ＴＷＥＡＫ受容体のマルチマー化およびオリゴマー化可溶性断片に関する組成物および方法
本発明は、マルチマー化可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなる融合タンパク質に関する方法および組成物を提供する。そのような融合タンパク質は、ＴＷＥＡＫ受容体をアンタゴナイズし、そして充実性腫瘍および炎症性状態のような血管形成により仲介される疾患または状態を治療するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年７月２４日出願の米国仮特許出願６０／４９０，０３６の利益を主張し、前記出願の開示は参考によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管形成は多工程の発生過程であり、存在する血管から新しい血管の形成という結果に至る。この空間的および時間的に調節された工程は、プロテアーゼにより存在する血管のマトリックス接触および細胞相互作用の支持を弱め、続いて存在する血管の平滑筋細胞および内皮細胞の協調した運動、形態変化および増殖に関与する。次いで、発生期の細胞は標的組織へ広がり、内皮細胞が、平滑筋細胞が取り囲むチューブを形成する細胞−細胞相互作用が続く。協調した方式で、血管の細胞外マトリックスタンパク質が分泌され、そして内皮周辺支持細胞が補充され、構造的完全性を支持しそして維持する（例えば、Ｄａｎｉｅｌら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００（６２）：６４９，２０００を参照されたい）。血管形成は正常のおよび病的な生理機能の両方に重要な役割を果たす。
【０００３】
正常な生理機能状態下で、血管形成は胎生のおよび胚性の発生、創傷治癒、器官再生、並びに子宮内膜、黄体および胎盤の形成を含む女性の生殖リモデリング過程に関与する。血管形成は、特に成体の動物において正常な状態下で厳密に調節されており、そして調節制御の乱れは病的血管形成に導きうる。
【０００４】
病的血管形成は、炎症性疾患、ある種の眼障害および癌の徴候および／または進行に関わっている。特に、いくつかの種類の証拠が、血管形成は充実性腫瘍およびそれらの転移の増殖と持続に必須であるという概念を支持する（例えば、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２、１９７１；Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５８、１９８９；Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１，１９９３；Ｈｏｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：６１８０、１９９１を参照されたい）。したがって、血管形成阻害剤は、癌の予防（例えば、前癌状態の治療）、介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）（例えば、小さい癌の治療）および後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）（例えば、大きな癌の治療）に有用である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：８０８，１９９９を参照されたい）。
【０００５】
疾患の予防、破棄および軽減のために、血管形成を変調するさらなる組成物および方法の必要性がある。
ＴＲＥＰＡおよびＡｐｏ３Ｌとも呼ばれるＴＷＥＡＫタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、そして非常に多様なヒト組織において発現する（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１）：３２４０１，１９９７；Ｗｉｌｅｙ，ＰＣＴ公開公報Ｎｏ．ＷＯ９８／３５０６１（１９９８年８月１３日）をまた参照されたい）。多くのＴＮＦファミリーのメンバーのように、ＴＷＥＡＫは細胞外Ｃ末端ドメインを持つＩＩ型膜タンパク質である。ＴＷＥＡＫははじめは弱いアポトーシスの誘導物質として記載されたが、この細胞死の誘導は後に間接的であることが示された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１７８５，１９９９）。
【０００６】
Ｌｙｎｃｈらは、ＴＷＥＡＫが直接的に内皮細胞増殖および血管形成を誘導することを実証した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１３）：８４５５，１９９９）。ピコモル濃度の組換え可溶性ＴＷＥＡＫは、複数の内皮細胞株および大動脈平滑筋細胞の増殖を誘導し、そして培養中の血清および増殖因子の要求を減じる。さらに、ＴＷＥＡＫは、ラット角膜ポケットアッセイにおいて強い血管形成応答を誘導する。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーを通じたシグナルによって生物学的応答を開始するので、ＴＷＥＡＫ受容体を同定しそして特性付けることに重大な興味があった。
【０００７】
Ｍａｒｓｔｅｒｓらは、ＴＷＥＡＫはＤＲ３、Ａｐｏ３、ＷＳＬ−１、ＴＲＡＭＰまたはＬＡＲＤとしてさまざまに知られるデスドメイン含有受容体に結合し、そしてそれらを通じてシグナルを伝えることを報告した（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（９）：５２５，１９９８）。しかしながら、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらは、ＴＷＥＡＫはＫｙｍ−１細胞に結合しそしてシグナルを伝えるが、Ｋｙｍ−１細胞は受容体ＤＲ３を発現しないことを示した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１７８５、１９９９）。Ｗｉｌｅｙはそれに続き、第一のＴＷＥＡＫ受容体を同定し、そして野生型ＴＷＥＡＫ受容体をアンタゴナイズする特定の可溶性断片および変異体を記載した（ＰＣＴ公開公報Ｎｏ．ＷＯ０１／４５７３０）。
【０００８】
ＴＷＥＡＫはインビボでの血管形成を誘導するので、主要な機能性ＴＷＥＡＫ受容体のアンタゴニストに特に必要性がある。そのようなＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストは、血管形成を減じるため、そして癌および炎症性疾患を含むヒト疾患の治療するために有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明は、主要な機能性ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫＲ）のマルチマー化可溶性断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドの同定および特性付けに基づく。驚くことに、これらのポリペプチドは、可溶性モノマー化ＴＷＥＡＫＲ断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチド、またはオリゴマー化ドメインなしのマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ断片を含んでなるポリペプチドのＴＷＥＡＫ結合および競合特性から予測されたものより、ＴＷＥＡＫへの高い結合親和性を有し、および／またはＴＷＥＡＫ結合への優れた競合体である。
【００１０】
本発明は、例えば、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストを含んでなる組成物の治療上の有効量を投与することを含んでなる、そのような治療を必要とする哺乳動物において血管形成を阻害するための組成物および方法を提供する。組成物は好ましくは医薬的に許容できる担体を含んでなり、そして哺乳動物は好ましくはヒトである。
【００１１】
１つの側面において、本発明は、ＴＷＥＡＫ受容体の第一可溶性断片、ＴＷＥＡＫ受容体の第二可溶性断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＴＷＥＡＫに結合し、そして前記第一可溶性断片が：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、前記ポリペプチドを提供する。１つの態様において、前記第一可溶性断片は：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片は：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１２】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第三可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１３】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第四可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１４】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第五可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１５】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第六可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１６】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第七可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１７】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはリンカーを含んでなる。もう１つの態様において、前記リンカーは、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合する。もう１つの態様において、前記リンカーは、前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する。もう１つの態様において、前記ポリペプチドは、第一リンカーおよび第二リンカーを含んでなり、ここで前記第一リンカーは前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合し、そして前記第二リンカーは前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する。もう１つの態様において、前記リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＧ（配列番号４５）を含んでなる。
【００１８】
もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は介在ポリペプチド配列なしに共に接合する。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記オリゴマー化ドメインは介在ポリペプチド配列なしに共に接合する。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、前記第二可溶性断片、および前記オリゴマー化ドメインは介在ポリペプチド配列なしに、直鎖状で連続しているポリペプチドにおいて共に接合する。
【００１９】
もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインは、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＮ末端側である。もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインは、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＣ末端側である。もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインはロイシンジッパーを含んでなる。もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインは抗体の断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記抗体の断片はＦｃドメインを含んでなる。
【００２０】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドは：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記ポリペプチドは：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記ポリペプチドは：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択される配列を含んでなる。
【００２１】
もう１つの側面において、本発明は、第一前記ポリペプチドおよび第二前記ポリペプチドを含んでなるタンパク質であって、ここで前記第一および第二ポリペプチドが互いにオリゴマー化している、前記タンパク質を提供する。もう１つの態様において、前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列は前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。もう１つの態様において、前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列は前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一でない。
【００２２】
もう１つの側面において、本発明は、対象中のＴＷＥＡＫ受容体を阻害する方法であって、前記対象に前記ポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
もう１つの側面において、本発明は、対象中の血管形成を阻害する方法であって、前記対象に前記ポリペプチドを含んでなる組成物の治療上の有効量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。もう１つの態様において、前記組成物は医薬的に許容できる担体をさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記対象は哺乳動物である。もう１つの態様において、前記哺乳動物はヒトである。もう１つの態様において、前記対象は血管形成により仲介されまたは悪化した疾患または状態を有する。もう１つの態様において、前記疾患または状態は眼の新血管新生により特徴付けられる。もう１つの態様において、前記疾患または状態は充実性腫瘍である。もう１つの態様において、前記方法は、放射線で前記対象を治療することをさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記方法は、第二化学療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記第二化学療法剤は：アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、植物由来化学療法剤、ニトロソウレア、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血球因子、放射線療法剤、および生物学的応答修飾剤からなる群より選択される。もう１つの態様において、前記第二化学療法剤は、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リンホカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、デルタインターフェロン、ＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌアスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される。もう１つの態様において、前記疾患または状態は炎症性疾患または状態である。もう１つの態様において、前記方法は第二療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記第二療法剤は炎症を促進するサイトカインまたはサイトカイン受容体を阻害する。もう１つの態様において、前記第二療法剤は前記サイトカイン受容体の可溶性断片、前記サイトカインに結合する抗体、または前記サイトカイン受容体に結合する抗体を含んでなる。もう１つの態様において、前記第二療法剤は炎症を阻害する受容体を活性化する。もう１つの態様において、前記第二療法剤は、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１４８アゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニスト、およびＴｅｋアンタゴニストからなる群より選択される。
【００２３】
もう１つの側面において、本発明は、前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる、核酸またはその相補体を提供する。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体が中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、第二核酸にハイブリダイズし、そして前記第二核酸は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸は：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードする。
【００２４】
もう１つの側面において、本発明は、前記核酸を含んでなるベクターを提供する。もう１つの態様において、前記ベクターは、発現ベクターである。
もう１つの側面において、本発明は、前記核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
【００２５】
もう１つの側面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で前記宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＴＷＥＡＫＲの可溶性断片のマルチマーおよびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドに関する組成物および方法を提供する。
【００２７】
明細書中で使用される略語および用語
「４−１ＢＢ」および「４−１ＢＢリガンド」（４−１ＢＢ−Ｌ）は、とりわけ米国特許番号５，６７４，７０４号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
「ｂＦＧＦ」は、塩基性線維芽細胞増殖因子である。
【００２８】
「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンである。
「ＣＤ４０リガンド」（ＣＤ４０Ｌ）は、とりわけ米国特許番号５，７１６，８０５号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
【００２９】
「ＣＨＯ」は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。
「ＤＭＥＭ」は、商業的に利用可能な細胞培養培地である、ダルベッコ修飾イーグル培地である。
【００３０】
「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着アッセイである。
「Ｆｌｔ３Ｌ」は、とりわけ米国特許番号５，５５４，５１２号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む、Ｆｌｔ３リガンドである。
【００３１】
「ＨＲＭＥＣ」は、初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞である。
「ＨＵＶＥＣ」は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の細胞株である。
【００３２】
「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水である。
「ＰＭＡ」は、ホルボール１２−ミリスチン酸−１３酢酸塩である。
【００３３】
「ＲＴＫ」は、受容体チロシンキナーゼである。
「Ｔｅｋ」は、Ｔｉｅ２およびｏｒｋとも呼ばれ、主に血管内皮で発現するＲＴＫである。ヒトＴｅｋ（ｏｒｋ）の分子クローニングは、Ｚｉｅｇｌｅｒによる米国特許番号５，４４７，８６０号に記載されている。「Ｔｅｋアンタゴニスト」は、とりわけＣｅｒｒｅｔｔｉらのＰＣＴ公開公報ＷＯ００／７５３２３（２０００年１２月１４日）に記載される。
【００３４】
「ＴＮＦＲ」は、腫瘍壊死因子受容体でありその可溶性型を含む。「ＴＮＦＲ／Ｆｃ」は、腫瘍壊死因子受容体−Ｆｃ融合ポリペプチドである。
「ＴＲＡＩＬ」は、とりわけ米国特許番号５，７６３，２２３号に記載されるＴＮＦファミリーのＩＩ型膜貫通ポリペプチドであり、その可溶性型を含む、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドである。
「ＶＥＧＦ」は、ＶＰＦまたは血管浸透因子としても知られる、血管内皮増殖因子である。
【００３５】
可溶性ＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド
天然のヒトＴＷＥＡＫ受容体ｃＤＮＡは配列番号３の配列を有し、１２９残基のポリペプチドをコードする（配列番号４）。ＤＮＡ配列の考察により、およそ７８アミノ酸の細胞外ドメイン（シグナルペプチドを含む、配列番号４の１−７８番目の残基）、およそ２３アミノ酸の膜貫通ドメイン（配列番号４の７９−１０１番目の残基）、およびおよそ２８アミノ酸の細胞内ドメイン（配列番号４の１０２−１２９番目の残基）を有するポリペプチドが予想された。ＴＷＥＡＫ受容体配列は、ＫａｔｏらのＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／５５５０８（１９９８年１２月１０日）およびＩｎｃｙｔｅのＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／６１４７１（１９９９年１２月２日）によってもまた報告されている。本明細書で使用される「ＴＷＥＡＫＲ」は、これらの配列を有するポリペプチドを含み、そして特に配列番号７の２８−７９のアミノ酸並びに天然に生じるその変異体を含んでなる。
【００３６】
本発明の１つの側面において、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドは、血管形成を阻害するためのおよび／またはＴＷＥＡＫリガンドのＴＷＥＡＫＲへの結合を阻害するためのＴＷＥＡＫＲアンタゴニストとして使用される。
【００３７】
可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能である。ポリペプチドの可溶性型の使用は、特定の応用に好都合である。ポリペプチドが分泌されるので、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製は容易であり、そして可溶性タンパク質は一般的に非経口投与に適している。分泌可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離により培養培地から望ましいポリペプチドを発現する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を分離し、そして培地（上清）を望ましいポリペプチドの存在についてアッセイすることによって、同定可能である（そしてその非可溶性膜結合対応物から区別可能である）。培地中の望ましいポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがってポリペプチドの可溶性型であることを示唆する。可溶性ポリペプチドは、多くの慣用の技術のいずれかにより調製可能である。望ましい可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ポリペプチドの産生のために発現ベクター中へサブクローニング可能であり、または望ましいコードするＤＮＡ断片は化学的に合成可能である。
【００３８】
可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドはＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインの全部または一部を含むが、一般的に細胞表面でのポリペプチドの保持を引き起こす膜貫通ドメインまたはその断片を欠く。可溶性ポリペプチドがそれを産生する細胞から分泌される限りは、膜貫通ドメインの一部あるいは細胞質ドメインの全部または一部を含んでよい。可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、細胞からの分泌を促進するために、はじめに合成されたとき天然のまたは異種のシグナルペプチドを有利に含んでなるが、該シグナル配列は分泌時に切断される。用語「ＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメイン」は、天然ＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインの全部または一部、並びに限定はされないが以下のものを含む関連型を包含することが意図される：（ａ）断片、（ｂ）変異体、（ｃ）誘導体、および（ｄ）融合タンパク質。これら関連型の血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害する能力は、以下で例示されるものまたは当該技術分野で知られる他のアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで決定可能である。可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの例は、以下に提供される。
【００３９】
マルチマー可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片は、ＴＷＥＡＫＲの可溶性断片のダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、またはそれ以上のマルチマーである。マルチマーは、当該技術分野で知られたいずれの方法によりともに連結してよい。例えば、それらは連続ポリペプチド鎖の一部であることが可能であり、ここで各モノマーは、例えばリンカーを通じてのような１つまたはそれより多くの介在アミノ酸またはペプチド結合を通じて、ペプチド結合を介して直接的にまたは間接的にその近隣モノマーに連結可能である。例えば、マルチマーは、例えば異なった可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチド上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合によるような、他の型の共有結合により互いに接合可能である。
【００４０】
オリゴマー化ドメインは、それらを含んでなるポリペプチドのオリゴマー化を引き起こす、即ち、対応するオリゴマー化ドメインを含んでなるもう１つのポリペプチドと共有および／または非共有結合を形成する、ポリペプチドである。したがって、もしポリペプチドがそれらのオリゴマー化ドメインを介して互いに結合する場合、２またはそれ以上のポリペプチドは「オリゴマー化される」。当該技術分野で知られるいかなるオリゴマー化ドメインが使用可能である。例は、以下でより詳細に記載されるように、ロイシンジッパーおよび例えばＦｃドメインのような抗体由来の特定のポリペプチドを含む。オリゴマー中のポリペプチドは同一ポリペプチド配列、類似ポリペプチド配列、または異なったポリペプチド配列を有することが可能である。特定の態様において、本発明のオリゴマー化ポリペプチドは、４から１４の可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を含んでなる。
【００４１】
いくつかの態様において、マルチマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して調製される。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）；および、ＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（「免疫グロブリン融合タンパク質の構築」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２中のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）により記載される。
【００４２】
本発明の１つの態様は、２つのポリペプチドを含んでなるＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーに向けられ、各ポリペプチドが２つの可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片およびＦｃドメインを含んでなる（ジＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ）。ジＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター中に挿入される。ジＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃポリペプチドは、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞中で発現され、そして抗体分子に酷似する会合が可能になり、ここで鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され４価の可溶性ＴＷＥＡＫＲが生じる。本明細書で使用される用語「Ｆｃポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型およびムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）型を含む。ダイマー化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの一部切除型もまた含まれる。
【００４３】
ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載される１つの適したＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然のＣ末端までに渡る一本鎖ポリペプチドである。もう１つの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２，１９９４に記載されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、１９番目のアミノ酸がＬｅｕからＡｌａに変化し、２０番目のアミノ酸がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そして２２番目のＧｌｙがＡｌａに変化したことを除いては、ＷＯ９３／１０１５１に示された天然Ｆｃ配列のものと同一である。該ムテインは、Ｆｃ受容体に減じた親和性を表わす。Ｆｃ部分、およびそれらから形成されたマルチマーを含んでなる融合ポリペプチドは、プロテインＡまたはプロテインＧカラムに対する親和性クロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提示し、そしてＦｃ融合ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドよりも療法応用に有用な長いインビボ半減期を提供することが可能である。
【００４４】
他の態様において、マルチマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片は、抗体重鎖または軽鎖の可変部分と置換可能である。もし融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方で作られたならば、８つまたはそれより多くの可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片で可溶性ＴＷＥＡＫＲオリゴマーを形成することが可能である。
【００４５】
もう１つの態様において、オリゴマー化ドメインはロイシンジッパードメインを含んでなる。ロイシンジッパードメインは、それらが発見されたタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初はいくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９，１９９８）、そしてその後種々の異なったタンパク質において発見された。公知のロイシンジッパーの中には、天然に生じるペプチドおよびダイマー化するまたはトリマー化するその誘導体がある。可溶性マルチマー化タンパク質の産生に適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載され、そしてＨｏｐｐｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４：１９１，１９９４に記載される、肺表面活性タンパク質Ｄ（ｌｕｎｇ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。ロイシンジッパーに融合した異種タンパク質の安定トリマー化を可能にする修飾ロイシンジッパードメインの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７，１９９４に記載される。ロイシンジッパーペプチドに融合した可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質は、適した宿主細胞中で発現され、そして形成した可溶性ＴＷＥＡＫＲマルチマーは培養上清から回収される。
【００４６】
あるいは、本発明のポリペプチドはペプチドリンカー（スペーサー）を含んでなる。リンカーは、第一ポリペプチド、リンカー、および第二ポリペプチドがアミノ酸の連続配列を形成するように、アミノ末端が第一ポリペプチドにペプチド結合しており、そしてカルボキシ末端が第二ポリペプチドにペプチド結合している、１つまたはそれより多くのアミノ酸の配列である。介在ポリペプチド配列なし（即ち、リンカーなし）でともに接合した第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドとは異なり、そのようなリンカーは第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドを「接合する」といわれる。適したペプチドリンカーの中には、米国特許４，７５１，１８０、４，９３５，２３３、および５，０７３，６２７に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られた慣用の技術を使用して、例えばＴＷＥＡＫＲ断片をコードするＤＮＡ配列の間に、そして同じ読み枠で挿入可能であり、並びに／またはＴＷＥＡＫＲ断片およびオリゴマー化ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の間に挿入可能である。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片をコードする配列間にライゲーション可能である。特定の態様において、本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーで分離された２から４つの可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなる。
【００４７】
本発明は、血管形成および／または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害するオリゴマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲマルチマーの種々の形態の使用を包含する。用語「オリゴマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲマルチマー」は、天然ＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインの全部または一部を含有するオリゴマー化マルチマー、並びに限定はされないが、可溶性ＴＷＥＡＫＲの断片、変異体、誘導体、および融合タンパク質のオリゴマー化マルチマーを含む関連型を包含することを意図する。これら関連型の血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害する能力は、実施例中に例示されるもののような方法を使用して、または当該技術分野で知られた他のアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで決定可能である。
【００４８】
本発明の実施に有用なポリペプチド、マルチマーおよびオリゴマーの中には、リガンドに結合する能力を保持し、および／または血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介反応を阻害するＴＷＥＡＫＲ変異体を含んでなるポリペプチドが含まれる。そのようなＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲに実質的に相同であるポリペプチドを含むが、１つまたはそれより多くの欠失、挿入または置換のため、天然ＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列から異なるアミノ酸配列を有する。特定の態様は、限定はされないが、天然のＴＷＥＡＫＲ配列と比べたときに、アミノ酸残基の１から１０の欠失、挿入または置換を含んでなるＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含む。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの変異体として含まれるものは、対立形質型および択一的スプライシング型のような天然に生じる変異体、ならびにＴＷＥＡＫＲポリペプチドのアミノ酸配列、またはＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を修飾することにより構築された変異体である。
【００４９】
一般的に、天然ポリペプチド中に存在する１またはそれより多くの置換は、保存的に成されるべきである。保存的置換の例は、活性ドメインの外側のアミノ酸の置換、およびＴＷＥＡＫＲの二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換を含む。さらなる例は、１つの脂肪族残基を別の脂肪族残基に置換すること、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを別のものに置換すること、または１つの極性残基を別の極性残基に置換すること、例えばＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間で置換すること、または１つの芳香族残基を別の芳香族残基に置換すること、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを別のものへ置換することを含む。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する全体部分の置換も当該技術分野で公知である。
【００５０】
いくつかの好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ７０％同一であり；いくつかの好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ８０％同一である。いくつかのより好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９０％同一であり；いくつかのより好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９５％同一である。いくつかの最も好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９８％同一であり；いくつかの最も好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９９％同一である。ポリペプチドおよび核酸の両方の場合、パーセント同一性は目視検査により決定されうる。パーセント同一性は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３、１９７０）の並列方法を使用して、また決定されうる。好ましくは、パーセント同一性は、例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７、１９８４を参照されたい）から利用できる、ＧＡＰコンピュータープログラム バージョン１０．ｘのようなコンピュータープログラムを使用することにより決定される。ＧＡＰプログラムに好ましいデフォルトパラメーターは、（１）核酸の単項比較マトリックス（同一には１の値、および非同一には０の値を含有する）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ．３５３−３５８，１９７９により記載されるＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５、１９８６のアミノ酸の加重比較マトリックス；（２）各ギャップへの３０（アミノ酸）または５０（ヌクレオチド）のペナルティ、および各ギャップにおける各シンボルへのさらなる１（アミノ酸）または３（ヌクレオチド）；（３）エンドギャップへのペナルティはなし；および（４）長いギャップへの最大ペナルティなしを含む。配列比較の当業者により使用される他のプログラムもまた使用してもよい。ＴＷＥＡＫＲの断片について、パーセント同一性は、断片中に存在するＴＷＥＡＫＲのその部分に基づいて計算される。
【００５１】
本発明は、関連した天然パターンの糖鎖付加ありで、またはなしでの可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの使用をさらに包含する。酵母または哺乳動物発現システム（例えば、ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）において発現したＴＷＥＡＫＲは、発現システムの選択に依存して、分子量および糖鎖付加パターンにおいて天然ＴＷＥＡＫＲポリペプチドに類似しても、または有意に異なってもよい。大腸菌のような細菌の発現システムにおけるＴＷＥＡＫＲポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。異なった宿主細胞は、異なってポリペプチドをまた処理することが可能であり、可変Ｎ−またはＣ−末端を有するポリペプチドの異種混合物を生じる。
【００５２】
可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの一次アミノ酸構造は、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等のような、他の化学部分と共有的なまたは集合的な共役を形成することにより誘導体を創出するように修飾されてもよい。ＴＷＥＡＫＲの共有的誘導体は、ＴＷＥＡＫＲアミノ酸側鎖またはＴＷＥＡＫＲポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端で、特定の官能基を連結することにより調製可能である。
【００５３】
本発明の実施に有用な可溶性ＴＷＥＡＫＲの融合タンパク質は、新規の多機能性性質を提供するために追加される、他のポリペプチドを有するＴＷＥＡＫＲポリペプチドの共有的なまたは集合的な共役体をまた含む。
【００５４】
ＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチドの組換え体産生
本発明において使用される可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチド、断片および融合タンパク質を含むＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、組換え発現システムを使用して調製してよい。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞（「組換え宿主細胞」）は、ＴＷＥＡＫＲの発現を促進する条件下で培養され、そしてＴＷＥＡＫＲは回収される。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、トランスジェニック植物もしくは動物、または化学合成によりまた生産されうる。
【００５５】
本発明は、以下を含む本発明で使用されるＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードする核酸分子を包含する：（ａ）ＴＷＥＡＫに結合する配列番号７の２８−７９番目の残基およびその断片をコードする核酸；（ｂ）（ａ）の核酸に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、ＴＷＥＡＫに結合できるポリペプチドをコードする核酸；および（ｃ）（ａ）の核酸に中程度なストリンジェンシーでハイブリダイズし、ＴＷＥＡＫに結合できるポリペプチドをコードする核酸。
【００５６】
遺伝暗号の縮重のために、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における多量なバリエーションがあり得る。本発明の態様に含まれるものは、ＴＷＥＡＫＲをコードするＤＮＡ配列に中程度にストリンジェントな条件下（例えば、５ＸＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液、および５０℃、５ＸＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件）で、ハイブリダイズできる核酸配列である。当業者は、中程度なハイブリダイゼーションストリンジェンシーを構成する塩および温度のさらなる組み合わせを決定可能である（参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８２；およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９８９およびそれ以降の版を参照されたい）。高度なストリンジェンシーの条件は、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄のより高い温度、および／またはより低い塩濃度を含む。核酸のパーセント同一性はポリペプチドへの上述の方法、即ち、目視検査およびＧＡＰのようなコンピュータープログラムの使用を含む方法により決定可能である。
【００５７】
いずれかの適した発現システムが、組換えＴＷＥＡＫＲの産生のために採用されうる。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子由来のもののような、適した転写および翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結したＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。調節配列がＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列に機能的に関係するとき、ヌクレオチド配列は機能可能に連結されている。したがって、ＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列の転写を制御するならば、プロモーターヌクレオチド配列は、ＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列に機能可能に連結されている。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、もしくはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列を含む。適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列は、発現ベクター中に組み込まれることが可能である。シグナルペプチド（分泌リーダー、リーダーペプチド、またはリーダーを含む種々の名称で呼ばれる）のＤＮＡ配列は、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドがシグナルペプチドを含んでなる融合タンパク質としてはじめに翻訳されるように、ＴＷＥＡＫＲ配列にインフレームに融合されうる。意図する宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からＴＷＥＡＫＲの分泌の際に、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドから切断される。
【００５８】
ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの発現のための適した宿主細胞は、原核生物、酵母、ならびに昆虫および哺乳動物を含む高度な真核細胞を含む。細菌、真菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞性宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８５において記載される。
【００５９】
原核生物は、グラム陰性生物、または例えば大腸菌またはバチルス属の細菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）のようなグラム陽性生物を含む。形質転換のための適した原核生物宿主細胞は、例えば、大腸菌、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス属、スプレプトミセス属、およびスプレプトコッカス属内の多様な他の種を含む。大腸菌のような原核生物宿主細胞において、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、原核生物宿主細胞において組換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ末端のメチオニン残基を含んでよい。Ｎ末端のＭｅｔは、発現した組換えポリペプチドから切断されうる。
【００６０】
原核生物宿主細胞において使用するための発現ベクターは、一般的に１つまたはそれより多くの表現型選択可能マーカー遺伝子を含んでなる。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養要求性を補うタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞の有用な発現ベクターの例は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような商業的に利用可能なプラスミドに由来するものを含む。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、そしてしたがって、形質転換細胞を同定するために簡素な方法を提供する。適切なプロモーターおよびＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列は、ｐＢＲ３２２ベクター中に挿入される。他の商業的に利用可能なベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，スウェーデン、ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，米国ウィスコンシン州マジソン）を含む。
【００６１】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに共通して使用されるプロモーター配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４、１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７、１９８０；ＥＰ−Ａ−３６７７６）、およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２、１９８２）を含む。特に有用な原核生物宿主細胞発現システムは、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性抑制配列を採用する。λＰＬプロモーターの誘導体を組み込むＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから利用可能なプラスミドベクターは、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９中にある、ＡＴＣＣ３７０９２）およびプラスミドｐＰＬｃ２８（大腸菌株ＲＲ１に中にある、ＡＴＣＣ５３０８２）を含む。
【００６２】
ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてまた発現可能である。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母もまた適用可能である。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母ベクターのための適したプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセンリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸アイソメラーゼ、３−ホスホグリセンリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸アイソメラーゼ、ホスホグルコースアイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）を含む。酵母発現における使用のための他の適したベクターおよびプロモーターは、さらにＨｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７中に記載される。もう一つの代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４、１９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４、１９８２）により記載されたグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上記の酵母ベクター中に挿入することによって構築可能である。
【００６３】
酵母α因子リーダー配列を採用して、組換えポリペプチドの分泌を方向付けることが可能である。α因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間にしばしば挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３、１９８２；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。酵母宿主から組換えポリペプチドの分泌を容易にするために適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列は、１つまたはそれより多く制限部位を含有するように、その３’末付近を修飾可能である。これは、リーダー配列の構造遺伝子への融合を容易にするであろう。
【００６４】
酵母の形質転換プロトコルは、当業者に公知である。そのようなプロトコルの１つは、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、選択培地におけるＴｒｐ＋形質転換体を選択し、ここで選択培地は、０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００６５】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、「富化した」培地において発現を誘導するために増殖されうる。富化した培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルで補足した、１％酵母抽出液、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。培地からグルコースが使い果たされたとき、ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除が起こる。
【００６６】
昆虫宿主細胞培養システムを採用し、可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含む組換えＴＷＥＡＫＲポリペプチドを発現させることも可能である。昆虫細胞における異種ポリペプチドの産生のためのバキュロウイルスシステムは、ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７，１９８８により概説される。
【００６７】
哺乳動物細胞は、特に宿主細胞としての使用のために好ましい。適した哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１，１９９１）により記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株を含む。療法ポリペプチドの産生のために、動物タンパク質を含有しない培地において増殖するように適応した哺乳動物宿主細胞株を使用することが特に有利である。
【００６８】
哺乳動物細胞へのＤＮＡの導入のための確立された方法は、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９に記載されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｐｌｕｓのような商業的に利用可能な試薬を使用する追加のプロトコルを使用して、細胞をトランスフェクト可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３，１９８７）。さらに、エレクトロポレーションを使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｅｄ． Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９中のもののような慣用の手法を使用して、哺乳動物細胞をトランスフェクト可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤への耐性のような当該技術分野で公知の方法を使用して実行可能である。Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７，１９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性のようないくつかの選択スキームを記載する。ＤＨＦＲ選択のために適した宿主系統は、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ系統ＤＸ−Ｂ１１（ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）であり得る。ＤＨＦＲのｃＤＮＡを発現するプラスミドは、ＤＸ−Ｂ１１系統に導入可能であり、そして該プラスミドを含有する細胞のみが適切な選択培地において増殖可能である。発現ベクター中に組み込まれ得る選択可能マーカーの他の例は、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢのような抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡを含む。該ベクターを有する細胞は、これらの化合物に対する耐性を基にして選択可能である。
【００６９】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切除可能である。共通して使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。例えば、ＳＶ４０起点部位、初期および後期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライス部位、およびポリアデニル化部位のようなＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列を使用して、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他のゲノム要素を提供可能である。ウイルス初期および後期プロモーターは、双方とも断片としてウイルスゲノムから容易に入手され、それはウイルスの複製起点もまた含有しうる（Ｆｉｅｒｓら、 Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３、１９７８；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）ので、特に有用である。ＳＶ４０ウイルス複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へ伸びるおよそ２５０ｂｐ配列を含むことを条件に、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた使用可能である。
【００７０】
哺乳動物発現ベクターから異種遺伝子の発現を改善することが示されているさらなる制御配列は、ＣＨＯ細胞に由来する発現増強配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４）、ならびにアデノウイルス２由来の三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５，１９８２）のような要素を含む。ウイルス起源の内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロニックｍＲＮＡが効率よく翻訳されることを可能にする（ＯｈとＳａｒｎｏｗ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５，１９９３；Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７，１９９６）。ジシストロニックｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡ、および続く選択可能マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）の遺伝子の発現は、宿主のトランスフェクションの容易さ、および異種ｃＤＮＡの発現を改善することが示されている（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）。ジシストロニックｍＲＮＡを採用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０，１９９７により記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４により記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【００７１】
有用な高発現ベクターｐＣＡＶＮＯＴは、Ｍｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９：３３５，１９８９により記載されている。哺乳動物宿主細胞に使用する他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ３：２８０，１９８３）により開示されるように構築可能である。Ｃ１２７マウス哺乳動物上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定高レベル発現のために有用なシステムは、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）により記載されるように、実質的に構築可能である。Ｃｏｓｍａｎら Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，１９８４により記載される有用な高発現ベクターＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは当該技術分野で公知である。
【００７２】
ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを産生することにおいて採用してもよいシグナルペプチドに関して、天然ＴＷＥＡＫＲシグナルペプチドを使用してもよく、または、所望であれば異種のシグナルペプチドまたはリーダー配列により置換してもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えＴＷＥＡＫＲを産生しようとする宿主細胞の型のような因子に依存しうる。哺乳動物宿主細胞において機能する異種シグナルペプチドの例は、米国特許４，９６５，１９５に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体のシグナル配列；米国特許４，９６８，６０７に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体のシグナル配列；および、ＥＰ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体のシグナル配列を含む。
【００７３】
突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組換えＤＮＡの技術を使用して、ＴＷＥＡＫＲ断片、変異体、誘導体、および融合ポリペプチドを含む、アミノ酸残基または配列の種々の付加または置換、あるいは末端のまたは内部の残基または配列の欠失を含んでなるＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、当業者は生産可能である。
【００７４】
マウス、ヤギ、ヒツジおよびブタを含むトランスジェニック動物、ならびにタバコ、トマト、マメ、草、穀物を含むトランスジェニック植物は、可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含むＴＷＥＡＫＲポリペプチドの産生のためのバイオリアクターとしてもまた使用可能である。トランスジェニック動物の場合、ミルクおよび／または他の体液中への、可溶性ＴＷＥＡＫＲの発現を促進するシス作動性調節配列に機能可能に連結するＴＷＥＡＫＲコード配列を含む、キメラＤＮＡを構築することが特に有用である（例えば、米国特許番号５，８４３，７０５；米国特許番号５，８８０，３２７を参照されたい）。トランスジェニック植物の場合、特定の細胞型、組織、または器官においてＴＷＥＡＫＲを産生することが特に有用である（例えば、米国特許５，６３９，９４７号；米国特許５，８８９，１８９号を参照されたい）。
【００７５】
当業者は、発現した可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを精製するための手法が、採用した宿主システムによって、そして組換えポリペプチドが分泌されるか否かによって変化するであろうことを認識するであろう。可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、１つまたはそれより多くの濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製、ＨＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を含む当該技術分野で公知の方法を使用して精製可能である。Ｆｃ部分を含んでなる融合ポリペプチド（およびそれから形成されたマルチマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムに対してアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提示する。
【００７６】
治療の方法
以下に記載したものは、標的組織または細胞のグループにおける血管形成を促進するまたは抑制するための、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド、あるいはＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドをコードする遺伝子を採用する方法または組成物である。用語「治療する」、「治療すること」、「治療」、「療法」、「療法の」等は、予防的療法（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、予防的療法（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）、改良療法、および治療療法を含むことを意図する。
【００７７】
開示されたポリペプチド、組成物および方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物における血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害するために使用される。用語「ＴＷＥＡＫＲ仲介応答」は、ＴＷＥＡＫリガンドのＴＷＥＡＫＲへの結合により少なくとも一部が引き起こされる、あるいはＴＷＥＡＫをＴＷＥＡＫＲへの結合から遮断することにより、全部または一部において阻害されまたは抑制されうる、いずれかの細胞の、生理学的な、または他の生物学的応答を含む。治療は、血管形成により仲介される疾患または状態の開始または再発を予防するために、あるいは血管形成により仲介される疾患または状態を有する哺乳動物を治療するために、有利に施される。血管形成により仲介される疾患および状態は、限定するわけではないが、眼障害、悪性のおよび転移性の状態、ならびに炎症性疾患を含む。
【００７８】
本発明により治療可能である眼障害の中には、限定するわけではないが、糖尿病性網膜症（糖尿病の主要な合併症）、未熟児網膜症（頻繁に慢性な視覚問題に導き、そして失明の高いリスクを有する壊滅的眼状態は、未熟児の世話の間の深刻な合併症である。）、血管新生グリオーマ、網膜芽腫、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、ブドウ膜炎、黄斑変性および角膜移植片新血管新生を含む、眼新血管新生を特徴とする目の疾患を含む。他の目の炎症性疾患、眼腫瘍、および脈絡膜または光彩の新血管新生に関連する疾患もまた、本発明により治療可能である。
【００７９】
本発明を使用して、充実性腫瘍のような悪性状態および転移性状態もまた治療可能である。充実性腫瘍は、初期のならびに転移性の肉腫および癌腫の両方を含む。
本発明を使用して、限定するわけではないが、関節炎、リウマチおよび乾癬を含む炎症性疾患もまた治療可能である。
【００８０】
本発明により治療可能である他の疾患および状態は、良性腫瘍および新生物発生前状態、心筋血管形成、血友病関節、強皮症、血管接着、アテローム性斑新血管新生、毛細血管拡張症、および創傷肉芽形成を含む。
【００８１】
血管形成依存性である疾患状態は、心臓、肝臓、脳などを含むいずれかの組織または器官の冠状動脈のまたは末梢のアテローム動脈硬化症、および虚血を含む。これらの種の疾患は、血管形成を促進する組成物により治療可能である。
【００８２】
本発明による方法は、インビボ動物モデルにおいて試験し、望ましい予防のまたは療法の活性を確認し、並びにヒトに投与する前に最適な療法の用量を決定することが可能である。
【００８３】
治療の特定の方法において有効であるであろう特定のＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの量は、年齢、治療しようとする状態の型および重症度、体重、治療の望ましい期間、投与の方法、ならびに他のパラメーターに依存する。有効な用量は、医師または他の有資格の医学専門家により決定される。典型的な有効な用量は、およそ０．０１ｍｇ／ｋｇからおよそ１００ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの好ましい態様において、用量はおよそ０．１−５０ｍｇ／ｋｇであり、いくつかの好ましい態様において、用量は０．５−１０ｍｇ／ｋｇである。局所投与のための用量は、典型的には全身投与のためよりも少ない。いくつかの態様において、一回の投与が十分であり；いくつかの態様において、ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、１またはそれより多くの日数に渡って複数の用量として投与される。
【００８４】
ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、典型的には１またはそれより多くの薬理学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物の形態で投与される。医薬的に許容できる担体は、投与の経路について医薬的に許容できる希釈剤、増量剤、アジュバント、賦形剤、およびビヒクル、ならびに適した分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を使用して処方される、水性のまたは油性の懸濁液であってよい。
【００８５】
医薬的に許容できる担体は、一般的に無菌であり、そして発熱性剤がなく、そして水、油、溶媒、塩、糖、および他の炭水化物、乳化剤、緩衝剤、抗菌剤、およびキレート剤を含んでよい。特定の医薬的に許容できる担体および担体に対する活性化合物の比は、組成物の溶解度および化学特性、投与の方式、ならびに標準の医薬実務により決定される。
【００８６】
本明細書に記載される組成物は、バイアル、ビン、チューブ、シリンジ吸入器または単一のもしくは複数の投与のために他の容器の中に含まれることが可能である。そのような容器は、ガラス、または例えばポリプロピレン、ポリエチレン、若しくはポリビニルクロリドのようなポリマー材料から作られることが可能である。好ましい容器は、シール、または一回の用量を引き出すために針により貫通することができ、次いで針を引き抜くと再びシールされるゴムのストッパーのような封入システムを含んでよい。当該技術分野において公知の、注射できる液体、凍結乾燥処方物、再構成凍結乾燥処方物または注射のための再構成可能な粉末のための、あるいはエアロゾル化組成物の投与のためのそのような容器全ては、本明細書で開示された組成物および方法における使用が考慮される。
【００８７】
ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、徴候に適切な方式で患者に投与される。したがって、例えば、ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストまたはその医薬組成物は、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内、鼻腔内、硬膜外、経口、局所、皮下、腔内、埋め込み物からの持続的放出、蠕動経路、またはいずれかの他の適した技術により投与可能である。非経口投与が好ましい。
【００８８】
本発明の特定の方法において、治療は、１つまたはそれより多くの追加の化学療法剤で哺乳動物を治療することをさらに含んでなる。追加の化学療法剤は、ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの投与の前に、または同時に、または後に投与可能である。治療されている哺乳動物が充実性腫瘍を有しているとき、１以上の化学療法剤の使用は特に有用である。本発明のいくつかの態様において、治療は、放射線で哺乳動物を治療することをさらに含んでなる。近接療法および遠隔療法を含む放射線は、第二化学療法剤および／またはＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの投与の前に、または同時に、または後に投与可能である。
【００８９】
治療されている哺乳動物が充実性腫瘍を有しているとき、方法は、好ましくはＴＷＥＡＫＲアンタゴニストに加えて、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、および他の植物由来化学療法剤、ニトロソウレア、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血球因子、放射線療法剤、および生物学的応答修飾剤からなる群より選択される１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９０】
いくつかの好ましい態様において、方法はＴＷＥＡＫＲアンタゴニストに加えて、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、およびビンブラスチン、インターロイキンのようなリンホカインおよびサイトカイン、インターフェロン（アルファ、ベータ、デルタを含む）、およびＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌアスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９１】
いくつかの好ましい態様において、方法はＴＷＥＡＫＲアンタゴニストに加えて、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１またはＫＤＲとしても知られるＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２を含む）アンタゴニスト、Ｔｅｋアンタゴニスト、およびＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰおよびＰＴＰＲＪとして言及される、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２１３５−４５、１９９９を参照されたい）アゴニスト、からなる群より選択される、その種々の可溶性型を含む１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。いくつかの好ましい態様において、本発明のＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、ＢｒｏｗｄｅｒらおよびＫｌｅｍｅｎｔら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ６０：１８７８、２０００；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８）：Ｒ１５、２０００；Ｂａｒｉｎａｇａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２４５、２０００もまた参照されたい）により記載されるような「メトロノミック（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ）療法」の成分として、または組み合わせて使用される。
【００９２】
本発明のポリペプチド、組成物および方法は、初期療法に続いて残った疾患の治療のための一次治療として、または化学療法、外科手術、放射線、および当該技術分野で公知の他の療法の方法を含む他の療法の付加物として使用可能である。
【００９３】
本発明の核酸配列は、本明細書に開示された方法に従って配送されるとき、該配列が発現のための細胞中に取り込まれることができるように、配送機構を使用する利点がある。考慮された方法を有利にも採用可能である配送システムは、例えば、レトロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス配送システム、ならびに非ウイルス配送システムの使用を含む。そのような配送システムは、当業者に周知である。
【００９４】
スクリーニングの方法
本明細書に記載されるＴＷＥＡＫ受容体は、例えばＴＷＥＡＫＲアゴニストおよびアンタゴニストを単離するスクリーニングの種々の方法において使用可能である。ＴＷＥＡＫＲアゴニストは、ＴＷＥＡＫＲの生物学的活性を促進する化合物であり、そしてＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、ＴＷＥＡＫＲの生物学的活性を阻害する化合物である。後述のスクリーニングアッセイを介して同定された化合物は、種々の疾患状態を治療するための血管形成を変調するための組成物および方法において使用可能である。本発明は、（１）標的組織または細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドの遺伝子発現を変調し、（２）ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用を変調して、血管形成を調節し；（３）ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドに結合して、血管形成に影響を及ぼし；または（４）血管形成のような下流の事象への結合したＴＷＥＡＫ受容体−リガンド複合体の影響を干渉する、または調節する、化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００９５】
本発明は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の活性を変調する（即ち、ＴＷＥＡＫ遺伝子の発現のレベルを変調する、および／またはＴＷＥＡＫ遺伝子産物の活性のレベルを変調する）化合物を同定するために設計されたアッセイの使用を意図している。アッセイはＴＷＥＡＫ遺伝子調節配列（例えば、プロモーター配列；例えば、Ｐｌａｔｔ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２８５５８−２８５６２を参照されたい）に結合し、そしてＴＷＥＡＫ遺伝子発現のレベルを変調可能な化合物を同定することに、さらに利用可能である。
【００９６】
そのようなアッセイは、例えば、通常のＴＷＥＡＫ遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすと思われる試験化合物を含むシステムと比較して、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の転写および翻訳が起こる制御システムを使用することを包含してもよい。例えば、心臓細胞により産生されるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの比率は決定可能であり、そしてこれを使用して、試験化合物がこの比率に影響を及ぼすか否かが決定可能である。この正常な転写比率に影響を及ぼすと思われる試験化合物の影響を評価するために、まず、例えばノーザンブロッティングにより心臓細胞培養物におけるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡ産生の比率が決定されるであろう。次いで、対照培養と他は同じ条件下で、心臓細胞培養物に試験化合物を投与することができる。次いで、試験化合物で処理された培養物におけるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの比率は、例えばノーザンブロッティングにより決定可能であり、そして対照培養細胞により産生されたＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの比率と比較される。対照細胞に比べて試験化合物と接触した細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの増加は、心臓細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体遺伝子の転写および／または翻訳の刺激物質の指標であり、一方、減少は心臓細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体遺伝子の転写および／または翻訳の阻害剤の指標である。
【００９７】
ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現のレベルを決定するために使用可能である他の種々の方法があり、そしてアッセイにおいてさらに使用し、試験化合物のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現のレベルに対する影響をさらに決定可能である。例えば、心臓のようにＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子を発現することが知られる、または思われる細胞型または組織からのＲＮＡは単離可能であり、そしてハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術を利用して試験可能である。単離された細胞は、細胞培養物からまたは患者に由来することが可能である。培養物からとられた細胞の解析は、細胞に基づく遺伝子治療技術の一部として、使用される細胞の評価において、あるいは化合物のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の発現に対する影響を試験するために必要な工程である。そのような解析は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現の活性化または不活性化を含む、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の発現パターンの定量的なおよび定性的な側面の両方を明らかにすることができる。
【００９８】
そのような検出スキームの１つの態様において、ｃＤＮＡ分子は目的のＲＮＡ分子から合成される（例えば、ｃＤＮＡへのＲＮＡ分子の逆転写による）。次いで、ｃＤＮＡ中の配列は、核酸増幅反応、例えばＰＣＲ増幅反応などのための鋳型として使用される。本方法の逆転写工程および核酸増幅工程において、合成開始反応物（例えば、プライマー）として使用される核酸反応物は、上述のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子核酸部分の中から選択される。そのような核酸反応物の好ましい長さは、少なくとも９−３０ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、核酸増幅は、放射活性または非放射活性標識ヌクレオチドを使用して実行可能である。あるいは、十分に増幅した産物は、標準のエチジウムブロマイド染色による、またはいずれか他の適した核酸染色方法を利用することにより、産物が可視化できるように、十分に増幅した産物を生成可能である。
【００９９】
加えて、そのようなＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現アッセイを「ｉｎ ｓｉｔｕ」（即ち、核酸増幅が必要でないような生検または切除から得られた患者組織の組織切片（固定したおよび／または凍結した）上で直接的に）で実行することができる。上記のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子核酸部分は、そのようなｉｎ ｓｉｔｕ手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用可能である（例えば、Ｎｕｏｖｏ．Ｇ．Ｊ．、１９９２「ＰＣＲ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照されたい）。
【０１００】
本明細書に記載するもののようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用により影響される血管形成を変調に有用であり得る。ＴＷＥＡＫに影響される血管形成を刺激するまたは阻害するそのような方法は、本明細書で検討された。
【０１０１】
あるいは、アッセイシステムを設計して、本発明のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドポリペプチドと結合でき、そしてそれにより、この相互作用から生じる血管形成に影響を及ぼすことができる化合物を同定可能である。同定された化合物は、例えば、標的組織または細胞の血管新生の変調に有用であり得るし、正常なＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用を崩壊させる化合物を同定するためのスクリーニングに有用であり得るし、またはそれ自体がそのような相互作用を崩壊しうる。
【０１０２】
ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドに結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、２つの成分を相互作用しそして結合することができるために十分な条件下および時間の間、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドおよび試験化合物の反応混合物を調製し、したがって反応混合物中に取り除かれそして／または検出され得る複合体を形成することを包含する。これらのアッセイは多様な方法で行われることができる。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体と結合する化合物をスクリーニングするそのようなアッセイを行う１つの方法は、ＴＷＥＡＫ受容体または試験基質を固相上にアンカーし、そして反応の終わりに固相上にアンカーされたＴＷＥＡＫ受容体／試験化合物複合体を検出することを包含するであろう。そのような方法の１つの態様において、ＴＷＥＡＫ受容体は固相表面上にアンカー可能であり、そしてアンカーされていない試験化合物を直接的にまたは間接的にのいずれかで標識してもよい。あるいは、これら同様の方法を使用して、受容体よりもむしろＴＷＥＡＫリガンドに結合する試験化合物をスクリーニング可能である。
【０１０３】
実際のところ、マイクロタイタープレートは固相として都合良く利用可能である。アンカーされた成分は、非共有または共有結合により固定化可能である。非共有結合は、タンパク質の溶液で固相表面を単純にコートし、そして乾燥することにより実行可能である。あるいは、固定化しようとするタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固相表面にアンカー可能である。表面は、あらかじめ調製され、そして保存可能である。
【０１０４】
アッセイを行うために、非固定化成分が、アンカーした成分を含有するコートされた表面に付加される。反応が完了した後、いかなる形成された複合体も固相表面上に固定化されたまま保持されるであろうような条件下で、非反応成分を除去する（例えば、洗浄による）。固相表面上にアンカーした化合物の検出は、多くの方法で実行可能である。前に固定化されていない成分があらかじめ標識されている場合、表面に固定化された標識の検出が複合体の形成を示唆する。前に固定化されていない成分があらかじめ標識されていない場合、間接標識を使用して、表面にアンカーされた複合体を検出可能であり；例えば、それは前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体を使用する（今度は、抗体が直接的に標識されていてもよく、あるいは標識抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されていてもよい）。
【０１０５】
あるいは、反応は液相中で行われ、反応産物を非反応成分から分離し、複合体を検出可能であり；例えば溶液中に形成したいずれかの複合体をアンカーするためのＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドまたは試験化合物に特異的な固定化抗体を使用し、およびアンカーした複合体を検出するための可能性のある複合体の他の成分への特異的な標識抗体を使用する。
【０１０６】
ＴＷＥＡＫ受容体またはＴＷＥＡＫリガンドのいずれかへの結合剤として同定されたこれらの成分は、以下に記載されるようにＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用を干渉し、そしてそれによりＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用から生じる血管形成を抑制しまたは促進するそれらの能力についてさらに評価可能である。次いで、そのような化合物を療法的に使用して、血管形成を刺激するまたは阻害することが可能である。
【０１０７】
本発明のＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドポリペプチドは、スクリーニングアッセイにおいて使用し、ＴＷＥＡＫ受容体とリガンド間の相互作用を阻害する（アンタゴナイズする）か増進する（アゴナイズする）かのいずれかの、開示されたＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドと特異的に相互作用する化合物および低分子を同定することも可能である。したがって、例えば本発明のポリペプチドを使用して、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物混合物から、アンタゴニストおよびアゴニストを同定可能である。アンタゴニストおよびアゴニストは、本発明のポリペプチドの天然または修飾基質、リガンド、酵素、受容体などであってよく、または該ポリペプチドの構造的または機能的模倣体であってよい。本発明のＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用の可能性のあるアンタゴニストは、ポリペプチドに結合しそしてポリペプチドの結合部位を占め、それらの相互作用を利用できなくさせ、そしてしたがって血管形成を変調するそれらの正常な能力を妨げる低分子、ペプチドおよび抗体であってよい。他の可能性のあるアンタゴニストは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズ可能であり、そしてｍＲＮＡの本発明のポリペプチドへの翻訳を遮断するアンチセンス分子である。可能性のあるアゴニストは、本発明のＴＷＥＡＫポリペプチドに結合し、そして本発明のＴＷＥＡＫポリペプチドの開示された相互作用により引き起こされるような血管形成に影響を及ぼす低分子、ペプチドおよび抗体を含む。
【０１０８】
低分子アゴニストおよびアンタゴニストは、通常１０Ｋ分子量未満であり、そして細胞浸透性を増進し、分解に抵抗し、そしてそれらの生理学的半減期を延長する多くの生理化学的および薬理学的特性を保持することができる。（Ｇｉｂｂｓ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」 Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．７９，（１９９４））。そのままの分子、ならびにＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片のような断片を含む抗体を使用して、シグナルカスケードの開始を遮断することにより本発明のポリペプチドに結合しそして阻害することが可能である。抗体がヒト化されていることが好ましく、そして抗体がヒトであることがより好ましい。本発明の抗体はいずれかの種々の公知の方法により調製可能である。
【０１０９】
特異的スクリーニング方法は当該技術分野で公知であり、そして多くは、多数の試験化合物を短い時間内にスクリーニング可能になるように、ハイスループット試験システム中に大規模に取り入れられている。該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、細胞に基づくアッセイなどを含む種々の形式において実行可能である。これらのアッセイの形式は、当該技術分野で周知である。本発明のスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーのスクリーニングに敏感であり、そして低分子薬剤候補、抗体、ペプチドならびに他のアンタゴニストおよびアゴニストの同定に適している。
【０１１０】
ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用をアンタゴナイズするまたは阻害する分子の同定のための方法の１つの態様は、本発明のポリペプチドを発現する細胞を含有する培地に候補分子を添加し；候補分子の存在のためではなく、ポリペプチドが相互作用するように前記培地の条件を変化させ；そして結合および血管形成の阻害を観察することを包含する。ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドの結合は、以上で概説した競合的阻害アッセイにより決定可能であり、そして当該技術分野で周知である。この結合の血管形成効果は、例えば細胞密度アッセイ、または当該技術分野でまた周知である他の細胞増殖アッセイのような細胞増殖アッセイを介して決定してもよい。次いで、候補分子と接触した細胞の活性を、接触していない同じ細胞と比較してよく、そして本発明のＴＷＥＡＫポリペプチド相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストが同定してもよい。生物学的活性の測定は、存在するタンパク質の量の測定（例えば、ＥＬＩＳＡ）またはタンパク質の活性の測定のような多くの周知の方法により実行可能である。生物学的刺激または活性の減少は、アンタゴニストを示唆する。増加はアゴニストを示唆する。
【０１１１】
スクリーニングアッセイを設計し、本発明のＴＷＥＡＫポリペプチド相互作用から生じる生物学的活性を模倣する分子をさらに発見可能である。ポリペプチドの生物学的活性を模倣する分子は、ポリペプチドの生物学的活性を増進するために有用であり得る。ポリペプチドの生物学的活性を模倣する療法活性剤のための化合物を同定するために、候補分子がポリペプチドに結合するか否かをまず決定しなければならない。次いで、結合候補分子は、その生物学的効果を決定するために生物学的アッセイに加えられる。次いで、候補分子の生物学的効果をポリペプチドのものと比較する。
【０１１２】
加えて、試験化合物および正常なＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内の複合体形成を、試験化合物および突然変異体ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内の複合体形成と比較可能してもよい。突然変異体の相互作用を崩壊するが、正常なＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子タンパク質は崩壊しない化合物の同定が望ましい場合において、この比較は重要であり得る。
【０１１３】
ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドの遺伝子産物および結合パートナーの相互作用を干渉する化合物のアッセイは、異種のまたは同種の形式で行うことが可能である。異種アッセイは、固相上にＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物または結合パートナーのいずれかをアンカーし、そして反応の終わりに固相上のアンカーされた複合体を検出することを包含する。同種アッセイにおいて、全反応は液相中で行われる。いずれのアプローチにおいて、反応物の添加の順序を変更して、試験されている化合物に関する異なった情報を得ることが可能である。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物および結合パートナー間の相互作用を干渉する（例えば、競合による）試験化合物は、試験基質の存在下で反応を行うことによって同定可能であり；即ち、ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンド遺伝子産物の前に、または同時に、反応混合物に試験基質を追加することによる。あるいは、例えば複合体から成分の１つを置き換えた高い結合定数を有する化合物のような、あらかじめ形成された複合体を崩壊する試験化合物は、複合体が形成された後に、反応混合物に試験化合物を添加することにより試験可能である。多様な形式が以下で手短に記載される。
【０１１４】
異種アッセイシステムにおいて、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物のいずれかが固相表面上にアンカーされ、一方、非アンカー種は直接または間接のいずれかで標識される。実際上は、マイクロタイタープレートが都合良く利用される。アンカーされた種は、非共有または共有結合により固定化されうる。非共有結合は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物の溶液で固相表面をコートし、そして乾燥することにより簡単に実行可能である。あるいは、アンカーしようとする種に特異的な固定化抗体を使用して、種を固相表面にアンカー可能である。表面は、あらかじめ調製され、そして保存可能である。
【０１１５】
アッセイを行うために、固定化種のパートナーは、試験化合物ありのまたはなしのコートされた表面に曝される。反応が完了した後に、非反応化合物を除去し（例えば、洗浄により）、そしていずれかの形成された複合体が固相表面上に固定化されて残るであろう。固相表面上にアンカーされた複合体の検出は、多くの方法により実行可能である。非固定化種があらかじめ標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示唆する。非固定化種があらかじめ標識されていない場合、間接標識を使用して表面上にアンカーされた複合体を検出可能であり；例えば、はじめの非固定化種に特異的な標識抗体を使用する（今度は、該抗体が直接的に標識され、または標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識可能である）。反応成分の追加の順序に依存して、複合体形成を阻害するまたは複合体形成を崩壊する試験化合物が検出可能である。
【０１１６】
あるいは、反応は、試験化合物の存在下または非存在下の液相中で行われ、反応産物を非反応成分から分離し、そして複合体を検出し；例えば、溶液中で形成されたいずれかの複合体をアンカーするための結合成分の１つに特異的な固定化抗体、およびアンカーされた複合体を検出するための他のパートナーに特異的な標識抗体を使用する。再び、液相への反応物の添加の順序に依存して、複合体を阻害しまたはあらかじめ形成された複合体を崩壊する試験化合物を同定可能である。
【０１１７】
本発明の代わりの態様において、同種アッセイが使用可能である。このアプローチにおいて、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物のあらかじめ形成された複合体は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかが標識されて調製されるが、標識により生成されたシグナルは複合体形成のために消される（例えば、免疫アッセイのためにこのアプローチを利用する、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎの米国特許４，１０９，４９６号を参照されたい）。実行された複合体と競合し、そして該複合体由来の種の１つを置き代える試験基質の添加は、上述の背景のシグナルの生成という結果となる。この方法において、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物相互作用を崩壊する試験化合物を同定可能である。
【０１１８】
特定の態様において、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物は、組換えＤＮＡ技術を使用して固定化のために調製可能である。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体のまたはリガンドのコード領域は、結果生じる融合タンパク質においてその結合活性が維持されるような方式で、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合可能である。当該技術分野で日常的に実施される方法を使用して、相互作用結合パートナーは精製され、そして使用され、そしてモノクローナル抗体を作ることが可能である。この抗体は、例えば当該技術分野で日常的に実施される方法により、放射性同位体〈１２５〉Ｉで標識可能である。異種アッセイにおいて、例えばＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズにアンカー可能である。次いで、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物は、相互作用および結合が生じることが可能な方式で、試験化合物の存在または非存在下で添加可能である。反応時間の終わりに、非結合材料を洗浄可能であり、そして標識モノクローナル抗体を該システムに添加し、そして複合体形成した成分に結合することが可能である。ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンド遺伝子産物間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに結合したまま残る放射活性の量を測定することにより検出可能である。試験化合物による相互作用の成功した阻害は、測定された放射活性の減少に帰着するであろう。
【０１１９】
あるいは、ＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体遺伝子融合タンパク質およびＴＷＥＡＫリガンド遺伝子産物（または、その逆）は、固相のグルタチオン−アガロースビーズの非存在下で液中で共に混合可能である。試験化合物は、種が相互作用できる間、またはその後のいずれかに追加可能である。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加可能であり、そして非結合材料は洗浄される。再び、ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド遺伝子産物相互作用の阻害の程度は、標識抗体を追加し、そしてビーズと結合した放射活性を測定することにより検出可能である。
【０１２０】
本発明のもう１つの態様において、これら同様の技術が、１つまたは両方の全長タンパク質の代わりに、ＴＷＥＡＫ受容体および／またはリガンドタンパク質の結合ドメインに対応するペプチド断片を使用して、採用可能である。当該技術分野で日常的に実行される任意の数の方法を使用して、結合部位を同定しそして単離することが可能である。これらの方法は、限定はされないが、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発、および免疫共沈アッセイにおける結合の崩壊のスクリーニングを含む。次いで、複合体における第二の種をコードする遺伝子の代償性突然変異が選択可能である。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列解析は、相互作用結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにするであろう。あるいは、あるタンパク質を本項目の上に記載した方法を使用して固相表面にアンカー可能であり、そしてトリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理した、その標識された結合パートナーと相互作用しそして結合することができる。洗浄後、結合ドメインを含んでなる短い標識されたペプチドは固相材料と結合したままであることができ、それは単離され、そしてアミノ酸配列決定により同定可能である。また、部分をコードする遺伝子を遺伝子工学処理して、タンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いでそれを結合活性および精製または合成のために試験することができる。
【０１２１】
例えば、限定する目的ではないが、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物は、ＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド融合タンパク質を生成し、そしてグルタチオンアガロースビーズに結合可能にすることにより、本項目において上で記載したように固相材料にアンカー可能である。得られた相互作用結合パートナーは、〈３５〉Ｓのような放射性同位体で標識可能であり、そしてトリプシンのようなタンパク質分解酵素で切断可能である。次いで、切断産物は、アンカーされたＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体融合タンパク質またはＴＷＥＡＫリガンド融合タンパク質に添加することができ、そして結合可能である。非結合ペプチドの洗浄後、結合パートナー結合ドメインを表わす標識結合材料は、周知の方法により溶出され、精製され、そしてアミノ酸配列決定の解析が可能である。そのように同定されたペプチドは合成的に生成可能であり、または組換えＤＮＡ技術を使用して適切な容易にするタンパク質に結合可能である。
【０１２２】
インビボの本発明のＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用は、細胞または組織の標的群における血管形成を刺激するか阻害するかのいずれかであるカスケードの事象を開始する。核酸分子、タンパク質、または低分子のような分子は、今度はこのカスケードに影響を及ぼす。この方法でＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用効果を崩壊する化合物は、血管形成の調節に有用であり得る。
【０１２３】
ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用の血管形成または抗血管形成効果を干渉する化合物を同定するために使用されるアッセイシステムの基本原理は、ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドが相互作用しそして結合し、よって複合体を形成することが可能なために十分な条件下および時間の間で、ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドを含有する反応混合物を調製することを包含する。この相互作用の効果の阻害活性のための化合物を試験するために、反応混合物は試験化合物の存在下および非存在下において調製される。試験化合物ははじめ反応混合物中に含んでもよく、あるいはＴＷＥＡＫ受容体−リガンド複合体の添加に続く時間に添加してもよい。対照反応混合物は、試験化合物なしで、または偽薬と共にインキュベートされる。次いで、血管新生に対するＴＷＥＡＫ複合体のいずれかの効果の阻害または強化を検出する。試験化合物を含有する反応混合物中ではなく、対照反応における正常な血管形成応答は、化合物がＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用により開始されるカスケードの事象を干渉することを示唆する。試験化合物を含有する培養における増進した血管形成は、ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド複合体効果の刺激物質を示唆する。
【０１２４】
続く実施例は特定の態様を説明することを意図するものであり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体のクローニングおよび同定を示す。
ＴＷＥＡＫ受容体ｃＤＮＡの発現クローニング
ＴＷＥＡＫ受容体ｃＤＮＡをクローニングするために、ヒトＴＷＥＡＫの増殖ホルモンリーダー、ロイシンジッパーマルチマー化ドメイン、およびＣ末端細胞外ドメインをコードする発現ベクター（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（５１）：３２４０１，１９９７を参照されたい）を構築した。ｐＤＣ４０９−ＬＺ−ＴＷＥＡＫと命名されたこの発現ベクターは、配列番号１のＤＮＡ配列を含んでなり、そして配列番号２のポリペプチドをコードする。ｐＤＣ４０９−ＬＺ−ＴＷＥＡＫ馴化上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を、ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞に一過的にトランスフェクションすることにより産生した。ロイシンジッパーに対するマウスモノクローナル抗体とあらかじめインキュベートしたポリクローナルヤギ抗マウス抗体でコートした磁性ビーズと、これらの上清をインキュベートした。対照ビーズは、空ベクターでトランスフェクトした細胞からの上清でコートしたビーズを混合することにより生産した。
【０１２６】
Ｔ１７５フラスコ中で増殖した単層のＣＯＳ細胞を、ＨＵＶＥＣのｃＤＮＡ発現ライブラリーからの１００，０００の複雑性の１５μｇのＤＮＡプールでトランスフェクトした。２日後、これらの細胞をフラスコから引き上げ、そして５％無脂肪乾燥ミルクを加えた１．５ｍｌの結合培地中、回転装置ホイール上で３時間、４℃でインキュベートした。細胞を対照ビーズの添加により前清澄して、４℃でさらに４５分間回転し、その後ビーズに結合した細胞を磁石で取り除いた。前清澄を２−３回繰り返し、次いでＴＷＥＡＫコートビーズを細胞に添加し、そして３０分間、４℃で回転した。細胞が結合したＴＷＥＡＫビーズを、磁石を用いて分離し、そして４ｘＰＢＳ中で洗浄した。プラスミドＤＮＡを０．１％ＳＤＳ中で溶解することによってこれらの細胞から抽出し、そしてＤＨ１０１Ｂ細胞中の上清をエレクトロポレーションした。コロニーをアンピシリン選択培地上で一晩増殖させた。形質転換体をプールし、そしてさらなるパニングの回のためにプラスミドＤＮＡの供給源として使用した。２回のパニングの後、以下のパートＢに記載するようなスライド結合プロトコルを使用してＴＷＥＡＫに結合するそれらの能力に基づいて、結果生じたプールからポジティブクローンを選び取った。
【０１２７】
ヒトＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫＲとも呼ばれる）のｃＤＮＡが配列番号３の配列を有することを決定し、それは１２９残基のポリペプチドをコードした（配列番号４）。配列の検討により、およそ７８アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号４の１−７８番目の残基、シグナルペプチドを含む）、およそ２３アミノ酸の膜貫通ドメイン（配列番号４の７９−１０１番目の残基）、およびおよそ２８アミノ酸の細胞内ドメイン（配列番号４の１０２−１２９番目の残基）を有するポリペプチドが予測される。ＴＷＥＡＫＲは、最も小さい公知のＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。他のＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーの３−４繰り返しに比較して、それは細胞外ドメインに単一のシステインに富んだ繰り返し領域を有する。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、以前にヒト肝臓ｃＤＮＡクローンによりコードされた膜貫通タンパク質として記載されたが（ＷＯ９８／５５５０８、ＷＯ９９／６１４７１もまた参照されたい）、ＴＷＥＡＫ受容体として同定されなかった。マウスホモログのＦＧＦ−誘導可能（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ） Ｆｎ１４（Ｍｅｉｇｈａｎ−Ｍａｎｔｈａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４６）３３１６６，１９９９）は、図１の並列により示されたヒトタンパク質におよそ８２％の同一性である。
【０１２８】
新たに同定されたＴＷＥＡＫ受容体を、ＴＷＥＡＫに結合する能力について、ＤＲ３（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ８：５２５、１９９８によりＴＷＥＡＫ受容体として同定されている）と並べて試験した。
【０１２９】
Ｂ．ＴＷＥＡＫに結合するＴＷＥＡＫ受容体
ＣＯＳ細胞のスライドを、ＴＷＥＡＫＲ、ＤＲ３または挿入無しのベクター（対照）を含有する発現ベクターでトランスフェクトした。２日後、ロイシンジッパーＴＷＥＡＫ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードするベクターでトランスフェクトしたＣＶ−１細胞からの濃縮上清とインキュベートした。１時間後、細胞を洗浄し、そしてロイシンジッパードメインに対するＩ−１２５標識抗体で精査した（ｐｒｏｂｅ）。スライドを洗浄し、固定し、そしてＸ線フィルムを使用してオートラジオグラフィーを実行した。ＴＷＥＡＫＲトランスフェクト細胞は、かなりの量のＴＷＥＡＫに結合した。ＴＷＥＡＫは、ＤＲ３でトランスフェクトした細胞または対照細胞に結合しなかった。この実験は、ＤＲ３よりむしろ、上のパートＡにおいて同定されたＴＷＥＡＫＲポリペプチドが、ＴＷＥＡＫの主要な受容体であることを確認した。機能的ＴＷＥＡＫ受容体の発見の後、他の研究者もまた、ＤＲ３はＴＷＥＡＫへの主要な受容体ではないと報告した（Ｋａｐｔｅｉｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４８５（２−３）：１３５，２０００）。ＴＷＥＡＫ−ＴＷＥＡＫＲ結合相互作用を、スキャッチャード解析によりさらに特徴付けた。
【０１３０】
ＣＶ−１細胞をヒト全長ＴＷＥＡＫでトランスフェクトし、そしてＴＷＥＡＫを発現しないＲａｊｉ細胞と１：３０で混合した。該細胞を、１２５−Ｉ標識ヒトＴＷＥＡＫ受容体−Ｆｃの連続希釈で、２時間、４℃でインキュベートした。フリーのおよび結合したプローブを、プラスチックチューブ中のファレート（Ｐｈａｌａｔｅ）オイル混合物を通じて試料をマイクロフュージングする（ｍｉｃｒｏｆｕｇｉｎｇ）ことにより分離した。上清およびペレットをガンマ線カウントした。ＴＷＥＡＫリガンド結合ＴＷＥＡＫ受容体のスキャッチャード解析は、およそ４．５ｘ１０８Ｍ−１の結合アフィニティー定数（Ｋａ）を示した。
【０１３１】
Ｃ．ＴＷＥＡＫ受容体は、心臓組織において強く発現する
ＴＷＥＡＫ受容体の発現パターンを決定するために、ノーザンブロット解析を実行した。ヒト複数組織ノーザンブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カルフォリニア州パロアルト）から購入し、そしてＴＷＥＡＫ受容体コード領域からＰ−３２標識ランダムプライム化ＤＮＡで精査した。ブロットを洗浄し、そしてＸ線フィルムを使用してオートラジオグラフィーを実行した。結果は、大人において、ＴＷＥＡＫＲが心臓、胎盤、およびいくつかの骨格筋試料において発現するということを示した。心臓組織における強い発現が、心臓疾患の診断および治療におけるＴＷＥＡＫＲの有用性をさらに支持した。大人とは反対に、胎児の組織はＴＷＥＡＫＲをより普遍的に発現し；ＴＷＥＡＫＲ転写物が肺および肝臓において見られた。
【０１３２】
実施例２
本実施例は、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体Ｆｃ（ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ）融合ポリペプチドの組換え産生を示す。
【０１３３】
Ｆｃに融合したＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインをコードする核酸を構築するために、リーダー（シグナルペプチド）を含む、ＴＷＥＡＫＲ由来のＮ末端７９アミノ酸をコードする核酸を、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分をコードする核酸に接合した。この構築体の配列を配列番号６（核酸）および配列番号７（アミノ酸）として示す。配列番号７において、１−２７番目の残基は、予測されたシグナルペプチド（細胞から分泌される際に切断されることが予想される；実際の切断部位はＮ末端配列解析により同定された、以下を参照されたい）であり、２８−７９番目の残基は、システインに富んだＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメイン由来であり、８０−８１番目の残基はＢｇｌＩＩクローニング部位由来であり、そして残りはＦｃ部分である。哺乳動物発現ベクター中に挿入し、そして哺乳動物宿主細胞において発現しそして哺乳動物宿主細胞から分泌する際に、この構築体はＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃに指定されたポリペプチドを産生する。Ｎ末端配列解析は、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃに指定される分泌されたポリペプチドが、配列番号７の２８番目の残基（Ｇｌｕ）に対応するＮ末端を有することを決定した。ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃの抗血管形成活性は、続く実施例により記載されるもののようなアッセイを使用して実証された。Ｆｃ−融合構築体の類似体を、マウスＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインを使用して調製した。
【０１３４】
実施例３
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な平面内皮細胞移動（創傷閉鎖）アッセイを示す。このアッセイにおいて、内皮細胞移動を、培養された細胞単層における円形創傷の閉鎖の比率として測定する。創傷閉鎖の比率は直線状であり、そしてインビボでの血管形成を刺激しそして阻害する剤により劇的に調節される。
【０１３５】
初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞であるＨＲＭＥＣを単離し、培養し、そしてＭａｒｔｉｎら，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３：２６１，１９９７に記載されるように、解凍後に３回継代で使用した。複製円形損傷である「創傷」（６００−８００ミクロンの直径）を、シリコン先端ドリルプレスを使用して集密ＨＲＭＥＣ単層において生成した。創傷時に、培地（ＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡ）を、２０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（フォルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸塩）、ＥＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）、および０．１５０〜５μｇ／ｍｌ ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ、または４０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦおよび０．１５０〜５μｇ／ｍｌＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃの組み合わせで補った。残った創傷面積を、顕微鏡および画像解析ソフトウエア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ，テネシー州ナッシュビル）を使用して、機能時間（０−１２時間）として測定した。相対的な移動比率を、時間とともにプロットされた残った創傷面積の直線回帰により、各剤のおよび剤の組み合わせについて計算した。結果を図２−３に示す。
【０１３６】
ｈｕＩｇＧまたは培地＋ＢＳＡに比較して、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは用量に応答する方式でＰＭＡ誘導内皮移動を阻害し、５μｇ／ｍｌで非刺激レベルに移動の比率を減じた（図２）。ｈｕＩｇＧもＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃも、基礎（非誘導性）移動を阻害しなかった。ＨＲＭＥＣ移動がＥＧＦにより誘導された時、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは、用量依存的な方式で内皮移動を阻害し、５μｇ／ｍｌで非刺激レベルに移動の比率を減じた（図３）。
【０１３７】
実施例４
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な、マウス角膜ポケットアッセイを示す。このアッセイにおいて、血管形成活性または抗血管形成活性について試験される剤は、ヒドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレット中に持続放出形態で固定され、それは麻酔されたマウスの角膜上皮に作られたマイクロポケット中に埋め込まれる。血管新生を、外見、密度、および通常の無血管の角膜中に、血管新生した角膜縁から内側に増殖した血管の範囲として測定する。
【０１３８】
Ｋｅｎｙｏｎら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｍｏｌ．＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ３７：１６２５，１９９６に記載されるように、ヒドロンペレットは、ｂＦＧＦ（９０ｎｇ／ペレット）、ｂＦＧＦおよびＩｇＧ（１４μｇ／ペレット、対照）、またはｂＦＧＦおよびＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ（１４μｇ）とスクラルファートを取り込んだ。ペレットを、６−８週齢のオスＣ５７ＢＬマウスの後方角膜縁の中央１ｍｍを顕微解剖により作った、角膜ストロママイクロポケット中に外科的に埋め込んだ。５日後、ｂＦＧＦの新血管新生反応のピークに、ペレットを含有する線の極軸から３５−５０°の初期角で、Ｚｅｉｓｓスリットランプを使用して、角膜を写真撮影した。画像をデジタル化し、そして差し引きカラーフィルター（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ４．０）により処理し、ヘモグロビン含量により、確立した微小血管を線引きした。画像解析ソフトウエア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ，テネシー州ナッシュビル）を使用して、血管新生した角膜画像、血管新生した範囲中の血管密度、および全角膜中の血管密度の比を計算した。
【０１３９】
表１に示されるように、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ（１００ｐｍｏｌ）は、ｂＦＧＦ（３ｐｍｏｌ）誘導角膜血管形成を阻害し、ＦＧＦ単独またはＦＧＦ＋ＩｇＧにより誘導される血管密度に対して５０％減少した。
【０１４０】
表１
マウス角膜ポケットアッセイにおけるＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＦＧＦ誘導血管形成に対する効果
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
実施例５
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な内皮細胞増殖アッセイを示す。このアッセイにおいて、カルセインＡＭと呼ばれる細胞標識分子を使用して、マイクロタイターウェル中の４日目の細胞増殖後に、内皮細胞増殖を測定する。細胞により発現したエステラーゼはカルセインを切断し、そして４８５ｎｍで励起したときそれは蛍光を生じる。非切断カルセインは蛍光を発しない。蛍光の量は、直接的に培養ウェル中の内皮細胞の数に関係する。内皮細胞増殖は、インビボでの血管形成を刺激しおよび／または阻害する剤によりしばしば調節される。
【０１４３】
初代ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を商業的供給源（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，メリーランド州ウォーカーズビル）から入手し、培養し、そして２から７回の継代で使用した。０．０５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を加えた内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ、増殖因子または血清を含有しない内皮細胞基礎培地であり、そしてコロラド大学のＲｉｃｈａｒｄ Ｈａｍ博士により開発された培地製剤に基づく，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）入りの各マイクロタイターウェルに３０００ＨＵＶＥＣを添加することにより、複製培養物をセットアップした。培養の開始の際に、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子−２，１０ｎｇ／ｍｌ）またはヒトＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、０．０８μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ（ＴＷＥＡＫ誘導については０．２５から２０μｇ／ｍｌ、そしてＦＧＦ−２誘導については０．０８から６．７μｇ／ｍｌ）の範囲の濃度で、ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ，対照）、またはヒトＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃの存在下で加えた。ＨＵＶＥＣ含有培養物を４日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培養４日目に、４μＭカルセイン−ＡＭを培養物に添加し、そして２時間後、ウェルを蛍光について評価した。ＳＥＭを加えたまたは引いた複製ウェルについて平均蛍光（４８５−５３０ｎｍ）カウントとして表わされた結果を図４および５に示す。
【０１４４】
ＴＷＥＡＫ誘導増殖に影響しないｈｕＩｇＧと比較して、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは用量依存的な方式でＴＷＥＡＫ誘導ＨＵＶＥＣ増殖を特異的に阻害した（図４）。加えて、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは、そうでないｈｕＩｇＧと比較して、０．０５％ＦＢＳを加えたＥＢＭにおける培養の間観察した、ＨＵＶＥＣの基礎増殖を阻害した。興味深いことに、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃはまた、ＦＧＦ−２誘導ＨＵＶＥＣ増殖反応に影響しないｈｕＩｇＧと比較して、２μｇ／ｍｌ以上の濃度でＦＧＦ−２仲介ＨＵＶＥＣ増殖を阻害した（図５）。これらの結果は、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃが外因性組換えヒトＴＷＥＡＫの添加により誘導されるＨＵＶＥＣ増殖を阻害することを示す。ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃが部分的に血清誘導ＨＵＶＥＣ増殖を阻害することは、ＨＵＶＥＣがＴＷＥＡＫＲを介してＥＣ（内皮細胞）の増殖／生存を促進する内因性ＴＷＥＡＫを産生することを示唆する。ＦＧＦ−２誘導増殖のＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ減弱は、少なくともＦＧＦ−２へのＥＣ反応の一部は、内因性ＴＷＥＡＫ／ＴＷＥＡＫＲ相互作用に依存していることを示唆する。
【０１４５】
実施例６
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な、マウス心臓の虚血／移植体モデルを示す。
【０１４６】
あるマウス提供者からもう１つの遺伝的に類似なマウスの耳の皮膚へ異所的に移植された心臓組織の生存は、生存および心筋機能のエネルギーを促進するために、移植された心臓および周辺の組織による十分な新血管新生を必要とする。移植部位での不十分な血管新生は、心臓の過度の虚血、組織損傷、および組織の移植の失敗を引き起こす。内皮細胞移動および血管形成に関与する因子をアンタゴナイズする剤は、移植部位での血管形成を減少可能であり、それにより移植組織の機能および究極的には移植自体を制限する。マウス異所心臓同種移植片モデルは、新血管新生に対する抗体およびＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃを含むＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの効果を実証するために使用される。
【０１４７】
メスＢＡＬＢ／ｃ（およそ１２週齢）被提供者は、同系統のマウス提供者から新生児心臓移植片を与えられる。提供者の心臓組織は、０日に被提供者の左耳の耳介に移植され、そしてマウスを２つのグループに分ける。対照グループはヒトＩｇＧ（Ｈｕ ＩｇＧ）を、一方他のグループはＴＷＥＡＫＲアンタゴニストを、両方とも腹腔内に受ける。処置は５日間連続で続ける。移植片の機能性を、移植後７−１４日での可視脈動仮性をモニターすることによって決定する。ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの用量の機能として、機能性移植の阻害を決定する。移植された心臓の組織構造を、移植部位での浮腫ならびに宿主および提供者組織の血管構造に対するＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの効果を可視化するために（例えば、因子ＶＩＩＩ染色を使用して）検査する。
【０１４８】
実施例７
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストでの腫瘍の治療の方法を示す。
ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストを、充実性腫瘍の動物モデルにおいて試験する。ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの効果を、腫瘍の頻度および腫瘍増殖を測定することにより決定する。
【０１４９】
実施例８
本実施例は、例えばモノマー化およびマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーのような、ＴＷＥＡＫ結合分子の結合特性を決定するために有用なＥＬＩＳＡに基づくアッセイを示す。本実施例のために、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１）、トリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３）、およびＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９）を使用した。
【０１５０】
９６ウェルＬＩＮＢＲＯ（登録商標）／ＴＩＴＥＲＴＥＫＴＭ酵素免疫アッセイプレート（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，オハイオ州オーロラ）を、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）でコートし、プレートシーラーを適用し、そして４℃で一晩インキュベートした。各ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ２０；２００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、次いでＰＢＳＴ＋３％無脂肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）中で、１時間３７℃でインキュベートした。
【０１５１】
別個の反応において、ＦＬＡＧタグの付加したＴＷＥＡＫ（ＴＷＥＡＫ−ＦＬＡＧ）を、５０ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫ−ＦＬＡＧの最終濃度で９６ウェルＵ底プレートにおいて、周辺温度で３０分間、ＤＭＥＭ＋０．５％低Ｉｇ血清中で、上述のＴＷＥＡＫＲポリペプチドのそれぞれでプレインキュベートし、そして各ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの最終濃度は、９，０００から４ｎｇ／ｍｌの３倍連続希釈であった。
【０１５２】
ＥＩＡプレートを、再びＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで３回洗浄した。５０μｌ／ウェルのリガンド／受容体混合物を添加し、周辺温度で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで３回洗浄した。
【０１５３】
ＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭ中で１：５００に希釈したＦＬＡＧ−Ｍ２ビオチン化抗体を、５０μｌ／ウェルで添加し、４５分間周辺温度でインキュベートし、ＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで３回洗浄した。
【０１５４】
ＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭ中で１：２０００に希釈したＳＡ−ＨＲＰを、５０μｌ／ウェルで添加し、次いで４５分間周辺温度でインキュベートした。
プレートを５回洗浄し、１００μｌ／ウェルの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、そしてプレートを周辺温度で５−２０分間インキュベートした。
【０１５５】
反応を５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で停止し、そしてＡ４５０／５７０で吸光度を測定した。
【０１５６】
図６に示されるように、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃが最も弱い結合を示し、ＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ、次いでジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１）、次いでトリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３）と続いた。したがって、融合タンパク質が含む可溶性ＴＷＥＡＫＲドメインが多いほど、そのＴＷＥＡＫへの結合は強くなる。さらに、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃおよびジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ間の結合の違いにより示されるように、結合の増加は添加物以上であった。
【０１５７】
実施例９
本実施例は、例えばモノマー化およびマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーのような、ＴＷＥＡＫ結合分子の結合特性を決定するために有用な、ユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃを使用した競合結合アッセイを示す。本実施例のために、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１）、トリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３）、およびＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９）を使用した。
【０１５８】
Ｍ２抗ｆｌａｇ抗体を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中で４μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１００μｌ／ウェルを、コート９６ウェル平底プレートに使用した。プレートシーラーを適用し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。
【０１５９】
各ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ２０）で５回洗浄し、次いで２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭを添加した。プレートを１時間３７℃でインキュベートし、次いでＰＢＳＴで５回洗浄した。
【０１６０】
ＦＬＡＧ−ＴＷＥＡＫをＰＢＳ中に５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μｌ／ウェルで添加した。プレートを周辺温度で振盪しながら１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回以上洗浄した。
【０１６１】
非標識およびユーロピウム標識受容体を９６ウェルＵ底プレート中で前混合し、ユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲが３５ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるようにＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで希釈し、非標識受容体の３倍希釈で９０００−１２ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
【０１６２】
各ウェルに１００μｌの前混合受容体を添加した。プレートを１時間、周辺温度で、振盪しながらインキュベートし、次いでこれまでのように１０回洗浄した。１００μｌ／ウェルの増進溶液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，１２４４−１０５）を添加し、そしてプレートを振盪しながら５分間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃプレートリーダーで、吸光度をＡ６１５で測定した。
【０１６３】
図７に示されるように、モノマー化ＴＷＥＡＫＲは、ＴＷＥＡＫに結合するためのユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃとの最も弱い競合能力を示し、ダイマー化ＴＷＥＡＫＲおよびトリマー化ＴＷＥＡＫＲと続いた。
【０１６４】
実施例１０
本実施例は、例えばモノマー化およびマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーのような、ＴＷＥＡＫ結合分子の結合特性を決定するために有用な、ＥＬＩＳＡ型アッセイを示す。
【０１６５】
ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１５）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：Ｆｃ（配列番号１７）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、リンカー、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１８）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、リンカー、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１９）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。
【０１６６】
実施例８に記載されるものに類似のＥＬＩＳＡ型アッセイを使用して、モノマー化オリゴマー（ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＦｃおよびＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：Ｆｃ）が同じくらいにＴＷＥＡＫに結合するが、ダイマー化オリゴマー構築物（ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＦｃおよびＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ）よりも弱いことを決定した（図８）。
【０１６７】
実施例１１
本実施例は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノ−３（配列番号２１）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー−１（配列番号２３）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー−５（配列番号２５）、ＴＷＥＡＫＲ４０クオド（ｑｕａｄ）−２（配列番号２７）、ＴＷＥＡＫＲ４０クイント（ｑｕｉｎｔ）−１（配列番号２９）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノ−Ｆ４（配列番号３１）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー−Ｆ２（配列番号３３）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー−１（配列番号３５）、ＴＷＥＡＫＲ４３クオド−２（配列番号３７）、ＴＷＥＡＫＲ４３クイント−３（配列番号３９）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘックス（ｈｅｘ）−１（配列番号４１）、およびＴＷＥＡＫＲ４３セプト（ｓｅｐｔ）−１（配列番号４３）を使用する、ＥＬＩＳＡに基づくＴＷＥＡＫ結合アッセイの結果を示す。洗浄緩衝液からＢＳＡの存在を省略したことを除いては、実施例８に記載のプロトコルを使用した。結果を図９−１２に示す。
【０１６８】
実施例１２
本実施例は、実施例９に記載されるユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃを使用した競合結合アッセイの結果を示す。本実施例においては、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノ−３（配列番号２１）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー−１（配列番号２３）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー−５（配列番号２５）、ＴＷＥＡＫＲ４０クオド（ｑｕａｄ）−２（配列番号２７）、ＴＷＥＡＫＲ４０クイント（ｑｕｉｎｔ）−１（配列番号２９）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノ−Ｆ４（配列番号３１）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー−Ｆ２（配列番号３３）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー−１（配列番号３５）、ＴＷＥＡＫＲ４３クオド−２（配列番号３７）、ＴＷＥＡＫＲ４３クイント−３（配列番号３９）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘックス（ｈｅｘ）−１（配列番号４１）、およびＴＷＥＡＫＲ４３セプト（ｓｅｐｔ）−１（配列番号４３）を使用した。結果を図１３および１４に示す。
【０１６９】
本明細書に引用される文献の関連ある開示は、参照により特に取り込まれる。以上の実施例は、本発明の範囲を網羅することまたは限定することを意図するものではない。当業者は、以上の教示に照らして修飾および変化の可能性があり、そのような修飾および変化は本発明の範囲内であることを意図しているを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド配列の配列並列を示す。上段配列がマウスＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド（配列番号５）であり、そして下段配列がヒトＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド（配列番号４）である。
【図２】図２は、ＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＰＭＡ誘導ＨＲＭＥＣ創傷閉鎖への効果を示す。
【図３】図３は、ＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＥＧＦ誘導ＨＲＭＥＣ創傷閉鎖への効果を示す。
【図４】図４は、ヒトＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＴＷＥＡＫ誘導（１００ｎｇ／ｍｌ）ＨＵＶＥＣ増殖への効果を示す。
【図５】図５は、ヒトＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＦＧＦ−２誘導（１０ｎｇ／ｍｌ）ＨＵＶＥＣ増殖への効果を示す。
【図６】図６は、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７；「モノマー」）、ＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９、「ＤＲ５」）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１、「ダイマー」）、およびトリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３、「トリマー」）の、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおけるＴＷＥＡＫ−ＦＬＡＧへの結合を示す。
【図７】図７は、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７；「ｈｕ＋ｅｕ」）、ＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９、「ＤＲ５＋ｅｕ」）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１、「ｄｉ＋ｅｕ」）、およびトリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３、「ｔｒｉ＋ｅｕ」）の、競合結合アッセイにおけるＴＷＥＡＫへ結合するためのユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲとの競合の能力を示す。
【図８】図８は、ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１５；黒丸）、ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：Ｆｃ（配列番号１７、アスタリスク）、ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１８；黒三角）、およびＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１９；白丸）の、ＥＬＩＳＡ型アッセイを使用したＴＷＥＡＫへの結合を示す。
【図９】図９は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノマー（配列番号３１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー（配列番号３３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー（配列番号３５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲテトラマー（配列番号３７）（白ダイヤモンド）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１０】図１０は、ＴＷＥＡＫＲ４３テトラマー（配列番号３７）（白ダイヤモンド）、ＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘキサマー（配列番号４１）（白三角）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ヘプタマー（配列番号４３）（アスタリスク）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ ＴＡＮＤＥＭ（配列番号１９、安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞において発現する）、ＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘキサマー（配列番号４１）（白三角）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ヘプタマー（配列番号４３）（アスタリスク）を使用した、３３ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１２】図１２は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノマー（配列番号２１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー（配列番号２３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー（配列番号２５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲ４０テトラマー（配列番号２７）（白ダイヤモンド）、およびＴＷＥＡＫＲ４０ペンタマー（配列番号２９）（白丸）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１３】図１３は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノマー（配列番号２１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー（配列番号２３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー（配列番号２５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲ４０テトラマー（配列番号２７）（白ダイヤモンド）、およびＴＷＥＡＫＲ４０ペンタマー（配列番号２９）（白丸）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの固定化ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃ対ユーロピウムＴｗｅａｋＲの比較を示す。
【図１４】図１４は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノマー（配列番号３１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー（配列番号３３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー（配列番号３５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲ４３テトラマー（配列番号３７）（白ダイヤモンド）、ＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘキサマー（配列番号４１）（垂直線）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ヘプタマー（配列番号４３）（アスタリスク）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの固定化ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃ対ユーロピウムＴｗｅａｋＲの比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００３年７月２４日出願の米国仮特許出願６０／４９０，０３６の利益を主張し、前記出願の開示は参考によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管形成は多工程の発生過程であり、存在する血管から新しい血管の形成という結果に至る。この空間的および時間的に調節された工程は、プロテアーゼにより存在する血管のマトリックス接触および細胞相互作用の支持を弱め、続いて存在する血管の平滑筋細胞および内皮細胞の協調した運動、形態変化および増殖に関与する。次いで、発生期の細胞は標的組織へ広がり、内皮細胞が、平滑筋細胞が取り囲むチューブを形成する細胞−細胞相互作用が続く。協調した方式で、血管の細胞外マトリックスタンパク質が分泌され、そして内皮周辺支持細胞が補充され、構造的完全性を支持しそして維持する（例えば、Ｄａｎｉｅｌら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００（６２）：６４９，２０００を参照されたい）。血管形成は正常のおよび病的な生理機能の両方に重要な役割を果たす。
【０００３】
正常な生理機能状態下で、血管形成は胎生のおよび胚性の発生、創傷治癒、器官再生、並びに子宮内膜、黄体および胎盤の形成を含む女性の生殖リモデリング過程に関与する。血管形成は、特に成体の動物において正常な状態下で厳密に調節されており、そして調節制御の乱れは病的血管形成に導きうる。
【０００４】
病的血管形成は、炎症性疾患、ある種の眼障害および癌の徴候および／または進行に関わっている。特に、いくつかの種類の証拠が、血管形成は充実性腫瘍およびそれらの転移の増殖と持続に必須であるという概念を支持する（例えば、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２、１９７１；Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５８、１９８９；Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１，１９９３；Ｈｏｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：６１８０、１９９１を参照されたい）。したがって、血管形成阻害剤は、癌の予防（例えば、前癌状態の治療）、介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）（例えば、小さい癌の治療）および後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）（例えば、大きな癌の治療）に有用である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：８０８，１９９９を参照されたい）。
【０００５】
疾患の予防、破棄および軽減のために、血管形成を変調するさらなる組成物および方法の必要性がある。
ＴＲＥＰＡおよびＡｐｏ３Ｌとも呼ばれるＴＷＥＡＫタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、そして非常に多様なヒト組織において発現する（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１）：３２４０１，１９９７；Ｗｉｌｅｙ，ＰＣＴ公開公報Ｎｏ．ＷＯ９８／３５０６１（１９９８年８月１３日）をまた参照されたい）。多くのＴＮＦファミリーのメンバーのように、ＴＷＥＡＫは細胞外Ｃ末端ドメインを持つＩＩ型膜タンパク質である。ＴＷＥＡＫははじめは弱いアポトーシスの誘導物質として記載されたが、この細胞死の誘導は後に間接的であることが示された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１７８５，１９９９）。
【０００６】
Ｌｙｎｃｈらは、ＴＷＥＡＫが直接的に内皮細胞増殖および血管形成を誘導することを実証した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１３）：８４５５，１９９９）。ピコモル濃度の組換え可溶性ＴＷＥＡＫは、複数の内皮細胞株および大動脈平滑筋細胞の増殖を誘導し、そして培養中の血清および増殖因子の要求を減じる。さらに、ＴＷＥＡＫは、ラット角膜ポケットアッセイにおいて強い血管形成応答を誘導する。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーを通じたシグナルによって生物学的応答を開始するので、ＴＷＥＡＫ受容体を同定しそして特性付けることに重大な興味があった。
【０００７】
Ｍａｒｓｔｅｒｓらは、ＴＷＥＡＫはＤＲ３、Ａｐｏ３、ＷＳＬ−１、ＴＲＡＭＰまたはＬＡＲＤとしてさまざまに知られるデスドメイン含有受容体に結合し、そしてそれらを通じてシグナルを伝えることを報告した（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（９）：５２５，１９９８）。しかしながら、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらは、ＴＷＥＡＫはＫｙｍ−１細胞に結合しそしてシグナルを伝えるが、Ｋｙｍ−１細胞は受容体ＤＲ３を発現しないことを示した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１７８５、１９９９）。Ｗｉｌｅｙはそれに続き、第一のＴＷＥＡＫ受容体を同定し、そして野生型ＴＷＥＡＫ受容体をアンタゴナイズする特定の可溶性断片および変異体を記載した（ＰＣＴ公開公報Ｎｏ．ＷＯ０１／４５７３０）。
【０００８】
ＴＷＥＡＫはインビボでの血管形成を誘導するので、主要な機能性ＴＷＥＡＫ受容体のアンタゴニストに特に必要性がある。そのようなＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストは、血管形成を減じるため、そして癌および炎症性疾患を含むヒト疾患の治療するために有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明は、主要な機能性ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫＲ）のマルチマー化可溶性断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドの同定および特性付けに基づく。驚くことに、これらのポリペプチドは、可溶性モノマー化ＴＷＥＡＫＲ断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチド、またはオリゴマー化ドメインなしのマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ断片を含んでなるポリペプチドのＴＷＥＡＫ結合および競合特性から予測されたものより、ＴＷＥＡＫへの高い結合親和性を有し、および／またはＴＷＥＡＫ結合への優れた競合体である。
【００１０】
本発明は、例えば、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストを含んでなる組成物の治療上の有効量を投与することを含んでなる、そのような治療を必要とする哺乳動物において血管形成を阻害するための組成物および方法を提供する。組成物は好ましくは医薬的に許容できる担体を含んでなり、そして哺乳動物は好ましくはヒトである。
【００１１】
１つの側面において、本発明は、ＴＷＥＡＫ受容体の第一可溶性断片、ＴＷＥＡＫ受容体の第二可溶性断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＴＷＥＡＫに結合し、そして前記第一可溶性断片が：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、前記ポリペプチドを提供する。１つの態様において、前記第一可溶性断片は：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片は：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１２】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第三可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１３】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第四可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１４】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第五可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１５】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第六可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１６】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはＴＷＥＡＫ受容体の第七可溶性断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片は、それぞれ独立に：配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基；配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および、配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基、からなる群より選択される配列からなる。
【００１７】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドはリンカーを含んでなる。もう１つの態様において、前記リンカーは、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合する。もう１つの態様において、前記リンカーは、前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する。もう１つの態様において、前記ポリペプチドは、第一リンカーおよび第二リンカーを含んでなり、ここで前記第一リンカーは前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合し、そして前記第二リンカーは前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する。もう１つの態様において、前記リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＧ（配列番号４５）を含んでなる。
【００１８】
もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片は介在ポリペプチド配列なしに共に接合する。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片および前記オリゴマー化ドメインは介在ポリペプチド配列なしに共に接合する。もう１つの態様において、前記第一可溶性断片、前記第二可溶性断片、および前記オリゴマー化ドメインは介在ポリペプチド配列なしに、直鎖状で連続しているポリペプチドにおいて共に接合する。
【００１９】
もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインは、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＮ末端側である。もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインは、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＣ末端側である。もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインはロイシンジッパーを含んでなる。もう１つの態様において、前記オリゴマー化ドメインは抗体の断片を含んでなる。もう１つの態様において、前記抗体の断片はＦｃドメインを含んでなる。
【００２０】
もう１つの態様において、前記ポリペプチドは：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記ポリペプチドは：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記ポリペプチドは：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択される配列を含んでなる。
【００２１】
もう１つの側面において、本発明は、第一前記ポリペプチドおよび第二前記ポリペプチドを含んでなるタンパク質であって、ここで前記第一および第二ポリペプチドが互いにオリゴマー化している、前記タンパク質を提供する。もう１つの態様において、前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列は前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。もう１つの態様において、前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列は前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一でない。
【００２２】
もう１つの側面において、本発明は、対象中のＴＷＥＡＫ受容体を阻害する方法であって、前記対象に前記ポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
もう１つの側面において、本発明は、対象中の血管形成を阻害する方法であって、前記対象に前記ポリペプチドを含んでなる組成物の治療上の有効量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。もう１つの態様において、前記組成物は医薬的に許容できる担体をさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記対象は哺乳動物である。もう１つの態様において、前記哺乳動物はヒトである。もう１つの態様において、前記対象は血管形成により仲介されまたは悪化した疾患または状態を有する。もう１つの態様において、前記疾患または状態は眼の新血管新生により特徴付けられる。もう１つの態様において、前記疾患または状態は充実性腫瘍である。もう１つの態様において、前記方法は、放射線で前記対象を治療することをさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記方法は、第二化学療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記第二化学療法剤は：アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、植物由来化学療法剤、ニトロソウレア、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血球因子、放射線療法剤、および生物学的応答修飾剤からなる群より選択される。もう１つの態様において、前記第二化学療法剤は、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リンホカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、デルタインターフェロン、ＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌアスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される。もう１つの態様において、前記疾患または状態は炎症性疾患または状態である。もう１つの態様において、前記方法は第二療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる。もう１つの態様において、前記第二療法剤は炎症を促進するサイトカインまたはサイトカイン受容体を阻害する。もう１つの態様において、前記第二療法剤は前記サイトカイン受容体の可溶性断片、前記サイトカインに結合する抗体、または前記サイトカイン受容体に結合する抗体を含んでなる。もう１つの態様において、前記第二療法剤は炎症を阻害する受容体を活性化する。もう１つの態様において、前記第二療法剤は、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１４８アゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニスト、およびＴｅｋアンタゴニストからなる群より選択される。
【００２３】
もう１つの側面において、本発明は、前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる、核酸またはその相補体を提供する。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体が中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、第二核酸にハイブリダイズし、そして前記第二核酸は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸またはその相補体は：配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；および、配列番号４２、からなる群より選択される配列を含んでなる。もう１つの態様において、前記核酸は：配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；および、配列番号４４、からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードする。
【００２４】
もう１つの側面において、本発明は、前記核酸を含んでなるベクターを提供する。もう１つの態様において、前記ベクターは、発現ベクターである。
もう１つの側面において、本発明は、前記核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
【００２５】
もう１つの側面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で前記宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＴＷＥＡＫＲの可溶性断片のマルチマーおよびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドに関する組成物および方法を提供する。
【００２７】
明細書中で使用される略語および用語
「４−１ＢＢ」および「４−１ＢＢリガンド」（４−１ＢＢ−Ｌ）は、とりわけ米国特許番号５，６７４，７０４号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
「ｂＦＧＦ」は、塩基性線維芽細胞増殖因子である。
【００２８】
「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンである。
「ＣＤ４０リガンド」（ＣＤ４０Ｌ）は、とりわけ米国特許番号５，７１６，８０５号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む。
【００２９】
「ＣＨＯ」は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株である。
「ＤＭＥＭ」は、商業的に利用可能な細胞培養培地である、ダルベッコ修飾イーグル培地である。
【００３０】
「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着アッセイである。
「Ｆｌｔ３Ｌ」は、とりわけ米国特許番号５，５５４，５１２号に記載されるポリペプチドであり、その可溶性型を含む、Ｆｌｔ３リガンドである。
【００３１】
「ＨＲＭＥＣ」は、初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞である。
「ＨＵＶＥＣ」は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の細胞株である。
【００３２】
「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水である。
「ＰＭＡ」は、ホルボール１２−ミリスチン酸−１３酢酸塩である。
【００３３】
「ＲＴＫ」は、受容体チロシンキナーゼである。
「Ｔｅｋ」は、Ｔｉｅ２およびｏｒｋとも呼ばれ、主に血管内皮で発現するＲＴＫである。ヒトＴｅｋ（ｏｒｋ）の分子クローニングは、Ｚｉｅｇｌｅｒによる米国特許番号５，４４７，８６０号に記載されている。「Ｔｅｋアンタゴニスト」は、とりわけＣｅｒｒｅｔｔｉらのＰＣＴ公開公報ＷＯ００／７５３２３（２０００年１２月１４日）に記載される。
【００３４】
「ＴＮＦＲ」は、腫瘍壊死因子受容体でありその可溶性型を含む。「ＴＮＦＲ／Ｆｃ」は、腫瘍壊死因子受容体−Ｆｃ融合ポリペプチドである。
「ＴＲＡＩＬ」は、とりわけ米国特許番号５，７６３，２２３号に記載されるＴＮＦファミリーのＩＩ型膜貫通ポリペプチドであり、その可溶性型を含む、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドである。
「ＶＥＧＦ」は、ＶＰＦまたは血管浸透因子としても知られる、血管内皮増殖因子である。
【００３５】
可溶性ＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド
天然のヒトＴＷＥＡＫ受容体ｃＤＮＡは配列番号３の配列を有し、１２９残基のポリペプチドをコードする（配列番号４）。ＤＮＡ配列の考察により、およそ７８アミノ酸の細胞外ドメイン（シグナルペプチドを含む、配列番号４の１−７８番目の残基）、およそ２３アミノ酸の膜貫通ドメイン（配列番号４の７９−１０１番目の残基）、およびおよそ２８アミノ酸の細胞内ドメイン（配列番号４の１０２−１２９番目の残基）を有するポリペプチドが予想された。ＴＷＥＡＫ受容体配列は、ＫａｔｏらのＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／５５５０８（１９９８年１２月１０日）およびＩｎｃｙｔｅのＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／６１４７１（１９９９年１２月２日）によってもまた報告されている。本明細書で使用される「ＴＷＥＡＫＲ」は、これらの配列を有するポリペプチドを含み、そして特に配列番号７の２８−７９のアミノ酸並びに天然に生じるその変異体を含んでなる。
【００３６】
本発明の１つの側面において、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドは、血管形成を阻害するためのおよび／またはＴＷＥＡＫリガンドのＴＷＥＡＫＲへの結合を阻害するためのＴＷＥＡＫＲアンタゴニストとして使用される。
【００３７】
可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能である。ポリペプチドの可溶性型の使用は、特定の応用に好都合である。ポリペプチドが分泌されるので、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製は容易であり、そして可溶性タンパク質は一般的に非経口投与に適している。分泌可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離により培養培地から望ましいポリペプチドを発現する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を分離し、そして培地（上清）を望ましいポリペプチドの存在についてアッセイすることによって、同定可能である（そしてその非可溶性膜結合対応物から区別可能である）。培地中の望ましいポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがってポリペプチドの可溶性型であることを示唆する。可溶性ポリペプチドは、多くの慣用の技術のいずれかにより調製可能である。望ましい可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ポリペプチドの産生のために発現ベクター中へサブクローニング可能であり、または望ましいコードするＤＮＡ断片は化学的に合成可能である。
【００３８】
可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドはＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインの全部または一部を含むが、一般的に細胞表面でのポリペプチドの保持を引き起こす膜貫通ドメインまたはその断片を欠く。可溶性ポリペプチドがそれを産生する細胞から分泌される限りは、膜貫通ドメインの一部あるいは細胞質ドメインの全部または一部を含んでよい。可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、細胞からの分泌を促進するために、はじめに合成されたとき天然のまたは異種のシグナルペプチドを有利に含んでなるが、該シグナル配列は分泌時に切断される。用語「ＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメイン」は、天然ＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインの全部または一部、並びに限定はされないが以下のものを含む関連型を包含することが意図される：（ａ）断片、（ｂ）変異体、（ｃ）誘導体、および（ｄ）融合タンパク質。これら関連型の血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害する能力は、以下で例示されるものまたは当該技術分野で知られる他のアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで決定可能である。可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの例は、以下に提供される。
【００３９】
マルチマー可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片は、ＴＷＥＡＫＲの可溶性断片のダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、またはそれ以上のマルチマーである。マルチマーは、当該技術分野で知られたいずれの方法によりともに連結してよい。例えば、それらは連続ポリペプチド鎖の一部であることが可能であり、ここで各モノマーは、例えばリンカーを通じてのような１つまたはそれより多くの介在アミノ酸またはペプチド結合を通じて、ペプチド結合を介して直接的にまたは間接的にその近隣モノマーに連結可能である。例えば、マルチマーは、例えば異なった可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチド上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合によるような、他の型の共有結合により互いに接合可能である。
【００４０】
オリゴマー化ドメインは、それらを含んでなるポリペプチドのオリゴマー化を引き起こす、即ち、対応するオリゴマー化ドメインを含んでなるもう１つのポリペプチドと共有および／または非共有結合を形成する、ポリペプチドである。したがって、もしポリペプチドがそれらのオリゴマー化ドメインを介して互いに結合する場合、２またはそれ以上のポリペプチドは「オリゴマー化される」。当該技術分野で知られるいかなるオリゴマー化ドメインが使用可能である。例は、以下でより詳細に記載されるように、ロイシンジッパーおよび例えばＦｃドメインのような抗体由来の特定のポリペプチドを含む。オリゴマー中のポリペプチドは同一ポリペプチド配列、類似ポリペプチド配列、または異なったポリペプチド配列を有することが可能である。特定の態様において、本発明のオリゴマー化ポリペプチドは、４から１４の可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を含んでなる。
【００４１】
いくつかの態様において、マルチマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して調製される。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）；および、ＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（「免疫グロブリン融合タンパク質の構築」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２中のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）により記載される。
【００４２】
本発明の１つの態様は、２つのポリペプチドを含んでなるＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーに向けられ、各ポリペプチドが２つの可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片およびＦｃドメインを含んでなる（ジＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ）。ジＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター中に挿入される。ジＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃポリペプチドは、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞中で発現され、そして抗体分子に酷似する会合が可能になり、ここで鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され４価の可溶性ＴＷＥＡＫＲが生じる。本明細書で使用される用語「Ｆｃポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型およびムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）型を含む。ダイマー化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの一部切除型もまた含まれる。
【００４３】
ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載される１つの適したＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然のＣ末端までに渡る一本鎖ポリペプチドである。もう１つの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２，１９９４に記載されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、１９番目のアミノ酸がＬｅｕからＡｌａに変化し、２０番目のアミノ酸がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そして２２番目のＧｌｙがＡｌａに変化したことを除いては、ＷＯ９３／１０１５１に示された天然Ｆｃ配列のものと同一である。該ムテインは、Ｆｃ受容体に減じた親和性を表わす。Ｆｃ部分、およびそれらから形成されたマルチマーを含んでなる融合ポリペプチドは、プロテインＡまたはプロテインＧカラムに対する親和性クロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提示し、そしてＦｃ融合ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドよりも療法応用に有用な長いインビボ半減期を提供することが可能である。
【００４４】
他の態様において、マルチマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片は、抗体重鎖または軽鎖の可変部分と置換可能である。もし融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方で作られたならば、８つまたはそれより多くの可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片で可溶性ＴＷＥＡＫＲオリゴマーを形成することが可能である。
【００４５】
もう１つの態様において、オリゴマー化ドメインはロイシンジッパードメインを含んでなる。ロイシンジッパードメインは、それらが発見されたタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初はいくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９，１９９８）、そしてその後種々の異なったタンパク質において発見された。公知のロイシンジッパーの中には、天然に生じるペプチドおよびダイマー化するまたはトリマー化するその誘導体がある。可溶性マルチマー化タンパク質の産生に適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載され、そしてＨｏｐｐｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４：１９１，１９９４に記載される、肺表面活性タンパク質Ｄ（ｌｕｎｇ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。ロイシンジッパーに融合した異種タンパク質の安定トリマー化を可能にする修飾ロイシンジッパードメインの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７，１９９４に記載される。ロイシンジッパーペプチドに融合した可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質は、適した宿主細胞中で発現され、そして形成した可溶性ＴＷＥＡＫＲマルチマーは培養上清から回収される。
【００４６】
あるいは、本発明のポリペプチドはペプチドリンカー（スペーサー）を含んでなる。リンカーは、第一ポリペプチド、リンカー、および第二ポリペプチドがアミノ酸の連続配列を形成するように、アミノ末端が第一ポリペプチドにペプチド結合しており、そしてカルボキシ末端が第二ポリペプチドにペプチド結合している、１つまたはそれより多くのアミノ酸の配列である。介在ポリペプチド配列なし（即ち、リンカーなし）でともに接合した第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドとは異なり、そのようなリンカーは第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドを「接合する」といわれる。適したペプチドリンカーの中には、米国特許４，７５１，１８０、４，９３５，２３３、および５，０７３，６２７に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られた慣用の技術を使用して、例えばＴＷＥＡＫＲ断片をコードするＤＮＡ配列の間に、そして同じ読み枠で挿入可能であり、並びに／またはＴＷＥＡＫＲ断片およびオリゴマー化ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の間に挿入可能である。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片をコードする配列間にライゲーション可能である。特定の態様において、本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーで分離された２から４つの可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなる。
【００４７】
本発明は、血管形成および／または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害するオリゴマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲマルチマーの種々の形態の使用を包含する。用語「オリゴマー化可溶性ＴＷＥＡＫＲマルチマー」は、天然ＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインの全部または一部を含有するオリゴマー化マルチマー、並びに限定はされないが、可溶性ＴＷＥＡＫＲの断片、変異体、誘導体、および融合タンパク質のオリゴマー化マルチマーを含む関連型を包含することを意図する。これら関連型の血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害する能力は、実施例中に例示されるもののような方法を使用して、または当該技術分野で知られた他のアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで決定可能である。
【００４８】
本発明の実施に有用なポリペプチド、マルチマーおよびオリゴマーの中には、リガンドに結合する能力を保持し、および／または血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介反応を阻害するＴＷＥＡＫＲ変異体を含んでなるポリペプチドが含まれる。そのようなＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲに実質的に相同であるポリペプチドを含むが、１つまたはそれより多くの欠失、挿入または置換のため、天然ＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列から異なるアミノ酸配列を有する。特定の態様は、限定はされないが、天然のＴＷＥＡＫＲ配列と比べたときに、アミノ酸残基の１から１０の欠失、挿入または置換を含んでなるＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含む。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの変異体として含まれるものは、対立形質型および択一的スプライシング型のような天然に生じる変異体、ならびにＴＷＥＡＫＲポリペプチドのアミノ酸配列、またはＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を修飾することにより構築された変異体である。
【００４９】
一般的に、天然ポリペプチド中に存在する１またはそれより多くの置換は、保存的に成されるべきである。保存的置換の例は、活性ドメインの外側のアミノ酸の置換、およびＴＷＥＡＫＲの二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換を含む。さらなる例は、１つの脂肪族残基を別の脂肪族残基に置換すること、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを別のものに置換すること、または１つの極性残基を別の極性残基に置換すること、例えばＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間で置換すること、または１つの芳香族残基を別の芳香族残基に置換すること、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを別のものへ置換することを含む。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する全体部分の置換も当該技術分野で公知である。
【００５０】
いくつかの好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ７０％同一であり；いくつかの好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ８０％同一である。いくつかのより好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９０％同一であり；いくつかのより好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９５％同一である。いくつかの最も好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９８％同一であり；いくつかの最も好ましい態様において、ＴＷＥＡＫＲ変異体は、天然のＴＷＥＡＫＲのアミノ酸配列にアミノ酸配列で少なくともおよそ９９％同一である。ポリペプチドおよび核酸の両方の場合、パーセント同一性は目視検査により決定されうる。パーセント同一性は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３、１９７０）の並列方法を使用して、また決定されうる。好ましくは、パーセント同一性は、例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７、１９８４を参照されたい）から利用できる、ＧＡＰコンピュータープログラム バージョン１０．ｘのようなコンピュータープログラムを使用することにより決定される。ＧＡＰプログラムに好ましいデフォルトパラメーターは、（１）核酸の単項比較マトリックス（同一には１の値、および非同一には０の値を含有する）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ．３５３−３５８，１９７９により記載されるＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５、１９８６のアミノ酸の加重比較マトリックス；（２）各ギャップへの３０（アミノ酸）または５０（ヌクレオチド）のペナルティ、および各ギャップにおける各シンボルへのさらなる１（アミノ酸）または３（ヌクレオチド）；（３）エンドギャップへのペナルティはなし；および（４）長いギャップへの最大ペナルティなしを含む。配列比較の当業者により使用される他のプログラムもまた使用してもよい。ＴＷＥＡＫＲの断片について、パーセント同一性は、断片中に存在するＴＷＥＡＫＲのその部分に基づいて計算される。
【００５１】
本発明は、関連した天然パターンの糖鎖付加ありで、またはなしでの可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの使用をさらに包含する。酵母または哺乳動物発現システム（例えば、ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）において発現したＴＷＥＡＫＲは、発現システムの選択に依存して、分子量および糖鎖付加パターンにおいて天然ＴＷＥＡＫＲポリペプチドに類似しても、または有意に異なってもよい。大腸菌のような細菌の発現システムにおけるＴＷＥＡＫＲポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。異なった宿主細胞は、異なってポリペプチドをまた処理することが可能であり、可変Ｎ−またはＣ−末端を有するポリペプチドの異種混合物を生じる。
【００５２】
可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの一次アミノ酸構造は、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等のような、他の化学部分と共有的なまたは集合的な共役を形成することにより誘導体を創出するように修飾されてもよい。ＴＷＥＡＫＲの共有的誘導体は、ＴＷＥＡＫＲアミノ酸側鎖またはＴＷＥＡＫＲポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端で、特定の官能基を連結することにより調製可能である。
【００５３】
本発明の実施に有用な可溶性ＴＷＥＡＫＲの融合タンパク質は、新規の多機能性性質を提供するために追加される、他のポリペプチドを有するＴＷＥＡＫＲポリペプチドの共有的なまたは集合的な共役体をまた含む。
【００５４】
ＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチドの組換え体産生
本発明において使用される可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチド、断片および融合タンパク質を含むＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、組換え発現システムを使用して調製してよい。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞（「組換え宿主細胞」）は、ＴＷＥＡＫＲの発現を促進する条件下で培養され、そしてＴＷＥＡＫＲは回収される。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、トランスジェニック植物もしくは動物、または化学合成によりまた生産されうる。
【００５５】
本発明は、以下を含む本発明で使用されるＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードする核酸分子を包含する：（ａ）ＴＷＥＡＫに結合する配列番号７の２８−７９番目の残基およびその断片をコードする核酸；（ｂ）（ａ）の核酸に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、ＴＷＥＡＫに結合できるポリペプチドをコードする核酸；および（ｃ）（ａ）の核酸に中程度なストリンジェンシーでハイブリダイズし、ＴＷＥＡＫに結合できるポリペプチドをコードする核酸。
【００５６】
遺伝暗号の縮重のために、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における多量なバリエーションがあり得る。本発明の態様に含まれるものは、ＴＷＥＡＫＲをコードするＤＮＡ配列に中程度にストリンジェントな条件下（例えば、５ＸＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液、および５０℃、５ＸＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件）で、ハイブリダイズできる核酸配列である。当業者は、中程度なハイブリダイゼーションストリンジェンシーを構成する塩および温度のさらなる組み合わせを決定可能である（参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８２；およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９８９およびそれ以降の版を参照されたい）。高度なストリンジェンシーの条件は、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄のより高い温度、および／またはより低い塩濃度を含む。核酸のパーセント同一性はポリペプチドへの上述の方法、即ち、目視検査およびＧＡＰのようなコンピュータープログラムの使用を含む方法により決定可能である。
【００５７】
いずれかの適した発現システムが、組換えＴＷＥＡＫＲの産生のために採用されうる。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子由来のもののような、適した転写および翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結したＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。調節配列がＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列に機能的に関係するとき、ヌクレオチド配列は機能可能に連結されている。したがって、ＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列の転写を制御するならば、プロモーターヌクレオチド配列は、ＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列に機能可能に連結されている。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、もしくはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列を含む。適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列は、発現ベクター中に組み込まれることが可能である。シグナルペプチド（分泌リーダー、リーダーペプチド、またはリーダーを含む種々の名称で呼ばれる）のＤＮＡ配列は、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドがシグナルペプチドを含んでなる融合タンパク質としてはじめに翻訳されるように、ＴＷＥＡＫＲ配列にインフレームに融合されうる。意図する宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からＴＷＥＡＫＲの分泌の際に、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドから切断される。
【００５８】
ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの発現のための適した宿主細胞は、原核生物、酵母、ならびに昆虫および哺乳動物を含む高度な真核細胞を含む。細菌、真菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞性宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８５において記載される。
【００５９】
原核生物は、グラム陰性生物、または例えば大腸菌またはバチルス属の細菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）のようなグラム陽性生物を含む。形質転換のための適した原核生物宿主細胞は、例えば、大腸菌、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス属、スプレプトミセス属、およびスプレプトコッカス属内の多様な他の種を含む。大腸菌のような原核生物宿主細胞において、ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、原核生物宿主細胞において組換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ末端のメチオニン残基を含んでよい。Ｎ末端のＭｅｔは、発現した組換えポリペプチドから切断されうる。
【００６０】
原核生物宿主細胞において使用するための発現ベクターは、一般的に１つまたはそれより多くの表現型選択可能マーカー遺伝子を含んでなる。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養要求性を補うタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞の有用な発現ベクターの例は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような商業的に利用可能なプラスミドに由来するものを含む。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有し、そしてしたがって、形質転換細胞を同定するために簡素な方法を提供する。適切なプロモーターおよびＴＷＥＡＫＲ ＤＮＡ配列は、ｐＢＲ３２２ベクター中に挿入される。他の商業的に利用可能なベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，スウェーデン、ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，米国ウィスコンシン州マジソン）を含む。
【００６１】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに共通して使用されるプロモーター配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４、１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７、１９８０；ＥＰ−Ａ−３６７７６）、およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２、１９８２）を含む。特に有用な原核生物宿主細胞発現システムは、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性抑制配列を採用する。λＰＬプロモーターの誘導体を組み込むＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから利用可能なプラスミドベクターは、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９中にある、ＡＴＣＣ３７０９２）およびプラスミドｐＰＬｃ２８（大腸菌株ＲＲ１に中にある、ＡＴＣＣ５３０８２）を含む。
【００６２】
ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてまた発現可能である。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母もまた適用可能である。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母ベクターのための適したプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセンリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸アイソメラーゼ、３−ホスホグリセンリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸アイソメラーゼ、ホスホグルコースアイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）を含む。酵母発現における使用のための他の適したベクターおよびプロモーターは、さらにＨｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７中に記載される。もう一つの代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４、１９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４、１９８２）により記載されたグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上記の酵母ベクター中に挿入することによって構築可能である。
【００６３】
酵母α因子リーダー配列を採用して、組換えポリペプチドの分泌を方向付けることが可能である。α因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間にしばしば挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３、１９８２；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。酵母宿主から組換えポリペプチドの分泌を容易にするために適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列は、１つまたはそれより多く制限部位を含有するように、その３’末付近を修飾可能である。これは、リーダー配列の構造遺伝子への融合を容易にするであろう。
【００６４】
酵母の形質転換プロトコルは、当業者に公知である。そのようなプロトコルの１つは、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、選択培地におけるＴｒｐ＋形質転換体を選択し、ここで選択培地は、０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００６５】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、「富化した」培地において発現を誘導するために増殖されうる。富化した培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルで補足した、１％酵母抽出液、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。培地からグルコースが使い果たされたとき、ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除が起こる。
【００６６】
昆虫宿主細胞培養システムを採用し、可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含む組換えＴＷＥＡＫＲポリペプチドを発現させることも可能である。昆虫細胞における異種ポリペプチドの産生のためのバキュロウイルスシステムは、ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７，１９８８により概説される。
【００６７】
哺乳動物細胞は、特に宿主細胞としての使用のために好ましい。適した哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１，１９９１）により記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株を含む。療法ポリペプチドの産生のために、動物タンパク質を含有しない培地において増殖するように適応した哺乳動物宿主細胞株を使用することが特に有利である。
【００６８】
哺乳動物細胞へのＤＮＡの導入のための確立された方法は、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９に記載されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｐｌｕｓのような商業的に利用可能な試薬を使用する追加のプロトコルを使用して、細胞をトランスフェクト可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３，１９８７）。さらに、エレクトロポレーションを使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｅｄ． Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９中のもののような慣用の手法を使用して、哺乳動物細胞をトランスフェクト可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤への耐性のような当該技術分野で公知の方法を使用して実行可能である。Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７，１９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性のようないくつかの選択スキームを記載する。ＤＨＦＲ選択のために適した宿主系統は、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ系統ＤＸ−Ｂ１１（ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）であり得る。ＤＨＦＲのｃＤＮＡを発現するプラスミドは、ＤＸ−Ｂ１１系統に導入可能であり、そして該プラスミドを含有する細胞のみが適切な選択培地において増殖可能である。発現ベクター中に組み込まれ得る選択可能マーカーの他の例は、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢのような抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡを含む。該ベクターを有する細胞は、これらの化合物に対する耐性を基にして選択可能である。
【００６９】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切除可能である。共通して使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。例えば、ＳＶ４０起点部位、初期および後期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライス部位、およびポリアデニル化部位のようなＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列を使用して、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他のゲノム要素を提供可能である。ウイルス初期および後期プロモーターは、双方とも断片としてウイルスゲノムから容易に入手され、それはウイルスの複製起点もまた含有しうる（Ｆｉｅｒｓら、 Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３、１９７８；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）ので、特に有用である。ＳＶ４０ウイルス複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へ伸びるおよそ２５０ｂｐ配列を含むことを条件に、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた使用可能である。
【００７０】
哺乳動物発現ベクターから異種遺伝子の発現を改善することが示されているさらなる制御配列は、ＣＨＯ細胞に由来する発現増強配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４）、ならびにアデノウイルス２由来の三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５，１９８２）のような要素を含む。ウイルス起源の内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロニックｍＲＮＡが効率よく翻訳されることを可能にする（ＯｈとＳａｒｎｏｗ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５，１９９３；Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７，１９９６）。ジシストロニックｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡ、および続く選択可能マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）の遺伝子の発現は、宿主のトランスフェクションの容易さ、および異種ｃＤＮＡの発現を改善することが示されている（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）。ジシストロニックｍＲＮＡを採用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０，１９９７により記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４により記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【００７１】
有用な高発現ベクターｐＣＡＶＮＯＴは、Ｍｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９：３３５，１９８９により記載されている。哺乳動物宿主細胞に使用する他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ３：２８０，１９８３）により開示されるように構築可能である。Ｃ１２７マウス哺乳動物上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定高レベル発現のために有用なシステムは、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）により記載されるように、実質的に構築可能である。Ｃｏｓｍａｎら Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，１９８４により記載される有用な高発現ベクターＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは当該技術分野で公知である。
【００７２】
ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを産生することにおいて採用してもよいシグナルペプチドに関して、天然ＴＷＥＡＫＲシグナルペプチドを使用してもよく、または、所望であれば異種のシグナルペプチドまたはリーダー配列により置換してもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えＴＷＥＡＫＲを産生しようとする宿主細胞の型のような因子に依存しうる。哺乳動物宿主細胞において機能する異種シグナルペプチドの例は、米国特許４，９６５，１９５に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体のシグナル配列；米国特許４，９６８，６０７に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体のシグナル配列；および、ＥＰ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体のシグナル配列を含む。
【００７３】
突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組換えＤＮＡの技術を使用して、ＴＷＥＡＫＲ断片、変異体、誘導体、および融合ポリペプチドを含む、アミノ酸残基または配列の種々の付加または置換、あるいは末端のまたは内部の残基または配列の欠失を含んでなるＴＷＥＡＫＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、当業者は生産可能である。
【００７４】
マウス、ヤギ、ヒツジおよびブタを含むトランスジェニック動物、ならびにタバコ、トマト、マメ、草、穀物を含むトランスジェニック植物は、可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを含むＴＷＥＡＫＲポリペプチドの産生のためのバイオリアクターとしてもまた使用可能である。トランスジェニック動物の場合、ミルクおよび／または他の体液中への、可溶性ＴＷＥＡＫＲの発現を促進するシス作動性調節配列に機能可能に連結するＴＷＥＡＫＲコード配列を含む、キメラＤＮＡを構築することが特に有用である（例えば、米国特許番号５，８４３，７０５；米国特許番号５，８８０，３２７を参照されたい）。トランスジェニック植物の場合、特定の細胞型、組織、または器官においてＴＷＥＡＫＲを産生することが特に有用である（例えば、米国特許５，６３９，９４７号；米国特許５，８８９，１８９号を参照されたい）。
【００７５】
当業者は、発現した可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドを精製するための手法が、採用した宿主システムによって、そして組換えポリペプチドが分泌されるか否かによって変化するであろうことを認識するであろう。可溶性ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、１つまたはそれより多くの濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製、ＨＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を含む当該技術分野で公知の方法を使用して精製可能である。Ｆｃ部分を含んでなる融合ポリペプチド（およびそれから形成されたマルチマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムに対してアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提示する。
【００７６】
治療の方法
以下に記載したものは、標的組織または細胞のグループにおける血管形成を促進するまたは抑制するための、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド、あるいはＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドをコードする遺伝子を採用する方法または組成物である。用語「治療する」、「治療すること」、「治療」、「療法」、「療法の」等は、予防的療法（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、予防的療法（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）、改良療法、および治療療法を含むことを意図する。
【００７７】
開示されたポリペプチド、組成物および方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物における血管形成または他のＴＷＥＡＫＲ仲介応答を阻害するために使用される。用語「ＴＷＥＡＫＲ仲介応答」は、ＴＷＥＡＫリガンドのＴＷＥＡＫＲへの結合により少なくとも一部が引き起こされる、あるいはＴＷＥＡＫをＴＷＥＡＫＲへの結合から遮断することにより、全部または一部において阻害されまたは抑制されうる、いずれかの細胞の、生理学的な、または他の生物学的応答を含む。治療は、血管形成により仲介される疾患または状態の開始または再発を予防するために、あるいは血管形成により仲介される疾患または状態を有する哺乳動物を治療するために、有利に施される。血管形成により仲介される疾患および状態は、限定するわけではないが、眼障害、悪性のおよび転移性の状態、ならびに炎症性疾患を含む。
【００７８】
本発明により治療可能である眼障害の中には、限定するわけではないが、糖尿病性網膜症（糖尿病の主要な合併症）、未熟児網膜症（頻繁に慢性な視覚問題に導き、そして失明の高いリスクを有する壊滅的眼状態は、未熟児の世話の間の深刻な合併症である。）、血管新生グリオーマ、網膜芽腫、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、ブドウ膜炎、黄斑変性および角膜移植片新血管新生を含む、眼新血管新生を特徴とする目の疾患を含む。他の目の炎症性疾患、眼腫瘍、および脈絡膜または光彩の新血管新生に関連する疾患もまた、本発明により治療可能である。
【００７９】
本発明を使用して、充実性腫瘍のような悪性状態および転移性状態もまた治療可能である。充実性腫瘍は、初期のならびに転移性の肉腫および癌腫の両方を含む。
本発明を使用して、限定するわけではないが、関節炎、リウマチおよび乾癬を含む炎症性疾患もまた治療可能である。
【００８０】
本発明により治療可能である他の疾患および状態は、良性腫瘍および新生物発生前状態、心筋血管形成、血友病関節、強皮症、血管接着、アテローム性斑新血管新生、毛細血管拡張症、および創傷肉芽形成を含む。
【００８１】
血管形成依存性である疾患状態は、心臓、肝臓、脳などを含むいずれかの組織または器官の冠状動脈のまたは末梢のアテローム動脈硬化症、および虚血を含む。これらの種の疾患は、血管形成を促進する組成物により治療可能である。
【００８２】
本発明による方法は、インビボ動物モデルにおいて試験し、望ましい予防のまたは療法の活性を確認し、並びにヒトに投与する前に最適な療法の用量を決定することが可能である。
【００８３】
治療の特定の方法において有効であるであろう特定のＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの量は、年齢、治療しようとする状態の型および重症度、体重、治療の望ましい期間、投与の方法、ならびに他のパラメーターに依存する。有効な用量は、医師または他の有資格の医学専門家により決定される。典型的な有効な用量は、およそ０．０１ｍｇ／ｋｇからおよそ１００ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの好ましい態様において、用量はおよそ０．１−５０ｍｇ／ｋｇであり、いくつかの好ましい態様において、用量は０．５−１０ｍｇ／ｋｇである。局所投与のための用量は、典型的には全身投与のためよりも少ない。いくつかの態様において、一回の投与が十分であり；いくつかの態様において、ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、１またはそれより多くの日数に渡って複数の用量として投与される。
【００８４】
ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、典型的には１またはそれより多くの薬理学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物の形態で投与される。医薬的に許容できる担体は、投与の経路について医薬的に許容できる希釈剤、増量剤、アジュバント、賦形剤、およびビヒクル、ならびに適した分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を使用して処方される、水性のまたは油性の懸濁液であってよい。
【００８５】
医薬的に許容できる担体は、一般的に無菌であり、そして発熱性剤がなく、そして水、油、溶媒、塩、糖、および他の炭水化物、乳化剤、緩衝剤、抗菌剤、およびキレート剤を含んでよい。特定の医薬的に許容できる担体および担体に対する活性化合物の比は、組成物の溶解度および化学特性、投与の方式、ならびに標準の医薬実務により決定される。
【００８６】
本明細書に記載される組成物は、バイアル、ビン、チューブ、シリンジ吸入器または単一のもしくは複数の投与のために他の容器の中に含まれることが可能である。そのような容器は、ガラス、または例えばポリプロピレン、ポリエチレン、若しくはポリビニルクロリドのようなポリマー材料から作られることが可能である。好ましい容器は、シール、または一回の用量を引き出すために針により貫通することができ、次いで針を引き抜くと再びシールされるゴムのストッパーのような封入システムを含んでよい。当該技術分野において公知の、注射できる液体、凍結乾燥処方物、再構成凍結乾燥処方物または注射のための再構成可能な粉末のための、あるいはエアロゾル化組成物の投与のためのそのような容器全ては、本明細書で開示された組成物および方法における使用が考慮される。
【００８７】
ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、徴候に適切な方式で患者に投与される。したがって、例えば、ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストまたはその医薬組成物は、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内、鼻腔内、硬膜外、経口、局所、皮下、腔内、埋め込み物からの持続的放出、蠕動経路、またはいずれかの他の適した技術により投与可能である。非経口投与が好ましい。
【００８８】
本発明の特定の方法において、治療は、１つまたはそれより多くの追加の化学療法剤で哺乳動物を治療することをさらに含んでなる。追加の化学療法剤は、ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの投与の前に、または同時に、または後に投与可能である。治療されている哺乳動物が充実性腫瘍を有しているとき、１以上の化学療法剤の使用は特に有用である。本発明のいくつかの態様において、治療は、放射線で哺乳動物を治療することをさらに含んでなる。近接療法および遠隔療法を含む放射線は、第二化学療法剤および／またはＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの投与の前に、または同時に、または後に投与可能である。
【００８９】
治療されている哺乳動物が充実性腫瘍を有しているとき、方法は、好ましくはＴＷＥＡＫＲアンタゴニストに加えて、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、および他の植物由来化学療法剤、ニトロソウレア、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血球因子、放射線療法剤、および生物学的応答修飾剤からなる群より選択される１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９０】
いくつかの好ましい態様において、方法はＴＷＥＡＫＲアンタゴニストに加えて、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、およびビンブラスチン、インターロイキンのようなリンホカインおよびサイトカイン、インターフェロン（アルファ、ベータ、デルタを含む）、およびＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌアスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。
【００９１】
いくつかの好ましい態様において、方法はＴＷＥＡＫＲアンタゴニストに加えて、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１またはＫＤＲとしても知られるＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２を含む）アンタゴニスト、Ｔｅｋアンタゴニスト、およびＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰおよびＰＴＰＲＪとして言及される、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２１３５−４５、１９９９を参照されたい）アゴニスト、からなる群より選択される、その種々の可溶性型を含む１つまたはそれより多くの化学療法剤の投与を含む。いくつかの好ましい態様において、本発明のＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、ＢｒｏｗｄｅｒらおよびＫｌｅｍｅｎｔら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ６０：１８７８、２０００；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８）：Ｒ１５、２０００；Ｂａｒｉｎａｇａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２４５、２０００もまた参照されたい）により記載されるような「メトロノミック（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ）療法」の成分として、または組み合わせて使用される。
【００９２】
本発明のポリペプチド、組成物および方法は、初期療法に続いて残った疾患の治療のための一次治療として、または化学療法、外科手術、放射線、および当該技術分野で公知の他の療法の方法を含む他の療法の付加物として使用可能である。
【００９３】
本発明の核酸配列は、本明細書に開示された方法に従って配送されるとき、該配列が発現のための細胞中に取り込まれることができるように、配送機構を使用する利点がある。考慮された方法を有利にも採用可能である配送システムは、例えば、レトロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス配送システム、ならびに非ウイルス配送システムの使用を含む。そのような配送システムは、当業者に周知である。
【００９４】
スクリーニングの方法
本明細書に記載されるＴＷＥＡＫ受容体は、例えばＴＷＥＡＫＲアゴニストおよびアンタゴニストを単離するスクリーニングの種々の方法において使用可能である。ＴＷＥＡＫＲアゴニストは、ＴＷＥＡＫＲの生物学的活性を促進する化合物であり、そしてＴＷＥＡＫＲアンタゴニストは、ＴＷＥＡＫＲの生物学的活性を阻害する化合物である。後述のスクリーニングアッセイを介して同定された化合物は、種々の疾患状態を治療するための血管形成を変調するための組成物および方法において使用可能である。本発明は、（１）標的組織または細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドの遺伝子発現を変調し、（２）ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用を変調して、血管形成を調節し；（３）ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドに結合して、血管形成に影響を及ぼし；または（４）血管形成のような下流の事象への結合したＴＷＥＡＫ受容体−リガンド複合体の影響を干渉する、または調節する、化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００９５】
本発明は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の活性を変調する（即ち、ＴＷＥＡＫ遺伝子の発現のレベルを変調する、および／またはＴＷＥＡＫ遺伝子産物の活性のレベルを変調する）化合物を同定するために設計されたアッセイの使用を意図している。アッセイはＴＷＥＡＫ遺伝子調節配列（例えば、プロモーター配列；例えば、Ｐｌａｔｔ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２８５５８−２８５６２を参照されたい）に結合し、そしてＴＷＥＡＫ遺伝子発現のレベルを変調可能な化合物を同定することに、さらに利用可能である。
【００９６】
そのようなアッセイは、例えば、通常のＴＷＥＡＫ遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすと思われる試験化合物を含むシステムと比較して、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の転写および翻訳が起こる制御システムを使用することを包含してもよい。例えば、心臓細胞により産生されるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの比率は決定可能であり、そしてこれを使用して、試験化合物がこの比率に影響を及ぼすか否かが決定可能である。この正常な転写比率に影響を及ぼすと思われる試験化合物の影響を評価するために、まず、例えばノーザンブロッティングにより心臓細胞培養物におけるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡ産生の比率が決定されるであろう。次いで、対照培養と他は同じ条件下で、心臓細胞培養物に試験化合物を投与することができる。次いで、試験化合物で処理された培養物におけるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの比率は、例えばノーザンブロッティングにより決定可能であり、そして対照培養細胞により産生されたＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの比率と比較される。対照細胞に比べて試験化合物と接触した細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体ＲＮＡの増加は、心臓細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体遺伝子の転写および／または翻訳の刺激物質の指標であり、一方、減少は心臓細胞におけるＴＷＥＡＫ受容体遺伝子の転写および／または翻訳の阻害剤の指標である。
【００９７】
ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現のレベルを決定するために使用可能である他の種々の方法があり、そしてアッセイにおいてさらに使用し、試験化合物のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現のレベルに対する影響をさらに決定可能である。例えば、心臓のようにＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子を発現することが知られる、または思われる細胞型または組織からのＲＮＡは単離可能であり、そしてハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術を利用して試験可能である。単離された細胞は、細胞培養物からまたは患者に由来することが可能である。培養物からとられた細胞の解析は、細胞に基づく遺伝子治療技術の一部として、使用される細胞の評価において、あるいは化合物のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の発現に対する影響を試験するために必要な工程である。そのような解析は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現の活性化または不活性化を含む、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子の発現パターンの定量的なおよび定性的な側面の両方を明らかにすることができる。
【００９８】
そのような検出スキームの１つの態様において、ｃＤＮＡ分子は目的のＲＮＡ分子から合成される（例えば、ｃＤＮＡへのＲＮＡ分子の逆転写による）。次いで、ｃＤＮＡ中の配列は、核酸増幅反応、例えばＰＣＲ増幅反応などのための鋳型として使用される。本方法の逆転写工程および核酸増幅工程において、合成開始反応物（例えば、プライマー）として使用される核酸反応物は、上述のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子核酸部分の中から選択される。そのような核酸反応物の好ましい長さは、少なくとも９−３０ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、核酸増幅は、放射活性または非放射活性標識ヌクレオチドを使用して実行可能である。あるいは、十分に増幅した産物は、標準のエチジウムブロマイド染色による、またはいずれか他の適した核酸染色方法を利用することにより、産物が可視化できるように、十分に増幅した産物を生成可能である。
【００９９】
加えて、そのようなＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子発現アッセイを「ｉｎ ｓｉｔｕ」（即ち、核酸増幅が必要でないような生検または切除から得られた患者組織の組織切片（固定したおよび／または凍結した）上で直接的に）で実行することができる。上記のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子核酸部分は、そのようなｉｎ ｓｉｔｕ手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用可能である（例えば、Ｎｕｏｖｏ．Ｇ．Ｊ．、１９９２「ＰＣＲ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照されたい）。
【０１００】
本明細書に記載するもののようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用により影響される血管形成を変調に有用であり得る。ＴＷＥＡＫに影響される血管形成を刺激するまたは阻害するそのような方法は、本明細書で検討された。
【０１０１】
あるいは、アッセイシステムを設計して、本発明のＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドポリペプチドと結合でき、そしてそれにより、この相互作用から生じる血管形成に影響を及ぼすことができる化合物を同定可能である。同定された化合物は、例えば、標的組織または細胞の血管新生の変調に有用であり得るし、正常なＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用を崩壊させる化合物を同定するためのスクリーニングに有用であり得るし、またはそれ自体がそのような相互作用を崩壊しうる。
【０１０２】
ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドに結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、２つの成分を相互作用しそして結合することができるために十分な条件下および時間の間、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドおよび試験化合物の反応混合物を調製し、したがって反応混合物中に取り除かれそして／または検出され得る複合体を形成することを包含する。これらのアッセイは多様な方法で行われることができる。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体と結合する化合物をスクリーニングするそのようなアッセイを行う１つの方法は、ＴＷＥＡＫ受容体または試験基質を固相上にアンカーし、そして反応の終わりに固相上にアンカーされたＴＷＥＡＫ受容体／試験化合物複合体を検出することを包含するであろう。そのような方法の１つの態様において、ＴＷＥＡＫ受容体は固相表面上にアンカー可能であり、そしてアンカーされていない試験化合物を直接的にまたは間接的にのいずれかで標識してもよい。あるいは、これら同様の方法を使用して、受容体よりもむしろＴＷＥＡＫリガンドに結合する試験化合物をスクリーニング可能である。
【０１０３】
実際のところ、マイクロタイタープレートは固相として都合良く利用可能である。アンカーされた成分は、非共有または共有結合により固定化可能である。非共有結合は、タンパク質の溶液で固相表面を単純にコートし、そして乾燥することにより実行可能である。あるいは、固定化しようとするタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固相表面にアンカー可能である。表面は、あらかじめ調製され、そして保存可能である。
【０１０４】
アッセイを行うために、非固定化成分が、アンカーした成分を含有するコートされた表面に付加される。反応が完了した後、いかなる形成された複合体も固相表面上に固定化されたまま保持されるであろうような条件下で、非反応成分を除去する（例えば、洗浄による）。固相表面上にアンカーした化合物の検出は、多くの方法で実行可能である。前に固定化されていない成分があらかじめ標識されている場合、表面に固定化された標識の検出が複合体の形成を示唆する。前に固定化されていない成分があらかじめ標識されていない場合、間接標識を使用して、表面にアンカーされた複合体を検出可能であり；例えば、それは前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体を使用する（今度は、抗体が直接的に標識されていてもよく、あるいは標識抗Ｉｇ抗体で間接的に標識されていてもよい）。
【０１０５】
あるいは、反応は液相中で行われ、反応産物を非反応成分から分離し、複合体を検出可能であり；例えば溶液中に形成したいずれかの複合体をアンカーするためのＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドまたは試験化合物に特異的な固定化抗体を使用し、およびアンカーした複合体を検出するための可能性のある複合体の他の成分への特異的な標識抗体を使用する。
【０１０６】
ＴＷＥＡＫ受容体またはＴＷＥＡＫリガンドのいずれかへの結合剤として同定されたこれらの成分は、以下に記載されるようにＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用を干渉し、そしてそれによりＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用から生じる血管形成を抑制しまたは促進するそれらの能力についてさらに評価可能である。次いで、そのような化合物を療法的に使用して、血管形成を刺激するまたは阻害することが可能である。
【０１０７】
本発明のＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドポリペプチドは、スクリーニングアッセイにおいて使用し、ＴＷＥＡＫ受容体とリガンド間の相互作用を阻害する（アンタゴナイズする）か増進する（アゴナイズする）かのいずれかの、開示されたＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドと特異的に相互作用する化合物および低分子を同定することも可能である。したがって、例えば本発明のポリペプチドを使用して、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物混合物から、アンタゴニストおよびアゴニストを同定可能である。アンタゴニストおよびアゴニストは、本発明のポリペプチドの天然または修飾基質、リガンド、酵素、受容体などであってよく、または該ポリペプチドの構造的または機能的模倣体であってよい。本発明のＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用の可能性のあるアンタゴニストは、ポリペプチドに結合しそしてポリペプチドの結合部位を占め、それらの相互作用を利用できなくさせ、そしてしたがって血管形成を変調するそれらの正常な能力を妨げる低分子、ペプチドおよび抗体であってよい。他の可能性のあるアンタゴニストは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズ可能であり、そしてｍＲＮＡの本発明のポリペプチドへの翻訳を遮断するアンチセンス分子である。可能性のあるアゴニストは、本発明のＴＷＥＡＫポリペプチドに結合し、そして本発明のＴＷＥＡＫポリペプチドの開示された相互作用により引き起こされるような血管形成に影響を及ぼす低分子、ペプチドおよび抗体を含む。
【０１０８】
低分子アゴニストおよびアンタゴニストは、通常１０Ｋ分子量未満であり、そして細胞浸透性を増進し、分解に抵抗し、そしてそれらの生理学的半減期を延長する多くの生理化学的および薬理学的特性を保持することができる。（Ｇｉｂｂｓ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」 Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．７９，（１９９４））。そのままの分子、ならびにＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片のような断片を含む抗体を使用して、シグナルカスケードの開始を遮断することにより本発明のポリペプチドに結合しそして阻害することが可能である。抗体がヒト化されていることが好ましく、そして抗体がヒトであることがより好ましい。本発明の抗体はいずれかの種々の公知の方法により調製可能である。
【０１０９】
特異的スクリーニング方法は当該技術分野で公知であり、そして多くは、多数の試験化合物を短い時間内にスクリーニング可能になるように、ハイスループット試験システム中に大規模に取り入れられている。該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、細胞に基づくアッセイなどを含む種々の形式において実行可能である。これらのアッセイの形式は、当該技術分野で周知である。本発明のスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーのスクリーニングに敏感であり、そして低分子薬剤候補、抗体、ペプチドならびに他のアンタゴニストおよびアゴニストの同定に適している。
【０１１０】
ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用をアンタゴナイズするまたは阻害する分子の同定のための方法の１つの態様は、本発明のポリペプチドを発現する細胞を含有する培地に候補分子を添加し；候補分子の存在のためではなく、ポリペプチドが相互作用するように前記培地の条件を変化させ；そして結合および血管形成の阻害を観察することを包含する。ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドの結合は、以上で概説した競合的阻害アッセイにより決定可能であり、そして当該技術分野で周知である。この結合の血管形成効果は、例えば細胞密度アッセイ、または当該技術分野でまた周知である他の細胞増殖アッセイのような細胞増殖アッセイを介して決定してもよい。次いで、候補分子と接触した細胞の活性を、接触していない同じ細胞と比較してよく、そして本発明のＴＷＥＡＫポリペプチド相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストが同定してもよい。生物学的活性の測定は、存在するタンパク質の量の測定（例えば、ＥＬＩＳＡ）またはタンパク質の活性の測定のような多くの周知の方法により実行可能である。生物学的刺激または活性の減少は、アンタゴニストを示唆する。増加はアゴニストを示唆する。
【０１１１】
スクリーニングアッセイを設計し、本発明のＴＷＥＡＫポリペプチド相互作用から生じる生物学的活性を模倣する分子をさらに発見可能である。ポリペプチドの生物学的活性を模倣する分子は、ポリペプチドの生物学的活性を増進するために有用であり得る。ポリペプチドの生物学的活性を模倣する療法活性剤のための化合物を同定するために、候補分子がポリペプチドに結合するか否かをまず決定しなければならない。次いで、結合候補分子は、その生物学的効果を決定するために生物学的アッセイに加えられる。次いで、候補分子の生物学的効果をポリペプチドのものと比較する。
【０１１２】
加えて、試験化合物および正常なＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内の複合体形成を、試験化合物および突然変異体ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内の複合体形成と比較可能してもよい。突然変異体の相互作用を崩壊するが、正常なＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子タンパク質は崩壊しない化合物の同定が望ましい場合において、この比較は重要であり得る。
【０１１３】
ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンドの遺伝子産物および結合パートナーの相互作用を干渉する化合物のアッセイは、異種のまたは同種の形式で行うことが可能である。異種アッセイは、固相上にＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物または結合パートナーのいずれかをアンカーし、そして反応の終わりに固相上のアンカーされた複合体を検出することを包含する。同種アッセイにおいて、全反応は液相中で行われる。いずれのアプローチにおいて、反応物の添加の順序を変更して、試験されている化合物に関する異なった情報を得ることが可能である。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物および結合パートナー間の相互作用を干渉する（例えば、競合による）試験化合物は、試験基質の存在下で反応を行うことによって同定可能であり；即ち、ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンド遺伝子産物の前に、または同時に、反応混合物に試験基質を追加することによる。あるいは、例えば複合体から成分の１つを置き換えた高い結合定数を有する化合物のような、あらかじめ形成された複合体を崩壊する試験化合物は、複合体が形成された後に、反応混合物に試験化合物を添加することにより試験可能である。多様な形式が以下で手短に記載される。
【０１１４】
異種アッセイシステムにおいて、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物のいずれかが固相表面上にアンカーされ、一方、非アンカー種は直接または間接のいずれかで標識される。実際上は、マイクロタイタープレートが都合良く利用される。アンカーされた種は、非共有または共有結合により固定化されうる。非共有結合は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物の溶液で固相表面をコートし、そして乾燥することにより簡単に実行可能である。あるいは、アンカーしようとする種に特異的な固定化抗体を使用して、種を固相表面にアンカー可能である。表面は、あらかじめ調製され、そして保存可能である。
【０１１５】
アッセイを行うために、固定化種のパートナーは、試験化合物ありのまたはなしのコートされた表面に曝される。反応が完了した後に、非反応化合物を除去し（例えば、洗浄により）、そしていずれかの形成された複合体が固相表面上に固定化されて残るであろう。固相表面上にアンカーされた複合体の検出は、多くの方法により実行可能である。非固定化種があらかじめ標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示唆する。非固定化種があらかじめ標識されていない場合、間接標識を使用して表面上にアンカーされた複合体を検出可能であり；例えば、はじめの非固定化種に特異的な標識抗体を使用する（今度は、該抗体が直接的に標識され、または標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識可能である）。反応成分の追加の順序に依存して、複合体形成を阻害するまたは複合体形成を崩壊する試験化合物が検出可能である。
【０１１６】
あるいは、反応は、試験化合物の存在下または非存在下の液相中で行われ、反応産物を非反応成分から分離し、そして複合体を検出し；例えば、溶液中で形成されたいずれかの複合体をアンカーするための結合成分の１つに特異的な固定化抗体、およびアンカーされた複合体を検出するための他のパートナーに特異的な標識抗体を使用する。再び、液相への反応物の添加の順序に依存して、複合体を阻害しまたはあらかじめ形成された複合体を崩壊する試験化合物を同定可能である。
【０１１７】
本発明の代わりの態様において、同種アッセイが使用可能である。このアプローチにおいて、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物のあらかじめ形成された複合体は、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかが標識されて調製されるが、標識により生成されたシグナルは複合体形成のために消される（例えば、免疫アッセイのためにこのアプローチを利用する、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎの米国特許４，１０９，４９６号を参照されたい）。実行された複合体と競合し、そして該複合体由来の種の１つを置き代える試験基質の添加は、上述の背景のシグナルの生成という結果となる。この方法において、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物相互作用を崩壊する試験化合物を同定可能である。
【０１１８】
特定の態様において、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物は、組換えＤＮＡ技術を使用して固定化のために調製可能である。例えば、ＴＷＥＡＫ受容体のまたはリガンドのコード領域は、結果生じる融合タンパク質においてその結合活性が維持されるような方式で、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合可能である。当該技術分野で日常的に実施される方法を使用して、相互作用結合パートナーは精製され、そして使用され、そしてモノクローナル抗体を作ることが可能である。この抗体は、例えば当該技術分野で日常的に実施される方法により、放射性同位体〈１２５〉Ｉで標識可能である。異種アッセイにおいて、例えばＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズにアンカー可能である。次いで、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物は、相互作用および結合が生じることが可能な方式で、試験化合物の存在または非存在下で添加可能である。反応時間の終わりに、非結合材料を洗浄可能であり、そして標識モノクローナル抗体を該システムに添加し、そして複合体形成した成分に結合することが可能である。ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンド遺伝子産物間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに結合したまま残る放射活性の量を測定することにより検出可能である。試験化合物による相互作用の成功した阻害は、測定された放射活性の減少に帰着するであろう。
【０１１９】
あるいは、ＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体遺伝子融合タンパク質およびＴＷＥＡＫリガンド遺伝子産物（または、その逆）は、固相のグルタチオン−アガロースビーズの非存在下で液中で共に混合可能である。試験化合物は、種が相互作用できる間、またはその後のいずれかに追加可能である。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加可能であり、そして非結合材料は洗浄される。再び、ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド遺伝子産物相互作用の阻害の程度は、標識抗体を追加し、そしてビーズと結合した放射活性を測定することにより検出可能である。
【０１２０】
本発明のもう１つの態様において、これら同様の技術が、１つまたは両方の全長タンパク質の代わりに、ＴＷＥＡＫ受容体および／またはリガンドタンパク質の結合ドメインに対応するペプチド断片を使用して、採用可能である。当該技術分野で日常的に実行される任意の数の方法を使用して、結合部位を同定しそして単離することが可能である。これらの方法は、限定はされないが、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発、および免疫共沈アッセイにおける結合の崩壊のスクリーニングを含む。次いで、複合体における第二の種をコードする遺伝子の代償性突然変異が選択可能である。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列解析は、相互作用結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにするであろう。あるいは、あるタンパク質を本項目の上に記載した方法を使用して固相表面にアンカー可能であり、そしてトリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理した、その標識された結合パートナーと相互作用しそして結合することができる。洗浄後、結合ドメインを含んでなる短い標識されたペプチドは固相材料と結合したままであることができ、それは単離され、そしてアミノ酸配列決定により同定可能である。また、部分をコードする遺伝子を遺伝子工学処理して、タンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いでそれを結合活性および精製または合成のために試験することができる。
【０１２１】
例えば、限定する目的ではないが、ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド遺伝子産物は、ＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体またはリガンド融合タンパク質を生成し、そしてグルタチオンアガロースビーズに結合可能にすることにより、本項目において上で記載したように固相材料にアンカー可能である。得られた相互作用結合パートナーは、〈３５〉Ｓのような放射性同位体で標識可能であり、そしてトリプシンのようなタンパク質分解酵素で切断可能である。次いで、切断産物は、アンカーされたＧＳＴ−ＴＷＥＡＫ受容体融合タンパク質またはＴＷＥＡＫリガンド融合タンパク質に添加することができ、そして結合可能である。非結合ペプチドの洗浄後、結合パートナー結合ドメインを表わす標識結合材料は、周知の方法により溶出され、精製され、そしてアミノ酸配列決定の解析が可能である。そのように同定されたペプチドは合成的に生成可能であり、または組換えＤＮＡ技術を使用して適切な容易にするタンパク質に結合可能である。
【０１２２】
インビボの本発明のＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用は、細胞または組織の標的群における血管形成を刺激するか阻害するかのいずれかであるカスケードの事象を開始する。核酸分子、タンパク質、または低分子のような分子は、今度はこのカスケードに影響を及ぼす。この方法でＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用効果を崩壊する化合物は、血管形成の調節に有用であり得る。
【０１２３】
ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用の血管形成または抗血管形成効果を干渉する化合物を同定するために使用されるアッセイシステムの基本原理は、ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドが相互作用しそして結合し、よって複合体を形成することが可能なために十分な条件下および時間の間で、ＴＷＥＡＫ受容体およびリガンドを含有する反応混合物を調製することを包含する。この相互作用の効果の阻害活性のための化合物を試験するために、反応混合物は試験化合物の存在下および非存在下において調製される。試験化合物ははじめ反応混合物中に含んでもよく、あるいはＴＷＥＡＫ受容体−リガンド複合体の添加に続く時間に添加してもよい。対照反応混合物は、試験化合物なしで、または偽薬と共にインキュベートされる。次いで、血管新生に対するＴＷＥＡＫ複合体のいずれかの効果の阻害または強化を検出する。試験化合物を含有する反応混合物中ではなく、対照反応における正常な血管形成応答は、化合物がＴＷＥＡＫ受容体−リガンド相互作用により開始されるカスケードの事象を干渉することを示唆する。試験化合物を含有する培養における増進した血管形成は、ＴＷＥＡＫ受容体−リガンド複合体効果の刺激物質を示唆する。
【０１２４】
続く実施例は特定の態様を説明することを意図するものであり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体のクローニングおよび同定を示す。
ＴＷＥＡＫ受容体ｃＤＮＡの発現クローニング
ＴＷＥＡＫ受容体ｃＤＮＡをクローニングするために、ヒトＴＷＥＡＫの増殖ホルモンリーダー、ロイシンジッパーマルチマー化ドメイン、およびＣ末端細胞外ドメインをコードする発現ベクター（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（５１）：３２４０１，１９９７を参照されたい）を構築した。ｐＤＣ４０９−ＬＺ−ＴＷＥＡＫと命名されたこの発現ベクターは、配列番号１のＤＮＡ配列を含んでなり、そして配列番号２のポリペプチドをコードする。ｐＤＣ４０９−ＬＺ−ＴＷＥＡＫ馴化上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を、ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞に一過的にトランスフェクションすることにより産生した。ロイシンジッパーに対するマウスモノクローナル抗体とあらかじめインキュベートしたポリクローナルヤギ抗マウス抗体でコートした磁性ビーズと、これらの上清をインキュベートした。対照ビーズは、空ベクターでトランスフェクトした細胞からの上清でコートしたビーズを混合することにより生産した。
【０１２６】
Ｔ１７５フラスコ中で増殖した単層のＣＯＳ細胞を、ＨＵＶＥＣのｃＤＮＡ発現ライブラリーからの１００，０００の複雑性の１５μｇのＤＮＡプールでトランスフェクトした。２日後、これらの細胞をフラスコから引き上げ、そして５％無脂肪乾燥ミルクを加えた１．５ｍｌの結合培地中、回転装置ホイール上で３時間、４℃でインキュベートした。細胞を対照ビーズの添加により前清澄して、４℃でさらに４５分間回転し、その後ビーズに結合した細胞を磁石で取り除いた。前清澄を２−３回繰り返し、次いでＴＷＥＡＫコートビーズを細胞に添加し、そして３０分間、４℃で回転した。細胞が結合したＴＷＥＡＫビーズを、磁石を用いて分離し、そして４ｘＰＢＳ中で洗浄した。プラスミドＤＮＡを０．１％ＳＤＳ中で溶解することによってこれらの細胞から抽出し、そしてＤＨ１０１Ｂ細胞中の上清をエレクトロポレーションした。コロニーをアンピシリン選択培地上で一晩増殖させた。形質転換体をプールし、そしてさらなるパニングの回のためにプラスミドＤＮＡの供給源として使用した。２回のパニングの後、以下のパートＢに記載するようなスライド結合プロトコルを使用してＴＷＥＡＫに結合するそれらの能力に基づいて、結果生じたプールからポジティブクローンを選び取った。
【０１２７】
ヒトＴＷＥＡＫ受容体（ＴＷＥＡＫＲとも呼ばれる）のｃＤＮＡが配列番号３の配列を有することを決定し、それは１２９残基のポリペプチドをコードした（配列番号４）。配列の検討により、およそ７８アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号４の１−７８番目の残基、シグナルペプチドを含む）、およそ２３アミノ酸の膜貫通ドメイン（配列番号４の７９−１０１番目の残基）、およびおよそ２８アミノ酸の細胞内ドメイン（配列番号４の１０２−１２９番目の残基）を有するポリペプチドが予測される。ＴＷＥＡＫＲは、最も小さい公知のＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。他のＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーの３−４繰り返しに比較して、それは細胞外ドメインに単一のシステインに富んだ繰り返し領域を有する。ＴＷＥＡＫＲポリペプチドは、以前にヒト肝臓ｃＤＮＡクローンによりコードされた膜貫通タンパク質として記載されたが（ＷＯ９８／５５５０８、ＷＯ９９／６１４７１もまた参照されたい）、ＴＷＥＡＫ受容体として同定されなかった。マウスホモログのＦＧＦ−誘導可能（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ） Ｆｎ１４（Ｍｅｉｇｈａｎ−Ｍａｎｔｈａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４６）３３１６６，１９９９）は、図１の並列により示されたヒトタンパク質におよそ８２％の同一性である。
【０１２８】
新たに同定されたＴＷＥＡＫ受容体を、ＴＷＥＡＫに結合する能力について、ＤＲ３（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ８：５２５、１９９８によりＴＷＥＡＫ受容体として同定されている）と並べて試験した。
【０１２９】
Ｂ．ＴＷＥＡＫに結合するＴＷＥＡＫ受容体
ＣＯＳ細胞のスライドを、ＴＷＥＡＫＲ、ＤＲ３または挿入無しのベクター（対照）を含有する発現ベクターでトランスフェクトした。２日後、ロイシンジッパーＴＷＥＡＫ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードするベクターでトランスフェクトしたＣＶ−１細胞からの濃縮上清とインキュベートした。１時間後、細胞を洗浄し、そしてロイシンジッパードメインに対するＩ−１２５標識抗体で精査した（ｐｒｏｂｅ）。スライドを洗浄し、固定し、そしてＸ線フィルムを使用してオートラジオグラフィーを実行した。ＴＷＥＡＫＲトランスフェクト細胞は、かなりの量のＴＷＥＡＫに結合した。ＴＷＥＡＫは、ＤＲ３でトランスフェクトした細胞または対照細胞に結合しなかった。この実験は、ＤＲ３よりむしろ、上のパートＡにおいて同定されたＴＷＥＡＫＲポリペプチドが、ＴＷＥＡＫの主要な受容体であることを確認した。機能的ＴＷＥＡＫ受容体の発見の後、他の研究者もまた、ＤＲ３はＴＷＥＡＫへの主要な受容体ではないと報告した（Ｋａｐｔｅｉｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４８５（２−３）：１３５，２０００）。ＴＷＥＡＫ−ＴＷＥＡＫＲ結合相互作用を、スキャッチャード解析によりさらに特徴付けた。
【０１３０】
ＣＶ−１細胞をヒト全長ＴＷＥＡＫでトランスフェクトし、そしてＴＷＥＡＫを発現しないＲａｊｉ細胞と１：３０で混合した。該細胞を、１２５−Ｉ標識ヒトＴＷＥＡＫ受容体−Ｆｃの連続希釈で、２時間、４℃でインキュベートした。フリーのおよび結合したプローブを、プラスチックチューブ中のファレート（Ｐｈａｌａｔｅ）オイル混合物を通じて試料をマイクロフュージングする（ｍｉｃｒｏｆｕｇｉｎｇ）ことにより分離した。上清およびペレットをガンマ線カウントした。ＴＷＥＡＫリガンド結合ＴＷＥＡＫ受容体のスキャッチャード解析は、およそ４．５ｘ１０８Ｍ−１の結合アフィニティー定数（Ｋａ）を示した。
【０１３１】
Ｃ．ＴＷＥＡＫ受容体は、心臓組織において強く発現する
ＴＷＥＡＫ受容体の発現パターンを決定するために、ノーザンブロット解析を実行した。ヒト複数組織ノーザンブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カルフォリニア州パロアルト）から購入し、そしてＴＷＥＡＫ受容体コード領域からＰ−３２標識ランダムプライム化ＤＮＡで精査した。ブロットを洗浄し、そしてＸ線フィルムを使用してオートラジオグラフィーを実行した。結果は、大人において、ＴＷＥＡＫＲが心臓、胎盤、およびいくつかの骨格筋試料において発現するということを示した。心臓組織における強い発現が、心臓疾患の診断および治療におけるＴＷＥＡＫＲの有用性をさらに支持した。大人とは反対に、胎児の組織はＴＷＥＡＫＲをより普遍的に発現し；ＴＷＥＡＫＲ転写物が肺および肝臓において見られた。
【０１３２】
実施例２
本実施例は、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体Ｆｃ（ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ）融合ポリペプチドの組換え産生を示す。
【０１３３】
Ｆｃに融合したＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインをコードする核酸を構築するために、リーダー（シグナルペプチド）を含む、ＴＷＥＡＫＲ由来のＮ末端７９アミノ酸をコードする核酸を、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分をコードする核酸に接合した。この構築体の配列を配列番号６（核酸）および配列番号７（アミノ酸）として示す。配列番号７において、１−２７番目の残基は、予測されたシグナルペプチド（細胞から分泌される際に切断されることが予想される；実際の切断部位はＮ末端配列解析により同定された、以下を参照されたい）であり、２８−７９番目の残基は、システインに富んだＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメイン由来であり、８０−８１番目の残基はＢｇｌＩＩクローニング部位由来であり、そして残りはＦｃ部分である。哺乳動物発現ベクター中に挿入し、そして哺乳動物宿主細胞において発現しそして哺乳動物宿主細胞から分泌する際に、この構築体はＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃに指定されたポリペプチドを産生する。Ｎ末端配列解析は、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃに指定される分泌されたポリペプチドが、配列番号７の２８番目の残基（Ｇｌｕ）に対応するＮ末端を有することを決定した。ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃの抗血管形成活性は、続く実施例により記載されるもののようなアッセイを使用して実証された。Ｆｃ−融合構築体の類似体を、マウスＴＷＥＡＫＲ細胞外ドメインを使用して調製した。
【０１３４】
実施例３
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な平面内皮細胞移動（創傷閉鎖）アッセイを示す。このアッセイにおいて、内皮細胞移動を、培養された細胞単層における円形創傷の閉鎖の比率として測定する。創傷閉鎖の比率は直線状であり、そしてインビボでの血管形成を刺激しそして阻害する剤により劇的に調節される。
【０１３５】
初代ヒト腎臓微小血管内皮細胞であるＨＲＭＥＣを単離し、培養し、そしてＭａｒｔｉｎら，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３：２６１，１９９７に記載されるように、解凍後に３回継代で使用した。複製円形損傷である「創傷」（６００−８００ミクロンの直径）を、シリコン先端ドリルプレスを使用して集密ＨＲＭＥＣ単層において生成した。創傷時に、培地（ＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡ）を、２０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（フォルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸塩）、ＥＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）、および０．１５０〜５μｇ／ｍｌ ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ、または４０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦおよび０．１５０〜５μｇ／ｍｌＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃの組み合わせで補った。残った創傷面積を、顕微鏡および画像解析ソフトウエア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ，テネシー州ナッシュビル）を使用して、機能時間（０−１２時間）として測定した。相対的な移動比率を、時間とともにプロットされた残った創傷面積の直線回帰により、各剤のおよび剤の組み合わせについて計算した。結果を図２−３に示す。
【０１３６】
ｈｕＩｇＧまたは培地＋ＢＳＡに比較して、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは用量に応答する方式でＰＭＡ誘導内皮移動を阻害し、５μｇ／ｍｌで非刺激レベルに移動の比率を減じた（図２）。ｈｕＩｇＧもＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃも、基礎（非誘導性）移動を阻害しなかった。ＨＲＭＥＣ移動がＥＧＦにより誘導された時、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは、用量依存的な方式で内皮移動を阻害し、５μｇ／ｍｌで非刺激レベルに移動の比率を減じた（図３）。
【０１３７】
実施例４
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な、マウス角膜ポケットアッセイを示す。このアッセイにおいて、血管形成活性または抗血管形成活性について試験される剤は、ヒドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレット中に持続放出形態で固定され、それは麻酔されたマウスの角膜上皮に作られたマイクロポケット中に埋め込まれる。血管新生を、外見、密度、および通常の無血管の角膜中に、血管新生した角膜縁から内側に増殖した血管の範囲として測定する。
【０１３８】
Ｋｅｎｙｏｎら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｍｏｌ．＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ３７：１６２５，１９９６に記載されるように、ヒドロンペレットは、ｂＦＧＦ（９０ｎｇ／ペレット）、ｂＦＧＦおよびＩｇＧ（１４μｇ／ペレット、対照）、またはｂＦＧＦおよびＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ（１４μｇ）とスクラルファートを取り込んだ。ペレットを、６−８週齢のオスＣ５７ＢＬマウスの後方角膜縁の中央１ｍｍを顕微解剖により作った、角膜ストロママイクロポケット中に外科的に埋め込んだ。５日後、ｂＦＧＦの新血管新生反応のピークに、ペレットを含有する線の極軸から３５−５０°の初期角で、Ｚｅｉｓｓスリットランプを使用して、角膜を写真撮影した。画像をデジタル化し、そして差し引きカラーフィルター（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ４．０）により処理し、ヘモグロビン含量により、確立した微小血管を線引きした。画像解析ソフトウエア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ，テネシー州ナッシュビル）を使用して、血管新生した角膜画像、血管新生した範囲中の血管密度、および全角膜中の血管密度の比を計算した。
【０１３９】
表１に示されるように、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ（１００ｐｍｏｌ）は、ｂＦＧＦ（３ｐｍｏｌ）誘導角膜血管形成を阻害し、ＦＧＦ単独またはＦＧＦ＋ＩｇＧにより誘導される血管密度に対して５０％減少した。
【０１４０】
表１
マウス角膜ポケットアッセイにおけるＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＦＧＦ誘導血管形成に対する効果
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
実施例５
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な内皮細胞増殖アッセイを示す。このアッセイにおいて、カルセインＡＭと呼ばれる細胞標識分子を使用して、マイクロタイターウェル中の４日目の細胞増殖後に、内皮細胞増殖を測定する。細胞により発現したエステラーゼはカルセインを切断し、そして４８５ｎｍで励起したときそれは蛍光を生じる。非切断カルセインは蛍光を発しない。蛍光の量は、直接的に培養ウェル中の内皮細胞の数に関係する。内皮細胞増殖は、インビボでの血管形成を刺激しおよび／または阻害する剤によりしばしば調節される。
【０１４３】
初代ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を商業的供給源（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，メリーランド州ウォーカーズビル）から入手し、培養し、そして２から７回の継代で使用した。０．０５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を加えた内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ、増殖因子または血清を含有しない内皮細胞基礎培地であり、そしてコロラド大学のＲｉｃｈａｒｄ Ｈａｍ博士により開発された培地製剤に基づく，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）入りの各マイクロタイターウェルに３０００ＨＵＶＥＣを添加することにより、複製培養物をセットアップした。培養の開始の際に、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子−２，１０ｎｇ／ｍｌ）またはヒトＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、０．０８μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ（ＴＷＥＡＫ誘導については０．２５から２０μｇ／ｍｌ、そしてＦＧＦ−２誘導については０．０８から６．７μｇ／ｍｌ）の範囲の濃度で、ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ，対照）、またはヒトＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃの存在下で加えた。ＨＵＶＥＣ含有培養物を４日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培養４日目に、４μＭカルセイン−ＡＭを培養物に添加し、そして２時間後、ウェルを蛍光について評価した。ＳＥＭを加えたまたは引いた複製ウェルについて平均蛍光（４８５−５３０ｎｍ）カウントとして表わされた結果を図４および５に示す。
【０１４４】
ＴＷＥＡＫ誘導増殖に影響しないｈｕＩｇＧと比較して、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは用量依存的な方式でＴＷＥＡＫ誘導ＨＵＶＥＣ増殖を特異的に阻害した（図４）。加えて、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃは、そうでないｈｕＩｇＧと比較して、０．０５％ＦＢＳを加えたＥＢＭにおける培養の間観察した、ＨＵＶＥＣの基礎増殖を阻害した。興味深いことに、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃはまた、ＦＧＦ−２誘導ＨＵＶＥＣ増殖反応に影響しないｈｕＩｇＧと比較して、２μｇ／ｍｌ以上の濃度でＦＧＦ−２仲介ＨＵＶＥＣ増殖を阻害した（図５）。これらの結果は、ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃが外因性組換えヒトＴＷＥＡＫの添加により誘導されるＨＵＶＥＣ増殖を阻害することを示す。ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃが部分的に血清誘導ＨＵＶＥＣ増殖を阻害することは、ＨＵＶＥＣがＴＷＥＡＫＲを介してＥＣ（内皮細胞）の増殖／生存を促進する内因性ＴＷＥＡＫを産生することを示唆する。ＦＧＦ−２誘導増殖のＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃ減弱は、少なくともＦＧＦ−２へのＥＣ反応の一部は、内因性ＴＷＥＡＫ／ＴＷＥＡＫＲ相互作用に依存していることを示唆する。
【０１４５】
実施例６
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストの活性を測定するために有用な、マウス心臓の虚血／移植体モデルを示す。
【０１４６】
あるマウス提供者からもう１つの遺伝的に類似なマウスの耳の皮膚へ異所的に移植された心臓組織の生存は、生存および心筋機能のエネルギーを促進するために、移植された心臓および周辺の組織による十分な新血管新生を必要とする。移植部位での不十分な血管新生は、心臓の過度の虚血、組織損傷、および組織の移植の失敗を引き起こす。内皮細胞移動および血管形成に関与する因子をアンタゴナイズする剤は、移植部位での血管形成を減少可能であり、それにより移植組織の機能および究極的には移植自体を制限する。マウス異所心臓同種移植片モデルは、新血管新生に対する抗体およびＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃを含むＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの効果を実証するために使用される。
【０１４７】
メスＢＡＬＢ／ｃ（およそ１２週齢）被提供者は、同系統のマウス提供者から新生児心臓移植片を与えられる。提供者の心臓組織は、０日に被提供者の左耳の耳介に移植され、そしてマウスを２つのグループに分ける。対照グループはヒトＩｇＧ（Ｈｕ ＩｇＧ）を、一方他のグループはＴＷＥＡＫＲアンタゴニストを、両方とも腹腔内に受ける。処置は５日間連続で続ける。移植片の機能性を、移植後７−１４日での可視脈動仮性をモニターすることによって決定する。ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの用量の機能として、機能性移植の阻害を決定する。移植された心臓の組織構造を、移植部位での浮腫ならびに宿主および提供者組織の血管構造に対するＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの効果を可視化するために（例えば、因子ＶＩＩＩ染色を使用して）検査する。
【０１４８】
実施例７
本実施例は、ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニストでの腫瘍の治療の方法を示す。
ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストを、充実性腫瘍の動物モデルにおいて試験する。ＴＷＥＡＫＲアンタゴニストの効果を、腫瘍の頻度および腫瘍増殖を測定することにより決定する。
【０１４９】
実施例８
本実施例は、例えばモノマー化およびマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーのような、ＴＷＥＡＫ結合分子の結合特性を決定するために有用なＥＬＩＳＡに基づくアッセイを示す。本実施例のために、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１）、トリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３）、およびＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９）を使用した。
【０１５０】
９６ウェルＬＩＮＢＲＯ（登録商標）／ＴＩＴＥＲＴＥＫＴＭ酵素免疫アッセイプレート（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，オハイオ州オーロラ）を、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）でコートし、プレートシーラーを適用し、そして４℃で一晩インキュベートした。各ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ２０；２００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、次いでＰＢＳＴ＋３％無脂肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）中で、１時間３７℃でインキュベートした。
【０１５１】
別個の反応において、ＦＬＡＧタグの付加したＴＷＥＡＫ（ＴＷＥＡＫ−ＦＬＡＧ）を、５０ｎｇ／ｍｌのＴＷＥＡＫ−ＦＬＡＧの最終濃度で９６ウェルＵ底プレートにおいて、周辺温度で３０分間、ＤＭＥＭ＋０．５％低Ｉｇ血清中で、上述のＴＷＥＡＫＲポリペプチドのそれぞれでプレインキュベートし、そして各ＴＷＥＡＫＲポリペプチドの最終濃度は、９，０００から４ｎｇ／ｍｌの３倍連続希釈であった。
【０１５２】
ＥＩＡプレートを、再びＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで３回洗浄した。５０μｌ／ウェルのリガンド／受容体混合物を添加し、周辺温度で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで３回洗浄した。
【０１５３】
ＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭ中で１：５００に希釈したＦＬＡＧ−Ｍ２ビオチン化抗体を、５０μｌ／ウェルで添加し、４５分間周辺温度でインキュベートし、ＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで３回洗浄した。
【０１５４】
ＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭ中で１：２０００に希釈したＳＡ−ＨＲＰを、５０μｌ／ウェルで添加し、次いで４５分間周辺温度でインキュベートした。
プレートを５回洗浄し、１００μｌ／ウェルの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、そしてプレートを周辺温度で５−２０分間インキュベートした。
【０１５５】
反応を５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で停止し、そしてＡ４５０／５７０で吸光度を測定した。
【０１５６】
図６に示されるように、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃが最も弱い結合を示し、ＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ、次いでジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１）、次いでトリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３）と続いた。したがって、融合タンパク質が含む可溶性ＴＷＥＡＫＲドメインが多いほど、そのＴＷＥＡＫへの結合は強くなる。さらに、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃおよびジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ間の結合の違いにより示されるように、結合の増加は添加物以上であった。
【０１５７】
実施例９
本実施例は、例えばモノマー化およびマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーのような、ＴＷＥＡＫ結合分子の結合特性を決定するために有用な、ユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃを使用した競合結合アッセイを示す。本実施例のために、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１）、トリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３）、およびＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９）を使用した。
【０１５８】
Ｍ２抗ｆｌａｇ抗体を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中で４μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１００μｌ／ウェルを、コート９６ウェル平底プレートに使用した。プレートシーラーを適用し、そしてプレートを４℃で一晩インキュベートした。
【０１５９】
各ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ２０）で５回洗浄し、次いで２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭを添加した。プレートを１時間３７℃でインキュベートし、次いでＰＢＳＴで５回洗浄した。
【０１６０】
ＦＬＡＧ−ＴＷＥＡＫをＰＢＳ中に５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μｌ／ウェルで添加した。プレートを周辺温度で振盪しながら１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回以上洗浄した。
【０１６１】
非標識およびユーロピウム標識受容体を９６ウェルＵ底プレート中で前混合し、ユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲが３５ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるようにＰＢＳＴ＋３％ＮＦＤＭで希釈し、非標識受容体の３倍希釈で９０００−１２ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
【０１６２】
各ウェルに１００μｌの前混合受容体を添加した。プレートを１時間、周辺温度で、振盪しながらインキュベートし、次いでこれまでのように１０回洗浄した。１００μｌ／ウェルの増進溶液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，１２４４−１０５）を添加し、そしてプレートを振盪しながら５分間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃプレートリーダーで、吸光度をＡ６１５で測定した。
【０１６３】
図７に示されるように、モノマー化ＴＷＥＡＫＲは、ＴＷＥＡＫに結合するためのユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃとの最も弱い競合能力を示し、ダイマー化ＴＷＥＡＫＲおよびトリマー化ＴＷＥＡＫＲと続いた。
【０１６４】
実施例１０
本実施例は、例えばモノマー化およびマルチマー化ＴＷＥＡＫＲ−Ｆｃオリゴマーのような、ＴＷＥＡＫ結合分子の結合特性を決定するために有用な、ＥＬＩＳＡ型アッセイを示す。
【０１６５】
ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１５）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：Ｆｃ（配列番号１７）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、リンカー、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１８）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、リンカー、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１９）は、Ｎ末端メチオニン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、ＴＷＥＡＫ受容体の２９番目の残基から７０番目の残基、５つのグリシン残基、およびＦｃ断片由来ペプチドを含んでなる融合タンパク質である。
【０１６６】
実施例８に記載されるものに類似のＥＬＩＳＡ型アッセイを使用して、モノマー化オリゴマー（ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＦｃおよびＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：Ｆｃ）が同じくらいにＴＷＥＡＫに結合するが、ダイマー化オリゴマー構築物（ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＦｃおよびＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ）よりも弱いことを決定した（図８）。
【０１６７】
実施例１１
本実施例は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノ−３（配列番号２１）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー−１（配列番号２３）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー−５（配列番号２５）、ＴＷＥＡＫＲ４０クオド（ｑｕａｄ）−２（配列番号２７）、ＴＷＥＡＫＲ４０クイント（ｑｕｉｎｔ）−１（配列番号２９）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノ−Ｆ４（配列番号３１）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー−Ｆ２（配列番号３３）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー−１（配列番号３５）、ＴＷＥＡＫＲ４３クオド−２（配列番号３７）、ＴＷＥＡＫＲ４３クイント−３（配列番号３９）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘックス（ｈｅｘ）−１（配列番号４１）、およびＴＷＥＡＫＲ４３セプト（ｓｅｐｔ）−１（配列番号４３）を使用する、ＥＬＩＳＡに基づくＴＷＥＡＫ結合アッセイの結果を示す。洗浄緩衝液からＢＳＡの存在を省略したことを除いては、実施例８に記載のプロトコルを使用した。結果を図９−１２に示す。
【０１６８】
実施例１２
本実施例は、実施例９に記載されるユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃを使用した競合結合アッセイの結果を示す。本実施例においては、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノ−３（配列番号２１）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー−１（配列番号２３）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー−５（配列番号２５）、ＴＷＥＡＫＲ４０クオド（ｑｕａｄ）−２（配列番号２７）、ＴＷＥＡＫＲ４０クイント（ｑｕｉｎｔ）−１（配列番号２９）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノ−Ｆ４（配列番号３１）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー−Ｆ２（配列番号３３）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー−１（配列番号３５）、ＴＷＥＡＫＲ４３クオド−２（配列番号３７）、ＴＷＥＡＫＲ４３クイント−３（配列番号３９）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘックス（ｈｅｘ）−１（配列番号４１）、およびＴＷＥＡＫＲ４３セプト（ｓｅｐｔ）−１（配列番号４３）を使用した。結果を図１３および１４に示す。
【０１６９】
本明細書に引用される文献の関連ある開示は、参照により特に取り込まれる。以上の実施例は、本発明の範囲を網羅することまたは限定することを意図するものではない。当業者は、以上の教示に照らして修飾および変化の可能性があり、そのような修飾および変化は本発明の範囲内であることを意図しているを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド配列の配列並列を示す。上段配列がマウスＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド（配列番号５）であり、そして下段配列がヒトＴＷＥＡＫ受容体ポリペプチド（配列番号４）である。
【図２】図２は、ＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＰＭＡ誘導ＨＲＭＥＣ創傷閉鎖への効果を示す。
【図３】図３は、ＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＥＧＦ誘導ＨＲＭＥＣ創傷閉鎖への効果を示す。
【図４】図４は、ヒトＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＴＷＥＡＫ誘導（１００ｎｇ／ｍｌ）ＨＵＶＥＣ増殖への効果を示す。
【図５】図５は、ヒトＴＷＥＡＫＲ−ＦｃのＦＧＦ−２誘導（１０ｎｇ／ｍｌ）ＨＵＶＥＣ増殖への効果を示す。
【図６】図６は、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７；「モノマー」）、ＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９、「ＤＲ５」）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１、「ダイマー」）、およびトリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３、「トリマー」）の、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおけるＴＷＥＡＫ−ＦＬＡＧへの結合を示す。
【図７】図７は、ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７；「ｈｕ＋ｅｕ」）、ＴＷＥＡＫＲ：ＤＲ５：Ｆｃ（配列番号９、「ＤＲ５＋ｅｕ」）、ジ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１１、「ｄｉ＋ｅｕ」）、およびトリ−ＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号１３、「ｔｒｉ＋ｅｕ」）の、競合結合アッセイにおけるＴＷＥＡＫへ結合するためのユーロピウム標識ＴＷＥＡＫＲとの競合の能力を示す。
【図８】図８は、ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１５；黒丸）、ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：Ｆｃ（配列番号１７、アスタリスク）、ＴＷＥＡＫＲ：１ＫＰＥＧ：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１８；黒三角）、およびＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：ＴＷＥＡＫＲ：Ｇｌｙ５：Ｆｃ（配列番号１９；白丸）の、ＥＬＩＳＡ型アッセイを使用したＴＷＥＡＫへの結合を示す。
【図９】図９は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノマー（配列番号３１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー（配列番号３３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー（配列番号３５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲテトラマー（配列番号３７）（白ダイヤモンド）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１０】図１０は、ＴＷＥＡＫＲ４３テトラマー（配列番号３７）（白ダイヤモンド）、ＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘキサマー（配列番号４１）（白三角）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ヘプタマー（配列番号４３）（アスタリスク）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ ＴＡＮＤＥＭ（配列番号１９、安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞において発現する）、ＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘキサマー（配列番号４１）（白三角）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ヘプタマー（配列番号４３）（アスタリスク）を使用した、３３ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１２】図１２は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノマー（配列番号２１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー（配列番号２３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー（配列番号２５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲ４０テトラマー（配列番号２７）（白ダイヤモンド）、およびＴＷＥＡＫＲ４０ペンタマー（配列番号２９）（白丸）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの可溶性ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃオリゴマーの比較を示す。
【図１３】図１３は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０モノマー（配列番号２１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４０ダイマー（配列番号２３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４０トリマー（配列番号２５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲ４０テトラマー（配列番号２７）（白ダイヤモンド）、およびＴＷＥＡＫＲ４０ペンタマー（配列番号２９）（白丸）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの固定化ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃ対ユーロピウムＴｗｅａｋＲの比較を示す。
【図１４】図１４は、ｈｕＴＷＥＡＫＲ：Ｆｃ（配列番号７）（黒四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３モノマー（配列番号３１）（白四角）、ＴＷＥＡＫＲ４３ダイマー（配列番号３３）（白三角）、ＴＷＥＡＫＲ４３トリマー（配列番号３５）（クロス）、ＴＷＥＡＫＲ４３テトラマー（配列番号３７）（白ダイヤモンド）、ＴＷＥＡＫＲ４３ペンタマー（配列番号３９）（白丸）、ＴＷＥＡＫＲ４３ヘキサマー（配列番号４１）（垂直線）、およびＴＷＥＡＫＲ４３ヘプタマー（配列番号４３）（アスタリスク）を使用した、５０ｎｇ／ｍｌでの固定化ＴＷＥＡＫに結合するＴｗｅａｋＲ−Ｆｃ対ユーロピウムＴｗｅａｋＲの比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＷＥＡＫ受容体の第一可溶性断片、ＴＷＥＡＫ受容体の第二可溶性断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＴＷＥＡＫに結合し、そして前記第一可溶性断片が
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記第一可溶性断片が
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
前記第一可溶性断片が
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項２のポリペプチド。
【請求項４】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項５】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項４のポリペプチド。
【請求項６】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
ＴＷＥＡＫ受容体の第三可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項８】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項７のポリペプチド。
【請求項９】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項９のポリペプチド。
【請求項１１】
ＴＷＥＡＫ受容体の第四可溶性断片をさらに含んでなる、請求項７のポリペプチド。
【請求項１２】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１３】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項１２のポリペプチド。
【請求項１４】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項１３のポリペプチド。
【請求項１５】
ＴＷＥＡＫ受容体の第五可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１６】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１５のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項１６のポリペプチド。
【請求項１８】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項１７のポリペプチド。
【請求項１９】
ＴＷＥＡＫ受容体の第六可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１５のポリペプチド。
【請求項２０】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１９のポリペプチド。
【請求項２１】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項２０のポリペプチド。
【請求項２２】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項２１のポリペプチド。
【請求項２３】
ＴＷＥＡＫ受容体の第七可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１９のポリペプチド。
【請求項２４】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項２３のポリペプチド。
【請求項２５】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項２４のポリペプチド。
【請求項２６】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項２５のポリペプチド。
【請求項２７】
リンカーをさらに含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項２８】
前記リンカーが、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合する、請求項２７のポリペプチド。
【請求項２９】
前記リンカーが、前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する、請求項２７のポリペプチド。
【請求項３０】
第一リンカーおよび第二リンカーをさらに含んでなり、ここで前記第一リンカーは前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合し、そして前記第二リンカーは前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３１】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＧ（配列番号４５）を含んでなる、請求項２７のポリペプチド。
【請求項３２】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、介在ポリペプチド配列なしに共に接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３３】
前記第一可溶性断片および前記オリゴマー化ドメインが、介在ポリペプチド配列なしに共に接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３４】
前記第一可溶性断片、前記第二可溶性断片、および前記オリゴマー化ドメインが介在ポリペプチド配列なしに、直鎖状で連続しているポリペプチドにおいて共に接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３５】
前記オリゴマー化ドメインが、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＮ末端である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３６】
前記オリゴマー化ドメインが、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＣ末端である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３７】
前記オリゴマー化ドメインがロイシンジッパーを含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項３８】
前記オリゴマー化ドメインが抗体の断片を含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項３９】
前記抗体の断片がＦｃドメインを含んでなる、請求項３８のポリペプチド。
【請求項４０】
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項４１】
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、請求項４０のポリペプチド。
【請求項４２】
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項４１のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１の第一ポリペプチドおよび請求項１の第二ポリペプチドを含んでなるタンパク質であって、前記第一および第二ポリペプチドが互いにオリゴマー化している、前記タンパク質。
【請求項４４】
前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列が前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である、請求項４３のタンパク質。
【請求項４５】
前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列が前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一でない、請求項４３のタンパク質。
【請求項４６】
対象中のＴＷＥＡＫ受容体を阻害する方法であって、前記対象に請求項１のポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４７】
対象中の血管形成を阻害する方法であって、前記対象に請求項１のポリペプチドを含んでなる組成物の治療上の有効量を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４８】
前記組成物が医薬的に許容できる担体をさらに含んでなる、請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記対象が哺乳動物である、請求項４７の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記対象が血管形成により仲介されまたは悪化した疾患または状態を有する、請求項４７の方法。
【請求項５２】
前記疾患または状態が眼の新血管新生により特徴付けられる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記疾患または状態が充実性腫瘍である、請求項５１の方法。
【請求項５４】
放射線で前記対象を治療することをさらに含んでなる、請求項５３の方法。
【請求項５５】
第二化学療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる、請求項５３の方法。
【請求項５６】
前記第二化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、植物由来化学療法剤、ニトロソウレア、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血球因子、放射線療法剤、および生物学的応答修飾剤からなる群より選択される、請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記第二化学療法剤が、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リンホカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、デルタインターフェロン、ＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌアスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される、請求項５５の方法。
【請求項５８】
前記疾患または状態が炎症性疾患または状態である、請求項５１の方法。
【請求項５９】
第二療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記第二療法剤が炎症を促進するサイトカインまたはサイトカイン受容体を阻害する、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記第二療法剤が前記サイトカイン受容体の可溶性断片、前記サイトカインに結合する抗体、または前記サイトカイン受容体に結合する抗体を含んでなる、請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記第二療法剤が炎症を阻害する受容体を活性化する、請求項５９の方法。
【請求項６３】
前記第二療法剤が、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１４８アゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニスト、およびＴｅｋアンタゴニストからなる群より選択される、請求項５９の方法。
【請求項６４】
請求項１の前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる、核酸またはその相補体。
【請求項６５】
前記核酸またはその相補体が中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第二核酸にハイブリダイズし、そして前記第二核酸が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項６４の方法。
【請求項６６】
前記核酸またはその相補体が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、請求項６４の方法。
【請求項６７】
前記核酸またはその相補体が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、請求項６６の方法。
【請求項６８】
前記核酸またはその相補体が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記核酸が、
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードする、請求項６４の方法。
【請求項７０】
請求項６４の前記核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項７１】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項７０のベクター。
【請求項７２】
請求項６４の前記核酸を含んでなる、宿主細胞。
【請求項７３】
ポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項７２の宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
【請求項１】
ＴＷＥＡＫ受容体の第一可溶性断片、ＴＷＥＡＫ受容体の第二可溶性断片、およびオリゴマー化ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＴＷＥＡＫに結合し、そして前記第一可溶性断片が
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記第一可溶性断片が
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
前記第一可溶性断片が
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項２のポリペプチド。
【請求項４】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項５】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項４のポリペプチド。
【請求項６】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
ＴＷＥＡＫ受容体の第三可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項８】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項７のポリペプチド。
【請求項９】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、および第三可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項９のポリペプチド。
【請求項１１】
ＴＷＥＡＫ受容体の第四可溶性断片をさらに含んでなる、請求項７のポリペプチド。
【請求項１２】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１３】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項１２のポリペプチド。
【請求項１４】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、および第四可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項１３のポリペプチド。
【請求項１５】
ＴＷＥＡＫ受容体の第五可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１６】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１５のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項１６のポリペプチド。
【請求項１８】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、および第五可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項１７のポリペプチド。
【請求項１９】
ＴＷＥＡＫ受容体の第六可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１５のポリペプチド。
【請求項２０】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項１９のポリペプチド。
【請求項２１】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項２０のポリペプチド。
【請求項２２】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、および第六可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項２１のポリペプチド。
【請求項２３】
ＴＷＥＡＫ受容体の第七可溶性断片をさらに含んでなる、請求項１９のポリペプチド。
【請求項２４】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列からなる、請求項２３のポリペプチド。
【請求項２５】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列からなる、請求項２４のポリペプチド。
【請求項２６】
前記第一可溶性断片、第二可溶性断片、第三可溶性断片、第四可溶性断片、第五可溶性断片、第六可溶性断片、および第七可溶性断片が、それぞれ独立に
ａ．配列番号７のアミノ酸配列の２９番目の残基から７０番目の残基
ｂ．配列番号７のアミノ酸配列の２８番目の残基から７９番目の残基
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７３番目の残基；および
ｄ．配列番号７のアミノ酸配列の３０番目の残基から７０番目の残基
からなる群より選択される配列からなる、請求項２５のポリペプチド。
【請求項２７】
リンカーをさらに含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項２８】
前記リンカーが、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合する、請求項２７のポリペプチド。
【請求項２９】
前記リンカーが、前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する、請求項２７のポリペプチド。
【請求項３０】
第一リンカーおよび第二リンカーをさらに含んでなり、ここで前記第一リンカーは前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片を接合し、そして前記第二リンカーは前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片と前記オリゴマー化ドメインを接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３１】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＧ（配列番号４５）を含んでなる、請求項２７のポリペプチド。
【請求項３２】
前記第一可溶性断片および前記第二可溶性断片が、介在ポリペプチド配列なしに共に接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３３】
前記第一可溶性断片および前記オリゴマー化ドメインが、介在ポリペプチド配列なしに共に接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３４】
前記第一可溶性断片、前記第二可溶性断片、および前記オリゴマー化ドメインが介在ポリペプチド配列なしに、直鎖状で連続しているポリペプチドにおいて共に接合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３５】
前記オリゴマー化ドメインが、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＮ末端である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３６】
前記オリゴマー化ドメインが、前記第一可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片および前記第二可溶性ＴＷＥＡＫＲ断片のＣ末端である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３７】
前記オリゴマー化ドメインがロイシンジッパーを含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項３８】
前記オリゴマー化ドメインが抗体の断片を含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項３９】
前記抗体の断片がＦｃドメインを含んでなる、請求項３８のポリペプチド。
【請求項４０】
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、請求項１のポリペプチド。
【請求項４１】
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、請求項４０のポリペプチド。
【請求項４２】
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項４１のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１の第一ポリペプチドおよび請求項１の第二ポリペプチドを含んでなるタンパク質であって、前記第一および第二ポリペプチドが互いにオリゴマー化している、前記タンパク質。
【請求項４４】
前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列が前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である、請求項４３のタンパク質。
【請求項４５】
前記第一ポリペプチドのアミノ酸配列が前記第二ポリペプチドのアミノ酸配列と同一でない、請求項４３のタンパク質。
【請求項４６】
対象中のＴＷＥＡＫ受容体を阻害する方法であって、前記対象に請求項１のポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４７】
対象中の血管形成を阻害する方法であって、前記対象に請求項１のポリペプチドを含んでなる組成物の治療上の有効量を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４８】
前記組成物が医薬的に許容できる担体をさらに含んでなる、請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記対象が哺乳動物である、請求項４７の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記対象が血管形成により仲介されまたは悪化した疾患または状態を有する、請求項４７の方法。
【請求項５２】
前記疾患または状態が眼の新血管新生により特徴付けられる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記疾患または状態が充実性腫瘍である、請求項５１の方法。
【請求項５４】
放射線で前記対象を治療することをさらに含んでなる、請求項５３の方法。
【請求項５５】
第二化学療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる、請求項５３の方法。
【請求項５６】
前記第二化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、植物由来化学療法剤、ニトロソウレア、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト、抗体、免疫療法剤、血球因子、放射線療法剤、および生物学的応答修飾剤からなる群より選択される、請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記第二化学療法剤が、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リンホカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、デルタインターフェロン、ＴＮＦ、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌアスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、およびフルオキシメステロンからなる群より選択される、請求項５５の方法。
【請求項５８】
前記疾患または状態が炎症性疾患または状態である、請求項５１の方法。
【請求項５９】
第二療法剤で前記対象を治療することをさらに含んでなる、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記第二療法剤が炎症を促進するサイトカインまたはサイトカイン受容体を阻害する、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記第二療法剤が前記サイトカイン受容体の可溶性断片、前記サイトカインに結合する抗体、または前記サイトカイン受容体に結合する抗体を含んでなる、請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記第二療法剤が炎症を阻害する受容体を活性化する、請求項５９の方法。
【請求項６３】
前記第二療法剤が、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、インターロイキン−２、インターロイキン−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、インターロイキン−１２、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１４８アゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニスト、およびＴｅｋアンタゴニストからなる群より選択される、請求項５９の方法。
【請求項６４】
請求項１の前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる、核酸またはその相補体。
【請求項６５】
前記核酸またはその相補体が中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第二核酸にハイブリダイズし、そして前記第二核酸が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項６４の方法。
【請求項６６】
前記核酸またはその相補体が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、請求項６４の方法。
【請求項６７】
前記核酸またはその相補体が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、請求項６６の方法。
【請求項６８】
前記核酸またはその相補体が、
ａ）配列番号１０
ｂ）配列番号１２
ｃ）配列番号１４
ｄ）配列番号１６
ｅ）配列番号２０
ｆ）配列番号２２
ｇ）配列番号２４
ｈ）配列番号２６
ｉ）配列番号２８
ｊ）配列番号３０
ｋ）配列番号３２
ｌ）配列番号３４
ｍ）配列番号３６
ｎ）配列番号３８
ｏ）配列番号４０；および
ｐ）配列番号４２
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記核酸が、
ａ）配列番号９
ｂ）配列番号１１
ｃ）配列番号１３
ｄ）配列番号１５
ｅ）配列番号１７
ｆ）配列番号１８
ｇ）配列番号１９
ｈ）配列番号２１
ｉ）配列番号２３
ｊ）配列番号２５
ｋ）配列番号２７
ｌ）配列番号２９
ｍ）配列番号３１
ｎ）配列番号３３
ｏ）配列番号３５
ｐ）配列番号３７
ｑ）配列番号３９
ｒ）配列番号４１
ｓ）配列番号４３；および
ｔ）配列番号４４
からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードする、請求項６４の方法。
【請求項７０】
請求項６４の前記核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項７１】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項７０のベクター。
【請求項７２】
請求項６４の前記核酸を含んでなる、宿主細胞。
【請求項７３】
ポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項７２の宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５２７２２４（Ｐ２００７−５２７２２４Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２１２９２（Ｐ２００６−５２１２９２）
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２３９０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１００４５
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２３９０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１００４５
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
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