ＴＡＦ４ｂプロモーターおよびその利用
【課題】細胞増殖因子かつ転写因子であるＭｙｃの直接の標的およびそれを用いた真核生物の組織特異的事象の調節手段の提供。
【解決手段】Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含有してなるベクター、前記ヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有してなるレポータープラスミド、前記ベクターもしくはレポータープラスミドを導入してなる形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物、ならびに前記レポータープラスミドまたは形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤または妊娠調節剤をスクリーニングする方法。
【解決手段】Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含有してなるベクター、前記ヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有してなるレポータープラスミド、前記ベクターもしくはレポータープラスミドを導入してなる形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物、ならびに前記レポータープラスミドまたは形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤または妊娠調節剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＡＦ４ｂプロモーターおよびその利用に関する。詳しくは、組織特異的な転写調節または転写増強が可能なヌクレオチドおよび真核生物の様々な事象の解明に寄与する当該ヌクレオチドの利用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞（真核生物）において、タンパク質をコードする遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ）によって転写される。特定の遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩを導く分子機構は、調節タンパク質の複数のクラスから構成される（非特許文献１）。ＴＦＩＩＤは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ制御機構の中核となる要素であり、酵母（Saccharomyces cerevisiae）からヒトに至るまで保存されており、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）と複数のＴＢＰ関連因子（ＴＡＦｓ）からなる大きな多量体タンパク質複合体である。ＴＦＩＩＤは、初期の頃には発現および機能において遍在性(ユビキタス)であると考えられていたが、組織特異的ＴＡＦｓの同定は、特殊化したＴＦＩＩＤ複合体が遺伝子発現の組織特異的プログラムの調節において直接的な役割を果たしうるということを示唆した。同定された最初の細胞型特異的ＴＦＩＩＤサブユニットは、ＴＡＦ４ｂ（以前はＴＡＦＩＩ１０５と呼ばれていた）であった（非特許文献２）。ＴＡＦ４ｂは、広範囲に発現される因子であるＴＡＦ４（以前はＴＡＦＩＩ１３０と呼ばれていた）のホモロガスタンパク質である。ＴＡＦ４ｂの細胞型特異的機能は、ＴＡＦ４ｂがマウスの精巣および卵巣で高度に発現しており、ＴＡＦ４ｂを欠損したマウスは、生存可能であるがオス・メスともに不妊である（非特許文献３、４）という発見によって支持された。
【０００３】
一次Ｂリンパ球が細菌のリポ多糖によって活性化された場合、ＴＡＦ４ではなくＴＡＦ４ｂの発現が増加した（非特許文献５）。最近では、ＴＡＦ４およびＴＡＦ４ｂを含むＴＦＩＩＤ複合体が別個の標的遺伝子特異性を有しているということが報告されている。ＴＡＦ４を不活性化すると、多くの一連の遺伝子の発現に影響を及ぼした。これらの中で、ＴＡＦ４ｂの不活性化は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、ＣＴＧＦ、ＩＴＧα６およびＨＢ−ＥＧＦを含む多くの成長因子を誘導した。これらの成長因子は、ＴＡＦ４ｂの過剰発現によっても誘導された。これらの結果は、ＴＡＦ４とＴＡＦ４ｂとの平衡が細胞増殖の制御に関連する遺伝子の調節に作用しているということ（非特許文献６）を示唆しているとともに、ＴＡＦ４ｂの発現は厳密に制御されるべきであることを示している。しかしながら、ＴＡＦ４ｂ発現の制御メカニズムは、未だ解明されていない。
【０００４】
プロトオンコジーンのｍｙｃファミリーは、３つの主要な遺伝子：ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃから構成されている（非特許文献７、８、９）。この３つの遺伝子は、異なる発現パターンを示すが、基本的には同じ生物学的活性を有しているように見える。ｃ−ｍｙｃまたはＮ−ｍｙｃを欠損したマウスの胎児は、多臓器発育不全になり、胚形成の中間の段階で死ぬ（非特許文献１０、１１）。ｃ−ｍｙｃの発現が一定量減少する対立形質を有する一連のマウスを作製した場合、in vivoでのｃ−ｍｙｃレベルの減少は、多臓器発育不全が原因となって、ｃ−ｍｙｃのレベルに依存してマウスの体重を減少させる（非特許文献１２）。これらの結果は、Ｍｙｃの量が細胞増殖に直接的に関与していることを示すものである。これらの蓄積されたデータは、ｍｙｃファミリー遺伝子が細胞増殖の調節因子の中心となっていることを示している。
【０００５】
ｍｙｃがコードするタンパク質は、塩基性へリックス・ループ・へリックス−ロイシンジッパー転写因子のメンバーである（非特許文献８、１３）。Ｍｙｃタンパク質とその必須パートナーＭａｘタンパク質との二量体化が起こると、Ｅ−ボックス部位に結合するヘテロ二量体が形成される。このＥ−ボックス部位は、通常は基準的なもの（ＣＡＣＧＴＧ）であるが、まれにはＣＧＣＧＴＧを含む非基準的なものである。Ｍｙｃ−Ｍａｘヘテロ二量体は、オルニチンデカルボキシラーゼ（非特許文献１４）、ＲＣＣ１（非特許文献１５）、ヌクレオリン（非特許文献１６）、サイクリンD2（非特許文献１７）、mina53（非特許文献１８）、およびmimitin（非特許文献１９）を含む、種々の遺伝子の転写を活性化する。ｍｙｃに関しては、その研究に多大な努力がなされているが、いまだなぞのままであり、Ｍｙｃによって制御されるさらなる遺伝子に関する情報は、ｍｙｃの機能の解明に役立てることができる。
【０００６】
ｍｙｃプロトオンコジーンファミリーのタンパク質以外にも、ＵＳＦ（非特許文献２０）およびＴＦＥ３（非特許文献２１）を含むＥ−ボックス結合転写因子の他のクラスが存在する。これらの因子も、Ｅ−ボックスを介して遺伝子発現をトランスに活性化するが、これらの生物学的な機能およびこれらに対応する遺伝子は、Ｍｙｃとは異なっている。しかしながら、それぞれのＥ−ボックス結合転写因子におけるこれらの相違を創り出すメカニズムは、未だ明らかになっていない。
【非特許文献１】Lemon, B. et al., Genes Dev. 14:2551-2569, 2000
【非特許文献２】Dikstein, R. et al., Cell 87:137-146, 1996
【非特許文献３】Falender, A. E. et al., Genes Dev. 19:794-803, 2005
【非特許文献４】Freiman, R. N. et al., Science 293:2084-2087, 2001
【非特許文献５】Freiman, R. N.et al., Mol. Cell. Biol. 22:6564-6572, 2002
【非特許文献６】Mengus, G. et al., EMBO J. 24:2753-2767, 2005
【非特許文献７】DePinho, R. A. et al., Adv. Cancer Res. 57:1-46, 1991
【非特許文献８】Grandori, C. et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:653-699, 2000
【非特許文献９】Henriksson, M. et al., Adv. Cancer Res. 68:109-182, 1996
【非特許文献１０】Davis, A. C. et al., Genes Dev. 7:671-682, 1993
【非特許文献１１】Stanton, B. R. et al., Genes Dev. 6:2235-2247, 1992
【非特許文献１２】Trumpp, A. et al., Nature 414:768-773, 2001
【非特許文献１３】Luscher, B. et al., Gene 277:1-14, 2001
【非特許文献１４】Bello-Fernandez, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:7804-7808, 1993
【非特許文献１５】Tsuneoka, M. et al., Oncogene 14:2301-2311, 1997
【非特許文献１６】Greasley, P. J. et al., Nucleic Acids Res. 28:446-453, 2000
【非特許文献１７】Bouchard, C. et al., Genes Dev. 15:2042-2047, 2001
【非特許文献１８】Tsuneoka, M. et al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459, 2002
【非特許文献１９】Tsuneoka, M. et al., J. Biol. Chem. 280:19977-19985, 2005
【非特許文献２０】Gregor, P. D. et al., Genes Dev. 4:1730-1740, 1990
【非特許文献２１】Beckmann, H. et al., Genes Dev. 4:167-179, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、細胞増殖因子かつ転写因子であるＭｙｃの直接の標的およびそれを用いた真核生物の組織特異的事象の調節手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記観点から鋭意検討した結果、Ｍｙｃの直接の標的となる核酸配列および当該配列中の必須配列を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕 Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチド。
〔２〕 前記ヌクレオチドが
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列、
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列、
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列および／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列が配置されてなる塩基配列を含む塩基配列、または
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列、
からなるものである、前記〔１〕記載のヌクレオチド。
〔３〕 （ａ）配列番号４に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、５１位〜５７位のＴＡＴＡボックスおよび４３〜４８位のＣＡＣＧＴＧモチーフ以外の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
を含有するものである、前記〔１〕に記載のヌクレオチド。
〔４〕 前記ＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフが、下記：
（ｉ）塩基配列ＧＴＧにおける少なくとも１塩基の置換、
（ii）塩基配列ＣＡＣにおける少なくとも１塩基の置換もしくは挿入
のいずれかまたは両方の変異を有するものである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のヌクレオチド。
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のヌクレオチドを含有してなるベクター。
〔６〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有してなる、レポータープラスミド。
〔７〕 前記〔５〕に記載のベクターまたは前記〔６〕に記載のレポータープラスミドを導入してなる形質転換体。
〔８〕 前記〔５〕に記載のベクターまたは前記〔６〕に記載のレポータープラスミドを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
〔９〕 前記〔６〕に記載のレポータープラスミドまたは前記〔７〕に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤をスクリーニングする方法。
〔１０〕 前記〔６〕に記載のレポータープラスミド、前記〔７〕に記載の形質転換体または前記〔８〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、妊娠調節剤をスクリーニングする方法。
〔１１〕 Ｍｙｃによる組織特異的発現の調節剤であって、下記いずれかのペプチドを有効成分として含有する調節剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からコードされるペプチド、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）前記（１）または（２）に記載のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
〔１２〕 妊娠の調節に用いられる前記〔１１〕に記載の調節剤。
〔１３〕 （ａ）配列番号５に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において２１０位〜２１６位のＴＡＴＡボックスおよび２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号５に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するサルＴＡＦ４ｂプロモーター。
〔１４〕 （ａ）配列番号６に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において７７８位〜７８４位のＴＡＴＡボックスおよび７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号６に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するラットＴＡＦ４ｂプロモーター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のヌクレオチドによると、Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するために必要十分な塩基配列を提供することが可能となり、真核生物におけるＭｙｃを介した転写のさらなる解明のみならず、細胞増殖や組織特異的な転写制御の調節に寄与することができる。本発明のベクターによると、本発明のヌクレオチドを様々な用途に供する際に便利なツールを提供することができる。本発明のレポータープラスミドによると、Ｍｙｃの活性を測るための新しいツールとして利用することができる。
【００１０】
本発明のベクター、レポータープラスミド、形質転換体およびトランスジェニック非ヒト動物によると、真核生物におけるＭｙｃを介した転写のさらなる解明ならびに細胞増殖や組織特異的な転写制御の調節をインビトロまたはインビボで調べるためのツールを提供することができる。本発明のスクリーニング方法によると、細胞増殖のシグナル伝達の中核に位置するＭｙｃの活性を調節可能な細胞増殖調節剤を簡便および高感度に選別することができる。また、本発明のスクリーニング方法によると、今までに知られていない作用機序を有する妊娠調節剤を選別することができる。
【００１１】
本発明のＭｙｃによる組織特異的発現の調節剤によると、Ｍｙｃが介在する真核生物の発生および維持に関する様々な事象の調節に用いることができ、好ましくは妊娠の調節に用いられうる。本発明のサルまたはラットＴＡＦ４ｂプロモーターによると、サルまたはラット等の実験動物を用いた転写調節の研究のみならず、哺乳動物を始めとする多細胞生物全体の転写調節の解明にも寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドを提供する。前記ヌクレオチドは、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＧＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチドである。
【００１３】
本発明において「Ｍｙｃによる組織特異的発現」とは、転写因子であるＭｙｃが特定の塩基配列を標的とすることにより、真核生物の特定の組織で当該特定の塩基配列の下流に位置する遺伝子が転写されることをいう。
【００１４】
本発明におけるＭｙｃとは、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃを包含するものであり、特に限定されるものではないが、種々の癌において遺伝子増幅、過剰発現や転座が報告されているｃ−Ｍｙｃを中心に説明する。
【００１５】
本発明における組織とは、真核生物を構成するものである限り特に限定されるものではないが、例えば、脳、神経、骨髄、骨、筋肉、脂肪、心臓、肺、食道、胃、腸、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、血管、血球、臍帯、皮膚、感覚器官、およびその前駆体、生殖組織、幹細胞などが好ましい。また、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株も組織に含まれる。
【００１６】
本発明において「調節」とは、本発明のヌクレオチドの下流に位置する遺伝子の転写の開始、転写増強、転写抑制などをいう。
【００１７】
本発明のヌクレオチドとは、その下流に位置する遺伝子の転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する核酸をいい、通常プロモーターと称される用語と同義である。
【００１８】
本発明のヌクレオチドは、具体的には、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＧＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するものであり、本発明によって初めて解明された、Ｍｙｃの直接の標的である。
【００１９】
「ＴＡＦ４ｂプロモーターに由来する」とは、ＴＡＦ４ｂとして公知の、例えばGenBank Accession No.XM_290809.4のヒトＴＡＦ４ｂ中のプロモーター領域の塩基配列そのものであってもよく、本発明の目的を達成しうるプロモーター活性を有する限りＴＡＦ４ｂプロモーター領域内の塩基配列が改変されていてもよい。プロモーター活性は、後述するレポーターアッセイによりレポーターの発現強度を指標にして調べることができる。
【００２０】
本発明のヌクレオチドの必須配列である「ＴＡＴＡボックス」とは、真核細胞のｍＲＮＡをコードする遺伝子の転写開始位置より約２０〜８０塩基上流にあって、通常「ＴＡＴＡＴ（Ａ）ＡＡ（Ｔ）」と一般化されているＤＮＡ配列をいう。
【００２１】
本発明のヌクレオチドの必須配列である「ＣＡＣＧＴＧ」モチーフまたは「ＣＧＣＧＴＧ」モチーフとは、Ｍｙｃが直接結合する部位のコンセンサス配列であり、本発明によりＭｙｃによる組織特異的発現がこれらのモチーフの使い分けにより調節されていることを初めて解明したものである。
【００２２】
本発明のヌクレオチド中に含まれる前記ＣＡＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＧＣＧＴＧモチーフは、いずれかのモチーフ１つのみでもよく、同じ配列のモチーフが２つでもよく、異なる配列のモチーフが１つずつでもよい。異なる配列のモチーフを含む場合、モチーフ間の上流、下流の関係は特に限定されるものではない。これらのモチーフの位置関係は、前記ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではない。
【００２３】
別の側面によると、本発明のヌクレオチドは、
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列、
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列、
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列および／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列が配置されてなる塩基配列を含む塩基配列、または
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列、
からなるものであることが好ましい。
【００２４】
同一性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。本発明において、塩基配列の「同一性」とは、比較する２種の塩基配列を整列（アラインメント）させ、整列により一致した塩基配列の数を基準となる塩基配列の総数で除して算出した割合を％で示した数字である。なお、整列により生じたギャップは、不一致と見なして算出する。
【００２５】
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列
本発明によりＭｙｃの直接の標的となる配列としてクローニングされた塩基配列である。
【００２６】
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
ここで「実質的に同一」とは、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスと１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフとがプロモーターの構成要素として機能する限り、それ以外の塩基配列は特に限定されないことを意味する。「実質的に同一」か否かの判断は、後述するレポーターアッセイによる前記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列との間のレポーターの発現量を比較し、同程度の発現量であることを指標にすればよい。
【００２７】
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
前記ＴＡＴＡボックスおよびＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。前記必須配列は、配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域と対応する塩基配列中に含まれていることが好ましく、対応する塩基配列中に含まれていない場合は、対応配列外に機能可能に連結される。ＣＧＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００２８】
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
前記ＴＡＴＡボックスおよびＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。前記必須配列は、配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域と対応する塩基配列中に含まれていることが好ましく、対応する塩基配列中に含まれていない場合は、対応配列外に機能可能に連結される。ＣＧＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００２９】
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
前記ＴＡＴＡボックスおよびＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。前記必須配列は、配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域と対応する塩基配列中に含まれていることが好ましく、対応する塩基配列中に含まれていない場合は、対応配列外に機能可能に連結される。ＣＧＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００３０】
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列
配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置した塩基配列である。
【００３１】
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列Ｂを必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列Ａおよび／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列Ｃが配置されてなる塩基配列を含む塩基配列
ここでは、前記塩基配列Ｂを必須とするものであり、塩基配列ＡＢ（左から右に５’→３’と連結される、以下同様）、塩基配列ＢＣ、塩基配列ＡＢＣの３通りの組合せがあげられる。すなわち、塩基配列Ｂは必須であるがこの塩基配列のみではＭｙｃによる組織特異的発現が十分ではなく、発現を上昇させる目的には、塩基配列ＡＢまたはＢＣが好ましく、塩基配列ＡＢＣがより好ましい。
【００３２】
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列
当該断片は、前記（ｇ）の項の塩基配列ＡＢ、塩基配列ＢＣ、塩基配列ＡＢＣに対応するものであり、これらの塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列である。
【００３３】
Ｍｙｃによる組織特異的発現を増強する目的に使用する場合、本発明のヌクレオチドは、
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、５１位〜５７位のＴＡＴＡボックスおよび４３〜４８位のＣＡＣＧＴＧモチーフ以外の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
を含有することが好ましい。
【００３４】
前記（ａ）は、本発明により、Ｍｙｃの直接の標的となる配列の中でもＭｙｃによって発現がさらに増強されうる配列として見出された塩基配列である。したがって、当該配列は、Ｍｙｃの存在量を高感度に検出するプロモーターとなりうる。
【００３５】
前記（ｂ）は、ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、必須配列以外の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。ＣＡＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００３６】
本発明のヌクレオチド中に含まれる前記ＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフは、本発明のヌクレオチドをプロモーターとして用いた場合に、当該モチーフ内の塩基を変異させることによりＭｙｃによる発現の程度を維持または抑制することができる。具体的には前記モチーフは、下記：
（ｉ）塩基配列ＧＴＧにおける少なくとも１塩基の置換、
（ii）塩基配列ＣＡＣにおける少なくとも１塩基の置換もしくは挿入
のいずれかまたは両方の変異を有するものである場合、変異前のＭｙｃによる発現を同等またはそれ以下に調節することができる。変異モチーフの具体例としては、ＣＡＣＣＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＡＡＣＧＴＧ、ＣＡＣＧＡＧモチーフなどがあげられる。
【００３７】
本発明のヌクレオチドを細胞に導入する場合、ベクターの形で導入されることが好ましい。本発明は、前記ヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
【００３８】
基本骨格となるベクターは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＬ２、ｐＧＬ３、ｐＧＬ４ (プロメガ社)等が使用可能である。
【００３９】
本発明のベクターは、本発明のヌクレオチドを自体公知の方法により前記基本骨格となるベクターにクローニングすることにより得られる。このようにして得られたベクターは、シークエンス等により所望の位置に所望の方向で本発明のヌクレオチドがクローニングされていることを確認することができる。
【００４０】
本発明のヌクレオチドのプロモーター活性を調べるためには、レポーター遺伝子を用いることが好ましい。本発明は、本発明のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有するレポータープラスミドを提供する。
【００４１】
ここで、レポーター遺伝子とは、本発明のヌクレオチドのプロモーター活性を調べるために組み込まれる目印用の遺伝子をいい、公知のあらゆるレポーター遺伝子を制限なく用いることができる。検出が簡単で定量化も可能であるという観点から、レポーター遺伝子は発光タンパク質遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子が好ましい。
【００４２】
前記発光タンパク質としては、ホタル由来のルシフェラーゼ、Renilla（ウミシイタケ）由来のルシフェラーゼなどがあげられる。これら発光タンパク質および当該タンパク質をコードする核酸は、公知である。
【００４３】
前記蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体などがあげられる。これら蛍光タンパク質およびそれらの類似体ならびに当該タンパク質をコードする核酸は、公知である。
【００４４】
前記レポーター遺伝子は、公知の塩基配列に基づいて、常法により調製することができる。
【００４５】
本発明のレポータープラスミドにおいて、構成要素である本発明のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子は、直接結合していてもよく、本発明の目的を達成しうる限りにおいて、任意の塩基配列が挿入されていてもよい。かかる挿入配列としては、例えば、クローニングの過程で付加される制限酵素切断部位から生じる塩基配列などがあげられ、通常、１〜１０００塩基程度の長さを有するものである。
【００４６】
本発明のレポータープラスミドの基本骨格となるプラスミドは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＬ２、ｐＧＬ３、ｐＧＬ４(プロメガ社)等が使用可能である。
【００４７】
本発明のレポータープラスミドは、前記ヌクレオチドおよび前記レポーター遺伝子を自体公知の方法により前記基本骨格となるプラスミドにクローニングすることにより得られる。このようにして得られたレポータープラスミドは、シークエンス等によりヌクレオチドおよびレポーター遺伝子が所望の位置に所望の方向でクローニングされていることを確認することができる。
【００４８】
このようにして構築された本発明のベクターまたはレポータープラスミドを用いて、形質転換体を製造することができる。本発明は、かかる形質転換体を提供する。
【００４９】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌は、本発明のヌクレオチド、ベクターまたはレポータープラスミドを調製するためにもっぱら用いられ、その他の宿主は本発明のヌクレオチドの活性等を調べるために用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１、ＪＭ１０３、ＪＡ２２１、ＨＢ１０１、Ｃ６００などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−））、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００５０】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やGene，１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular ＆ General Genetics，１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Virology，５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
【００５１】
前記ベクターまたはレポータープラスミド（以下、「ベクター等」と略す場合がある）を導入することにより、トランスジェニック非ヒト動物を作出することができる。本発明は、かかるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００５２】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物には、前記ヌクレオチドおよび場合によってはレポーター遺伝子が対立遺伝子の両方に導入されたホモ接合動物、対立遺伝子の片方に導入されたヘテロ接合動物およびそれらの出生前の胎仔も含まれる。前記ホモ接合動物は、前記ヘテロ接合動物を交配することにより得られるものである。
【００５３】
用いられる非ヒト動物（本発明においては、単に動物と略す場合がある。）としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではない。好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜があげられるが、遺伝子工学的に利用が容易であるところから、マウスがより好ましい。
【００５４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、自体公知の方法により製造することができる。次に、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法について説明する。
【００５５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法により製造することができる。
（ａ）前記ベクター等を調製する工程；
（ｂ）前記ベクター等を受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；
（ｃ）前記動物から出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する工程；および
（ｄ）前記選別した動物（ファウンダー）から系統を樹立する工程。
【００５６】
前記工程（ａ）は、本発明のベクターまたはレポータープラスミドにおいて記載した通りである。得られたベクター等は、制限酵素等により線状化して工程（ｂ）に供することが好ましい。
【００５７】
前記工程（ｂ）において、前記ベクター等を受精卵に導入する方法は、例えば、交配後の雌の卵管を洗浄して受精卵を採取し、精子または卵子由来の前核にマイクロインジェクション法により前記ベクター等を直接注入する方法があげられる。この受精卵を偽妊娠させた仮親の輸卵管に移植し、子宮内で発生を続けさせる。
【００５８】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で移植した動物が出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する方法としては、例えば、注入したベクター等が染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かについて、産仔の尾部等より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンブロット法またはＰＣＲ法によりレポーター遺伝子の組み込みを確認する方法があげられる。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合、レポーター遺伝子が発現している生体の部位に紫外線等を照射して蛍光を調べることにより確認することができる。
【００５９】
前記工程（ｄ）において、工程（ｃ）で選別した動物（ファウンダー）から遺伝的背景の均一な系統を樹立する方法としては、ベクター等が組み込まれた動物とＣ５７ＢＬ／６、ＦＶＢ、ＢＡＬＢ／ｃなどの近交系の野生型動物とを戻し交配をする方法があげられる。
【００６０】
このようにして得られた本発明のトランスジェニック非ヒト動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞も本発明に含まれる。前記組織としては、すべての組織があげられ、例えば、脳、神経、骨髄、骨、筋肉、脂肪、心臓、肺、食道、胃、腸、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、血管、血球、臍帯、皮膚、感覚器官およびその前駆体、生殖組織、幹細胞などが好ましい。また、前記細胞としては、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株があげられる。
【００６１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のヌクレオチド（ＴＡＦ４ｂプロモーターに由来する塩基配列）によってレポータータンパク質の発現が調節されているものが好ましい。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、Ｍｙｃに感受性が高い状態で、様々な用途に利用することができる。好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、生体内で代謝された後の物質の生体中の各組織への影響を調べるものとして使用される。
【００６２】
本発明は、前記レポータープラスミドまたは前記形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤をスクリーニングする方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供する。
【００６３】
[スクリーニング方法Ｉ]
本発明のスクリーニング方法Ｉは、具体的には、下記工程を含む：
（ａ）レポータープラスミド導入細胞または形質転換体と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた細胞または形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量を調べ、被験物質を接触させない細胞または形質転換体における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、細胞増殖を調節しうる被験物質を選択する工程。
【００６４】
前記（ａ）において、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
【００６５】
被験物質と接触させる前に、レポータープラスミドの場合はレポーター遺伝子が発現できるように所望の細胞に一過性に導入し、形質転換体の場合は宿主に適した培地および培養条件で培養しておく。用いる細胞または宿主の種類は、好ましくは、ヒト子宮頚部癌細胞HeLa、ヒトクリオブラストーマ細胞T98G、大腸癌細胞SW620、HCT116などである。被験物質との接触方法としては、例えば、前記細胞または形質転換体を適当な培地中に入れ、約２５〜４０℃のインキュベーター中で生存または培養させ、次に、前記培地中に被験物質を添加し、インキュベートを続けることで接触がなされうる。
【００６６】
前記被験物質の添加量は、有効成分の種類、培地に対する溶解性、細胞または形質転換体の感受性等によって適宜設定することができる。
【００６７】
工程（ｂ）において、前記被験物質を接触させた細胞または形質転換体におけるレポーターの発現量は、各レポーター遺伝子に応じて自体公知の方法により調べることができる。例えば、蛍光タンパク質の場合、各蛍光タンパク質に応じた励起波長を照射して検出される蛍光を測定することにより行う方法などがあげられる。
【００６８】
前記工程（ｂ）において、被験物質を接触させない細胞または形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量も同時にまたは別途調べ、接触した場合の結果と接触しない場合の結果とを比較する。
【００６９】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、細胞増殖を調節しうる被験物質を選択する。選択する基準は、レポーターの発現が上昇または低下していることを指標にすればよい。レポーターの発現が上昇している場合、被験物質は、細胞増殖を促進させる作用を有する。レポーターの発現が低下している場合、被験物質は、細胞増殖を抑制させる作用を有する。
【００７０】
このようにして選択された被験物質は、Ｍｙｃと本発明のヌクレオチドとの結合に特異的に作用して、あるいはＭｙｃ発現量に影響して、あるいはＭｙｃによる転写制御機構に作用して機能する作用機序の明確な細胞増殖調節剤の候補となりうる。
【００７１】
[スクリーニング方法ＩＩ]
また、本発明は、本発明のレポータープラスミド、形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、妊娠調節剤をスクリーニングする方法（スクリーニング方法ＩＩ）を提供する。スクリーニング方法ＩＩは、下記工程：
（ａ）レポータープラスミド導入細胞、形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた細胞、形質転換体または動物におけるレポーターの発現量を調べ、被験物質を接触させない細胞、形質転換体または動物における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、妊娠調節剤の候補となる被験物質を選択する工程を含む。
スクリーニング方法ＩＩにおいて、レポータープラスミド導入細胞または形質転換体を用いる場合は、工程（ａ）および（ｂ）はスクリーニング方法Ｉと同様である。ここでは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いる場合について説明する。
【００７２】
工程（ａ）において、被験物質は、スクリーニング方法Ｉと同様のものがあげられる。
【００７３】
前記被験物質を本発明のトランスジェニック動物と接触させる方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内等の全身投与、または標的細胞付近への局所投与等があげられる。
【００７４】
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
【００７５】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物におけるレポーター遺伝子の発現量を調べる方法としては、各レポーター遺伝子に応じて自体公知の方法により行うことができる、例えば、蛍光タンパク質の場合、各蛍光タンパク質に応じた励起波長を照射して検出される蛍光を測定することにより行う方法などがあげられる。
【００７６】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与しない動物におけるレポーター遺伝子の発現量も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
【００７７】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、妊娠調節剤の候補となる被験物質を選択する。選択する基準は、レポーターの発現が上昇または低下していることを指標にすればよい。
【００７８】
このようにして選択された被験物質は、Ｍｙｃと本発明のヌクレオチドとの結合に特異的に作用して、、あるいはＭｙｃ発現量に影響して、あるいはＭｙｃによる転写制御機構に作用して機能する作用機序の明確な妊娠調節剤の候補となりうる。
【００７９】
また、本発明は、下記いずれかのペプチド：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からコードされるペプチド、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）前記（１）または（２）に記載のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチド
を有効成分として含有する、Ｍｙｃによる組織特異的発現の調節剤を提供する。前記調節剤は、妊娠の調節に用いられることが好ましい。
【００８０】
「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは２以上（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、いっそう好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列であって、同質の活性を有するものである。
【００８１】
また、「実質的に同一のアミノ酸配列」として、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上、いっそうより好ましくは約９７％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を用いることもできる。同一性（％）は、前記塩基配列の同一性と同様に決定することができる。
【００８２】
「同質の活性」とは活性が定性的に同等であることを意味し、定量的にも同等であることが好ましいが、許容し得る範囲（例えば、約０．５〜約２倍）で異なっていてもよい。ここでＴＡＦ４ｂの活性としては、ＴＢＰまたはＴＡＦｓ(TBP associated factors)との結合があげられる。
【００８３】
また、本発明は、下記：
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において２１０位〜２１６位のＴＡＴＡボックスおよび２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号５に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するサルＴＡＦ４ｂプロモーターを提供する。
【００８４】
ここで「実質的に同一」とは、２１０〜２１６位のＴＡＴＡボックスと２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフとがプロモーターの構成要素として機能する限り、それ以外の塩基配列は特に限定されないことを意味する。「実質的に同一」か否かの判断は、後述するレポーターアッセイによる前記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列との間のレポーターの発現量を比較し、同程度の発現量であることを指標にすればよい。
【００８５】
また、本発明は、下記：
（ａ）配列番号６に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において７７８位〜７８４位のＴＡＴＡボックスおよび７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号６に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するラットＴＡＦ４ｂプロモーターを提供する。
【００８６】
ここで「実質的に同一」とは、７７８〜７８４位のＴＡＴＡボックスと７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフとがプロモーターの構成要素として機能する限り、それ以外の塩基配列は特に限定されないことを意味する。「実質的に同一」か否かの判断は、後述するレポーターアッセイによる前記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列との間のレポーターの発現量を比較し、同程度の発現量であることを指標にすればよい。
【実施例】
【００８７】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８８】
細胞培養
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞、およびその派生体であり、ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を発現するＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞（Tsuneoka M. et al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）を、非必須アミノ酸および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグル培地中で培養した。ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を発現するラット線維芽細胞株３Ｙ１の派生体、３Ｙ１ＭｙｃＥＲ（Tsuneoka M. et al., Oncogene 14:2301-2311 (1997)）およびアフリカミドリサルの腎線維芽細胞株Ｃｏｓ−７を、１０％ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞を、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ラット大腸がん細胞株ＲＣＮ−９（理研細胞バンク）およびヒト赤白血病細胞株ＨＥＬ（ヘルスサイエンスリサーチ資源バンク製）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
【００８９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲ増幅は、各プライマーを１０pmoles、ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１．２Ｕ、およびｄＮＴＰを２００μＭ含む５０μｌ ＥＸ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ製）中で行った。
【００９０】
５’−ＲＡＣＥ法による解析
ＨＥＬ細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）からの逆転写反応、二本鎖ｃＤＮＡ合成、およびアダプターライゲーションは、マラソン（Marathon）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社製）を用いて行った（Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)，Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 280:19977-19985 (2005)）。第１ＰＣＲは、プライマーとして、AA287145-1st（５’−TTCTTATGCCTCTTCCTTTCTCCTG−３’（配列番号７）、ＥＳＴクローンAA287145の５’末端領域の配列）、および供給者によって提供されたＡＰ１プライマーを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の最初の熱変性後、９６℃で１５秒間の熱変性工程ならびに６８℃で３分間のアニーリング工程および伸張工程を１サイクルとする２５サイクルであった。上記第１ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を１０００倍希釈した液１μｌをネストＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。ネストＲＡＣＥ−ＰＣＲは、AA287145ネストプライマー（5’−TTGGCAAATGAGGCAGGTAGTAACA−3’（配列番号８）、ＥＳＴクローンAA287145のAA287145-1stの上流領域配列に対応するもの）と、供給者によって提供されたＡＰ２プライマーとを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の最初の熱変性後、９６℃で１５秒間の熱変性工程ならびに６８℃で３分間のアニーリング工程および伸張工程を１サイクルとする２５サイクルであった。増幅したＤＮＡ断片をpGEM-Tベクター（Promega社製）にクローニング（pT/fragmentTAF4b）し、シークエンスした。シークエンスの結果、AA287145はＴＡＦ４ｂ遺伝子の３’−ＵＴＲの一部であることが確認された。
【００９１】
ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの５’末端に関する情報を得るために、５’−ＲＡＣＥ増幅が上述のように実施された。ここでは、プライマーとして、ＴＡＦ４ｂＲＡＣＥ−１（5’−GGTCTCGGCTCTTGTTACAGTTTGCTG−3’（配列番号９）、文献（Dikstein R. et. al., Cell 87:137-146 (1996)）において以前に報告したＴＡＦ４ｂ ｃＤＮＡの５’末端領域の配列）と第１ＰＣＲ用に供給者によって提供されたＡＰ１プライマー、ＴＡＦ４ｂＲＡＣＥ−２プライマー（5’−GGATTGTCGTGGTGTTGGGGGCTTTCA−3’（配列番号１０）、ＴＡＦ４ｂＲＡＣＥ−１の上流領域の配列に対応するもの）およびネストＰＣＲ用に供給者によって提供されたＡＰ２プライマーを使用した。増幅したＤＮＡ断片をpGEM-Tベクター（Promega社製）にクローニングし、シークエンスした。
【００９２】
逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＨＥＬ細胞の一本鎖ｃＤＮＡの合成は、スーパースクリプト（Superscript）First-strand Synthesis system（インビトロジェン製）を使用して、全ＲＮＡ（１μｇ）で行った。得られた一本鎖ｃＤＮＡ１μｌ（全量２０μｌ）をＰＣＲの鋳型として使用した。増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、
ＴＡＦ４ｂコードＵ（5’−CGGAATTCGAAGCTGCGAGAGGTCGGGCGGGTGTCG−3’（配列番号１１）、５’非翻訳領域にＥｃｏＲＩ部位を付加した配列）、および、
ＴＡＦ４ｂコードＬ（5’−CGGAATTCGGCAGTAAATAGCAAGGATGTGGATGGA−3’（配列番号１２）、 ３’非翻訳領域にＥｃｏＲＩ部位を付加した配列）であった。温度プロファイルは、９８℃での１５秒間の熱変性工程と、６５℃での１分間のアニーリング工程および７２℃での２分３０秒間の伸張工程を１サイクルとして３５サイクルであった。増幅したＤＮＡ断片をpGEM-Tベクター（プロメガ社製）にクローニングしてｐＴ／ＴＡＦ４ｂを作製し、その配列を決定した。当該配列は、増幅された断片を使用してダイレクトシークエンスによって確認された。
【００９３】
ＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡ断片を有するレポータープラスミド
ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡ断片は、プロモーター領域からエキソン１（exon 1）へと伸長しており、プライマー
5’−TTTTACCATAACCTCACTTGCTGGAAGGGG−3’（配列番号１３）、および、
5’−TGTTGGGGGCTTTCACGGCGACTATCTG−3’（配列番号１４）
を使用したＰＣＲによって増幅した。２．２ｋｂの増幅された断片を、ＳａｃＩおよびＮｃｏＩで切断し、ＳａｃＩとＮｃｏＩで切断したホタルルシフェラーゼを含むｐＧＬ３（Promega社製）の４．８ｋｂ断片に挿入し、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉを作製した。ＳｍａＩとＮｃｏＩで切断したｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉの０．６ｋｂの断片を、ＳｍａＩとＮｃｏＩで切断したｐＧＬ３の４．８ｋｐの断片に挿入し、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉを作製した。ＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断したｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉの０．６ｋｐの断片を、ＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断したｐＧＬ３の４．８ｋｐの断片に挿入し、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＸｈｏ）ｌｕｃｉを作製した。ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉを、ＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断した後、Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲートして、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｘｈｏ）ｌｕｃｉを作製した。また、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉを、ＰｖｕＩＩとＮｃｏＩで切断した後、Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲートして、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを作製した。
【００９４】
さらに、欠失変異体ｐＴＡＦ４ｂ（１１７Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１１４Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１０２Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（７３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉおよびｐＴＡＦ４ｂ（４３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを、鋳型としてｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを使用し、適当なプライマーを用いたＰＣＲ、および、その後に行われるｐＧＬ３ベクターへの増幅断片の導入によって作製した。
【００９５】
突然変異は、Gene EditorTMインビトロ部位指向突然変異システム（プロメガ社製）を用いて、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉのＥ−ボックス部位に導入し、２つのＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧエレメント）がＣＡＣＣＴＧに変異したｐＴＡＦ４ｂ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉを作製した。また、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉの非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス部位にも突然変異を導入し、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１／２）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１）ｌｕｃｉおよびｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ２）ｌｕｃｉを作製した。これにより、１または２個のＮＣＥ−ボックス（CGCGTGエレメント）がCGCCTGに変異した。ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉにおける非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス部位２（ＮＣＥ−ｂｏｘ２）を、CACGTGに変異させ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ＣａｎｏＥ２）ｌｕｃｉを作製した。作製されたプラスミドのＤＮＡ配列は、シークエンスによって確認した。
【００９６】
ラットおよびサルのＴＡＦ４ｂプロモーターの配列
ラットＴＡＦ４ｂプロモーターの１．２ｋｐ断片を、以下のようにして単離した。
まず、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子について、マウスのＤＮＡ配列のホモログを選択した（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＫ０１２１３５）。マウスのＤＮＡ配列においては、ヒトＴＡＦ４ｂのゲノム配列に正確に適合するヌクレオチド配列として２つの領域を選択し、以下のオリゴヌクレオチド、
ラットＴＡＦＩＩ−Ｆ（5’−GCGCACGTGTGAGCGCCGCTGAGG−3’（配列番号１５））、および、ラットＴＡＦＩＩＰＦ−１（5’−CTGACAGGAGCCTTAGTCAC−3’（配列番号１６））を合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、ラット結腸癌細胞ＲＣＮ−９ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ラットＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をシークエンスし、この配列の上流領域を、promoter find kit（クロンテック社製）によってさらにクローニングした。なお、このクローニングには、鋳型としてＤｒａＩおよびＳｓｐＩライブラリーが用いられ、プライマーとして
ラットＴＡＦＩＩＰＦ３（5’−GCCGGGGCGGGCGGCAGGAGACTCG−3’（配列番号１７））およびＴＡＦＩＩＰＦ４（5’−CGGGCACTCCCTCAGCGGCGCTCAC−3’（配列番号１８））（これらの配列は、先に確認されたラットのＴＡＦ４ｂＤＮＡ配列内のもの）、ならびにＡＰ１およびＡＰ２が使用された。増幅されたラットのＴＡＦ４ｂゲノム断片を、シークエンスした。
サルＴＡＦ４ｂプロモーターを、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子と適合するＴＡＦ−プライマー１（5’−GACACAAGGAGAGGAACACGGATGC−3’（配列番号１９））、およびＴＡＦ−プライマー２（5’−GCCTGGGCTGCCCCCGGAGCGACAC−3’（配列番号２０））をプライマーとし、Ｃｏｓ−７細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して増幅した後、シークエンスした。
【００９７】
その他のプラスミド
ＣＭＶプロモーターの制御条件下のウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla reniformis luciferase）遺伝子を含むｐＲＬ−ＣＭＶを、Promega社から購入した。ＣＭＶ−ｃ−Ｍｙｃ、ｐＣＭＶ−ＵＳＦ、およびｐＣＭＶ−ＴＦＥ−３は、Martin Eilers博士から供与された（Desbarats L. et. al., Genes Dev. 10:447-460 (1996)）。組換え型のＧＦＰ−ＵＳＦおよびＧＦＰ−ＴＦＥ３を作製するために、ｐＣＭＶ−ＵＳＦおよびｐＣＭＶ−ＴＦＥ−３を鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマーとしては、
5’−GGCGGATCCAGATGAAGGGGCAGCAGAAAAC−3’（配列番号２１） (USF-BamHI-5’)、および、
5’−CGGGAATTCCCCATAGTTAGTTGCTGTC−3’（配列番号２２） (USF-EcoRI-3’)、
あるいは、5’−GCCGGATCCATGGCGCTGCTCACCATCGG−3’（配列番号２３） (TFE3-BamHI-5’)、および、5’−CGGCTCGAGGGTTCATGGGGAAGGGGCAG−3’（配列番号２４） (TFE3-XhoI-3’)を使用した。次いで、得られた断片を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ、またはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した細菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ３にそれぞれ導入し、ｐＧＥＸ−ＵＳＦまたはｐＧＥＸ−ＴＦＥ−３を作製した。
【００９８】
ＲＮＡ調製
全ＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理されたＲＮＡ調製液セット（ナカライテスク社製）を用いて、酸グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法によって細胞から単離した。
【００９９】
ＤＮＡチップを使用した示差ディスプレイ解析（ｃＤＮＡマイクロアレイ）
ｃＤＮＡマイクロアレイは、文献（Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）で説明した方法によって実施した。全ＲＮＡを、未処理のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞および４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）で２０時間処理した細胞から単離した。ｐｏｌｙ(Ａ＋）ＲＮＡを回収し、ＤＮＡチップ（インサイト社製）を利用した示差ディスプレイ解析に供した。発現遺伝子配列タグ（ＥＳＴ）クローンを含む約９０００種のｃＤＮＡがチップ上に搭載された（UniGEM Human V Ver. 2）。
【０１００】
ノーザンブロット解析およびプローブＤＮＡの調製
ＲＮＡは、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンドＮ（アマシャム社製）に転写し、32Ｐ標識した各ｃＤＮＡプローブで検出した。各プローブは、市販のMultiprimeラベリングキット（アマシャム社製）を用いて[α−32Ｐ]ｄＣＴＰで標識した。結果はＢＡＳ２０００イメージアナライザー（富士フィルム社製）を用いて定量した。ｃ−ｍｙｃ用のＤＮＡプローブは、文献（Tsuneoka M. et. al., Oncogene 14:2301-2311 (1997)）に示すものであった。ＴＡＦ４ｂ用のＤＮＡプローブは、pT/fragmentTAF4b由来の０．６ｋｐのＳａｃＩ断片であった。
【０１０１】
一過性発現解析
Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞における一過性発現レポーター解析を、文献（Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）に説明する方法で行った。
ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＭｙｃおよびその他の転写因子の影響を、当該転写因子をコードしているプラスミドの転写によって調べた。Ｔ９８Ｇ細胞を、１０％ＦＣＳを含む培地で生育させた。細胞（３×１０４個）を培養皿（１２ウエルのプレート、ウエルの径は２２ｍｍ）に入れ、２０〜２４時間培養した。１μｇのレポータープラスミド、インターナルマーカーとして２０ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、および転写因子を発現する様々な量のプラスミドをFuGENE6試薬（ロシュ・ダイアグノステイックス社製）を用いて細胞に導入し、トランスフェクションを行った。各トランスフェクションにおける全ＤＮＡ量は、空の発現ベクターを加えることによって一定に維持した。一日経過後、細胞を集め、ルシフェラーゼ活性を文献（Tsuneoka M. et. al., Oncogene 14:2301-2311 (1997)）に示す方法によって測定した。
【０１０２】
クロマチン免疫沈降実験
クロマチン免疫沈降実験は、基本的に文献（Tsuneoka, M., et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459(2002)）に示す方法と同様に実施した。免疫沈降したＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって検出した。使用したＰＣＲプライマーは、
5’−GACACAAGGAGAGGAACACGGATGC−3’（配列番号２５） (TAF4b-primer 1)、
および、5’−GCCTGGGCTGCCCCCGGAGCGACAC−3’ （配列番号２６）(TAF4b-primer 2)である。これらは、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子のプライマー（TAF4b primers）の転写開始部位を含む５２１ｂｐ断片を増幅するプライマーである。
また、他のＰＣＲプライマーとして、
5’−TTACAGGTAAGCCCTCCAATGACC−3’（配列番号２７）、
および、5’−GCAAAGCTACCATTTAGGAACCC−3’（配列番号２８）を使用した。これらは、第２２番染色体中のＥ−ボックスを含む領域のゲノム配列を増幅するプライマーである（control primers）。このＥ−ボックスは検出可能な遺伝子を有しない染色体中に位置している（Bouchard, C., et. al., Genes Dev. 15:2042-2047.(2001)）。
【０１０３】
抗体
ｃ−Ｍｙｃに対する抗体−１は、文献（Tsuneoka, M., et. al., Oncogene 14:2301-2311.(1997)）に記載されたものである。抗ｃ−Ｍｙｃ抗体−２（Ｎ２６２）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、抗Ｍａｘ抗体（Oncogene Science）、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｃ−８）（Santa Cruz Biotechnology）、抗ＴＦＥ３ヤギ抗体（ｓｃ−５９５８）（Santa Cruz Biotechnology）、および、抗ＵＳＦ−１ウサギ抗体（ｓｃ−２２９）（Santa Cruz Biotechnology）は、購入した。
【０１０４】
ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイは、本質的には文献（Tsuneoka, M., et. al., Oncogene 14:2301-2311(1997)）に示す方法で行った。組換え型ＧＳＴ−ＭｙｃおよびＧＳＴ−Ｍａｘを混合し、室温で３０分間インキュベートした。混合物を、ヒトＴＡＦ４ｂプロモーターの合成二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合について解析した。二本鎖オリゴヌクレオチドＣａｎｏＥは、ＴＡＦ４ｂプロモーターＣＧＣＧＴＧ（ＮＣＥ−ｂｏｘ２）の代わりにＣＡＣＧＴＧエレメントを含んでいるが、合成オリゴヌクレオチド
5’−GCGTGCGCGAGGTCTCCACGTGGCTATATAAACATGG−3’（配列番号２９）、
および、5’−GCCAGCCATGTTTATATAGCCACGTGGAGACCTCG−3’（配列番号３０）
のアニーリングによって作製された。ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドは、Klenow酵素を使用して[32Ｐ]ｄＣＴＰで標識した。
２０μｌの結合反応溶液内の最終状態は、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド：１ｎｇ、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Pharmacia Biotech社製）：１μｇ、非特異的一本鎖オリゴヌクレオチド（5’−GAGTCGACGAACACACCAGGTCTTGGAGCG−3’（配列番号３１））：１μｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：９８．５ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣｌ）：２．１ｍＭ、リン酸ナトリウム：４．８ｍＭ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）：２ｍＭ、ＥＤＴＡ：０．１ｍＭ、グリセロール：１％であった。
反応を進行させるために、反応混合液を室温で２０分間放置した。抗Ｍａｘ（Oncogene Science）、非特異的抗体または抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｃ−８）（Santa Cruz Biotechnology）をＤＮＡ結合反応中に加え、抗体解析を行った。標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドＣａｎｏＥ、標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドｎｏｎ−ＣａｎｏＥ（野生型：5’−GCGTGCGCGAGGTCTCCGCGTGGCTATATAAACATGG−3’（配列番号３２）と、
5’−GCCAGCCATGTTTATATAGCCACGCGGAGACCTCG−3’（配列番号３３）とのアニーリングによって作製されたもの）、および、
ｍＥ（5’−GCGTGCGCGAGGTCTCCGCCTGGCTATATAAACATGG−3’（配列番号３４）と5’−GCCAGCCATGTTTATATAGCCAGGCGGAGACCTCG−3’（配列番号３５）とのアニーリングによって作製されたもの）は、competitorとして使用された。
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼフュージョンＵＳＦおよびＴＦＥ３タンパク質を、E. coli Rosetta(Novagen Inc. Cat# 70953-4)中のｐＧＥＸ−ＵＳＦあるいはｐＧＥＸ−ＴＦＥ３を用いて発現させ、グルタチオンセファロースカラム（Amersham Biosciences）で単離した。ゲルシフトアッセイを、ｃ−Ｍｙｃの場合と同様の方法で、ＵＳＦおよびＴＦＥ３について実施した。
【０１０５】
（結果）
ｃ−Ｍｙｃは、ＴＡＦ４ｂの発現を誘導する。
条件付でｃ−Ｍｙｃ活性を誘導するために、エストロゲン誘発性Ｍｙｃシステム（Eilers M. et. al., Nature 340:66-68(1989)，Tsuneoka M. et.al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)参照）を使用した。キメラタンパク質ｃ−ＭｙｃＥＲは、ヒトｃ−Ｍｙｃおよびヒトエストロゲン受容体のエストロゲン結合ドメインから構成されており、エストロゲンの非存在下では細胞骨格成分に結合している。このキメラタンパク質にエストロゲンまたはその類似体４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）が結合すると、細胞骨格成分から遊離し、ｃ−Ｍｙｃとして機能する。ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇを、異所性ｃ−Ｍｙｃ活性が導入される親細胞として使用した。ｃ−ＭｙｃＥＲタンパク質を発現するＴ９８Ｇ細胞株（Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞）が確立された（Tsuneoka M. et.al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）。ＯＨＴの存在下あるいは非存在下における指数増殖期の２０時間のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞由来の全ＲＮＡを、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析に供した。Ｍｙｃ標的遺伝子であるオルニチンデカルボキシラーゼ（Bello-Fernandez C. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:7804-7808 (1993)）、ヌクレオリン（Greasley P. J. et. al., Nucleic Acids Res. 28:446-453 (2000)）、およびmina53（Tsuneoka M. et.al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）に対する特異的シグナルは、ｃ−ＭｙｃＥＲの活性化によって、それぞれ２．６倍、１．６倍、１．９倍に上昇した。これらの結果は、Ｍｙｃ標的遺伝子がこの実験システムにおいて検出されうるということを示唆している。
【０１０６】
本発明者は、ＥＳＴクローンＡＡ２８７１４５に対するシグナルが、ｃ−Ｍｙｃの活性化によって２．３倍に刺激されるということを見出した。ＥＳＴクローンＡＡ２８７１４５の５’上流領域をコードするｃＤＮＡは、ヒト赤白血病ＨＥＬ細胞ライブラリーから５’−ＲＡＣＥプロトコールを用いて単離した。そして、ＡＡ２８７１４５は、ＴＡＦ４ｂ遺伝子（Dikstein, R., et. al., Cell 87:137-146 (1996)）においてはＴＡＦＩＩ１０５と呼ばれるもの）の３’非コード領域の一部であることが確認された。ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子の翻訳および転写開始部位は以前に報告されていなかったため、本発明者らは、５’−ＲＡＣＥ実験によって転写物の５’末端をコードするｃＤＮＡを単離した。転写開始部位をＴＡＦ４ｂゲノム配列上にマップした。この部位は、図１Ａにおいて矢印を付して示している。ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの５’および３’配列と一致するプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに基づいてＨＥＬ細胞の全ＲＮＡから３．２ｋｂ長のｃＤＮＡを増幅し、シークエンスした。全体のヌクレオチド配列は文献（Dikstein, R., et. al., Cell 87:137-146.(1996)）において報告したものとほぼ同じであったが、既に報告しているＴＡＦ４ｂのＮ末端のアミノ酸Ｇｌｙの先に６６個のアミノ酸配列が付加されていること（図１Ａ参照）、および、いくつかのアミノ酸が異なっていることが確認された（当該配列は、ジーンバンク（Ｇｅｎ／Ｂａｎｋ）にアクセッション番号ＡＢ２３４０９６として登録されている。）。当該ｃＤＮＡクローンは、８６２アミノ酸からなり、推定分子量９１０９０．５２Ｄａ、等電点９．５９のタンパク質をコードしている。
【０１０７】
ＴＡＦ４ｂ ｍＲＮＡの発現
ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞を、ＴＰＡ（phorbol 12-myristate 13-acetate）によって末期に分化させると、一時的に刺激された後（Vass, J. K., et al., Differentiation 45:49-54 (1990)参照）にｃ−ｍｙｃの発現量が減少する（Hickstein, D. D., et. al., J. Biol. Chem. 264:21812-21817 (1989)、Hozumi, M., Adv. Cancer Res. 38:121-169 (1983)参照）。この実験システムを用いて、Ｍｙｃ標的遺伝子がＭｙｃの遮断中に影響されるか否かを調べた（Coller, H. A., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:3260-3265.(2000)、Grandori, C., et. al., EMBO J 15:4344-4357.(1996)参照）。図２Ａに示すように、ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡのレベルは、ＴＰＡを添加した後１時間で２倍に増加した後、３時間後に減少し始め、７時間後には１／５に減少した。ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡのレベルは、ＴＰＡを添加した後３時間で１．５倍に上昇した後、６時間後に減少し始め、９時間後に１／１０に減少した。これらの結果は、ＴＡＦ４ｂ発現がｃ−ｍｙｃ発現の後に起こることを示している。
【０１０８】
次に、ＭｙｃＥＲシステムを用いて、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡに対するｃ−Ｍｙｃ活性化の影響を調べた（図２Ｂ参照）。ＯＨＴ処理されたＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞において、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡのレベルは、３時間で２倍、７時間で３倍にそれぞれ上昇した。Ｔ９８Ｇ親細胞のＯＨＴ処理は、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡのレベルを刺激しなかった。図２Ｃに示すように、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞におけるＯＨＴによるＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの誘導は、タンパク質合成阻害剤シクロへキシミドの存在下で維持された。シキロヘキシミドによる処理は、Ｔ９８Ｇ親細胞において、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルにほとんど影響を及ぼさなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＴＡＦ４ｂ遺伝子がＭｙｃの直接の標的となっていることを示すものである。
【０１０９】
ｃ−ＭｙｃはインビボでＴＡＦ４ｂプロモーターの領域に結合する
ＨＬ６０細胞の増殖中において、生体内での内因性ＴＡＦ４ｂ遺伝子に結合するｃ−Ｍｙｃタンパク質を調べるために、クロマチン免疫沈降を前述した方法（Boyd, K. E., et. al., Mol. Cell. Biol. 17:2529-2537.(1997)，Boyd, K. E., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95:13887-13892.(1998)参照）により行った。免疫沈降後、各サンプルにおける内因性ＴＡＦ４ｂ遺伝子断片の強化を、ＴＡＦ４ｂ遺伝子における転写開始部位周辺のＤＮＡを特異的に増幅させるプライマーを用いたＰＣＲによってモニターした。図１Ｂに示すように、２つの異なる抗ｃ−Ｍｙｃ抗体が、増殖期のＨＬ６０細胞由来のＴＡＦ４ｂＤＮＡ断片を免疫沈降した。一方、ＴＰＡ処理された細胞からは、同じ抗体は検出可能なレベルのＤＮＡ断片を免疫沈降しなかった。なお、ＴＰＡ処理された場合、ｃ−ｍｙｃの発現は非常に低くなった。非特異的抗体はＴＡＦ４ｂ遺伝子断片を免疫沈降しないため、ＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡ断片の強化は、ＴＡＦ４ｂ遺伝子に結合するｃ−Ｍｙｃに依存する。さらに、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体は、第２２番染色体において検出可能な遺伝子を有さない染色体領域に位置するＥ−ボックスを含むゲノムＤＮＡ断片を強化しないため、ＴＡＦ４ｂ遺伝子において検出されるｃ−Ｍｙｃの結合は特異的であるといえる。これらの結果から、転写開始部位周辺のＴＡＦ４ｂ遺伝子が、ＨＬ６０細胞の増殖期で、特異的にｃ−Ｍｙｃに結合していることがわかる。
【０１１０】
ｃ−Ｍｙｃは、非基準型Ｅ−ボックス（ＣＧＣＧＴＧ）エレメントを介してＴＡＦ４ｂプロモーターを活性化する。
ｃ−ＭｙｃがどのＤＮＡエレメントを介してＴＡＦ４ｂの発現を制御するかを確認するために、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子のプロモーター領域を単離した。図１Ａでは、最初のＡＴＧにおける“Ａ”を「＋１」とした（星印で示す）。転写開始部位は−４６０ｂｐであった。この位置は、５’−ＲＡＣＥによって決定し、図１Ａにおいては矢じりで示した。ＴＡＴＡボックスの配列は、転写開始部位の約３０ｂｐ上流付近で見つかった。
ＴＡＦ４ｂプロモーターの活性を調べるために、エキソン１の上流領域からエキソン１の一部にかけての１．６ｋｐ領域を含むゲノムＤＮＡ断片を、ホタルルシフェラーゼｃＤＮＡに結合して、レポータープラスミドｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉを構築した（図３Ａ参照）。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞における一過性発現解析により、前記ＤＮＡ断片がプロモーター活性を有することが示された。ＯＨＴによってｃ−ＭｙｃＥＲを活性化した後、ルシフェラーゼ活性が２．５倍にまで上昇した（図３Ａ）。この刺激は、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞においてＯＨＴにより増加したＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルの増加で観察されたものに匹敵する（図２Ｂ参照）。
【０１１１】
転写開始部位付近には、２つの基準型Ｅ−ボックス部位（ＣＡＣＧＴＧエレメント）が存在する。この第１および第２のＣＡＣＧＴＧエレメントを、Ｅ−ボックス１、Ｅ−ボックス２とそれぞれ命名した。ＣＡＣＧＴＧエレメントは、多くのＭｙｃ標的遺伝子においてＭｙｃ応答エレメントとして機能することが報告されていたため、当該Ｅ−ボックス部位がｃ−Ｍｙｃによってプロモーターの活性化に関与するか否かを調べた。しかしながら、Ｅ−ボックス１およびＥ−ボックス２が変異した場合でも、ルシフェラーゼ活性は野生型レポータープラスミドと同様にＭｙｃによって依然として増加した（図３ＡのｐＴＡＦ４ｂ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉ）。
【０１１２】
次に、Ｍｙｃ刺激に応答可能なプロモーター領域を、欠失変異株を用いて調べた（図３Ａ参照）。−１５７５番目から−５３５番目までの領域の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃによるプロモーターの刺激を減少させなかったが、−１５７５番目から−３６７番目までのＤＮＡ断片の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＸｈｏ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃ刺激を消滅させた。この結果から、−５３４番目から−３６７番目までの領域が重要であることが示唆される。続いて、２つの追加レポーターを構成した。このレポーターは、−５３４番目から−３６０番目までの配列を含むもの（ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｘｈｏ）ｌｕｃｉ）と、−５３４番目から−３７７番目までの配列を含むもの（ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）であった。これら２つのレポーターの発現は、Ｍｙｃによって十分刺激された。
【０１１３】
応答部位を見つけるために、レポーター（ｐＴＡＦ４b（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）におけるＤＮＡ断片をさらに短くした（図３Ｂ参照）。−５３４番目と−４９２番目との間の領域の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（１１７Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃによる上昇にほとんど影響を及ぼさないが、−５３４番目と−４９０番目との間の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（１１４Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃによる上昇を消滅させた。さらに多くの部位を欠失させたレポーター（ｐＴＡＦ４ｂ（１０２Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（７３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（４３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）による発現も、Ｍｙｃによって上昇しなかった。これらの結果は、−４９２番目から−４９０番目までの領域の重要性を示すものである。
【０１１４】
−４９２番目から−４９０番目までの領域は、非基準型Ｅ−ボックスエレメントＣＧＣＧＴＧ（図１Ａの−４９２番目から−４８７番目）内に存在した。ＣＧＣＧＴＧエレメントが、Ｍｙｃ応答エレメントであるということはほとんど実証されていないが、ｃ−Ｍｙｃがこのエレメントに結合しうるということは文献（Grandori, C., et. al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:653-699 (2000)）に報告されている。そこで我々は、ＣＧＣＧＴＧエレメントがＭｙｃの活性化に関与するか否かを実験した。ＴＡＴＡボックス配列のすぐ近くには２つのＣＧＣＧＴＧエレメントが存在する（図１Ａおよび３Ｃ）。我々は、第１および第２のＣＧＣＧＴＧエレメントを、それぞれ非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス１（−５０９番目から−５０４番目）、ＮＣＥ−ボックス２（−４９２番目から−４８７番目）と命名した。我々は、レポータープラスミドｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ、ｍＮＣＥ１）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ、ｍＮＣＥ２）ｌｕｃｉおよびｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ、ｍＮＣＥ１／２）ｌｕｃｉを作製した。これらのプラスミドにおいて、１個または２個のＣＧＣＧＴＧをＣＧＣＣＴＧに変異させた（図３Ｃ）。ＮＣＥ−ボックス１の変異は、ｃ−Ｍｙｃによるプロモーター活性の刺激にほとんど影響を及ぼさないが、ＮＣＥ−ボックス２を変異させた場合、あるいは、ＮＣＥ−ボックス１およびＮＣＥ−ボックス２をともに変異させた場合には、Ｍｙｃ刺激をかなり減少させた（図３Ｃ参照）。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃがＮＣＥ−ボックス２を介してＴＡＦ４ｂプロモーターをトランス活性化させることを示唆する。
【０１１５】
ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＣＧＣＧＴＧエレメントは、哺乳類の進化の過程で保存されている。
ｃ−Ｍｙｃが他の種においてＴＡＦ４ｂの発現を刺激するか否かを調べるために、ラットの細胞でＴＡＦ４ｂの発現に対するｃ−Ｍｙｃの影響を調べた。図４Ａに示すように、ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を発現するラット３Ｙ１線維芽細胞（Tsuneoka M. et. al., Oncogene 14:2301-2311(1997)）において、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルは、ＯＨＴによって３倍まで上昇した。この誘導は、タンパク質合成阻害剤シクロへキシミドの存在下で維持された。ＴＡＦ４ｂはラットにおいてもＭｙｃ標的遺伝子であるということが、この結果から示唆される。
【０１１６】
我々は、プロモーター領域を含むラットＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡの１．２ｋｐ断片を単離し、この断片についてシークエンスした。図４ｂは、ヒトおよびラットＴＡＦ４ｂプロモーター領域間のヌクレオチド配列の相違を示している。１０ｂｐ間隔においた１００ｂｐのウインドウをスライドさせたり、重ねたりした際のヌクレオチドの相違数の平均を用いて、ヌクレオチド多様性を算出した。この解析において、挿入／欠失（indel）を一重変異として扱った。ヌクレオチド多様性の最小値、すなわち最大の相同性は、ＮＣＥ−ボックス２（位置７９２）の周囲で観察された。低レベルのヌクレオチド多様性は、位置１０００の周辺でも観察された。これは、上記の位置では、実際より小さく見積もられるヌクレオチド多様性を引き起こす大きな挿入／欠失（indel）がいくつか存在するという事実に起因するものである。ヒトＴＡＦ４ｂプロモーター配列を、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＡＣ１３３１７２．４として最近ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されたマウスのＴＡＦ４ｂプロモーター配列と比較すると、似たような結果が得られた（データ示さず）。
【０１１７】
我々は、アフリカミドリサルの腎臓の線維芽細胞Ｃｏｓ−７からサルＴＡＦ４ｂプロモーターのＤＮＡ断片を単離し、それをシークエンスした。ヒト、サル、ラット、およびマウスのＮＣＥ−ボックス２周辺のヌクレオチド配列を、図４Ｃにおいて比較する。ＮＣＥ−ボックス２およびＴＡＴＡボックスエレメントを含む２８ｂｐの配列が４つの種において完全に保存されていた。
【０１１８】
ＣＧＣＧＴＧおよびＣＡＣＧＴＧエレメントは、異なる優先度でＥ−ボックス結合転写因子に応答する。
非基準型Ｅ−ボックス配列の保存は、生理学的な意義を有している可能性がある。ＮＣＥ−ボックス２（ＣＧＣＧＴＧ）が基準型Ｅ−ボックスに変異した場合、プロモーター活性はｃ−Ｍｙｃによって刺激され、野生型プロモーターの活性よりも上昇する（図５Ａ参照）。
次に、Ｍｙｃの基準型Ｅ−ボックスおよび非基準型Ｅ−ボックスに対する結合活性を調べた。ＴＡＦ４ｂプロモーターの場合においてＮＣＥ−ボックス２の位置に基準型Ｅ−ボックスを含んでいる、放射標識されたＣａｎｏＥヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイにおいて、ＭｙｃとＭａｘとの結合はシフトしたバンドを生成した（図６Ａ、レーン２参照）。このバンドは抗ｃ−Ｍｙｃ抗体または抗Ｍａｘ抗体の存在下において減少し、スーパーシフトした（図６Ａ、レーン１およびレーン３参照）。標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドを過剰に添加した場合、シフトしたバンドの強度は減少した。一方、ＣＡＣＧＴＧがＣＧＣＣＴＧに変異した非標識のｍＥオリゴヌクレオチドを過剰に添加することによっては、バンドの強度はほとんど影響されなかった。この結果は、ｃ−ＭｙｃおよびＭａｘが、オリゴヌクレオチド内のＣＡＣＧＴＧエレメントを特異的に認識することを示すものである。スキャッチャードプロット解析（図６Ｃ）によって解離定数を計算すると、２４ｎＭであった。
【０１１９】
基準型Ｅ−ボックス部位に対するＭｙｃ−Ｍａｘのアフィニティを、非基準型Ｅ−ボックス部位に対するＭｙｃ−Ｍａｘのアフィニティと比較するために、標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドまたはｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（野生型Ｅ−ボックスＣＧＣＧＴＧを有する）が、反応混合物に対して過剰に加えられた。図５Ｄは、標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドと比較して、約３０倍以上の標識されていないｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドが、標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドおよびＭｙｃ−Ｍａｘによって生成される特異的シグナルを５０％に減少させるために必要であったことを示す。これらの結果から、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、Ｍｙｃ−Ｍａｘは、ＣＡＣＧＴＧエレメントよりもＣＧＣＧＴＧエレメントに弱く結合することが示唆される。この弱い結合活性によって、Ｍｙｃによる野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターの活性は緩やかに上昇すると思われる。
【０１２０】
ｍｙｃプロトオンコジーンファミリーのタンパク質以外にも、ＵＳＦ（Gregor, P. D., et. al., Genes Dev. 4:1730-1740.(1990)参照）、ＴＦＥ３（Beckmann, H., et. al., Genes Dev. 4:167-179.(1990)参照）を始めとする他のＥ−ボックス結合転写因子が存在する。次に、当該Ｅ−ボックス結合転写因子が、ＣＡＣＧＴＧエレメントおよびＣＧＣＧＴＧエレメントにどのように応答するのかについて調べた。図５Ｂおよび図５Ｃに示すように、野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターは、ＴＦＥ３およびＵＳＦによってほとんど刺激されなかった。これらの結果は、ＴＡＦ４ｂプロモーターがＭｙｃに特異的に応答することを示唆する。ＣＧＣＧＴＧエレメントが基準型（canonical）ＣＡＣＧＴＧに変異した場合、ＴＡＦ４ｂプロモーターからの発現は、ＵＳＦによって刺激されたが、ＴＦＥ３は依然として当該レポーターからの発現をほとんど刺激しなかった。
【０１２１】
ＵＳＦおよびＴＦＥ３のＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに対する結合活性は、Ｍｙｃ−Ｍａｘの場合と同様の方法で決定された（図７参照）。ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに結合するＴＦＥ３およびＵＳＦのＫｄ値は、それぞれ５．６ｎＭおよび４．８ｎＭであった。標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドと比較して、約３０倍の標識されていないｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドが、標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドおよびＵＳＦによって生成される特異的シグナルを５０％に減少させるために必要とされることが確認された。これらの結果から、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、ＵＳＦとＣＧＣＧＴＧエレメントとの結合は、ＵＳＦとＣＡＣＧＴＧエレメントとの結合よりも弱いことが示唆される（図５Ｆ参照）。このことから、ＵＳＦによって野生型ＴＡＦ４ｂプロモーター活性は上昇しないことがわかった。
【０１２２】
ＴＦＥ３の場合には、標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドおよびＴＦＥ３によって生成される特異的シグナルを５０％に減少させるためには標識されていないｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドは、標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドの場合と比較して、３倍だけ必要であった。
【０１２３】
（考察）
ＴＡＦ４ｂ遺伝子は、Ｍｙｃの直接の標的である。
我々は、ｃ−ＭｙｃがＴＡＦ４ｂの発現を直接誘導するということを実証した。ＨＬ６０細胞において、ＴＰＡ処理後のＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの発現は、ｃ−ｍｙｃの発現と密接に続いて起こった（図２Ａ参照）。ｃ−Ｍｙｃがｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質で活性化されると、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの発現の刺激が観察された（図２Ｂ参照）。この誘導は、タンパク質合成阻害剤の存在下でも維持され（図２Ｃ参照）、ｃ−ＭｙｃはＴＡＦ４ｂの発現を直接制御することが示された。ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、増殖中のＨＬ６０細胞で、インビボでＴＡＦ４ｂプロモーターに結合した（図１Ｂ参照）。ＴＡＦ４ｂプロモーター活性は、ｃ−Ｍｙｃによって上昇した（図３参照）。この活性の上昇は、進化の過程で保存された非基準型Ｅ−ボックス（ＮＣＥ−ボックス２；ＣＧＣＧＴＧエレメント）を介することによって起こる（図３および図４参照）。ゲルシフトアッセイでは、ＴＡＦ４ｂプロモーターの場合、ｃ−Ｍｙｃタンパク質はＮＣＥ−ボックス２に結合することが示された（図５Ｄ参照）。これらの結果をまとめると、ｃ−Ｍｙｃは進化の過程で保存されたＥ−ボックス部位を介してＴＡＦ４ｂの発現を直接誘導するということがいえる。
【０１２４】
ＴＡＦ４ｂを欠損したオスおよびメスのマウスは、生殖能力に顕著な異常を示す（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)， Freiman, R. N., et. al., Science 293:2084-2087.(2001)参照）。ＴＡＦ４ｂを欠損するメスのマウスは、卵巣での卵胞形成に欠陥を有するために不妊である一方、野生型マウスの卵胞の顆粒膜細胞においては、ＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃの発現が見られた（Freiman, R. N., et. al., Science 293:2084-2087.(2001)，Li, S., et. al., Endocr J. 41:83-92.(1994)，Sato, A., et. al., Eur. J. Endocrinol. 131:319-322.(1994)参照）。成体の精巣において、ＴＡＦ４ｂは生殖細胞の増殖に必要とされ（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)参照）、ＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃの発現は減数分裂前の精原細胞において検出される（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)，Koji, T., et. al., Histochem. J. 20:551-557.(1998)参照）。ＴＡＦ４ｂは細胞増殖の制御に関与する多くの遺伝子を誘導し得るため（Mengus, G., et. al., EMBO J. 24:2753-2767.(2005)参照）、上記の結果は、ｃ−ｍｙｃがＴＡＦ４ｂ発現の刺激を介して、卵胞形成および精子形成中の細胞増殖に寄与する可能性を示唆する。
【０１２５】
Ｅ−ボックス内の配列：基準型（ＣＡＣＧＴＧ）および非基準型（ＣＧＣＧＴＧ）エレメント
ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＣＧＣＧＴＧエレメント（ＮＣＥ−ボックス２）は、ｃ−ＭｙｃによるＴＡＦ４ｂ発現の誘導に必要である。この非基準型エレメントは進化の過程で保存されているが、これは、この配列が生理学的に重要であることを示すものである。ＣＧＣＧＴＧエレメントが基準型ＣＡＣＧＴＧに変異した場合、ｃ−ＭｙｃのＴＡＦ４ｂプロモーターへの結合は強化され、ｃ−Ｍｙｃはプロモーター活性をより強くアップレギュレートした（図５参照）。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃのＥ−ボックスへの結合活性がその転写活性化に直接影響を及ぼすということを示すものである。ＵＳＦの場合も、同様の現象が観察された（以下参照）。
【０１２６】
本発明者は、別のＥ−ボックス結合転写因子であるＵＳＦに関しても、Ｅ−ボックス部位における配列変化の影響を調査した。ＵＳＦは野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターをほとんど刺激しない。しかしながら、ＮＣＥ−ボックス２がＣＡＣＧＴＧに変異すると、ＵＳＦとＴＡＦ４ｂプロモーターとの結合はより強固なものとなり、ＵＳＦはプロモーター活性をアップレギュレートし始めた（図５Ｃおよび図５Ｆ参照）。これらの結果は、非基準型ＣＧＣＧＴＧ Ｅ−ボックスがＵＳＦによる制御を避けるために選択されている可能性を示唆する。
【０１２７】
マウスの精巣では、幹細胞系列でＴＡＦ４ｂは発現するが、体細胞であるセルトリ細胞ではＴＡＦ４ｂは発現しない（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)参照）。セルトリ細胞では、ＵＳＦは高度に発現しており、基準型Ｅ−ボックスエレメント（ＣＡＣＧＴＧ）を介してステロイド産生因子１（Daggett, M. A., et. al., Biol. Reprod. 62:670-679.(2000)参照）および卵胞刺激ホルモンレセプター（Heckert, L. L., et. al., Mol. Endocrinol. 14:1836-1848.(2000)：参照）の発現を誘導する。ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいてＮＣＥ−ボックス２が基準型であったとすれば、セルトリ細胞において、ＴＡＦ４ｂの発現はＵＳＦによって誘導されるであろう。それゆえ、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＣＧＣＧＴＧエレメントの保存は、哺乳類の精巣においてＴＡＦ４ｂの適度な発現を支持するために必要であるかもしれない。
【０１２８】
ＴＡＦ４ｂプロモーターの場合において、ＣＡＣＧＴＧエレメントに結合するｃ−Ｍｙｃ−Ｍａｘ、ＵＳＦ、およびＴＦＥ３のＫｄ値は、それぞれ２４ｎＭ、４．８ｎＭ、５．８ｎＭであり、ｃ−Ｍｙｃは上記のタンパク質の中で最も効率的にＴＡＦ４ｂプロモーターを活性化する。それゆえ、応答するエレメントに対する転写因子の結合活性は、応答する遺伝子を単純に決定するものではない。ＴＦＥ３のＣＡＣＧＴＧエレメントに対する結合活性は、ＣＧＣＧＴＧエレメントの結合活性と近似している。そして、ＴＦＥ３は、ＣＡＣＧＴＧエレメントを有するＴＡＦ４ｂプロモーターならびにＣＧＣＧＴＧエレメントを有するプロモーターを活性化しなかった。しかしながら、上述したように、ＵＳＦのＥ−ボックスエレメントに対する結合活性が上昇すると、結果としてＵＳＦによるＴＡＦ４ｂプロモーターの活性化が起こる。これらの結果は、転写因子のその応答エレメントに対する結合活性の上昇が、応答遺伝子の範囲を拡大しうることを示唆する。
【０１２９】
ＴＦＥ３のＣＧＣＧＴＧエレメントに対する結合活性は、ＣＡＣＧＴＧエレメントに対する結合活性と同等であった。一方、ｃ−Ｍｙｃ−ＭａｘおよびＵＳＦのＣＧＣＧＴＧエレメントに対する結合活性は、ＣＡＣＧＴＧエレメントに対する結合活性に比べて非常に弱かった（図５参照）。これらの結果から、Ｅ−ボックス内の各配列は、Ｅ−ボックスに対するＥ−ボックス結合転写因子の結合活性にそれぞれ異なる影響を与えるということが示唆される。現在までのところ、Ｍｙｃ−Ｍａｘに対する非基準型（non-canonical）結合配列がいくつか報告されている（ＣＡＣＣＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＡＡＣＧＴＧ、およびＣＡＣＧＡＧ）（Grandori, C., et. al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:653-699.(2000)：参照）。これらのエレメントは、異なる結合活性でＥ−ボックス結合転写因子と異なって結合する。これらの違いは、Ｅ−ボックス結合転写因子に応答する遺伝子の領域（spectrum）に影響を与える可能性を有している。以上の結果は、Ｅ−ボックス転写因子が異なる標的遺伝子特異性を有するというメカニズムに、Ｅ−ボックス内の配列が寄与しているという証拠を初めて提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＡＦ４ｂプロモーターおよびエキソン１の一部のゲノムＤＮＡ配列である。また、本図では、以前には報告していなかったＮ末端のアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列の下に一文字表記で示す。転写開始部位は矢印で示され、翻訳開始部位は星印で示されている。図中には、Ｅ−ボックス部位、Ｅ−ボックス１およびＥ−ボックス２（破線で囲まれた部分）、非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス部位、ＮＣＥ−ボックス１およびＮＣＥ−ボックス２（下線を引いた部分）、ＴＡＴＡボックス配列（影付きの部分）、ＳｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ）、ＰｖｕＩＩ部位（ＣＡＧＣＴＧ）、およびＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が示されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用したクロマチン免疫沈降実験の結果を示す図である。増殖期のＨＬ６０細胞（−ＴＰＡ）、および、１０ｎＭ ＴＰＡで２４時間処理されたＨＬ６０細胞（＋ＴＰＡ）を、１％ホルムアルデヒドで固定した後、核抽出物を集め、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体（ｃ−ＭｙｃのＮ末端側と反応する抗ｃ−Ｍｙｃ抗体１、ｃ−ＭｙｃのＣ末端側と反応する抗ｃ−Ｍｙｃ抗体２）、又はコントロール抗体を使用して、あるいは抗体を使用せずに（no antibody）、クロマチンを免疫沈降した。ＴＰＡの存在下でｃ−ｍｙｃ発現は大きく低下した（図２Ａ）。核抽出物を添加しないmock免疫沈降実験も実施された（nuclear extract -）。ＤＮＡを精製した後、試料を、ＴＡＦ４ｂプロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅するために設計されたプライマー（ＴＡＦ４ｂプライマー）、または、第２２番染色体のＥ−ボックスを含むＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマー（コントロールプライマー）を用いたＰＣＲに付した（Bouchard, C., et. al., Genes Dev. 15:2042-2047.(2001)：参照）。
【図２Ａ】図２Ａは、ＴＰＡ処理後のヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞におけるＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの変化を示す図である。ＲＮＡを１０ｎＭ ＴＰＡによる処理が行われた後、指示された時点で単離し、ノーザンブロッティングで解析してＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡを検出した（左側の図参照）。２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも検出した。この結果を定量し、プロットした（右側の図参照）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＭｙｃＥＲタンパク質の活性化によって、Ｔ９８Ｇ細胞中で増加したＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルを示す。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞（Ｔ９８ＧＭｙｃＥＲ）および親細胞（Ｔ９８Ｇ）を、０．２５％血清を含む培地で４０時間培養した後、２００ｎＭ ＯＨＴの存在下（＋）、あるいは非存在下（−）で培養した。ＲＮＡを指示された時点で単離し、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡを検出するためにノーザンブロッティングによる解析が行われた（左側の図参照）。２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも示す。結果を定量し、棒グラフとして表す（右側の図参照）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、タンパク質合成阻害剤の存在下で、ＭｙｃＥＲタンパク質の活性化によってＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルの増加が維持されたことを示す図である。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞を、０．２５％血清を含む培地で４０時間培養した後、２００ｎＭ ＯＨＴで８時間処理した。ＲＮＡを単離し、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡを検出するためにノーザンブロッティングにより解析した（左側の図参照）。図中、ＣＨＸの列で「＋」と示されたものは、ＯＨＴ添加の２０分前に２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドが添加されたものである。２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも示す。結果を定量し、棒グラフとして表す（右側の図参照）。
【図３Ａ】図３Ａは、レポーターアッセイの結果を示すグラフである。レポータープラスミド（ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉ）を、ＴＡＦ４ｂプロモーター活性を検出するために構築した。ｐＴＡＦ４ｂ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉにおいて、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉの２つのＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧエレメント）をＣＡＣＣＴＧに変異させた（図１Ａ参照）。また、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＸｈｏ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｘｈｏ）ｌｕｃｉ、およびｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉの欠失変異体を作製した。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトした。一日経過後、ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を活性化させるために、最終濃度が２００ｎＭになるようにＯＨＴを加え、細胞をさらに１７時間培養した。細胞抽出物を、ホタルルシフェラーゼ活性について解析した。プロモーター活性は、ＭｙｃＥＲ活性化なしの活性に対する割合として決定した。ＭｙｃＥＲ活性化を介さないＯＨＴの効果を規準化するために、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞の細胞数を、Ｔ９８Ｇ親細胞の細胞数で除した。なお、Ｔ９８Ｇ親細胞は、上述したＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と全く同じ手順で処理した。基本のプロモーターとして、何も挿入されていないｐＧＬ３プラスミドを用いた。数値は、４つの別個の実験の結果を平均したものである。バーは、標準誤差を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、レポーターアッセイの結果を示すグラフである。ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉの配列を欠失させ、ｐＴＡＦ４ｂ（１１７Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１１４Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１０２Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（７３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、およびｐＴＡＦ４ｂ（４３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを作製した。Ｍｙｃによるプロモーター活性化は、図３Ａで説明したのと同様にして測定した。
【図３Ｃ】図３Ｃは、レポーターアッセイの結果を示すグラフである。ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉのＮＣＥ−ボックス１およびＮＣＥ−ボックス２（図１Ａ参照）について変異を施し、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ２）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１／２）ｌｕｃｉを作製した。ここでは、１つまたは両方の非基準型Ｅ−ボックス（ＣＧＣＧＴＧエレメント）を、ＣＧＣＣＴＧに変異した。Ｍｙｃによるプロモーター活性化は、図３Ａで説明したのと同様にして測定した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＭｙｃＥＲタンパク質の活性化によって、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡ量がラットの線維芽細胞３Ｙ１においてどの程度増加するかを示す図である。２００ｎＭのＯＨＴで細胞を８時間処理した後、ＲＮＡを単離した。図中、ＣＨＸの列で「＋」と示されたものは、ＯＨＴ添加の２０分前に２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドが添加されたものである。得られたＲＮＡをノーザンブロッティングで解析し、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡを検出した。ここでも、２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒトとラットとの間でＴＡＦ４ｂプロモーター配列を比較したものである。この解析において、相同性が高い領域については、数値が低くなった（本文参照）。本図では、ＮＣＥ−ボックス２（ＣＧＣＧＴＧ）およびＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡ）の位置を示している（図１Ａ参照）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヒト（ＨＵＭ）、サル（ＭＯＮ）、ラット（ＲＡＴ）、およびマウス（ＭＯＵ）のＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、ＣＧＣＧＴＧエレメント周辺の配列を比較したものである。ＮＣＥ−ボックス２およびＴＡＴＡボックス配列は、明るい影付きで示している。ヒトＴＡＦ４ｂプロモーターとは異なるヌクレオチドは、暗い影付きで示している。本図では、ヒトプロモーターのＳｍａＩ部位も示している。
【図５】図５は、ＴＡＦ４ｂプロモーターの特性を示すグラフである。 図５Ａ〜図５Ｃでは、ＴＡＦ４ｂプロモーター活性に対するｃ−Ｍｙｃ、ＴＦＥ３、およびＵＳＦの影響を調べた。本図では、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを（○）で、ＮＣＥＷ−ボックス２（ＣＧＣＧＴＧエレメント）が基準型（ＣＡＣＧＴＧ）に変異されたｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ＣＡＣＧＴＧ）ｌｕｃｉを（●）で示している。Ｔ９８Ｇ細胞を、トランスフェクション効率の基準化用のｐＲＬ／ＣＭＶとともにレポータープラスミド、および、ｐＣＭＶ／ｃ−ｍｙｃ（Ａ）、ｐＣＭＶ／ＴＦＥ３（Ｂ）、又はｐＣＭＶ／ＵＳＦ（Ｃ）でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、エフェクタープラスミドが無い場合の発現量に対する割合で表す。図中、Ｘ軸はエフェクタープラスミドの量を示す。数値は、４つの別個の実験の結果を平均したものである。バー（the bars）は、基準誤差を示している。 図５Ｄ〜図５Ｆは、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、非基準型（野生型）Ｅ−ボックスに対するＭｙｃ−Ｍａｘ（Ｄ）、ＴＦＥ３（Ｅ）、またはＵＳＦ（Ｆ）の結合活性を、基準型Ｅ−ボックスに対するそれぞれの結合活性と比較した図である。組換えタンパク質を、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、様々な量の非標識のＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（●で示す）あるいはｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（野生型；○で示す）を加えたものとともにインキュベートし、その後、実施例ならびに図６で説明したゲルシフトアッセイにより解析した。ｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドは、野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターから合成されたオリゴヌクレオチドであり、Ｍｙｃ応答性ＮＣＥ−ボックス２を有するものであった。ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドにおいて、ＮＣＥ−ボックス２を基準型ＣＡＣＧＴＧエレメントに変異させた。反応混合物中、標識されていないcompetitorの量は、標識されたオリゴヌクレオチドとの倍数として表す。
【図６】ｃ−Ｍｙｃ／ＭａｘとＴＡＦ４ｂプロモーターオリゴヌクレオチドとの結合を調べた図である。 図６Ａは、ｃ−Ｍｙｃ／Ｍａｘ複合体とのゲルシフトアッセイの結果を示す。組換えタンパク質を３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、ゲルシフトアッセイにより解析した。シフトしたバンドの特異性をテストするために、ゲルシフトアッセイの前に、ウサギ抗Ｍａｘ抗体（文献１：Beckmann, H., et. al., Genes Dev. 4:167-179.(1990)：参照）、非特異的抗体（Bello-Fernandez, C., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:7804-7808.(1993)参照）、あるいは抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Bouchard, C., et. al., Genes Dev. 15:2042-2047.(2001)参照）を反応混合物に加えた。図には、シフトしたバンド（＊）および抗体によってスーパーシフトしたバンド（＜）が示されている。 図６Ｂでは、配列特異的結合をテストするために、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、その３０倍量（レーン３および５）、１００倍量（レーン４および６）、３００倍量（レーン７）過剰の非標識ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（レーン３および４）あるいはＣＡＣＧＴＧエレメントがＣＧＣＣＴＧに置き換わったｍＥオリゴヌクレオチド（レーン５、６、および７）が加えられたものとともに、タンパク質をインキュベートした。その後、上述の方法でゲルシフトによる解析が行われた。 図６Ｃは、Ｍｙｃ／Ｍａｘと３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドとの結合を示す。ｃ−Ｍｙｃ／Ｍａｘ複合体を、反応混合物中で様々な濃度の３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドとともに室温でインキュベートした。次いで、前記混合物を電気泳動し（左側の図参照）、シフトした放射能の強度を定量した。この結果を、スキャッチャードプロットで解析した（右側の図参照）。
【図７】ＵＳＦおよびＴＦＥ３とＴＡＦ４ｂプロモーターオリゴヌクレオチドとの結合を調べた図である。 図７Ａでは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに結合するＵＳＦのゲルシフトアッセイを図６と同様にして実施した。シフトしたバンドの特異性をテストするために、抗ＵＳＦ抗体を反応混合物に加えた（レーン３）。配列特異的結合をテストするために、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、その３０倍量（レーン４および７）、１００倍量（レーン５および８）、３００倍量（レーン６および９）過剰の非標識ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（レーン４、５、および６）あるいはｍＥオリゴヌクレオチド（レーン７、８、および９）が加えられたものとともに、タンパク質をインキュベートした。 図７Ｂでは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに対するＵＳＦの結合を解析するため、スキャッチャードプロット解析を図６と同様にして実施した。 図７Ｃは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに結合するＴＦＥ３のゲルシフトアッセイを示す。シフトしたバンドの特異性をテストするために、抗ＴＦＥ３抗体（レーン３）またはコントロールの抗体をインキュベーション混合物に加えた。配列特異的結合をテストするために、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、その３０倍量（レーン５および７）、１００倍量（レーン６および８）、３００倍量（レーン９）過剰の非標識ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（レーン５および６）またはｍＥオリゴヌクレオチド（レーン７、８、および９）が加えられたものとともに、タンパク質をインキュベートした。 図７Ｄでは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに対するＴＦＥ３の結合を解析するために、スキャッチャードプロット解析が図６と同様にして実施された。
【図８】図８は、ＴＡＦ４ｂプロモーター領域とその活性および推定される発現上昇因子の結合部位を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＡＦ４ｂプロモーターおよびその利用に関する。詳しくは、組織特異的な転写調節または転写増強が可能なヌクレオチドおよび真核生物の様々な事象の解明に寄与する当該ヌクレオチドの利用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞（真核生物）において、タンパク質をコードする遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ）によって転写される。特定の遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩを導く分子機構は、調節タンパク質の複数のクラスから構成される（非特許文献１）。ＴＦＩＩＤは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ制御機構の中核となる要素であり、酵母（Saccharomyces cerevisiae）からヒトに至るまで保存されており、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）と複数のＴＢＰ関連因子（ＴＡＦｓ）からなる大きな多量体タンパク質複合体である。ＴＦＩＩＤは、初期の頃には発現および機能において遍在性(ユビキタス)であると考えられていたが、組織特異的ＴＡＦｓの同定は、特殊化したＴＦＩＩＤ複合体が遺伝子発現の組織特異的プログラムの調節において直接的な役割を果たしうるということを示唆した。同定された最初の細胞型特異的ＴＦＩＩＤサブユニットは、ＴＡＦ４ｂ（以前はＴＡＦＩＩ１０５と呼ばれていた）であった（非特許文献２）。ＴＡＦ４ｂは、広範囲に発現される因子であるＴＡＦ４（以前はＴＡＦＩＩ１３０と呼ばれていた）のホモロガスタンパク質である。ＴＡＦ４ｂの細胞型特異的機能は、ＴＡＦ４ｂがマウスの精巣および卵巣で高度に発現しており、ＴＡＦ４ｂを欠損したマウスは、生存可能であるがオス・メスともに不妊である（非特許文献３、４）という発見によって支持された。
【０００３】
一次Ｂリンパ球が細菌のリポ多糖によって活性化された場合、ＴＡＦ４ではなくＴＡＦ４ｂの発現が増加した（非特許文献５）。最近では、ＴＡＦ４およびＴＡＦ４ｂを含むＴＦＩＩＤ複合体が別個の標的遺伝子特異性を有しているということが報告されている。ＴＡＦ４を不活性化すると、多くの一連の遺伝子の発現に影響を及ぼした。これらの中で、ＴＡＦ４ｂの不活性化は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、ＣＴＧＦ、ＩＴＧα６およびＨＢ−ＥＧＦを含む多くの成長因子を誘導した。これらの成長因子は、ＴＡＦ４ｂの過剰発現によっても誘導された。これらの結果は、ＴＡＦ４とＴＡＦ４ｂとの平衡が細胞増殖の制御に関連する遺伝子の調節に作用しているということ（非特許文献６）を示唆しているとともに、ＴＡＦ４ｂの発現は厳密に制御されるべきであることを示している。しかしながら、ＴＡＦ４ｂ発現の制御メカニズムは、未だ解明されていない。
【０００４】
プロトオンコジーンのｍｙｃファミリーは、３つの主要な遺伝子：ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃから構成されている（非特許文献７、８、９）。この３つの遺伝子は、異なる発現パターンを示すが、基本的には同じ生物学的活性を有しているように見える。ｃ−ｍｙｃまたはＮ−ｍｙｃを欠損したマウスの胎児は、多臓器発育不全になり、胚形成の中間の段階で死ぬ（非特許文献１０、１１）。ｃ−ｍｙｃの発現が一定量減少する対立形質を有する一連のマウスを作製した場合、in vivoでのｃ−ｍｙｃレベルの減少は、多臓器発育不全が原因となって、ｃ−ｍｙｃのレベルに依存してマウスの体重を減少させる（非特許文献１２）。これらの結果は、Ｍｙｃの量が細胞増殖に直接的に関与していることを示すものである。これらの蓄積されたデータは、ｍｙｃファミリー遺伝子が細胞増殖の調節因子の中心となっていることを示している。
【０００５】
ｍｙｃがコードするタンパク質は、塩基性へリックス・ループ・へリックス−ロイシンジッパー転写因子のメンバーである（非特許文献８、１３）。Ｍｙｃタンパク質とその必須パートナーＭａｘタンパク質との二量体化が起こると、Ｅ−ボックス部位に結合するヘテロ二量体が形成される。このＥ−ボックス部位は、通常は基準的なもの（ＣＡＣＧＴＧ）であるが、まれにはＣＧＣＧＴＧを含む非基準的なものである。Ｍｙｃ−Ｍａｘヘテロ二量体は、オルニチンデカルボキシラーゼ（非特許文献１４）、ＲＣＣ１（非特許文献１５）、ヌクレオリン（非特許文献１６）、サイクリンD2（非特許文献１７）、mina53（非特許文献１８）、およびmimitin（非特許文献１９）を含む、種々の遺伝子の転写を活性化する。ｍｙｃに関しては、その研究に多大な努力がなされているが、いまだなぞのままであり、Ｍｙｃによって制御されるさらなる遺伝子に関する情報は、ｍｙｃの機能の解明に役立てることができる。
【０００６】
ｍｙｃプロトオンコジーンファミリーのタンパク質以外にも、ＵＳＦ（非特許文献２０）およびＴＦＥ３（非特許文献２１）を含むＥ−ボックス結合転写因子の他のクラスが存在する。これらの因子も、Ｅ−ボックスを介して遺伝子発現をトランスに活性化するが、これらの生物学的な機能およびこれらに対応する遺伝子は、Ｍｙｃとは異なっている。しかしながら、それぞれのＥ−ボックス結合転写因子におけるこれらの相違を創り出すメカニズムは、未だ明らかになっていない。
【非特許文献１】Lemon, B. et al., Genes Dev. 14:2551-2569, 2000
【非特許文献２】Dikstein, R. et al., Cell 87:137-146, 1996
【非特許文献３】Falender, A. E. et al., Genes Dev. 19:794-803, 2005
【非特許文献４】Freiman, R. N. et al., Science 293:2084-2087, 2001
【非特許文献５】Freiman, R. N.et al., Mol. Cell. Biol. 22:6564-6572, 2002
【非特許文献６】Mengus, G. et al., EMBO J. 24:2753-2767, 2005
【非特許文献７】DePinho, R. A. et al., Adv. Cancer Res. 57:1-46, 1991
【非特許文献８】Grandori, C. et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:653-699, 2000
【非特許文献９】Henriksson, M. et al., Adv. Cancer Res. 68:109-182, 1996
【非特許文献１０】Davis, A. C. et al., Genes Dev. 7:671-682, 1993
【非特許文献１１】Stanton, B. R. et al., Genes Dev. 6:2235-2247, 1992
【非特許文献１２】Trumpp, A. et al., Nature 414:768-773, 2001
【非特許文献１３】Luscher, B. et al., Gene 277:1-14, 2001
【非特許文献１４】Bello-Fernandez, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:7804-7808, 1993
【非特許文献１５】Tsuneoka, M. et al., Oncogene 14:2301-2311, 1997
【非特許文献１６】Greasley, P. J. et al., Nucleic Acids Res. 28:446-453, 2000
【非特許文献１７】Bouchard, C. et al., Genes Dev. 15:2042-2047, 2001
【非特許文献１８】Tsuneoka, M. et al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459, 2002
【非特許文献１９】Tsuneoka, M. et al., J. Biol. Chem. 280:19977-19985, 2005
【非特許文献２０】Gregor, P. D. et al., Genes Dev. 4:1730-1740, 1990
【非特許文献２１】Beckmann, H. et al., Genes Dev. 4:167-179, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、細胞増殖因子かつ転写因子であるＭｙｃの直接の標的およびそれを用いた真核生物の組織特異的事象の調節手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記観点から鋭意検討した結果、Ｍｙｃの直接の標的となる核酸配列および当該配列中の必須配列を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕 Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチド。
〔２〕 前記ヌクレオチドが
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列、
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列、
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列および／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列が配置されてなる塩基配列を含む塩基配列、または
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列、
からなるものである、前記〔１〕記載のヌクレオチド。
〔３〕 （ａ）配列番号４に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、５１位〜５７位のＴＡＴＡボックスおよび４３〜４８位のＣＡＣＧＴＧモチーフ以外の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
を含有するものである、前記〔１〕に記載のヌクレオチド。
〔４〕 前記ＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフが、下記：
（ｉ）塩基配列ＧＴＧにおける少なくとも１塩基の置換、
（ii）塩基配列ＣＡＣにおける少なくとも１塩基の置換もしくは挿入
のいずれかまたは両方の変異を有するものである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のヌクレオチド。
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のヌクレオチドを含有してなるベクター。
〔６〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有してなる、レポータープラスミド。
〔７〕 前記〔５〕に記載のベクターまたは前記〔６〕に記載のレポータープラスミドを導入してなる形質転換体。
〔８〕 前記〔５〕に記載のベクターまたは前記〔６〕に記載のレポータープラスミドを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
〔９〕 前記〔６〕に記載のレポータープラスミドまたは前記〔７〕に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤をスクリーニングする方法。
〔１０〕 前記〔６〕に記載のレポータープラスミド、前記〔７〕に記載の形質転換体または前記〔８〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、妊娠調節剤をスクリーニングする方法。
〔１１〕 Ｍｙｃによる組織特異的発現の調節剤であって、下記いずれかのペプチドを有効成分として含有する調節剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からコードされるペプチド、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）前記（１）または（２）に記載のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
〔１２〕 妊娠の調節に用いられる前記〔１１〕に記載の調節剤。
〔１３〕 （ａ）配列番号５に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において２１０位〜２１６位のＴＡＴＡボックスおよび２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号５に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するサルＴＡＦ４ｂプロモーター。
〔１４〕 （ａ）配列番号６に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において７７８位〜７８４位のＴＡＴＡボックスおよび７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号６に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するラットＴＡＦ４ｂプロモーター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のヌクレオチドによると、Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するために必要十分な塩基配列を提供することが可能となり、真核生物におけるＭｙｃを介した転写のさらなる解明のみならず、細胞増殖や組織特異的な転写制御の調節に寄与することができる。本発明のベクターによると、本発明のヌクレオチドを様々な用途に供する際に便利なツールを提供することができる。本発明のレポータープラスミドによると、Ｍｙｃの活性を測るための新しいツールとして利用することができる。
【００１０】
本発明のベクター、レポータープラスミド、形質転換体およびトランスジェニック非ヒト動物によると、真核生物におけるＭｙｃを介した転写のさらなる解明ならびに細胞増殖や組織特異的な転写制御の調節をインビトロまたはインビボで調べるためのツールを提供することができる。本発明のスクリーニング方法によると、細胞増殖のシグナル伝達の中核に位置するＭｙｃの活性を調節可能な細胞増殖調節剤を簡便および高感度に選別することができる。また、本発明のスクリーニング方法によると、今までに知られていない作用機序を有する妊娠調節剤を選別することができる。
【００１１】
本発明のＭｙｃによる組織特異的発現の調節剤によると、Ｍｙｃが介在する真核生物の発生および維持に関する様々な事象の調節に用いることができ、好ましくは妊娠の調節に用いられうる。本発明のサルまたはラットＴＡＦ４ｂプロモーターによると、サルまたはラット等の実験動物を用いた転写調節の研究のみならず、哺乳動物を始めとする多細胞生物全体の転写調節の解明にも寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドを提供する。前記ヌクレオチドは、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＧＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチドである。
【００１３】
本発明において「Ｍｙｃによる組織特異的発現」とは、転写因子であるＭｙｃが特定の塩基配列を標的とすることにより、真核生物の特定の組織で当該特定の塩基配列の下流に位置する遺伝子が転写されることをいう。
【００１４】
本発明におけるＭｙｃとは、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃを包含するものであり、特に限定されるものではないが、種々の癌において遺伝子増幅、過剰発現や転座が報告されているｃ−Ｍｙｃを中心に説明する。
【００１５】
本発明における組織とは、真核生物を構成するものである限り特に限定されるものではないが、例えば、脳、神経、骨髄、骨、筋肉、脂肪、心臓、肺、食道、胃、腸、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、血管、血球、臍帯、皮膚、感覚器官、およびその前駆体、生殖組織、幹細胞などが好ましい。また、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株も組織に含まれる。
【００１６】
本発明において「調節」とは、本発明のヌクレオチドの下流に位置する遺伝子の転写の開始、転写増強、転写抑制などをいう。
【００１７】
本発明のヌクレオチドとは、その下流に位置する遺伝子の転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する核酸をいい、通常プロモーターと称される用語と同義である。
【００１８】
本発明のヌクレオチドは、具体的には、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＧＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するものであり、本発明によって初めて解明された、Ｍｙｃの直接の標的である。
【００１９】
「ＴＡＦ４ｂプロモーターに由来する」とは、ＴＡＦ４ｂとして公知の、例えばGenBank Accession No.XM_290809.4のヒトＴＡＦ４ｂ中のプロモーター領域の塩基配列そのものであってもよく、本発明の目的を達成しうるプロモーター活性を有する限りＴＡＦ４ｂプロモーター領域内の塩基配列が改変されていてもよい。プロモーター活性は、後述するレポーターアッセイによりレポーターの発現強度を指標にして調べることができる。
【００２０】
本発明のヌクレオチドの必須配列である「ＴＡＴＡボックス」とは、真核細胞のｍＲＮＡをコードする遺伝子の転写開始位置より約２０〜８０塩基上流にあって、通常「ＴＡＴＡＴ（Ａ）ＡＡ（Ｔ）」と一般化されているＤＮＡ配列をいう。
【００２１】
本発明のヌクレオチドの必須配列である「ＣＡＣＧＴＧ」モチーフまたは「ＣＧＣＧＴＧ」モチーフとは、Ｍｙｃが直接結合する部位のコンセンサス配列であり、本発明によりＭｙｃによる組織特異的発現がこれらのモチーフの使い分けにより調節されていることを初めて解明したものである。
【００２２】
本発明のヌクレオチド中に含まれる前記ＣＡＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＧＣＧＴＧモチーフは、いずれかのモチーフ１つのみでもよく、同じ配列のモチーフが２つでもよく、異なる配列のモチーフが１つずつでもよい。異なる配列のモチーフを含む場合、モチーフ間の上流、下流の関係は特に限定されるものではない。これらのモチーフの位置関係は、前記ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではない。
【００２３】
別の側面によると、本発明のヌクレオチドは、
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列、
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列、
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列および／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列が配置されてなる塩基配列を含む塩基配列、または
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列、
からなるものであることが好ましい。
【００２４】
同一性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。本発明において、塩基配列の「同一性」とは、比較する２種の塩基配列を整列（アラインメント）させ、整列により一致した塩基配列の数を基準となる塩基配列の総数で除して算出した割合を％で示した数字である。なお、整列により生じたギャップは、不一致と見なして算出する。
【００２５】
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列
本発明によりＭｙｃの直接の標的となる配列としてクローニングされた塩基配列である。
【００２６】
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
ここで「実質的に同一」とは、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスと１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフとがプロモーターの構成要素として機能する限り、それ以外の塩基配列は特に限定されないことを意味する。「実質的に同一」か否かの判断は、後述するレポーターアッセイによる前記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列との間のレポーターの発現量を比較し、同程度の発現量であることを指標にすればよい。
【００２７】
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
前記ＴＡＴＡボックスおよびＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。前記必須配列は、配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域と対応する塩基配列中に含まれていることが好ましく、対応する塩基配列中に含まれていない場合は、対応配列外に機能可能に連結される。ＣＧＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００２８】
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
前記ＴＡＴＡボックスおよびＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。前記必須配列は、配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域と対応する塩基配列中に含まれていることが好ましく、対応する塩基配列中に含まれていない場合は、対応配列外に機能可能に連結される。ＣＧＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００２９】
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
前記ＴＡＴＡボックスおよびＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。前記必須配列は、配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域と対応する塩基配列中に含まれていることが好ましく、対応する塩基配列中に含まれていない場合は、対応配列外に機能可能に連結される。ＣＧＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００３０】
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列
配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置した塩基配列である。
【００３１】
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列Ｂを必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列Ａおよび／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列Ｃが配置されてなる塩基配列を含む塩基配列
ここでは、前記塩基配列Ｂを必須とするものであり、塩基配列ＡＢ（左から右に５’→３’と連結される、以下同様）、塩基配列ＢＣ、塩基配列ＡＢＣの３通りの組合せがあげられる。すなわち、塩基配列Ｂは必須であるがこの塩基配列のみではＭｙｃによる組織特異的発現が十分ではなく、発現を上昇させる目的には、塩基配列ＡＢまたはＢＣが好ましく、塩基配列ＡＢＣがより好ましい。
【００３２】
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列
当該断片は、前記（ｇ）の項の塩基配列ＡＢ、塩基配列ＢＣ、塩基配列ＡＢＣに対応するものであり、これらの塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列である。
【００３３】
Ｍｙｃによる組織特異的発現を増強する目的に使用する場合、本発明のヌクレオチドは、
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、５１位〜５７位のＴＡＴＡボックスおよび４３〜４８位のＣＡＣＧＴＧモチーフ以外の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
を含有することが好ましい。
【００３４】
前記（ａ）は、本発明により、Ｍｙｃの直接の標的となる配列の中でもＭｙｃによって発現がさらに増強されうる配列として見出された塩基配列である。したがって、当該配列は、Ｍｙｃの存在量を高感度に検出するプロモーターとなりうる。
【００３５】
前記（ｂ）は、ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含み、必須配列以外の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、さらにいっそうより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるものである。ＣＡＣＧＴＧモチーフは、ＴＡＴＡボックスの１〜５０塩基上流に位置する限り特に限定されるものではなく、モチーフの数は１つまたは２つでもよい。
【００３６】
本発明のヌクレオチド中に含まれる前記ＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフは、本発明のヌクレオチドをプロモーターとして用いた場合に、当該モチーフ内の塩基を変異させることによりＭｙｃによる発現の程度を維持または抑制することができる。具体的には前記モチーフは、下記：
（ｉ）塩基配列ＧＴＧにおける少なくとも１塩基の置換、
（ii）塩基配列ＣＡＣにおける少なくとも１塩基の置換もしくは挿入
のいずれかまたは両方の変異を有するものである場合、変異前のＭｙｃによる発現を同等またはそれ以下に調節することができる。変異モチーフの具体例としては、ＣＡＣＣＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＡＡＣＧＴＧ、ＣＡＣＧＡＧモチーフなどがあげられる。
【００３７】
本発明のヌクレオチドを細胞に導入する場合、ベクターの形で導入されることが好ましい。本発明は、前記ヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
【００３８】
基本骨格となるベクターは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＬ２、ｐＧＬ３、ｐＧＬ４ (プロメガ社)等が使用可能である。
【００３９】
本発明のベクターは、本発明のヌクレオチドを自体公知の方法により前記基本骨格となるベクターにクローニングすることにより得られる。このようにして得られたベクターは、シークエンス等により所望の位置に所望の方向で本発明のヌクレオチドがクローニングされていることを確認することができる。
【００４０】
本発明のヌクレオチドのプロモーター活性を調べるためには、レポーター遺伝子を用いることが好ましい。本発明は、本発明のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有するレポータープラスミドを提供する。
【００４１】
ここで、レポーター遺伝子とは、本発明のヌクレオチドのプロモーター活性を調べるために組み込まれる目印用の遺伝子をいい、公知のあらゆるレポーター遺伝子を制限なく用いることができる。検出が簡単で定量化も可能であるという観点から、レポーター遺伝子は発光タンパク質遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子が好ましい。
【００４２】
前記発光タンパク質としては、ホタル由来のルシフェラーゼ、Renilla（ウミシイタケ）由来のルシフェラーゼなどがあげられる。これら発光タンパク質および当該タンパク質をコードする核酸は、公知である。
【００４３】
前記蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体などがあげられる。これら蛍光タンパク質およびそれらの類似体ならびに当該タンパク質をコードする核酸は、公知である。
【００４４】
前記レポーター遺伝子は、公知の塩基配列に基づいて、常法により調製することができる。
【００４５】
本発明のレポータープラスミドにおいて、構成要素である本発明のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子は、直接結合していてもよく、本発明の目的を達成しうる限りにおいて、任意の塩基配列が挿入されていてもよい。かかる挿入配列としては、例えば、クローニングの過程で付加される制限酵素切断部位から生じる塩基配列などがあげられ、通常、１〜１０００塩基程度の長さを有するものである。
【００４６】
本発明のレポータープラスミドの基本骨格となるプラスミドは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＬ２、ｐＧＬ３、ｐＧＬ４(プロメガ社)等が使用可能である。
【００４７】
本発明のレポータープラスミドは、前記ヌクレオチドおよび前記レポーター遺伝子を自体公知の方法により前記基本骨格となるプラスミドにクローニングすることにより得られる。このようにして得られたレポータープラスミドは、シークエンス等によりヌクレオチドおよびレポーター遺伝子が所望の位置に所望の方向でクローニングされていることを確認することができる。
【００４８】
このようにして構築された本発明のベクターまたはレポータープラスミドを用いて、形質転換体を製造することができる。本発明は、かかる形質転換体を提供する。
【００４９】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌は、本発明のヌクレオチド、ベクターまたはレポータープラスミドを調製するためにもっぱら用いられ、その他の宿主は本発明のヌクレオチドの活性等を調べるために用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１、ＪＭ１０３、ＪＡ２２１、ＨＢ１０１、Ｃ６００などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−））、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００５０】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やGene，１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular ＆ General Genetics，１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Virology，５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
【００５１】
前記ベクターまたはレポータープラスミド（以下、「ベクター等」と略す場合がある）を導入することにより、トランスジェニック非ヒト動物を作出することができる。本発明は、かかるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００５２】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物には、前記ヌクレオチドおよび場合によってはレポーター遺伝子が対立遺伝子の両方に導入されたホモ接合動物、対立遺伝子の片方に導入されたヘテロ接合動物およびそれらの出生前の胎仔も含まれる。前記ホモ接合動物は、前記ヘテロ接合動物を交配することにより得られるものである。
【００５３】
用いられる非ヒト動物（本発明においては、単に動物と略す場合がある。）としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではない。好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜があげられるが、遺伝子工学的に利用が容易であるところから、マウスがより好ましい。
【００５４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、自体公知の方法により製造することができる。次に、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法について説明する。
【００５５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法により製造することができる。
（ａ）前記ベクター等を調製する工程；
（ｂ）前記ベクター等を受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；
（ｃ）前記動物から出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する工程；および
（ｄ）前記選別した動物（ファウンダー）から系統を樹立する工程。
【００５６】
前記工程（ａ）は、本発明のベクターまたはレポータープラスミドにおいて記載した通りである。得られたベクター等は、制限酵素等により線状化して工程（ｂ）に供することが好ましい。
【００５７】
前記工程（ｂ）において、前記ベクター等を受精卵に導入する方法は、例えば、交配後の雌の卵管を洗浄して受精卵を採取し、精子または卵子由来の前核にマイクロインジェクション法により前記ベクター等を直接注入する方法があげられる。この受精卵を偽妊娠させた仮親の輸卵管に移植し、子宮内で発生を続けさせる。
【００５８】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で移植した動物が出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する方法としては、例えば、注入したベクター等が染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かについて、産仔の尾部等より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンブロット法またはＰＣＲ法によりレポーター遺伝子の組み込みを確認する方法があげられる。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合、レポーター遺伝子が発現している生体の部位に紫外線等を照射して蛍光を調べることにより確認することができる。
【００５９】
前記工程（ｄ）において、工程（ｃ）で選別した動物（ファウンダー）から遺伝的背景の均一な系統を樹立する方法としては、ベクター等が組み込まれた動物とＣ５７ＢＬ／６、ＦＶＢ、ＢＡＬＢ／ｃなどの近交系の野生型動物とを戻し交配をする方法があげられる。
【００６０】
このようにして得られた本発明のトランスジェニック非ヒト動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞も本発明に含まれる。前記組織としては、すべての組織があげられ、例えば、脳、神経、骨髄、骨、筋肉、脂肪、心臓、肺、食道、胃、腸、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、血管、血球、臍帯、皮膚、感覚器官およびその前駆体、生殖組織、幹細胞などが好ましい。また、前記細胞としては、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株があげられる。
【００６１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のヌクレオチド（ＴＡＦ４ｂプロモーターに由来する塩基配列）によってレポータータンパク質の発現が調節されているものが好ましい。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、Ｍｙｃに感受性が高い状態で、様々な用途に利用することができる。好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、生体内で代謝された後の物質の生体中の各組織への影響を調べるものとして使用される。
【００６２】
本発明は、前記レポータープラスミドまたは前記形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤をスクリーニングする方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供する。
【００６３】
[スクリーニング方法Ｉ]
本発明のスクリーニング方法Ｉは、具体的には、下記工程を含む：
（ａ）レポータープラスミド導入細胞または形質転換体と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた細胞または形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量を調べ、被験物質を接触させない細胞または形質転換体における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、細胞増殖を調節しうる被験物質を選択する工程。
【００６４】
前記（ａ）において、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
【００６５】
被験物質と接触させる前に、レポータープラスミドの場合はレポーター遺伝子が発現できるように所望の細胞に一過性に導入し、形質転換体の場合は宿主に適した培地および培養条件で培養しておく。用いる細胞または宿主の種類は、好ましくは、ヒト子宮頚部癌細胞HeLa、ヒトクリオブラストーマ細胞T98G、大腸癌細胞SW620、HCT116などである。被験物質との接触方法としては、例えば、前記細胞または形質転換体を適当な培地中に入れ、約２５〜４０℃のインキュベーター中で生存または培養させ、次に、前記培地中に被験物質を添加し、インキュベートを続けることで接触がなされうる。
【００６６】
前記被験物質の添加量は、有効成分の種類、培地に対する溶解性、細胞または形質転換体の感受性等によって適宜設定することができる。
【００６７】
工程（ｂ）において、前記被験物質を接触させた細胞または形質転換体におけるレポーターの発現量は、各レポーター遺伝子に応じて自体公知の方法により調べることができる。例えば、蛍光タンパク質の場合、各蛍光タンパク質に応じた励起波長を照射して検出される蛍光を測定することにより行う方法などがあげられる。
【００６８】
前記工程（ｂ）において、被験物質を接触させない細胞または形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量も同時にまたは別途調べ、接触した場合の結果と接触しない場合の結果とを比較する。
【００６９】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、細胞増殖を調節しうる被験物質を選択する。選択する基準は、レポーターの発現が上昇または低下していることを指標にすればよい。レポーターの発現が上昇している場合、被験物質は、細胞増殖を促進させる作用を有する。レポーターの発現が低下している場合、被験物質は、細胞増殖を抑制させる作用を有する。
【００７０】
このようにして選択された被験物質は、Ｍｙｃと本発明のヌクレオチドとの結合に特異的に作用して、あるいはＭｙｃ発現量に影響して、あるいはＭｙｃによる転写制御機構に作用して機能する作用機序の明確な細胞増殖調節剤の候補となりうる。
【００７１】
[スクリーニング方法ＩＩ]
また、本発明は、本発明のレポータープラスミド、形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、妊娠調節剤をスクリーニングする方法（スクリーニング方法ＩＩ）を提供する。スクリーニング方法ＩＩは、下記工程：
（ａ）レポータープラスミド導入細胞、形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた細胞、形質転換体または動物におけるレポーターの発現量を調べ、被験物質を接触させない細胞、形質転換体または動物における発現量と比較する工程、および
（ｃ）前記比較結果に基づいて、妊娠調節剤の候補となる被験物質を選択する工程を含む。
スクリーニング方法ＩＩにおいて、レポータープラスミド導入細胞または形質転換体を用いる場合は、工程（ａ）および（ｂ）はスクリーニング方法Ｉと同様である。ここでは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いる場合について説明する。
【００７２】
工程（ａ）において、被験物質は、スクリーニング方法Ｉと同様のものがあげられる。
【００７３】
前記被験物質を本発明のトランスジェニック動物と接触させる方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内等の全身投与、または標的細胞付近への局所投与等があげられる。
【００７４】
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
【００７５】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物におけるレポーター遺伝子の発現量を調べる方法としては、各レポーター遺伝子に応じて自体公知の方法により行うことができる、例えば、蛍光タンパク質の場合、各蛍光タンパク質に応じた励起波長を照射して検出される蛍光を測定することにより行う方法などがあげられる。
【００７６】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与しない動物におけるレポーター遺伝子の発現量も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
【００７７】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、妊娠調節剤の候補となる被験物質を選択する。選択する基準は、レポーターの発現が上昇または低下していることを指標にすればよい。
【００７８】
このようにして選択された被験物質は、Ｍｙｃと本発明のヌクレオチドとの結合に特異的に作用して、、あるいはＭｙｃ発現量に影響して、あるいはＭｙｃによる転写制御機構に作用して機能する作用機序の明確な妊娠調節剤の候補となりうる。
【００７９】
また、本発明は、下記いずれかのペプチド：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からコードされるペプチド、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）前記（１）または（２）に記載のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチド
を有効成分として含有する、Ｍｙｃによる組織特異的発現の調節剤を提供する。前記調節剤は、妊娠の調節に用いられることが好ましい。
【００８０】
「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは２以上（好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、いっそう好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列であって、同質の活性を有するものである。
【００８１】
また、「実質的に同一のアミノ酸配列」として、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上、いっそうより好ましくは約９７％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を用いることもできる。同一性（％）は、前記塩基配列の同一性と同様に決定することができる。
【００８２】
「同質の活性」とは活性が定性的に同等であることを意味し、定量的にも同等であることが好ましいが、許容し得る範囲（例えば、約０．５〜約２倍）で異なっていてもよい。ここでＴＡＦ４ｂの活性としては、ＴＢＰまたはＴＡＦｓ(TBP associated factors)との結合があげられる。
【００８３】
また、本発明は、下記：
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において２１０位〜２１６位のＴＡＴＡボックスおよび２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号５に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するサルＴＡＦ４ｂプロモーターを提供する。
【００８４】
ここで「実質的に同一」とは、２１０〜２１６位のＴＡＴＡボックスと２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフとがプロモーターの構成要素として機能する限り、それ以外の塩基配列は特に限定されないことを意味する。「実質的に同一」か否かの判断は、後述するレポーターアッセイによる前記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列との間のレポーターの発現量を比較し、同程度の発現量であることを指標にすればよい。
【００８５】
また、本発明は、下記：
（ａ）配列番号６に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において７７８位〜７８４位のＴＡＴＡボックスおよび７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号６に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するラットＴＡＦ４ｂプロモーターを提供する。
【００８６】
ここで「実質的に同一」とは、７７８〜７８４位のＴＡＴＡボックスと７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフとがプロモーターの構成要素として機能する限り、それ以外の塩基配列は特に限定されないことを意味する。「実質的に同一」か否かの判断は、後述するレポーターアッセイによる前記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列との間のレポーターの発現量を比較し、同程度の発現量であることを指標にすればよい。
【実施例】
【００８７】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８８】
細胞培養
ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ細胞、およびその派生体であり、ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を発現するＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞（Tsuneoka M. et al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）を、非必須アミノ酸および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグル培地中で培養した。ｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を発現するラット線維芽細胞株３Ｙ１の派生体、３Ｙ１ＭｙｃＥＲ（Tsuneoka M. et al., Oncogene 14:2301-2311 (1997)）およびアフリカミドリサルの腎線維芽細胞株Ｃｏｓ−７を、１０％ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞を、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ラット大腸がん細胞株ＲＣＮ−９（理研細胞バンク）およびヒト赤白血病細胞株ＨＥＬ（ヘルスサイエンスリサーチ資源バンク製）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
【００８９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲ増幅は、各プライマーを１０pmoles、ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１．２Ｕ、およびｄＮＴＰを２００μＭ含む５０μｌ ＥＸ Ｔａｑバッファー（タカラバイオ製）中で行った。
【００９０】
５’−ＲＡＣＥ法による解析
ＨＥＬ細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）からの逆転写反応、二本鎖ｃＤＮＡ合成、およびアダプターライゲーションは、マラソン（Marathon）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社製）を用いて行った（Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)，Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 280:19977-19985 (2005)）。第１ＰＣＲは、プライマーとして、AA287145-1st（５’−TTCTTATGCCTCTTCCTTTCTCCTG−３’（配列番号７）、ＥＳＴクローンAA287145の５’末端領域の配列）、および供給者によって提供されたＡＰ１プライマーを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の最初の熱変性後、９６℃で１５秒間の熱変性工程ならびに６８℃で３分間のアニーリング工程および伸張工程を１サイクルとする２５サイクルであった。上記第１ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を１０００倍希釈した液１μｌをネストＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型として使用した。ネストＲＡＣＥ−ＰＣＲは、AA287145ネストプライマー（5’−TTGGCAAATGAGGCAGGTAGTAACA−3’（配列番号８）、ＥＳＴクローンAA287145のAA287145-1stの上流領域配列に対応するもの）と、供給者によって提供されたＡＰ２プライマーとを使用して行った。温度プロファイルは、９４℃で１分間の最初の熱変性後、９６℃で１５秒間の熱変性工程ならびに６８℃で３分間のアニーリング工程および伸張工程を１サイクルとする２５サイクルであった。増幅したＤＮＡ断片をpGEM-Tベクター（Promega社製）にクローニング（pT/fragmentTAF4b）し、シークエンスした。シークエンスの結果、AA287145はＴＡＦ４ｂ遺伝子の３’−ＵＴＲの一部であることが確認された。
【００９１】
ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの５’末端に関する情報を得るために、５’−ＲＡＣＥ増幅が上述のように実施された。ここでは、プライマーとして、ＴＡＦ４ｂＲＡＣＥ−１（5’−GGTCTCGGCTCTTGTTACAGTTTGCTG−3’（配列番号９）、文献（Dikstein R. et. al., Cell 87:137-146 (1996)）において以前に報告したＴＡＦ４ｂ ｃＤＮＡの５’末端領域の配列）と第１ＰＣＲ用に供給者によって提供されたＡＰ１プライマー、ＴＡＦ４ｂＲＡＣＥ−２プライマー（5’−GGATTGTCGTGGTGTTGGGGGCTTTCA−3’（配列番号１０）、ＴＡＦ４ｂＲＡＣＥ−１の上流領域の配列に対応するもの）およびネストＰＣＲ用に供給者によって提供されたＡＰ２プライマーを使用した。増幅したＤＮＡ断片をpGEM-Tベクター（Promega社製）にクローニングし、シークエンスした。
【００９２】
逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＨＥＬ細胞の一本鎖ｃＤＮＡの合成は、スーパースクリプト（Superscript）First-strand Synthesis system（インビトロジェン製）を使用して、全ＲＮＡ（１μｇ）で行った。得られた一本鎖ｃＤＮＡ１μｌ（全量２０μｌ）をＰＣＲの鋳型として使用した。増幅用のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、
ＴＡＦ４ｂコードＵ（5’−CGGAATTCGAAGCTGCGAGAGGTCGGGCGGGTGTCG−3’（配列番号１１）、５’非翻訳領域にＥｃｏＲＩ部位を付加した配列）、および、
ＴＡＦ４ｂコードＬ（5’−CGGAATTCGGCAGTAAATAGCAAGGATGTGGATGGA−3’（配列番号１２）、 ３’非翻訳領域にＥｃｏＲＩ部位を付加した配列）であった。温度プロファイルは、９８℃での１５秒間の熱変性工程と、６５℃での１分間のアニーリング工程および７２℃での２分３０秒間の伸張工程を１サイクルとして３５サイクルであった。増幅したＤＮＡ断片をpGEM-Tベクター（プロメガ社製）にクローニングしてｐＴ／ＴＡＦ４ｂを作製し、その配列を決定した。当該配列は、増幅された断片を使用してダイレクトシークエンスによって確認された。
【００９３】
ＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡ断片を有するレポータープラスミド
ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡ断片は、プロモーター領域からエキソン１（exon 1）へと伸長しており、プライマー
5’−TTTTACCATAACCTCACTTGCTGGAAGGGG−3’（配列番号１３）、および、
5’−TGTTGGGGGCTTTCACGGCGACTATCTG−3’（配列番号１４）
を使用したＰＣＲによって増幅した。２．２ｋｂの増幅された断片を、ＳａｃＩおよびＮｃｏＩで切断し、ＳａｃＩとＮｃｏＩで切断したホタルルシフェラーゼを含むｐＧＬ３（Promega社製）の４．８ｋｂ断片に挿入し、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉを作製した。ＳｍａＩとＮｃｏＩで切断したｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉの０．６ｋｂの断片を、ＳｍａＩとＮｃｏＩで切断したｐＧＬ３の４．８ｋｐの断片に挿入し、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉを作製した。ＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断したｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉの０．６ｋｐの断片を、ＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断したｐＧＬ３の４．８ｋｐの断片に挿入し、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＸｈｏ）ｌｕｃｉを作製した。ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉを、ＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断した後、Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲートして、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｘｈｏ）ｌｕｃｉを作製した。また、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉを、ＰｖｕＩＩとＮｃｏＩで切断した後、Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲートして、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを作製した。
【００９４】
さらに、欠失変異体ｐＴＡＦ４ｂ（１１７Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１１４Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１０２Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（７３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉおよびｐＴＡＦ４ｂ（４３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを、鋳型としてｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを使用し、適当なプライマーを用いたＰＣＲ、および、その後に行われるｐＧＬ３ベクターへの増幅断片の導入によって作製した。
【００９５】
突然変異は、Gene EditorTMインビトロ部位指向突然変異システム（プロメガ社製）を用いて、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉのＥ−ボックス部位に導入し、２つのＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧエレメント）がＣＡＣＣＴＧに変異したｐＴＡＦ４ｂ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉを作製した。また、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉの非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス部位にも突然変異を導入し、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１／２）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１）ｌｕｃｉおよびｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ２）ｌｕｃｉを作製した。これにより、１または２個のＮＣＥ−ボックス（CGCGTGエレメント）がCGCCTGに変異した。ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉにおける非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス部位２（ＮＣＥ−ｂｏｘ２）を、CACGTGに変異させ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ＣａｎｏＥ２）ｌｕｃｉを作製した。作製されたプラスミドのＤＮＡ配列は、シークエンスによって確認した。
【００９６】
ラットおよびサルのＴＡＦ４ｂプロモーターの配列
ラットＴＡＦ４ｂプロモーターの１．２ｋｐ断片を、以下のようにして単離した。
まず、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子について、マウスのＤＮＡ配列のホモログを選択した（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＫ０１２１３５）。マウスのＤＮＡ配列においては、ヒトＴＡＦ４ｂのゲノム配列に正確に適合するヌクレオチド配列として２つの領域を選択し、以下のオリゴヌクレオチド、
ラットＴＡＦＩＩ−Ｆ（5’−GCGCACGTGTGAGCGCCGCTGAGG−3’（配列番号１５））、および、ラットＴＡＦＩＩＰＦ−１（5’−CTGACAGGAGCCTTAGTCAC−3’（配列番号１６））を合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、ラット結腸癌細胞ＲＣＮ−９ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ラットＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をシークエンスし、この配列の上流領域を、promoter find kit（クロンテック社製）によってさらにクローニングした。なお、このクローニングには、鋳型としてＤｒａＩおよびＳｓｐＩライブラリーが用いられ、プライマーとして
ラットＴＡＦＩＩＰＦ３（5’−GCCGGGGCGGGCGGCAGGAGACTCG−3’（配列番号１７））およびＴＡＦＩＩＰＦ４（5’−CGGGCACTCCCTCAGCGGCGCTCAC−3’（配列番号１８））（これらの配列は、先に確認されたラットのＴＡＦ４ｂＤＮＡ配列内のもの）、ならびにＡＰ１およびＡＰ２が使用された。増幅されたラットのＴＡＦ４ｂゲノム断片を、シークエンスした。
サルＴＡＦ４ｂプロモーターを、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子と適合するＴＡＦ−プライマー１（5’−GACACAAGGAGAGGAACACGGATGC−3’（配列番号１９））、およびＴＡＦ−プライマー２（5’−GCCTGGGCTGCCCCCGGAGCGACAC−3’（配列番号２０））をプライマーとし、Ｃｏｓ−７細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して増幅した後、シークエンスした。
【００９７】
その他のプラスミド
ＣＭＶプロモーターの制御条件下のウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla reniformis luciferase）遺伝子を含むｐＲＬ−ＣＭＶを、Promega社から購入した。ＣＭＶ−ｃ−Ｍｙｃ、ｐＣＭＶ−ＵＳＦ、およびｐＣＭＶ−ＴＦＥ−３は、Martin Eilers博士から供与された（Desbarats L. et. al., Genes Dev. 10:447-460 (1996)）。組換え型のＧＦＰ−ＵＳＦおよびＧＦＰ−ＴＦＥ３を作製するために、ｐＣＭＶ−ＵＳＦおよびｐＣＭＶ−ＴＦＥ−３を鋳型としてＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマーとしては、
5’−GGCGGATCCAGATGAAGGGGCAGCAGAAAAC−3’（配列番号２１） (USF-BamHI-5’)、および、
5’−CGGGAATTCCCCATAGTTAGTTGCTGTC−3’（配列番号２２） (USF-EcoRI-3’)、
あるいは、5’−GCCGGATCCATGGCGCTGCTCACCATCGG−3’（配列番号２３） (TFE3-BamHI-5’)、および、5’−CGGCTCGAGGGTTCATGGGGAAGGGGCAG−3’（配列番号２４） (TFE3-XhoI-3’)を使用した。次いで、得られた断片を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ、またはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した細菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ３にそれぞれ導入し、ｐＧＥＸ−ＵＳＦまたはｐＧＥＸ−ＴＦＥ−３を作製した。
【００９８】
ＲＮＡ調製
全ＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理されたＲＮＡ調製液セット（ナカライテスク社製）を用いて、酸グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法によって細胞から単離した。
【００９９】
ＤＮＡチップを使用した示差ディスプレイ解析（ｃＤＮＡマイクロアレイ）
ｃＤＮＡマイクロアレイは、文献（Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）で説明した方法によって実施した。全ＲＮＡを、未処理のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞および４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）で２０時間処理した細胞から単離した。ｐｏｌｙ(Ａ＋）ＲＮＡを回収し、ＤＮＡチップ（インサイト社製）を利用した示差ディスプレイ解析に供した。発現遺伝子配列タグ（ＥＳＴ）クローンを含む約９０００種のｃＤＮＡがチップ上に搭載された（UniGEM Human V Ver. 2）。
【０１００】
ノーザンブロット解析およびプローブＤＮＡの調製
ＲＮＡは、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンドＮ（アマシャム社製）に転写し、32Ｐ標識した各ｃＤＮＡプローブで検出した。各プローブは、市販のMultiprimeラベリングキット（アマシャム社製）を用いて[α−32Ｐ]ｄＣＴＰで標識した。結果はＢＡＳ２０００イメージアナライザー（富士フィルム社製）を用いて定量した。ｃ−ｍｙｃ用のＤＮＡプローブは、文献（Tsuneoka M. et. al., Oncogene 14:2301-2311 (1997)）に示すものであった。ＴＡＦ４ｂ用のＤＮＡプローブは、pT/fragmentTAF4b由来の０．６ｋｐのＳａｃＩ断片であった。
【０１０１】
一過性発現解析
Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞における一過性発現レポーター解析を、文献（Tsuneoka M. et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）に説明する方法で行った。
ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＭｙｃおよびその他の転写因子の影響を、当該転写因子をコードしているプラスミドの転写によって調べた。Ｔ９８Ｇ細胞を、１０％ＦＣＳを含む培地で生育させた。細胞（３×１０４個）を培養皿（１２ウエルのプレート、ウエルの径は２２ｍｍ）に入れ、２０〜２４時間培養した。１μｇのレポータープラスミド、インターナルマーカーとして２０ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、および転写因子を発現する様々な量のプラスミドをFuGENE6試薬（ロシュ・ダイアグノステイックス社製）を用いて細胞に導入し、トランスフェクションを行った。各トランスフェクションにおける全ＤＮＡ量は、空の発現ベクターを加えることによって一定に維持した。一日経過後、細胞を集め、ルシフェラーゼ活性を文献（Tsuneoka M. et. al., Oncogene 14:2301-2311 (1997)）に示す方法によって測定した。
【０１０２】
クロマチン免疫沈降実験
クロマチン免疫沈降実験は、基本的に文献（Tsuneoka, M., et. al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459(2002)）に示す方法と同様に実施した。免疫沈降したＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって検出した。使用したＰＣＲプライマーは、
5’−GACACAAGGAGAGGAACACGGATGC−3’（配列番号２５） (TAF4b-primer 1)、
および、5’−GCCTGGGCTGCCCCCGGAGCGACAC−3’ （配列番号２６）(TAF4b-primer 2)である。これらは、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子のプライマー（TAF4b primers）の転写開始部位を含む５２１ｂｐ断片を増幅するプライマーである。
また、他のＰＣＲプライマーとして、
5’−TTACAGGTAAGCCCTCCAATGACC−3’（配列番号２７）、
および、5’−GCAAAGCTACCATTTAGGAACCC−3’（配列番号２８）を使用した。これらは、第２２番染色体中のＥ−ボックスを含む領域のゲノム配列を増幅するプライマーである（control primers）。このＥ−ボックスは検出可能な遺伝子を有しない染色体中に位置している（Bouchard, C., et. al., Genes Dev. 15:2042-2047.(2001)）。
【０１０３】
抗体
ｃ−Ｍｙｃに対する抗体−１は、文献（Tsuneoka, M., et. al., Oncogene 14:2301-2311.(1997)）に記載されたものである。抗ｃ−Ｍｙｃ抗体−２（Ｎ２６２）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、抗Ｍａｘ抗体（Oncogene Science）、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｃ−８）（Santa Cruz Biotechnology）、抗ＴＦＥ３ヤギ抗体（ｓｃ−５９５８）（Santa Cruz Biotechnology）、および、抗ＵＳＦ−１ウサギ抗体（ｓｃ−２２９）（Santa Cruz Biotechnology）は、購入した。
【０１０４】
ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイは、本質的には文献（Tsuneoka, M., et. al., Oncogene 14:2301-2311(1997)）に示す方法で行った。組換え型ＧＳＴ−ＭｙｃおよびＧＳＴ−Ｍａｘを混合し、室温で３０分間インキュベートした。混合物を、ヒトＴＡＦ４ｂプロモーターの合成二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合について解析した。二本鎖オリゴヌクレオチドＣａｎｏＥは、ＴＡＦ４ｂプロモーターＣＧＣＧＴＧ（ＮＣＥ−ｂｏｘ２）の代わりにＣＡＣＧＴＧエレメントを含んでいるが、合成オリゴヌクレオチド
5’−GCGTGCGCGAGGTCTCCACGTGGCTATATAAACATGG−3’（配列番号２９）、
および、5’−GCCAGCCATGTTTATATAGCCACGTGGAGACCTCG−3’（配列番号３０）
のアニーリングによって作製された。ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドは、Klenow酵素を使用して[32Ｐ]ｄＣＴＰで標識した。
２０μｌの結合反応溶液内の最終状態は、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド：１ｎｇ、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Pharmacia Biotech社製）：１μｇ、非特異的一本鎖オリゴヌクレオチド（5’−GAGTCGACGAACACACCAGGTCTTGGAGCG−3’（配列番号３１））：１μｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：９８．５ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣｌ）：２．１ｍＭ、リン酸ナトリウム：４．８ｍＭ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）：２ｍＭ、ＥＤＴＡ：０．１ｍＭ、グリセロール：１％であった。
反応を進行させるために、反応混合液を室温で２０分間放置した。抗Ｍａｘ（Oncogene Science）、非特異的抗体または抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｃ−８）（Santa Cruz Biotechnology）をＤＮＡ結合反応中に加え、抗体解析を行った。標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドＣａｎｏＥ、標識されていない二本鎖オリゴヌクレオチドｎｏｎ−ＣａｎｏＥ（野生型：5’−GCGTGCGCGAGGTCTCCGCGTGGCTATATAAACATGG−3’（配列番号３２）と、
5’−GCCAGCCATGTTTATATAGCCACGCGGAGACCTCG−3’（配列番号３３）とのアニーリングによって作製されたもの）、および、
ｍＥ（5’−GCGTGCGCGAGGTCTCCGCCTGGCTATATAAACATGG−3’（配列番号３４）と5’−GCCAGCCATGTTTATATAGCCAGGCGGAGACCTCG−3’（配列番号３５）とのアニーリングによって作製されたもの）は、competitorとして使用された。
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼフュージョンＵＳＦおよびＴＦＥ３タンパク質を、E. coli Rosetta(Novagen Inc. Cat# 70953-4)中のｐＧＥＸ−ＵＳＦあるいはｐＧＥＸ−ＴＦＥ３を用いて発現させ、グルタチオンセファロースカラム（Amersham Biosciences）で単離した。ゲルシフトアッセイを、ｃ−Ｍｙｃの場合と同様の方法で、ＵＳＦおよびＴＦＥ３について実施した。
【０１０５】
（結果）
ｃ−Ｍｙｃは、ＴＡＦ４ｂの発現を誘導する。
条件付でｃ−Ｍｙｃ活性を誘導するために、エストロゲン誘発性Ｍｙｃシステム（Eilers M. et. al., Nature 340:66-68(1989)，Tsuneoka M. et.al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)参照）を使用した。キメラタンパク質ｃ−ＭｙｃＥＲは、ヒトｃ−Ｍｙｃおよびヒトエストロゲン受容体のエストロゲン結合ドメインから構成されており、エストロゲンの非存在下では細胞骨格成分に結合している。このキメラタンパク質にエストロゲンまたはその類似体４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）が結合すると、細胞骨格成分から遊離し、ｃ−Ｍｙｃとして機能する。ヒト膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇを、異所性ｃ−Ｍｙｃ活性が導入される親細胞として使用した。ｃ−ＭｙｃＥＲタンパク質を発現するＴ９８Ｇ細胞株（Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞）が確立された（Tsuneoka M. et.al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）。ＯＨＴの存在下あるいは非存在下における指数増殖期の２０時間のＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞由来の全ＲＮＡを、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析に供した。Ｍｙｃ標的遺伝子であるオルニチンデカルボキシラーゼ（Bello-Fernandez C. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:7804-7808 (1993)）、ヌクレオリン（Greasley P. J. et. al., Nucleic Acids Res. 28:446-453 (2000)）、およびmina53（Tsuneoka M. et.al., J. Biol. Chem. 277:35450-35459 (2002)）に対する特異的シグナルは、ｃ−ＭｙｃＥＲの活性化によって、それぞれ２．６倍、１．６倍、１．９倍に上昇した。これらの結果は、Ｍｙｃ標的遺伝子がこの実験システムにおいて検出されうるということを示唆している。
【０１０６】
本発明者は、ＥＳＴクローンＡＡ２８７１４５に対するシグナルが、ｃ−Ｍｙｃの活性化によって２．３倍に刺激されるということを見出した。ＥＳＴクローンＡＡ２８７１４５の５’上流領域をコードするｃＤＮＡは、ヒト赤白血病ＨＥＬ細胞ライブラリーから５’−ＲＡＣＥプロトコールを用いて単離した。そして、ＡＡ２８７１４５は、ＴＡＦ４ｂ遺伝子（Dikstein, R., et. al., Cell 87:137-146 (1996)）においてはＴＡＦＩＩ１０５と呼ばれるもの）の３’非コード領域の一部であることが確認された。ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子の翻訳および転写開始部位は以前に報告されていなかったため、本発明者らは、５’−ＲＡＣＥ実験によって転写物の５’末端をコードするｃＤＮＡを単離した。転写開始部位をＴＡＦ４ｂゲノム配列上にマップした。この部位は、図１Ａにおいて矢印を付して示している。ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの５’および３’配列と一致するプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに基づいてＨＥＬ細胞の全ＲＮＡから３．２ｋｂ長のｃＤＮＡを増幅し、シークエンスした。全体のヌクレオチド配列は文献（Dikstein, R., et. al., Cell 87:137-146.(1996)）において報告したものとほぼ同じであったが、既に報告しているＴＡＦ４ｂのＮ末端のアミノ酸Ｇｌｙの先に６６個のアミノ酸配列が付加されていること（図１Ａ参照）、および、いくつかのアミノ酸が異なっていることが確認された（当該配列は、ジーンバンク（Ｇｅｎ／Ｂａｎｋ）にアクセッション番号ＡＢ２３４０９６として登録されている。）。当該ｃＤＮＡクローンは、８６２アミノ酸からなり、推定分子量９１０９０．５２Ｄａ、等電点９．５９のタンパク質をコードしている。
【０１０７】
ＴＡＦ４ｂ ｍＲＮＡの発現
ヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞を、ＴＰＡ（phorbol 12-myristate 13-acetate）によって末期に分化させると、一時的に刺激された後（Vass, J. K., et al., Differentiation 45:49-54 (1990)参照）にｃ−ｍｙｃの発現量が減少する（Hickstein, D. D., et. al., J. Biol. Chem. 264:21812-21817 (1989)、Hozumi, M., Adv. Cancer Res. 38:121-169 (1983)参照）。この実験システムを用いて、Ｍｙｃ標的遺伝子がＭｙｃの遮断中に影響されるか否かを調べた（Coller, H. A., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:3260-3265.(2000)、Grandori, C., et. al., EMBO J 15:4344-4357.(1996)参照）。図２Ａに示すように、ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡのレベルは、ＴＰＡを添加した後１時間で２倍に増加した後、３時間後に減少し始め、７時間後には１／５に減少した。ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡのレベルは、ＴＰＡを添加した後３時間で１．５倍に上昇した後、６時間後に減少し始め、９時間後に１／１０に減少した。これらの結果は、ＴＡＦ４ｂ発現がｃ−ｍｙｃ発現の後に起こることを示している。
【０１０８】
次に、ＭｙｃＥＲシステムを用いて、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡに対するｃ−Ｍｙｃ活性化の影響を調べた（図２Ｂ参照）。ＯＨＴ処理されたＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞において、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡのレベルは、３時間で２倍、７時間で３倍にそれぞれ上昇した。Ｔ９８Ｇ親細胞のＯＨＴ処理は、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡのレベルを刺激しなかった。図２Ｃに示すように、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞におけるＯＨＴによるＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの誘導は、タンパク質合成阻害剤シクロへキシミドの存在下で維持された。シキロヘキシミドによる処理は、Ｔ９８Ｇ親細胞において、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルにほとんど影響を及ぼさなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＴＡＦ４ｂ遺伝子がＭｙｃの直接の標的となっていることを示すものである。
【０１０９】
ｃ−ＭｙｃはインビボでＴＡＦ４ｂプロモーターの領域に結合する
ＨＬ６０細胞の増殖中において、生体内での内因性ＴＡＦ４ｂ遺伝子に結合するｃ−Ｍｙｃタンパク質を調べるために、クロマチン免疫沈降を前述した方法（Boyd, K. E., et. al., Mol. Cell. Biol. 17:2529-2537.(1997)，Boyd, K. E., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95:13887-13892.(1998)参照）により行った。免疫沈降後、各サンプルにおける内因性ＴＡＦ４ｂ遺伝子断片の強化を、ＴＡＦ４ｂ遺伝子における転写開始部位周辺のＤＮＡを特異的に増幅させるプライマーを用いたＰＣＲによってモニターした。図１Ｂに示すように、２つの異なる抗ｃ−Ｍｙｃ抗体が、増殖期のＨＬ６０細胞由来のＴＡＦ４ｂＤＮＡ断片を免疫沈降した。一方、ＴＰＡ処理された細胞からは、同じ抗体は検出可能なレベルのＤＮＡ断片を免疫沈降しなかった。なお、ＴＰＡ処理された場合、ｃ−ｍｙｃの発現は非常に低くなった。非特異的抗体はＴＡＦ４ｂ遺伝子断片を免疫沈降しないため、ＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡ断片の強化は、ＴＡＦ４ｂ遺伝子に結合するｃ−Ｍｙｃに依存する。さらに、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体は、第２２番染色体において検出可能な遺伝子を有さない染色体領域に位置するＥ−ボックスを含むゲノムＤＮＡ断片を強化しないため、ＴＡＦ４ｂ遺伝子において検出されるｃ−Ｍｙｃの結合は特異的であるといえる。これらの結果から、転写開始部位周辺のＴＡＦ４ｂ遺伝子が、ＨＬ６０細胞の増殖期で、特異的にｃ−Ｍｙｃに結合していることがわかる。
【０１１０】
ｃ−Ｍｙｃは、非基準型Ｅ−ボックス（ＣＧＣＧＴＧ）エレメントを介してＴＡＦ４ｂプロモーターを活性化する。
ｃ−ＭｙｃがどのＤＮＡエレメントを介してＴＡＦ４ｂの発現を制御するかを確認するために、ヒトＴＡＦ４ｂ遺伝子のプロモーター領域を単離した。図１Ａでは、最初のＡＴＧにおける“Ａ”を「＋１」とした（星印で示す）。転写開始部位は−４６０ｂｐであった。この位置は、５’−ＲＡＣＥによって決定し、図１Ａにおいては矢じりで示した。ＴＡＴＡボックスの配列は、転写開始部位の約３０ｂｐ上流付近で見つかった。
ＴＡＦ４ｂプロモーターの活性を調べるために、エキソン１の上流領域からエキソン１の一部にかけての１．６ｋｐ領域を含むゲノムＤＮＡ断片を、ホタルルシフェラーゼｃＤＮＡに結合して、レポータープラスミドｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉを構築した（図３Ａ参照）。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞における一過性発現解析により、前記ＤＮＡ断片がプロモーター活性を有することが示された。ＯＨＴによってｃ−ＭｙｃＥＲを活性化した後、ルシフェラーゼ活性が２．５倍にまで上昇した（図３Ａ）。この刺激は、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞においてＯＨＴにより増加したＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルの増加で観察されたものに匹敵する（図２Ｂ参照）。
【０１１１】
転写開始部位付近には、２つの基準型Ｅ−ボックス部位（ＣＡＣＧＴＧエレメント）が存在する。この第１および第２のＣＡＣＧＴＧエレメントを、Ｅ−ボックス１、Ｅ−ボックス２とそれぞれ命名した。ＣＡＣＧＴＧエレメントは、多くのＭｙｃ標的遺伝子においてＭｙｃ応答エレメントとして機能することが報告されていたため、当該Ｅ−ボックス部位がｃ−Ｍｙｃによってプロモーターの活性化に関与するか否かを調べた。しかしながら、Ｅ−ボックス１およびＥ−ボックス２が変異した場合でも、ルシフェラーゼ活性は野生型レポータープラスミドと同様にＭｙｃによって依然として増加した（図３ＡのｐＴＡＦ４ｂ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉ）。
【０１１２】
次に、Ｍｙｃ刺激に応答可能なプロモーター領域を、欠失変異株を用いて調べた（図３Ａ参照）。−１５７５番目から−５３５番目までの領域の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃによるプロモーターの刺激を減少させなかったが、−１５７５番目から−３６７番目までのＤＮＡ断片の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＸｈｏ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃ刺激を消滅させた。この結果から、−５３４番目から−３６７番目までの領域が重要であることが示唆される。続いて、２つの追加レポーターを構成した。このレポーターは、−５３４番目から−３６０番目までの配列を含むもの（ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｘｈｏ）ｌｕｃｉ）と、−５３４番目から−３７７番目までの配列を含むもの（ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）であった。これら２つのレポーターの発現は、Ｍｙｃによって十分刺激された。
【０１１３】
応答部位を見つけるために、レポーター（ｐＴＡＦ４b（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）におけるＤＮＡ断片をさらに短くした（図３Ｂ参照）。−５３４番目と−４９２番目との間の領域の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（１１７Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃによる上昇にほとんど影響を及ぼさないが、−５３４番目と−４９０番目との間の欠失（ｐＴＡＦ４ｂ（１１４Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）は、Ｍｙｃによる上昇を消滅させた。さらに多くの部位を欠失させたレポーター（ｐＴＡＦ４ｂ（１０２Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（７３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（４３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ）による発現も、Ｍｙｃによって上昇しなかった。これらの結果は、−４９２番目から−４９０番目までの領域の重要性を示すものである。
【０１１４】
−４９２番目から−４９０番目までの領域は、非基準型Ｅ−ボックスエレメントＣＧＣＧＴＧ（図１Ａの−４９２番目から−４８７番目）内に存在した。ＣＧＣＧＴＧエレメントが、Ｍｙｃ応答エレメントであるということはほとんど実証されていないが、ｃ−Ｍｙｃがこのエレメントに結合しうるということは文献（Grandori, C., et. al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:653-699 (2000)）に報告されている。そこで我々は、ＣＧＣＧＴＧエレメントがＭｙｃの活性化に関与するか否かを実験した。ＴＡＴＡボックス配列のすぐ近くには２つのＣＧＣＧＴＧエレメントが存在する（図１Ａおよび３Ｃ）。我々は、第１および第２のＣＧＣＧＴＧエレメントを、それぞれ非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス１（−５０９番目から−５０４番目）、ＮＣＥ−ボックス２（−４９２番目から−４８７番目）と命名した。我々は、レポータープラスミドｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ、ｍＮＣＥ１）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ、ｍＮＣＥ２）ｌｕｃｉおよびｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ、ｍＮＣＥ１／２）ｌｕｃｉを作製した。これらのプラスミドにおいて、１個または２個のＣＧＣＧＴＧをＣＧＣＣＴＧに変異させた（図３Ｃ）。ＮＣＥ−ボックス１の変異は、ｃ−Ｍｙｃによるプロモーター活性の刺激にほとんど影響を及ぼさないが、ＮＣＥ−ボックス２を変異させた場合、あるいは、ＮＣＥ−ボックス１およびＮＣＥ−ボックス２をともに変異させた場合には、Ｍｙｃ刺激をかなり減少させた（図３Ｃ参照）。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃがＮＣＥ−ボックス２を介してＴＡＦ４ｂプロモーターをトランス活性化させることを示唆する。
【０１１５】
ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＣＧＣＧＴＧエレメントは、哺乳類の進化の過程で保存されている。
ｃ−Ｍｙｃが他の種においてＴＡＦ４ｂの発現を刺激するか否かを調べるために、ラットの細胞でＴＡＦ４ｂの発現に対するｃ−Ｍｙｃの影響を調べた。図４Ａに示すように、ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を発現するラット３Ｙ１線維芽細胞（Tsuneoka M. et. al., Oncogene 14:2301-2311(1997)）において、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルは、ＯＨＴによって３倍まで上昇した。この誘導は、タンパク質合成阻害剤シクロへキシミドの存在下で維持された。ＴＡＦ４ｂはラットにおいてもＭｙｃ標的遺伝子であるということが、この結果から示唆される。
【０１１６】
我々は、プロモーター領域を含むラットＴＡＦ４ｂゲノムＤＮＡの１．２ｋｐ断片を単離し、この断片についてシークエンスした。図４ｂは、ヒトおよびラットＴＡＦ４ｂプロモーター領域間のヌクレオチド配列の相違を示している。１０ｂｐ間隔においた１００ｂｐのウインドウをスライドさせたり、重ねたりした際のヌクレオチドの相違数の平均を用いて、ヌクレオチド多様性を算出した。この解析において、挿入／欠失（indel）を一重変異として扱った。ヌクレオチド多様性の最小値、すなわち最大の相同性は、ＮＣＥ−ボックス２（位置７９２）の周囲で観察された。低レベルのヌクレオチド多様性は、位置１０００の周辺でも観察された。これは、上記の位置では、実際より小さく見積もられるヌクレオチド多様性を引き起こす大きな挿入／欠失（indel）がいくつか存在するという事実に起因するものである。ヒトＴＡＦ４ｂプロモーター配列を、そのＤＮＡ配列がアクセッション番号ＡＣ１３３１７２．４として最近ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されたマウスのＴＡＦ４ｂプロモーター配列と比較すると、似たような結果が得られた（データ示さず）。
【０１１７】
我々は、アフリカミドリサルの腎臓の線維芽細胞Ｃｏｓ−７からサルＴＡＦ４ｂプロモーターのＤＮＡ断片を単離し、それをシークエンスした。ヒト、サル、ラット、およびマウスのＮＣＥ−ボックス２周辺のヌクレオチド配列を、図４Ｃにおいて比較する。ＮＣＥ−ボックス２およびＴＡＴＡボックスエレメントを含む２８ｂｐの配列が４つの種において完全に保存されていた。
【０１１８】
ＣＧＣＧＴＧおよびＣＡＣＧＴＧエレメントは、異なる優先度でＥ−ボックス結合転写因子に応答する。
非基準型Ｅ−ボックス配列の保存は、生理学的な意義を有している可能性がある。ＮＣＥ−ボックス２（ＣＧＣＧＴＧ）が基準型Ｅ−ボックスに変異した場合、プロモーター活性はｃ−Ｍｙｃによって刺激され、野生型プロモーターの活性よりも上昇する（図５Ａ参照）。
次に、Ｍｙｃの基準型Ｅ−ボックスおよび非基準型Ｅ−ボックスに対する結合活性を調べた。ＴＡＦ４ｂプロモーターの場合においてＮＣＥ−ボックス２の位置に基準型Ｅ−ボックスを含んでいる、放射標識されたＣａｎｏＥヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイにおいて、ＭｙｃとＭａｘとの結合はシフトしたバンドを生成した（図６Ａ、レーン２参照）。このバンドは抗ｃ−Ｍｙｃ抗体または抗Ｍａｘ抗体の存在下において減少し、スーパーシフトした（図６Ａ、レーン１およびレーン３参照）。標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドを過剰に添加した場合、シフトしたバンドの強度は減少した。一方、ＣＡＣＧＴＧがＣＧＣＣＴＧに変異した非標識のｍＥオリゴヌクレオチドを過剰に添加することによっては、バンドの強度はほとんど影響されなかった。この結果は、ｃ−ＭｙｃおよびＭａｘが、オリゴヌクレオチド内のＣＡＣＧＴＧエレメントを特異的に認識することを示すものである。スキャッチャードプロット解析（図６Ｃ）によって解離定数を計算すると、２４ｎＭであった。
【０１１９】
基準型Ｅ−ボックス部位に対するＭｙｃ−Ｍａｘのアフィニティを、非基準型Ｅ−ボックス部位に対するＭｙｃ−Ｍａｘのアフィニティと比較するために、標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドまたはｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（野生型Ｅ−ボックスＣＧＣＧＴＧを有する）が、反応混合物に対して過剰に加えられた。図５Ｄは、標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドと比較して、約３０倍以上の標識されていないｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドが、標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドおよびＭｙｃ−Ｍａｘによって生成される特異的シグナルを５０％に減少させるために必要であったことを示す。これらの結果から、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、Ｍｙｃ−Ｍａｘは、ＣＡＣＧＴＧエレメントよりもＣＧＣＧＴＧエレメントに弱く結合することが示唆される。この弱い結合活性によって、Ｍｙｃによる野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターの活性は緩やかに上昇すると思われる。
【０１２０】
ｍｙｃプロトオンコジーンファミリーのタンパク質以外にも、ＵＳＦ（Gregor, P. D., et. al., Genes Dev. 4:1730-1740.(1990)参照）、ＴＦＥ３（Beckmann, H., et. al., Genes Dev. 4:167-179.(1990)参照）を始めとする他のＥ−ボックス結合転写因子が存在する。次に、当該Ｅ−ボックス結合転写因子が、ＣＡＣＧＴＧエレメントおよびＣＧＣＧＴＧエレメントにどのように応答するのかについて調べた。図５Ｂおよび図５Ｃに示すように、野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターは、ＴＦＥ３およびＵＳＦによってほとんど刺激されなかった。これらの結果は、ＴＡＦ４ｂプロモーターがＭｙｃに特異的に応答することを示唆する。ＣＧＣＧＴＧエレメントが基準型（canonical）ＣＡＣＧＴＧに変異した場合、ＴＡＦ４ｂプロモーターからの発現は、ＵＳＦによって刺激されたが、ＴＦＥ３は依然として当該レポーターからの発現をほとんど刺激しなかった。
【０１２１】
ＵＳＦおよびＴＦＥ３のＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに対する結合活性は、Ｍｙｃ−Ｍａｘの場合と同様の方法で決定された（図７参照）。ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに結合するＴＦＥ３およびＵＳＦのＫｄ値は、それぞれ５．６ｎＭおよび４．８ｎＭであった。標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドと比較して、約３０倍の標識されていないｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドが、標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドおよびＵＳＦによって生成される特異的シグナルを５０％に減少させるために必要とされることが確認された。これらの結果から、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、ＵＳＦとＣＧＣＧＴＧエレメントとの結合は、ＵＳＦとＣＡＣＧＴＧエレメントとの結合よりも弱いことが示唆される（図５Ｆ参照）。このことから、ＵＳＦによって野生型ＴＡＦ４ｂプロモーター活性は上昇しないことがわかった。
【０１２２】
ＴＦＥ３の場合には、標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドおよびＴＦＥ３によって生成される特異的シグナルを５０％に減少させるためには標識されていないｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドは、標識されていないＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドの場合と比較して、３倍だけ必要であった。
【０１２３】
（考察）
ＴＡＦ４ｂ遺伝子は、Ｍｙｃの直接の標的である。
我々は、ｃ−ＭｙｃがＴＡＦ４ｂの発現を直接誘導するということを実証した。ＨＬ６０細胞において、ＴＰＡ処理後のＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの発現は、ｃ−ｍｙｃの発現と密接に続いて起こった（図２Ａ参照）。ｃ−Ｍｙｃがｃ−ＭｙｃＥＲキメラタンパク質で活性化されると、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡの発現の刺激が観察された（図２Ｂ参照）。この誘導は、タンパク質合成阻害剤の存在下でも維持され（図２Ｃ参照）、ｃ−ＭｙｃはＴＡＦ４ｂの発現を直接制御することが示された。ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、増殖中のＨＬ６０細胞で、インビボでＴＡＦ４ｂプロモーターに結合した（図１Ｂ参照）。ＴＡＦ４ｂプロモーター活性は、ｃ−Ｍｙｃによって上昇した（図３参照）。この活性の上昇は、進化の過程で保存された非基準型Ｅ−ボックス（ＮＣＥ−ボックス２；ＣＧＣＧＴＧエレメント）を介することによって起こる（図３および図４参照）。ゲルシフトアッセイでは、ＴＡＦ４ｂプロモーターの場合、ｃ−Ｍｙｃタンパク質はＮＣＥ−ボックス２に結合することが示された（図５Ｄ参照）。これらの結果をまとめると、ｃ−Ｍｙｃは進化の過程で保存されたＥ−ボックス部位を介してＴＡＦ４ｂの発現を直接誘導するということがいえる。
【０１２４】
ＴＡＦ４ｂを欠損したオスおよびメスのマウスは、生殖能力に顕著な異常を示す（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)， Freiman, R. N., et. al., Science 293:2084-2087.(2001)参照）。ＴＡＦ４ｂを欠損するメスのマウスは、卵巣での卵胞形成に欠陥を有するために不妊である一方、野生型マウスの卵胞の顆粒膜細胞においては、ＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃの発現が見られた（Freiman, R. N., et. al., Science 293:2084-2087.(2001)，Li, S., et. al., Endocr J. 41:83-92.(1994)，Sato, A., et. al., Eur. J. Endocrinol. 131:319-322.(1994)参照）。成体の精巣において、ＴＡＦ４ｂは生殖細胞の増殖に必要とされ（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)参照）、ＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃの発現は減数分裂前の精原細胞において検出される（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)，Koji, T., et. al., Histochem. J. 20:551-557.(1998)参照）。ＴＡＦ４ｂは細胞増殖の制御に関与する多くの遺伝子を誘導し得るため（Mengus, G., et. al., EMBO J. 24:2753-2767.(2005)参照）、上記の結果は、ｃ−ｍｙｃがＴＡＦ４ｂ発現の刺激を介して、卵胞形成および精子形成中の細胞増殖に寄与する可能性を示唆する。
【０１２５】
Ｅ−ボックス内の配列：基準型（ＣＡＣＧＴＧ）および非基準型（ＣＧＣＧＴＧ）エレメント
ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＣＧＣＧＴＧエレメント（ＮＣＥ−ボックス２）は、ｃ−ＭｙｃによるＴＡＦ４ｂ発現の誘導に必要である。この非基準型エレメントは進化の過程で保存されているが、これは、この配列が生理学的に重要であることを示すものである。ＣＧＣＧＴＧエレメントが基準型ＣＡＣＧＴＧに変異した場合、ｃ−ＭｙｃのＴＡＦ４ｂプロモーターへの結合は強化され、ｃ−Ｍｙｃはプロモーター活性をより強くアップレギュレートした（図５参照）。これらの結果は、ｃ−ＭｙｃのＥ−ボックスへの結合活性がその転写活性化に直接影響を及ぼすということを示すものである。ＵＳＦの場合も、同様の現象が観察された（以下参照）。
【０１２６】
本発明者は、別のＥ−ボックス結合転写因子であるＵＳＦに関しても、Ｅ−ボックス部位における配列変化の影響を調査した。ＵＳＦは野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターをほとんど刺激しない。しかしながら、ＮＣＥ−ボックス２がＣＡＣＧＴＧに変異すると、ＵＳＦとＴＡＦ４ｂプロモーターとの結合はより強固なものとなり、ＵＳＦはプロモーター活性をアップレギュレートし始めた（図５Ｃおよび図５Ｆ参照）。これらの結果は、非基準型ＣＧＣＧＴＧ Ｅ−ボックスがＵＳＦによる制御を避けるために選択されている可能性を示唆する。
【０１２７】
マウスの精巣では、幹細胞系列でＴＡＦ４ｂは発現するが、体細胞であるセルトリ細胞ではＴＡＦ４ｂは発現しない（Falender, A. E., et. al., Genes Dev. 19:794-803.(2005)参照）。セルトリ細胞では、ＵＳＦは高度に発現しており、基準型Ｅ−ボックスエレメント（ＣＡＣＧＴＧ）を介してステロイド産生因子１（Daggett, M. A., et. al., Biol. Reprod. 62:670-679.(2000)参照）および卵胞刺激ホルモンレセプター（Heckert, L. L., et. al., Mol. Endocrinol. 14:1836-1848.(2000)：参照）の発現を誘導する。ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいてＮＣＥ−ボックス２が基準型であったとすれば、セルトリ細胞において、ＴＡＦ４ｂの発現はＵＳＦによって誘導されるであろう。それゆえ、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおけるＣＧＣＧＴＧエレメントの保存は、哺乳類の精巣においてＴＡＦ４ｂの適度な発現を支持するために必要であるかもしれない。
【０１２８】
ＴＡＦ４ｂプロモーターの場合において、ＣＡＣＧＴＧエレメントに結合するｃ−Ｍｙｃ−Ｍａｘ、ＵＳＦ、およびＴＦＥ３のＫｄ値は、それぞれ２４ｎＭ、４．８ｎＭ、５．８ｎＭであり、ｃ−Ｍｙｃは上記のタンパク質の中で最も効率的にＴＡＦ４ｂプロモーターを活性化する。それゆえ、応答するエレメントに対する転写因子の結合活性は、応答する遺伝子を単純に決定するものではない。ＴＦＥ３のＣＡＣＧＴＧエレメントに対する結合活性は、ＣＧＣＧＴＧエレメントの結合活性と近似している。そして、ＴＦＥ３は、ＣＡＣＧＴＧエレメントを有するＴＡＦ４ｂプロモーターならびにＣＧＣＧＴＧエレメントを有するプロモーターを活性化しなかった。しかしながら、上述したように、ＵＳＦのＥ−ボックスエレメントに対する結合活性が上昇すると、結果としてＵＳＦによるＴＡＦ４ｂプロモーターの活性化が起こる。これらの結果は、転写因子のその応答エレメントに対する結合活性の上昇が、応答遺伝子の範囲を拡大しうることを示唆する。
【０１２９】
ＴＦＥ３のＣＧＣＧＴＧエレメントに対する結合活性は、ＣＡＣＧＴＧエレメントに対する結合活性と同等であった。一方、ｃ−Ｍｙｃ−ＭａｘおよびＵＳＦのＣＧＣＧＴＧエレメントに対する結合活性は、ＣＡＣＧＴＧエレメントに対する結合活性に比べて非常に弱かった（図５参照）。これらの結果から、Ｅ−ボックス内の各配列は、Ｅ−ボックスに対するＥ−ボックス結合転写因子の結合活性にそれぞれ異なる影響を与えるということが示唆される。現在までのところ、Ｍｙｃ−Ｍａｘに対する非基準型（non-canonical）結合配列がいくつか報告されている（ＣＡＣＣＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＡＡＣＧＴＧ、およびＣＡＣＧＡＧ）（Grandori, C., et. al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:653-699.(2000)：参照）。これらのエレメントは、異なる結合活性でＥ−ボックス結合転写因子と異なって結合する。これらの違いは、Ｅ−ボックス結合転写因子に応答する遺伝子の領域（spectrum）に影響を与える可能性を有している。以上の結果は、Ｅ−ボックス転写因子が異なる標的遺伝子特異性を有するというメカニズムに、Ｅ−ボックス内の配列が寄与しているという証拠を初めて提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＡＦ４ｂプロモーターおよびエキソン１の一部のゲノムＤＮＡ配列である。また、本図では、以前には報告していなかったＮ末端のアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列の下に一文字表記で示す。転写開始部位は矢印で示され、翻訳開始部位は星印で示されている。図中には、Ｅ−ボックス部位、Ｅ−ボックス１およびＥ−ボックス２（破線で囲まれた部分）、非基準型Ｅ（ＮＣＥ）−ボックス部位、ＮＣＥ−ボックス１およびＮＣＥ−ボックス２（下線を引いた部分）、ＴＡＴＡボックス配列（影付きの部分）、ＳｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ）、ＰｖｕＩＩ部位（ＣＡＧＣＴＧ）、およびＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が示されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用したクロマチン免疫沈降実験の結果を示す図である。増殖期のＨＬ６０細胞（−ＴＰＡ）、および、１０ｎＭ ＴＰＡで２４時間処理されたＨＬ６０細胞（＋ＴＰＡ）を、１％ホルムアルデヒドで固定した後、核抽出物を集め、ｃ−Ｍｙｃに対する抗体（ｃ−ＭｙｃのＮ末端側と反応する抗ｃ−Ｍｙｃ抗体１、ｃ−ＭｙｃのＣ末端側と反応する抗ｃ−Ｍｙｃ抗体２）、又はコントロール抗体を使用して、あるいは抗体を使用せずに（no antibody）、クロマチンを免疫沈降した。ＴＰＡの存在下でｃ−ｍｙｃ発現は大きく低下した（図２Ａ）。核抽出物を添加しないmock免疫沈降実験も実施された（nuclear extract -）。ＤＮＡを精製した後、試料を、ＴＡＦ４ｂプロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅するために設計されたプライマー（ＴＡＦ４ｂプライマー）、または、第２２番染色体のＥ−ボックスを含むＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマー（コントロールプライマー）を用いたＰＣＲに付した（Bouchard, C., et. al., Genes Dev. 15:2042-2047.(2001)：参照）。
【図２Ａ】図２Ａは、ＴＰＡ処理後のヒト前骨髄性白血病ＨＬ６０細胞におけるＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの変化を示す図である。ＲＮＡを１０ｎＭ ＴＰＡによる処理が行われた後、指示された時点で単離し、ノーザンブロッティングで解析してＴＡＦ４ｂおよびｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡを検出した（左側の図参照）。２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも検出した。この結果を定量し、プロットした（右側の図参照）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＭｙｃＥＲタンパク質の活性化によって、Ｔ９８Ｇ細胞中で増加したＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルを示す。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞（Ｔ９８ＧＭｙｃＥＲ）および親細胞（Ｔ９８Ｇ）を、０．２５％血清を含む培地で４０時間培養した後、２００ｎＭ ＯＨＴの存在下（＋）、あるいは非存在下（−）で培養した。ＲＮＡを指示された時点で単離し、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡを検出するためにノーザンブロッティングによる解析が行われた（左側の図参照）。２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも示す。結果を定量し、棒グラフとして表す（右側の図参照）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、タンパク質合成阻害剤の存在下で、ＭｙｃＥＲタンパク質の活性化によってＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡレベルの増加が維持されたことを示す図である。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞を、０．２５％血清を含む培地で４０時間培養した後、２００ｎＭ ＯＨＴで８時間処理した。ＲＮＡを単離し、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡを検出するためにノーザンブロッティングにより解析した（左側の図参照）。図中、ＣＨＸの列で「＋」と示されたものは、ＯＨＴ添加の２０分前に２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドが添加されたものである。２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも示す。結果を定量し、棒グラフとして表す（右側の図参照）。
【図３Ａ】図３Ａは、レポーターアッセイの結果を示すグラフである。レポータープラスミド（ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉ）を、ＴＡＦ４ｂプロモーター活性を検出するために構築した。ｐＴＡＦ４ｂ（ｍＥ１／２）ｌｕｃｉにおいて、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉの２つのＥ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧエレメント）をＣＡＣＣＴＧに変異させた（図１Ａ参照）。また、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｗ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＳｍａ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（ｄＸｈｏ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｘｈｏ）ｌｕｃｉ、およびｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉの欠失変異体を作製した。Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトした。一日経過後、ＭｙｃＥＲキメラタンパク質を活性化させるために、最終濃度が２００ｎＭになるようにＯＨＴを加え、細胞をさらに１７時間培養した。細胞抽出物を、ホタルルシフェラーゼ活性について解析した。プロモーター活性は、ＭｙｃＥＲ活性化なしの活性に対する割合として決定した。ＭｙｃＥＲ活性化を介さないＯＨＴの効果を規準化するために、Ｔ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞の細胞数を、Ｔ９８Ｇ親細胞の細胞数で除した。なお、Ｔ９８Ｇ親細胞は、上述したＴ９８Ｇｍｙｃｅｒ−２細胞と全く同じ手順で処理した。基本のプロモーターとして、何も挿入されていないｐＧＬ３プラスミドを用いた。数値は、４つの別個の実験の結果を平均したものである。バーは、標準誤差を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、レポーターアッセイの結果を示すグラフである。ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉの配列を欠失させ、ｐＴＡＦ４ｂ（１１７Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１１４Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（１０２Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（７３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉ、およびｐＴＡＦ４ｂ（４３Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを作製した。Ｍｙｃによるプロモーター活性化は、図３Ａで説明したのと同様にして測定した。
【図３Ｃ】図３Ｃは、レポーターアッセイの結果を示すグラフである。ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉのＮＣＥ−ボックス１およびＮＣＥ−ボックス２（図１Ａ参照）について変異を施し、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ２）ｌｕｃｉ、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ｍＮＣＥ１／２）ｌｕｃｉを作製した。ここでは、１つまたは両方の非基準型Ｅ−ボックス（ＣＧＣＧＴＧエレメント）を、ＣＧＣＣＴＧに変異した。Ｍｙｃによるプロモーター活性化は、図３Ａで説明したのと同様にして測定した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＭｙｃＥＲタンパク質の活性化によって、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡ量がラットの線維芽細胞３Ｙ１においてどの程度増加するかを示す図である。２００ｎＭのＯＨＴで細胞を８時間処理した後、ＲＮＡを単離した。図中、ＣＨＸの列で「＋」と示されたものは、ＯＨＴ添加の２０分前に２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドが添加されたものである。得られたＲＮＡをノーザンブロッティングで解析し、ＴＡＦ４ｂのｍＲＮＡを検出した。ここでも、２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮＡも示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒトとラットとの間でＴＡＦ４ｂプロモーター配列を比較したものである。この解析において、相同性が高い領域については、数値が低くなった（本文参照）。本図では、ＮＣＥ−ボックス２（ＣＧＣＧＴＧ）およびＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡ）の位置を示している（図１Ａ参照）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヒト（ＨＵＭ）、サル（ＭＯＮ）、ラット（ＲＡＴ）、およびマウス（ＭＯＵ）のＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、ＣＧＣＧＴＧエレメント周辺の配列を比較したものである。ＮＣＥ−ボックス２およびＴＡＴＡボックス配列は、明るい影付きで示している。ヒトＴＡＦ４ｂプロモーターとは異なるヌクレオチドは、暗い影付きで示している。本図では、ヒトプロモーターのＳｍａＩ部位も示している。
【図５】図５は、ＴＡＦ４ｂプロモーターの特性を示すグラフである。 図５Ａ〜図５Ｃでは、ＴＡＦ４ｂプロモーター活性に対するｃ−Ｍｙｃ、ＴＦＥ３、およびＵＳＦの影響を調べた。本図では、ｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ）ｌｕｃｉを（○）で、ＮＣＥＷ−ボックス２（ＣＧＣＧＴＧエレメント）が基準型（ＣＡＣＧＴＧ）に変異されたｐＴＡＦ４ｂ（Ｓｍａ−Ｐｖｕ ＣＡＣＧＴＧ）ｌｕｃｉを（●）で示している。Ｔ９８Ｇ細胞を、トランスフェクション効率の基準化用のｐＲＬ／ＣＭＶとともにレポータープラスミド、および、ｐＣＭＶ／ｃ−ｍｙｃ（Ａ）、ｐＣＭＶ／ＴＦＥ３（Ｂ）、又はｐＣＭＶ／ＵＳＦ（Ｃ）でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、エフェクタープラスミドが無い場合の発現量に対する割合で表す。図中、Ｘ軸はエフェクタープラスミドの量を示す。数値は、４つの別個の実験の結果を平均したものである。バー（the bars）は、基準誤差を示している。 図５Ｄ〜図５Ｆは、ＴＡＦ４ｂプロモーターにおいて、非基準型（野生型）Ｅ−ボックスに対するＭｙｃ−Ｍａｘ（Ｄ）、ＴＦＥ３（Ｅ）、またはＵＳＦ（Ｆ）の結合活性を、基準型Ｅ−ボックスに対するそれぞれの結合活性と比較した図である。組換えタンパク質を、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、様々な量の非標識のＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（●で示す）あるいはｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（野生型；○で示す）を加えたものとともにインキュベートし、その後、実施例ならびに図６で説明したゲルシフトアッセイにより解析した。ｎｏｎ−ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドは、野生型ＴＡＦ４ｂプロモーターから合成されたオリゴヌクレオチドであり、Ｍｙｃ応答性ＮＣＥ−ボックス２を有するものであった。ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドにおいて、ＮＣＥ−ボックス２を基準型ＣＡＣＧＴＧエレメントに変異させた。反応混合物中、標識されていないcompetitorの量は、標識されたオリゴヌクレオチドとの倍数として表す。
【図６】ｃ−Ｍｙｃ／ＭａｘとＴＡＦ４ｂプロモーターオリゴヌクレオチドとの結合を調べた図である。 図６Ａは、ｃ−Ｍｙｃ／Ｍａｘ複合体とのゲルシフトアッセイの結果を示す。組換えタンパク質を３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、ゲルシフトアッセイにより解析した。シフトしたバンドの特異性をテストするために、ゲルシフトアッセイの前に、ウサギ抗Ｍａｘ抗体（文献１：Beckmann, H., et. al., Genes Dev. 4:167-179.(1990)：参照）、非特異的抗体（Bello-Fernandez, C., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:7804-7808.(1993)参照）、あるいは抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Bouchard, C., et. al., Genes Dev. 15:2042-2047.(2001)参照）を反応混合物に加えた。図には、シフトしたバンド（＊）および抗体によってスーパーシフトしたバンド（＜）が示されている。 図６Ｂでは、配列特異的結合をテストするために、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、その３０倍量（レーン３および５）、１００倍量（レーン４および６）、３００倍量（レーン７）過剰の非標識ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（レーン３および４）あるいはＣＡＣＧＴＧエレメントがＣＧＣＣＴＧに置き換わったｍＥオリゴヌクレオチド（レーン５、６、および７）が加えられたものとともに、タンパク質をインキュベートした。その後、上述の方法でゲルシフトによる解析が行われた。 図６Ｃは、Ｍｙｃ／Ｍａｘと３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドとの結合を示す。ｃ−Ｍｙｃ／Ｍａｘ複合体を、反応混合物中で様々な濃度の３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドとともに室温でインキュベートした。次いで、前記混合物を電気泳動し（左側の図参照）、シフトした放射能の強度を定量した。この結果を、スキャッチャードプロットで解析した（右側の図参照）。
【図７】ＵＳＦおよびＴＦＥ３とＴＡＦ４ｂプロモーターオリゴヌクレオチドとの結合を調べた図である。 図７Ａでは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに結合するＵＳＦのゲルシフトアッセイを図６と同様にして実施した。シフトしたバンドの特異性をテストするために、抗ＵＳＦ抗体を反応混合物に加えた（レーン３）。配列特異的結合をテストするために、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、その３０倍量（レーン４および７）、１００倍量（レーン５および８）、３００倍量（レーン６および９）過剰の非標識ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（レーン４、５、および６）あるいはｍＥオリゴヌクレオチド（レーン７、８、および９）が加えられたものとともに、タンパク質をインキュベートした。 図７Ｂでは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに対するＵＳＦの結合を解析するため、スキャッチャードプロット解析を図６と同様にして実施した。 図７Ｃは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに結合するＴＦＥ３のゲルシフトアッセイを示す。シフトしたバンドの特異性をテストするために、抗ＴＦＥ３抗体（レーン３）またはコントロールの抗体をインキュベーション混合物に加えた。配列特異的結合をテストするために、３２Ｐ標識されたＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに、その３０倍量（レーン５および７）、１００倍量（レーン６および８）、３００倍量（レーン９）過剰の非標識ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチド（レーン５および６）またはｍＥオリゴヌクレオチド（レーン７、８、および９）が加えられたものとともに、タンパク質をインキュベートした。 図７Ｄでは、ＣａｎｏＥオリゴヌクレオチドに対するＴＦＥ３の結合を解析するために、スキャッチャードプロット解析が図６と同様にして実施された。
【図８】図８は、ＴＡＦ４ｂプロモーター領域とその活性および推定される発現上昇因子の結合部位を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチド。
【請求項２】
前記ヌクレオチドが
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列、
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列、
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列および／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列が配置されてなる塩基配列を含む塩基配列、または
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列、
からなるものである、請求項１記載のヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、５１位〜５７位のＴＡＴＡボックスおよび４３〜４８位のＣＡＣＧＴＧモチーフ以外の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
を含有するものである、請求項１に記載のヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフが、下記：
（ｉ）塩基配列ＧＴＧにおける少なくとも１塩基の置換、
（ii）塩基配列ＣＡＣにおける少なくとも１塩基の置換もしくは挿入
のいずれかまたは両方の変異を有するものである、請求項１〜３いずれか１項に記載のヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載のヌクレオチドを含有してなるベクター。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか１項に記載のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有してなる、レポータープラスミド。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターまたは請求項６に記載のレポータープラスミドを導入してなる形質転換体。
【請求項８】
請求項５に記載のベクターまたは請求項６に記載のレポータープラスミドを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
請求項６に記載のレポータープラスミドまたは請求項７に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のレポータープラスミド、請求項７に記載の形質転換体または請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、妊娠調節剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
Ｍｙｃによる組織特異的発現の調節剤であって、下記いずれかのペプチドを有効成分として含有する調節剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からコードされるペプチド、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）前記（１）または（２）に記載のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１２】
妊娠の調節に用いられる請求項１１に記載の調節剤。
【請求項１３】
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において２１０位〜２１６位のＴＡＴＡボックスおよび２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号５に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するサルＴＡＦ４ｂプロモーター。
【請求項１４】
（ａ）配列番号６に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において７７８位〜７８４位のＴＡＴＡボックスおよび７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号６に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するラットＴＡＦ４ｂプロモーター。
【請求項１】
Ｍｙｃによる組織特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、ＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフとを必須の配列として含むＴＡＦ４ｂプロモーターに由来するヌクレオチド。
【請求項２】
前記ヌクレオチドが
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列において、１０９０〜１０９６位のＴＡＴＡボックスおよび１０８２〜１０８７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号３に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列、
（ｃ）配列番号３の１０４０〜１１２６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｄ）配列番号３の１０８２〜１１５６位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｅ）配列番号３の１０４０〜１１２０位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＧＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列、
（ｆ）配列番号３の１０７９〜１１０７位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ１０４０〜１０７８位および１１０８〜１１２０位の領域の塩基配列とそれぞれ７０％以上の同一性を有する塩基配列をそれぞれ当該必須配列の上流および下流に配置してなる塩基配列を含む塩基配列、
（ｇ）配列番号３の１０８１〜１１２６位の領域の塩基配列を必須の配列として含み、かつ当該必須配列の上流に１０４０〜１０８０位の領域の塩基配列および／または当該必須配列の下流に１１２７〜１１５７位の領域の塩基配列が配置されてなる塩基配列を含む塩基配列、または
（ｈ）配列番号３の１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域とからなる断片、１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片、および１０４０〜１０８０位の領域と１０８１〜１１２６位の領域と１１２７〜１１５７位の領域とからなる断片からなる群より選ばれる塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む塩基配列、
からなるものである、請求項１記載のヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、５１位〜５７位のＴＡＴＡボックスおよび４３〜４８位のＣＡＣＧＴＧモチーフ以外の塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつＴＡＴＡボックスとその１〜５０塩基上流に位置するＣＡＣＧＴＧモチーフとを含む塩基配列
を含有するものである、請求項１に記載のヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＣＧＣＧＴＧモチーフおよび／またはＣＡＣＧＴＧモチーフが、下記：
（ｉ）塩基配列ＧＴＧにおける少なくとも１塩基の置換、
（ii）塩基配列ＣＡＣにおける少なくとも１塩基の置換もしくは挿入
のいずれかまたは両方の変異を有するものである、請求項１〜３いずれか１項に記載のヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載のヌクレオチドを含有してなるベクター。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか１項に記載のヌクレオチドおよびレポーター遺伝子を含有してなる、レポータープラスミド。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターまたは請求項６に記載のレポータープラスミドを導入してなる形質転換体。
【請求項８】
請求項５に記載のベクターまたは請求項６に記載のレポータープラスミドを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
請求項６に記載のレポータープラスミドまたは請求項７に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、細胞増殖の調節剤をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項６に記載のレポータープラスミド、請求項７に記載の形質転換体または請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、妊娠調節剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
Ｍｙｃによる組織特異的発現の調節剤であって、下記いずれかのペプチドを有効成分として含有する調節剤：
（１）配列番号１に記載の塩基配列からコードされるペプチド、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）前記（１）または（２）に記載のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１２】
妊娠の調節に用いられる請求項１１に記載の調節剤。
【請求項１３】
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において２１０位〜２１６位のＴＡＴＡボックスおよび２０２〜２０７位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号５に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するサルＴＡＦ４ｂプロモーター。
【請求項１４】
（ａ）配列番号６に記載の塩基配列、または
（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において７７８位〜７８４位のＴＡＴＡボックスおよび７７０〜７７５位のＣＧＣＧＴＧモチーフを必須の塩基配列として含有し、かつ配列番号６に記載の塩基配列と実質的に同一な塩基配列
を含有するラットＴＡＦ４ｂプロモーター。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−２１５４８６（Ｐ２００７−２１５４８６Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４０００８（Ｐ２００６−４０００８）
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
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