え細胞からインタクトに生成され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じる１つ以上の細胞を含み得る。
【０１３２】
所望の場合、投与される薬学的組成物はまた、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン等））を含み得る。
【０１３３】
この化合物を用いる投薬レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；処置される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに用いられる特定の化合物またはその塩を含む、種々の要因に従って選択される。通常の技術を有する医師または獣医は、その状態の進行を予防、抵抗、または休止させるのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、処方し得る。
【０１３４】
本発明の経口用量は、示される効果について使用される場合、約０．０５〜１０００ｍｇ／日の間の範囲（経口）である。この組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０、および１０００．０ｍｇの活性成分を含む等級付けされた錠剤の形態で提供される。本発明の化合物の有効血漿レベルは、０．００２ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【０１３５】
本発明の化合物は、単一の一日用量で投与され得るか、または総一日用量が、一日に２、３、または４回の分割された用量で投与され得る。
【０１３６】
上記薬学的組成物のいずれも、０．１〜９９％、好ましくは、１〜７０％のＩＬ−２１、ＩＬ−２１レセプター、ＩＬ−２１アゴニスト、またはＩＬ−２１アンタゴニストを含み得る。
【０１３７】
所望の場合、この薬学的組成物は、アジュバントと共に提供され得る。アジュバントは、上述されている。いくつかの実施形態において、アジュバントは、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加するために使用され得、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール）、およびヒトにおいて有用なアジュバント（例えば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。一般的には、動物は、連続するいくつかの注射可能物（好ましくは、少なくとも３つのブースター注射を含む）を用いて、抗原を注射される。
【０１３８】
本発明はさらに、以下の非限定的な例において例示される。実施例１〜８は、以下の物質および方法を用いて実施した。
【実施例】
【０１３９】
（マウス）
そうでないことが示されない限り、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを全ての実験に使用した。Ｃ５７ＢＬ／６欠損バックグラウンドのＳｔａｔ６欠損マウスを、Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３１３−９，１９９６に記載されるようにして作製した。
【０１４０】
（リンパ球の調製および培養）
リンパ球を、（Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３１３−９，１９９６）に記載されるように補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。抗ＣＤ４および抗ＣＤ２６Ｌを用いたセルソーティングにより、未処理のＴｈｐ細胞をリンパ節および脾臓から、９５〜９８％純度まで精製した。
【０１４１】
（抗体およびサイトカイン）
Ｔ−ｂｅｔ特異的抗血清を、（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ １００：６５５−６９，２０００）に記載されるようにして調製した。Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ１、およびアクチンに特異的な抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した。リン酸化Ｓｔａｔ４に特異的な抗体を、Ｚｙｍｅｄ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から得た。Ｔｈ分化培養物において使用した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＩＬ−４、およびＩＦＮγに対する抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した。組み換えＩＬ−４を、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈから入手した。組み換えＩＬ−２は、Ｃｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から提供された。組み換えＩＬ−１２は、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）から提供された。ＣＯＳ上清中において発現したマウスＩＬ−２１を調製および濃縮した。１ユニットの活性を、ＩＬ−２１でトランスフェクトしたＢＡＦ３細胞の５０％最大増殖を誘導するのに必要とされる上清濃度と定義した。ＩＬ−２１と平行して調製および濃縮したモックトランスフェクトＣＯＳ上清を、コントロールとして使用した。
【０１４２】
（インビトロＴヘルパー細胞分化）
未処理のＴ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）をコーティングしたプレート上に、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４、１０μｇ／ｍｌ抗ＩＦＮγ（Ｔｈ２条件）、または１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１２、１０μｇ／ｍｌ 抗ＩＬ−４（Ｔｈ１条件）の存在下、１〜２×１０６／ｍｌでプレーティングした。３日後に、細胞をＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）中で拡張した。培養１週間後、細胞を、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎで刺激し、サイトカイン産生を、（Ｂｒｉｄ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：２２９−３７，１９９８）に記載されるような細胞内サイトカイン染色により決定した。
【０１４３】
（ＲＮＡ分析）
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離した。ノザン分析のために、このＲＮＡを、１．５％アガロース／６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎメンブレン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）に移した。このメンブレンを、ＩＬ−２１、Ｉｌ−４、ＩＦＮγ、γ−アクチンに対する放射標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。リアルタイムＰＣＲのために、１μｇのＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）でプライムし、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｃＤＮＡに変換した。２５ｎｇのｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ２×またはＴａｑＭａｎ ２× ＰＣＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いるＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、以下のプライマーを用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。
【０１４４】
【化６】
【０１４５】
ＩＬ−４、ＩＦＮγ、およびＧＡＰＤＨに対するプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、以前から公開されている（Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈ，Ｌ．ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １１：３０５−１２ １９９９）。
【０１４６】
（イムノブロット分析）
細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５％ ＮＰ４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ中に溶解し、溶解物を遠心分離により洗浄することによって、全細胞抽出物を調製した。タンパク質抽出物を、８〜１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｏｐｔｉｔｒａｎメンブレン（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ；Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。イムノブロットを、室温にて１時間、５％ミルクを含有するＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｐｈ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中でブロックし、そして示される抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、抗ウサギＨＲＰ結合抗体（Ｚｙｍｅｄ）と共に室温にてインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄した後、強化化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、販売元の指示に従って検出を実施した。
【０１４７】
（実施例１．ＩＬ−２１は、インビトロでＴｈ２経路に沿って発達するよう誘導されたＴｈ細胞において優先的に発現される）
ＴｈサブセットにおけるＩＬ−２１の発現を決定した。ノザン分析を、１週間かけてＴｈ１またはＴｈ２細胞に分化させ、サイトカイン産生を誘導するため４時間再刺激した未処理のＴｈｐ（Ｔｈ前駆細胞）由来のｍＲＮＡを用いて実施した。その結果を図１Ａ〜１Ｄに示す。図１Ａに示される結果について、Ｔｈｐ細胞は、６日間、Ｔｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件（Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ｓｋｅｗｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で培養した。この細胞を、静止させる（−）か、またはＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｐ＋Ｉ）と共に４時間再刺激した。ＲＮＡを精製し、ノザンブロットによりサイトカイン発現について評価した。示される結果は、３回の独立した実験の代表例である。ＩＬ−２１をコードするメッセージを、刺激したＴｈ２細胞においてのみ検出した。対照的に、ＩＬ−２１メッセージは、Ｔｈ１培養物では検出されなかった。これらの結果は、ＩＬ−２１がＴｈ２特異的サイトカインであることを示している。
【０１４８】
ＩＬ−２１を発現する能力がＴｈ２経路に沿った細胞の発達と共に増加するか否かを決定するため、一次刺激Ｔｈｐ細胞におけるＩＬ−２１発現を、二次刺激Ｔｈ２細胞におけるＩＬ−２１メッセージ発現と比較した。その結果を図１Ｂに示す。示される結果について、Ｔｈｐ細胞は、中立のＴｈ１条件（ｎｅｕｔｒａｌ Ｔｈ１ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）およびＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。ＲＮＡを、一次および二次抗ＣＤ３刺激の２４時間後に精製した。サイトカイン発現を、リアルタイムＰＣＲにより評価し（二連）、ＧＡＰＤＨと比較して示した。ＩＬ−４と同様に、ＩＬ−２１メッセージは、一次刺激後にＴｈｐ細胞において比較的低度で観察された。対照的に、ＩＬ−２１の発現は、細胞がＴｈ２経路に沿って分化した後に顕著に増加した。これらの結果は、ＩＬ−２１遺伝子の発現が、他のＴｈ２特異的サイトカインと同様に調節されることを実証している。
【０１４９】
分化した細胞におけるＩＬ−２１発現に対するサイトカイン環境（ｍｉｌｉｅｕ）の効果を決定した。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を、それぞれ、二次刺激の前にＩＬ−４およびＩＦＮγの存在下で培養した。細胞は、ＩＬ−４およびＩＦＮγによるＳｔａｔ６およびＳｔａｔ１の活性化により証明される通り、これらのサイトカインに応答性であった。
【０１５０】
ＩＬ−２１の発現を回復させるＩＬ−４の能力を試験した。結果を図１Ｃに示す。Ｔｈｐ細胞を、５日間、Ｔｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。ＩＬ−４またはＩＦＮγを、抗ＣＤ３による二次刺激の２４時間前に、示された培養物に添加した。ＲＮＡを、二次刺激の２４時間後に精製し、リアルタイムＰＣＲによりＧＡＰＤＨと比較してＩＬ−２１の発現を評価した（二連）。Ｔｈ１へのＩＬ−４の添加によって、Ｔｈ２細胞に見られるレベルにまでＩＬ−２１発現を回復することはできなかった。さらに、Ｔｈ２培養物へのＩＦＮγの添加は、ＩＬ−２１の発現に対して阻害効果を有さなかった。これらの結果は、Ｔｈ２細胞におけるＩＬ−２１の発現が、Ｔｈ２分化の初期で固定されるようであり、ＩＬ−４またはＩＦＮγによって直接調節されないことを実証している。
【０１５１】
（実施例２．Ｔｈ２細胞は、インビボでのＴｈ２免疫応答の間にＩＬ−２１を発現する）
Ｔｈ２細胞におけるインビボ免疫応答の間のＩＬ−２１の発現を、病原性原生生物モデル系において決定した。原生生物Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒの感染は、Ｔｈ細胞のインビボ応答を研究するための十分に特徴付けられたモデルを提供する（Ｒｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：１５１−７７，１９９５）。Ｌ．ｍａｊｏｒを感染させてた、いつくかの同系交配マウス系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）は、病原体に対する保護的および効果的Ｔｈ１応答を惹起する。逆に、他の同系交配マウス系統（例えば、ＢＡＬＢマウス系統）は、主に、Ｔｈ２応答を生じ、感染を除去できない。
【０１５２】
Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスの両方に、Ｌ．ｍａｊｏｒを感染させた。８匹のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのコホートの後ろ足のフットパッドにＬ．ｍａｊｏｒを感染させた。６週間後、枯渇したリンパ節からのＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、抗ＣＤ３で刺激した。ＲＮＡを刺激６時間後に精製し、サイトカイン発現を、リアルタイムＰＣＲによりＧＡＰＤＨと比較して評価した。
【０１５３】
結果を図１Ｄに示す。予想された通り、Ｃ５７ＢＬ／６感染マウス由来のＣＤ４＋細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ感染マウス由来の細胞よりも多くのＩＦＮγを発現した。優勢Ｔｈ２応答と同じく、感染ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞よりも有意に多くのＩＬ−４を生成した。インビトロＴｈ２をゆがめる条件下で観察されたものと同様に、ＩＬ−２１もまた、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボＴｈ２応答の間に優先的に発現された。これらの結果は、インビトロでの発見（図１）と合わせて、ＩＬ−２１はＴｈ２サイトカインであることを実証している。
【０１５４】
（実施例３．ＩＬ−２１は、Ｔｈ細胞の発達の際にＩＦＮγの産生を特異的に阻害する）
ＩＬ−２１は、ＩＬ−４と、Ｔｈ細胞における類似の発現プロフィールおよび構造的類似性を共有しているので、ＩＬ−４と同様に、Ｔｈ分化に直接影響を及ぼすＩＬ−２１の能力を決定した。
【０１５５】
Ｔｈｐ分化に対するＩＬ−２１の影響を決定するために、Ｔｈｐ細胞を、中立のＴｈ１条件およびＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。
【０１５６】
精製した未処理のＴｈｐ細胞を、中立のＴｈ１条件およびＴｈ２をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下および非存在下でプライムした。これらの細胞のサイトカイン力を、培養１週間後の細胞内サイトカイン染色により評価した。
【０１５７】
結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａに示される結果について、細胞は、ＩＬ−２１の存在下またはモック上清中で１週間培養した。サイトカイン産生を、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎによる再刺激の４時間後の細胞内サイトカイン染色により評価した。結果は、少なくとも１０回の実験の代表例である。
【０１５８】
ＩＬ−４と同様、中性およびＴｈ１培養物へのＩＬ−２１の添加は、ＩＦＮγ産生細胞数を顕著に減少させた（図２Ａ、中性およびＴｈ１条件）。Ｔｈ１細胞における減少した数のＩＦＮγ産生細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析により確認された。しかし、ＩＬ−４を用いて観察されたものと異なり、ＩＬ−２１自体は、ＩＬ−４産生Ｔｈ２細胞の産生を強化できなかった（図２Ａ、中性条件）。ＩＬ−２１処理は、Ｔｈ２をゆがめる条件下でのＩＬ−４産生細胞の発生に対して刺激効果も阻害効果も有さなかった（図２Ａ、Ｔｈ２）。
【０１５９】
最近刺激したＴｈｐ細胞からのＩＦＮγ産生に影響を与えるＩＬ−２１の能力を決定した。精製した未処理のＴｈｐ細胞を、中性およびＴｈ１条件下、ＩＬ−２１の存在下または非存在下で、４８時間培養した。得られた培養上清を、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮγ産生について試験した。ＩＬ−２１は、分化している培養物中で早期に生じるＩＦＮγの量を減少させることが見出された（図２Ｂ）。従って、Ｔｈプライミングの間のＩＬ−２１の存在は、分化Ｔｈ１細胞およびエフェクター細胞の両方がＩＦＮγを産生する能力に影響を及ぼす。
【０１６０】
（実施例４．ＩＬ−２１は、Ｔｈ１エフェクター細胞からのＩＦＮγ産生を直接的に阻害しない）
ＩＬ−２１が、ＩＬ−２１産生を直接的に抑制するか、または代わりに、ＩＦＮγ細胞の分化に影響を与えるかを決定するため、精製した未処理のＴｈｐ細胞を、Ｔｈ１をゆがめる条件下で培養した。ＩＬ−２１またはモック上清を、培養開始時（第０日）または再刺激および分析の２４時間前（第５日）に添加した。サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色により評価した。結果を図３Ａに示す。
【０１６１】
ＩＬ−２１を第０日に添加した際に観察されたものと異なり、分化期間の最後におけるＴｈ１培養物へのＩＬ−２１の添加は、ＩＦＮγ産生に対する効果を有さなかった（Ｔｈ１細胞はＩＬ−２１Ｒを発現し、ＩＬ−２１に対して応答性であるけれども）。この発見は、ＩＬ−２１が、Ｔｈｐ細胞のＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞へと分化する能力に損傷を与えるが、Ｔｈ１エフェクター細胞からのＩＦＮγ産生を直接的に阻害しないことを実証している。
【０１６２】
（実施例５．ＩＦＮγのＩＬ−２１阻害は、Ｓｔａｔ６から独立している）
Ｔｈ１細胞の分化を阻害するＩＬ−４の能力は、Ｓｔａｔ６の発現に依存する（Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．，ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：３１３−９，１９９６，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６２７−３０ １９９６，およびＳｈｉｍｏｄａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６３０−３，１９９６）。
【０１６３】
ＩＦＮγのＩＬ−２１媒介阻害もまたＳｔａｔ６に依存するか否かを決定するため、Ｓｔａｔ６欠損細胞におけるＴｈ１分化に影響を与えるＩＬ−２１の能力を決定した。野生型マウスまたはＳｔａｔ６欠損マウスから精製したＴｈｐ細胞を、Ｔｈ１をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下またはモック上清中で１週間培養した。サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色により評価した。
【０１６４】
結果を図３Ｂに示す。Ｓｔａｔ６の非存在下では、Ｉｌ−２１は、Ｓｔａｔ６の存在下の場合とほぼ同じ程度、ＩＦＮγ産生細胞の発生を防止するのに有効であった。従って、ＩＬ−４と異なり、ＩＬ−２１は、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞の発生を防止するのに、Ｓｔａｔ６シグナル伝達に依存しない。さらに、これらの結果は、ＩＬ−２１により誘導されるＩＦＮγの抑制が、直接ＩＬ−４の作用を通じて媒介されないことを実証している。
【０１６５】
（実施例６．ＩＬ−２１は、他のＴｈ１サイトカインを阻害しない）
ＩＬ−２１が、ＩＦＮγ産生を阻害するのに加えて、Ｔｈ１の発達の局面に影響を及ぼすか否かを決定するため、ＩＬ−２１処理したＴｈ１細胞が、他のＴｈ１関連サイトカインを産生する能力を試験した。
【０１６６】
Ｔｈｐ細胞を、Ｔｈ１をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下またはモック上清中で培養し、その後、これらを、二次刺激後に、細胞内サイトカイン染色によりサイトカイン産生について評価した。
【０１６７】
結果を図３Ｃに示す。驚くべきことに、ＩＦＮγ産生細胞の数は、ＩＬ−２１がプライミング条件下で誘導された際に有意に減少したが、同じ細胞集団は、正常な数のＩＬ−２およびＴＮＦα産生細胞を有していた。これらの結果は、ＩＬ−２１が、Ｔｈ１細胞のＩＦＮγ産生能を効果的に抑制するが、同じ細胞は、Ｔｈ１細胞産生能を維持しており、Ｔｈ２サイトカインを産生するように戻らないことを実証している。
【０１６８】
（実施例７．Ｔ−ｂｅｔ発現は、ＩＬ−２１により影響を受けない）
Ｔ−ｂｅｔは、分化Ｔｈ１細胞において特異的に発現され、かつＩＦＮγを強力に誘導することもできる、最近同定された転写因子である。分化Ｔｈ１細胞のＩＬ−２１処理が、Ｔｈ細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現の誘導に影響を及ぼすか否かを決定するため、Ｔｈｐ細胞を、Ｔｈ１またはＴｈ２をゆがめる条件下で培養した。タンパク質抽出物を、開始時（未処理）および培養４８時間後（Ｔｈ１およびＴｈ２）に回収した。Ｔ−ｂｅｔおよびアクチンの発現を、ウェスタンブロットにより決定した。
【０１６９】
結果を図４Ａに示す。ＩＬ−２１またはモック上清が、示される培養物中に含まれていた。予想された通り、Ｔ−ｂｅｔの発現は、Ｔｈ１培養物において誘導され、Ｔｈ２条件下では低度に維持されていた。ＩＬ−２１の添加は、Ｔｈ１細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現に対して効果を有さなかった。この結果は、ＩＦＮγ発現のＩＬ−２１媒介発現が減少したＴ−ｂｅｔ発現の結果ではないことを示している。
【０１７０】
（実施例８．ＩＬ−２１は、ＩＬ−１２シグナル伝達を阻害する）
ＩＬ−１２シグナル伝達は、Ｔｈ１細胞の発達において重要な役割を果たすことが報告されている。ＩＬ−１２Ｒ欠損Ｔｈ細胞は、ＩＦＮγを生成する能力が大きく損なわれている（Ｗｕ，Ｃ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：１６５８−６５，１９９７）。さらに、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖は、Ｔｈ２細胞の発達において、ＩＬ−４により媒介される効果を特異的に失活させる（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８５：８１７−２４，１９９７）。ＩＬ−２１が、ＩＬ−４と同様に、Ｔｈ１細胞においてＩＬ−１２ｂ２鎖の発現に影響を及ぼすか否かを決定するために、Ｔｈ１およびＴｈ２をゆがめる条件下、ＩＬ−２１の存在下および非存在下で培養したナイーブＴｈｐ細胞由来のＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって、１２Ｒβ２発現について分析した。Ｔｈｐ細胞を、Ｔｈ１またはＴｈ２をゆがめる条件下で１週間培養した。ＩＬ−２１またはモック上清が、示される培養物中に含まれた。ＲＮＡを、抗ＣＤ３による二次刺激の２４時間後に回収し、リアルタイムＰＣＲによりＩＬ−１２Ｒβ２について評価した。
【０１７１】
結果を図４Ｂに示す。この結果は、３回の独立した実験の代表例である。予想された通り、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現は、Ｔｈ２細胞と比較した場合、Ｔｈ１細胞において高かった。しかし、Ｔｈ１培養物へのＩＬ−２１の添加は、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現に影響を及ぼさなかった。従って、ＩＬ−４について報告された結果と異なり、ＩＬ−２１は、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現の減少を引き起こさなかった。さらに、高いＴＮＦαおよびＩＬ−２レベルと結び付けると、ＩＬ−１２Ｒβ２の高発現は、ＩＬ−２１処理Ｔｈ１細胞が、多くのＴｈ１の特徴を維持している（減少したＩＦＮγ産生を除く）ことを示唆している。
【０１７２】
Ｓｔａｔ４は、ＩＬ−１２により特異的に活性化され、そしてＩＦＮγ産生Ｔｈ１細胞の発生にとって重要なメディエーターであることが報告されている（Ｗｕｒｓｔｅｒ，Ａ．Ｌ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：２５７７−８４，２０００）。ＩＬ−２１が、ＳＴＡＴ−４を活性化するＩＬ−１２の能力に影響を及ぼすか否かを決定するため、未処理のＴｈｐ細胞を、ＩＬ−２１の存在下または非存在下で４８時間活性化した。その後、この細胞をＩＬ−１２で刺激し、Ｓｔａｔ４のリン酸化の程度を、ウェスタンブロット分析によって決定した。Ｔｈｐ細胞を、Ｉｌ−２１の存在下またはモック上清中で、４８時間、抗ＣＤ３を用いて刺激した。タンパク質抽出物を、ウェスタンブロットにより、リン酸化Ｓｔａｔ４（ｐ−Ｓｔａｔ４）、Ｓｔａｔ４、およびＳｔａｔ１について評価した。結果は、４回の独立した実験の代表例である。
【０１７３】
結果を図４Ｃに示す。ＩＬ−２１処理細胞は、通常レベルのＩＬ−１２Ｒβ２を発現することが見出されたが、ＩＬ−１２刺激に応答したＳｔａｔ４のリン酸化は、ＩＬ−１２処理細胞において減少していた。この減少したレベルのリン酸化Ｓｔａｔ４はまた、総Ｓｔａｔ４タンパク質レベルにおける減少により反映された。比較として、Ｓｔａｔ１タンパク質は、ＩＬ−２１処理による影響を受けなかった。
【０１７４】
Ｓｔａｔ４ ＲＮＡレベルもまた試験した。Ｔｈｐ細胞を、図４Ｃに記載されるようにして培養し、その後、ＲＮＡを回収して、リアルタイムＰＣＲによりＳｔａｔ４発現について評価した（二連）。
【０１７５】
結果を図４Ｄに示す。結果は、３回の独立した実験の代表例である。より低レベルのＳｔａｔ４ ＲＮＡレベルを検出した。Ｓｔａｔ４タンパク質レベルにおけるＩＬ−２１により誘導された減少は、Ｓｔａｔ４ ｍＲＮＡの減少に起因する可能性がある。これらの発見は、ＩＬ−２１が、Ｓｔａｔ４遺伝子発現の減少を通じて、ＩＬ−１２に対する発達中のＴｈ１細胞の応答を妨害することを示唆している。
【０１７６】
（実施例９．ＩＬ−２１シグナル伝達は、インビボでのＴｈ１応答を制限するために必要とされる）
内部産生したＩＬ−２１は、インビボでのＴｈ１細胞の機能を制限する上で役割を果たすか否かを決定するため、遅延型過敏応答（ＤＴＨ）の程度を、ＩＬ−２１Ｒ欠損マウスにおいて試験した。ＤＴＨは、古典的なＴｈ１細胞媒介炎症応答である。Ｃ５７ＢＬ／６系に戻し交配したＩＬ−２１Ｒ欠損マウスを、Ｋａｓｉａｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：５５９−６０，２００２に記載されるようにして作製した。１００ｍｇ ＴＮＰ−ＫＬＨ（２，４，６−トリニトロフェニル−キーホールリンペットヘモシアン；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を乳化させたＤＦＡを用いて、８週齢の雌マウスの尻尾の基部を皮下免疫した。６日後に、マウスの一方の後ろ足のフットパッドに５０μｇのＴＮＰ−ＫＬＨを、反対側の後ろ足のフットパッドにＰＢＳをチャレンジした。フットパッドの厚さを、チャレンジの２４時間後に測定した。
【０１７７】
結果を図５Ａに示す。野生型マウスおよびＩＬ−２１Ｒ欠損（ＩＬ−２１Ｒ−／−）マウスの特異的なフットパッドの肥大を、ＴＮＰ−ＫＬＨにより誘導された肥大からＰＢＳを注射したフットパッドの非特異的肥大を差し引くことにより決定した。各々のデータポイントは、１匹のマウスを表している。水平線は、平均を示す。結果は、２回の独立した実験からのデータの蓄積を反映している。この結果は、野生型動物が、抗原チャレンジに応答し、フットバッドが大きく肥大したことを実証している。驚くべきことに、ＩＬ−２１Ｒ欠損マウスは、ずっと強力なＤＴＨ応答（平均２倍の肥大）を惹起した。
【０１７８】
ＩＦＮγ産生をまた、免疫したマウスにおいても試験した。結果を図５Ｂに示す。免疫マウスの枯渇リンパ節から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、２５０ｍｇ／ｍｌ ＴＮＰ−ＫＬＨを用いてインビボで刺激した。上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγレベルについて分析した。示される結果は、二連で実施した各遺伝子型からの２匹のマウスのデータの平均である。ＩＬ−２１Ｒ欠損動物における増加したＤＴＨ応答は、枯渇リンパ節から精製されインビトロで抗原によって再刺激したＣＤ４＋細胞からのＩＦＮγ産生における顕著な増加と相関した。
【０１７９】
これらの結果は、ＩＬ−２１が、ＩＦＮγの産生を抑制することにより、ＴＨ１細胞応答の制限に関与することを実証している。
【０１８０】
さらなる実施形態は、各請求項に示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公開番号】特開２０１０−９０１３３（Ｐ２０１０−９０１３３Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７０８５１（Ｐ２００９−２７０８５１）
【出願日】平成２１年１１月２７日（２００９．１１．２７）
【分割の表示】特願２００４−５２１７９３（Ｐ２００４−５２１７９３）の分割
【原出願日】平成１５年７月１５日（２００３．７．１５）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２７日（２００９．１１．２７）
【分割の表示】特願２００４−５２１７９３（Ｐ２００４−５２１７９３）の分割
【原出願日】平成１５年７月１５日（２００３．７．１５）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
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