ＴＲＥＭ−１による炎症治療、検出およびモニタリング
本発明は、ＴＲＥＭ−１発現活性／シグナル伝達および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現および／または活性を阻害する／拮抗することによって対象の炎症性疾患／障害を治療する方法を提供する。対象またはそれから得られた試料におけるＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現および／または活性を検出することによって対象の炎症性疾患の存在を検出する方法であって、発現または活性の増加が炎症性疾患を示すところの、方法も含まれる。さらに、本発明は、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）のレベルおよび／または患者もしくは患者からの試料における１種もしくは複数の他のバイオマーカーを検出することによって患者に投与されるＴＲＥＭ−１修飾剤の有効性を評価する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年１１月２日出願の、米国仮特許出願番号第６１／００１，６８７号、２００７年４月１１日出願の、米国仮特許出願番号第６０／９２３，１３１号、２００７年２月２８日出願の、米国仮特許出願番号第６０／９０４，２６４号、および２００７年１月１６日出願の、米国仮特許出願番号第６０／８８０，８０４号の優先権を主張し、その各々の全体開示を、出典明示により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、人口の約１−２％に影響を及ぼす自己免疫炎症性疾患である（Ｆｅｌｄｍａｎ（２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（５）：３６４−３７１；Ｍｏｕｎｔら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４（１）：１１−１２）。ＲＡは、可動関節中の骨および軟骨の慢性炎症および破壊によって特徴付けられる。疾患の発症は、典型的には、２５〜５０歳の年齢であり、３人の患者のうち１人は、２０歳までに重症身体障害者になる。
【０００３】
ＲＡの明確な病因は知られていないが、ＲＡの発症事象が感染事象または環境暴露に関与することが提唱されている（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３ Ｓｕｐｐ．）：Ｓ３９−４４）。先天性免疫の局所誘導は、滑膜表層の細胞を活性化し、遺伝的に感受性の高い個体の次の適応免疫反応の領域を刺激しうる（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３ Ｓｕｐｐ．）：Ｓ３９−４４）。罹患ＲＡ患者の滑膜は、著しい滑膜の血管内膜過形成、血管増生の増加、および下内層における炎症細胞の蓄積によって特徴付けられる。ＲＡ滑膜の生検は、多数の炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の自発的産生を明らかにしている（Ｆｅｌｄｍａｎら（１９９６） Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９７−４４０）。ＴＮＦ−α活性化を中和する抗体は、多数のサイトカインの産生を抑制するので、ＲＡを治療するための新規抗ＴＮＦ（療法を見出された。最近の臨床的所見は、ＲＡの多様性を強調し、さらなる因子が疾患の発症に寄与しうることを示唆する。
【０００４】
骨髄細胞上で発現するトリガー受容体−１（ＴＲＥＭ−１）は、好中球および一部のＣＤ１４ｈｉｇｈ単球上で主に発現する、最近になって同定された免疫グロブリン様細胞表面受容体である（Ｃｏｌｏｎｎａら（２０００） Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）：１２１−２７）。ＴＲＥＭ−１は、短い細胞内ドメインを有し、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達は、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２／ＴｙｐｒｏＢＰを介して媒介される。ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を伴う膜貫通型タンパク質であり、ＴＲＥＭ−１および他の膜貫通型受容体に関連している、アダプタータンパク質として機能する。
【０００５】
ＴＲＥＭ−１発現は、急性炎症中におよび種々のトール様受容体（ＴＬＲ）リガンドによってアップレギュレートされる（Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７；Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８；Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００６） ５４（２）：４５５−６２）。例えば、ＴＲＥＭ−１は、敗血症に付随する急性炎症に関与している（Ｃｏｌｏｎｎａ（２００３） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．３（６）：４４５−５３）。細胞表面および可溶性ＴＲＥＭ−１の発現は、疾患重症度と相関する手法で敗血症において増大する（Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８；Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３３（４）：７９２−９６）。痛風の尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）誘発性炎症モデルにおいて、ＴＲＥＭ−１発現は、浸潤性腹腔マクロファージおよび好中球で急速に誘発される。そのため、ＴＲＥＭ−１の活性化は、複数の炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を刺激する。
【０００６】
さらに、これらのサイトカインの産生におけるＴＲＥＭ−１のＴＬＲおよびＮｏｄ様受容体との相乗効果は、免疫反応を増幅する（Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７；Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８；Ｎｅｔｅａら（２００６） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．８０（６）：１４５４−６１）。これらのデータは、ＴＲＥＭ−１発現の増大およびＴＲＥＭ−１発現細胞の炎症部位への移動が、炎症反応の増幅を介して急性炎症に寄与しうることを示唆する。
【０００７】
急性炎症におけるＴＲＥＭ−１の役割は、ＴＲＥＭ−１細胞外ドメイン−Ｆｃ融合またはＴＲＥＭ−１細胞外ドメインの合成ペプチドを用いてＬＰＳまたはバクテリア誘発性敗血性ショックの致死率からマウスを保護することによってさらに立証された（Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７；Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１１）：１４１９−２６）。ＴＲＥＭ−１−Ｆｃはまた、ザイモサン−Ａ誘発性肉芽腫形成を阻止し、ＴＲＥＭ−１が慢性炎症ならびに急性炎症に関与しうることを示唆する（Ｎｏｃｈｉら（２００３） Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６２（４）：１１９１−２０１）。さらに、累積証拠は、可溶型ＴＲＥＭ−１の濃度を循環させることが、敗血症、肺炎、急性膵炎、および消化性潰瘍疾患を含む、複数の炎症性疾患のバイオマーカーであることを示す（Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３１（４）：５９４−９７；Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８；Ｗａｎｇら（２００４） Ｗｏｒｌｄ Ｊ．ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０（１８）：２７４４−４６；Ｋｏｕｓｓｏｕｌａｓら（２００６） Ｅｕｒ． Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（４）：３７５−７９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎ（２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（５）：３６４−３７１
【非特許文献２】Ｍｏｕｎｔら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４（１）：１１−１２
【非特許文献３】Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３ Ｓｕｐｐ．）：Ｓ３９−４４
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎら（１９９６） Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９７−４４０
【非特許文献５】Ｃｏｌｏｎｎａら（２０００） Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）：１２１−２７
【非特許文献６】Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７
【非特許文献７】Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８；Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００６） ５４（２）：４５５−６２
【非特許文献８】Ｃｏｌｏｎｎａ（２００３） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．３（６）：４４５−５３
【非特許文献９】Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８
【非特許文献１０】Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３３（４）：７９２−９６
【非特許文献１１】Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８
【非特許文献１２】Ｎｅｔｅａら（２００６） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．８０（６）：１４５４−６１
【非特許文献１３】Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１１）：１４１９−２６
【非特許文献１４】Ｎｏｃｈｉら（２００３） Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６２（４）：１１９１−２０１
【非特許文献１５】Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３１（４）：５９４−９７
【非特許文献１６】Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８
【非特許文献１７】Ｗａｎｇら（２００４） Ｗｏｒｌｄ Ｊ．ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０（１８）：２７４４−４６
【非特許文献１８】Ｋｏｕｓｓｏｕｌａｓら（２００６） Ｅｕｒ． Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（４）：３７５−７９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの過剰発現が自己免疫および／または炎症性疾患の存在に関連するという所見に一部基づいている。したがって、ＴＲＥＭ−１および／またはＤａｐ１２／ＴｙｒｏＢＰは、自己免疫および炎症性疾患の治療または予防のための新規の治療標的となる。１の態様において、本発明は、炎症性疾患を治療または予防するためのＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰアンタゴニストの使用に関する。本発明に用いられうるアンタゴニストには、例えば、抗体（例えば、以下にさらに詳細に記載するように、例えば、ヒト、マウス、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むいずれかの種由来の抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体を含む）；可溶性受容体（切断型受容体、天然可溶性受容体、または第２タンパク質、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部と融合する受容体（またはそのフラグメント）を含む融合タンパク質）；ペプチド阻害薬；低分子；リガンド融合；および結合タンパク質が含まれる。ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰはＲＡ患者において過剰発現されるので、これらの遺伝子はＲＡに有効なバイオマーカーとなる。ＴＲＥＭ−１は、特定の細胞型、例えば、好中球および一部の単球上に発現される細胞受容体であり、ＴＲＥＭ−１はまた可溶型で存在する。ＴＲＥＭ−１シグナル伝達は、アダプタータンパク質、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰを介して媒介される。ＴＲＥＭ−１の活性化は、炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を誘導する。したがって、ＴＲＥＭ−１の発現の上昇は、ＲＡ、喘息、および他の炎症性疾患、例えば、慢性炎症性疾患および呼吸器炎症性障害／疾患で観察される炎症をもたらすかまたは寄与しうる。したがって、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、ＲＡおよび他の炎症性障害に付随する症状を治療、調節および／または予防するための有望な治療標的となる。
【００１０】
１の態様において、本発明は、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させることによって、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療方法を提供する。ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させることには、ＴＲＥＭ−１受容体および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達に関与する他の分子（例えば、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ）を修飾、阻害、および／または拮抗することによって、ＴＲＥＭ−１媒介炎症に付随する症状を軽減、治療、予防、緩和および／または改善することが含まれうる。いくつかの実施態様において、ＴＲＥＭ−１タンパク質発現は、ＴＲＥＭ−１転写を阻害することによって；内因性ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡを選択的に切断することによって；または内因性ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって低下する。例えば、ＴＲＥＭ−１タンパク質発現は、干渉ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ（例えば、配列番号９−２２のいずれかによってコードされるｓｈＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号２３−２６のいずれか）を投与することによって低下する。他の実施態様において、ＴＲＥＭ−１活性化は、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に結合する抗体または抗体フラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合する抗体または抗体フラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体またはそのリガンド結合タンパク質、あるいは可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質を投与することによって阻害される。本発明のさらなる実施態様は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達経路の非ＴＲＥＭメンバー（例えば、ＴＲＥＭ−１付属タンパク質ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ）を直接阻害することによって、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達は、対象における内因性ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質に対する免疫反応を誘発することによってヒト患者で低下する。例えば、アジュバントおよびＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含む免疫原性組成物は、内因性タンパク質に対する免疫反応を引き起こすために対象に投与されうる。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、受容体を活性化することなくＴＲＥＭ−１に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。抗体または抗体フラグメントは、例えば、モノクローナルでありうる。本発明のさらなる実施態様は、受容体を活性化することなくＴＲＥＭ−１に結合する抗体または抗体フラグメントの治療上有効な量を対象に投与する工程を含む対象（例えば、ヒト患者）の治療方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、配列番号９−２２のいずれかによってコードされるｓｈＲＮＡを提供する。
【００１３】
本発明は、ＴＲＥＭ−１の活性化が、多数の遺伝子、例えば、ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして用いられうる、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）の差次的発現をもたらすことを提供する。したがって、別の態様において、本発明は、特異的で、ＴＲＥＭ−１活性を示すマーカーを提供する。１種または複数のこれらのマーカーの濃度変化は、ＴＲＥＭ−１活性の変化に相関する。したがって、本発明はまた、ＴＲＥＭ−１活性、および／または１種もしくは複数のこれらのマーカーを検出することによって、かかる治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者）に投与されるＴＲＥＭ−１修飾剤の有効性を評価する方法を提供する。例えば、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１；オステオポンチン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質Ｉ（ＢＳＰＩ）、早期Ｔ−リンパ球活性化１（ＥＴＡ−１）、またはＭＧＣ１１０９４０としても知られている）濃度は、患者または患者からの試料で検出することができ、ＳＰＰ１濃度の変化は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の変化に相関する。ＳＰＰ１濃度は、患者または患者からの任意の臨床的に関連する試料、例えば、体液試料（例えば、血清、髄液、気管気管支粒体、唾液）で検出されうる。１の実施態様において、該方法には、ＳＰＰ１濃度を基準濃度と比較し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の増加がＴＲＥＭ−１活性の増加を示し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の減少がＴＲＥＭ−１活性の減少を示しうるところのさらなる工程が含まれる。基準濃度は、例えば、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前に患者または患者からの試料で検出されるＳＰＰ１濃度でありうる。本発明に記載のＴＲＥＭ−１活性を評価するために用いられうるさらなるマーカーは、以下にさらに詳細に記載され、例えば、図８Ａに記載されている。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節しうる候補薬剤のスクリーニング方法を提供する。該方法には、ＴＲＥＭ−１発現細胞を候補薬剤と接触させ、候補薬剤がＴＲＥＭ−１活性化を調節するか否かを決定するためにＴＲＥＭ−１発現細胞の分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を評価することが含まれる。本発明にしたがってスクリーンされうる候補薬剤には、例えば、干渉ＲＮＡ、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に結合する抗体またはそのフラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合する抗体またはそのフラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、およびその組み合わせが含まれる。他の実施態様において、該方法には、ＴＲＥＭ−１発現細胞をＴＲＥＭ−１活性化因子（例えば、架橋抗体）と接触させることが含まれる。さらに他の実施態様において、該方法には、求めたＳＰＰ１濃度を基準濃度と比較することが含まれうる。基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の増加は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の増加を示し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の減少は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の減少を示しうる。１の実施態様において、基準濃度は、ＴＲＥＭ−１発現細胞を候補薬剤と接触させる前に求められたＴＲＥＭ−１発現細胞のＳＰＰ１濃度に相当する。本発明に記載のＴＲＥＭ−１活性を評価するために用いられうるさらなるマーカーは、以下にさらに詳細に記載され、例えば、図８Ａに記載されている。
【００１５】
本発明の別の態様は、炎症または慢性炎症の治療を受けた患者のモニタリング方法を提供する。該方法には、それを必要とする患者（例えば、ヒト患者）にＴＲＥＭ−１修飾剤を投与すること、患者または患者からの試料で分泌リンタンパク質（ＳＰＰ１）濃度を検出すること、および検出ＳＰＰ１濃度を基準濃度と比較することが含まれる。ＳＰＰ１濃度は、患者または患者からの試料、例えば、体液試料（例えば、血清、髄液、気管気管支流体、唾液）で検出されうる。基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の低下は、ＴＲＥＭ−１媒介炎症の低下を示し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の変化なしまたは増加は、それぞれ、ＴＲＥＭ−１媒介炎症の変化なしまたは増加であることを示しうる。いくつかの実施態様において、基準濃度は、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前または同時に患者または患者からの試料で検出されたＳＰＰ１濃度に相当する。他の実施態様において、基準濃度は、対照患者（例えば、ヒト）または対照患者からの試料のＳＰＰ１濃度に相当し、ここで、対照患者は、慢性炎症を伴わないことが知られている。本発明に記載のＴＲＥＭ−１活性を評価するために用いられうるさらなるマーカーは、以下にさらに詳細に記載され、例えば、図８Ａに記載されている。
【００１６】
別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の存在の検出方法に関する。炎症性疾患には、例えば、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬性関節炎、ループス性関節炎、強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、自己免疫性皮膚疾患、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病（Ｉ型）；例えば、皮膚（例えば、乾癬、急性および慢性じんま疹（じんましん））、心臓血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）および膵臓（例えば、膵炎）の炎症性疾患；心臓血管疾患、例えば、コレステロール代謝性障害、酸素フリーラジカル損傷；損傷治癒に付随する障害；高級胃障害、例えば、喘息およびＣＯＰＤ（例えば、嚢胞性線維症）；急性炎症性疾患（例えば、内毒素血症、敗血症、敗血性ショック、毒素性ショック症候群および感染性疾患）；移植片拒絶反応およびアレルギー（例えば、アナフィラキシー、血管性浮腫、アトピー、虫さされアレルギー、アレルギー性鼻炎）が含まれる。本発明にしたがって検出されうるさらなる病態には、虚血が含まれる。該方法には、対象または対象から得られた試料において、ＴＲＥＭ−１（例えば、膜結合型ＴＲＥＭ−１、可溶性ＴＲＥＭ−１）またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程が含まれる。（本願において、「または」は「および／または」を意味しうるので、該方法には、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの両方の検出が含まれ、必要に応じて、発現および活性の検出が含まれうる）。本発明の該方法および他の方法の実施に有用な試料は、例えば、免疫系の組織における、または慢性炎症の部位に予め曝された組織もしくは流体における（例えば、血液、血漿、またはリンパ液）を循環しようと慢性炎症の部位に局在しようと、例えば、関節組織、滑液、滑膜、または他の臨床的に関連のある体液または組織を含む試料を含む、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが検出されうる任意の試料である。ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の上昇の検出は、例えば、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＡなどの炎症性疾患の存在を示す。該方法には、対象、または対象由来の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を既知の基準濃度と比較するさらなる工程が含まれうる。比較結果（例えば、発現または活性の増加）は、炎症性疾患の存在を示す。基準濃度は、例えば、炎症性疾患の存在、または正常発現と増大した発現を区別するための閾値を示しうる。
【００１７】
本発明はまた、対象または対象からの試料でＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現を検出すること、および対象または試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現を基準濃度と比較することによって、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＡまたは喘息などの炎症性疾患の存在を検出する方法を提供する。比較結果（例えば、発現の増加）は、炎症性疾患の存在を示す。基準濃度は、炎症性疾患の存在、または正常と増大した発現を区別するための閾値などを示しうる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患のモニタリング方法を提供する。該方法は、（対象において異なる時間で決定されるようにまたは異なる時間で対象から得られた試料で決定されるように）時間による対象におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の変化が病態の変化の指標として用いられうるという認識の恩恵を受ける。該方法には、２もしくは複数の異なる時間（最初および第２の、後の時間と本明細書で称される時々）の対象または２もしくは複数の異なる時間の対象から得られた試料における、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出することならびに観察された発現または活性を比較することが含まれる。時間によるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の低下は、炎症性疾患の低下を示しうる、一方、時間によるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の増加は、炎症性疾患の増加を示しうる。
【００１９】
モニタリング方法はまた、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療を評価するのに有用である。治療は、対象におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する第２の、後の時間前あるいは第２の、後の試料を得る前に行われる。治療は、モニタリング方法を開始する前または後（対象における最初の検出または対象からの最初の試料を得る前または後）に行われうる。そのため、治療方針は、最初または最初の試料のＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性と第２の、後の時間または第２の試料のＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性との比較に基づき変更されうる。
【００２０】
これらのおよび他の本発明の態様および実施態様はまた、本願の以下の項目に記載されており、本発明の特定の実施態様を強調するために提供され、本発明を限定することを意図とするものではなく、その範囲は、特許請求の範囲によってのみ特定される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つの彩色図面を含有する。彩色図面（複数）を伴う該特許公報または特許出願公開公報の写しは、請求および必要な手数料の支払に応じて特許庁によって提供されるであろう。
【００２２】
【図１】図１は、ＲＡ患者からの滑膜におけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現を示す棒グラフである。
【図２】図２は、マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＴＲＥＭ−１陽性指数＞１０００を有するＲＡ陽性滑膜部分におけるヒトＴＲＥＭ−１の免疫組織化学染色の典型的な画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＲＥＭ−１陽性指数＜２０を有する変形性関節炎（ＯＡ）対照部分におけるヒトＴＲＥＭ−１の免疫組織化学染色の典型的な画像を示す。
【図４】図４は、ＲＡおよび対照（ＨＶＯＳ）患者から得られたヒト血漿試料におけるＥＬＩＳＡによって検出された可溶性ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、ＴＲＥＭ−１の架橋後のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化の経時変化を図示する典型的なウエスタンブロットを示す。
【図６】図６は、ｐ＜０．０１を有する＞２倍に調節された遺伝子の典型的なＡＮＯＶＡヒートマップクラスタ分析を示す。個々のドナーを左側に示し、平均強度を右側に示す。
【図７】図７は、全ての存在遺伝子（「コール」）の典型的な散布図を示す。Ｌｎ率変化は、負の値に変換されたダウンレギュレーションを伴って、ＴＲＥＭ−１（ｘ軸）およびＬＰＳ（ｙ軸）にプロットされた。選択遺伝子を強調する。４５°軸は、両処理により同等に調節された遺伝子を画定する。
【図８Ａ】図８Ａは、ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍アップレギュレートされる典型的な遺伝子を記載する表を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＬＰＳでの処置で＞４倍アップレギュレートされる典型的な遺伝子を記載する表を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、一般に＞４倍アップレギュレートされる典型的な遺伝子、すなわち、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理の両方でアップレギュレートされる遺伝子を記載する表を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳ処理のいずれかで＞４倍ダウンレギュレートされる典型的な遺伝子を記載する表を示す。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、ＧＦＰ発現ヒト単球ＴＨＰ−１細胞での典型的なファゴサイトーシスアッセイの結果を示す。１μＭビーズは赤色で生じる。図１０Ａは、処理後のＴＨＰ−１細胞の形態変化を示す。図１０Ｂは、α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳでの処理が、マイクロスフィアファゴサイトーシスを誘発することを示す。
【図１１】図１１Ａ−Ｆは、典型的な経時的ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１１ＡはＧＭ−ＣＳＦを示し、図１１ＢはＭ−ＣＳＦを示し、図１１ＣはＧ−ＣＳＦを示し、図１１ＤはＩＮＨＢＡ（インヒビン、βＡ（アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、αペプチド））を示し、図１１ＥはＳＰＰ１を示し、図１１ＦはＩＬ−２３を示す。
【図１２】図１２は、ＴＲＥＭ−１の架橋結合が用量依存的にＲＡ組織試料中の多数のサイトカインの産生を誘導することを示す一連の棒グラフである。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、３つの異なるドナーから調製された組織試料における複数の産生サイトカインを示すチャートである。図１３Ａは、３つのドナー試料における自発的サイトカイン産生の比較を示す。図１３Ｂは、３つのドナー試料におけるＴＲＥＭ−１の架橋におけるサイトカイン産生の比較を示す。
【図１４】図１４は、Ｋ／ＢｘＮ足におけるＴＲＥＭ−１発現の増大を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、Ｋ／ＢｘＮ血清輸送に対する反応における、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦＣトランスジェニックマウスおよび野生型マウスの足首肥厚を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｋ／ＢｘＮ血清輸送に対する反応における、１４日目のｍＴＲＥＭ−１−ｈＦＣトランスジェニックマウスの足首肥厚を示すグラフを示す。
【図１７】図１７は、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスにおける抗ＩｇＥ抗体投与後の耳の腫脹を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃタンパク質で前処理したマウスにおける抗ＩｇＥ抗体投与後の耳の腫脹を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃタンパク質で前処理したマウスにおける抗ＩｇＥ抗体投与後の耳の腫脹の用量反応を示すグラフである。
【図２０】図２０は、抗ＩｇＥ抗体投与後のＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスにおける耳の腫脹を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡノックダウン後のＲＴ−ＰＣＲによってＴＲＥＭ−１発現を示す棒グラフである。
【図２２】図２２Ａ−Ｂは、ＴＲＥＭ−１過剰発現細胞株におけるＴＲＥＭ−１のレンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン後のＴＲＥＭ−１発現を図示する典型的なウエスタンブロットを示す。
【図２３】図２３は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３＿プラス２．０アレイを用いて精製ヒト単球の全遺伝子発現プロファイリングからの結果を要約する表である（実施例６を参照）。
【図２４】図２４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３＿プラス２．０アレイを用いて精製ヒト単球の全遺伝子発現プロファイリングからの結果をさらに要約する表である（実施例６を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に用いられる、「核酸」なる語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、必要に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）をいう。該用語はまた、記載されている実施態様に適用できるように、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことを理解する必要がある。
【００２４】
本明細書に用いられる、「ＲＡ陽性」、「ＲＡ試料」、および「ＲＡ組織」は、対象、または任意の組織、流体、あるいは関節リウマチを伴う対象由来の他の試料をいう。「ＲＡ陰性」は、対象、または任意の組織、流体、あるいは疾患に罹患していない対象由来の他の試料をいう。
【００２５】
本明細書に用いられる、「ＲＡ」なる語は関節リウマチをいう。本明細書に用いられる、「ＯＡ」なる語は変形性関節炎をいう。
【００２６】
「抗体」なる語には、無傷分子ならびにその機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一変数ドメイン抗体（Ｄａｂ）、ダイアボディ（二価および二重特異性）、およびキメラ（例えば、ヒト化）抗体が含まれ、それらは、組換えＤＮＡ技術を用いて全抗体またはデノボ合成された抗体の修飾によって産生されうる。これらの機能的抗体フラグメントは、それらの各抗原または受容体と選択的に結合する能力を保有する、抗体および抗体フラグメントは、限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの抗体ならびに任意のサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）由来でありうる。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。抗体はまた、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植、またはインビトロ生成抗体でありうる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有しうる。抗体はまた、例えば、κまたはλから選択される軽鎖を有しうる。抗体の定常領域は、抗体の性質を修飾するために（例えば、１種または複数のＦｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能、または補体機能を増加または減少するために）変化、例えば、変異しうる。典型的には、抗体は、所定の抗原、例えば、障害、例えば、神経変性、代謝性、炎症性、自己免疫および／または悪性疾患に付随する抗原に特異的に結合する。
【００２７】
本発明の抗体はまた、単一ドメイン抗体でありうる。単一ドメイン抗体には、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体が含まれうる。例として、限定されるものではないが、重鎖抗体、軽鎖が天然に欠損している抗体、通常４鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、改変抗体および抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、先行技術のいずれか、または任意の次世代の単一ドメイン抗体でありうる。単一ドメイン抗体は、限定されるものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む、任意の種から得られうる。本発明の１の態様において、単一ドメイン抗体は、魚で見出された免疫グロブリンの可変領域から得られうる、例えば、サメの血清中で見出された新規抗原抗体（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプから得られる。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域から得られる単一ドメイン抗体の産生方法は、ＷＯ０３／０１４１６１およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。本発明の別の態様にしたがって、単一ドメイン抗体は、軽鎖が欠損している重鎖抗体として知られている天然単一ドメイン抗体である。かかる単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ９４０４６７８に記載されている。明確な理由で、該軽鎖を天然に欠損している重鎖抗体から得られる可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの通常ＶＨと区別するためにＶＨＨまたはナノ体として本明細書で知られている。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコでもたらされる抗チアから得られうる。ラクダ科に加えて他の種は、軽鎖を天然に欠損している重鎖抗体を産生しうる；かかるＶＨＨは、本発明の範囲内にある。
【００２８】
本発明はまた、ＣＨ１以外の、免疫グロブリン重鎖からの１つまたは複数の天然または改変定常領域、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域に順に融合するかあるいは結合する、典型的には、免疫グロブリンヒンジまたはヒンジ作用領域ポリペプチドに融合するかまたは結合する結合ドメインポリペプチドを含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を表す低分子免疫医薬品（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）の使用を意図とする（さらに詳細な記載については、例えば、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．らによるＵ．Ｓ．２００５／０１３６０４９を参照）。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質には、ヒンジ領域ポリペプチドに融合するかあるいは結合する天然または改変免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ペプチド（またはＩｇＥから全体でもしくは部分で得られた構築物の場合、ＣＨ３）ならびにＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥから全体でもしくは部分で得られた構築物の場合、ＣＨ３）に融合するかあるいは結合する天然または改変免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥから全体でもしくは部分で得られた構築物の場合、ＣＨ４）を含む領域がさらに含まれうる。典型的には、かかる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、補体結合、および／または標的、例えば、標的抗原への結合からなる群より選択される少なくとも１つの免疫学的活性能がある。
【００２９】
本明細書に用いられる「アンチセンス」なる語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」なる語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖について用いられる。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに逆方向である目的遺伝子（複数）を連結することによる合成を含む、任意の方法によって産生されうる。細胞に導入されるとすぐに、転写鎖は、二本鎖を形成するために細胞によって産生される天然配列を組み合わせる。次いで、これらの二本鎖は、さらなる転写または翻訳のいずれかを阻害する。「負」なる表示は、アンチセンス鎖について時々用いられ、「正」は、センチ鎖について時々用いられる。
【００３０】
本明細書に用いられる、「対象」および「患者」なる語は、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物をいう。
【００３１】
本明細書に用いられる、「検出する」なる語および「検出する」なる語幹の他の全ての形態は、１つまたは複数の標的の存在または不存在の確認、１つまたは複数の標的の定量化、あるいは１つまたは複数のバイオマーカーの閾値の存在または不存在の決定をいう。
【００３２】
本明細書に用いられる、「関節組織」なる語は、非限定的な例として、腱、靱帯、および滑膜を含む、接合面から得られる任意の組織または流体をいう。
【００３３】
本明細書に用いられる、「炎症性疾患」なる語には、非限定的な例として、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬性関節炎、ループス性関節炎または強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、自己免疫性皮膚疾患、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病（Ｉ型）；例えば、皮膚（例えば、乾癬、急性および慢性じんま疹（じんましん））、心臓血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）および膵臓（例えば、膵炎）の炎症性疾患；心臓血管疾患、例えば、コレステロール代謝性障害、酸素フリーラジカル損傷；損傷治癒に付随する障害；呼吸器障害、例えば、喘息およびＣＯＰＤ（例えば、嚢胞性線維症）；急性炎症性疾患（例えば、内毒素血症、敗血症、敗血性ショック、毒素性ショック症候群および感染性疾患）；移植片拒絶反応およびアレルギー（例えば、アナフィラキシー、血管性浮腫、アトピー、虫さされアレルギー、アレルギー性鼻炎）が含まれる。
【００３４】
本明細書に用いられる、「慢性炎症性疾患」なる語は、炎症反応の持続時間が長い場合（例えば、数週間、数ヶ月、あるいは無期限）ならびに時間的経過の延長が組織の炎症の原因刺激の持続によって引き起こされる場合の任意の疾患をいう。「慢性炎症性疾患」なる語には、例えば、関節リウマチが含まれる。
【００３５】
本明細書に用いられる、「示す」なる語（例えば、炎症性疾患を示す）は、それ自体は決定的証拠であることとは対照的に、考えられる兆しまたは指標または因子を意味する。一般的に、ＴＲＥＭ−１発現レベルの増大は、炎症性疾患（例えば、ＲＡ）の可能性の増大と相関する、そのため、ＴＲＥＭ−１発現の増大は、炎症性疾患（例えば、ＲＡ）の存在を示す。同様に、正常ＴＲＥＭ−１発現レベルは、一般的に、炎症性疾患（例えば、ＲＡ）の不在の可能性の増大と相関する。
【００３６】
本明細書に用いられる、「ＰＣＲ」なる語は、ポリメラーゼ連鎖反応をいう。
【００３７】
本発明は、例えば、慢性炎症性疾患などの炎症性疾患のバイオマーカーとして、より具体的には、ＲＡのバイオマーカーとしてのＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの同定を含む。ＲＡの転写プロファイリングと正常滑膜組織の比較は、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡ発現が、ヒトＲＡ試料にて正常の６．５倍以上アップレギュレートされ、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現が、ヒトＲＡ試料にて正常の２倍以上アップレギュレートされることを明らかにした（実施例１を参照）。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、正常マウスの足に比べてＣＩＡの足では１３２倍アップレギュレートされ、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡは、正常マウスの足に比べてＣＩＡの足では８．２１倍アップレギュレートされた（実施例２を参照）。免疫組織化学によって、ヒトＲＡ滑膜試料は、増加したＴＲＥＭ−１発現細胞を含有していた（実施例３を参照）。そのため、滑膜培地におけるＴＲＥＭ−１の活性化は、用量依存的手法で炎症性サイトカインおよびサイトカイン産生を誘導した（実施例９を参照）。さらに、可溶性ＴＲＥＭ−１レベルは、対照患者と比較してＲＡ患者からのヒト臨床血漿試料で上昇する（実施例４を参照）。ＲＡのバイオマーカーとしてのＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの同一性ならびにＴＲＥＭ−１の炎症反応を誘導する能力は、ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１シグナル経路のメンバーを、例えば、慢性炎症性疾患、特にＲＡなどの、炎症性疾患の望ましい治療標的にする。
【００３８】
遺伝子発現の検出
本発明は、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの発現または活性を検出するかまたは定量化することによって、例えば、慢性炎症性疾患などの炎症性疾患の検出およびモニタリング方法を提供する。定量化の有無に関わらず、目的のタンパク質、核酸、または活性レベルの多数の検出方法は、既知であり、本発明の実施に用いられうる。
【００３９】
標的遺伝子転写物は、当該分野にて既知である多数の技法を用いて検出されうる。いくつかの有用な核酸検出システムは、試料の精製された核酸画分を調製すること、および該試料を直接検出アッセイまたは増幅過程、次いで、検出アッセイ、例えば、関節組織中ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡのアッセイを対象とすることに関与する。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）および共役ＲＴ−ＰＣＲによって達成されうる。核酸の検出は、例えば、目的核酸にハイブリダイズするプローブを有する精製された核酸画分を探索することによって達成することができ、多くの場合、検出は、同様に増幅に関与する。ノーザンブロット法、ドットブロット法、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、全ての既知の試料中の核酸を検出する方法である。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、ＳＤＡ法（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、自家持続配列複製法または核酸配列増幅法によって増幅されうる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２（９）：ｌ；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８；およびＷｅｉｓｓ（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９２を参照のこと。核酸はまた、スプライシングによって検出することができ、スプライシングは、標的核酸に特異的なプライマー（例えば、ＴＲＥＭ−１ ｃＤＮＡ配列）または標的核酸に結合したアダプター配列に対するプライマーを用いうる。無作為に選択されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのスプライシングは、バイオマーカー（例えば、ＴＲＥＭ−１ ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列）に対応する核酸配列を含有する全ての配列転写物の割合によって示されるバイオマーカーの相対的発現の指標を提供しうる。あるいは、核酸は、抽出または精製することなく、例えば、ハイブリダイゼーションによって、インサイツで検出されうる。
【００４０】
標的タンパク質は、例えば、１種または複数の抗体を用いて免疫学的に検出されうる。免疫アッセイにおいて、バイオマーカーに対し特異的結合アフィニティーを有する抗体またはかかる抗体に結合する二次抗体は、直接的または間接的のいずれかで標識されうる。抗体は完全である必要はない：抗体可変ドメインまたはその人工アナログ、例えば、一本鎖抗体は、十分である。適当な標識には、限定されるものではないが、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、または１４Ｃ）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ、ローダミン、またはＰＥ）、発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡが提供するＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）、所定の波長の光を吸収する化合物、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）が含まれる。抗体は、ビオチンとの抱合によって間接的に標識され、次いで、上記分子で標識されたアビジンまたはストレプトアビジンで検出されうる。標識の検出または定量化方法は、標識の特性に依存し、当該分野にて既知である。検出器の例として、限定されるものではないが、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、および密度計が挙げられる。当業者に既知のこれらのアプローチの組み合わせ（「多層」アッセイを含む）は、アッセイの感度を高めるために用いられうる。
【００４１】
標的タンパク質を検出するための免疫アッセイは、サンドイッチ分析、競合アッセイ（競合ＲＩＡ）、またはブリッジ免疫アッセイを含む、種々の既知の形式で実施されうる。例えば、米国特許番号第５，２９６，３４７号；第４，２３３，４０２号；第４，０９８，８７６号；および第４，０３４，０７４号を参照のこと。標的タンパク質の検出方法は、一般的に、生物試料をタンパク質に結合する抗体と接触させることおよびタンパク質の抗体に対する結合を含む。例えば、ＴＲＥＭ−１に特異的な結合アフィニティーを有する抗体は、種々の当該分野にて既知の方法のいずれかによって固定基質上で固定され、次いで、生物試料に曝されうる。固体基質上のＴＲＥＭ−１の抗体に対する結合は、表面プラズモン共鳴の現象を利用することによって検出することができ、適当な装置、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ，Ｒａｐｓｇａｔａｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって定性的または定量的に検出されうる結合における表面プラズモン共鳴の強度の変化をもたらす。あるいは、抗体は、上記のように、標識および検出されうる。既知のタンパク質量を用いる標準曲線は、バイオマーカーレベルの定量化に役立てるために作成されうる。
【００４２】
他の実施態様において、捕捉抗体が固体基質上で固定される「サンドイッチ」分析は、標的タンパク質の濃度を検出するために用いられる。固体基質は、試料中の任意の標的タンパク質が固定化抗体に結合しうるように生物試料と接触されうる。抗体に結合する標的タンパク質の濃度は、標的タンパク質に特異的な結合アフィニティーを有する「検出」抗体および上記の方法を用いて測定されうる。これらのサンドイッチ分析において、捕捉抗体が、検出抗体として同一エピトープ（またはポリクローナル抗体の場合、エピトープの範囲）に結合する必要がないことは理解される。したがって、モノクローナル抗体が、捕捉抗体として用いられるならば、検出抗体は、捕捉モノクローナル抗体が結合するエピトープから完全に物理的に分離されるかまたはそれと部分的にのみ重複するエピトープに結合する別のモノクローナル抗体、あるいは捕捉モノクローナル抗体が結合するもの以外のまたはそれを加えたエピトープに結合するポリクローナル抗体でありうる。ポリクローナル抗体が捕捉抗体として用いられるならば、検出抗体は、捕捉ポリクローナル抗体が結合するエピトープのいずれかから完全に物理的に分離されるかまたはそれと部分的に重複するエピトープに結合するモノクローナル抗体、あるいは捕捉ポリクローナル抗体が結合するもの以外のまたはそれを加えたエピトープに結合するモノクローナル抗体のいずれかでありうる。サンドイッチ分析は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチウエスタンブロット法アッセイ、またはサンドイッチ免疫磁性検出アッセイとして実施されうる。
【００４３】
抗体（例えば、捕捉抗体）に対する適当な固体基質は、限定されるものではないが、マイクロタイタープレート、チューブ、膜、例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜、およびビーズまたは粒子（例えば、アガロース、セルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、磁気、または磁化可能なビーズまたは粒子）を含みうる。磁気または磁化可能な粒子は、自動免疫アッセイシステムを用いる場合に特に有用でありうる。
【００４４】
標的ポリペプチドを検出する他の方法には、質量−分光光度法、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれる。例えば、Ｇｅｖａｅｒｔら（２００１） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２２（９）：１６４５−５１；Ｃｈａｕｒａｎｄら（１９９９） Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１０（２）：９１−１０３を参照のこと。かかる用途に有用な質量分光計は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。
【００４５】
本発明に記載の任意の標的遺伝子転写物または標的タンパク質の発現が、１つまたは複数の上記方法を用いて容易に検出されうることは明らかであろう。
【００４６】
ＴＲＥＭ−１活性の検出
ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの活性は、例えば、１種または複数（例えば、２種もしくは２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、１０種以上、または２０種以上）のＴＲＥＭ−１応答遺伝子の発現レベルを求めることによって評価されうる。発現レベルは、例えば、対照試料または基準レベルと比較して絶対的または相対的でありうる。差次的遺伝子発現は、試験試料および、所望により、対照試料の転写プロファイリングによって決定されうる。基準レベルは、既知の病態の試料に対応する転写プロファイリングでありうる。正の対照は、例えば、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが、１種または複数の細胞で意図的に過剰発現されている試料、内因性または組換え技術によって発現したＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが、例えば、架橋抗体、重症度が知られている炎症性疾患または慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）を伴う対象から得られる試料の付加によって活性化されている細胞の試料でありうる。負の対照は、例えば、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが発現または活性化されていない試料あるいは炎症性疾患または慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）を伴わない対象からの試料でありうる。
【００４７】
多数のプロトコールは、転写プロファイリングの核酸マイクロアレイを用いるのに利用可能である。プロトコールの例として、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイの使用に関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供されるものが挙げられる。核酸マイクロアレイハイブリダイゼーションに適している試料は、任意のヒト細胞または組織から調製されうる。核酸マイクロアレイが、非ヒト薬物標的遺伝子のプローブを含む場合、試料は、対応する非ヒト種の細胞または組織を調製しうる。
【００４８】
核酸マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションの試料は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡ）またはＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）のいずれかでありうる。種々の方法は、組織からＲＮＡを単離するのに利用可能である。これらの方法には、限定されるものではないが、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって得られる），ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって得られる）、およびＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによって得られる）が含まれる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって得られるＲＮＡ単離プロトコールはまた、用いられうる。
【００４９】
１の実施態様において、核酸マイクロアレイにハイブリダイズする前に、単離されたＲＮＡは、増幅または標識される。適当なＲＮＡ増幅法には、限定されるものではないが、逆転写ＰＣＲ、等温増幅法、リガーゼ連鎖反応、およびＱβレプリカーゼ法が含まれる。増幅生成物は、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡのいずれかでありうる。１の実施態様において、単離されたｍＲＮＡは、逆転写酵素およびオリゴｄ（Ｔ）およびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写される。ｃＤＮＡは一本鎖である。第二鎖のｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて合成され、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを分解するＲＮアーゼと組み合わされうる。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、第二鎖の二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを転写するために付加される。１の実施態様において、最初に単離されたＲＮＡは、増幅することなく核酸マイクロアレイにハイブリダイズされうる。
【００５０】
ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、または他の核酸試料は、ハイブリッドポリヌクレオチド複合体の検出を可能にするために１つまたは複数の標識部分で標識されうる。標識部分には、分光的、光化学的、生化学的、生体電子的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的方法によって検出可能である組成物が含まれうる。標識部分には、放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー、例えば、蛍光マーカーおよび染料、磁気標識、結合酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子移動供与体および受容体などが含まれる。
【００５１】
ハイブリッド形成反応は、絶対的または異なるハイブリッド形式で実施されうる。絶対的ハイブリッド形式では、１つの試料から得られるポリヌクレオチドは、核酸マイクロアレイ中でプローブにハイブリダイズされる。ハイブリッド複合体の形成後に検出されたシグナルは、試料中のポリヌクレオチド濃度に相関する。異なるハイブリッド形式では、２つの試料から得られるポリヌクレオチドは、異なる標識部分で標識される。これらの異なって標識されたポリヌクレオチドの混合物は、核酸マイクロアレイに付加される。次いで、核酸マイクロアレイは、２つの異なる標識からの放射を個々に検出可能である条件下で試験される。１の実施態様において、フルオロフォアＣｙ３およびＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、異なるハイブリッド形式の標識部分として用いられる。
【００５２】
核酸マイクロアレイから得られるシグナルは、商業的に入手可能なソフトウェア、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって得られるものを用いて分析されうる。走査感度、プローブ標識、およびｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ定量化の対照は、ハイブリッド実験に含まれうる。ハイブリッドシグナルは、さらに分析する前に、計算されうるかまたは正常化されうる。例えば、個々のプローブのハイブリッドシグナルは、１以上のマイクロアレイが同様の試験条件下で用いられる場合にハイブリッド強度の変化を考慮するために標準化されうる。ハイブリッドシグナルはまた、各マイクロアレイ上に含まれる内部正常化対照から得られる強度を用いて正常化されうる。さらに、試料を通して比較的一致する発現レベルを有する遺伝子は、他の遺伝子の発現レベルを正常化にするために用いられうる。１の実施態様において、ある保守遺伝子のプローブは、核酸マイクロアレイに含まれる。多様な集合の組織を通して安定な発現レベルを示すので、これらの遺伝子は選択される。ハイブリッドシグナルは、これらの保守遺伝子の発現レベルに基づき、正常化または計算されうる。
【００５３】
疾患または治療のモニタリングおよび評価
本発明は、対象における、例えば、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＮＡなどの炎症性疾患のモニタリング方法を提供する。対象における炎症性疾患の進行は、１種または複数のバイオマーカー、例えば、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰに対応するｍＲＮＡの発現レベル、またはそれによってコードされるタンパク質、またはその活性を測定することによって観測されうる。標的遺伝子ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルは、インビボまたは例えば、関節組織、滑液、滑膜、または他の臨床的に関連のある源で検出されうる。標的遺伝子に対応するｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現レベルは、上記の標準的方法によって検出されうる。対象における病態は、対象における標的遺伝子タンパク質またはＲＮＡのレベルを対象の標的タンパク質またはＲＮＡの基準濃度と比較することによって（例えば、疾患の改善、悪化、または再発について）観測されうる。例えば、最初の対象におけるＴＲＥＭ−１発現レベルは、第２の、後の時間の対象におけるＴＲＥＭ−１発現レベルと比較されうる。時間によるＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの増大は、炎症性疾患の進行を示す。時間によるＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少は、炎症性疾患の低下を示す。
【００５４】
対象における、例えば、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはＲＮＡの濃度はまた、治療の有効性を観測するために用いられうる。典型的には、対象の標的タンパク質またはＲＮＡの基準濃度は、（例えば、治療前に）得られ、治療後または治療中の種々の時点（例えば、治療１日または数日、数週間、または数ヶ月後）の標的タンパク質またはＲＮＡの濃度と比較される。比較の結果は、過去の治療の有効性を明らかにすることができ、将来の治療は、それに応じて修正されうる。例えば、予め検出された濃度と比較したＴＲＥＭ−１タンパク質またはＲＮＡ濃度の減少は、一般的に、治療計画に対して好反応を示すので、同様の治療を継続する必要がある。同様に、対象における病態は、対象における標的タンパク質またはＲＮＡの濃度を標的タンパク質またはＲＮＡの対象の基準濃度、または予め検出した濃度と比較することによって（例えば、疾患の改善、悪化、または再発について）観測されうる。
【００５５】
治療
本発明は、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を阻害および／または拮抗することによって、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療方法を提供する。ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達の阻害および／または拮抗は、ＴＲＥＭ−１を直接阻害することによってあるいはＴＲＥＭ−１シグナル経路の非ＴＲＥＭ−１メンバー、例えば、ＴＲＥＭ−１付属タンパク質ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰを阻害および／または拮抗することによって達成されうる。適当な阻害薬および／または拮抗薬は、例えば、ＴＲＥＭ−１をコードする核酸の発現を減少させうるか、ＴＲＥＭ−１タンパク質の濃度を減少させうるか、またはＴＲＥＭ−１活性を阻害しうる。阻害薬および／または拮抗薬の例として、限定されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド；干渉ＲＮＡ；ＴＲＥＭ−１に対する抗体；ＴＲＥＭ−１リガンドに対する抗体；ＴＲＥＭ−１受容体およびそのリガンド結合フラグメント、可溶性切断ＴＲＥＭ−１受容体、および可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、例えば、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部を含有するＴＲＥＭ−１融合、リガンド融合タンパク質を含む、ＴＲＥＭ−１リガンド結合部位のコンペティター；ペプチド模倣薬；ペプチド阻害薬；低分子；およびその組み合わせが挙げられる。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡおよびタンパク質濃度を減少させることによって、ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、またはＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰシグナル経路の他のメンバーを阻害するために用いられうる。アンチセンス抑制は、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、標的対立遺伝子の発現を阻害するように１種または複数の対象標的対立遺伝子をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと一緒に、特に細胞条件下でハイブリダイズするかまたは結合する核酸配列またはその誘導体の投与またはインサイツ生成をいう。結合は、通常の塩基対相補性によるものであってもよく、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖への結合の場合、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介するものであってもよい。一般的に、アンチセンス抑制は、当該分野にて一般的に用いられる方法の範囲をいい、核酸配列への特異的結合による任意の抑制を含む。本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞中で転写される場合に、内在性遺伝子の標的配列または標的対立遺伝子をコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも固有部分に相補的であるＲＮＡを産生する発現プラスミドとして輸送されうる。あるいは、アンチセンス構築物は、エクスビボで生成され、細胞に導入される場合に、内在性遺伝子の標的対立遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列でハイブリダイズすることによって発現の阻害をもたらす、核酸でありうる。かかる核酸は、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性である、そのため、インビボで安定である修飾オリゴヌクレオチドである。修飾、例えば、ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ分解、結合アフィニティーおよび取り込みに対するその抵抗性を増大させるために核酸で行われている。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いるための核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホロアミダート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアナログである（米国特許番号第５，１７６，９９６号；第５，２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号も参照のこと）。
【００５７】
アンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体または「その修飾体」でありうる。本明細書に用いられる、「その修飾体」は、例えば、安定性、半減期、ハイブリダイゼーション、有効性などを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾される核酸をいう。可能な修飾には、限定されるものではないが、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオエートまたは２’ Ｏ−メチルの使用が含まれる。核酸は、他の付加基、例えば、（例えば、インビボにおける標的宿主細胞受容体についての）ペプチド、または細胞膜（例えば、１９８８年１２月１５日公開の、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照）もしくは血液−脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開の、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照）内外の輸送を促進する薬剤、ハイブリッド誘発性切断剤もしくは挿入剤を含みうる。そのために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリッド誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリッド誘発性切断剤などと接合されうる。
【００５８】
アンチセンス核酸には、所望により、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、疑似ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、−５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む、群から選択される少なくとも１つの塩基部分が含まれうる。
【００５９】
固相合成法を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成方法は、既知である。かかる合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含む、いくつかの製造業者から商業的に入手可能である。あるいは、アンチセンス転写物の産生を誘導する調節要素を含有する発現ベクターは、アンチセンス分子を産生するために用いられうる。
【００６０】
生理的条件下でハイブリダイズするのに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要がないことは当該分野では理解されている。ＴＲＥＭ−１核酸に対するオリゴヌクレオチドの結合がＴＲＥＭ−１核酸の正常機能を阻害し、非標的配列に対する非特異的結合が最小限である場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは生理的条件下でハイブリダイズする。
【００６１】
ＲＮＡｉ
本発明は、ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、またはＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰシグナル経路の他のメンバーの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用をさらに意図とする。本発明のＲＮＡｉ分子は、ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、またはＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰシグナル経路の他のメンバーを特異的に阻害するように設計されうる。いかなるタイプのＲＮＡｉ配列も本発明に用いられうる。非限定的な例として、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。種々のアルゴリズムは、ＲＮＡｉ配列設計に利用可能である。１の実施態様において、ｓｉＲＮＡの標的配列には、約１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる。２ｄＴ’ｓは、「ＡＡ」突出を引き起こす、ｓｉＲＮＡ合成中に３’末端に付加されうる。多くの場合、標的配列のＧＣ含量は、３５％〜５５％であり、該配列には、任意の４連続のＡまたはＴ（すなわち、ＡＡＡＡまたはＴＴＴＴ）、３連続のＧまたはＣ（すなわち、ＧＧＧまたはＣＣＣ）、あるいは連続して７つの「ＧＣ」を含まない。より厳しい基準としても用いられうる。例えば、標的配列のＧＣ含量は、４５％〜５５％に制限することができ、３連続の同一塩基（すなわち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、またはＡＡＡ）を有する任意の配列あるいは５またはそれ以上の塩基を有するパリンドローム配列は除外されうる。さらに、標的配列は、他の変種または遺伝子に対し低い配列相同性を有するように選択されうる。ＲＮＡｉ分子の有効性は、標的遺伝子生成物を発現する細胞中でＲＮＡｉ配列を導入または発現することによって評価されうる。標的遺伝子生成物のｍＲＮＡまたはタンパク質濃度の実質的な変化は、遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ分子の有効性を示す。細胞におけるＲＮＡｉ分子の発現方法は、当該分野にて既知であり、例えば、レンチウイルスベクターを含む。
【００６２】
免疫原性組成物
ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰに対する免疫反応を誘発する組成物は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を低下させるのに用いられうる。組成物は、ヒトＴＲＥＭ−１またはヒトＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰに対する免疫反応を誘発するのに有用なＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはそのフラグメントもしくは変種（例えば、その変種またはフラグメントは、ヒトＭＨＣ分子への結合を促進している）を含みうる。タンパク質、フラグメントまたは変種は、単離したポリペプチドとして得られうるかまたは例えば、融合タンパク質または担体タンパク質などの別のポリペプチドとの複合体として付加的なペプチド配列で得られうる。いくつかの実施態様において、タンパク質、フラグメントまたは変種をコードする核酸は、タンパク質、フラグメントまたは変種自体を提供する代わりに免疫原性組成物中に提供される。免疫原性組成物はまた、好ましくは、アジュバントを含有する。アジュバントは、外来性抗原に対する免疫反応（抗体および／または細胞媒介性）を促進するかまたは強化する任意の基質でありうる。免疫刺激剤の例として、アルミニウム塩；生分解性マイクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ガラクトシド）；リポソーム（その中に化合物を組み込む）；サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１２、またはそれらをコードする核酸など）；およびＣｐＧポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６３】
上記のように、ワクチンは、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドがインビボで生成されるような、ＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはその一部もしくは変種をコードするＤＮＡを含有し、サイトカインなどのアジュバントタンパク質をコードするＤＮＡも含有しうる。ＤＮＡは、核酸発現ベクター、遺伝子導入ベクター、および細菌発現系を含む、当業者に既知の種々の導入系のいずれかに存在しうる。多数の遺伝子導入法は当該分野にて既知である。適当な核酸発現系は、対象における発現に必要なＤＮＡ配列を含有する（例えば、適当なプロモーターおよび末端シグナル）。細菌導入系は、その細胞表面上の免疫原性部分のポリペプチドを発現するかまたはかかるエピトープを分泌するバクテリア属（例えば、バシルス・カルメット・ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ））の投与に関与する。１の実施態様において、ＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックス・ウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入され、非病原性（欠損）で、複製可能なウイルスの使用に関与しうる。ＤＮＡをかかる発現系に組み込む方法は、当業者に既知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９に記載されるように「ネイキッド」でありうる。ネイキッドＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ上でＤＮＡをコーティングすることによって増加させることができ、細胞中に効率的に輸送される。ワクチンは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含みうる。かかるワクチンは、免疫反応の促進を提供しうる。
【００６４】
リガンド結合コンペティター
ＴＲＥＭ−１シグナル伝達はまた、ＴＲＥＭ−１のリガンドへの結合のコンペティターの投与によって阻害されうる。これは、例えば、当該分野にて既知のＩｇＧ免疫グロブリンなどの担体タンパク質と所望により結合する、ＴＲＥＭ−１細胞外ドメインの可溶性フラグメントの投与によって達成されうる。例えば、ＴＲＥＭ−１フラグメントおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部を用いるＴＲＥＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、記載されており、細菌性敗血症を阻止するのに有効であることが示されている（例えば、その全体を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許出願公開第２００５−０２６０６７０号を参照）。融合タンパク質のＩｇＧ Ｆｃ部は、任意のＩｇＧサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に由来しうる。ＴＲＥＭ−１／ＩｇＧ融合タンパク質の作製方法は既知である。例えば、Ｂｏｕｃｈｏｎら（２０００） Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｍｍｕｎ．１６４（１０）：４９９１−９５は、可溶性ＴＲＥＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質の産生方法を記載および教唆する。現在、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰとＲＡとの関連性に基づき、ＲＡ患者における適当なＴＲＥＭ−１フラグメントの同様の投与が、疾患の重篤度を低下させうると期待されている。重要なことに、ヒトの治療は、野生型ヒトＴＲＥＭ−１のフラグメントの投与を必ずしも必要としない：フラグメントが、リガンドとの結合のために内因性ヒトＴＲＥＭ−１と競合する能力を保有する限り、ＴＲＥＭ−１：他の哺乳動物からの他のＴＲＥＭ−１フラグメントは用いられ、１つまたは複数のアミノ酸置換は組み込まれうる。
【００６５】
結合パートナー
例えば、ＲＡおよび喘息などの炎症性疾患を治療するさらなる方法には、治療標的と相互作用する、例えば、結合および／または中和する結合剤、例えば、タンパク質、ペプチドおよび／または抗体またはその部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖフラグメント）投与が含まれる。本発明の治療標的には、例えば、ＴＲＥＭ−１、ＴＲＥＭ−１リガンド、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、およびＴＲＥＭ−１シグナル経路の他のメンバーが含まれる。ＲＡまたは喘息患者への抗ＴＲＥＭ−１結合剤、例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体の投与は、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ活性またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害および／または拮抗することによって疾患の症状を低下させうる。抗体は、単離した抗体でありうる。１の実施態様において、抗体はアンタゴニスト抗体である。別の実施態様において、抗体は中和抗体である。さらなる実施態様において、抗体は、限定されるものではないが、ＴＲＥＭ−１リガンドおよび／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰとのＴＲＥＭ−１相互作用を調節、低下および／または阻害すること；ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を調節、低下および／または阻害すること；ＴＲＥＭ−１活性化炎症性サイトカインおよび／またはケモカインの発現を調節、低下および／または阻害すること；ならびに、例えば、ＳＰＰ１などの、ＴＲＥＭ−１活性化遺伝子の発現を調節、低下および／または阻害することを含む、１つまたは複数のＴＲＥＭ−１関連活性を調節、低下および／または阻害する。本発明の抗ＴＲＥＭ−１抗体には、例えば、ＴＲＥＭ−１と特異的に結合する抗体、および／またはＴＲＥＭ−１受容体を活性化することなく膜貫通型ＴＲＥＭ−１受容体と結合する抗体が含まれる。特定の実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、結合または非結合抗体の検出を促進するために検出可能な基質で直接的または間接的に標識される。適当な検出可能な基質には、例えば、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。抗体の作製方法およびスクリーニング方法、例えば、本発明を実施するのに有用な方法は、当該分野にて既知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗら（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照のこと）。本発明の抗ＴＲＥＭ−１抗体はまた、いずれかの種由来の単一ドメイン抗体を含みうる。例えば、ＳＭＩＰ（登録商標）などの、代替結合ドメインポリペプチドはまた、ＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ活性またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害および／または拮抗するために用いられうる。抗体、またはそのフラグメントはまた、例えば、ＲＡおよび喘息などの、炎症性疾患を対象において診断、モニタリング、および／または予防するのに有用でありうる。
【実施例】
【００６６】
実施例１：ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの転写プロファイリング分析
遺伝子発現分析によるメッセンジャーＲＮＡの全体分析は、疾患病因に寄与し、新規療法の潜在的標的である遺伝子を同定する多数の疾患にうまく適用されている（Ｂａｔｔｉｗａｌｌａら（２００５） Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６（５）：３８８−９７）。遺伝子発現分析を用いて、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、例えば、ＲＡなどの炎症性疾患の療法の潜在的標的として同定された。
【００６７】
簡単に言えば、２４の滑膜組織試料は、地方研究倫理委員会から事前に承認を得て、米国リウマチ学会基準で定義されているように外科手術時にＲＡ患者から得られた。これらの２４の試料のうち、１０の試料は、関節滑膜から得られ、１４の試料は、腱鞘滑膜から得られた。８の非関与（例えば、正常）滑膜組織は、非ＲＡ患者から得られた。非関与滑膜組織は、鈍的外傷により切断術を必要とする３人の患者から単離され、滑膜は、外傷部から離れた部位から単離された。ＲＡ患者および非ＲＡ患者からの滑膜試料を採取し、液体窒素ですぐに急速冷凍し、処理するまで−８０℃で保存した。全ＲＮＡを単離し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ） ＨＧ＿Ｕ９５ＡおよびＢ（ヒト試料） ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて分析した。アレイからの発現測定値を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）ＭＡＳ４アルゴリズムによってもたらし、急上昇した基準値を基準として１００万ごとに転写物の予測値に標準化した（Ｈｉｌｌら（２００１） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２（１２）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００５５）。
【００６８】
ＲＮＡ単離
冷凍試料を分離し、組織溶解緩衝液（ＲＮＡｇｅｎｔｓ（登録商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にてＰｏｗｅｒＧｅｎ（登録商標）７００ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で溶解した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書を変更して単離した。簡単に言えば、ＲＮＡを、イソプロパノールを加えて沈殿させ、７５％冷却エタノールで２回洗浄した。ペレットを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉｋｉｔ試料溶解緩衝液（ＲＬＴ）で溶解し、ＲＮＡを、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にしたがって生成した。各試料について、全ＲＮＡを、２６０ｎｍのＵＶ吸収から定量化し、アリコートを、ＲＮＡ完全性を決定するために、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で分析した。
【００６９】
オリゴヌクレオチドアレイ分析のハイブリダイゼーション溶液の調製
二本鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｃｈｏｉｃｅ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および３３ｐＭｏｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ−ｄＴプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ，ＬＬＣ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて、５μｇの全ＲＮＡから調製した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、以下のキット成分：１Ｘの第一鎖緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、４００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＩＩ、および４０ＵのＲＮアーゼ阻害薬を添加して開始された。反応は４７℃で１時間進行した。第二鎖合成は、以下のキット成分：１Ｘの第二鎖緩衝液、２００μＭの付加的なｄＮＴＰ、４０Ｕのイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、２Ｕのイー・コリＲＮアーゼＨ、１０Ｕのイー・コリＤＮＡリガーゼを添加して進行した。反応は１５．８℃で２時間進行した。６Ｕの最終濃度の、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、第二鎖反応の最後の５分間で加えた。二本鎖ｃＤＮＡを、固相、可逆的固定化方法を用いて精製し、２０μｌ量の１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．８で回収した。精製したｃＤＮＡ（１０μｌ）を、製造業者のプロトコール（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）にしたがって、ＢｉｏＡｒｒａｙ（商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ（商標）ＲＮＡ転写物標識キット（Ｔ７）で転写した。ビオチン標識アンチセンスｃＲＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって記載されるように、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて精製した。ｃＲＮＡ収率を、２６０ｎｍのＵＶ吸収の測定値から決定した。
【００７０】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション法
ハイブリダイゼーション効率を改善するために、１５μｇのｃＲＮＡを断片化した。断片化ｃＲＮＡプローブを、製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）が示唆しているように、オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション溶液を作製するのに用いた。ハイブリダイゼーション溶液は、各々、異なる既知の濃度で、１１の原核生物ＲＮＡの混合物を含有し、各マイクロアレイの内部標準曲線を作成するのに用いられ、検出した遺伝子の頻度を決定するために補間された。ハイブリダイゼーション溶液を、４５℃で一晩２つのガラスビーズ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に予めハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液を、無菌管に除去し、１−２分間９５℃で加熱し、２分間最大速度でペレット不溶性残渣に微小遠心分離した。標識ｃＲＮＡ溶液を、１２８のヒト遺伝子配列の、２５の配列に配置するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ） Ｈｇ＿Ｕ９５Ａｖ２ ＆ Ｂ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ｃＲＮＡ溶液を回収し、マイクロアレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールにしたがって走査のために調製した。生蛍光データを回収し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）３．２アプリケーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して減らした。
【００７１】
発現プロファイリングデータの分析
一次データを、Ｈｉｌｌら（２００１） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２（１２）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００５５で記載されるハイブリッドスケール頻度標準化を用いて処理した。スケール頻度データを減らし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ（商標）ｖ７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて分析した。２種類の分析を実施した。第１では、全ての病的試料を、全ての正常試料に対して比較した。第２では、関節ＲＡ滑液を、対照関節滑膜試料の平均値に標準化し、腱鞘滑膜ＲＡ試料を、対照腱鞘滑膜試料の平均値に標準化するように、データを、疾患部位に基づき細分化した。
【００７２】
ＲＡに関連する転写物を同定するために、各病的試料からの遺伝子転写物スケール頻度を、全ての非リウマチ遺伝子転写物頻度の平均値に標準化した。対照の平均値と比べて発現レベルが増加または減少した遺伝子転写物を識別することによって、データを減らした。データ標準化工程に加えて、いくつかの統計分析を、識別データで実施した。偽発見率（ＦＤＲ）およびボンフェローニ家族単位過誤率（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｆａｍｉｌｙ−ｗｉｓｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）（ＦＷＥＲ）を、０．０５のカットオフｐ値を用いて決定した。さらに、データセットの教師なし階層的クラスタ分析およびｋ−最近傍分析を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（商標）で実施した。得られたデータセットを、教師なし階層的クラスタ分析で視覚化した。
【００７３】
第２の分析において、関節および腱の試料を、別々に分析した。関節滑膜および腱鞘滑膜の試料を、その各部位特異的対照の平均値に標準化した。同一識別および統計パラメータを、上記の各分析に適用した。２つの得られたデータセットを、Ｖｅｎｎ分析を用いて組み合わせ、遺伝子および試料の教師なし階層的クラスタ分析にかけた。ｋ−最近傍分析を、４つのパラメータ：疾患、非疾患、関節、および腱の間を識別するために用いた。該分析方法は、以下に記載されている。次いで、一番識別されている遺伝子を、試料および遺伝子の教師なし階層的クラスタ分析にかけた。
【００７４】
ｌｏｇ２変換発現測定に基づき、発現データの統計分析を実行した。試料のグループ間の倍率変化を、各グループにおけるｌｏｇ２発現レベルの平均値の差をとり、得られたｌｏｇ変化率を均等スケールに戻すことによって算出した。グループ間の差次的発現の有意性を、並べ替え検定によって決定した。簡単に言えば、Ｆ統計値を、同様の強度レベルを有するプローブセットの誤差評価の蓄積から得られた群間誤差評価を用いて、目的の各比較における各プローブセットについて算出した。測定Ｆ統計値は、試料ラベルを無作為に並べ替えた後、同一データセットから同様に計算したＦ統計値のヌル分布に言及した。差次的発現のｐ値を、各プローブセットの測定Ｆ統計値以上である並べ替えＦ統計値の割合として定義した（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ（１９９５） Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）；Ｚａｒ（１９９９） Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｓｉｍｏｎ ＆ Ｓｈｕｓｔｅｒ））。
【００７５】
結果
滑膜生検の遺伝子発現分析は、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現がＲＡ患者にて有意にアップレギュレートされることを明らかにした。図１は、ＲＡ患者からの滑膜におけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの発現を示す棒グラフである。ＴＲＥＭ−１の倍率変化を、正常な滑膜検体に標準化した。ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、非関与試料（ｎ＝８）に比べてＲＡ陽性試料（ｎ＝２４）において６．５倍（１．９８ｘ１０−６のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。さらに、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡは、非関与試料（ｎ＝８）に比べてＲＡ陽性試料（ｎ＝２４）において２倍（７．８３ｘ１０−４のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。
【００７６】
ＲＡでアップレギュレートされることに加えて、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現レベルは、ＲＡの重篤度によって変化する。１４のＲＡ患者からの腱試料は、２つの臨床的に定義された疾患サブタイプ、浸潤性および被嚢性に分類され、浸潤性ＲＡは、より進行性の形態である。ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、被嚢性腱鞘滑膜試料（ｎ＝７）に比べて浸潤性腱鞘滑膜試料（ｎ＝７）にて２．６４倍（１．３６ｘ１０−４のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。同様に、ＤＡＰ１２／Ｔｙｒｏ１２ ｍＲＮＡは、被嚢性腱鞘滑膜試料（ｎ＝７）に比べて浸潤性試料（ｎ＝７）にて１．４倍（１．６７ｘ１０ −２のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。
【００７７】
単球、好中球、およびマクロファージにおける細胞特異的遺伝子発現の比較は、炎症性細胞浸潤が、ＲＡ陽性滑膜組織におけるＴＲＥＭ−１発現レベルの増加に部分的にのみ関与することを示す。ＴＲＥＭ−１発現の増大が、ＲＡ滑膜におけるＴＲＥＭ−１陽性炎症性細胞の浸潤によるかどうかを確認するために、本発明者らは、単球（１８２遺伝子）、好中球（３２８遺伝子）およびマクロファージ（３４遺伝子）で特異的に発現する遺伝子の発現レベルに全体的に目を向けた。これらの遺伝子の平均発現レベルは、１．２２〜１．５９の範囲であり、広い標準偏差を伴う。ＴＲＥＭ−１発現の増大は、主に、細胞浸潤の大幅な増加によってよりむしろＴＲＥＭ−１遺伝子発現のアップレギュレーションによってもたらされた。
【００７８】
実施例２：ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの定量的リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡは、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて過剰発現される。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、ウシＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いて雄ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）で行われた。マウスを、１週間に少なくとも３回疾患の進行についてモニターした。個々の肢を、以下の指標：（０）正常；（１）１〜２本の指の腫れを伴う目に見える紅斑；（２）足の腫れおよび／または複数の指の腫れによって特徴付けられる顕著な紅斑；（３）足首または手首関節に及ぶひどい腫れ；および（４）手足または関節硬直の使用の困難、に基づき臨床スコアを決定した。任意の所定のマウスの全ての肢スコアの和は、１６の潜在的最大全身スコアを生じる。動物を安楽死させ、組織を種々の病期で採取した。疾患動物からのＲＮＡを、３つのスコア３の足および１つのスコア４の足から調製した。正常な動物から抽出されたＲＮＡを、４つのスコア０の足から調製した。ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡを、以下のプライマーおよびプローブを用いて定量化した：
順方向プライマー ＣＡＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡ（４１３−４３６）（配列番号：１）；
逆方向プライマー ＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＧＧ（４９４−４６８）（配列番号：２）；
プローブ ＣＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＣＧＴＣＣＣＡ（４３９−４６６）（配列番号：３）。
標準曲線を、ｍＴＲＥＭ−１の既知の濃度を用いて作成した。
ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡを、以下のプライマーおよびプローブを用いて定量化した：
順方向プライマー ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡ（２５５−２７３）（配列番号：４）；
逆方向プライマー ＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ（３２３−３０２）（配列番号：５）；
プローブ ＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴ（３００−２７９）（配列番号：６）。
【００７９】
発現の倍率変化を算出するために、ＴＲＥＭ−１ ＲＮＡレベルおよびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに標準化した。ＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、正常マウスからの足に比べてＣＩＡの足にて１３２倍アップレギュレートされ（図２）、一方、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、８．２１倍アップレギュレートされた（図２）。これらの結果は、ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１シグナル伝達に付随するタンパク質の発現がＲＡ疾患部位で上昇することをさらに確認する。
【００８０】
実施例３：免疫組織化学によるＴＲＥＭ−１発現
種々の滑膜試料の免疫組織化学は、ＴＲＥＭ−１発現がタンパク質濃度で増大するかどうかを決定するために行われた。簡単に言えば、５のＲＡ滑膜試料を、ケネディ・リウマチ研究所（Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）を通じて外科手術中に患者から得、２つのＯＡ組織を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂａｐｔｉｓｔ病院から得た。組織をホルマリン中に入れ、パラフィンに組み込んだ。免疫組織化学を、４μｍ組織断片上で行った。断片を、最初にキシレンで脱パラフィン処理し、グレードエタノール系で再水和した。ＰＢＳでの洗浄後、抗原を採取し、細胞をツイーン２０で透過処理した。試料を、標準プロトコールにしたがって、ＢｉｏｇｅｎｅｘＴＭ ｉ６０００ＴＭシステムにおいてマウス抗ＴＲＥＭ−１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で免疫染色した。二次抗体および用いる検出試薬を、Ｍａｃｈ３ＴＭ−マウスプローブＨＲＰポリマーキット（Ｂｉｏｃａｒｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）から得た。免疫組織化学染色陽性細胞を、褐色色素を有するものとして定義した。各スライドについて、滑膜表面に隣接した１０個の２００倍領域の画像（ｖｉｅｗ）を無作為に選択し、免疫組織化学陽性細胞を計測し、免疫組織化学陽性細胞指標として合計した。
【００８１】
５人のＲＡ患者からの断片における免疫組織化学は、５人の患者のうち３人においてＴＲＥＭ−１レベルが高いことを明らかにし、１人の患者ＲＡ４で非常に高レベルを観測した（表１）。ＲＡ試料の２つ（ＲＡ１およびＲＡ２）は、低ＴＲＥＭ−１レベルを有し、変形性関節炎患者からの対照試料（ＯＡ１およびＯＡ２）と同様であった（表１）。図３Ａは、抗ＴＲＥＭ−１標識ＲＡ滑膜組織試料の１の典型的な領域を図示する。図３Ｂは、対照、ＯＡ患者からの抗ＴＲＥＭ−１標識滑膜組織試料の１の典型的な領域を図示する。
【００８２】
ＲＡ試料におけるＴＲＥＭ−１陽性細胞の細胞型を確認するために、ＴＲＥＭ−１およびＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ６８またはミエロペルオキシダーゼの二重免疫組織化学を、最初にＴＲＥＭ−１抗体、次いで、ＣＤ１６３（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡからの１０Ｄ１６）、ＣＤ１４（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ＣＤ６８（Ｂｉｏｃａｒｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡからのＰＧ−Ｍ１）、またはミエロペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）抗体それぞれで染色することによって連続して行った。断片は、好中球の欠損を示唆するミエロペルオキシダーゼで染色しなかった。驚くべきことに、ＲＡ５からの断片のみＣＤ６８で染色したが、これらの断片は、ＴＲＥＭ−１で共染色しなかった。ＲＡ３およびＲＡ５からの少量（３−１０％）のＴＲＥＭ−１陽性細胞は、ＣＤ１４またはＣＤ１６３で共染色した。５つのＲＡ滑膜断片におけるこれらのマーカーおよびＴＲＥＭ−１の存在の違いは、疾患の不均一性を示した。
【表１】
【００８３】
実施例４：ヒト臨床血漿試料における可溶性ＴＲＥＭ−１の検出
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＴＲＥＭ−１タンパク質濃度が、検出可能であって、ヒトＲＡ試料において上昇することを立証するために行われた。ＲＡ患者からの血漿を、活性ＲＡおよび安定な用量のメトトレキサート（ＭＴＸ）（１週に１回７．５〜２０ｍｇ）に対する不十分な反応を伴う対象におけるフェーズＩＩの、二重盲検、プラセボ対照、並行、ランダム化、多施設、外来患者、比較研究から得た。対象は、世界８１カ所で登録された。選択された場所で、予備的バイオマーカー研究のための自発的試料採取に参加することに同意した３２人の対象は、血液試料を提供した。ここで記録されたデータは、第１日目（投与前）に得られた血漿試料からのものである。対照群血漿を、健常ボランティア多施設、前向き、非介入解析に登録された対象から採取した。各臨床施設の施設内治験審査委員会または倫理委員会は、これらの研究を承認し、各患者からインフォームド・コンセントを得る前には手続を行わなかった。
【００８４】
ヒト臨床血漿試料において可溶性ＴＲＥＭ−１を検出するためのＥＬＩＳＡプロトコールは、ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ開発システムから適合させ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ＤＹ１２７８）から商業的に入手可能である。適合ＥＬＩＳＡプロトコールは、誤検出を減少させ、標準曲線の線形動的範囲を改良した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡは、４．０ｕｇ／ｍｌの捕捉抗体および２００ｎｇ／ｍｌの検出抗体でサンドイッチ形式にて行われた。血漿試料を、ＧＦ１緩衝液で１：２比率にて希釈し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ Ｒ５４ＢＢ−３）から商業的に入手可能である。基準はまた、ニート血漿のＧＦ１緩衝液中１：２希釈液で希釈された。検出の限界は、１．３７〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲内で０．９９９のＲ２と一緒に４パラメータ曲線適合（ＸＬ−Ｆｉｔ ＩＤＢＳ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いると１．３７ｐｇ／ｍｌであった。
【００８５】
上記のＥＬＩＳＡ法を用いて、ＲＡ患者からの３２の試料および健常ボランティアからの２５の試料（ＨＶＯＳ）を試験した。図４は、ＲＡおよび対照患者（ＨＶＯＳ）から得られたヒト血漿試料においてＥＬＩＳＡによって検出された可溶性ＴＲＥＭ−１のタンパク質濃度を示すグラフである。図４に見られるように、ＲＡ血漿における可溶性ＴＲＥＭ−１の平均値は、１０．０４±１．６２６（ｎ＝３２）ｐｇ／ｍｌであったが、健常ボランティア（ＨＶＯＳ）における可溶性ＴＲＥＭ−１の平均値は、２．５４９±０．６２５３（ｎ＝２５）ｐｇ／ｍｌであった。ＲＡ血漿における可溶性ＴＲＥＭ−１の濃度は、＜０．０００１のｐ値（対応のないｔ検定）を有する、健常ボランティアのものより高い（３倍以上）。したがって、血漿中ヒト可溶性ＴＲＥＭ−１の濃度の増加の検出は、ＲＡと相関し、そして、ＲＡを示す。
【００８６】
さらに、血漿ＴＲＥＭ−１濃度の上昇とリウマチ因子の濃度の上昇との間の有意な関連性を検出した。
【００８７】
実施例５：ＴＲＥＭ−１の架橋後のマイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化
ＴＲＥＭ−１受容体活性化がマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を引き起こすか否かを決定するために、精製したヒト単球を、アイソタイプ適合対照抗体またはα−ＴＲＥＭ−１架橋抗体のいずれかで予め被覆したウェルに播種した。簡単に言えば、健常ボランティアからのヒトロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）(軟膜)を、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。次の日、細胞を単離するために、軟膜を４℃で一晩保存した。単球を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）（ＳＩＧＭＡ，Ｈ８８８９）の密度遠心分離によって製造業者のプロトコールにより、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ；１５０６８）を用いて陰性選択によって単離した。全て、５％ＣＯ２で維持した組織培養インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。精製した単球を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地で保持した。組織培養処理プレートを、組織培養インキュベーター中、５μｇ／ｍｌのα−ＴＲＥＭ−１架橋抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；ＭＡＢ１２７８）のＰＢＳ中溶液で一晩処理した。対照ウェルを、イー・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）に対するアイソタイプ適合抗体で同様に処理した。ウェルを、細胞添加の直前にＰＢＳで２回洗浄した。ウエスタンブロット法を、５〜１８０分の時間経過の間に標準的プロトコールを用いて行った（図５を参照）。α−ホスホ−ＥＲＫ、α−ホスホ−ｐ３８、およびα−ホスホ−ＪＮＫ抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ；各々９１０１、９２１１および９２５１）から購入した。α−アクチン抗体を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ａ２１０３）から購入した。図５に見られるように、架橋抗体とＴＲＥＭ−１の活性化は、ＭＡＰＫの活性化を広範囲にもたらす。ｐ３８およびＪＮＫは、ＴＲＥＭ−１活性化に反応することを以前は知られていなかった。これらの広範囲の炎症反応は、精製したヒト単球におけるＴＲＥＭ−１活性化から生じる広範囲の遺伝子発現変化によって裏付けられた（実施例１０を参照）。
【００８８】
実施例６：α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ処理後の転写プロファイリング分析
ＴＲＥＭ−１受容体の活性化により異なった形で発現される遺伝子を同定するために、転写プロファイリング分析を用いた。転写プロファイリングを用いて、偏性炎症性読み出しであるのとは対照的に、炎症性分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１；オステオポンチン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質Ｉ（ＢＳＰＩ）、早期Ｔ−リンパ球活性化１（ＥＴＡ−１）、またはＭＧＣ１１０９４０としても既知）を、ＴＲＥＭ−１活性化に特異的なマーカーとして同定した。
【００８９】
組織培養調製物およびＲＮＡ単離
多数のドナーから精製したヒト単球を、実施例９に記載されるように調製し、組織培養処理ウェルに播種した。組織培養処理ウェルを、処理しなかったか（未処理対照およびリポ多糖（ＬＰＳ）処理）、または実施例９に記載されるようにアイソタイプ対照抗体もしくはα−ＴＲＥＭ−１架橋抗体のいずれかで予め被覆した。ＬＰＳ処理について、エス・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｌ２２６２）からのゲル濾過クロマトグラフィー精製したＬＰＳを、最終濃度が１ｎｇ／ｍｌになるように添加した。次いで、５ｘ１０６単球を未処理または抗体被覆１２ウェル組織培養処理プレート中に蒔いた。処理の２時間後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールにより、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（商標）カラムおよびＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；各々７９６５４および７４１０４）を用いて単離した。高信頼分析に適している遺伝子発現変化をもたらしながら、二次的および／または分化効果の寄与を最小限にするために２時間の時点を選択した。全ＲＮＡ収量は、１−６μｇの範囲であった。全ＲＮＡを、標準的プロトコールを用いて、ＤＮアーゼ処理、次いで、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりさらに精製した。マイクロアレイ分析を、確立したプロトコールにしたがってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＨＧ＿Ｕ１３３ ２．０プラスアレイを用いて行った。各アレイについて、全プローブセットを、１００の平均強度値に標準化した。デフォルトＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オペレーティング・システム（ＧＣＯＳ）統計値を、全分析に用いた。合計１１人の健常ドナーからの単球を分析した。
【００９０】
発現プロファイリングデータの分析
＞５０シグナルで存在し、＞６６％の処理群で存在するといわれる修飾子（Ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）は、分析用とみなされた。標準化シグナル値を、ＡＮＯＶＡ分析前にｌｏｇ２値に変換した。ｐ＜０．０１および任意の処理群間の発現の２倍以上の変化を有する修飾子（ＦＣ）を、図６のヒートマップを作製するためおよびその後の分析のために用いた。倍率低下は、負の倍率変化として記録される。多数の修飾子によって示される遺伝子について、未処理試料における最大の平均強度を有する修飾子を、さらなる分析のために選択した。
【００９１】
図６は、転写プロファイリングデータのヒートマップクラスタ分析を示す。図６において、個々のドナーを左側に示し（各カラムは個々のドナーを示す）、平均強度を右側に示す；各列は個々の修飾子を示す。蛍光強度を示す。α−ＴＲＥＭ−１−処理試料を対照抗体処理試料と比べ、ＬＰＳ処理試料を未処理と比べた。階層的クラスタ化アルゴリズムを、発現の同様のパターンを有する修飾子を分類するために用いた。図６において、ブラケット領域は、ＴＲＥＭ−１活性化によりアップレギュレート、ＬＰＳによりアップレギュレート、共通ダウンレギュレート、ＴＲＥＭ−１活性化によりダウンレギュレート、またはＬＰＳによりダウンレギュレートされた修飾子に対応するヒートマップ領域を示す。
【００９２】
図７は、全ての存在コールの典型的な散布図を示す。散布図分析について、ｌｎ率変化は、ダウンレギュレーションで負の値に変換され、ＴＲＥＭ−１（ｘ軸）およびＬＰＳ（ｙ軸）にプロットした。ｌｎ（−１／ＦＣ）としてプロットした遺伝子をダウンレギュレートして、全ての存在コールに対するｌｎＦＣ（α−ＴＲＥＭ−１／対照抗体およびＬＰＳ／未処理）を算出し、プロットした。選択遺伝子を強調する。４５°軸は、両処理によって同様に調製された遺伝子を画定する。
【００９３】
図２３および２４は、ＴＲＥＭ−１活性化および／またはＬＰＳ処理に反応することが決定された遺伝子を記載する表である。図２３は、修飾子、遺伝子名、遺伝子解説、および様々な処理をした同定遺伝子の平均強度を示す。処理には、未処理（対照）、アイソタイプ抗体（対照）、α−ＴＲＥＭ−１抗体、ＬＰＳ、アイソタイプ抗体＋α−ＴＲＥＭ−１抗体、およびα−ＴＲＥＭ−１抗体＋ＬＰＳが含まれる。図２４は、同定遺伝子の修飾子ならびに異なる処理間の比較のｐ値および比率を示す。以下の処理を比較した：α−ＴＲＥＭ−１ ｖ．アイソタイプ；ＬＰＳ ｖ．未処理；α−ＴＲＥＭ−１ ｖ．ＬＰＳ；α−ＴＲＥＭ−１＋ＬＰＳ ｖ．アイソタイプ；α−ＴＲＥＭ−１ ｖ．α−ＴＲＥＭ−１＋ＬＰＳ；およびＬＰＳ ｖ．α−ＴＲＥＭ−１＋ＬＰＳ。
【００９４】
結果
複数の遺伝子は、α−ＴＲＥＭ−１処理および／またはＬＰＳ処理に反応して特異的に発現するものとして同定されたので（図７、８Ａ−Ｂ、９Ａ−Ｂ、および２３−３４を参照）、ＴＲＥＭ−１および／またはＬＰＳシグナル伝達を調節する物質を評価するためにバイオマーカーとして用いられうる。特異的に発現した遺伝子は、主要な３種類：ＴＲＥＭ−１バイアス遺伝子、ＬＰＳバイアス遺伝子、ならびにα−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ両方の処理に反応して同等に発現された遺伝子に分類された。図８Ａ−Ｂに記載の遺伝子は、ＴＲＥＭ−１／ＬＰＳ率またはＬＰＳ／ＴＲＥＭ−１率それぞれによってランクされる。ＴＲＥＭ−１／ＬＰＳ率（図８Ａを参照）およびＬＰＳ／ＴＲＥＭ−１率（図８Ｂを参照）は、直接対比較から算出され、個々の処理における倍数変化に関する任意の変化を占める。二重処理、すなわち、α−ＴＲＥＭ−１抗体およびＬＰＳ両方での処理がもたらす遺伝子発現の倍率変化はまた、図８Ａ−Ｂ、９Ａ−Ｂ、２３および２４に示される。
【００９５】
上記の識別基準に合格し、＞４倍の発現の変化が立証された遺伝子は、さらなる分析について検討された。これらの基準によって、２３８の遺伝子は、ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳのいずれかで＞４倍アップレギュレートされた。これらのうち、６９の遺伝子は、両処理にて＞４倍、または１つだけの処理にて＞４倍だが２つの処理の間の直接対比較で２倍以内に誘導された；これらの遺伝子は、一般にアップレギュレートしたとして分類されている。ＴＲＥＭ−１活性化（６２遺伝子）またはＬＰＳ処理（１０１遺伝子）のいずれかで＞４倍アップレギュレートされた残りの遺伝子は、処理特異的（すなわち、処理バイアス）であるとして分類されている。
【００９６】
ＴＲＥＭ−１活性化に反応して＞４倍アップレギュレートされるＴＲＥＭ−１バイアス遺伝子の概略は、図８Ａに示される。ＴＲＥＭ−１／ＬＰＳの比率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性化＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍アップレギュレートされた遺伝子のｐ値は、７．７ｘ１０−４〜２．６ｘ１０−１２の範囲であった。ＴＲＥＭ−１活性化によって特異的に誘発される同定された遺伝子には、ＳＰＲＹ２、サイトカインおよび関連分子（ＴＮＦＳＦ１４、ＣＳＦ１、ＳＰＰ１、ＣＣＬ７、ＩＬ１Ｆ５、ＬＩＦ）、メタロチオネイン（ＭＴ１Ｋ、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ）、ホスファターゼ（ＤＵＳＰ１４、ＤＵＳＰ４）、転写因子（ＥＧＲ２、ＡＴＦ３）、糖質代謝および／またはシグナル伝達に関与する因子（ＥＤＧ３、ＬＰＬ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＬＣＸＤ１、ＮＰＣ１、ＦＡＢＰ３、ＡＣＳＬ３）、ＭＭＰ１９、およびＰＰＡＲＧが含まれる。これらの遺伝子のうち、ＳＰＰ１は、ＴＲＥＭ−１活性化に反応して２８．０倍（ｐ＝１．２ｘ１０−０７）アップレギュレートされるが（図８Ａおよび１１Ｅを参照）、ＬＰＳ処理後あまりアップレギュレートされない。したがって、ＳＰＰ１は、偏性炎症性読み出しではなく、患者（または患者試料）およびＴＲＥＭ−１修飾剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおける、ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして有用でありうる。さらに、ＳＰＰ１はまた、患者における、炎症または慢性炎症、例えば、ＲＡの治療のためのＴＲＥＭ−１療法の有効性または潜在的有効性の指標として有用でありうる。ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして用いられうるさらなる遺伝子は、図８Ａ、２３および２４に記載されている。識別基準を満たすが、図８Ａに記載されていない遺伝子には、Ｃ６ｏｒｆ１１４、Ｃ６ｏｒｇ１２８、Ｃ９ｏｒｆ４７、ＫＩＡＡ１１９９、ＫＩＡＡ１３９３、ＬＯＣ４４０９９５、およびＭＧＣ３３２１２が含まれる。一般的に、ＴＲＥＭ−１活性化により特異的に誘発された遺伝子は、ＬＰＳ処理によっては大体影響がなかった。
【００９７】
ＬＰＳ処理に反応して＞４倍アップレギュレートされるＬＰＳバイアス遺伝子の概略は、図８Ｂに示される。ＬＰＳ／ＴＲＥＭ−１の比率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。該表におけるＬＰＳで＞４倍アップレギュレートされた遺伝子のｐ値は、１．２ｘ１０−３〜３．６ｘ１０−１４の範囲であった。ＬＰＳによって特異的に誘発される同定された遺伝子には、インターロイキン（ＩＬ２３Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＥＢＩ３、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１０、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１８）、インターロイキン受容体（ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ７Ｒ）、サイトカインおよび関連分子（ＣＳＦ３、ＣＣＬ２３、ＣＸＣＬ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＬ５、ＣＬＣ、ＥＲＥＧ、ＴＮＦＳＦ９）、脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する因子（ＳＧＰＰ２、ＰＬＡ１Ａ、ＭＧＬＬ）、キナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ８、ＲＩＰＫ２、ＭＡＰ３Ｋ４、ＴＢＫ１、ＰＩＭ３）、ＮＦ−κＢシグナル伝達のレギュレーター（ＴＮＩＰ３、ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＣＲ７、およびＣＩＡＳ１が含まれる。識別基準を満たすが、図８Ｂに記載されていない遺伝子には、Ｃ１０ｏｒｆ７８、Ｃ２１ｏｒｆ７１、ＦＬＪ１４４９０、ＦＬＪ２３２３１、ＦＬＪ２５５９０、ＦＬＪ３２４９９、ＫＩＡＡ０２８６、ＫＩＡＡ０３７６、ＬＯＣ９０１６７、ＬＯＣ１２３８７２、ＬＯＣ２８５６２８、ＬＯＣ３３８７５８、ＬＯＣ３４１７２０、ＬＯＣＬＯＣ３７４４４３、ＬＯＣ３８７７６３、ＬＯＣ４００５８１、ＬＯＣ４４１３６６、ＭＧＣ１０７４４、およびＭＧＣ１１０８２が含まれる。
【００９８】
図９Ａは、共通アップレギュレート遺伝子（すなわち、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理によりアップレギュレートされた遺伝子）の概略を示す。ＴＲＥＭ−１活性化での誘導率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性化＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍アップレギュレートされた遺伝子のｐ値は１．７ｘ１０−３〜１．５ｘ１０−１０の範囲であり、ＬＰＳのｐ値は４．１ｘ１０−３〜２．０ｘ１０−１４の範囲であった。共通にアップレギュレートされる同定された遺伝子には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーおよびモジュレーター（ＴＮＦＳＦ１５、ＢＲＥ、ＴＮＦ）、ケモカイン（ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ５、ＣＣＬ３）、他のサイトカインおよびマイトジェン因子（ＣＳＦ２、ＩＬ−６、ＡＲＥＧ）、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０）、およびＰＴＧＳ２／ＣＯＸ２が含まれる。これらの結果は、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ誘発炎症反応の両方と一致している。ＩＮＨＢＡ、凝固および血管新生因子（Ｆ３、ＥＤＮ１、ＴＦＰＩ２、ＳＥＲＰＩＮＢ２）、転写およびＤＮＡ結合因子（ＨＥＳ４、ＥＧＲ１、ＦＯＳＬ１、Ｅ２Ｆ７、ＥＧＲ３、ＭＡＦＦ、ＥＴＳ２、ＨＥＳ１）、および脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する因子（ＰＬＤ１、ＥＬＯＶＬ７、ＳＹＮＪ２、ＧＬＡ、ＳＴＡＲＤ４）もまた存在する。識別基準を満たすが、図９Ａに記載されていない遺伝子には、Ｃ２０ｏｒｆ１３９、ＫＩＡＡ１７１８、ＬＯＣ３４８９３８、ＬＯＣ４０１１５１、ＬＯＣ４０１５８８、ＬＯＣ９２１６２、およびＭＧＣ４５０４が含まれる。
【００９９】
組み合わせ（二重）処理において、図９Ａの遺伝子の大部分の発現変化は、個々の処理の変化の和の２倍以内であった。ある例外は、ｍＲＮＡ誘導が、個々の処理に対して組み合わせ処理で有意に増加した（ＴＲＥＭ−１活性化、ＬＰＳ、および組み合わせ処理でそれぞれ９．６倍、１８．９倍、および１９２．４倍）、ＣＳＦ２（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）であった。
【０１００】
ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳ処理のいずれかで＜−４（すなわち、＞４倍ダウンレギュレートされた）倍率変化を伴う遺伝子の概略は、図９Ｂに示される。ＴＲＥＭ−１活性化での誘導率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性化＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍ダウンレギュレートされる遺伝子のｐ値は５．６ｘ１０−３〜５．７ｘ１０−１２の範囲であり、ＬＰＳのｐ値は２．４ｘ１０−３〜１．１ｘ１０−１４の範囲であった。図６に見られるように、これらの遺伝子の間に処理特異性はあまりなかったけれども、同数の遺伝子を、アップレギュレートしたように本分析においてダウンレギュレートした。ダウンレギュレートされる同定された遺伝子には、ケモカイン受容体（ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１）、転写因子（ＯＬＩＧ１、ＺＮＦ５５５、ＯＬＩＧ２）、免疫関連タンパク質のＧＴＰアーゼ（ＧＩＭＡＰ６、ＧＩＭＡＰ７、ＧＩＭＡＰ８、ＧＩＭＡＰ１）、およびＣＣＬ８が含まれる。ダウンレギュレーションが単球からマクロファージへの分化のマーカーである、ＣＣＲ２は、α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ処理の両方でダウンレギュレートされる（図９Ｂを参照）。さらに、ＴＬＲ１およびＮＯＤ様受容体（ＣＡＲＤ１２、ＮＡＬＰ１２）はまた、ダウンレギュレートされる。識別基準を満たすが、図９Ｂに記載されていない遺伝子には、Ｃ９ｏｒｆ５９、ＦＬＪ１２４４２、ＦＬＪ３３６４１、ＬＯＣ９０１２０、ＭＧＣ２９４１、およびＭＧＣ１７７９１が含まれる。分析に対するｍＲＮＡ半減期の制限動力学的関与を考慮すると、ダウンレギュレーションのダイナミック・レンジは、予想通り、アップレギュレーションのものより低い。
【０１０１】
一般に、相対的に少ない遺伝子は、ある処理でダウンレギュレートしたが、他ではしなかった。一般にダウンレギュレートしなかったある遺伝子は、オリゴデンドロサイト転写因子ＯＬＩＧ２であり、ＴＲＥＭ−１活性化により３．１倍アップレギュレートし、ＬＰＳにより５．６倍ダウンレギュレートした（図９Ｂを参照）。
【０１０２】
さらに、ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳは、ＴＲＥＭ−１−バイアスであるＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ−特異的であるＧ−ＣＳＦを伴う、ＣＳＦ産生を特異的に調節する（図７、８Ａ−Ｂを参照）。
【０１０３】
実施例７：ファゴサイトーシスアッセイ
ヒトＴＨＰ−１細胞を、ＴＨＰ−１細胞形態学および行動におけるα−ＴＲＥＭ−１処理およびＬＰＳ処理の効果を比較するために、α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳで処理した。ヒトＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ−２０２）を、推奨増殖指針にしたがって維持した。視覚化の強化について、ＴＨＰ−１細胞は、指示された処理前に、組織培養処理ウェル中で５日間ＧＦＰ発現レンチウイルスが形質導入された。Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（商標）多染色性赤色１．０ミクロンマイクロスフィア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ；１８６６０）を加え、組織培養インキュベーター中で３０分間インキュベートし、成長培地で洗浄し、イメージング前に非オプソニン化ビーズを除去することによってファゴサイトーシスアッセイを行った。α−ＴＲＥＭ−１処理は、ＴＨＰ−１細胞の形態変化を誘導した（図１０Ａ）。さらに、α−ＴＲＥＭ−１処理およびＬＰＳ処理の両方は、免疫反応の刺激におけるＴＲＥＭ−１活性化の役割が一致している、標識マイクロスフィア（１μＭビーズは赤色で生じる）のファゴサイトーシスを誘発した（図１０Ｂ）。
【０１０４】
実施例８：遺伝子発現のＥＬＩＳＡプロファイリング
α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ処理に反応する選択遺伝子の差次的発現を、ＥＬＩＳＡにより確認した。製造業者のプロトコールにより訓化培地上でＥＬＩＳＡを実施した。ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳのいずれかの後に細胞培養基中に分泌されるタンパク質濃度を、８時間経過の間に測定した。ＧＭ−ＣＳＦは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に発注したカスタム被覆プレート上の検体であった。Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＮＨＢＡ、およびＳＰＰ１検出キットを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；各々ＤＭＣ００、ＤＣＳ５０、ＤＹ３３８、およびＤＯＳＴ００）。ＩＬ−２３検出キットをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；８８−７２３７）。
【０１０５】
標的タンパク質濃度の検出（括弧内は、ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳそれぞれの転写レベルの倍率変化）は、ＳＰＰ１（２８．０および３．７；図１１Ｅ）およびＭ−ＣＳＦ（２２．０および１．８；図１１Ｂ）が、ＴＲＥＭ−１活性化には反応するが、ＬＰＳ処理には反応せずにアップレギュレートされることを確認した。これらの結果はまた、分泌ＳＰＰ１タンパク質が細胞外液、例えば、組織培養基で検出可能であることを立証する。さらに、Ｇ−ＣＳＦ（１．３および４５．２；図１１Ｃ）およびＩＬ−２３（−１．１および３１．８；図１１Ｆ）のタンパク質濃度は、これらの遺伝子がＬＰＳ処理に反応してアップレギュレートされることを確認した。最終的に、ＩＮＨＢＡ（９６．７および９７．０；図１１Ｄ）およびＧＭ−ＣＳＦ（９．６および１８．９；図１１Ａ）のタンパク質濃度は、これらの遺伝子が、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理の両方に反応して同等にアップレギュレートされることを確認した。
【０１０６】
これらのＥＬＩＳＡ結果は、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理に反応する遺伝子を同定するために、転写プロファイリング分析の用途を立証する。これらの結果はまた、最初に、サイトカインまたはＴＲＥＭ−１活性化により誘導されるが、ＬＰＳによっては誘導されない関連因子を同定する。さらに、ＥＬＩＳＡ結果は、ＳＰＰ１がＴＲＥＭ−１活性化に応答してタンパク質濃度でアップレギュレートされることおよびＳＰＰ１がＴＲＥＭ−１活性化マーカーとして用いられうることを示す。ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして用いられうるさらなる遺伝子は、図８Ａ、２３および２４に記載されている。
【０１０７】
実施例９：ＴＲＥＭ−１活性化によるＲＡ患者の滑膜からのサイトカイン産生の分析
架橋抗体でのＴＲＥＭ−１の活性化は、ヒト単球および好中球の両方において炎症性因子の産生をもたらすことが示されている。したがって、本発明者らは、ＴＲＥＭ−１活性化が、ＲＡ陽性滑膜培養物において同様の炎症誘発効果を有するか否かを試験した。滑膜培養アッセイを、Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８９） Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２ Ｓｕｐｐ：１７７−８６で最初に記載されるように行った。簡単に言えば、滑膜組織を、３人の異なるＲＡ患者の関節化鏡視下膝手術中に得た（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ ｉｎ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）。試料を、輸送のために５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を有するＲＰＭＩ中に置いた。組織を分離し、細胞を放出するために、ドナー１およびドナー２からの組織を、５０ｍｌの５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および０．１５ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する５％ＦＣＳを有するＲＰＭＩで処理し、３７℃で９０分間回転させた。ドナー３からの組織は、リベラーゼブレンザイム４（Ｒｏｃｈｅ）がコラゲナーゼ／ＤＮアーゼと置換されたことを除き、同様に調製され、製造業者の提案プロトコールにしたがって用いられた。リベラーゼブレンザイム４は、実質的にエンドトキシン不含であるとして促進される。１００μｍナイロンメッシュにかけて試料を通過させることによって断片を除去した。細胞を洗浄し、プレーティングのために０．５％ＦＣＳでＲＰＭＩにて再懸濁した。ＴＲＥＭ−１の抗体活性化について、組織培養処理プレートを、細胞添加前に３時間指示濃度で、抗ｈＴＲＥＭ−１抗体（ＭＡＢ１２７８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）またはアイソタイプ適合対照抗体、抗イー・テネラ（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）のいずれかを含有する１００μｌの抗体溶液で被覆した。抗ｈＴＲＥＭ−１抗体は、０．１２、０．３７、１．１１、３．３３、および１０μｇ／ｍｌの濃度でアッセイした；対照抗体は、０．１２、１．１１、および１０μｇ／ｍｌの濃度でアッセイした。６ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で１００μｌの細胞懸濁液を添加する前に、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。２４時間後、上清を、多重ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて指示因子についてアッセイした。
【０１０８】
１個体からのデータを示す、図１２に見られるように、架橋抗体を用いるこれらの培養物におけるＴＲＥＭ−１の活性化は、用量依存的手法でＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を誘導した。全３つのドナー試料から同様の結果を得た。さらに、図１３Ａは、３つの各ドナー試料における自発的サイトカイン産生の比較を示し、図１３Ｂは、３つの各ドナー試料におけるＴＲＥＭ−１の架橋におけるサイトカイン産生の比較を示す。図１３に示されるように、ドナー３自発的サイトカイン濃度は、少量のエンドトキシン混入が共通している、ドナー１および２のものよりかなり低いが、ドナー変異性も原因でありうる。全３つのドナーからの結果は、ＴＲＥＭ−１がＲＡ培養物に機能的に存在することおよびＴＲＥＭ−１が滑膜における炎症反応を増幅しうることを示している。
【０１０９】
実施例１０：ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃトランスジェニックマウス
トランスジェニックマウスは、マウスＴＲＥＭ−１の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部（「ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ」）を含む融合タンパク質を構成的に発現するために作製された。融合構築物ヌクレオチドおよびタンパク質配列は、配列番号７および配列番号８それぞれに示されている。あるいは、トランスジェニックマウスは、ＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物が、構成的に発現されるよりむしろ誘導性プロモーターの支配下にある場合に作製されうる。可溶性ＴＲＥＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質はまた、当該分野にてよく知られており、ＬＰＳおよび敗血性ショックならびにザイモサンＡ誘導性肉芽腫形成に有効であることが示されている。
【０１１０】
ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃトランスジェニックマウスにおけるＫ／ＢｘＮ移動
マウスＫ／ＢｘＮモデルは、ＲＡを含む、多数の形態のヒト炎症性関節炎に類似するマウスモデルである（Ｄｉｔｚｅｌ（２００４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０（１）：４０−４５）。図１４に示されるように、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡ発現は、正常な足と比べてＫ／ＢｘＮ足で著しく増大した。したがって、関節炎Ｋ／ＢｘＮマウスからの血清または抗体は、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物がＫ／ＢｘＮ血清または抗体に対する炎症反応を阻害するかどうかを決定するために、実験動物に移植されうる。
【０１１１】
１の実施態様において、可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ＴＲＥＭ−１が関節性炎症を減少させるか否かを評価するために、可溶性ＴＲＥＭ−１は、Ｋ／ＢｘＮ血清が投与された。簡単に言えば、ＴＲＥＭ−１トランスジェニック（“Ｔｇ）マウスを、ＣＭＶエンハンサーおよびβ−アクチンプロモーターからなる偏在的に強力な融合プロモーターである、ＣＡＧＧＳプロモーターの支配下で可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するために、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上で作製した。全ての構築物は、ＣＡＧＧＳ／ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ／ウサギβ−グロブリンポリＡであった。トランスジェニックマウスの血漿における可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃタンパク質濃度は、約１−２ｍｇ／ｍｌであった。ＴＲＥＭ−１トランスジェニック雄マウス（ｎ＝７）および野生型雄マウス（ｎ＝７）を、０日目および２日目に１５０μｌのＫ／ＢｘＮ血清で腹腔内（ｉｐ）注射した。足首の直径を、１４日目まで定期的に測定した。
【０１１２】
図１５は、野生型対照と比べたＣ５７ＢＬ／６−ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの平均足首肥厚を示す。図１５に示されるように、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスは、６日目までに野生型マウスとして同様の表現型を発現した。７日目になると、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスでは足首の腫れは治まったが、野生型対照では腫れは継続した。次いで、足首の腫れの有意な減少は、野生型対照に比べてＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの９−１４日目（ｐ＜０．０５）から観察された。さらに、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの最大の腫れは、野生型対照において観察された最大の腫れの約半分であった。１４日目まで、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの足首の腫れは、野生型対照で観察された腫れの量の約１／４であった（図１６）。したがって、可溶性ＴＲＥＭ−１は、炎症性関節炎に付随する炎症の量を有意に低下させるのに有効であり、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節、低下および／または阻害するために、ＴＲＥＭ−１アンタゴニスト、例えば、ＴＲＥＭ−１融合タンパク質および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体の使用が、例えば、ＲＡを含む炎症性障害の有効な治療方法であることを立証している。
【０１１３】
本発明の融合タンパク質を作製するのに用いられる転写および翻訳制御配列には、限定されるものではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれうる。１の実施態様において、制御配列には、プロモーターならびに転写開始および終止配列が含まれる。
【０１１４】
プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーターをコードしうる。プロモーターは、天然プロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかでありうる。１つ以上のプロモーターの要素を組み合わせる、ハイブリッドプロモーターはまた、当該分野にて知られており、本発明に用いられうる。
【０１１５】
付加的な実験動物は、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ接合体マウスを野生型マウスに戻し交配させることによって作製され、野生型子孫は、子をはらんだ対照として役割を果たしうる。種々のｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物が炎症性疾患を保護するかどうかを決定するために、実験動物は、当該分野にて知られている種々の炎症性疾患の動物モデル、例えば、ＬＰＳ、およびＣＩＡなどで試験されうる。ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物は構成的に発現されうるか、またはｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物の発現は、ＬＰＳおよびＣＩＡの投与前に、投与と同時に、および／または投与後の１もしくは複数の時点で誘導されうる。ＴＲＥＭ−１受容体の安定形態を発現するトランスジェニックマウスはまた、炎症性疾患の推定阻害薬をスクリーンするために作製されうる。
【０１１６】
内毒素性ショックのリポ多糖（ＬＰＳ）モデルにおいて、実験動物は、ＬＰＳ誘発性ショックに対する炎症性反応を減少させるのにｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物の有効性を決定するために、ＬＰＳが注射される。さらに、実験動物は、ＣＩＡに対する炎症反応を減少させるのにｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物の有効性を決定するために、例えば、実施例２における、ＣＩＡモデルで試験されうる。
【０１１７】
ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰとＲＡとの関連性に基づき、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物は、マウスにおけるＬＰＳおよびＣＩＡ投与を保護することが期待されている。同様に、炎症性疾患、例えば、ＲＡに罹患するヒト対象に対する適当なＴＲＥＭ−１構築物および／または適当なＴＲＥＭ−１タンパク質の投与は、炎症性疾患の重篤度を低下させうる。
【０１１８】
実施例１１：抗ｈＴＲＥＭ−１抗体
抗ｈＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＲＡ滑膜培養アッセイにおいて炎症性サイトカインの産生を阻害する能力を識別される。例えば、実施例９および実施例１２における、ＲＡおよび喘息モデルは、炎症反応の１または複数の態様を中和する治療抗体を開発するための炎症性疾患のモデルとしてうまく用いられている。ＴＲＥＭ−１と炎症性疾患、例えば、ＲＡおよび喘息との関連性に一部基づき、抗ｈＴＲＥＭ−１抗体は、ＲＡ滑膜培養アッセイおよび喘息モデルにおける炎症性サイトカインの産生を阻害することが期待されている。同様に、炎症性疾患、例えば、ＲＡまたは喘息に罹患するヒト対象に対する適当な抗体の投与は、炎症性疾患の重篤度を低下および／または疾患の症状を減少させることが必要である。
【０１１９】
実施例１２：ＴＲＥＭ−１および抗ＩｇＥ抗体での投与
肥満細胞の表面上のＩｇＥの架橋が、肥満細胞活性化および脱顆粒をもたらすシグナル伝達現象を誘発するであろうという理由から、肥満細胞およびＩｇＥは、アレルギー反応、例えば、喘息またはアナフィラキシーなどの急性呼吸器障害の確立したプレーヤーである。該シグナル伝達系および肥満細胞活性化および脱顆粒の下流結果は、ラット抗マウスＩｇＥを耳に皮内（ｉｄ）注射する受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）モデルを用いてマウスにおいてインビボで調査されうる。抗ＩｇＥ抗体は、肥満細胞活性化および脱顆粒を誘導する肥満細胞の表面上のＦｃεＲＩ受容体に結合するＩｇＥと結合および交差結合するであろう。次の炎症性浮腫反応は、技術者のマイクロメータを用いて算出されうる耳の中の測定可能な腫れをもたらす。Ｉｎａｇａｋｉら「Ｍｏｕｓｅ ｅａｒ ＰＣＡ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｔｉａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ」，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７４（１）：９１−２（１９８４）。
【０１２０】
トランスジェニックＴＲＥＭ−１マウスにおける抗ＩｇＥ投与
トランスジェニックＴＲＥＭ−１マウスおよび野生型マウスは、耳の腫脹モデルを用いて抗ＩｇＥが投与された。トランスジェニックマウスは、実施例１０と同様に生産された。該実験に用いられるトランスジェニックマウス株は、約２００μｇ／ｍｌのｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃタンパク質の血液血漿濃度を含有していた。イソフルラン麻酔中に、ＴＲＥＭ−１野生型マウスおよびトランスジェニックヘテロ接合体ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃマウスの耳を、耳厚について測定した。抗マウスＩｇＥは、０．９％セイラインで１０ｎｇ／２０ｕｌに希釈された。表２に示されるように、トランスジェニックおよび野生型マウスは、左耳において０時間に抗ＩｇＥ抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ５５３４１３）が投与され、一方、別群のトランスジェニックおよび野生型マウスは、エンドトキシン不含０．９％正常セイラインビヒクルが投与された。投与後＋１時間、＋２時間、＋４時間、および＋６時間で耳測定値を得た。
【表２】
【０１２１】
図１７に示されるように、野生型対照と比べてＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスにおいて耳の腫脹の減少が観察された。したがって、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦＣキメラタンパク質を過剰発現するＣ５７ＢＬ／６マウスは皮膚の耳の腫脹を減少させているので、ＴＲＥＭ−１はインビボにおけるアレルギー反応に関与しうる。したがって、可溶性ＴＲＥＭ−１は、抗ＩｇＥ投与に付随する炎症を減少させるのに有効である。例えば、可溶性ＴＲＥＭ−１は、喘息、アナフィラキシー、急性および慢性じんま疹（じんましん）、血管性浮腫、アレルギー性鼻炎、虫さされアレルギー、およびアトピーを調節するのに有効であることが期待されている。
【０１２２】
可溶性ＴＲＥＭ−１で前処理した野生型マウスにおける抗ＩｇＥ投与
可溶性ＴＲＥＭ−１の投与が、耳の腫脹モデルにおいて炎症を保護するか否かを評価するために、マウスを可溶性ＴＲＥＭ−１融合タンパク質で前処理した。研究前日、マウスを、表３に示されるように、０．９％セイライン、ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃ（５００ｕｇ／４００ｕｌ、２５０ｕｇ／４００ｕｌ、または１００ｕｇ／４００ｕｌ）または抗イー・テネラ−ＩｇＧ ２ａ（５００ｕｇ／４００ｕｌ）のいずれかで腹腔内注射した。抗マウスＩｇＥを、０．９％セイラインで１０ｎｇ／２０ｕｌに希釈した。マウスＴＲＥＭ−１の細胞外ドメインおよび突然変異マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部（「ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃ」）（配列番号２７）を含む組換えｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃを作製した。Ｆｃ領域を、補体およびＦｃ受容体結合を減少させるために突然変異させた。ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃおよび抗イー・テネラ−ＩｇＧ ２ａ（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＮＪ）を、所望の用量レベルにＰＢＳで希釈した。投与前に、全マウスの耳を、基準耳厚を決定するために測定した。マウスは、左耳において０時間に抗ＩｇＥ（１０ｎｇ／２０ｕｌ／皮内）が投与され、一方、右耳は、０．９％正常セイライン（２０ｕｌ／皮内）が投与された。投与後＋１時間、＋２時間、＋４時間、および＋５時間で耳測定値を得た。
【表３】
【０１２３】
図１８に示されるように、可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃタンパク質を有するマウスの前処理は、対照と比べて耳の腫脹を減少させた。さらに、図１９に示されるように、耳の腫脹の減少は、用量依存的である。これらのデータは、可溶性ＴＲＥＭ−１が、抗ＩｇＥ投与に付随する炎症を減少させることおよび例えば、可溶性ＴＲＥＭ−１融合タンパク質および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体などのＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達のアンタゴニストが、抗ＩｇＥ投与に付随する炎症の治療のために患者に投与されうることをさらに立証している。例えば、可溶性ＴＲＥＭ−１および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体は、喘息、アナフィラキシー、急性および慢性じんま疹（じんましん）、血管性浮腫、アレルギー性鼻炎、虫さされアレルギー、およびアトピーを調節するのに有効であると期待されている。
【０１２４】
ＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスにおける抗ＩｇＥ投与
ＴＲＥＭ−１ヘテロ接合体（＋／−）およびホモ接合体（−／−）ノックアウトマウスを、耳の腫脹が機能的ＴＲＥＭ−１の欠損で減少するか否かを評価するために作製した。ストレートＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスを、ＴＲＥＭ−１遺伝子のエキソン１およびエキソン２を、ｌｏｘ Ｐ−隣接二重プロモーター駆動性Ｎｅｏ耐性遺伝子で置換して作製し、ＴＲＥＭ−１遺伝子におけるリーティング・フレーム移動をもたらす。遺伝子ターゲッティングを、Ｃ５７ＢＬ／６胚幹細胞で行った。ＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスは、プロタミン−Ｃｒｅマウスと交配され、Ｎｅｏ検出ＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスを作製した。０日目に、イソフルラン麻酔中に、全てのマウスの耳を、基準耳厚を決定するために測定した。表４に示されるように、マウスは、左耳において０時間に抗ＩｇＥ（１０ｎｇ／２０ｕｌ／皮内）が投与され、一方、右耳は、０．９％正常セイライン（２０ｕｌ／皮内）が投与された。抗マウスＩｇＥを０．９％セイラインで１０ｎｇ／２０ｕｌに希釈した。投与後＋１時間で耳測定値を得た。
【表４】
【０１２５】
図２０に示されるように、ＴＲＥＭ−１遺伝子にヘテロ接合体（＋／−）であるマウスおよびＴＲＥＭ−１ヘテロ接合体（−／−）ノックアウトマウスは、野生型（＋／＋）対応物と比べて抗ＩｇＧの皮内投与後の耳の腫脹反応が減少した。これは、ＴＲＥＭ−１が炎症反応に関与すること、およびＴＲＥＭ−１が、例えば、喘息、アナフィラキシー、急性および慢性じんま疹（じんましん）、血管性浮腫、アレルギー性鼻炎、虫さされアレルギー、およびアトピーなどの、ＩｇＥ媒介炎症性疾患／障害の治療標的となることをさらに立証している。したがって、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達の拮抗および／または阻害は、ＩｇＥ媒介炎症性疾患／障害に付随する炎症の程度を有意に減少させるのに有効であり、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節、低下および／または阻害するための、ＴＲＥＭ−１アンタゴニスト、例えば、ＴＲＥＭ−１融合タンパク質および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体の使用が、ＩｇＥ媒介炎症性疾患／障害の有効な治療方法であることを立証している。
【０１２６】
実施例１３：ＴＲＥＭ−１のｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡノックダウン
炎症性疾患に対する干渉ＲＮＡによる治療の有用性を立証するために、ＴＨＰ−１単球におけるＴＲＥＭ−１発現を、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡノックダウン後に測定した。簡単に言えば、種々のヒトＴＲＥＭ−１およびマウスＴＲＥＭ−１ ｓｈＲＮＡ配列を生成し、ＴＲＥＭ−１発現を減少させる能力について個々に試験した。典型的なｓｈＲＮＡ配列を表５に示す。ｓｈＲＮＡを、レンチウイルス形質導入によりＴＨＰ−１単球で発現した。ヒトＴＲＥＭ−１ ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から商業的に入手可能であり、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）によりＴＨＰ−１単球中に導入された。典型的なｓｉＲＮＡ配列を表６に示す。ノックダウン後、ＴＲＥＭ−１発現を、形質導入の７２時間後（ｓｈＲＮＡの場合）またはヌクレオフェクションの４８時間後（ｓｉＲＮＡの場合）にＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【０１２７】
図２１は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡノックダウン後のＲＴ−ＰＣＲによってＴＲＥＭ−１発現を示す棒グラフである。図２１に示されるように、ｓｈ２４７、ｓｈ５３３、ｓｈ３８２、およびプールＴＲＥＭ−１ ｓｉＲＮＡは、ｖＧＦＰおよびスクランブルｓｉＲＮＡ対照に比べて有効にＴＨＰ−１単球における内因性ＴＲＥＭ−１発現をノックダウンした。したがって、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＲＥＭ−１発現を低下させる有効な手段であるので、炎症性疾患の治療に用いられうる。
【０１２８】
ＲＮＡによる治療がＴＲＥＭ−１過剰発現を有効にノックダウンしうることを立証するために、レンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン前に、ＴＲＥＭ−１をＣＨＯ細胞で過剰発現した。１の実験において、ヒトＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞株で安定に過剰発現した。別の実験において、マウスＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞株で安定に過剰発現した。ＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現の後で、ｓｈＲＮＡを、レンチウイルスを用いて各ＣＨＯ細胞株で発現した。種々のヒトおよびマウスＴＲＥＭ−１ ｓｈＲＮＡ配列を生成し、ＴＲＥＭ−１過剰発現を低下させる能力について個々に試験した。典型的なｓｈＲＮＡ配列を表５に示している。レンチウイルスｓｈＲＮＡを暴露した後、ＴＲＥＭ−１発現レベルを、プローブとして抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットによって測定した。
【０１２９】
図２２Ａ−Ｂは、ＴＲＥＭ−１過剰発現細胞株におけるＴＲＥＭ−１のレンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン後のＴＲＥＭ−１発現を図示する典型的なウエスタンブロットを示す。図２２Ａに示されるように、ｓｈ１１４、ｓｈ２４７、ｓｈ２４７、ｓｈ２８０、ｓｈ３１５、ｓｈ３６０、ｓｈ４５０、およびｓｈ５３３は、対照に比べて有効にヒトＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現をノックダウンし、一方、ｓｈ３８２およびｓｈ６００は、ヒトＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現のノックダウンに効果がなかった。図２２Ｂに示されるように、ｓｈ７５、ｓｈ２８４、およびｓｈ４１４は、対照に比べて有効にマウスＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現をノックダウンし、一方、ｓｈ５９１は、マウスＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現のノックダウンに効果がなかった。したがって、ｓｈＲＮＡノックダウンは、ＴＲＥＭ−１過剰発現を低下させるのに有効な手段であるので、ＴＲＥＭ−１関連炎症性疾患を治療する。
【表５】
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
参照の一部
本願で引用されるすべての刊行物および特許文献は、個々の刊行物または特許文献の内容を本明細書の一部とするかの如く同一範囲で全ての目的に応じてその全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年１１月２日出願の、米国仮特許出願番号第６１／００１，６８７号、２００７年４月１１日出願の、米国仮特許出願番号第６０／９２３，１３１号、２００７年２月２８日出願の、米国仮特許出願番号第６０／９０４，２６４号、および２００７年１月１６日出願の、米国仮特許出願番号第６０／８８０，８０４号の優先権を主張し、その各々の全体開示を、出典明示により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、人口の約１−２％に影響を及ぼす自己免疫炎症性疾患である（Ｆｅｌｄｍａｎ（２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（５）：３６４−３７１；Ｍｏｕｎｔら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４（１）：１１−１２）。ＲＡは、可動関節中の骨および軟骨の慢性炎症および破壊によって特徴付けられる。疾患の発症は、典型的には、２５〜５０歳の年齢であり、３人の患者のうち１人は、２０歳までに重症身体障害者になる。
【０００３】
ＲＡの明確な病因は知られていないが、ＲＡの発症事象が感染事象または環境暴露に関与することが提唱されている（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３ Ｓｕｐｐ．）：Ｓ３９−４４）。先天性免疫の局所誘導は、滑膜表層の細胞を活性化し、遺伝的に感受性の高い個体の次の適応免疫反応の領域を刺激しうる（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３ Ｓｕｐｐ．）：Ｓ３９−４４）。罹患ＲＡ患者の滑膜は、著しい滑膜の血管内膜過形成、血管増生の増加、および下内層における炎症細胞の蓄積によって特徴付けられる。ＲＡ滑膜の生検は、多数の炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の自発的産生を明らかにしている（Ｆｅｌｄｍａｎら（１９９６） Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９７−４４０）。ＴＮＦ−α活性化を中和する抗体は、多数のサイトカインの産生を抑制するので、ＲＡを治療するための新規抗ＴＮＦ（療法を見出された。最近の臨床的所見は、ＲＡの多様性を強調し、さらなる因子が疾患の発症に寄与しうることを示唆する。
【０００４】
骨髄細胞上で発現するトリガー受容体−１（ＴＲＥＭ−１）は、好中球および一部のＣＤ１４ｈｉｇｈ単球上で主に発現する、最近になって同定された免疫グロブリン様細胞表面受容体である（Ｃｏｌｏｎｎａら（２０００） Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）：１２１−２７）。ＴＲＥＭ−１は、短い細胞内ドメインを有し、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達は、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２／ＴｙｐｒｏＢＰを介して媒介される。ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を伴う膜貫通型タンパク質であり、ＴＲＥＭ−１および他の膜貫通型受容体に関連している、アダプタータンパク質として機能する。
【０００５】
ＴＲＥＭ−１発現は、急性炎症中におよび種々のトール様受容体（ＴＬＲ）リガンドによってアップレギュレートされる（Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７；Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８；Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００６） ５４（２）：４５５−６２）。例えば、ＴＲＥＭ−１は、敗血症に付随する急性炎症に関与している（Ｃｏｌｏｎｎａ（２００３） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．３（６）：４４５−５３）。細胞表面および可溶性ＴＲＥＭ−１の発現は、疾患重症度と相関する手法で敗血症において増大する（Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８；Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３３（４）：７９２−９６）。痛風の尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）誘発性炎症モデルにおいて、ＴＲＥＭ−１発現は、浸潤性腹腔マクロファージおよび好中球で急速に誘発される。そのため、ＴＲＥＭ−１の活性化は、複数の炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を刺激する。
【０００６】
さらに、これらのサイトカインの産生におけるＴＲＥＭ−１のＴＬＲおよびＮｏｄ様受容体との相乗効果は、免疫反応を増幅する（Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７；Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８；Ｎｅｔｅａら（２００６） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．８０（６）：１４５４−６１）。これらのデータは、ＴＲＥＭ−１発現の増大およびＴＲＥＭ−１発現細胞の炎症部位への移動が、炎症反応の増幅を介して急性炎症に寄与しうることを示唆する。
【０００７】
急性炎症におけるＴＲＥＭ−１の役割は、ＴＲＥＭ−１細胞外ドメイン−Ｆｃ融合またはＴＲＥＭ−１細胞外ドメインの合成ペプチドを用いてＬＰＳまたはバクテリア誘発性敗血性ショックの致死率からマウスを保護することによってさらに立証された（Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７；Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１１）：１４１９−２６）。ＴＲＥＭ−１−Ｆｃはまた、ザイモサン−Ａ誘発性肉芽腫形成を阻止し、ＴＲＥＭ−１が慢性炎症ならびに急性炎症に関与しうることを示唆する（Ｎｏｃｈｉら（２００３） Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６２（４）：１１９１−２０１）。さらに、累積証拠は、可溶型ＴＲＥＭ−１の濃度を循環させることが、敗血症、肺炎、急性膵炎、および消化性潰瘍疾患を含む、複数の炎症性疾患のバイオマーカーであることを示す（Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３１（４）：５９４−９７；Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８；Ｗａｎｇら（２００４） Ｗｏｒｌｄ Ｊ．ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０（１８）：２７４４−４６；Ｋｏｕｓｓｏｕｌａｓら（２００６） Ｅｕｒ． Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（４）：３７５−７９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎ（２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（５）：３６４−３７１
【非特許文献２】Ｍｏｕｎｔら（２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４（１）：１１−１２
【非特許文献３】Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００５） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１（３ Ｓｕｐｐ．）：Ｓ３９−４４
【非特許文献４】Ｆｅｌｄｍａｎら（１９９６） Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９７−４４０
【非特許文献５】Ｃｏｌｏｎｎａら（２０００） Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）：１２１−２７
【非特許文献６】Ｂｏｕｃｈｏｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０（６８３２）：１１０３−０７
【非特許文献７】Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８；Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００６） ５４（２）：４５５−６２
【非特許文献８】Ｃｏｌｏｎｎａ（２００３） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．３（６）：４４５−５３
【非特許文献９】Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８
【非特許文献１０】Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３３（４）：７９２−９６
【非特許文献１１】Ｂｌｅｈａｒｓｋｉら（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（７）：３８１２−１８
【非特許文献１２】Ｎｅｔｅａら（２００６） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．８０（６）：１４５４−６１
【非特許文献１３】Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（１１）：１４１９−２６
【非特許文献１４】Ｎｏｃｈｉら（２００３） Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６２（４）：１１９１−２０１
【非特許文献１５】Ｇｉｂｏｔら（２００５） Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．３１（４）：５９４−９７
【非特許文献１６】Ｇｉｂｏｔら（２００４） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（５）：４５１−５８
【非特許文献１７】Ｗａｎｇら（２００４） Ｗｏｒｌｄ Ｊ．ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０（１８）：２７４４−４６
【非特許文献１８】Ｋｏｕｓｓｏｕｌａｓら（２００６） Ｅｕｒ． Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １８（４）：３７５−７９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの過剰発現が自己免疫および／または炎症性疾患の存在に関連するという所見に一部基づいている。したがって、ＴＲＥＭ−１および／またはＤａｐ１２／ＴｙｒｏＢＰは、自己免疫および炎症性疾患の治療または予防のための新規の治療標的となる。１の態様において、本発明は、炎症性疾患を治療または予防するためのＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰアンタゴニストの使用に関する。本発明に用いられうるアンタゴニストには、例えば、抗体（例えば、以下にさらに詳細に記載するように、例えば、ヒト、マウス、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むいずれかの種由来の抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体を含む）；可溶性受容体（切断型受容体、天然可溶性受容体、または第２タンパク質、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部と融合する受容体（またはそのフラグメント）を含む融合タンパク質）；ペプチド阻害薬；低分子；リガンド融合；および結合タンパク質が含まれる。ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰはＲＡ患者において過剰発現されるので、これらの遺伝子はＲＡに有効なバイオマーカーとなる。ＴＲＥＭ−１は、特定の細胞型、例えば、好中球および一部の単球上に発現される細胞受容体であり、ＴＲＥＭ−１はまた可溶型で存在する。ＴＲＥＭ−１シグナル伝達は、アダプタータンパク質、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰを介して媒介される。ＴＲＥＭ−１の活性化は、炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を誘導する。したがって、ＴＲＥＭ−１の発現の上昇は、ＲＡ、喘息、および他の炎症性疾患、例えば、慢性炎症性疾患および呼吸器炎症性障害／疾患で観察される炎症をもたらすかまたは寄与しうる。したがって、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、ＲＡおよび他の炎症性障害に付随する症状を治療、調節および／または予防するための有望な治療標的となる。
【００１０】
１の態様において、本発明は、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させることによって、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療方法を提供する。ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させることには、ＴＲＥＭ−１受容体および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達に関与する他の分子（例えば、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ）を修飾、阻害、および／または拮抗することによって、ＴＲＥＭ−１媒介炎症に付随する症状を軽減、治療、予防、緩和および／または改善することが含まれうる。いくつかの実施態様において、ＴＲＥＭ−１タンパク質発現は、ＴＲＥＭ−１転写を阻害することによって；内因性ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡを選択的に切断することによって；または内因性ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって低下する。例えば、ＴＲＥＭ−１タンパク質発現は、干渉ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ（例えば、配列番号９−２２のいずれかによってコードされるｓｈＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号２３−２６のいずれか）を投与することによって低下する。他の実施態様において、ＴＲＥＭ−１活性化は、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に結合する抗体または抗体フラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合する抗体または抗体フラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体またはそのリガンド結合タンパク質、あるいは可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質を投与することによって阻害される。本発明のさらなる実施態様は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達経路の非ＴＲＥＭメンバー（例えば、ＴＲＥＭ−１付属タンパク質ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ）を直接阻害することによって、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達は、対象における内因性ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質に対する免疫反応を誘発することによってヒト患者で低下する。例えば、アジュバントおよびＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含む免疫原性組成物は、内因性タンパク質に対する免疫反応を引き起こすために対象に投与されうる。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、受容体を活性化することなくＴＲＥＭ−１に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。抗体または抗体フラグメントは、例えば、モノクローナルでありうる。本発明のさらなる実施態様は、受容体を活性化することなくＴＲＥＭ−１に結合する抗体または抗体フラグメントの治療上有効な量を対象に投与する工程を含む対象（例えば、ヒト患者）の治療方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、配列番号９−２２のいずれかによってコードされるｓｈＲＮＡを提供する。
【００１３】
本発明は、ＴＲＥＭ−１の活性化が、多数の遺伝子、例えば、ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして用いられうる、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）の差次的発現をもたらすことを提供する。したがって、別の態様において、本発明は、特異的で、ＴＲＥＭ−１活性を示すマーカーを提供する。１種または複数のこれらのマーカーの濃度変化は、ＴＲＥＭ−１活性の変化に相関する。したがって、本発明はまた、ＴＲＥＭ−１活性、および／または１種もしくは複数のこれらのマーカーを検出することによって、かかる治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者）に投与されるＴＲＥＭ−１修飾剤の有効性を評価する方法を提供する。例えば、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１；オステオポンチン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質Ｉ（ＢＳＰＩ）、早期Ｔ−リンパ球活性化１（ＥＴＡ−１）、またはＭＧＣ１１０９４０としても知られている）濃度は、患者または患者からの試料で検出することができ、ＳＰＰ１濃度の変化は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の変化に相関する。ＳＰＰ１濃度は、患者または患者からの任意の臨床的に関連する試料、例えば、体液試料（例えば、血清、髄液、気管気管支粒体、唾液）で検出されうる。１の実施態様において、該方法には、ＳＰＰ１濃度を基準濃度と比較し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の増加がＴＲＥＭ−１活性の増加を示し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の減少がＴＲＥＭ−１活性の減少を示しうるところのさらなる工程が含まれる。基準濃度は、例えば、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前に患者または患者からの試料で検出されるＳＰＰ１濃度でありうる。本発明に記載のＴＲＥＭ−１活性を評価するために用いられうるさらなるマーカーは、以下にさらに詳細に記載され、例えば、図８Ａに記載されている。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節しうる候補薬剤のスクリーニング方法を提供する。該方法には、ＴＲＥＭ−１発現細胞を候補薬剤と接触させ、候補薬剤がＴＲＥＭ−１活性化を調節するか否かを決定するためにＴＲＥＭ−１発現細胞の分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を評価することが含まれる。本発明にしたがってスクリーンされうる候補薬剤には、例えば、干渉ＲＮＡ、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に結合する抗体またはそのフラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合する抗体またはそのフラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、およびその組み合わせが含まれる。他の実施態様において、該方法には、ＴＲＥＭ−１発現細胞をＴＲＥＭ−１活性化因子（例えば、架橋抗体）と接触させることが含まれる。さらに他の実施態様において、該方法には、求めたＳＰＰ１濃度を基準濃度と比較することが含まれうる。基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の増加は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の増加を示し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の減少は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の減少を示しうる。１の実施態様において、基準濃度は、ＴＲＥＭ−１発現細胞を候補薬剤と接触させる前に求められたＴＲＥＭ−１発現細胞のＳＰＰ１濃度に相当する。本発明に記載のＴＲＥＭ−１活性を評価するために用いられうるさらなるマーカーは、以下にさらに詳細に記載され、例えば、図８Ａに記載されている。
【００１５】
本発明の別の態様は、炎症または慢性炎症の治療を受けた患者のモニタリング方法を提供する。該方法には、それを必要とする患者（例えば、ヒト患者）にＴＲＥＭ−１修飾剤を投与すること、患者または患者からの試料で分泌リンタンパク質（ＳＰＰ１）濃度を検出すること、および検出ＳＰＰ１濃度を基準濃度と比較することが含まれる。ＳＰＰ１濃度は、患者または患者からの試料、例えば、体液試料（例えば、血清、髄液、気管気管支流体、唾液）で検出されうる。基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の低下は、ＴＲＥＭ−１媒介炎症の低下を示し、基準濃度と比較したＳＰＰ１濃度の変化なしまたは増加は、それぞれ、ＴＲＥＭ−１媒介炎症の変化なしまたは増加であることを示しうる。いくつかの実施態様において、基準濃度は、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前または同時に患者または患者からの試料で検出されたＳＰＰ１濃度に相当する。他の実施態様において、基準濃度は、対照患者（例えば、ヒト）または対照患者からの試料のＳＰＰ１濃度に相当し、ここで、対照患者は、慢性炎症を伴わないことが知られている。本発明に記載のＴＲＥＭ−１活性を評価するために用いられうるさらなるマーカーは、以下にさらに詳細に記載され、例えば、図８Ａに記載されている。
【００１６】
別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の存在の検出方法に関する。炎症性疾患には、例えば、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬性関節炎、ループス性関節炎、強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、自己免疫性皮膚疾患、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病（Ｉ型）；例えば、皮膚（例えば、乾癬、急性および慢性じんま疹（じんましん））、心臓血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）および膵臓（例えば、膵炎）の炎症性疾患；心臓血管疾患、例えば、コレステロール代謝性障害、酸素フリーラジカル損傷；損傷治癒に付随する障害；高級胃障害、例えば、喘息およびＣＯＰＤ（例えば、嚢胞性線維症）；急性炎症性疾患（例えば、内毒素血症、敗血症、敗血性ショック、毒素性ショック症候群および感染性疾患）；移植片拒絶反応およびアレルギー（例えば、アナフィラキシー、血管性浮腫、アトピー、虫さされアレルギー、アレルギー性鼻炎）が含まれる。本発明にしたがって検出されうるさらなる病態には、虚血が含まれる。該方法には、対象または対象から得られた試料において、ＴＲＥＭ−１（例えば、膜結合型ＴＲＥＭ−１、可溶性ＴＲＥＭ−１）またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程が含まれる。（本願において、「または」は「および／または」を意味しうるので、該方法には、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの両方の検出が含まれ、必要に応じて、発現および活性の検出が含まれうる）。本発明の該方法および他の方法の実施に有用な試料は、例えば、免疫系の組織における、または慢性炎症の部位に予め曝された組織もしくは流体における（例えば、血液、血漿、またはリンパ液）を循環しようと慢性炎症の部位に局在しようと、例えば、関節組織、滑液、滑膜、または他の臨床的に関連のある体液または組織を含む試料を含む、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが検出されうる任意の試料である。ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の上昇の検出は、例えば、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＡなどの炎症性疾患の存在を示す。該方法には、対象、または対象由来の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を既知の基準濃度と比較するさらなる工程が含まれうる。比較結果（例えば、発現または活性の増加）は、炎症性疾患の存在を示す。基準濃度は、例えば、炎症性疾患の存在、または正常発現と増大した発現を区別するための閾値を示しうる。
【００１７】
本発明はまた、対象または対象からの試料でＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現を検出すること、および対象または試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現を基準濃度と比較することによって、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＡまたは喘息などの炎症性疾患の存在を検出する方法を提供する。比較結果（例えば、発現の増加）は、炎症性疾患の存在を示す。基準濃度は、炎症性疾患の存在、または正常と増大した発現を区別するための閾値などを示しうる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患のモニタリング方法を提供する。該方法は、（対象において異なる時間で決定されるようにまたは異なる時間で対象から得られた試料で決定されるように）時間による対象におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の変化が病態の変化の指標として用いられうるという認識の恩恵を受ける。該方法には、２もしくは複数の異なる時間（最初および第２の、後の時間と本明細書で称される時々）の対象または２もしくは複数の異なる時間の対象から得られた試料における、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出することならびに観察された発現または活性を比較することが含まれる。時間によるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の低下は、炎症性疾患の低下を示しうる、一方、時間によるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性の増加は、炎症性疾患の増加を示しうる。
【００１９】
モニタリング方法はまた、対象（例えば、ヒト患者）における、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療を評価するのに有用である。治療は、対象におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する第２の、後の時間前あるいは第２の、後の試料を得る前に行われる。治療は、モニタリング方法を開始する前または後（対象における最初の検出または対象からの最初の試料を得る前または後）に行われうる。そのため、治療方針は、最初または最初の試料のＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性と第２の、後の時間または第２の試料のＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性との比較に基づき変更されうる。
【００２０】
これらのおよび他の本発明の態様および実施態様はまた、本願の以下の項目に記載されており、本発明の特定の実施態様を強調するために提供され、本発明を限定することを意図とするものではなく、その範囲は、特許請求の範囲によってのみ特定される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つの彩色図面を含有する。彩色図面（複数）を伴う該特許公報または特許出願公開公報の写しは、請求および必要な手数料の支払に応じて特許庁によって提供されるであろう。
【００２２】
【図１】図１は、ＲＡ患者からの滑膜におけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現を示す棒グラフである。
【図２】図２は、マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＴＲＥＭ−１陽性指数＞１０００を有するＲＡ陽性滑膜部分におけるヒトＴＲＥＭ−１の免疫組織化学染色の典型的な画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＲＥＭ−１陽性指数＜２０を有する変形性関節炎（ＯＡ）対照部分におけるヒトＴＲＥＭ−１の免疫組織化学染色の典型的な画像を示す。
【図４】図４は、ＲＡおよび対照（ＨＶＯＳ）患者から得られたヒト血漿試料におけるＥＬＩＳＡによって検出された可溶性ＴＲＥＭ−１濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、ＴＲＥＭ−１の架橋後のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化の経時変化を図示する典型的なウエスタンブロットを示す。
【図６】図６は、ｐ＜０．０１を有する＞２倍に調節された遺伝子の典型的なＡＮＯＶＡヒートマップクラスタ分析を示す。個々のドナーを左側に示し、平均強度を右側に示す。
【図７】図７は、全ての存在遺伝子（「コール」）の典型的な散布図を示す。Ｌｎ率変化は、負の値に変換されたダウンレギュレーションを伴って、ＴＲＥＭ−１（ｘ軸）およびＬＰＳ（ｙ軸）にプロットされた。選択遺伝子を強調する。４５°軸は、両処理により同等に調節された遺伝子を画定する。
【図８Ａ】図８Ａは、ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍アップレギュレートされる典型的な遺伝子を記載する表を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＬＰＳでの処置で＞４倍アップレギュレートされる典型的な遺伝子を記載する表を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、一般に＞４倍アップレギュレートされる典型的な遺伝子、すなわち、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理の両方でアップレギュレートされる遺伝子を記載する表を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳ処理のいずれかで＞４倍ダウンレギュレートされる典型的な遺伝子を記載する表を示す。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、ＧＦＰ発現ヒト単球ＴＨＰ−１細胞での典型的なファゴサイトーシスアッセイの結果を示す。１μＭビーズは赤色で生じる。図１０Ａは、処理後のＴＨＰ−１細胞の形態変化を示す。図１０Ｂは、α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳでの処理が、マイクロスフィアファゴサイトーシスを誘発することを示す。
【図１１】図１１Ａ−Ｆは、典型的な経時的ＥＬＩＳＡを示すグラフである。図１１ＡはＧＭ−ＣＳＦを示し、図１１ＢはＭ−ＣＳＦを示し、図１１ＣはＧ−ＣＳＦを示し、図１１ＤはＩＮＨＢＡ（インヒビン、βＡ（アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、αペプチド））を示し、図１１ＥはＳＰＰ１を示し、図１１ＦはＩＬ−２３を示す。
【図１２】図１２は、ＴＲＥＭ−１の架橋結合が用量依存的にＲＡ組織試料中の多数のサイトカインの産生を誘導することを示す一連の棒グラフである。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、３つの異なるドナーから調製された組織試料における複数の産生サイトカインを示すチャートである。図１３Ａは、３つのドナー試料における自発的サイトカイン産生の比較を示す。図１３Ｂは、３つのドナー試料におけるＴＲＥＭ−１の架橋におけるサイトカイン産生の比較を示す。
【図１４】図１４は、Ｋ／ＢｘＮ足におけるＴＲＥＭ−１発現の増大を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、Ｋ／ＢｘＮ血清輸送に対する反応における、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦＣトランスジェニックマウスおよび野生型マウスの足首肥厚を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｋ／ＢｘＮ血清輸送に対する反応における、１４日目のｍＴＲＥＭ−１−ｈＦＣトランスジェニックマウスの足首肥厚を示すグラフを示す。
【図１７】図１７は、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスにおける抗ＩｇＥ抗体投与後の耳の腫脹を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃタンパク質で前処理したマウスにおける抗ＩｇＥ抗体投与後の耳の腫脹を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃタンパク質で前処理したマウスにおける抗ＩｇＥ抗体投与後の耳の腫脹の用量反応を示すグラフである。
【図２０】図２０は、抗ＩｇＥ抗体投与後のＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスにおける耳の腫脹を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡノックダウン後のＲＴ−ＰＣＲによってＴＲＥＭ−１発現を示す棒グラフである。
【図２２】図２２Ａ−Ｂは、ＴＲＥＭ−１過剰発現細胞株におけるＴＲＥＭ−１のレンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン後のＴＲＥＭ−１発現を図示する典型的なウエスタンブロットを示す。
【図２３】図２３は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３＿プラス２．０アレイを用いて精製ヒト単球の全遺伝子発現プロファイリングからの結果を要約する表である（実施例６を参照）。
【図２４】図２４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３＿プラス２．０アレイを用いて精製ヒト単球の全遺伝子発現プロファイリングからの結果をさらに要約する表である（実施例６を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に用いられる、「核酸」なる語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、必要に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）をいう。該用語はまた、記載されている実施態様に適用できるように、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことを理解する必要がある。
【００２４】
本明細書に用いられる、「ＲＡ陽性」、「ＲＡ試料」、および「ＲＡ組織」は、対象、または任意の組織、流体、あるいは関節リウマチを伴う対象由来の他の試料をいう。「ＲＡ陰性」は、対象、または任意の組織、流体、あるいは疾患に罹患していない対象由来の他の試料をいう。
【００２５】
本明細書に用いられる、「ＲＡ」なる語は関節リウマチをいう。本明細書に用いられる、「ＯＡ」なる語は変形性関節炎をいう。
【００２６】
「抗体」なる語には、無傷分子ならびにその機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一変数ドメイン抗体（Ｄａｂ）、ダイアボディ（二価および二重特異性）、およびキメラ（例えば、ヒト化）抗体が含まれ、それらは、組換えＤＮＡ技術を用いて全抗体またはデノボ合成された抗体の修飾によって産生されうる。これらの機能的抗体フラグメントは、それらの各抗原または受容体と選択的に結合する能力を保有する、抗体および抗体フラグメントは、限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの抗体ならびに任意のサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）由来でありうる。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。抗体はまた、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植、またはインビトロ生成抗体でありうる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有しうる。抗体はまた、例えば、κまたはλから選択される軽鎖を有しうる。抗体の定常領域は、抗体の性質を修飾するために（例えば、１種または複数のＦｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能、または補体機能を増加または減少するために）変化、例えば、変異しうる。典型的には、抗体は、所定の抗原、例えば、障害、例えば、神経変性、代謝性、炎症性、自己免疫および／または悪性疾患に付随する抗原に特異的に結合する。
【００２７】
本発明の抗体はまた、単一ドメイン抗体でありうる。単一ドメイン抗体には、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体が含まれうる。例として、限定されるものではないが、重鎖抗体、軽鎖が天然に欠損している抗体、通常４鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、改変抗体および抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、先行技術のいずれか、または任意の次世代の単一ドメイン抗体でありうる。単一ドメイン抗体は、限定されるものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む、任意の種から得られうる。本発明の１の態様において、単一ドメイン抗体は、魚で見出された免疫グロブリンの可変領域から得られうる、例えば、サメの血清中で見出された新規抗原抗体（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプから得られる。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域から得られる単一ドメイン抗体の産生方法は、ＷＯ０３／０１４１６１およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。本発明の別の態様にしたがって、単一ドメイン抗体は、軽鎖が欠損している重鎖抗体として知られている天然単一ドメイン抗体である。かかる単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ９４０４６７８に記載されている。明確な理由で、該軽鎖を天然に欠損している重鎖抗体から得られる可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの通常ＶＨと区別するためにＶＨＨまたはナノ体として本明細書で知られている。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコでもたらされる抗チアから得られうる。ラクダ科に加えて他の種は、軽鎖を天然に欠損している重鎖抗体を産生しうる；かかるＶＨＨは、本発明の範囲内にある。
【００２８】
本発明はまた、ＣＨ１以外の、免疫グロブリン重鎖からの１つまたは複数の天然または改変定常領域、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域に順に融合するかあるいは結合する、典型的には、免疫グロブリンヒンジまたはヒンジ作用領域ポリペプチドに融合するかまたは結合する結合ドメインポリペプチドを含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を表す低分子免疫医薬品（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）の使用を意図とする（さらに詳細な記載については、例えば、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．らによるＵ．Ｓ．２００５／０１３６０４９を参照）。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質には、ヒンジ領域ポリペプチドに融合するかあるいは結合する天然または改変免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ペプチド（またはＩｇＥから全体でもしくは部分で得られた構築物の場合、ＣＨ３）ならびにＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥから全体でもしくは部分で得られた構築物の場合、ＣＨ３）に融合するかあるいは結合する天然または改変免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥから全体でもしくは部分で得られた構築物の場合、ＣＨ４）を含む領域がさらに含まれうる。典型的には、かかる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、補体結合、および／または標的、例えば、標的抗原への結合からなる群より選択される少なくとも１つの免疫学的活性能がある。
【００２９】
本明細書に用いられる「アンチセンス」なる語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」なる語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖について用いられる。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに逆方向である目的遺伝子（複数）を連結することによる合成を含む、任意の方法によって産生されうる。細胞に導入されるとすぐに、転写鎖は、二本鎖を形成するために細胞によって産生される天然配列を組み合わせる。次いで、これらの二本鎖は、さらなる転写または翻訳のいずれかを阻害する。「負」なる表示は、アンチセンス鎖について時々用いられ、「正」は、センチ鎖について時々用いられる。
【００３０】
本明細書に用いられる、「対象」および「患者」なる語は、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物をいう。
【００３１】
本明細書に用いられる、「検出する」なる語および「検出する」なる語幹の他の全ての形態は、１つまたは複数の標的の存在または不存在の確認、１つまたは複数の標的の定量化、あるいは１つまたは複数のバイオマーカーの閾値の存在または不存在の決定をいう。
【００３２】
本明細書に用いられる、「関節組織」なる語は、非限定的な例として、腱、靱帯、および滑膜を含む、接合面から得られる任意の組織または流体をいう。
【００３３】
本明細書に用いられる、「炎症性疾患」なる語には、非限定的な例として、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬性関節炎、ループス性関節炎または強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、自己免疫性皮膚疾患、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病（Ｉ型）；例えば、皮膚（例えば、乾癬、急性および慢性じんま疹（じんましん））、心臓血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）および膵臓（例えば、膵炎）の炎症性疾患；心臓血管疾患、例えば、コレステロール代謝性障害、酸素フリーラジカル損傷；損傷治癒に付随する障害；呼吸器障害、例えば、喘息およびＣＯＰＤ（例えば、嚢胞性線維症）；急性炎症性疾患（例えば、内毒素血症、敗血症、敗血性ショック、毒素性ショック症候群および感染性疾患）；移植片拒絶反応およびアレルギー（例えば、アナフィラキシー、血管性浮腫、アトピー、虫さされアレルギー、アレルギー性鼻炎）が含まれる。
【００３４】
本明細書に用いられる、「慢性炎症性疾患」なる語は、炎症反応の持続時間が長い場合（例えば、数週間、数ヶ月、あるいは無期限）ならびに時間的経過の延長が組織の炎症の原因刺激の持続によって引き起こされる場合の任意の疾患をいう。「慢性炎症性疾患」なる語には、例えば、関節リウマチが含まれる。
【００３５】
本明細書に用いられる、「示す」なる語（例えば、炎症性疾患を示す）は、それ自体は決定的証拠であることとは対照的に、考えられる兆しまたは指標または因子を意味する。一般的に、ＴＲＥＭ−１発現レベルの増大は、炎症性疾患（例えば、ＲＡ）の可能性の増大と相関する、そのため、ＴＲＥＭ−１発現の増大は、炎症性疾患（例えば、ＲＡ）の存在を示す。同様に、正常ＴＲＥＭ−１発現レベルは、一般的に、炎症性疾患（例えば、ＲＡ）の不在の可能性の増大と相関する。
【００３６】
本明細書に用いられる、「ＰＣＲ」なる語は、ポリメラーゼ連鎖反応をいう。
【００３７】
本発明は、例えば、慢性炎症性疾患などの炎症性疾患のバイオマーカーとして、より具体的には、ＲＡのバイオマーカーとしてのＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの同定を含む。ＲＡの転写プロファイリングと正常滑膜組織の比較は、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡ発現が、ヒトＲＡ試料にて正常の６．５倍以上アップレギュレートされ、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現が、ヒトＲＡ試料にて正常の２倍以上アップレギュレートされることを明らかにした（実施例１を参照）。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、正常マウスの足に比べてＣＩＡの足では１３２倍アップレギュレートされ、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡは、正常マウスの足に比べてＣＩＡの足では８．２１倍アップレギュレートされた（実施例２を参照）。免疫組織化学によって、ヒトＲＡ滑膜試料は、増加したＴＲＥＭ−１発現細胞を含有していた（実施例３を参照）。そのため、滑膜培地におけるＴＲＥＭ−１の活性化は、用量依存的手法で炎症性サイトカインおよびサイトカイン産生を誘導した（実施例９を参照）。さらに、可溶性ＴＲＥＭ−１レベルは、対照患者と比較してＲＡ患者からのヒト臨床血漿試料で上昇する（実施例４を参照）。ＲＡのバイオマーカーとしてのＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの同一性ならびにＴＲＥＭ−１の炎症反応を誘導する能力は、ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１シグナル経路のメンバーを、例えば、慢性炎症性疾患、特にＲＡなどの、炎症性疾患の望ましい治療標的にする。
【００３８】
遺伝子発現の検出
本発明は、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの発現または活性を検出するかまたは定量化することによって、例えば、慢性炎症性疾患などの炎症性疾患の検出およびモニタリング方法を提供する。定量化の有無に関わらず、目的のタンパク質、核酸、または活性レベルの多数の検出方法は、既知であり、本発明の実施に用いられうる。
【００３９】
標的遺伝子転写物は、当該分野にて既知である多数の技法を用いて検出されうる。いくつかの有用な核酸検出システムは、試料の精製された核酸画分を調製すること、および該試料を直接検出アッセイまたは増幅過程、次いで、検出アッセイ、例えば、関節組織中ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡのアッセイを対象とすることに関与する。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）および共役ＲＴ−ＰＣＲによって達成されうる。核酸の検出は、例えば、目的核酸にハイブリダイズするプローブを有する精製された核酸画分を探索することによって達成することができ、多くの場合、検出は、同様に増幅に関与する。ノーザンブロット法、ドットブロット法、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、全ての既知の試料中の核酸を検出する方法である。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、ＳＤＡ法（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、自家持続配列複製法または核酸配列増幅法によって増幅されうる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２（９）：ｌ；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８；およびＷｅｉｓｓ（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９２を参照のこと。核酸はまた、スプライシングによって検出することができ、スプライシングは、標的核酸に特異的なプライマー（例えば、ＴＲＥＭ−１ ｃＤＮＡ配列）または標的核酸に結合したアダプター配列に対するプライマーを用いうる。無作為に選択されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのスプライシングは、バイオマーカー（例えば、ＴＲＥＭ−１ ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列）に対応する核酸配列を含有する全ての配列転写物の割合によって示されるバイオマーカーの相対的発現の指標を提供しうる。あるいは、核酸は、抽出または精製することなく、例えば、ハイブリダイゼーションによって、インサイツで検出されうる。
【００４０】
標的タンパク質は、例えば、１種または複数の抗体を用いて免疫学的に検出されうる。免疫アッセイにおいて、バイオマーカーに対し特異的結合アフィニティーを有する抗体またはかかる抗体に結合する二次抗体は、直接的または間接的のいずれかで標識されうる。抗体は完全である必要はない：抗体可変ドメインまたはその人工アナログ、例えば、一本鎖抗体は、十分である。適当な標識には、限定されるものではないが、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、または１４Ｃ）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ、ローダミン、またはＰＥ）、発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡが提供するＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）、所定の波長の光を吸収する化合物、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）が含まれる。抗体は、ビオチンとの抱合によって間接的に標識され、次いで、上記分子で標識されたアビジンまたはストレプトアビジンで検出されうる。標識の検出または定量化方法は、標識の特性に依存し、当該分野にて既知である。検出器の例として、限定されるものではないが、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、および密度計が挙げられる。当業者に既知のこれらのアプローチの組み合わせ（「多層」アッセイを含む）は、アッセイの感度を高めるために用いられうる。
【００４１】
標的タンパク質を検出するための免疫アッセイは、サンドイッチ分析、競合アッセイ（競合ＲＩＡ）、またはブリッジ免疫アッセイを含む、種々の既知の形式で実施されうる。例えば、米国特許番号第５，２９６，３４７号；第４，２３３，４０２号；第４，０９８，８７６号；および第４，０３４，０７４号を参照のこと。標的タンパク質の検出方法は、一般的に、生物試料をタンパク質に結合する抗体と接触させることおよびタンパク質の抗体に対する結合を含む。例えば、ＴＲＥＭ−１に特異的な結合アフィニティーを有する抗体は、種々の当該分野にて既知の方法のいずれかによって固定基質上で固定され、次いで、生物試料に曝されうる。固体基質上のＴＲＥＭ−１の抗体に対する結合は、表面プラズモン共鳴の現象を利用することによって検出することができ、適当な装置、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ，Ｒａｐｓｇａｔａｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって定性的または定量的に検出されうる結合における表面プラズモン共鳴の強度の変化をもたらす。あるいは、抗体は、上記のように、標識および検出されうる。既知のタンパク質量を用いる標準曲線は、バイオマーカーレベルの定量化に役立てるために作成されうる。
【００４２】
他の実施態様において、捕捉抗体が固体基質上で固定される「サンドイッチ」分析は、標的タンパク質の濃度を検出するために用いられる。固体基質は、試料中の任意の標的タンパク質が固定化抗体に結合しうるように生物試料と接触されうる。抗体に結合する標的タンパク質の濃度は、標的タンパク質に特異的な結合アフィニティーを有する「検出」抗体および上記の方法を用いて測定されうる。これらのサンドイッチ分析において、捕捉抗体が、検出抗体として同一エピトープ（またはポリクローナル抗体の場合、エピトープの範囲）に結合する必要がないことは理解される。したがって、モノクローナル抗体が、捕捉抗体として用いられるならば、検出抗体は、捕捉モノクローナル抗体が結合するエピトープから完全に物理的に分離されるかまたはそれと部分的にのみ重複するエピトープに結合する別のモノクローナル抗体、あるいは捕捉モノクローナル抗体が結合するもの以外のまたはそれを加えたエピトープに結合するポリクローナル抗体でありうる。ポリクローナル抗体が捕捉抗体として用いられるならば、検出抗体は、捕捉ポリクローナル抗体が結合するエピトープのいずれかから完全に物理的に分離されるかまたはそれと部分的に重複するエピトープに結合するモノクローナル抗体、あるいは捕捉ポリクローナル抗体が結合するもの以外のまたはそれを加えたエピトープに結合するモノクローナル抗体のいずれかでありうる。サンドイッチ分析は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチウエスタンブロット法アッセイ、またはサンドイッチ免疫磁性検出アッセイとして実施されうる。
【００４３】
抗体（例えば、捕捉抗体）に対する適当な固体基質は、限定されるものではないが、マイクロタイタープレート、チューブ、膜、例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜、およびビーズまたは粒子（例えば、アガロース、セルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、磁気、または磁化可能なビーズまたは粒子）を含みうる。磁気または磁化可能な粒子は、自動免疫アッセイシステムを用いる場合に特に有用でありうる。
【００４４】
標的ポリペプチドを検出する他の方法には、質量−分光光度法、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれる。例えば、Ｇｅｖａｅｒｔら（２００１） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２２（９）：１６４５−５１；Ｃｈａｕｒａｎｄら（１９９９） Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１０（２）：９１−１０３を参照のこと。かかる用途に有用な質量分光計は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。
【００４５】
本発明に記載の任意の標的遺伝子転写物または標的タンパク質の発現が、１つまたは複数の上記方法を用いて容易に検出されうることは明らかであろう。
【００４６】
ＴＲＥＭ−１活性の検出
ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの活性は、例えば、１種または複数（例えば、２種もしくは２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、１０種以上、または２０種以上）のＴＲＥＭ−１応答遺伝子の発現レベルを求めることによって評価されうる。発現レベルは、例えば、対照試料または基準レベルと比較して絶対的または相対的でありうる。差次的遺伝子発現は、試験試料および、所望により、対照試料の転写プロファイリングによって決定されうる。基準レベルは、既知の病態の試料に対応する転写プロファイリングでありうる。正の対照は、例えば、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが、１種または複数の細胞で意図的に過剰発現されている試料、内因性または組換え技術によって発現したＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが、例えば、架橋抗体、重症度が知られている炎症性疾患または慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）を伴う対象から得られる試料の付加によって活性化されている細胞の試料でありうる。負の対照は、例えば、ＴＲＥＭ−１および／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰが発現または活性化されていない試料あるいは炎症性疾患または慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）を伴わない対象からの試料でありうる。
【００４７】
多数のプロトコールは、転写プロファイリングの核酸マイクロアレイを用いるのに利用可能である。プロトコールの例として、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイの使用に関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供されるものが挙げられる。核酸マイクロアレイハイブリダイゼーションに適している試料は、任意のヒト細胞または組織から調製されうる。核酸マイクロアレイが、非ヒト薬物標的遺伝子のプローブを含む場合、試料は、対応する非ヒト種の細胞または組織を調製しうる。
【００４８】
核酸マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションの試料は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡ）またはＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）のいずれかでありうる。種々の方法は、組織からＲＮＡを単離するのに利用可能である。これらの方法には、限定されるものではないが、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって得られる），ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって得られる）、およびＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによって得られる）が含まれる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって得られるＲＮＡ単離プロトコールはまた、用いられうる。
【００４９】
１の実施態様において、核酸マイクロアレイにハイブリダイズする前に、単離されたＲＮＡは、増幅または標識される。適当なＲＮＡ増幅法には、限定されるものではないが、逆転写ＰＣＲ、等温増幅法、リガーゼ連鎖反応、およびＱβレプリカーゼ法が含まれる。増幅生成物は、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡのいずれかでありうる。１の実施態様において、単離されたｍＲＮＡは、逆転写酵素およびオリゴｄ（Ｔ）およびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写される。ｃＤＮＡは一本鎖である。第二鎖のｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて合成され、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを分解するＲＮアーゼと組み合わされうる。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、第二鎖の二本鎖ｃＤＮＡからｃＲＮＡを転写するために付加される。１の実施態様において、最初に単離されたＲＮＡは、増幅することなく核酸マイクロアレイにハイブリダイズされうる。
【００５０】
ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、または他の核酸試料は、ハイブリッドポリヌクレオチド複合体の検出を可能にするために１つまたは複数の標識部分で標識されうる。標識部分には、分光的、光化学的、生化学的、生体電子的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的方法によって検出可能である組成物が含まれうる。標識部分には、放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー、例えば、蛍光マーカーおよび染料、磁気標識、結合酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子移動供与体および受容体などが含まれる。
【００５１】
ハイブリッド形成反応は、絶対的または異なるハイブリッド形式で実施されうる。絶対的ハイブリッド形式では、１つの試料から得られるポリヌクレオチドは、核酸マイクロアレイ中でプローブにハイブリダイズされる。ハイブリッド複合体の形成後に検出されたシグナルは、試料中のポリヌクレオチド濃度に相関する。異なるハイブリッド形式では、２つの試料から得られるポリヌクレオチドは、異なる標識部分で標識される。これらの異なって標識されたポリヌクレオチドの混合物は、核酸マイクロアレイに付加される。次いで、核酸マイクロアレイは、２つの異なる標識からの放射を個々に検出可能である条件下で試験される。１の実施態様において、フルオロフォアＣｙ３およびＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、異なるハイブリッド形式の標識部分として用いられる。
【００５２】
核酸マイクロアレイから得られるシグナルは、商業的に入手可能なソフトウェア、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって得られるものを用いて分析されうる。走査感度、プローブ標識、およびｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ定量化の対照は、ハイブリッド実験に含まれうる。ハイブリッドシグナルは、さらに分析する前に、計算されうるかまたは正常化されうる。例えば、個々のプローブのハイブリッドシグナルは、１以上のマイクロアレイが同様の試験条件下で用いられる場合にハイブリッド強度の変化を考慮するために標準化されうる。ハイブリッドシグナルはまた、各マイクロアレイ上に含まれる内部正常化対照から得られる強度を用いて正常化されうる。さらに、試料を通して比較的一致する発現レベルを有する遺伝子は、他の遺伝子の発現レベルを正常化にするために用いられうる。１の実施態様において、ある保守遺伝子のプローブは、核酸マイクロアレイに含まれる。多様な集合の組織を通して安定な発現レベルを示すので、これらの遺伝子は選択される。ハイブリッドシグナルは、これらの保守遺伝子の発現レベルに基づき、正常化または計算されうる。
【００５３】
疾患または治療のモニタリングおよび評価
本発明は、対象における、例えば、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＮＡなどの炎症性疾患のモニタリング方法を提供する。対象における炎症性疾患の進行は、１種または複数のバイオマーカー、例えば、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰに対応するｍＲＮＡの発現レベル、またはそれによってコードされるタンパク質、またはその活性を測定することによって観測されうる。標的遺伝子ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルは、インビボまたは例えば、関節組織、滑液、滑膜、または他の臨床的に関連のある源で検出されうる。標的遺伝子に対応するｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現レベルは、上記の標準的方法によって検出されうる。対象における病態は、対象における標的遺伝子タンパク質またはＲＮＡのレベルを対象の標的タンパク質またはＲＮＡの基準濃度と比較することによって（例えば、疾患の改善、悪化、または再発について）観測されうる。例えば、最初の対象におけるＴＲＥＭ−１発現レベルは、第２の、後の時間の対象におけるＴＲＥＭ−１発現レベルと比較されうる。時間によるＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの増大は、炎症性疾患の進行を示す。時間によるＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの減少は、炎症性疾患の低下を示す。
【００５４】
対象における、例えば、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはＲＮＡの濃度はまた、治療の有効性を観測するために用いられうる。典型的には、対象の標的タンパク質またはＲＮＡの基準濃度は、（例えば、治療前に）得られ、治療後または治療中の種々の時点（例えば、治療１日または数日、数週間、または数ヶ月後）の標的タンパク質またはＲＮＡの濃度と比較される。比較の結果は、過去の治療の有効性を明らかにすることができ、将来の治療は、それに応じて修正されうる。例えば、予め検出された濃度と比較したＴＲＥＭ−１タンパク質またはＲＮＡ濃度の減少は、一般的に、治療計画に対して好反応を示すので、同様の治療を継続する必要がある。同様に、対象における病態は、対象における標的タンパク質またはＲＮＡの濃度を標的タンパク質またはＲＮＡの対象の基準濃度、または予め検出した濃度と比較することによって（例えば、疾患の改善、悪化、または再発について）観測されうる。
【００５５】
治療
本発明は、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を阻害および／または拮抗することによって、例えば、慢性炎症性疾患（例えば、ＲＡ）または呼吸器障害／疾患（例えば、喘息）などの炎症性疾患の治療方法を提供する。ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達の阻害および／または拮抗は、ＴＲＥＭ−１を直接阻害することによってあるいはＴＲＥＭ−１シグナル経路の非ＴＲＥＭ−１メンバー、例えば、ＴＲＥＭ−１付属タンパク質ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰを阻害および／または拮抗することによって達成されうる。適当な阻害薬および／または拮抗薬は、例えば、ＴＲＥＭ−１をコードする核酸の発現を減少させうるか、ＴＲＥＭ−１タンパク質の濃度を減少させうるか、またはＴＲＥＭ−１活性を阻害しうる。阻害薬および／または拮抗薬の例として、限定されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド；干渉ＲＮＡ；ＴＲＥＭ−１に対する抗体；ＴＲＥＭ−１リガンドに対する抗体；ＴＲＥＭ−１受容体およびそのリガンド結合フラグメント、可溶性切断ＴＲＥＭ−１受容体、および可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、例えば、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部を含有するＴＲＥＭ−１融合、リガンド融合タンパク質を含む、ＴＲＥＭ−１リガンド結合部位のコンペティター；ペプチド模倣薬；ペプチド阻害薬；低分子；およびその組み合わせが挙げられる。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡおよびタンパク質濃度を減少させることによって、ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、またはＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰシグナル経路の他のメンバーを阻害するために用いられうる。アンチセンス抑制は、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、標的対立遺伝子の発現を阻害するように１種または複数の対象標的対立遺伝子をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと一緒に、特に細胞条件下でハイブリダイズするかまたは結合する核酸配列またはその誘導体の投与またはインサイツ生成をいう。結合は、通常の塩基対相補性によるものであってもよく、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖への結合の場合、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介するものであってもよい。一般的に、アンチセンス抑制は、当該分野にて一般的に用いられる方法の範囲をいい、核酸配列への特異的結合による任意の抑制を含む。本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞中で転写される場合に、内在性遺伝子の標的配列または標的対立遺伝子をコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも固有部分に相補的であるＲＮＡを産生する発現プラスミドとして輸送されうる。あるいは、アンチセンス構築物は、エクスビボで生成され、細胞に導入される場合に、内在性遺伝子の標的対立遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列でハイブリダイズすることによって発現の阻害をもたらす、核酸でありうる。かかる核酸は、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性である、そのため、インビボで安定である修飾オリゴヌクレオチドである。修飾、例えば、ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ分解、結合アフィニティーおよび取り込みに対するその抵抗性を増大させるために核酸で行われている。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いるための核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホロアミダート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアナログである（米国特許番号第５，１７６，９９６号；第５，２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号も参照のこと）。
【００５７】
アンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体または「その修飾体」でありうる。本明細書に用いられる、「その修飾体」は、例えば、安定性、半減期、ハイブリダイゼーション、有効性などを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾される核酸をいう。可能な修飾には、限定されるものではないが、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオエートまたは２’ Ｏ−メチルの使用が含まれる。核酸は、他の付加基、例えば、（例えば、インビボにおける標的宿主細胞受容体についての）ペプチド、または細胞膜（例えば、１９８８年１２月１５日公開の、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照）もしくは血液−脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開の、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照）内外の輸送を促進する薬剤、ハイブリッド誘発性切断剤もしくは挿入剤を含みうる。そのために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリッド誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリッド誘発性切断剤などと接合されうる。
【００５８】
アンチセンス核酸には、所望により、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、疑似ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、−５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む、群から選択される少なくとも１つの塩基部分が含まれうる。
【００５９】
固相合成法を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成方法は、既知である。かかる合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含む、いくつかの製造業者から商業的に入手可能である。あるいは、アンチセンス転写物の産生を誘導する調節要素を含有する発現ベクターは、アンチセンス分子を産生するために用いられうる。
【００６０】
生理的条件下でハイブリダイズするのに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要がないことは当該分野では理解されている。ＴＲＥＭ−１核酸に対するオリゴヌクレオチドの結合がＴＲＥＭ−１核酸の正常機能を阻害し、非標的配列に対する非特異的結合が最小限である場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは生理的条件下でハイブリダイズする。
【００６１】
ＲＮＡｉ
本発明は、ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、またはＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰシグナル経路の他のメンバーの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用をさらに意図とする。本発明のＲＮＡｉ分子は、ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、またはＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰシグナル経路の他のメンバーを特異的に阻害するように設計されうる。いかなるタイプのＲＮＡｉ配列も本発明に用いられうる。非限定的な例として、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。種々のアルゴリズムは、ＲＮＡｉ配列設計に利用可能である。１の実施態様において、ｓｉＲＮＡの標的配列には、約１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる。２ｄＴ’ｓは、「ＡＡ」突出を引き起こす、ｓｉＲＮＡ合成中に３’末端に付加されうる。多くの場合、標的配列のＧＣ含量は、３５％〜５５％であり、該配列には、任意の４連続のＡまたはＴ（すなわち、ＡＡＡＡまたはＴＴＴＴ）、３連続のＧまたはＣ（すなわち、ＧＧＧまたはＣＣＣ）、あるいは連続して７つの「ＧＣ」を含まない。より厳しい基準としても用いられうる。例えば、標的配列のＧＣ含量は、４５％〜５５％に制限することができ、３連続の同一塩基（すなわち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、またはＡＡＡ）を有する任意の配列あるいは５またはそれ以上の塩基を有するパリンドローム配列は除外されうる。さらに、標的配列は、他の変種または遺伝子に対し低い配列相同性を有するように選択されうる。ＲＮＡｉ分子の有効性は、標的遺伝子生成物を発現する細胞中でＲＮＡｉ配列を導入または発現することによって評価されうる。標的遺伝子生成物のｍＲＮＡまたはタンパク質濃度の実質的な変化は、遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ分子の有効性を示す。細胞におけるＲＮＡｉ分子の発現方法は、当該分野にて既知であり、例えば、レンチウイルスベクターを含む。
【００６２】
免疫原性組成物
ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰに対する免疫反応を誘発する組成物は、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を低下させるのに用いられうる。組成物は、ヒトＴＲＥＭ−１またはヒトＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰに対する免疫反応を誘発するのに有用なＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはそのフラグメントもしくは変種（例えば、その変種またはフラグメントは、ヒトＭＨＣ分子への結合を促進している）を含みうる。タンパク質、フラグメントまたは変種は、単離したポリペプチドとして得られうるかまたは例えば、融合タンパク質または担体タンパク質などの別のポリペプチドとの複合体として付加的なペプチド配列で得られうる。いくつかの実施態様において、タンパク質、フラグメントまたは変種をコードする核酸は、タンパク質、フラグメントまたは変種自体を提供する代わりに免疫原性組成物中に提供される。免疫原性組成物はまた、好ましくは、アジュバントを含有する。アジュバントは、外来性抗原に対する免疫反応（抗体および／または細胞媒介性）を促進するかまたは強化する任意の基質でありうる。免疫刺激剤の例として、アルミニウム塩；生分解性マイクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ガラクトシド）；リポソーム（その中に化合物を組み込む）；サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１２、またはそれらをコードする核酸など）；およびＣｐＧポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６３】
上記のように、ワクチンは、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドがインビボで生成されるような、ＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはその一部もしくは変種をコードするＤＮＡを含有し、サイトカインなどのアジュバントタンパク質をコードするＤＮＡも含有しうる。ＤＮＡは、核酸発現ベクター、遺伝子導入ベクター、および細菌発現系を含む、当業者に既知の種々の導入系のいずれかに存在しうる。多数の遺伝子導入法は当該分野にて既知である。適当な核酸発現系は、対象における発現に必要なＤＮＡ配列を含有する（例えば、適当なプロモーターおよび末端シグナル）。細菌導入系は、その細胞表面上の免疫原性部分のポリペプチドを発現するかまたはかかるエピトープを分泌するバクテリア属（例えば、バシルス・カルメット・ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ））の投与に関与する。１の実施態様において、ＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックス・ウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入され、非病原性（欠損）で、複製可能なウイルスの使用に関与しうる。ＤＮＡをかかる発現系に組み込む方法は、当業者に既知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９に記載されるように「ネイキッド」でありうる。ネイキッドＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ上でＤＮＡをコーティングすることによって増加させることができ、細胞中に効率的に輸送される。ワクチンは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含みうる。かかるワクチンは、免疫反応の促進を提供しうる。
【００６４】
リガンド結合コンペティター
ＴＲＥＭ−１シグナル伝達はまた、ＴＲＥＭ−１のリガンドへの結合のコンペティターの投与によって阻害されうる。これは、例えば、当該分野にて既知のＩｇＧ免疫グロブリンなどの担体タンパク質と所望により結合する、ＴＲＥＭ−１細胞外ドメインの可溶性フラグメントの投与によって達成されうる。例えば、ＴＲＥＭ−１フラグメントおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部を用いるＴＲＥＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、記載されており、細菌性敗血症を阻止するのに有効であることが示されている（例えば、その全体を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許出願公開第２００５−０２６０６７０号を参照）。融合タンパク質のＩｇＧ Ｆｃ部は、任意のＩｇＧサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に由来しうる。ＴＲＥＭ−１／ＩｇＧ融合タンパク質の作製方法は既知である。例えば、Ｂｏｕｃｈｏｎら（２０００） Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｍｍｕｎ．１６４（１０）：４９９１−９５は、可溶性ＴＲＥＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質の産生方法を記載および教唆する。現在、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰとＲＡとの関連性に基づき、ＲＡ患者における適当なＴＲＥＭ−１フラグメントの同様の投与が、疾患の重篤度を低下させうると期待されている。重要なことに、ヒトの治療は、野生型ヒトＴＲＥＭ−１のフラグメントの投与を必ずしも必要としない：フラグメントが、リガンドとの結合のために内因性ヒトＴＲＥＭ−１と競合する能力を保有する限り、ＴＲＥＭ−１：他の哺乳動物からの他のＴＲＥＭ−１フラグメントは用いられ、１つまたは複数のアミノ酸置換は組み込まれうる。
【００６５】
結合パートナー
例えば、ＲＡおよび喘息などの炎症性疾患を治療するさらなる方法には、治療標的と相互作用する、例えば、結合および／または中和する結合剤、例えば、タンパク質、ペプチドおよび／または抗体またはその部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖフラグメント）投与が含まれる。本発明の治療標的には、例えば、ＴＲＥＭ−１、ＴＲＥＭ−１リガンド、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ、およびＴＲＥＭ−１シグナル経路の他のメンバーが含まれる。ＲＡまたは喘息患者への抗ＴＲＥＭ−１結合剤、例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体の投与は、ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ活性またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害および／または拮抗することによって疾患の症状を低下させうる。抗体は、単離した抗体でありうる。１の実施態様において、抗体はアンタゴニスト抗体である。別の実施態様において、抗体は中和抗体である。さらなる実施態様において、抗体は、限定されるものではないが、ＴＲＥＭ−１リガンドおよび／またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰとのＴＲＥＭ−１相互作用を調節、低下および／または阻害すること；ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を調節、低下および／または阻害すること；ＴＲＥＭ−１活性化炎症性サイトカインおよび／またはケモカインの発現を調節、低下および／または阻害すること；ならびに、例えば、ＳＰＰ１などの、ＴＲＥＭ−１活性化遺伝子の発現を調節、低下および／または阻害することを含む、１つまたは複数のＴＲＥＭ−１関連活性を調節、低下および／または阻害する。本発明の抗ＴＲＥＭ−１抗体には、例えば、ＴＲＥＭ−１と特異的に結合する抗体、および／またはＴＲＥＭ−１受容体を活性化することなく膜貫通型ＴＲＥＭ−１受容体と結合する抗体が含まれる。特定の実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、結合または非結合抗体の検出を促進するために検出可能な基質で直接的または間接的に標識される。適当な検出可能な基質には、例えば、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。抗体の作製方法およびスクリーニング方法、例えば、本発明を実施するのに有用な方法は、当該分野にて既知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗら（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照のこと）。本発明の抗ＴＲＥＭ−１抗体はまた、いずれかの種由来の単一ドメイン抗体を含みうる。例えば、ＳＭＩＰ（登録商標）などの、代替結合ドメインポリペプチドはまた、ＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ活性またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害および／または拮抗するために用いられうる。抗体、またはそのフラグメントはまた、例えば、ＲＡおよび喘息などの、炎症性疾患を対象において診断、モニタリング、および／または予防するのに有用でありうる。
【実施例】
【００６６】
実施例１：ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの転写プロファイリング分析
遺伝子発現分析によるメッセンジャーＲＮＡの全体分析は、疾患病因に寄与し、新規療法の潜在的標的である遺伝子を同定する多数の疾患にうまく適用されている（Ｂａｔｔｉｗａｌｌａら（２００５） Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６（５）：３８８−９７）。遺伝子発現分析を用いて、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、例えば、ＲＡなどの炎症性疾患の療法の潜在的標的として同定された。
【００６７】
簡単に言えば、２４の滑膜組織試料は、地方研究倫理委員会から事前に承認を得て、米国リウマチ学会基準で定義されているように外科手術時にＲＡ患者から得られた。これらの２４の試料のうち、１０の試料は、関節滑膜から得られ、１４の試料は、腱鞘滑膜から得られた。８の非関与（例えば、正常）滑膜組織は、非ＲＡ患者から得られた。非関与滑膜組織は、鈍的外傷により切断術を必要とする３人の患者から単離され、滑膜は、外傷部から離れた部位から単離された。ＲＡ患者および非ＲＡ患者からの滑膜試料を採取し、液体窒素ですぐに急速冷凍し、処理するまで−８０℃で保存した。全ＲＮＡを単離し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ） ＨＧ＿Ｕ９５ＡおよびＢ（ヒト試料） ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて分析した。アレイからの発現測定値を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）ＭＡＳ４アルゴリズムによってもたらし、急上昇した基準値を基準として１００万ごとに転写物の予測値に標準化した（Ｈｉｌｌら（２００１） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２（１２）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００５５）。
【００６８】
ＲＮＡ単離
冷凍試料を分離し、組織溶解緩衝液（ＲＮＡｇｅｎｔｓ（登録商標）Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にてＰｏｗｅｒＧｅｎ（登録商標）７００ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で溶解した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書を変更して単離した。簡単に言えば、ＲＮＡを、イソプロパノールを加えて沈殿させ、７５％冷却エタノールで２回洗浄した。ペレットを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉｋｉｔ試料溶解緩衝液（ＲＬＴ）で溶解し、ＲＮＡを、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にしたがって生成した。各試料について、全ＲＮＡを、２６０ｎｍのＵＶ吸収から定量化し、アリコートを、ＲＮＡ完全性を決定するために、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で分析した。
【００６９】
オリゴヌクレオチドアレイ分析のハイブリダイゼーション溶液の調製
二本鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｃｈｏｉｃｅ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および３３ｐＭｏｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ−ｄＴプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ，ＬＬＣ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて、５μｇの全ＲＮＡから調製した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、以下のキット成分：１Ｘの第一鎖緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、４００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＩＩ、および４０ＵのＲＮアーゼ阻害薬を添加して開始された。反応は４７℃で１時間進行した。第二鎖合成は、以下のキット成分：１Ｘの第二鎖緩衝液、２００μＭの付加的なｄＮＴＰ、４０Ｕのイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、２Ｕのイー・コリＲＮアーゼＨ、１０Ｕのイー・コリＤＮＡリガーゼを添加して進行した。反応は１５．８℃で２時間進行した。６Ｕの最終濃度の、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、第二鎖反応の最後の５分間で加えた。二本鎖ｃＤＮＡを、固相、可逆的固定化方法を用いて精製し、２０μｌ量の１０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．８で回収した。精製したｃＤＮＡ（１０μｌ）を、製造業者のプロトコール（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）にしたがって、ＢｉｏＡｒｒａｙ（商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ（商標）ＲＮＡ転写物標識キット（Ｔ７）で転写した。ビオチン標識アンチセンスｃＲＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって記載されるように、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて精製した。ｃＲＮＡ収率を、２６０ｎｍのＵＶ吸収の測定値から決定した。
【００７０】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション法
ハイブリダイゼーション効率を改善するために、１５μｇのｃＲＮＡを断片化した。断片化ｃＲＮＡプローブを、製造業者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）が示唆しているように、オリゴヌクレオチドマイクロアレイハイブリダイゼーション溶液を作製するのに用いた。ハイブリダイゼーション溶液は、各々、異なる既知の濃度で、１１の原核生物ＲＮＡの混合物を含有し、各マイクロアレイの内部標準曲線を作成するのに用いられ、検出した遺伝子の頻度を決定するために補間された。ハイブリダイゼーション溶液を、４５℃で一晩２つのガラスビーズ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に予めハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液を、無菌管に除去し、１−２分間９５℃で加熱し、２分間最大速度でペレット不溶性残渣に微小遠心分離した。標識ｃＲＮＡ溶液を、１２８のヒト遺伝子配列の、２５の配列に配置するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ） Ｈｇ＿Ｕ９５Ａｖ２ ＆ Ｂ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ｃＲＮＡ溶液を回収し、マイクロアレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールにしたがって走査のために調製した。生蛍光データを回収し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）３．２アプリケーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して減らした。
【００７１】
発現プロファイリングデータの分析
一次データを、Ｈｉｌｌら（２００１） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２（１２）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００５５で記載されるハイブリッドスケール頻度標準化を用いて処理した。スケール頻度データを減らし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ（商標）ｖ７．３（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて分析した。２種類の分析を実施した。第１では、全ての病的試料を、全ての正常試料に対して比較した。第２では、関節ＲＡ滑液を、対照関節滑膜試料の平均値に標準化し、腱鞘滑膜ＲＡ試料を、対照腱鞘滑膜試料の平均値に標準化するように、データを、疾患部位に基づき細分化した。
【００７２】
ＲＡに関連する転写物を同定するために、各病的試料からの遺伝子転写物スケール頻度を、全ての非リウマチ遺伝子転写物頻度の平均値に標準化した。対照の平均値と比べて発現レベルが増加または減少した遺伝子転写物を識別することによって、データを減らした。データ標準化工程に加えて、いくつかの統計分析を、識別データで実施した。偽発見率（ＦＤＲ）およびボンフェローニ家族単位過誤率（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｆａｍｉｌｙ−ｗｉｓｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）（ＦＷＥＲ）を、０．０５のカットオフｐ値を用いて決定した。さらに、データセットの教師なし階層的クラスタ分析およびｋ−最近傍分析を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（商標）で実施した。得られたデータセットを、教師なし階層的クラスタ分析で視覚化した。
【００７３】
第２の分析において、関節および腱の試料を、別々に分析した。関節滑膜および腱鞘滑膜の試料を、その各部位特異的対照の平均値に標準化した。同一識別および統計パラメータを、上記の各分析に適用した。２つの得られたデータセットを、Ｖｅｎｎ分析を用いて組み合わせ、遺伝子および試料の教師なし階層的クラスタ分析にかけた。ｋ−最近傍分析を、４つのパラメータ：疾患、非疾患、関節、および腱の間を識別するために用いた。該分析方法は、以下に記載されている。次いで、一番識別されている遺伝子を、試料および遺伝子の教師なし階層的クラスタ分析にかけた。
【００７４】
ｌｏｇ２変換発現測定に基づき、発現データの統計分析を実行した。試料のグループ間の倍率変化を、各グループにおけるｌｏｇ２発現レベルの平均値の差をとり、得られたｌｏｇ変化率を均等スケールに戻すことによって算出した。グループ間の差次的発現の有意性を、並べ替え検定によって決定した。簡単に言えば、Ｆ統計値を、同様の強度レベルを有するプローブセットの誤差評価の蓄積から得られた群間誤差評価を用いて、目的の各比較における各プローブセットについて算出した。測定Ｆ統計値は、試料ラベルを無作為に並べ替えた後、同一データセットから同様に計算したＦ統計値のヌル分布に言及した。差次的発現のｐ値を、各プローブセットの測定Ｆ統計値以上である並べ替えＦ統計値の割合として定義した（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ（１９９５） Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）；Ｚａｒ（１９９９） Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｓｉｍｏｎ ＆ Ｓｈｕｓｔｅｒ））。
【００７５】
結果
滑膜生検の遺伝子発現分析は、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現がＲＡ患者にて有意にアップレギュレートされることを明らかにした。図１は、ＲＡ患者からの滑膜におけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの発現を示す棒グラフである。ＴＲＥＭ−１の倍率変化を、正常な滑膜検体に標準化した。ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、非関与試料（ｎ＝８）に比べてＲＡ陽性試料（ｎ＝２４）において６．５倍（１．９８ｘ１０−６のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。さらに、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡは、非関与試料（ｎ＝８）に比べてＲＡ陽性試料（ｎ＝２４）において２倍（７．８３ｘ１０−４のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。
【００７６】
ＲＡでアップレギュレートされることに加えて、ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡ発現レベルは、ＲＡの重篤度によって変化する。１４のＲＡ患者からの腱試料は、２つの臨床的に定義された疾患サブタイプ、浸潤性および被嚢性に分類され、浸潤性ＲＡは、より進行性の形態である。ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、被嚢性腱鞘滑膜試料（ｎ＝７）に比べて浸潤性腱鞘滑膜試料（ｎ＝７）にて２．６４倍（１．３６ｘ１０−４のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。同様に、ＤＡＰ１２／Ｔｙｒｏ１２ ｍＲＮＡは、被嚢性腱鞘滑膜試料（ｎ＝７）に比べて浸潤性試料（ｎ＝７）にて１．４倍（１．６７ｘ１０ −２のｐ値）アップレギュレートされた（図１）。
【００７７】
単球、好中球、およびマクロファージにおける細胞特異的遺伝子発現の比較は、炎症性細胞浸潤が、ＲＡ陽性滑膜組織におけるＴＲＥＭ−１発現レベルの増加に部分的にのみ関与することを示す。ＴＲＥＭ−１発現の増大が、ＲＡ滑膜におけるＴＲＥＭ−１陽性炎症性細胞の浸潤によるかどうかを確認するために、本発明者らは、単球（１８２遺伝子）、好中球（３２８遺伝子）およびマクロファージ（３４遺伝子）で特異的に発現する遺伝子の発現レベルに全体的に目を向けた。これらの遺伝子の平均発現レベルは、１．２２〜１．５９の範囲であり、広い標準偏差を伴う。ＴＲＥＭ−１発現の増大は、主に、細胞浸潤の大幅な増加によってよりむしろＴＲＥＭ−１遺伝子発現のアップレギュレーションによってもたらされた。
【００７８】
実施例２：ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰの定量的リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡは、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて過剰発現される。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、ウシＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いて雄ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）で行われた。マウスを、１週間に少なくとも３回疾患の進行についてモニターした。個々の肢を、以下の指標：（０）正常；（１）１〜２本の指の腫れを伴う目に見える紅斑；（２）足の腫れおよび／または複数の指の腫れによって特徴付けられる顕著な紅斑；（３）足首または手首関節に及ぶひどい腫れ；および（４）手足または関節硬直の使用の困難、に基づき臨床スコアを決定した。任意の所定のマウスの全ての肢スコアの和は、１６の潜在的最大全身スコアを生じる。動物を安楽死させ、組織を種々の病期で採取した。疾患動物からのＲＮＡを、３つのスコア３の足および１つのスコア４の足から調製した。正常な動物から抽出されたＲＮＡを、４つのスコア０の足から調製した。ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡを、以下のプライマーおよびプローブを用いて定量化した：
順方向プライマー ＣＡＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡ（４１３−４３６）（配列番号：１）；
逆方向プライマー ＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＧＧ（４９４−４６８）（配列番号：２）；
プローブ ＣＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＣＧＴＣＣＣＡ（４３９−４６６）（配列番号：３）。
標準曲線を、ｍＴＲＥＭ−１の既知の濃度を用いて作成した。
ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ｍＲＮＡを、以下のプライマーおよびプローブを用いて定量化した：
順方向プライマー ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡ（２５５−２７３）（配列番号：４）；
逆方向プライマー ＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ（３２３−３０２）（配列番号：５）；
プローブ ＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴ（３００−２７９）（配列番号：６）。
【００７９】
発現の倍率変化を算出するために、ＴＲＥＭ−１ ＲＮＡレベルおよびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ ＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに標準化した。ＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡは、正常マウスからの足に比べてＣＩＡの足にて１３２倍アップレギュレートされ（図２）、一方、ＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰは、８．２１倍アップレギュレートされた（図２）。これらの結果は、ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１シグナル伝達に付随するタンパク質の発現がＲＡ疾患部位で上昇することをさらに確認する。
【００８０】
実施例３：免疫組織化学によるＴＲＥＭ−１発現
種々の滑膜試料の免疫組織化学は、ＴＲＥＭ−１発現がタンパク質濃度で増大するかどうかを決定するために行われた。簡単に言えば、５のＲＡ滑膜試料を、ケネディ・リウマチ研究所（Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）を通じて外科手術中に患者から得、２つのＯＡ組織を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂａｐｔｉｓｔ病院から得た。組織をホルマリン中に入れ、パラフィンに組み込んだ。免疫組織化学を、４μｍ組織断片上で行った。断片を、最初にキシレンで脱パラフィン処理し、グレードエタノール系で再水和した。ＰＢＳでの洗浄後、抗原を採取し、細胞をツイーン２０で透過処理した。試料を、標準プロトコールにしたがって、ＢｉｏｇｅｎｅｘＴＭ ｉ６０００ＴＭシステムにおいてマウス抗ＴＲＥＭ−１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で免疫染色した。二次抗体および用いる検出試薬を、Ｍａｃｈ３ＴＭ−マウスプローブＨＲＰポリマーキット（Ｂｉｏｃａｒｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）から得た。免疫組織化学染色陽性細胞を、褐色色素を有するものとして定義した。各スライドについて、滑膜表面に隣接した１０個の２００倍領域の画像（ｖｉｅｗ）を無作為に選択し、免疫組織化学陽性細胞を計測し、免疫組織化学陽性細胞指標として合計した。
【００８１】
５人のＲＡ患者からの断片における免疫組織化学は、５人の患者のうち３人においてＴＲＥＭ−１レベルが高いことを明らかにし、１人の患者ＲＡ４で非常に高レベルを観測した（表１）。ＲＡ試料の２つ（ＲＡ１およびＲＡ２）は、低ＴＲＥＭ−１レベルを有し、変形性関節炎患者からの対照試料（ＯＡ１およびＯＡ２）と同様であった（表１）。図３Ａは、抗ＴＲＥＭ−１標識ＲＡ滑膜組織試料の１の典型的な領域を図示する。図３Ｂは、対照、ＯＡ患者からの抗ＴＲＥＭ−１標識滑膜組織試料の１の典型的な領域を図示する。
【００８２】
ＲＡ試料におけるＴＲＥＭ−１陽性細胞の細胞型を確認するために、ＴＲＥＭ−１およびＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ６８またはミエロペルオキシダーゼの二重免疫組織化学を、最初にＴＲＥＭ−１抗体、次いで、ＣＤ１６３（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡからの１０Ｄ１６）、ＣＤ１４（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ＣＤ６８（Ｂｉｏｃａｒｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡからのＰＧ−Ｍ１）、またはミエロペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）抗体それぞれで染色することによって連続して行った。断片は、好中球の欠損を示唆するミエロペルオキシダーゼで染色しなかった。驚くべきことに、ＲＡ５からの断片のみＣＤ６８で染色したが、これらの断片は、ＴＲＥＭ−１で共染色しなかった。ＲＡ３およびＲＡ５からの少量（３−１０％）のＴＲＥＭ−１陽性細胞は、ＣＤ１４またはＣＤ１６３で共染色した。５つのＲＡ滑膜断片におけるこれらのマーカーおよびＴＲＥＭ−１の存在の違いは、疾患の不均一性を示した。
【表１】
【００８３】
実施例４：ヒト臨床血漿試料における可溶性ＴＲＥＭ−１の検出
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＴＲＥＭ−１タンパク質濃度が、検出可能であって、ヒトＲＡ試料において上昇することを立証するために行われた。ＲＡ患者からの血漿を、活性ＲＡおよび安定な用量のメトトレキサート（ＭＴＸ）（１週に１回７．５〜２０ｍｇ）に対する不十分な反応を伴う対象におけるフェーズＩＩの、二重盲検、プラセボ対照、並行、ランダム化、多施設、外来患者、比較研究から得た。対象は、世界８１カ所で登録された。選択された場所で、予備的バイオマーカー研究のための自発的試料採取に参加することに同意した３２人の対象は、血液試料を提供した。ここで記録されたデータは、第１日目（投与前）に得られた血漿試料からのものである。対照群血漿を、健常ボランティア多施設、前向き、非介入解析に登録された対象から採取した。各臨床施設の施設内治験審査委員会または倫理委員会は、これらの研究を承認し、各患者からインフォームド・コンセントを得る前には手続を行わなかった。
【００８４】
ヒト臨床血漿試料において可溶性ＴＲＥＭ−１を検出するためのＥＬＩＳＡプロトコールは、ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ開発システムから適合させ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ＤＹ１２７８）から商業的に入手可能である。適合ＥＬＩＳＡプロトコールは、誤検出を減少させ、標準曲線の線形動的範囲を改良した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡは、４．０ｕｇ／ｍｌの捕捉抗体および２００ｎｇ／ｍｌの検出抗体でサンドイッチ形式にて行われた。血漿試料を、ＧＦ１緩衝液で１：２比率にて希釈し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ Ｒ５４ＢＢ−３）から商業的に入手可能である。基準はまた、ニート血漿のＧＦ１緩衝液中１：２希釈液で希釈された。検出の限界は、１．３７〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲内で０．９９９のＲ２と一緒に４パラメータ曲線適合（ＸＬ−Ｆｉｔ ＩＤＢＳ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いると１．３７ｐｇ／ｍｌであった。
【００８５】
上記のＥＬＩＳＡ法を用いて、ＲＡ患者からの３２の試料および健常ボランティアからの２５の試料（ＨＶＯＳ）を試験した。図４は、ＲＡおよび対照患者（ＨＶＯＳ）から得られたヒト血漿試料においてＥＬＩＳＡによって検出された可溶性ＴＲＥＭ−１のタンパク質濃度を示すグラフである。図４に見られるように、ＲＡ血漿における可溶性ＴＲＥＭ−１の平均値は、１０．０４±１．６２６（ｎ＝３２）ｐｇ／ｍｌであったが、健常ボランティア（ＨＶＯＳ）における可溶性ＴＲＥＭ−１の平均値は、２．５４９±０．６２５３（ｎ＝２５）ｐｇ／ｍｌであった。ＲＡ血漿における可溶性ＴＲＥＭ−１の濃度は、＜０．０００１のｐ値（対応のないｔ検定）を有する、健常ボランティアのものより高い（３倍以上）。したがって、血漿中ヒト可溶性ＴＲＥＭ−１の濃度の増加の検出は、ＲＡと相関し、そして、ＲＡを示す。
【００８６】
さらに、血漿ＴＲＥＭ−１濃度の上昇とリウマチ因子の濃度の上昇との間の有意な関連性を検出した。
【００８７】
実施例５：ＴＲＥＭ−１の架橋後のマイトジェン活性化プロテインキナーゼの活性化
ＴＲＥＭ−１受容体活性化がマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を引き起こすか否かを決定するために、精製したヒト単球を、アイソタイプ適合対照抗体またはα−ＴＲＥＭ−１架橋抗体のいずれかで予め被覆したウェルに播種した。簡単に言えば、健常ボランティアからのヒトロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）(軟膜)を、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。次の日、細胞を単離するために、軟膜を４℃で一晩保存した。単球を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）（ＳＩＧＭＡ，Ｈ８８８９）の密度遠心分離によって製造業者のプロトコールにより、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ；１５０６８）を用いて陰性選択によって単離した。全て、５％ＣＯ２で維持した組織培養インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。精製した単球を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地で保持した。組織培養処理プレートを、組織培養インキュベーター中、５μｇ／ｍｌのα−ＴＲＥＭ−１架橋抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；ＭＡＢ１２７８）のＰＢＳ中溶液で一晩処理した。対照ウェルを、イー・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）に対するアイソタイプ適合抗体で同様に処理した。ウェルを、細胞添加の直前にＰＢＳで２回洗浄した。ウエスタンブロット法を、５〜１８０分の時間経過の間に標準的プロトコールを用いて行った（図５を参照）。α−ホスホ−ＥＲＫ、α−ホスホ−ｐ３８、およびα−ホスホ−ＪＮＫ抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ；各々９１０１、９２１１および９２５１）から購入した。α−アクチン抗体を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ａ２１０３）から購入した。図５に見られるように、架橋抗体とＴＲＥＭ−１の活性化は、ＭＡＰＫの活性化を広範囲にもたらす。ｐ３８およびＪＮＫは、ＴＲＥＭ−１活性化に反応することを以前は知られていなかった。これらの広範囲の炎症反応は、精製したヒト単球におけるＴＲＥＭ−１活性化から生じる広範囲の遺伝子発現変化によって裏付けられた（実施例１０を参照）。
【００８８】
実施例６：α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ処理後の転写プロファイリング分析
ＴＲＥＭ−１受容体の活性化により異なった形で発現される遺伝子を同定するために、転写プロファイリング分析を用いた。転写プロファイリングを用いて、偏性炎症性読み出しであるのとは対照的に、炎症性分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１；オステオポンチン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質Ｉ（ＢＳＰＩ）、早期Ｔ−リンパ球活性化１（ＥＴＡ−１）、またはＭＧＣ１１０９４０としても既知）を、ＴＲＥＭ−１活性化に特異的なマーカーとして同定した。
【００８９】
組織培養調製物およびＲＮＡ単離
多数のドナーから精製したヒト単球を、実施例９に記載されるように調製し、組織培養処理ウェルに播種した。組織培養処理ウェルを、処理しなかったか（未処理対照およびリポ多糖（ＬＰＳ）処理）、または実施例９に記載されるようにアイソタイプ対照抗体もしくはα−ＴＲＥＭ−１架橋抗体のいずれかで予め被覆した。ＬＰＳ処理について、エス・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｌ２２６２）からのゲル濾過クロマトグラフィー精製したＬＰＳを、最終濃度が１ｎｇ／ｍｌになるように添加した。次いで、５ｘ１０６単球を未処理または抗体被覆１２ウェル組織培養処理プレート中に蒔いた。処理の２時間後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールにより、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（商標）カラムおよびＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；各々７９６５４および７４１０４）を用いて単離した。高信頼分析に適している遺伝子発現変化をもたらしながら、二次的および／または分化効果の寄与を最小限にするために２時間の時点を選択した。全ＲＮＡ収量は、１−６μｇの範囲であった。全ＲＮＡを、標準的プロトコールを用いて、ＤＮアーゼ処理、次いで、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりさらに精製した。マイクロアレイ分析を、確立したプロトコールにしたがってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＨＧ＿Ｕ１３３ ２．０プラスアレイを用いて行った。各アレイについて、全プローブセットを、１００の平均強度値に標準化した。デフォルトＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オペレーティング・システム（ＧＣＯＳ）統計値を、全分析に用いた。合計１１人の健常ドナーからの単球を分析した。
【００９０】
発現プロファイリングデータの分析
＞５０シグナルで存在し、＞６６％の処理群で存在するといわれる修飾子（Ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）は、分析用とみなされた。標準化シグナル値を、ＡＮＯＶＡ分析前にｌｏｇ２値に変換した。ｐ＜０．０１および任意の処理群間の発現の２倍以上の変化を有する修飾子（ＦＣ）を、図６のヒートマップを作製するためおよびその後の分析のために用いた。倍率低下は、負の倍率変化として記録される。多数の修飾子によって示される遺伝子について、未処理試料における最大の平均強度を有する修飾子を、さらなる分析のために選択した。
【００９１】
図６は、転写プロファイリングデータのヒートマップクラスタ分析を示す。図６において、個々のドナーを左側に示し（各カラムは個々のドナーを示す）、平均強度を右側に示す；各列は個々の修飾子を示す。蛍光強度を示す。α−ＴＲＥＭ−１−処理試料を対照抗体処理試料と比べ、ＬＰＳ処理試料を未処理と比べた。階層的クラスタ化アルゴリズムを、発現の同様のパターンを有する修飾子を分類するために用いた。図６において、ブラケット領域は、ＴＲＥＭ−１活性化によりアップレギュレート、ＬＰＳによりアップレギュレート、共通ダウンレギュレート、ＴＲＥＭ−１活性化によりダウンレギュレート、またはＬＰＳによりダウンレギュレートされた修飾子に対応するヒートマップ領域を示す。
【００９２】
図７は、全ての存在コールの典型的な散布図を示す。散布図分析について、ｌｎ率変化は、ダウンレギュレーションで負の値に変換され、ＴＲＥＭ−１（ｘ軸）およびＬＰＳ（ｙ軸）にプロットした。ｌｎ（−１／ＦＣ）としてプロットした遺伝子をダウンレギュレートして、全ての存在コールに対するｌｎＦＣ（α−ＴＲＥＭ−１／対照抗体およびＬＰＳ／未処理）を算出し、プロットした。選択遺伝子を強調する。４５°軸は、両処理によって同様に調製された遺伝子を画定する。
【００９３】
図２３および２４は、ＴＲＥＭ−１活性化および／またはＬＰＳ処理に反応することが決定された遺伝子を記載する表である。図２３は、修飾子、遺伝子名、遺伝子解説、および様々な処理をした同定遺伝子の平均強度を示す。処理には、未処理（対照）、アイソタイプ抗体（対照）、α−ＴＲＥＭ−１抗体、ＬＰＳ、アイソタイプ抗体＋α−ＴＲＥＭ−１抗体、およびα−ＴＲＥＭ−１抗体＋ＬＰＳが含まれる。図２４は、同定遺伝子の修飾子ならびに異なる処理間の比較のｐ値および比率を示す。以下の処理を比較した：α−ＴＲＥＭ−１ ｖ．アイソタイプ；ＬＰＳ ｖ．未処理；α−ＴＲＥＭ−１ ｖ．ＬＰＳ；α−ＴＲＥＭ−１＋ＬＰＳ ｖ．アイソタイプ；α−ＴＲＥＭ−１ ｖ．α−ＴＲＥＭ−１＋ＬＰＳ；およびＬＰＳ ｖ．α−ＴＲＥＭ−１＋ＬＰＳ。
【００９４】
結果
複数の遺伝子は、α−ＴＲＥＭ−１処理および／またはＬＰＳ処理に反応して特異的に発現するものとして同定されたので（図７、８Ａ−Ｂ、９Ａ−Ｂ、および２３−３４を参照）、ＴＲＥＭ−１および／またはＬＰＳシグナル伝達を調節する物質を評価するためにバイオマーカーとして用いられうる。特異的に発現した遺伝子は、主要な３種類：ＴＲＥＭ−１バイアス遺伝子、ＬＰＳバイアス遺伝子、ならびにα−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ両方の処理に反応して同等に発現された遺伝子に分類された。図８Ａ−Ｂに記載の遺伝子は、ＴＲＥＭ−１／ＬＰＳ率またはＬＰＳ／ＴＲＥＭ−１率それぞれによってランクされる。ＴＲＥＭ−１／ＬＰＳ率（図８Ａを参照）およびＬＰＳ／ＴＲＥＭ−１率（図８Ｂを参照）は、直接対比較から算出され、個々の処理における倍数変化に関する任意の変化を占める。二重処理、すなわち、α−ＴＲＥＭ−１抗体およびＬＰＳ両方での処理がもたらす遺伝子発現の倍率変化はまた、図８Ａ−Ｂ、９Ａ−Ｂ、２３および２４に示される。
【００９５】
上記の識別基準に合格し、＞４倍の発現の変化が立証された遺伝子は、さらなる分析について検討された。これらの基準によって、２３８の遺伝子は、ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳのいずれかで＞４倍アップレギュレートされた。これらのうち、６９の遺伝子は、両処理にて＞４倍、または１つだけの処理にて＞４倍だが２つの処理の間の直接対比較で２倍以内に誘導された；これらの遺伝子は、一般にアップレギュレートしたとして分類されている。ＴＲＥＭ−１活性化（６２遺伝子）またはＬＰＳ処理（１０１遺伝子）のいずれかで＞４倍アップレギュレートされた残りの遺伝子は、処理特異的（すなわち、処理バイアス）であるとして分類されている。
【００９６】
ＴＲＥＭ−１活性化に反応して＞４倍アップレギュレートされるＴＲＥＭ−１バイアス遺伝子の概略は、図８Ａに示される。ＴＲＥＭ−１／ＬＰＳの比率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性化＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍アップレギュレートされた遺伝子のｐ値は、７．７ｘ１０−４〜２．６ｘ１０−１２の範囲であった。ＴＲＥＭ−１活性化によって特異的に誘発される同定された遺伝子には、ＳＰＲＹ２、サイトカインおよび関連分子（ＴＮＦＳＦ１４、ＣＳＦ１、ＳＰＰ１、ＣＣＬ７、ＩＬ１Ｆ５、ＬＩＦ）、メタロチオネイン（ＭＴ１Ｋ、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ）、ホスファターゼ（ＤＵＳＰ１４、ＤＵＳＰ４）、転写因子（ＥＧＲ２、ＡＴＦ３）、糖質代謝および／またはシグナル伝達に関与する因子（ＥＤＧ３、ＬＰＬ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＬＣＸＤ１、ＮＰＣ１、ＦＡＢＰ３、ＡＣＳＬ３）、ＭＭＰ１９、およびＰＰＡＲＧが含まれる。これらの遺伝子のうち、ＳＰＰ１は、ＴＲＥＭ−１活性化に反応して２８．０倍（ｐ＝１．２ｘ１０−０７）アップレギュレートされるが（図８Ａおよび１１Ｅを参照）、ＬＰＳ処理後あまりアップレギュレートされない。したがって、ＳＰＰ１は、偏性炎症性読み出しではなく、患者（または患者試料）およびＴＲＥＭ−１修飾剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおける、ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして有用でありうる。さらに、ＳＰＰ１はまた、患者における、炎症または慢性炎症、例えば、ＲＡの治療のためのＴＲＥＭ−１療法の有効性または潜在的有効性の指標として有用でありうる。ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして用いられうるさらなる遺伝子は、図８Ａ、２３および２４に記載されている。識別基準を満たすが、図８Ａに記載されていない遺伝子には、Ｃ６ｏｒｆ１１４、Ｃ６ｏｒｇ１２８、Ｃ９ｏｒｆ４７、ＫＩＡＡ１１９９、ＫＩＡＡ１３９３、ＬＯＣ４４０９９５、およびＭＧＣ３３２１２が含まれる。一般的に、ＴＲＥＭ−１活性化により特異的に誘発された遺伝子は、ＬＰＳ処理によっては大体影響がなかった。
【００９７】
ＬＰＳ処理に反応して＞４倍アップレギュレートされるＬＰＳバイアス遺伝子の概略は、図８Ｂに示される。ＬＰＳ／ＴＲＥＭ−１の比率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。該表におけるＬＰＳで＞４倍アップレギュレートされた遺伝子のｐ値は、１．２ｘ１０−３〜３．６ｘ１０−１４の範囲であった。ＬＰＳによって特異的に誘発される同定された遺伝子には、インターロイキン（ＩＬ２３Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＥＢＩ３、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１０、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１８）、インターロイキン受容体（ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ７Ｒ）、サイトカインおよび関連分子（ＣＳＦ３、ＣＣＬ２３、ＣＸＣＬ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＬ５、ＣＬＣ、ＥＲＥＧ、ＴＮＦＳＦ９）、脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する因子（ＳＧＰＰ２、ＰＬＡ１Ａ、ＭＧＬＬ）、キナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ８、ＲＩＰＫ２、ＭＡＰ３Ｋ４、ＴＢＫ１、ＰＩＭ３）、ＮＦ−κＢシグナル伝達のレギュレーター（ＴＮＩＰ３、ＮＦＫＢＩＺ）、ＣＣＲ７、およびＣＩＡＳ１が含まれる。識別基準を満たすが、図８Ｂに記載されていない遺伝子には、Ｃ１０ｏｒｆ７８、Ｃ２１ｏｒｆ７１、ＦＬＪ１４４９０、ＦＬＪ２３２３１、ＦＬＪ２５５９０、ＦＬＪ３２４９９、ＫＩＡＡ０２８６、ＫＩＡＡ０３７６、ＬＯＣ９０１６７、ＬＯＣ１２３８７２、ＬＯＣ２８５６２８、ＬＯＣ３３８７５８、ＬＯＣ３４１７２０、ＬＯＣＬＯＣ３７４４４３、ＬＯＣ３８７７６３、ＬＯＣ４００５８１、ＬＯＣ４４１３６６、ＭＧＣ１０７４４、およびＭＧＣ１１０８２が含まれる。
【００９８】
図９Ａは、共通アップレギュレート遺伝子（すなわち、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理によりアップレギュレートされた遺伝子）の概略を示す。ＴＲＥＭ−１活性化での誘導率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性化＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍アップレギュレートされた遺伝子のｐ値は１．７ｘ１０−３〜１．５ｘ１０−１０の範囲であり、ＬＰＳのｐ値は４．１ｘ１０−３〜２．０ｘ１０−１４の範囲であった。共通にアップレギュレートされる同定された遺伝子には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーおよびモジュレーター（ＴＮＦＳＦ１５、ＢＲＥ、ＴＮＦ）、ケモカイン（ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ５、ＣＣＬ３）、他のサイトカインおよびマイトジェン因子（ＣＳＦ２、ＩＬ−６、ＡＲＥＧ）、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０）、およびＰＴＧＳ２／ＣＯＸ２が含まれる。これらの結果は、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ誘発炎症反応の両方と一致している。ＩＮＨＢＡ、凝固および血管新生因子（Ｆ３、ＥＤＮ１、ＴＦＰＩ２、ＳＥＲＰＩＮＢ２）、転写およびＤＮＡ結合因子（ＨＥＳ４、ＥＧＲ１、ＦＯＳＬ１、Ｅ２Ｆ７、ＥＧＲ３、ＭＡＦＦ、ＥＴＳ２、ＨＥＳ１）、および脂質代謝および／またはシグナル伝達に関与する因子（ＰＬＤ１、ＥＬＯＶＬ７、ＳＹＮＪ２、ＧＬＡ、ＳＴＡＲＤ４）もまた存在する。識別基準を満たすが、図９Ａに記載されていない遺伝子には、Ｃ２０ｏｒｆ１３９、ＫＩＡＡ１７１８、ＬＯＣ３４８９３８、ＬＯＣ４０１１５１、ＬＯＣ４０１５８８、ＬＯＣ９２１６２、およびＭＧＣ４５０４が含まれる。
【００９９】
組み合わせ（二重）処理において、図９Ａの遺伝子の大部分の発現変化は、個々の処理の変化の和の２倍以内であった。ある例外は、ｍＲＮＡ誘導が、個々の処理に対して組み合わせ処理で有意に増加した（ＴＲＥＭ−１活性化、ＬＰＳ、および組み合わせ処理でそれぞれ９．６倍、１８．９倍、および１９２．４倍）、ＣＳＦ２（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）であった。
【０１００】
ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳ処理のいずれかで＜−４（すなわち、＞４倍ダウンレギュレートされた）倍率変化を伴う遺伝子の概略は、図９Ｂに示される。ＴＲＥＭ−１活性化での誘導率で分類された、ＴＲＥＭ−１活性化（ＴＲＥＭ）、ＬＰＳ（ＬＰＳ）、および組み合わせＴＲＥＭ−１活性化＋ＬＰＳ（二重）で倍率変化が得られる。ＴＲＥＭ−１活性化で＞４倍ダウンレギュレートされる遺伝子のｐ値は５．６ｘ１０−３〜５．７ｘ１０−１２の範囲であり、ＬＰＳのｐ値は２．４ｘ１０−３〜１．１ｘ１０−１４の範囲であった。図６に見られるように、これらの遺伝子の間に処理特異性はあまりなかったけれども、同数の遺伝子を、アップレギュレートしたように本分析においてダウンレギュレートした。ダウンレギュレートされる同定された遺伝子には、ケモカイン受容体（ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１）、転写因子（ＯＬＩＧ１、ＺＮＦ５５５、ＯＬＩＧ２）、免疫関連タンパク質のＧＴＰアーゼ（ＧＩＭＡＰ６、ＧＩＭＡＰ７、ＧＩＭＡＰ８、ＧＩＭＡＰ１）、およびＣＣＬ８が含まれる。ダウンレギュレーションが単球からマクロファージへの分化のマーカーである、ＣＣＲ２は、α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ処理の両方でダウンレギュレートされる（図９Ｂを参照）。さらに、ＴＬＲ１およびＮＯＤ様受容体（ＣＡＲＤ１２、ＮＡＬＰ１２）はまた、ダウンレギュレートされる。識別基準を満たすが、図９Ｂに記載されていない遺伝子には、Ｃ９ｏｒｆ５９、ＦＬＪ１２４４２、ＦＬＪ３３６４１、ＬＯＣ９０１２０、ＭＧＣ２９４１、およびＭＧＣ１７７９１が含まれる。分析に対するｍＲＮＡ半減期の制限動力学的関与を考慮すると、ダウンレギュレーションのダイナミック・レンジは、予想通り、アップレギュレーションのものより低い。
【０１０１】
一般に、相対的に少ない遺伝子は、ある処理でダウンレギュレートしたが、他ではしなかった。一般にダウンレギュレートしなかったある遺伝子は、オリゴデンドロサイト転写因子ＯＬＩＧ２であり、ＴＲＥＭ−１活性化により３．１倍アップレギュレートし、ＬＰＳにより５．６倍ダウンレギュレートした（図９Ｂを参照）。
【０１０２】
さらに、ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳは、ＴＲＥＭ−１−バイアスであるＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ−特異的であるＧ−ＣＳＦを伴う、ＣＳＦ産生を特異的に調節する（図７、８Ａ−Ｂを参照）。
【０１０３】
実施例７：ファゴサイトーシスアッセイ
ヒトＴＨＰ−１細胞を、ＴＨＰ−１細胞形態学および行動におけるα−ＴＲＥＭ−１処理およびＬＰＳ処理の効果を比較するために、α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳで処理した。ヒトＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ−２０２）を、推奨増殖指針にしたがって維持した。視覚化の強化について、ＴＨＰ−１細胞は、指示された処理前に、組織培養処理ウェル中で５日間ＧＦＰ発現レンチウイルスが形質導入された。Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（商標）多染色性赤色１．０ミクロンマイクロスフィア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ；１８６６０）を加え、組織培養インキュベーター中で３０分間インキュベートし、成長培地で洗浄し、イメージング前に非オプソニン化ビーズを除去することによってファゴサイトーシスアッセイを行った。α−ＴＲＥＭ−１処理は、ＴＨＰ−１細胞の形態変化を誘導した（図１０Ａ）。さらに、α−ＴＲＥＭ−１処理およびＬＰＳ処理の両方は、免疫反応の刺激におけるＴＲＥＭ−１活性化の役割が一致している、標識マイクロスフィア（１μＭビーズは赤色で生じる）のファゴサイトーシスを誘発した（図１０Ｂ）。
【０１０４】
実施例８：遺伝子発現のＥＬＩＳＡプロファイリング
α−ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳ処理に反応する選択遺伝子の差次的発現を、ＥＬＩＳＡにより確認した。製造業者のプロトコールにより訓化培地上でＥＬＩＳＡを実施した。ＴＲＥＭ−１活性化またはＬＰＳのいずれかの後に細胞培養基中に分泌されるタンパク質濃度を、８時間経過の間に測定した。ＧＭ−ＣＳＦは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に発注したカスタム被覆プレート上の検体であった。Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＮＨＢＡ、およびＳＰＰ１検出キットを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；各々ＤＭＣ００、ＤＣＳ５０、ＤＹ３３８、およびＤＯＳＴ００）。ＩＬ−２３検出キットをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；８８−７２３７）。
【０１０５】
標的タンパク質濃度の検出（括弧内は、ＴＲＥＭ−１およびＬＰＳそれぞれの転写レベルの倍率変化）は、ＳＰＰ１（２８．０および３．７；図１１Ｅ）およびＭ−ＣＳＦ（２２．０および１．８；図１１Ｂ）が、ＴＲＥＭ−１活性化には反応するが、ＬＰＳ処理には反応せずにアップレギュレートされることを確認した。これらの結果はまた、分泌ＳＰＰ１タンパク質が細胞外液、例えば、組織培養基で検出可能であることを立証する。さらに、Ｇ−ＣＳＦ（１．３および４５．２；図１１Ｃ）およびＩＬ−２３（−１．１および３１．８；図１１Ｆ）のタンパク質濃度は、これらの遺伝子がＬＰＳ処理に反応してアップレギュレートされることを確認した。最終的に、ＩＮＨＢＡ（９６．７および９７．０；図１１Ｄ）およびＧＭ−ＣＳＦ（９．６および１８．９；図１１Ａ）のタンパク質濃度は、これらの遺伝子が、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理の両方に反応して同等にアップレギュレートされることを確認した。
【０１０６】
これらのＥＬＩＳＡ結果は、ＴＲＥＭ−１活性化およびＬＰＳ処理に反応する遺伝子を同定するために、転写プロファイリング分析の用途を立証する。これらの結果はまた、最初に、サイトカインまたはＴＲＥＭ−１活性化により誘導されるが、ＬＰＳによっては誘導されない関連因子を同定する。さらに、ＥＬＩＳＡ結果は、ＳＰＰ１がＴＲＥＭ−１活性化に応答してタンパク質濃度でアップレギュレートされることおよびＳＰＰ１がＴＲＥＭ−１活性化マーカーとして用いられうることを示す。ＴＲＥＭ−１活性のマーカーとして用いられうるさらなる遺伝子は、図８Ａ、２３および２４に記載されている。
【０１０７】
実施例９：ＴＲＥＭ−１活性化によるＲＡ患者の滑膜からのサイトカイン産生の分析
架橋抗体でのＴＲＥＭ−１の活性化は、ヒト単球および好中球の両方において炎症性因子の産生をもたらすことが示されている。したがって、本発明者らは、ＴＲＥＭ−１活性化が、ＲＡ陽性滑膜培養物において同様の炎症誘発効果を有するか否かを試験した。滑膜培養アッセイを、Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８９） Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２ Ｓｕｐｐ：１７７−８６で最初に記載されるように行った。簡単に言えば、滑膜組織を、３人の異なるＲＡ患者の関節化鏡視下膝手術中に得た（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ ｉｎ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）。試料を、輸送のために５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を有するＲＰＭＩ中に置いた。組織を分離し、細胞を放出するために、ドナー１およびドナー２からの組織を、５０ｍｌの５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および０．１５ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する５％ＦＣＳを有するＲＰＭＩで処理し、３７℃で９０分間回転させた。ドナー３からの組織は、リベラーゼブレンザイム４（Ｒｏｃｈｅ）がコラゲナーゼ／ＤＮアーゼと置換されたことを除き、同様に調製され、製造業者の提案プロトコールにしたがって用いられた。リベラーゼブレンザイム４は、実質的にエンドトキシン不含であるとして促進される。１００μｍナイロンメッシュにかけて試料を通過させることによって断片を除去した。細胞を洗浄し、プレーティングのために０．５％ＦＣＳでＲＰＭＩにて再懸濁した。ＴＲＥＭ−１の抗体活性化について、組織培養処理プレートを、細胞添加前に３時間指示濃度で、抗ｈＴＲＥＭ−１抗体（ＭＡＢ１２７８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）またはアイソタイプ適合対照抗体、抗イー・テネラ（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）のいずれかを含有する１００μｌの抗体溶液で被覆した。抗ｈＴＲＥＭ−１抗体は、０．１２、０．３７、１．１１、３．３３、および１０μｇ／ｍｌの濃度でアッセイした；対照抗体は、０．１２、１．１１、および１０μｇ／ｍｌの濃度でアッセイした。６ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で１００μｌの細胞懸濁液を添加する前に、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。２４時間後、上清を、多重ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて指示因子についてアッセイした。
【０１０８】
１個体からのデータを示す、図１２に見られるように、架橋抗体を用いるこれらの培養物におけるＴＲＥＭ−１の活性化は、用量依存的手法でＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を誘導した。全３つのドナー試料から同様の結果を得た。さらに、図１３Ａは、３つの各ドナー試料における自発的サイトカイン産生の比較を示し、図１３Ｂは、３つの各ドナー試料におけるＴＲＥＭ−１の架橋におけるサイトカイン産生の比較を示す。図１３に示されるように、ドナー３自発的サイトカイン濃度は、少量のエンドトキシン混入が共通している、ドナー１および２のものよりかなり低いが、ドナー変異性も原因でありうる。全３つのドナーからの結果は、ＴＲＥＭ−１がＲＡ培養物に機能的に存在することおよびＴＲＥＭ−１が滑膜における炎症反応を増幅しうることを示している。
【０１０９】
実施例１０：ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃトランスジェニックマウス
トランスジェニックマウスは、マウスＴＲＥＭ−１の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部（「ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ」）を含む融合タンパク質を構成的に発現するために作製された。融合構築物ヌクレオチドおよびタンパク質配列は、配列番号７および配列番号８それぞれに示されている。あるいは、トランスジェニックマウスは、ＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物が、構成的に発現されるよりむしろ誘導性プロモーターの支配下にある場合に作製されうる。可溶性ＴＲＥＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質はまた、当該分野にてよく知られており、ＬＰＳおよび敗血性ショックならびにザイモサンＡ誘導性肉芽腫形成に有効であることが示されている。
【０１１０】
ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃトランスジェニックマウスにおけるＫ／ＢｘＮ移動
マウスＫ／ＢｘＮモデルは、ＲＡを含む、多数の形態のヒト炎症性関節炎に類似するマウスモデルである（Ｄｉｔｚｅｌ（２００４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０（１）：４０−４５）。図１４に示されるように、ＴＲＥＭ−１ ｍＲＮＡ発現は、正常な足と比べてＫ／ＢｘＮ足で著しく増大した。したがって、関節炎Ｋ／ＢｘＮマウスからの血清または抗体は、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物がＫ／ＢｘＮ血清または抗体に対する炎症反応を阻害するかどうかを決定するために、実験動物に移植されうる。
【０１１１】
１の実施態様において、可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ＴＲＥＭ−１が関節性炎症を減少させるか否かを評価するために、可溶性ＴＲＥＭ−１は、Ｋ／ＢｘＮ血清が投与された。簡単に言えば、ＴＲＥＭ−１トランスジェニック（“Ｔｇ）マウスを、ＣＭＶエンハンサーおよびβ−アクチンプロモーターからなる偏在的に強力な融合プロモーターである、ＣＡＧＧＳプロモーターの支配下で可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ融合タンパク質を発現するために、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上で作製した。全ての構築物は、ＣＡＧＧＳ／ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ／ウサギβ−グロブリンポリＡであった。トランスジェニックマウスの血漿における可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃタンパク質濃度は、約１−２ｍｇ／ｍｌであった。ＴＲＥＭ−１トランスジェニック雄マウス（ｎ＝７）および野生型雄マウス（ｎ＝７）を、０日目および２日目に１５０μｌのＫ／ＢｘＮ血清で腹腔内（ｉｐ）注射した。足首の直径を、１４日目まで定期的に測定した。
【０１１２】
図１５は、野生型対照と比べたＣ５７ＢＬ／６−ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの平均足首肥厚を示す。図１５に示されるように、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスは、６日目までに野生型マウスとして同様の表現型を発現した。７日目になると、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスでは足首の腫れは治まったが、野生型対照では腫れは継続した。次いで、足首の腫れの有意な減少は、野生型対照に比べてＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの９−１４日目（ｐ＜０．０５）から観察された。さらに、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの最大の腫れは、野生型対照において観察された最大の腫れの約半分であった。１４日目まで、ＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスの足首の腫れは、野生型対照で観察された腫れの量の約１／４であった（図１６）。したがって、可溶性ＴＲＥＭ−１は、炎症性関節炎に付随する炎症の量を有意に低下させるのに有効であり、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節、低下および／または阻害するために、ＴＲＥＭ−１アンタゴニスト、例えば、ＴＲＥＭ−１融合タンパク質および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体の使用が、例えば、ＲＡを含む炎症性障害の有効な治療方法であることを立証している。
【０１１３】
本発明の融合タンパク質を作製するのに用いられる転写および翻訳制御配列には、限定されるものではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれうる。１の実施態様において、制御配列には、プロモーターならびに転写開始および終止配列が含まれる。
【０１１４】
プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーターをコードしうる。プロモーターは、天然プロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかでありうる。１つ以上のプロモーターの要素を組み合わせる、ハイブリッドプロモーターはまた、当該分野にて知られており、本発明に用いられうる。
【０１１５】
付加的な実験動物は、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ接合体マウスを野生型マウスに戻し交配させることによって作製され、野生型子孫は、子をはらんだ対照として役割を果たしうる。種々のｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物が炎症性疾患を保護するかどうかを決定するために、実験動物は、当該分野にて知られている種々の炎症性疾患の動物モデル、例えば、ＬＰＳ、およびＣＩＡなどで試験されうる。ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物は構成的に発現されうるか、またはｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物の発現は、ＬＰＳおよびＣＩＡの投与前に、投与と同時に、および／または投与後の１もしくは複数の時点で誘導されうる。ＴＲＥＭ−１受容体の安定形態を発現するトランスジェニックマウスはまた、炎症性疾患の推定阻害薬をスクリーンするために作製されうる。
【０１１６】
内毒素性ショックのリポ多糖（ＬＰＳ）モデルにおいて、実験動物は、ＬＰＳ誘発性ショックに対する炎症性反応を減少させるのにｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物の有効性を決定するために、ＬＰＳが注射される。さらに、実験動物は、ＣＩＡに対する炎症反応を減少させるのにｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物の有効性を決定するために、例えば、実施例２における、ＣＩＡモデルで試験されうる。
【０１１７】
ＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰとＲＡとの関連性に基づき、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃ構築物は、マウスにおけるＬＰＳおよびＣＩＡ投与を保護することが期待されている。同様に、炎症性疾患、例えば、ＲＡに罹患するヒト対象に対する適当なＴＲＥＭ−１構築物および／または適当なＴＲＥＭ−１タンパク質の投与は、炎症性疾患の重篤度を低下させうる。
【０１１８】
実施例１１：抗ｈＴＲＥＭ−１抗体
抗ｈＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＲＡ滑膜培養アッセイにおいて炎症性サイトカインの産生を阻害する能力を識別される。例えば、実施例９および実施例１２における、ＲＡおよび喘息モデルは、炎症反応の１または複数の態様を中和する治療抗体を開発するための炎症性疾患のモデルとしてうまく用いられている。ＴＲＥＭ−１と炎症性疾患、例えば、ＲＡおよび喘息との関連性に一部基づき、抗ｈＴＲＥＭ−１抗体は、ＲＡ滑膜培養アッセイおよび喘息モデルにおける炎症性サイトカインの産生を阻害することが期待されている。同様に、炎症性疾患、例えば、ＲＡまたは喘息に罹患するヒト対象に対する適当な抗体の投与は、炎症性疾患の重篤度を低下および／または疾患の症状を減少させることが必要である。
【０１１９】
実施例１２：ＴＲＥＭ−１および抗ＩｇＥ抗体での投与
肥満細胞の表面上のＩｇＥの架橋が、肥満細胞活性化および脱顆粒をもたらすシグナル伝達現象を誘発するであろうという理由から、肥満細胞およびＩｇＥは、アレルギー反応、例えば、喘息またはアナフィラキシーなどの急性呼吸器障害の確立したプレーヤーである。該シグナル伝達系および肥満細胞活性化および脱顆粒の下流結果は、ラット抗マウスＩｇＥを耳に皮内（ｉｄ）注射する受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）モデルを用いてマウスにおいてインビボで調査されうる。抗ＩｇＥ抗体は、肥満細胞活性化および脱顆粒を誘導する肥満細胞の表面上のＦｃεＲＩ受容体に結合するＩｇＥと結合および交差結合するであろう。次の炎症性浮腫反応は、技術者のマイクロメータを用いて算出されうる耳の中の測定可能な腫れをもたらす。Ｉｎａｇａｋｉら「Ｍｏｕｓｅ ｅａｒ ＰＣＡ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｔｉａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ」，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７４（１）：９１−２（１９８４）。
【０１２０】
トランスジェニックＴＲＥＭ−１マウスにおける抗ＩｇＥ投与
トランスジェニックＴＲＥＭ−１マウスおよび野生型マウスは、耳の腫脹モデルを用いて抗ＩｇＥが投与された。トランスジェニックマウスは、実施例１０と同様に生産された。該実験に用いられるトランスジェニックマウス株は、約２００μｇ／ｍｌのｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃタンパク質の血液血漿濃度を含有していた。イソフルラン麻酔中に、ＴＲＥＭ−１野生型マウスおよびトランスジェニックヘテロ接合体ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦｃマウスの耳を、耳厚について測定した。抗マウスＩｇＥは、０．９％セイラインで１０ｎｇ／２０ｕｌに希釈された。表２に示されるように、トランスジェニックおよび野生型マウスは、左耳において０時間に抗ＩｇＥ抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ５５３４１３）が投与され、一方、別群のトランスジェニックおよび野生型マウスは、エンドトキシン不含０．９％正常セイラインビヒクルが投与された。投与後＋１時間、＋２時間、＋４時間、および＋６時間で耳測定値を得た。
【表２】
【０１２１】
図１７に示されるように、野生型対照と比べてＴＲＥＭ−１トランスジェニックマウスにおいて耳の腫脹の減少が観察された。したがって、ｍＴＲＥＭ−１−ｈＦＣキメラタンパク質を過剰発現するＣ５７ＢＬ／６マウスは皮膚の耳の腫脹を減少させているので、ＴＲＥＭ−１はインビボにおけるアレルギー反応に関与しうる。したがって、可溶性ＴＲＥＭ−１は、抗ＩｇＥ投与に付随する炎症を減少させるのに有効である。例えば、可溶性ＴＲＥＭ−１は、喘息、アナフィラキシー、急性および慢性じんま疹（じんましん）、血管性浮腫、アレルギー性鼻炎、虫さされアレルギー、およびアトピーを調節するのに有効であることが期待されている。
【０１２２】
可溶性ＴＲＥＭ−１で前処理した野生型マウスにおける抗ＩｇＥ投与
可溶性ＴＲＥＭ−１の投与が、耳の腫脹モデルにおいて炎症を保護するか否かを評価するために、マウスを可溶性ＴＲＥＭ−１融合タンパク質で前処理した。研究前日、マウスを、表３に示されるように、０．９％セイライン、ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃ（５００ｕｇ／４００ｕｌ、２５０ｕｇ／４００ｕｌ、または１００ｕｇ／４００ｕｌ）または抗イー・テネラ−ＩｇＧ ２ａ（５００ｕｇ／４００ｕｌ）のいずれかで腹腔内注射した。抗マウスＩｇＥを、０．９％セイラインで１０ｎｇ／２０ｕｌに希釈した。マウスＴＲＥＭ−１の細胞外ドメインおよび突然変異マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部（「ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃ」）（配列番号２７）を含む組換えｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃを作製した。Ｆｃ領域を、補体およびＦｃ受容体結合を減少させるために突然変異させた。ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃおよび抗イー・テネラ−ＩｇＧ ２ａ（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＮＪ）を、所望の用量レベルにＰＢＳで希釈した。投与前に、全マウスの耳を、基準耳厚を決定するために測定した。マウスは、左耳において０時間に抗ＩｇＥ（１０ｎｇ／２０ｕｌ／皮内）が投与され、一方、右耳は、０．９％正常セイライン（２０ｕｌ／皮内）が投与された。投与後＋１時間、＋２時間、＋４時間、および＋５時間で耳測定値を得た。
【表３】
【０１２３】
図１８に示されるように、可溶性ｍＴＲＥＭ−１−ｍＦｃタンパク質を有するマウスの前処理は、対照と比べて耳の腫脹を減少させた。さらに、図１９に示されるように、耳の腫脹の減少は、用量依存的である。これらのデータは、可溶性ＴＲＥＭ−１が、抗ＩｇＥ投与に付随する炎症を減少させることおよび例えば、可溶性ＴＲＥＭ−１融合タンパク質および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体などのＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達のアンタゴニストが、抗ＩｇＥ投与に付随する炎症の治療のために患者に投与されうることをさらに立証している。例えば、可溶性ＴＲＥＭ−１および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体は、喘息、アナフィラキシー、急性および慢性じんま疹（じんましん）、血管性浮腫、アレルギー性鼻炎、虫さされアレルギー、およびアトピーを調節するのに有効であると期待されている。
【０１２４】
ＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスにおける抗ＩｇＥ投与
ＴＲＥＭ−１ヘテロ接合体（＋／−）およびホモ接合体（−／−）ノックアウトマウスを、耳の腫脹が機能的ＴＲＥＭ−１の欠損で減少するか否かを評価するために作製した。ストレートＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスを、ＴＲＥＭ−１遺伝子のエキソン１およびエキソン２を、ｌｏｘ Ｐ−隣接二重プロモーター駆動性Ｎｅｏ耐性遺伝子で置換して作製し、ＴＲＥＭ−１遺伝子におけるリーティング・フレーム移動をもたらす。遺伝子ターゲッティングを、Ｃ５７ＢＬ／６胚幹細胞で行った。ＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスは、プロタミン−Ｃｒｅマウスと交配され、Ｎｅｏ検出ＴＲＥＭ−１ノックアウトマウスを作製した。０日目に、イソフルラン麻酔中に、全てのマウスの耳を、基準耳厚を決定するために測定した。表４に示されるように、マウスは、左耳において０時間に抗ＩｇＥ（１０ｎｇ／２０ｕｌ／皮内）が投与され、一方、右耳は、０．９％正常セイライン（２０ｕｌ／皮内）が投与された。抗マウスＩｇＥを０．９％セイラインで１０ｎｇ／２０ｕｌに希釈した。投与後＋１時間で耳測定値を得た。
【表４】
【０１２５】
図２０に示されるように、ＴＲＥＭ−１遺伝子にヘテロ接合体（＋／−）であるマウスおよびＴＲＥＭ−１ヘテロ接合体（−／−）ノックアウトマウスは、野生型（＋／＋）対応物と比べて抗ＩｇＧの皮内投与後の耳の腫脹反応が減少した。これは、ＴＲＥＭ−１が炎症反応に関与すること、およびＴＲＥＭ−１が、例えば、喘息、アナフィラキシー、急性および慢性じんま疹（じんましん）、血管性浮腫、アレルギー性鼻炎、虫さされアレルギー、およびアトピーなどの、ＩｇＥ媒介炎症性疾患／障害の治療標的となることをさらに立証している。したがって、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達の拮抗および／または阻害は、ＩｇＥ媒介炎症性疾患／障害に付随する炎症の程度を有意に減少させるのに有効であり、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節、低下および／または阻害するための、ＴＲＥＭ−１アンタゴニスト、例えば、ＴＲＥＭ−１融合タンパク質および／または抗ＴＲＥＭ−１抗体の使用が、ＩｇＥ媒介炎症性疾患／障害の有効な治療方法であることを立証している。
【０１２６】
実施例１３：ＴＲＥＭ−１のｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡノックダウン
炎症性疾患に対する干渉ＲＮＡによる治療の有用性を立証するために、ＴＨＰ−１単球におけるＴＲＥＭ−１発現を、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡノックダウン後に測定した。簡単に言えば、種々のヒトＴＲＥＭ−１およびマウスＴＲＥＭ−１ ｓｈＲＮＡ配列を生成し、ＴＲＥＭ−１発現を減少させる能力について個々に試験した。典型的なｓｈＲＮＡ配列を表５に示す。ｓｈＲＮＡを、レンチウイルス形質導入によりＴＨＰ−１単球で発現した。ヒトＴＲＥＭ−１ ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から商業的に入手可能であり、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）によりＴＨＰ−１単球中に導入された。典型的なｓｉＲＮＡ配列を表６に示す。ノックダウン後、ＴＲＥＭ−１発現を、形質導入の７２時間後（ｓｈＲＮＡの場合）またはヌクレオフェクションの４８時間後（ｓｉＲＮＡの場合）にＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【０１２７】
図２１は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡノックダウン後のＲＴ−ＰＣＲによってＴＲＥＭ−１発現を示す棒グラフである。図２１に示されるように、ｓｈ２４７、ｓｈ５３３、ｓｈ３８２、およびプールＴＲＥＭ−１ ｓｉＲＮＡは、ｖＧＦＰおよびスクランブルｓｉＲＮＡ対照に比べて有効にＴＨＰ−１単球における内因性ＴＲＥＭ−１発現をノックダウンした。したがって、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＲＥＭ−１発現を低下させる有効な手段であるので、炎症性疾患の治療に用いられうる。
【０１２８】
ＲＮＡによる治療がＴＲＥＭ−１過剰発現を有効にノックダウンしうることを立証するために、レンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン前に、ＴＲＥＭ−１をＣＨＯ細胞で過剰発現した。１の実験において、ヒトＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞株で安定に過剰発現した。別の実験において、マウスＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞株で安定に過剰発現した。ＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現の後で、ｓｈＲＮＡを、レンチウイルスを用いて各ＣＨＯ細胞株で発現した。種々のヒトおよびマウスＴＲＥＭ−１ ｓｈＲＮＡ配列を生成し、ＴＲＥＭ−１過剰発現を低下させる能力について個々に試験した。典型的なｓｈＲＮＡ配列を表５に示している。レンチウイルスｓｈＲＮＡを暴露した後、ＴＲＥＭ−１発現レベルを、プローブとして抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットによって測定した。
【０１２９】
図２２Ａ−Ｂは、ＴＲＥＭ−１過剰発現細胞株におけるＴＲＥＭ−１のレンチウイルスｓｈＲＮＡノックダウン後のＴＲＥＭ−１発現を図示する典型的なウエスタンブロットを示す。図２２Ａに示されるように、ｓｈ１１４、ｓｈ２４７、ｓｈ２４７、ｓｈ２８０、ｓｈ３１５、ｓｈ３６０、ｓｈ４５０、およびｓｈ５３３は、対照に比べて有効にヒトＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現をノックダウンし、一方、ｓｈ３８２およびｓｈ６００は、ヒトＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現のノックダウンに効果がなかった。図２２Ｂに示されるように、ｓｈ７５、ｓｈ２８４、およびｓｈ４１４は、対照に比べて有効にマウスＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現をノックダウンし、一方、ｓｈ５９１は、マウスＴＲＥＭ−１−ＦＬＡＧ過剰発現のノックダウンに効果がなかった。したがって、ｓｈＲＮＡノックダウンは、ＴＲＥＭ−１過剰発現を低下させるのに有効な手段であるので、ＴＲＥＭ−１関連炎症性疾患を治療する。
【表５】
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
参照の一部
本願で引用されるすべての刊行物および特許文献は、個々の刊行物または特許文献の内容を本明細書の一部とするかの如く同一範囲で全ての目的に応じてその全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の炎症性疾患の治療方法であって、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させる工程を含む方法。
【請求項２】
炎症性疾患がＩｇＥによって媒介される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
炎症性疾患が呼吸器疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
疾患が喘息である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
炎症性疾患が関節リウマチである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
低下させる工程が、ＴＲＥＭ−１発現を低下させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
低下させる工程が、対象に干渉ＲＮＡを投与することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ｓｈＲＮＡが、配列番号９−１８のいずれかによってコードされるＲＮＡを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡが、配列番号２３−２６のいずれかを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
低下させる工程が、ＴＲＥＭ−１活性化を阻害することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ＴＲＥＭ−１活性化が、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物を投与することによって阻害される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
低下させる工程が、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達に関与する非ＴＲＥＭ−１タンパク質の発現または活性化を直接阻害することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
非ＴＲＥＭ−１タンパク質がＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
低下させる工程が、対象において内因性ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質に対する免疫反応を誘発することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
低下させる工程が、アジュバントおよびＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含む、免疫原性組成物を対象に投与することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
抗体またはそのフラグメントがモノクローナルである、請求項１８記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントが単一ドメイン抗体である、請求項１８記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
対象の治療方法であって、治療上有効な量の請求項１９記載の抗体またはそのフラグメントを対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２２】
配列番号９−２２のいずれかによってコードされるＲＮＡを含むｓｈＲＮＡ。
【請求項２３】
治療を必要とする対象の炎症性疾患の治療方法であって、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物を投与することによってＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させる工程を含む、方法。
【請求項２４】
治療を必要とする患者に投与されるＴＲＥＭ−１修飾剤の有効性を評価する方法であって、患者または患者からの試料における分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を検出することを含む、方法。
【請求項２５】
ＳＰＰ１濃度が患者から体液試料中で検出される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＳＰＰ１濃度を基準と比較する工程をさらに含み、基準と比較したＳＰＰ１濃度の増加がＴＲＥＭ−１活性の増加を示し、基準と比較したＳＰＰ１濃度の減少がＴＲＥＭ−１活性の減少を示すところの、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
基準が、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前に患者または患者からの試料にて検出されたＳＰＰ１濃度に相当する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節しうる候補薬剤のスクリーニング方法であって、
ＴＲＥＭ−１発現細胞を候補薬剤と接触させる工程；および
候補薬剤がＴＲＥＭ−１活性化を調節するかどうかを決定するためにＴＲＥＭ−１発現細胞の分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を評価する工程を含む、方法。
【請求項２９】
慢性炎症の治療を受ける患者のモニタリング方法であって、
ＴＲＥＭ−１修飾剤をそれを必要とする患者に投与する工程；
患者または患者からの試料における分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を検出する工程；および
検出ＳＰＰ１濃度を基準と比較し、患者をモニタリングする工程を含む、方法。
【請求項３０】
ＳＰＰ１濃度が患者からの体液試料中で検出される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
基準と比較したＳＰＰ１濃度の低下がＴＲＥＭ−１媒介炎症の低下を示す、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
基準と比較したＳＰＰ１濃度の変化なしがＴＲＥＭ−１媒介炎症の変化なしを示す、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
基準と比較したＳＰＰ１濃度の増加がＴＲＥＭ−１媒介炎症を示す、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
基準が、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前または同時に患者または患者からの試料で検出されたＳＰＰ１濃度に相当する、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
基準が、慢性炎症を伴わないことが知られている対照患者におけるＳＰＰ１濃度に相当する、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
対象における炎症性疾患の存在の検出方法であって、対象または対象から得られた試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程を含み、発現または活性の増加が炎症性疾患を示すところの、方法。
【請求項３７】
対象における炎症性疾患のモニタリング方法であって、
（ａ）最初の対象または対象から得られた最初の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；
（ｂ）第２の、後の対象または対象から得られた第２の、後の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の発現または活性を比較する工程を含み、発現または活性の変化が病態の変化を示すところの、方法。
【請求項３８】
炎症性疾患が関節リウマチである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
対象における炎症性疾患の治療の評価方法であって、
（ａ）最初の対象または対象から得られた最初の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；
（ｂ）第２の、後の対象または対象から得られた第２の、後の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；
（ｃ）第２の、後または第２の、後の試料前に治療を行う工程；および
（ｄ）（ａ）および（ｂ）の発現または活性を比較する工程を含み、発現または活性の変化が病態の変化を示すところの、方法。
【請求項４０】
治療が、最初または最初の試料後に行われる、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
比較の結果に基づき対象の治療方針を修正することをさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項１】
対象の炎症性疾患の治療方法であって、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させる工程を含む方法。
【請求項２】
炎症性疾患がＩｇＥによって媒介される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
炎症性疾患が呼吸器疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
疾患が喘息である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
炎症性疾患が関節リウマチである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
低下させる工程が、ＴＲＥＭ−１発現を低下させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
低下させる工程が、対象に干渉ＲＮＡを投与することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ｓｈＲＮＡが、配列番号９−１８のいずれかによってコードされるＲＮＡを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡが、配列番号２３−２６のいずれかを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
低下させる工程が、ＴＲＥＭ−１活性化を阻害することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ＴＲＥＭ−１活性化が、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物を投与することによって阻害される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
低下させる工程が、ＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達に関与する非ＴＲＥＭ−１タンパク質の発現または活性化を直接阻害することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
非ＴＲＥＭ−１タンパク質がＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
低下させる工程が、対象において内因性ＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質に対する免疫反応を誘発することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
低下させる工程が、アジュバントおよびＴＲＥＭ−１もしくはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含む、免疫原性組成物を対象に投与することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
抗体またはそのフラグメントがモノクローナルである、請求項１８記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントが単一ドメイン抗体である、請求項１８記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
対象の治療方法であって、治療上有効な量の請求項１９記載の抗体またはそのフラグメントを対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２２】
配列番号９−２２のいずれかによってコードされるＲＮＡを含むｓｈＲＮＡ。
【請求項２３】
治療を必要とする対象の炎症性疾患の治療方法であって、低分子、ペプチド模倣薬、ペプチド阻害薬、リガンド融合タンパク質、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体、可溶性ＴＲＥＭ−１受容体融合タンパク質、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物を投与することによってＴＲＥＭ−１媒介シグナル伝達を低下させる工程を含む、方法。
【請求項２４】
治療を必要とする患者に投与されるＴＲＥＭ−１修飾剤の有効性を評価する方法であって、患者または患者からの試料における分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を検出することを含む、方法。
【請求項２５】
ＳＰＰ１濃度が患者から体液試料中で検出される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＳＰＰ１濃度を基準と比較する工程をさらに含み、基準と比較したＳＰＰ１濃度の増加がＴＲＥＭ−１活性の増加を示し、基準と比較したＳＰＰ１濃度の減少がＴＲＥＭ−１活性の減少を示すところの、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
基準が、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前に患者または患者からの試料にて検出されたＳＰＰ１濃度に相当する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を調節しうる候補薬剤のスクリーニング方法であって、
ＴＲＥＭ−１発現細胞を候補薬剤と接触させる工程；および
候補薬剤がＴＲＥＭ−１活性化を調節するかどうかを決定するためにＴＲＥＭ−１発現細胞の分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を評価する工程を含む、方法。
【請求項２９】
慢性炎症の治療を受ける患者のモニタリング方法であって、
ＴＲＥＭ−１修飾剤をそれを必要とする患者に投与する工程；
患者または患者からの試料における分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）濃度を検出する工程；および
検出ＳＰＰ１濃度を基準と比較し、患者をモニタリングする工程を含む、方法。
【請求項３０】
ＳＰＰ１濃度が患者からの体液試料中で検出される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
基準と比較したＳＰＰ１濃度の低下がＴＲＥＭ−１媒介炎症の低下を示す、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
基準と比較したＳＰＰ１濃度の変化なしがＴＲＥＭ−１媒介炎症の変化なしを示す、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
基準と比較したＳＰＰ１濃度の増加がＴＲＥＭ−１媒介炎症を示す、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
基準が、ＴＲＥＭ−１修飾剤の投与前または同時に患者または患者からの試料で検出されたＳＰＰ１濃度に相当する、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
基準が、慢性炎症を伴わないことが知られている対照患者におけるＳＰＰ１濃度に相当する、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
対象における炎症性疾患の存在の検出方法であって、対象または対象から得られた試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程を含み、発現または活性の増加が炎症性疾患を示すところの、方法。
【請求項３７】
対象における炎症性疾患のモニタリング方法であって、
（ａ）最初の対象または対象から得られた最初の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；
（ｂ）第２の、後の対象または対象から得られた第２の、後の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の発現または活性を比較する工程を含み、発現または活性の変化が病態の変化を示すところの、方法。
【請求項３８】
炎症性疾患が関節リウマチである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
対象における炎症性疾患の治療の評価方法であって、
（ａ）最初の対象または対象から得られた最初の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；
（ｂ）第２の、後の対象または対象から得られた第２の、後の試料におけるＴＲＥＭ−１またはＤＡＰ１２／ＴｙｒｏＢＰ発現または活性を検出する工程；
（ｃ）第２の、後または第２の、後の試料前に治療を行う工程；および
（ｄ）（ａ）および（ｂ）の発現または活性を比較する工程を含み、発現または活性の変化が病態の変化を示すところの、方法。
【請求項４０】
治療が、最初または最初の試料後に行われる、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
比較の結果に基づき対象の治療方針を修正することをさらに含む、請求項３９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２３−２】
【図２３−３】
【図２３−４】
【図２３−５】
【図２３−６】
【図２３−７】
【図２３−８】
【図２３−９】
【図２３−１０】
【図２３−１１】
【図２３−１２】
【図２３−１３】
【図２３−１４】
【図２３−１５】
【図２３−１６】
【図２３−１７】
【図２３−１８】
【図２３−１９】
【図２３−２０】
【図２３−２１】
【図２３−２２】
【図２３−２３】
【図２３−２４】
【図２３−２５】
【図２３−２６】
【図２３−２７】
【図２３−２８】
【図２３−２９】
【図２３−３０】
【図２３−３１】
【図２３−３２】
【図２３−３３】
【図２３−３４】
【図２３−３５】
【図２３−３６】
【図２３−３７】
【図２３−３８】
【図２３−３９】
【図２３−４０】
【図２３−４１】
【図２３−４２】
【図２３−４３】
【図２３−４４】
【図２３−４５】
【図２３−４６】
【図２３−４７】
【図２３−４８】
【図２３−４９】
【図２３−５０】
【図２３−５１】
【図２３−５２】
【図２３−５３】
【図２３−５４】
【図２３−５５】
【図２３−５６】
【図２３−５７】
【図２３−５８】
【図２３−５９】
【図２３−６０】
【図２３−６１】
【図２３−６２】
【図２３−６３】
【図２３−６４】
【図２３−６５】
【図２３−６６】
【図２３−６７】
【図２３−６８】
【図２３−６９】
【図２３−７０】
【図２３−７１】
【図２３−７２】
【図２３−７３】
【図２３−７４】
【図２３−７５】
【図２３−７６】
【図２３−７７】
【図２３−７８】
【図２３−７９】
【図２３−８０】
【図２３−８１】
【図２３−８２】
【図２３−８３】
【図２３−８４】
【図２３−８５】
【図２３−８６】
【図２３−８７】
【図２３−８８】
【図２３−８９】
【図２３−９０】
【図２３−９１】
【図２３−９２】
【図２３−９３】
【図２３−９４】
【図２３−９５】
【図２３−９６】
【図２３−９７】
【図２３−９８】
【図２３−９９】
【図２３−１００】
【図２３−１０１】
【図２３−１０２】
【図２３−１０３】
【図２３−１０４】
【図２３−１０５】
【図２３−１０６】
【図２３−１０７】
【図２３−１０８】
【図２３−１０９】
【図２３−１１０】
【図２３−１１１】
【図２３−１１２】
【図２３−１１３】
【図２３−１１４】
【図２３−１１５】
【図２３−１１６】
【図２３−１１７】
【図２３−１１８】
【図２３−１１９】
【図２３−１２０】
【図２３−１２１】
【図２３−１２２】
【図２３−１２３】
【図２３−１２４】
【図２３−１２５】
【図２３−１２６】
【図２３−１２７】
【図２３−１２８】
【図２３−１２９】
【図２３−１３０】
【図２３−１３１】
【図２３−１３２】
【図２３−１３３】
【図２３−１３４】
【図２３−１３５】
【図２３−１３６】
【図２３−１３７】
【図２３−１３８】
【図２３−１３９】
【図２３−１４０】
【図２３−１４１】
【図２３−１４２】
【図２３−１４３】
【図２３−１４４】
【図２３−１４５】
【図２３−１４６】
【図２３−１４７】
【図２３−１４８】
【図２３−１４９】
【図２３−１５０】
【図２３−１５１】
【図２３−１５２】
【図２３−１５３】
【図２３−１５４】
【図２３−１５５】
【図２３−１５６】
【図２３−１５７】
【図２３−１５８】
【図２３−１５９】
【図２３−１６０】
【図２３−１６１】
【図２３−１６２】
【図２３−１６３】
【図２３−１６４】
【図２３−１６５】
【図２３−１６６】
【図２３−１６７】
【図２３−１６８】
【図２３−１６９】
【図２３−１７０】
【図２３−１７１】
【図２３−１７２】
【図２３−１７３】
【図２３−１７４】
【図２３−１７５】
【図２３−１７６】
【図２３−１７７】
【図２３−１７８】
【図２３−１７９】
【図２３−１８０】
【図２３−１８１】
【図２３−１８２】
【図２４】
【図２４−２】
【図２４−３】
【図２４−４】
【図２４−５】
【図２４−６】
【図２４−７】
【図２４−８】
【図２４−９】
【図２４−１０】
【図２４−１１】
【図２４−１２】
【図２４−１３】
【図２４−１４】
【図２４−１５】
【図２４−１６】
【図２４−１７】
【図２４−１８】
【図２４−１９】
【図２４−２０】
【図２４−２１】
【図２４−２２】
【図２４−２３】
【図２４−２４】
【図２４−２５】
【図２４−２６】
【図２４−２７】
【図２４−２８】
【図２４−２９】
【図２４−３０】
【図２４−３１】
【図２４−３２】
【図２４−３３】
【図２４−３４】
【図２４−３５】
【図２４−３６】
【図２４−３７】
【図２４−３８】
【図２４−３９】
【図２４−４０】
【図２４−４１】
【図２４−４２】
【図２４−４３】
【図２４−４４】
【図２４−４５】
【図２４−４６】
【図２４−４７】
【図２４−４８】
【図２４−４９】
【図２４−５０】
【図２４−５１】
【図２４−５２】
【図２４−５３】
【図２４−５４】
【図２４−５５】
【図２４−５６】
【図２４−５７】
【図２４−５８】
【図２４−５９】
【図２４−６０】
【図２４−６１】
【図２４−６２】
【図２４−６３】
【図２４−６４】
【図２４−６５】
【図２４−６６】
【図２４−６７】
【図２４−６８】
【図２４−６９】
【図２４−７０】
【図２４−７１】
【図２４−７２】
【図２４−７３】
【図２４−７４】
【図２４−７５】
【図２４−７６】
【図２４−７７】
【図２４−７８】
【図２４−７９】
【図２４−８０】
【図２４−８１】
【図２４−８２】
【図２４−８３】
【図２４−８４】
【図２４−８５】
【図２４−８６】
【図２４−８７】
【図２４−８８】
【図２４−８９】
【図２４−９０】
【図２４−９１】
【図２４−９２】
【図２４−９３】
【図２４−９４】
【図２４−９５】
【図２４−９６】
【図２４−９７】
【図２４−９８】
【図２４−９９】
【図２４−１００】
【図２４−１０１】
【図２４−１０２】
【図２４−１０３】
【図２４−１０４】
【図２４−１０５】
【図２４−１０６】
【図２４−１０７】
【図２４−１０８】
【図２４−１０９】
【図２４−１１０】
【図２４−１１１】
【図２４−１１２】
【図２４−１１３】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２３−２】
【図２３−３】
【図２３−４】
【図２３−５】
【図２３−６】
【図２３−７】
【図２３−８】
【図２３−９】
【図２３−１０】
【図２３−１１】
【図２３−１２】
【図２３−１３】
【図２３−１４】
【図２３−１５】
【図２３−１６】
【図２３−１７】
【図２３−１８】
【図２３−１９】
【図２３−２０】
【図２３−２１】
【図２３−２２】
【図２３−２３】
【図２３−２４】
【図２３−２５】
【図２３−２６】
【図２３−２７】
【図２３−２８】
【図２３−２９】
【図２３−３０】
【図２３−３１】
【図２３−３２】
【図２３−３３】
【図２３−３４】
【図２３−３５】
【図２３−３６】
【図２３−３７】
【図２３−３８】
【図２３−３９】
【図２３−４０】
【図２３−４１】
【図２３−４２】
【図２３−４３】
【図２３−４４】
【図２３−４５】
【図２３−４６】
【図２３−４７】
【図２３−４８】
【図２３−４９】
【図２３−５０】
【図２３−５１】
【図２３−５２】
【図２３−５３】
【図２３−５４】
【図２３−５５】
【図２３−５６】
【図２３−５７】
【図２３−５８】
【図２３−５９】
【図２３−６０】
【図２３−６１】
【図２３−６２】
【図２３−６３】
【図２３−６４】
【図２３−６５】
【図２３−６６】
【図２３−６７】
【図２３−６８】
【図２３−６９】
【図２３−７０】
【図２３−７１】
【図２３−７２】
【図２３−７３】
【図２３−７４】
【図２３−７５】
【図２３−７６】
【図２３−７７】
【図２３−７８】
【図２３−７９】
【図２３−８０】
【図２３−８１】
【図２３−８２】
【図２３−８３】
【図２３−８４】
【図２３−８５】
【図２３−８６】
【図２３−８７】
【図２３−８８】
【図２３−８９】
【図２３−９０】
【図２３−９１】
【図２３−９２】
【図２３−９３】
【図２３−９４】
【図２３−９５】
【図２３−９６】
【図２３−９７】
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【図２３−１００】
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【図２３−１０２】
【図２３−１０３】
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【図２３−１０８】
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【図２３−１１０】
【図２３−１１１】
【図２３−１１２】
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【図２３−１１５】
【図２３−１１６】
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【図２３−１５０】
【図２３−１５１】
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【図２３−１５３】
【図２３−１５４】
【図２３−１５５】
【図２３−１５６】
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【図２３−１５８】
【図２３−１５９】
【図２３−１６０】
【図２３−１６１】
【図２３−１６２】
【図２３−１６３】
【図２３−１６４】
【図２３−１６５】
【図２３−１６６】
【図２３−１６７】
【図２３−１６８】
【図２３−１６９】
【図２３−１７０】
【図２３−１７１】
【図２３−１７２】
【図２３−１７３】
【図２３−１７４】
【図２３−１７５】
【図２３−１７６】
【図２３−１７７】
【図２３−１７８】
【図２３−１７９】
【図２３−１８０】
【図２３−１８１】
【図２３−１８２】
【図２４】
【図２４−２】
【図２４−３】
【図２４−４】
【図２４−５】
【図２４−６】
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【図２４−２１】
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【図２４−２３】
【図２４−２４】
【図２４−２５】
【図２４−２６】
【図２４−２７】
【図２４−２８】
【図２４−２９】
【図２４−３０】
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【図２４−３６】
【図２４−３７】
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【図２４−４０】
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【図２４−４５】
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【図２４−５０】
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【図２４−５４】
【図２４−５５】
【図２４−５６】
【図２４−５７】
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【図２４−５９】
【図２４−６０】
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【図２４−６２】
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【図２４−６４】
【図２４−６５】
【図２４−６６】
【図２４−６７】
【図２４−６８】
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【図２４−７０】
【図２４−７１】
【図２４−７２】
【図２４−７３】
【図２４−７４】
【図２４−７５】
【図２４−７６】
【図２４−７７】
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【図２４−８０】
【図２４−８１】
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【図２４−８９】
【図２４−９０】
【図２４−９１】
【図２４−９２】
【図２４−９３】
【図２４−９４】
【図２４−９５】
【図２４−９６】
【図２４−９７】
【図２４−９８】
【図２４−９９】
【図２４−１００】
【図２４−１０１】
【図２４−１０２】
【図２４−１０３】
【図２４−１０４】
【図２４−１０５】
【図２４−１０６】
【図２４−１０７】
【図２４−１０８】
【図２４−１０９】
【図２４−１１０】
【図２４−１１１】
【図２４−１１２】
【図２４−１１３】
【公表番号】特表２０１０−５１６６７８（Ｐ２０１０−５１６６７８Ａ）
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４６４２３（Ｐ２００９−５４６４２３）
【出願日】平成２０年１月１６日（２００８．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０００６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８８８４９
【国際公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１６日（２００８．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０００６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８８８４９
【国際公開日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
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