Ｔｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物
【課題】優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する安全性の高いＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物の提供。
【解決手段】サンザシの抽出物を有効成分として含有するＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物である。
【解決手段】サンザシの抽出物を有効成分として含有するＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、血管内皮細胞と血管壁細胞（血管平滑筋細胞やペリサイト）とが、細胞外マトリックスを介して間接的に、又は直接的に接着する構造を有しており、酸素及び栄養素を生体組織に供給し、生体組織から老廃物を除去する機能を有している。
【０００３】
一般に、血管の形成は、新たに血管が形成される血管発生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と、形成された既存の血管が伸長し、分岐することにより、新たな血管のネットワークが形成される血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）との２段階に分けられる。前者は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が作用し、脈管形成とよばれる血管の初期発生からその後の血管新生に至るまで非常に広い範囲の血管形成に関与するものであり、後者は、アンジオポエチン（Ａｎｇ）が作用し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着の制御、血管の構造的安定化に関与するものである。
【０００４】
血管は通常の酸素状況においては、血管内皮細胞とその周囲を裏打ちする血管壁細胞とが強固に接着しており、血管構造が安定に保たれているが、組織で低酸素が生じると血管壁細胞が血管内皮細胞から脱離し、無秩序な血管が増生することがある。このような現象（血管新生）は、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患において、しばしば観察されている。
【０００５】
これらの血管新生は、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＥＧＦ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ２）を活性化させることにより、抑制されることが知られている（例えば、特許文献１参照）。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死を抑制することも報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
このように、Ｔｉｅ２の活性化により、血管新生が抑制されることが知られているだけでなく、血管を成熟化、正常化、及び安定化させることも知られている。
例えば、血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが知られている。
例えば、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが知られている。
例えば、種々の細胞内外の血管構造を破たんさせる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが知られている。
【０００７】
このようなＴｉｅ２の活性化により血管新生を抑制する天然由来の物質としては、桂皮の抽出物が知られているが（例えば、特許文献１参照）、活性が不十分であるという問題がある。また、血管新生を抑制する物質としては、スラミンが知られているが（例えば、特許文献２参照）、安全性に優れないという問題がある。
【０００８】
一方、サンザシの抽出物は、これまでにヒスタミン遊離抑制等の医薬品として用いられてきたが（例えば、特許文献３参照）、サンザシの抽出物が、Ｔｉｅ２活性化作用、ＶＥＧＦ阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有することについては知られておらず、優れたＴｉｅ２活性化作用、ＶＥＧＦ阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する安全性の高い物質について、速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２６３３５８号公報
【特許文献２】特表平９−５０３４８８号公報
【特許文献３】特開平６−１８３９９１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９ Ｄｅｃ ２４；２８６（５４４９）：２５１１−４．
【非特許文献２】Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２００４ Ａｐｒ １３；１０１（１５）：５５５３−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用を有し、安全性の高い血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた血管新生抑制作用を有し、安全性の高い血管新生抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い医薬品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、サンザシの抽出物が優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有することを知見し、本発明を完成したものである。
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤である。
＜２＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤である。
＜３＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管新生抑制剤である。
＜４＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤である。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のＴｉｅ２活性化剤、前記＜２＞に記載の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、前記＜３＞に記載の血管新生抑制剤、及び前記＜４＞に記載の血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬品組成物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することができる。
本発明の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用を有し、安全性の高い血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤を提供することができる。
本発明の血管新生抑制剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血管新生抑制作用を有し、安全性の高い血管新生抑制剤を提供することができる。
本発明の血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤を提供することができる。
本発明の医薬品組成物によると、従来における前記諸問題を解決し、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＨＵＶＥＣの各試料におけるＴｉｅ２リン酸化をウエスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
【図２】図２は、ＨＵＶＥＣの各試料における血管分岐数を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（Ｔｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物）
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤、並びに医薬品組成物は、サンザシの抽出物を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１７】
前記Ｔｉｅ２活性化剤は、Ｔｉｅ２をリン酸化することで、その活性体（リン酸化Ｔｉｅ２）に変換するＴｉｅ２活性化作用を有する。前記Ｔｉｅ２が活性化されると、細胞内チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を惹起し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が誘導される。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化される。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死が抑制される。
【００１８】
前記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤は、ＶＥＧＦの働きを阻害するＶＥＧＦ阻害作用を有する。前記ＶＥＧＦは、分子量３４ｋＤａ〜４６ｋＤａの糖タンパク質であり、血管内皮細胞に働き、細胞の増殖及び遊走の促進作用、並びに血管新生の促進作用を有する。
【００１９】
前記血管新生抑制剤は、既存の血管から形成される新たな血管のネットワークを抑制する血管新生抑制作用を有する。低酸素状態では、Ｔｉｅ２の活性化が一時的に抑制され、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が乖離し、接着が乖離された血管内皮細胞から新しい血管のネットワークが形成される。血管新生抑制剤は、このような血管壁細胞が内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管の増生を抑制することができる。
【００２０】
前記血管の成熟化剤は、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管内環境因子（細胞及び液性因子）が容易には血管外に漏出しないような血管内皮細胞間の接着斑を形成する成熟化作用を有する。また、血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが可能である。
【００２１】
前記血管の正常化剤は、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の血管内皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、正常な状態にする正常化作用を有する。また、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが可能である。
【００２２】
前記血管の安定化剤は、既存の血管に対する障害、血管内皮細胞同士の解離、及び血管内皮細胞と血管壁細胞の解離を抑制する作用、及び血管内皮細胞の細胞死を抑制する安定化作用を有する。また、種々の細胞内外の血管構造を破たんさせる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが可能である。
【００２３】
前記医薬品組成物は、前記Ｔｉｅ２活性化剤、前記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、前記血管の成熟化剤、前記血管の正常化剤、前記血管の安定化剤、及び前記血管新生抑制剤のいずれかを含む組成物であり、Ｔｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する。
【００２４】
＜サンザシの抽出物＞
前記サンザシは、バラ科サンザシ属の落葉低木であり、学名はＣｒａｔａｅｇｕｓ ｃｕｎｅａｔａである。前記サンザシは、中国中南部の地域から容易に入手可能である。前記サンザシの茎の高さは、３０ｃｍ〜９０ｃｍであり、８月〜９月に紫又は白色の花が咲く。前記サンザシの薬用部位は果実であり、健胃消化薬として広く用いられている。
【００２５】
前記サンザシの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法により容易に得ることができる。前記サンザシの抽出物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出液の希釈液、濃縮液、抽出液の乾燥物などが挙げられる。
【００２６】
前記サンザシの抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料である前記サンザシを投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら可溶性成分を溶出した後、濾過して抽出残渣を除くことにより抽出液を得る方法などが挙げられる。
【００２７】
前記サンザシの抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葉部、枝部、幹部、樹皮部、花部、果実部などが挙げられるが、これらの中でも、果実部、葉部が好ましい。
前記サンザシの抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００２８】
前記サンザシの抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出時間は１時間〜３時間が好ましく、抽出温度は常温〜９５℃が好ましい。
【００２９】
前記サンザシの抽出溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。前記水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。前記親水性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。前記混合溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、低級アルコールを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部、多価アルコールを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、添加することが好ましい。なお、前記サンザシの抽出溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
これらの中でも、熱水を用いて抽出することが、好ましい。
【００３０】
前記サンザシの抽出溶媒の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出原料としてのサンザシに対して、５倍量〜１５倍量（質量比）であることが好ましい。
【００３１】
前記サンザシの抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００３２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤などが挙げられる。
【００３３】
＜用途＞
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤、並びに医薬品組成物は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患、アトピー性皮膚炎、及び花粉症などのアレルギー性疾患に関する医薬品、並びにこれらの疾患に関する安全な予防薬として好適に用いることができ、その配合量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、美容用飲食品、健康用飲食品などの飲食品として好適に用いることができ、その配合量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
前記配合量としては、抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記サンザシの精製物に換算して、０．０００１質量％〜２０質量％が好ましく、０．０００１質量％〜１０質量％がより好ましい。
【００３５】
前記用法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、非経口、外用などの投与形態が挙げられる。
【００３６】
前記剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、及びシロップ剤等の経口投与剤、注射剤、点滴剤、及び坐剤等の非経口投与剤、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、及び浴用剤等の外用剤などが挙げられる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３８】
（製造例１）
＜サンザシの抽出物の製造＞
サンザシの抽出物として、実施例１及び３では、サンザシエキスパウダーＭＦ（果実部）（丸善製薬株式会社製）、実施例２では、山査葉エキスパウダー（葉部）（丸善製薬株式会社製）を用いた。
【００３９】
（実施例１）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
前記サンザシの抽出物の薬理効果について、リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量を検出することにより、評価を行った。前記リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いた免疫化学的手法により検出した。以下に手順を示す。
まず、６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに２×１０５のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ ＥＧ２培地（Ｋｕｒａｂｏ社製）にて、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで１２時間培養した。培養液を除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ-１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製、Ｒ−８７５５）中で２時間培養した。サンザシ抽出物（果実部）（丸善製薬株式会社製、サンザシエキスパウダーＭＦ）をＤＭＳＯを用いて最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、前記培地に添加した。１０分間インキュベーション後、細胞を氷上で冷却し、冷ＰＢＳで洗浄した。タンパク質分解酵素阻害剤（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，ＰＭＳＦ，Ｎａ３ＶＯ４）を含んだＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ中、細胞を超音波粉砕した。ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４質量％ＳＤＳ、２０質量％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１質量％ＢＰＢ）を加えて試料１とした。得られた試料１を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５質量％ポリアクリルアミドゲル，１２ウェル，ＮＰＵ−７．５Ｌ，アトー株式会社製）を以下の条件にて行った。
・ ゲル：７．５質量％アクリルアミドゲル（ＮＰＵ−７．５Ｌ，アトー株式会社製）
・ 泳動条件：４０ｍＡ（７５分、ゲル２枚）
・ Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２抗体：＃４２２１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｍａ製）
次に、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（２０Ｖ，４℃，終夜）によりＰＶＤＦ膜へ転写した。５質量％スキムミルク／ＴＢＳＴによりブロッキング（１時間）を行い、その後、リン酸化Ｔｉｅ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，♯４２２１）を加え、室温で１時間放置した。次いでヤギ-抗ウサギＩｇ’ｓ ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ ＡＬＩ３４０４）を加え、室温で１時間放置した。化学発光検出（ＥＣＬ）により、タンパク質のバンドを検出した。結果を図１に示す。
【００４０】
（比較例１）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、桂皮抽出物（丸善製薬株式会社製、ケイヒエキスパウダーＭＦ）に変更した以外は実施例１と同様にして、比較例１とした。なお、前記桂皮抽出物（丸善製薬株式会社製、ケイヒエキスパウダーＭＦ）はＤＭＳＯを用いて最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。結果を図１に示す。
【００４１】
（参考例１）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、陽性コントロールとしてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）に変更した以外は実施例１と同様にして、参考例１とした。なお、前記Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）はＤＭＳＯを用いて最終濃度が３００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。結果を図１に示す。
【００４２】
（参考例２）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、陰性コントロールとしてＤＭＳＯに変更した以外は実施例１と同様にして、参考例２とした。結果を図１に示す。
【００４３】
実施例１、比較例１、並びに参考例１及び２におけるＴｉｅ２リン酸化作用の結果について説明する。図１は、ウエスタンブロットにより検出した各試料におけるリン酸化されたＴｉｅ２タンパク質のバンドを示している。検出されたバンドの濃さは、リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量に比例している。バンドが濃い程、リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量が多いことを示している。図１より、前記サンザシ抽出物（果実部）は、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１と同様、Ｔｉｅ２の顕著なリン酸化をもたらすことが認められた。以前、Ｔｉｅ２をリン酸化すると報告のある桂皮についても、Ｔｉｅ２リン酸化誘導が確認されたが、サンザシの方がより強く活性化を誘導することがわかった。なお、陰性コントロールであるＤＭＳＯを添加した系では、Ｔｉｅ２のリン酸化は事実上認められなかった。また、Ｔｉｅ２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−３２４）を用いたウエスタンブロットでは、Ｔｉｅ２の発現量そのものは全試料とも同量であった。
【００４４】
（実施例２）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェルプレートへ２．０×１０４細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるように播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２（低血清血管内皮細胞増殖用培地）を用いて一晩培養した。次に、一晩培養後の前記ＨＵＶＥＣを、細胞刺激（被験試料添加）の３時間前に０．１ｍＬのＨｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２（血管内皮細胞基礎培地）に置換し、再度培養を行った。その後、前記ウェル内に、被験試料として前記Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２で各濃度に調製したサンザシ抽出部（葉部）（丸善製薬株式会社製、山査葉エキスパウダー）を０．１ｍＬ添加し、１０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型Ｔｉｅ２量及び総Ｔｉｅ２量を測定し、総Ｔｉｅ２に対するリン酸化型Ｔｉｅ２の比率を計算し、下記式（１）に従いＴｉｅ２リン酸化作用を評価した。
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたＤＭＳＯについても同様に評価した。結果を表１に示す。
Ｔｉｅ２活性化率（％）＝
［｛（被験試料添加時のリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（被験試料添加時の総Ｔｉｅ２の測定値）｝／｛（陰性コントロールでのリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（陰性コントロールでの総Ｔｉｅ２の測定値）｝］×１００ ・・・式（１）
【００４５】
（参考例３）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例２において、前記サンザシ抽出物（葉部）を、陽性コントロールとしてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例２と同様にして、参考例３とした。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
実施例２及び参考例３におけるＴｉｅ２リン酸化作用の結果について説明する。前記イムノアッセイキットによりＴｉｅ２リン酸化作用の評価を実施したところ、実施例２の前記サンザシ抽出物（葉部）には、Ｔｉｅ２がリン酸化し、Ｔｉｅ２が活性化されることが認められた。なお、陰性コントロールであるＤＭＳＯを添加した系では、Ｔｉｅ２の顕著なリン酸化は認められなかった。また、参考例３の陽性コントロールであるＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１を添加した系では、Ｔｉｅ２がリン酸化し、Ｔｉｅ２が活性化されることが認められた。したがって、実施例２の前記サンザシ抽出物（葉部）によりＴｉｅ２がリン酸化して活性化され、血管成熟化、血管正常化、血管安定化がもたらされ、血管新生が抑制されることが示唆された。
【００４８】
（実施例３）
＜血管新生抑制作用＞
次に、前記サンザシの抽出物（果実部）により、どの程度、血管分岐数が低減されているのかを画像解析することで、血管新生抑制作用の評価を行った。以下に手順を示す。
まず、血管新生キット（倉敷紡績株式会社製）を用い、ヒト正常臍帯静脈血管内皮細胞とヒト正常真皮繊維芽細胞を一定の比率で共培養させ、管腔形成初期段階の増殖状態に調製した。血管内皮細胞増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（倉敷紡績株式会社製）１０ｎｇ／ｍＬの共存下、被験試料として、サンザシ抽出物（果実部）（丸善製薬株式会社製、サンザシエキスパウダーＭＦ）を用い、表２に記載の各濃度を含有した培地に添加後、３７℃、５％ＣＯ２条件にて、インキュベーションした。培養開始から４日後、７日後、９日後の各々の時点で、ＶＥＧＦ−Ａ共存下、サンザシ抽出物（果実部）（丸善製薬株式会社製、サンザシエキスパウダーＭＦ）を表２に示す所定濃度含有した培地と交換した。その後、各ウェルの細胞層を７０容積％エタノールで固定化し、管腔染色キット（倉敷紡績株式会社製、ＣＤ３１）を用いてＨＵＶＥＣ細胞のＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）を染色した。各ウェルから得られた染色像を撮影し、管腔形成について、管腔の分岐数をもとに、血管新生抑制作用を評価した。結果を表２及び図２に示す。
【００４９】
（比較例２）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、桂皮抽出物（丸善製薬株式会社製、ケイヒエキスパウダーＭＦ）に変更し、表２に記載の濃度を用いた以外は実施例３と同様にして、比較例２とした。結果を表２及び図２に示す。
【００５０】
（参考例４）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を用いずに、ＶＥＧＦ−Ａ（＋）をＶＥＧＦ−Ａ（−）に変更して、陰性コントロールとしたこと以外は実施例３と同様にして、参考例４とした。結果を表２及び図２に示す。
（参考例５）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を用いずに陽性コントロールとしたこと以外は実施例３と同様にして、参考例５とした。結果を表２及び図２に示す。
（参考例６）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、血管新生阻害剤として知られるＳｕｒａｍｉｎ（倉敷紡績株式会社製（血管新生キットに付属））（５０μＭ）に変更した以外は実施例３と同様にして、参考例６とした。結果を表２及び図２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
実施例３、比較例２、並びに参考例４〜６において、血管分岐数を基にした血管新生抑制作用の評価を実施したところ、実施例３のサンザシ抽出物（果実部）には、ＶＥＧＦ−Ａ（＋）によって増加する血管分岐数を濃度依存で抑制する作用が認められた（抑制率約２０％）。一方、比較例２の桂皮抽出物には、今回実施した試験濃度において、作用を確認することができなかった。これらの結果から、今回実施した試験条件でサンザシ抽出物（果実部）には、ＶＥＧＦの働きを阻害するＶＥＧＦ阻害作用を有し、有効な血管新生抑制作用を有することがわかった。
【００５３】
以上より、サンザシの抽出物が、Ｔｉｅ２リン酸化効果を有することにより、血管内皮増殖因子の阻害、及び血管新生の抑制が起こり、血管の成熟化、血管の正常化、及び血管の安定化を誘導できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤、並びに医薬品組成物は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患に関する医薬品、及びこれらの疾患に関する安全な予防薬として、幅広く用いることができる。また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、美容用飲食品、健康用飲食品などの飲食品として、幅広く用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、血管内皮細胞と血管壁細胞（血管平滑筋細胞やペリサイト）とが、細胞外マトリックスを介して間接的に、又は直接的に接着する構造を有しており、酸素及び栄養素を生体組織に供給し、生体組織から老廃物を除去する機能を有している。
【０００３】
一般に、血管の形成は、新たに血管が形成される血管発生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と、形成された既存の血管が伸長し、分岐することにより、新たな血管のネットワークが形成される血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）との２段階に分けられる。前者は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が作用し、脈管形成とよばれる血管の初期発生からその後の血管新生に至るまで非常に広い範囲の血管形成に関与するものであり、後者は、アンジオポエチン（Ａｎｇ）が作用し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着の制御、血管の構造的安定化に関与するものである。
【０００４】
血管は通常の酸素状況においては、血管内皮細胞とその周囲を裏打ちする血管壁細胞とが強固に接着しており、血管構造が安定に保たれているが、組織で低酸素が生じると血管壁細胞が血管内皮細胞から脱離し、無秩序な血管が増生することがある。このような現象（血管新生）は、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患において、しばしば観察されている。
【０００５】
これらの血管新生は、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＥＧＦ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ２）を活性化させることにより、抑制されることが知られている（例えば、特許文献１参照）。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死を抑制することも報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
このように、Ｔｉｅ２の活性化により、血管新生が抑制されることが知られているだけでなく、血管を成熟化、正常化、及び安定化させることも知られている。
例えば、血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが知られている。
例えば、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが知られている。
例えば、種々の細胞内外の血管構造を破たんさせる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが知られている。
【０００７】
このようなＴｉｅ２の活性化により血管新生を抑制する天然由来の物質としては、桂皮の抽出物が知られているが（例えば、特許文献１参照）、活性が不十分であるという問題がある。また、血管新生を抑制する物質としては、スラミンが知られているが（例えば、特許文献２参照）、安全性に優れないという問題がある。
【０００８】
一方、サンザシの抽出物は、これまでにヒスタミン遊離抑制等の医薬品として用いられてきたが（例えば、特許文献３参照）、サンザシの抽出物が、Ｔｉｅ２活性化作用、ＶＥＧＦ阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有することについては知られておらず、優れたＴｉｅ２活性化作用、ＶＥＧＦ阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する安全性の高い物質について、速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２６３３５８号公報
【特許文献２】特表平９−５０３４８８号公報
【特許文献３】特開平６−１８３９９１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９ Ｄｅｃ ２４；２８６（５４４９）：２５１１−４．
【非特許文献２】Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２００４ Ａｐｒ １３；１０１（１５）：５５５３−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用を有し、安全性の高い血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた血管新生抑制作用を有し、安全性の高い血管新生抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れた血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤を提供することを目的とする。また、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い医薬品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、サンザシの抽出物が優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有することを知見し、本発明を完成したものである。
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤である。
＜２＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤である。
＜３＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管新生抑制剤である。
＜４＞ サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤である。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のＴｉｅ２活性化剤、前記＜２＞に記載の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、前記＜３＞に記載の血管新生抑制剤、及び前記＜４＞に記載の血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬品組成物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することができる。
本発明の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用を有し、安全性の高い血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤を提供することができる。
本発明の血管新生抑制剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血管新生抑制作用を有し、安全性の高い血管新生抑制剤を提供することができる。
本発明の血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤を提供することができる。
本発明の医薬品組成物によると、従来における前記諸問題を解決し、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有し、安全性の高い医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＨＵＶＥＣの各試料におけるＴｉｅ２リン酸化をウエスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
【図２】図２は、ＨＵＶＥＣの各試料における血管分岐数を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（Ｔｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、及び血管の安定化剤、並びに医薬品組成物）
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤、並びに医薬品組成物は、サンザシの抽出物を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１７】
前記Ｔｉｅ２活性化剤は、Ｔｉｅ２をリン酸化することで、その活性体（リン酸化Ｔｉｅ２）に変換するＴｉｅ２活性化作用を有する。前記Ｔｉｅ２が活性化されると、細胞内チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を惹起し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が誘導される。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化される。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死が抑制される。
【００１８】
前記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤は、ＶＥＧＦの働きを阻害するＶＥＧＦ阻害作用を有する。前記ＶＥＧＦは、分子量３４ｋＤａ〜４６ｋＤａの糖タンパク質であり、血管内皮細胞に働き、細胞の増殖及び遊走の促進作用、並びに血管新生の促進作用を有する。
【００１９】
前記血管新生抑制剤は、既存の血管から形成される新たな血管のネットワークを抑制する血管新生抑制作用を有する。低酸素状態では、Ｔｉｅ２の活性化が一時的に抑制され、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が乖離し、接着が乖離された血管内皮細胞から新しい血管のネットワークが形成される。血管新生抑制剤は、このような血管壁細胞が内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管の増生を抑制することができる。
【００２０】
前記血管の成熟化剤は、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管内環境因子（細胞及び液性因子）が容易には血管外に漏出しないような血管内皮細胞間の接着斑を形成する成熟化作用を有する。また、血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが可能である。
【００２１】
前記血管の正常化剤は、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の血管内皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、正常な状態にする正常化作用を有する。また、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが可能である。
【００２２】
前記血管の安定化剤は、既存の血管に対する障害、血管内皮細胞同士の解離、及び血管内皮細胞と血管壁細胞の解離を抑制する作用、及び血管内皮細胞の細胞死を抑制する安定化作用を有する。また、種々の細胞内外の血管構造を破たんさせる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが可能である。
【００２３】
前記医薬品組成物は、前記Ｔｉｅ２活性化剤、前記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、前記血管の成熟化剤、前記血管の正常化剤、前記血管の安定化剤、及び前記血管新生抑制剤のいずれかを含む組成物であり、Ｔｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有する。
【００２４】
＜サンザシの抽出物＞
前記サンザシは、バラ科サンザシ属の落葉低木であり、学名はＣｒａｔａｅｇｕｓ ｃｕｎｅａｔａである。前記サンザシは、中国中南部の地域から容易に入手可能である。前記サンザシの茎の高さは、３０ｃｍ〜９０ｃｍであり、８月〜９月に紫又は白色の花が咲く。前記サンザシの薬用部位は果実であり、健胃消化薬として広く用いられている。
【００２５】
前記サンザシの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法により容易に得ることができる。前記サンザシの抽出物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出液の希釈液、濃縮液、抽出液の乾燥物などが挙げられる。
【００２６】
前記サンザシの抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料である前記サンザシを投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら可溶性成分を溶出した後、濾過して抽出残渣を除くことにより抽出液を得る方法などが挙げられる。
【００２７】
前記サンザシの抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葉部、枝部、幹部、樹皮部、花部、果実部などが挙げられるが、これらの中でも、果実部、葉部が好ましい。
前記サンザシの抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００２８】
前記サンザシの抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出時間は１時間〜３時間が好ましく、抽出温度は常温〜９５℃が好ましい。
【００２９】
前記サンザシの抽出溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。前記水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。前記親水性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。前記混合溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、低級アルコールを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部、多価アルコールを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、添加することが好ましい。なお、前記サンザシの抽出溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
これらの中でも、熱水を用いて抽出することが、好ましい。
【００３０】
前記サンザシの抽出溶媒の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抽出原料としてのサンザシに対して、５倍量〜１５倍量（質量比）であることが好ましい。
【００３１】
前記サンザシの抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００３２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤などが挙げられる。
【００３３】
＜用途＞
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤、並びに医薬品組成物は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患、アトピー性皮膚炎、及び花粉症などのアレルギー性疾患に関する医薬品、並びにこれらの疾患に関する安全な予防薬として好適に用いることができ、その配合量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、美容用飲食品、健康用飲食品などの飲食品として好適に用いることができ、その配合量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
前記配合量としては、抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記サンザシの精製物に換算して、０．０００１質量％〜２０質量％が好ましく、０．０００１質量％〜１０質量％がより好ましい。
【００３５】
前記用法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、非経口、外用などの投与形態が挙げられる。
【００３６】
前記剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、及びシロップ剤等の経口投与剤、注射剤、点滴剤、及び坐剤等の非経口投与剤、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、及び浴用剤等の外用剤などが挙げられる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３８】
（製造例１）
＜サンザシの抽出物の製造＞
サンザシの抽出物として、実施例１及び３では、サンザシエキスパウダーＭＦ（果実部）（丸善製薬株式会社製）、実施例２では、山査葉エキスパウダー（葉部）（丸善製薬株式会社製）を用いた。
【００３９】
（実施例１）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
前記サンザシの抽出物の薬理効果について、リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量を検出することにより、評価を行った。前記リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いた免疫化学的手法により検出した。以下に手順を示す。
まず、６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに２×１０５のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ ＥＧ２培地（Ｋｕｒａｂｏ社製）にて、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで１２時間培養した。培養液を除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ-１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製、Ｒ−８７５５）中で２時間培養した。サンザシ抽出物（果実部）（丸善製薬株式会社製、サンザシエキスパウダーＭＦ）をＤＭＳＯを用いて最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、前記培地に添加した。１０分間インキュベーション後、細胞を氷上で冷却し、冷ＰＢＳで洗浄した。タンパク質分解酵素阻害剤（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，ＰＭＳＦ，Ｎａ３ＶＯ４）を含んだＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ中、細胞を超音波粉砕した。ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４質量％ＳＤＳ、２０質量％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１質量％ＢＰＢ）を加えて試料１とした。得られた試料１を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５質量％ポリアクリルアミドゲル，１２ウェル，ＮＰＵ−７．５Ｌ，アトー株式会社製）を以下の条件にて行った。
・ ゲル：７．５質量％アクリルアミドゲル（ＮＰＵ−７．５Ｌ，アトー株式会社製）
・ 泳動条件：４０ｍＡ（７５分、ゲル２枚）
・ Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２抗体：＃４２２１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｍａ製）
次に、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（２０Ｖ，４℃，終夜）によりＰＶＤＦ膜へ転写した。５質量％スキムミルク／ＴＢＳＴによりブロッキング（１時間）を行い、その後、リン酸化Ｔｉｅ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，♯４２２１）を加え、室温で１時間放置した。次いでヤギ-抗ウサギＩｇ’ｓ ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ ＡＬＩ３４０４）を加え、室温で１時間放置した。化学発光検出（ＥＣＬ）により、タンパク質のバンドを検出した。結果を図１に示す。
【００４０】
（比較例１）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、桂皮抽出物（丸善製薬株式会社製、ケイヒエキスパウダーＭＦ）に変更した以外は実施例１と同様にして、比較例１とした。なお、前記桂皮抽出物（丸善製薬株式会社製、ケイヒエキスパウダーＭＦ）はＤＭＳＯを用いて最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。結果を図１に示す。
【００４１】
（参考例１）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、陽性コントロールとしてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）に変更した以外は実施例１と同様にして、参考例１とした。なお、前記Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）はＤＭＳＯを用いて最終濃度が３００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。結果を図１に示す。
【００４２】
（参考例２）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例１において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、陰性コントロールとしてＤＭＳＯに変更した以外は実施例１と同様にして、参考例２とした。結果を図１に示す。
【００４３】
実施例１、比較例１、並びに参考例１及び２におけるＴｉｅ２リン酸化作用の結果について説明する。図１は、ウエスタンブロットにより検出した各試料におけるリン酸化されたＴｉｅ２タンパク質のバンドを示している。検出されたバンドの濃さは、リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量に比例している。バンドが濃い程、リン酸化されたＴｉｅ２のタンパク質量が多いことを示している。図１より、前記サンザシ抽出物（果実部）は、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１と同様、Ｔｉｅ２の顕著なリン酸化をもたらすことが認められた。以前、Ｔｉｅ２をリン酸化すると報告のある桂皮についても、Ｔｉｅ２リン酸化誘導が確認されたが、サンザシの方がより強く活性化を誘導することがわかった。なお、陰性コントロールであるＤＭＳＯを添加した系では、Ｔｉｅ２のリン酸化は事実上認められなかった。また、Ｔｉｅ２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−３２４）を用いたウエスタンブロットでは、Ｔｉｅ２の発現量そのものは全試料とも同量であった。
【００４４】
（実施例２）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェルプレートへ２．０×１０４細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるように播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２（低血清血管内皮細胞増殖用培地）を用いて一晩培養した。次に、一晩培養後の前記ＨＵＶＥＣを、細胞刺激（被験試料添加）の３時間前に０．１ｍＬのＨｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２（血管内皮細胞基礎培地）に置換し、再度培養を行った。その後、前記ウェル内に、被験試料として前記Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２で各濃度に調製したサンザシ抽出部（葉部）（丸善製薬株式会社製、山査葉エキスパウダー）を０．１ｍＬ添加し、１０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型Ｔｉｅ２量及び総Ｔｉｅ２量を測定し、総Ｔｉｅ２に対するリン酸化型Ｔｉｅ２の比率を計算し、下記式（１）に従いＴｉｅ２リン酸化作用を評価した。
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたＤＭＳＯについても同様に評価した。結果を表１に示す。
Ｔｉｅ２活性化率（％）＝
［｛（被験試料添加時のリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（被験試料添加時の総Ｔｉｅ２の測定値）｝／｛（陰性コントロールでのリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（陰性コントロールでの総Ｔｉｅ２の測定値）｝］×１００ ・・・式（１）
【００４５】
（参考例３）
＜Ｔｉｅ２リン酸化作用＞
実施例２において、前記サンザシ抽出物（葉部）を、陽性コントロールとしてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）に変更し、表１に記載の濃度を用いた以外は、実施例２と同様にして、参考例３とした。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
実施例２及び参考例３におけるＴｉｅ２リン酸化作用の結果について説明する。前記イムノアッセイキットによりＴｉｅ２リン酸化作用の評価を実施したところ、実施例２の前記サンザシ抽出物（葉部）には、Ｔｉｅ２がリン酸化し、Ｔｉｅ２が活性化されることが認められた。なお、陰性コントロールであるＤＭＳＯを添加した系では、Ｔｉｅ２の顕著なリン酸化は認められなかった。また、参考例３の陽性コントロールであるＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１を添加した系では、Ｔｉｅ２がリン酸化し、Ｔｉｅ２が活性化されることが認められた。したがって、実施例２の前記サンザシ抽出物（葉部）によりＴｉｅ２がリン酸化して活性化され、血管成熟化、血管正常化、血管安定化がもたらされ、血管新生が抑制されることが示唆された。
【００４８】
（実施例３）
＜血管新生抑制作用＞
次に、前記サンザシの抽出物（果実部）により、どの程度、血管分岐数が低減されているのかを画像解析することで、血管新生抑制作用の評価を行った。以下に手順を示す。
まず、血管新生キット（倉敷紡績株式会社製）を用い、ヒト正常臍帯静脈血管内皮細胞とヒト正常真皮繊維芽細胞を一定の比率で共培養させ、管腔形成初期段階の増殖状態に調製した。血管内皮細胞増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（倉敷紡績株式会社製）１０ｎｇ／ｍＬの共存下、被験試料として、サンザシ抽出物（果実部）（丸善製薬株式会社製、サンザシエキスパウダーＭＦ）を用い、表２に記載の各濃度を含有した培地に添加後、３７℃、５％ＣＯ２条件にて、インキュベーションした。培養開始から４日後、７日後、９日後の各々の時点で、ＶＥＧＦ−Ａ共存下、サンザシ抽出物（果実部）（丸善製薬株式会社製、サンザシエキスパウダーＭＦ）を表２に示す所定濃度含有した培地と交換した。その後、各ウェルの細胞層を７０容積％エタノールで固定化し、管腔染色キット（倉敷紡績株式会社製、ＣＤ３１）を用いてＨＵＶＥＣ細胞のＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）を染色した。各ウェルから得られた染色像を撮影し、管腔形成について、管腔の分岐数をもとに、血管新生抑制作用を評価した。結果を表２及び図２に示す。
【００４９】
（比較例２）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、桂皮抽出物（丸善製薬株式会社製、ケイヒエキスパウダーＭＦ）に変更し、表２に記載の濃度を用いた以外は実施例３と同様にして、比較例２とした。結果を表２及び図２に示す。
【００５０】
（参考例４）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を用いずに、ＶＥＧＦ−Ａ（＋）をＶＥＧＦ−Ａ（−）に変更して、陰性コントロールとしたこと以外は実施例３と同様にして、参考例４とした。結果を表２及び図２に示す。
（参考例５）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を用いずに陽性コントロールとしたこと以外は実施例３と同様にして、参考例５とした。結果を表２及び図２に示す。
（参考例６）
＜血管新生抑制作用＞
実施例３において、前記サンザシ抽出物（果実部）を、血管新生阻害剤として知られるＳｕｒａｍｉｎ（倉敷紡績株式会社製（血管新生キットに付属））（５０μＭ）に変更した以外は実施例３と同様にして、参考例６とした。結果を表２及び図２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
実施例３、比較例２、並びに参考例４〜６において、血管分岐数を基にした血管新生抑制作用の評価を実施したところ、実施例３のサンザシ抽出物（果実部）には、ＶＥＧＦ−Ａ（＋）によって増加する血管分岐数を濃度依存で抑制する作用が認められた（抑制率約２０％）。一方、比較例２の桂皮抽出物には、今回実施した試験濃度において、作用を確認することができなかった。これらの結果から、今回実施した試験条件でサンザシ抽出物（果実部）には、ＶＥＧＦの働きを阻害するＶＥＧＦ阻害作用を有し、有効な血管新生抑制作用を有することがわかった。
【００５３】
以上より、サンザシの抽出物が、Ｔｉｅ２リン酸化効果を有することにより、血管内皮増殖因子の阻害、及び血管新生の抑制が起こり、血管の成熟化、血管の正常化、及び血管の安定化を誘導できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤、並びに医薬品組成物は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害作用、血管新生抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、及び血管の安定化作用を有するため、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患に関する医薬品、及びこれらの疾患に関する安全な予防薬として、幅広く用いることができる。また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、及び血管新生抑制剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、美容用飲食品、健康用飲食品などの飲食品として、幅広く用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤。
【請求項２】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤。
【請求項３】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管新生抑制剤。
【請求項４】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤。
【請求項５】
請求項１に記載のＴｉｅ２活性化剤、請求項２に記載の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、請求項３に記載の血管新生抑制剤、及び請求項４に記載の血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤。
【請求項２】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤。
【請求項３】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管新生抑制剤。
【請求項４】
サンザシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤。
【請求項５】
請求項１に記載のＴｉｅ２活性化剤、請求項２に記載の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、請求項３に記載の血管新生抑制剤、及び請求項４に記載の血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬品組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１３１７６６（Ｐ２０１２−１３１７６６Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０５６９６（Ｐ２０１１−１０５６９６）
【出願日】平成２３年５月１０日（２０１１．５．１０）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１０日（２０１１．５．１０）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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