ＴｃおよびＲｅ標識放射活性グリコシル化オクトレオチド誘導体
【課題】グリコシル化され、かつソマトスタチンレセプターに結合する新規放射活性オクトレオチド誘導体を提供すること。
【解決手段】核医学における診断および治療応用のための改良されたｓｓｔ−レセプター結合ペプチド性リガンドを提供する。改良されたリガンドは、Ｎ−末端もしくはＣ−末端もしくはその両端に天然または非天然アミノ酸またはペプチド類似構造、炭水化物単位およびキレート化剤もしくは接合団を含有し、放射性同位体を結合または保持する放射性同位体の錯体形成物を提供する。該ｓｓｔ−またはＳＳＴＲ−レセプター結合ペプチド性リガンドは、任意にペプチドにカップリング結合した１個以上の多機能リンカー単位、および／または糖部分および／またはキレート化剤および／または接合団を含有していてもよい。
【解決手段】核医学における診断および治療応用のための改良されたｓｓｔ−レセプター結合ペプチド性リガンドを提供する。改良されたリガンドは、Ｎ−末端もしくはＣ−末端もしくはその両端に天然または非天然アミノ酸またはペプチド類似構造、炭水化物単位およびキレート化剤もしくは接合団を含有し、放射性同位体を結合または保持する放射性同位体の錯体形成物を提供する。該ｓｓｔ−またはＳＳＴＲ−レセプター結合ペプチド性リガンドは、任意にペプチドにカップリング結合した１個以上の多機能リンカー単位、および／または糖部分および／またはキレート化剤および／または接合団を含有していてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリコシル化され、かつソマトスタチンレセプターに結合する新規放射活性オクトレオチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
これらのいわゆるＳＳＴＲリガンドは、ソマトスタチンレセプターのインビボ標的化に適しており、また核医学での広い応用が見出されている。
これら分子の必須の部分は、当該分子の生物活性部分に直接またはリンカーを介して接合する糖部分である。対応する非糖質化誘導体に比べて、これらの誘導体は、レニウムおよびテクネチウムなどの放射性同位体で標識し、直接の還元的方法またはトリカルボニル錯体を経て、改善された腫瘍／非腫瘍蓄積比、改善された薬物動態および改善されたインターナリゼーション現象を示す強力なソマトスタチンレセプターリガンドに誘導し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明のソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドは天然の、または非天然（合成）リガンドから調製する。これらのリガンドはＮ−末端またはＣ−末端またはその両方に構造上の修飾をもつ。当該ペプチドリガンドはｓｓｔ−レセプターに対し親和性を有し、図示すると以下の構造により表される：
【化１】
ただし、式中のＸはリガンドのＣ末端を示す。本発明の組成物において多重リガンドが存在し得る場合、ペプチド鎖のＣ末端とＮ末端が交じり合って結合することにより、二量体および多量体の形成が可能となる。従って、本発明の範囲は、ホモ二量体、ホモ多量体または異なる結合構造のヘテロ二量体およびヘテロ多量体を包含する。二量体および多量体はペプチド鎖のＣ末端とＮ末端が交じり合うカップリングにより形成し得る。
【０００４】
本発明のリガンド組成は、多機能となり得る少なくとも１個のリンカー単位を任意に含む。かかるリンカー単位は、縮合反応、アシル化反応、置換反応または付加反応を介して、ペプチド、糖部分およびキレート化剤の結合を可能とする。代表的なリンカー単位はペプチド性または他の有機構造、例えば、Ｌ−またはＤ−アミノ酸（リジン、オルニチン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｏ−アミノセリンなど）、メルカプトプロピオン酸、ヒドロキシ炭酸類、アミノ炭酸類、ハロゲン炭酸類またはポリアミノ酸類などから得られるリガンドを含んでなる。
【０００５】
本発明の改良されたソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドは、炭水化物、特に、単糖類、二糖類および三糖類などの糖を含んでなる。代表的な適切な糖は、共有結合を介して結合するグルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース、マルトロトリオースおよびラクトースなどである。すなわち、該糖はメイラード（Maillard）反応およびアマドリ（Amadori）転移、グリコシド結合、アルキル化、アリル化反応を介して結合させるか、または修飾後の錯体形成、すなわち、炭水化物イソニトリルまたは炭水化物リン酸エステルの形成を経て結合させることが可能である。
【０００６】
本発明の改良されたソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドのもう一つの成分はキレート化剤である。代表的なキレート化剤は、ＴｃおよびＲｅ放射性同位体の単座もしくは多座配位錯体形成に適したペプチド性または非ペプチド性構造である。本発明組成物において有用なキレート化剤は、その酸化状態と錯体幾何構造に依存的に、放射性金属の錯体形成に必要な数の官能基を有する１個以上の（リガンドおよびコリガンド）有機分子を含んでなる。模範となる適切なキレート化剤は、例えば、ヒスチジン、ピコリルアミン二酢酸、ヒドロキシニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）およびテトラペプチドである。
【０００７】
本発明の改良されたソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドについてより詳しく記載するために、図１Ａ〜１Ｃを参照する。図１Ａ〜１Ｃには、本発明のペプチドリガンドをその中で調製し得る様々な立体配置を図解形式で示す。他の実際の立体配置については本明細書の教示に基づき、当業者が思考し得る。
【０００８】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃには、リンカー部分Ｌ、糖部分Ｓ、およびＴｃとＲｅの放射性同位体を保持し得るキレート化剤Ｃを含む単量体、二量体および多量体を示す（ただし、ｎは２またはそれ以上の整数である）。
【０００９】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいては、ペプチドの末端はＸによってＣ末端を表し、その反対側の末端がＮ末端であるように規定する。従って、薬理作用ペプチドはリンカー、キレート化剤などのＣ−またはＮ−端と結合している。上述のように、ペプチドリガンドおよびリンカー（多機能性）はともに天然または非天然のアミノ酸から構成される。勿論、リガンド（すなわち、オクトレオチド）は本発明の組成物においてリンカーとして採用されないであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド類似構造、少なくとも１個の炭水化物、およびＴｃおよびＲｅから選択される放射性同位体の単座または多座配位錯体形成を可能とする少なくとも１個のキレート化基を含んでなるソマトスタチンレセプター（ｓｓｔ）結合ペプチド性リガンド。
（項目２）
放射性同位体がＴｃの同位体である項目１記載のリガンド。
（項目３）
該キレート化基がペプチドのＮ末端に結合し、該炭水化物がキレート化基に結合している項目１記載のリガンド。
（項目４）
該炭水化物がペプチドのＮ末端に結合し、該キレート化基が該炭水化物に結合している項目１記載のリガンド。
（項目５）
該炭水化物が糖である項目１記載のリガンド。
（項目６）
該糖が単糖類または多糖類である項目５記載のリガンド。
（項目７）
さらに少なくとも１個の多機能リンカー単位を含んでなる項目１記載のリガンド。
（項目８）
該糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはグリコシド結合を介してキレート化剤にカップリング結合する項目７記載のリガンド。
（項目９）
該糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはキレート化剤のアミノ基と、アルドースとの間の、アマドリ反応によるカップリング結合産物である項目７記載のリガンド。
（項目１０）
該糖がグルコース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択されるものである項目７記載のリガンド。
（項目１１）
該リガンドがＮ末端でグリコシル化されている項目７記載のリガンド。
（項目１２）
該放射性同位体が同位体ＴｃおよびＲｅからなる群より選択されるものである項目７記載のリガンド。
（項目１３）
該多機能リンカー単位がペプチドのＮ末端と併合し、該炭水化物と該キレート化基が多機能リンカー単位に結合している項目７記載のリガンド。
（項目１４）
該多機能リンカー単位がリガンドのＮ末端に結合し、該キレート化基が多機能リンカー単位に結合し、該炭水化物がキレート化基に結合している項目７記載のリガンド。
（項目１５）
さらに少なくとも１個の多機能リンカー単位および少なくとも２個のｓｓｔ−レセプター結合構造ペプチド基を含んでなる項目１記載のリガンド。
（項目１６）
該２個のペプチド基が多機能リンカー単位に結合し、該キレート化基と該炭水化物双方が多機能リンカーに結合している項目１４記載のリガンド。
（項目１７）
それぞれがペプチド単位の１個のＮ末端に結合する２個の炭水化物単位が存在し、当該炭水化物単位それぞれが多機能リンカー単位に結合し、かつ該キレート化基が多機能リンカー単位に結合している項目１４記載のリガンド。
（項目１８）
それぞれがペプチドのＮ末端に結合する２個の多機能リンカー単位、多機能リンカー単位に連結する１個のキレート化基、およびそれぞれが多機能リンカー単位の一方に結合する２個の炭水化物とが存在する項目１４記載のリガンド。
（項目１９）
該放射性同位体がＴｃおよびＲｅの同位体から選択されるものである項目１４記載のリガンド。
（項目２０）
該炭水化物が糖であり、糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはキレート化剤のアミノ基と、アルドースとの間の、アマドリ反応によるカップリング結合産物である項目１４記載のリガンド。
（項目２１）
該糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはグリコシド結合を介してキレート化剤にカップリング結合する項目１４記載のリガンド。
（項目２２）
項目１記載の組成物と医薬的に許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
（項目２３）
項目７記載の組成物と医薬的に許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
（項目２４）
項目１４記載の組成物と医薬的に許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
（項目２５）
項目２２記載の組成物を患者に投与することを特徴とするｓｓｔ−画像化からなる群より選択される画像化方法。
（項目２６）
項目２３記載の組成物を患者に投与することを特徴とするｓｓｔ−画像化からなる群より選択される画像化方法。
（項目２７）
項目２４記載の組成物を患者に投与することを特徴とするｓｓｔ−画像化からなる群より選択される画像化方法。
（項目２８）
化合物［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣ。
（項目２９）
化合物［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａには、２個以上のペプチドリガンドの多量体を提供する本発明の組成物の様々な立体配置を示す。該多量体は同一のレセプターペプチド結合構造（ホモ二量体、ホモ多量体）または異なるレセプター結合構造（ヘテロ二量体、ヘテロ多量体）を含んでいてもよい。
【図１Ｂ】図１Ｂには、種々量体の立体配置を示すが、その幾つかはリンカー単位（多機能）を含み、その内の４個はリンカー単位を含まない。従って、多機能リンカー単位は本発明の組成物において任意であることが分かる。
【図１Ｃ】図１Ｃには二量体と多量体を示すが、この場合には、多重リンカー単位をペプチドと、勿論、多重ペプチドリガンドの様々な配向で採用する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図１Ａおよび図１Ｃに示す二量体と多量体は、リンカーまたはペプチドリガンドのキレート化剤への共有結合を介して形成されるか、またはリンカーとキレート化剤間の錯体の形成を介して形成される。
本発明を以下の実施例で説明するが、これら実施例は本発明を制限するものではない。（実施例１）
【００１２】
ペプチド放射線医薬の合理的な設計：
インビトロでの研究はリガンド誘発ＳＳＴ−２インターナリゼーションに対するオクトレオチドの糖質化およびＣ末端酸化の相乗作用を示す。
【００１３】
目的：その薬物動態による外に、画像化用および治療目的のレセプターに基づくトレーサーの適性は、主としてその薬物動態プロフィルにより決定する。本研究の目的はＳＳＴＲ細胞内取り込みと排出（インターナリゼーションとエクスターナリゼーション）および再細胞取り込み（再循環）に対するオクトレオチド（octreotide）とオクトレオテート（octreotate）の糖質化の影響を研究することであった。
【００１４】
方法：［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）、［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＯＣＡ）およびそのグルコース（Ｇｌｕｃ）−とマルトトリオース（Ｍｔｒ）−誘導体のインターナリゼーション、エクスターナリゼーションおよび再循環は、ＡＲ４２Ｊ細胞（ＳＳＴＲ２）の集密単層を用いて検討した。細胞は放射性リガンドと１２０分までインキュベートした（ｎ＝３）。各時点で、上清の活性、表面結合およびインターナリゼーション活性を測定し、ＴＯＣ値に標準化した。エクスターナリゼーションおよび再循環は１２０分のインキュベーション後に２時間にわたり検討した。結合リガンドの特異性を１０Ｍサンドスタチン（sandostatin）との競合実験により検討した。
【００１５】
結果；インキュベーション２時間後の取り込みリガンド量［取り込まれたＴＯＣ％］は以下のとおりであった：Ｍｔｒ−ＴＯＣ（３５±４％）＜Ｇｌｕｃ−ＴＯＣ（１２１％）＜ＴＯＣＡ（１５４％）＜Ｍｔｒ−ＴＯＣＡ（５４９％）＜Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡ（６３７％）。競合実験において、すべての化合物のインターナリゼーションが、加えた放射活性の＜０.１±０.０２％（３０分）に低下した。リガンドの再循環を可能とするエクスターナリゼーション実験において、ＴＯＣＡおよびグリケーションしたＴＯＣＡは、再循環しない実験と比較して、細胞外に局在する放射活性の２／３を示したが、一方、約８０％はＴＯＣ、Ｇｌｕｃ−ＴＯＣおよびＭｔｒ−ＴＯＣに見出された。ＴＯＣの糖質化は細胞表面上のリガンドの利用能に対して有意な作用を示さなかったが、ＴＯＣＡおよびＭｔｒ−ＴＯＣＡの表面濃度は、ＴＯＣに比較してそれぞれ２.１および２.３のファクター増加する。Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡはＴＯＣに比較して、細胞表面上のトレーサー利用能の５倍の増加を示す。ＴＯＣのインターナリゼーション率（取り込み／表面結合活性）はグリコシル化により有意な影響を受けないが、ＴＯＣＡは１.４倍の増加を示す。Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡおよびＭｔｒ−ＴＯＣＡについて、我々はＴＯＣに比べて１８６％および１７１％のインターナリゼーション率を観察した。
【００１６】
結論：ＡＲ４２Ｊ−細胞を用いて、ＴＯＣＡを糖質化することにより、放射活性リガンドの細胞表面濃度とインターナリゼーション率を有意に増大させた。
（実施例２）
【００１７】
ＳＰＥＣＴ用糖質化Ｔｃ−９９Ｍ−オクトレオチド誘導体
合成、放射活性標識およびインビボデータ
過去１０年にわたり、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴによるＳＳＴＲ−シンチグラフィー用の９９ｍＴＣ−および１８Ｆ−標識オクトレオチド誘導体についての様々な方法が研究されている。Decristoforoらは、ＥＤＤＡをもつ９９ｍＴｃ−標識ＨＹＮＩＣ−Ｔｙｒ３−オクトレオチドがコリガンドとして好適な生物動力学とマウスにおける高い腫瘍取り込みを示すことを示した。これまでに知られた唯一の１８Ｆ−標識オクトレオチドである２−［１８Ｆ］フルオロプロピオニル−Ｄ−Ｐｈｅ１−オクトレオチドは優勢な肝胆汁分泌を示すが、これはインビトロＳＳＴＲ画像化に適用する上での欠点の一つである。
【００１８】
本発明者らは、放射活性ヨウ素化Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）とそのＴｈｒ８−誘導体Ｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＯＣＡ）をＮ末端グリコシル化が、生体分布の有意な改善、すなわち、腫瘍への蓄積増大をもたらすことを見出した。この原理の一般的応用を検討するために、我々は９９ｍＴｃ−標識化用のグリコシル化オクトレオチド−およびオクトレテート−誘導体を合成し、評価した（図２）。Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）−ＴＯＣ（Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣ）のＮ−グリコシル化誘導体は、有機金属水和イオン［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−法１［EgliA. et al. J. Nucl. Med. 40: 1913-1917 (1999)］を用いる９９ｍＴｃ−標識化用前駆体として使用した。該ペプチドは標準Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳプロトコールに従って合成した。グルコース（Ｇｌｕｃ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）との接合はアマドリ反応経由で実施した。
Ｌｙｓ５−脱保護ペプチドを９９ｍＴｃ−標識化すると、水和イオンに基づき＞９７％の放射化学収率で［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣを得た。
【００１９】
９９ｍＴｃ−標識化誘導体（注射３０および１２０分後）の生体分布の検討はＡＲ４２Ｊ−腫瘍担持ヌードマウス（ｎ＝３〜４）にて実施した。インターナリゼーションおよびエクスターナリゼーションの実験は同じ細胞株を用いて実施した。
【００２０】
インターナリゼーションの増加は、対照の［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣについては２.３±０.８のファクター、また［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４のファクターで見出された。［１２５Ｉ］ＴＯＣはインキュベーションにより急速に細胞から排出されるが、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣは１２０分まで細胞内に取り込まれたままである。
【００２１】
［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣについて、注射２時間後の生体分布を表１に示す。
【００２２】
表１：ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスにおける［９９ｍＴｃ］Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ注射２時間後の組織蓄積［％ｉＤ／ｇ］（ｎ＝３〜４）
【表１】
【００２３】
グリコシル化化合物は共に注射１２０分後にｓｓｔ２陽性組織に高い蓄積性を示す。排泄器官での比較的高い非特異的取り込みならびに血液クリアランスの遅延は、二座ヒスチジンリガンドによる９９ｍＴｃ−コアの不十分な錯体形成によるものと我々は思考する。残りの金属配位部位はチオール含有の本来のタンパク質によりインビボで飽和され、それが血液、肝臓およびその他の排泄器官でのこれら錯体の急速な捕捉に至らしめる。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンとＮ−Ａｃ−Ｈｉｓなどの三座リガンドとの飽和した錯体が形成されると、非腫瘍組織での活性蓄積は有意に低下する。
【００２４】
結論として、オクトレオチド（−テート）の炭水化物接合および［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンの三座錯体形成の組合わせに基づく導入トレーサーの設計は新しい一連の非常に有望なＳＳＴＲ−トレーサーの基礎となると言える。
（実施例３）
【００２５】
ＳＳＴ−レセプター−アゴニストのグリケーション：放射活性標識ソマトスタチンアゴニストの動的リガンド移動の改善
糖質化は放射活性標識化オクトレオチドおよび∀ｖ∃３類似体の薬物動態改善のための強力な手段であることが今回判明した。オクトレオチドおよびオクトレオテートのグリケーションは肝胆汁排泄および腎吸収を有意に低下させ、腫瘍取り込みと腫瘍／組織比を上昇させる。放射活性ｓｓｔ２−アゴニストの腫瘍蓄積は、レセプター介在インターナリゼーション、崩壊および引き続く細胞内蓄積に、またはリガンドおよび／または代謝産物の両方の再循環に左右される。各段階で定量分析すると、決定的に重要なことは、ｓｓｔ２発現腫瘍細胞におけるトレーサーの蓄積を如何に制御するかであることが理解される。従って、本研究の目的は、放射活性標識オクトレオチドとオクトレオテートのインターナリゼーションおよび再循環動力学に対するグリケーションの影響を試験することであった。
【００２６】
Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）、Ｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＯＣＡ）およびその誘導体であるグルコース（Ｇｌｕｃ）、マルトース（Ｍａｌｔ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）誘導体は、Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳおよび引き続く炭水化物接合を経て合成した。放射活性ヨウ素化はヨードゲン法により実施した。放射化学収率はＲＰ−ＨＰＬＣ精製後、５０〜８４％の範囲であった。９９ｍＴｃ−標識化（Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）−ＴＯＣ）およびＭｔｒ−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）−ＴＯＣ））のための前駆体は、上記のペプチド同様に調製した。９９ｍＴｃでの標識化はすでに記載した［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンプロトコールに従って実施した［EgliA. et al. J. Nucl. Med. 40: 1913-1917 (1999)］。比較のために、我々は［１１１Ｉｎ］オクトレオスキャン（Octreoscan）および［１１１Ｉｎ］ドタトック（DOTATOC）をも我々の検討に含めた。
【００２７】
インターナリゼーションとエクスターナリゼーションの実験は、ｓｓｔ２発現ラット膵臓腫瘍細胞株ＡＲ４２Ｊを用いて実施した。遊離の表面結合内部に取込まれた放射活性は、放射活性リガンドと３７℃でインキュベートし、その１０、３０、６０、９０および１２０分後に定量した。リガンド再循環を可能とするエクスターナリゼーション実験では、１０、３０、６０、９０および１２０分の間に上清に放出された放射活性フラクションならびに細胞中に残存する放射活性を定量した。我々はまた引き続く５回のインキュベーション（１０、２０および３×３０分）に際して、培地の中間変化（制限再循環）を伴って放出された活性を測定した。
【００２８】
インターナリゼーションに対するＴＯＣ糖質化の影響は、使用した糖の大きさに平行する。［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、グルコース接合体のみが細胞への取込みを上昇させた。対照的に、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−ＴＯＣＡ両方の細胞内蓄積（図３および表２）は有意に増大した（［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、７.３６±０.５０および５.６８±０.３８倍）。ＴＯＣとＴＯＣＡのインターナリゼーション特性およびそれぞれのグリコシル化誘導体のインターナリゼーション特性を比較して、我々は、表面利用能およびインターナリゼーション率に対する両方の構造的修飾（Ｔｈｒ８によるＴｈｒ（ｏｌ）８の置換および糖質化）の相乗作用を観察した。［１１１Ｉｎ］オクトレオスキャン（Octreoscan）および［１１１Ｉｎ］ドタトック（DOTATOC）に比較して、両方の９９ｍＴｃ−標識化糖質化誘導体のインターナリゼーションは意外に高かった。
【００２９】
１０μＭサンドスタチン（sanndostatin）による事前処理実験は、リガンドの取込みを対照の最大５％まで低下させ、ｉ）ｓｓｔ２特異取込みであって、ii）炭水化物関連取込みメカニズムは関与しないことを示した（表２）。検討したトレーサーすべてについて、内部取込み活性はリガンドの表面利用能と強力に相関する。
【００３０】
表２：ＡＲ４２Ｊ細胞と６０分間インキュベーション後に得られたインターナリゼーション・データ（インターナリゼーション値ならびに比は対照の［１２５Ｉ］ＴＯＣに標準化する）
ａ：表面利用能＝％表面結合リガンド／％遊離放射活性リガンド
ｂ：インターナリゼーション率＝％内部取込みリガンド／％表面結合リガンド
＊：１０Ｍサンドスタチンでの事前処理実験は細胞リガンド取込みを最小９５％低下させた。
【表２】
【００３１】
エクスターナリゼーションに関しては、グリコシル化が影響していないように思われる（図４）。細胞からの放射リガンドのエクスターナリゼーションの度合いは、主としてペプチド（ＴＯＣまたはＴＯＣＡ）の性質により、また標識の細胞内運命により判定する。リガンドの再循環を可能とするエクスターナリゼーション実験において、ＴＯＣＡとそのグリケーション誘導体は再循環なしの実験に比較して、細胞外に局在する放射活性の約２／３を示した。一方、約８０％がＴＯＣ、Ｇｌｕｃ−ＴＯＣおよびＭｔｒ−ＴＯＣに見出された。［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣならびに両方の１１１Ｉｎ−標識化合物は、再循環条件下、１２０分以内に細胞中略定量的な保持を示した。対照的に、［１１１Ｉｎ］オクトレオスキャン（Octreoscan）および［１１１Ｉｎ］ドタトック（DOTATOC）の細胞内活性は、再循環を制限した場合、１２０分間に３３％および４９％消尽した。
（実施例４）
【００３２】
［Ｔｃ−９９ｍ］（ＣＯ）３−標識糖質化ＳＳＴＲ−リガンド：
合成、インターナリゼーション動力学およびラット膵臓腫瘍モデルでの生体分布
目的：本研究はＳＳＴＲ発現腫瘍の特異的高レベル標的化用トレーサーの設計を示すためのものである。これを目的として、我々は薬物動態を最適化し、ＳＳＴＲ特異インターナリゼーションと腫瘍保持を改善するために、糖質化オクトレオチド誘導体を導入した。本明細書にて我々が記載する化合物は一連の新規糖質化９９ｍＴｃ−ＳＳＴＲリガンドである。
【００３３】
方法：グルコース（Ｇｌｕｃ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）をＮ−（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ５（Ｄｄｅ）−オクトレオチド（保護Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ）のＮ−Ｌｙｓ０に結合させ、最終的に脱保護し、Ｇｌｕｃ−およびＭｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣを得た。９９ｍＴｃ−標識化は［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋を用いて実施した。インターナリゼーションとエクスターナリゼーションの検討（＜２時間）はＳＳＴＲ２発現ラット膵臓細胞株ＡＲ４２Ｊおよび対照としての［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオチド（［１２５Ｉ］ＴＯＣ）を用いて実施した。生体分布はＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスにて、０.５時間および２時間のインキュベーション（ｎ＝４）により評価した。
【００３４】
結果：放射活性標識は効率的に（０.５時間、ＲＣＹ＞９７％）均一の産物を生じた。［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、両方の炭水化物導入ペプチドは有意により高い細胞間活性レベルを示した；例えば、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては２時間で２.３±０.２倍高いレベル、また［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４倍高いレベルを示した。エクスターナリゼーションの検討では、２時間で［１２５Ｉ］ＴＯＣに対し約５０％の細胞内活性の低下を明らかにした。一方、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣの細胞間レベルは２時間まで殆ど安定であり、このトレーサーが保持されていることを示した。インビボでは、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.７７、Ｔ／腎層０.６３）および［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.９７、Ｔ／腎臓０.８４）に対して、腫瘍の蓄積は注射２時間後にそれぞれ１２.２±１.０および１４.０±６.３％ＩＤ／ｇに達し、血中レベルは１.５±０.２％ＩＤ／ｇおよび４.４±１.０％ＩＤ／ｇであった。
結論：これらの結果はＳＳＴＲ標的化改善の手段として糖質化が有用であることを証明している。
（実施例５）
【００３５】
［Ｔｃ−９９ｍ］（ＣＯ）３−標識糖質化ＳＳＴＲ−リガンド：
合成、インターナリゼーション動力学およびラット膵臓腫瘍モデルでの生体分布
目的：本研究はＳＳＴＲ発現腫瘍の特異的高レベル標的化用トレーサーの設計を示すための我々の努力の一部である。この目的のために、我々は薬物動態を最適化し、ＳＳＴＲ特異インターナリゼーションと腫瘍保持を改善するのに適当な糖質化部分を使用した。本明細書に我々は初めて［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋水和イオン法により標識化した糖質化ＳＳＴＲ結合ペプチドを記載する。
【００３６】
方法：標準的なＦｍｏｃ化学により、Ｎ−（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ５（Ｄｄｅ）−オクトレオチド（保護Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ）を合成した。グルコース（Ｇｌｕｃ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）をＮ−Ｌｙｓ０に結合させ、最終的に脱保護し、Ｋ（Ｈ）ＴＯＣのＧｌｕｃ−およびＭｔｒ−誘導体を得た。Ｔｃ−９９ｍ−標識化は有機金属水和イオン［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋（１）を用いて実施した。インターナリゼーションとエクスターナリゼーションの検討（＜１２０分）はＳＳＴＲ２発現細胞株ＡＲ４２Ｊを用い、両化合物について実施した。インビトロの検討のために、対照として［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオチド（［１２５Ｉ］ＴＯＣ）を用いた。静脈内投与した［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣの生体分布はＡＲ４２Ｊラット膵臓腫瘍担持ヌードマウスにて、注射３０分および１２０分（ｎ＝４）後に評価した。
【００３７】
結果：本標識手法は効率的に（３０分間、ＲＣＹ＞９７％）均一の産物を生じた（ＨＰＬＣ）。［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、両方の糖質化ペプチドは検討したすべての時点で有意により高いインターナリゼーションを示した；例えば、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては２時間で２.３±０.２倍高いレベル、また［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４倍高いレベル、また［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４倍高いレベルを示した。さらに、エクスターナリゼーションの検討では、１２０分で対照化合物の約５０％の細胞内活性の低下を明らかにした。一方、細胞内［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣの高いレベルは２時間まで殆ど安定であり、このトレーサーが検討した細胞株に保持されていることを示した。インビボでは、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.７７、Ｔ／腎層０.６３）および［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.９７、Ｔ／腎臓０.８４）に対して、腫瘍の蓄積が注射１２０分後にそれぞれ１２.２±１.０および１４.０±６.３％ＩＤ／ｇに達し、対応する血中レベルは１.５±０.２％ＩＤ／ｇおよび４.４±１.０％ＩＤ／ｇであった。
結論：これらの結果はＳＳＴＲ標的化改善の手段として炭水化物導入が有用であることを示している。
（実施例６）
【００３８】
固相ペプチド合成
１. Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−オクトレオチド（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＯＣ（Ｄｄｅ））Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１.３９１ｇ、３.５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶かした溶液を−１０℃に冷却した。Ｎ−メチルモルホリン（３８６μｌ、３.５ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸エチル（３３３μｌ、３.５ｍｍｏｌ）を引き続き加えた。反応混合物を−１０℃で３０分間撹拌した。次いで、ホウ素化水素ナトリウム（３９６ｍｇ、１０.５ｍｍｏｌ）を加えた。３０分を要してメタノール６０ｍｌをゆっくりと反応混合物に加え、次いで、０℃で３時間撹拌した。
【００３９】
１Ｎ−ＨＣｌを５０〜７０ｍｌ添加した後（濁りのある反応混合物が透明にならなければならない）、有機溶媒を蒸発させ、残りの水相はジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。抽出効率は両相の薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）による産物のＲｆ＝０.８３）によりモニターした。併合した有機層を硫酸マグネシウム上乾燥し、濾過、減圧濃縮し、黄色油状物を得た。粗生成物をＡｃＯＥｔによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。産物は油状物（１.１９ｇ、８９％）として得た。
単一同位体質量；Ｃ２３Ｈ２９ＮＯ４として計算値＝３８３.２１；測定値：ｍ／ｚ４０６.１［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４０】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｄｐｈｅ１−Ｃｙｓ２−Ｔｙｒ３−ＤＴｒｐ４−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−Ｔｈｒ６−Ｃｙｓ７−Ｔｈｒ−オール８ ＤＨＰ−ＨＭ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルメトキシメチルポリスチロール）樹脂（１.０００ｇ、０.９４ｍｍｏｌ／ｇ）を１０ｍｌの乾燥ＤＣＥ（１，２−ジクロロエタン）中、１時間、予め膨潤させた。次いで、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール（１.２６６ｇ、３.３ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（４１４ｍｇ、１.７５ｍｍｏｌ）を７ｍｌの乾燥ＤＣＥに溶かした溶液を加え、その反応混合物をアルゴン下、８０℃で一夜撹拌した。遊離の官能基を樹脂に取り付けるために、ピリジン５ｍｌを加え、懸濁液を室温で１５分間撹拌した。負荷した樹脂を次いで濾過し、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）で２回、およびＤＣＭで洗浄し、乾燥器中で乾燥した。樹脂の最終負荷物は０.８３４ｍｍｏｌ／ｇであった。ペプチド配列は標準Ｆｍｏｃ−プロトコールを用いて樹脂結合アミノアルコール上で推定した。簡単に説明すると、Ｎ−末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し、樹脂支持ペプチドの樹脂をＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）で洗浄した。カップリング反応はＮＭＰ中、１.５当量のアミノ酸誘導体と、１.５当量のＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、１.５当量のＴＢＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−ベンゾールトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロボレート）および３.５当量のＤＩＰＥＡ（Ｎ−エチル−ジイソプロピルアミン）と反応させることにより実施した。活性化したアミノ酸を反応容器に加えた後、適当な時間（通常４０〜６０分）、樹脂を撹拌した。次いで、樹脂を追加のＮＭＰで洗浄した。ＴＯＣ合成のための添加の順序は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）、Ｆｍｏｃ−ＤＴｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−ＤｐｈｅおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の順であった。
【００４１】
最終アミノ酸を配列にカップリング結合させた後、樹脂を数回ＮＭＰおよびＤＣＭで洗浄した。樹脂からの脱離およびＴｈｒ−、Ｃｙｓ−およびＬｙｓ０−側鎖の脱保護は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＩＢＳ（トリイソブチルシラン）／水（９５：２.５：２.５）およびＤＣＭの混合物（１：１）を用いて実施した。９０分後に樹脂を濾取し、ＤＣＭで２回洗浄した。併合した濾液をロータリーエバポレーターにて濃縮し、粗製の産物をエーテルで沈殿させた。我々は８２８ｍｇの粗生成物を得た。収率８３％。
【００４２】
粗製のペプチドは（ぺプチド３００ｍｇあたり）５０ｍｌのＴＨＦに再懸濁し、澄明な溶液が得られるまで、５ｍＭ酢酸アンモニウムを添加した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を滴下することでｐＨ７に調整した。次いで、過酸化水素水（３０％）１００μｌ（ペプチド３００ｍｇあたり）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、環化を終了した（勾配ＨＰＬＣ−コントロール：３０〜８０％Ｂ、１５分）。溶媒を蒸発させ、環化した生成物を凍結乾燥した。収率は定量的であった。
単一同位体質量；Ｃ８０Ｈ１００Ｎ１２Ｏ１６Ｓ２として計算値＝１５４８.６８；測定値：ｍ／ｚ１５４９.５［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１５７１.５［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４３】
２. Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−オクトレオチド（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ））Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｄｐｈｅ１−Ｃｙｓ２−Ｔｙｒ３−ＤＴｒｐ４−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−Ｔｈｒ６−Ｃｙｓ７−Ｔｈｒ８ 乾燥ＴＣＰ−樹脂１.５０２ｇに、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）８９４ｍｇ（２.２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ３２１μｌ（１.８７ｍｍｏｌ）および乾燥ＤＣＭ１５ｍｌからなる溶液を加えた。５分間撹拌した後、追加のＤＩＰＥＡ６４２μｌ（３.７６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で９０分間、激しく撹拌した後、メタノール１.５ｍｌを加えて、未反応の塩化トリチル基を遮断した。１５分後、樹脂を濾取し、ＤＣＭ、ＤＭＦおよびメタノールでそれぞれ２回洗浄し、減圧乾燥した。樹脂の最終的負荷は０.７７ｍｍｏｌ／ｇであった。樹脂結合アミノ酸上のペプチド配列、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＤＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＤＰｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃの合成、脱保護、および樹脂からの切断、ならびに環化反応は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）について記載したのと同様に実施した。
単一同位体質量；Ｃ８０Ｈ９８Ｎ１２Ｏ１７Ｓ２として計算値＝１５６２.６６；測定値：ｍ／ｚ＝ （［Ｍ＋Ｈ］＋）
【００４４】
溶液相誘導化
１. Ｌｙｓ０（Ｎ∈−Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）５００ｍｇ（０.３２ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）１７０ｍｇ（０.４８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ６５ｍｇ（０.０４８ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ１５４ｍｇ（０.４８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ３００μｌ（１.７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３ｍｌに溶かした溶液を室温で撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析（勾配：３０〜８０％Ｂ、１５分）により、反応は３０分以内に終了することが判明した。生成物を水で沈殿させ、減圧下に乾燥した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護基を除去するために、ペプチドを１ｍｌのピペリジン／ＤＭＦ（１：４）に溶解し、１５分間撹拌した。エーテルで沈殿させ、脱保護産物を８６％の収率で得た。
単一同位体質量；Ｃ８１Ｈ１１３Ｎ１５Ｏ１９Ｓ２として計算値＝１６６３.７８；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４５】
２. Ｌｙｓ０（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）のＬｙｓ０−Ｎ−アマドリ誘導体
以前に報告された方法１に基づき、１当量のＬｙｓ０（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）および１０当量のそれぞれのアルドース（グルコース＝Ｓ１、マルトース＝Ｓ２、マルトトリオース＝Ｓ３）をメタノール／酢酸（９５：５）に溶かし、その反応混合物を６０℃で２４〜４８時間撹拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、粗生成物をエーテル添加により沈殿させた。
【００４６】
Ｄｄｅ−保護基を除去するために、グリコシル化ペプチドを少量のＤＭＦに再溶解し、２容量％のヒドラジン水和物を添加し、その溶液を室温で１５分間撹拌した。脱保護ペプチドをエーテル添加により沈殿させ、エーテルで洗浄して減圧乾燥した。Ｈｉｓ−残基上のＢｏｃ−保護基は、粗生成物を少量のＴＦＡ／ＴＩＢＳ／水（９５：２.５：２.５）に再溶解し、室温にて１５分間撹拌することにより除去した。生成物をエーテルで沈殿させ、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（勾配：１０〜６０％Ｂ，３０分）にて精製した。収率は１７〜３２％の範囲であった。
【００４７】
Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｎａ−（１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０Ｎ−Ｈｉｓ）−Ｔｙｒ３−オクトレオチド：
単一同位体質量；Ｃ６７Ｈ９５Ｎ１５Ｏ１８Ｓ２として計算値＝１４６１.６０；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋Ｓ２ Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｎ−（Ｏ− −Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０（Ｎ∈−Ｈｉｓ）−Ｔｙｒ３−オクトレオチド）：
単一同位体質量；Ｃ７３Ｈ１０５Ｎ１５Ｏ２８Ｓ２として計算値＝１６２３.７０；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋
Ｓ３ Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｎａ−（Ｏ−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−Ｏ−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）−Ｔｙｒ３−オクトレオチド：
単一同位体質量；Ｃ７３Ｈ１１５Ｎ１５Ｏ２３Ｓ２として計算値＝１７８５.７５；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４８】
３. Ｌｙｓ０（Ｎ−２−ピコリルアミノ−....）ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）
２−ピコリルアミンＮ，Ｎ−二酢酸２
イミノ二酢酸（３.２５ｇ、２４.４ｍｍｏｌ）を無水エタノール３０ｍｌおよびＮａＯＨ（１.９５ｇ；４９ｍｍｏｌ）水溶液（１０ｍｌ）の混合物に溶解した。水９ｍｌに溶かした塩化ピコリル４.００ｇ（２４.４ｍｍｏｌ）および水４ｍｌに溶かしたＮａＯＨ１.９５ｇ（４９ｍｍｏｌ）を添加した後、その溶液を７０℃で２時間撹拌した。追加のＮａＯＨを１.９５ｇ（４９ｍｍｏｌ）添加した後、その溶液をさらに７０℃で１.５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）により反応を追跡し、その時点で反応物が完全に消失していることを確認した。溶媒を減圧下に蒸発させ、残渣を水２５ｍｌに再溶解した。溶液のｐＨを濃塩酸により１.５に調整した後、溶液を再度蒸発乾固した。残渣をメタノールで再懸濁して還流する工程を数回連続して繰返し、懸濁液を熱時濾過し、濾液を減圧下に濃縮して過剰のＮａＣｌを成功裏に除去した。ピコリルアミノ二酢酸を残りのメタノール溶液から一夜−２０℃で結晶化した。
単一同位体質量；Ｃ１０Ｈ１２Ｎ２Ｏ４として計算値＝２２４.０８；測定値：ｍ／ｚ＝ ［Ｍ＋Ｈ］＋（二ナトリウム塩）
【００４９】
２−ピコリルアミンＮ，Ｎ−二酢酸のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）へのカップリング反応
２−ピコリルアミンＮ，Ｎ−二酢酸５２ｍｇ（０.１９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ２６ｍｇ（０.１９ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ６２ｍｇ（０.１９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ１７５μｌ（１.７５ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＭＦに溶かした溶液を室温で１０分間撹拌した。この溶液をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）２００ｍｇ（０.１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に激しく撹拌しながら滴下した。３０分後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下に乾燥した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護基を除去するために、ペプチドをピペリジン／ＤＭＦ（１：４）２ｍｌに溶解し、１０分間撹拌した。エーテルで沈殿させることにより、脱保護した産物を８４％の収率で得た。
単一同位体質量；Ｃ７５Ｈ９８Ｎ１４Ｏ１８Ｓ２として計算値＝１５４６.６６；測定値：ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００５０】
４. Ｌｙｓ０（Ｐｉｃ）ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）のＬｙｓ０−Ｎａ−アマドリ誘導体
Ｌｙｓ０（Ｐｉｃ）ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）とグルコースの接合、および引き続くＤｄｅ−脱保護は、Ｌｙｓ０（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）のＬｙｓ０−Ｎａ−アマドリ誘導体について記載したと同様に実施した。
単一同位体質量；Ｃ７１Ｈ９６Ｎ１４Ｏ２１Ｓ２として計算値＝１５４４.６３；測定値：ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００５１】
放射活性標識化
最近報告された有機金属水和イオン［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−法３に基づき、１０ｍｇのＮａＢＨ４、８ｍｇのＮａ２ＣＯ３および４１.５ｍｇのＮａ／Ｋ酒石酸塩を、ガラスフラスコ中６００μｌの［９９ｍＴｃ］ペルテクネテート溶離液に溶解した。次いで、フラスコをＣＯを満たした風船につなぎ、密封した。７５℃で４５分間撹拌した後、溶液を氷浴上で冷却し、１５０μｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７.４）を加えた。還元剤を分解するために６００μｌの１Ｎ−ＨＣｌを加えた。次いで、溶液を５００μｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液で中和した。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンの存在はＴＬＣ（５％conc. ＨＣｌ／メタノール）にて確認した。
【００５２】
Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ７００μｇに１ｍｌの［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−溶液（５１ＭＢｑ）を加えた後、混合物を７５℃に３０分間加熱した。勾配ＨＰＬＣ精製により、放射化学的に純粋なペプチドＮａ−（１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋）−Ｔｙｒ３−オクトレオチドを３４％の収率で得た。
Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣは同様の方法で標識した。
【００５３】
親油性の定量
放射活性標識ペプチド約３０００００ｃｐｍをＰＢＳ（ｐＨ７.４）５００ｍｌに溶かした溶液に、オクタノール５００ｍｌを添加した（ｎ＝６）。バイアルを３分間ボルテックス処理し、１５０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。ＰＢＳとオクタノールの１００ｍｌを取り、γ−カウンターにて測定した。
Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ：ｌｏｇｐｏｗ＝−０.６７３±０.０６４
Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ：ｌｏｇｐｏｗ＝−１.３０４±０.０４０
インビトロ実験
ＡＲ４２Ｊ細胞を、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ−Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ１６４０中に維持した。
【００５４】
インターナリゼーションの検討
１ウエルあたり８×１０５〜５×１０６個のＡＲ４２Ｊ細胞の細胞集団を容れた６穴プレートを、実験に先立ち、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＢＳＡ、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン）とともに１時間インキュベートした。培地１０μｌ中、約３０００００ｃｐｍの放射活性金属ペプチドを各ウエルに加えた（対照化合物［１２５Ｉ］ＴＯＣ（内部基準）および各対象の放射活性金属化合物について、３組の実験とする）。３７℃で１０、３０、６０、９０または１２０分間インキュベートした後、上清を採取し、細胞は冷培地１ｍｌにて１回洗浄した。上清を前工程の上清と併合した。レセプター結合（酸解離可能）放射活性を除くために、細胞を０.０２Ｍ−ＮａＯＡｃ（酸洗浄）１ｍｌと３７℃でインキュベートした。１０分後に上清を採取し、細胞を０.０２Ｍ−ＮａＯＡｃ１ｍｌにて１回洗浄し、その上清を前工程の上清と再度併合した。次いで、細胞を１ｍｌの１Ｎ−ＮａＯＨで抽出し、ウエルはＰＢＳにて１回洗浄した。このプールしたフラクションはインターナリゼーションの放射活性リガンドを示している。ＮａＯＨフラクションならびに上清と酸洗浄フラクションの活性をγ−カウンターにて計測した。
【００５５】
エクスターナリゼーションの検討
インターナリゼーションの検討にて記載したように、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＢＳＡ、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン）を容れた６穴プレートを、実験に先立ち、３７℃で１時間インキュベートした。培地１０μｌ中、約３０００００ｃｐｍの放射活性金属ペプチドを各ウエルに加えた（対照化合物［１２５Ｉ］ＴＯＣ（内部基準）および各対象の放射活性金属化合物について、３組の実験とする）。３７℃にて１２０分間インキュベートした後、上清を採取し、細胞は冷培地１ｍｌにて１回洗浄した。上清を前工程の上清と併合した。エクスターナリゼーションの放射活性を採取するために、細胞を１ｍｌの培地とともに３７℃でインキュベートした。１０、３０、６０、９０および１２０分後に、それぞれ上清を集め、細胞は１ｍｌの培地で１回洗浄し、その上清を前工程の上清と併合した。次いで、細胞を１ｍｌの１Ｎ−ＮａＯＨで抽出し、ウエルはＰＢＳにて１回洗浄した。このプールしたフラクションは細胞中になお局在する放射活性リガンドを示している。ＮａＯＨフラクションならびに上清とエクスターナリゼーションフラクションの活性をγ−カウンターにて計測した。
【００５６】
トレーサー再循環なしのエクスターナリゼーションの検討
前記実験について記載したのと同様に、６穴プレートを放射活性リガンドとともに３７℃にて１２０分間インキュベートした。上清を採取し、細胞は冷培地１ｍｌにて１回洗浄した。上清を前工程の上清と併合した。エクスターナリゼーションの放射活性を採取するために、細胞を１ｍｌの培地とともに３７℃でインキュベートした。１０分後に上清を採取し、細胞は再度さらに２０分間３７℃にて培地１ｍｌとインキュベートした。上清を採取し、細胞は１ｍｌの培地とともに３７℃にて３０分間さらに３回インキュベートした。次いで、細胞を１ｍｌの１Ｎ−ＮａＯＨで抽出し、ウエルはＰＢＳにて１回洗浄した。このプールしたフラクションは細胞中になお局在する放射活性リガンドを示している。ＮａＯＨフラクションならびにすべての時点でのエクスターナリゼーションフラクションの活性をγ−カウンターにて計測した。
【００５７】
生体分布の検討
腫瘍増殖を確立するために、サブコンフルエント単層細胞を１ｍＭ−ＥＤＴＡで処理し、懸濁し、遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。
ヌードマウス（オスおよびメス、６〜８週令）の脇腹に、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）１００μｌに懸濁した細胞２.５〜３×１０７個を皮下接種し、ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスの尾部静脈に注射した。動物（ｎ＝３〜４）を注射後３０分および１２０分後に屠殺し、対象臓器を摘出した。秤量した組織サンプルにつきガンマカウンターにて放射活性を測定した。データは％ｉＤ／ｇ組織で表す（平均±ＤＳ、ｎ＝３〜４）。
【００５８】
表１：ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスにおける［９９ｍＴｃ］Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ注射２時間後の組織蓄積［％ｉＤ／ｇ］（ｎ＝３〜４）
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリコシル化され、かつソマトスタチンレセプターに結合する新規放射活性オクトレオチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
これらのいわゆるＳＳＴＲリガンドは、ソマトスタチンレセプターのインビボ標的化に適しており、また核医学での広い応用が見出されている。
これら分子の必須の部分は、当該分子の生物活性部分に直接またはリンカーを介して接合する糖部分である。対応する非糖質化誘導体に比べて、これらの誘導体は、レニウムおよびテクネチウムなどの放射性同位体で標識し、直接の還元的方法またはトリカルボニル錯体を経て、改善された腫瘍／非腫瘍蓄積比、改善された薬物動態および改善されたインターナリゼーション現象を示す強力なソマトスタチンレセプターリガンドに誘導し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明のソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドは天然の、または非天然（合成）リガンドから調製する。これらのリガンドはＮ−末端またはＣ−末端またはその両方に構造上の修飾をもつ。当該ペプチドリガンドはｓｓｔ−レセプターに対し親和性を有し、図示すると以下の構造により表される：
【化１】
ただし、式中のＸはリガンドのＣ末端を示す。本発明の組成物において多重リガンドが存在し得る場合、ペプチド鎖のＣ末端とＮ末端が交じり合って結合することにより、二量体および多量体の形成が可能となる。従って、本発明の範囲は、ホモ二量体、ホモ多量体または異なる結合構造のヘテロ二量体およびヘテロ多量体を包含する。二量体および多量体はペプチド鎖のＣ末端とＮ末端が交じり合うカップリングにより形成し得る。
【０００４】
本発明のリガンド組成は、多機能となり得る少なくとも１個のリンカー単位を任意に含む。かかるリンカー単位は、縮合反応、アシル化反応、置換反応または付加反応を介して、ペプチド、糖部分およびキレート化剤の結合を可能とする。代表的なリンカー単位はペプチド性または他の有機構造、例えば、Ｌ−またはＤ−アミノ酸（リジン、オルニチン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｏ−アミノセリンなど）、メルカプトプロピオン酸、ヒドロキシ炭酸類、アミノ炭酸類、ハロゲン炭酸類またはポリアミノ酸類などから得られるリガンドを含んでなる。
【０００５】
本発明の改良されたソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドは、炭水化物、特に、単糖類、二糖類および三糖類などの糖を含んでなる。代表的な適切な糖は、共有結合を介して結合するグルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース、マルトロトリオースおよびラクトースなどである。すなわち、該糖はメイラード（Maillard）反応およびアマドリ（Amadori）転移、グリコシド結合、アルキル化、アリル化反応を介して結合させるか、または修飾後の錯体形成、すなわち、炭水化物イソニトリルまたは炭水化物リン酸エステルの形成を経て結合させることが可能である。
【０００６】
本発明の改良されたソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドのもう一つの成分はキレート化剤である。代表的なキレート化剤は、ＴｃおよびＲｅ放射性同位体の単座もしくは多座配位錯体形成に適したペプチド性または非ペプチド性構造である。本発明組成物において有用なキレート化剤は、その酸化状態と錯体幾何構造に依存的に、放射性金属の錯体形成に必要な数の官能基を有する１個以上の（リガンドおよびコリガンド）有機分子を含んでなる。模範となる適切なキレート化剤は、例えば、ヒスチジン、ピコリルアミン二酢酸、ヒドロキシニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）およびテトラペプチドである。
【０００７】
本発明の改良されたソマトスタチンレセプター結合ペプチド性リガンドについてより詳しく記載するために、図１Ａ〜１Ｃを参照する。図１Ａ〜１Ｃには、本発明のペプチドリガンドをその中で調製し得る様々な立体配置を図解形式で示す。他の実際の立体配置については本明細書の教示に基づき、当業者が思考し得る。
【０００８】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃには、リンカー部分Ｌ、糖部分Ｓ、およびＴｃとＲｅの放射性同位体を保持し得るキレート化剤Ｃを含む単量体、二量体および多量体を示す（ただし、ｎは２またはそれ以上の整数である）。
【０００９】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいては、ペプチドの末端はＸによってＣ末端を表し、その反対側の末端がＮ末端であるように規定する。従って、薬理作用ペプチドはリンカー、キレート化剤などのＣ−またはＮ−端と結合している。上述のように、ペプチドリガンドおよびリンカー（多機能性）はともに天然または非天然のアミノ酸から構成される。勿論、リガンド（すなわち、オクトレオチド）は本発明の組成物においてリンカーとして採用されないであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド類似構造、少なくとも１個の炭水化物、およびＴｃおよびＲｅから選択される放射性同位体の単座または多座配位錯体形成を可能とする少なくとも１個のキレート化基を含んでなるソマトスタチンレセプター（ｓｓｔ）結合ペプチド性リガンド。
（項目２）
放射性同位体がＴｃの同位体である項目１記載のリガンド。
（項目３）
該キレート化基がペプチドのＮ末端に結合し、該炭水化物がキレート化基に結合している項目１記載のリガンド。
（項目４）
該炭水化物がペプチドのＮ末端に結合し、該キレート化基が該炭水化物に結合している項目１記載のリガンド。
（項目５）
該炭水化物が糖である項目１記載のリガンド。
（項目６）
該糖が単糖類または多糖類である項目５記載のリガンド。
（項目７）
さらに少なくとも１個の多機能リンカー単位を含んでなる項目１記載のリガンド。
（項目８）
該糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはグリコシド結合を介してキレート化剤にカップリング結合する項目７記載のリガンド。
（項目９）
該糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはキレート化剤のアミノ基と、アルドースとの間の、アマドリ反応によるカップリング結合産物である項目７記載のリガンド。
（項目１０）
該糖がグルコース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択されるものである項目７記載のリガンド。
（項目１１）
該リガンドがＮ末端でグリコシル化されている項目７記載のリガンド。
（項目１２）
該放射性同位体が同位体ＴｃおよびＲｅからなる群より選択されるものである項目７記載のリガンド。
（項目１３）
該多機能リンカー単位がペプチドのＮ末端と併合し、該炭水化物と該キレート化基が多機能リンカー単位に結合している項目７記載のリガンド。
（項目１４）
該多機能リンカー単位がリガンドのＮ末端に結合し、該キレート化基が多機能リンカー単位に結合し、該炭水化物がキレート化基に結合している項目７記載のリガンド。
（項目１５）
さらに少なくとも１個の多機能リンカー単位および少なくとも２個のｓｓｔ−レセプター結合構造ペプチド基を含んでなる項目１記載のリガンド。
（項目１６）
該２個のペプチド基が多機能リンカー単位に結合し、該キレート化基と該炭水化物双方が多機能リンカーに結合している項目１４記載のリガンド。
（項目１７）
それぞれがペプチド単位の１個のＮ末端に結合する２個の炭水化物単位が存在し、当該炭水化物単位それぞれが多機能リンカー単位に結合し、かつ該キレート化基が多機能リンカー単位に結合している項目１４記載のリガンド。
（項目１８）
それぞれがペプチドのＮ末端に結合する２個の多機能リンカー単位、多機能リンカー単位に連結する１個のキレート化基、およびそれぞれが多機能リンカー単位の一方に結合する２個の炭水化物とが存在する項目１４記載のリガンド。
（項目１９）
該放射性同位体がＴｃおよびＲｅの同位体から選択されるものである項目１４記載のリガンド。
（項目２０）
該炭水化物が糖であり、糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはキレート化剤のアミノ基と、アルドースとの間の、アマドリ反応によるカップリング結合産物である項目１４記載のリガンド。
（項目２１）
該糖がレセプター結合構造、多機能リンカー単位、またはグリコシド結合を介してキレート化剤にカップリング結合する項目１４記載のリガンド。
（項目２２）
項目１記載の組成物と医薬的に許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
（項目２３）
項目７記載の組成物と医薬的に許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
（項目２４）
項目１４記載の組成物と医薬的に許容し得る担体とを含有してなる医薬組成物。
（項目２５）
項目２２記載の組成物を患者に投与することを特徴とするｓｓｔ−画像化からなる群より選択される画像化方法。
（項目２６）
項目２３記載の組成物を患者に投与することを特徴とするｓｓｔ−画像化からなる群より選択される画像化方法。
（項目２７）
項目２４記載の組成物を患者に投与することを特徴とするｓｓｔ−画像化からなる群より選択される画像化方法。
（項目２８）
化合物［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣ。
（項目２９）
化合物［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａには、２個以上のペプチドリガンドの多量体を提供する本発明の組成物の様々な立体配置を示す。該多量体は同一のレセプターペプチド結合構造（ホモ二量体、ホモ多量体）または異なるレセプター結合構造（ヘテロ二量体、ヘテロ多量体）を含んでいてもよい。
【図１Ｂ】図１Ｂには、種々量体の立体配置を示すが、その幾つかはリンカー単位（多機能）を含み、その内の４個はリンカー単位を含まない。従って、多機能リンカー単位は本発明の組成物において任意であることが分かる。
【図１Ｃ】図１Ｃには二量体と多量体を示すが、この場合には、多重リンカー単位をペプチドと、勿論、多重ペプチドリガンドの様々な配向で採用する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図１Ａおよび図１Ｃに示す二量体と多量体は、リンカーまたはペプチドリガンドのキレート化剤への共有結合を介して形成されるか、またはリンカーとキレート化剤間の錯体の形成を介して形成される。
本発明を以下の実施例で説明するが、これら実施例は本発明を制限するものではない。（実施例１）
【００１２】
ペプチド放射線医薬の合理的な設計：
インビトロでの研究はリガンド誘発ＳＳＴ−２インターナリゼーションに対するオクトレオチドの糖質化およびＣ末端酸化の相乗作用を示す。
【００１３】
目的：その薬物動態による外に、画像化用および治療目的のレセプターに基づくトレーサーの適性は、主としてその薬物動態プロフィルにより決定する。本研究の目的はＳＳＴＲ細胞内取り込みと排出（インターナリゼーションとエクスターナリゼーション）および再細胞取り込み（再循環）に対するオクトレオチド（octreotide）とオクトレオテート（octreotate）の糖質化の影響を研究することであった。
【００１４】
方法：［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）、［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＯＣＡ）およびそのグルコース（Ｇｌｕｃ）−とマルトトリオース（Ｍｔｒ）−誘導体のインターナリゼーション、エクスターナリゼーションおよび再循環は、ＡＲ４２Ｊ細胞（ＳＳＴＲ２）の集密単層を用いて検討した。細胞は放射性リガンドと１２０分までインキュベートした（ｎ＝３）。各時点で、上清の活性、表面結合およびインターナリゼーション活性を測定し、ＴＯＣ値に標準化した。エクスターナリゼーションおよび再循環は１２０分のインキュベーション後に２時間にわたり検討した。結合リガンドの特異性を１０Ｍサンドスタチン（sandostatin）との競合実験により検討した。
【００１５】
結果；インキュベーション２時間後の取り込みリガンド量［取り込まれたＴＯＣ％］は以下のとおりであった：Ｍｔｒ−ＴＯＣ（３５±４％）＜Ｇｌｕｃ−ＴＯＣ（１２１％）＜ＴＯＣＡ（１５４％）＜Ｍｔｒ−ＴＯＣＡ（５４９％）＜Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡ（６３７％）。競合実験において、すべての化合物のインターナリゼーションが、加えた放射活性の＜０.１±０.０２％（３０分）に低下した。リガンドの再循環を可能とするエクスターナリゼーション実験において、ＴＯＣＡおよびグリケーションしたＴＯＣＡは、再循環しない実験と比較して、細胞外に局在する放射活性の２／３を示したが、一方、約８０％はＴＯＣ、Ｇｌｕｃ−ＴＯＣおよびＭｔｒ−ＴＯＣに見出された。ＴＯＣの糖質化は細胞表面上のリガンドの利用能に対して有意な作用を示さなかったが、ＴＯＣＡおよびＭｔｒ−ＴＯＣＡの表面濃度は、ＴＯＣに比較してそれぞれ２.１および２.３のファクター増加する。Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡはＴＯＣに比較して、細胞表面上のトレーサー利用能の５倍の増加を示す。ＴＯＣのインターナリゼーション率（取り込み／表面結合活性）はグリコシル化により有意な影響を受けないが、ＴＯＣＡは１.４倍の増加を示す。Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡおよびＭｔｒ−ＴＯＣＡについて、我々はＴＯＣに比べて１８６％および１７１％のインターナリゼーション率を観察した。
【００１６】
結論：ＡＲ４２Ｊ−細胞を用いて、ＴＯＣＡを糖質化することにより、放射活性リガンドの細胞表面濃度とインターナリゼーション率を有意に増大させた。
（実施例２）
【００１７】
ＳＰＥＣＴ用糖質化Ｔｃ−９９Ｍ−オクトレオチド誘導体
合成、放射活性標識およびインビボデータ
過去１０年にわたり、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴによるＳＳＴＲ−シンチグラフィー用の９９ｍＴＣ−および１８Ｆ−標識オクトレオチド誘導体についての様々な方法が研究されている。Decristoforoらは、ＥＤＤＡをもつ９９ｍＴｃ−標識ＨＹＮＩＣ−Ｔｙｒ３−オクトレオチドがコリガンドとして好適な生物動力学とマウスにおける高い腫瘍取り込みを示すことを示した。これまでに知られた唯一の１８Ｆ−標識オクトレオチドである２−［１８Ｆ］フルオロプロピオニル−Ｄ−Ｐｈｅ１−オクトレオチドは優勢な肝胆汁分泌を示すが、これはインビトロＳＳＴＲ画像化に適用する上での欠点の一つである。
【００１８】
本発明者らは、放射活性ヨウ素化Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）とそのＴｈｒ８−誘導体Ｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＯＣＡ）をＮ末端グリコシル化が、生体分布の有意な改善、すなわち、腫瘍への蓄積増大をもたらすことを見出した。この原理の一般的応用を検討するために、我々は９９ｍＴｃ−標識化用のグリコシル化オクトレオチド−およびオクトレテート−誘導体を合成し、評価した（図２）。Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）−ＴＯＣ（Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣ）のＮ−グリコシル化誘導体は、有機金属水和イオン［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−法１［EgliA. et al. J. Nucl. Med. 40: 1913-1917 (1999)］を用いる９９ｍＴｃ−標識化用前駆体として使用した。該ペプチドは標準Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳプロトコールに従って合成した。グルコース（Ｇｌｕｃ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）との接合はアマドリ反応経由で実施した。
Ｌｙｓ５−脱保護ペプチドを９９ｍＴｃ−標識化すると、水和イオンに基づき＞９７％の放射化学収率で［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣを得た。
【００１９】
９９ｍＴｃ−標識化誘導体（注射３０および１２０分後）の生体分布の検討はＡＲ４２Ｊ−腫瘍担持ヌードマウス（ｎ＝３〜４）にて実施した。インターナリゼーションおよびエクスターナリゼーションの実験は同じ細胞株を用いて実施した。
【００２０】
インターナリゼーションの増加は、対照の［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣについては２.３±０.８のファクター、また［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４のファクターで見出された。［１２５Ｉ］ＴＯＣはインキュベーションにより急速に細胞から排出されるが、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣは１２０分まで細胞内に取り込まれたままである。
【００２１】
［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣについて、注射２時間後の生体分布を表１に示す。
【００２２】
表１：ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスにおける［９９ｍＴｃ］Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ注射２時間後の組織蓄積［％ｉＤ／ｇ］（ｎ＝３〜４）
【表１】
【００２３】
グリコシル化化合物は共に注射１２０分後にｓｓｔ２陽性組織に高い蓄積性を示す。排泄器官での比較的高い非特異的取り込みならびに血液クリアランスの遅延は、二座ヒスチジンリガンドによる９９ｍＴｃ−コアの不十分な錯体形成によるものと我々は思考する。残りの金属配位部位はチオール含有の本来のタンパク質によりインビボで飽和され、それが血液、肝臓およびその他の排泄器官でのこれら錯体の急速な捕捉に至らしめる。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンとＮ−Ａｃ−Ｈｉｓなどの三座リガンドとの飽和した錯体が形成されると、非腫瘍組織での活性蓄積は有意に低下する。
【００２４】
結論として、オクトレオチド（−テート）の炭水化物接合および［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンの三座錯体形成の組合わせに基づく導入トレーサーの設計は新しい一連の非常に有望なＳＳＴＲ−トレーサーの基礎となると言える。
（実施例３）
【００２５】
ＳＳＴ−レセプター−アゴニストのグリケーション：放射活性標識ソマトスタチンアゴニストの動的リガンド移動の改善
糖質化は放射活性標識化オクトレオチドおよび∀ｖ∃３類似体の薬物動態改善のための強力な手段であることが今回判明した。オクトレオチドおよびオクトレオテートのグリケーションは肝胆汁排泄および腎吸収を有意に低下させ、腫瘍取り込みと腫瘍／組織比を上昇させる。放射活性ｓｓｔ２−アゴニストの腫瘍蓄積は、レセプター介在インターナリゼーション、崩壊および引き続く細胞内蓄積に、またはリガンドおよび／または代謝産物の両方の再循環に左右される。各段階で定量分析すると、決定的に重要なことは、ｓｓｔ２発現腫瘍細胞におけるトレーサーの蓄積を如何に制御するかであることが理解される。従って、本研究の目的は、放射活性標識オクトレオチドとオクトレオテートのインターナリゼーションおよび再循環動力学に対するグリケーションの影響を試験することであった。
【００２６】
Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）、Ｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＯＣＡ）およびその誘導体であるグルコース（Ｇｌｕｃ）、マルトース（Ｍａｌｔ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）誘導体は、Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳおよび引き続く炭水化物接合を経て合成した。放射活性ヨウ素化はヨードゲン法により実施した。放射化学収率はＲＰ−ＨＰＬＣ精製後、５０〜８４％の範囲であった。９９ｍＴｃ−標識化（Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）−ＴＯＣ）およびＭｔｒ−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）−ＴＯＣ））のための前駆体は、上記のペプチド同様に調製した。９９ｍＴｃでの標識化はすでに記載した［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンプロトコールに従って実施した［EgliA. et al. J. Nucl. Med. 40: 1913-1917 (1999)］。比較のために、我々は［１１１Ｉｎ］オクトレオスキャン（Octreoscan）および［１１１Ｉｎ］ドタトック（DOTATOC）をも我々の検討に含めた。
【００２７】
インターナリゼーションとエクスターナリゼーションの実験は、ｓｓｔ２発現ラット膵臓腫瘍細胞株ＡＲ４２Ｊを用いて実施した。遊離の表面結合内部に取込まれた放射活性は、放射活性リガンドと３７℃でインキュベートし、その１０、３０、６０、９０および１２０分後に定量した。リガンド再循環を可能とするエクスターナリゼーション実験では、１０、３０、６０、９０および１２０分の間に上清に放出された放射活性フラクションならびに細胞中に残存する放射活性を定量した。我々はまた引き続く５回のインキュベーション（１０、２０および３×３０分）に際して、培地の中間変化（制限再循環）を伴って放出された活性を測定した。
【００２８】
インターナリゼーションに対するＴＯＣ糖質化の影響は、使用した糖の大きさに平行する。［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、グルコース接合体のみが細胞への取込みを上昇させた。対照的に、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−ＴＯＣＡおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−ＴＯＣＡ両方の細胞内蓄積（図３および表２）は有意に増大した（［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、７.３６±０.５０および５.６８±０.３８倍）。ＴＯＣとＴＯＣＡのインターナリゼーション特性およびそれぞれのグリコシル化誘導体のインターナリゼーション特性を比較して、我々は、表面利用能およびインターナリゼーション率に対する両方の構造的修飾（Ｔｈｒ８によるＴｈｒ（ｏｌ）８の置換および糖質化）の相乗作用を観察した。［１１１Ｉｎ］オクトレオスキャン（Octreoscan）および［１１１Ｉｎ］ドタトック（DOTATOC）に比較して、両方の９９ｍＴｃ−標識化糖質化誘導体のインターナリゼーションは意外に高かった。
【００２９】
１０μＭサンドスタチン（sanndostatin）による事前処理実験は、リガンドの取込みを対照の最大５％まで低下させ、ｉ）ｓｓｔ２特異取込みであって、ii）炭水化物関連取込みメカニズムは関与しないことを示した（表２）。検討したトレーサーすべてについて、内部取込み活性はリガンドの表面利用能と強力に相関する。
【００３０】
表２：ＡＲ４２Ｊ細胞と６０分間インキュベーション後に得られたインターナリゼーション・データ（インターナリゼーション値ならびに比は対照の［１２５Ｉ］ＴＯＣに標準化する）
ａ：表面利用能＝％表面結合リガンド／％遊離放射活性リガンド
ｂ：インターナリゼーション率＝％内部取込みリガンド／％表面結合リガンド
＊：１０Ｍサンドスタチンでの事前処理実験は細胞リガンド取込みを最小９５％低下させた。
【表２】
【００３１】
エクスターナリゼーションに関しては、グリコシル化が影響していないように思われる（図４）。細胞からの放射リガンドのエクスターナリゼーションの度合いは、主としてペプチド（ＴＯＣまたはＴＯＣＡ）の性質により、また標識の細胞内運命により判定する。リガンドの再循環を可能とするエクスターナリゼーション実験において、ＴＯＣＡとそのグリケーション誘導体は再循環なしの実験に比較して、細胞外に局在する放射活性の約２／３を示した。一方、約８０％がＴＯＣ、Ｇｌｕｃ−ＴＯＣおよびＭｔｒ−ＴＯＣに見出された。［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ０（Ｈ）ＴＯＣならびに両方の１１１Ｉｎ−標識化合物は、再循環条件下、１２０分以内に細胞中略定量的な保持を示した。対照的に、［１１１Ｉｎ］オクトレオスキャン（Octreoscan）および［１１１Ｉｎ］ドタトック（DOTATOC）の細胞内活性は、再循環を制限した場合、１２０分間に３３％および４９％消尽した。
（実施例４）
【００３２】
［Ｔｃ−９９ｍ］（ＣＯ）３−標識糖質化ＳＳＴＲ−リガンド：
合成、インターナリゼーション動力学およびラット膵臓腫瘍モデルでの生体分布
目的：本研究はＳＳＴＲ発現腫瘍の特異的高レベル標的化用トレーサーの設計を示すためのものである。これを目的として、我々は薬物動態を最適化し、ＳＳＴＲ特異インターナリゼーションと腫瘍保持を改善するために、糖質化オクトレオチド誘導体を導入した。本明細書にて我々が記載する化合物は一連の新規糖質化９９ｍＴｃ−ＳＳＴＲリガンドである。
【００３３】
方法：グルコース（Ｇｌｕｃ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）をＮ−（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ５（Ｄｄｅ）−オクトレオチド（保護Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ）のＮ−Ｌｙｓ０に結合させ、最終的に脱保護し、Ｇｌｕｃ−およびＭｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣを得た。９９ｍＴｃ−標識化は［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋を用いて実施した。インターナリゼーションとエクスターナリゼーションの検討（＜２時間）はＳＳＴＲ２発現ラット膵臓細胞株ＡＲ４２Ｊおよび対照としての［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオチド（［１２５Ｉ］ＴＯＣ）を用いて実施した。生体分布はＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスにて、０.５時間および２時間のインキュベーション（ｎ＝４）により評価した。
【００３４】
結果：放射活性標識は効率的に（０.５時間、ＲＣＹ＞９７％）均一の産物を生じた。［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、両方の炭水化物導入ペプチドは有意により高い細胞間活性レベルを示した；例えば、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては２時間で２.３±０.２倍高いレベル、また［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４倍高いレベルを示した。エクスターナリゼーションの検討では、２時間で［１２５Ｉ］ＴＯＣに対し約５０％の細胞内活性の低下を明らかにした。一方、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣの細胞間レベルは２時間まで殆ど安定であり、このトレーサーが保持されていることを示した。インビボでは、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.７７、Ｔ／腎層０.６３）および［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.９７、Ｔ／腎臓０.８４）に対して、腫瘍の蓄積は注射２時間後にそれぞれ１２.２±１.０および１４.０±６.３％ＩＤ／ｇに達し、血中レベルは１.５±０.２％ＩＤ／ｇおよび４.４±１.０％ＩＤ／ｇであった。
結論：これらの結果はＳＳＴＲ標的化改善の手段として糖質化が有用であることを証明している。
（実施例５）
【００３５】
［Ｔｃ−９９ｍ］（ＣＯ）３−標識糖質化ＳＳＴＲ−リガンド：
合成、インターナリゼーション動力学およびラット膵臓腫瘍モデルでの生体分布
目的：本研究はＳＳＴＲ発現腫瘍の特異的高レベル標的化用トレーサーの設計を示すための我々の努力の一部である。この目的のために、我々は薬物動態を最適化し、ＳＳＴＲ特異インターナリゼーションと腫瘍保持を改善するのに適当な糖質化部分を使用した。本明細書に我々は初めて［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋水和イオン法により標識化した糖質化ＳＳＴＲ結合ペプチドを記載する。
【００３６】
方法：標準的なＦｍｏｃ化学により、Ｎ−（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ５（Ｄｄｅ）−オクトレオチド（保護Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ）を合成した。グルコース（Ｇｌｕｃ）およびマルトトリオース（Ｍｔｒ）をＮ−Ｌｙｓ０に結合させ、最終的に脱保護し、Ｋ（Ｈ）ＴＯＣのＧｌｕｃ−およびＭｔｒ−誘導体を得た。Ｔｃ−９９ｍ−標識化は有機金属水和イオン［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋（１）を用いて実施した。インターナリゼーションとエクスターナリゼーションの検討（＜１２０分）はＳＳＴＲ２発現細胞株ＡＲ４２Ｊを用い、両化合物について実施した。インビトロの検討のために、対照として［１２５Ｉ］Ｔｙｒ３−オクトレオチド（［１２５Ｉ］ＴＯＣ）を用いた。静脈内投与した［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣの生体分布はＡＲ４２Ｊラット膵臓腫瘍担持ヌードマウスにて、注射３０分および１２０分（ｎ＝４）後に評価した。
【００３７】
結果：本標識手法は効率的に（３０分間、ＲＣＹ＞９７％）均一の産物を生じた（ＨＰＬＣ）。［１２５Ｉ］ＴＯＣに比較して、両方の糖質化ペプチドは検討したすべての時点で有意により高いインターナリゼーションを示した；例えば、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては２時間で２.３±０.２倍高いレベル、また［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４倍高いレベル、また［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣについては３.６±０.４倍高いレベルを示した。さらに、エクスターナリゼーションの検討では、１２０分で対照化合物の約５０％の細胞内活性の低下を明らかにした。一方、細胞内［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣの高いレベルは２時間まで殆ど安定であり、このトレーサーが検討した細胞株に保持されていることを示した。インビボでは、［９９ｍＴｃ］Ｇｌｕｃ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.７７、Ｔ／腎層０.６３）および［９９ｍＴｃ］Ｍｔｒ−Ｋ（Ｈ）ＴＯＣ（Ｔ／肝臓０.９７、Ｔ／腎臓０.８４）に対して、腫瘍の蓄積が注射１２０分後にそれぞれ１２.２±１.０および１４.０±６.３％ＩＤ／ｇに達し、対応する血中レベルは１.５±０.２％ＩＤ／ｇおよび４.４±１.０％ＩＤ／ｇであった。
結論：これらの結果はＳＳＴＲ標的化改善の手段として炭水化物導入が有用であることを示している。
（実施例６）
【００３８】
固相ペプチド合成
１. Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−オクトレオチド（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＯＣ（Ｄｄｅ））Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１.３９１ｇ、３.５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌに溶かした溶液を−１０℃に冷却した。Ｎ−メチルモルホリン（３８６μｌ、３.５ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸エチル（３３３μｌ、３.５ｍｍｏｌ）を引き続き加えた。反応混合物を−１０℃で３０分間撹拌した。次いで、ホウ素化水素ナトリウム（３９６ｍｇ、１０.５ｍｍｏｌ）を加えた。３０分を要してメタノール６０ｍｌをゆっくりと反応混合物に加え、次いで、０℃で３時間撹拌した。
【００３９】
１Ｎ−ＨＣｌを５０〜７０ｍｌ添加した後（濁りのある反応混合物が透明にならなければならない）、有機溶媒を蒸発させ、残りの水相はジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。抽出効率は両相の薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）による産物のＲｆ＝０.８３）によりモニターした。併合した有機層を硫酸マグネシウム上乾燥し、濾過、減圧濃縮し、黄色油状物を得た。粗生成物をＡｃＯＥｔによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。産物は油状物（１.１９ｇ、８９％）として得た。
単一同位体質量；Ｃ２３Ｈ２９ＮＯ４として計算値＝３８３.２１；測定値：ｍ／ｚ４０６.１［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４０】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｄｐｈｅ１−Ｃｙｓ２−Ｔｙｒ３−ＤＴｒｐ４−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−Ｔｈｒ６−Ｃｙｓ７−Ｔｈｒ−オール８ ＤＨＰ−ＨＭ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルメトキシメチルポリスチロール）樹脂（１.０００ｇ、０.９４ｍｍｏｌ／ｇ）を１０ｍｌの乾燥ＤＣＥ（１，２−ジクロロエタン）中、１時間、予め膨潤させた。次いで、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール（１.２６６ｇ、３.３ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（４１４ｍｇ、１.７５ｍｍｏｌ）を７ｍｌの乾燥ＤＣＥに溶かした溶液を加え、その反応混合物をアルゴン下、８０℃で一夜撹拌した。遊離の官能基を樹脂に取り付けるために、ピリジン５ｍｌを加え、懸濁液を室温で１５分間撹拌した。負荷した樹脂を次いで濾過し、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）で２回、およびＤＣＭで洗浄し、乾燥器中で乾燥した。樹脂の最終負荷物は０.８３４ｍｍｏｌ／ｇであった。ペプチド配列は標準Ｆｍｏｃ−プロトコールを用いて樹脂結合アミノアルコール上で推定した。簡単に説明すると、Ｎ−末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中の２０％ピペリジンで除去し、樹脂支持ペプチドの樹脂をＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）で洗浄した。カップリング反応はＮＭＰ中、１.５当量のアミノ酸誘導体と、１.５当量のＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、１.５当量のＴＢＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−ベンゾールトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロボレート）および３.５当量のＤＩＰＥＡ（Ｎ−エチル−ジイソプロピルアミン）と反応させることにより実施した。活性化したアミノ酸を反応容器に加えた後、適当な時間（通常４０〜６０分）、樹脂を撹拌した。次いで、樹脂を追加のＮＭＰで洗浄した。ＴＯＣ合成のための添加の順序は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）、Ｆｍｏｃ−ＤＴｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−ＤｐｈｅおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の順であった。
【００４１】
最終アミノ酸を配列にカップリング結合させた後、樹脂を数回ＮＭＰおよびＤＣＭで洗浄した。樹脂からの脱離およびＴｈｒ−、Ｃｙｓ−およびＬｙｓ０−側鎖の脱保護は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＩＢＳ（トリイソブチルシラン）／水（９５：２.５：２.５）およびＤＣＭの混合物（１：１）を用いて実施した。９０分後に樹脂を濾取し、ＤＣＭで２回洗浄した。併合した濾液をロータリーエバポレーターにて濃縮し、粗製の産物をエーテルで沈殿させた。我々は８２８ｍｇの粗生成物を得た。収率８３％。
【００４２】
粗製のペプチドは（ぺプチド３００ｍｇあたり）５０ｍｌのＴＨＦに再懸濁し、澄明な溶液が得られるまで、５ｍＭ酢酸アンモニウムを添加した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を滴下することでｐＨ７に調整した。次いで、過酸化水素水（３０％）１００μｌ（ペプチド３００ｍｇあたり）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、環化を終了した（勾配ＨＰＬＣ−コントロール：３０〜８０％Ｂ、１５分）。溶媒を蒸発させ、環化した生成物を凍結乾燥した。収率は定量的であった。
単一同位体質量；Ｃ８０Ｈ１００Ｎ１２Ｏ１６Ｓ２として計算値＝１５４８.６８；測定値：ｍ／ｚ１５４９.５［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１５７１.５［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４３】
２. Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｔｙｒ３−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−オクトレオチド（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ））Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−Ｄｐｈｅ１−Ｃｙｓ２−Ｔｙｒ３−ＤＴｒｐ４−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）５−Ｔｈｒ６−Ｃｙｓ７−Ｔｈｒ８ 乾燥ＴＣＰ−樹脂１.５０２ｇに、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）８９４ｍｇ（２.２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ３２１μｌ（１.８７ｍｍｏｌ）および乾燥ＤＣＭ１５ｍｌからなる溶液を加えた。５分間撹拌した後、追加のＤＩＰＥＡ６４２μｌ（３.７６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で９０分間、激しく撹拌した後、メタノール１.５ｍｌを加えて、未反応の塩化トリチル基を遮断した。１５分後、樹脂を濾取し、ＤＣＭ、ＤＭＦおよびメタノールでそれぞれ２回洗浄し、減圧乾燥した。樹脂の最終的負荷は０.７７ｍｍｏｌ／ｇであった。樹脂結合アミノ酸上のペプチド配列、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＤＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＤＰｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃの合成、脱保護、および樹脂からの切断、ならびに環化反応は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）について記載したのと同様に実施した。
単一同位体質量；Ｃ８０Ｈ９８Ｎ１２Ｏ１７Ｓ２として計算値＝１５６２.６６；測定値：ｍ／ｚ＝ （［Ｍ＋Ｈ］＋）
【００４４】
溶液相誘導化
１. Ｌｙｓ０（Ｎ∈−Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）５００ｍｇ（０.３２ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）１７０ｍｇ（０.４８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ６５ｍｇ（０.０４８ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ１５４ｍｇ（０.４８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ３００μｌ（１.７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３ｍｌに溶かした溶液を室温で撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析（勾配：３０〜８０％Ｂ、１５分）により、反応は３０分以内に終了することが判明した。生成物を水で沈殿させ、減圧下に乾燥した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護基を除去するために、ペプチドを１ｍｌのピペリジン／ＤＭＦ（１：４）に溶解し、１５分間撹拌した。エーテルで沈殿させ、脱保護産物を８６％の収率で得た。
単一同位体質量；Ｃ８１Ｈ１１３Ｎ１５Ｏ１９Ｓ２として計算値＝１６６３.７８；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４５】
２. Ｌｙｓ０（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）のＬｙｓ０−Ｎ−アマドリ誘導体
以前に報告された方法１に基づき、１当量のＬｙｓ０（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）および１０当量のそれぞれのアルドース（グルコース＝Ｓ１、マルトース＝Ｓ２、マルトトリオース＝Ｓ３）をメタノール／酢酸（９５：５）に溶かし、その反応混合物を６０℃で２４〜４８時間撹拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、粗生成物をエーテル添加により沈殿させた。
【００４６】
Ｄｄｅ−保護基を除去するために、グリコシル化ペプチドを少量のＤＭＦに再溶解し、２容量％のヒドラジン水和物を添加し、その溶液を室温で１５分間撹拌した。脱保護ペプチドをエーテル添加により沈殿させ、エーテルで洗浄して減圧乾燥した。Ｈｉｓ−残基上のＢｏｃ−保護基は、粗生成物を少量のＴＦＡ／ＴＩＢＳ／水（９５：２.５：２.５）に再溶解し、室温にて１５分間撹拌することにより除去した。生成物をエーテルで沈殿させ、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（勾配：１０〜６０％Ｂ，３０分）にて精製した。収率は１７〜３２％の範囲であった。
【００４７】
Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｎａ−（１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０Ｎ−Ｈｉｓ）−Ｔｙｒ３−オクトレオチド：
単一同位体質量；Ｃ６７Ｈ９５Ｎ１５Ｏ１８Ｓ２として計算値＝１４６１.６０；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋Ｓ２ Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｎ−（Ｏ− −Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０（Ｎ∈−Ｈｉｓ）−Ｔｙｒ３−オクトレオチド）：
単一同位体質量；Ｃ７３Ｈ１０５Ｎ１５Ｏ２８Ｓ２として計算値＝１６２３.７０；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋
Ｓ３ Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ（Ｎａ−（Ｏ−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−Ｏ−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ）−Ｔｙｒ３−オクトレオチド：
単一同位体質量；Ｃ７３Ｈ１１５Ｎ１５Ｏ２３Ｓ２として計算値＝１７８５.７５；測定値：ｍ／ｚ＝１８７３.６［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝１８９５.７［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００４８】
３. Ｌｙｓ０（Ｎ−２−ピコリルアミノ−....）ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）
２−ピコリルアミンＮ，Ｎ−二酢酸２
イミノ二酢酸（３.２５ｇ、２４.４ｍｍｏｌ）を無水エタノール３０ｍｌおよびＮａＯＨ（１.９５ｇ；４９ｍｍｏｌ）水溶液（１０ｍｌ）の混合物に溶解した。水９ｍｌに溶かした塩化ピコリル４.００ｇ（２４.４ｍｍｏｌ）および水４ｍｌに溶かしたＮａＯＨ１.９５ｇ（４９ｍｍｏｌ）を添加した後、その溶液を７０℃で２時間撹拌した。追加のＮａＯＨを１.９５ｇ（４９ｍｍｏｌ）添加した後、その溶液をさらに７０℃で１.５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）により反応を追跡し、その時点で反応物が完全に消失していることを確認した。溶媒を減圧下に蒸発させ、残渣を水２５ｍｌに再溶解した。溶液のｐＨを濃塩酸により１.５に調整した後、溶液を再度蒸発乾固した。残渣をメタノールで再懸濁して還流する工程を数回連続して繰返し、懸濁液を熱時濾過し、濾液を減圧下に濃縮して過剰のＮａＣｌを成功裏に除去した。ピコリルアミノ二酢酸を残りのメタノール溶液から一夜−２０℃で結晶化した。
単一同位体質量；Ｃ１０Ｈ１２Ｎ２Ｏ４として計算値＝２２４.０８；測定値：ｍ／ｚ＝ ［Ｍ＋Ｈ］＋（二ナトリウム塩）
【００４９】
２−ピコリルアミンＮ，Ｎ−二酢酸のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）へのカップリング反応
２−ピコリルアミンＮ，Ｎ−二酢酸５２ｍｇ（０.１９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ２６ｍｇ（０.１９ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ６２ｍｇ（０.１９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ１７５μｌ（１.７５ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＭＦに溶かした溶液を室温で１０分間撹拌した。この溶液をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ０−ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）２００ｍｇ（０.１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に激しく撹拌しながら滴下した。３０分後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下に乾燥した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護基を除去するために、ペプチドをピペリジン／ＤＭＦ（１：４）２ｍｌに溶解し、１０分間撹拌した。エーテルで沈殿させることにより、脱保護した産物を８４％の収率で得た。
単一同位体質量；Ｃ７５Ｈ９８Ｎ１４Ｏ１８Ｓ２として計算値＝１５４６.６６；測定値：ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００５０】
４. Ｌｙｓ０（Ｐｉｃ）ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）のＬｙｓ０−Ｎａ−アマドリ誘導体
Ｌｙｓ０（Ｐｉｃ）ＴＡＴＥ（Ｄｄｅ）とグルコースの接合、および引き続くＤｄｅ−脱保護は、Ｌｙｓ０（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ））−ＴＯＣ（Ｄｄｅ）のＬｙｓ０−Ｎａ−アマドリ誘導体について記載したと同様に実施した。
単一同位体質量；Ｃ７１Ｈ９６Ｎ１４Ｏ２１Ｓ２として計算値＝１５４４.６３；測定値：ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝［Ｍ＋Ｎａ］＋
【００５１】
放射活性標識化
最近報告された有機金属水和イオン［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−法３に基づき、１０ｍｇのＮａＢＨ４、８ｍｇのＮａ２ＣＯ３および４１.５ｍｇのＮａ／Ｋ酒石酸塩を、ガラスフラスコ中６００μｌの［９９ｍＴｃ］ペルテクネテート溶離液に溶解した。次いで、フラスコをＣＯを満たした風船につなぎ、密封した。７５℃で４５分間撹拌した後、溶液を氷浴上で冷却し、１５０μｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７.４）を加えた。還元剤を分解するために６００μｌの１Ｎ−ＨＣｌを加えた。次いで、溶液を５００μｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液で中和した。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−水和イオンの存在はＴＬＣ（５％conc. ＨＣｌ／メタノール）にて確認した。
【００５２】
Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ７００μｇに１ｍｌの［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋−溶液（５１ＭＢｑ）を加えた後、混合物を７５℃に３０分間加熱した。勾配ＨＰＬＣ精製により、放射化学的に純粋なペプチドＮａ−（１−デオキシ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌｙｓ０（Ｎ−Ｈｉｓ［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋）−Ｔｙｒ３−オクトレオチドを３４％の収率で得た。
Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣは同様の方法で標識した。
【００５３】
親油性の定量
放射活性標識ペプチド約３０００００ｃｐｍをＰＢＳ（ｐＨ７.４）５００ｍｌに溶かした溶液に、オクタノール５００ｍｌを添加した（ｎ＝６）。バイアルを３分間ボルテックス処理し、１５０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。ＰＢＳとオクタノールの１００ｍｌを取り、γ−カウンターにて測定した。
Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ：ｌｏｇｐｏｗ＝−０.６７３±０.０６４
Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ：ｌｏｇｐｏｗ＝−１.３０４±０.０４０
インビトロ実験
ＡＲ４２Ｊ細胞を、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ−Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ１６４０中に維持した。
【００５４】
インターナリゼーションの検討
１ウエルあたり８×１０５〜５×１０６個のＡＲ４２Ｊ細胞の細胞集団を容れた６穴プレートを、実験に先立ち、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＢＳＡ、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン）とともに１時間インキュベートした。培地１０μｌ中、約３０００００ｃｐｍの放射活性金属ペプチドを各ウエルに加えた（対照化合物［１２５Ｉ］ＴＯＣ（内部基準）および各対象の放射活性金属化合物について、３組の実験とする）。３７℃で１０、３０、６０、９０または１２０分間インキュベートした後、上清を採取し、細胞は冷培地１ｍｌにて１回洗浄した。上清を前工程の上清と併合した。レセプター結合（酸解離可能）放射活性を除くために、細胞を０.０２Ｍ−ＮａＯＡｃ（酸洗浄）１ｍｌと３７℃でインキュベートした。１０分後に上清を採取し、細胞を０.０２Ｍ−ＮａＯＡｃ１ｍｌにて１回洗浄し、その上清を前工程の上清と再度併合した。次いで、細胞を１ｍｌの１Ｎ−ＮａＯＨで抽出し、ウエルはＰＢＳにて１回洗浄した。このプールしたフラクションはインターナリゼーションの放射活性リガンドを示している。ＮａＯＨフラクションならびに上清と酸洗浄フラクションの活性をγ−カウンターにて計測した。
【００５５】
エクスターナリゼーションの検討
インターナリゼーションの検討にて記載したように、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＢＳＡ、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン）を容れた６穴プレートを、実験に先立ち、３７℃で１時間インキュベートした。培地１０μｌ中、約３０００００ｃｐｍの放射活性金属ペプチドを各ウエルに加えた（対照化合物［１２５Ｉ］ＴＯＣ（内部基準）および各対象の放射活性金属化合物について、３組の実験とする）。３７℃にて１２０分間インキュベートした後、上清を採取し、細胞は冷培地１ｍｌにて１回洗浄した。上清を前工程の上清と併合した。エクスターナリゼーションの放射活性を採取するために、細胞を１ｍｌの培地とともに３７℃でインキュベートした。１０、３０、６０、９０および１２０分後に、それぞれ上清を集め、細胞は１ｍｌの培地で１回洗浄し、その上清を前工程の上清と併合した。次いで、細胞を１ｍｌの１Ｎ−ＮａＯＨで抽出し、ウエルはＰＢＳにて１回洗浄した。このプールしたフラクションは細胞中になお局在する放射活性リガンドを示している。ＮａＯＨフラクションならびに上清とエクスターナリゼーションフラクションの活性をγ−カウンターにて計測した。
【００５６】
トレーサー再循環なしのエクスターナリゼーションの検討
前記実験について記載したのと同様に、６穴プレートを放射活性リガンドとともに３７℃にて１２０分間インキュベートした。上清を採取し、細胞は冷培地１ｍｌにて１回洗浄した。上清を前工程の上清と併合した。エクスターナリゼーションの放射活性を採取するために、細胞を１ｍｌの培地とともに３７℃でインキュベートした。１０分後に上清を採取し、細胞は再度さらに２０分間３７℃にて培地１ｍｌとインキュベートした。上清を採取し、細胞は１ｍｌの培地とともに３７℃にて３０分間さらに３回インキュベートした。次いで、細胞を１ｍｌの１Ｎ−ＮａＯＨで抽出し、ウエルはＰＢＳにて１回洗浄した。このプールしたフラクションは細胞中になお局在する放射活性リガンドを示している。ＮａＯＨフラクションならびにすべての時点でのエクスターナリゼーションフラクションの活性をγ−カウンターにて計測した。
【００５７】
生体分布の検討
腫瘍増殖を確立するために、サブコンフルエント単層細胞を１ｍＭ−ＥＤＴＡで処理し、懸濁し、遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。
ヌードマウス（オスおよびメス、６〜８週令）の脇腹に、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）１００μｌに懸濁した細胞２.５〜３×１０７個を皮下接種し、ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスの尾部静脈に注射した。動物（ｎ＝３〜４）を注射後３０分および１２０分後に屠殺し、対象臓器を摘出した。秤量した組織サンプルにつきガンマカウンターにて放射活性を測定した。データは％ｉＤ／ｇ組織で表す（平均±ＤＳ、ｎ＝３〜４）。
【００５８】
表１：ＡＲ４２Ｊ腫瘍担持ヌードマウスにおける［９９ｍＴｃ］Ｓ１−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣおよび［９９ｍＴｃ］Ｓ３−Ｌｙｓ０（Ｈｉｓ）ＴＯＣ注射２時間後の組織蓄積［％ｉＤ／ｇ］（ｎ＝３〜４）
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【公開番号】特開２０１３−１００３４９（Ｐ２０１３−１００３４９Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−２３００１（Ｐ２０１３−２３００１）
【出願日】平成２５年２月８日（２０１３．２．８）
【分割の表示】特願２００９−２２８９９８（Ｐ２００９−２２８９９８）の分割
【原出願日】平成１４年４月２３日（２００２．４．２３）
【出願人】（５９５１８１００３）マリンクロッド エルエルシー (203)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年２月８日（２０１３．２．８）
【分割の表示】特願２００９−２２８９９８（Ｐ２００９−２２８９９８）の分割
【原出願日】平成１４年４月２３日（２００２．４．２３）
【出願人】（５９５１８１００３）マリンクロッド エルエルシー (203)
【Ｆターム（参考）】
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