ＴＮＦアンタゴニスト及びそれを有効成分とするＴＮＦ阻害剤
【課題】 この発明は、腫瘍壊死因子変異体蛋白質、とりわけ、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的な腫瘍壊死因子変異体蛋白質を提供することを課題とするものである。
【解決手段】 配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する腫瘍壊死因子の変異体蛋白質であって、配列表における配列番号９乃至２２で表されるアミノ酸配列のいずれかを有する、腫瘍壊死因子変異体蛋白質を提供することにより前記課題を解決する。
【解決手段】 配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する腫瘍壊死因子の変異体蛋白質であって、配列表における配列番号９乃至２２で表されるアミノ酸配列のいずれかを有する、腫瘍壊死因子変異体蛋白質を提供することにより前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は腫瘍壊死因子（以下、本明細書において「ＴＮＦ」と略記する）変異体蛋白質、とりわけ、ＴＮＦ受容体ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２に特異的なＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニスト、及び、それらを有効成分とするＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦは、多くの腫瘍細胞に対して、極めて強力な抗腫瘍作用を発揮することから、抗癌剤としての活用が嘱望されてきた。しかしながら、ＴＮＦは、細胞障害活性による生体への副作用が大きすぎるため、医薬品としてまだ利用されるには至っていない。また、ＴＮＦは、癌や感染症などの疾病時に患者の生体内で産生され、炎症反応を引き起こし、場合によっては症状を重篤化する因子ともなり得る。このため、ＴＮＦの作用を調節する方法の開発が望まれている。ＴＮＦの作用を調節する方法としては、ＴＮＦと結合する抗体を生体に投与し、ＴＮＦの活性を中和する方法があり、当該抗体を有効成分とする医薬品がすでに開発されている。しかしながら、この方法は、ＴＮＦによる有益な生体防御能のすべてを喪失させる恐れがある。
【０００３】
ところで、ＴＮＦ受容体として、分子量５５キロダルトンのＴＮＦ受容体（以下、「ＴＮＦ−Ｒ１」と呼称する。）及び分子量７５キロダルトンのＴＮＦ受容体（以下、「ＴＮＦ−Ｒ２」と呼称する。）が存在することが知られている。ヴァン・オスターデ・エックス（Ｖａｎ Ｏｓｔａｄｅ Ｘ）、タベアニアー・ジェイ（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ Ｊ）、プランジェ・ティー（Ｐｒａｎｇｅ Ｔ）、フィアーズ・ダブル（Ｆｉｅｒｓ Ｗ）、ローカリゼーション・オブ・ジ・アクティブ・サイト・オブ・ヒューマン・ツモア・ネクロシス・ファクター（ｈＴＮＦ）・バイ・ミューテーショナル・アナリシス（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ｈＴＮＦ） ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＮＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９１年、第１０巻、第４号、８２７乃至８３６頁には、マウスＴＮＦ−Ｒ２に結合しないヒト由来のα型ＴＮＦ（以下、「ＴＮＦ−α」と呼称する）は、両方の受容体と結合するマウスＴＮＦ−αとは異なった生物作用を発揮することが報告されている。したがって、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方にのみに選択的に結合するＴＮＦ変異体蛋白質は、従来のＴＮＦの持つ生物作用とは異なった作用を発揮することが期待される。
【０００４】
ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方にのみ選択的に結合する、すなわち、受容体特異的なＴＮＦ変異体蛋白質を作製するにあたり、ヴァン・オスターデ・エックス（Ｖａｎ Ｏｓｔａｄｅ Ｘ）等は、上記文献において、ＴＮＦ−αにおけるＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２との結合部位を変異導入法によりそれぞれ調べ、その結果、ＴＮＦ−αにおけるＮ末端から２９乃至３４番目、８６番目及び１４６番目のアミノ酸残基への変異導入は、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力を、また、１４３乃至１４５番目のアミノ酸残基への変異導入はＴＮＦ−Ｒ１への結合力を低減させることが開示されている。とりわけ、Ｎ末端から３２番目のアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）に、Ｎ末端から８６番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）に変異されたＴＮＦ−α変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力を保持したまま、ＴＮＦ−Ｒ２との結合力を著しく低減することを開示されている。さらに、特開平６−２５６３９５号公報、特開平７−２８５９９７号公報、ツアング・エックスエム（Ｚｈａｎｇ ＸＭ）、ウエーバー・アイ（Ｗｅｂｅｒ Ｉ）、チェン・エムジェイ（Ｃｈｅｎ ＭＪ）、サイト−ディレクテッド・ミューテーショナル・アナリシス・オブ・ヒューマン・ネクロシス・ファクター−アルファ・レセプター・バインディング・サイト・アンド・ストラクチャー−ファンクショナル・リレーションシップ（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９２年、第２６７巻、第３３号、２４０６９乃至２４０７５頁、及び、ローチャー・エイチ（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｈ）、スチューバー・ディー（Ｓｔｕｅｂｅｒ Ｄ）、バンナー・ディー（Ｂａｎｎｅｒ Ｄ）、マッケイ・エフ（Ｍａｃｋａｙ Ｆ）、レスロイアー・ダブル（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ Ｗ）、ヒューマン・ツモア・ネクロシス・ファクター・アルファー（ティー・エヌ・エフ・アルファ）・ミュータンツ・ウイズ・エクスクルーシブ・スペシフィシティ・フォー・ザ・５５−ｋＤａ・オア・７５−ｋＤａ・ＴＮＦ・レセプターズ（Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ （ＴＮＦ ａｌｐｈａ） ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ５５−ｋＤａ ｏｒ ７５−ｋＤａ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９３年、第２６８巻、第３５号、２６３５０乃至２６３５７頁を参照すると、受容体特異性をＴＮＦ変異体蛋白質に付与するためには、ＴＮＦ−αのＮ末端から２９乃至３４、８１乃至８９、又は、１４３乃至１４７番目のアミノ酸残基に変異導入することが有望であると考えられる。なお、上記文献において、受容体特異的なＴＮＦ‐α変異体蛋白質が作成されており、それらはＴＮＦとしての活性を保持するいわゆるアゴニストである。これらは、ＴＮＦの薬効を期待してのＴＮＦ製剤としての利用が期待できる。
【０００５】
一方、ＴＮＦとしての活性が弱いか全くないＴＮＦ変異体蛋白質、つまりＴＮＦアンタゴニストは、どちらか一方のＴＮＦ受容体に選択的に結合するので、生体内で産生されるＴＮＦを残る一方のＴＮＦ受容体のみに選択的に結合させることができる。しかしながら、上記文献にはどちらか一方のＴＮＦ受容体に特異的なアンタゴニスト活性を有するＴＮＦ変異体蛋白質は開示されておらず、受容体特異的なＴＮＦアンタゴニストの開発が望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
斯かる状況に鑑み、この発明は、ＴＮＦ変異体蛋白質、とりわけ、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニスト、並びにそれを有効成分とするＴＮＦ阻害剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、ＴＮＦ受容体の一種であるＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストを得るべく、網羅的にＴＮＦ変異体蛋白質を作製し、スクリーニングした結果、ＴＮＦ−Ｒ１との結合力のみが野性型ＴＮＦと比べて著しく弱いＴＮＦ変異体蛋白質、又は、ＴＮＦ−Ｒ２との結合力のみが野性型ＴＮＦと比べて著しく弱いＴＮＦ変異体蛋白質を得ることに成功した。これらのＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦといずれか一方のＴＮＦ受容体のみとの結合を拮抗阻害することが可能なＴＮＦアンタゴニスト、又は、いずれか一方のＴＮＦ受容体にのみに選択的に結合して、ＴＮＦ様の作用を示すＴＮＦアゴニストであることを確認し、この発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、この発明は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２に特異的なＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニスト、及び当該蛋白質を有効成分とするＴＮＦ阻害剤を提供することによって前記課題を解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この発明でいうＴＮＦ−Ｒ１特異的とは、ＴＮＦ−Ｒ２との結合力が著しく弱く、その結果、主にＴＮＦ−Ｒ１と結合する能力が顕著であることを意味し、ＴＮＦ−Ｒ２特異的とは、ＴＮＦ−Ｒ１との結合力が著しく弱く、その結果、主にＴＮＦ−Ｒ２と結合する能力が顕著であることを意味する。この発明でいうＴＮＦアンタゴニストとは、ＴＮＦ受容体と結合するが野性型ＴＮＦよりも活性が弱いか全く示さない蛋白質を意味する。この発明のＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方の受容体との結合力が強ければ強いほど、残る一方の受容体への結合が弱ければ弱いほど好ましい。
【００１０】
この発明のＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２に特異的なＴＮＦアンタゴニストは、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−αをコードするＤＮＡに、所望の位置にＮＮＳ配列（Ｎは塩基がＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを、Ｓは塩基がＧ又はＣを示す）を常法のＰＣＲ技術などにより導入し、ファージディスプレー法により、所期の特性を有するクローンを選出することによって得ることができる。また、ＴＮＦ−αの代わりに、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１、６５、９０、９８、１１２、１２８番目のリジン残基のうち１又は２以上が欠失、又は他のアミノ酸残基に置換した、好ましくは、配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体（以下、単に「リジン変換体」という）を基にすることもできる。具体的にいえば、まず、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２への結合力を変化させるために、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列において、それらのＮ末端から２９、３１、３２、１４５、１４６及び１４７番目のアミノ酸残基をランダムなアミノ酸に置換（配列表における配列番号５）するか、また、それらのＮ末端から８４、８５、８６、８７、８８及び８９番目のアミノ酸残基をランダムなアミノ酸に置換（配列表における配列番号７）するために、常法のオリゴＤＮＡ合成技術、ＰＣＲ技術、ＤＮＡライゲーション技術などを駆使して、上記位置のアミノ酸残基のコドンをＮＮＳに置換したＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号６又は８）を作製する。得られたＤＮＡはファージライブラリーを作製するために、ファージミドベクターに組み込み、蛋白質を発現させた後、ＴＮＦ−Ｒ１（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５８２８６に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）又はＴＮＦ−Ｒ２蛋白質（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５５９９４に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と結合するファージクローンを、表面プラズモン共鳴原理を利用した機器などを用いてパニング法を行うことにより選択する。得られたクローンは、さらに、残る一方の受容体（ＴＮＦ−Ｒ２又はＴＮＦ−Ｒ１）との結合性を調べ、２つの受容体に対する結合力に差を生じたクローンを選択し、基になったＴＮＦ−αあるいはＴＮＦリジン変換体の２分の１、好ましくは１０分の１、さらに好ましくは１，０００分の１、最も好ましくは、検出可能レベル以下までに片方の受容体への結合力が消失したクローンを選択する。選択されたクローンを、ヒト喉頭癌由来の細胞株ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２３）又はマウス結合組織由来の細胞株Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１．２）などのＴＮＦ標的細胞を用いる公知のバイオアッセイによってその生物活性を測定する。その結果、活性が低いもの、例えば、ＴＮＦ−αの２分の１、好ましくは、１０分の１、さらに好ましくは１，０００分の１、最も好ましくは、検出可能レベル以下までに細胞障害活性が消失したファージクローンを選別する。
【００１１】
斯くして得られるこの発明のＴＮＦアンタゴニストは、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−α、又は、配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体におけるＮ末端から、２９、３１、３２、１４５、１４６及び１４７番目のアミノ酸残基、又は、８４乃至８９番目のアミノ酸残基の一部又は全てが他のアミノ酸又は終止コドンに置換されている。これらのＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のいずれかに特異的に結合するが、野性型ＴＮＦよりも活性が低いか全く示さない、いわゆる、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストであることから、生体に投与された場合、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方と選択的に結合するので、生体内で産生されたＴＮＦが選択された方のＴＮＦ受容体に結合することを阻害する。したがって、生体内で産生されたＴＮＦに対して過剰量のこの発明のＴＮＦアンタゴニストを投与することにより、生体内で産生されたＴＮＦの作用をどちらか一方のＴＮＦ受容体を介してのＴＮＦ活性のみに制御することができる。
【００１２】
この発明のＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアンタゴニストとしては、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２９番目のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン又はセリン、３１番目がアルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、プロリン又はセリン、３２番目がヒスチジン、メチオニン、トレオニン又はチロシン、１４５番目がアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸又はセリン、１４６番目がアスパラギン、グリシン、メチオニン又はセリン、及び、１４７番目がアラニン、アスパラギン、プロリン、トレオニン又は終止コドンで置換されるか、又は８４番目がアラニン、トレオニン、セリン又はグリシン、８５番目がプロリン、トレオニン又はグリシン、８６番目がアラニン、グリシン、トレオニン又はプロリン、８７番目がチロシン、イソロイシン又はヒスチジン、８８番目がグルタミン、アスパラギン又はセリン、及び、８９番目がアルギニン、ヒスチジン又はグルタミンで置換されたＴＮＦ変異体蛋白質が挙げられ、例えば、配列表における配列番号９乃至１３又は配列番号１９乃至２２で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ変異体蛋白質が好適であり、この発明のＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストとしては、１４５番目がアラニン、リジン又はアルギニン、１４６番目がグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸又はトレオニン、及び、１４７番目がトレオニン又はアスパラギン酸で置換されたＴＮＦ変異体蛋白質が挙げられ、例えば、配列表における配列番号１４乃至１８で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ変異体蛋白質が好適である。
【００１３】
一方、本発明のＴＮＦアンタゴニストを検索するにあたり、ＴＮＦ−Ｒ１と特異的に結合するも、活性を保持しているか、活性の低下が少ないＴＮＦ変異体蛋白質が得られた。これらの蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ２への結合能を欠いており、野性型ＴＮＦとは異なった生物活性を発揮することが期待されるものである。このような蛋白質はＴＮＦアゴニストとして作用すると考えられ、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２９番目がロイシン、グルタミン、トレオニン又はリジン、３１番目がアルギニン、グリシン、セリン又はアラニン、３２番目がトリプトファン、チロシン、アスパラギン酸又はグリシン、１４６番目がグルタミン酸、アラニン又はセリン、及び、１４７番目がセリン、アルギニン又はトレオニンで置換されているか、又は、８４番目がトレオニン、セリン又はアスパラギン、８５番目がセリン、リジン、プロリン、チロシン、アルギニン、トレオニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアラニン、８６番目がヒスチジン、トレオニン、ロイシン、アスパラギン、アラニン、バリン、リジン、セリン、グルタミン、グリシン、アルギニン又はアスパラギン酸、８８番目がセリン、プロリン、トレオニン、アスパラギン、アラニン、グリシン、アルギニン又はグルタミン、及び、８９番目がアスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、グリシン、セリン、プロリン、アラニン、グルタミン、フェニルアラニン又はアルギニンで置換されたＴＮＦ変異体蛋白質が挙げられ、例えば、配列表における配列番号３７乃至５９で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ変異体蛋白質が好適である。
【００１４】
この発明でいうＴＮＦリジン変換体とは、本発明者らによって、ＴＮＦ−αの生物活性を低減させないように水溶性の高分子に結合させるために、ＴＮＦ−αのアミノ酸配列のＮ末端から１１、６５、９０、９８、１１２及び１２８番目のアミノ酸残基の１又は２以上のリジン残基を他のアミノ酸残基に置換又は欠失したものである（欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書参照）。配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体は、ＴＮＦ−αと比較して、同等又は同等以上の活性を有しており、実質的にＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２への結合力についても同等である。したがって、この発明のＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストを水溶性の高分子に結合せしめて複合体として医薬品として利用する場合、蛋白部分にリジン残基を有しないか、リジン残基数を低減させたＴＮＦリジン変換体が有利である。配列表における配列番号９乃至２２で表される上記のこの発明のＴＮＦアンタゴニスト、又は配列表における配列番号３７乃至５９で表される上記のこの発明のＴＮＦアゴニストは、ＴＮＦリジン変換体を基にして作製されており、全くリジン残基を有していないか又は１つしかリジン残基を有していないので、水溶性の高分子と複合体を作製するうえで好適な例であるといえる。なお、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質を水溶性の高分子と結合することを意図しないならば、配列表における配列番号９乃至２２又は３７乃至５９で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１１、６５、９０、９８、１１２及び１２８番目のアミノ酸残基の１又は２以上が野性型ＴＮＦと同様にリジン残基であってもよく、それらの全てがリジン残基であってもかまわない。
【００１５】
この発明のＴＮＦ変異体蛋白質は、それらをコードするＤＮＡ、例えば、配列表における配列番号２３乃至３６又は６０乃至８２で表される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡを用いて、常法の遺伝子工学技術により製造することができる。すなわち、必要に応じて、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかをＰＣＲ反応によって増幅した後、蛋白質発現用のプラスミドベクターに組み込んで大腸菌などの宿主へ導入して形質転換し、得られる形質転換体から目的とする蛋白質を産生するクローンを選択し、それを培養することによって所望量得ることができる。形質転換体の培養物から蛋白質を採取するには、例えば、透析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの蛋白質を精製するための汎用の方法を適用すればよく、必要に応じて、これらの方法は適宜組み合わせて用いられる。
【００１６】
この発明のＴＮＦ変異体蛋白質は、生体内への安定性を向上させるために、適宜の水溶性の高分子を人為的に結合せしめることができる。この発明で用いる水溶性の高分子は、実質的に水溶性であって、とりわけ、生体にとって無害かつ抗原となり難い非蛋白質性のものが好ましい。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの単独重合体、エチレングリコールとビニルアルコール、プロピレングリコールなどとの共重合体又はそれらの誘導体などの合成高分子や、エルシナン、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、プルラン、メチルセルロースなどの天然高分子が挙げられ、このうち、分子量が揃った調製物を入手し易い点で、ポリエチレングリコールの単独重合体、ポリエチレングリコールと他の水溶性の高分子との共重合体及びそれらの誘導体が好ましい。なお、水溶性の高分子の分子量は、平均分子量として、通常、５００乃至１００，０００ダルトン、好ましくは、１，０００乃至５０，０００ダルトンの範囲内から選択すればよい。分子量が均一化された水溶性の高分子を用いたい場合には、蛋白質への結合反応に先だって、例えば、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの汎用の方法によって分子量分画することも随意である。また、水溶性の高分子の形状は、直鎖構造及び分岐構造のもののいずれも用いることができるが、立体障害性の観点から分岐構造のものが好ましく用いられる。水溶性の高分子の種類や複合体の最終用途にもよるけれども、水溶性の高分子の分子量が上記範囲を下回ると体内動態を改善し難くなり、逆に、上記範囲を上回ると、複合体の生理活性が低下しすぎて、医薬品として使用できなくなることがある。
【００１７】
ＴＮＦ変異体蛋白質へ斯かる水溶性の高分子を結合せしめるには、遊離のアミノ基へ特異的に反応して共有結合を形成する試薬により別途活性化させておいた水溶性の高分子を蛋白質に反応させるか、あるいは、遊離のアミノ基へ特異的に反応する官能基を有する多官能試薬により、蛋白質と水溶性の高分子とを架橋すればよい。反応方法としては、欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書に記載されている方法に準じて行うことができる。また、斯界において汎用される方法、例えば、特開昭６２−２８９５２２号公報などに記載されたエステル結合法、アミド結合法などを用いてもよい。蛋白質部分と水溶性の高分子との間に形成される結合は、安定な共有結合が形成されるアミド結合法によるものが好ましい。
【００１８】
反応方法にもよるけれども、反応開始時における蛋白質と水溶性の高分子との割合は、モル比で１：０．１乃至１：１００、好ましくは、１：０．５乃至１：５０、最も好ましくは、１：１乃至１：１０の範囲で加減する。一般に、この範囲を下回ると蛋白質同士の結合が顕著となり、反対に、この範囲を上回ると水溶性の高分子同士の結合が顕著となる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率を低下させることとなり、通常、上記の範囲で加減するのが望ましい。反応の際の温度、ｐＨ及び反応時間は、蛋白質が失活又は分解し難く、かつ、望ましくない副反応が最小になるように設定され、具体的には、反応温度を０乃至１００℃、好ましくは、２０乃至４０℃、ｐＨを０．１乃至１２、好ましくは、ｐＨ５乃至９とし、０．１乃至５０時間、好ましくは、１０時間以内に反応が完結するように設定する。斯くして得られたＴＮＦ変異体蛋白質と水溶性の高分子との複合体は、ＴＮＦ変異体蛋白質を精製する場合と同様の方法によって精製することができ、最終使用形態に応じて、例えば、濃縮、塩析、遠心分離、凍結乾燥などの方法により液状又は固状とする。
【００１９】
この発明のＴＮＦ変異体蛋白質、又はそれらと水溶性の高分子との複合体は、感受性疾患を治療及び／又は予防するための、又は、炎症などの症状を緩和するためのＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤として極めて有用である。この発明でいう感受性疾患とは、この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤を単独で投与するか、あるいは、他の薬剤とともに投与することによって治療、予防、又は症状を緩和し得る疾患全般を意味し、具体的には、生体内でのＴＮＦの過剰発現あるいは過剰投与により引き起こされる各種疾病、ＴＮＦの過剰発現を引き起こす各種疾病、又はＴＮＦの腫瘍壊死作用により治療効果が認められる各種疾病であり、個々の疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、副腎腫、甲状腺腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症などの固形腫瘍、白血病、リンパ腫などの血液系腫瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リュウマチ、アレルギー、乾癬などの自己免疫疾患、悪液質、慢性及び急性炎症、関節炎、敗血症、播種性血管内凝固症候群、移植拒絶反応、対宿主移植片疾患、感染、卒中、虚血、急性呼吸困難症候群、再狭窄、脳障害、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳ、骨疾患、アテローム性動脈硬化、川崎病、ベーチェット病、全身性紅斑性狼瘡、多臓器不全、マラリア、髄膜炎、劇症肝炎、ボウル病、アルツハイマー病などが挙げられる。したがって、この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、斯かる疾患を治療及び／又は予防するための、又は炎症などの症状を緩和するための、医薬品として多種多様な用途を有することとなる。
【００２０】
この発明のＴＮＦアンタゴニストとともにＴＮＦを併用することにより、この発明のＴＮＦアゴニストと同様の作用、すなわち、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２を介してのＴＮＦ活性を選択的に発揮させることが可能である。ＴＮＦとしては、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β、それらの変異体蛋白質、又は、それらと水溶性の高分子との複合体であってもよい。この発明のＴＮＦアンタゴニストとＴＮＦの配合量は、患者の症状に合わせて適宜設定すればよいが、片方の受容体を介してのＴＮＦ活性を実質的に発揮させないようにするためには、この発明のＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストをＴＮＦに比べてモル比で１００，０００倍以上、好ましくは５００，０００倍以上配合すればよい。また、上記モル比未満であっても、片方の受容体を介してのＴＮＦ活性は部分的に抑制されるので、通常と異なったＴＮＦの作用が発揮されることやＴＮＦの副作用の軽減化が期待できる。したがって、ＴＮＦアンタゴニストとＴＮＦの比率は、モル比で１乃至１，０００，０００倍、好ましくは、１０乃至１，０００，０００倍、さらに好ましくは１００乃至１，０００，０００倍から選ばれる。
【００２１】
適用対象となる感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、この発明によるＴＮＦ変異体蛋白質を含んでなるＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、投与経路に応じて、１回当たりの用量として、その有効成分を０．２５ｎｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは、２．５ｎｇ乃至４００ｍｇ／ｋｇ体重を投与し、用途に応じて、エキス剤、エリキシル剤、下気道吸入剤、カプセル剤、顆粒剤、眼科用徐放剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シロップ剤、浸漬剤、煎剤、注射剤、点滴剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などの形態のものに調製することができる。
【００２２】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤の適用及び好適な投与量を決定するために、患者の血液中のＴＮＦ及び可溶性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２）濃度、患部組織における細胞表面のＴＮＦ受容体の発現数などを、常法のエンザイムイムノアッセイ、フローサイトメトリー法又は結合アッセイ法などにより計測することは有意義である。
【００２３】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、いわゆる、投薬単位形態の薬剤をも包含するものとし、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくは約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、例えば、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、座剤、散剤、錠剤、注射剤、点滴剤、パップ剤などが挙げられる。
【００２４】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、有効成分としてのこの発明のＴＮＦ変異体蛋白質以外の、例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤などの薬剤一般に汎用される適宜の調剤用薬を配合することを妨げない。また、この発明の目的を逸脱しない範囲で、ＴＮＦ変異体蛋白質とともに、他の有効成分として、例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、消炎剤などの外皮用薬、ビタミンＡ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤などのビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤などの滋養強壮薬、クロロフィル製剤、色素製剤などの細胞賦活用薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤などの抗腫瘍薬、抗ヒスタミン剤などのアレルギー用薬、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウイルス剤などの化学療法剤、さらには、ホルモン剤、抗生物質製剤、生物学的製剤などのこの発明のＴＮＦ変異体蛋白質以外の薬剤を１又は複数配合してもよい。
【００２５】
さらに、この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、免疫助成剤として、例えば、アクチノマイシンＤ、アセグラトン、イホスファミド、ウベニメクス、エトポシド、エノシタビン、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸エピルビシン、塩酸ゲムシタビン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、塩酸ニムスチン、塩酸ピラルビシン、塩酸ファドゾール水和物、塩酸ブレオマイシン、塩酸ブロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、クレスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ジノスタンチンスチマラマー、酒石酸ビノレルビン、ソブゾキサン、ダカルバジン、チオテパ、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム、ドキシフルリジン、ドセタキセル水和物、トレチノイン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バクリタキセル、ビカルタミド、ピシバニール、ヒドロキシカルバミド、ブスルファン、フルオロウラシル、フルタミド、ベントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシンＣ、ミトブリニトール、メトトレキセート、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ペプロマイシン、レンチナンなどの抗腫瘍薬などと組み合わせて用いることができる。また、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、及びそれらに対する抗体、結合蛋白質、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤又は可溶性受容体とともに用いれば、いずれか一方のみでは容易に達成できない、相乗的に高い効果が得られる。
【００２６】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、経口経路で適用しても非経口経路で適用しても感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、具体的には、例えば、患者の症状や適用後の経過を観察しながら、体重１ｋｇ当たり０．０１乃至１，０００ｍｇ／日、好ましくは、０．１乃至１００ｍｇ／日のこの発明のＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニストを、必要に応じて、複数回に分けて１乃至７回／週の頻度で１週間乃至１年間に亙って経口経路で適用するか、あるいは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、直腸内、腹腔内などの非経口経路により、注射又は点滴により適用する。この発明のＴＮＦ変異蛋白質と水溶性の高分子との複合体は、安定であって、血液中のプロテアーゼなどによって分解され難く、しかも、生体における滞留時間が、ＴＮＦ−αやＴＮＦ変異体蛋白質よりも有意に長く、投与経路によっては１０倍以上にも達することから、同一の感受性疾患に対して同一の経路で適用する場合、投与量を有意に少なくすることができる実益がある。
【００２７】
以下、この発明の詳細につき、実験例に基づいて説明する。
【００２８】
実験例１：ＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニング
常法にしたがって、欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書に記載の実施例２に開示されているヒトＴＮＦリジン変換体、すなわち、ＴＮＦ−αの１１番目、６５番目、９０番目、９８番目、１１２番目及び１２８番目のリジン残基が、それぞれ、メチオニン、セリン、プロリン、アルギニン、アスパラギン、プロリン残基に置換された蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号２）を鋳型として、配列表における配列番号８３及び８４で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、さらに、得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、配列表における配列番号８５及び８６で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、Ｎ末端から２９、３１、３２、１４５、１４６、１４７番目のアミノ酸残基がランダムなアミノ酸残基に置換された配列表における配列番号５で表されるＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号６）を得た。また、同様にして、ヒトＴＮＦリジン変換体ＤＮＡ（配列表における配列番号２）を鋳型にして、配列表における配列番号８５及び８７で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、さらに、得られたＰＣＲ産物と配列表における配列番号８８で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、Ｎ末端から８４乃至８９番のアミノ酸がランダムなアミノ酸に置換された配列表における配列番号７で表される蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号８）を得た。
【００２９】
これらのＤＮＡを常法にしたがって、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（アマシャムバイオサイエンシーズ社製）へ導入し、Ｎ末端から２９、３１、３２、１４５、１４６、１４７番目のアミノ酸残基の全てがランダムなアミノ酸残基に置換されたＴＮＦ変異体蛋白質、又は、８４乃至８９番のアミノ酸残基の全てがランダムなアミノ酸残基に置換されたＴＮＦ変異体蛋白質を発現したファージミドライブラリーを得た。このライブラリーに対して、ＴＮＦ−Ｒ１（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５８２８６に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）をセンサーチップに固定化した市販の表面プラズモン共鳴を利用した検出機器（商品名『ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００』、ビアコア株式会社販売）を用いるパニング法を３回繰り返し適用することによって、ＴＮＦ−Ｒ１に結合するファージクローン、また、同様にして、ＴＮＦ−Ｒ２（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５５９９４に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）を固定化したセンサーチップにより、ＴＮＦ−Ｒ２に結合するファージクローンを得た。
【００３０】
かくして得られたＴＮＦ−Ｒ１に結合するクローンに対してはＴＮＦ−Ｒ２を固定化したセンサーチップを、ＴＮＦ−Ｒ２に結合するクローンに対してはＴＮＦ−Ｒ１を固定化したセンサーチップを用いた上記表面プラズモン共鳴を利用した検出機器により、受容体への結合力を測定し、受容体への結合力に差を有するクローンを選別した。さらに、得られたファージクローンのＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号８９（制限酵素ＮｄｅＩ切断部位、開始コドン、及びＴＮＦ変異体蛋白質の５´末端付近の塩基配列を有する）及び配列番号９０（制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位、終止コドン、ＴＮＦ変異体蛋白質の３´末端付近の塩基配列を有する）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、常法のＰＣＲ法により、プライマー配列に特異的なＤＮＡを増幅した後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化してＤＮＡ断片とした。得られたＤＮＡ断片を、Ｔ７プロモーター領域、Ｔ７ターミネーター領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及びＣｏｌＥ１・Ｏｒｉ領域を有するプラスミドベクター（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、ノバジェン社製）へ、常法にしたがって、その上記制限酵素部位に導入した。さらに、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株へ導入し、ＴＮＦ変異体蛋白質産生用の大腸菌を得た。常法により、得られた大腸菌を培養した後、遠心分離により菌体を回収し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）（２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸、及び０．５Ｍ塩化ナトリウム）にて２回洗浄後、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に加え、常法にしたがい超音波処理し、遠心分離し、産生されたＴＮＦ変異体蛋白質を含む残さを回収した。これを１（ｗ／ｖ）％トリトンエックス−１００を含むＴＥＳ緩衝液に加え、攪拌後に遠心分離して上清を除く操作を３回行い、得られた沈澱物を、８Ｍグアニジン塩酸塩及び５０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、室温遮光下で１６時間攪拌し、遠心分離して上清を回収した。これに１００倍量の１Ｍトリス、０．９（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、０．４ＭＬ−アルギニン塩酸塩、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、０．０５（ｗ／ｖ）％ツイーン２０を含む水溶液に少量ずつ徐々に攪拌しつつ加えた後、４℃で１６時間置した。これを４倍量の０．１（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミンを含むリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に加え、ｐＨを６．５乃至７．５に調整した後、常法にしたがって、Ｑ−セファロース（ファルマシア社製）、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）、スーパーロース１２ ＨＲ １０／３０（ファルマシア社製）及び／又は抗ＴＮＦ−α抗体カラムクロマトグラフィーにより、それぞれのＴＮＦ変異体蛋白質を順次精製した。
【００３１】
得られたＴＮＦ変異体蛋白質は、常法のＨＥｐ−２細胞又はＬ−Ｍ細胞を標的細胞として用いたバイオアッセイを適用することによって細胞障害活性を調べた。また、常法のＤＮＡシークエンス法によって、それぞれのクローンのＤＮＡの変異導入箇所の塩基配列を解読し、どのアミノ酸残基又は終止コドンに置換されているか調べた。また、細胞障害性及び受容体への結合力についての評価方法は、上記と同様の方法により大腸菌で産生させた組換え型ＴＮＦ−αを対照にして、次のように設定した。
【００３２】
「４」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が２倍以上向上
「３」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性がほぼ同等（０．５乃至２倍）
「２」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が０．５乃至０．１倍に低下
「１」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が０．００１乃至０．１倍に低下
「０」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が０．００１倍以下に低下
「−」：測定せず
【００３３】
結果を表１（２９、３１、３２、１４５、１４６及び１４７番目のアミノ酸残基が置換されているＴＮＦ変異体）及び表２（８４乃至８９番目のアミノ酸残基が置換されているＴＮＦ変異体）に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
表１に示すとおり、対照のＴＮＦ−αとＴＮＦリジン変換体は同じ程度の細胞障害活性及びＴＮＦ受容体への結合力を示した。また、ＴＮＦリジン変換体を基にして作製されたＴＮＦ変異体蛋白質においては、クローン番号１乃至４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は弱く、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイでは細胞障害活性を示した。一方、クローン番号５乃至９のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等または同等以下、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は極めて弱く、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイでは細胞障害活性が極めて減弱されていた。この結果から、これらのクローンはすべてＴＮＦ−Ｒ１特異性のＴＮＦ変異体蛋白質であるものの、クローン番号１乃至４のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアゴニスト、クローン番号５乃至９のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアンタゴニストであることが判明した。また、クローン番号１０乃至１４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は対照の組換え型ＴＮＦ−αと同等又は同等以上、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は極めて弱く、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイでは細胞障害活性が極めて減弱されていた。この結果から、クローン番号１０乃至１４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストであることが判明した。
【００３７】
また、表２に示すとおり、対照のＴＮＦリジン変換体と比較して、クローン番号１６乃至３４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等又は同等以上、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は同等又は同等以下であり、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイではほぼ同等の細胞障害活性を示した。一方、クローン番号３５乃至３８のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等であり、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は極めて弱く、バイオアッセイでは細胞障害活性が極めて減弱していた。この結果から、これらのクローンはＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦ変異体蛋白質であるものの、クローン番号１６乃至３４のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアゴニスト、クローン番号３５乃至３８のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアンタゴニストであることが判明した。
【００３８】
実験例２：ＴＮＦ拮抗阻害活性
上記クローン番号３５乃至３８のＴＮＦアンタゴニストについて、拮抗阻害活性をさらに詳細に調べた。１０ｎｇ／ｍｌの常法の遺伝子工学技術を用いて製造した組換え型ヒトＴＮＦ−αと下記表３の濃度のＴＮＦアンタゴニストを含む培養培地を用いて、ＴＮＦ−Ｒ１のみを多量に細胞膜表面に発現しているＨＥｐ−２細胞、または、ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２を発現しているＬ−Ｍ細胞（ＴＮＦ−Ｒ１の発現量はＨＥｐ−２よりも少ない）の生存率（値が小ほどＴＮＦの細胞障害活性が強い）を測定した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３に示すとおり、強い細胞障害活性を示す１０ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトＴＮＦ−α存在下、ＨＥｐ−２細胞の生存率は、１００，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＴＮＦアンタゴニストの添加により、生存率９％から、実験に供した各クローンにおいて、それぞれ８６％、３８％、４３％又は７２％に増加し、組換え型ヒトＴＮＦ−αの細胞障害作用が部分的に打ち消されていた。さらに、ＴＮＦアンタゴニスト５００，０００ｎｇ／ｍｌの濃度では、生存率はそれぞれ１０３％、７４％、７５％、９５％となり、ほぼＴＮＦ−αの細胞障害作用が打ち消された。一方、ＴＮＦアンタゴニストの添加により、Ｌ−Ｍ細胞では、生存率１７％から、１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で生存率がそれぞれ４３％、４３％、５１％、４７％となったが、５００，０００ｎｇ／ｍｌの濃度でも生存率が６４％、５９％、７２％、７０％にまでしか回復しなかった。この結果は、クローン番号３５乃至３８のＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ−Ｒ１のみを豊富に発現するＨＥｐ−２細胞に対しては、ＴＮＦの作用を打ち消すために比較的高濃度のＴＮＦ変異体蛋白質を必要とするものの、ＨＥｐ−２細胞はＴＮＦ−Ｒ２を発現していないゆえに、高濃度のＴＮＦアンタゴニストによって、ＴＮＦの作用を完全に打ち消すことが可能であり、これに対して、ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２の両方を発現するＬ−Ｍ細胞に対しては、ＴＮＦ−Ｒ１を介してのＴＮＦの作用はＴＮＦ−Ｒ１の発現数が少ないために容易に打ち消すことができるものの、ＴＮＦ−Ｒ２によって介してのＴＮＦの作用を打ち消すことができないので、高濃度のＴＮＦアンタゴニストによってもＴＮＦ−αの細胞障害作用を打ち消すことができないと考えられた。したがって、この結果は、この発明のＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ−Ｒ１特異性を有していることを物語っている。
【００４１】
実験例３：ＴＮＦ変異体蛋白質と水溶性の高分子との複合体の調製
実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）又は２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）を燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に濃度０．１乃至１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、水溶性の高分子としてモノメトキシＮ−サクシンイミジルプロピオネートにより活性化させたポリエチレングリコール（ｍ−ＰＡＧ−ＳＰＡ、平均分子量５，０００ダルトン）をモル比で蛋白質の３倍になるように加え、３７℃で３０分間反応させた。次いで、反応混合物へε−アミノカプロン酸をモル比で水溶性の高分子の１０倍量加え、暫時静置して反応を停止させた後、反応混合物を陰イオン交換クロマトカラム（商品名『Ｍｏｎｏ Ｓ』、アマシャムバイオサイエンス社製）によりＨＰＬＣ分画して蛋白質に結合していないポリエチレングリコールを除去して、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質を水溶性の高分子に結合した複合体を得た。これらのうちのＴＮＦアンタゴニスト１４種を、ＨＥｐ−２細胞を用いた実験例２に記載の競合試験に供し、同様にしてＴＮＦ拮抗阻害活性を測定したところ、ポリエチレングリコールを結合していないそれぞれのＴＮＦアンタゴニストの約７０％のＴＮＦ拮抗阻害活性を有していることが判明した。
【００４２】
実験例４：急性毒性試験
常法にしたがって、８週齢の雄性マウス（体重２０乃至２５ｇ）に実験例１で得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）又は２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）、又は、実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト又は２３種類のＴＮＦアゴニストとポリエチレングリコールが結合した複合体のいずれかを、経皮、経口又は腹腔経路で注射投与したところ、ＴＮＦアンタゴニスト及びそれとポリエチレングリコールが結合した複合体のＬＤ５０は、いずれの投与経路においても１００ｍｇ／ｋｇ体重以上であった。このことは、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質及びそれとポリエチレングリコールが結合した複合体がヒトやウシなどの家畜への投与を前提とする医薬品として、又は医薬品に配合して用いることが安全であることを物語っている。
【００４３】
以下、この発明の実施の形態につき、実施例に基づいて説明する。
【００４４】
実施例１：液剤
安定剤として１％（ｗ／ｗ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）、２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）又は実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニストとポリエチレングリコールとの複合体のいずれかを１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。
【００４５】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防、及び症状を緩和するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００４６】
実施例２：液剤
安定剤として１％（ｗ／ｗ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）、２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）又は実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニストとポリエチレングリコールを結合した複合体のいずれかを１０ｍｇ／ｍｌ、組換え型ヒトＴＮＦ−αを１μｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。
【００４７】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防、及び症状を緩和するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００４８】
実施例３：乾燥注射剤
安定剤として１％（ｗ／ｗ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに、実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）とポリエチレングリコールとの複合体のうちのいずれかを１ｇ、欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書の実施例２で得た生理活性複合体（本出願明細書の配列表における配列番号２で表される塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体とポリエチレングリコールとの複合体）を０．１ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥させた後、密栓して乾燥注射剤を得た。
【００４９】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防、及び症状を緩和するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００５０】
実施例４：軟膏剤
滅菌蒸留水にカルボキシビニルポリマー（商品名『ハイビスワコー』、株式会社和光純薬工業製造）とパイロジェンを除去した高純度トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原製造）とをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解した後、実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）又は２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）のいずれかの適量を均一に混合し、ｐＨ７．２に調製して、１ｇ当りＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニストを約１０μｇ含むペースト状物を得た。
【００５１】
延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性感染、又は、細菌感染症や、ＴＮＦに起因する炎症、アレルギーなどの疾患の治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００５２】
実施例５：錠剤
無水結晶性α−マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原製造）に実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）とポリエチレングリコールとの複合体のいずれかの適量を、それに対してモル比で１０，０００分の１量の欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書の実施例２の方法により得られたＴＮＦ活性を有する生理活性複合体（本出願明細書の配列表における配列番号２で表される塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体とポリエチレングリコールとの複合体）を均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当りＴＮＦアンタゴニスト活性を有する生理活性複合体を約１０ｍｇ、ＴＮＦ活性を有する生理活性複合体を約１μｇ含む錠剤を得た。
【００５３】
摂取性、安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性感染、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上説明したとおり、この発明のＴＮＦアンタゴニスト又はそれを有効成分とするＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２を介してのＴＮＦの作用を抑制することができるので、医薬品の分野において、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス疾患剤、抗感染症剤、炎症性疾患剤、免疫疾患剤などとして多種多様の用途を有する。また、ＴＮＦ−Ｒ１に対して特異的に結合するＴＮＦアゴニストは、野性型ＴＮＦとは異なった生物作用が発揮されることが期待される。さらに、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質は、ポリエチレングリコールなどの水溶性の高分子と結合させることにより、生体内の安定性を高めることが可能であるので、医薬品への利用に極めて有利である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は腫瘍壊死因子（以下、本明細書において「ＴＮＦ」と略記する）変異体蛋白質、とりわけ、ＴＮＦ受容体ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２に特異的なＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニスト、及び、それらを有効成分とするＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦは、多くの腫瘍細胞に対して、極めて強力な抗腫瘍作用を発揮することから、抗癌剤としての活用が嘱望されてきた。しかしながら、ＴＮＦは、細胞障害活性による生体への副作用が大きすぎるため、医薬品としてまだ利用されるには至っていない。また、ＴＮＦは、癌や感染症などの疾病時に患者の生体内で産生され、炎症反応を引き起こし、場合によっては症状を重篤化する因子ともなり得る。このため、ＴＮＦの作用を調節する方法の開発が望まれている。ＴＮＦの作用を調節する方法としては、ＴＮＦと結合する抗体を生体に投与し、ＴＮＦの活性を中和する方法があり、当該抗体を有効成分とする医薬品がすでに開発されている。しかしながら、この方法は、ＴＮＦによる有益な生体防御能のすべてを喪失させる恐れがある。
【０００３】
ところで、ＴＮＦ受容体として、分子量５５キロダルトンのＴＮＦ受容体（以下、「ＴＮＦ−Ｒ１」と呼称する。）及び分子量７５キロダルトンのＴＮＦ受容体（以下、「ＴＮＦ−Ｒ２」と呼称する。）が存在することが知られている。ヴァン・オスターデ・エックス（Ｖａｎ Ｏｓｔａｄｅ Ｘ）、タベアニアー・ジェイ（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ Ｊ）、プランジェ・ティー（Ｐｒａｎｇｅ Ｔ）、フィアーズ・ダブル（Ｆｉｅｒｓ Ｗ）、ローカリゼーション・オブ・ジ・アクティブ・サイト・オブ・ヒューマン・ツモア・ネクロシス・ファクター（ｈＴＮＦ）・バイ・ミューテーショナル・アナリシス（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ｈＴＮＦ） ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）、ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＮＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９１年、第１０巻、第４号、８２７乃至８３６頁には、マウスＴＮＦ−Ｒ２に結合しないヒト由来のα型ＴＮＦ（以下、「ＴＮＦ−α」と呼称する）は、両方の受容体と結合するマウスＴＮＦ−αとは異なった生物作用を発揮することが報告されている。したがって、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方にのみに選択的に結合するＴＮＦ変異体蛋白質は、従来のＴＮＦの持つ生物作用とは異なった作用を発揮することが期待される。
【０００４】
ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方にのみ選択的に結合する、すなわち、受容体特異的なＴＮＦ変異体蛋白質を作製するにあたり、ヴァン・オスターデ・エックス（Ｖａｎ Ｏｓｔａｄｅ Ｘ）等は、上記文献において、ＴＮＦ−αにおけるＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２との結合部位を変異導入法によりそれぞれ調べ、その結果、ＴＮＦ−αにおけるＮ末端から２９乃至３４番目、８６番目及び１４６番目のアミノ酸残基への変異導入は、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力を、また、１４３乃至１４５番目のアミノ酸残基への変異導入はＴＮＦ−Ｒ１への結合力を低減させることが開示されている。とりわけ、Ｎ末端から３２番目のアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）に、Ｎ末端から８６番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）に変異されたＴＮＦ−α変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力を保持したまま、ＴＮＦ−Ｒ２との結合力を著しく低減することを開示されている。さらに、特開平６−２５６３９５号公報、特開平７−２８５９９７号公報、ツアング・エックスエム（Ｚｈａｎｇ ＸＭ）、ウエーバー・アイ（Ｗｅｂｅｒ Ｉ）、チェン・エムジェイ（Ｃｈｅｎ ＭＪ）、サイト−ディレクテッド・ミューテーショナル・アナリシス・オブ・ヒューマン・ネクロシス・ファクター−アルファ・レセプター・バインディング・サイト・アンド・ストラクチャー−ファンクショナル・リレーションシップ（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９２年、第２６７巻、第３３号、２４０６９乃至２４０７５頁、及び、ローチャー・エイチ（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｈ）、スチューバー・ディー（Ｓｔｕｅｂｅｒ Ｄ）、バンナー・ディー（Ｂａｎｎｅｒ Ｄ）、マッケイ・エフ（Ｍａｃｋａｙ Ｆ）、レスロイアー・ダブル（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ Ｗ）、ヒューマン・ツモア・ネクロシス・ファクター・アルファー（ティー・エヌ・エフ・アルファ）・ミュータンツ・ウイズ・エクスクルーシブ・スペシフィシティ・フォー・ザ・５５−ｋＤａ・オア・７５−ｋＤａ・ＴＮＦ・レセプターズ（Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ （ＴＮＦ ａｌｐｈａ） ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ５５−ｋＤａ ｏｒ ７５−ｋＤａ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９３年、第２６８巻、第３５号、２６３５０乃至２６３５７頁を参照すると、受容体特異性をＴＮＦ変異体蛋白質に付与するためには、ＴＮＦ−αのＮ末端から２９乃至３４、８１乃至８９、又は、１４３乃至１４７番目のアミノ酸残基に変異導入することが有望であると考えられる。なお、上記文献において、受容体特異的なＴＮＦ‐α変異体蛋白質が作成されており、それらはＴＮＦとしての活性を保持するいわゆるアゴニストである。これらは、ＴＮＦの薬効を期待してのＴＮＦ製剤としての利用が期待できる。
【０００５】
一方、ＴＮＦとしての活性が弱いか全くないＴＮＦ変異体蛋白質、つまりＴＮＦアンタゴニストは、どちらか一方のＴＮＦ受容体に選択的に結合するので、生体内で産生されるＴＮＦを残る一方のＴＮＦ受容体のみに選択的に結合させることができる。しかしながら、上記文献にはどちらか一方のＴＮＦ受容体に特異的なアンタゴニスト活性を有するＴＮＦ変異体蛋白質は開示されておらず、受容体特異的なＴＮＦアンタゴニストの開発が望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
斯かる状況に鑑み、この発明は、ＴＮＦ変異体蛋白質、とりわけ、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニスト、並びにそれを有効成分とするＴＮＦ阻害剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、ＴＮＦ受容体の一種であるＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストを得るべく、網羅的にＴＮＦ変異体蛋白質を作製し、スクリーニングした結果、ＴＮＦ−Ｒ１との結合力のみが野性型ＴＮＦと比べて著しく弱いＴＮＦ変異体蛋白質、又は、ＴＮＦ−Ｒ２との結合力のみが野性型ＴＮＦと比べて著しく弱いＴＮＦ変異体蛋白質を得ることに成功した。これらのＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦといずれか一方のＴＮＦ受容体のみとの結合を拮抗阻害することが可能なＴＮＦアンタゴニスト、又は、いずれか一方のＴＮＦ受容体にのみに選択的に結合して、ＴＮＦ様の作用を示すＴＮＦアゴニストであることを確認し、この発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、この発明は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２に特異的なＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニスト、及び当該蛋白質を有効成分とするＴＮＦ阻害剤を提供することによって前記課題を解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この発明でいうＴＮＦ−Ｒ１特異的とは、ＴＮＦ−Ｒ２との結合力が著しく弱く、その結果、主にＴＮＦ−Ｒ１と結合する能力が顕著であることを意味し、ＴＮＦ−Ｒ２特異的とは、ＴＮＦ−Ｒ１との結合力が著しく弱く、その結果、主にＴＮＦ−Ｒ２と結合する能力が顕著であることを意味する。この発明でいうＴＮＦアンタゴニストとは、ＴＮＦ受容体と結合するが野性型ＴＮＦよりも活性が弱いか全く示さない蛋白質を意味する。この発明のＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方の受容体との結合力が強ければ強いほど、残る一方の受容体への結合が弱ければ弱いほど好ましい。
【００１０】
この発明のＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２に特異的なＴＮＦアンタゴニストは、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−αをコードするＤＮＡに、所望の位置にＮＮＳ配列（Ｎは塩基がＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを、Ｓは塩基がＧ又はＣを示す）を常法のＰＣＲ技術などにより導入し、ファージディスプレー法により、所期の特性を有するクローンを選出することによって得ることができる。また、ＴＮＦ−αの代わりに、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１、６５、９０、９８、１１２、１２８番目のリジン残基のうち１又は２以上が欠失、又は他のアミノ酸残基に置換した、好ましくは、配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体（以下、単に「リジン変換体」という）を基にすることもできる。具体的にいえば、まず、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２への結合力を変化させるために、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列において、それらのＮ末端から２９、３１、３２、１４５、１４６及び１４７番目のアミノ酸残基をランダムなアミノ酸に置換（配列表における配列番号５）するか、また、それらのＮ末端から８４、８５、８６、８７、８８及び８９番目のアミノ酸残基をランダムなアミノ酸に置換（配列表における配列番号７）するために、常法のオリゴＤＮＡ合成技術、ＰＣＲ技術、ＤＮＡライゲーション技術などを駆使して、上記位置のアミノ酸残基のコドンをＮＮＳに置換したＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号６又は８）を作製する。得られたＤＮＡはファージライブラリーを作製するために、ファージミドベクターに組み込み、蛋白質を発現させた後、ＴＮＦ−Ｒ１（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５８２８６に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）又はＴＮＦ−Ｒ２蛋白質（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５５９９４に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）と結合するファージクローンを、表面プラズモン共鳴原理を利用した機器などを用いてパニング法を行うことにより選択する。得られたクローンは、さらに、残る一方の受容体（ＴＮＦ−Ｒ２又はＴＮＦ−Ｒ１）との結合性を調べ、２つの受容体に対する結合力に差を生じたクローンを選択し、基になったＴＮＦ−αあるいはＴＮＦリジン変換体の２分の１、好ましくは１０分の１、さらに好ましくは１，０００分の１、最も好ましくは、検出可能レベル以下までに片方の受容体への結合力が消失したクローンを選択する。選択されたクローンを、ヒト喉頭癌由来の細胞株ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２３）又はマウス結合組織由来の細胞株Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１．２）などのＴＮＦ標的細胞を用いる公知のバイオアッセイによってその生物活性を測定する。その結果、活性が低いもの、例えば、ＴＮＦ−αの２分の１、好ましくは、１０分の１、さらに好ましくは１，０００分の１、最も好ましくは、検出可能レベル以下までに細胞障害活性が消失したファージクローンを選別する。
【００１１】
斯くして得られるこの発明のＴＮＦアンタゴニストは、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−α、又は、配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体におけるＮ末端から、２９、３１、３２、１４５、１４６及び１４７番目のアミノ酸残基、又は、８４乃至８９番目のアミノ酸残基の一部又は全てが他のアミノ酸又は終止コドンに置換されている。これらのＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のいずれかに特異的に結合するが、野性型ＴＮＦよりも活性が低いか全く示さない、いわゆる、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストであることから、生体に投与された場合、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２のどちらか一方と選択的に結合するので、生体内で産生されたＴＮＦが選択された方のＴＮＦ受容体に結合することを阻害する。したがって、生体内で産生されたＴＮＦに対して過剰量のこの発明のＴＮＦアンタゴニストを投与することにより、生体内で産生されたＴＮＦの作用をどちらか一方のＴＮＦ受容体を介してのＴＮＦ活性のみに制御することができる。
【００１２】
この発明のＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアンタゴニストとしては、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２９番目のアミノ酸残基がアルギニン、ヒスチジン又はセリン、３１番目がアルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、プロリン又はセリン、３２番目がヒスチジン、メチオニン、トレオニン又はチロシン、１４５番目がアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸又はセリン、１４６番目がアスパラギン、グリシン、メチオニン又はセリン、及び、１４７番目がアラニン、アスパラギン、プロリン、トレオニン又は終止コドンで置換されるか、又は８４番目がアラニン、トレオニン、セリン又はグリシン、８５番目がプロリン、トレオニン又はグリシン、８６番目がアラニン、グリシン、トレオニン又はプロリン、８７番目がチロシン、イソロイシン又はヒスチジン、８８番目がグルタミン、アスパラギン又はセリン、及び、８９番目がアルギニン、ヒスチジン又はグルタミンで置換されたＴＮＦ変異体蛋白質が挙げられ、例えば、配列表における配列番号９乃至１３又は配列番号１９乃至２２で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ変異体蛋白質が好適であり、この発明のＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストとしては、１４５番目がアラニン、リジン又はアルギニン、１４６番目がグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸又はトレオニン、及び、１４７番目がトレオニン又はアスパラギン酸で置換されたＴＮＦ変異体蛋白質が挙げられ、例えば、配列表における配列番号１４乃至１８で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ変異体蛋白質が好適である。
【００１３】
一方、本発明のＴＮＦアンタゴニストを検索するにあたり、ＴＮＦ−Ｒ１と特異的に結合するも、活性を保持しているか、活性の低下が少ないＴＮＦ変異体蛋白質が得られた。これらの蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ２への結合能を欠いており、野性型ＴＮＦとは異なった生物活性を発揮することが期待されるものである。このような蛋白質はＴＮＦアゴニストとして作用すると考えられ、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から２９番目がロイシン、グルタミン、トレオニン又はリジン、３１番目がアルギニン、グリシン、セリン又はアラニン、３２番目がトリプトファン、チロシン、アスパラギン酸又はグリシン、１４６番目がグルタミン酸、アラニン又はセリン、及び、１４７番目がセリン、アルギニン又はトレオニンで置換されているか、又は、８４番目がトレオニン、セリン又はアスパラギン、８５番目がセリン、リジン、プロリン、チロシン、アルギニン、トレオニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアラニン、８６番目がヒスチジン、トレオニン、ロイシン、アスパラギン、アラニン、バリン、リジン、セリン、グルタミン、グリシン、アルギニン又はアスパラギン酸、８８番目がセリン、プロリン、トレオニン、アスパラギン、アラニン、グリシン、アルギニン又はグルタミン、及び、８９番目がアスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、グリシン、セリン、プロリン、アラニン、グルタミン、フェニルアラニン又はアルギニンで置換されたＴＮＦ変異体蛋白質が挙げられ、例えば、配列表における配列番号３７乃至５９で表されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ変異体蛋白質が好適である。
【００１４】
この発明でいうＴＮＦリジン変換体とは、本発明者らによって、ＴＮＦ−αの生物活性を低減させないように水溶性の高分子に結合させるために、ＴＮＦ−αのアミノ酸配列のＮ末端から１１、６５、９０、９８、１１２及び１２８番目のアミノ酸残基の１又は２以上のリジン残基を他のアミノ酸残基に置換又は欠失したものである（欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書参照）。配列表における配列番号２乃至４の塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体は、ＴＮＦ−αと比較して、同等又は同等以上の活性を有しており、実質的にＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２への結合力についても同等である。したがって、この発明のＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストを水溶性の高分子に結合せしめて複合体として医薬品として利用する場合、蛋白部分にリジン残基を有しないか、リジン残基数を低減させたＴＮＦリジン変換体が有利である。配列表における配列番号９乃至２２で表される上記のこの発明のＴＮＦアンタゴニスト、又は配列表における配列番号３７乃至５９で表される上記のこの発明のＴＮＦアゴニストは、ＴＮＦリジン変換体を基にして作製されており、全くリジン残基を有していないか又は１つしかリジン残基を有していないので、水溶性の高分子と複合体を作製するうえで好適な例であるといえる。なお、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質を水溶性の高分子と結合することを意図しないならば、配列表における配列番号９乃至２２又は３７乃至５９で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端から１１、６５、９０、９８、１１２及び１２８番目のアミノ酸残基の１又は２以上が野性型ＴＮＦと同様にリジン残基であってもよく、それらの全てがリジン残基であってもかまわない。
【００１５】
この発明のＴＮＦ変異体蛋白質は、それらをコードするＤＮＡ、例えば、配列表における配列番号２３乃至３６又は６０乃至８２で表される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡを用いて、常法の遺伝子工学技術により製造することができる。すなわち、必要に応じて、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかをＰＣＲ反応によって増幅した後、蛋白質発現用のプラスミドベクターに組み込んで大腸菌などの宿主へ導入して形質転換し、得られる形質転換体から目的とする蛋白質を産生するクローンを選択し、それを培養することによって所望量得ることができる。形質転換体の培養物から蛋白質を採取するには、例えば、透析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの蛋白質を精製するための汎用の方法を適用すればよく、必要に応じて、これらの方法は適宜組み合わせて用いられる。
【００１６】
この発明のＴＮＦ変異体蛋白質は、生体内への安定性を向上させるために、適宜の水溶性の高分子を人為的に結合せしめることができる。この発明で用いる水溶性の高分子は、実質的に水溶性であって、とりわけ、生体にとって無害かつ抗原となり難い非蛋白質性のものが好ましい。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの単独重合体、エチレングリコールとビニルアルコール、プロピレングリコールなどとの共重合体又はそれらの誘導体などの合成高分子や、エルシナン、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、プルラン、メチルセルロースなどの天然高分子が挙げられ、このうち、分子量が揃った調製物を入手し易い点で、ポリエチレングリコールの単独重合体、ポリエチレングリコールと他の水溶性の高分子との共重合体及びそれらの誘導体が好ましい。なお、水溶性の高分子の分子量は、平均分子量として、通常、５００乃至１００，０００ダルトン、好ましくは、１，０００乃至５０，０００ダルトンの範囲内から選択すればよい。分子量が均一化された水溶性の高分子を用いたい場合には、蛋白質への結合反応に先だって、例えば、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの汎用の方法によって分子量分画することも随意である。また、水溶性の高分子の形状は、直鎖構造及び分岐構造のもののいずれも用いることができるが、立体障害性の観点から分岐構造のものが好ましく用いられる。水溶性の高分子の種類や複合体の最終用途にもよるけれども、水溶性の高分子の分子量が上記範囲を下回ると体内動態を改善し難くなり、逆に、上記範囲を上回ると、複合体の生理活性が低下しすぎて、医薬品として使用できなくなることがある。
【００１７】
ＴＮＦ変異体蛋白質へ斯かる水溶性の高分子を結合せしめるには、遊離のアミノ基へ特異的に反応して共有結合を形成する試薬により別途活性化させておいた水溶性の高分子を蛋白質に反応させるか、あるいは、遊離のアミノ基へ特異的に反応する官能基を有する多官能試薬により、蛋白質と水溶性の高分子とを架橋すればよい。反応方法としては、欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書に記載されている方法に準じて行うことができる。また、斯界において汎用される方法、例えば、特開昭６２−２８９５２２号公報などに記載されたエステル結合法、アミド結合法などを用いてもよい。蛋白質部分と水溶性の高分子との間に形成される結合は、安定な共有結合が形成されるアミド結合法によるものが好ましい。
【００１８】
反応方法にもよるけれども、反応開始時における蛋白質と水溶性の高分子との割合は、モル比で１：０．１乃至１：１００、好ましくは、１：０．５乃至１：５０、最も好ましくは、１：１乃至１：１０の範囲で加減する。一般に、この範囲を下回ると蛋白質同士の結合が顕著となり、反対に、この範囲を上回ると水溶性の高分子同士の結合が顕著となる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率を低下させることとなり、通常、上記の範囲で加減するのが望ましい。反応の際の温度、ｐＨ及び反応時間は、蛋白質が失活又は分解し難く、かつ、望ましくない副反応が最小になるように設定され、具体的には、反応温度を０乃至１００℃、好ましくは、２０乃至４０℃、ｐＨを０．１乃至１２、好ましくは、ｐＨ５乃至９とし、０．１乃至５０時間、好ましくは、１０時間以内に反応が完結するように設定する。斯くして得られたＴＮＦ変異体蛋白質と水溶性の高分子との複合体は、ＴＮＦ変異体蛋白質を精製する場合と同様の方法によって精製することができ、最終使用形態に応じて、例えば、濃縮、塩析、遠心分離、凍結乾燥などの方法により液状又は固状とする。
【００１９】
この発明のＴＮＦ変異体蛋白質、又はそれらと水溶性の高分子との複合体は、感受性疾患を治療及び／又は予防するための、又は、炎症などの症状を緩和するためのＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤として極めて有用である。この発明でいう感受性疾患とは、この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤を単独で投与するか、あるいは、他の薬剤とともに投与することによって治療、予防、又は症状を緩和し得る疾患全般を意味し、具体的には、生体内でのＴＮＦの過剰発現あるいは過剰投与により引き起こされる各種疾病、ＴＮＦの過剰発現を引き起こす各種疾病、又はＴＮＦの腫瘍壊死作用により治療効果が認められる各種疾病であり、個々の疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、副腎腫、甲状腺腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症などの固形腫瘍、白血病、リンパ腫などの血液系腫瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リュウマチ、アレルギー、乾癬などの自己免疫疾患、悪液質、慢性及び急性炎症、関節炎、敗血症、播種性血管内凝固症候群、移植拒絶反応、対宿主移植片疾患、感染、卒中、虚血、急性呼吸困難症候群、再狭窄、脳障害、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳ、骨疾患、アテローム性動脈硬化、川崎病、ベーチェット病、全身性紅斑性狼瘡、多臓器不全、マラリア、髄膜炎、劇症肝炎、ボウル病、アルツハイマー病などが挙げられる。したがって、この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、斯かる疾患を治療及び／又は予防するための、又は炎症などの症状を緩和するための、医薬品として多種多様な用途を有することとなる。
【００２０】
この発明のＴＮＦアンタゴニストとともにＴＮＦを併用することにより、この発明のＴＮＦアゴニストと同様の作用、すなわち、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２を介してのＴＮＦ活性を選択的に発揮させることが可能である。ＴＮＦとしては、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β、それらの変異体蛋白質、又は、それらと水溶性の高分子との複合体であってもよい。この発明のＴＮＦアンタゴニストとＴＮＦの配合量は、患者の症状に合わせて適宜設定すればよいが、片方の受容体を介してのＴＮＦ活性を実質的に発揮させないようにするためには、この発明のＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストをＴＮＦに比べてモル比で１００，０００倍以上、好ましくは５００，０００倍以上配合すればよい。また、上記モル比未満であっても、片方の受容体を介してのＴＮＦ活性は部分的に抑制されるので、通常と異なったＴＮＦの作用が発揮されることやＴＮＦの副作用の軽減化が期待できる。したがって、ＴＮＦアンタゴニストとＴＮＦの比率は、モル比で１乃至１，０００，０００倍、好ましくは、１０乃至１，０００，０００倍、さらに好ましくは１００乃至１，０００，０００倍から選ばれる。
【００２１】
適用対象となる感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、この発明によるＴＮＦ変異体蛋白質を含んでなるＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、投与経路に応じて、１回当たりの用量として、その有効成分を０．２５ｎｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは、２．５ｎｇ乃至４００ｍｇ／ｋｇ体重を投与し、用途に応じて、エキス剤、エリキシル剤、下気道吸入剤、カプセル剤、顆粒剤、眼科用徐放剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シロップ剤、浸漬剤、煎剤、注射剤、点滴剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などの形態のものに調製することができる。
【００２２】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤の適用及び好適な投与量を決定するために、患者の血液中のＴＮＦ及び可溶性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２）濃度、患部組織における細胞表面のＴＮＦ受容体の発現数などを、常法のエンザイムイムノアッセイ、フローサイトメトリー法又は結合アッセイ法などにより計測することは有意義である。
【００２３】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、いわゆる、投薬単位形態の薬剤をも包含するものとし、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくは約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、例えば、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、座剤、散剤、錠剤、注射剤、点滴剤、パップ剤などが挙げられる。
【００２４】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、有効成分としてのこの発明のＴＮＦ変異体蛋白質以外の、例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤などの薬剤一般に汎用される適宜の調剤用薬を配合することを妨げない。また、この発明の目的を逸脱しない範囲で、ＴＮＦ変異体蛋白質とともに、他の有効成分として、例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、消炎剤などの外皮用薬、ビタミンＡ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤などのビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤などの滋養強壮薬、クロロフィル製剤、色素製剤などの細胞賦活用薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤などの抗腫瘍薬、抗ヒスタミン剤などのアレルギー用薬、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウイルス剤などの化学療法剤、さらには、ホルモン剤、抗生物質製剤、生物学的製剤などのこの発明のＴＮＦ変異体蛋白質以外の薬剤を１又は複数配合してもよい。
【００２５】
さらに、この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、免疫助成剤として、例えば、アクチノマイシンＤ、アセグラトン、イホスファミド、ウベニメクス、エトポシド、エノシタビン、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸エピルビシン、塩酸ゲムシタビン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、塩酸ニムスチン、塩酸ピラルビシン、塩酸ファドゾール水和物、塩酸ブレオマイシン、塩酸ブロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、クレスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ジノスタンチンスチマラマー、酒石酸ビノレルビン、ソブゾキサン、ダカルバジン、チオテパ、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム、ドキシフルリジン、ドセタキセル水和物、トレチノイン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バクリタキセル、ビカルタミド、ピシバニール、ヒドロキシカルバミド、ブスルファン、フルオロウラシル、フルタミド、ベントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシンＣ、ミトブリニトール、メトトレキセート、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ペプロマイシン、レンチナンなどの抗腫瘍薬などと組み合わせて用いることができる。また、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、及びそれらに対する抗体、結合蛋白質、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤又は可溶性受容体とともに用いれば、いずれか一方のみでは容易に達成できない、相乗的に高い効果が得られる。
【００２６】
この発明のＴＮＦ阻害剤又はＴＮＦ製剤は、経口経路で適用しても非経口経路で適用しても感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、具体的には、例えば、患者の症状や適用後の経過を観察しながら、体重１ｋｇ当たり０．０１乃至１，０００ｍｇ／日、好ましくは、０．１乃至１００ｍｇ／日のこの発明のＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニストを、必要に応じて、複数回に分けて１乃至７回／週の頻度で１週間乃至１年間に亙って経口経路で適用するか、あるいは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、直腸内、腹腔内などの非経口経路により、注射又は点滴により適用する。この発明のＴＮＦ変異蛋白質と水溶性の高分子との複合体は、安定であって、血液中のプロテアーゼなどによって分解され難く、しかも、生体における滞留時間が、ＴＮＦ−αやＴＮＦ変異体蛋白質よりも有意に長く、投与経路によっては１０倍以上にも達することから、同一の感受性疾患に対して同一の経路で適用する場合、投与量を有意に少なくすることができる実益がある。
【００２７】
以下、この発明の詳細につき、実験例に基づいて説明する。
【００２８】
実験例１：ＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニング
常法にしたがって、欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書に記載の実施例２に開示されているヒトＴＮＦリジン変換体、すなわち、ＴＮＦ−αの１１番目、６５番目、９０番目、９８番目、１１２番目及び１２８番目のリジン残基が、それぞれ、メチオニン、セリン、プロリン、アルギニン、アスパラギン、プロリン残基に置換された蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号２）を鋳型として、配列表における配列番号８３及び８４で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、さらに、得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、配列表における配列番号８５及び８６で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、Ｎ末端から２９、３１、３２、１４５、１４６、１４７番目のアミノ酸残基がランダムなアミノ酸残基に置換された配列表における配列番号５で表されるＴＮＦ変異体蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号６）を得た。また、同様にして、ヒトＴＮＦリジン変換体ＤＮＡ（配列表における配列番号２）を鋳型にして、配列表における配列番号８５及び８７で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、さらに、得られたＰＣＲ産物と配列表における配列番号８８で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法にしたがってＰＣＲを行い、Ｎ末端から８４乃至８９番のアミノ酸がランダムなアミノ酸に置換された配列表における配列番号７で表される蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号８）を得た。
【００２９】
これらのＤＮＡを常法にしたがって、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（アマシャムバイオサイエンシーズ社製）へ導入し、Ｎ末端から２９、３１、３２、１４５、１４６、１４７番目のアミノ酸残基の全てがランダムなアミノ酸残基に置換されたＴＮＦ変異体蛋白質、又は、８４乃至８９番のアミノ酸残基の全てがランダムなアミノ酸残基に置換されたＴＮＦ変異体蛋白質を発現したファージミドライブラリーを得た。このライブラリーに対して、ＴＮＦ−Ｒ１（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５８２８６に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）をセンサーチップに固定化した市販の表面プラズモン共鳴を利用した検出機器（商品名『ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００』、ビアコア株式会社販売）を用いるパニング法を３回繰り返し適用することによって、ＴＮＦ−Ｒ１に結合するファージクローン、また、同様にして、ＴＮＦ−Ｒ２（ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ５５９９４に開示されるアミノ酸配列を有する蛋白質）を固定化したセンサーチップにより、ＴＮＦ−Ｒ２に結合するファージクローンを得た。
【００３０】
かくして得られたＴＮＦ−Ｒ１に結合するクローンに対してはＴＮＦ−Ｒ２を固定化したセンサーチップを、ＴＮＦ−Ｒ２に結合するクローンに対してはＴＮＦ−Ｒ１を固定化したセンサーチップを用いた上記表面プラズモン共鳴を利用した検出機器により、受容体への結合力を測定し、受容体への結合力に差を有するクローンを選別した。さらに、得られたファージクローンのＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号８９（制限酵素ＮｄｅＩ切断部位、開始コドン、及びＴＮＦ変異体蛋白質の５´末端付近の塩基配列を有する）及び配列番号９０（制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位、終止コドン、ＴＮＦ変異体蛋白質の３´末端付近の塩基配列を有する）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、常法のＰＣＲ法により、プライマー配列に特異的なＤＮＡを増幅した後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化してＤＮＡ断片とした。得られたＤＮＡ断片を、Ｔ７プロモーター領域、Ｔ７ターミネーター領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及びＣｏｌＥ１・Ｏｒｉ領域を有するプラスミドベクター（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、ノバジェン社製）へ、常法にしたがって、その上記制限酵素部位に導入した。さらに、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株へ導入し、ＴＮＦ変異体蛋白質産生用の大腸菌を得た。常法により、得られた大腸菌を培養した後、遠心分離により菌体を回収し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）（２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸、及び０．５Ｍ塩化ナトリウム）にて２回洗浄後、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に加え、常法にしたがい超音波処理し、遠心分離し、産生されたＴＮＦ変異体蛋白質を含む残さを回収した。これを１（ｗ／ｖ）％トリトンエックス−１００を含むＴＥＳ緩衝液に加え、攪拌後に遠心分離して上清を除く操作を３回行い、得られた沈澱物を、８Ｍグアニジン塩酸塩及び５０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、室温遮光下で１６時間攪拌し、遠心分離して上清を回収した。これに１００倍量の１Ｍトリス、０．９（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、０．４ＭＬ−アルギニン塩酸塩、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、０．０５（ｗ／ｖ）％ツイーン２０を含む水溶液に少量ずつ徐々に攪拌しつつ加えた後、４℃で１６時間置した。これを４倍量の０．１（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミンを含むリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に加え、ｐＨを６．５乃至７．５に調整した後、常法にしたがって、Ｑ−セファロース（ファルマシア社製）、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５（ファルマシア社製）、スーパーロース１２ ＨＲ １０／３０（ファルマシア社製）及び／又は抗ＴＮＦ−α抗体カラムクロマトグラフィーにより、それぞれのＴＮＦ変異体蛋白質を順次精製した。
【００３１】
得られたＴＮＦ変異体蛋白質は、常法のＨＥｐ−２細胞又はＬ−Ｍ細胞を標的細胞として用いたバイオアッセイを適用することによって細胞障害活性を調べた。また、常法のＤＮＡシークエンス法によって、それぞれのクローンのＤＮＡの変異導入箇所の塩基配列を解読し、どのアミノ酸残基又は終止コドンに置換されているか調べた。また、細胞障害性及び受容体への結合力についての評価方法は、上記と同様の方法により大腸菌で産生させた組換え型ＴＮＦ−αを対照にして、次のように設定した。
【００３２】
「４」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が２倍以上向上
「３」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性がほぼ同等（０．５乃至２倍）
「２」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が０．５乃至０．１倍に低下
「１」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が０．００１乃至０．１倍に低下
「０」：組換え型ＴＮＦ−αよりも結合力若しくは細胞障害活性が０．００１倍以下に低下
「−」：測定せず
【００３３】
結果を表１（２９、３１、３２、１４５、１４６及び１４７番目のアミノ酸残基が置換されているＴＮＦ変異体）及び表２（８４乃至８９番目のアミノ酸残基が置換されているＴＮＦ変異体）に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
表１に示すとおり、対照のＴＮＦ−αとＴＮＦリジン変換体は同じ程度の細胞障害活性及びＴＮＦ受容体への結合力を示した。また、ＴＮＦリジン変換体を基にして作製されたＴＮＦ変異体蛋白質においては、クローン番号１乃至４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は弱く、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイでは細胞障害活性を示した。一方、クローン番号５乃至９のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等または同等以下、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は極めて弱く、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイでは細胞障害活性が極めて減弱されていた。この結果から、これらのクローンはすべてＴＮＦ−Ｒ１特異性のＴＮＦ変異体蛋白質であるものの、クローン番号１乃至４のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアゴニスト、クローン番号５乃至９のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアンタゴニストであることが判明した。また、クローン番号１０乃至１４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は対照の組換え型ＴＮＦ−αと同等又は同等以上、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は極めて弱く、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイでは細胞障害活性が極めて減弱されていた。この結果から、クローン番号１０乃至１４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ２特異的なＴＮＦアンタゴニストであることが判明した。
【００３７】
また、表２に示すとおり、対照のＴＮＦリジン変換体と比較して、クローン番号１６乃至３４のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等又は同等以上、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は同等又は同等以下であり、ＨＥｐ−２細胞及びＬ−Ｍ細胞を用いたバイオアッセイではほぼ同等の細胞障害活性を示した。一方、クローン番号３５乃至３８のＴＮＦ変異体蛋白質は、ＴＮＦ−Ｒ１への結合力は同等であり、ＴＮＦ−Ｒ２への結合力は極めて弱く、バイオアッセイでは細胞障害活性が極めて減弱していた。この結果から、これらのクローンはＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦ変異体蛋白質であるものの、クローン番号１６乃至３４のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアゴニスト、クローン番号３５乃至３８のＴＮＦ変異体蛋白質はＴＮＦ−Ｒ１特異的なＴＮＦアンタゴニストであることが判明した。
【００３８】
実験例２：ＴＮＦ拮抗阻害活性
上記クローン番号３５乃至３８のＴＮＦアンタゴニストについて、拮抗阻害活性をさらに詳細に調べた。１０ｎｇ／ｍｌの常法の遺伝子工学技術を用いて製造した組換え型ヒトＴＮＦ−αと下記表３の濃度のＴＮＦアンタゴニストを含む培養培地を用いて、ＴＮＦ−Ｒ１のみを多量に細胞膜表面に発現しているＨＥｐ−２細胞、または、ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２を発現しているＬ−Ｍ細胞（ＴＮＦ−Ｒ１の発現量はＨＥｐ−２よりも少ない）の生存率（値が小ほどＴＮＦの細胞障害活性が強い）を測定した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３に示すとおり、強い細胞障害活性を示す１０ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトＴＮＦ−α存在下、ＨＥｐ−２細胞の生存率は、１００，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＴＮＦアンタゴニストの添加により、生存率９％から、実験に供した各クローンにおいて、それぞれ８６％、３８％、４３％又は７２％に増加し、組換え型ヒトＴＮＦ−αの細胞障害作用が部分的に打ち消されていた。さらに、ＴＮＦアンタゴニスト５００，０００ｎｇ／ｍｌの濃度では、生存率はそれぞれ１０３％、７４％、７５％、９５％となり、ほぼＴＮＦ−αの細胞障害作用が打ち消された。一方、ＴＮＦアンタゴニストの添加により、Ｌ−Ｍ細胞では、生存率１７％から、１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で生存率がそれぞれ４３％、４３％、５１％、４７％となったが、５００，０００ｎｇ／ｍｌの濃度でも生存率が６４％、５９％、７２％、７０％にまでしか回復しなかった。この結果は、クローン番号３５乃至３８のＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ−Ｒ１のみを豊富に発現するＨＥｐ−２細胞に対しては、ＴＮＦの作用を打ち消すために比較的高濃度のＴＮＦ変異体蛋白質を必要とするものの、ＨＥｐ−２細胞はＴＮＦ−Ｒ２を発現していないゆえに、高濃度のＴＮＦアンタゴニストによって、ＴＮＦの作用を完全に打ち消すことが可能であり、これに対して、ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２の両方を発現するＬ−Ｍ細胞に対しては、ＴＮＦ−Ｒ１を介してのＴＮＦの作用はＴＮＦ−Ｒ１の発現数が少ないために容易に打ち消すことができるものの、ＴＮＦ−Ｒ２によって介してのＴＮＦの作用を打ち消すことができないので、高濃度のＴＮＦアンタゴニストによってもＴＮＦ−αの細胞障害作用を打ち消すことができないと考えられた。したがって、この結果は、この発明のＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ−Ｒ１特異性を有していることを物語っている。
【００４１】
実験例３：ＴＮＦ変異体蛋白質と水溶性の高分子との複合体の調製
実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）又は２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）を燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に濃度０．１乃至１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、水溶性の高分子としてモノメトキシＮ−サクシンイミジルプロピオネートにより活性化させたポリエチレングリコール（ｍ−ＰＡＧ−ＳＰＡ、平均分子量５，０００ダルトン）をモル比で蛋白質の３倍になるように加え、３７℃で３０分間反応させた。次いで、反応混合物へε−アミノカプロン酸をモル比で水溶性の高分子の１０倍量加え、暫時静置して反応を停止させた後、反応混合物を陰イオン交換クロマトカラム（商品名『Ｍｏｎｏ Ｓ』、アマシャムバイオサイエンス社製）によりＨＰＬＣ分画して蛋白質に結合していないポリエチレングリコールを除去して、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質を水溶性の高分子に結合した複合体を得た。これらのうちのＴＮＦアンタゴニスト１４種を、ＨＥｐ−２細胞を用いた実験例２に記載の競合試験に供し、同様にしてＴＮＦ拮抗阻害活性を測定したところ、ポリエチレングリコールを結合していないそれぞれのＴＮＦアンタゴニストの約７０％のＴＮＦ拮抗阻害活性を有していることが判明した。
【００４２】
実験例４：急性毒性試験
常法にしたがって、８週齢の雄性マウス（体重２０乃至２５ｇ）に実験例１で得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）又は２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）、又は、実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト又は２３種類のＴＮＦアゴニストとポリエチレングリコールが結合した複合体のいずれかを、経皮、経口又は腹腔経路で注射投与したところ、ＴＮＦアンタゴニスト及びそれとポリエチレングリコールが結合した複合体のＬＤ５０は、いずれの投与経路においても１００ｍｇ／ｋｇ体重以上であった。このことは、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質及びそれとポリエチレングリコールが結合した複合体がヒトやウシなどの家畜への投与を前提とする医薬品として、又は医薬品に配合して用いることが安全であることを物語っている。
【００４３】
以下、この発明の実施の形態につき、実施例に基づいて説明する。
【００４４】
実施例１：液剤
安定剤として１％（ｗ／ｗ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）、２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）又は実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニストとポリエチレングリコールとの複合体のいずれかを１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。
【００４５】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防、及び症状を緩和するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００４６】
実施例２：液剤
安定剤として１％（ｗ／ｗ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）、２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）又は実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニストとポリエチレングリコールを結合した複合体のいずれかを１０ｍｇ／ｍｌ、組換え型ヒトＴＮＦ−αを１μｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。
【００４７】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防、及び症状を緩和するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００４８】
実施例３：乾燥注射剤
安定剤として１％（ｗ／ｗ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに、実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）とポリエチレングリコールとの複合体のうちのいずれかを１ｇ、欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書の実施例２で得た生理活性複合体（本出願明細書の配列表における配列番号２で表される塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体とポリエチレングリコールとの複合体）を０．１ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥させた後、密栓して乾燥注射剤を得た。
【００４９】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防、及び症状を緩和するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００５０】
実施例４：軟膏剤
滅菌蒸留水にカルボキシビニルポリマー（商品名『ハイビスワコー』、株式会社和光純薬工業製造）とパイロジェンを除去した高純度トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原製造）とをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解した後、実験例１の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）又は２３種類のＴＮＦアゴニスト（クローン番号１乃至４、１６乃至３４）のいずれかの適量を均一に混合し、ｐＨ７．２に調製して、１ｇ当りＴＮＦアンタゴニスト又はＴＮＦアゴニストを約１０μｇ含むペースト状物を得た。
【００５１】
延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性感染、又は、細菌感染症や、ＴＮＦに起因する炎症、アレルギーなどの疾患の治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００５２】
実施例５：錠剤
無水結晶性α−マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原製造）に実験例３の方法により得た１４種類のＴＮＦアンタゴニスト（クローン番号５乃至１４、３５乃至３８）とポリエチレングリコールとの複合体のいずれかの適量を、それに対してモル比で１０，０００分の１量の欧州公開特許ＥＰ１３５４８９３号明細書の実施例２の方法により得られたＴＮＦ活性を有する生理活性複合体（本出願明細書の配列表における配列番号２で表される塩基配列に併記されるアミノ酸配列を有するＴＮＦリジン変換体とポリエチレングリコールとの複合体）を均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当りＴＮＦアンタゴニスト活性を有する生理活性複合体を約１０ｍｇ、ＴＮＦ活性を有する生理活性複合体を約１μｇ含む錠剤を得た。
【００５３】
摂取性、安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性感染、細菌感染症、炎症性疾患及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上説明したとおり、この発明のＴＮＦアンタゴニスト又はそれを有効成分とするＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２を介してのＴＮＦの作用を抑制することができるので、医薬品の分野において、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス疾患剤、抗感染症剤、炎症性疾患剤、免疫疾患剤などとして多種多様の用途を有する。また、ＴＮＦ−Ｒ１に対して特異的に結合するＴＮＦアゴニストは、野性型ＴＮＦとは異なった生物作用が発揮されることが期待される。さらに、この発明のＴＮＦ変異体蛋白質は、ポリエチレングリコールなどの水溶性の高分子と結合させることにより、生体内の安定性を高めることが可能であるので、医薬品への利用に極めて有利である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する腫瘍壊死因子の変異体蛋白質であって、配列表における配列番号９乃至２２で表されるアミノ酸配列のいずれかを有する、腫瘍壊死因子変異体蛋白質。
【請求項１】
配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する腫瘍壊死因子の変異体蛋白質であって、配列表における配列番号９乃至２２で表されるアミノ酸配列のいずれかを有する、腫瘍壊死因子変異体蛋白質。
【公開番号】特開２０１２−２１０１５（Ｐ２０１２−２１０１５Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９６７８０（Ｐ２０１１−１９６７８０）
【出願日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【分割の表示】特願２０１０−２２７６３５（Ｐ２０１０−２２７６３５）の分割
【原出願日】平成１７年１月５日（２００５．１．５）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【出願人】（５０２３４０７０１）
【出願人】（５０２３３９８６４）
【出願人】（５０２３３９８７５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【分割の表示】特願２０１０−２２７６３５（Ｐ２０１０−２２７６３５）の分割
【原出願日】平成１７年１月５日（２００５．１．５）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【出願人】（５０２３４０７０１）
【出願人】（５０２３３９８６４）
【出願人】（５０２３３９８７５）
【Ｆターム（参考）】
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