ＵＶに関連するｍｔＤＮＡの融合転写物ならびにその方法および使用
本発明は、ＵＶ曝露に関連する新規のミトコンドリア融合転写物および関連する欠失分子を提供する。ｍｔＤＮＡ分子および関連する融合転写物をインビボおよびインビトロにて検出するための方法、ならびに、スキンケア製品のスクリーニングおよび試験におけるこれらの使用もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本発明は、米国特許出願第６１／３０９，２１６号（２０１０年３月１日出願）から優先権を主張する。上記特許出願の内容の全体が、参考として本明細書にて援用される。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、ミトコンドリアゲノミクスの分野に関する。より詳細には、本発明は、ＵＶ曝露と関連するミトコンドリア融合転写物および関連する欠失分子、ならびに生物学的サンプルにおけるそれらの検出およびモニタリングに関する。
【０００３】
〔背景技術〕
〔ミトコンドリアのゲノム〕
ミトコンドリアのゲノムは、コンパクトであるが重要な核酸配列である。ミトコンドリアのＤＮＡすなわち「ｍｔＤＮＡ」は、３３億ｂｐ（一倍体）の巨大な核ゲノムとは対照的に、１６，５６９核酸塩基対（ｂｐ）の小さいゲノムを包含する(Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999)。上記ｍｔＤＮＡの遺伝的相補性は、核細胞メイト（ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｍａｔｅ）の相補性よりも実質的に小さい（０．０００５％）。しかし、個々の細胞は、特定の細胞機能に依存して、概して１０３個から１０４個のミトコンドリアを有している(Singh and Modica-Napolitano, 2002)。伝達すなわち化学的シグナリングは、核ゲノムとミトコンドリアゲノムとの間で通常生じる(Sherratt et al., 1997)。さらに、核の特定の構成成分は、ミトコンドリア配列の維持および保全を担っている(Croteau et al., 1999)。受精が生じるとすぐに卵子内でミトコンドリアがクローン増殖することに起因して、所定の個体における全てのｍｔＤＮＡゲノムは同一である。しかし、変異原性の事象は、体細胞変異として反映される配列多様性を誘発し得る。これらの変異は、ヘテロプラズミ―（ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｙ）として知られる状態において体中の種々の組織にて蓄積し得る。
【０００４】
〔ミトコンドリア融合トランスクリプトーム〕
ミトコンドリアのゲノムは、通常と異なっており、環状の、イントロンが存在しないＤＮＡ分子である。このゲノムにおいては、特定の長さの配列に隣接する繰返しモチーフが散在している。これらの繰返しの間の配列は、あまりよく理解されていない環境下において欠失する傾向がある。ミトコンドリアゲノムにいくつかの繰り返しがある場合、多くの欠失が存在する。最もよく知られている例示は、４９７７の「共通の欠失（ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」である。この欠失は、意図されたいくつかの状態および病気と関連している。この欠失は、加齢に伴って頻度が増加すると考えられている(Dai et al., 2004; Ro et al., 2003; Barron et al., 2001; Lewis et al., 2000; Muller-Hocker, 1998; Porteous et al., 1998)。
【０００５】
種々の他のミトコンドリアの欠失は、前立腺癌、皮膚癌および肺癌の初期の発症、ならびに、加齢(e.g. Polyak et al., 1998)、早期老化、および発癌性物質に対する曝露(Lee et al., 1998)と関連している。さらに、研究者は、非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）の発生および病因に紫外線が重要であること(Weinstock 1998; Rees, 1998)、ならびに、ヒト皮膚において紫外線がｍｔＤＮＡ損傷を誘発すること、を見出している(Birch-Machin, 2000a)。例えば、カナダ国特許出願番号第２，４８０，１８４号において、ミトコンドリアゲノムのマイナーアーク（ｍｉｎｏｒ ａｒｃ）における３８９５ｂｐの欠失が、ＵＶ誘発性のＤＮＡ損傷のバイオマーカーとして同定された。以来、上記３８９５ｂｐの欠失もまた、皮膚癌と関連している（ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００６５２号）。
【０００６】
出願人の同時係属の国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１号にて論じられているように、ヒトミトコンドリアゲノムの大規模な欠失をマッピングすることから得られる知識は、病気と関連する欠失の同定に有用である。例えば、ミトコンドリアゲノムのコンピュータ解析は、出願人が欠失サイトを同定することを可能にする。ＤＮＡ分子における欠失事象の開始の際に、上記欠失サイトは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する融合ＤＮＡ配列を生成するために、再閉鎖（ｒｅ−ｃｌｏｓｅ）または再連結（ｒｅ−ｌｉｇａｔｅ）する。これらの研究から、出願人は、欠失分子および関連した融合転写物のサブセットを同定した。上記欠失分子および関連した融合転写物は悪性腫瘍に関連性を示す。
【０００７】
出願人は、ミトコンドリアの欠失、およびＵＶ曝露と関連する融合転写物の、さらなるサブセットを同定している。これらの研究からの結果およびＵＶ損傷の検出へのその適用を本明細書中に記載する。
【０００８】
〔発明の概要〕
一態様において、本発明は、ミトコンドリア融合転写物を検出するための方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ミトコンドリア融合転写物を検出するための方法を提供し、ここで、上記転写物はＵＶ曝露と関連する。上記方法は以下の工程を含む：（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；および（ｂ）上記サンプルにおけるミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程。
【００１０】
本発明の別の態様によると、被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法が提供される。上記方法は以下の工程を含む：（ａ）被験体からの生物学的サンプルを提供する工程；および（ｂ）ＵＶ曝露と関連するミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程。
【００１１】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露と関連した、単離されたミトコンドリ融合転写物が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露の検出のための融合転写物の使用が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしての融合転写物の使用が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露を検出するためのキットが提供され、上記キットは、（ａ）本発明の単離された融合配列の一部に対して実質的に相補的な配列を有するプローブを備える。
【００１５】
本発明の別の態様によると、ヒトｍｔＤＮＡゲノムにおいて欠失を検出するための方法が提供され、上記欠失は、ＵＶ曝露に関連しており、上記方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；（ｂ）上記生物学的サンプルからｍｔＤＮＡを抽出する工程；および（ｃ）ｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程を含む。
【００１６】
本発明の別の態様によると、被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法が提供され、上記方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；（ｂ）上記生物学的サンプルからｍｔＤＮＡを抽出する工程；および（ｃ）ＵＶ曝露と関連したｍｔＤＮＡでの欠失の存在を検出する工程を含む。
【００１７】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露と関連した、単離されたｍｔＤＮＡ欠失分子が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露を検出するためのｍｔＤＮＡ欠失体の使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしてのｍｔＤＮＡ欠失体の使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するためのスキンケア製品の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露と関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；および（ｅ）上記転写物の存在を参照値と比較する工程。
【００２１】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するための新たなスキンケア製品または処方物の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露と関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；および（ｅ）上記分子の存在を参照値と比較する工程。
【００２２】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露と関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々に対する上記融合転写物の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２３】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露と関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々について上記欠失分子の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２４】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化を防止、回復または保護するためのスキンケア製品の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露と関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；および（ｅ）上記転写物の存在を参照値と比較する工程。
【００２５】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化を防止、回復または保護するための新しいスキンケア製品または処方物の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露に関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；および（ｅ）上記分子の存在を参照値と比較する工程。
【００２６】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化を防止、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露に関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々に対する上記融合転写物の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２７】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化に対する防止、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露に関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々に対する上記欠失分子の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照してなされる以下の詳細な説明においてより明確になる。
【００２９】
図１は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後における、３８６〜５４７位：４４４３〜５５１１位からのフレーム２のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
図２は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後に生成される読み枠を示す図である。ヌクレオチド３８２は赤い四角によって示されている。上記赤い四角は、ミトコンドリアゲノムの１位に関する読み枠２の開始を特定している。
【００３１】
図３は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去によって形成されるフレーム２融合転写物の寄与配列を示す。
【００３２】
図４は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の欠失による融合転写物形態の最終アミノ酸配列を示す。上記配列は、ミトコンドリアゲノムの、再結合したヌクレオチド４７０〜５４７位および４４４３〜５５１１位を含む。
【００３３】
図５Ａは、ｍｔＤＮＡ欠失体解析を使用したインビボでのＵＶＲ線量応答を示す。
【００３４】
図５Ｂは、ＵＶ損傷を測定するためのサンプルの計算を示す。
【００３５】
図６〜９は、皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す。
【００３６】
図１０〜１２は、３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す。
【００３７】
図１３および１４は、ＵＶ曝露に続く種々の日焼け止めおよび抗加齢銘柄のスクリーニングを示す。
【００３８】
図１５は、実施例３の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す。
【００３９】
図１６は実施例４の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す。
【００４０】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ＵＶ曝露と関連している、新規のミトコンドリア融合転写物および関連するｍｔＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、生物学的サンプルにおいて融合転写物および関連するｍｔＤＮＡ分子の検出およびモニタリングを提供する。本発明はさらに、スキンケア製品のスクリーニングおよび試験における、融合転写物および関連するｍｔＤＮＡの欠失体の使用を提供する。
【００４１】
本発明の技術および手順は、概して、当該分野における慣用的方法および種々の一般的な参考文献（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., and Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983)参照）に従って行われる。
【００４２】
〔定義〕
他で規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって広く理解されるものと同一の意味を有する。以下の用語は、他で指示されない限り、以下の意味を有することが理解されるべきである。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、一定の値および係数からの変動をいうことが意図される。このことが特に言及されているか否かにかかわらず、上記用語が特に参照されるか否かにかかわらず、本明細書中にて提供されている任意の所定の値および係数に常に含まれることが理解されるべきである。例として、上記変動は、およそ＋／−１０％であってもよい。測定に必然的に関連するある程度の誤差が存在することもまた、全ての当業者に周知である。上記誤差の程度は、記録を取得するために使用される機器の精度に依存して変動する。出願人は、本発明を行う者によって使用される機器の精度を知り得ないので、測定誤差の程度を必然的に規定し得ない。同様に、本明細書中にて提示されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の精度は、使用される装置およびプロセスの精度に依存する。したがって、配列の些細な変異は、本願の教示の範囲外とみなされない。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「ミトコンドリア融合転写物」または「融合転写物」という表現は、変異したミトコンドリアＤＮＡ配列の転写の結果として生成されるＲＮＡ転写産物をいう。ここで、上記変異は、ミトコンドリア欠失および他の大規模なミトコンドリアＤＮＡの再編成を含み得る。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、核酸の「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」という用語は、検出可能にかつ特異的に第２の核酸に結合する能力をいう。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびこれらの断片は、非特異的な核酸に検出可能に結合するかなりの量を最小化するハイブリダイゼーション条件下および洗浄条件下において直接的な標的核酸鎖にハイブリダイズする。高ストリンジェンシーの条件は、当該分野において公知の選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、慣用的なハイブリダイゼーション手順に従って高ストリンジェンシーにおいて行われる。洗浄条件は、一般に、１〜３×ＳＳＣ、０．１〜１％ ＳＤＳ、５０〜７０℃であり、約５〜３０分間の後に洗浄溶液を交換する。
【００４６】
「回復する」という用語は、ＵＶ損傷の一つ以上の症状、徴候または特徴において、一過性および長期間の両方の停止、防止、低減または改善を含む。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「異常」または「変異」は、野生型ミトコンドリアのＤＮＡ配列における改変を含む。上記改変は、融合転写物を生じ、そして、限定されることなく実質的なｍｔＤＮＡ欠失体または大規模なｍｔＤＮＡ欠失体を含む。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、「ミトコンドリアＤＮＡ」または「ｍｔＤＮＡ」は、ミトコンドリアに存在するか、またはミトコンドリアにおいて生じている。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、「被験体」または「患者」という用語は、治療が必要な動物または試験される動物をいう。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方をいい、制限されないが、哺乳類、鳥類および魚類を含む。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、物体に適用されるような「由来する」という用語は、その物体が特定の供給源から得られることを示し、その供給源から直接的に得られることを必ずしも必要としない。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、「診断の（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）」または「診断すること（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」は、ＵＶ曝露の診断またはＵＶ曝露の管理における因子として、変異、または変異の組合せの存在または非存在あるいは変異の組合せの量を使用することを意味する。
【００５３】
「皮膚」という用語は、体の外部を保護的に覆うことをいう。皮膚は、真皮および表皮からなり、汗、皮脂腺および毛嚢構造を含むことが理解される。一実施態様において、皮膚は哺乳類の皮膚であり、ヒトであることが好ましい。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、「生物学的サンプル」は、細胞を含む組織または体液をいう。上記細胞からは、目的の分子が得られ得る。例えば、生物学的サンプルは、皮膚細胞または組織に由来し得る。上記組織は、真皮もしくは表皮、またはこれら両方の組合せから採取され得る。生物学的サンプルは、その供給源から得られた状態で直接的に使用されても、サンプルの特性を改変させる前処理に続いて、使用されてもよい。サンプルは、種々の方法によって得られ得る。上記方法は、制限されないが、以下が含まれる：皮膚組織の微小核（ｍｉｃｒｏ−ｃｏｒｅｓ）を採集するための、パンチ生検法、外科的切除法および非侵襲的または最小限に侵襲性の皮膚の採集方法（例えば、ウェットスビング（ｗｅｔ ｓｗａｂｂｉｎｇ）、テープリフト（ｔａｐｅｌｉｆｔ）、コットンチップスワビング、滅菌したメスを用いた皮膚のかきとり、木製のスクレーパーを用いた皮膚のかきとり、粘着パッドの接着面（ＣａｐＳｕｒｅＴＭＣｌｅａｎ−ｕｐ Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からのフィルム、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からの加熱フィルムおよび小さなゲージ（例えば、２８ゲージ）の針の使用）。これらの方法は、当該分野において周知である（例えば、出願人の同時係属出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１７９０およびＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１８０１（上記同時係属出願は、皮膚を採集するための種々の方法を開示している。）参照）。
【００５５】
〔ゲノムの変異〕
ｍｔＤＮＡｓは、危険因子、または崩壊性の細胞プロセスを同定するに有用なバイオマーカーである。上記危険因子または細胞プロセスは、疾患の開始、ならびに因子（例えば、毒素、発癌性物質または有害な放射線）への環境的な曝露に関連するものである。本発明によると、ミトコンドリアゲノムにおける大規模な再構成の変異が、ＵＶ曝露と関連した融合転写物を同定する。したがって、ＵＶ曝露の検出、診断およびモニタリングのための、上記の転写物をコードするｍｔＤＮＡおよびこのｍｔＤＮＡを指向するプローブの使用が、本明細書中に提供される。
【００５６】
本発明の方法論はまた、ｍｔＤＮＡ欠失体またはそれらに関連する融合転写物のいずれを介しても、スキンケア製品の同定において有効である。したがって、本願は、生物学的サンプルにおけるＵＶに関連した損傷の量を検出（および計測）するための種々の方法、ならびに上記損傷を低減または防止し得る製品をスクリーニングおよび試験するための種々の方法を提供する。
【００５７】
当業者は、本発明の方法における使用のためのｍｔＤＮＡ分子が、天然に存在する変異体の単離を介して得られても、本明細書中に記載された融合転写物の何れかの相補配列に基づいてもよい、ということを正しく認識する。例示的なｍｔＤＮＡ配列および融合転写物は、出願人の同時係属のＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１）に開示されており、この同時係属のＰＣＴ出願は、参考として本明細書にて援用される。
【００５８】
〔変異ゲノム配列の検出〕
本発明による、ＵＶ曝露と関連した変異配列は、融合転写物を生成するｍｔＤＮＡ欠失体を含む。その改変または変化は、わずか数ベースから数キロベースまで、サイズを顕著に変更し得るで、好ましくは、上記改変が、実質的または大規模なｍｔＤＮＡ欠失（ゲノム異常とも呼ばれる。）を生じる。
【００５９】
異常なｍｔＤＮＡ分子を抽出および単離するための技術は、出願人の同時係属の特許出願（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１号）に開示されている。上記方法は、適切なプライマー、プローブおよびゲノム配列（例えば、それらは新規のｍｔＤＮＡ結合ポイントを有する）を選択するための技術も含んでおり、参考として本明細書に参照にて援用される。
【００６０】
本発明の一態様によると、候補ゲノム配列を決定するために、配列欠失の結合ポイントが初めに同定される。配列の欠失は５’末端および３’末端にて欠失されるべき配列に隣接する直接的および間接的な繰返しエレメントによって、最初に同定される。ゲノムからの一区切りのヌクレオチドを除去し、次いでゲノムをライゲーションすることによって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および新規の結合ポイントを有する融合ＤＮＡ配列が生じる。
【００６１】
本発明の方法における使用のための例示的なｍｔＤＮＡ分子が、以下に提供される。以前に述べられてるように（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１参照）、これらのｍｔＤＮＡは、公知のミトコンドリアゲノム（配列番号１）の改変に基づいており、融合または「ＦＵＳ」の呼称が割り当てられている。ここで、Ａ：Ｂは第一のスプライシングされた遺伝子の最後のミトコンドリアヌクレオチドと第二のスプライシングされた遺伝子の最初のミトコンドリアヌクレオチドとの間の結合ポイントを示す。スプライシングされた遺伝子の同定が、対応する配列の識別子に続く括弧書きにて提供される。以下に提供される場合、（ＡｌｔＭｅｔ）および（ＯｒｉｇＭｅｔ）はそれぞれ、代替えの翻訳開始部位および元々の翻訳開始部位をいう。
【００６２】
ＦＵＳ ４６９：１３４４７（ＡｌｔＭｅｔ）（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット８（ＡＴＰａｓｅ８）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号２）
ＦＵＳ ０７４４：１４１２４（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ（ＮＤ４Ｌ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号３）
ＦＵＳ７９７４：１５４９６（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＩＩ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号４）
ＦＵＳ ９９２：１５７３０（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＭ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号５）
ＦＵＳ ２１０：１５３３９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＭ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号６）
ＦＵＳ ８２８：１４８９６（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット６（ＡＴＰａｓｅ６)−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号７）
ＦＵＳ１０６６５：１４８５６（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ（ＮＤ４Ｌ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号８）
ＦＵＳ ０７５：１３７９９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯI)−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号９）
ＦＵＳ ３２５：１３９８９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１０）
ＦＵＳ ７４３８：１３４７６（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１１）
ＦＵＳ ７７５：１３５３２（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＭ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５ （ＮＤ５））（配列番号１２）
ＦＵＳ ２１３：１３９９１（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ （ＣＯＭ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１３）
ＦＵＳ １４４：１３８１６（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１４）
ＦＵＳ １９１：１２９０９（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１５）
ＦＵＳ ５７４：１２９７２（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩＩ（ＣＯＩＩＩ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１６）
ＦＵＳ ０３６７：１２８２９（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＮＤ３）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１７）
ＦＵＳ １１２３２：１３９８０（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＮＤ４）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１８）
ＦＵＳ ８４６９：１３４４７（ＯｒｉｇＭｅｔ）（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット８（ＡＴＰａｓｅ８）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１９）
ＦＵＳ ５４７：４４４３（Ｍｅｔ−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＮＤ２））（配列番号２０）。
【００６３】
以下の実施例に記載されているように、一旦配列が同定されると、それらの配列のＵＶ曝露との関連性が解析される。このような試験が、被験体または患者においてインビボで行われてもよく（実施例５参照）、増殖されそして種々のレベルのＵＶＲが照射される皮膚培養物の試験を介して行われてもよい（実施例３および４参照）。これらの配列の発現はまた、１時間またはそれより長い時間にわたってハウスキーピング（ｋｅｅｐｅｒ）遺伝子についてモニタリングされてもよい、上記ハウスキーピング遺伝子としては、限定されないが、ヒトＰＰＩＢ、ヒトＰＧＫ−１、ヒトＡＣＴＢ（ベータアクチン）、ヒトＧＵＳＢ（ベータグルクロ二ダーゼ）、ヒトＢ２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン）、ヒトＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ヒトＧＡＰＤ（グリセルアルデヒド（ｇｌｙｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヒトＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ヒトＲＰＬＰＯ＝ＬＲＰ（リボソームタンパク質、ラージ（ｌａｒｇｅ）、ＰＯ）、ヒトＨＭＢＳ＝ＰＢＧＤ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ヒトＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ヒトＴＲＦＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１）、および、ヒトＡＢＣＣ１３（染色体１３ 偽遺伝子）が挙げられる。
【００６４】
本発明の一実施形態において、以下のｍｔＤＮＡ配列が、ＵＶ損傷を予測、診断またはモニタリングすること、ならびに、ＵＶ損傷の防止または回復に効果的なスキンケア製品を試験およびスクリーニングすること、に対して有用であると判断される。：
配列番号３（ＦＵＳ １０７４４：１４１２４）
配列番号４（ＦＵＳ ７９７４：１５４９６）
配列番号１２（ＦＵＳ ７７７５：１３５３２）
配列番号１３（ＦＵＳ ８２１３：１３９９１）
配列番号１９（ＦＵＳ ８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）
配列番号２０（ＦＵＳ ５４７：４４４３）。
【００６５】
本発明の他の実施形態において、配列番号１９および２０を有するｍｔＤＮＡ配列が、本発明の方法を行う際に、好ましく使用される。
【００６６】
上記配列に加えて、本発明はまた、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を予測、診断および／またはモニタリングするための、これらの配列の改変体または断片の使用を提供する。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「改変体」は本発明のｍｔＤＮＡ配列とは異なる核酸をいうが、その本質的な特性を保持している。一般に、改変体は、選んだｍｔＤＮＡ配列に対して、全体的に密接に類似しており、そして、多くの領域において同一である。詳細には、本発明の改変体は、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントのヌクレオチドを少なくとも一つ含む。上記改変体は、上記結合ポイントに隣接した一つ以上のヌクレオチドをさらに含んでもよい。本発明の一実施形態において、改変体配列は、本発明のｍｔＤＮＡ配列のいずれか一つまたはそれらの相補鎖に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００６８】
本発明において、「断片」は、開示されたゲノム配列またはその相補鎖に含まれている核酸配列の一部である短い核酸配列をいう。この一部は、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントを含むヌクレオチドの少なくとも一つを含む。この一部はさらに、隣接する一つ以上のヌクレオチドを含んでもよい。本発明の断片は，少なくとも約１５ｎｔの長さであることが好ましく、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔの長さであり、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔの長さであり、さらにより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さ、少なくとも約５０ｎｔの長さ、少なくとも約７５ｎｔの長さまたは少なくとも約１５０ｎｔの長さである。「少なくとも２０ｎｔの長さ」の断片は、例えば、上記に挙げられたｍｔＤＮＡ配列のいずれか一つの２０個以上連続する塩基を含むことが意図される。この内容において、「約」は、詳細に記載されている値、および数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きい値または小さい値を、どちらか一方の末端または両方の末端に含む。これらの断片は、用途を有し、上記用途としては、限定されないが、本明細書中に記載されるような診断プローブおよびプライマーが挙げられる。もちろん、より大きな断片（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）もまた企図される。
【００６９】
〔プライマーおよびプローブ〕
本発明の他の態様は、本発明のｍｔＤＮＡ配列を認識し得るプライマーおよびプローブを提供することである。本発明に用いられる場合、「プライマー」および「プローブ」という用語は、上記プライマーおよびプローブにおける少なくとも一つの配列の上記標的領域との相補性に起因して標的核酸における配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドをいう。当該分野において公知の方法によると、上記プローブは標識化されてもよい。
【００７０】
一旦ＵＶ曝露と関連した異常型のｍｔＤＮＡが同定されると、例えば、オリゴヌクレオチドのアレイに対するｍｔＤＮＡのハイブリダイゼーションが、特定の変異の同定のために使用され得るが、公知の任意のハイブリダイゼーション法が使用され得る。
【００７１】
本発明にて使用するために好適なプライマーおよびプローブの調製が、出願人の同時係属のＰＣＴ出願に記載されているように生成され得る。この点において、プローブは、本発明の例示的なｍｔＤＮＡ融合分子に対して、またはそれらの断片もしくは改変体に対して、直接的に生成され得る。例えば、配列番号３、４、１２、１３、１９および２０に記載の配列は、目的の融合配列を含む核酸配列を検出するプライマーまたはプローブの設計のために使用され得る。当業者に理解されるように、これらの核酸分子にハイブリダイズするプライマーまたはプローブは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイズしてもよい。上記条件は当業者に公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989))，6.3.1-6.3.6.において見出される。本発明のプライマーおよびプローブはまた、標的配列のＤＮＡスリッページが存在する箇所または類似の配列変更事象が生じた箇所にハイブリダイズし得る。
【００７２】
本発明の特定の実施形態において、本発明のプローブは、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントを含む異常型ｍｔＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的な配列を含む。この一部は、結合ポイントＡ：Ｂに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドを含み、隣接する１個以上のヌクレオチドをさらに含んでもよい。この点について、本発明は、任意の好適な標的化メカニズムを含む。上記メカニズムは、結合ポイントＡ：Ｂに含まれているおよび／または隣接しているヌクレオチドを使用してｍｔＤＮＡ分子を選択する。
【００７３】
種々のタイプのプローブ（出願人の同時係属のＰＣＴ出願において記載されているような）が、本発明によって企図される。本発明のプローブは，好ましくは少なくとも約１５ｎｔの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔの長さであり、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔの長さであり、さらにより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さ、少なくとも約５０ｎｔの長さ、少なくとも約７５ｎｔの長さまたは少なくとも約１５０ｎｔの長さである。「少なくとも２０ｎｔの長さ」のプローブは、例えば、２０個以上の連続する塩基を含むことが意図される。上記連続する塩基は、本発明のｍｔＤＮＡ配列に対して相補的である。もちろん、より大きなプローブ（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）もまた好ましい。
【００７４】
本発明のプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、これにより、本発明の方法を可能にする。よって、本発明の一態様において、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露の検出、診断および／またはモニタリングに使用するためのハイブリダイゼーションプローブが提供される。ここで、上記プローブは、異常型ｍｔＤＮＡ分子の少なくとも一部に対して相補的である。他の態様において、本発明は、プローブおよび上記プローブの使用（または使用方法）を提供し、上記使用は、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を防止または回復することに効果的なスキンケア製品をスクリーニングまたは検証するための、上記プローブの使用である。
【００７５】
〔アッセイ〕
生物学的サンプルにおいて異常型のｍｔＤＮＡのレベルを測定することは、被験体におけるＵＶ曝露のレベルを決定し得る。したがって、本発明は、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露を検出、診断またはモニタリングするための方法を含み、上記方法は一つ以上の生物学的サンプルを得る工程、上記サンプルからｍｔＤＮＡを抽出する工程、および上記サンプルにおける一つ以上の異常型ｍｔＤＮＡ配列の量を定量し、検出された量を参照値と比較することによって異常型ｍｔＤＮＡについて上記サンプルをアッセイする工程を含む。
【００７６】
当業者に理解されるように、上記参照値は、上記方法が、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露の検出、診断またはモニタリングを要求するか否かに基づく。よって、上記参照値は、一つ以上の公知のＵＶ曝露された生物学的サンプルから、一つ以上の公知のＵＶ曝露されていない生物学的サンプルから、および／または一つ以上の生物学的サンプルから、一定の期間にわたって収集されたｍｔＤＮＡデータに関してもよい。上記サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚または血液に由来し得る。上記サンプルは、限定されないが、以下の方法を含む種々の方法によって採集され得る：皮膚組織の微小核を採集するための、パンチ生検法、外科的切除法、および非侵襲的または最小限に侵襲性の皮膚の採集方法（例えば、ウェットスワビング、テープリフト、コットンチップスワビング、滅菌したメスを用いた皮膚のかきとり、木製のスクレーパーを用いた皮膚のかきとり、粘着パッドの接着面（ＣａｐＳｕｒｅＴＭＣｌｅａｎ−ｕｐ Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からのフィルム、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からの加熱フィルム、および小さなゲージ（例えば、２８ゲージ）の針の使用）。
【００７７】
ｍｔＤＮＡにおける変異の存在を検出する工程は、当業者に公知の任意の技術から選択され得る。例えば、ｍｔＤＮＡを解析することは、ｍｔＤＮＡの配列決定、ＰＣＲによるｍｔＤＮＡの増幅、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノザンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンサウス−ウエスタンブロットハイブリダイゼーション、変性ＨＰＬＣ、マイクロアレイ、バイオチップまたはジーンチップに対するハイブリダイゼーション、分子マーカー解析、バイオセンサー、融点プロファイリング、または上述した解析のいずれかの組合せを含み得る。
【００７８】
一態様において、本発明は、哺乳類におけるＵＶ曝露を検出するための方法を提供する。上記方法は、上記の異常型ミトコンドリアＤＮＡの存在について哺乳類からの組織サンプルをアッセイする工程を含む。本発明はまた、哺乳類からの組織サンプルを少なくとも一つのハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズすることによって、上記サンプルをアッセイする工程を含む方法を提供する。上記プローブは、本明細書中に記載されたような本発明の変異ミトコンドリアＤＮＡ配列に対して生成され得る。
【００７９】
他の態様において、本発明は、上述したような方法を提供する。上記アッセイは、以下を含む：ａ）少なくとも一つのプロ―ブが相補的な異常型ミトコンドリアＤＮＡ配列にハイブリダイズすることを可能にするために本発明の少なくとも一つのプローブを使用するハイブリダイゼーション反応を行う工程；ｂ）上記サンプルにおける上記少なくとも一つの異常型ミトコンドリアＤＮＡ配列の量を、上記少なくとも一つのプローブにハイブリダイズしたミトコンドリアＤＮＡの量を定量することによって定量する工程；およびＣ）上記サンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡの量を少なくとも一つの既知の参照値と比較する工程。
【００８０】
当業者に公知のような画像診断アッセイを含む、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を検出、診断またはモニタリングするための方法もまた本発明に含まれる。本発明の診断アッセイは、高スル―プットに容易に適合され得る。高スル―プットアッセイは、多くのサンプルを同時に処理するという利点を提供し、多数のサンプルをスクリーニングするために必要な時間を顕著に減少させる。よって、本発明は、複数の試験サンプルにおける標的ヌクレオチド配列の検出および／または定量のための、高スループットスクリーニングまたは高スループットアッセイにおける本発明のヌクレオチドの使用を企図する。
【００８１】
〔融合転写物〕
本発明の他の態様は、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を予測、診断および／またはモニタリングするための方法に有用な、融合転写物および関連するハイブリダイゼーションプローブの同定である。出願人の同時係属のＰＣＴ出願において開示されているように、上記分子は、天然の転写物の単離を介して、あるいは、本発明の方法に従って単離されるｍｔＤＮＡｓのリコンビナント発現によって、生成され得る。これらのｍｔＤＮＡｓは、典型的には、スプライシングされた遺伝子を含む。上記スプライシングされた遺伝子は、第一の遺伝子に由来する開始コドンおよび第二の遺伝子の終止コドンを有する。よって、スプライシングされた遺伝子から得られた融合転写物は、スプライシングされた遺伝子と関連する結合ポイントを含む。
【００８２】
〔融合転写物の検出〕
天然の融合転写物は、任意の好適な当該分野にて公知の方法に従って、生物学的サンプルから抽出され得、そして同定され得る。または、出願人の同時係属のＰＣＴ出願に記載されている方法に従って処理されてもよい。本発明の一実施形態において、ポリＡテイルを有する転写物を標的化するオリゴ（ｄｔ）プライマーを使用し、続いて標的転写物に対して設計されたプライマー対を使用したＲＴ−ＰＣＲによって、安定的なポリアデニル化した融合転写物が同定される。
【００８３】
以下の例示的な融合転写物が、これらの方法を使用して検出された：
配列番号２２（転写物２；１０７４４：１４１２４）
配列番号３８（転写物２０；８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）。
【００８４】
融合転写物はまた、当該分野にて公知のリコンビナント技術によって生成され得る。典型的には、上記リコンビナント技術は、目的のｍｔＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いる好適な宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、形質導入または感染を含む。）を含む。
【００８５】
〔予期しない融合転写物の検出〕
予期しない特性の融合転写物もまた出願人によって同定されており、本発明の方法に有用であることが証明されている。現在までに、同定された融合転写物の各々が、ミトコンドリアゲノムにおける欠失事象の結果として生じており、新規配列を形成するための２つの遺伝子の融合体を生じ、次いでミトコンドリアによって転写される。対照的に、以下に詳しく記載されている３８９５ｂｐの欠失は、Ｄ−ｌｏｏｐの融合体を生じる。上記融合体はｍｔＤＮＡの非コード領域に位置している。
【００８６】
〔融合転写物と関連した３８９５ｂｐの欠失の検出が予期されない理由〕
ミトコンドリア融合転写物は、その大多数が、隣接している２つの遺伝子または隣接していない２つの遺伝子の間に含まれているヌクレオチドが欠失することによって形成される（上述したゲノムの変異の項および出願人の同時係属のＰＣＴ出願参照）。欠失したＤＮＡの除去の後、ミトコンドリアゲノムの残余物が、次いで、再結合され、新しい遺伝子すなわち転写物を生じる。これまでに記載したように、このスプライシングされた遺伝子は、５’末端側（ｍｏｓｔ）の元々の遺伝子の開始コドン、元々の２つの遺伝子からの遺伝物質の種々の貢献、および３’末端側の遺伝子の元々の終止コドンから構成される。
【００８７】
対照的に、ヌクレオチド５４７−４４４３位の間の遺伝物質の欠失からの融合転写物（転写物３２；配列番号３９）は、予期されない。なぜなら、５’部分が、ミトコンドリアゲノムの非コード置換ループ（Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｌｏｏｐ）(Ｄ−Ｌｏｏｐ)（１６０２４−５７６）内に位置しているからである。この事実にもかかわらず、５４８−４４４位が除去される場合、フレーム２におけるインタクトな読み枠は、３８６−５４７位：４４４３−５５１１位から観察される（図１および２参照）。フレーム１および３は、多くの末端コドンを有し、よって、読み枠を生成し損なう（図２）。
【００８８】
フレーム２の融合転写物の５’部分（ｃｏｎｔｅｎｔ）は、超可変セグメント３（４３８−５７４）内に位置する４７０位の最初のメチオニンにて開始するのでなく、３８６位のプロリンで開始する。上記融合転写物の３’部分は、ｔＲＮＡのメチオニン（４４０２−５５１１）内の４４４３位で開始し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（４４７０−５５１１）の５５１１位にて終止する（図３）。図４は、ミトコンドリアゲノムの５４８−４４４２位の欠失によって形成される、４７０位にて開始する融合転写物が生じたことを示す。
【００８９】
よって、本発明は、種々の内容物を含む融合転写物を含み、すなわち、上記融合転写物が、２つのコード領域のスプライシングされた配列を含み、そして上記融合転写物がスプライシングされたコード領域および非コード領域を含む。
【００９０】
〔ＵＶＲと関連した融合転写物〕
一旦ミトコンドリア融合転写物が同定されると、その配列は、次いで、以下の実施例に記載されるように、ＵＶＲとの関連について試験される。このような試験は、インビボで、すなわち培養された皮膚等価物にて実行され得る。上記皮膚等価物は、増殖され、そして種々のレベルのＵＶＲを照射される（実施例６参照）。これらの配列の発現がまた、一つ以上のハウスキーピング遺伝子に関してモニタリングされ得る、上記ハウスキーピング遺伝子としては、限定されないが、ヒトＰＰＩＢ、ヒトＰＧＫ−１、ヒトＡＣＴＢ（ベータアクチン）、ヒトＧＵＳＢ（ベータグルクロ二ダーゼ）、ヒトＢ２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン）、ヒトＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ヒトＧＡＰＤ （グリセルアルデヒド（ｇｌｙｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヒトＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ヒトＲＰＬＰＯ＝ＬＲＰ（リボソームタンパク質、ラージ（ｌａｒｇｅ）、ＰＯ）、ヒトＨＭＢＳ＝ＰＢＧＤ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ヒトＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ヒトＴＲＦＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７1)、および、ヒトＡＢＣＣ１３（染色体１３ 偽遺伝子）が挙げられる。
【００９１】
本発明の一実施形態において、以下のミトコンドリア融合転写物が、ＵＶ損傷を予測、診断およびモニタリングすることに有用であること、ならびに、ＵＶ損傷の防止または回復に効果的なスキンケア製品を試験およびスクリーニングすることに有用であることが同定されている：
配列番号２２（転写物２；１０７４４：１４１２４）
配列番号２３（転写物３；７９７４：１５４９６）
配列番号３１（転写物１１；７７７５：１３５３２）
配列番号３２（転写物１２；８２１３：１３９９１）
配列番号３８（転写物２０；８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）
配列番号３９（転写物３２；５４７：４４４３）
上記配列に加えて、本発明は、ＵＶ曝露を予測、診断およびモニタリングするための上記配列の改変体または断片の使用を提供する。本明細書中にて同定された融合転写物の改変体または断片は、ゲノム改変体および断片に関して上述されたサイズ制限および同一性パーセントに、または当業者によって好適に決定されるようなサイズ制限および同一性パーセントに、従う。
【００９２】
さらに、本発明の転写物２、３、１１、１２、２０および３２に対応する推定のタンパク質配列が、以下に挙げられる。これらの配列は、仮想の融合タンパク質をコードしており、本発明のさらなる実施形態として提供され、そして本発明の方法に有用であるとみなされるべきである．
配列番号４０（転写物２）
配列番号４１（転写物３）
配列番号４２（転写物１１）
配列番号４３（転写物１２）
配列番号４４（転写物２０）
配列番号４５（転写物３２）。
【００９３】
〔プライマーおよびプローブ〕
一旦融合転写物を特徴付けると、プライマーまたはプローブが、生物学的サンプル中の上記転写物を標的化するように開発され得る。このようなプライマーおよびプローブは、（上述したような）任意の公知の方法を用いて調製されても、または出願人の同時係属のＰＣＴ出願に提供される実施例に示されるように、調製されてもよい。プローブは、例えば、融合転写物に対して作製され得、そして、サンプル中の転写物の存在を検出するために検出技術（例えば、ＰａｎｏｍｉｃｓＴＭによるＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０ＴＭ）が使用され得る。プライマーおよびプローブは、本発明の例示的な融合転写物、または、それらの断片もしくは改変体に対して直接に生成され得る。例えば、配列番号２２、２３、３１、３２、３８および３９に示される配列を使用して、目的の融合配列を含む核酸配列を検出するプローブを設計し得る。
【００９４】
当業者によって理解されるように、本発明の融合転写物にハイブリダイズするために設計されたプローブは、上記転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、好ましくは、上記一部は、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントを発現する。この部分は、上記発現される結合ポイントに対して相補的なヌクレオチドの少なくとも一つを含み、上記一部は、隣接する１個以上の相補的なヌクレオチドをさらに含み得る。この点において、本発明は、任意の好適な標的化メカニズムを含み、上記メカニズムは、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントに含まれているかまたは隣接しているヌクレオチドを使用する融合転写物を選択する。
【００９５】
種々のタイプのプローブ、および当該分野において公知の標識化方法が、転写物プローブの調製のために企図される。このようなタイプおよび方法は、ゲノム配列の検出に関して上述されている。本発明の転写プローブは、少なくとも約１５ｎｔの長さであるが好ましく、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔの長さであり、なお好ましくは、少なくとも約３０ｎｔの長さであり、皿により好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さ、少なくとも約５０ｎｔの長さ、少なくとも約７５ｎｔの長さまたは少なくとも約１５０ｎｔの長さである。「少なくとも２０ｎｔの長さ」のプローブは、例えば、２０個以上の連続する塩基を含むことが意図される。上記隣接する塩基は、本発明のｍｔＤＮＡ配列に対して相補的である。もちろん、より大きなプローブ（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）もまた好ましい。
【００９６】
本発明のプローブは、生物学的サンプルにおける核酸分子にもまたハイブリダイズする。したがって、本発明の方法を可能にする。よって、本発明の一態様において、ＵＶ損傷または曝露を検出すること、診断することおよび／またはモニタリングすることにおいての使用のための提供されたハイブリダイゼーションプローブが存在する。上記プローブは、本発明融合転写物の少なくとも一部に対して相補的である。他の一態様において、提供されるプローブおよびその利用方法（または使用の方法）が存在する。上記プローブはＵＶ損または曝露の防止または改善において効果的なスキンケア製品の試験およびスクリーニングのためのものである。
【００９７】
〔アッセイ〕
本発明に従って、疑似太陽光を用いた照射に対して曝露することに続いて新規融合転写物が多量に増加することが実証された（例えば、図６参照）。これらの新規転写物のインビトロおよびインビボの両方での検出は、ＵＶ照射（ＵＶＢおよびＵＶＡの両方）に対する曝露の定量化を可能にする。よって、本発明は、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露を検出、診断またはモニタリングするための方法を含み、上記方法は、一つ以上の生物学的サンプルを得る工程、上記サンプルからミトコンドリアＲＮＡを抽出する工程、および上記サンプルにおける一つ以上の融合転写物の量を定量し、検出された量を参照値と比較することによって融合転写物について上記サンプルをアッセイする工程を含む。
【００９８】
当業者に理解されるように、上記参照値は、上記方法が、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露の検出、診断またはモニタリングを要求するか否かに基づく。よって、上記参照値は、一つ以上の既知のＵＶ曝露された生物学的サンプルから、一つ以上の公知のＵＶ曝露されていない生物学的サンプルから、および／または一つ以上の生物学的サンプルから一定の期間にわたって収集された転写物データに関してもよい。上記サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚または血液に由来し得る。上記サンプルは、上述した種々の方法によって採集され得る。
【００９９】
一態様において、本発明は、哺乳類におけるＵＶ曝露を検出するための方法を提供する。上記方法は、上記の融合転写物の存在について哺乳類からの組織サンプルをアッセイする工程を含む。本発明はまた、哺乳類からの組織サンプルを少なくとも一つのハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズすることによって、上記サンプルをアッセイする工程を含む方法を提供する。上記プローブは、本明細書中に記載されたような本発明の融合転写物に対して生成され得る。
【０１００】
他の態様において、本発明は、上述したような方法を提供する。上記アッセイは、以下を含む：ａ）少なくとも一つのプロ―ブが相補的な融合転写物の配列にハイブリダイズすることを可能にするために少なくとも一つのプローブを使用するハイブリダイゼーション反応を行う工程；ｂ）上記サンプルにおける上記少なくとも一つの融合転写物の配列の量を、上記少なくとも一つのプローブにハイブリダイズした融合転写物の配列量を定量することによって定量する工程；およびＣ）上記サンプルにおける上記転写物の量を少なくとも一つの既知の参照値と比較する工程。
【０１０１】
上述したように、本発明の診断アッセイはまた、本明細書中に記載されたような診断方法およびスクリーニングツールを含み得、高スル―プットに対し容易に適合され得る。よって、本発明は、複数の試験サンプルにおける標的ヌクレオチド配列の検出および／または定量のための、高スループットスクリーニングまたは高スループットアッセイにおける本発明の融合転写物および関連するプローブの使用を企図する。
【０１０２】
〔スキンケア製品の試験およびスクリーニング〕
〔新しい処方物〕
特定の活性物質または処方物（例えば、日焼け止め、抗酸化物質または抗加齢の製品）の適用を介した、多くの新規のＵＶ関連融合転写物および関連するｍｔＤＮＡ分子における変化の調節は、ＵＶ照射による損傷から皮膚を保護する際の製品の効力を評価するために使用され得る。このような評価は、皮膚等価物モデルを使用した、新しい処方物のインビトロでの試験の形式（図１０および１１参照）を採用しても、生物学的サンプルを使用した、製品のインビボでの試験（図１２参照）を介した形式を採用してもよい。
【０１０３】
よって、本発明は、以下の工程を実行することによって、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷に対して防止、最小化、回復または保護するスキンケア製品の効力を調製および試験する方法を企図する：所望の特徴（例えば、ＵＶＡフィルターおよび／またはＵＶＢフィルター）を有する製品を調製する工程；スキンケア製品を、患者の皮膚または皮膚等価物モデルに適用する工程；上記皮膚または皮膚等価物モデルをＵＶＲに曝露する工程；太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚から採取したサンプルにおける少なくとも一つのミトコンドリア欠失分子および／または融合転写物の存在を検出する工程；ならびに、上記欠失体すなわち転写物の存在を参照値（例えば、コントロール遺伝子および／または転写物）と比較する工程。コントロール患者または皮膚等価物モデル（スキン製品を受けていないもの）がまた、参照値として使用されてもよい。
【０１０４】
ＵＶ損傷の一つ以上の症状、徴候または特徴において、一過性および長期間の両方における停止、防止、減少または改善は、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷に対する防止、最小化、改善または保護のための新しい製品（処方物）の能力を示す、ということを当業者は理解する。本発明の一実施形態において、以下に提供される実施例にて示されるような製品解析が行われる。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態において、新しい製品を試験するための方法は、ｍｔＤＮＡ欠失体または融合転写物の存在を検出する工程の前に、被験体の皮膚または皮膚等価物モデルを致死線量よりも低い線量の紫外線（ＵＶＲ）に少なくとも１回曝露する工程を含む。さらに、試験する前に、皮膚および皮膚等価物は、一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲ（例えば、毎日のＵＶＲ照射）に曝露され得る。概して、上記ＵＶＲは、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する。ここで、上記ＵＶＲは、ＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む。しかし、本明細書において太陽曝露がまた企図される。コントロール配列（上述したハウスキーピング遺伝子および転写物が挙げられるが、これらに限定されない。）がまた企図される。ｍｔＤＮＡ欠失体および融合転写物マーカーに関する限りでは、記載された方法の最後においてそれらを単独またはタンデムのどちらかによって挿入し得る。
【０１０６】
〔皮膚サンプル〕
患者の皮膚サンプルが、皮膚の真皮層または表皮層から採集され得、以下の方法によって得られてもよい：皮膚組織の微小核を採集するための、パンチ生検法、外科的切除法、および非侵襲的または最小限に侵襲性の皮膚の採集方法（例えば、ウェットスワビング、テープリフト、コットンチップスワビング、滅菌したメスを用いた皮膚のかきとり、木製のスクレーパーを用いた皮膚のかきとり、粘着パッドの接着面（ＣａｐＳｕｒｅＴＭＣｌｅａｎ−ｕｐ Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からのフィルム、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からの加熱フィルム、および小さなゲージ（例えば、２８ゲージ）の針の使用）。サンプルは、供給源から得られたまま直接的に用いられても、サンプルの特性を改変させる前処理に続いて用いられてもよい。よって、皮膚サンプルは、使用する前に、例えば、保存薬、試薬などを用いて前処理され得る。
【０１０７】
一つよりも多い採集技術が同時に使用され得ることは当業者に明らかである。さらに、採集の経過が、例えば、一定の期間にわたって製品のモニタリングに必要とされる場合、同一または異なる技術が、試験期間を通して単独または一緒に使用され得る。これに関して、皮膚の採集が、一度だけ、または規則的な間隔にて（例えば、１日毎、１週毎または１月毎に）行われ得る。
【０１０８】
〔皮膚等価物モデル〕
出願人はまた、皮膚等価物モデルを使用した、スキンケア製品をインビトロで試験するための新規システムを開発している。これらのモデルは、例えば、実施例２に記載されるように生成され、そして増殖され、続いて、上記モデルは、スキンケア製品を用いて処理され、種々の変化量のＵＶＲによって照射される。試験されるべき製品は、皮膚等価物の表面に単純にアプライされ（例えば、２ｍｇ/ｃｍ2の濃度にて）、そして細胞の表面にわたって均一に広げられる。皮膚等価物は、疑似太陽の下に配置され、一つ以上のＵＶ光の照射に曝露される。照射は、個々の実験設定および試験されるべき製品に依存する。しかし、典型的な照射レジメンのいくつかの例が、以下の表１および２に提供される。
【０１０９】
〔製品のスクリーニングおよび個別のスキンケア〕
融合転写物および関連ｍｔＤＮＡ欠失体の発生に対して保護するためのスキンケア製品の能力に対するデータの収集を介して、日焼け防止および抗加齢に関してより効果的な製品が開発され得る。なお、つい最近まで、太陽への曝露の間に個人によって定期的に適用される日焼け止めおよび日焼け止めクリーム（ｓｕｎｂｌｏｃｋ）は、概して、ＵＶＢの変異誘発効果に対して保護されるが、ＵＶＡ照射の有害な効果に指向される因子を含んでいなかった。よって、スキンケア製品の標的になるスクリーニングは、それらのＵＶＡ照射およびＵＶＢ照射の両方に対して保護し得る製品を同定する際に役立つ。
【０１１０】
これらの要素はとりわけ、市場に入る新しい製品の効力を測定すること、ならびに、研究の経過を介して、皮膚に対するＵＶＲ損傷を防止するための現行の測定の成功および適合性をモニタリングすることの両方を目的としたツールの利用可能性を必要とする。製品を適用し規則的な間隔でＵＶＲを照射した後に皮膚サンプルを採取することによって、患者の皮膚および皮膚等価物モデルにおいてミトコンドリＤＮＡ欠失体のレベルを測定することは、ＤＮＡおよび皮膚損傷の防止に対する上記製品の効力を決定することを補助し得る。上記ＤＮＡおよび皮膚の損傷は、関連する光老化および皮膚癌を含む。
【０１１１】
本発明の方法はまた、医療目的および化粧目的の両方のための、広く行きわたった皮膚スクリーニングに使用され得る。例えば、任意の時点での、外側の解剖学的な任意の位置からのＵＶ照射に起因する、被験体の皮膚におけるＤＮＡ損傷のレベルを評価するための能力は、現存するスキンケア製品および新しいスキンケア製品、ならびに所定の被験体に対するスキンケアレジメンの、安全性および効力を評価するために、独特かつ有益なスクリーニング試験のための基礎を提供する。さらに、ＵＶ曝露と関連した特定の遺伝子変化を同定することによって、特定のスキンケア製品またはレジメンが提供されるべきか否か、そしてどの程度提供されるべきかが、容易に決定され得る。
【０１１２】
すでに市場にあるスキンケア製品について、本発明の方法は、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷に対して防止、最小化、回復または保護するための、それらのスキンケア製品の能力を測定するための因子をスクリーニングすることを助ける。これは、熟練者または消費者が、それらの特定のスキンケアにおける要求性にどの商品が最も適しているのかを評価することを可能にする。本発明の方法によってスクリーニングされる製品としては、限定されないが、日焼け止め、ならびに、抗加齢の血清およびクリームが挙げられ、ペアにて、あるいは３つ以上の製品のバッチにて評価され得る。新しい処方物、または以下の実施例に詳述されているようなものを試験するためのスクリーニング方法が、上述されるように実行され得る。
【０１１３】
〔キット〕
本発明は、被験体のＵＶ曝露を検出またはモニタリングするための診断キットを提供する。本発明に従う一つ以上のプライマーもしくはプローブの組合せにおいて、上記キットは、一つ以上のサンプリング手段を備えてもよい。このようなキットはまた、その内容物を使用するための指示書を備え得る。
【０１１４】
上記キットは、必要に応じて、診断アッセイを行うために必要な試薬（例えば、緩衝液、塩、検出試薬など）を備える。他の構成要素（例えば、生物学的サンプルの単離および／または処理のための溶液）がまた、上記キットに備えられ得る。上記キットの一つ以上の構成要素は、凍結乾燥されていてもよく、凍結乾燥された構成要素の再構築に好適な試薬をさらに備えていてもよい。
【０１１５】
場合によっては、上記キットはまた、反応容器、混合容器、および試験サンプルの調製を容易にする他の構成要素を備えていてもよい。上記キットはまた、必要に応じて、使用のための指示書を備えていてもよく、上記指示書は、紙形態出提供されても、コンピュータ読取り可能な形態（例えば、ディスク、ＣＤ、ＤＶＤなど）で提供されてもよい。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、ＵＶ曝露を診断するためのキットが提供される。上記キットは、サンプリング手段および本発明のプローブまたはプライマーを備える。
【０１１７】
本明細書中に記載された本発明をより良く理解するために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態を記載することが意図され、本発明の範囲を限定することが決して意図されていない、ということが理解される。
【０１１８】
〔実施例〕
〔実施例１：ＨｐＥＫｐ細胞の増殖〕
〔材料〕
１．ＨｐＥＫｐ細胞＜１５継代（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
２．Ｔ７５組織培養フラスコ（ＩＷＡＫＩ）
３．ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ（１２５６３−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
４．１０ｍｌ滅菌Ｓｔｒｉｐｅｔｔｅｓ（Ｓｔａｒ Ｌａｂｓ）
５．自動ピペッター
６．倒立ＴＣ顕微鏡
７．滅菌１５ｍｌファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）
８．クラス２組織培養キャビネット（３７℃、５％ＣＯ２）（Ｂｉｎｄｅｒ）
９．ウォーターバス（３７℃）
１０．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
１１．ＰＣＭ完全培地（ＣｎＴ−５７）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）。
【０１１９】
〔プロトコル〕
１．ＨｐＥＫｐ細胞（９０％コンフルエンス）のフラスコからＣｎＴ−５７培地を除去する
２．滅菌ＰＢＳ（２ｍｌ）を用いて細胞を洗浄する。吸引オフ
３．細胞を覆うために、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔを１フラスコ当たり１．５ｍｌ加える
４．細胞が剥離するまで、２〜３分間インキュベーターに戻して静置する（顕微鏡を用いて確認する。）
５．細胞を再懸濁するために、５ｍｌのＣｎＴ−５７培地中で細胞を再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
６．１６０×ｇで５分間細胞をスピンする
７．培地を除去し、新鮮なＣｎＴ−５７培地５ｍｌ中で再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
８．細胞を計数するために２０μｌの細胞懸濁液を移す
９．細胞を希釈し、４×１０３細胞／ｃｍ２の濃度にて播種する
１０．３７℃および５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターの中にフラスコを置く
１１．２〜３日毎に１５ｍｌのＣｎＴ−５７培地を用いて給餌することによって細胞を維持する
１２．９０％コンフルエントまで増殖させ、次いで再び継代する。
【０１２０】
〔実施例２：表皮性の皮膚等価物の生成〕
〔材料〕
１．９０％コンフルエントにまで増殖させたＨｐＥＫｐ細胞＜１５継代（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）（実施例１参照）
２．Ｔ７５組織培養フラスコ（ＩＷＡＫＩ）
３．ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ（１２５６３−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
４．１０ｍｌ滅菌Ｓｔｒｉｐｅｔｔｅｓ（Ｓｔａｒ Ｌａｂｓ）
５．自動ピペッター
６．倒立ＴＣ顕微鏡
７．滅菌１５ｍｌファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）
８．６ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
９．Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＰＣＦ ０．４ μｍ Ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
１０．ＲａｐｉＤｉｆｆ ＩＩ ｓｔａｉｎ Ｐａｃｋ （ＢｉｏＳｔａｉｎ）
１１．２４ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
１２．クラス２組織培養キャビネット（３７℃、５％ＣＯ２）（Ｂｉｎｄｅｒ）
１３．ウォーターバス（３７℃）
１４．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
１５．滅菌ピンセット
１６．ＰＣＭ完全培地（ＣｎＴ−５７）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
１７．３Ｄ−Ｐｒｉｍｅ完全培地（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）。
【０１２１】
〔プロトコル〕
１．４つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＰＣＦ ０．４μｍ １２ｍｍ インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ♯：ＰＩＨＰ０１２５０）を、６ウエル培養プレートの各ウエル内に置き、実験に必要な数をプレートアウト（ｐｌａｔｉｎｇ ｏｕｔ）する。予備インサートを２つ準備する（コンフルエンシーをモニタリングするため−ステップ１５）
２．ＨｐＥＫｐ細胞のフラスコからＣｎＴ−５７培地を除去する
３．滅菌ＰＢＳ（２ｍｌ）を用いて細胞を洗浄する。吸引オフ
４．細胞を覆うために、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔを１フラスコ当たり１．５ｍｌ加える
５．細胞が剥離するまで、２〜３分間インキュベーターに戻して静置する（顕微鏡を用いて確認する。）
６．細胞を再懸濁するために、５ｍｌのＣｎＴ−５７培地中で細胞を再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
７．１６０×ｇで５分間細胞をスピンする
８．培地を除去し、新鮮なＣｎＴ−５７培地５ｍｌ中で再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
９．細胞を計数するために２０μｌの細胞懸濁液を移す
１０．５×１０５細胞／ｍｌの濃度に細胞を希釈する
１１．インサート１つ当たりに、４００μｌのＣｎＴ−５７（またはＣｎＴ−０７）中にて２×１０５個の細胞を添加する
１２．インサートの内側および外側の培地のレベルが等しくなりかつ細胞を埋もれるように、インサートの外側（プレートのウエル内）に適量（約２ｍｌ）のＣｎＴ−５７を添加する；上記膜の底部に、気泡が閉じ込められていないことを確認する
１３．３７℃および５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターの中にインサートを置く
１４．２〜３日間細胞を増殖させる
１５．ＲＡＰＩ−ＤＩＦＦ ＩＩ染色を用いて一つの予備インサートを染色する
１６．単層がコンフルエントの場合、ステップ１７に進む。そうでなければ、残存しているインサートにおいて培地を交換し、さらに１日間培養し、次いで、第２の予備インサートを用いて別の染色を行う
１７．インサートの内側および外側の培養培地を３Ｄ 培地（ＣｎＴ−０２−３ＤＰ）に取り換える（播種した時と同量、ステップ１２）
１８．細胞が細胞間接着構造を形成することを可能にするために、インキュベーターの中にインサートを一晩（１５−１６ｈ）置く。
【０１２２】
１９．インサートの内側から全ての培地を吸引することによって３Ｄ培養を開始し、２４ウエルプレートの個々のウエルに置く。（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）外側培地を加える（２５０μｌ）
２０．経時的な検討を行う場合、インサートを同一プレートに残して、おいて２〜３日毎に培地交換をしてもよい。放射線照射処理を開始する前に、乾燥雰囲気下において１４日間細胞を増殖させる。
【０１２３】
〔実施例３：表皮性の皮膚等価物の放射線照射−ＵＶＡ照射〕
〔材料〕
１．Ｏｒｉｅｌ １０００Ｗ ＵＶ Ｓｏｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．）
２．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．−８１０１７）
３．Ｖｉｓ ＩＲフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ ｃｏｒｐ−８７０６６）
４．ＰＥＴＧフィルター（ＲＶＩ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ）
５．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ ＵＶＡ 光線療法放射計（Ａｂｌｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−ＩＬ１４０２）
６．表皮性の皮膚等価物（実施例２参照）
７．３Ｄ−Ｐｒｉｍｅ完全培地（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
８．２４ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
９．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
１０．滅菌ピンセットおよびメス。
【０１２４】
〔使用したＵＶスペクトル（疑似太陽）〕
Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター＋Ｖｉｓ ＩＲフィルター＋ＰＥＴＧフィルター：図１５に示すように。
【０１２５】
〔手順〕
１．実施例２に示したように、皮膚等価物を作製しそして増殖させる。
【０１２６】
２．１４日間の乾燥雰囲気下での増殖の後に、上記ＳＥを放射線照射／処理するために準備する
３．皮膚等価物を増殖培地から移し、新しい２４ウエルプレート内に配置する。上記２４ウエルプレートは２００μｌの滅菌ＰＢＳを含む
４．必要であれば、試験されるべき製品を、２ｍｇ／ｃｍ２の濃度（または任意の特定の濃度）にて上記皮膚等価物の表面にアプライする。上記製品を曲がった２００μｌの滅菌ピペットチップを用いてアプライし、表面にわたって均等に広げる
５．皮膚等価物を準備したら直ちに、ＵＶ光に対する曝露の前に、それら皮膚等価物をインキュベーター内へ戻して、２０分間静置する
６．疑似太陽を点灯し、処理の前に１０分間暖めておく。放射計を用いてＵＶ出力を測定し、上記強度を用いて曝露に必要な時間を算出する
７．上記皮膚等価物を疑似太陽下に置き、（実験上の要求に応じて上記６にて計算されるような）Ｘ ＳＥＤのＵＶ光に曝露する
８．曝露に続いて、上記皮膚等価物を３Ｄ培地中に再度配置し、インキュベーター内へ戻す
９．放射線照射は個々の実験の設定に依存する。いくつかの例を表１に示す
１０．ＳＥへの放射線照射に続いて、ＳＥを３Ｄ培地から移し、抽出の前に−８０℃にて保存する。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
〔実施例４：表皮性の皮膚等価物の放射線照射−疑似太陽光〕
〔材料〕
１． １．Ｏｒｉｅｌ １０００Ｗ ＵＶ Ｓｏｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．）
２．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．−８１０１７）
３．Ｖｉｓ ＩＲフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ ｃｏｒｐ−８７０６６）
４．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ ＵＶＡ 光線療法放射計（Ａｂｌｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−ＩＬ１４０２）
５．表皮性の皮膚等価物（実施例２参照）
６．３Ｄ−Ｐｒｉｍｅ完全培地（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
７．２４ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
８．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
９．滅菌ピンセットおよびメス。
【０１２９】
〔使用したＵＶスペクトル（疑似太陽）〕
Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター＋Ｖｉｓ ＩＲフィルター：図１６に示すように。
【０１３０】
〔手順〕
１．実施例２に示したように、皮膚等価物を作製しそして増殖させる
２．１４日間の乾燥雰囲気下での増殖の後に、上記ＳＥを放射線照射／処理するために準備する
３．皮膚等価物を増殖培地から移し、新しい２４ウエルプレート内に配置する。上記２４ウエルプレートは２００μｌの滅菌ＰＢＳを含む
４．必要であれば、試験されるべき製品を、２ｍｇ／ｃｍ２の濃度（または任意の特定の濃度）にて上記皮膚等価物の表面にアプライする。上記製品を曲がった２００μｌの滅菌ピペットチップを用いてアプライし、表面にわたって均等に広げる
５．皮膚等価物を準備したら直ちに、ＵＶ光に対する曝露の前に、それら皮膚等価物をインキュベーター内へ戻して、２０分間静置する
６．疑似太陽を点灯し、処理の前に１０分間暖めておく。放射計を用いてＵＶ出力を測定し、上記強度を用いて曝露に必要な時間を算出する
７．上記皮膚等価物を疑似太陽下に置き、（実験上の要求に応じて上記６にて計算されるような）Ｘ ＳＥＤのＵＶ光に曝露する
８．曝露に続いて、上記皮膚等価物を３Ｄ培地中に再度配置し、インキュベーター内へ戻す
９．放射線照射は個々の実験の設定に依存する。いくつかの例を表１に示す
１０．ＳＥへの放射線線量に続いて、ＳＥを３Ｄ培地から移し、抽出の前に−８０℃にて保存する。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
〔実施例５：インビボでのＵＶＲ線量応答〕
種々のレベルのＵＶＲを用いて放射線照射を行い、次いで、拭き取って皮膚サンプルを収集することによって、個体に対するインビボでの試験を行った。図５を参照して、ＳＥＤは標準的な紅斑線量（ｅｒｙｔｈｅｍａｌ ｄｏｓｅ）をいう。上記線量は、紅斑（または皮膚の発赤）を生じさせるために必要とされるＵＶＲの量である。図５Ａは、３．０ ＳＥＤまでのＵＶＲ照射に続く皮膚拭取りサンプルにおける定量的リアルタイムＰＣＲによって行われた、ｍｔＤＮＡ欠失体の解析についての線量応答の結果を示す。この実験は、紅斑が生じ始める時点まで、漸増量のＵＶＲの線量を用いて、ＵＶＲ誘導性のｍｔＤＮＡ損傷が増加することを実証する。紅斑が生じ始める時点で、おそらく紅斑組織における増加したレベルのアポトーシスに起因して、サンプルにおけるｍｔＤＮＡ損傷は低下する。このことは、皮膚に対する長期間にわたる損傷の観点で、それが紅斑線量よりも低い線量であることを示し、この線量は、皮膚において観察されるｍｔＤＮＡの長期間にわたる損傷を生成する。図５Ｂに示すように、損傷における変化度（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を算出する。
【０１３３】
〔実施例６：ＵＶ曝露と関連した融合転写物の同定〕
培養した皮膚等価物を増殖させ、上記の実施例に記載したような疑似太陽を使用した種々のレベルのＵＶＲを用いて照射した。
【０１３４】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｋｉｔ：Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＱＳ０１００）およびｔｈｅ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＱＳ０００８）の製造業者のプロトコルに従いサンプルを処理した。詳細には、３００μｌの希釈した溶解混合液を皮膚等価物の各々に加え、その後、上記皮膚等価物を５０℃にて１．５時間または細胞の膜が完全に溶解されている外観を細胞が呈するまで、インキュベートした。各々を１：１０に希釈し、プロトコルの残りを実行し、ハウスキーパーとしてＡＣＢＴベータアクチンを用いて融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２を標的化した。全ての転写物について、各サンプルを三連にてアッセイし、各サンプル／転写物のペアについて、テンプレートのないバックグラウンドを設けた。
【０１３５】
図６〜９を参照して、０．５ ＳＥＤおよび１．０ ＳＥＤを、種々の回数の反復性の照射（０×、１５×、１８×、２１×、２４×、２７×）での本実験の目的のために使用した。明確に記載すると、１．０ ＳＥＤ ２７×に曝露されたこれらの皮膚等価物が、最大のレベルのＵＶＲを受けた。
【０１３６】
これらの結果は、試験された融合転写物の各々が、反復性の放射線照射を増やす場合およびＵＶＲ曝露との関連を示す０．５ ＳＥＤ〜１．０ ＳＥＤの場合の両方にて、量的に増加したことを実証する。
【０１３７】
〔実施例７：製品の処方および試験〕
異なるレベルのＵＶＡフィルターの３つのブラインド処方物を２ｍｇ／ｃｍ２にて試験した。各処方物のサンプルを、１４日間経過した皮膚等価物に対して、ＵＶＡおよび疑似太陽光源の両方を用いて試験した。同時に、上記サンプルをｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験した。サイバーグリーン（ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ）定量的リアルタイムＰＣＲによって欠失解析を行った。
【０１３８】
実験に用いる所望物を、標準的な化粧用成分から構成される化粧用の化粧用ローションエマルションにて、調製した。各製品は、一定のレベルのＵＶＢフィルターを含むが、ＵＶＡフィルターのレベルを以下のように変化させた。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
図１０は、処方物（Ａ、ＢまたはＣ）の適用に続く、ＵＶＡ（図１０）および疑似太陽光（図１１）に曝露したインビトロのサンプルに対するＰＣＲ解析の結果を示す。図１２に、処方物のインビボ試験に続く結果を提供する。これらのデータは、疑似太陽光からのＵＶＲ損傷の多因子的性質を示し、ＵＶＡのみの曝露を用いて分離した時、損傷レベルは、日焼け止めによって与えられたＵＶＡ保護の割合に追従する。しかしながら、疑似太陽光において曝露がＵＶＡのＵＶＲおよびＵＶＢのＵＶＲの両方を結合させた場合、サンプル間の損傷率は変化する。サンプルＡおよびＢについては、ＵＶＡフィルターの欠如および疑似太陽光におけるＵＶＢの併用は、紅斑の閾値を超える損傷を受けているので（前出の００１２１）、Ａが予想よりも高いというよりもむしろ、Ｂが予想よりも低いのかもしれない。このことは、上記サンプルにおいて、より少ない損傷が記録されたことを意味する。
【０１４１】
これらの結果はまた、この化合物において、欠失のレベルによって示されているような損傷のレベルとＵＶＡフィルターの量との間に逆相関関係が存在していることを実証する。明確に記載すると、化合物ＢのようなＵＶＡフィルターの欠失は、より高いレベルの欠失を生じる。
【０１４２】
〔実施例８：日焼け止めおよび抗加齢の商品のスクリーニング〕
ＵＶＡ光に対する反復性の曝露の前に、種々の日焼け止めおよび抗加齢の製品のサンプルを２ｍｇ／ｃｍ２にてアプライした。日焼け止め剤のパネルは、ＵＫ／北アメリカのトップブランドからのｓｐｆ １５の製品を含んでいた。抗加齢の製品は、多くのトップブランドからの広範なナイトクリーム／血清を含んでいた（図１３）。上記結果は、全ての製品が同じＳＰＦ規格を有するにもかかわらず（１５）、ＵＶＡおよび疑似太陽ＵＶＲの両方を用いた放射線照射に続く、これらの製品によって与えられる保護レベルがかなり変動したことを示す。これは、ｍｔＤＮＡ損傷において（ＳＰＦ規格によって測定される）ＵＶＢ曝露の要素（例えば、ＵＶＡ保護および抗酸化活性）が重要であるので、日焼け止めによって与えられたＵＶＲ保護の効力を評価するためにはＳＰＦ単独では不十分であることを示唆する。抗加齢の製品は、多くのトップブランドからの広範なナイトクリーム／血清を含んでいた（図１４）。これらのデータは、高加齢型の製品によって与えられる保護において、ｍｔＤＮＡに関するかぎりで、顕著な変量が存在することを示す。これらの製品の多くは、これらの主な活性成分として抗酸化化合物を含み、このことは、ｍｔＤＮＡ損傷の測定が、上述した処方物、さらに、個々の活性成分を効果的であるものと、保護をほとんどもしくは全く示さないものとの間で差別化し得ることを示す。
【０１４３】
本発明は、いくつかの特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の目的および範囲を逸脱することなく、本明細書に添付の特許請求の範囲で述べるような上記実施形態の種々改変が、当業者に明白である。本明細書中に提供される任意の実施例は、単に本発明を例示する目的のために含まれており、本発明を限定することを決して意図するものでない。本明細書とともに提供される任意の図面は、単に本発明の種々の態様を例示するための目的であり、本発明を縮小するまたは限定することを決して意図するものでない。本明細書中に挙げられた全ての先行技術の開示は、それらの全てが参考として本明細書にて援用される。
【０１４４】
〔引用文献〕
以下の参考文献が、他にも文献は存在するが、これまでの記載の中で引用された。これらの参考文献の内容の全体が、本明細書に対する参照の目的で、本明細書にて援用される。
【０１４５】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後の、３８６〜５４７位：４４４３〜５５１１位からのフレーム２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後に生成される読み枠を示す図である。ヌクレオチド３８２は赤い四角によって示されている。上記赤い四角は、ミトコンドリアゲノムの１位に関する読み枠２の開始を特定している。
【図３】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去によって形成されるフレーム２融合転写物の寄与配列を示す図である。
【図４】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の欠失による融合転写物形態の最終アミノ酸配列を示す図である。上記配列は、ミトコンドリアゲノムの、再結合したヌクレオチド４７０〜５４７位および４４４３〜５５１１位を含む。
【図５Ａ】は、ｍｔＤＮＡ欠失体解析を使用したインビボでのＵＶＲ線量応答を示す図である。
【図５Ｂ】は、ＵＶ損傷を測定するためのサンプルの計算を示す図である。
【図６】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図７】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図８】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図９】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図１０】３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す図である。
【図１１】３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す図である。
【図１２】３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す図である。
【図１３】ＵＶ曝露に続く種々の日焼け止めおよび抗加齢銘柄のスクリーニングを示す図である。
【図１４】種々の日焼け止め商品および抗加齢商品の、ＵＶ曝露に続くスクリーニングを示す図である。
【図１５】実施例３の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す図である。
【図１６】実施例４の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本発明は、米国特許出願第６１／３０９，２１６号（２０１０年３月１日出願）から優先権を主張する。上記特許出願の内容の全体が、参考として本明細書にて援用される。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、ミトコンドリアゲノミクスの分野に関する。より詳細には、本発明は、ＵＶ曝露と関連するミトコンドリア融合転写物および関連する欠失分子、ならびに生物学的サンプルにおけるそれらの検出およびモニタリングに関する。
【０００３】
〔背景技術〕
〔ミトコンドリアのゲノム〕
ミトコンドリアのゲノムは、コンパクトであるが重要な核酸配列である。ミトコンドリアのＤＮＡすなわち「ｍｔＤＮＡ」は、３３億ｂｐ（一倍体）の巨大な核ゲノムとは対照的に、１６，５６９核酸塩基対（ｂｐ）の小さいゲノムを包含する(Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999)。上記ｍｔＤＮＡの遺伝的相補性は、核細胞メイト（ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｍａｔｅ）の相補性よりも実質的に小さい（０．０００５％）。しかし、個々の細胞は、特定の細胞機能に依存して、概して１０３個から１０４個のミトコンドリアを有している(Singh and Modica-Napolitano, 2002)。伝達すなわち化学的シグナリングは、核ゲノムとミトコンドリアゲノムとの間で通常生じる(Sherratt et al., 1997)。さらに、核の特定の構成成分は、ミトコンドリア配列の維持および保全を担っている(Croteau et al., 1999)。受精が生じるとすぐに卵子内でミトコンドリアがクローン増殖することに起因して、所定の個体における全てのｍｔＤＮＡゲノムは同一である。しかし、変異原性の事象は、体細胞変異として反映される配列多様性を誘発し得る。これらの変異は、ヘテロプラズミ―（ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｙ）として知られる状態において体中の種々の組織にて蓄積し得る。
【０００４】
〔ミトコンドリア融合トランスクリプトーム〕
ミトコンドリアのゲノムは、通常と異なっており、環状の、イントロンが存在しないＤＮＡ分子である。このゲノムにおいては、特定の長さの配列に隣接する繰返しモチーフが散在している。これらの繰返しの間の配列は、あまりよく理解されていない環境下において欠失する傾向がある。ミトコンドリアゲノムにいくつかの繰り返しがある場合、多くの欠失が存在する。最もよく知られている例示は、４９７７の「共通の欠失（ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」である。この欠失は、意図されたいくつかの状態および病気と関連している。この欠失は、加齢に伴って頻度が増加すると考えられている(Dai et al., 2004; Ro et al., 2003; Barron et al., 2001; Lewis et al., 2000; Muller-Hocker, 1998; Porteous et al., 1998)。
【０００５】
種々の他のミトコンドリアの欠失は、前立腺癌、皮膚癌および肺癌の初期の発症、ならびに、加齢(e.g. Polyak et al., 1998)、早期老化、および発癌性物質に対する曝露(Lee et al., 1998)と関連している。さらに、研究者は、非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）の発生および病因に紫外線が重要であること(Weinstock 1998; Rees, 1998)、ならびに、ヒト皮膚において紫外線がｍｔＤＮＡ損傷を誘発すること、を見出している(Birch-Machin, 2000a)。例えば、カナダ国特許出願番号第２，４８０，１８４号において、ミトコンドリアゲノムのマイナーアーク（ｍｉｎｏｒ ａｒｃ）における３８９５ｂｐの欠失が、ＵＶ誘発性のＤＮＡ損傷のバイオマーカーとして同定された。以来、上記３８９５ｂｐの欠失もまた、皮膚癌と関連している（ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００６５２号）。
【０００６】
出願人の同時係属の国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１号にて論じられているように、ヒトミトコンドリアゲノムの大規模な欠失をマッピングすることから得られる知識は、病気と関連する欠失の同定に有用である。例えば、ミトコンドリアゲノムのコンピュータ解析は、出願人が欠失サイトを同定することを可能にする。ＤＮＡ分子における欠失事象の開始の際に、上記欠失サイトは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する融合ＤＮＡ配列を生成するために、再閉鎖（ｒｅ−ｃｌｏｓｅ）または再連結（ｒｅ−ｌｉｇａｔｅ）する。これらの研究から、出願人は、欠失分子および関連した融合転写物のサブセットを同定した。上記欠失分子および関連した融合転写物は悪性腫瘍に関連性を示す。
【０００７】
出願人は、ミトコンドリアの欠失、およびＵＶ曝露と関連する融合転写物の、さらなるサブセットを同定している。これらの研究からの結果およびＵＶ損傷の検出へのその適用を本明細書中に記載する。
【０００８】
〔発明の概要〕
一態様において、本発明は、ミトコンドリア融合転写物を検出するための方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ミトコンドリア融合転写物を検出するための方法を提供し、ここで、上記転写物はＵＶ曝露と関連する。上記方法は以下の工程を含む：（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；および（ｂ）上記サンプルにおけるミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程。
【００１０】
本発明の別の態様によると、被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法が提供される。上記方法は以下の工程を含む：（ａ）被験体からの生物学的サンプルを提供する工程；および（ｂ）ＵＶ曝露と関連するミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程。
【００１１】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露と関連した、単離されたミトコンドリ融合転写物が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露の検出のための融合転写物の使用が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしての融合転写物の使用が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露を検出するためのキットが提供され、上記キットは、（ａ）本発明の単離された融合配列の一部に対して実質的に相補的な配列を有するプローブを備える。
【００１５】
本発明の別の態様によると、ヒトｍｔＤＮＡゲノムにおいて欠失を検出するための方法が提供され、上記欠失は、ＵＶ曝露に関連しており、上記方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；（ｂ）上記生物学的サンプルからｍｔＤＮＡを抽出する工程；および（ｃ）ｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程を含む。
【００１６】
本発明の別の態様によると、被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法が提供され、上記方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；（ｂ）上記生物学的サンプルからｍｔＤＮＡを抽出する工程；および（ｃ）ＵＶ曝露と関連したｍｔＤＮＡでの欠失の存在を検出する工程を含む。
【００１７】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露と関連した、単離されたｍｔＤＮＡ欠失分子が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露を検出するためのｍｔＤＮＡ欠失体の使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしてのｍｔＤＮＡ欠失体の使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するためのスキンケア製品の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露と関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；および（ｅ）上記転写物の存在を参照値と比較する工程。
【００２１】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するための新たなスキンケア製品または処方物の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露と関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；および（ｅ）上記分子の存在を参照値と比較する工程。
【００２２】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露と関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々に対する上記融合転写物の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２３】
本発明の別の態様によると、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷を防止、最小化、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露と関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々について上記欠失分子の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２４】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化を防止、回復または保護するためのスキンケア製品の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露と関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；および（ｅ）上記転写物の存在を参照値と比較する工程。
【００２５】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化を防止、回復または保護するための新しいスキンケア製品または処方物の効力を試験するための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）所望の特徴を有するスキンケア製品を調製する工程；（ｂ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｃ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｄ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物のサンプルにおいてＵＶ曝露に関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；および（ｅ）上記分子の存在を参照値と比較する工程。
【００２６】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化を防止、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露に関連したミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々に対する上記融合転写物の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２７】
本発明の別の態様によると、皮膚の加齢または光老化に対する防止、回復または保護するための能力についてスキンケア製品をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は以下の工程を含む：（ａ）上記スキンケア製品を患者の皮膚または皮膚等価物に適用する工程；（ｂ）上記皮膚または皮膚等価物をＵＶＲに曝露する工程；（ｃ）上記曝露された患者の皮膚または皮膚等価物においてＵＶ曝露に関連したｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程；ならびに（ｅ）試験したスキンケア製品の各々に対する上記欠失分子の存在を参照値と比較するおよび／または互いに比較する工程。
【００２８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照してなされる以下の詳細な説明においてより明確になる。
【００２９】
図１は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後における、３８６〜５４７位：４４４３〜５５１１位からのフレーム２のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
図２は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後に生成される読み枠を示す図である。ヌクレオチド３８２は赤い四角によって示されている。上記赤い四角は、ミトコンドリアゲノムの１位に関する読み枠２の開始を特定している。
【００３１】
図３は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去によって形成されるフレーム２融合転写物の寄与配列を示す。
【００３２】
図４は、ヌクレオチド５４８〜４４４２位の欠失による融合転写物形態の最終アミノ酸配列を示す。上記配列は、ミトコンドリアゲノムの、再結合したヌクレオチド４７０〜５４７位および４４４３〜５５１１位を含む。
【００３３】
図５Ａは、ｍｔＤＮＡ欠失体解析を使用したインビボでのＵＶＲ線量応答を示す。
【００３４】
図５Ｂは、ＵＶ損傷を測定するためのサンプルの計算を示す。
【００３５】
図６〜９は、皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す。
【００３６】
図１０〜１２は、３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す。
【００３７】
図１３および１４は、ＵＶ曝露に続く種々の日焼け止めおよび抗加齢銘柄のスクリーニングを示す。
【００３８】
図１５は、実施例３の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す。
【００３９】
図１６は実施例４の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す。
【００４０】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ＵＶ曝露と関連している、新規のミトコンドリア融合転写物および関連するｍｔＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、生物学的サンプルにおいて融合転写物および関連するｍｔＤＮＡ分子の検出およびモニタリングを提供する。本発明はさらに、スキンケア製品のスクリーニングおよび試験における、融合転写物および関連するｍｔＤＮＡの欠失体の使用を提供する。
【００４１】
本発明の技術および手順は、概して、当該分野における慣用的方法および種々の一般的な参考文献（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., and Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983)参照）に従って行われる。
【００４２】
〔定義〕
他で規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって広く理解されるものと同一の意味を有する。以下の用語は、他で指示されない限り、以下の意味を有することが理解されるべきである。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、一定の値および係数からの変動をいうことが意図される。このことが特に言及されているか否かにかかわらず、上記用語が特に参照されるか否かにかかわらず、本明細書中にて提供されている任意の所定の値および係数に常に含まれることが理解されるべきである。例として、上記変動は、およそ＋／−１０％であってもよい。測定に必然的に関連するある程度の誤差が存在することもまた、全ての当業者に周知である。上記誤差の程度は、記録を取得するために使用される機器の精度に依存して変動する。出願人は、本発明を行う者によって使用される機器の精度を知り得ないので、測定誤差の程度を必然的に規定し得ない。同様に、本明細書中にて提示されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の精度は、使用される装置およびプロセスの精度に依存する。したがって、配列の些細な変異は、本願の教示の範囲外とみなされない。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「ミトコンドリア融合転写物」または「融合転写物」という表現は、変異したミトコンドリアＤＮＡ配列の転写の結果として生成されるＲＮＡ転写産物をいう。ここで、上記変異は、ミトコンドリア欠失および他の大規模なミトコンドリアＤＮＡの再編成を含み得る。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、核酸の「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」という用語は、検出可能にかつ特異的に第２の核酸に結合する能力をいう。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびこれらの断片は、非特異的な核酸に検出可能に結合するかなりの量を最小化するハイブリダイゼーション条件下および洗浄条件下において直接的な標的核酸鎖にハイブリダイズする。高ストリンジェンシーの条件は、当該分野において公知の選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、慣用的なハイブリダイゼーション手順に従って高ストリンジェンシーにおいて行われる。洗浄条件は、一般に、１〜３×ＳＳＣ、０．１〜１％ ＳＤＳ、５０〜７０℃であり、約５〜３０分間の後に洗浄溶液を交換する。
【００４６】
「回復する」という用語は、ＵＶ損傷の一つ以上の症状、徴候または特徴において、一過性および長期間の両方の停止、防止、低減または改善を含む。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「異常」または「変異」は、野生型ミトコンドリアのＤＮＡ配列における改変を含む。上記改変は、融合転写物を生じ、そして、限定されることなく実質的なｍｔＤＮＡ欠失体または大規模なｍｔＤＮＡ欠失体を含む。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、「ミトコンドリアＤＮＡ」または「ｍｔＤＮＡ」は、ミトコンドリアに存在するか、またはミトコンドリアにおいて生じている。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、「被験体」または「患者」という用語は、治療が必要な動物または試験される動物をいう。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方をいい、制限されないが、哺乳類、鳥類および魚類を含む。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、物体に適用されるような「由来する」という用語は、その物体が特定の供給源から得られることを示し、その供給源から直接的に得られることを必ずしも必要としない。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、「診断の（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）」または「診断すること（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」は、ＵＶ曝露の診断またはＵＶ曝露の管理における因子として、変異、または変異の組合せの存在または非存在あるいは変異の組合せの量を使用することを意味する。
【００５３】
「皮膚」という用語は、体の外部を保護的に覆うことをいう。皮膚は、真皮および表皮からなり、汗、皮脂腺および毛嚢構造を含むことが理解される。一実施態様において、皮膚は哺乳類の皮膚であり、ヒトであることが好ましい。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、「生物学的サンプル」は、細胞を含む組織または体液をいう。上記細胞からは、目的の分子が得られ得る。例えば、生物学的サンプルは、皮膚細胞または組織に由来し得る。上記組織は、真皮もしくは表皮、またはこれら両方の組合せから採取され得る。生物学的サンプルは、その供給源から得られた状態で直接的に使用されても、サンプルの特性を改変させる前処理に続いて、使用されてもよい。サンプルは、種々の方法によって得られ得る。上記方法は、制限されないが、以下が含まれる：皮膚組織の微小核（ｍｉｃｒｏ−ｃｏｒｅｓ）を採集するための、パンチ生検法、外科的切除法および非侵襲的または最小限に侵襲性の皮膚の採集方法（例えば、ウェットスビング（ｗｅｔ ｓｗａｂｂｉｎｇ）、テープリフト（ｔａｐｅｌｉｆｔ）、コットンチップスワビング、滅菌したメスを用いた皮膚のかきとり、木製のスクレーパーを用いた皮膚のかきとり、粘着パッドの接着面（ＣａｐＳｕｒｅＴＭＣｌｅａｎ−ｕｐ Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からのフィルム、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からの加熱フィルムおよび小さなゲージ（例えば、２８ゲージ）の針の使用）。これらの方法は、当該分野において周知である（例えば、出願人の同時係属出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１７９０およびＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１８０１（上記同時係属出願は、皮膚を採集するための種々の方法を開示している。）参照）。
【００５５】
〔ゲノムの変異〕
ｍｔＤＮＡｓは、危険因子、または崩壊性の細胞プロセスを同定するに有用なバイオマーカーである。上記危険因子または細胞プロセスは、疾患の開始、ならびに因子（例えば、毒素、発癌性物質または有害な放射線）への環境的な曝露に関連するものである。本発明によると、ミトコンドリアゲノムにおける大規模な再構成の変異が、ＵＶ曝露と関連した融合転写物を同定する。したがって、ＵＶ曝露の検出、診断およびモニタリングのための、上記の転写物をコードするｍｔＤＮＡおよびこのｍｔＤＮＡを指向するプローブの使用が、本明細書中に提供される。
【００５６】
本発明の方法論はまた、ｍｔＤＮＡ欠失体またはそれらに関連する融合転写物のいずれを介しても、スキンケア製品の同定において有効である。したがって、本願は、生物学的サンプルにおけるＵＶに関連した損傷の量を検出（および計測）するための種々の方法、ならびに上記損傷を低減または防止し得る製品をスクリーニングおよび試験するための種々の方法を提供する。
【００５７】
当業者は、本発明の方法における使用のためのｍｔＤＮＡ分子が、天然に存在する変異体の単離を介して得られても、本明細書中に記載された融合転写物の何れかの相補配列に基づいてもよい、ということを正しく認識する。例示的なｍｔＤＮＡ配列および融合転写物は、出願人の同時係属のＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１）に開示されており、この同時係属のＰＣＴ出願は、参考として本明細書にて援用される。
【００５８】
〔変異ゲノム配列の検出〕
本発明による、ＵＶ曝露と関連した変異配列は、融合転写物を生成するｍｔＤＮＡ欠失体を含む。その改変または変化は、わずか数ベースから数キロベースまで、サイズを顕著に変更し得るで、好ましくは、上記改変が、実質的または大規模なｍｔＤＮＡ欠失（ゲノム異常とも呼ばれる。）を生じる。
【００５９】
異常なｍｔＤＮＡ分子を抽出および単離するための技術は、出願人の同時係属の特許出願（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１号）に開示されている。上記方法は、適切なプライマー、プローブおよびゲノム配列（例えば、それらは新規のｍｔＤＮＡ結合ポイントを有する）を選択するための技術も含んでおり、参考として本明細書に参照にて援用される。
【００６０】
本発明の一態様によると、候補ゲノム配列を決定するために、配列欠失の結合ポイントが初めに同定される。配列の欠失は５’末端および３’末端にて欠失されるべき配列に隣接する直接的および間接的な繰返しエレメントによって、最初に同定される。ゲノムからの一区切りのヌクレオチドを除去し、次いでゲノムをライゲーションすることによって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および新規の結合ポイントを有する融合ＤＮＡ配列が生じる。
【００６１】
本発明の方法における使用のための例示的なｍｔＤＮＡ分子が、以下に提供される。以前に述べられてるように（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００３５１参照）、これらのｍｔＤＮＡは、公知のミトコンドリアゲノム（配列番号１）の改変に基づいており、融合または「ＦＵＳ」の呼称が割り当てられている。ここで、Ａ：Ｂは第一のスプライシングされた遺伝子の最後のミトコンドリアヌクレオチドと第二のスプライシングされた遺伝子の最初のミトコンドリアヌクレオチドとの間の結合ポイントを示す。スプライシングされた遺伝子の同定が、対応する配列の識別子に続く括弧書きにて提供される。以下に提供される場合、（ＡｌｔＭｅｔ）および（ＯｒｉｇＭｅｔ）はそれぞれ、代替えの翻訳開始部位および元々の翻訳開始部位をいう。
【００６２】
ＦＵＳ ４６９：１３４４７（ＡｌｔＭｅｔ）（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット８（ＡＴＰａｓｅ８）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号２）
ＦＵＳ ０７４４：１４１２４（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ（ＮＤ４Ｌ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号３）
ＦＵＳ７９７４：１５４９６（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＩＩ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号４）
ＦＵＳ ９９２：１５７３０（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＭ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号５）
ＦＵＳ ２１０：１５３３９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＭ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号６）
ＦＵＳ ８２８：１４８９６（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット６（ＡＴＰａｓｅ６)−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号７）
ＦＵＳ１０６６５：１４８５６（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ（ＮＤ４Ｌ）−シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号８）
ＦＵＳ ０７５：１３７９９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯI)−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号９）
ＦＵＳ ３２５：１３９８９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１０）
ＦＵＳ ７４３８：１３４７６（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１１）
ＦＵＳ ７７５：１３５３２（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ（ＣＯＭ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５ （ＮＤ５））（配列番号１２）
ＦＵＳ ２１３：１３９９１（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩｌ （ＣＯＭ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１３）
ＦＵＳ １４４：１３８１６（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１４）
ＦＵＳ １９１：１２９０９（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１５）
ＦＵＳ ５７４：１２９７２（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩＩ（ＣＯＩＩＩ）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１６）
ＦＵＳ ０３６７：１２８２９（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＮＤ３）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１７）
ＦＵＳ １１２３２：１３９８０（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＮＤ４）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１８）
ＦＵＳ ８４６９：１３４４７（ＯｒｉｇＭｅｔ）（ＡＴＰシンターゼＦＯサブユニット８（ＡＴＰａｓｅ８）−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１９）
ＦＵＳ ５４７：４４４３（Ｍｅｔ−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＮＤ２））（配列番号２０）。
【００６３】
以下の実施例に記載されているように、一旦配列が同定されると、それらの配列のＵＶ曝露との関連性が解析される。このような試験が、被験体または患者においてインビボで行われてもよく（実施例５参照）、増殖されそして種々のレベルのＵＶＲが照射される皮膚培養物の試験を介して行われてもよい（実施例３および４参照）。これらの配列の発現はまた、１時間またはそれより長い時間にわたってハウスキーピング（ｋｅｅｐｅｒ）遺伝子についてモニタリングされてもよい、上記ハウスキーピング遺伝子としては、限定されないが、ヒトＰＰＩＢ、ヒトＰＧＫ−１、ヒトＡＣＴＢ（ベータアクチン）、ヒトＧＵＳＢ（ベータグルクロ二ダーゼ）、ヒトＢ２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン）、ヒトＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ヒトＧＡＰＤ（グリセルアルデヒド（ｇｌｙｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヒトＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ヒトＲＰＬＰＯ＝ＬＲＰ（リボソームタンパク質、ラージ（ｌａｒｇｅ）、ＰＯ）、ヒトＨＭＢＳ＝ＰＢＧＤ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ヒトＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ヒトＴＲＦＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１）、および、ヒトＡＢＣＣ１３（染色体１３ 偽遺伝子）が挙げられる。
【００６４】
本発明の一実施形態において、以下のｍｔＤＮＡ配列が、ＵＶ損傷を予測、診断またはモニタリングすること、ならびに、ＵＶ損傷の防止または回復に効果的なスキンケア製品を試験およびスクリーニングすること、に対して有用であると判断される。：
配列番号３（ＦＵＳ １０７４４：１４１２４）
配列番号４（ＦＵＳ ７９７４：１５４９６）
配列番号１２（ＦＵＳ ７７７５：１３５３２）
配列番号１３（ＦＵＳ ８２１３：１３９９１）
配列番号１９（ＦＵＳ ８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）
配列番号２０（ＦＵＳ ５４７：４４４３）。
【００６５】
本発明の他の実施形態において、配列番号１９および２０を有するｍｔＤＮＡ配列が、本発明の方法を行う際に、好ましく使用される。
【００６６】
上記配列に加えて、本発明はまた、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を予測、診断および／またはモニタリングするための、これらの配列の改変体または断片の使用を提供する。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「改変体」は本発明のｍｔＤＮＡ配列とは異なる核酸をいうが、その本質的な特性を保持している。一般に、改変体は、選んだｍｔＤＮＡ配列に対して、全体的に密接に類似しており、そして、多くの領域において同一である。詳細には、本発明の改変体は、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントのヌクレオチドを少なくとも一つ含む。上記改変体は、上記結合ポイントに隣接した一つ以上のヌクレオチドをさらに含んでもよい。本発明の一実施形態において、改変体配列は、本発明のｍｔＤＮＡ配列のいずれか一つまたはそれらの相補鎖に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００６８】
本発明において、「断片」は、開示されたゲノム配列またはその相補鎖に含まれている核酸配列の一部である短い核酸配列をいう。この一部は、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントを含むヌクレオチドの少なくとも一つを含む。この一部はさらに、隣接する一つ以上のヌクレオチドを含んでもよい。本発明の断片は，少なくとも約１５ｎｔの長さであることが好ましく、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔの長さであり、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔの長さであり、さらにより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さ、少なくとも約５０ｎｔの長さ、少なくとも約７５ｎｔの長さまたは少なくとも約１５０ｎｔの長さである。「少なくとも２０ｎｔの長さ」の断片は、例えば、上記に挙げられたｍｔＤＮＡ配列のいずれか一つの２０個以上連続する塩基を含むことが意図される。この内容において、「約」は、詳細に記載されている値、および数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きい値または小さい値を、どちらか一方の末端または両方の末端に含む。これらの断片は、用途を有し、上記用途としては、限定されないが、本明細書中に記載されるような診断プローブおよびプライマーが挙げられる。もちろん、より大きな断片（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）もまた企図される。
【００６９】
〔プライマーおよびプローブ〕
本発明の他の態様は、本発明のｍｔＤＮＡ配列を認識し得るプライマーおよびプローブを提供することである。本発明に用いられる場合、「プライマー」および「プローブ」という用語は、上記プライマーおよびプローブにおける少なくとも一つの配列の上記標的領域との相補性に起因して標的核酸における配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドをいう。当該分野において公知の方法によると、上記プローブは標識化されてもよい。
【００７０】
一旦ＵＶ曝露と関連した異常型のｍｔＤＮＡが同定されると、例えば、オリゴヌクレオチドのアレイに対するｍｔＤＮＡのハイブリダイゼーションが、特定の変異の同定のために使用され得るが、公知の任意のハイブリダイゼーション法が使用され得る。
【００７１】
本発明にて使用するために好適なプライマーおよびプローブの調製が、出願人の同時係属のＰＣＴ出願に記載されているように生成され得る。この点において、プローブは、本発明の例示的なｍｔＤＮＡ融合分子に対して、またはそれらの断片もしくは改変体に対して、直接的に生成され得る。例えば、配列番号３、４、１２、１３、１９および２０に記載の配列は、目的の融合配列を含む核酸配列を検出するプライマーまたはプローブの設計のために使用され得る。当業者に理解されるように、これらの核酸分子にハイブリダイズするプライマーまたはプローブは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイズしてもよい。上記条件は当業者に公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989))，6.3.1-6.3.6.において見出される。本発明のプライマーおよびプローブはまた、標的配列のＤＮＡスリッページが存在する箇所または類似の配列変更事象が生じた箇所にハイブリダイズし得る。
【００７２】
本発明の特定の実施形態において、本発明のプローブは、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントを含む異常型ｍｔＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的な配列を含む。この一部は、結合ポイントＡ：Ｂに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドを含み、隣接する１個以上のヌクレオチドをさらに含んでもよい。この点について、本発明は、任意の好適な標的化メカニズムを含む。上記メカニズムは、結合ポイントＡ：Ｂに含まれているおよび／または隣接しているヌクレオチドを使用してｍｔＤＮＡ分子を選択する。
【００７３】
種々のタイプのプローブ（出願人の同時係属のＰＣＴ出願において記載されているような）が、本発明によって企図される。本発明のプローブは，好ましくは少なくとも約１５ｎｔの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔの長さであり、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔの長さであり、さらにより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さ、少なくとも約５０ｎｔの長さ、少なくとも約７５ｎｔの長さまたは少なくとも約１５０ｎｔの長さである。「少なくとも２０ｎｔの長さ」のプローブは、例えば、２０個以上の連続する塩基を含むことが意図される。上記連続する塩基は、本発明のｍｔＤＮＡ配列に対して相補的である。もちろん、より大きなプローブ（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）もまた好ましい。
【００７４】
本発明のプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、これにより、本発明の方法を可能にする。よって、本発明の一態様において、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露の検出、診断および／またはモニタリングに使用するためのハイブリダイゼーションプローブが提供される。ここで、上記プローブは、異常型ｍｔＤＮＡ分子の少なくとも一部に対して相補的である。他の態様において、本発明は、プローブおよび上記プローブの使用（または使用方法）を提供し、上記使用は、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を防止または回復することに効果的なスキンケア製品をスクリーニングまたは検証するための、上記プローブの使用である。
【００７５】
〔アッセイ〕
生物学的サンプルにおいて異常型のｍｔＤＮＡのレベルを測定することは、被験体におけるＵＶ曝露のレベルを決定し得る。したがって、本発明は、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露を検出、診断またはモニタリングするための方法を含み、上記方法は一つ以上の生物学的サンプルを得る工程、上記サンプルからｍｔＤＮＡを抽出する工程、および上記サンプルにおける一つ以上の異常型ｍｔＤＮＡ配列の量を定量し、検出された量を参照値と比較することによって異常型ｍｔＤＮＡについて上記サンプルをアッセイする工程を含む。
【００７６】
当業者に理解されるように、上記参照値は、上記方法が、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露の検出、診断またはモニタリングを要求するか否かに基づく。よって、上記参照値は、一つ以上の公知のＵＶ曝露された生物学的サンプルから、一つ以上の公知のＵＶ曝露されていない生物学的サンプルから、および／または一つ以上の生物学的サンプルから、一定の期間にわたって収集されたｍｔＤＮＡデータに関してもよい。上記サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚または血液に由来し得る。上記サンプルは、限定されないが、以下の方法を含む種々の方法によって採集され得る：皮膚組織の微小核を採集するための、パンチ生検法、外科的切除法、および非侵襲的または最小限に侵襲性の皮膚の採集方法（例えば、ウェットスワビング、テープリフト、コットンチップスワビング、滅菌したメスを用いた皮膚のかきとり、木製のスクレーパーを用いた皮膚のかきとり、粘着パッドの接着面（ＣａｐＳｕｒｅＴＭＣｌｅａｎ−ｕｐ Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からのフィルム、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からの加熱フィルム、および小さなゲージ（例えば、２８ゲージ）の針の使用）。
【００７７】
ｍｔＤＮＡにおける変異の存在を検出する工程は、当業者に公知の任意の技術から選択され得る。例えば、ｍｔＤＮＡを解析することは、ｍｔＤＮＡの配列決定、ＰＣＲによるｍｔＤＮＡの増幅、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノザンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンサウス−ウエスタンブロットハイブリダイゼーション、変性ＨＰＬＣ、マイクロアレイ、バイオチップまたはジーンチップに対するハイブリダイゼーション、分子マーカー解析、バイオセンサー、融点プロファイリング、または上述した解析のいずれかの組合せを含み得る。
【００７８】
一態様において、本発明は、哺乳類におけるＵＶ曝露を検出するための方法を提供する。上記方法は、上記の異常型ミトコンドリアＤＮＡの存在について哺乳類からの組織サンプルをアッセイする工程を含む。本発明はまた、哺乳類からの組織サンプルを少なくとも一つのハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズすることによって、上記サンプルをアッセイする工程を含む方法を提供する。上記プローブは、本明細書中に記載されたような本発明の変異ミトコンドリアＤＮＡ配列に対して生成され得る。
【００７９】
他の態様において、本発明は、上述したような方法を提供する。上記アッセイは、以下を含む：ａ）少なくとも一つのプロ―ブが相補的な異常型ミトコンドリアＤＮＡ配列にハイブリダイズすることを可能にするために本発明の少なくとも一つのプローブを使用するハイブリダイゼーション反応を行う工程；ｂ）上記サンプルにおける上記少なくとも一つの異常型ミトコンドリアＤＮＡ配列の量を、上記少なくとも一つのプローブにハイブリダイズしたミトコンドリアＤＮＡの量を定量することによって定量する工程；およびＣ）上記サンプルにおけるミトコンドリアＤＮＡの量を少なくとも一つの既知の参照値と比較する工程。
【００８０】
当業者に公知のような画像診断アッセイを含む、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を検出、診断またはモニタリングするための方法もまた本発明に含まれる。本発明の診断アッセイは、高スル―プットに容易に適合され得る。高スル―プットアッセイは、多くのサンプルを同時に処理するという利点を提供し、多数のサンプルをスクリーニングするために必要な時間を顕著に減少させる。よって、本発明は、複数の試験サンプルにおける標的ヌクレオチド配列の検出および／または定量のための、高スループットスクリーニングまたは高スループットアッセイにおける本発明のヌクレオチドの使用を企図する。
【００８１】
〔融合転写物〕
本発明の他の態様は、ＵＶ損傷またはＵＶ曝露を予測、診断および／またはモニタリングするための方法に有用な、融合転写物および関連するハイブリダイゼーションプローブの同定である。出願人の同時係属のＰＣＴ出願において開示されているように、上記分子は、天然の転写物の単離を介して、あるいは、本発明の方法に従って単離されるｍｔＤＮＡｓのリコンビナント発現によって、生成され得る。これらのｍｔＤＮＡｓは、典型的には、スプライシングされた遺伝子を含む。上記スプライシングされた遺伝子は、第一の遺伝子に由来する開始コドンおよび第二の遺伝子の終止コドンを有する。よって、スプライシングされた遺伝子から得られた融合転写物は、スプライシングされた遺伝子と関連する結合ポイントを含む。
【００８２】
〔融合転写物の検出〕
天然の融合転写物は、任意の好適な当該分野にて公知の方法に従って、生物学的サンプルから抽出され得、そして同定され得る。または、出願人の同時係属のＰＣＴ出願に記載されている方法に従って処理されてもよい。本発明の一実施形態において、ポリＡテイルを有する転写物を標的化するオリゴ（ｄｔ）プライマーを使用し、続いて標的転写物に対して設計されたプライマー対を使用したＲＴ−ＰＣＲによって、安定的なポリアデニル化した融合転写物が同定される。
【００８３】
以下の例示的な融合転写物が、これらの方法を使用して検出された：
配列番号２２（転写物２；１０７４４：１４１２４）
配列番号３８（転写物２０；８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）。
【００８４】
融合転写物はまた、当該分野にて公知のリコンビナント技術によって生成され得る。典型的には、上記リコンビナント技術は、目的のｍｔＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いる好適な宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、形質導入または感染を含む。）を含む。
【００８５】
〔予期しない融合転写物の検出〕
予期しない特性の融合転写物もまた出願人によって同定されており、本発明の方法に有用であることが証明されている。現在までに、同定された融合転写物の各々が、ミトコンドリアゲノムにおける欠失事象の結果として生じており、新規配列を形成するための２つの遺伝子の融合体を生じ、次いでミトコンドリアによって転写される。対照的に、以下に詳しく記載されている３８９５ｂｐの欠失は、Ｄ−ｌｏｏｐの融合体を生じる。上記融合体はｍｔＤＮＡの非コード領域に位置している。
【００８６】
〔融合転写物と関連した３８９５ｂｐの欠失の検出が予期されない理由〕
ミトコンドリア融合転写物は、その大多数が、隣接している２つの遺伝子または隣接していない２つの遺伝子の間に含まれているヌクレオチドが欠失することによって形成される（上述したゲノムの変異の項および出願人の同時係属のＰＣＴ出願参照）。欠失したＤＮＡの除去の後、ミトコンドリアゲノムの残余物が、次いで、再結合され、新しい遺伝子すなわち転写物を生じる。これまでに記載したように、このスプライシングされた遺伝子は、５’末端側（ｍｏｓｔ）の元々の遺伝子の開始コドン、元々の２つの遺伝子からの遺伝物質の種々の貢献、および３’末端側の遺伝子の元々の終止コドンから構成される。
【００８７】
対照的に、ヌクレオチド５４７−４４４３位の間の遺伝物質の欠失からの融合転写物（転写物３２；配列番号３９）は、予期されない。なぜなら、５’部分が、ミトコンドリアゲノムの非コード置換ループ（Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｌｏｏｐ）(Ｄ−Ｌｏｏｐ)（１６０２４−５７６）内に位置しているからである。この事実にもかかわらず、５４８−４４４位が除去される場合、フレーム２におけるインタクトな読み枠は、３８６−５４７位：４４４３−５５１１位から観察される（図１および２参照）。フレーム１および３は、多くの末端コドンを有し、よって、読み枠を生成し損なう（図２）。
【００８８】
フレーム２の融合転写物の５’部分（ｃｏｎｔｅｎｔ）は、超可変セグメント３（４３８−５７４）内に位置する４７０位の最初のメチオニンにて開始するのでなく、３８６位のプロリンで開始する。上記融合転写物の３’部分は、ｔＲＮＡのメチオニン（４４０２−５５１１）内の４４４３位で開始し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（４４７０−５５１１）の５５１１位にて終止する（図３）。図４は、ミトコンドリアゲノムの５４８−４４４２位の欠失によって形成される、４７０位にて開始する融合転写物が生じたことを示す。
【００８９】
よって、本発明は、種々の内容物を含む融合転写物を含み、すなわち、上記融合転写物が、２つのコード領域のスプライシングされた配列を含み、そして上記融合転写物がスプライシングされたコード領域および非コード領域を含む。
【００９０】
〔ＵＶＲと関連した融合転写物〕
一旦ミトコンドリア融合転写物が同定されると、その配列は、次いで、以下の実施例に記載されるように、ＵＶＲとの関連について試験される。このような試験は、インビボで、すなわち培養された皮膚等価物にて実行され得る。上記皮膚等価物は、増殖され、そして種々のレベルのＵＶＲを照射される（実施例６参照）。これらの配列の発現がまた、一つ以上のハウスキーピング遺伝子に関してモニタリングされ得る、上記ハウスキーピング遺伝子としては、限定されないが、ヒトＰＰＩＢ、ヒトＰＧＫ−１、ヒトＡＣＴＢ（ベータアクチン）、ヒトＧＵＳＢ（ベータグルクロ二ダーゼ）、ヒトＢ２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン）、ヒトＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ヒトＧＡＰＤ （グリセルアルデヒド（ｇｌｙｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヒトＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ヒトＲＰＬＰＯ＝ＬＲＰ（リボソームタンパク質、ラージ（ｌａｒｇｅ）、ＰＯ）、ヒトＨＭＢＳ＝ＰＢＧＤ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ヒトＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ヒトＴＲＦＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７1)、および、ヒトＡＢＣＣ１３（染色体１３ 偽遺伝子）が挙げられる。
【００９１】
本発明の一実施形態において、以下のミトコンドリア融合転写物が、ＵＶ損傷を予測、診断およびモニタリングすることに有用であること、ならびに、ＵＶ損傷の防止または回復に効果的なスキンケア製品を試験およびスクリーニングすることに有用であることが同定されている：
配列番号２２（転写物２；１０７４４：１４１２４）
配列番号２３（転写物３；７９７４：１５４９６）
配列番号３１（転写物１１；７７７５：１３５３２）
配列番号３２（転写物１２；８２１３：１３９９１）
配列番号３８（転写物２０；８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）
配列番号３９（転写物３２；５４７：４４４３）
上記配列に加えて、本発明は、ＵＶ曝露を予測、診断およびモニタリングするための上記配列の改変体または断片の使用を提供する。本明細書中にて同定された融合転写物の改変体または断片は、ゲノム改変体および断片に関して上述されたサイズ制限および同一性パーセントに、または当業者によって好適に決定されるようなサイズ制限および同一性パーセントに、従う。
【００９２】
さらに、本発明の転写物２、３、１１、１２、２０および３２に対応する推定のタンパク質配列が、以下に挙げられる。これらの配列は、仮想の融合タンパク質をコードしており、本発明のさらなる実施形態として提供され、そして本発明の方法に有用であるとみなされるべきである．
配列番号４０（転写物２）
配列番号４１（転写物３）
配列番号４２（転写物１１）
配列番号４３（転写物１２）
配列番号４４（転写物２０）
配列番号４５（転写物３２）。
【００９３】
〔プライマーおよびプローブ〕
一旦融合転写物を特徴付けると、プライマーまたはプローブが、生物学的サンプル中の上記転写物を標的化するように開発され得る。このようなプライマーおよびプローブは、（上述したような）任意の公知の方法を用いて調製されても、または出願人の同時係属のＰＣＴ出願に提供される実施例に示されるように、調製されてもよい。プローブは、例えば、融合転写物に対して作製され得、そして、サンプル中の転写物の存在を検出するために検出技術（例えば、ＰａｎｏｍｉｃｓＴＭによるＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０ＴＭ）が使用され得る。プライマーおよびプローブは、本発明の例示的な融合転写物、または、それらの断片もしくは改変体に対して直接に生成され得る。例えば、配列番号２２、２３、３１、３２、３８および３９に示される配列を使用して、目的の融合配列を含む核酸配列を検出するプローブを設計し得る。
【００９４】
当業者によって理解されるように、本発明の融合転写物にハイブリダイズするために設計されたプローブは、上記転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、好ましくは、上記一部は、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントを発現する。この部分は、上記発現される結合ポイントに対して相補的なヌクレオチドの少なくとも一つを含み、上記一部は、隣接する１個以上の相補的なヌクレオチドをさらに含み得る。この点において、本発明は、任意の好適な標的化メカニズムを含み、上記メカニズムは、スプライシングされた遺伝子の結合ポイントに含まれているかまたは隣接しているヌクレオチドを使用する融合転写物を選択する。
【００９５】
種々のタイプのプローブ、および当該分野において公知の標識化方法が、転写物プローブの調製のために企図される。このようなタイプおよび方法は、ゲノム配列の検出に関して上述されている。本発明の転写プローブは、少なくとも約１５ｎｔの長さであるが好ましく、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔの長さであり、なお好ましくは、少なくとも約３０ｎｔの長さであり、皿により好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さ、少なくとも約５０ｎｔの長さ、少なくとも約７５ｎｔの長さまたは少なくとも約１５０ｎｔの長さである。「少なくとも２０ｎｔの長さ」のプローブは、例えば、２０個以上の連続する塩基を含むことが意図される。上記隣接する塩基は、本発明のｍｔＤＮＡ配列に対して相補的である。もちろん、より大きなプローブ（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）もまた好ましい。
【００９６】
本発明のプローブは、生物学的サンプルにおける核酸分子にもまたハイブリダイズする。したがって、本発明の方法を可能にする。よって、本発明の一態様において、ＵＶ損傷または曝露を検出すること、診断することおよび／またはモニタリングすることにおいての使用のための提供されたハイブリダイゼーションプローブが存在する。上記プローブは、本発明融合転写物の少なくとも一部に対して相補的である。他の一態様において、提供されるプローブおよびその利用方法（または使用の方法）が存在する。上記プローブはＵＶ損または曝露の防止または改善において効果的なスキンケア製品の試験およびスクリーニングのためのものである。
【００９７】
〔アッセイ〕
本発明に従って、疑似太陽光を用いた照射に対して曝露することに続いて新規融合転写物が多量に増加することが実証された（例えば、図６参照）。これらの新規転写物のインビトロおよびインビボの両方での検出は、ＵＶ照射（ＵＶＢおよびＵＶＡの両方）に対する曝露の定量化を可能にする。よって、本発明は、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露を検出、診断またはモニタリングするための方法を含み、上記方法は、一つ以上の生物学的サンプルを得る工程、上記サンプルからミトコンドリアＲＮＡを抽出する工程、および上記サンプルにおける一つ以上の融合転写物の量を定量し、検出された量を参照値と比較することによって融合転写物について上記サンプルをアッセイする工程を含む。
【００９８】
当業者に理解されるように、上記参照値は、上記方法が、ＵＶ損傷およびＵＶ曝露の検出、診断またはモニタリングを要求するか否かに基づく。よって、上記参照値は、一つ以上の既知のＵＶ曝露された生物学的サンプルから、一つ以上の公知のＵＶ曝露されていない生物学的サンプルから、および／または一つ以上の生物学的サンプルから一定の期間にわたって収集された転写物データに関してもよい。上記サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚または血液に由来し得る。上記サンプルは、上述した種々の方法によって採集され得る。
【００９９】
一態様において、本発明は、哺乳類におけるＵＶ曝露を検出するための方法を提供する。上記方法は、上記の融合転写物の存在について哺乳類からの組織サンプルをアッセイする工程を含む。本発明はまた、哺乳類からの組織サンプルを少なくとも一つのハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズすることによって、上記サンプルをアッセイする工程を含む方法を提供する。上記プローブは、本明細書中に記載されたような本発明の融合転写物に対して生成され得る。
【０１００】
他の態様において、本発明は、上述したような方法を提供する。上記アッセイは、以下を含む：ａ）少なくとも一つのプロ―ブが相補的な融合転写物の配列にハイブリダイズすることを可能にするために少なくとも一つのプローブを使用するハイブリダイゼーション反応を行う工程；ｂ）上記サンプルにおける上記少なくとも一つの融合転写物の配列の量を、上記少なくとも一つのプローブにハイブリダイズした融合転写物の配列量を定量することによって定量する工程；およびＣ）上記サンプルにおける上記転写物の量を少なくとも一つの既知の参照値と比較する工程。
【０１０１】
上述したように、本発明の診断アッセイはまた、本明細書中に記載されたような診断方法およびスクリーニングツールを含み得、高スル―プットに対し容易に適合され得る。よって、本発明は、複数の試験サンプルにおける標的ヌクレオチド配列の検出および／または定量のための、高スループットスクリーニングまたは高スループットアッセイにおける本発明の融合転写物および関連するプローブの使用を企図する。
【０１０２】
〔スキンケア製品の試験およびスクリーニング〕
〔新しい処方物〕
特定の活性物質または処方物（例えば、日焼け止め、抗酸化物質または抗加齢の製品）の適用を介した、多くの新規のＵＶ関連融合転写物および関連するｍｔＤＮＡ分子における変化の調節は、ＵＶ照射による損傷から皮膚を保護する際の製品の効力を評価するために使用され得る。このような評価は、皮膚等価物モデルを使用した、新しい処方物のインビトロでの試験の形式（図１０および１１参照）を採用しても、生物学的サンプルを使用した、製品のインビボでの試験（図１２参照）を介した形式を採用してもよい。
【０１０３】
よって、本発明は、以下の工程を実行することによって、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷に対して防止、最小化、回復または保護するスキンケア製品の効力を調製および試験する方法を企図する：所望の特徴（例えば、ＵＶＡフィルターおよび／またはＵＶＢフィルター）を有する製品を調製する工程；スキンケア製品を、患者の皮膚または皮膚等価物モデルに適用する工程；上記皮膚または皮膚等価物モデルをＵＶＲに曝露する工程；太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚から採取したサンプルにおける少なくとも一つのミトコンドリア欠失分子および／または融合転写物の存在を検出する工程；ならびに、上記欠失体すなわち転写物の存在を参照値（例えば、コントロール遺伝子および／または転写物）と比較する工程。コントロール患者または皮膚等価物モデル（スキン製品を受けていないもの）がまた、参照値として使用されてもよい。
【０１０４】
ＵＶ損傷の一つ以上の症状、徴候または特徴において、一過性および長期間の両方における停止、防止、減少または改善は、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷に対する防止、最小化、改善または保護のための新しい製品（処方物）の能力を示す、ということを当業者は理解する。本発明の一実施形態において、以下に提供される実施例にて示されるような製品解析が行われる。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態において、新しい製品を試験するための方法は、ｍｔＤＮＡ欠失体または融合転写物の存在を検出する工程の前に、被験体の皮膚または皮膚等価物モデルを致死線量よりも低い線量の紫外線（ＵＶＲ）に少なくとも１回曝露する工程を含む。さらに、試験する前に、皮膚および皮膚等価物は、一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲ（例えば、毎日のＵＶＲ照射）に曝露され得る。概して、上記ＵＶＲは、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する。ここで、上記ＵＶＲは、ＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む。しかし、本明細書において太陽曝露がまた企図される。コントロール配列（上述したハウスキーピング遺伝子および転写物が挙げられるが、これらに限定されない。）がまた企図される。ｍｔＤＮＡ欠失体および融合転写物マーカーに関する限りでは、記載された方法の最後においてそれらを単独またはタンデムのどちらかによって挿入し得る。
【０１０６】
〔皮膚サンプル〕
患者の皮膚サンプルが、皮膚の真皮層または表皮層から採集され得、以下の方法によって得られてもよい：皮膚組織の微小核を採集するための、パンチ生検法、外科的切除法、および非侵襲的または最小限に侵襲性の皮膚の採集方法（例えば、ウェットスワビング、テープリフト、コットンチップスワビング、滅菌したメスを用いた皮膚のかきとり、木製のスクレーパーを用いた皮膚のかきとり、粘着パッドの接着面（ＣａｐＳｕｒｅＴＭＣｌｅａｎ−ｕｐ Ｐａｄ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からのフィルム、ＬＣＭ ＭａｃｒｏＣａｐＴＭ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）からの加熱フィルム、および小さなゲージ（例えば、２８ゲージ）の針の使用）。サンプルは、供給源から得られたまま直接的に用いられても、サンプルの特性を改変させる前処理に続いて用いられてもよい。よって、皮膚サンプルは、使用する前に、例えば、保存薬、試薬などを用いて前処理され得る。
【０１０７】
一つよりも多い採集技術が同時に使用され得ることは当業者に明らかである。さらに、採集の経過が、例えば、一定の期間にわたって製品のモニタリングに必要とされる場合、同一または異なる技術が、試験期間を通して単独または一緒に使用され得る。これに関して、皮膚の採集が、一度だけ、または規則的な間隔にて（例えば、１日毎、１週毎または１月毎に）行われ得る。
【０１０８】
〔皮膚等価物モデル〕
出願人はまた、皮膚等価物モデルを使用した、スキンケア製品をインビトロで試験するための新規システムを開発している。これらのモデルは、例えば、実施例２に記載されるように生成され、そして増殖され、続いて、上記モデルは、スキンケア製品を用いて処理され、種々の変化量のＵＶＲによって照射される。試験されるべき製品は、皮膚等価物の表面に単純にアプライされ（例えば、２ｍｇ/ｃｍ2の濃度にて）、そして細胞の表面にわたって均一に広げられる。皮膚等価物は、疑似太陽の下に配置され、一つ以上のＵＶ光の照射に曝露される。照射は、個々の実験設定および試験されるべき製品に依存する。しかし、典型的な照射レジメンのいくつかの例が、以下の表１および２に提供される。
【０１０９】
〔製品のスクリーニングおよび個別のスキンケア〕
融合転写物および関連ｍｔＤＮＡ欠失体の発生に対して保護するためのスキンケア製品の能力に対するデータの収集を介して、日焼け防止および抗加齢に関してより効果的な製品が開発され得る。なお、つい最近まで、太陽への曝露の間に個人によって定期的に適用される日焼け止めおよび日焼け止めクリーム（ｓｕｎｂｌｏｃｋ）は、概して、ＵＶＢの変異誘発効果に対して保護されるが、ＵＶＡ照射の有害な効果に指向される因子を含んでいなかった。よって、スキンケア製品の標的になるスクリーニングは、それらのＵＶＡ照射およびＵＶＢ照射の両方に対して保護し得る製品を同定する際に役立つ。
【０１１０】
これらの要素はとりわけ、市場に入る新しい製品の効力を測定すること、ならびに、研究の経過を介して、皮膚に対するＵＶＲ損傷を防止するための現行の測定の成功および適合性をモニタリングすることの両方を目的としたツールの利用可能性を必要とする。製品を適用し規則的な間隔でＵＶＲを照射した後に皮膚サンプルを採取することによって、患者の皮膚および皮膚等価物モデルにおいてミトコンドリＤＮＡ欠失体のレベルを測定することは、ＤＮＡおよび皮膚損傷の防止に対する上記製品の効力を決定することを補助し得る。上記ＤＮＡおよび皮膚の損傷は、関連する光老化および皮膚癌を含む。
【０１１１】
本発明の方法はまた、医療目的および化粧目的の両方のための、広く行きわたった皮膚スクリーニングに使用され得る。例えば、任意の時点での、外側の解剖学的な任意の位置からのＵＶ照射に起因する、被験体の皮膚におけるＤＮＡ損傷のレベルを評価するための能力は、現存するスキンケア製品および新しいスキンケア製品、ならびに所定の被験体に対するスキンケアレジメンの、安全性および効力を評価するために、独特かつ有益なスクリーニング試験のための基礎を提供する。さらに、ＵＶ曝露と関連した特定の遺伝子変化を同定することによって、特定のスキンケア製品またはレジメンが提供されるべきか否か、そしてどの程度提供されるべきかが、容易に決定され得る。
【０１１２】
すでに市場にあるスキンケア製品について、本発明の方法は、ＵＶ曝露またはＵＶ損傷に対して防止、最小化、回復または保護するための、それらのスキンケア製品の能力を測定するための因子をスクリーニングすることを助ける。これは、熟練者または消費者が、それらの特定のスキンケアにおける要求性にどの商品が最も適しているのかを評価することを可能にする。本発明の方法によってスクリーニングされる製品としては、限定されないが、日焼け止め、ならびに、抗加齢の血清およびクリームが挙げられ、ペアにて、あるいは３つ以上の製品のバッチにて評価され得る。新しい処方物、または以下の実施例に詳述されているようなものを試験するためのスクリーニング方法が、上述されるように実行され得る。
【０１１３】
〔キット〕
本発明は、被験体のＵＶ曝露を検出またはモニタリングするための診断キットを提供する。本発明に従う一つ以上のプライマーもしくはプローブの組合せにおいて、上記キットは、一つ以上のサンプリング手段を備えてもよい。このようなキットはまた、その内容物を使用するための指示書を備え得る。
【０１１４】
上記キットは、必要に応じて、診断アッセイを行うために必要な試薬（例えば、緩衝液、塩、検出試薬など）を備える。他の構成要素（例えば、生物学的サンプルの単離および／または処理のための溶液）がまた、上記キットに備えられ得る。上記キットの一つ以上の構成要素は、凍結乾燥されていてもよく、凍結乾燥された構成要素の再構築に好適な試薬をさらに備えていてもよい。
【０１１５】
場合によっては、上記キットはまた、反応容器、混合容器、および試験サンプルの調製を容易にする他の構成要素を備えていてもよい。上記キットはまた、必要に応じて、使用のための指示書を備えていてもよく、上記指示書は、紙形態出提供されても、コンピュータ読取り可能な形態（例えば、ディスク、ＣＤ、ＤＶＤなど）で提供されてもよい。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、ＵＶ曝露を診断するためのキットが提供される。上記キットは、サンプリング手段および本発明のプローブまたはプライマーを備える。
【０１１７】
本明細書中に記載された本発明をより良く理解するために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態を記載することが意図され、本発明の範囲を限定することが決して意図されていない、ということが理解される。
【０１１８】
〔実施例〕
〔実施例１：ＨｐＥＫｐ細胞の増殖〕
〔材料〕
１．ＨｐＥＫｐ細胞＜１５継代（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
２．Ｔ７５組織培養フラスコ（ＩＷＡＫＩ）
３．ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ（１２５６３−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
４．１０ｍｌ滅菌Ｓｔｒｉｐｅｔｔｅｓ（Ｓｔａｒ Ｌａｂｓ）
５．自動ピペッター
６．倒立ＴＣ顕微鏡
７．滅菌１５ｍｌファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）
８．クラス２組織培養キャビネット（３７℃、５％ＣＯ２）（Ｂｉｎｄｅｒ）
９．ウォーターバス（３７℃）
１０．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
１１．ＰＣＭ完全培地（ＣｎＴ−５７）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）。
【０１１９】
〔プロトコル〕
１．ＨｐＥＫｐ細胞（９０％コンフルエンス）のフラスコからＣｎＴ−５７培地を除去する
２．滅菌ＰＢＳ（２ｍｌ）を用いて細胞を洗浄する。吸引オフ
３．細胞を覆うために、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔを１フラスコ当たり１．５ｍｌ加える
４．細胞が剥離するまで、２〜３分間インキュベーターに戻して静置する（顕微鏡を用いて確認する。）
５．細胞を再懸濁するために、５ｍｌのＣｎＴ−５７培地中で細胞を再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
６．１６０×ｇで５分間細胞をスピンする
７．培地を除去し、新鮮なＣｎＴ−５７培地５ｍｌ中で再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
８．細胞を計数するために２０μｌの細胞懸濁液を移す
９．細胞を希釈し、４×１０３細胞／ｃｍ２の濃度にて播種する
１０．３７℃および５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターの中にフラスコを置く
１１．２〜３日毎に１５ｍｌのＣｎＴ−５７培地を用いて給餌することによって細胞を維持する
１２．９０％コンフルエントまで増殖させ、次いで再び継代する。
【０１２０】
〔実施例２：表皮性の皮膚等価物の生成〕
〔材料〕
１．９０％コンフルエントにまで増殖させたＨｐＥＫｐ細胞＜１５継代（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）（実施例１参照）
２．Ｔ７５組織培養フラスコ（ＩＷＡＫＩ）
３．ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ（１２５６３−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
４．１０ｍｌ滅菌Ｓｔｒｉｐｅｔｔｅｓ（Ｓｔａｒ Ｌａｂｓ）
５．自動ピペッター
６．倒立ＴＣ顕微鏡
７．滅菌１５ｍｌファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）
８．６ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
９．Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＰＣＦ ０．４ μｍ Ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
１０．ＲａｐｉＤｉｆｆ ＩＩ ｓｔａｉｎ Ｐａｃｋ （ＢｉｏＳｔａｉｎ）
１１．２４ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
１２．クラス２組織培養キャビネット（３７℃、５％ＣＯ２）（Ｂｉｎｄｅｒ）
１３．ウォーターバス（３７℃）
１４．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
１５．滅菌ピンセット
１６．ＰＣＭ完全培地（ＣｎＴ−５７）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
１７．３Ｄ−Ｐｒｉｍｅ完全培地（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）。
【０１２１】
〔プロトコル〕
１．４つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＰＣＦ ０．４μｍ １２ｍｍ インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ♯：ＰＩＨＰ０１２５０）を、６ウエル培養プレートの各ウエル内に置き、実験に必要な数をプレートアウト（ｐｌａｔｉｎｇ ｏｕｔ）する。予備インサートを２つ準備する（コンフルエンシーをモニタリングするため−ステップ１５）
２．ＨｐＥＫｐ細胞のフラスコからＣｎＴ−５７培地を除去する
３．滅菌ＰＢＳ（２ｍｌ）を用いて細胞を洗浄する。吸引オフ
４．細胞を覆うために、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔを１フラスコ当たり１．５ｍｌ加える
５．細胞が剥離するまで、２〜３分間インキュベーターに戻して静置する（顕微鏡を用いて確認する。）
６．細胞を再懸濁するために、５ｍｌのＣｎＴ−５７培地中で細胞を再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
７．１６０×ｇで５分間細胞をスピンする
８．培地を除去し、新鮮なＣｎＴ−５７培地５ｍｌ中で再懸濁する。２、３回激しくピペッティングする
９．細胞を計数するために２０μｌの細胞懸濁液を移す
１０．５×１０５細胞／ｍｌの濃度に細胞を希釈する
１１．インサート１つ当たりに、４００μｌのＣｎＴ−５７（またはＣｎＴ−０７）中にて２×１０５個の細胞を添加する
１２．インサートの内側および外側の培地のレベルが等しくなりかつ細胞を埋もれるように、インサートの外側（プレートのウエル内）に適量（約２ｍｌ）のＣｎＴ−５７を添加する；上記膜の底部に、気泡が閉じ込められていないことを確認する
１３．３７℃および５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターの中にインサートを置く
１４．２〜３日間細胞を増殖させる
１５．ＲＡＰＩ−ＤＩＦＦ ＩＩ染色を用いて一つの予備インサートを染色する
１６．単層がコンフルエントの場合、ステップ１７に進む。そうでなければ、残存しているインサートにおいて培地を交換し、さらに１日間培養し、次いで、第２の予備インサートを用いて別の染色を行う
１７．インサートの内側および外側の培養培地を３Ｄ 培地（ＣｎＴ−０２−３ＤＰ）に取り換える（播種した時と同量、ステップ１２）
１８．細胞が細胞間接着構造を形成することを可能にするために、インキュベーターの中にインサートを一晩（１５−１６ｈ）置く。
【０１２２】
１９．インサートの内側から全ての培地を吸引することによって３Ｄ培養を開始し、２４ウエルプレートの個々のウエルに置く。（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）外側培地を加える（２５０μｌ）
２０．経時的な検討を行う場合、インサートを同一プレートに残して、おいて２〜３日毎に培地交換をしてもよい。放射線照射処理を開始する前に、乾燥雰囲気下において１４日間細胞を増殖させる。
【０１２３】
〔実施例３：表皮性の皮膚等価物の放射線照射−ＵＶＡ照射〕
〔材料〕
１．Ｏｒｉｅｌ １０００Ｗ ＵＶ Ｓｏｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．）
２．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．−８１０１７）
３．Ｖｉｓ ＩＲフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ ｃｏｒｐ−８７０６６）
４．ＰＥＴＧフィルター（ＲＶＩ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ）
５．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ ＵＶＡ 光線療法放射計（Ａｂｌｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−ＩＬ１４０２）
６．表皮性の皮膚等価物（実施例２参照）
７．３Ｄ−Ｐｒｉｍｅ完全培地（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
８．２４ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
９．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
１０．滅菌ピンセットおよびメス。
【０１２４】
〔使用したＵＶスペクトル（疑似太陽）〕
Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター＋Ｖｉｓ ＩＲフィルター＋ＰＥＴＧフィルター：図１５に示すように。
【０１２５】
〔手順〕
１．実施例２に示したように、皮膚等価物を作製しそして増殖させる。
【０１２６】
２．１４日間の乾燥雰囲気下での増殖の後に、上記ＳＥを放射線照射／処理するために準備する
３．皮膚等価物を増殖培地から移し、新しい２４ウエルプレート内に配置する。上記２４ウエルプレートは２００μｌの滅菌ＰＢＳを含む
４．必要であれば、試験されるべき製品を、２ｍｇ／ｃｍ２の濃度（または任意の特定の濃度）にて上記皮膚等価物の表面にアプライする。上記製品を曲がった２００μｌの滅菌ピペットチップを用いてアプライし、表面にわたって均等に広げる
５．皮膚等価物を準備したら直ちに、ＵＶ光に対する曝露の前に、それら皮膚等価物をインキュベーター内へ戻して、２０分間静置する
６．疑似太陽を点灯し、処理の前に１０分間暖めておく。放射計を用いてＵＶ出力を測定し、上記強度を用いて曝露に必要な時間を算出する
７．上記皮膚等価物を疑似太陽下に置き、（実験上の要求に応じて上記６にて計算されるような）Ｘ ＳＥＤのＵＶ光に曝露する
８．曝露に続いて、上記皮膚等価物を３Ｄ培地中に再度配置し、インキュベーター内へ戻す
９．放射線照射は個々の実験の設定に依存する。いくつかの例を表１に示す
１０．ＳＥへの放射線照射に続いて、ＳＥを３Ｄ培地から移し、抽出の前に−８０℃にて保存する。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
〔実施例４：表皮性の皮膚等価物の放射線照射−疑似太陽光〕
〔材料〕
１． １．Ｏｒｉｅｌ １０００Ｗ ＵＶ Ｓｏｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．）
２．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．−８１０１７）
３．Ｖｉｓ ＩＲフィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ ｃｏｒｐ−８７０６６）
４．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ ＵＶＡ 光線療法放射計（Ａｂｌｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−ＩＬ１４０２）
５．表皮性の皮膚等価物（実施例２参照）
６．３Ｄ−Ｐｒｉｍｅ完全培地（ＣＮＴ−０２−３ＤＰ）（ＣｅｌｌｎＴｅｃ）
７．２４ウエル培養プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
８．滅菌リン酸緩衝化生理食塩水
９．滅菌ピンセットおよびメス。
【０１２９】
〔使用したＵＶスペクトル（疑似太陽）〕
Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎフィルター＋Ｖｉｓ ＩＲフィルター：図１６に示すように。
【０１３０】
〔手順〕
１．実施例２に示したように、皮膚等価物を作製しそして増殖させる
２．１４日間の乾燥雰囲気下での増殖の後に、上記ＳＥを放射線照射／処理するために準備する
３．皮膚等価物を増殖培地から移し、新しい２４ウエルプレート内に配置する。上記２４ウエルプレートは２００μｌの滅菌ＰＢＳを含む
４．必要であれば、試験されるべき製品を、２ｍｇ／ｃｍ２の濃度（または任意の特定の濃度）にて上記皮膚等価物の表面にアプライする。上記製品を曲がった２００μｌの滅菌ピペットチップを用いてアプライし、表面にわたって均等に広げる
５．皮膚等価物を準備したら直ちに、ＵＶ光に対する曝露の前に、それら皮膚等価物をインキュベーター内へ戻して、２０分間静置する
６．疑似太陽を点灯し、処理の前に１０分間暖めておく。放射計を用いてＵＶ出力を測定し、上記強度を用いて曝露に必要な時間を算出する
７．上記皮膚等価物を疑似太陽下に置き、（実験上の要求に応じて上記６にて計算されるような）Ｘ ＳＥＤのＵＶ光に曝露する
８．曝露に続いて、上記皮膚等価物を３Ｄ培地中に再度配置し、インキュベーター内へ戻す
９．放射線照射は個々の実験の設定に依存する。いくつかの例を表１に示す
１０．ＳＥへの放射線線量に続いて、ＳＥを３Ｄ培地から移し、抽出の前に−８０℃にて保存する。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
〔実施例５：インビボでのＵＶＲ線量応答〕
種々のレベルのＵＶＲを用いて放射線照射を行い、次いで、拭き取って皮膚サンプルを収集することによって、個体に対するインビボでの試験を行った。図５を参照して、ＳＥＤは標準的な紅斑線量（ｅｒｙｔｈｅｍａｌ ｄｏｓｅ）をいう。上記線量は、紅斑（または皮膚の発赤）を生じさせるために必要とされるＵＶＲの量である。図５Ａは、３．０ ＳＥＤまでのＵＶＲ照射に続く皮膚拭取りサンプルにおける定量的リアルタイムＰＣＲによって行われた、ｍｔＤＮＡ欠失体の解析についての線量応答の結果を示す。この実験は、紅斑が生じ始める時点まで、漸増量のＵＶＲの線量を用いて、ＵＶＲ誘導性のｍｔＤＮＡ損傷が増加することを実証する。紅斑が生じ始める時点で、おそらく紅斑組織における増加したレベルのアポトーシスに起因して、サンプルにおけるｍｔＤＮＡ損傷は低下する。このことは、皮膚に対する長期間にわたる損傷の観点で、それが紅斑線量よりも低い線量であることを示し、この線量は、皮膚において観察されるｍｔＤＮＡの長期間にわたる損傷を生成する。図５Ｂに示すように、損傷における変化度（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を算出する。
【０１３３】
〔実施例６：ＵＶ曝露と関連した融合転写物の同定〕
培養した皮膚等価物を増殖させ、上記の実施例に記載したような疑似太陽を使用した種々のレベルのＵＶＲを用いて照射した。
【０１３４】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｋｉｔ：Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＱＳ０１００）およびｔｈｅ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＱＳ０００８）の製造業者のプロトコルに従いサンプルを処理した。詳細には、３００μｌの希釈した溶解混合液を皮膚等価物の各々に加え、その後、上記皮膚等価物を５０℃にて１．５時間または細胞の膜が完全に溶解されている外観を細胞が呈するまで、インキュベートした。各々を１：１０に希釈し、プロトコルの残りを実行し、ハウスキーパーとしてＡＣＢＴベータアクチンを用いて融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２を標的化した。全ての転写物について、各サンプルを三連にてアッセイし、各サンプル／転写物のペアについて、テンプレートのないバックグラウンドを設けた。
【０１３５】
図６〜９を参照して、０．５ ＳＥＤおよび１．０ ＳＥＤを、種々の回数の反復性の照射（０×、１５×、１８×、２１×、２４×、２７×）での本実験の目的のために使用した。明確に記載すると、１．０ ＳＥＤ ２７×に曝露されたこれらの皮膚等価物が、最大のレベルのＵＶＲを受けた。
【０１３６】
これらの結果は、試験された融合転写物の各々が、反復性の放射線照射を増やす場合およびＵＶＲ曝露との関連を示す０．５ ＳＥＤ〜１．０ ＳＥＤの場合の両方にて、量的に増加したことを実証する。
【０１３７】
〔実施例７：製品の処方および試験〕
異なるレベルのＵＶＡフィルターの３つのブラインド処方物を２ｍｇ／ｃｍ２にて試験した。各処方物のサンプルを、１４日間経過した皮膚等価物に対して、ＵＶＡおよび疑似太陽光源の両方を用いて試験した。同時に、上記サンプルをｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験した。サイバーグリーン（ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ）定量的リアルタイムＰＣＲによって欠失解析を行った。
【０１３８】
実験に用いる所望物を、標準的な化粧用成分から構成される化粧用の化粧用ローションエマルションにて、調製した。各製品は、一定のレベルのＵＶＢフィルターを含むが、ＵＶＡフィルターのレベルを以下のように変化させた。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
図１０は、処方物（Ａ、ＢまたはＣ）の適用に続く、ＵＶＡ（図１０）および疑似太陽光（図１１）に曝露したインビトロのサンプルに対するＰＣＲ解析の結果を示す。図１２に、処方物のインビボ試験に続く結果を提供する。これらのデータは、疑似太陽光からのＵＶＲ損傷の多因子的性質を示し、ＵＶＡのみの曝露を用いて分離した時、損傷レベルは、日焼け止めによって与えられたＵＶＡ保護の割合に追従する。しかしながら、疑似太陽光において曝露がＵＶＡのＵＶＲおよびＵＶＢのＵＶＲの両方を結合させた場合、サンプル間の損傷率は変化する。サンプルＡおよびＢについては、ＵＶＡフィルターの欠如および疑似太陽光におけるＵＶＢの併用は、紅斑の閾値を超える損傷を受けているので（前出の００１２１）、Ａが予想よりも高いというよりもむしろ、Ｂが予想よりも低いのかもしれない。このことは、上記サンプルにおいて、より少ない損傷が記録されたことを意味する。
【０１４１】
これらの結果はまた、この化合物において、欠失のレベルによって示されているような損傷のレベルとＵＶＡフィルターの量との間に逆相関関係が存在していることを実証する。明確に記載すると、化合物ＢのようなＵＶＡフィルターの欠失は、より高いレベルの欠失を生じる。
【０１４２】
〔実施例８：日焼け止めおよび抗加齢の商品のスクリーニング〕
ＵＶＡ光に対する反復性の曝露の前に、種々の日焼け止めおよび抗加齢の製品のサンプルを２ｍｇ／ｃｍ２にてアプライした。日焼け止め剤のパネルは、ＵＫ／北アメリカのトップブランドからのｓｐｆ １５の製品を含んでいた。抗加齢の製品は、多くのトップブランドからの広範なナイトクリーム／血清を含んでいた（図１３）。上記結果は、全ての製品が同じＳＰＦ規格を有するにもかかわらず（１５）、ＵＶＡおよび疑似太陽ＵＶＲの両方を用いた放射線照射に続く、これらの製品によって与えられる保護レベルがかなり変動したことを示す。これは、ｍｔＤＮＡ損傷において（ＳＰＦ規格によって測定される）ＵＶＢ曝露の要素（例えば、ＵＶＡ保護および抗酸化活性）が重要であるので、日焼け止めによって与えられたＵＶＲ保護の効力を評価するためにはＳＰＦ単独では不十分であることを示唆する。抗加齢の製品は、多くのトップブランドからの広範なナイトクリーム／血清を含んでいた（図１４）。これらのデータは、高加齢型の製品によって与えられる保護において、ｍｔＤＮＡに関するかぎりで、顕著な変量が存在することを示す。これらの製品の多くは、これらの主な活性成分として抗酸化化合物を含み、このことは、ｍｔＤＮＡ損傷の測定が、上述した処方物、さらに、個々の活性成分を効果的であるものと、保護をほとんどもしくは全く示さないものとの間で差別化し得ることを示す。
【０１４３】
本発明は、いくつかの特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の目的および範囲を逸脱することなく、本明細書に添付の特許請求の範囲で述べるような上記実施形態の種々改変が、当業者に明白である。本明細書中に提供される任意の実施例は、単に本発明を例示する目的のために含まれており、本発明を限定することを決して意図するものでない。本明細書とともに提供される任意の図面は、単に本発明の種々の態様を例示するための目的であり、本発明を縮小するまたは限定することを決して意図するものでない。本明細書中に挙げられた全ての先行技術の開示は、それらの全てが参考として本明細書にて援用される。
【０１４４】
〔引用文献〕
以下の参考文献が、他にも文献は存在するが、これまでの記載の中で引用された。これらの参考文献の内容の全体が、本明細書に対する参照の目的で、本明細書にて援用される。
【０１４５】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後の、３８６〜５４７位：４４４３〜５５１１位からのフレーム２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去後に生成される読み枠を示す図である。ヌクレオチド３８２は赤い四角によって示されている。上記赤い四角は、ミトコンドリアゲノムの１位に関する読み枠２の開始を特定している。
【図３】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の除去によって形成されるフレーム２融合転写物の寄与配列を示す図である。
【図４】ヌクレオチド５４８〜４４４２位の欠失による融合転写物形態の最終アミノ酸配列を示す図である。上記配列は、ミトコンドリアゲノムの、再結合したヌクレオチド４７０〜５４７位および４４４３〜５５１１位を含む。
【図５Ａ】は、ｍｔＤＮＡ欠失体解析を使用したインビボでのＵＶＲ線量応答を示す図である。
【図５Ｂ】は、ＵＶ損傷を測定するためのサンプルの計算を示す図である。
【図６】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図７】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図８】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図９】皮膚等価物における、ＵＶ照射に続く本発明の融合転写物２、３、１１、１２、２０および３２の発現を示す図である。
【図１０】３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す図である。
【図１１】３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す図である。
【図１２】３つのＵＶ処方物のインビボ実験およびインビトロ試験を示す図である。
【図１３】ＵＶ曝露に続く種々の日焼け止めおよび抗加齢銘柄のスクリーニングを示す図である。
【図１４】種々の日焼け止め商品および抗加齢商品の、ＵＶ曝露に続くスクリーニングを示す図である。
【図１５】実施例３の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す図である。
【図１６】実施例４の疑似太陽照射のために使用されるＵＶスペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ曝露と関連した、単離されたミトコンドリア融合転写物。
【請求項２】
上記転写物は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項１に記載の融合転写物。
【請求項３】
上記転写物は、配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項１に記載の融合転写物。
【請求項４】
生物学的サンプルにおける紫外線（ＵＶＲ）の曝露を検出またはモニタリングするための方法であって、上記生物学的サンプルにおけるミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程を含み、上記転写物はＵＶＲの曝露と関連している、方法。
【請求項５】
上記生物学的サンプルが被験体から採取された皮膚サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記生物学的サンプルが組織培養サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記皮膚サンプルが上記被験体の表皮層から採取される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記融合転写物の存在を検出する工程の前に、致死線量よりも低い線量の紫外線（ＵＶＲ）に少なくとも１回上記サンプルを曝露する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに上記生物学的サンプルを曝露する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記一連の反復性の、致死線量よりも低い線量が、上記生物学的サンプルを毎日のＵＶＲ照射に曝露することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＵＶＲが、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する、請求項８から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＵＶＲがＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む、請求項８から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記転写物は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項４から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記転写物が配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験体から得られた生物学的サンプルにおけるＵＶ曝露に関連するミトコンドリア融合転写物の存在を一定期間にわたって検出する工程を含む、被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法。
【請求項１６】
上記サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的サンプルにおける上記転写物の存在を、生物学的な参照サンプルにおける転写物の存在と、またはコントロール転写物と比較する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記生物参照サンプルが、めったに太陽に曝露しない皮膚サンプル、時折太陽に曝露した皮膚サンプル、常々太陽に曝露した皮膚サンプルまたは血液を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＵＶ曝露の検出のための、またはＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしての、融合転写物の使用。
【請求項２０】
ＵＶ曝露を検出するためのキットであって、上記キットは、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列の一部に対して実質的に相補的な配列を有するプローブを備えている、キット。
【請求項２１】
生物学的サンプルのヒトｍｔＤＮＡゲノムにおいて欠失を検出するための方法であって、上記欠失はＵＶ曝露に関連しており、上記方法は、上記生物学的サンプルにおけるｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程を含み、上記ｍｔＤＮＡ欠失分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸を有する、方法。
【請求項２２】
上記生物学的サンプルが被験体から採取された皮膚サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記生物学的サンプルが組織培養サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記皮膚サンプルが上記被験体の表皮層から採取される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記方法は、ＵＶ曝露を検出またはモニタリングするために使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程の前に、致死線量よりも低い線量の紫外線（ＵＶＲ）に少なくとも１回上記サンプルを曝露する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
上記生物学的サンプルが、一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに曝露される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記一連が、上記生物学的サンプルを毎日のＵＶＲ照射に曝露する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項２９】
上記ＵＶＲが、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する、請求項２６から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
上記ＵＶＲがＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む、請求項２６から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＵＶ曝露と関連した、単離されたｍｔＤＮＡ欠失分子であって、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸を有する、ｍｔＤＮＡ欠失分子。
【請求項３２】
被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法であって、被験体から得られた生物学的サンプルにおけるＵＶ曝露に関連するｍｔＤＮＡでの欠失の存在を一定期間にわたって検出する工程を含み、上記欠失が、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸配列を有する、方法。
【請求項３３】
上記生物学的サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記生物学的サンプルにおける上記欠失の存在を、生物学的な参照サンプルにおける上記欠失の存在と、またはコントロール配列と比較する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記生物学的な参照サンプルが、太陽にまれに曝露される皮膚サンプル、太陽に時折曝露される皮膚サンプル、太陽にたいてい曝露される皮膚サンプル、および血液を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＵＶ曝露を検出するための、またはＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしての、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸配列を有するｍｔＤＮＡ欠失体の、使用。
【請求項３７】
ＵＶ曝露、ＵＶ損傷、皮膚の加齢または光老化に対する防止、最小化、回復または保護におけるスキンケア製品の能力を試験またはスクリーニングするための方法であって、上記方法は以下の工程：
（ａ）上記スキンケア製品を試験サンプルに適用する工程であって、上記試験サンプルが皮膚または皮膚等価物を含む、工程；
（ｂ）上記試験サンプルを紫外線（ＵＶＲ）に曝曝する工程;
（ｃ）上記試験サンプルにおける以下の（ｉ）または（ｉｉ）の存在を検出する工程：
（ｉ）ＵＶ曝露に関連するミトコンドリア融合転写物；または
（ｉｉ）ＵＶ曝露に関連し、かつ配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９または配列番号２０に対応する核酸配列を有する、ｍｔＤＮＡ欠失分子；および
（ｅ）上記検出する工程の結果を参照値と比較する工程
を含む、方法。
【請求項３８】
上記融合転写物または上記ｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程の前に、上記試験サンプルが、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに少なくとも１回曝露される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記試験サンプルが、一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに曝露される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲが、上記試験サンプルを毎日のＵＶＲに曝露する工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記ＵＶＲが、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する、請求項３８から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
上記ＵＶＲがＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む、請求項３８から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
上記ミトコンドリア融合転写物が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項３７から４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
上記参照値が、コントロール、または別のスキンケア製品において検出された値である、請求項３７から４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１】
ＵＶ曝露と関連した、単離されたミトコンドリア融合転写物。
【請求項２】
上記転写物は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項１に記載の融合転写物。
【請求項３】
上記転写物は、配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項１に記載の融合転写物。
【請求項４】
生物学的サンプルにおける紫外線（ＵＶＲ）の曝露を検出またはモニタリングするための方法であって、上記生物学的サンプルにおけるミトコンドリア融合転写物の存在を検出する工程を含み、上記転写物はＵＶＲの曝露と関連している、方法。
【請求項５】
上記生物学的サンプルが被験体から採取された皮膚サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記生物学的サンプルが組織培養サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記皮膚サンプルが上記被験体の表皮層から採取される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記融合転写物の存在を検出する工程の前に、致死線量よりも低い線量の紫外線（ＵＶＲ）に少なくとも１回上記サンプルを曝露する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに上記生物学的サンプルを曝露する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記一連の反復性の、致死線量よりも低い線量が、上記生物学的サンプルを毎日のＵＶＲ照射に曝露することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＵＶＲが、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する、請求項８から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＵＶＲがＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む、請求項８から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記転写物は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項４から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記転写物が配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験体から得られた生物学的サンプルにおけるＵＶ曝露に関連するミトコンドリア融合転写物の存在を一定期間にわたって検出する工程を含む、被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法。
【請求項１６】
上記サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的サンプルにおける上記転写物の存在を、生物学的な参照サンプルにおける転写物の存在と、またはコントロール転写物と比較する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記生物参照サンプルが、めったに太陽に曝露しない皮膚サンプル、時折太陽に曝露した皮膚サンプル、常々太陽に曝露した皮膚サンプルまたは血液を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＵＶ曝露の検出のための、またはＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしての、融合転写物の使用。
【請求項２０】
ＵＶ曝露を検出するためのキットであって、上記キットは、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列の一部に対して実質的に相補的な配列を有するプローブを備えている、キット。
【請求項２１】
生物学的サンプルのヒトｍｔＤＮＡゲノムにおいて欠失を検出するための方法であって、上記欠失はＵＶ曝露に関連しており、上記方法は、上記生物学的サンプルにおけるｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程を含み、上記ｍｔＤＮＡ欠失分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸を有する、方法。
【請求項２２】
上記生物学的サンプルが被験体から採取された皮膚サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記生物学的サンプルが組織培養サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記皮膚サンプルが上記被験体の表皮層から採取される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記方法は、ＵＶ曝露を検出またはモニタリングするために使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程の前に、致死線量よりも低い線量の紫外線（ＵＶＲ）に少なくとも１回上記サンプルを曝露する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
上記生物学的サンプルが、一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに曝露される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記一連が、上記生物学的サンプルを毎日のＵＶＲ照射に曝露する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項２９】
上記ＵＶＲが、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する、請求項２６から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
上記ＵＶＲがＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む、請求項２６から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＵＶ曝露と関連した、単離されたｍｔＤＮＡ欠失分子であって、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸を有する、ｍｔＤＮＡ欠失分子。
【請求項３２】
被験体における累積のＵＶ曝露を測定するための方法であって、被験体から得られた生物学的サンプルにおけるＵＶ曝露に関連するｍｔＤＮＡでの欠失の存在を一定期間にわたって検出する工程を含み、上記欠失が、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸配列を有する、方法。
【請求項３３】
上記生物学的サンプルは、太陽にまれに曝露される皮膚、太陽に時折曝露される皮膚、または太陽にたいてい曝露される皮膚由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記生物学的サンプルにおける上記欠失の存在を、生物学的な参照サンプルにおける上記欠失の存在と、またはコントロール配列と比較する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記生物学的な参照サンプルが、太陽にまれに曝露される皮膚サンプル、太陽に時折曝露される皮膚サンプル、太陽にたいてい曝露される皮膚サンプル、および血液を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＵＶ曝露を検出するための、またはＵＶ曝露に対するバイオマーカーとしての、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１９に対応する核酸配列を有するｍｔＤＮＡ欠失体の、使用。
【請求項３７】
ＵＶ曝露、ＵＶ損傷、皮膚の加齢または光老化に対する防止、最小化、回復または保護におけるスキンケア製品の能力を試験またはスクリーニングするための方法であって、上記方法は以下の工程：
（ａ）上記スキンケア製品を試験サンプルに適用する工程であって、上記試験サンプルが皮膚または皮膚等価物を含む、工程；
（ｂ）上記試験サンプルを紫外線（ＵＶＲ）に曝曝する工程;
（ｃ）上記試験サンプルにおける以下の（ｉ）または（ｉｉ）の存在を検出する工程：
（ｉ）ＵＶ曝露に関連するミトコンドリア融合転写物；または
（ｉｉ）ＵＶ曝露に関連し、かつ配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９または配列番号２０に対応する核酸配列を有する、ｍｔＤＮＡ欠失分子；および
（ｅ）上記検出する工程の結果を参照値と比較する工程
を含む、方法。
【請求項３８】
上記融合転写物または上記ｍｔＤＮＡ欠失分子の存在を検出する工程の前に、上記試験サンプルが、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに少なくとも１回曝露される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記試験サンプルが、一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲに曝露される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記一連の反復性の、致死線量よりも低い線量のＵＶＲが、上記試験サンプルを毎日のＵＶＲに曝露する工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記ＵＶＲが、疑似太陽のＵＶＲ光源に由来する、請求項３８から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
上記ＵＶＲがＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ／ＵＶＢを含む、請求項３８から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
上記ミトコンドリア融合転写物が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３８または配列番号３９に対応する核酸配列を有する、請求項３７から４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
上記参照値が、コントロール、または別のスキンケア製品において検出された値である、請求項３７から４３の何れか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１３−５２０９６５（Ｐ２０１３−５２０９６５Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５２６６（Ｐ２０１２−５５５２６６）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／０５０１２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６８９２
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５１０１００５０８）ミトミクス インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＳＩＳ ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ １０００，２９０ Ｍｕｎｒｏ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｂａｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ Ｐ７Ａ ７Ｔ１
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／０５０１２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６８９２
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５１０１００５０８）ミトミクス インコーポレイテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＳＩＳ ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ １０００，２９０ Ｍｕｎｒｏ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｂａｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ Ｐ７Ａ ７Ｔ１
【Ｆターム（参考）】
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