ＴＴＫペプチドおよびそれを含むワクチン
本明細書では、がんに対するペプチドワクチンについて記載する。特に、ＣＴＬを誘発するＴＴＫ遺伝子由来のエピトープペプチドを提供する。抗原提示細胞、およびそのようなペプチドを標的とする単離されたＣＴＬ、ならびに抗原提示細胞またはＣＴＬを誘導する方法もまた提供する。本発明はさらに、ＴＴＫ由来のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む薬学的組成物を提供する。さらに本発明は、ＴＴＫ由来のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ペプチドを提示する抗原提示細胞、または本発明の薬学的組成物を用いて、がん（腫瘍）を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防する方法、さらにはＣＴＬを誘導する方法、抗腫瘍免疫を誘導する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２００９年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／２１６，０１７号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（非特許文献１／Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２／Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）。これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床開発の前進が保証される（非特許文献３／Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４／Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５／Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６／van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７／Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８／Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９／Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０／Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。残念ながら、現在のがんワクチンの治験の大半では低い客観的奏功率しか観察されていない（非特許文献１１／Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２／Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３／Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。したがって、免疫療法の標的としての新規ＴＡＡの必要性が依然として存在している。
【０００５】
この目的のために、網羅的ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現プロファイルの解析を通して、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（特許文献１／ＷＯ２００７／０１３６６５）および食道癌（特許文献２／ＷＯ２００７／０１３６７１）においていくつかの上方制御された遺伝子が同定された。それらの中から免疫療法の標的として優れた候補を同定するという目的で、これらの遺伝子が詳細に調べられた。免疫療法においてがん細胞を特異的に標的化するには、好ましいＴＡＡは、主にがん細胞によって発現され、正常な健常組織では発現が限定されているかまたは発現されないものである必要がある。
【０００６】
免疫療法の標的として好ましいＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡである。そのようなＴＡＡにより、治療によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳説されているリスクが最小限に抑えられ得る。
【０００７】
２３，０４０個の遺伝子を含む網羅的ｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイル解析を使用して、ＴＴＫプロテインキナーゼ（ＴＴＫ）が肺癌において上方制御されている遺伝子の１つとして同定された（非特許文献１４／Kikuchi at al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805）。ＴＴＫの発現は、肺癌患者および食道癌患者の８０％超において、腫瘍細胞で特異的に上方制御されている。同時に、ＴＴＫは、精巣を除く他の正常な重要器官では発現していない。まとめると、これらの事実から、ＴＴＫは、ＴＴＫが上方制御されている腫瘍を有する患者に対するがん免疫療法の標的として適用可能である可能性があることが示唆される。ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ誘導能を有するＴＴＫ由来のペプチドは、以前に開示されている（ＷＯ２００８／１０２５５７（特許文献３）を参照されたく、この結果を本明細書において図４として繰り返す）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０１３６６５
【特許文献２】ＷＯ２００７／０１３６７１
【特許文献３】ＷＯ２００８／１０２５５７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Kikuchi at al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、免疫療法の標的として役立ち得る新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは場合によっては免疫系により「自己」として認識され、したがって生得的な免疫原性を有さない場合が多いため、適切な標的の発見は極めて重要である。上記したように、ＴＴＫ（典型的なアミノ酸配列および遺伝子配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すが、これらに限定されることはなく、典型的な遺伝子配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３１８からも入手可能である）は、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんにおいて上方制御されると同定された。したがって本発明は、がん／腫瘍免疫療法の標的の候補としてＴＴＫに着目する。
【００１１】
本発明はさらに、ＴＴＫに特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、ＴＴＫの遺伝子産物の特異的エピトープペプチドの同定に関する。以下に詳述するように、健常ドナーから採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＴＴＫ由来のＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。その後、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株が樹立された。そのようなＣＴＬ株の中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドで誘導されたＣＴＬ株は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＴＴＫを発現する細胞に対して、有意に強力な特異的細胞傷害性を示した。これらの結果から、これらのペプチド（特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチド）が、ＴＴＫを発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが実証される。さらにこの結果から、ＴＴＫは免疫原性が強く、かつそのエピトープはがん／腫瘍免疫療法の有効な標的であることが示される。
【００１２】
したがって、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチド、特にＴＴＫのアミノ酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）またはその免疫学的活性断片を含むものを提供することは、本発明の１つの目的である。これらのペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予測され、したがってＣＴＬをエクスビボで誘導するために用いることができ、または、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍などのがんに対する免疫応答を誘導する目的で対象に投与するために用いることができる。好ましいペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１３】
本発明のペプチドは、結果として生じた改変ペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されているペプチドも包含する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の任意のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドとほぼ同様に、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導もしくは調製するために用いることができ、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１５】
対象に投与した場合、本発明のペプチドは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、好ましくはＡＰＣの表面上に提示される。したがって、本発明の１つもしくは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬを誘導する剤または組成物を提供することは、本発明の１つの目的である。本発明はさらに、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療および／または予防、ならびに術後のその再発の予防のために製剤化された、本発明の１つもしくは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物を企図する。本発明の薬学的な剤または組成物は、有効成分として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに／に加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを含み得る。
【００１６】
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを該ペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することにより、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣを誘導し得る。このようなＡＰＣは、標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、そのためがん免疫療法に使用される。したがって本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法、およびこのような方法によって得られるＡＰＣの双方を企図する。
【００１７】
本発明はまた、ＣＴＬを誘導する方法であって、ＣＤ８陽性細胞を、本発明の１つもしくは複数のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む方法を提供する。このような方法によって得られるＣＴＬは、例として肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療および予防に使用される。したがって本発明は、本発明の方法によって得られるＣＴＬを包含する。
【００１８】
がんに対する免疫応答を必要とする対象においてこれを誘導する方法であって、ＴＴＫポリペプチドまたはその免疫学的活性断片、ＴＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＴＴＫポリペプチドを提示するエキソソームまたはＡＰＣを含む剤または組成物を該対象に投与する段階を含む方法を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１９】
本発明の適用性は、がんなど、ＴＴＫ過剰発現に関連するか、またはＴＴＫ過剰発現から生じるいくつかの疾患のいずれにも及び、例示的ながんには、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［２１］を提供する：
［１］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
［２］細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド、
［３］以下の特徴の一方または両方を有する、［２］記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている、
［４］前記ペプチドがノナペプチドである、［１］〜［３］のいずれか一項記載の単離されたペプチド、
［５］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
［６］ＣＴＬを誘導するための剤であって、［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または［５］記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む、剤、
［７］がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または［５］記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む薬剤、
［８］ＨＬＡ−Ａ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、［７］記載の薬剤、
［９］ＨＬＡ−Ａ２がＨＬＡ−Ａ＊０２０１である、［８］記載の薬剤、
［１０］がんの治療のために製剤化される、［７］または［８］記載の薬剤、
［１１］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
（ａ）ＡＰＣと［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
（ｂ）［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階、
［１２］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導する方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階、
［１３］ＨＬＡ抗原と［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ、
［１４］［１１］記載の方法によって誘導される、［１３］記載のＡＰＣ、
［１５］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ、
［１６］［１２］記載の方法によって誘導される、［１５］記載のＣＴＬ、
［１７］対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１］〜［４］のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチド、１つもしくは複数のその免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む剤を該対象に投与する段階を含む、方法、
［１８］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体またはその断片、
［１９］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、
［２０］［１９］記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞、ならびに
［２１］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチド、［５］記載のヌクレオチド、または［１８］記載の抗体を含む、診断キット。
【００２１】
本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００２２】
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１】図１は、ＴＴＫ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｊ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル＃１および＃４（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃７（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃５（ｃ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃４、＃５、＃６、および＃７（ｄ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃５および＃７（ｅ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）で刺激した＃７（ｆ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）で刺激した＃５、＃７、および＃８（ｇ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃１、＃２、および＃５（ｈ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−５４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）で刺激した＃２（ｉ）、ならびにＴＴＫ−Ａ０２−１０−６６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃２（ｊ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２ａ−ｄ】図２ａ〜ｄは、ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）（ｃ）、およびＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）（ｄ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）から構成される。結果から、特定のＴＴＫペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株、および該ＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２ｅ−ｇ】図２ｅ〜ｇは、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｅ）およびＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（ｆ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生、ならびにＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローンの同じペプチドによる刺激によるＩＦＮ−γ産生（ｇ）を実証するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ｅ）〜（ｇ）から構成される。結果から、特定のＴＴＫペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株、および該ＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞、ならびにＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＴＴＫを過剰発現する腫瘍細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｃ）から構成される。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１および全長ＴＴＫ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を標的細胞として調製し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＴＴＫ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した（（ａ）および（ｂ））。また、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＴＴＫを過剰発現する腫瘍細胞株であるＨ１６５０を標的細胞として調製し、ＨＬＡ−Ａ２陰性であり、かつＴＴＫを過剰発現する腫瘍細胞株であるＰＣ−３およびＴＥ−１を対照として調製した（（ｃ））。ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬ株（ａ）、および該ＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローン（ｂ）は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角）またはＴＴＫ（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。ＣＴＬクローンはまた、腫瘍細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＴＴＫ＋）：Ｈ１６５０細胞に対しても特異的ＣＴＬ活性を示した（ｃ）（黒四角）。一方、標的細胞（ＨＬＡ−Ａ２−、ＴＴＫ＋）に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった（三角：ＰＣ−３、丸：ＴＥ−１）。
【図４】図４は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する、ＴＴＫ由来ペプチドの特異的ＣＴＬ誘導活性を示す１組の折れ線グラフから構成される（Ｅｎｄｏアッセイ結果）。グラフは、本出願人らのＷＯ２００８／１０２５５７に記載される図８ｂ、ｃ、ｄ、およびｅに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および／または最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００２５】
本明細書において言及される出版物、特許、または特許出願はすべて、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
【００２６】
Ｉ．定義
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。
【００２７】
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であり得るか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であり得るアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２９】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾された１個もしくは複数個のＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００３０】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００３１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
【００３２】
本明細書で使用する「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。「薬学的組成物」に関するそのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の文脈において、「薬学的組成物」という語句は、本発明の化合物と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の組成物を包含する。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、本発明の活性成分をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００３３】
特記しない限り、「がん」という用語は、ＴＴＫ遺伝子を過剰発現するがんまたは腫瘍を指し、その例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球の亜群を指す。
【００３５】
特記しない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプを指す。
【００３６】
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
【００３７】
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、ＴＴＫ遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００３８】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられて、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。
【００３９】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００４０】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
【００４１】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。
【００４２】
ＩＩ．ペプチド
ＴＴＫ由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＴＴＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）由来のペプチドを分析して、それらが、通常見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。
【００４３】
ＴＴＫ由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、および
ＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
【００４４】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。本明細書におけるこれらの結果から、ＴＴＫがＣＴＬによって認識される抗原であること、および試験されたペプチドがＨＬＡ−Ａ２によって拘束されるＴＴＫのエピトープペプチドであることが実証される。
【００４５】
さらに、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＴＴＫを発現する標的細胞に対して、以前に報告されたよりも強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果から、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、ＴＴＫを過剰発現する細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を誘導するのに適したペプチドであることが実証される。
【００４６】
ＴＴＫ遺伝子は、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがん細胞および組織において過剰発現されるが、ほとんどの正常器官では発現されないため、これはがん免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明は、ＣＴＬに認識されるＴＴＫ由来のエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。あるいは本発明は、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する単離されたペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のアミノ酸配列からなるか、またはその免疫学的活性断片である、単離されたペプチドを提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００４７】
一般的に、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75およびNielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17に記載されているソフトウェアプログラムなど、例えばインターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラムを用いて、インシリコで様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えば、Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220等に要約されているParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75、Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81、Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424、Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003、Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796に記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定する方法は、例えば、Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190；およびProtein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、そのようなソフトウェアプログラムを使用して、ＨＬＡ抗原と高い結合親和性を有するＴＴＫ由来の断片を選択することができる。したがって本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原と結合するＴＴＫ由来の任意の断片から構成されるペプチドを包含する。さらに、そのようなペプチドは、全長ＴＴＫからなるペプチドを含み得る。
【００４８】
本発明のノナペプチドおよびデカペプチドには、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明は、ＴＴＫ由来のペプチドを含む、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満であり、多くの場合には約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００４９】
一般的に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、付加、欠失、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する。
【００５０】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質の類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存的であることが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９８４を参照されたい）。
【００５１】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＴＴＫの多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
【００５２】
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、欠失、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個もしくは３個またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００５３】
がんの免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
【００５４】
例えば、ＨＬＡ−Ａ２結合親和性を増大させるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンもしくはメチオニンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をバリンもしくはロイシンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明に包含される。
【００５５】
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元の機能と同等であるかまたはより優れた機能を有し得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００５６】
本発明はまた、１個、２個、または数個のアミノ酸の付加もまた、本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができることを企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００５７】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００５８】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００５９】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によって示されるアミノ酸配列からなるノナペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。したがって、このようなペプチドは本発明の例示的な好ましい態様である。
【００６０】
さらに、相同性分析の結果から、このペプチドが任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが示された。そのため、免疫療法に用いた場合に、未知のまたは望ましくない免疫応答が起きる可能性は低くなっている。したがって、この局面からもまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドはがん患者においてＴＴＫに対する免疫を誘発するのに使用される。よって、本発明のペプチドは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００６１】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。他の適切なペプチドの例には、ＴＴＫに由来する他のＣＴＬ誘導性ペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、６、１５、および２２から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド）または他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。ペプチド間の適切なリンカーは当技術分野で周知であり、例えばＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、またはＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）である。
【００６２】
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、ＴＴＫではない腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に使用することもできる。がん細胞が２種類以上の腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは、十分に確立されている。したがって、特定の対象がさらなる腫瘍関連遺伝子を発現するかどうかを判定すること、ならびに続いて本発明によるＴＴＫ組成物またはワクチン中に、そのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含めることは、当業者の慣例的な実験法の範囲内である。
【００６３】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの例は当業者に公知であり（例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照されたい）、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明において用いることができる。したがって当業者は、１つもしくは複数のＴＴＫペプチドおよび１つもしくは複数のＴＴＫではないペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準的な手順を用いて容易に調製することができる。
【００６４】
上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（または該ポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
【００６５】
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用により連結して、ポリトープを形成することができ、またポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997；Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996；Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
【００６６】
本発明のペプチドはまた、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化することができる。
【００６７】
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のポリペプチドに適合させることもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生体媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
【００６８】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、および／または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的な方法は以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：段階ａにおいて産生されたペプチドの活性を決定する段階、および
ｃ：元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
【００６９】
本明細書において、アッセイする活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。好ましくは、アッセイする活性はＣＴＬ誘導能であり、そのような活性は「実施例」に記載の方法を用いてアッセイすることができる。
【００７０】
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「ＴＴＫペプチド」または「ＴＴＫポリペプチド」と記載することもできる。
【００７１】
ＩＩＩ．ＴＴＫペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００７２】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば当該ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
【００７３】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「続医薬品の開発」（日本語）, 第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００７４】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.編) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。そのようなベクターおよび宿主細胞もまた本発明において提供される。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００７５】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然ＴＴＫ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３１８（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体から構成され得る。当該技術分野においては周知のように、ＤＮＡ分子は天然塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれることを認識する。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明のペプチドおよび他のエピトープペプチドを含む複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００７８】
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００７９】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００８０】
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が広く一般的であり、したがってこれは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＡ２４型またはＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ＊０２０１、およびＡ＊０２０６などのサブタイプもまた使用される。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＴＴＫ部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失、および／または付加を行うことができる。
【００８１】
本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくは、エキソソームによって提示されるペプチドとして使用され得、このようなペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのＨＬＡ−Ａ２と高い結合親和性を有する。したがって好ましい態様において、本発明のエキソソームは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する。
【００８２】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとで形成された複合体を自身の表面上に提示する単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してもよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、ワクチンとして投与することができる。
【００８３】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００８４】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
【００８５】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００８６】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明によれば、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階ｂによって得られるＡＰＣは、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍などであるがこれらに限定されないがんを治療および／または予防するためのワクチンであり得る。
【００８７】
本発明の一局面によると、前記ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て本発明の部分ペプチドが提示される。
【００８８】
好ましい態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ抗原とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドとの間に形成された複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣであってよい。より好ましくは、ＡＰＣはＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのＨＬＡ−Ａ２抗原を保有し、そのようなＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチド）とで形成された複合体を自身の表面上に提示する。
【００８９】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれか１つに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれか１つによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
【００９０】
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）こと、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または（４）本発明のペプチドに結合することのできるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することによって得ることができる。そのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法の詳細は「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に記載する。
【００９１】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と併用して投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようにＴＴＫを内因的に発現する細胞、またはＴＴＫ遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
【００９２】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。本発明のＴＣＲサブユニットは、ＴＴＫを提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１つまたは複数のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットを構成するα鎖およびβ鎖をコードする核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲサブユニットをコードするヌクレオチド配列を分析するためにはＰＣＲ法が好ましい。分析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＴＴＫペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＴＴＫペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００９３】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
【００９４】
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に存在する場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に付与し得る受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、その好ましい例には、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いるＨＬＡ多量体染色分析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法が含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を形質導入されたＴ細胞が、ＨＬＡ分子およびＴＴＫを発現する細胞を認識するかどうか、ならびにシグナルが細胞内で伝達されるかどうかを確認することができる。当技術分野で公知の方法により、Ｔ細胞に導入されたＴＣＲサブユニットがＴ細胞に細胞傷害活性を付与し得るかどうかということを確認することもできる。好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＴＴＫを過剰発現する細胞を用いるクロム放出アッセイ法が含まれる。
【００９５】
また本発明は、本発明のペプチドと、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのＨＬＡ−Ａ２分子との間に形成された複合体に結合するＴＣＲサブユニットをコードする核酸の形質導入によって調製されるＣＴＬを提供する。
【００９６】
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または予防を必要としている患者におけるがんの治療および／または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００９７】
ＩＸ．薬学的な剤または組成物
ＴＴＫの発現は、正常組織と比較して、例として肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって本発明は、術後のその再発の治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１つまたは複数を有効成分として含む剤または組成物を提供する。あるいは、薬学的な剤または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれか１つを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な剤または組成物の有効成分として用いることができる。
【００９８】
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、ワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【００９９】
本発明の薬学的な剤または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【０１００】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤または組成物の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０１】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０２】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、有効成分としての以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０３】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０４】
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが判明した。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な剤または組成物にも当てはまる。
【０１０５】
本発明の薬学的な剤または組成物によって治療されるがんは、非限定的に、例えば肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含む、ＴＴＫが関与する（すなわち、ＴＴＫが過剰発現される）あらゆる種類のがんを含む。
【０１０６】
本発明の薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
【０１０７】
必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、その他の治療物質が、例えば本発明のペプチドのいずれかなどの有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法薬等を含み得る。医薬自体にその他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数のその他の薬理学的物質と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的物質の量は、例えば、使用する薬理学的物質の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
【０１０８】
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物は、対象となる製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の剤も含み得ることが理解されるべきである。
【０１０９】
本発明の一態様において、本発明の薬学的な剤または組成物を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、剤または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【０１１０】
本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【０１１１】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化することもできる。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【０１１２】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種類またはそれ以上および他のエピトープペプチド（例えば、他のＴＡＡに由来するペプチド）から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または１つまたは複数のアミノ酸をリンカーとして有する単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい（例えば、リジンリンカー：K.S. Kawamura et al., J.Immunol. 2002, 168:5709-1715）。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再度投与して、該対象においてＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【０１１３】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒へ製剤化することによって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する任意の化合物、物質、または組成物を指す。本明細書において企図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【０１１５】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」とは、その化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られる塩を指す。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【０１１７】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１１８】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０も参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１１９】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１２０】
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１２１】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【０１２２】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１２３】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、それらのＣＴＬ誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に考察されるように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【０１２４】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
【０１２５】
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボまたはインビトロで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階：、および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【０１２６】
前記ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するため、好ましくはＤＣを用いることができる。本発明の任意のペプチドを単独で、または他のペプチドと共に用いることができる。
【０１２７】
一方、本発明のペプチドを対象に投与した場合、ＡＰＣは該ペプチドとインビボで接触し、結果的に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明は、本発明のペプチドを対象に投与する段階を含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与した場合、本発明のペプチドが発現し、これがＡＰＣとインビボで接触し、結果的に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する段階を含む。「発現可能な形態」については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物、（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物」の章において上述されている。
【０１２８】
本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することを含み得る。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；、および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
【０１２９】
あるいは本発明は、以下の段階のうちの１つを含み得る、ＴＴＫに対するＣＴＬ活性を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣと本発明のペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１３０】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。
【０１３１】
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導する方法は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含み得る：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
【０１３２】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
【０１３３】
あるいは、それらをエクスビボまたはインビトロで用いることによってＣＴＬを誘導し、ＣＴＬの誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻すこともできる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ．対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ．段階ａのＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階、および
ｃ．段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
【０１３４】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【０１３５】
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
【０１３６】
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
【０１３７】
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【０１３８】
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＴＴＫに関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがんが含まれ、その例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む剤または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与を企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物」の項、特に本発明の薬学的な剤または組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびＡＰＣは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述されている。
【０１４０】
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための方法または過程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
【０１４１】
あるいは、本発明の方法は、以下を含むワクチンまたは薬学的な剤もしくは組成物を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソーム；または
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１４２】
本発明との関連において、ＴＴＫを過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。このようながんの例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的な剤もしくは組成物を投与する前に、治療すべき細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって一つの態様において、本発明は、ＴＴＫを（過剰）発現するがんの治療を必要とする患者において該がんを治療する方法を提供し、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＴＴＫの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＴＴＫを過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１４３】
あるいは本発明は、ＴＴＫを過剰発現するがんを有する対象に投与するための、上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的な剤もしくは組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＴＴＫポリペプチドで治療すべき対象を同定する方法であって、対象由来の細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該レベルが上昇していることにより、該対象が本発明のＴＴＫポリペプチドで治療され得るがんを有している可能性があることが示される方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下、より詳細に説明する。
【０１４４】
目的とするＴＴＫの転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織をＴＴＫ発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを対象由来試料として用いてもよい。
【０１４５】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生体試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生体試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本発明によれば、対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＴＴＫのｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップ、アレイ等において行うことができる。アレイの使用は、ＴＴＫの発現レベルを検出するのに好ましいと考えられる。当業者は、ＴＴＫの配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＴＴＫのｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０１４８】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、ＴＴＫの転写産物（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）を定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【０１４９】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＴＴＫのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【０１５０】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＴＴＫタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）またはその免疫学的断片の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＴＴＫタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。本発明のペプチドおよびその断片に対するそのような抗体もまた、本発明によって提供される。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１５１】
ＴＴＫ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＴＴＫタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強力な染色により、該タンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＴＴＫ遺伝子の高発現レベルが示される。
【０１５２】
がん細胞中の標的遺伝子、例えばＴＴＫ遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞中のレベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
【０１５３】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に測定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から採取された正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＴＴＫ遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生体試料中のＴＴＫ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＴＴＫ遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 ＋／− ２ Ｓ．Ｄ．または平均値 ＋／− ３ Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【０１５４】
ＴＴＫ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１５５】
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有する疑いがあるかどうかを診断する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、当該方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＴＴＫの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＴＴＫの発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１５６】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＴＴＫの発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＴＴＫの発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１５７】
本発明はまた、本発明のＴＴＫポリペプチドで治療され得るがんに罹患しているか、または罹患している疑いのある対象を診断または判定するための診断キットを提供し、このキットはまた、がんの予後を評価する、および／またはがん療法、特にがん免疫療法の有効性もしくは適用性をモニターするのにも使用され得る。適切ながんの具体例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは、対象由来の細胞中のＴＴＫ遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み得ることが好ましく、そのような試薬は以下の群より選択される：
（ａ）ＴＴＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＴＴＫタンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＴＴＫタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【０１５８】
ＴＴＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＴＴＫ ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＴＴＫ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＴＴＫ ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれ得る。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＴＴＫ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＴＴＫ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＴＴＫ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１５９】
一方、ＴＴＫタンパク質またはその免疫学的断片を検出するのに適した試薬の例には、ＴＴＫタンパク質またはその免疫学的断片に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＴＴＫタンパクまたはその免疫学的断片への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＴＴＫタンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１６０】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。キットはさらに、ＴＴＫ遺伝子に対するプローブまたはＴＴＫペプチドに対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＴＴＫペプチドに対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんを有さない対象、またはがんに罹患している対象から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれ得る。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１６１】
本発明の一態様において、試薬がＴＴＫ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＴＴＫ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１６２】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＴＴＫ標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＴＴＫ陽性試料を回収し、次にそれらのＴＴＫレベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＴＴＫタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＴＴＫを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＴＴＫ標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＴＴＫは組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＴＴＫレベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１６３】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその免疫原性断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
【０１６４】
本明細書において企図する本発明のタンパク質の部分ペプチドおよび免疫原性断片の例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のペプチドまたはタンパク質を調製する方法は、上記の通りである。
【０１６５】
抗ＴＴＫ抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＴＴＫ抗体の量との差を測定することにより、本発明のがんを診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＴＴＫ）に対する抗体を含み、この抗ＴＴＫ抗体の量が正常対照中の抗ＴＴＫ抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１６６】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出する適切な方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
【０１６７】
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。当該複合体を用いて、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することができる。
【０１６８】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫応答を評価するための方法または診断用試薬を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。特定の態様において、試薬として使用する物質または組成物は、ペプチドエピトープを認識してこれに結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る組成物であってよい。ペプチド試薬を免疫原として使用する必要はない。そのような分析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法などの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１６９】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174 : 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１７０】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンからなる四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような分析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１７１】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について分析することができる。ＰＢＭＣを培養し、当該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について分析することができる。
【０１７２】
本ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて分析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を分析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１７３】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＴＴＫ免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。そのような方法は、生体試料中でのＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチド、またはＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体であってよい。腫瘍生検材料などの生体試料中のＴＴＫの発現は、ＴＴＫプライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＴＴＫ増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１７４】
好ましい診断法は、対象から単離された生体試料をＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生体試料中のＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生体試料中に存在するＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生体試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般的に、剤と生体試料を接触させるための条件は、分子と生体試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Lowらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１７５】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生体試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生体試料はインビボの組織であってよく、かつＴＴＫ免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生体試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生体試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から得られた腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１７６】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法を用いて、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法もまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法はすべて、より慣例的なアッセイ法より少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
【０１７７】
ＸＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＴＴＫががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＴＴＫの発現が関与するがんの治療において治療的に使用することができ、そのようながんの例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明はまた、ＴＴＫタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法を提供する。そのようなアッセイ法は、必要に応じて、ＴＴＫタンパク質またはその断片を認識してそれと結合し得る１つまたは複数の抗ＴＴＫ抗体を含み得る。本発明との関連において、ＴＴＫポリペプチドに結合する抗ＴＴＫ抗体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長ＴＴＫポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２のアミノ酸配列からなる任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイ法は、様々な型の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０１７９】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイ法には、Ｔ細胞免疫原性アッセイ法（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイ法もまた含まれ得る。加えて、本発明は、ＴＴＫを発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法を企図し、その例には、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイ法は、ＴＴＫを発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用することができ、そのようながんの例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体をさらに含み得る。
【０１８１】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
【０１８２】
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
【０１８３】
本明細書では、抗体を、ＴＴＫペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるＴＴＫの断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明との関連において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１８４】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
【０１８５】
任意の哺乳動物を前記抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０１８６】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０１８７】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０１８８】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
【０１８９】
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１９０】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０１９１】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１９２】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
【０１９３】
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
【０１９４】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１９５】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
【０１９６】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１９７】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１９８】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１９９】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２００】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０２０１】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
【０２０２】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
【０２０３】
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０２０４】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用され得る。
【０２０５】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２０６】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２０７】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２０８】
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０２０９】
材料および方法
細胞株
Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ヒトＢリンパ芽球様細胞株、およびＣＯＳ７すなわちアフリカミドリザル腎細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＴＴＫ陽性腫瘍細胞株であるＨ１６５０は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＬＡ−Ａ２陰性かつＴＴＫ陽性細胞株であるＰＣ−３およびＴＥ−１は、それぞれＪＣＲＢ細胞バンクおよび理研細胞バンクから購入した。
【０２１０】
ＴＴＫ由来ペプチドの合成
ＴＴＫ由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対する結合親和性の予測に基づいて設計した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３８）。ペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＳＩＧＭＡ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）またはＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０２１１】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２１２】
ＣＴＬ増殖手順
Riddell ら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に再懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２１３】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２１４】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０２１５】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０２１６】
結果
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１で拘束されたＴＴＫ由来予測ペプチドによるＣＴＬの誘導
ＴＴＫ由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｊ）。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃１および＃４（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃７（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃５（ｃ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃４、＃５、＃６、および＃７（ｄ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃５および＃７（ｅ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）で刺激した＃７（ｆ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）で刺激した＃５、＃７、および＃８（ｇ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃１、＃２、および＃５（ｈ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−５４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）で刺激した＃２（ｉ）、ならびにＴＴＫ−Ａ０２−１０−６６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃２（ｊ）。
【０２１７】
ＴＴＫ特異的ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
「材料および方法」に記載したように、ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃１（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃７（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃５（ｃ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃５（ｄ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃５（ｅ）、およびＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃２（ｆ）中の、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、限界希釈によりＣＴＬ株を樹立した。それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ ａ〜ｆ）。すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。
【０２１８】
さらに、「材料および方法」に記載したように、ＣＴＬ株から限界希釈によりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された（図２ｇ）。
【０２１９】
ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
各ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株およびＣＴＬクローンを、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を内因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株およびＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。全長ＴＴＫ遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図３において、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株およびＣＴＬクローンは、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した（ａ：株、ｂ：クローン）。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬクローンはまた、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を内因的に発現する腫瘍細胞株：Ｈ１６５０細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（ｃ）。一方、対照：ＴＥ１細胞およびＰＣ３細胞に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と共に標的細胞上に提示されることが明確に実証された。その後、このペプチド−ＨＬＡ複合体はＣＴＬによって認識された。これらの結果から、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、ＴＴＫを発現する腫瘍を有する患者に対するがんワクチンとして適している可能性があることが示される。
【０２２０】
抗原ペプチドの相同性解析
ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列は固有のものであることが示され、したがって本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどない。
【０２２１】
結論として、ＴＴＫ由来の新規なＨＬＡ−Ａ０２エピトープペプチドが同定された。さらに、ＴＴＫのエピトープペプチドを用いるワクチンががん免疫療法に適用できる可能性があることが実証された。
【０２２２】
参照実施例
ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性［ＷＯ２００８／１０２５５７］
ＷＯ２００８／１０２５５７として公開された本出願人らの先の出願は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対するＴＴＫ由来ペプチドの特異的ＣＴＬ誘導活性を開示している（図４）。
【０２２３】
これらのペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬクローンを、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞を認識するそれらの能力について調べた。ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現する標的細胞の特異的モデルである、全長ＴＴＫ遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７に対する特異的ＣＴＬ活性を、ＴＴＫ−Ａ２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＴＴＫ−Ａ２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、およびＴＴＫ−Ａ２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）によって産生されたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて、試験した。全長ＴＴＫをトランスフェクトしたが、全長ＨＬＡ−Ａ＊０２０１をトランスフェクトしなかったＣＯＳ７、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１をトランスフェクトしたが、全長ＴＴＫをトランスフェクトしなかった（または全長ＨＩＧ２遺伝子で置き換えた）ＣＯＳ７、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１をトランスフェクトし、かつ異なる標的エピトープペプチドをパルスしたＣＯＳ７を、対照として調製した。結果から、それらのペプチドに対して産生されたＣＴＬクローンは、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７に対して特異的ＣＴＬ活性を有することが実証される（図４、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２００８／１０２５５７における図８ｂ、ｃ、ｄ、およびｅに対応している）。
【０２２４】
それらのペプチドと比較して、本発明において同定されたＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、ＩＦＮ−γ産生において一桁または二桁分増加する明らかに効果的な活性を有する（図３）。したがって、本発明のペプチドは、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ、および／またはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）の有望な標的であると考えられる。
【０２２５】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、かつ幅広いがんの種類に対する適用性を有し得る、ＴＴＫ由来の新規ＴＡＡを提供する。このようなＴＡＡは、ＴＴＫに関連した疾患、例えばがん、より詳細には肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍に対するペプチドワクチンとして有用であり得る。
【０２２６】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明するが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２００９年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／２１６，０１７号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（非特許文献１／Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80；非特許文献２／Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9）。これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床開発の前進が保証される（非特許文献３／Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55；非特許文献４／Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42；非特許文献５／Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9；非特許文献６／van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14；非特許文献７／Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8；非特許文献８／Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72；非特許文献９／Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66；非特許文献１０／Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94）。残念ながら、現在のがんワクチンの治験の大半では低い客観的奏功率しか観察されていない（非特許文献１１／Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80；非特許文献１２／Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42；非特許文献１３／Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15）。したがって、免疫療法の標的としての新規ＴＡＡの必要性が依然として存在している。
【０００５】
この目的のために、網羅的ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現プロファイルの解析を通して、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（特許文献１／ＷＯ２００７／０１３６６５）および食道癌（特許文献２／ＷＯ２００７／０１３６７１）においていくつかの上方制御された遺伝子が同定された。それらの中から免疫療法の標的として優れた候補を同定するという目的で、これらの遺伝子が詳細に調べられた。免疫療法においてがん細胞を特異的に標的化するには、好ましいＴＡＡは、主にがん細胞によって発現され、正常な健常組織では発現が限定されているかまたは発現されないものである必要がある。
【０００６】
免疫療法の標的として好ましいＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡである。そのようなＴＡＡにより、治療によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳説されているリスクが最小限に抑えられ得る。
【０００７】
２３，０４０個の遺伝子を含む網羅的ｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイル解析を使用して、ＴＴＫプロテインキナーゼ（ＴＴＫ）が肺癌において上方制御されている遺伝子の１つとして同定された（非特許文献１４／Kikuchi at al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805）。ＴＴＫの発現は、肺癌患者および食道癌患者の８０％超において、腫瘍細胞で特異的に上方制御されている。同時に、ＴＴＫは、精巣を除く他の正常な重要器官では発現していない。まとめると、これらの事実から、ＴＴＫは、ＴＴＫが上方制御されている腫瘍を有する患者に対するがん免疫療法の標的として適用可能である可能性があることが示唆される。ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ誘導能を有するＴＴＫ由来のペプチドは、以前に開示されている（ＷＯ２００８／１０２５５７（特許文献３）を参照されたく、この結果を本明細書において図４として繰り返す）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０１３６６５
【特許文献２】ＷＯ２００７／０１３６７１
【特許文献３】ＷＯ２００８／１０２５５７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Kikuchi at al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、免疫療法の標的として役立ち得る新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは場合によっては免疫系により「自己」として認識され、したがって生得的な免疫原性を有さない場合が多いため、適切な標的の発見は極めて重要である。上記したように、ＴＴＫ（典型的なアミノ酸配列および遺伝子配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すが、これらに限定されることはなく、典型的な遺伝子配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３１８からも入手可能である）は、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんにおいて上方制御されると同定された。したがって本発明は、がん／腫瘍免疫療法の標的の候補としてＴＴＫに着目する。
【００１１】
本発明はさらに、ＴＴＫに特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、ＴＴＫの遺伝子産物の特異的エピトープペプチドの同定に関する。以下に詳述するように、健常ドナーから採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＴＴＫ由来のＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。その後、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株が樹立された。そのようなＣＴＬ株の中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドで誘導されたＣＴＬ株は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＴＴＫを発現する細胞に対して、有意に強力な特異的細胞傷害性を示した。これらの結果から、これらのペプチド（特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチド）が、ＴＴＫを発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが実証される。さらにこの結果から、ＴＴＫは免疫原性が強く、かつそのエピトープはがん／腫瘍免疫療法の有効な標的であることが示される。
【００１２】
したがって、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチド、特にＴＴＫのアミノ酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）またはその免疫学的活性断片を含むものを提供することは、本発明の１つの目的である。これらのペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予測され、したがってＣＴＬをエクスビボで誘導するために用いることができ、または、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍などのがんに対する免疫応答を誘導する目的で対象に投与するために用いることができる。好ましいペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１３】
本発明のペプチドは、結果として生じた改変ペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されているペプチドも包含する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の任意のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドとほぼ同様に、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導もしくは調製するために用いることができ、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
【００１５】
対象に投与した場合、本発明のペプチドは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、好ましくはＡＰＣの表面上に提示される。したがって、本発明の１つもしくは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬを誘導する剤または組成物を提供することは、本発明の１つの目的である。本発明はさらに、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療および／または予防、ならびに術後のその再発の予防のために製剤化された、本発明の１つもしくは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物を企図する。本発明の薬学的な剤または組成物は、有効成分として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに／に加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを含み得る。
【００１６】
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを該ペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することにより、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣを誘導し得る。このようなＡＰＣは、標的ペプチドに対する高いＣＴＬ誘導能を有し、そのためがん免疫療法に使用される。したがって本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法、およびこのような方法によって得られるＡＰＣの双方を企図する。
【００１７】
本発明はまた、ＣＴＬを誘導する方法であって、ＣＤ８陽性細胞を、本発明の１つもしくは複数のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する段階を含む方法を提供する。このような方法によって得られるＣＴＬは、例として肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療および予防に使用される。したがって本発明は、本発明の方法によって得られるＣＴＬを包含する。
【００１８】
がんに対する免疫応答を必要とする対象においてこれを誘導する方法であって、ＴＴＫポリペプチドまたはその免疫学的活性断片、ＴＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＴＴＫポリペプチドを提示するエキソソームまたはＡＰＣを含む剤または組成物を該対象に投与する段階を含む方法を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１９】
本発明の適用性は、がんなど、ＴＴＫ過剰発現に関連するか、またはＴＴＫ過剰発現から生じるいくつかの疾患のいずれにも及び、例示的ながんには、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［２１］を提供する：
［１］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
［２］細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド、
［３］以下の特徴の一方または両方を有する、［２］記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている、
［４］前記ペプチドがノナペプチドである、［１］〜［３］のいずれか一項記載の単離されたペプチド、
［５］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
［６］ＣＴＬを誘導するための剤であって、［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または［５］記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む、剤、
［７］がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または［５］記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む薬剤、
［８］ＨＬＡ−Ａ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、［７］記載の薬剤、
［９］ＨＬＡ−Ａ２がＨＬＡ−Ａ＊０２０１である、［８］記載の薬剤、
［１０］がんの治療のために製剤化される、［７］または［８］記載の薬剤、
［１１］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
（ａ）ＡＰＣと［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
（ｂ）［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階、
［１２］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導する方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階、
［１３］ＨＬＡ抗原と［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ、
［１４］［１１］記載の方法によって誘導される、［１３］記載のＡＰＣ、
［１５］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ、
［１６］［１２］記載の方法によって誘導される、［１５］記載のＣＴＬ、
［１７］対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１］〜［４］のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチド、１つもしくは複数のその免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む剤を該対象に投与する段階を含む、方法、
［１８］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体またはその断片、
［１９］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、
［２０］［１９］記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞、ならびに
［２１］［１］〜［４］のいずれか一項記載のペプチド、［５］記載のヌクレオチド、または［１８］記載の抗体を含む、診断キット。
【００２１】
本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００２２】
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の様々な局面および適用は、図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１】図１は、ＴＴＫ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真（ａ）〜（ｊ）から構成される。以下のウェル番号中のＣＴＬは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル＃１および＃４（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃７（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃５（ｃ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃４、＃５、＃６、および＃７（ｄ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃５および＃７（ｅ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）で刺激した＃７（ｆ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）で刺激した＃５、＃７、および＃８（ｇ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃１、＃２、および＃５（ｈ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−５４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）で刺激した＃２（ｉ）、ならびにＴＴＫ−Ａ０２−１０−６６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃２（ｊ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２ａ−ｄ】図２ａ〜ｄは、ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）（ｃ）、およびＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）（ｄ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を実証するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）から構成される。結果から、特定のＴＴＫペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株、および該ＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２ｅ−ｇ】図２ｅ〜ｇは、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ｅ）およびＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（ｆ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生、ならびにＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローンの同じペプチドによる刺激によるＩＦＮ−γ産生（ｇ）を実証するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（ｅ）〜（ｇ）から構成される。結果から、特定のＴＴＫペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株、および該ＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図３】図３は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞、ならびにＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＴＴＫを過剰発現する腫瘍細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｃ）から構成される。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１および全長ＴＴＫ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を標的細胞として調製し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＴＴＫ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した（（ａ）および（ｂ））。また、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＴＴＫを過剰発現する腫瘍細胞株であるＨ１６５０を標的細胞として調製し、ＨＬＡ−Ａ２陰性であり、かつＴＴＫを過剰発現する腫瘍細胞株であるＰＣ−３およびＴＥ−１を対照として調製した（（ｃ））。ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬ株（ａ）、および該ＣＴＬ株から樹立されたＣＴＬクローン（ｂ）は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角）またはＴＴＫ（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。ＣＴＬクローンはまた、腫瘍細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＴＴＫ＋）：Ｈ１６５０細胞に対しても特異的ＣＴＬ活性を示した（ｃ）（黒四角）。一方、標的細胞（ＨＬＡ−Ａ２−、ＴＴＫ＋）に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった（三角：ＰＣ−３、丸：ＴＥ−１）。
【図４】図４は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する、ＴＴＫ由来ペプチドの特異的ＣＴＬ誘導活性を示す１組の折れ線グラフから構成される（Ｅｎｄｏアッセイ結果）。グラフは、本出願人らのＷＯ２００８／１０２５５７に記載される図８ｂ、ｃ、ｄ、およびｅに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および／または最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００２５】
本明細書において言及される出版物、特許、または特許出願はすべて、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
【００２６】
Ｉ．定義
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。
【００２７】
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であり得るか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であり得るアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２９】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾された１個もしくは複数個のＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００３０】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００３１】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。
【００３２】
本明細書で使用する「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。「薬学的組成物」に関するそのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の文脈において、「薬学的組成物」という語句は、本発明の化合物と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の組成物を包含する。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、本発明の活性成分をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
【００３３】
特記しない限り、「がん」という用語は、ＴＴＫ遺伝子を過剰発現するがんまたは腫瘍を指し、その例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球の亜群を指す。
【００３５】
特記しない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプを指す。
【００３６】
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
【００３７】
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、ＴＴＫ遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がり、もしくは転移能の減少などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
【００３８】
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられて、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。
【００３９】
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
【００４０】
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
【００４１】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。
【００４２】
ＩＩ．ペプチド
ＴＴＫ由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＴＴＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）由来のペプチドを分析して、それらが、通常見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。
【００４３】
ＴＴＫ由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：
ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、および
ＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
【００４４】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。本明細書におけるこれらの結果から、ＴＴＫがＣＴＬによって認識される抗原であること、および試験されたペプチドがＨＬＡ−Ａ２によって拘束されるＴＴＫのエピトープペプチドであることが実証される。
【００４５】
さらに、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＴＴＫを発現する標的細胞に対して、以前に報告されたよりも強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これらの結果から、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、ＴＴＫを過剰発現する細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を誘導するのに適したペプチドであることが実証される。
【００４６】
ＴＴＫ遺伝子は、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがん細胞および組織において過剰発現されるが、ほとんどの正常器官では発現されないため、これはがん免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明は、ＣＴＬに認識されるＴＴＫ由来のエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。あるいは本発明は、ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する単離されたペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のアミノ酸配列からなるか、またはその免疫学的活性断片である、単離されたペプチドを提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００４７】
一般的に、Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75およびNielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17に記載されているソフトウェアプログラムなど、例えばインターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラムを用いて、インシリコで様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えば、Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220等に要約されているParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75、Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81、Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424、Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003、Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17、およびNielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796に記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定する方法は、例えば、Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190；およびProtein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。したがって、そのようなソフトウェアプログラムを使用して、ＨＬＡ抗原と高い結合親和性を有するＴＴＫ由来の断片を選択することができる。したがって本発明は、そのような公知のプログラムによってＨＬＡ抗原と結合するＴＴＫ由来の任意の断片から構成されるペプチドを包含する。さらに、そのようなペプチドは、全長ＴＴＫからなるペプチドを含み得る。
【００４８】
本発明のノナペプチドおよびデカペプチドには、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明は、ＴＴＫ由来のペプチドを含む、ＨＬＡ抗原に対する結合親和性を有するペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば約４０アミノ酸未満であり、多くの場合には約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００４９】
一般的に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、付加、欠失、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する。
【００５０】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、または置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質の類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存的であることが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９８４を参照されたい）。
【００５１】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＴＴＫの多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
【００５２】
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、欠失、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個もしくは３個またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００５３】
がんの免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（J Immunol 1994, 152: 3913；Immunogenetics 1995, 41: 178；J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。
【００５４】
例えば、ＨＬＡ−Ａ２結合親和性を増大させるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンもしくはメチオニンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をバリンもしくはロイシンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明に包含される。
【００５５】
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元の機能と同等であるかまたはより優れた機能を有し得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００５６】
本発明はまた、１個、２個、または数個のアミノ酸の付加もまた、本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができることを企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００５７】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００５８】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００５９】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によって示されるアミノ酸配列からなるノナペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。したがって、このようなペプチドは本発明の例示的な好ましい態様である。
【００６０】
さらに、相同性分析の結果から、このペプチドが任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが示された。そのため、免疫療法に用いた場合に、未知のまたは望ましくない免疫応答が起きる可能性は低くなっている。したがって、この局面からもまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドはがん患者においてＴＴＫに対する免疫を誘発するのに使用される。よって、本発明のペプチドは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００６１】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。他の適切なペプチドの例には、ＴＴＫに由来する他のＣＴＬ誘導性ペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、６、１５、および２２から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド）または他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。ペプチド間の適切なリンカーは当技術分野で周知であり、例えばＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、またはＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）である。
【００６２】
例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩを介する免疫応答を増大させるために、ＴＴＫではない腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に使用することもできる。がん細胞が２種類以上の腫瘍関連遺伝子を発現し得ることは、十分に確立されている。したがって、特定の対象がさらなる腫瘍関連遺伝子を発現するかどうかを判定すること、ならびに続いて本発明によるＴＴＫ組成物またはワクチン中に、そのような遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含めることは、当業者の慣例的な実験法の範囲内である。
【００６３】
ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの例は当業者に公知であり（例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照されたい）、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明において用いることができる。したがって当業者は、１つもしくは複数のＴＴＫペプチドおよび１つもしくは複数のＴＴＫではないペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準的な手順を用いて容易に調製することができる。
【００６４】
上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（または該ポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
【００６５】
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用により連結して、ポリトープを形成することができ、またポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995；Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997；Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996；Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
【００６６】
本発明のペプチドはまた、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、例えば、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化することができる。
【００６７】
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のポリペプチドに適合させることもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生体媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
【００６８】
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、および／または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的な方法は以下の段階を含み得る：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
ｂ：段階ａにおいて産生されたペプチドの活性を決定する段階、および
ｃ：元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
【００６９】
本明細書において、アッセイする活性には、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣまたはＣＴＬ誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。好ましくは、アッセイする活性はＣＴＬ誘導能であり、そのような活性は「実施例」に記載の方法を用いてアッセイすることができる。
【００７０】
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「ＴＴＫペプチド」または「ＴＴＫポリペプチド」と記載することもできる。
【００７１】
ＩＩＩ．ＴＴＫペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
【００７２】
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば当該ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
【００７３】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「続医薬品の開発」（日本語）, 第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００７４】
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.編) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。そのようなベクターおよび宿主細胞もまた本発明において提供される。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００７５】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然ＴＴＫ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３１８（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体から構成され得る。当該技術分野においては周知のように、ＤＮＡ分子は天然塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれることを認識する。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明のペプチドおよび他のエピトープペプチドを含む複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００７８】
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００７９】
Ｖ．エキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００８０】
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が広く一般的であり、したがってこれは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＡ２４型またはＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ＊０２０１、およびＡ＊０２０６などのサブタイプもまた使用される。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＴＴＫ部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失、および／または付加を行うことができる。
【００８１】
本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくは、エキソソームによって提示されるペプチドとして使用され得、このようなペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのＨＬＡ−Ａ２と高い結合親和性を有する。したがって好ましい態様において、本発明のエキソソームは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドとＨＬＡ抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する。
【００８２】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとで形成された複合体を自身の表面上に提示する単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してもよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、ワクチンとして投与することができる。
【００８３】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００８４】
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
【００８５】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と併用して、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣをペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００８６】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明によれば、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供する。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階ｂによって得られるＡＰＣは、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍などであるがこれらに限定されないがんを治療および／または予防するためのワクチンであり得る。
【００８７】
本発明の一局面によると、前記ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て本発明の部分ペプチドが提示される。
【００８８】
好ましい態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ抗原とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドとの間に形成された複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣであってよい。より好ましくは、ＡＰＣはＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのＨＬＡ−Ａ２抗原を保有し、そのようなＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチド）とで形成された複合体を自身の表面上に提示する。
【００８９】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれか１つに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれか１つによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
【００９０】
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、または（２）対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）こと、または（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または（４）本発明のペプチドに結合することのできるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することによって得ることができる。そのようなＡＰＣまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができ、（４）の方法の詳細は「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に記載する。
【００９１】
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と併用して投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようにＴＴＫを内因的に発現する細胞、またはＴＴＫ遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
【００９２】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。本発明のＴＣＲサブユニットは、ＴＴＫを提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１つまたは複数のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットを構成するα鎖およびβ鎖をコードする核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＴＣＲサブユニットをコードするヌクレオチド配列を分析するためにはＰＣＲ法が好ましい。分析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、および３'側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＴＴＫペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＴＴＫペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
【００９３】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
【００９４】
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に存在する場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に付与し得る受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、その好ましい例には、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いるＨＬＡ多量体染色分析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法が含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を形質導入されたＴ細胞が、ＨＬＡ分子およびＴＴＫを発現する細胞を認識するかどうか、ならびにシグナルが細胞内で伝達されるかどうかを確認することができる。当技術分野で公知の方法により、Ｔ細胞に導入されたＴＣＲサブユニットがＴ細胞に細胞傷害活性を付与し得るかどうかということを確認することもできる。好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、かつＴＴＫを過剰発現する細胞を用いるクロム放出アッセイ法が含まれる。
【００９５】
また本発明は、本発明のペプチドと、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１などのＨＬＡ−Ａ２分子との間に形成された複合体に結合するＴＣＲサブユニットをコードする核酸の形質導入によって調製されるＣＴＬを提供する。
【００９６】
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬは、治療または予防を必要としている患者におけるがんの治療および／または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００９７】
ＩＸ．薬学的な剤または組成物
ＴＴＫの発現は、正常組織と比較して、例として肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって本発明は、術後のその再発の治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１つまたは複数を有効成分として含む剤または組成物を提供する。あるいは、薬学的な剤または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれか１つを標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的な剤または組成物の有効成分として用いることができる。
【００９８】
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、ワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【００９９】
本発明の薬学的な剤または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【０１００】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤または組成物の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０１】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０２】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、有効成分としての以下の中より選択される有効成分と薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０３】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１０４】
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたはその候補であることが判明した。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な剤または組成物にも当てはまる。
【０１０５】
本発明の薬学的な剤または組成物によって治療されるがんは、非限定的に、例えば肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含む、ＴＴＫが関与する（すなわち、ＴＴＫが過剰発現される）あらゆる種類のがんを含む。
【０１０６】
本発明の薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例示されるが、これに限定されない。
【０１０７】
必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、その他の治療物質が、例えば本発明のペプチドのいずれかなどの有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法薬等を含み得る。医薬自体にその他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数のその他の薬理学的物質と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的物質の量は、例えば、使用する薬理学的物質の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
【０１０８】
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物は、対象となる製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の剤も含み得ることが理解されるべきである。
【０１０９】
本発明の一態様において、本発明の薬学的な剤または組成物を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、剤または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【０１１０】
本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【０１１１】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化することもできる。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【０１１２】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種類またはそれ以上および他のエピトープペプチド（例えば、他のＴＡＡに由来するペプチド）から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または１つまたは複数のアミノ酸をリンカーとして有する単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい（例えば、リジンリンカー：K.S. Kawamura et al., J.Immunol. 2002, 168:5709-1715）。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再度投与して、該対象においてＣＴＬを誘導し、結果として、腫瘍関連内皮細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【０１１３】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒へ製剤化することによって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強する任意の化合物、物質、または組成物を指す。本明細書において企図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【０１１５】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」とは、その化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られる塩を指す。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、および無機酸との塩が含まれる。
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【０１１７】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１１８】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０も参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【０１１９】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１２０】
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１２１】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【０１２２】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
【０１２３】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導することができる。本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いて、ＣＴＬを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、それらのＣＴＬ誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかを用いてＣＴＬを誘導することができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に考察されるように、ＡＰＣを誘導することもできる。
【０１２４】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
【０１２５】
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボまたはインビトロで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階：、および
ｂ：段階ａのＡＰＣを該ペプチドと接触させる段階。
【０１２６】
前記ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するため、好ましくはＤＣを用いることができる。本発明の任意のペプチドを単独で、または他のペプチドと共に用いることができる。
【０１２７】
一方、本発明のペプチドを対象に投与した場合、ＡＰＣは該ペプチドとインビボで接触し、結果的に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明は、本発明のペプチドを対象に投与する段階を含む。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与した場合、本発明のペプチドが発現し、これがＡＰＣとインビボで接触し、結果的に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する段階を含む。「発現可能な形態」については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物、（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物」の章において上述されている。
【０１２８】
本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することを含み得る。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；、および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
【０１２９】
あるいは本発明は、以下の段階のうちの１つを含み得る、ＴＴＫに対するＣＴＬ活性を特異的に誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣと本発明のペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【０１３０】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。
【０１３１】
本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬを誘導する方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導する方法は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含み得る：
ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
ｂ）本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性細胞に導入する段階。
【０１３２】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
【０１３３】
あるいは、それらをエクスビボまたはインビトロで用いることによってＣＴＬを誘導し、ＣＴＬの誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻すこともできる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ．対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ．段階ａのＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階、および
ｃ．段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
【０１３４】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
【０１３５】
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
【０１３６】
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
【０１３７】
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
【０１３８】
（３）免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＴＴＫに関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがんが含まれ、その例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む剤または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはＡＰＣの投与を企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物」の項、特に本発明の薬学的な剤または組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびＡＰＣは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述されている。
【０１４０】
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための方法または過程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
【０１４１】
あるいは、本発明の方法は、以下を含むワクチンまたは薬学的な剤もしくは組成物を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソーム；または
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。
【０１４２】
本発明との関連において、ＴＴＫを過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。このようながんの例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含むワクチンまたは薬学的な剤もしくは組成物を投与する前に、治療すべき細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって一つの態様において、本発明は、ＴＴＫを（過剰）発現するがんの治療を必要とする患者において該がんを治療する方法を提供し、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＴＴＫの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＴＴＫを過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
【０１４３】
あるいは本発明は、ＴＴＫを過剰発現するがんを有する対象に投与するための、上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的な剤もしくは組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のＴＴＫポリペプチドで治療すべき対象を同定する方法であって、対象由来の細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該レベルが上昇していることにより、該対象が本発明のＴＴＫポリペプチドで治療され得るがんを有している可能性があることが示される方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下、より詳細に説明する。
【０１４４】
目的とするＴＴＫの転写産物または翻訳産物を含む限り、対象由来の任意の細胞または組織をＴＴＫ発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがんの疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを対象由来試料として用いてもよい。
【０１４５】
本発明との関連において、がん性でないと判明している生体試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生体試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本発明によれば、対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＴＴＫのｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップ、アレイ等において行うことができる。アレイの使用は、ＴＴＫの発現レベルを検出するのに好ましいと考えられる。当業者は、ＴＴＫの配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＴＴＫのｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０１４８】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、ＴＴＫの転写産物（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）を定量してもよい。そのようなプライマーは、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【０１４９】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＴＴＫのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【０１５０】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＴＴＫタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）またはその免疫学的断片の量を測定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を測定する方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＴＴＫタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。本発明のペプチドおよびその断片に対するそのような抗体もまた、本発明によって提供される。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
【０１５１】
ＴＴＫ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＴＴＫタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強力な染色により、該タンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＴＴＫ遺伝子の高発現レベルが示される。
【０１５２】
がん細胞中の標的遺伝子、例えばＴＴＫ遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞中のレベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
【０１５３】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に測定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から採取された正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＴＴＫ遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生体試料中のＴＴＫ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＴＴＫ遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 ＋／− ２ Ｓ．Ｄ．または平均値 ＋／− ３ Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
【０１５４】
ＴＴＫ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１５５】
本発明はまた、（ｉ）対象が治療すべきがんを有する疑いがあるかどうかを診断する方法、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法を提供し、当該方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＴＴＫの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＴＴＫの発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１５６】
あるいは、そのような方法は以下の段階を含み得る：
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取された細胞または組織中のＴＴＫの発現レベルを測定する段階；
ｂ）前記ＴＴＫの発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）前記ＴＴＫの発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
【０１５７】
本発明はまた、本発明のＴＴＫポリペプチドで治療され得るがんに罹患しているか、または罹患している疑いのある対象を診断または判定するための診断キットを提供し、このキットはまた、がんの予後を評価する、および／またはがん療法、特にがん免疫療法の有効性もしくは適用性をモニターするのにも使用され得る。適切ながんの具体例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは、対象由来の細胞中のＴＴＫ遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み得ることが好ましく、そのような試薬は以下の群より選択される：
（ａ）ＴＴＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＴＴＫタンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬；および
（ｃ）ＴＴＫタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【０１５８】
ＴＴＫ遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＴＴＫ ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＴＴＫ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＴＴＫ ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれ得る。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＴＴＫ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＴＴＫ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＴＴＫ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１５９】
一方、ＴＴＫタンパク質またはその免疫学的断片を検出するのに適した試薬の例には、ＴＴＫタンパク質またはその免疫学的断片に対する抗体が含まれ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＴＴＫタンパクまたはその免疫学的断片への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。さらに、直接連結技法または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識することができる。標識、および抗体を標識し、標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＴＴＫタンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキット中に含めることもできる。
【０１６０】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。キットはさらに、ＴＴＫ遺伝子に対するプローブまたはＴＴＫペプチドに対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＴＴＫペプチドに対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんを有さない対象、またはがんに罹患している対象から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を備えた包装封入物（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれ得る。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１６１】
本発明の一態様において、試薬がＴＴＫ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより多い量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＴＴＫ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１６２】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＴＴＫ標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＴＴＫ陽性試料を回収し、次にそれらのＴＴＫレベルをアッセイすることによって調製することができる。あるいは、精製ＴＴＫタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＴＴＫを発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＴＴＫ標準試料を形成してもよい。本発明において、精製ＴＴＫは組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＴＴＫレベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１６３】
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその免疫原性断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
【０１６４】
本明細書において企図する本発明のタンパク質の部分ペプチドおよび免疫原性断片の例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも８個、好ましくは１５個、およびより好ましくは２０個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）を用いて試料（例えば、血液、組織）中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のペプチドまたはタンパク質を調製する方法は、上記の通りである。
【０１６５】
抗ＴＴＫ抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗ＴＴＫ抗体の量との差を測定することにより、本発明のがんを診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物（ＴＴＫ）に対する抗体を含み、この抗ＴＴＫ抗体の量が正常対照中の抗ＴＴＫ抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんに罹患していることが疑われる。
【０１６６】
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合しているＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出する適切な方法は、既に確立されている（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
【０１６７】
詳細には、公知の方法に従って（例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい）、放射標識ＨＬＡ分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。当該複合体を用いて、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬを定量することができる。
【０１６８】
本発明はさらに、本明細書に記載されるペプチドエピトープを用いて、対象の免疫応答を評価するための方法または診断用試薬を提供する。本発明の一態様において、本明細書に記載するようなＨＬＡ拘束性ペプチドを、対象の免疫応答を評価または予測するための試薬として用いることができる。評価される免疫応答は、免疫原を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導され得る。特定の態様において、試薬として使用する物質または組成物は、ペプチドエピトープを認識してこれに結合する抗原特異的ＣＴＬの産生をもたらし得る組成物であってよい。ペプチド試薬を免疫原として使用する必要はない。そのような分析に用いられるアッセイ系には、四量体、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法などの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
【０１６９】
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998；およびAltman et al, Science 174 : 94-96, 1996を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
【０１７０】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンからなる四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような分析を、診断または予後診断目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
【０１７１】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、免疫リコール応答を評価するための試薬を提供する（例えば、Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997、およびPenna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991を参照されたい）。例えば、治療すべきがんを有する個体からの患者ＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異的ＣＴＬの有無について分析することができる。ＰＢＭＣを培養し、当該細胞を本発明のペプチドで刺激することによって、単核細胞を含む血液試料を評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団を例えばＣＴＬ活性について分析することができる。
【０１７２】
本ペプチドは、ワクチンの有効性を評価するための試薬として用いることもできる。免疫原をワクチン接種した患者から得られたＰＢＭＣを、例えば上記の方法のいずれかを用いて分析することができる。患者のＨＬＡ型を決定し、該患者に存在するアリル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を分析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの存在によって示され得る。本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY；およびAntibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい）、この抗体は、がんを診断、検出、またはモニターするための試薬として使用され得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
【０１７３】
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＴＴＫ免疫原性ポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出する方法を提供する。そのような方法は、生体試料中でのＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチド、またはＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現を測定する段階を含む。ペプチドまたはペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体の発現は、該ペプチドまたは該複合体の結合パートナーを用いてアッセイすることによって、測定または検出することができる。好ましい態様において、ペプチドまたは複合体の結合パートナーは、該ペプチドを認識してこれに特異的に結合する抗体であってよい。腫瘍生検材料などの生体試料中のＴＴＫの発現は、ＴＴＫプライマーを用いる標準的なＰＣＲ増幅プロトコールによって試験することもできる。腫瘍発現の例は本明細書に提示してあり、ＴＴＫ増幅のための例示的な条件およびプライマーのさらなる開示は、ＷＯ２００３／２７３２２に見出すことができる。
【０１７４】
好ましい診断法は、対象から単離された生体試料をＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドに特異的な物質と接触させて、該生体試料中のＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドの存在を検出する段階を含む。本明細書で使用する「接触させる」とは、剤と生体試料中に存在するＴＴＫ ＨＬＡ結合ペプチドとの間の特異的相互作用が可能となるように、生体試料を、例えば濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、剤に十分に近接させて配置することを意味する。一般的に、剤と生体試料を接触させるための条件は、分子と生体試料中のその同族物（例えば、タンパク質とその受容体同族物、抗体とそのタンパク質抗原同族物、核酸とその相補的配列同族物）との間の特異的相互作用を促進するための、当業者に公知の条件である。分子とその同族物との間の特異的相互作用を促進するための例示的な条件は、Lowらに対して発行された米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。
【０１７５】
本発明の診断法は、インビボおよびインビトロの一方または両方で行うことができる。したがって、生体試料は、本発明においてインビボまたはインビトロに位置し得る。例えば、生体試料はインビボの組織であってよく、かつＴＴＫ免疫原性ポリペプチドに特異的な剤を用いて、組織中のそのような分子の存在を検出することができる。あるいは、生体試料をインビトロで採取または単離することができる（例えば、血液試料、腫瘍生検材料、組織抽出物）。特に好ましい態様において、生体試料は細胞を含む試料であってよく、より好ましくは、診断または治療する対象から得られた腫瘍細胞を含む試料であってよい。
【０１７６】
あるいは、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法を用いて、診断を行うこともできる（例えば、Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94；Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ法、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法もまた提供されている。多量体染色、細胞内リンホカイン染色、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法はすべて、より慣例的なアッセイ法より少なくとも１０倍感度が高いようである（Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177；Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859；Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413）。五量体（例えば、ＵＳ ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ ０２／０７２６３１）、およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Nature medicine 6. 631-637 (2002)）を使用することもできる。
【０１７７】
ＸＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＴＴＫががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および／または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＴＴＫの発現が関与するがんの治療において治療的に使用することができ、そのようながんの例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明はまた、ＴＴＫタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法を提供する。そのようなアッセイ法は、必要に応じて、ＴＴＫタンパク質またはその断片を認識してそれと結合し得る１つまたは複数の抗ＴＴＫ抗体を含み得る。本発明との関連において、ＴＴＫポリペプチドに結合する抗ＴＴＫ抗体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長ＴＴＫポリペプチドとの間の結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２のアミノ酸配列からなる任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイ法は、様々な型の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
【０１７９】
本発明の免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイ法には、Ｔ細胞免疫原性アッセイ法（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイ法もまた含まれ得る。加えて、本発明は、ＴＴＫを発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法を企図し、その例には、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイ法は、ＴＴＫを発現するがんの検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用することができ、そのようながんの例には、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体をさらに含み得る。
【０１８１】
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
【０１８２】
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片を含み得る。
【０１８３】
本明細書では、抗体を、ＴＴＫペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、６、１５、および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるＴＴＫの断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明との関連において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
【０１８４】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
【０１８５】
任意の哺乳動物を前記抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
【０１８６】
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
【０１８７】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
【０１８８】
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
【０１８９】
公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
【０１９０】
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
【０１９１】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１９２】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
【０１９３】
あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
【０１９４】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
【０１９５】
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
【０１９６】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
【０１９７】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
【０１９８】
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１９９】
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２００】
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０２０１】
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
【０２０２】
本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。
【０２０３】
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
【０２０４】
ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用され得る。
【０２０５】
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、ａｒａＢプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２０６】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
【０２０７】
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２０８】
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０２０９】
材料および方法
細胞株
Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ヒトＢリンパ芽球様細胞株、およびＣＯＳ７すなわちアフリカミドリザル腎細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＴＴＫ陽性腫瘍細胞株であるＨ１６５０は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＬＡ−Ａ２陰性かつＴＴＫ陽性細胞株であるＰＣ−３およびＴＥ−１は、それぞれＪＣＲＢ細胞バンクおよび理研細胞バンクから購入した。
【０２１０】
ＴＴＫ由来ペプチドの合成
ＴＴＫ由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対する結合親和性の予測に基づいて設計した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３８）。ペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＳＩＧＭＡ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）またはＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０２１１】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非動化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２１２】
ＣＴＬ増殖手順
Riddell ら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44；Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に再懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9；Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7；Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２１３】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０２１４】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
【０２１５】
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ０２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
標的遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性細胞株であるＣＯＳ７に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０２１６】
結果
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１で拘束されたＴＴＫ由来予測ペプチドによるＣＴＬの誘導
ＴＴＫ由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｊ）。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した：ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃１および＃４（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃７（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃５（ｃ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃４、＃５、＃６、および＃７（ｄ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃５および＃７（ｅ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）で刺激した＃７（ｆ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）で刺激した＃５、＃７、および＃８（ｇ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃１、＃２、および＃５（ｈ）、ＴＴＫ−Ａ０２−１０−５４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）で刺激した＃２（ｉ）、ならびにＴＴＫ−Ａ０２−１０−６６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）で刺激した＃２（ｊ）。
【０２１７】
ＴＴＫ特異的ペプチドに対するＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
「材料および方法」に記載したように、ＴＴＫ−Ａ０２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃１（ａ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−６３０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃７（ｂ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃５（ｃ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）で刺激した＃５（ｄ）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−１４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で刺激した＃５（ｅ）、およびＴＴＫ−Ａ０２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で刺激した＃２（ｆ）中の、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出されるペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、限界希釈によりＣＴＬ株を樹立した。それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ ａ〜ｆ）。すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。
【０２１８】
さらに、「材料および方法」に記載したように、ＣＴＬ株から限界希釈によりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬクローンから、強力なＩＦＮ−γ産生が測定された（図２ｇ）。
【０２１９】
ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
各ペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株およびＣＴＬクローンを、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を内因的に発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株およびＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。全長ＴＴＫ遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図３において、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬ株およびＣＴＬクローンは、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した（ａ：株、ｂ：クローン）。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いて樹立されたＣＴＬクローンはまた、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を内因的に発現する腫瘍細胞株：Ｈ１６５０細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（ｃ）。一方、対照：ＴＥ１細胞およびＰＣ３細胞に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と共に標的細胞上に提示されることが明確に実証された。その後、このペプチド−ＨＬＡ複合体はＣＴＬによって認識された。これらの結果から、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が、ＴＴＫを発現する腫瘍を有する患者に対するがんワクチンとして適している可能性があることが示される。
【０２２０】
抗原ペプチドの相同性解析
ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の配列は固有のものであることが示され、したがって本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどない。
【０２２１】
結論として、ＴＴＫ由来の新規なＨＬＡ−Ａ０２エピトープペプチドが同定された。さらに、ＴＴＫのエピトープペプチドを用いるワクチンががん免疫療法に適用できる可能性があることが実証された。
【０２２２】
参照実施例
ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性［ＷＯ２００８／１０２５５７］
ＷＯ２００８／１０２５５７として公開された本出願人らの先の出願は、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対するＴＴＫ由来ペプチドの特異的ＣＴＬ誘導活性を開示している（図４）。
【０２２３】
これらのペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬクローンを、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞を認識するそれらの能力について調べた。ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を内因的に発現する標的細胞の特異的モデルである、全長ＴＴＫ遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７に対する特異的ＣＴＬ活性を、ＴＴＫ−Ａ２−９−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＴＴＫ−Ａ０２−９−５４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＴＴＫ−Ａ２−９−７１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、およびＴＴＫ−Ａ２−１０−４６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）によって産生されたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて、試験した。全長ＴＴＫをトランスフェクトしたが、全長ＨＬＡ−Ａ＊０２０１をトランスフェクトしなかったＣＯＳ７、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１をトランスフェクトしたが、全長ＴＴＫをトランスフェクトしなかった（または全長ＨＩＧ２遺伝子で置き換えた）ＣＯＳ７、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１をトランスフェクトし、かつ異なる標的エピトープペプチドをパルスしたＣＯＳ７を、対照として調製した。結果から、それらのペプチドに対して産生されたＣＴＬクローンは、ＴＴＫおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７に対して特異的ＣＴＬ活性を有することが実証される（図４、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２００８／１０２５５７における図８ｂ、ｃ、ｄ、およびｅに対応している）。
【０２２４】
それらのペプチドと比較して、本発明において同定されたＴＴＫ−Ａ０２−９−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、ＩＦＮ−γ産生において一桁または二桁分増加する明らかに効果的な活性を有する（図３）。したがって、本発明のペプチドは、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんの治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ、および／またはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）の有望な標的であると考えられる。
【０２２５】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、かつ幅広いがんの種類に対する適用性を有し得る、ＴＴＫ由来の新規ＴＡＡを提供する。このようなＴＡＡは、ＴＴＫに関連した疾患、例えばがん、より詳細には肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、びまん性胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、および精巣腫瘍に対するペプチドワクチンとして有用であり得る。
【０２２６】
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明するが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項３】
以下の特徴の一方または両方を有する、請求項２記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている。
【請求項４】
前記ペプチドがノナペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＣＴＬを誘導するための剤であって、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または請求項５記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む、剤。
【請求項７】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または請求項５記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む、薬剤。
【請求項８】
ＨＬＡ−Ａ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
ＨＬＡ−Ａ２がＨＬＡ−Ａ＊０２０１である、請求項８記載の薬剤。
【請求項１０】
がんの治療のために製剤化される、請求項７または８記載の薬剤。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
（ａ）ＡＰＣと請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
（ｂ）請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導する方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法によって誘導される、請求項１３記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法によって誘導される、請求項１５記載のＣＴＬ。
【請求項１７】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチド、１つもしくは複数のその免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体またはその断片。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド、請求項５記載のヌクレオチド、または請求項１８記載の抗体を含む、診断キット。
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
【請求項３】
以下の特徴の一方または両方を有する、請求項２記載の単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、または該アミノ酸であるように改変されている。
【請求項４】
前記ペプチドがノナペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＣＴＬを誘導するための剤であって、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または請求項５記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む、剤。
【請求項７】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドの１つもしくは複数、または請求項５記載のポリヌクレオチドの１つもしくは複数を含む、薬剤。
【請求項８】
ＨＬＡ−Ａ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
ＨＬＡ−Ａ２がＨＬＡ−Ａ＊０２０１である、請求項８記載の薬剤。
【請求項１０】
がんの治療のために製剤化される、請求項７または８記載の薬剤。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
（ａ）ＡＰＣと請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
（ｂ）請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導する方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をＴ細胞に導入する段階。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法によって誘導される、請求項１３記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法によって誘導される、請求項１５記載のＣＴＬ。
【請求項１７】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項記載の１つもしくは複数のペプチド、１つもしくは複数のその免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体またはその断片。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド、請求項５記載のヌクレオチド、または請求項１８記載の抗体を含む、診断キット。
【図１】
【図２ａ−ｄ】
【図２ｅ−ｇ】
【図３】
【図４】
【図２ａ−ｄ】
【図２ｅ−ｇ】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５２６５１９（Ｐ２０１２−５２６５１９Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８４５１（Ｐ２０１１−５４８４５１）
【出願日】平成２２年５月１０日（２０１０．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／００３１６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３１４５２
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１０日（２０１０．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／００３１６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３１４５２
【国際公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
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