ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質の製法
細胞培養、特に（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量の１つまたはそれ以上により特徴付けられるタンパク質および／またはポリペプチドの大規模生産の改善システムに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、仮特許出願第６０／６０５，０９７、６０／６０４，９４１および６０／６０５，０７４号（それぞれ、２００４年８月２７日に出願し、これらは出典明示により本明細書に組み入れる）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質およびポリペプチドは、治療剤としてますます重要になっている。大抵の場合、治療タンパク質およびポリペプチドは、目的の特定のタンパク質またはポリペプチドを非常に高レベルで産生するように設計および／または選択された細胞から、細胞培養にて生産される。細胞培養条件の制御および最適化は、タンパク質およびポリペプチドの商業生産の成功にとって非常に重要である。
【０００３】
細胞培養にて生産される多くのタンパク質およびポリペプチドは、細胞を一定期間培養し、ついで、培養を終え、産生されたタンパク質またはポリペプチドを単離する、バッチまたはフェドバッチ（fed-batch）法で生産される。生産されたタンパク質またはポリペプチドの最終的な量と質は、細胞培養の条件に非常に影響を受ける。例えば、慣用的なバッチおよびフェドバッチ培養法は、しばしば、細胞成長、生存率および生産または目的のタンパク質またはポリペプチドの安定性に不利益をもたらす代謝廃棄物の産生を引き起こす。バッチおよびフェドバッチ培養法におけるタンパク質またはポリペプチドの生産を改善する努力がなされているが、さらなる改善がいまだ必要である。
【０００４】
加えて、細胞、特に哺乳動物細胞の培養において用いるための合成培地（すなわち、公知の個々の成分からなり、血清および他の動物由来成分を含まない培地）の改善のために多大な努力がなされてきた。合成培地において、細胞成長特性は血清由来の培地と比較して非常に異なる。合成培地における細胞培養によるタンパク質またはポリペプチドの生産の改善されたシステムを発達させる特定のニーズがある。
【０００５】
発明の概要
本発明は、細胞培養におけるタンパク質および／またはポリペプチドの大規模生産のための改善されたシステムを提供する。例えば、本発明は、１つまたはそれ以上の：ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量；ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比；ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比；ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比；またはｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギン濃度を合わせた累積量により特徴付けられる培地を利用する、商業規模の（例えば、５００Ｌ以上）培養法を提供する。当業者は、上で用いられる「累積」が、培養開始時に加えられた成分およびその後加えられた成分を含む、細胞培養の過程において加えられた特定の成分（複数でも可）の総量を意味することは理解できるだろう。本発明のある種の好ましい具体例において、培養物の「フィード」を最小限にすることが望ましく、したがって、初期に存在する量を最大限にすることが望ましい。もちろん、培地成分は培養中に代謝され、同じ累積量の所定の成分の培養物は、それらの成分が異なる時間に加えられた場合には（例えば、すべて初期に存在することに対して、いくつかはフィードにより加える）、異なる絶対値を有するだろう。
【０００６】
本発明により、かかる培地の使用により高レベルのタンパク質生産およびアンモニウムおよび／または乳酸塩のようなある種の望ましくない因子の蓄積を減少させることが可能となる。
【０００７】
当業者は、本発明の培地が合成および非合成培地の両方を含むことは理解できるだろう。本発明のある種の好ましい具体例において、培養培地は、培地の組成が公知であり、コントロールされた合成培地である。
【０００８】
本発明のある種の好ましい具体例において、培養法は、培養物を第１の培養条件から第２の培養条件に変更して、細胞の代謝シフトを行うことを含む。いくつかの具体例において、この変更は、培養が、最大限の細胞密度の約２０〜８０％に達した場合に行われる。いくつかの具体例において、この変更は、培養を維持する場合の温度（または温度範囲）を含む。別に、または加えて、本発明は、培養物における乳酸塩および／またはアンモニウムレベルを、ピークに達した後、時間と共に減少させるように調節した方法を提供する。他の具体例において、シフトは、ｐＨ、オスモル濃度または化学誘導剤レベル、例えばアルカン酸またはその誘導体をシフトさせることを含む。
【０００９】
本発明の細胞培養は、ホルモンおよび／または他の成長因子、特にイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（一般的に非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質または他のエネルギー源を含む、栄養物および／または他の培地成分を補足していてもよい。本発明のある種の具体例において、化学誘導剤、例えばヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酢酸ナトリウム（「ＮａＢ」）を培地に補足することは有益であり得る。これらの任意のサプリメントは、培養の開始時に加えてもよく、あるいは、消費した栄養分の補給または他の理由により後から加えてもよい。一般的には、本発明に従って、補給を最小限にするように、初期培地組成を選択することが望ましい。
【００１０】
ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、乳酸レベル、アンモニウムレベル、オスモル濃度または発現ポリペプチドまたはタンパク質の力価を含む、種々の培養条件は、本発明に従ってモニターしてもよい。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、抗ＧＤＦ−８細胞を用いる振盪フラスコでの培地１および培地２の比較を示す。
図２は、培地１での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長および生存率を示す。
図３は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞成長を示す。
図４は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞生存率を示す。
図５は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物のアンモニウムレベルを示す。
図６は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の乳酸レベルを示す。
図７は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図８は、対照およびグルタミン不足フィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞密度を示す。
図９は、対照およびグルタミン不足フィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞生存率を示す。
図１０は、対照およびグルタミン不足培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物のアンモニウムレベルを示す。
図１１は、対照およびグルタミン不足培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の乳酸レベルを示す。
図１２は、対照およびグルタミン不足培養条件での抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図１３は、培地１および培地２での、抗ＧＤＦ−８細胞の鉄投与応答を示す。
図１４は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の細胞密度を示す。
図１５は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の細胞生存率を示す。
図１６は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の抗ルイスＹ力価を示す。
図１７は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物における乳酸レベルを示す。
図１８は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物におけるアンモニウムレベルを示す。
図１９は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物のオスモル濃度を示す。
図２０は、抗ルイスＹ細胞の細胞密度を示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２１は、抗ルイスＹ細胞の細胞生存率を示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２２は、抗ルイスＹ培養の平均力価を示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２３は、抗ルイスＹ細胞のアンモニウムレベルを示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２４は、フェドバッチ培養に用いたインペラー・ジャンプを示す。
図２５は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図２６は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８細胞の生存率を示す。
図２７は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図２８は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図２９は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図３０は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図３１は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図３２は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図３３は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図３４は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図３５は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞生存率を示す。
図３６は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図３７は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図３８は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミンレベルを示す。
図３９は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図４０は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物のオスモル濃度を示す。
図４１は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図４２は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図４３は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図４４は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミンレベルを示す。
図４５は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミン酸レベルを示す。
図４６は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図４７は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物オスモル濃度を示す。
図４８は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図４９は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図５０は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図５１は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミンレベルを示す。
図５２は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図５３は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図５４は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図５５は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図５６は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図５７は、培地１、３および９での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図５８は、培地１、３および９での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図５９は、種々のレベルのグルタミン単独およびグルタミンおよびアスパラギンの組合せに関する、推定抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図６０は、試験した種々の培地条件下での、抗Ａベータ細胞の細胞成長を示す。
図６１は、試験した種々の培地条件下での、抗Ａベータ細胞の細胞生存率を示す。
図６２は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ培養物の乳酸レベルを示す。
図６３は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ培養物のアンモニウムレベルを示す。
図６４は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ力価を示す。
図６５は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ培養物のオスモル濃度を示す。
図６６は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの細胞成長を示す。
図６７は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの生存率を示す。
図６８は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養の残存グルコースをを示す。
図６９は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養のグルタミンレベルを示す。
図７０は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養の乳酸濃度を示す。
図７１は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養での、アンモニウムレベルを示す。
図７２は、種々の実験条件下での、ＴＮＦＲ−Ｉｇ相対力価を示す。
図７３は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞の細胞密度を示す。
図７４は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞の力価を示す。
図７５は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞の乳酸レベルを示す。
図７６は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞のアンモニウムレベルを示す。
【００１２】
定義
「約」：本明細書で用いられる場合、「約」なる用語は、１またはそれ以上の特定の細胞培養条件に適するように、その培養条件に関する規定の基準値と同様である数値の範囲を意味する。ある種の具体例において、「約」なる用語は、その培養条件に関する規定の基準値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１パーセント以下の範囲の値を意味する。
【００１３】
「アミノ酸」：本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」なる用語は、ポリペプチドの形成に通常用いられる２０種の天然のアミノ酸、またはそれらのアミノ酸単独もしくは誘導体を意味する。本発明のアミノ酸は、培地において細胞培養物に与えられる。培地に与えられるアミノ酸は、塩または水和物の形態として提供してもよい。
【００１４】
「抗体」：本明細書で用いられる場合、「抗体」なる用語は、抗原と特異的に結合（免疫反応）する１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを意味する。本明細書で用いられる場合、「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成」なる用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応が可能なただ１種の抗原結合部位を含有する抗体分子のクローン群を意味し、一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル組成」は、抗原の特定の抗原と相互作用が可能な多種の抗原結合部位を含有する、抗体分子のクローン群を意味する。モノクローナル抗体の定義は、慣用的な技術により誘導されたクローン分子ならびに特定の残基を操作または変異させて誘導した合成配列の分子、例えばヒト化抗体を含む。
【００１５】
「バッチ培養」：本明細書で用いられる場合、「バッチ培養」なる用語は、培地（下記の「培地」の定義を参照）ならびに細胞自体を含む、最終的に細胞の培養に用いるすべての成分を、培養工程の始めに与える細胞の培養方法を意味する。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止し、培地の細胞および／または成分を回収し、精製してもよい。
【００１６】
「バイオリアクター」：本明細書で用いられる場合、「バイオリアクター」なる用語は、哺乳動物細胞培養物の成長に用いられる容器を意味する。バイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養に利用する限り、いずれの大きさであってもよい。典型的には、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれの体積であってもよい。限定するものではないがｐＨおよび温度を含むバイオリアクターの初期条件は、典型的には、培養期間中にコントロールすることができる。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地中に懸濁させた哺乳動物細胞培養物を保持するのに適した、ガラス、プラスチックまたは金属を含むいずれもの物質から構成されていてもよい。本明細書で用いられる場合、「生産用バイオリアクター」なる用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の生産に用いる最終的なバイオリアクターを意味する。大規模細胞培養生産用バイオリアクターの体積は、典型的には、少なくとも５００リットルであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれの体積であってもよい。当業者は、本発明の実施に用いるのに適したバイオリアクターを選択することができるだろう。
【００１７】
「細胞密度」：本明細書で用いられる場合、「細胞密度」なる用語は、培地の所定の体積中に存在する細胞の数を意味する。
「細胞生存率」：本明細書で用いられる場合、「細胞生存率」なる用語は、所定の培養条件または実験条件下で、培養物中の細胞が生存する能力を意味する。また、本明細書で用いられる場合、該用語は、ある時点の培養物中のすべての生存および死亡細胞の合計数に対する、その時点で生存している細胞の割合を意味する。
【００１８】
「培養物」、「細胞培養物」および「哺乳動物細胞培養物」：本明細書で用いられる場合、これらの用語は、細胞群の生存および／または成長に適した条件下で培地（下記の「培地」の定義を参照）に懸濁した哺乳動物細胞群を意味する。当業者には明らかなように、本明細書で用いられる場合、これらの用語は、哺乳動物細胞群および群を懸濁させる培地を含む組合せも意味する。
【００１９】
「フェドバッチ培養」：本明細書で用いられる場合、「フェドバッチ培養」なる用語は、付加的な成分を、培養工程開始後のある時点で培養物に与える細胞の培養方法を意味する。典型的には、与えられる成分は、培養工程中に消費される細胞用の栄養補給剤を含む。典型的には、フェドバッチ培養を、ある時点で停止して、培地中の細胞および／または成分を回収し、精製してもよい。
【００２０】
「フラグメント」：本明細書で用いられる場合、「フラグメント」なる用語は、ポリペプチドを意味し、そのポリペプチドに独自のまたはそれを特徴付ける所定のポリペプチドの分離部分として定義される。また、本明細書で用いられる場合、該用語は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持した所定のポリペプチドの分離部分を意味する。好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。より好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。さらにより好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。また、本明細書で用いられる場合、この用語は、完全長ポリペプチドに見られる少なくとも既存の配列エレメントを含む所定のポリペプチドの部分も意味する。好ましくは、配列エレメントは、完全長ポリペプチドの、少なくとも４〜５個、より好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸に及ぶ。
【００２１】
「遺伝子」：本明細書で用いられる場合、「遺伝子」なる用語は、細胞代謝または細胞発達のある態様において機能する、ヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ、少なくとも、分離最終産物、典型的には、限定するものではないが、ポリペプチドをコードするその部分を意味する。該用語は、単にポリペプチドまたは他の分離最終産物をコードするコーディング配列を意味するだけでなく、発現の基礎レベルを調節するコーディング配列（下記の「遺伝子制御因子」の定義を参照）の前後、ならびに、介在配列（「イントロン」）と個々のコーディングセグメント（「エクソン」）の間の領域を含みうる。
【００２２】
「遺伝子制御因子」：本明細書で用いられる場合、「遺伝子制御因子」なる用語は、操作的に結合して、遺伝子発現を調節するいずれもの配列エレメントを意味する。遺伝子制御因子は、発現レベルを増加または減少させることにより機能し、コーディング配列の前、内または後に位置することができる。遺伝子制御因子は、例えば、転写の開始、伸長または終結、細胞内でのｍＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡ編集、ｍＲＮＡ復元、ｍＲＮＡの局在化、翻訳の開始、伸長または終結、あるいは遺伝子発現の他のいずれもの段階を調節することにより、遺伝子発現のいずれもの段階で作用しうる。遺伝子制御因子は、個別に、または他と組み合わせて機能しうる。
【００２３】
「ハイブリドーマ」：本明細書で用いられる場合、「ハイブリドーマ」なる用語は、免疫学的供給源および抗体産生細胞由来の不死化細胞の融合により得られる細胞を意味する。得られたハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマの作成に用いられる個々の細胞は、限定するものではないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびヒトを含むいずれもの哺乳動物源から得ることができる。また、この用語は、ヒト細胞およびマウス骨髄腫細胞株間の融合の産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合の子孫が、形質細胞と融合した場合に生じる、トリオーマ細胞株を含む。さらに、該用語は、抗体を産生する不死化ハイブリッド細胞株、例えばグアドローマ（例えば、Milstein et al., Nature, 537:3053 (1983)を参照）を含む。
【００２４】
「合成生存細胞密度」：本明細書で用いられる場合、「合成生存細胞密度」なる用語は、培養中の生存細胞の平均密度に、培養を行っている時間を乗じたものを意味する。生産されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量が、培養中に存在する生存細胞の数に比例すると過程すると、合成生存細胞密度は、培養中に生産されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量を推測するためのツールとして有用である。
【００２５】
「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」：本明細書で用いられる場合、これらの用語は、成長する哺乳動物細胞に栄養分を与える、栄養分を含有する溶液を意味する。典型的には、これらの溶液は、細胞が最小限の成長および／または生存するのに必要な必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質および微量元素を提供する。また、溶液は、最小限の割合以上に、成長および／または生存率を増強するホルモンおよび成長因子を含む、成分を含有していてもよい。好ましくは、溶液は、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度で調製される。また、培地は、「合成培地」−タンパク質、加水分解物または未知の組成の成分を含有しない、血清不含培地であってもよい。合成培地は動物由来の成分を含まず、すべての成分が公知の化学構造を有する。
【００２６】
「代謝廃棄物」：本明細書で用いられる場合、「代謝廃棄物」なる用語は、細胞培養物に何らかの害を、特に所望の組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に関連する害を及ぼす、正常または異常代謝過程の結果物としての、細胞培養により産生される化合物を意味する。例えば、代謝廃棄物は、細胞培養物の成長または生存率に害を与え、産生される組み換えポリペプチドまたはタンパク質の量を減少させ、発現ポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み、安定性、グリコシル化または他の翻訳後修飾を改変し、あるいは、他の多くの点で、細胞および／または組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に悪影響を及ぼしうる。代表的な代謝廃棄物は、グルコース代謝の結果として産生される乳酸塩およびグルタミン代謝の結果として産生されるアンモニウムが挙げられる。本発明は、哺乳動物細胞培養における代謝廃棄物の産生を遅らせ、これを減少させ、またはさらに除去することを目的とする。
【００２７】
「オスモル濃度」および「重量オスモル濃度」：「重量オスモル濃度」は、水溶液に溶解した溶質粒子の浸透圧の尺度である。溶質粒子は、イオンおよび非イオン性分子を含む。重量オスモル濃度は、１ｋｇの溶液に溶解している浸透活性粒子の濃度（例えば、オスモル）として表される（３８℃で、１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧と等価である）。これに対して、「オスモル濃度」は、１リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を意味する。本明細書で用いられる場合、略号「ｍＯｓｍ」は、「ミリオスモル／ｋｇ溶液」を意味する。
【００２８】
「潅流培養」：本明細書で用いられる場合、「潅流培養」なる用語は、培養工程の開始後、培養物に持続的または半持続的に付加的な成分を供給する、細胞の培養方法を意味する。典型的には、供給される成分は、培養工程中に消費される細胞用の栄養補給剤を含む。典型的には、培地中の細胞および／または成分を継続的または半継続的に回収し、精製してもよい。
【００２９】
「ポリペプチド」：本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合を介して一緒に連結したアミノ酸の連続鎖を意味する。該用語は、いずれもの長さのアミノ酸鎖を表すのに用いられるが、当業者は、該用語が、非常に長い鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して一緒に結合した２つのアミノ酸を含む、最小限の鎖も意味することは理解できるだろう。
【００３０】
「タンパク質」：本明細書で用いられる場合、「タンパク質」なる用語は、別個のユニットとして機能する１個またはそれ以上のポリペプチドを意味する。単一のポリペプチドが別個の機能性ユニットであり、別個の機能性ユニットを形成するのに他のポリペプチドと恒久的な物理結合を必要とする場合、本明細書で用いられる場合、該「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、ほとんど同じ意味で用いられる。別個の機能性ユニットが、他と物理的に結合した１個以上のポリペプチドからなる場合、本明細書で用いられる場合、「タンパク質」なる用語は、物理的に結合し、別個のユニットとして一緒に機能する複数のポリペプチドを意味する。
【００３１】
「組み換え発現ポリペプチド」および「組み換えポリペプチド」：本明細書で用いられる場合、これらの用語は、そのポリペプチドを発現するように遺伝子学的に設計された哺乳動物ホスト細胞から発現するポリペプチドを意味する。組み換え発現ポリペプチドは、哺乳動物ホスト細胞において正常に発現されたポリペプチドと一致するか、または同一でありうる。また、組み換え発現ポリペプチドは、ホスト細胞と異なっていてもよく、すなわち、哺乳動物ホスト細胞において正常に発現されるペプチドと異種のものであってもよい。別として、組み換え発現ポリペプチドは、ポリペプチドの一部が、哺乳動物ホスト細胞において正常に発現されるポリペプチドと一致するか、または同一である、アミノ酸配列を含有するが、他の部分がホスト細胞とは異なっているという点でキメラ性であってもよい。
【００３２】
「播種」：本明細書で用いられる場合、「播種」なる用語は、バイオリアクターまたは他の容器に細胞培養物を提供する工程を意味する。細胞は、他のバイオリアクターまたは容器で前もって増殖させていてもよい。別として、細胞は冷凍され、バイオリアクターまたは容器に提供する直前に解凍してもよい。該用語は、単細胞を含む多数の細胞を意味する。
【００３３】
「力価」：本明細書で用いられる場合、「力価」なる用語は、所定体積の培地により分割した哺乳動物細胞培養物により産生された、組み換え発現ポリペプチドまたはタンパク質の総量を意味する。典型的には、力価は、培地１ミリリットルあたりのポリペプチドまたはタンパク質を単位として表す。
【００３４】
ある種の好ましい具体例の詳細な記載
本発明は、細胞培養によるタンパク質および／またはポリペプチドの製造に関する改善されたシステムを提供する。特に、本発明は、細胞成長、生存率および／またはタンパク質産生または質に有害である１つまたはそれ以上の代謝産物の産生を最小限にするシステムを提供する。本発明の好ましい具体例において、細胞培養は、バッチまたはフェドバッチ培養である。本発明の他のある種の好ましい具体例は、以下に詳細に記載する。しかしながら、当業者は、これらの好ましい具体例の種々の改良されたものが本発明の範囲に含まれることは理解できるだろう。本発明の請求の範囲は、具体例の記載に限定されるものではない。
【００３５】
ポリペプチド
ホスト細胞において発現可能なポリペプチドは、本発明の方法に従って生産することができる。ポリペプチドは、ホスト細胞の内部の遺伝子から、または遺伝子操作によりホスト細胞に導入された遺伝子から発現することができる。ポリペプチドは、天然のものであってもよく、あるいは、人により設計されるか、または選択された配列を有するものであってもよい。人工ポリペプチドは、天然に生じる別個の他のポリペプチドセグメントから構成されていてもよく、あるいは、天然に存在しない１つまたはそれ以上のセグメントを含んでいてもよい。
本発明に従って望ましく発現されうるポリペプチドは、目的の生物学的または化学的活性に基づいて選択されるだろう。例えば、本発明は、医薬的または商業的関連がある酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤等を発現するのに用いることができる。
【００３６】
抗体
現在、医薬品または他の市販の薬剤、抗体の製品として使用され、研究されている多くの所定の抗体が、本発明における特定の目的の抗体である。抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質である。ホスト細胞において発現することができるいずれもの抗体を、本発明に従って用いることができる。好ましい具体例において、発現される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３７】
他の好ましい具体例において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、１つ以上の有機体から誘導されるアミノ酸フラグメントを含有する。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラットまたは他の種の抗体から由来の抗原結合ドメインを、ヒト定常領域と一緒に含みうる。種々のキメラ抗体の製造方法が、例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985)；Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., 米国特許第４，８１６，５６７号；Boss et al., 米国特許第４，８１６，３９７号；Tanaguchi et al., 欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開ＥＰ０１７３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂに記載されている。
【００３８】
他の好ましい具体例において、モノクローナル抗体は、例えば、リボソームディスプレイ（ribosome-display）またはファージディスプレイ（phage-display）法の使用（例えば、Winter et al., 米国特許第６，２９１，１５９号およびKawasaki,米国特許第５，６５８，７５４号を参照）により、あるいは、天然抗体遺伝子が不活性化されており、機能的にヒト抗体遺伝子で置き換えられているが、天然の免疫系の他の構成要素は損なわれていない、異種移植（xenographic species）種の使用（例えば、Kucherlapati et al.,米国特許第６，６５７，１０３号を参照）により誘導されるヒト抗体である。
【００３９】
他の好ましい具体例において、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、大多数のアミノ酸残基がヒト抗体由来であり、ヒト対照にデリバリーした場合、免疫反応の可能性を最小限にするキメラ抗体である。ヒト化抗体において、相補性決定領域におけるアミノ酸残基は、少なくとも一部で、所望の抗原特異性またはアフィニティを与える非ヒト種由来の残基に置き換わっている。かかる改変免疫グロブリン分子は、当該分野で公知のいくつかの手法により製造することができ（例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983)；Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983)；Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)）、好ましくは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ０２３９４００（出典明示により本明細書に組み入れる）に記載の方法により製造することができる。ヒト化抗体は、例えば、Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britainにより市販されている。さらなる引用文献に関しては、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992）（すべて出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【００４０】
他の好ましい具体例において、上記のモノクローナル、キメラまたはヒト化抗体は、天然の種においていずれの抗体も生じないアミノ酸残基を含有してもよい。これらの異種の残基は、モノクローナル、キメラまたはヒト化抗体に新規のまたは修飾した特異性、アフィニティまたはエフェクター機能を与えるために用いることができる。他の好ましい具体例において、上記の抗体は、全身性薬物療法、例えば毒素、低分子量細胞毒性剤、生物学的応答修飾因子および放射性核種用の薬剤とコンジュゲートしてもよい（例えば、Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates、ＵＳ２００４００８２７６４Ａ１を参照）。
【００４１】
一の具体例において、抗体は、アミロイド前駆タンパク質のＡβフラグメントまたはアミロイド斑の他の成分に特異的に結合する抗体であり、アルツハイマー病を特徴つける脳におけるアミロイド斑の蓄積に対して有用である（例えば、米国仮出願番号第６０／６３６，６８４号）。
【００４２】
他の具体例において、本発明の抗体は、増殖性障害、例えば癌における、標的細胞および／または組織で発現する細胞表面抗原に対するものである。一の具体例において、抗体は、ＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体である。ルイスＹは、構造：Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４［Ｆｕｃα１→３］ＧｌｃＮａｃβ１→３Ｒ（Abe et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797）を有する、糖鎖抗原である。ルイスＹ抗原は、ヒト上皮腫瘍（乳房、結腸、肺および前立腺の腫瘍を含む）の６０％〜９０％の表面上で発現され、少なくともその４０％は抗原を過剰に発現し、正常細胞においては発現が制限されている。
【００４３】
Ｌｅｙを標的とし、腫瘍を効果的に標的とするために、抗原に排他的特異性を有する抗体が、理想として必要とされている。かくして、好ましくは、本発明の抗ルイスＹ抗体は、１型構造（すなわち、血液型のラクト系（ＬｅａおよびＬｅｂ））と交差反応を起こさず、好ましくは、他の２型エピトープ（すなわち、ネオラクト構造）様ＬｅｘおよびＨ−２型構造と結合しない。好ましい抗ルイスＹ抗体の例としては、ｈｕ３Ｓ１９３が設計されている（米国特許第６，３１０，１８５号；第６，５１８，４１５号；第５，８７４，０６０号（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。ヒト化抗体ｈｕ３Ｓ１９３（Attia, M.A., et al. 1787-1800）は、Ｌｅｙに非常に特異的である乳癌細胞に対するマウスモノクローナル抗体である３Ｓ１９３からＣＤＲ−グラフティングにより生成された（Kitamura, K., 12957-12961）。Ｈｕ３Ｓ１９３は、単にＬｅｙに対する３Ｓ１９３の特異性を残しているだけでなく、補体依存性細胞毒性（以後、ＣＤＣと称する）および抗体依存性細胞障害性（以後、ＡＤＣＣと称する）を媒介する能力を獲得している（Attia, M.A., et al. 1787-1800）。この抗体は、１２５Ｉ、１１１Ｉｎまたは１８Ｆならびにキレート剤を必要とする他の放射性標識、例えば１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃまたは９０Ｙで標識化したｈｕ３Ｓ１９３での生体内分布研究により証明されているように、ヌードマウスおいてＬｅｙ発現異種移植片を標的とする（Clark, et al. 4804-4811）。
【００４４】
他の具体例において、抗体は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８およびＭｙｏ２２と呼ばれるヒト抗ＧＤＦ−８抗体、ならびにそれ由来の抗体および抗原−結合フラグメントである。これらの抗体は、成熟ＧＤＦ−８に高アフィニティで結合することができ、例えばＡｃｔＲＩＩＢ結合およびレポーター遺伝子アッセイの阻害により証明されるように、インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８活性を阻害し、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害しうる。例えば、Veldman, et al、米国特許出願第２００４０１４２３８２号を参照のこと。
【００４５】
受容体
医薬および／または市販の薬剤として有効であることが示されているポリペプチドの他の群は、受容体を含む。受容体は、典型的には、細胞外シグナリングリガンドを認識することにより機能する膜貫通糖タンパク質である。典型的には、受容体は、リガンド認識ドメインに加え、細胞内での発育変動または代謝性変化を誘導する、結合リガンドでの標的細胞内分子のリン酸化によりシグナリング経路を開始する、タンパク質キナーゼドメインを有する。一の具体例において、目的の受容体は、膜貫通および／または細胞内ドメイン（複数でも可）を除去し、その代わりにＩｇ−ドメインに結合できるように修飾されている。好ましい具体例において、本発明により製造される受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＲＴＫファミリーは、種々の機能の多数の細胞型に欠かせない受容体を含む（例えば、Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988；Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。ＲＴＫｓの非限定的な例としては、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーの一員、表皮成長因子受容体（ＥＧＦ）ファミリーの一員、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、免疫グロブリンを有するチロシンキナーゼおよびＥＧＦ相同ドメイン−１（ＴＩＥ−１）およびＴＩＥ−２受容体（Sato et al., Nature 376(6535):70-74 (1995）（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）およびｃ−Ｍｅｔ受容体が挙げられ、これらのいくつかは、直接的または間接的に血管新生を促進することが示唆されている（Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995）。ＲＴＫｓの他の非限定的な例としては、胎児肝臓キナーゼ１（ＦＬＫ−１）（キナーゼ挿入ドメイン−含有受容体（ＫＤＲ）（Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991）または血管内皮細胞成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）とも称される）、ｆｍｓ−様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）（DeVries et al. Science 255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990）、（血管内皮細胞成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリンおよびＡｘｌとも称される）が挙げられる。当業者は、好ましくは、本発明に従って発現されうる他の受容体も把握するだろう。
【００４６】
特に好ましい具体例において、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ受容体（ＴＮＦＲ−１；１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７，５６３；およびＴＮＦＲ−２、１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７，０１４）の形態である、腫瘍壊死因子阻害剤は、本発明に従って発現される（Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7 (1995-96)（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。一の具体例により、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性ＴＮＦ受容体および好ましくはＴＮＦＲ−Ｉｇを含む。一の具体例において、本発明の好ましいＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩの可溶性形態、ならびに、可溶性ＴＮＦ結合タンパク質であり、他の具体例において、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合は、ＴＮＦＲ：Ｆｃであり、本明細書で用いられる場合、かかる用語は、「エタネルセプト」を意味し、これは、ｐ７５ＴＮＦ−α受容体の細胞外部分の２分子の二量体であり、ここの分子は、ヒトＩｇＧ．ｓｕｂ．１の２３５個のアミノ酸Ｆｃ部分からなる。
【００４７】
成長因子および他のシグナリング分子
医薬および／または市販の薬剤として有効であることが示されているポリペプチドの他の群は、成長因子および他のシグナリング分子を含む。成長因子は、典型的には、細胞により分泌され、他の細胞に結合し、受容体を活性化し、受容体細胞の代謝性変化または発育変動を生じさせる、糖タンパク質である。一の具体例において、目的のタンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインおよび抗体のＦｃ部を含有する、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドである（例えば、Wolfman, et al., ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor、ＵＳ２００４／０２２３９６６Ａ１を参照）。他の具体例において、成長因子は、修飾ＧＤＦ−８プロペプチドであってもよい（例えば、Wolfman, et al., Modifed and stabilized GDF propeptides and uses thereof、ＵＳ２００３／０１０４４０６Ａ１を参照）。別として、目的のタンパク質は、ホリスタチン−ドメイン含有タンパク質であり得る（例えば、Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US 2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US 2005/0106154 A1, Hill, et al., Follistatin domain containing protein、ＵＳ２００３／０１８０３０６Ａ１を参照）。
【００４８】
哺乳動物成長因子および他のシグナリング分子の非限定的な例としては、サイトカイン；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；形質転換成長因子（ＴＧＦｓ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４またはＴＧＦ−ベータ５を含む）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＴＬｓ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子およびフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲンアクチベータ、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン、造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常Ｔ−細胞で発現、分泌され活性化を調節する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ミュラー管阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレキサシン；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）または神経成長因子、例えばＮＧＦ−ベータが挙げられる。当業者は、好ましくは、本発明に従って発現されうる他の成長因子およびシグナリング分子も把握するだろう。
【００４９】
Ｇ−タンパク質共役受容体
医薬および／または市販の薬剤として有効であることが示されているポリペプチドの他の群は、成長因子および他のシグナリング分子を含む。Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）は、７回膜貫通ドメインを有するタンパク質である。リガンドのＧＰＣＲへの結合において、シグナルは、細胞の生物学的または生理学的特性の変化が生じる細胞内で伝達される。
【００５０】
Ｇ−タンパク質およびエフェクター（Ｇ−タンパク質により調節される細胞内酵素およびチャンネル）と共にＧＰＣＲｓは、細胞内第二メッセンジャーを細胞外インプットに接続する、モジュラーシグナリングシステムの構成要素である。これらの遺伝子および遺伝子産物は、疾患の原因物質の可能性がある。
【００５１】
ロドプシン遺伝子およびＶ２バソプレシン受容体遺伝子の特異的欠損は、種々の形態の常染色体優性および常染色体網膜色素変性症、腎性尿崩症の原因であることが示されている。これらの受容体は、中枢神経系および末梢生理学的プロセスの両方で非常に重要である。ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、異なる種からの同じ受容体である相同分子種とは対照的に、遺伝子重複（または他のプロセス）により生成される変異体を意味する受容体である、２５０型を超えるパラローグを含有する。スーパーファミリーは、５つのファミリー：ファミリーＩ、ロドプシンおよびベータ２−アドレナリン受容体に代表され、現在２００を超える独自のメンバーにより表される受容体；ファミリーＩＩ、近年特徴付けられた副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー；ファミリーＩＩＩ、哺乳動物における代謝型グルタミン受容体ファミリー；ファミリーＩＶ、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性および発生に重要なｃＡＭＰ受容体ファミリー；およびファミリーＶ、真菌コウビフェロモン受容体、例えばＳＴＥ２に分類することができる。
【００５２】
ＧＰＣＲｓは、生体アミン、炎症の脂質メディエータ、ペプチドホルモンおよび知覚シグナルメディエータに対する受容体を含む。ＧＰＣＲは、受容体がその細胞外リガンドと結合した場合に活性化される。ＧＰＣＲにおけるリガンド受容体相互作用により生じる立体構造の変化は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ細胞内ドメインに対する結合アフィニティに影響を与える。このことにより、ＧＴＰがＧタンパク質に高アフィニティで結合することが可能になる。
【００５３】
ＧＴＰによるＧタンパク質の活性化は、Ｇタンパク質αサブユニットの、アデニル酸シクラーゼまたは他の第二メッセンジャー分子ジェネレーターとの相互作用を誘発する。この相互作用は、アデニル酸シクラーゼの活性化を調節し、したがって、第二メッセンジャー分子、ｃＡＭＰの産生を調節する。ｃＡＭＰは、他の細胞内タンパク質リン酸化および活性化を調節する。別法として、他の第二メッセンジャー分子、例えばｃＧＭＰまたはエイコサノイドの細胞レベルは、ＧＰＣＲｓの活性化によりアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。Ｇタンパク質サブユニットは、ＧＴＰａｓｅによるＧＴＰの加水分解により不活性化され、α、βおよびγサブユニットは再び連結する。ついで、ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、アデニル酸シクラーゼまたは他の第二メッセンジャー分子ジェネレーターから解離する。また、ＧＰＣＲの活性は、細胞内および細胞外ドメインまたはループのリン酸化反応によりレギュレートされうる。
【００５４】
グルタミン酸塩受容体は、神経伝達において重要なＧＰＣＲｓの群を形成する。グルタミン酸塩は、ＣＮＳにおける主要な神経伝達物質であり、神経可塑性、認知、記憶、学習およびいくつかの神経障害、例えば癲癇、卒中および神経変性において重要な役割を果たすと考えられている（Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G- Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, pp. 130-132）。これらのグルタミン酸塩の影響は、イオンチャンネル型および代謝調節型と称される、受容体の異なる２つの群により媒介される。イオンチャンネル型受容体は、固有のカチオンチャンネルを含有し、グルタミン酸塩の即効興奮作用を媒介する。代謝調節型受容体は修飾され、カルシウム依存性カリウムコンダクタンスを阻害し、イオンチャンネル型受容体の興奮性伝達を阻害し、増強させることによりニューロンの膜興奮性を増強させる。代謝調節型受容体は、アゴニスト薬理学およびシグナル伝達経路に基づいて５つのサブユニットに分類され、脳組織に広く分布する。
【００５５】
血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）ファミリーは、その作用がＧＰＣＲｓにより媒介される関連ポリペプチドの一群である。このファミリーの主要な一員は、それ自体のＶＩＰ、セクレチンおよび成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）である。ＶＩＰは、平滑筋の弛緩、種々の組織における分泌の刺激または阻害、種々の免疫細胞活性およびＣＮＳにおける種々の興奮性および阻害活性の調節を含む、多種の生理作用を有する。セクレチンは、膵臓および腸における酵素およびイオンの分泌を刺激し、また、脳にも少量が存在する。ＧＲＦは、下垂体前葉からの成長ホルモンの合成および放出を調節する重要な神経内分泌物質である（Watson, S. and S. Arkinstall supra, pp. 278-283）。
【００５６】
ＧＰＣＲへのリガンドの結合についで、立体構造変化がＧタンパク質に伝達され、これにより、α−サブユニットは結合ＧＤＰ分子をＧＴＰ分子と交換し、βγ−サブユニットから解離する。典型的には、α−サブユニットのＧＴＰ−結合形態は、エフェクター調節部として機能し、第二メッセンジャー、例えばサイクリックＡＭＰ（例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化により）、ジアシルグリセロールまたはイノシトールホスフェートの産生を誘導する。２０以上の異なる型のα−サブユニットが知られており、これはβおよびγサブユニットのより小さいプールに関連する。哺乳動物Ｇタンパク質の例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが挙げられる。Ｇタンパク質は、Lodish H. et al. Molecular Cell Biology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995）（出典明示により本明細書に組み入れる）に十分に記載されている。
【００５７】
ＧＰＣＲｓは、薬物作用および開発において主要なターゲットである。実際、受容体は、現在公知の薬剤の半分以上に用いられており（Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516）、ＧＰＣＲｓは、ＧＰＣＲをアンタゴナイズまたはアゴナイズする臨床的処方薬の３０％での治療行為に関して最も重要なターゲットとなっている（Milligan, G. and Rees,S., (1999) TIPS, 20:118-124）。このことは、これらの受容体が、治療的ターゲットとして確立し、立証されていることを示す。
【００５８】
一般的に、本発明の実施者は、目的のポリペプチドを選択し、その正確なアミノ酸配列を知っているだろう。本発明の技術は、例えば成長および分化因子８に関連するヒトモノクローナル抗体（実施例１、３、４、７〜１４）、ヒト化抗ルイスＹ抗体（実施例５および６）、抗Ａベータ（実施例１５）および腫瘍壊死因子受容体の二量体Ｆｃ−融合タンパク質（実施例１６）を含む、多様なポリペプチドの生産への適当に成功しており、本発明が種々の異なるポリペプチドおよびタンパク質の発現に有用であることが示されている。本発明に従って発現される所定のタンパク質は、それ自体固有の特性を有しており、培養された細胞の細胞密度または生存率に影響を与え、同一の培養条件下での他のポリペプチドまたはタンパク質成長よりも低レベルで発現されうる。当業者は、所定のポリペプチドまたはタンパク質の細胞成長および／または産生を最適化するために、本発明の工程および組成を適当に修飾することができるだろう。
【００５９】
遺伝子制御因子
当業者には明らかであるように、遺伝子制御因子は、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝子発現をするために用いることができる。かかる遺伝子制御因子は、関連するホスト細胞で活性化するように選択されるべきである。制御因子は、構造的に活性であってもよく、または所定の条件下で誘導性であってもよい。誘導制御因子は、発現したタンパク質が毒性であるか、または細胞成長および／または生存率に悪影響を及ぼすものである場合に、特に有用である。このような場合、誘導制御因子が、細胞生存率、細胞密度および／または発現ポリペプチドまたはタンパク質の総収率を改善することにより、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を調節する。本発明の実施に有用な多くの制御因子は、当該分野で公知であり、入手可能である。
【００６０】
本発明により用いることができる代表的な構成的哺乳動物プロモーターは、限定するものではないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）プロモーター、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ベータアクチンプロモーターならびに当業者に公知の他の構造的プロモーターを含む。加えて、真核細胞におけるコーディング配列の構造的発現を促進することが示されているウイルスプロモーターは、例えば、サルウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、乳頭腫ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲｓ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターウイルスならびに当業者に公知の他のウイルスプロモーターを含む。
【００６１】
誘導プロモーターは、誘発剤の存在下で人工的に結合したコーディング配列の発現を促進し、また、本発明に従って用いることもできる。例えば、哺乳動物細胞において、メタロチオネインプロモーターは、ある種の金属イオンの存在下で下流コーディング配列の転写を誘発する。他の誘発プロモーターは、当業者に認識され、および／または公知である。
【００６２】
一般的に、遺伝子発現配列は、また、それぞれ、転写および翻訳の開始に関連する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。エンハンサーエレメントは、発現されるポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増加されるために用いることができる。哺乳動物細胞において機能することが示されているエンハンサーエレメントの例としては、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761に記載されているようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーおよびGorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777に記載のようなラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーターおよびBoshart et al., Cell (1985) 41:521に記載のようなヒトサイトメガロウイルスが挙げられる。
【００６３】
制御因子がコーディング配列に結合する機構は、当該分野では公知である（一般的な分子生物学的および組み換えＤＮＡ技法は、Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989（出典明示により本明細書に組み入れる）に記載されている）。種々の成長および誘発条件下での哺乳動物細胞における発現に関する好ましいコーディング配列の挿入に適した市販のベクターは、当該分野でよく知られている。
【００６４】
コーディング配列および関連制御因子のホスト細胞への導入
目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現を行うの十分な哺乳動物ホスト細胞核酸の導入に適した方法は、当該分野でよく知られている。例えば、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.；ＥＰ１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【００６５】
哺乳動物細胞に関して、好ましい、形質転換法は、Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ、Ｆｏｃｕｓ１５：７３（１１９３）のリポフェクトアミン（lipofectamine）（登録商標）（Gibco BRL）法を含む。哺乳動物細胞ホストシステム形質転換の一般的な態様は、Ａｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号（１９８３年８月１６日に取得）に記載されている。哺乳動物細胞の形質転換の種々の方法に関しては、Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。哺乳動物細胞におけるポリペプチドまたはタンパク質の発現に適したベクターの非限定的代表例としては、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142を参照）；ｐＭＣｌｎｅｏＰｏｌｙ−Ａ（Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512を参照）；およびバキュロウイルスベクター、例えばｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０が挙げられる。
【００６６】
好ましい具体例において、ポリペプチドまたはタンパク質は、ホスト細胞に安定にトランスフェクトされる。しかしながら、本発明は、一過性または安定性トランスフェクト哺乳動物細胞で用いることができることは当業者には明らかだろう。
【００６７】
細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性であるいずれの哺乳動物細胞または細胞型を、本発明の方法に従って利用することができる。本発明の方法により用いることができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣＮｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（CruCell, Leiden, The Netherlands））；ＳＶ４０によりトランスフェクトされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養物の成長に関する、サブクローン化した２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカモドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 75)；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓癌株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。特に好ましい具体例において、本発明は、ＣＨＯ細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の培養および発現に用いることができる。
【００６８】
加えて、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する多くの市販のまたは非売品のハイブリドーマ細胞株を、本発明に従って用いることができる。ハイブリドーマ細胞株が、成長およびポリペプチドまたはタンパク質発現を最適化するために、異なる栄養分を必要とし、および／または異なる培養条件を必要とし、要すれば条件を修飾することができることは、当業者には明らかだろう。
【００６９】
上記したように、多くの場合において、細胞は、高レベルでのタンパク質またはポリペプチドの生産のために、選択され、設計されるだろう。しばしば、細胞は、例えば目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、および／または目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内在性遺伝子または導入遺伝子）の発現を制御する制御因子を導入することにより、高レベルのタンパク質を生産するために遺伝子操作される。
【００７０】
ある種のポリペプチドは、多くの点で目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生を最終的に制限する、細胞成長、細胞生存率または他の細胞特性に悪影響を及ぼしうる。特定のポリペプチドを発現するように改変された一の特定の型の細胞群においてさえも、ある個体細胞がより成長し、および／または目的のポリペプチドをより生産する、細胞群内の多様性が存在する。本発明のある種の好ましい具体例において、細胞株は、細胞を培養するのに選択された特定の条件下で着実に成長するように、実施者により経験的に選択される。特に好ましい具体例において、特定のポリペプチドを発現するように改変された個々の細胞は、細胞成長、最終細胞密度、細胞生存率、発現ポリペプチドの力価またはその組合せ、あるいは実施者が重要であるとみなす他の条件に基づいて、大規模生産に選択される。
【００７１】
細胞培養フェーズ
目的のポリペプチドを製造する典型的な方法は、バッチおよびフェドバッチ培養の両方を含む。バッチ培養法は、慣用的には、大規模生産培養物を特定の細胞密度の種培養で接種し、細胞成長および生存を促す条件下で細胞を培養し、細胞が特定の細胞密度に達した場合に回収し、発現したポリペプチドを精製することを含む。フェドバッチ培養法は、細胞の成長の間に消費される栄養分および他の成分をバッチ培養物に供給する付加的な工程を含む。慣用的なバッチおよびフェドバッチ培養に付随する難解な問題は、代謝廃棄物の産生であり、これは、細胞成長、生存率および発現ポリペプチドの産生に悪影響を及ぼす。特に悪影響を及ぼす２つの代謝廃棄物は、乳酸塩およびアンモニウムであり、これらは、それぞれ、グルコースおよびグルタミン代謝の結果として産生される。グルタミン代謝の結果としてのアンモニウムの酵素産生に加えて、また、アンモニウムは、時間とともに非代謝性分解の結果としても細胞培養物中に蓄積される。本発明は、細胞培養物におけるこれらの廃棄物の蓄積を遅らせ、逆進さえさせることにより、アンモニウムおよび乳酸塩の悪影響を最小限にした、ポリペプチドの改善された大規模生産法を提供する。限定するものではないが、バッチ、フェドバッチおよび潅流システムを含む、細胞を培養するいずれのシステムにおいても用いることができることは、当業者には明らかだろう。本発明のある種の好ましい具体例において、細胞を、バッチまたはフェドバッチシステムにおいて成長させる。
【００７２】
培地
市販されている培地、例えばハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ修飾イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）を含む、慣用的な培地組成は、他のアミノ酸と比較して、相対的に高レベルのグルコースおよびグルタミンを含有していた。これらの成分は、細胞の一次代謝エネルギー源であるので、大量に必要とされることが考えられる。しかしながら、これらの栄養分の急激な消費により、上記したような乳酸塩およびアンモニウムの蓄積が誘発される。加えて、高い初期濃度のグルコースおよびグルタミンならびにその後の乳酸塩およびアンモニウムの蓄積の結果として、高オスモル濃度となり、この環境が、細胞成長、細胞生存率およびポリペプチドの産生に悪影響を与える。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載の他の培養工程で用いた場合に、乳酸塩およびアンモニウムの蓄積を最小限にし、逆進さえさせる種々の培地組成物を提供する。細胞成長および／または生存率またはポリペプチドまたはタンパク質の発現に有利な影響を与えることが示されている本発明の培地組成は、１つまたはそれ以上の：ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、およびｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含む。当業者は、上記に用いる場合「累積」が、特定の成分または培養の開始時に添加される成分およびその後に添加される成分を含む、細胞培養中に添加される成分の総量であることは理解できるだろう。当業者には、本発明の培地組成物が、合成培地および非合成培地の両方を含むことは理解できるだろう。
【００７４】
従来の培地組成は、本発明の培地組成と比較して、相対的に低レベルの総アミノ酸を含有して開始される。例えば、ＤＭＥ−Ｆ１２として知られる従来の細胞培養培地（ダルベッコ修飾イーグル培地およびハムＦ１２培地の５０：５０混合物）は、７．２９ｍＭの総アミノ酸含有量を有し、ＲＰＭＩ−１６４０として知られる従来の細胞培養培地は、６．４４ｍＭの総アミノ酸含有量を有する（例えば、H.J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. (USA), 53:288-293 (1965)；G.E. Moore et al., J. Am. Medical Assn., 199:519-24 (1967)（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。本発明のある種の具体例において、培養培地中のアミノ酸濃度は、好ましくは、約７０ｍＭ以上である。より好ましくは、本発明の培地組成は、出発培地において約７０ｍＭを超えるアミノ酸濃度を含有する。開示時の培地のアミノ酸濃度がこの範囲である場合、細胞密度および力価は、培養の成長期間を通して増加することが示される（実施例１３を参照）。
【００７５】
加えて、本発明のある種の具体例において、培養培地におけるアスパラギンに対するグルタミンのモル比は、他の市販の培地または市販されていない培地と比較して減少する。好ましくは、培養培地における、アスパラギンに対するグルタミンのモル比は、約２未満である。
【００７６】
加えて、本発明のある種の具体例において、培養培地における総アミノ酸に対するグルタミンのモル比は、他の市販の培地または市販されていない培地と比較して減少する。好ましくは、培養培地における、総アミノ酸に対するグルタミンのモル比は、約０．２未満である。
【００７７】
本発明の出発培地におけるアスパラギンに対するグルタミンのモル比または総アミノ酸濃度が低いという興味深い予期せぬ結果は、アンモニウムの蓄積の減少が観察されたことに加え、乳酸塩の蓄積の減少もまた同様に見られてことである。ある種の具体例において、アンモニウムおよび乳酸塩の蓄積レベルは、対照培地と比較して単に低いだけでなく、初期蓄積後に実際に減少する（例えば、実施例３および７を参照）。
【００７８】
Ｂｏｒａｓｔｏｎ（米国特許第５，８７１，９９９号）は、総アミノ酸に対する総無機イオンのモル比が１〜１０である培養培地を開示している。Ｂｏｒａｓｔｏｎは、総アミノ酸に対する総無機イオンのモル比がこの範囲である培養培地を提供することによって、培地におけるＣＨＯ細胞成長の凝集が減少することを示した。本発明の他の好ましい具体例において、培養培地における総アミノ酸に対する総無機イオンのモル比を、約０．４〜１までさらに少なくしている。実施例１３に示されるように、１．７５〜約０．７の比において、培養の成長期間にわたって、細胞密度および発現ポリペプチドまたはタンパク質の産生が著しく増加している。
【００７９】
本発明の他の好ましい具体例において、濃度培養は、合わせて約１６〜３６ｍＭの濃度であるグルタミンおよびアスパラギンを含有する。実施例１４、表２２に示すように、この範囲の組合せ総濃度のグルタミンおよびアスパラギンを含有する培地は、この範囲外の組合せ総濃度のグルタミンおよびアスパラギンを含有する培地よりも高い発現ポリペプチドの力価を示す。当業者は、細胞成長および／または生存率を最適化し、発現ポリペプチドの産生を最大限にするためにこの範囲内で的確な組合せグルタミンおよびアスパラギン濃度を選択できるだろう。
【００８０】
さらに、当業者は、上記に挙げたいずれもの条件を、単独または他の条件と種々組み合わせて利用できることは、当業者には明らかだろう。上記特性の１または複数またはすべてを示す培地組成物を利用することにより、当業者は、細胞成長および／または生存率を最適化し、発現ポリペプチドの産生を最大限にすることができるだろう。
【００８１】
本発明に開示する培地組成物は、要すれば、ホルモンおよび／または他の成長因子、特にイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、タンパク質加水分解物またはグルコースあるいは他のエネルギー源を補足してもよい。本発明のある種の具体例において、化学誘導剤、例えばヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）を培地に補足することは有益でありうる。これらの任意の補足剤は、培養の開始時に加えてもよく、あるいは、消費された栄養分を補給するためまたは他の理由から培養後のある時点で添加してもよい。開示した培地組成物に含まれうる所望のまたは必要な補足剤は、当業者には明らかだろう。
【００８２】
哺乳動物細胞培養物の提供
バッチおよびフェドバッチ培養によるタンパク質またはポリペプチドの生産用の哺乳動物細胞の種々の製造方法は、当該分野でよく知られている。上記したように、発現するのに十分な核酸（典型的には、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子およびいずれもの作用的に結合した遺伝子制御因子を含有するベクター）を、ホスト細胞株に多くのよく知られた技術のいずれかにより導入することができる。典型的には、細胞は、ベクターを取り込み、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現するホスト細胞を決定するために、細胞をスクリーニングする。哺乳動物細胞により発現された特定の目的のポリペプチドまたはタンパク質を検出する慣用的な方法は、限定するものではないが、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、生物活性アッセイおよびアフィニティクロマトグラフィーを含む。発現ポリペプチドまたはタンパク質を検出する他の適当な方法は、当業者には明らかだろう。複数のホスト細胞が目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する場合、記載した方法のいくつかまたはすべてを、ポリペプチドまたはタンパク質を最も高レベルに発現する細胞を決定するのに用いることができる。
【００８３】
一旦、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞を同定すると、細胞を当業者によく知られた種々の方法のいずれかにより培養物中で増殖させる。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、典型的には、細胞の成長および生存を促す温度および培地で成長させることにより増殖させる。初期培養体積はいずれの体積でもよいが、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終生産に用いる生産バイオリアクターの培養体積よりも小さく、生産バイオリアクターに播種する前に、より大きな体積のバイオリアクターに細胞を数回移してもよい。細胞培養は、培地の酸素化および栄養分の細胞への分散を増加させるために、撹拌または振盪することができる。別として、または加えて、当該分野でよく知られた特定の散布デバイスを、培養物の酸素化を増加または制御するのに用いることができる。本発明に従って、限定するものではないが、ｐＨ、温度、酸素化等を含むバイオリアクターの所定の初期条件を制御または調節することが有益であることを当業者は理解できるだろう。
【００８４】
生産バイオリアクターにおける出発細胞密度は、当業者により選択することができる。本発明に従って、生産バイオリアクターにおける出発細胞密度は、培養体積あたり１の細胞まで低くてもよい。本発明の好ましい具体例において、生産バイオリアクターにおける出発細胞密度は、１ｍｌあたり約２×１０２生存細胞〜１ｍｌあたり約２×１０３、２×１０４、２×１０５、２×１０６、５×１０６または１０×１０６生存細胞以上の範囲でありうる。
【００８５】
初期および中間細胞培養物は、次の中間または最終生産バイオリアクターに播種する前に、望ましい密度まで成長させてもよい。すべてまたはほとんどの生存が必要ではないが、細胞のほとんどが播種前に生存していることが好ましい。本発明の一の具体例において、細胞は、例えば低速遠心分離により上清から除去してもよい。また、望ましくない代謝廃棄物または培地成分を除去するために、次のバイオリアクターに播種する前に、培地で除去した細胞を洗浄することが望ましい。培地は、細胞を予め成長させた培地であってもよく、あるいは、本発明の実施者により選択される別個の培地または線上溶液であってもよい。
【００８６】
ついで、細胞を、播種生産バイオリアクターに播種するのに適当な密度に希釈してもよい。本発明の好ましい具体例において、細胞を、生産バイオリアクターで用いられる同様の培地で希釈する。別として、細胞を、本発明の実施者の要求または希望に応じて、あるいは、細胞自体の特定の要求に適合するように、例えば、生産バイオリアクターに播種する前の短期間貯蔵する場合、他の培地または溶液で希釈することができる。
【００８７】
初期成長フェーズ
一旦、生産バイオリアクターに上記のように播種すると、細胞培養物を、細胞培養物の成長および生存に適した条件下で、初期成長フェーズにおいて保持する。正確な条件は、細胞型、細胞をデリバリーする生物および発現ポリペプチドまたはタンパク質の性質および特性に応じて変化するだろう。
【００８８】
本発明に従って、生産バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模生産に適したいずれもの体積でありうる。好ましい具体例において、生産バイオリアクターの体積は、少なくとも５００リットルである。好ましい他の具体例において、生産バイオリアクターの体積は、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれもの体積である。当業者は、本発明の実施に用いるのに適当なバイオリアクターを選択することができるだろう。生産バイオリアクターは、細胞成長および生存を促し、産生ポリペプチドまたはタンパク質の発現または安定性に干渉しないいずれもの物質で構成されていてもよい。
【００８９】
初期成長フェーズにおける細胞培養の温度は、主に細胞培養物が生存可能な温度範囲に基づいて選択されるだろう。例えば、初期成長フェーズの期間、ＣＨＯ細胞は、３７℃で良好に成長する。一般的に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃の範囲内で良好に成長する。好ましくは、哺乳動物細胞は、約３５℃〜４０℃の範囲内で良好に成長するだろう。当業者は、細胞の要求および実施者の要求生産量に応じて、細胞が成長する適当な温度を選択することができるだろう。
【００９０】
本発明の一の具体例において、初期成長フェーズの温度は、ある一定の温度に維持される。他の具体例において、初期成長フェーズの温度は、ある温度範囲内に維持される。例えば、温度は、初期成長フェーズの期間に、徐々に高くしても、低くしてもよい。別として、温度は、初期成長フェーズのある時点で一定の温度だけ高くしても、低くしてもよい。当業者は、単一または複数の温度を用いるべきかどうか、温度を徐々に調節すべきか、不連続に一定の温度だけ調節すべきかどうか決定することができるだろう。
【００９１】
初期成長フェーズの間、実施者の要求および細胞自体の要求に応じて、より長くまたは短い時間、細胞を成長させることができる。一の具体例において、細胞の成長が妨害されない場合に最終的に到達する最大生存細胞密度の所定のパーセントである、生存細胞密度に達するのに十分な期間、細胞を培養する。例えば、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントである所望の生存細胞密度を得るのに十分な期間、細胞を成長させることができる。
【００９２】
他の具体例において、所定の期間、細胞を成長させることができる。例えば、細胞培養の初期濃度、細胞成長の温度および細胞の本質的な成長速度に応じて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上の間、細胞を成長させてもよい。ある場合には、１ヶ月またはそれ以上の間、細胞を成長させてもよい。シードバイオリアクター中、初期成長フェーズ温度での細胞の成長が、その接種時点で生産バイオリアクターにおける生存細胞密度が、すでに最大生存細胞密度の所望のパーセントである場合、生産バイオリアクターにおいて細胞は０日間成長させらるだろう。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質産生要求量および細胞自体の要求に応じて、初期成長フェーズの期間を選択することができるだろう。
【００９３】
酸素化および細胞への栄養分の分散を増加させるために、初期培養フェーズの期間、細胞培養物を撹拌または振盪してもよい。本発明に従って、限定するものではないが、ｐＨ、温度、酸素化等を含む、初期成長フェーズ期間のバイオリアクターにおけるある内部条件を制御または調節することが有益でありうることは、当業者には理解できるだろう。例えば、ｐＨは、適当な量の酸または塩基をスプレーすることにより制御することができ、酸素化は、当該分野でよく知られた散布デバイスにより制御することができる。
【００９４】
培養条件のシフト
本発明の教示に従って、初期成長フェーズの終わりに、第２の培養条件を適用し、培養物に代謝シフトが生じるように、少なくとも１つの培養条件をシフトしてもよい。阻害代謝物、最も顕著には乳酸塩およびアンモニアの蓄積は、成長を阻害する。細胞培養物の温度、ｐＨ、重量オスモル濃度または化学誘導剤レベルを変更することにより為される代謝シフトは、特定のグルコース消費速度に対する特定の乳酸塩産生速度の割合を減少させることにより特徴付けられる。一の非限定的具体例において、培養温度をシフトさせることにより培養条件をシフトする。しかしながら、当該分野で知られているように、温度のシフトは、適当な代謝シフトを達成することができるただ一つのメカニズムというわけではない。例えば、かかる代謝シフトは、限定するものではないが、ｐＨ、重量オスモル濃度および酪酸ナトリウムレベルを含む他の培養条件をシフトすることによっても達成することができる。上記したように、培養シフトのタイミングは、本発明の実施者により、ポリペプチドまたはタンパク質生産要求量または細胞自体の要求に基づいて決定されるだろう。
【００９５】
培養温度をシフトした場合、温度シフトは相対的に徐々に行ってもよい。例えば、温度変化が完了するまでに数時間または数日かかってもよい。別として、温度シフトは、相対的に急激に行ってもよい。例えば、温度変化を、数時間未満で完了させてもよい。適当な生産物および制御装置が、例えばポリペプチドまたはタンパク質の商業的大規模生産である場合、温度変化は１時間以内に完了してもよい。
【００９６】
次成長フェーズの細胞培養温度は、主に細胞培養物が生存し、商業的に十分なレベルで組み換えポリペプチドまたはタンパク質を発現できる温度範囲に基づいて選択されるだろう。一般的に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃の範囲内で生存し、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を商業的に十分なレベルで発現することができる。好ましくは、哺乳動物細胞は、約２５℃〜３５℃の範囲内で生存し、商業的に十分なレベルで組み換えポリペプチドまたはタンパク質を発現することができる。当業者であれば、細胞の要求および実施者の生産要求量に応じて、細胞を成長させる適当な温度を選択することができるだろう。
【００９７】
本発明の一の具体例において、次成長フェーズの温度は、ある一定の温度に維持される。他の具体例において、次成長フェーズの温度は、ある温度範囲内に維持される。例えば、温度は、次成長フェーズの期間に、徐々に高くしても、低くしてもよい。別として、温度は、次成長フェーズのある時点で一定の温度だけ高くしても、低くしてもよい。当業者は、この具体例に複数回の温度シフトが含まれることは理解できるだろう。例えば、温度を１回シフトして、この温度またはこの温度範囲である期間、細胞を保持し、その後、温度を再び低温または高温側のいずれにシフトしてもよい。個々のシフト後の培養温度は、一定であってもよく、またはある温度範囲内で維持されてもよい。
【００９８】
実施例１６において、データにより、２回の逐次的な温度変化を用いる効果が示されているが、本発明に従って、３回またはそれ以上の逐次的な温度変化が、細胞生存率または密度を増加する、および／または組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現を増加するために用いることができることが当業者には理解できるだろう。個々の逐次温度シフト後の細胞培養温度または温度範囲は、シフト前の温度または温度範囲より高くても、または低くてもよい。本発明の好ましい具体例において、個々の逐次的温度または温度範囲は、前の温度または温度範囲よりも低い。
【００９９】
次生産フェーズ
本発明に従って、一旦、細胞培養条件を上記したようにシフトさせると、細胞培養物を、細胞培養物の生存および商業的に十分なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に適した、第２の培養条件下で、次生産フェーズの間保持する。
【０１００】
上記したように、限定するものではないが、温度、ｐＨ、重量オスモル濃度および酪酸ナトリウムレベルを含む多くの培養条件の１つまたはそれ以上をシフトされることにより、培養をシフトさせることができる。一の具体例において、培養温度をシフトさせる。この具体例により、次生産フェーズの期間、培養物を、初期成長フェーズの温度または温度範囲より低い温度または温度範囲で維持する。例えば、次生産フェーズの期間、ＣＨＯ細胞は、２５℃〜３５℃の範囲内で良好に組み換えポリペプチドおよびタンパク質を発現する。上記したように、細胞密度または生存率を増加させるため、あるいは組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現を増加させるために、複数回の温度シフトを行うことができる。
【０１０１】
本発明により、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、次生産フェーズにおいて細胞を維持してもよい。一の具体例において、組み換えポリペプチドまたはタンパク質の力価が最大になるまで、細胞を次生産フェーズにて保持した。他の具体例において、実施者の生産要求量または細胞自体の必要性に応じて、この時点までに培養物を回収してもよい。例えば、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの生存細胞密度を達成するのに十分な期間細胞を保持してもよい。ある場合において、生存細胞密度を最大にし、ついで、培養物を回収する前に、生存細胞密度をあるレベルまで減少させることが望ましい。極端な例として、培養物を回収する前に、生存細胞密度を０に近づけるか、または０にすることが望ましい。
【０１０２】
本発明の他の具体例において、所定の次生産フェーズの期間、細胞を成長させてもよいる。例えば、次成長フェーズの開始時の細胞培養物の濃度、細胞が成長する温度および細胞の固有の成長速度に応じて、細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上の間成長させてもよい。ある場合において、細胞を１ヶ月またはそれ以上成長させてもよい。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質の生産必要量および細胞自体の要求に応じて、次生産フェーズの期間を選択することができるだろう。
【０１０３】
ある場合において、次生産フェーズの期間、細胞により消費または代謝される栄養物または他の培地成分を、細胞培養に補足することは、有益または必要でありうる。例えば、細胞培養に、細胞培養のモニタリングの期間、消費が観察された栄養物または他の培地成分を補足することは有利である（下記する「培養条件のモニタリング」の項を参照）。別として、または加えて、次生産フェーズの前に、細胞培養物を補足することは、有益または必要でありうる。非限定的例として、細胞培養に、ホルモンおよび／または他の成長因子、特にイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質またはグルコースあるいは他のエネルギー源を補足することは、有益または必要でありうる。
【０１０４】
これらの補足成分は、細胞培養に１回ですべてを加えてもよく、あるいは、一連の添加として細胞培養に提供してもよい。本発明の一の具体例において、補足成分は、比例した量で、複数回で細胞培養に提供する。別の具体例において、最初にある補足成分を提供し、後に残りの成分を加えることも望ましい。本発明のさらなる別の具体例において、細胞培養を、これらの補足成分を継続的に流し込んでもよい。
【０１０５】
発明により、細胞培養物に添加される総体積は、最適には、最小量に保たれるべきである。例えば、細胞培養物に添加した補足成分を含有する培地または溶液の総体積は、補足成分を加える前の細胞培養物の体積の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％であってもよい。
【０１０６】
細胞培養物を、細胞の酸素化および栄養物の分散を増加させるために、次生産フェーズの期間、撹拌または振盪してもよい。本発明により、当業者は、限定するものではないが、ｐＨ、温度、酸素化等を含む、次成長フェーズ期間のバイオリアクターのある種の初期条件、を制御または調節することが有益であり得ることは理解できるだろう。例えば、ｐＨは、適当な量の酸または塩基をスプレーすることにより調節することができ、酸素化は、当該分野でよく知られた散布デバイスで制御することができる。
【０１０７】
培養条件のモニタリング
本発明のある種の具体例において、実施者は、成長細胞培養物の特定の条件を定期的にモニターすることが有益または必要であると感じるかもしれない。細胞培養条件をモニタリングすることにより、実施者は、細胞培養物が、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を最適なレベルで産生しているがどうか、あるいは、培養物が、最適な産生フェーズに入っているかどうかを判断することができる。ある細胞培養条件をモニターするために、分析用の少量の培養物アリコートを取り出す必要があるだろう。当業者は、かかる採取により、細胞培養が汚染される可能性があることは理解でき、かかる汚染のリスクを最小限にするために適切に注意すべきだろう。
【０１０８】
非限定的例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、合成生存細胞密度、乳酸レベル、アンモニウムレベル、オスモル濃度または発現ポリペプチドまたはタンパク質の力価をモニターすることは有益または必要でありうる。当業者がこれらの条件を測定するための多くの方法が当該分野で知られている。例えば、細胞密度は、血球計、コールター・カウンターまたは細胞密度試験（ＣＥＤＥＸ）を用いて測定することができる。生存細胞密度は、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅで培養試料を染色することにより測定することができる。死亡細胞だけが、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅを取り込むことができるので、生存細胞密度は、細胞の総数をカウントし、染色された細胞数を細胞の総数で除し、その逆数を得ることにより測定することができる。ＨＰＬＣは、乳酸塩、アンモニアまたは発現ポリペプチドまたはタンパク質のレベルを測定するのに用いることができる。別法として、発現ポリペプチドまたはタンパク質のレベルを、標準的な分子生物的方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマーシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、ＢｉｕｒｅｔアッセイおよびＵＶ吸収により、測定することができる。リン酸化およびグリコシル化を含むポリペプチドまたはタンパク質、発現の翻訳後修飾をモニターすることも有益または必要でありうる。
【０１０９】
発現ポリペプチドの単離
一般的に、典型的には、本発明により発現したタンパク質またはポリペプチドを単離および／または精製することが望ましいだろう。好ましい具体例において、発現ポリペプチドまたはタンパク質は培地中に産生され、かくして、細胞および他の固体を、例えば精製工程の最初に、遠心分離または濾過除去により除去してもよい。この具体例は、特に、本明細書に記載の方法および組成物は高い細胞生存率を与えるので、本発明において用いる場合に有用である。結果として、培養プロセスの間に死亡する細胞がより少なく、発現ポリペプチドまたはタンパク質の収率を減少させる可能性がある培地中へのタンパク質分解酵素の放出がより少なくなる。
【０１１０】
別法として、発現ポリペプチドまたはタンパク質を、ホスト細胞の表面に結合させる。この具体例において、精製工程の最初の工程として、培地を取り出し、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するホスト細胞を溶解する。哺乳動物ホスト細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者によく知られた多くの手段により行うことができる。
【０１１１】
ポリペプチドまたはタンパク質は、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離または溶解度の差異、エタノール沈殿を含む標準的な方法により、あるいは、他のタンパク質の精製法（例えば、Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987；Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999;およびDeutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997（すべて出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）により単離、精製することができる。特に、イムノアフィニティクロマトグラフィーに関して、タンパク質を、そのタンパク質に対して作用し、固定相に貼り付けられた抗体を含むアフィニティカラムにタンパク質を結合されることにより単離することができる。別法として、アフィニティタグ、例えばインフルエンザコート配列、ポリ−ヒスチジンまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを、標準的な組み換え法によりタンパク質に結合させ、適当なアフィニティカラムを通すことにより容易に精製することができる。プロテアーゼ阻害剤、例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンを、精製工程の間のポリペプチドまたはタンパク質の崩壊を減少させる、または解消するために、いずれかまたはすべての工程において添加してもよい。プロテアーゼ阻害剤は、発現ポリペプチドまたはタンパク質の単離、精製のために、細胞を溶解しなければならない場合に特に好ましい。精製すべきポリペプチドまたはタンパク質の特性、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞の特性および細胞を成長させる培地の組成に応じて変化するだろうことは、当業者には明らかだろう。
【０１１２】
医薬処方
本発明のある種の好ましい具体例において、産生ポリペプチドまたはタンパク質は、薬理活性を有し、医薬の製造において有用であるだろう。上記した本願の組成物は、対象に投与されるか、あるいは、最初に、限定するものではないが、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、眼、経皮（局所）、経粘膜、直腸および膣経路を含む可能な経路によるデリバリー用に処方することができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、哺乳動物細胞株から発現した精製ポリペプチドまたはタンパク質、デリバリー剤（すなわち、上記したカチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、界面活性剤等）を医薬上許容される担体と組み合わせて含みうる。本明細書で用いられる場合、「医薬上許容される担体」なる用語は、医薬投与に適当しうる、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。また、追加の活性化合物を、組成物中に組み入れることもできる。
【０１１３】
医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように処方される。非経口、皮内または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液は、下記成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、セイライン溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調製剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含みうる。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムにより調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチックの複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１１４】
注射用途に適した医薬組成物は、典型的には、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および滅菌注射可能溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して適当な担体は、生理食塩水、精菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は滅菌されるべきであり、容易に注入可能である程度に流動性であるべきである。好ましい医薬処方は、製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。一般的に、関連する担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒でありうる。適当な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いることにより、分散剤である場合には要求粒度を管理することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいだろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより実現できる。
【０１１５】
滅菌注射可能溶液は、必要量の精製ポリペプチドまたはタンパク質を、適当な溶媒中に、必要に応じて上記した成分の１つまたは組合せと一緒に溶解し、ついで、濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、哺乳動物細胞株から発現された精製ポリペプチドまたはタンパク質を、基礎分散媒および上記した必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに入れることにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め滅菌濾過した溶液から活性成分と所望の付加的な成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１１６】
一般的に、経口組成物は、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的に関して、精製ポリペプチドまたはタンパク質は、賦形剤と一緒に組み入れ、錠剤、トローチまたはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。また、経口組成物は、口腔洗浄剤として用いられる液体担体を用いて製造することもできる。医薬上適合する結合剤および／またはアジュバントを、組成物の一部として含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、いずれもの以下の成分：結合剤、例えば、微結晶セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン；賦形剤、例えばスターチまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばシュークロースまたはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー、あるいはこれらと同様の性質を有する化合物を含みうる。経口デリバリー用の処方は、有利には、胃腸管内での安定性を改善するため、および／または吸収性を増強するために薬剤を含んでいてもよい。
【０１１７】
吸入による用途の場合、哺乳動物細胞株により発現される精製ポリペプチドまたはタンパク質およびデリバリー剤を含む本発明の組成物は、好ましくは、適当な推進剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーから、エアロゾールスプレー形態でデリバリーされる。本発明は、特に、鼻腔用スプレー、吸入または他の上気道および／または下気道への直接デリバリーを用いる組成物のデリバリーに適合する。インフルエンザウイルスに対するＤＮＡワクチンの鼻腔内投与は、ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発することが示されており、この経路によりデリバリーされた場合、気道内の少なくともいくつかの細胞がＤＮＡを取り込み、本発明のデリバリー剤は細胞摂取を増強するだろうことを示している。本発明のある種の具体例により、組成物は、哺乳動物細胞株から発現した精製ポリペプチドおよびデリバリー剤を含む組成物を、エアロゾール投与用の大きな多孔質粒子として処方される。
【０１１８】
また、全身性投与は、経粘膜または経皮法により行うことができる。経粘膜または経皮投与に関して、浸透すべきバリアに適した浸透剤を処方に用いる。かかる浸透剤は、一般的に当該分野で知られており、例えば、経粘膜投与に関しては、洗浄剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤を用いることにより行うことができる。経皮投与に関して、精製ポリペプチドまたはタンパク質およびデリバリー剤が、当該分野で一般に知られた、軟膏、ゲルまたはクリームに処方される。
【０１１９】
また、組成物は、直腸デリバリー用に、坐剤（例えば、慣用的な坐剤基剤、例えばココアバターおよび他のグリコライドと一緒に）または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１２０】
一の具体例において、例えば、埋め込みおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む、制御放出処方である組成物は、ポリペプチドまたはタンパク質が体内から急速に除去されることを防止する担体を用いて調製される。生分解可能で生体適合性のポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。かかる処方の調製方法は、当業者には明らかだろう。また、物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販されている。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞に標的化したリポソームを含む）は、医薬上許容される担体として用いることができる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている方法により調製することができる。
【０１２１】
投与および投与量を均一にすることを容易にするために、単位剤形で経口または非経口組成物に処方することが有利である。本明細書で用いられる場合、単位剤形は、治療されるべき対象とって単一用量として適した、物理的に別個の単位を意味する。かかる単位は、必要な医薬担体と関連して望ましい治療効果を誘発するように計算された活性ポリペプチドまたはタンパク質の所定量を含有する。
【０１２２】
本発明により発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、約１〜１０週、２〜８週、約３〜７週、約４、５または６週の期間、１週間に１回というように、必要に応じて種々の間隔および種々の期間、投与することができる。当業者には、限定するものではないが、疾患または障害の重篤度、前処理、対象の全体的な健康状態および／または年齢および他の疾患の存在を含むある種の因子が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投与量および時期に影響を与えうることは明らかだろう。一般的に、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質での対象の治療は、単一の治療を含むか、あるいは、多くの場合、一連の治療を含みうる。さらに、適当な投与量が、ポリペプチドまたはタンパク質の能力に依存し、例えば、予め選択した望ましい応答が得られるまで投与量を増加して投与することにより、特定の受容者に最適に合わせうることは理解されるだろう。特定の動物対象に対する特定の投与レベルは、用いられる特定のポリペプチドまたはタンパク質活性、対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与回数、投与経路、排泄速度、薬剤の組合せおよび調節される発現または活性の程度を含む、種々の因子に依存しうることは理解されるだろう。
【０１２３】
本発明は、非ヒト哺乳動物の治療用の本発明の化合物の使用を含む。したがって、投与量および投与方法は、よく知られた獣医学的原則に従って選択されうる。ガイダンスは、例えば、Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001にて見ることができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに投与の指示書と一緒に含まれうる。
【０１２５】
以下の記載は、本発明を単に説明し、代表的なものであって、なんら限定を意図するものではない。本発明を実施するための別法および別の物質、また、付加的な適用は、当業者には明らかであり、特許請求の範囲内に含まれる。
【０１２６】
実施例
実施例１：抗ＧＤＦ−８フェドパッチ法に関する、強化培地１
細胞株を培養する慣用的なフェドバッチ法は、供給物を与えるのに必要な時間と労力および大規模バイオリアクターにおいて特別な装置を必要とすることを含む、いくつかの欠点を有する。本願の目的は、最低限の供給で、大規模バイオリアクターにおける目的のタンパク質の生産用のバッチ培地を構築することである。
【０１２７】
物質および方法
株および培地：チャイニーズ・ハムスター・卵巣（「ＣＨＯ」）細胞を、成長および分化因子８（「抗ＧＤＦ−８細胞」）に対するモノクローナル抗体を発現するために設計した（Veldman et al., Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Therefor、ＵＳ２００４０１４２３８２Ａ１を参照）。抗ＧＤＦ−８細胞を、新規バッチ培地の試験に用いた。培地１および培地２を、高細胞密度および生存率を裏付けるために、その能力を比較した。これらの培地ならびに培地３の組成は、表１に記載する。培地は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを除くすべての成分を添加することにより作成した。ついで、培地を、ｐＨ７．２５に調節し、オスモル濃度を記録し、ついで、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加えた。
【０１２８】
培養条件：フラスコ実験に関して、抗ＧＤＦ−８細胞を振盪フラスコで成長させ、３回継代させた。バイオリアクター実験に関して、抗ＧＤＦ−８細胞を、５日目以降、毎日、２体積％の２０Ｘ培地４フィード培地（表３）または３体積％の１６Ｘ培地４（表４）を補足して、１２日間培地で成長させた。最初の４日間、細胞を３７℃で成長させた。５日目に、細胞を３１℃にシフトした。
【０１２９】
試料分析：毎日、試料を培地から採集し、アミノ酸、ビタミン、鉄、ホスフェート、グルコースおよびグルタミンレベルに関して分析した。
【０１３０】
【表１−１】
【０１３１】
【表１−２】
【０１３２】
結果および結論
図１は、フラスコ実験における、抗ＧＤＦ−８細胞の成長速度は、培地１および培地２で同じであったことを示している。
図２は、バイオリアクターにおいて、培地１が、培地３よりも、有意に高い最終細胞密度および生存率を示すことを示す。また、最終力価は、基本的な方法の５５１ｍｇ／Ｌから培地１で９７６ｍｇ／Ｌまで有意に増加した（データは示していない）。温度を、５日目に３７℃から３１℃にシフトした。予期せぬ高い細胞成長のため、培養物を、２体積％の２０Ｘ培地４または３体積％の１６Ｘ培地４のいずれかを、５日目以降、毎日供給した。かくして、これは、当初予定したバッチ実験とは正確には異なる。フィード培地へのアスパラギンおよびチアミンの供給を１０日目から開始した。
【０１３３】
濃縮バッチ培地の構築において、いくつかの可能性ある問題を考慮する必要がある。第１に、濃縮栄養物は、細胞に毒性である可能性がある。この実施例において構築した培地において、すべての栄養物および成分は、毒性限界以下になるように決定した（データには示していない）。
【０１３４】
第２に、濃縮バッチ培地は、必然的に、非濃縮培地よりも高オスモル濃度を有し、このことは細胞成長および生存率に有害な影響を与えることが示されている。この問題は、開始時の培地中のＮａＣｌ量を少なくすることにより回避することができる。さらに、濃縮バッチ培地は、培養期間全体にわたって成長を持続するのにグルコースのレベルが不十分である。かくして、グルコースフィードを培養物に、５日目以降、毎日補足する。
【０１３５】
第３に、インスリンおよびグルタミンは、１２日の培養期間の間に分解されやすい。かくして、グルコースに加えてこれらの成分を培養物に補足した。
【０１３６】
最後に、鉄は、高ｐＨで高濃度のホスフェートを含有する溶液で沈殿するだろう。この問題は、培地調製工程の最後に、適当なレベルにｐＨを調節した後に、鉄を添加することにより解決できる。
【０１３７】
実施例２：フェドバッチ法における、抗ＧＤＦ−８細胞用の濃縮フィード培地（培地５）の構築
実施例１において、培地１に用いる抗ＧＤＦ−８細胞を培養するバッチ法を構築した。そのプロセスにおいて得られた高細胞密度のため、グルコースおよびグルタミンに加えて栄養物を供給することが有益であることが分かった。しかしながら、８Ｘ培地４フィード培地を有するバッチを補足することにより、培養物が過剰に希釈される。より濃縮したフィード培地を、この問題を解決するために構築した。
【０１３８】
物質および方法および結果
表２は、表３〜４の処方に用いられる、培地４Ａ−１、培地４Ｂ、トレースＢおよびトレースＤの組成を示す。
【０１３９】
【表２−１】
【０１４０】
【表２−２】
【０１４１】
２０Ｘ培地４
第１の濃縮培地を、２０Ｘ培地４として構築した。２０Ｘ培地４の培地の構成を表３に示す。
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
培地の構成は、３つのパート：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩからなる。パートＩは、ビタミンの溶解度の問題のために葉酸を除いた培地４Ｂの個々の成分を含む８Ｘ培地４の濃縮バージョンである。パートＩＩは、パートＩに加えた場合、鉄が沈殿する可能性を回避するための、鉄ストック、トレースＤおよび酸性システインである。パートＩＩＩは葉酸ストックである。パートＩを、５日目から２体積％で毎日加え、パートＩＩおよびＩＩＩを、パート１と一緒に５日目に１回加える。
フィード培地の最終ｐＨを７．０に調節し、オスモル濃度は約１０６４ｍＯｓｍであった。２％フィードにより、培養物が２ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＭのグルタミンおよび１４ｍＯｓｍのオスモル濃度、増加する。
【０１４４】
２．１６Ｘ培地４．
オスモル濃度の増加を軽減するために、フィード培地を、２０Ｘ培地４（毎日２体積％）から１６Ｘ培地４（毎日３体積％）に変更した。１６Ｘ培地４の培地構成を、表４に示す。
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
また、この修飾１６Ｘ培地４において、さらにオスモル濃度を減少させるためにグルコースを除き、グルコースフィードに融通性を与えた。フィード培地の総オスモル濃度は、この時点で２９５ｍＯｓｍである。
【０１４７】
３．１６Ｘ培地４
１６Ｘ培地４の構成を変更した。鉄ストック溶液をフィードに加え、結果として、個々のフィードに０．４５μＭを添加した。さらに、グルコースを戻し、フィード毎に１．５ｇ／Ｌを加えた。この修飾１６Ｘ培地４の培地構成を表５に示す。
【０１４８】
【表５】
【０１４９】
４．１６Ｘ培地４
ここで、フィード培地（１６Ｘ培地４）を、いくつかのバッチと同様に、３つの別個のフィードの代わりに複合培地で作成した。葉酸を必要な濃度で溶解できることを確実にし、鉄または葉酸がいずれも、４℃または室温のいずれかで６日間貯蔵した後も溶液から沈殿しないことを確実にするために試験を行った。複合１６Ｘ培地４の培地構成を表６に示す。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
１日あたり２ｇ／Ｌのグルコース添加および１．５ｍＭのグルタミンの添加で、培地の最終オスモル濃度は７２４ｍＯｓｍである。
【０１５２】
５．１２Ｘ培地４．
ここで、フィード培地をいくらか変更する。培地４Ｂ粉末を、培地４Ｂにおける個々の成分を添加する代わりに用いた。培地４Ｂ粉末を、グルコースと混ぜ合わせ、溶液をｐＨ１０．２５まで滴定することにより、塩基性条件下で別々に溶解した。アミノ酸およびビタミン分析結果が、フェドバッチプロセスの終わりまでに、これらの二つの成分が排出されることを示したので、付加的なアスパラギンおよびチアミンを加えた。１２Ｘの培地４の使用は、さらに、培養物に供給する場合、オスモル濃度の増加を軽減した。１２Ｘ培地４の培地構成を表７に示す。
【０１５３】
【表７】
【０１５４】
採取オスモル濃度は５６６ｍＯｓｍである。４体積％の１日のフィードが、適度に、オスモル濃度を８．６、グルコースを２ｇ／Ｌおよびグルタミンを１．５ｍＭ増加させる。また、１２Ｘ培地４培地構成物が、培地５として知られている。培地５は、２０Ｘ培地４または１６Ｘ培地４と比較して容易に作成でき、室温または４℃で１０日以上安定である（データは示していない）。
【０１５５】
実施例３：グルタミン抗ＧＤＦ−８細胞培養物に関する、グルタミン不足フェドバッチプロセス
ＣＨＯ細胞は、生存するために初期の培地にグルタミンを必要とする。慣用的には、初期グルタミンレベルは高く、グルタミンは、５日目以降フェドパッチ工程の最後まで毎日供給される。慣用的なフェドバッチプロセスは、通常、細胞培養において、高い乳酸濃度およびアンモニウムレベルを生じ、このことが、細胞成長、細胞密度および組み換えタンパク質発現の効果を阻害することが知られている。グルコースを培養物にゆっくりと添加するフェドバッチ工程は、乳酸産物を低下させ、細胞成長、細胞密度および組み換えタンパク質発現を改善することが示された。しかしながら、グルコース添加の操作に関する従来の方法は、大規模製造で実用化されていない。そこで、低い初期グルタミンレベルおよびフィードからグルタミンを除いた培養培地を利用することにより、アンモニウムおよび乳酸の産生が低レベルであり、細胞生存率を増加させることが示された。加えて、グルタミン不足培地において、組み換えタンパク質発現は増加し、最終オスモル濃度は減少した。
【０１５６】
物質および方法
株および培地：抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌバイオリアクター中、培地１においてフェドバッチモードで培養した。
培養条件：細胞を、１Ｌバイオリアクターにおいて１２日間成長させた。温度を、細胞成長に応じて、４日目または５日目に３７℃から３１℃にシフトした。３つのフェドバッチプロセス：通常（対照）プロセス、非グルタミンフィードプロセスおよびグルタミン不足プロセスを試験した。これらのプロセスの関連細目を、表８および表９に示す。
【０１５７】
【表８】
【０１５８】
【表９】
【０１５９】
試料分析：培養物から毎日試料を採取し、細胞密度、細胞生存率、乳酸、グルタミンおよびアンモニウムレベルに関して分析した。また、発現抗ＧＤＦ−８抗体の力価を毎日測定した。
【０１６０】
結果および結論
図３は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物の細胞密度を示す。両方の場合において、細胞密度は、実験期間中同様であった。
図４は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物の細胞生存率を示す。非グルタミンフィード培養物は、６日目から実験の終わりにかけて非常に高い細胞生存率を示した。
図５は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物中のアンモニウムレベルを示す。非グルタミンフィード培地は、４日目から実験の終わりにかけてアンモニウムレベルの顕著な減少を示した。
図６は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物中の乳酸レベルを示す。乳酸レベルは、実験の期間中、非グルタミンフィード培養物においてわずかに低下した。
図７は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物における抗ＧＤＦ−８抗体力価を示す。最終抗ＧＤＦ−８抗体力価は、非グルタミンフィード培養物においてより高かった。
図８は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物の細胞密度を示す。両方の場合において、細胞密度は、実験期間中同様であった。
図９は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物における細胞生存率を示す。両方の場合において、細胞生存率は、実験期間中同様であった。
図１０は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物におけるアンモニウムレベルを示す。グルタミン不足培養物は、実験期間中、アンモニウムレベルの顕著な減少をを示した。
図１１は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物における乳酸レベルを示す。グルタミン不足培養物は、４日目から実験の終わりにかけて、乳酸レベルの顕著な減少をを示した。
図１２は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件における抗ＧＤＦ−８抗体力価を示す。最終抗ＧＤＦ−８抗体力価は、グルタミン不足培養物においてより高かった。
【０１６１】
総合すると、これらの結果は、低いグルタミンレベルが、アンモニウム産物の量を減少させ、細胞生存率を増加させ、発現抗ＧＤＦ−８抗体の力価を増加させることにより、細胞培養に有益であることを示している。加えて、グルタミン不足培養物において、場合により、低グルコース消費速度により、低乳酸レベルが観察された。また、低いアンモニウムおよび乳酸レベルは、トータルのオスモル濃度を減少させる効果を有する。高いオスモル濃度は、また、細胞成長および生存率に対して阻害効果を有することが知られている。グルタミンフィードを除くと共に、低い初期グルタミンレベルは、また、貯蔵培地における非酵素グルタミン分解の結果として生じるアンモニウムを減少させる優れた効果を有する。フィードにおいてグルタミンを排除することは、また、抗ＧＤＦ−８細胞の培養プロセスを単純化する。
【０１６２】
実施例４．培地１および培地２における抗ＧＤＦ−８細胞の鉄投与応答
培地１を、培地２よりも栄養物でさらに濃縮した。培地１における細胞成長最適な鉄レベルを、細胞培養期間の鉄欠乏に関する問題を回避するために測定した。
【０１６３】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、培地１または培地２においてディッシュ中で、１継代培養した。これらの培地の鉄濃度を、異なる量の貯蔵鉄溶液を添加することにより操作した。最終細胞密度を、ＣＥＤＥＸにより測定した。
【０１６４】
結果および結論
図１３は、異なる鉄濃度を有する培地１および培地２における抗ＧＤＦ−８細胞のＦｅ投与応答を示す。培地２において、細胞密度は、３μＭ〜１５μＭの範囲の鉄濃度に対して相対的に一定であった。培地１において、細胞密度は、鉄濃度の増加と共に増加したが、約５μＭで最大に達した。この違いは、培地１は高含有量で栄養分を含み、培地における鉄のキレート化の結果として、細胞が利用できる鉄が減少したためと考えられる。これらの結果は、培地１にける鉄欠乏に関する問題を回避するために、５μＭ以上を維持すべきであることを示している。
【０１６５】
実施例５：バイオリアクタープロセスにおける、グルタミンのグルタミン酸塩への置換
抗ルイスＹ細胞培養プロセスにおいて、グルタミンをグルタミン酸に置換することによる効果を、３つの実験で試験した。
【０１６６】
物質および方法
実験を、１０Ｌバイオリアクター中、ｐＨ７．１、３０％酸素溶解および開始温度３７℃、５日目に３１℃にシフトの条件で行った。散布ガスおよびヘッドスペースガスは、８８％の９３％空気／７％ＣＯ２混合物および１２％酸素であった。すべての実験において、出発培地は、グルタミンを含有する培地１であった。補足グルコースおよびグルタミンフィードを含む、フィード培地およびフィードスケジュールを、表１０に示す。「グルタミン酸塩」のカラムは、グルタミンを含有しないが、標準培地５におけるモルグルタミン濃度と等しいモル濃度のグルタミン酸塩を含有する、修飾培地５で与える。
【０１６７】
【表１０】
【０１６８】
結果および結論
各々の実験において、細胞密度は、図１４に示すように同様であった。グルタミン２およびグルタミン酸塩２の実験において、ｐＨが３日後に約６．７になったために細胞密度が低い。グルタミン３およびグルタミン酸塩３の実験における、６および７日目の間の密度の低下は、６日目での２９％培地フィードによるものである。
【０１６９】
図１５は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の細胞生存率を示す。細胞生存率は、グルタミン酸塩フェド培養物を含有するバイオリアクターにおける工程の後半の期間、高レベルを維持した。
【０１７０】
実験１において、抗ルイスＹ力価は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物間で同様である。図１６は、実験２および３において、抗ルイスＹ力価が、グルタミンフェドリアクターにおいてより低いことを示している。これらのリアクターで観察された低抗ルイスＹ力価は、図１７に示すように産生された高レベルの乳酸によるものであると考えられる。
【０１７１】
フィード培地にグルタミン酸塩を有するバイオリアクターでは、低アンモニウム濃度（図１８）および低オスモル濃度（図１９）であった。
【０１７２】
結合ＥＬＩＳＡアッセイを、グルタミン１およびグルタミン酸塩１実験からの試料の活性を試験するのに用いた。活性は、グルタミン１試料のリファレンスが１１０％およびグルタミン酸塩１試料のリファレンスが１２２％と同様であった（データは示していない）。
【０１７３】
３つの実験におけるグルタミンのグルタミン酸塩への置換は、細胞密度に有意な影響を与えなかった。しかしながら、細胞生存率は、グルタミンをフィードしたバイオリアクターがより低い。アンモニウム、乳酸塩およびオスモル濃度は、グルタミンをフィードしたものと比較して、グルタミン酸塩をフィードしたバイオリアクターが低い。平均して、抗ルイスＹ力価は、グルタミン酸塩をフィードしたバイオリアクターにおいてより高く、活性は、本質的に両方の条件下で同じである。
【０１７４】
実施例６．抗ルイスＹ細胞培養プロセルにおけるグルコースおよびグルタミンの置換
この実験の目的は抗ルイスＹ細胞の培養において、グルコースおよびグルタミンを下記表１１に示すフィード培地で置き換えることによる効果を試験することであった（Bogheart et al., Antibody-targeted chemotherapy with the calicheamicin conjugate hu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisy and eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografts, Clin. Can. Res. 10:4538-49 (2004)を参照）。細胞密度、細胞生存率、抗ルイスＹ力価およびアンモニウムレベルを測定した。
【０１７５】
物質および方法
実験を、２５０ｍｌの振盪フラスコ開始容量７５ｍｌで行った。すべての振盪フラスコに、培地２で０．２５×１０６細胞／ｍｌで播種した。フラスコを、インキュベーターにおいて、３７℃、７％のＣＯ２で、１４日間インキュベートした。３および４日目に、フラスコに、５体積％の培地６フィード培地をフィードした。培地６の組成を表１１に示す。５〜１３日目に、フラスコに、表１２に示すフィード溶液の１つをフィードした。各々の条件で、２回行った。試料を毎日採取し、細胞をＣＥＤＥＸにより計数し、アンモニウム、グルコースおよび乳酸塩に関してアッセイした。
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
【表１２】
【０１７８】
結果および結論
フィード培地中グルコースまたはガラクトースの存在下、グルタミン酸塩またはグリシルグルタミンをグルタミンの代わりに用いた場合に、最も高い細胞密度が観察された。細胞密度は、グルコース／グルタミン、ガラクトース／グルタミンまたはグルコース単独をフィードする培養物において、一般的に低い（図２０）。最終生存率は、グルコース単独をフィードする培養物で最も高く、ついで、グルコース／グルタミン酸塩をフィードする培養物で高かった。グルコースまたはガラクトースと組み合わせたグルタミンまたはアスパラギンをフィードする培養物において最も低い生存率が観察された（図２１）。
【０１７９】
１４日での力価は、グルコース／グリシルグルタミンおよびグルコース／グルタミン酸塩フェド培養物において約７００μｇ／ｍｌで最も高かった。力価は、ガラクトース／グリシルグルタミンおよびガラクトース／アスパラギンフェド培養物において約５００μｇ／ｍｌで最も低かった。グルコース／グルタミン対照における力価は約５７０μｇ／ｍｌであった（図２２）。
【０１８０】
グルコース／グルタミン酸塩またはグルコース単独をフィードするフラスコにおいて最も低いアンモニウムレベルが観察された。ガラクトース／グルタミン酸塩、グルコース／グルタミン、グルコース／グリシルグルタミンおよびグルコース／アスパラギンをフィードするフラスコは、中間レベルのアンモニウムを示した。ガラクトース／アスパラギン、ガラクトース／グリシルグルタミンおよびガラクトース／グルタミンをフィードしたフラスコは、最も高いレベルのアンモニウムを有していた（図２３）。
【０１８１】
グルコースレベルは、ガラクトースをフィードしたすべてのフラスコにおいて１１日目まで１ｇ／Ｌ以上残っていた。１１〜１４日目にかけては、これらの培養物のグルコースは完全には消費されず、個々の培養物間で有意な違いはなく、０．６〜１ｇ／Ｌ残っていた。
【０１８２】
グルコースレベルは、他の基質と組み合わせたグルコースまたはグルコースをフィードしたすべてのフラスコにおいて、１０日目まで増加した。１０〜１４日目に、これらの培養物において、グルコースレベルは、ほぼ一定であり、お互いに同様であった。１４日目には、グルコース／グルタミン酸塩フェド培養物において、約８．４ｇ／Ｌグルコースが残っており、グルコースのみをフィードする培養物においては、約１０．８ｇ／Ｌグルコースが残っていた。
【０１８３】
乳酸レベルは、５日目に約２．４ｇ／Ｌのレベルに達し、このとき条件がすべての細胞で同じになり、１４日目までにすべての培養物において本質的に０になった。乳酸塩レベルは、グルコース／グルタミン対照において、１０〜１４日目に最も高くなったが、この期間１ｇ／Ｌ未満であった（データは示していない）。
【０１８４】
この実験で試験したすべての条件は、対照グルコース／グルタミン条件よりも高い細胞密度であった。ガラクトース／アスパラギン条件を除いて、試験したすべての条件は、グルコース／グルタミン対照またはガラクトース／グルタミンフィード条件よりも、より高い最終生存率であった。グルコース／グルタミン対照における力価は、グルコース／グリシルグルタミンフィード条件およびグルコース／グルタミン酸塩フィード条件における最高値約７００μｇ／ｍｌと比較して、約５７０μｇ／ｍｌであった。
【０１８５】
実施例７：抗ＧＤＦ−８の産生に関するグルタミン欠乏バッチプロセスの評価
典型的なフェドバッチ生成法は、培養期間の間複数回のフィードを必要とする。これらのフィードは、細胞により消費されるか、あるいはバッチ期間中分解されうる培地中の栄養物を元に戻すように設計される。これらのフィードにより、大きなリアクターにスケールアップした場合に、インペラー・ジャンプ（ｉｍｐｅｌｌｅｒ ｊｕｍｐ）（図２４を参照）の必要性のような複雑な問題が生じる。さらに、フィードは、すでに培養物に分泌された抗ＧＤＦ−８の量を希釈し、したがって、採集力価に影響を与える。バッチプロセスの使用により、フィードに適合するように部分容量で植菌する代わりに最大容量でバイオリアクターの植菌をすることが可能になり、インペラー・ジャンプの必要性が取り除かれ、生産性への希釈影響を大きく減少させるだろう。
【０１８６】
グルタミンは、３７℃で不安定であり、バッチ培養において補充される必要性があると考えられることがフェドバッチ法を用いる最も大きな理由の１つである。しかしながら、グルタミン欠乏法を試験した実施例２、５および６の結果は、グルタミンをフィードした対照リアクターと比較して、生産性を有意に向上させたことを示した。この結果を、この実施例において試験したグルタミン欠乏バッチ法と組み合わせた。
【０１８７】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、以下の４つの成長条件に従って、１２日間、ｌＬのバイオリアクター中で成長させた。すべての条件に関するバイオリアクターパラメータを、同一に維持した。空気を散布することにより、溶解した酸素を維持し、空気飽和度の２３％より高く維持し、ｐＨを、０．５８Ｍの二酸化炭素および０．７１Ｍの炭酸ナトリウムを含有する溶液を添加することにより、７．００で維持した。すべての培養物の温度を、バッチの最初の４日間３７度に維持した。バッチの４日目に、すべてのバイオリアクターの温度を３１度に下げ、バッチ期間中この温度を維持した。対照およびフェドバッチ培養物に、８％、１２％および８％の総リアクター容量のフィード培地を、それぞれ、５、７および１０日目にフィードした。
【０１８８】
１）対照
− インキュベーション培地、培地７（表１３を参照）
− フィード培地８を５、７および１０日目にフィード（表１３を参照）
− ５ｍＭのグルタミンを４日目にフィード
− 温度を４日目に３１℃に下げる
２）フェドバッチグルタミン欠乏
− インキュベーション培地、４ｍＭのグルタミンだけを有する培地７（表１３を参照）
− グルタミン無しの培地８を、５、７および１０日目にフィード（表１３を参照）．
− ４日目に非グルタミンフィード
− 温度を４日目に３１℃に下げる
３）バッチグルタミン欠乏
− インキュベーション培地、４ｍＭのグルタミンだけを揺する新規バッチ培地（表１３を参照）
− フィード培地無し
− 非グルタミンフィード
− 温度を４日目に３１℃に下げる
− ８日目に５ｇ／Ｌのグルコースを加える
４）８日目に補給されるバッチグルタミン欠乏
− インキュベーション培地、４ｍＭのグルタミンだけを有する新規培地（表１３を参照）
− フィード培地無し
− グルタミンフィード無し
− ４日目に温度を３１℃に下げる
− ８日目に、４ｇのグルコース、３７５ｍｇのアスパラギン、３ｍＬの１ｍＭのＦｅＳＯ４ストック、３．３３ｍＬの５ｇ／ＬのＮｕｃｅｌｌｉｎ（登録商標）ストック、２．５７ｍＬの３６ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾンおよび１．０ｇ／Ｌプトレシンストック溶液、０．２３ｍＬの５０ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムストックおよび１３．１ｍｇのチアミンを加える。
【０１８９】
【表１３−１】
【０１９０】
【表１３−２】
【０１９１】
結果および結論
最初の４日間の細胞成長は、対照とバッチプロセスにおいて同様であるが、グルタミン欠乏フェドバッチプロセスは、細胞密度が有意に低く、バッチ後には少し低めであった。両方のバッチプロセスは、恐らく、有意な希釈が無かったために、バッチ期間中、高い細胞密度を維持した（図２５を参照）。すべての培養物の生存率は、８日目まで同じであった。しかしながら、１１日目に、補給がないバッチプロセスの生存率は、他の３つのバイオリアクターよりも低く、最終日までに有意に減少することに注目することは興味深い。このことは、補給バッチプロセスがフェドバッチバイオリアクターと同様の生存率を示しているので、バッチ培地はさらに最適化されうることを示唆している（図２６を参照）。
【０１９２】
グルタミン不足バッチプロセスまたはグルタミン不足フェドバッチプロセスにおいて培養した細胞は、対照フェドバッチプロセスにおいて培養された同じ細胞よりも、生産性において優れていた。対照フェドバッチプロセスは、予想通り、６８５μｇ／ｍＬの採取日力価を有していたが、グルタミン欠乏フェドバッチプロセスは、１０８０μｇ／ｍＬの採取力価を有しており、対照よりも約５８％高かった。これは、前に見られた結果と同様である。グルタミン欠乏非補給バッチプロセスは、９６０μｇ／ｍＬの採取日力価を有しており、グルタミン欠乏フェドバッチプロセスと同様に対照よりも４０％高かったが、補給グルタミン欠乏バッチプロセスは、最も高い採取力価、１２９６μｇ／ｍＬを有していた。これは、対照よりも８９％増加している（図２７を参照）。
【０１９３】
４つの条件での阻害剤レベルを分析した場合、その結果は、３つすべてのグルタミン欠乏プロセスにおける乳酸およびアンモニウムレベルが対照よりも有意に低いことを示していた。実際、４日後、これらの３つの条件は、乳酸の産生が停止するか、または乳酸の消費が開始されたが、対照はバッチ期間中乳酸を産生し続けた（図２８を参照）。予想通り、アンモニアレベルは、グルタミン欠乏プロセスにおいて非常に低く、４日後に低下したが、対照はアンモニアを生産し続けた（図２９を参照）。
【０１９４】
この実施例において、グルタミン欠乏法をバッチプロセスと組み合わせると、フェドバッチプロセスよりも、抗ＧＤＦ−８細胞の生産性が４０％向上した。また、データは、バッチ培地を最適化することにより、生産性を約２倍改善しうることを示唆している。この生産性の改善は、２つの因子に起因しうる。第１は、グルタミン欠乏が、直接生産性を向上させるか、またはアンモニアおよび乳酸レベルを非常に低く保つことにより生産性を向上させる。第２に、フィードがないので、力価がバッチ期間中に薄まらない。バッチプロセスの本来の操作の容易さに加え、高い生産性により、バッチプロセスは組み換えポリペプチドの生産において魅力ある選択肢である。
【０１９５】
実施例８：バッチ中のグルタミンおよびアスパラギン濃度の抗ＧＤＦ−８細胞培養プロセスに対する影響
実施例２、５および６において、グルタミン欠乏が、２つの細胞において、フェドバッチ培養に、細胞成長、細胞生存率および力価の増加ならびに乳酸塩およびアンモニウムの産生の減少を含む有益性をもたらすことが実証された。また、アスパラギンもバッチ培地において同様の役割を果たすと考えられる。
【０１９６】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、異なる濃度のグルタミンおよびアスパラギンを有する修飾培地９において、１Ｌのバイオリアクター中で１２日間培養した。基本培地９の組成を表１４に示す。この基本組成の実験バリエーションを、表１５に示す。培養物を、温度コントロールの問題のために最初の日に３０℃であってリアクター４を除き、最初の５日間３７℃でインキュベートした。培養物を、６日目に３１℃にした。７日目に、培養物に、１回、グルタミンを欠く５体積％の培地５をフィードした。培養物を、毎日、細胞密度、抗ＧＤＦ−８力価、乳酸塩およびアンモニウムレベルに関して測定した。
【０１９７】
【表１４−１】
【０１９８】
【表１４−２】
【０１９９】
【表１５】
【０２００】
結果および結論
図３０、３１、３２および３３は、それぞれ、種々の実験条件下での実験における、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長、抗ＧＤＦ−８力価、乳酸レベルおよびアンモニウムレベルを示す。
【０２０１】
すべての実験条件下で、４ｍＭのグルタミンが、１ｍＭのグルタミンよりも、試験したすべてのアスパラギンレベルで良好であった。同等のグルタミンレベルで、１２ｍＭおよび２０ｍＭアスパラギン条件が、８ｍＭアスパラギン条件よりも良好であった。乳酸塩およびＮＨ４レベルの減少が、すべての試験条件の培養の終わりに観察された。
【０２０２】
実施例９．バッチ培地におけるグルタミンおよびアスパラギン濃度の抗ＧＤＦ−８細胞培養プロセスに対する影響
実施例８において、アスパラギンレベルに拘わらず、初期濃度４ｍＭのグルタミンを含有する培地９が、１ｍＭのグルタミンを含有する培地よりも良好であることが実証された。この実施例は、１３ｍＭグルタミンレベルおよび種々のアスパラギンレベルを含有する培地の影響を実証する。
【０２０３】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、表１６に示す異なる濃度のグルタミンおよびアスパラギンを有する修飾培地９において、１Ｌバイオリアクター中で１２日間培養した。この培養物を、最初の３日間３７℃でインキュベートした。ついで、培養物を、４日目に３１℃にシフトした。７日目に、培養物に、１回、グルタミンを欠く５体積％の培地５をフィードした。培養物を、毎日、細胞密度、細胞生存率、乳酸塩、アンモニウムレベルおよびグルタミンレベル、抗ＧＤＦ−８力価およびオスモル濃度に関して測定した。
【０２０４】
【表１６】
【０２０５】
結果および結論
図３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０は、それぞれ、それぞれ、種々の実験条件下での実験における、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長、抗ＧＤＦ−８細胞の生存率パーセント、乳酸レベル、アンモニウムレベル、グルタミンレベル、抗ＧＤＦ−８力価およびオスモル濃度を示す。
【０２０６】
試験したすべての条件下の中で、１３ｍＭのグルタミンおよび２０ｍＭのアスパラギンを含有する培地９だけが、細胞成長および力価に対して有意な悪影響を示した。グルタミンは、４ｍＭまたは１３ｍＭのグルタミンで開始されたかどうかに拘わらず、ほとんど同時期にすべての培養物で使い果たされた。最も高い抗ＧＤＦ−８力価は、１３ｍＭのグルタミンおよび１２ｍＭのアスパラギンを含有する培養物で得られる。すべての培養条件は、培養の終わり付近で、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示す。アンモニウムレベルは、１３ｍＭのグルタミンおよび２０ｍＭのアスパラギンを含有する培地において最も高い。
【０２０７】
実施例１０：アスパラギンおよびシステインレベルの、培地９で培養された抗ＧＤＦ−８細胞における低い乳酸塩およびアンモニウムレベルに対する影響
実施例２、５および６において、グルタミン欠乏条件下で成長した培養物が、培養プロセスの最後に、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示すことが見出された。しかしながら、非グルタミン欠乏条件下で培地９にて成長した培養物が、培養プロセスの最後に、さらに低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した。この効果は、グルタミン欠乏が乳酸塩およびアンモニウムのレベルの低下に必要であると考えられる培地１のような他の培地では観察されなかった。培地９と培地１は、アスパラギン（培地９において２０ｍＭに対して、培地１＋フィードで合計１１ｍＭ）および酸性システイン（培地９において１．５ｍＭに対して、培地１において０．９５ｍＭ）のレベルの点で異なる。この実施例は、これら２つの成分が培養の終わりで観察される乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関与するかどうかを試験する。
【０２０８】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクターで１２日間培養した。細胞を、最初に３７℃で培養し、４日目または５日目に、８〜１０×１０６／ｍｌで、３１℃にシフトした。表１７に、試験した種々の実験条件を示す。試料を毎日採取し、力価分析をタンパク質Ａ ＨＰＬＣで行った。
【０２０９】
【表１７】
【０２１０】
結果および結論
培地９において成長した抗ＧＤＦ−８細胞は、培養を４ｍＭまたは１３ｍＭのグルタミンのいずれかで開始したかに拘わらず、培養工程の最後で、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した（図４２および４３を参照）。対照的に、培地１は、培養が４ｍＭのグルタミンで開始された場合にのみ培養工程の最後で、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した（図４２および４３を参照）。追加のアスパラギンおよびシステインを１３ｍＭのグルタミンを含有する培地１に添加すると、培養工程の最後で、乳酸塩およびアンモニウムレベルは低くなかった（図４２および４３を参照）。
【０２１１】
培養工程の終わりに低い乳酸塩およびアンモニウムレベル培養物（４ｍＭのグルタミンを有する培地１、４ｍＭのグルタミンを有する培地９および１３ｍＭのグルタミンを有する培地９）は、また、培養工程の終わりに低い総オスモル濃度を有することが示された（図４７を参照）。
【０２１２】
４ｍＭのグルタミンを有する培地９は、最も高い抗ＧＤＦ−８力価を示し、ついで、４日目にフィードされる１３ｍＭのグルタミンを有する培地９が高かった（図４６を参照）。フィードによる希釈の影響を考慮すると、４ｍＭのグルタミンを含有する培地９は、１３ｍＭのグルタミンを含有する培地９と、等価の抗ＧＤＦ−８力価を有していた。
【０２１３】
実施例１１：培地９において培養された抗ＧＤＦ−８細胞において観察された乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に対する、アミノ酸およびビタミンレベルの影響
実施例１０は、培地１および培地９間のアスパラギンおよびシステインレベルの違いが、グルタミンが欠乏していない培地９における培養工程の最後での乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関係しているかどうかを試験する。これらの因子が観察された減少に関与していないことが示された。培地１および培地９は、また、これらのアミノ酸およびビタミン濃度が異なる。この実施例は、２つの培地間のアミノ酸およびビタミン濃度の違いが、観察された減少に関係しているかどうかを試験する。
【０２１４】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクター中で１２日間試験した。細胞を、最初に３７℃で培養し、４日目に８〜１０×１０６／ｍｌで３１℃にシフトした。表１８に、種々の試験した実験条件を示す。アミノ酸、ビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅ（組成を表１９に示す）および鉄を、種々の実験培地１条件に加え、これらの成分のレベルを培地９のレベルと等しくした。試料を毎日採取し、タンパク質Ａ ＨＰＬＣにより力価分析を行った。
【０２１５】
【表１８】
【０２１６】
【表１９】
【０２１７】
結果および結論
試験したすべての条件は、付加的なアミノ酸を含有する培地１を除いて培養工程の最後に、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示し、培地１と比較して高い培地９のアミノ酸レベルは、恐らく、乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関与していないことを示している（図４９および５０を参照）。しかしながら、付加的なビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地１は、付加的なアミノ酸を含有する培地１を比較して、培養工程の最後に、より低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した（図４９および５０を参照）。これは、これらの成分が、培地９で観察された減少に関与しうることを示している。
【０２１８】
付加的なビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地１で成長した培養物は、出発培地においてアスパラギンおよびグルタミンの総量がより低いために、実験全体において最も低いレベルのアンモニウムを示した（図５０を参照）。
【０２１９】
実施例１２：ビタミン、微量元素Ｅおよび鉄レベルの、培地９で培養された抗ＧＤＦ−８細胞において観察された乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に対する影響
実施例１１において、培地１に対して高いレベルの培地９におけるビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅおよび鉄は、培養工程の最後に観察される乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関与しうることが決定された。ここでは、これらの成分を、個々におよび組み合わせて、減少に影響を与えるかを決定するために試験する。
【０２２０】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクター中で１２日間培養した。細胞を、最初３７℃で培養し、４日目に約６×１０６細胞／ｍｌでシフトする、微量元素Ｅを含有する培地１を除いて、４日目に８〜１０×１０６細胞／ｍｌで３１℃にシフトした。表２０に、試験した種々の実験条件を示す。ヒドロコルチゾンおよびプトレシンを、すべての培地１条件に加え、これらの成分のレベルを培地９のレベルと等しくした。ビタミン、微量元素Ｅ（組成は表１９に示す）および鉄を種々の実験培地１条件に加え、これらの成分のレベルを培地９のレベルと等しくした。試料を毎日採取し、タンパク質Ａ ＨＰＬＣにより力価分析を行った。
【０２２１】
【表２０】
【０２２２】
結果および結論
試験したすべての条件の内、１３ｍＭのグルタミンを含有する培地９および微量元素Ｅを含有する培地１だけが、培養工程の最後で、乳酸塩およびアンモニウムのレベルの減少を示した（図５４および５５を参照）。微量元素Ｅを含有する培地１で観察されたレベルの減少は、この培養物が、細胞が約６×１０６細胞／ｍＬである時に温度シフトされた事実によるものでありうることを注意すべきである。
１３ｍＭのグルタミンを含有する培地９は、培地１構成物より高い抗ＧＤＦ−８力価を示した。
【０２２３】
実施例１３：培地１、３および９の細胞成長および抗ＧＤＦ−８力価に関する比較
この実験は、培地１、３および９を用いる細胞成長および抗ＧＤＦ−８力価の違いを測定するために行った。
【０２２４】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞は、種々の培地、表２１に記載のフィード条件下で培養した。関連する培地の情報を表２２に示す。細胞を１Ｌのバイオリアクター中で１２日間成長させ、４日目に３７℃から３１℃にシフトした。
【０２２５】
【表２１】
【０２２６】
【表２２】
【０２２７】
結果および結論
培地９で培養した抗ＧＤＦ−８細胞は、最も高い細胞密度および抗ＧＤＦ−８力価を示し、一方、培地３で培養した抗ＧＤＦ−８細胞は、最も低い細胞密度および抗ＧＤＦ−８力価を示した（図５７および５８を参照）。培地９が培地１よりも結果が優れているという事実から、複数回フィードにより培地成分を供給するより、むしろ出発培地に培地成分を提供することがより好ましいことが示されている。加えて、培地１および培地９の両方が、培地３よりも良好に行われるという事実から、７０ｍＭ未満の濃度でアミノ酸を提供するよりも、約７０ｍＭより高い濃度でアミノ酸を提供することがより優れた結果をもたらすことが示されている。最後に、約７０ｍＭより高い濃度で出発物質にアミノ酸を提供することが、最も高い細胞密度および力価を与えた（培地１と培地９を比較した）。
【０２２８】
実施例１４：バイオリアクターにおける抗ＧＤＦ−８細胞培養に関する培地９における最適なグルタミンおよびアスパラギン総レベルの統計的分析
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクター中で培養し、表２３に示す日に３７℃から３１℃にシフトした。最終力価を、グルタミン単独の最適レベルおよびグルタミンおよびアスパラギンを合わせた最適レベルを決定するために、Ｔ−テストに付した。表２３に、培地９で成長した抗ＧＤＦ−８細胞の関連実験条件および最終結果を要約した。
【０２２９】
【表２３】
【０２３０】
結果および結論
図５９は、種々のレベルのグルタミン単独およびグルタミンおよびアスパラギンの組合せの推定抗ＧＤＦ−８力価を示す。表２４は、２〜１５ｍＭのグルタミンレベルおよびこの範囲外のグルタミンレベルの標準化力価を比較する、Ｔ−試験の結果を示す。表２５は、１６〜３６ｍＭのグルタミンおよびアスパラギンレベルの組合せおよびこの範囲外のレベルのグルタミンおよびアスパラギンの組合せを比較するＴ−試験の結果を示す。
【０２３１】
両方のＴ−試験結果は、比較した２つの群の間の抗ＧＤＦ−８力価に有意な違いがることを示している。２〜１５ｍＭのグルタミンおよび１６〜３６ｍＭのグルタミンおよびアスパラギンの組合せを含有する培地９において成長した培養物は、これらの範囲外のグルタミンおよびグルタミンおよびアスパラギン組合せレベルを有する培地において成長した培地よりも、より高い抗ＧＤＦ−８力価を示す。すべての実験において、アスパラギンレベルは、９ｍＭよりも高かった。
【０２３２】
【表２４】
【０２３３】
【表２５】
【０２３４】
実施例１５：培地の細胞培養物に対する影響
この実施例は、高密度播種培養物を用いる中規模での３つの細胞培養培地バリエーションの能力を評価する。試験したすべての培地は、小規模バイオリアクターデータに基づいて、フェーズ１培地（培地１１フィード培地をフィードした培地１０）において改善が見られることが期待された。
【０２３５】
物質および方法
ヒト化抗ＡベータペプチドＩｇＧ１モノクローナル抗体（「抗Ａベータ細胞」）を発現するＣＨＯ細胞を、表２６に示すように、種々の培地で試験した（Basi et al., Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide、ＷＯ０２／４６２３７を参照）。ｐＨの下点を、フェーズ１を除いて０．９５ＭのＮａ２ＣＯ３＋０．０５ＭのＫ２ＣＯ３で制御して７．０に設定し、フェーズ１は、０．５８Ｍの重炭酸ナトリウムおよび０．７１Ｍの炭酸ナトリウムを含有する溶液で制御した。溶存酸素を、必要により空気を散布することにより３０％に制御し、６０ｒｐｍで撹拌し、フィード培地は培地５（上記のように、グルタミンを含む、または含まない）であった。０３Ｐ４９Ｂ５０１を除くすべての培養物を１３０Ｌ規模で成長させ、０３Ｐ４９Ｂ５０１は５００Ｌ規模で成長させた。簡単には、培地１は、相対的な取り込み速度の考慮なしにすべての栄養物が豊富であり、一方、培地１２は、栄養分が無差別に豊富なバージョンから明らかに不必要な栄養分を除去することによりバランスをとった。培地１０、１１および１２の比較を表２７に示す。
【０２３６】
【表２６】
【０２３７】
【表２７−１】
【０２３８】
【表２７−２】
【０２３９】
【表２７−３】
【０２４０】
結果および結論
これらの実験を通じて、培地の変更により一様に改善された。細胞成長、生存率、低乳酸レベル、低アンモニウムレベルおよび力価の点で、低グルタミンレベルは、高いもの（図６０〜６４を参照）よりもより優れており、バランス化（バッチ）培地は、リッチ培地（培地１、図６０〜６４を参照）よりも優れていた。高密度接種で開始した培養物は、低密度接種で開始した培養物よりも高い最終力価を示した（図６４を参照）。
【０２４１】
小規模バイオリアクターにおいて観察されるものとは異なって、第１の培地（高Ｇｌｎを有する培地１）は、オリジナルプロセスよりも低い力価であった（図６４を参照）。また、温度変化後の乳酸塩取り込みのシフトはなかった（図６２を参照）。これは、この培地である程度の規模感受性が存在しうることを示唆している。この結論は、これらの中間規模実験と同様に、小規模（２Ｌ）並列運転によって指示されている（データは示していない）。グルタミンをあまり含まない後の培地組成は、規模に対して、少なくともこれらの実験において感受性がなかった（図６０〜６５を参照）。プロセスの繰り返し（バッチ２および３およびバッチ５および６）は、非常によい再現性を示しており（図６０〜６５を参照）、この計画で得られたすべてのデータは信頼性が高い。
【０２４２】
実施例１６：培地９を用いるＴＮＦＲ−Ｉｇの産生
物質および方法
ＩｇＧ１のＦｃ部位に結合したヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド−結合部からなる二量体融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞（「ＴＮＦＲ−Ｉｇ細胞」）を、潅流バイオリアクターから高密度で播種し、生産バイオリアクター工程に関して培地９で３×１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。
【０２４３】
結果および結論
図６６、６７、６８、６９、７０、７１および７２は、それぞれ、細胞成長、細胞生存率、残存グルコース、グルタミンレベル、乳酸塩濃度、アンモニウム濃度および相対生産力価を示す。プロセスの軽い修飾の範囲では、すべての条件で、良好な細胞成長、高い細胞生存率および高い総最終力価が得られた。
【０２４４】
この実験のすべての条件に関して、代謝阻害性副産物の乳酸塩を消費するか、または濃度を頭打ちにし、乳酸塩産生を阻害することを示唆している。同様に、阻害性代謝産物アンモニウムに関して、濃度は最初に増加するが、温度シフト後しばらくして、アンモニウムは細胞により消費され始める。この実施例において、ＴＮＦＲ−Ｉｇ細胞培養物を、化学誘導物、酪酸ナトリウムおよびＨＭＢＡに付した。
【０２４５】
実施例１７．大規模および小規模培養条件の比較
物質および方法
培養のサイズが、関連する培養特性に影響を与えるかどうかを決定するために、抗ＧＤＦ−８細胞を、小規模１リットルバイオリアクターまたは大規模６０００リットルバイオリアクターで成長させた。細胞を３７℃で成長させ、４日目に３１℃にシフトした。
【０２４６】
結果および結論
図７３、７４、７５および７６（それぞれ、細胞密度、力価、乳酸レベルおよびアンモニウムレベルを示す）に見ることができるように、６０００リットルの大規模および１リットルの小規模培養間にこれらの特定に関して違いはなかった。乳酸塩およびアンモニウムレベルの両方とも、４日目に温度をシフトした後減少が始まった。これらの実施例は、培養物が同様の成長条件に付される場合、培養の規模が、細胞密度、細胞生存率、乳酸レベルおよびアンモニウムレベルに影響を与えないことを実証している。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
（原文に記載無し）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、仮特許出願第６０／６０５，０９７、６０／６０４，９４１および６０／６０５，０７４号（それぞれ、２００４年８月２７日に出願し、これらは出典明示により本明細書に組み入れる）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質およびポリペプチドは、治療剤としてますます重要になっている。大抵の場合、治療タンパク質およびポリペプチドは、目的の特定のタンパク質またはポリペプチドを非常に高レベルで産生するように設計および／または選択された細胞から、細胞培養にて生産される。細胞培養条件の制御および最適化は、タンパク質およびポリペプチドの商業生産の成功にとって非常に重要である。
【０００３】
細胞培養にて生産される多くのタンパク質およびポリペプチドは、細胞を一定期間培養し、ついで、培養を終え、産生されたタンパク質またはポリペプチドを単離する、バッチまたはフェドバッチ（fed-batch）法で生産される。生産されたタンパク質またはポリペプチドの最終的な量と質は、細胞培養の条件に非常に影響を受ける。例えば、慣用的なバッチおよびフェドバッチ培養法は、しばしば、細胞成長、生存率および生産または目的のタンパク質またはポリペプチドの安定性に不利益をもたらす代謝廃棄物の産生を引き起こす。バッチおよびフェドバッチ培養法におけるタンパク質またはポリペプチドの生産を改善する努力がなされているが、さらなる改善がいまだ必要である。
【０００４】
加えて、細胞、特に哺乳動物細胞の培養において用いるための合成培地（すなわち、公知の個々の成分からなり、血清および他の動物由来成分を含まない培地）の改善のために多大な努力がなされてきた。合成培地において、細胞成長特性は血清由来の培地と比較して非常に異なる。合成培地における細胞培養によるタンパク質またはポリペプチドの生産の改善されたシステムを発達させる特定のニーズがある。
【０００５】
発明の概要
本発明は、細胞培養におけるタンパク質および／またはポリペプチドの大規模生産のための改善されたシステムを提供する。例えば、本発明は、１つまたはそれ以上の：ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量；ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比；ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比；ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比；またはｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギン濃度を合わせた累積量により特徴付けられる培地を利用する、商業規模の（例えば、５００Ｌ以上）培養法を提供する。当業者は、上で用いられる「累積」が、培養開始時に加えられた成分およびその後加えられた成分を含む、細胞培養の過程において加えられた特定の成分（複数でも可）の総量を意味することは理解できるだろう。本発明のある種の好ましい具体例において、培養物の「フィード」を最小限にすることが望ましく、したがって、初期に存在する量を最大限にすることが望ましい。もちろん、培地成分は培養中に代謝され、同じ累積量の所定の成分の培養物は、それらの成分が異なる時間に加えられた場合には（例えば、すべて初期に存在することに対して、いくつかはフィードにより加える）、異なる絶対値を有するだろう。
【０００６】
本発明により、かかる培地の使用により高レベルのタンパク質生産およびアンモニウムおよび／または乳酸塩のようなある種の望ましくない因子の蓄積を減少させることが可能となる。
【０００７】
当業者は、本発明の培地が合成および非合成培地の両方を含むことは理解できるだろう。本発明のある種の好ましい具体例において、培養培地は、培地の組成が公知であり、コントロールされた合成培地である。
【０００８】
本発明のある種の好ましい具体例において、培養法は、培養物を第１の培養条件から第２の培養条件に変更して、細胞の代謝シフトを行うことを含む。いくつかの具体例において、この変更は、培養が、最大限の細胞密度の約２０〜８０％に達した場合に行われる。いくつかの具体例において、この変更は、培養を維持する場合の温度（または温度範囲）を含む。別に、または加えて、本発明は、培養物における乳酸塩および／またはアンモニウムレベルを、ピークに達した後、時間と共に減少させるように調節した方法を提供する。他の具体例において、シフトは、ｐＨ、オスモル濃度または化学誘導剤レベル、例えばアルカン酸またはその誘導体をシフトさせることを含む。
【０００９】
本発明の細胞培養は、ホルモンおよび／または他の成長因子、特にイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（一般的に非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質または他のエネルギー源を含む、栄養物および／または他の培地成分を補足していてもよい。本発明のある種の具体例において、化学誘導剤、例えばヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酢酸ナトリウム（「ＮａＢ」）を培地に補足することは有益であり得る。これらの任意のサプリメントは、培養の開始時に加えてもよく、あるいは、消費した栄養分の補給または他の理由により後から加えてもよい。一般的には、本発明に従って、補給を最小限にするように、初期培地組成を選択することが望ましい。
【００１０】
ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、乳酸レベル、アンモニウムレベル、オスモル濃度または発現ポリペプチドまたはタンパク質の力価を含む、種々の培養条件は、本発明に従ってモニターしてもよい。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、抗ＧＤＦ−８細胞を用いる振盪フラスコでの培地１および培地２の比較を示す。
図２は、培地１での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長および生存率を示す。
図３は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞成長を示す。
図４は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞生存率を示す。
図５は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物のアンモニウムレベルを示す。
図６は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の乳酸レベルを示す。
図７は、対照および非グルタミンフィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図８は、対照およびグルタミン不足フィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞密度を示す。
図９は、対照およびグルタミン不足フィード培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の細胞生存率を示す。
図１０は、対照およびグルタミン不足培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物のアンモニウムレベルを示す。
図１１は、対照およびグルタミン不足培養条件での、抗ＧＤＦ−８細胞培養物の乳酸レベルを示す。
図１２は、対照およびグルタミン不足培養条件での抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図１３は、培地１および培地２での、抗ＧＤＦ−８細胞の鉄投与応答を示す。
図１４は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の細胞密度を示す。
図１５は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の細胞生存率を示す。
図１６は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の抗ルイスＹ力価を示す。
図１７は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物における乳酸レベルを示す。
図１８は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物におけるアンモニウムレベルを示す。
図１９は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物のオスモル濃度を示す。
図２０は、抗ルイスＹ細胞の細胞密度を示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２１は、抗ルイスＹ細胞の細胞生存率を示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２２は、抗ルイスＹ培養の平均力価を示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２３は、抗ルイスＹ細胞のアンモニウムレベルを示す。個々のプロットは、同じ条件を用いた２回の振盪フラスコ成長の平均値である。
図２４は、フェドバッチ培養に用いたインペラー・ジャンプを示す。
図２５は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図２６は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８細胞の生存率を示す。
図２７は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図２８は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図２９は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図３０は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図３１は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図３２は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図３３は、種々の実験条件下での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図３４は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図３５は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞生存率を示す。
図３６は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図３７は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図３８は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミンレベルを示す。
図３９は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図４０は、種々のレベルのグルタミンおよびアスパラギンを含有する修飾培地９での、抗ＧＤＦ−８培養物のオスモル濃度を示す。
図４１は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図４２は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図４３は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図４４は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミンレベルを示す。
図４５は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミン酸レベルを示す。
図４６は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図４７は、種々のレベルのアスパラギンおよびシステインを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物オスモル濃度を示す。
図４８は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図４９は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図５０は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図５１は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のグルタミンレベルを示す。
図５２は、種々のレベルのアミノ酸およびビタミンを含有する培地での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図５３は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図５４は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物の乳酸レベルを示す。
図５５は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８培養物のアンモニウムレベルを示す。
図５６は、種々のレベルのビタミン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図５７は、培地１、３および９での、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長を示す。
図５８は、培地１、３および９での、抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図５９は、種々のレベルのグルタミン単独およびグルタミンおよびアスパラギンの組合せに関する、推定抗ＧＤＦ−８力価を示す。
図６０は、試験した種々の培地条件下での、抗Ａベータ細胞の細胞成長を示す。
図６１は、試験した種々の培地条件下での、抗Ａベータ細胞の細胞生存率を示す。
図６２は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ培養物の乳酸レベルを示す。
図６３は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ培養物のアンモニウムレベルを示す。
図６４は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ力価を示す。
図６５は、試験した種々の培地条件での、抗Ａベータ培養物のオスモル濃度を示す。
図６６は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの細胞成長を示す。
図６７は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの生存率を示す。
図６８は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養の残存グルコースをを示す。
図６９は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養のグルタミンレベルを示す。
図７０は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養の乳酸濃度を示す。
図７１は、種々の実験条件下での、細胞発現ＴＮＦＲ−Ｉｇの培養での、アンモニウムレベルを示す。
図７２は、種々の実験条件下での、ＴＮＦＲ−Ｉｇ相対力価を示す。
図７３は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞の細胞密度を示す。
図７４は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞の力価を示す。
図７５は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞の乳酸レベルを示す。
図７６は、６０００Ｌおよび１Ｌバイオリアクターで成長させた抗ＧＤＦ−８細胞のアンモニウムレベルを示す。
【００１２】
定義
「約」：本明細書で用いられる場合、「約」なる用語は、１またはそれ以上の特定の細胞培養条件に適するように、その培養条件に関する規定の基準値と同様である数値の範囲を意味する。ある種の具体例において、「約」なる用語は、その培養条件に関する規定の基準値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１パーセント以下の範囲の値を意味する。
【００１３】
「アミノ酸」：本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」なる用語は、ポリペプチドの形成に通常用いられる２０種の天然のアミノ酸、またはそれらのアミノ酸単独もしくは誘導体を意味する。本発明のアミノ酸は、培地において細胞培養物に与えられる。培地に与えられるアミノ酸は、塩または水和物の形態として提供してもよい。
【００１４】
「抗体」：本明細書で用いられる場合、「抗体」なる用語は、抗原と特異的に結合（免疫反応）する１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを意味する。本明細書で用いられる場合、「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成」なる用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応が可能なただ１種の抗原結合部位を含有する抗体分子のクローン群を意味し、一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル組成」は、抗原の特定の抗原と相互作用が可能な多種の抗原結合部位を含有する、抗体分子のクローン群を意味する。モノクローナル抗体の定義は、慣用的な技術により誘導されたクローン分子ならびに特定の残基を操作または変異させて誘導した合成配列の分子、例えばヒト化抗体を含む。
【００１５】
「バッチ培養」：本明細書で用いられる場合、「バッチ培養」なる用語は、培地（下記の「培地」の定義を参照）ならびに細胞自体を含む、最終的に細胞の培養に用いるすべての成分を、培養工程の始めに与える細胞の培養方法を意味する。バッチ培養は、典型的には、ある時点で停止し、培地の細胞および／または成分を回収し、精製してもよい。
【００１６】
「バイオリアクター」：本明細書で用いられる場合、「バイオリアクター」なる用語は、哺乳動物細胞培養物の成長に用いられる容器を意味する。バイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養に利用する限り、いずれの大きさであってもよい。典型的には、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれの体積であってもよい。限定するものではないがｐＨおよび温度を含むバイオリアクターの初期条件は、典型的には、培養期間中にコントロールすることができる。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地中に懸濁させた哺乳動物細胞培養物を保持するのに適した、ガラス、プラスチックまたは金属を含むいずれもの物質から構成されていてもよい。本明細書で用いられる場合、「生産用バイオリアクター」なる用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の生産に用いる最終的なバイオリアクターを意味する。大規模細胞培養生産用バイオリアクターの体積は、典型的には、少なくとも５００リットルであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれの体積であってもよい。当業者は、本発明の実施に用いるのに適したバイオリアクターを選択することができるだろう。
【００１７】
「細胞密度」：本明細書で用いられる場合、「細胞密度」なる用語は、培地の所定の体積中に存在する細胞の数を意味する。
「細胞生存率」：本明細書で用いられる場合、「細胞生存率」なる用語は、所定の培養条件または実験条件下で、培養物中の細胞が生存する能力を意味する。また、本明細書で用いられる場合、該用語は、ある時点の培養物中のすべての生存および死亡細胞の合計数に対する、その時点で生存している細胞の割合を意味する。
【００１８】
「培養物」、「細胞培養物」および「哺乳動物細胞培養物」：本明細書で用いられる場合、これらの用語は、細胞群の生存および／または成長に適した条件下で培地（下記の「培地」の定義を参照）に懸濁した哺乳動物細胞群を意味する。当業者には明らかなように、本明細書で用いられる場合、これらの用語は、哺乳動物細胞群および群を懸濁させる培地を含む組合せも意味する。
【００１９】
「フェドバッチ培養」：本明細書で用いられる場合、「フェドバッチ培養」なる用語は、付加的な成分を、培養工程開始後のある時点で培養物に与える細胞の培養方法を意味する。典型的には、与えられる成分は、培養工程中に消費される細胞用の栄養補給剤を含む。典型的には、フェドバッチ培養を、ある時点で停止して、培地中の細胞および／または成分を回収し、精製してもよい。
【００２０】
「フラグメント」：本明細書で用いられる場合、「フラグメント」なる用語は、ポリペプチドを意味し、そのポリペプチドに独自のまたはそれを特徴付ける所定のポリペプチドの分離部分として定義される。また、本明細書で用いられる場合、該用語は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持した所定のポリペプチドの分離部分を意味する。好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。より好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。さらにより好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、保持される活性の一部とは、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。また、本明細書で用いられる場合、この用語は、完全長ポリペプチドに見られる少なくとも既存の配列エレメントを含む所定のポリペプチドの部分も意味する。好ましくは、配列エレメントは、完全長ポリペプチドの、少なくとも４〜５個、より好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸に及ぶ。
【００２１】
「遺伝子」：本明細書で用いられる場合、「遺伝子」なる用語は、細胞代謝または細胞発達のある態様において機能する、ヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ、少なくとも、分離最終産物、典型的には、限定するものではないが、ポリペプチドをコードするその部分を意味する。該用語は、単にポリペプチドまたは他の分離最終産物をコードするコーディング配列を意味するだけでなく、発現の基礎レベルを調節するコーディング配列（下記の「遺伝子制御因子」の定義を参照）の前後、ならびに、介在配列（「イントロン」）と個々のコーディングセグメント（「エクソン」）の間の領域を含みうる。
【００２２】
「遺伝子制御因子」：本明細書で用いられる場合、「遺伝子制御因子」なる用語は、操作的に結合して、遺伝子発現を調節するいずれもの配列エレメントを意味する。遺伝子制御因子は、発現レベルを増加または減少させることにより機能し、コーディング配列の前、内または後に位置することができる。遺伝子制御因子は、例えば、転写の開始、伸長または終結、細胞内でのｍＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡ編集、ｍＲＮＡ復元、ｍＲＮＡの局在化、翻訳の開始、伸長または終結、あるいは遺伝子発現の他のいずれもの段階を調節することにより、遺伝子発現のいずれもの段階で作用しうる。遺伝子制御因子は、個別に、または他と組み合わせて機能しうる。
【００２３】
「ハイブリドーマ」：本明細書で用いられる場合、「ハイブリドーマ」なる用語は、免疫学的供給源および抗体産生細胞由来の不死化細胞の融合により得られる細胞を意味する。得られたハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマの作成に用いられる個々の細胞は、限定するものではないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびヒトを含むいずれもの哺乳動物源から得ることができる。また、この用語は、ヒト細胞およびマウス骨髄腫細胞株間の融合の産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合の子孫が、形質細胞と融合した場合に生じる、トリオーマ細胞株を含む。さらに、該用語は、抗体を産生する不死化ハイブリッド細胞株、例えばグアドローマ（例えば、Milstein et al., Nature, 537:3053 (1983)を参照）を含む。
【００２４】
「合成生存細胞密度」：本明細書で用いられる場合、「合成生存細胞密度」なる用語は、培養中の生存細胞の平均密度に、培養を行っている時間を乗じたものを意味する。生産されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量が、培養中に存在する生存細胞の数に比例すると過程すると、合成生存細胞密度は、培養中に生産されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量を推測するためのツールとして有用である。
【００２５】
「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」：本明細書で用いられる場合、これらの用語は、成長する哺乳動物細胞に栄養分を与える、栄養分を含有する溶液を意味する。典型的には、これらの溶液は、細胞が最小限の成長および／または生存するのに必要な必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質および微量元素を提供する。また、溶液は、最小限の割合以上に、成長および／または生存率を増強するホルモンおよび成長因子を含む、成分を含有していてもよい。好ましくは、溶液は、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度で調製される。また、培地は、「合成培地」−タンパク質、加水分解物または未知の組成の成分を含有しない、血清不含培地であってもよい。合成培地は動物由来の成分を含まず、すべての成分が公知の化学構造を有する。
【００２６】
「代謝廃棄物」：本明細書で用いられる場合、「代謝廃棄物」なる用語は、細胞培養物に何らかの害を、特に所望の組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に関連する害を及ぼす、正常または異常代謝過程の結果物としての、細胞培養により産生される化合物を意味する。例えば、代謝廃棄物は、細胞培養物の成長または生存率に害を与え、産生される組み換えポリペプチドまたはタンパク質の量を減少させ、発現ポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み、安定性、グリコシル化または他の翻訳後修飾を改変し、あるいは、他の多くの点で、細胞および／または組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に悪影響を及ぼしうる。代表的な代謝廃棄物は、グルコース代謝の結果として産生される乳酸塩およびグルタミン代謝の結果として産生されるアンモニウムが挙げられる。本発明は、哺乳動物細胞培養における代謝廃棄物の産生を遅らせ、これを減少させ、またはさらに除去することを目的とする。
【００２７】
「オスモル濃度」および「重量オスモル濃度」：「重量オスモル濃度」は、水溶液に溶解した溶質粒子の浸透圧の尺度である。溶質粒子は、イオンおよび非イオン性分子を含む。重量オスモル濃度は、１ｋｇの溶液に溶解している浸透活性粒子の濃度（例えば、オスモル）として表される（３８℃で、１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは、１９ｍｍＨｇの浸透圧と等価である）。これに対して、「オスモル濃度」は、１リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を意味する。本明細書で用いられる場合、略号「ｍＯｓｍ」は、「ミリオスモル／ｋｇ溶液」を意味する。
【００２８】
「潅流培養」：本明細書で用いられる場合、「潅流培養」なる用語は、培養工程の開始後、培養物に持続的または半持続的に付加的な成分を供給する、細胞の培養方法を意味する。典型的には、供給される成分は、培養工程中に消費される細胞用の栄養補給剤を含む。典型的には、培地中の細胞および／または成分を継続的または半継続的に回収し、精製してもよい。
【００２９】
「ポリペプチド」：本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合を介して一緒に連結したアミノ酸の連続鎖を意味する。該用語は、いずれもの長さのアミノ酸鎖を表すのに用いられるが、当業者は、該用語が、非常に長い鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して一緒に結合した２つのアミノ酸を含む、最小限の鎖も意味することは理解できるだろう。
【００３０】
「タンパク質」：本明細書で用いられる場合、「タンパク質」なる用語は、別個のユニットとして機能する１個またはそれ以上のポリペプチドを意味する。単一のポリペプチドが別個の機能性ユニットであり、別個の機能性ユニットを形成するのに他のポリペプチドと恒久的な物理結合を必要とする場合、本明細書で用いられる場合、該「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、ほとんど同じ意味で用いられる。別個の機能性ユニットが、他と物理的に結合した１個以上のポリペプチドからなる場合、本明細書で用いられる場合、「タンパク質」なる用語は、物理的に結合し、別個のユニットとして一緒に機能する複数のポリペプチドを意味する。
【００３１】
「組み換え発現ポリペプチド」および「組み換えポリペプチド」：本明細書で用いられる場合、これらの用語は、そのポリペプチドを発現するように遺伝子学的に設計された哺乳動物ホスト細胞から発現するポリペプチドを意味する。組み換え発現ポリペプチドは、哺乳動物ホスト細胞において正常に発現されたポリペプチドと一致するか、または同一でありうる。また、組み換え発現ポリペプチドは、ホスト細胞と異なっていてもよく、すなわち、哺乳動物ホスト細胞において正常に発現されるペプチドと異種のものであってもよい。別として、組み換え発現ポリペプチドは、ポリペプチドの一部が、哺乳動物ホスト細胞において正常に発現されるポリペプチドと一致するか、または同一である、アミノ酸配列を含有するが、他の部分がホスト細胞とは異なっているという点でキメラ性であってもよい。
【００３２】
「播種」：本明細書で用いられる場合、「播種」なる用語は、バイオリアクターまたは他の容器に細胞培養物を提供する工程を意味する。細胞は、他のバイオリアクターまたは容器で前もって増殖させていてもよい。別として、細胞は冷凍され、バイオリアクターまたは容器に提供する直前に解凍してもよい。該用語は、単細胞を含む多数の細胞を意味する。
【００３３】
「力価」：本明細書で用いられる場合、「力価」なる用語は、所定体積の培地により分割した哺乳動物細胞培養物により産生された、組み換え発現ポリペプチドまたはタンパク質の総量を意味する。典型的には、力価は、培地１ミリリットルあたりのポリペプチドまたはタンパク質を単位として表す。
【００３４】
ある種の好ましい具体例の詳細な記載
本発明は、細胞培養によるタンパク質および／またはポリペプチドの製造に関する改善されたシステムを提供する。特に、本発明は、細胞成長、生存率および／またはタンパク質産生または質に有害である１つまたはそれ以上の代謝産物の産生を最小限にするシステムを提供する。本発明の好ましい具体例において、細胞培養は、バッチまたはフェドバッチ培養である。本発明の他のある種の好ましい具体例は、以下に詳細に記載する。しかしながら、当業者は、これらの好ましい具体例の種々の改良されたものが本発明の範囲に含まれることは理解できるだろう。本発明の請求の範囲は、具体例の記載に限定されるものではない。
【００３５】
ポリペプチド
ホスト細胞において発現可能なポリペプチドは、本発明の方法に従って生産することができる。ポリペプチドは、ホスト細胞の内部の遺伝子から、または遺伝子操作によりホスト細胞に導入された遺伝子から発現することができる。ポリペプチドは、天然のものであってもよく、あるいは、人により設計されるか、または選択された配列を有するものであってもよい。人工ポリペプチドは、天然に生じる別個の他のポリペプチドセグメントから構成されていてもよく、あるいは、天然に存在しない１つまたはそれ以上のセグメントを含んでいてもよい。
本発明に従って望ましく発現されうるポリペプチドは、目的の生物学的または化学的活性に基づいて選択されるだろう。例えば、本発明は、医薬的または商業的関連がある酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤等を発現するのに用いることができる。
【００３６】
抗体
現在、医薬品または他の市販の薬剤、抗体の製品として使用され、研究されている多くの所定の抗体が、本発明における特定の目的の抗体である。抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質である。ホスト細胞において発現することができるいずれもの抗体を、本発明に従って用いることができる。好ましい具体例において、発現される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３７】
他の好ましい具体例において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、１つ以上の有機体から誘導されるアミノ酸フラグメントを含有する。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラットまたは他の種の抗体から由来の抗原結合ドメインを、ヒト定常領域と一緒に含みうる。種々のキメラ抗体の製造方法が、例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985)；Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., 米国特許第４，８１６，５６７号；Boss et al., 米国特許第４，８１６，３９７号；Tanaguchi et al., 欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開ＥＰ０１７３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂに記載されている。
【００３８】
他の好ましい具体例において、モノクローナル抗体は、例えば、リボソームディスプレイ（ribosome-display）またはファージディスプレイ（phage-display）法の使用（例えば、Winter et al., 米国特許第６，２９１，１５９号およびKawasaki,米国特許第５，６５８，７５４号を参照）により、あるいは、天然抗体遺伝子が不活性化されており、機能的にヒト抗体遺伝子で置き換えられているが、天然の免疫系の他の構成要素は損なわれていない、異種移植（xenographic species）種の使用（例えば、Kucherlapati et al.,米国特許第６，６５７，１０３号を参照）により誘導されるヒト抗体である。
【００３９】
他の好ましい具体例において、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、大多数のアミノ酸残基がヒト抗体由来であり、ヒト対照にデリバリーした場合、免疫反応の可能性を最小限にするキメラ抗体である。ヒト化抗体において、相補性決定領域におけるアミノ酸残基は、少なくとも一部で、所望の抗原特異性またはアフィニティを与える非ヒト種由来の残基に置き換わっている。かかる改変免疫グロブリン分子は、当該分野で公知のいくつかの手法により製造することができ（例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983)；Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983)；Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)）、好ましくは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ０２３９４００（出典明示により本明細書に組み入れる）に記載の方法により製造することができる。ヒト化抗体は、例えば、Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britainにより市販されている。さらなる引用文献に関しては、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992）（すべて出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【００４０】
他の好ましい具体例において、上記のモノクローナル、キメラまたはヒト化抗体は、天然の種においていずれの抗体も生じないアミノ酸残基を含有してもよい。これらの異種の残基は、モノクローナル、キメラまたはヒト化抗体に新規のまたは修飾した特異性、アフィニティまたはエフェクター機能を与えるために用いることができる。他の好ましい具体例において、上記の抗体は、全身性薬物療法、例えば毒素、低分子量細胞毒性剤、生物学的応答修飾因子および放射性核種用の薬剤とコンジュゲートしてもよい（例えば、Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates、ＵＳ２００４００８２７６４Ａ１を参照）。
【００４１】
一の具体例において、抗体は、アミロイド前駆タンパク質のＡβフラグメントまたはアミロイド斑の他の成分に特異的に結合する抗体であり、アルツハイマー病を特徴つける脳におけるアミロイド斑の蓄積に対して有用である（例えば、米国仮出願番号第６０／６３６，６８４号）。
【００４２】
他の具体例において、本発明の抗体は、増殖性障害、例えば癌における、標的細胞および／または組織で発現する細胞表面抗原に対するものである。一の具体例において、抗体は、ＩｇＧ１抗ルイスＹ抗体である。ルイスＹは、構造：Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４［Ｆｕｃα１→３］ＧｌｃＮａｃβ１→３Ｒ（Abe et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797）を有する、糖鎖抗原である。ルイスＹ抗原は、ヒト上皮腫瘍（乳房、結腸、肺および前立腺の腫瘍を含む）の６０％〜９０％の表面上で発現され、少なくともその４０％は抗原を過剰に発現し、正常細胞においては発現が制限されている。
【００４３】
Ｌｅｙを標的とし、腫瘍を効果的に標的とするために、抗原に排他的特異性を有する抗体が、理想として必要とされている。かくして、好ましくは、本発明の抗ルイスＹ抗体は、１型構造（すなわち、血液型のラクト系（ＬｅａおよびＬｅｂ））と交差反応を起こさず、好ましくは、他の２型エピトープ（すなわち、ネオラクト構造）様ＬｅｘおよびＨ−２型構造と結合しない。好ましい抗ルイスＹ抗体の例としては、ｈｕ３Ｓ１９３が設計されている（米国特許第６，３１０，１８５号；第６，５１８，４１５号；第５，８７４，０６０号（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。ヒト化抗体ｈｕ３Ｓ１９３（Attia, M.A., et al. 1787-1800）は、Ｌｅｙに非常に特異的である乳癌細胞に対するマウスモノクローナル抗体である３Ｓ１９３からＣＤＲ−グラフティングにより生成された（Kitamura, K., 12957-12961）。Ｈｕ３Ｓ１９３は、単にＬｅｙに対する３Ｓ１９３の特異性を残しているだけでなく、補体依存性細胞毒性（以後、ＣＤＣと称する）および抗体依存性細胞障害性（以後、ＡＤＣＣと称する）を媒介する能力を獲得している（Attia, M.A., et al. 1787-1800）。この抗体は、１２５Ｉ、１１１Ｉｎまたは１８Ｆならびにキレート剤を必要とする他の放射性標識、例えば１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃまたは９０Ｙで標識化したｈｕ３Ｓ１９３での生体内分布研究により証明されているように、ヌードマウスおいてＬｅｙ発現異種移植片を標的とする（Clark, et al. 4804-4811）。
【００４４】
他の具体例において、抗体は、Ｍｙｏ２９、Ｍｙｏ２８およびＭｙｏ２２と呼ばれるヒト抗ＧＤＦ−８抗体、ならびにそれ由来の抗体および抗原−結合フラグメントである。これらの抗体は、成熟ＧＤＦ−８に高アフィニティで結合することができ、例えばＡｃｔＲＩＩＢ結合およびレポーター遺伝子アッセイの阻害により証明されるように、インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８活性を阻害し、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害しうる。例えば、Veldman, et al、米国特許出願第２００４０１４２３８２号を参照のこと。
【００４５】
受容体
医薬および／または市販の薬剤として有効であることが示されているポリペプチドの他の群は、受容体を含む。受容体は、典型的には、細胞外シグナリングリガンドを認識することにより機能する膜貫通糖タンパク質である。典型的には、受容体は、リガンド認識ドメインに加え、細胞内での発育変動または代謝性変化を誘導する、結合リガンドでの標的細胞内分子のリン酸化によりシグナリング経路を開始する、タンパク質キナーゼドメインを有する。一の具体例において、目的の受容体は、膜貫通および／または細胞内ドメイン（複数でも可）を除去し、その代わりにＩｇ−ドメインに結合できるように修飾されている。好ましい具体例において、本発明により製造される受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＲＴＫファミリーは、種々の機能の多数の細胞型に欠かせない受容体を含む（例えば、Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988；Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。ＲＴＫｓの非限定的な例としては、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーの一員、表皮成長因子受容体（ＥＧＦ）ファミリーの一員、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、免疫グロブリンを有するチロシンキナーゼおよびＥＧＦ相同ドメイン−１（ＴＩＥ−１）およびＴＩＥ−２受容体（Sato et al., Nature 376(6535):70-74 (1995）（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）およびｃ−Ｍｅｔ受容体が挙げられ、これらのいくつかは、直接的または間接的に血管新生を促進することが示唆されている（Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995）。ＲＴＫｓの他の非限定的な例としては、胎児肝臓キナーゼ１（ＦＬＫ−１）（キナーゼ挿入ドメイン−含有受容体（ＫＤＲ）（Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991）または血管内皮細胞成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）とも称される）、ｆｍｓ−様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）（DeVries et al. Science 255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990）、（血管内皮細胞成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリンおよびＡｘｌとも称される）が挙げられる。当業者は、好ましくは、本発明に従って発現されうる他の受容体も把握するだろう。
【００４６】
特に好ましい具体例において、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ受容体（ＴＮＦＲ−１；１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７，５６３；およびＴＮＦＲ−２、１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７，０１４）の形態である、腫瘍壊死因子阻害剤は、本発明に従って発現される（Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7 (1995-96)（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。一の具体例により、腫瘍壊死因子阻害剤は、可溶性ＴＮＦ受容体および好ましくはＴＮＦＲ−Ｉｇを含む。一の具体例において、本発明の好ましいＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩの可溶性形態、ならびに、可溶性ＴＮＦ結合タンパク質であり、他の具体例において、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合は、ＴＮＦＲ：Ｆｃであり、本明細書で用いられる場合、かかる用語は、「エタネルセプト」を意味し、これは、ｐ７５ＴＮＦ−α受容体の細胞外部分の２分子の二量体であり、ここの分子は、ヒトＩｇＧ．ｓｕｂ．１の２３５個のアミノ酸Ｆｃ部分からなる。
【００４７】
成長因子および他のシグナリング分子
医薬および／または市販の薬剤として有効であることが示されているポリペプチドの他の群は、成長因子および他のシグナリング分子を含む。成長因子は、典型的には、細胞により分泌され、他の細胞に結合し、受容体を活性化し、受容体細胞の代謝性変化または発育変動を生じさせる、糖タンパク質である。一の具体例において、目的のタンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインおよび抗体のＦｃ部を含有する、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドである（例えば、Wolfman, et al., ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor、ＵＳ２００４／０２２３９６６Ａ１を参照）。他の具体例において、成長因子は、修飾ＧＤＦ−８プロペプチドであってもよい（例えば、Wolfman, et al., Modifed and stabilized GDF propeptides and uses thereof、ＵＳ２００３／０１０４４０６Ａ１を参照）。別として、目的のタンパク質は、ホリスタチン−ドメイン含有タンパク質であり得る（例えば、Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US 2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US 2005/0106154 A1, Hill, et al., Follistatin domain containing protein、ＵＳ２００３／０１８０３０６Ａ１を参照）。
【００４８】
哺乳動物成長因子および他のシグナリング分子の非限定的な例としては、サイトカイン；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；形質転換成長因子（ＴＧＦｓ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４またはＴＧＦ−ベータ５を含む）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＴＬｓ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子およびフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲンアクチベータ、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン、造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常Ｔ−細胞で発現、分泌され活性化を調節する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ミュラー管阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレキサシン；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）または神経成長因子、例えばＮＧＦ−ベータが挙げられる。当業者は、好ましくは、本発明に従って発現されうる他の成長因子およびシグナリング分子も把握するだろう。
【００４９】
Ｇ−タンパク質共役受容体
医薬および／または市販の薬剤として有効であることが示されているポリペプチドの他の群は、成長因子および他のシグナリング分子を含む。Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）は、７回膜貫通ドメインを有するタンパク質である。リガンドのＧＰＣＲへの結合において、シグナルは、細胞の生物学的または生理学的特性の変化が生じる細胞内で伝達される。
【００５０】
Ｇ−タンパク質およびエフェクター（Ｇ−タンパク質により調節される細胞内酵素およびチャンネル）と共にＧＰＣＲｓは、細胞内第二メッセンジャーを細胞外インプットに接続する、モジュラーシグナリングシステムの構成要素である。これらの遺伝子および遺伝子産物は、疾患の原因物質の可能性がある。
【００５１】
ロドプシン遺伝子およびＶ２バソプレシン受容体遺伝子の特異的欠損は、種々の形態の常染色体優性および常染色体網膜色素変性症、腎性尿崩症の原因であることが示されている。これらの受容体は、中枢神経系および末梢生理学的プロセスの両方で非常に重要である。ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、異なる種からの同じ受容体である相同分子種とは対照的に、遺伝子重複（または他のプロセス）により生成される変異体を意味する受容体である、２５０型を超えるパラローグを含有する。スーパーファミリーは、５つのファミリー：ファミリーＩ、ロドプシンおよびベータ２−アドレナリン受容体に代表され、現在２００を超える独自のメンバーにより表される受容体；ファミリーＩＩ、近年特徴付けられた副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー；ファミリーＩＩＩ、哺乳動物における代謝型グルタミン受容体ファミリー；ファミリーＩＶ、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性および発生に重要なｃＡＭＰ受容体ファミリー；およびファミリーＶ、真菌コウビフェロモン受容体、例えばＳＴＥ２に分類することができる。
【００５２】
ＧＰＣＲｓは、生体アミン、炎症の脂質メディエータ、ペプチドホルモンおよび知覚シグナルメディエータに対する受容体を含む。ＧＰＣＲは、受容体がその細胞外リガンドと結合した場合に活性化される。ＧＰＣＲにおけるリガンド受容体相互作用により生じる立体構造の変化は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ細胞内ドメインに対する結合アフィニティに影響を与える。このことにより、ＧＴＰがＧタンパク質に高アフィニティで結合することが可能になる。
【００５３】
ＧＴＰによるＧタンパク質の活性化は、Ｇタンパク質αサブユニットの、アデニル酸シクラーゼまたは他の第二メッセンジャー分子ジェネレーターとの相互作用を誘発する。この相互作用は、アデニル酸シクラーゼの活性化を調節し、したがって、第二メッセンジャー分子、ｃＡＭＰの産生を調節する。ｃＡＭＰは、他の細胞内タンパク質リン酸化および活性化を調節する。別法として、他の第二メッセンジャー分子、例えばｃＧＭＰまたはエイコサノイドの細胞レベルは、ＧＰＣＲｓの活性化によりアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。Ｇタンパク質サブユニットは、ＧＴＰａｓｅによるＧＴＰの加水分解により不活性化され、α、βおよびγサブユニットは再び連結する。ついで、ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、アデニル酸シクラーゼまたは他の第二メッセンジャー分子ジェネレーターから解離する。また、ＧＰＣＲの活性は、細胞内および細胞外ドメインまたはループのリン酸化反応によりレギュレートされうる。
【００５４】
グルタミン酸塩受容体は、神経伝達において重要なＧＰＣＲｓの群を形成する。グルタミン酸塩は、ＣＮＳにおける主要な神経伝達物質であり、神経可塑性、認知、記憶、学習およびいくつかの神経障害、例えば癲癇、卒中および神経変性において重要な役割を果たすと考えられている（Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G- Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, pp. 130-132）。これらのグルタミン酸塩の影響は、イオンチャンネル型および代謝調節型と称される、受容体の異なる２つの群により媒介される。イオンチャンネル型受容体は、固有のカチオンチャンネルを含有し、グルタミン酸塩の即効興奮作用を媒介する。代謝調節型受容体は修飾され、カルシウム依存性カリウムコンダクタンスを阻害し、イオンチャンネル型受容体の興奮性伝達を阻害し、増強させることによりニューロンの膜興奮性を増強させる。代謝調節型受容体は、アゴニスト薬理学およびシグナル伝達経路に基づいて５つのサブユニットに分類され、脳組織に広く分布する。
【００５５】
血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）ファミリーは、その作用がＧＰＣＲｓにより媒介される関連ポリペプチドの一群である。このファミリーの主要な一員は、それ自体のＶＩＰ、セクレチンおよび成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）である。ＶＩＰは、平滑筋の弛緩、種々の組織における分泌の刺激または阻害、種々の免疫細胞活性およびＣＮＳにおける種々の興奮性および阻害活性の調節を含む、多種の生理作用を有する。セクレチンは、膵臓および腸における酵素およびイオンの分泌を刺激し、また、脳にも少量が存在する。ＧＲＦは、下垂体前葉からの成長ホルモンの合成および放出を調節する重要な神経内分泌物質である（Watson, S. and S. Arkinstall supra, pp. 278-283）。
【００５６】
ＧＰＣＲへのリガンドの結合についで、立体構造変化がＧタンパク質に伝達され、これにより、α−サブユニットは結合ＧＤＰ分子をＧＴＰ分子と交換し、βγ−サブユニットから解離する。典型的には、α−サブユニットのＧＴＰ−結合形態は、エフェクター調節部として機能し、第二メッセンジャー、例えばサイクリックＡＭＰ（例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化により）、ジアシルグリセロールまたはイノシトールホスフェートの産生を誘導する。２０以上の異なる型のα−サブユニットが知られており、これはβおよびγサブユニットのより小さいプールに関連する。哺乳動物Ｇタンパク質の例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが挙げられる。Ｇタンパク質は、Lodish H. et al. Molecular Cell Biology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995）（出典明示により本明細書に組み入れる）に十分に記載されている。
【００５７】
ＧＰＣＲｓは、薬物作用および開発において主要なターゲットである。実際、受容体は、現在公知の薬剤の半分以上に用いられており（Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516）、ＧＰＣＲｓは、ＧＰＣＲをアンタゴナイズまたはアゴナイズする臨床的処方薬の３０％での治療行為に関して最も重要なターゲットとなっている（Milligan, G. and Rees,S., (1999) TIPS, 20:118-124）。このことは、これらの受容体が、治療的ターゲットとして確立し、立証されていることを示す。
【００５８】
一般的に、本発明の実施者は、目的のポリペプチドを選択し、その正確なアミノ酸配列を知っているだろう。本発明の技術は、例えば成長および分化因子８に関連するヒトモノクローナル抗体（実施例１、３、４、７〜１４）、ヒト化抗ルイスＹ抗体（実施例５および６）、抗Ａベータ（実施例１５）および腫瘍壊死因子受容体の二量体Ｆｃ−融合タンパク質（実施例１６）を含む、多様なポリペプチドの生産への適当に成功しており、本発明が種々の異なるポリペプチドおよびタンパク質の発現に有用であることが示されている。本発明に従って発現される所定のタンパク質は、それ自体固有の特性を有しており、培養された細胞の細胞密度または生存率に影響を与え、同一の培養条件下での他のポリペプチドまたはタンパク質成長よりも低レベルで発現されうる。当業者は、所定のポリペプチドまたはタンパク質の細胞成長および／または産生を最適化するために、本発明の工程および組成を適当に修飾することができるだろう。
【００５９】
遺伝子制御因子
当業者には明らかであるように、遺伝子制御因子は、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝子発現をするために用いることができる。かかる遺伝子制御因子は、関連するホスト細胞で活性化するように選択されるべきである。制御因子は、構造的に活性であってもよく、または所定の条件下で誘導性であってもよい。誘導制御因子は、発現したタンパク質が毒性であるか、または細胞成長および／または生存率に悪影響を及ぼすものである場合に、特に有用である。このような場合、誘導制御因子が、細胞生存率、細胞密度および／または発現ポリペプチドまたはタンパク質の総収率を改善することにより、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を調節する。本発明の実施に有用な多くの制御因子は、当該分野で公知であり、入手可能である。
【００６０】
本発明により用いることができる代表的な構成的哺乳動物プロモーターは、限定するものではないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）プロモーター、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ベータアクチンプロモーターならびに当業者に公知の他の構造的プロモーターを含む。加えて、真核細胞におけるコーディング配列の構造的発現を促進することが示されているウイルスプロモーターは、例えば、サルウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、乳頭腫ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲｓ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターウイルスならびに当業者に公知の他のウイルスプロモーターを含む。
【００６１】
誘導プロモーターは、誘発剤の存在下で人工的に結合したコーディング配列の発現を促進し、また、本発明に従って用いることもできる。例えば、哺乳動物細胞において、メタロチオネインプロモーターは、ある種の金属イオンの存在下で下流コーディング配列の転写を誘発する。他の誘発プロモーターは、当業者に認識され、および／または公知である。
【００６２】
一般的に、遺伝子発現配列は、また、それぞれ、転写および翻訳の開始に関連する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。エンハンサーエレメントは、発現されるポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増加されるために用いることができる。哺乳動物細胞において機能することが示されているエンハンサーエレメントの例としては、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761に記載されているようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーおよびGorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777に記載のようなラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーターおよびBoshart et al., Cell (1985) 41:521に記載のようなヒトサイトメガロウイルスが挙げられる。
【００６３】
制御因子がコーディング配列に結合する機構は、当該分野では公知である（一般的な分子生物学的および組み換えＤＮＡ技法は、Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989（出典明示により本明細書に組み入れる）に記載されている）。種々の成長および誘発条件下での哺乳動物細胞における発現に関する好ましいコーディング配列の挿入に適した市販のベクターは、当該分野でよく知られている。
【００６４】
コーディング配列および関連制御因子のホスト細胞への導入
目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現を行うの十分な哺乳動物ホスト細胞核酸の導入に適した方法は、当該分野でよく知られている。例えば、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.；ＥＰ１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【００６５】
哺乳動物細胞に関して、好ましい、形質転換法は、Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ、Ｆｏｃｕｓ１５：７３（１１９３）のリポフェクトアミン（lipofectamine）（登録商標）（Gibco BRL）法を含む。哺乳動物細胞ホストシステム形質転換の一般的な態様は、Ａｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号（１９８３年８月１６日に取得）に記載されている。哺乳動物細胞の形質転換の種々の方法に関しては、Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。哺乳動物細胞におけるポリペプチドまたはタンパク質の発現に適したベクターの非限定的代表例としては、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142を参照）；ｐＭＣｌｎｅｏＰｏｌｙ−Ａ（Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512を参照）；およびバキュロウイルスベクター、例えばｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０が挙げられる。
【００６６】
好ましい具体例において、ポリペプチドまたはタンパク質は、ホスト細胞に安定にトランスフェクトされる。しかしながら、本発明は、一過性または安定性トランスフェクト哺乳動物細胞で用いることができることは当業者には明らかだろう。
【００６７】
細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性であるいずれの哺乳動物細胞または細胞型を、本発明の方法に従って利用することができる。本発明の方法により用いることができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣＮｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（CruCell, Leiden, The Netherlands））；ＳＶ４０によりトランスフェクトされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養物の成長に関する、サブクローン化した２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカモドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 75)；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓癌株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。特に好ましい具体例において、本発明は、ＣＨＯ細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の培養および発現に用いることができる。
【００６８】
加えて、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する多くの市販のまたは非売品のハイブリドーマ細胞株を、本発明に従って用いることができる。ハイブリドーマ細胞株が、成長およびポリペプチドまたはタンパク質発現を最適化するために、異なる栄養分を必要とし、および／または異なる培養条件を必要とし、要すれば条件を修飾することができることは、当業者には明らかだろう。
【００６９】
上記したように、多くの場合において、細胞は、高レベルでのタンパク質またはポリペプチドの生産のために、選択され、設計されるだろう。しばしば、細胞は、例えば目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、および／または目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内在性遺伝子または導入遺伝子）の発現を制御する制御因子を導入することにより、高レベルのタンパク質を生産するために遺伝子操作される。
【００７０】
ある種のポリペプチドは、多くの点で目的のポリペプチドまたはタンパク質の産生を最終的に制限する、細胞成長、細胞生存率または他の細胞特性に悪影響を及ぼしうる。特定のポリペプチドを発現するように改変された一の特定の型の細胞群においてさえも、ある個体細胞がより成長し、および／または目的のポリペプチドをより生産する、細胞群内の多様性が存在する。本発明のある種の好ましい具体例において、細胞株は、細胞を培養するのに選択された特定の条件下で着実に成長するように、実施者により経験的に選択される。特に好ましい具体例において、特定のポリペプチドを発現するように改変された個々の細胞は、細胞成長、最終細胞密度、細胞生存率、発現ポリペプチドの力価またはその組合せ、あるいは実施者が重要であるとみなす他の条件に基づいて、大規模生産に選択される。
【００７１】
細胞培養フェーズ
目的のポリペプチドを製造する典型的な方法は、バッチおよびフェドバッチ培養の両方を含む。バッチ培養法は、慣用的には、大規模生産培養物を特定の細胞密度の種培養で接種し、細胞成長および生存を促す条件下で細胞を培養し、細胞が特定の細胞密度に達した場合に回収し、発現したポリペプチドを精製することを含む。フェドバッチ培養法は、細胞の成長の間に消費される栄養分および他の成分をバッチ培養物に供給する付加的な工程を含む。慣用的なバッチおよびフェドバッチ培養に付随する難解な問題は、代謝廃棄物の産生であり、これは、細胞成長、生存率および発現ポリペプチドの産生に悪影響を及ぼす。特に悪影響を及ぼす２つの代謝廃棄物は、乳酸塩およびアンモニウムであり、これらは、それぞれ、グルコースおよびグルタミン代謝の結果として産生される。グルタミン代謝の結果としてのアンモニウムの酵素産生に加えて、また、アンモニウムは、時間とともに非代謝性分解の結果としても細胞培養物中に蓄積される。本発明は、細胞培養物におけるこれらの廃棄物の蓄積を遅らせ、逆進さえさせることにより、アンモニウムおよび乳酸塩の悪影響を最小限にした、ポリペプチドの改善された大規模生産法を提供する。限定するものではないが、バッチ、フェドバッチおよび潅流システムを含む、細胞を培養するいずれのシステムにおいても用いることができることは、当業者には明らかだろう。本発明のある種の好ましい具体例において、細胞を、バッチまたはフェドバッチシステムにおいて成長させる。
【００７２】
培地
市販されている培地、例えばハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ修飾イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）を含む、慣用的な培地組成は、他のアミノ酸と比較して、相対的に高レベルのグルコースおよびグルタミンを含有していた。これらの成分は、細胞の一次代謝エネルギー源であるので、大量に必要とされることが考えられる。しかしながら、これらの栄養分の急激な消費により、上記したような乳酸塩およびアンモニウムの蓄積が誘発される。加えて、高い初期濃度のグルコースおよびグルタミンならびにその後の乳酸塩およびアンモニウムの蓄積の結果として、高オスモル濃度となり、この環境が、細胞成長、細胞生存率およびポリペプチドの産生に悪影響を与える。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載の他の培養工程で用いた場合に、乳酸塩およびアンモニウムの蓄積を最小限にし、逆進さえさせる種々の培地組成物を提供する。細胞成長および／または生存率またはポリペプチドまたはタンパク質の発現に有利な影響を与えることが示されている本発明の培地組成は、１つまたはそれ以上の：ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、およびｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含む。当業者は、上記に用いる場合「累積」が、特定の成分または培養の開始時に添加される成分およびその後に添加される成分を含む、細胞培養中に添加される成分の総量であることは理解できるだろう。当業者には、本発明の培地組成物が、合成培地および非合成培地の両方を含むことは理解できるだろう。
【００７４】
従来の培地組成は、本発明の培地組成と比較して、相対的に低レベルの総アミノ酸を含有して開始される。例えば、ＤＭＥ−Ｆ１２として知られる従来の細胞培養培地（ダルベッコ修飾イーグル培地およびハムＦ１２培地の５０：５０混合物）は、７．２９ｍＭの総アミノ酸含有量を有し、ＲＰＭＩ−１６４０として知られる従来の細胞培養培地は、６．４４ｍＭの総アミノ酸含有量を有する（例えば、H.J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. (USA), 53:288-293 (1965)；G.E. Moore et al., J. Am. Medical Assn., 199:519-24 (1967)（出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）。本発明のある種の具体例において、培養培地中のアミノ酸濃度は、好ましくは、約７０ｍＭ以上である。より好ましくは、本発明の培地組成は、出発培地において約７０ｍＭを超えるアミノ酸濃度を含有する。開示時の培地のアミノ酸濃度がこの範囲である場合、細胞密度および力価は、培養の成長期間を通して増加することが示される（実施例１３を参照）。
【００７５】
加えて、本発明のある種の具体例において、培養培地におけるアスパラギンに対するグルタミンのモル比は、他の市販の培地または市販されていない培地と比較して減少する。好ましくは、培養培地における、アスパラギンに対するグルタミンのモル比は、約２未満である。
【００７６】
加えて、本発明のある種の具体例において、培養培地における総アミノ酸に対するグルタミンのモル比は、他の市販の培地または市販されていない培地と比較して減少する。好ましくは、培養培地における、総アミノ酸に対するグルタミンのモル比は、約０．２未満である。
【００７７】
本発明の出発培地におけるアスパラギンに対するグルタミンのモル比または総アミノ酸濃度が低いという興味深い予期せぬ結果は、アンモニウムの蓄積の減少が観察されたことに加え、乳酸塩の蓄積の減少もまた同様に見られてことである。ある種の具体例において、アンモニウムおよび乳酸塩の蓄積レベルは、対照培地と比較して単に低いだけでなく、初期蓄積後に実際に減少する（例えば、実施例３および７を参照）。
【００７８】
Ｂｏｒａｓｔｏｎ（米国特許第５，８７１，９９９号）は、総アミノ酸に対する総無機イオンのモル比が１〜１０である培養培地を開示している。Ｂｏｒａｓｔｏｎは、総アミノ酸に対する総無機イオンのモル比がこの範囲である培養培地を提供することによって、培地におけるＣＨＯ細胞成長の凝集が減少することを示した。本発明の他の好ましい具体例において、培養培地における総アミノ酸に対する総無機イオンのモル比を、約０．４〜１までさらに少なくしている。実施例１３に示されるように、１．７５〜約０．７の比において、培養の成長期間にわたって、細胞密度および発現ポリペプチドまたはタンパク質の産生が著しく増加している。
【００７９】
本発明の他の好ましい具体例において、濃度培養は、合わせて約１６〜３６ｍＭの濃度であるグルタミンおよびアスパラギンを含有する。実施例１４、表２２に示すように、この範囲の組合せ総濃度のグルタミンおよびアスパラギンを含有する培地は、この範囲外の組合せ総濃度のグルタミンおよびアスパラギンを含有する培地よりも高い発現ポリペプチドの力価を示す。当業者は、細胞成長および／または生存率を最適化し、発現ポリペプチドの産生を最大限にするためにこの範囲内で的確な組合せグルタミンおよびアスパラギン濃度を選択できるだろう。
【００８０】
さらに、当業者は、上記に挙げたいずれもの条件を、単独または他の条件と種々組み合わせて利用できることは、当業者には明らかだろう。上記特性の１または複数またはすべてを示す培地組成物を利用することにより、当業者は、細胞成長および／または生存率を最適化し、発現ポリペプチドの産生を最大限にすることができるだろう。
【００８１】
本発明に開示する培地組成物は、要すれば、ホルモンおよび／または他の成長因子、特にイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、タンパク質加水分解物またはグルコースあるいは他のエネルギー源を補足してもよい。本発明のある種の具体例において、化学誘導剤、例えばヘキサメチレン−ビス（アセトアミド）（「ＨＭＢＡ」）および酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）を培地に補足することは有益でありうる。これらの任意の補足剤は、培養の開始時に加えてもよく、あるいは、消費された栄養分を補給するためまたは他の理由から培養後のある時点で添加してもよい。開示した培地組成物に含まれうる所望のまたは必要な補足剤は、当業者には明らかだろう。
【００８２】
哺乳動物細胞培養物の提供
バッチおよびフェドバッチ培養によるタンパク質またはポリペプチドの生産用の哺乳動物細胞の種々の製造方法は、当該分野でよく知られている。上記したように、発現するのに十分な核酸（典型的には、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子およびいずれもの作用的に結合した遺伝子制御因子を含有するベクター）を、ホスト細胞株に多くのよく知られた技術のいずれかにより導入することができる。典型的には、細胞は、ベクターを取り込み、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現するホスト細胞を決定するために、細胞をスクリーニングする。哺乳動物細胞により発現された特定の目的のポリペプチドまたはタンパク質を検出する慣用的な方法は、限定するものではないが、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、生物活性アッセイおよびアフィニティクロマトグラフィーを含む。発現ポリペプチドまたはタンパク質を検出する他の適当な方法は、当業者には明らかだろう。複数のホスト細胞が目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する場合、記載した方法のいくつかまたはすべてを、ポリペプチドまたはタンパク質を最も高レベルに発現する細胞を決定するのに用いることができる。
【００８３】
一旦、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞を同定すると、細胞を当業者によく知られた種々の方法のいずれかにより培養物中で増殖させる。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、典型的には、細胞の成長および生存を促す温度および培地で成長させることにより増殖させる。初期培養体積はいずれの体積でもよいが、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終生産に用いる生産バイオリアクターの培養体積よりも小さく、生産バイオリアクターに播種する前に、より大きな体積のバイオリアクターに細胞を数回移してもよい。細胞培養は、培地の酸素化および栄養分の細胞への分散を増加させるために、撹拌または振盪することができる。別として、または加えて、当該分野でよく知られた特定の散布デバイスを、培養物の酸素化を増加または制御するのに用いることができる。本発明に従って、限定するものではないが、ｐＨ、温度、酸素化等を含むバイオリアクターの所定の初期条件を制御または調節することが有益であることを当業者は理解できるだろう。
【００８４】
生産バイオリアクターにおける出発細胞密度は、当業者により選択することができる。本発明に従って、生産バイオリアクターにおける出発細胞密度は、培養体積あたり１の細胞まで低くてもよい。本発明の好ましい具体例において、生産バイオリアクターにおける出発細胞密度は、１ｍｌあたり約２×１０２生存細胞〜１ｍｌあたり約２×１０３、２×１０４、２×１０５、２×１０６、５×１０６または１０×１０６生存細胞以上の範囲でありうる。
【００８５】
初期および中間細胞培養物は、次の中間または最終生産バイオリアクターに播種する前に、望ましい密度まで成長させてもよい。すべてまたはほとんどの生存が必要ではないが、細胞のほとんどが播種前に生存していることが好ましい。本発明の一の具体例において、細胞は、例えば低速遠心分離により上清から除去してもよい。また、望ましくない代謝廃棄物または培地成分を除去するために、次のバイオリアクターに播種する前に、培地で除去した細胞を洗浄することが望ましい。培地は、細胞を予め成長させた培地であってもよく、あるいは、本発明の実施者により選択される別個の培地または線上溶液であってもよい。
【００８６】
ついで、細胞を、播種生産バイオリアクターに播種するのに適当な密度に希釈してもよい。本発明の好ましい具体例において、細胞を、生産バイオリアクターで用いられる同様の培地で希釈する。別として、細胞を、本発明の実施者の要求または希望に応じて、あるいは、細胞自体の特定の要求に適合するように、例えば、生産バイオリアクターに播種する前の短期間貯蔵する場合、他の培地または溶液で希釈することができる。
【００８７】
初期成長フェーズ
一旦、生産バイオリアクターに上記のように播種すると、細胞培養物を、細胞培養物の成長および生存に適した条件下で、初期成長フェーズにおいて保持する。正確な条件は、細胞型、細胞をデリバリーする生物および発現ポリペプチドまたはタンパク質の性質および特性に応じて変化するだろう。
【００８８】
本発明に従って、生産バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模生産に適したいずれもの体積でありうる。好ましい具体例において、生産バイオリアクターの体積は、少なくとも５００リットルである。好ましい他の具体例において、生産バイオリアクターの体積は、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットルまたはそれ以上、あるいはその間のいずれもの体積である。当業者は、本発明の実施に用いるのに適当なバイオリアクターを選択することができるだろう。生産バイオリアクターは、細胞成長および生存を促し、産生ポリペプチドまたはタンパク質の発現または安定性に干渉しないいずれもの物質で構成されていてもよい。
【００８９】
初期成長フェーズにおける細胞培養の温度は、主に細胞培養物が生存可能な温度範囲に基づいて選択されるだろう。例えば、初期成長フェーズの期間、ＣＨＯ細胞は、３７℃で良好に成長する。一般的に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃の範囲内で良好に成長する。好ましくは、哺乳動物細胞は、約３５℃〜４０℃の範囲内で良好に成長するだろう。当業者は、細胞の要求および実施者の要求生産量に応じて、細胞が成長する適当な温度を選択することができるだろう。
【００９０】
本発明の一の具体例において、初期成長フェーズの温度は、ある一定の温度に維持される。他の具体例において、初期成長フェーズの温度は、ある温度範囲内に維持される。例えば、温度は、初期成長フェーズの期間に、徐々に高くしても、低くしてもよい。別として、温度は、初期成長フェーズのある時点で一定の温度だけ高くしても、低くしてもよい。当業者は、単一または複数の温度を用いるべきかどうか、温度を徐々に調節すべきか、不連続に一定の温度だけ調節すべきかどうか決定することができるだろう。
【００９１】
初期成長フェーズの間、実施者の要求および細胞自体の要求に応じて、より長くまたは短い時間、細胞を成長させることができる。一の具体例において、細胞の成長が妨害されない場合に最終的に到達する最大生存細胞密度の所定のパーセントである、生存細胞密度に達するのに十分な期間、細胞を培養する。例えば、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントである所望の生存細胞密度を得るのに十分な期間、細胞を成長させることができる。
【００９２】
他の具体例において、所定の期間、細胞を成長させることができる。例えば、細胞培養の初期濃度、細胞成長の温度および細胞の本質的な成長速度に応じて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上の間、細胞を成長させてもよい。ある場合には、１ヶ月またはそれ以上の間、細胞を成長させてもよい。シードバイオリアクター中、初期成長フェーズ温度での細胞の成長が、その接種時点で生産バイオリアクターにおける生存細胞密度が、すでに最大生存細胞密度の所望のパーセントである場合、生産バイオリアクターにおいて細胞は０日間成長させらるだろう。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質産生要求量および細胞自体の要求に応じて、初期成長フェーズの期間を選択することができるだろう。
【００９３】
酸素化および細胞への栄養分の分散を増加させるために、初期培養フェーズの期間、細胞培養物を撹拌または振盪してもよい。本発明に従って、限定するものではないが、ｐＨ、温度、酸素化等を含む、初期成長フェーズ期間のバイオリアクターにおけるある内部条件を制御または調節することが有益でありうることは、当業者には理解できるだろう。例えば、ｐＨは、適当な量の酸または塩基をスプレーすることにより制御することができ、酸素化は、当該分野でよく知られた散布デバイスにより制御することができる。
【００９４】
培養条件のシフト
本発明の教示に従って、初期成長フェーズの終わりに、第２の培養条件を適用し、培養物に代謝シフトが生じるように、少なくとも１つの培養条件をシフトしてもよい。阻害代謝物、最も顕著には乳酸塩およびアンモニアの蓄積は、成長を阻害する。細胞培養物の温度、ｐＨ、重量オスモル濃度または化学誘導剤レベルを変更することにより為される代謝シフトは、特定のグルコース消費速度に対する特定の乳酸塩産生速度の割合を減少させることにより特徴付けられる。一の非限定的具体例において、培養温度をシフトさせることにより培養条件をシフトする。しかしながら、当該分野で知られているように、温度のシフトは、適当な代謝シフトを達成することができるただ一つのメカニズムというわけではない。例えば、かかる代謝シフトは、限定するものではないが、ｐＨ、重量オスモル濃度および酪酸ナトリウムレベルを含む他の培養条件をシフトすることによっても達成することができる。上記したように、培養シフトのタイミングは、本発明の実施者により、ポリペプチドまたはタンパク質生産要求量または細胞自体の要求に基づいて決定されるだろう。
【００９５】
培養温度をシフトした場合、温度シフトは相対的に徐々に行ってもよい。例えば、温度変化が完了するまでに数時間または数日かかってもよい。別として、温度シフトは、相対的に急激に行ってもよい。例えば、温度変化を、数時間未満で完了させてもよい。適当な生産物および制御装置が、例えばポリペプチドまたはタンパク質の商業的大規模生産である場合、温度変化は１時間以内に完了してもよい。
【００９６】
次成長フェーズの細胞培養温度は、主に細胞培養物が生存し、商業的に十分なレベルで組み換えポリペプチドまたはタンパク質を発現できる温度範囲に基づいて選択されるだろう。一般的に、ほとんどの哺乳動物細胞は、約２５℃〜４２℃の範囲内で生存し、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を商業的に十分なレベルで発現することができる。好ましくは、哺乳動物細胞は、約２５℃〜３５℃の範囲内で生存し、商業的に十分なレベルで組み換えポリペプチドまたはタンパク質を発現することができる。当業者であれば、細胞の要求および実施者の生産要求量に応じて、細胞を成長させる適当な温度を選択することができるだろう。
【００９７】
本発明の一の具体例において、次成長フェーズの温度は、ある一定の温度に維持される。他の具体例において、次成長フェーズの温度は、ある温度範囲内に維持される。例えば、温度は、次成長フェーズの期間に、徐々に高くしても、低くしてもよい。別として、温度は、次成長フェーズのある時点で一定の温度だけ高くしても、低くしてもよい。当業者は、この具体例に複数回の温度シフトが含まれることは理解できるだろう。例えば、温度を１回シフトして、この温度またはこの温度範囲である期間、細胞を保持し、その後、温度を再び低温または高温側のいずれにシフトしてもよい。個々のシフト後の培養温度は、一定であってもよく、またはある温度範囲内で維持されてもよい。
【００９８】
実施例１６において、データにより、２回の逐次的な温度変化を用いる効果が示されているが、本発明に従って、３回またはそれ以上の逐次的な温度変化が、細胞生存率または密度を増加する、および／または組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現を増加するために用いることができることが当業者には理解できるだろう。個々の逐次温度シフト後の細胞培養温度または温度範囲は、シフト前の温度または温度範囲より高くても、または低くてもよい。本発明の好ましい具体例において、個々の逐次的温度または温度範囲は、前の温度または温度範囲よりも低い。
【００９９】
次生産フェーズ
本発明に従って、一旦、細胞培養条件を上記したようにシフトさせると、細胞培養物を、細胞培養物の生存および商業的に十分なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に適した、第２の培養条件下で、次生産フェーズの間保持する。
【０１００】
上記したように、限定するものではないが、温度、ｐＨ、重量オスモル濃度および酪酸ナトリウムレベルを含む多くの培養条件の１つまたはそれ以上をシフトされることにより、培養をシフトさせることができる。一の具体例において、培養温度をシフトさせる。この具体例により、次生産フェーズの期間、培養物を、初期成長フェーズの温度または温度範囲より低い温度または温度範囲で維持する。例えば、次生産フェーズの期間、ＣＨＯ細胞は、２５℃〜３５℃の範囲内で良好に組み換えポリペプチドおよびタンパク質を発現する。上記したように、細胞密度または生存率を増加させるため、あるいは組み換えポリペプチドまたはタンパク質の発現を増加させるために、複数回の温度シフトを行うことができる。
【０１０１】
本発明により、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、次生産フェーズにおいて細胞を維持してもよい。一の具体例において、組み換えポリペプチドまたはタンパク質の力価が最大になるまで、細胞を次生産フェーズにて保持した。他の具体例において、実施者の生産要求量または細胞自体の必要性に応じて、この時点までに培養物を回収してもよい。例えば、最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの生存細胞密度を達成するのに十分な期間細胞を保持してもよい。ある場合において、生存細胞密度を最大にし、ついで、培養物を回収する前に、生存細胞密度をあるレベルまで減少させることが望ましい。極端な例として、培養物を回収する前に、生存細胞密度を０に近づけるか、または０にすることが望ましい。
【０１０２】
本発明の他の具体例において、所定の次生産フェーズの期間、細胞を成長させてもよいる。例えば、次成長フェーズの開始時の細胞培養物の濃度、細胞が成長する温度および細胞の固有の成長速度に応じて、細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上の間成長させてもよい。ある場合において、細胞を１ヶ月またはそれ以上成長させてもよい。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質の生産必要量および細胞自体の要求に応じて、次生産フェーズの期間を選択することができるだろう。
【０１０３】
ある場合において、次生産フェーズの期間、細胞により消費または代謝される栄養物または他の培地成分を、細胞培養に補足することは、有益または必要でありうる。例えば、細胞培養に、細胞培養のモニタリングの期間、消費が観察された栄養物または他の培地成分を補足することは有利である（下記する「培養条件のモニタリング」の項を参照）。別として、または加えて、次生産フェーズの前に、細胞培養物を補足することは、有益または必要でありうる。非限定的例として、細胞培養に、ホルモンおよび／または他の成長因子、特にイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質またはグルコースあるいは他のエネルギー源を補足することは、有益または必要でありうる。
【０１０４】
これらの補足成分は、細胞培養に１回ですべてを加えてもよく、あるいは、一連の添加として細胞培養に提供してもよい。本発明の一の具体例において、補足成分は、比例した量で、複数回で細胞培養に提供する。別の具体例において、最初にある補足成分を提供し、後に残りの成分を加えることも望ましい。本発明のさらなる別の具体例において、細胞培養を、これらの補足成分を継続的に流し込んでもよい。
【０１０５】
発明により、細胞培養物に添加される総体積は、最適には、最小量に保たれるべきである。例えば、細胞培養物に添加した補足成分を含有する培地または溶液の総体積は、補足成分を加える前の細胞培養物の体積の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％であってもよい。
【０１０６】
細胞培養物を、細胞の酸素化および栄養物の分散を増加させるために、次生産フェーズの期間、撹拌または振盪してもよい。本発明により、当業者は、限定するものではないが、ｐＨ、温度、酸素化等を含む、次成長フェーズ期間のバイオリアクターのある種の初期条件、を制御または調節することが有益であり得ることは理解できるだろう。例えば、ｐＨは、適当な量の酸または塩基をスプレーすることにより調節することができ、酸素化は、当該分野でよく知られた散布デバイスで制御することができる。
【０１０７】
培養条件のモニタリング
本発明のある種の具体例において、実施者は、成長細胞培養物の特定の条件を定期的にモニターすることが有益または必要であると感じるかもしれない。細胞培養条件をモニタリングすることにより、実施者は、細胞培養物が、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を最適なレベルで産生しているがどうか、あるいは、培養物が、最適な産生フェーズに入っているかどうかを判断することができる。ある細胞培養条件をモニターするために、分析用の少量の培養物アリコートを取り出す必要があるだろう。当業者は、かかる採取により、細胞培養が汚染される可能性があることは理解でき、かかる汚染のリスクを最小限にするために適切に注意すべきだろう。
【０１０８】
非限定的例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、合成生存細胞密度、乳酸レベル、アンモニウムレベル、オスモル濃度または発現ポリペプチドまたはタンパク質の力価をモニターすることは有益または必要でありうる。当業者がこれらの条件を測定するための多くの方法が当該分野で知られている。例えば、細胞密度は、血球計、コールター・カウンターまたは細胞密度試験（ＣＥＤＥＸ）を用いて測定することができる。生存細胞密度は、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅで培養試料を染色することにより測定することができる。死亡細胞だけが、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅを取り込むことができるので、生存細胞密度は、細胞の総数をカウントし、染色された細胞数を細胞の総数で除し、その逆数を得ることにより測定することができる。ＨＰＬＣは、乳酸塩、アンモニアまたは発現ポリペプチドまたはタンパク質のレベルを測定するのに用いることができる。別法として、発現ポリペプチドまたはタンパク質のレベルを、標準的な分子生物的方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマーシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、ＢｉｕｒｅｔアッセイおよびＵＶ吸収により、測定することができる。リン酸化およびグリコシル化を含むポリペプチドまたはタンパク質、発現の翻訳後修飾をモニターすることも有益または必要でありうる。
【０１０９】
発現ポリペプチドの単離
一般的に、典型的には、本発明により発現したタンパク質またはポリペプチドを単離および／または精製することが望ましいだろう。好ましい具体例において、発現ポリペプチドまたはタンパク質は培地中に産生され、かくして、細胞および他の固体を、例えば精製工程の最初に、遠心分離または濾過除去により除去してもよい。この具体例は、特に、本明細書に記載の方法および組成物は高い細胞生存率を与えるので、本発明において用いる場合に有用である。結果として、培養プロセスの間に死亡する細胞がより少なく、発現ポリペプチドまたはタンパク質の収率を減少させる可能性がある培地中へのタンパク質分解酵素の放出がより少なくなる。
【０１１０】
別法として、発現ポリペプチドまたはタンパク質を、ホスト細胞の表面に結合させる。この具体例において、精製工程の最初の工程として、培地を取り出し、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するホスト細胞を溶解する。哺乳動物ホスト細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者によく知られた多くの手段により行うことができる。
【０１１１】
ポリペプチドまたはタンパク質は、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離または溶解度の差異、エタノール沈殿を含む標準的な方法により、あるいは、他のタンパク質の精製法（例えば、Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987；Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999;およびDeutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997（すべて出典明示により本明細書に組み入れる）を参照）により単離、精製することができる。特に、イムノアフィニティクロマトグラフィーに関して、タンパク質を、そのタンパク質に対して作用し、固定相に貼り付けられた抗体を含むアフィニティカラムにタンパク質を結合されることにより単離することができる。別法として、アフィニティタグ、例えばインフルエンザコート配列、ポリ−ヒスチジンまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを、標準的な組み換え法によりタンパク質に結合させ、適当なアフィニティカラムを通すことにより容易に精製することができる。プロテアーゼ阻害剤、例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンを、精製工程の間のポリペプチドまたはタンパク質の崩壊を減少させる、または解消するために、いずれかまたはすべての工程において添加してもよい。プロテアーゼ阻害剤は、発現ポリペプチドまたはタンパク質の単離、精製のために、細胞を溶解しなければならない場合に特に好ましい。精製すべきポリペプチドまたはタンパク質の特性、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞の特性および細胞を成長させる培地の組成に応じて変化するだろうことは、当業者には明らかだろう。
【０１１２】
医薬処方
本発明のある種の好ましい具体例において、産生ポリペプチドまたはタンパク質は、薬理活性を有し、医薬の製造において有用であるだろう。上記した本願の組成物は、対象に投与されるか、あるいは、最初に、限定するものではないが、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、眼、経皮（局所）、経粘膜、直腸および膣経路を含む可能な経路によるデリバリー用に処方することができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、哺乳動物細胞株から発現した精製ポリペプチドまたはタンパク質、デリバリー剤（すなわち、上記したカチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、界面活性剤等）を医薬上許容される担体と組み合わせて含みうる。本明細書で用いられる場合、「医薬上許容される担体」なる用語は、医薬投与に適当しうる、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。また、追加の活性化合物を、組成物中に組み入れることもできる。
【０１１３】
医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように処方される。非経口、皮内または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液は、下記成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、セイライン溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調製剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含みうる。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムにより調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチックの複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１１４】
注射用途に適した医薬組成物は、典型的には、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および滅菌注射可能溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して適当な担体は、生理食塩水、精菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は滅菌されるべきであり、容易に注入可能である程度に流動性であるべきである。好ましい医薬処方は、製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。一般的に、関連する担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒でありうる。適当な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いることにより、分散剤である場合には要求粒度を管理することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいだろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより実現できる。
【０１１５】
滅菌注射可能溶液は、必要量の精製ポリペプチドまたはタンパク質を、適当な溶媒中に、必要に応じて上記した成分の１つまたは組合せと一緒に溶解し、ついで、濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、哺乳動物細胞株から発現された精製ポリペプチドまたはタンパク質を、基礎分散媒および上記した必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに入れることにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め滅菌濾過した溶液から活性成分と所望の付加的な成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１１６】
一般的に、経口組成物は、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的に関して、精製ポリペプチドまたはタンパク質は、賦形剤と一緒に組み入れ、錠剤、トローチまたはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。また、経口組成物は、口腔洗浄剤として用いられる液体担体を用いて製造することもできる。医薬上適合する結合剤および／またはアジュバントを、組成物の一部として含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、いずれもの以下の成分：結合剤、例えば、微結晶セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン；賦形剤、例えばスターチまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばシュークロースまたはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー、あるいはこれらと同様の性質を有する化合物を含みうる。経口デリバリー用の処方は、有利には、胃腸管内での安定性を改善するため、および／または吸収性を増強するために薬剤を含んでいてもよい。
【０１１７】
吸入による用途の場合、哺乳動物細胞株により発現される精製ポリペプチドまたはタンパク質およびデリバリー剤を含む本発明の組成物は、好ましくは、適当な推進剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーから、エアロゾールスプレー形態でデリバリーされる。本発明は、特に、鼻腔用スプレー、吸入または他の上気道および／または下気道への直接デリバリーを用いる組成物のデリバリーに適合する。インフルエンザウイルスに対するＤＮＡワクチンの鼻腔内投与は、ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発することが示されており、この経路によりデリバリーされた場合、気道内の少なくともいくつかの細胞がＤＮＡを取り込み、本発明のデリバリー剤は細胞摂取を増強するだろうことを示している。本発明のある種の具体例により、組成物は、哺乳動物細胞株から発現した精製ポリペプチドおよびデリバリー剤を含む組成物を、エアロゾール投与用の大きな多孔質粒子として処方される。
【０１１８】
また、全身性投与は、経粘膜または経皮法により行うことができる。経粘膜または経皮投与に関して、浸透すべきバリアに適した浸透剤を処方に用いる。かかる浸透剤は、一般的に当該分野で知られており、例えば、経粘膜投与に関しては、洗浄剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤を用いることにより行うことができる。経皮投与に関して、精製ポリペプチドまたはタンパク質およびデリバリー剤が、当該分野で一般に知られた、軟膏、ゲルまたはクリームに処方される。
【０１１９】
また、組成物は、直腸デリバリー用に、坐剤（例えば、慣用的な坐剤基剤、例えばココアバターおよび他のグリコライドと一緒に）または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１２０】
一の具体例において、例えば、埋め込みおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む、制御放出処方である組成物は、ポリペプチドまたはタンパク質が体内から急速に除去されることを防止する担体を用いて調製される。生分解可能で生体適合性のポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。かかる処方の調製方法は、当業者には明らかだろう。また、物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販されている。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞に標的化したリポソームを含む）は、医薬上許容される担体として用いることができる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている方法により調製することができる。
【０１２１】
投与および投与量を均一にすることを容易にするために、単位剤形で経口または非経口組成物に処方することが有利である。本明細書で用いられる場合、単位剤形は、治療されるべき対象とって単一用量として適した、物理的に別個の単位を意味する。かかる単位は、必要な医薬担体と関連して望ましい治療効果を誘発するように計算された活性ポリペプチドまたはタンパク質の所定量を含有する。
【０１２２】
本発明により発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、約１〜１０週、２〜８週、約３〜７週、約４、５または６週の期間、１週間に１回というように、必要に応じて種々の間隔および種々の期間、投与することができる。当業者には、限定するものではないが、疾患または障害の重篤度、前処理、対象の全体的な健康状態および／または年齢および他の疾患の存在を含むある種の因子が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投与量および時期に影響を与えうることは明らかだろう。一般的に、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質での対象の治療は、単一の治療を含むか、あるいは、多くの場合、一連の治療を含みうる。さらに、適当な投与量が、ポリペプチドまたはタンパク質の能力に依存し、例えば、予め選択した望ましい応答が得られるまで投与量を増加して投与することにより、特定の受容者に最適に合わせうることは理解されるだろう。特定の動物対象に対する特定の投与レベルは、用いられる特定のポリペプチドまたはタンパク質活性、対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与回数、投与経路、排泄速度、薬剤の組合せおよび調節される発現または活性の程度を含む、種々の因子に依存しうることは理解されるだろう。
【０１２３】
本発明は、非ヒト哺乳動物の治療用の本発明の化合物の使用を含む。したがって、投与量および投与方法は、よく知られた獣医学的原則に従って選択されうる。ガイダンスは、例えば、Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001にて見ることができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに投与の指示書と一緒に含まれうる。
【０１２５】
以下の記載は、本発明を単に説明し、代表的なものであって、なんら限定を意図するものではない。本発明を実施するための別法および別の物質、また、付加的な適用は、当業者には明らかであり、特許請求の範囲内に含まれる。
【０１２６】
実施例
実施例１：抗ＧＤＦ−８フェドパッチ法に関する、強化培地１
細胞株を培養する慣用的なフェドバッチ法は、供給物を与えるのに必要な時間と労力および大規模バイオリアクターにおいて特別な装置を必要とすることを含む、いくつかの欠点を有する。本願の目的は、最低限の供給で、大規模バイオリアクターにおける目的のタンパク質の生産用のバッチ培地を構築することである。
【０１２７】
物質および方法
株および培地：チャイニーズ・ハムスター・卵巣（「ＣＨＯ」）細胞を、成長および分化因子８（「抗ＧＤＦ−８細胞」）に対するモノクローナル抗体を発現するために設計した（Veldman et al., Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Therefor、ＵＳ２００４０１４２３８２Ａ１を参照）。抗ＧＤＦ−８細胞を、新規バッチ培地の試験に用いた。培地１および培地２を、高細胞密度および生存率を裏付けるために、その能力を比較した。これらの培地ならびに培地３の組成は、表１に記載する。培地は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを除くすべての成分を添加することにより作成した。ついで、培地を、ｐＨ７．２５に調節し、オスモル濃度を記録し、ついで、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加えた。
【０１２８】
培養条件：フラスコ実験に関して、抗ＧＤＦ−８細胞を振盪フラスコで成長させ、３回継代させた。バイオリアクター実験に関して、抗ＧＤＦ−８細胞を、５日目以降、毎日、２体積％の２０Ｘ培地４フィード培地（表３）または３体積％の１６Ｘ培地４（表４）を補足して、１２日間培地で成長させた。最初の４日間、細胞を３７℃で成長させた。５日目に、細胞を３１℃にシフトした。
【０１２９】
試料分析：毎日、試料を培地から採集し、アミノ酸、ビタミン、鉄、ホスフェート、グルコースおよびグルタミンレベルに関して分析した。
【０１３０】
【表１−１】
【０１３１】
【表１−２】
【０１３２】
結果および結論
図１は、フラスコ実験における、抗ＧＤＦ−８細胞の成長速度は、培地１および培地２で同じであったことを示している。
図２は、バイオリアクターにおいて、培地１が、培地３よりも、有意に高い最終細胞密度および生存率を示すことを示す。また、最終力価は、基本的な方法の５５１ｍｇ／Ｌから培地１で９７６ｍｇ／Ｌまで有意に増加した（データは示していない）。温度を、５日目に３７℃から３１℃にシフトした。予期せぬ高い細胞成長のため、培養物を、２体積％の２０Ｘ培地４または３体積％の１６Ｘ培地４のいずれかを、５日目以降、毎日供給した。かくして、これは、当初予定したバッチ実験とは正確には異なる。フィード培地へのアスパラギンおよびチアミンの供給を１０日目から開始した。
【０１３３】
濃縮バッチ培地の構築において、いくつかの可能性ある問題を考慮する必要がある。第１に、濃縮栄養物は、細胞に毒性である可能性がある。この実施例において構築した培地において、すべての栄養物および成分は、毒性限界以下になるように決定した（データには示していない）。
【０１３４】
第２に、濃縮バッチ培地は、必然的に、非濃縮培地よりも高オスモル濃度を有し、このことは細胞成長および生存率に有害な影響を与えることが示されている。この問題は、開始時の培地中のＮａＣｌ量を少なくすることにより回避することができる。さらに、濃縮バッチ培地は、培養期間全体にわたって成長を持続するのにグルコースのレベルが不十分である。かくして、グルコースフィードを培養物に、５日目以降、毎日補足する。
【０１３５】
第３に、インスリンおよびグルタミンは、１２日の培養期間の間に分解されやすい。かくして、グルコースに加えてこれらの成分を培養物に補足した。
【０１３６】
最後に、鉄は、高ｐＨで高濃度のホスフェートを含有する溶液で沈殿するだろう。この問題は、培地調製工程の最後に、適当なレベルにｐＨを調節した後に、鉄を添加することにより解決できる。
【０１３７】
実施例２：フェドバッチ法における、抗ＧＤＦ−８細胞用の濃縮フィード培地（培地５）の構築
実施例１において、培地１に用いる抗ＧＤＦ−８細胞を培養するバッチ法を構築した。そのプロセスにおいて得られた高細胞密度のため、グルコースおよびグルタミンに加えて栄養物を供給することが有益であることが分かった。しかしながら、８Ｘ培地４フィード培地を有するバッチを補足することにより、培養物が過剰に希釈される。より濃縮したフィード培地を、この問題を解決するために構築した。
【０１３８】
物質および方法および結果
表２は、表３〜４の処方に用いられる、培地４Ａ−１、培地４Ｂ、トレースＢおよびトレースＤの組成を示す。
【０１３９】
【表２−１】
【０１４０】
【表２−２】
【０１４１】
２０Ｘ培地４
第１の濃縮培地を、２０Ｘ培地４として構築した。２０Ｘ培地４の培地の構成を表３に示す。
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
培地の構成は、３つのパート：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩからなる。パートＩは、ビタミンの溶解度の問題のために葉酸を除いた培地４Ｂの個々の成分を含む８Ｘ培地４の濃縮バージョンである。パートＩＩは、パートＩに加えた場合、鉄が沈殿する可能性を回避するための、鉄ストック、トレースＤおよび酸性システインである。パートＩＩＩは葉酸ストックである。パートＩを、５日目から２体積％で毎日加え、パートＩＩおよびＩＩＩを、パート１と一緒に５日目に１回加える。
フィード培地の最終ｐＨを７．０に調節し、オスモル濃度は約１０６４ｍＯｓｍであった。２％フィードにより、培養物が２ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＭのグルタミンおよび１４ｍＯｓｍのオスモル濃度、増加する。
【０１４４】
２．１６Ｘ培地４．
オスモル濃度の増加を軽減するために、フィード培地を、２０Ｘ培地４（毎日２体積％）から１６Ｘ培地４（毎日３体積％）に変更した。１６Ｘ培地４の培地構成を、表４に示す。
【０１４５】
【表４】
【０１４６】
また、この修飾１６Ｘ培地４において、さらにオスモル濃度を減少させるためにグルコースを除き、グルコースフィードに融通性を与えた。フィード培地の総オスモル濃度は、この時点で２９５ｍＯｓｍである。
【０１４７】
３．１６Ｘ培地４
１６Ｘ培地４の構成を変更した。鉄ストック溶液をフィードに加え、結果として、個々のフィードに０．４５μＭを添加した。さらに、グルコースを戻し、フィード毎に１．５ｇ／Ｌを加えた。この修飾１６Ｘ培地４の培地構成を表５に示す。
【０１４８】
【表５】
【０１４９】
４．１６Ｘ培地４
ここで、フィード培地（１６Ｘ培地４）を、いくつかのバッチと同様に、３つの別個のフィードの代わりに複合培地で作成した。葉酸を必要な濃度で溶解できることを確実にし、鉄または葉酸がいずれも、４℃または室温のいずれかで６日間貯蔵した後も溶液から沈殿しないことを確実にするために試験を行った。複合１６Ｘ培地４の培地構成を表６に示す。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
１日あたり２ｇ／Ｌのグルコース添加および１．５ｍＭのグルタミンの添加で、培地の最終オスモル濃度は７２４ｍＯｓｍである。
【０１５２】
５．１２Ｘ培地４．
ここで、フィード培地をいくらか変更する。培地４Ｂ粉末を、培地４Ｂにおける個々の成分を添加する代わりに用いた。培地４Ｂ粉末を、グルコースと混ぜ合わせ、溶液をｐＨ１０．２５まで滴定することにより、塩基性条件下で別々に溶解した。アミノ酸およびビタミン分析結果が、フェドバッチプロセスの終わりまでに、これらの二つの成分が排出されることを示したので、付加的なアスパラギンおよびチアミンを加えた。１２Ｘの培地４の使用は、さらに、培養物に供給する場合、オスモル濃度の増加を軽減した。１２Ｘ培地４の培地構成を表７に示す。
【０１５３】
【表７】
【０１５４】
採取オスモル濃度は５６６ｍＯｓｍである。４体積％の１日のフィードが、適度に、オスモル濃度を８．６、グルコースを２ｇ／Ｌおよびグルタミンを１．５ｍＭ増加させる。また、１２Ｘ培地４培地構成物が、培地５として知られている。培地５は、２０Ｘ培地４または１６Ｘ培地４と比較して容易に作成でき、室温または４℃で１０日以上安定である（データは示していない）。
【０１５５】
実施例３：グルタミン抗ＧＤＦ−８細胞培養物に関する、グルタミン不足フェドバッチプロセス
ＣＨＯ細胞は、生存するために初期の培地にグルタミンを必要とする。慣用的には、初期グルタミンレベルは高く、グルタミンは、５日目以降フェドパッチ工程の最後まで毎日供給される。慣用的なフェドバッチプロセスは、通常、細胞培養において、高い乳酸濃度およびアンモニウムレベルを生じ、このことが、細胞成長、細胞密度および組み換えタンパク質発現の効果を阻害することが知られている。グルコースを培養物にゆっくりと添加するフェドバッチ工程は、乳酸産物を低下させ、細胞成長、細胞密度および組み換えタンパク質発現を改善することが示された。しかしながら、グルコース添加の操作に関する従来の方法は、大規模製造で実用化されていない。そこで、低い初期グルタミンレベルおよびフィードからグルタミンを除いた培養培地を利用することにより、アンモニウムおよび乳酸の産生が低レベルであり、細胞生存率を増加させることが示された。加えて、グルタミン不足培地において、組み換えタンパク質発現は増加し、最終オスモル濃度は減少した。
【０１５６】
物質および方法
株および培地：抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌバイオリアクター中、培地１においてフェドバッチモードで培養した。
培養条件：細胞を、１Ｌバイオリアクターにおいて１２日間成長させた。温度を、細胞成長に応じて、４日目または５日目に３７℃から３１℃にシフトした。３つのフェドバッチプロセス：通常（対照）プロセス、非グルタミンフィードプロセスおよびグルタミン不足プロセスを試験した。これらのプロセスの関連細目を、表８および表９に示す。
【０１５７】
【表８】
【０１５８】
【表９】
【０１５９】
試料分析：培養物から毎日試料を採取し、細胞密度、細胞生存率、乳酸、グルタミンおよびアンモニウムレベルに関して分析した。また、発現抗ＧＤＦ−８抗体の力価を毎日測定した。
【０１６０】
結果および結論
図３は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物の細胞密度を示す。両方の場合において、細胞密度は、実験期間中同様であった。
図４は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物の細胞生存率を示す。非グルタミンフィード培養物は、６日目から実験の終わりにかけて非常に高い細胞生存率を示した。
図５は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物中のアンモニウムレベルを示す。非グルタミンフィード培地は、４日目から実験の終わりにかけてアンモニウムレベルの顕著な減少を示した。
図６は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物中の乳酸レベルを示す。乳酸レベルは、実験の期間中、非グルタミンフィード培養物においてわずかに低下した。
図７は、非グルタミンフィードまたは対照フェドバッチ条件において成長した培養物における抗ＧＤＦ−８抗体力価を示す。最終抗ＧＤＦ−８抗体力価は、非グルタミンフィード培養物においてより高かった。
図８は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物の細胞密度を示す。両方の場合において、細胞密度は、実験期間中同様であった。
図９は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物における細胞生存率を示す。両方の場合において、細胞生存率は、実験期間中同様であった。
図１０は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物におけるアンモニウムレベルを示す。グルタミン不足培養物は、実験期間中、アンモニウムレベルの顕著な減少をを示した。
図１１は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件において成長した培養物における乳酸レベルを示す。グルタミン不足培養物は、４日目から実験の終わりにかけて、乳酸レベルの顕著な減少をを示した。
図１２は、グルタミン不足または対照フェドバッチ条件における抗ＧＤＦ−８抗体力価を示す。最終抗ＧＤＦ−８抗体力価は、グルタミン不足培養物においてより高かった。
【０１６１】
総合すると、これらの結果は、低いグルタミンレベルが、アンモニウム産物の量を減少させ、細胞生存率を増加させ、発現抗ＧＤＦ−８抗体の力価を増加させることにより、細胞培養に有益であることを示している。加えて、グルタミン不足培養物において、場合により、低グルコース消費速度により、低乳酸レベルが観察された。また、低いアンモニウムおよび乳酸レベルは、トータルのオスモル濃度を減少させる効果を有する。高いオスモル濃度は、また、細胞成長および生存率に対して阻害効果を有することが知られている。グルタミンフィードを除くと共に、低い初期グルタミンレベルは、また、貯蔵培地における非酵素グルタミン分解の結果として生じるアンモニウムを減少させる優れた効果を有する。フィードにおいてグルタミンを排除することは、また、抗ＧＤＦ−８細胞の培養プロセスを単純化する。
【０１６２】
実施例４．培地１および培地２における抗ＧＤＦ−８細胞の鉄投与応答
培地１を、培地２よりも栄養物でさらに濃縮した。培地１における細胞成長最適な鉄レベルを、細胞培養期間の鉄欠乏に関する問題を回避するために測定した。
【０１６３】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、培地１または培地２においてディッシュ中で、１継代培養した。これらの培地の鉄濃度を、異なる量の貯蔵鉄溶液を添加することにより操作した。最終細胞密度を、ＣＥＤＥＸにより測定した。
【０１６４】
結果および結論
図１３は、異なる鉄濃度を有する培地１および培地２における抗ＧＤＦ−８細胞のＦｅ投与応答を示す。培地２において、細胞密度は、３μＭ〜１５μＭの範囲の鉄濃度に対して相対的に一定であった。培地１において、細胞密度は、鉄濃度の増加と共に増加したが、約５μＭで最大に達した。この違いは、培地１は高含有量で栄養分を含み、培地における鉄のキレート化の結果として、細胞が利用できる鉄が減少したためと考えられる。これらの結果は、培地１にける鉄欠乏に関する問題を回避するために、５μＭ以上を維持すべきであることを示している。
【０１６５】
実施例５：バイオリアクタープロセスにおける、グルタミンのグルタミン酸塩への置換
抗ルイスＹ細胞培養プロセスにおいて、グルタミンをグルタミン酸に置換することによる効果を、３つの実験で試験した。
【０１６６】
物質および方法
実験を、１０Ｌバイオリアクター中、ｐＨ７．１、３０％酸素溶解および開始温度３７℃、５日目に３１℃にシフトの条件で行った。散布ガスおよびヘッドスペースガスは、８８％の９３％空気／７％ＣＯ２混合物および１２％酸素であった。すべての実験において、出発培地は、グルタミンを含有する培地１であった。補足グルコースおよびグルタミンフィードを含む、フィード培地およびフィードスケジュールを、表１０に示す。「グルタミン酸塩」のカラムは、グルタミンを含有しないが、標準培地５におけるモルグルタミン濃度と等しいモル濃度のグルタミン酸塩を含有する、修飾培地５で与える。
【０１６７】
【表１０】
【０１６８】
結果および結論
各々の実験において、細胞密度は、図１４に示すように同様であった。グルタミン２およびグルタミン酸塩２の実験において、ｐＨが３日後に約６．７になったために細胞密度が低い。グルタミン３およびグルタミン酸塩３の実験における、６および７日目の間の密度の低下は、６日目での２９％培地フィードによるものである。
【０１６９】
図１５は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物の細胞生存率を示す。細胞生存率は、グルタミン酸塩フェド培養物を含有するバイオリアクターにおける工程の後半の期間、高レベルを維持した。
【０１７０】
実験１において、抗ルイスＹ力価は、グルタミン酸塩およびグルタミンフェド培養物間で同様である。図１６は、実験２および３において、抗ルイスＹ力価が、グルタミンフェドリアクターにおいてより低いことを示している。これらのリアクターで観察された低抗ルイスＹ力価は、図１７に示すように産生された高レベルの乳酸によるものであると考えられる。
【０１７１】
フィード培地にグルタミン酸塩を有するバイオリアクターでは、低アンモニウム濃度（図１８）および低オスモル濃度（図１９）であった。
【０１７２】
結合ＥＬＩＳＡアッセイを、グルタミン１およびグルタミン酸塩１実験からの試料の活性を試験するのに用いた。活性は、グルタミン１試料のリファレンスが１１０％およびグルタミン酸塩１試料のリファレンスが１２２％と同様であった（データは示していない）。
【０１７３】
３つの実験におけるグルタミンのグルタミン酸塩への置換は、細胞密度に有意な影響を与えなかった。しかしながら、細胞生存率は、グルタミンをフィードしたバイオリアクターがより低い。アンモニウム、乳酸塩およびオスモル濃度は、グルタミンをフィードしたものと比較して、グルタミン酸塩をフィードしたバイオリアクターが低い。平均して、抗ルイスＹ力価は、グルタミン酸塩をフィードしたバイオリアクターにおいてより高く、活性は、本質的に両方の条件下で同じである。
【０１７４】
実施例６．抗ルイスＹ細胞培養プロセルにおけるグルコースおよびグルタミンの置換
この実験の目的は抗ルイスＹ細胞の培養において、グルコースおよびグルタミンを下記表１１に示すフィード培地で置き換えることによる効果を試験することであった（Bogheart et al., Antibody-targeted chemotherapy with the calicheamicin conjugate hu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisy and eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografts, Clin. Can. Res. 10:4538-49 (2004)を参照）。細胞密度、細胞生存率、抗ルイスＹ力価およびアンモニウムレベルを測定した。
【０１７５】
物質および方法
実験を、２５０ｍｌの振盪フラスコ開始容量７５ｍｌで行った。すべての振盪フラスコに、培地２で０．２５×１０６細胞／ｍｌで播種した。フラスコを、インキュベーターにおいて、３７℃、７％のＣＯ２で、１４日間インキュベートした。３および４日目に、フラスコに、５体積％の培地６フィード培地をフィードした。培地６の組成を表１１に示す。５〜１３日目に、フラスコに、表１２に示すフィード溶液の１つをフィードした。各々の条件で、２回行った。試料を毎日採取し、細胞をＣＥＤＥＸにより計数し、アンモニウム、グルコースおよび乳酸塩に関してアッセイした。
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
【表１２】
【０１７８】
結果および結論
フィード培地中グルコースまたはガラクトースの存在下、グルタミン酸塩またはグリシルグルタミンをグルタミンの代わりに用いた場合に、最も高い細胞密度が観察された。細胞密度は、グルコース／グルタミン、ガラクトース／グルタミンまたはグルコース単独をフィードする培養物において、一般的に低い（図２０）。最終生存率は、グルコース単独をフィードする培養物で最も高く、ついで、グルコース／グルタミン酸塩をフィードする培養物で高かった。グルコースまたはガラクトースと組み合わせたグルタミンまたはアスパラギンをフィードする培養物において最も低い生存率が観察された（図２１）。
【０１７９】
１４日での力価は、グルコース／グリシルグルタミンおよびグルコース／グルタミン酸塩フェド培養物において約７００μｇ／ｍｌで最も高かった。力価は、ガラクトース／グリシルグルタミンおよびガラクトース／アスパラギンフェド培養物において約５００μｇ／ｍｌで最も低かった。グルコース／グルタミン対照における力価は約５７０μｇ／ｍｌであった（図２２）。
【０１８０】
グルコース／グルタミン酸塩またはグルコース単独をフィードするフラスコにおいて最も低いアンモニウムレベルが観察された。ガラクトース／グルタミン酸塩、グルコース／グルタミン、グルコース／グリシルグルタミンおよびグルコース／アスパラギンをフィードするフラスコは、中間レベルのアンモニウムを示した。ガラクトース／アスパラギン、ガラクトース／グリシルグルタミンおよびガラクトース／グルタミンをフィードしたフラスコは、最も高いレベルのアンモニウムを有していた（図２３）。
【０１８１】
グルコースレベルは、ガラクトースをフィードしたすべてのフラスコにおいて１１日目まで１ｇ／Ｌ以上残っていた。１１〜１４日目にかけては、これらの培養物のグルコースは完全には消費されず、個々の培養物間で有意な違いはなく、０．６〜１ｇ／Ｌ残っていた。
【０１８２】
グルコースレベルは、他の基質と組み合わせたグルコースまたはグルコースをフィードしたすべてのフラスコにおいて、１０日目まで増加した。１０〜１４日目に、これらの培養物において、グルコースレベルは、ほぼ一定であり、お互いに同様であった。１４日目には、グルコース／グルタミン酸塩フェド培養物において、約８．４ｇ／Ｌグルコースが残っており、グルコースのみをフィードする培養物においては、約１０．８ｇ／Ｌグルコースが残っていた。
【０１８３】
乳酸レベルは、５日目に約２．４ｇ／Ｌのレベルに達し、このとき条件がすべての細胞で同じになり、１４日目までにすべての培養物において本質的に０になった。乳酸塩レベルは、グルコース／グルタミン対照において、１０〜１４日目に最も高くなったが、この期間１ｇ／Ｌ未満であった（データは示していない）。
【０１８４】
この実験で試験したすべての条件は、対照グルコース／グルタミン条件よりも高い細胞密度であった。ガラクトース／アスパラギン条件を除いて、試験したすべての条件は、グルコース／グルタミン対照またはガラクトース／グルタミンフィード条件よりも、より高い最終生存率であった。グルコース／グルタミン対照における力価は、グルコース／グリシルグルタミンフィード条件およびグルコース／グルタミン酸塩フィード条件における最高値約７００μｇ／ｍｌと比較して、約５７０μｇ／ｍｌであった。
【０１８５】
実施例７：抗ＧＤＦ−８の産生に関するグルタミン欠乏バッチプロセスの評価
典型的なフェドバッチ生成法は、培養期間の間複数回のフィードを必要とする。これらのフィードは、細胞により消費されるか、あるいはバッチ期間中分解されうる培地中の栄養物を元に戻すように設計される。これらのフィードにより、大きなリアクターにスケールアップした場合に、インペラー・ジャンプ（ｉｍｐｅｌｌｅｒ ｊｕｍｐ）（図２４を参照）の必要性のような複雑な問題が生じる。さらに、フィードは、すでに培養物に分泌された抗ＧＤＦ−８の量を希釈し、したがって、採集力価に影響を与える。バッチプロセスの使用により、フィードに適合するように部分容量で植菌する代わりに最大容量でバイオリアクターの植菌をすることが可能になり、インペラー・ジャンプの必要性が取り除かれ、生産性への希釈影響を大きく減少させるだろう。
【０１８６】
グルタミンは、３７℃で不安定であり、バッチ培養において補充される必要性があると考えられることがフェドバッチ法を用いる最も大きな理由の１つである。しかしながら、グルタミン欠乏法を試験した実施例２、５および６の結果は、グルタミンをフィードした対照リアクターと比較して、生産性を有意に向上させたことを示した。この結果を、この実施例において試験したグルタミン欠乏バッチ法と組み合わせた。
【０１８７】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、以下の４つの成長条件に従って、１２日間、ｌＬのバイオリアクター中で成長させた。すべての条件に関するバイオリアクターパラメータを、同一に維持した。空気を散布することにより、溶解した酸素を維持し、空気飽和度の２３％より高く維持し、ｐＨを、０．５８Ｍの二酸化炭素および０．７１Ｍの炭酸ナトリウムを含有する溶液を添加することにより、７．００で維持した。すべての培養物の温度を、バッチの最初の４日間３７度に維持した。バッチの４日目に、すべてのバイオリアクターの温度を３１度に下げ、バッチ期間中この温度を維持した。対照およびフェドバッチ培養物に、８％、１２％および８％の総リアクター容量のフィード培地を、それぞれ、５、７および１０日目にフィードした。
【０１８８】
１）対照
− インキュベーション培地、培地７（表１３を参照）
− フィード培地８を５、７および１０日目にフィード（表１３を参照）
− ５ｍＭのグルタミンを４日目にフィード
− 温度を４日目に３１℃に下げる
２）フェドバッチグルタミン欠乏
− インキュベーション培地、４ｍＭのグルタミンだけを有する培地７（表１３を参照）
− グルタミン無しの培地８を、５、７および１０日目にフィード（表１３を参照）．
− ４日目に非グルタミンフィード
− 温度を４日目に３１℃に下げる
３）バッチグルタミン欠乏
− インキュベーション培地、４ｍＭのグルタミンだけを揺する新規バッチ培地（表１３を参照）
− フィード培地無し
− 非グルタミンフィード
− 温度を４日目に３１℃に下げる
− ８日目に５ｇ／Ｌのグルコースを加える
４）８日目に補給されるバッチグルタミン欠乏
− インキュベーション培地、４ｍＭのグルタミンだけを有する新規培地（表１３を参照）
− フィード培地無し
− グルタミンフィード無し
− ４日目に温度を３１℃に下げる
− ８日目に、４ｇのグルコース、３７５ｍｇのアスパラギン、３ｍＬの１ｍＭのＦｅＳＯ４ストック、３．３３ｍＬの５ｇ／ＬのＮｕｃｅｌｌｉｎ（登録商標）ストック、２．５７ｍＬの３６ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾンおよび１．０ｇ／Ｌプトレシンストック溶液、０．２３ｍＬの５０ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムストックおよび１３．１ｍｇのチアミンを加える。
【０１８９】
【表１３−１】
【０１９０】
【表１３−２】
【０１９１】
結果および結論
最初の４日間の細胞成長は、対照とバッチプロセスにおいて同様であるが、グルタミン欠乏フェドバッチプロセスは、細胞密度が有意に低く、バッチ後には少し低めであった。両方のバッチプロセスは、恐らく、有意な希釈が無かったために、バッチ期間中、高い細胞密度を維持した（図２５を参照）。すべての培養物の生存率は、８日目まで同じであった。しかしながら、１１日目に、補給がないバッチプロセスの生存率は、他の３つのバイオリアクターよりも低く、最終日までに有意に減少することに注目することは興味深い。このことは、補給バッチプロセスがフェドバッチバイオリアクターと同様の生存率を示しているので、バッチ培地はさらに最適化されうることを示唆している（図２６を参照）。
【０１９２】
グルタミン不足バッチプロセスまたはグルタミン不足フェドバッチプロセスにおいて培養した細胞は、対照フェドバッチプロセスにおいて培養された同じ細胞よりも、生産性において優れていた。対照フェドバッチプロセスは、予想通り、６８５μｇ／ｍＬの採取日力価を有していたが、グルタミン欠乏フェドバッチプロセスは、１０８０μｇ／ｍＬの採取力価を有しており、対照よりも約５８％高かった。これは、前に見られた結果と同様である。グルタミン欠乏非補給バッチプロセスは、９６０μｇ／ｍＬの採取日力価を有しており、グルタミン欠乏フェドバッチプロセスと同様に対照よりも４０％高かったが、補給グルタミン欠乏バッチプロセスは、最も高い採取力価、１２９６μｇ／ｍＬを有していた。これは、対照よりも８９％増加している（図２７を参照）。
【０１９３】
４つの条件での阻害剤レベルを分析した場合、その結果は、３つすべてのグルタミン欠乏プロセスにおける乳酸およびアンモニウムレベルが対照よりも有意に低いことを示していた。実際、４日後、これらの３つの条件は、乳酸の産生が停止するか、または乳酸の消費が開始されたが、対照はバッチ期間中乳酸を産生し続けた（図２８を参照）。予想通り、アンモニアレベルは、グルタミン欠乏プロセスにおいて非常に低く、４日後に低下したが、対照はアンモニアを生産し続けた（図２９を参照）。
【０１９４】
この実施例において、グルタミン欠乏法をバッチプロセスと組み合わせると、フェドバッチプロセスよりも、抗ＧＤＦ−８細胞の生産性が４０％向上した。また、データは、バッチ培地を最適化することにより、生産性を約２倍改善しうることを示唆している。この生産性の改善は、２つの因子に起因しうる。第１は、グルタミン欠乏が、直接生産性を向上させるか、またはアンモニアおよび乳酸レベルを非常に低く保つことにより生産性を向上させる。第２に、フィードがないので、力価がバッチ期間中に薄まらない。バッチプロセスの本来の操作の容易さに加え、高い生産性により、バッチプロセスは組み換えポリペプチドの生産において魅力ある選択肢である。
【０１９５】
実施例８：バッチ中のグルタミンおよびアスパラギン濃度の抗ＧＤＦ−８細胞培養プロセスに対する影響
実施例２、５および６において、グルタミン欠乏が、２つの細胞において、フェドバッチ培養に、細胞成長、細胞生存率および力価の増加ならびに乳酸塩およびアンモニウムの産生の減少を含む有益性をもたらすことが実証された。また、アスパラギンもバッチ培地において同様の役割を果たすと考えられる。
【０１９６】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、異なる濃度のグルタミンおよびアスパラギンを有する修飾培地９において、１Ｌのバイオリアクター中で１２日間培養した。基本培地９の組成を表１４に示す。この基本組成の実験バリエーションを、表１５に示す。培養物を、温度コントロールの問題のために最初の日に３０℃であってリアクター４を除き、最初の５日間３７℃でインキュベートした。培養物を、６日目に３１℃にした。７日目に、培養物に、１回、グルタミンを欠く５体積％の培地５をフィードした。培養物を、毎日、細胞密度、抗ＧＤＦ−８力価、乳酸塩およびアンモニウムレベルに関して測定した。
【０１９７】
【表１４−１】
【０１９８】
【表１４−２】
【０１９９】
【表１５】
【０２００】
結果および結論
図３０、３１、３２および３３は、それぞれ、種々の実験条件下での実験における、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長、抗ＧＤＦ−８力価、乳酸レベルおよびアンモニウムレベルを示す。
【０２０１】
すべての実験条件下で、４ｍＭのグルタミンが、１ｍＭのグルタミンよりも、試験したすべてのアスパラギンレベルで良好であった。同等のグルタミンレベルで、１２ｍＭおよび２０ｍＭアスパラギン条件が、８ｍＭアスパラギン条件よりも良好であった。乳酸塩およびＮＨ４レベルの減少が、すべての試験条件の培養の終わりに観察された。
【０２０２】
実施例９．バッチ培地におけるグルタミンおよびアスパラギン濃度の抗ＧＤＦ−８細胞培養プロセスに対する影響
実施例８において、アスパラギンレベルに拘わらず、初期濃度４ｍＭのグルタミンを含有する培地９が、１ｍＭのグルタミンを含有する培地よりも良好であることが実証された。この実施例は、１３ｍＭグルタミンレベルおよび種々のアスパラギンレベルを含有する培地の影響を実証する。
【０２０３】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、表１６に示す異なる濃度のグルタミンおよびアスパラギンを有する修飾培地９において、１Ｌバイオリアクター中で１２日間培養した。この培養物を、最初の３日間３７℃でインキュベートした。ついで、培養物を、４日目に３１℃にシフトした。７日目に、培養物に、１回、グルタミンを欠く５体積％の培地５をフィードした。培養物を、毎日、細胞密度、細胞生存率、乳酸塩、アンモニウムレベルおよびグルタミンレベル、抗ＧＤＦ−８力価およびオスモル濃度に関して測定した。
【０２０４】
【表１６】
【０２０５】
結果および結論
図３４、３５、３６、３７、３８、３９および４０は、それぞれ、それぞれ、種々の実験条件下での実験における、抗ＧＤＦ−８細胞の細胞成長、抗ＧＤＦ−８細胞の生存率パーセント、乳酸レベル、アンモニウムレベル、グルタミンレベル、抗ＧＤＦ−８力価およびオスモル濃度を示す。
【０２０６】
試験したすべての条件下の中で、１３ｍＭのグルタミンおよび２０ｍＭのアスパラギンを含有する培地９だけが、細胞成長および力価に対して有意な悪影響を示した。グルタミンは、４ｍＭまたは１３ｍＭのグルタミンで開始されたかどうかに拘わらず、ほとんど同時期にすべての培養物で使い果たされた。最も高い抗ＧＤＦ−８力価は、１３ｍＭのグルタミンおよび１２ｍＭのアスパラギンを含有する培養物で得られる。すべての培養条件は、培養の終わり付近で、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示す。アンモニウムレベルは、１３ｍＭのグルタミンおよび２０ｍＭのアスパラギンを含有する培地において最も高い。
【０２０７】
実施例１０：アスパラギンおよびシステインレベルの、培地９で培養された抗ＧＤＦ−８細胞における低い乳酸塩およびアンモニウムレベルに対する影響
実施例２、５および６において、グルタミン欠乏条件下で成長した培養物が、培養プロセスの最後に、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示すことが見出された。しかしながら、非グルタミン欠乏条件下で培地９にて成長した培養物が、培養プロセスの最後に、さらに低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した。この効果は、グルタミン欠乏が乳酸塩およびアンモニウムのレベルの低下に必要であると考えられる培地１のような他の培地では観察されなかった。培地９と培地１は、アスパラギン（培地９において２０ｍＭに対して、培地１＋フィードで合計１１ｍＭ）および酸性システイン（培地９において１．５ｍＭに対して、培地１において０．９５ｍＭ）のレベルの点で異なる。この実施例は、これら２つの成分が培養の終わりで観察される乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関与するかどうかを試験する。
【０２０８】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクターで１２日間培養した。細胞を、最初に３７℃で培養し、４日目または５日目に、８〜１０×１０６／ｍｌで、３１℃にシフトした。表１７に、試験した種々の実験条件を示す。試料を毎日採取し、力価分析をタンパク質Ａ ＨＰＬＣで行った。
【０２０９】
【表１７】
【０２１０】
結果および結論
培地９において成長した抗ＧＤＦ−８細胞は、培養を４ｍＭまたは１３ｍＭのグルタミンのいずれかで開始したかに拘わらず、培養工程の最後で、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した（図４２および４３を参照）。対照的に、培地１は、培養が４ｍＭのグルタミンで開始された場合にのみ培養工程の最後で、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した（図４２および４３を参照）。追加のアスパラギンおよびシステインを１３ｍＭのグルタミンを含有する培地１に添加すると、培養工程の最後で、乳酸塩およびアンモニウムレベルは低くなかった（図４２および４３を参照）。
【０２１１】
培養工程の終わりに低い乳酸塩およびアンモニウムレベル培養物（４ｍＭのグルタミンを有する培地１、４ｍＭのグルタミンを有する培地９および１３ｍＭのグルタミンを有する培地９）は、また、培養工程の終わりに低い総オスモル濃度を有することが示された（図４７を参照）。
【０２１２】
４ｍＭのグルタミンを有する培地９は、最も高い抗ＧＤＦ−８力価を示し、ついで、４日目にフィードされる１３ｍＭのグルタミンを有する培地９が高かった（図４６を参照）。フィードによる希釈の影響を考慮すると、４ｍＭのグルタミンを含有する培地９は、１３ｍＭのグルタミンを含有する培地９と、等価の抗ＧＤＦ−８力価を有していた。
【０２１３】
実施例１１：培地９において培養された抗ＧＤＦ−８細胞において観察された乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に対する、アミノ酸およびビタミンレベルの影響
実施例１０は、培地１および培地９間のアスパラギンおよびシステインレベルの違いが、グルタミンが欠乏していない培地９における培養工程の最後での乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関係しているかどうかを試験する。これらの因子が観察された減少に関与していないことが示された。培地１および培地９は、また、これらのアミノ酸およびビタミン濃度が異なる。この実施例は、２つの培地間のアミノ酸およびビタミン濃度の違いが、観察された減少に関係しているかどうかを試験する。
【０２１４】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクター中で１２日間試験した。細胞を、最初に３７℃で培養し、４日目に８〜１０×１０６／ｍｌで３１℃にシフトした。表１８に、種々の試験した実験条件を示す。アミノ酸、ビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅ（組成を表１９に示す）および鉄を、種々の実験培地１条件に加え、これらの成分のレベルを培地９のレベルと等しくした。試料を毎日採取し、タンパク質Ａ ＨＰＬＣにより力価分析を行った。
【０２１５】
【表１８】
【０２１６】
【表１９】
【０２１７】
結果および結論
試験したすべての条件は、付加的なアミノ酸を含有する培地１を除いて培養工程の最後に、低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示し、培地１と比較して高い培地９のアミノ酸レベルは、恐らく、乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関与していないことを示している（図４９および５０を参照）。しかしながら、付加的なビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地１は、付加的なアミノ酸を含有する培地１を比較して、培養工程の最後に、より低い乳酸塩およびアンモニウムレベルを示した（図４９および５０を参照）。これは、これらの成分が、培地９で観察された減少に関与しうることを示している。
【０２１８】
付加的なビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅおよび鉄を含有する培地１で成長した培養物は、出発培地においてアスパラギンおよびグルタミンの総量がより低いために、実験全体において最も低いレベルのアンモニウムを示した（図５０を参照）。
【０２１９】
実施例１２：ビタミン、微量元素Ｅおよび鉄レベルの、培地９で培養された抗ＧＤＦ−８細胞において観察された乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に対する影響
実施例１１において、培地１に対して高いレベルの培地９におけるビタミン、ヒドロコルチゾンおよびプトレシン、微量元素Ｅおよび鉄は、培養工程の最後に観察される乳酸塩およびアンモニウムレベルの減少に関与しうることが決定された。ここでは、これらの成分を、個々におよび組み合わせて、減少に影響を与えるかを決定するために試験する。
【０２２０】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクター中で１２日間培養した。細胞を、最初３７℃で培養し、４日目に約６×１０６細胞／ｍｌでシフトする、微量元素Ｅを含有する培地１を除いて、４日目に８〜１０×１０６細胞／ｍｌで３１℃にシフトした。表２０に、試験した種々の実験条件を示す。ヒドロコルチゾンおよびプトレシンを、すべての培地１条件に加え、これらの成分のレベルを培地９のレベルと等しくした。ビタミン、微量元素Ｅ（組成は表１９に示す）および鉄を種々の実験培地１条件に加え、これらの成分のレベルを培地９のレベルと等しくした。試料を毎日採取し、タンパク質Ａ ＨＰＬＣにより力価分析を行った。
【０２２１】
【表２０】
【０２２２】
結果および結論
試験したすべての条件の内、１３ｍＭのグルタミンを含有する培地９および微量元素Ｅを含有する培地１だけが、培養工程の最後で、乳酸塩およびアンモニウムのレベルの減少を示した（図５４および５５を参照）。微量元素Ｅを含有する培地１で観察されたレベルの減少は、この培養物が、細胞が約６×１０６細胞／ｍＬである時に温度シフトされた事実によるものでありうることを注意すべきである。
１３ｍＭのグルタミンを含有する培地９は、培地１構成物より高い抗ＧＤＦ−８力価を示した。
【０２２３】
実施例１３：培地１、３および９の細胞成長および抗ＧＤＦ−８力価に関する比較
この実験は、培地１、３および９を用いる細胞成長および抗ＧＤＦ−８力価の違いを測定するために行った。
【０２２４】
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞は、種々の培地、表２１に記載のフィード条件下で培養した。関連する培地の情報を表２２に示す。細胞を１Ｌのバイオリアクター中で１２日間成長させ、４日目に３７℃から３１℃にシフトした。
【０２２５】
【表２１】
【０２２６】
【表２２】
【０２２７】
結果および結論
培地９で培養した抗ＧＤＦ−８細胞は、最も高い細胞密度および抗ＧＤＦ−８力価を示し、一方、培地３で培養した抗ＧＤＦ−８細胞は、最も低い細胞密度および抗ＧＤＦ−８力価を示した（図５７および５８を参照）。培地９が培地１よりも結果が優れているという事実から、複数回フィードにより培地成分を供給するより、むしろ出発培地に培地成分を提供することがより好ましいことが示されている。加えて、培地１および培地９の両方が、培地３よりも良好に行われるという事実から、７０ｍＭ未満の濃度でアミノ酸を提供するよりも、約７０ｍＭより高い濃度でアミノ酸を提供することがより優れた結果をもたらすことが示されている。最後に、約７０ｍＭより高い濃度で出発物質にアミノ酸を提供することが、最も高い細胞密度および力価を与えた（培地１と培地９を比較した）。
【０２２８】
実施例１４：バイオリアクターにおける抗ＧＤＦ−８細胞培養に関する培地９における最適なグルタミンおよびアスパラギン総レベルの統計的分析
物質および方法
抗ＧＤＦ−８細胞を、１Ｌのバイオリアクター中で培養し、表２３に示す日に３７℃から３１℃にシフトした。最終力価を、グルタミン単独の最適レベルおよびグルタミンおよびアスパラギンを合わせた最適レベルを決定するために、Ｔ−テストに付した。表２３に、培地９で成長した抗ＧＤＦ−８細胞の関連実験条件および最終結果を要約した。
【０２２９】
【表２３】
【０２３０】
結果および結論
図５９は、種々のレベルのグルタミン単独およびグルタミンおよびアスパラギンの組合せの推定抗ＧＤＦ−８力価を示す。表２４は、２〜１５ｍＭのグルタミンレベルおよびこの範囲外のグルタミンレベルの標準化力価を比較する、Ｔ−試験の結果を示す。表２５は、１６〜３６ｍＭのグルタミンおよびアスパラギンレベルの組合せおよびこの範囲外のレベルのグルタミンおよびアスパラギンの組合せを比較するＴ−試験の結果を示す。
【０２３１】
両方のＴ−試験結果は、比較した２つの群の間の抗ＧＤＦ−８力価に有意な違いがることを示している。２〜１５ｍＭのグルタミンおよび１６〜３６ｍＭのグルタミンおよびアスパラギンの組合せを含有する培地９において成長した培養物は、これらの範囲外のグルタミンおよびグルタミンおよびアスパラギン組合せレベルを有する培地において成長した培地よりも、より高い抗ＧＤＦ−８力価を示す。すべての実験において、アスパラギンレベルは、９ｍＭよりも高かった。
【０２３２】
【表２４】
【０２３３】
【表２５】
【０２３４】
実施例１５：培地の細胞培養物に対する影響
この実施例は、高密度播種培養物を用いる中規模での３つの細胞培養培地バリエーションの能力を評価する。試験したすべての培地は、小規模バイオリアクターデータに基づいて、フェーズ１培地（培地１１フィード培地をフィードした培地１０）において改善が見られることが期待された。
【０２３５】
物質および方法
ヒト化抗ＡベータペプチドＩｇＧ１モノクローナル抗体（「抗Ａベータ細胞」）を発現するＣＨＯ細胞を、表２６に示すように、種々の培地で試験した（Basi et al., Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide、ＷＯ０２／４６２３７を参照）。ｐＨの下点を、フェーズ１を除いて０．９５ＭのＮａ２ＣＯ３＋０．０５ＭのＫ２ＣＯ３で制御して７．０に設定し、フェーズ１は、０．５８Ｍの重炭酸ナトリウムおよび０．７１Ｍの炭酸ナトリウムを含有する溶液で制御した。溶存酸素を、必要により空気を散布することにより３０％に制御し、６０ｒｐｍで撹拌し、フィード培地は培地５（上記のように、グルタミンを含む、または含まない）であった。０３Ｐ４９Ｂ５０１を除くすべての培養物を１３０Ｌ規模で成長させ、０３Ｐ４９Ｂ５０１は５００Ｌ規模で成長させた。簡単には、培地１は、相対的な取り込み速度の考慮なしにすべての栄養物が豊富であり、一方、培地１２は、栄養分が無差別に豊富なバージョンから明らかに不必要な栄養分を除去することによりバランスをとった。培地１０、１１および１２の比較を表２７に示す。
【０２３６】
【表２６】
【０２３７】
【表２７−１】
【０２３８】
【表２７−２】
【０２３９】
【表２７−３】
【０２４０】
結果および結論
これらの実験を通じて、培地の変更により一様に改善された。細胞成長、生存率、低乳酸レベル、低アンモニウムレベルおよび力価の点で、低グルタミンレベルは、高いもの（図６０〜６４を参照）よりもより優れており、バランス化（バッチ）培地は、リッチ培地（培地１、図６０〜６４を参照）よりも優れていた。高密度接種で開始した培養物は、低密度接種で開始した培養物よりも高い最終力価を示した（図６４を参照）。
【０２４１】
小規模バイオリアクターにおいて観察されるものとは異なって、第１の培地（高Ｇｌｎを有する培地１）は、オリジナルプロセスよりも低い力価であった（図６４を参照）。また、温度変化後の乳酸塩取り込みのシフトはなかった（図６２を参照）。これは、この培地である程度の規模感受性が存在しうることを示唆している。この結論は、これらの中間規模実験と同様に、小規模（２Ｌ）並列運転によって指示されている（データは示していない）。グルタミンをあまり含まない後の培地組成は、規模に対して、少なくともこれらの実験において感受性がなかった（図６０〜６５を参照）。プロセスの繰り返し（バッチ２および３およびバッチ５および６）は、非常によい再現性を示しており（図６０〜６５を参照）、この計画で得られたすべてのデータは信頼性が高い。
【０２４２】
実施例１６：培地９を用いるＴＮＦＲ−Ｉｇの産生
物質および方法
ＩｇＧ１のＦｃ部位に結合したヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド−結合部からなる二量体融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞（「ＴＮＦＲ−Ｉｇ細胞」）を、潅流バイオリアクターから高密度で播種し、生産バイオリアクター工程に関して培地９で３×１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。
【０２４３】
結果および結論
図６６、６７、６８、６９、７０、７１および７２は、それぞれ、細胞成長、細胞生存率、残存グルコース、グルタミンレベル、乳酸塩濃度、アンモニウム濃度および相対生産力価を示す。プロセスの軽い修飾の範囲では、すべての条件で、良好な細胞成長、高い細胞生存率および高い総最終力価が得られた。
【０２４４】
この実験のすべての条件に関して、代謝阻害性副産物の乳酸塩を消費するか、または濃度を頭打ちにし、乳酸塩産生を阻害することを示唆している。同様に、阻害性代謝産物アンモニウムに関して、濃度は最初に増加するが、温度シフト後しばらくして、アンモニウムは細胞により消費され始める。この実施例において、ＴＮＦＲ−Ｉｇ細胞培養物を、化学誘導物、酪酸ナトリウムおよびＨＭＢＡに付した。
【０２４５】
実施例１７．大規模および小規模培養条件の比較
物質および方法
培養のサイズが、関連する培養特性に影響を与えるかどうかを決定するために、抗ＧＤＦ−８細胞を、小規模１リットルバイオリアクターまたは大規模６０００リットルバイオリアクターで成長させた。細胞を３７℃で成長させ、４日目に３１℃にシフトした。
【０２４６】
結果および結論
図７３、７４、７５および７６（それぞれ、細胞密度、力価、乳酸レベルおよびアンモニウムレベルを示す）に見ることができるように、６０００リットルの大規模および１リットルの小規模培養間にこれらの特定に関して違いはなかった。乳酸塩およびアンモニウムレベルの両方とも、４日目に温度をシフトした後減少が始まった。これらの実施例は、培養物が同様の成長条件に付される場合、培養の規模が、細胞密度、細胞生存率、乳酸レベルおよびアンモニウムレベルに影響を与えないことを実証している。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
（原文に記載無し）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項２】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項３】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞；および
累積アスパラギンに対する比が約２未満であるモル累積グルタミンを含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地、（ｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下で第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項４】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
総累積アミノ酸に対する比が約０．２未満であるモル累積グルタミンを含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項５】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
総累積アミノ酸に対する比が約０．４〜１であるモル累積無機イオンを含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項６】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７】
少なくとも１つの培養条件を変更する工程における該細胞培養条件が、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該培地の初期グルタミン濃度が１３ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該培地の初期グルタミン濃度が１０ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該培地の初期グルタミン濃度が７ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該培地の初期グルタミン濃度が４ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が１３ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が１０ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が７ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が４ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
グルタミンが、細胞培養の開始時に初期培地にのみ与えられる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
培地における溶解鉄濃度が５μＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該培養の生存細胞密度を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
該培養の生存率を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該培地の該乳酸レベルを定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
該培養の該アンモニウムレベルを定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
該培養の該力価を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
該培養のオスモル濃度を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
該測定が毎日行われる、請求項１８〜２３記載の方法。
【請求項２５】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０２細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０３細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０４細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０５細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０６細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも５×１０６細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも１０×１０６細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
供給工程が少なくとも約１０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
供給工程が少なくとも約２５００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
供給工程が少なくとも約５０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
供給工程が少なくとも約８０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
供給工程が少なくとも約１０，０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
供給工程が少なくとも約１２，０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
該第１の条件が約３０〜４２℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
該第１の条件が約３２〜４０℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
該第１の条件が約３４〜３８℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
該第１の条件が約３６〜３７℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
該第１の条件が約３７℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
該第２の条件が約２５〜４１℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
該第２の条件が約２７〜３８℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４５】
該第２の条件が約２９〜３５℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４６】
該第２の条件が約２９〜３３℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４７】
該第２の条件が約３０〜３２℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４８】
該第２の条件が約３１℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４９】
さらに、少なくとも１つの培養条件を変更する第１の変更に続く、少なくとも１つの培養条件を変更し、第３の条件を培養物に適用する第２の変更段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５０】
第２の変更段階が、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびその組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの培養条件を変更することを含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該第３の条件が約２５〜４０℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
該第３の条件が約２７〜３７℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
該第３の条件が約２９〜３４℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
該第３の条件が約３０〜３２℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
該第１の期間が０〜８日である、請求項１記載の方法。
【請求項５６】
該第１の期間が１〜７日である、請求項１記載の方法。
【請求項５７】
該第１の期間が２〜６日である、請求項１記載の方法。
【請求項５８】
該第１の期間が３〜５日である、請求項１記載の方法。
【請求項５９】
該第１の期間が約４日である、請求項１記載の方法。
【請求項６０】
該第１の期間が約５日である、請求項１記載の方法。
【請求項６１】
該第１の期間が約６日である、請求項１記載の方法。
【請求項６２】
該第１の期間と第２の期間の合計が少なくとも５日である、請求項１記載の方法。
【請求項６３】
第２の期間、該培養物を維持する工程において、培地における乳酸レベルが最大限のレベルに到達した後に減少する、請求項１記載の方法。
【請求項６４】
第２の期間、該培養物を維持する工程において、培地におけるアンモニウムレベルが最大限のレベルに到達した後に減少する、請求項１記載の方法。
【請求項６５】
該生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの総量が、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの量の少なくとも１．５倍を超える、請求項１記載の方法。
【請求項６６】
該生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの総量が、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの量の少なくとも２倍を超える、請求項１記載の方法。
【請求項６７】
さらに、該細胞培養物に補足成分を供給する、請求項１記載の方法。
【請求項６８】
該補足成分を複数回供給する、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
該補足成分が、ホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンまたはリン酸イオン）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質またはグルコースあるいは他のエネルギー源からなる群から選択される、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比、およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度からなる群から選択される少なくとも２つの培地特性を有する合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７１】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度からなる群から選択される少なくとも３つの培地特性を有する合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％内で該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７２】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度からなる群から選択される少なくとも４つの培地特性を有する合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％内で該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７３】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比、およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度により特徴付けられる合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７４】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を有する培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％内で該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７５】
該培地が、グルタミンを含有し、（ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、（ｉｉ）約２未満の出発アスパラギンに対する出発グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の出発総アミノ酸に対するモル出発グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の出発総アミノ酸に対するモル出発無機イオン比、（ｖ）約１６ｍＭを超える出発グルタミンと出発アスパラギンの組合せ濃度、およびその組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７６】
該乳酸レベルが、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で観察される乳酸レベルよりも低く、
該アンモニウムレベルが、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で観察されるアンモニウムレベルよりも低く、
生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの総量が、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で観察される量より少なくとも多い、
請求項１〜６または７０〜７５いずれか１項記載の方法。
【請求項７７】
該培養物に、該ＴＮＦＲ−Ｉｇの生産の間さらなる成分を補足しない、請求項１記載の方法。
【請求項７８】
該培養物に、該ＴＮＦＲ−Ｉｇの生産の間さらなるグルタミンを補足しない、請求項１記載の方法。
【請求項７９】
該培養物におけるグルタミン濃度が、第２の培養条件に変更する段階の前に実質的に無くなる、請求項１記載の方法。
【請求項８０】
該培養物におけるグルタミン濃度が、第２の培養条件に変更する段階とほぼ同時に実質的に無くなる、請求項１記載の方法。
【請求項８１】
該培養物において、グルタミンの代わりにグリシルグルタミンを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項８２】
該培地が、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）累積アスパラギンに対して約２未満の比であるモル累積グルタミン、（ｉｉｉ）総累積アミノ酸に対して約０．２未満の比であるモル累積グルタミン、（ｉｖ）総累積アミノ酸に対して約０．４〜１の比であるモル累積無機イオンおよび（ｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項８３】
該培地が、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）総累積アミノ酸に対して約０．２未満の比であるモル累積グルタミン、（ｉｉｉ）総累積アミノ酸に対して約０．４〜１の比であるモル累積無機イオンおよび（ｉｖ）約１６ａｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項８４】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの総累積量が約２５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８５】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの総累積量が約３５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８６】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの初期総量が約２５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８７】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの初期総量が約３５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８８】
該培地が：
（ｉ）約１．７ｍＭを超える、単位体積あたりのヒスチジンの総累積量；
（ｉｉ）約３．５ｍＭを超える、単位体積あたりのイソロイシンの総累積量；
（ｉｉｉ）約５．５ｍＭを超える、単位体積あたりのロイシンの総累積量；
（ｉｖ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのメチオニンの総累積量；
（ｖ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのフェニルアラニンの総累積量；
（ｖｉ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの総累積量；
（ｖｉｉ）約１．０ｍＭを超える、単位体積あたりのトリプトファンの総累積量；
（ｖｉｉｉ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのチロシンの総累積量；および
（ｉｘ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの総累積量、
からなる群から選択される培地特性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項８９】
該培地が：
（ｉ）約１．７ｍＭを超える、単位体積あたりのヒスチジンの初期容量；
（ｉｉ）約３．５ｍＭを超える、単位体積あたりのイソロイシンの初期容量；
（ｉｉｉ）約５．５ｍＭを超える、単位体積あたりのロイシンの初期容量；
（ｉｖ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのメチオニンの初期容量；
（ｖ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのフェニルアラニンの初期容量；
（ｖｉ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの初期容量；
（ｖｉｉ）約１．０ｍＭを超える、単位体積あたりのトリプトファンの初期容量；
（ｖｉｉｉ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのチロシンの初期容量；および
（ｉｘ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの初期容量、
からなる群から選択される培地特性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項９０】
該培地における単位体積あたりのセリンの総累積量が約７ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９１】
該培地における単位体積あたりのセリンの総累積量が約１０ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９２】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約８ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９３】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約１２ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９４】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約８ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９５】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約１２ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９６】
該培地における単位体積あたりのリンの総累積量が約２．５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９７】
該培地における単位体積あたりのリンの総累積量が約５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９８】
該培地における単位体積あたりのグルタミン酸塩の総累積量が約１ｍＭ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項９９】
該培地における単位体積あたりのパントテン酸カルシウムの総累積量が約８ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１００】
該培地における単位体積あたりのパントテン酸カルシウムの総累積量が約２０ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０１】
該培地における単位体積あたりのニコチンアミドの総累積量が約７ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０２】
該培地における単位体積あたりのニコチンアミドの総累積量が約２５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０３】
該培地における単位体積あたりのピリドキシンおよびピリドキサルの総累積量が約５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０４】
該培地における単位体積あたりのピリドキシンおよびピリドキサルの総累積量が約３５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０５】
該培地における単位体積あたりのリボフラビンの総累積量が約１．０ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０６】
該培地における単位体積あたりのリボフラビンの総累積量が約２．０ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０７】
該培地における単位体積あたりのチアミン塩酸塩の総累積量が約７ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０８】
該培地における単位体積あたりのチアミン塩酸塩の総累積量が約３５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項２】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項３】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞；および
累積アスパラギンに対する比が約２未満であるモル累積グルタミンを含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地、（ｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下で第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項４】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
総累積アミノ酸に対する比が約０．２未満であるモル累積グルタミンを含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項５】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
総累積アミノ酸に対する比が約０．４〜１であるモル累積無機イオンを含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量を含有する培地、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項６】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含有する培地；
ここに、該培地は、グルタミンを含有し；
さらに、該培地は、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）約２未満の累積アスパラギンに対するモル累積グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の総累積アミノ酸に対するモル累積グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の総累積アミノ酸に対するモル累積無機イオン比、およびその組合せからなる群から選択される２つの培地特性を有する；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生存細胞密度まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７】
少なくとも１つの培養条件を変更する工程における該細胞培養条件が、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該培地の初期グルタミン濃度が１３ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該培地の初期グルタミン濃度が１０ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該培地の初期グルタミン濃度が７ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該培地の初期グルタミン濃度が４ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が１３ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が１０ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が７ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該培地のグルタミンの単位体積あたりの総累積量が４ｍＭ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
グルタミンが、細胞培養の開始時に初期培地にのみ与えられる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
培地における溶解鉄濃度が５μＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該培養の生存細胞密度を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
該培養の生存率を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該培地の該乳酸レベルを定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
該培養の該アンモニウムレベルを定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
該培養の該力価を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
該培養のオスモル濃度を定期的に測定する、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
該測定が毎日行われる、請求項１８〜２３記載の方法。
【請求項２５】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０２細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０３細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０４細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０５細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも２×１０６細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも５×１０６細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
該哺乳動物細胞の初期密度が少なくとも１０×１０６細胞／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
供給工程が少なくとも約１０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
供給工程が少なくとも約２５００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
供給工程が少なくとも約５０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
供給工程が少なくとも約８０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
供給工程が少なくとも約１０，０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
供給工程が少なくとも約１２，０００Ｌの培養物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
該第１の条件が約３０〜４２℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
該第１の条件が約３２〜４０℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
該第１の条件が約３４〜３８℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
該第１の条件が約３６〜３７℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
該第１の条件が約３７℃の第１の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
該第２の条件が約２５〜４１℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
該第２の条件が約２７〜３８℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４５】
該第２の条件が約２９〜３５℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４６】
該第２の条件が約２９〜３３℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４７】
該第２の条件が約３０〜３２℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４８】
該第２の条件が約３１℃の第２の温度範囲を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４９】
さらに、少なくとも１つの培養条件を変更する第１の変更に続く、少なくとも１つの培養条件を変更し、第３の条件を培養物に適用する第２の変更段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５０】
第２の変更段階が、（ｉ）温度、（ｉｉ）ｐＨ、（ｉｉｉ）重量オスモル濃度、（ｉｖ）化学誘導剤レベル、およびその組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの培養条件を変更することを含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該第３の条件が約２５〜４０℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
該第３の条件が約２７〜３７℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
該第３の条件が約２９〜３４℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
該第３の条件が約３０〜３２℃の第３の温度範囲を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
該第１の期間が０〜８日である、請求項１記載の方法。
【請求項５６】
該第１の期間が１〜７日である、請求項１記載の方法。
【請求項５７】
該第１の期間が２〜６日である、請求項１記載の方法。
【請求項５８】
該第１の期間が３〜５日である、請求項１記載の方法。
【請求項５９】
該第１の期間が約４日である、請求項１記載の方法。
【請求項６０】
該第１の期間が約５日である、請求項１記載の方法。
【請求項６１】
該第１の期間が約６日である、請求項１記載の方法。
【請求項６２】
該第１の期間と第２の期間の合計が少なくとも５日である、請求項１記載の方法。
【請求項６３】
第２の期間、該培養物を維持する工程において、培地における乳酸レベルが最大限のレベルに到達した後に減少する、請求項１記載の方法。
【請求項６４】
第２の期間、該培養物を維持する工程において、培地におけるアンモニウムレベルが最大限のレベルに到達した後に減少する、請求項１記載の方法。
【請求項６５】
該生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの総量が、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの量の少なくとも１．５倍を超える、請求項１記載の方法。
【請求項６６】
該生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの総量が、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの量の少なくとも２倍を超える、請求項１記載の方法。
【請求項６７】
さらに、該細胞培養物に補足成分を供給する、請求項１記載の方法。
【請求項６８】
該補足成分を複数回供給する、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
該補足成分が、ホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンまたはリン酸イオン）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質またはグルコースあるいは他のエネルギー源からなる群から選択される、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比、およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度からなる群から選択される少なくとも２つの培地特性を有する合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７１】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度からなる群から選択される少なくとも３つの培地特性を有する合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％内で該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７２】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度からなる群から選択される少なくとも４つの培地特性を有する合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％内で該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７３】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、ｉｉ）約２未満のアスパラギンに対するモルグルタミン比、ｉｉｉ）約０．２未満の総アミノ酸に対するモルグルタミン比、ｉｖ）約０．４〜１の総アミノ酸に対するモル無機イオン比、およびｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンとアスパラギンの組合せ濃度により特徴付けられる合成培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内まで該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下で該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７４】
大規模生産細胞培養におけるＴＮＦＲ−Ｉｇの製造方法であって、下記工程：
細胞培養条件下で発現し、ＴＮＦＲ−Ｉｇをコードする遺伝子を含有する哺乳動物細胞；および
グルタミンを含有し、約１６ｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を有する培地；
を含む細胞培養物を供給すること；
初期成長フェーズにおいて、該培養物が第１の培養条件下に維持された場合に、可能な最大生存細胞密度の約２０％〜８０％内で該細胞に再生産させるのに十分な第１の期間、第１の培養条件下、該培養物を維持すること；
少なくとも１つの培養条件を変更して、第２の培養条件を適用すること；
第２の条件下、第２の期間、該培養物を維持して、ＴＮＦＲ−Ｉｇを細胞培養物中に堆積させること；
を含む方法。
【請求項７５】
該培地が、グルタミンを含有し、（ｉ）約７０ｍＭを超える出発アミノ酸濃度、（ｉｉ）約２未満の出発アスパラギンに対する出発グルタミン比、（ｉｉｉ）約０．２未満の出発総アミノ酸に対するモル出発グルタミン比、（ｉｖ）約０．４〜１の出発総アミノ酸に対するモル出発無機イオン比、（ｖ）約１６ｍＭを超える出発グルタミンと出発アスパラギンの組合せ濃度、およびその組合せからなる群から選択される培地特性を有する培地を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７６】
該乳酸レベルが、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で観察される乳酸レベルよりも低く、
該アンモニウムレベルが、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で観察されるアンモニウムレベルよりも低く、
生産されたＴＮＦＲ−Ｉｇの総量が、該培地特性を欠くが他は同一の培地における他は同一の条件下で観察される量より少なくとも多い、
請求項１〜６または７０〜７５いずれか１項記載の方法。
【請求項７７】
該培養物に、該ＴＮＦＲ−Ｉｇの生産の間さらなる成分を補足しない、請求項１記載の方法。
【請求項７８】
該培養物に、該ＴＮＦＲ−Ｉｇの生産の間さらなるグルタミンを補足しない、請求項１記載の方法。
【請求項７９】
該培養物におけるグルタミン濃度が、第２の培養条件に変更する段階の前に実質的に無くなる、請求項１記載の方法。
【請求項８０】
該培養物におけるグルタミン濃度が、第２の培養条件に変更する段階とほぼ同時に実質的に無くなる、請求項１記載の方法。
【請求項８１】
該培養物において、グルタミンの代わりにグリシルグルタミンを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項８２】
該培地が、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）累積アスパラギンに対して約２未満の比であるモル累積グルタミン、（ｉｉｉ）総累積アミノ酸に対して約０．２未満の比であるモル累積グルタミン、（ｉｖ）総累積アミノ酸に対して約０．４〜１の比であるモル累積無機イオンおよび（ｖ）約１６ｍＭを超えるグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項８３】
該培地が、（ｉ）約７０ｍＭを超える単位体積あたりの累積アミノ酸量、（ｉｉ）総累積アミノ酸に対して約０．２未満の比であるモル累積グルタミン、（ｉｉｉ）総累積アミノ酸に対して約０．４〜１の比であるモル累積無機イオンおよび（ｉｖ）約１６ａｍＭを超える単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンを合わせた累積量を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項８４】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの総累積量が約２５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８５】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの総累積量が約３５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８６】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの初期総量が約２５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８７】
該培地における、単位体積あたりのヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびプロリンの初期総量が約３５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項８８】
該培地が：
（ｉ）約１．７ｍＭを超える、単位体積あたりのヒスチジンの総累積量；
（ｉｉ）約３．５ｍＭを超える、単位体積あたりのイソロイシンの総累積量；
（ｉｉｉ）約５．５ｍＭを超える、単位体積あたりのロイシンの総累積量；
（ｉｖ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのメチオニンの総累積量；
（ｖ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのフェニルアラニンの総累積量；
（ｖｉ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの総累積量；
（ｖｉｉ）約１．０ｍＭを超える、単位体積あたりのトリプトファンの総累積量；
（ｖｉｉｉ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのチロシンの総累積量；および
（ｉｘ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの総累積量、
からなる群から選択される培地特性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項８９】
該培地が：
（ｉ）約１．７ｍＭを超える、単位体積あたりのヒスチジンの初期容量；
（ｉｉ）約３．５ｍＭを超える、単位体積あたりのイソロイシンの初期容量；
（ｉｉｉ）約５．５ｍＭを超える、単位体積あたりのロイシンの初期容量；
（ｉｖ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのメチオニンの初期容量；
（ｖ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのフェニルアラニンの初期容量；
（ｖｉ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの初期容量；
（ｖｉｉ）約１．０ｍＭを超える、単位体積あたりのトリプトファンの初期容量；
（ｖｉｉｉ）約２．０ｍＭを超える、単位体積あたりのチロシンの初期容量；および
（ｉｘ）約２．５ｍＭを超える、単位体積あたりのプロリンの初期容量、
からなる群から選択される培地特性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項９０】
該培地における単位体積あたりのセリンの総累積量が約７ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９１】
該培地における単位体積あたりのセリンの総累積量が約１０ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９２】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約８ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９３】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約１２ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９４】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約８ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９５】
該培地における単位体積あたりのアスパラギンの総累積量が約１２ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９６】
該培地における単位体積あたりのリンの総累積量が約２．５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９７】
該培地における単位体積あたりのリンの総累積量が約５ｍＭを超える、請求項１記載の方法。
【請求項９８】
該培地における単位体積あたりのグルタミン酸塩の総累積量が約１ｍＭ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項９９】
該培地における単位体積あたりのパントテン酸カルシウムの総累積量が約８ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１００】
該培地における単位体積あたりのパントテン酸カルシウムの総累積量が約２０ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０１】
該培地における単位体積あたりのニコチンアミドの総累積量が約７ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０２】
該培地における単位体積あたりのニコチンアミドの総累積量が約２５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０３】
該培地における単位体積あたりのピリドキシンおよびピリドキサルの総累積量が約５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０４】
該培地における単位体積あたりのピリドキシンおよびピリドキサルの総累積量が約３５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０５】
該培地における単位体積あたりのリボフラビンの総累積量が約１．０ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０６】
該培地における単位体積あたりのリボフラビンの総累積量が約２．０ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０７】
該培地における単位体積あたりのチアミン塩酸塩の総累積量が約７ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【請求項１０８】
該培地における単位体積あたりのチアミン塩酸塩の総累積量が約３５ｍｇ／Ｌを超える、請求項１記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５１１３３０（Ｐ２００８−５１１３３０Ａ）
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３０１６７（Ｐ２００７−５３０１６７）
【出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３０４３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２６４４７
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０７０６３３００）ワイス・リサーチ・アイルランド・リミテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＷＹＥＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＲＥＬＡＮＤ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３０４３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２６４４７
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０７０６３３００）ワイス・リサーチ・アイルランド・リミテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＷＹＥＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＲＥＬＡＮＤ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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