ＶＬＡ−１に対するブロッキングモノクローナル抗体および炎症性障害の処置のためのその使用
【課題】被験体の炎症性障害の治療法を提供すること。
【解決手段】関節炎に罹患している被験体の処置のための組成物であって、ここで該組成物は、コントロール抗体処置した被験体と比較して約６５％以上の関節炎スコアの減少を提供するに有効な量で機能ブロッキング抗体または該抗体のフラグメントを含み、ここで該機能ブロッキング抗体または該抗体のフラグメントは、ＶＬＡ−１のエピトープと結合し得、ここで該エピトープは、図１５のアミノ酸残基９２〜９７を含む、組成物。
【解決手段】関節炎に罹患している被験体の処置のための組成物であって、ここで該組成物は、コントロール抗体処置した被験体と比較して約６５％以上の関節炎スコアの減少を提供するに有効な量で機能ブロッキング抗体または該抗体のフラグメントを含み、ここで該機能ブロッキング抗体または該抗体のフラグメントは、ＶＬＡ−１のエピトープと結合し得、ここで該エピトープは、図１５のアミノ酸残基９２〜９７を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
インテグリンは、細胞相互のおよび細胞の周囲への接着を仲介する細胞表面分子の大きいクラスを形成する細胞表面タンパク複合体である。細胞類は多くの発達過程および生理的過程において互いに、およびその環境内のその他分子に、接着する必要がある。その例は組織および器官の形成およびそれらの統合維持を含む。これらの生理的過程には炎症性障害が含まれる。
炎症性過程における重要な工程の一つは、細胞が血管から組織に、そして感染部位に向かって遊出する段階を含む。この過程における接着分子の役割はしばしば以下を含む三段階モデルに分けられる；最初、白血球が炎症中の内皮に運搬され、次の段階でこれにしっかりと付着し、そして白血球の炎症組織への経内皮的移動を生じる（非特許文献１；非特許文献２）。炎症カスケードにおけるさらなる重要な段階で、そしてこれまで広くは研究されていない段階は、末梢組織内に起こる；ここでは既存の細胞と同様侵潤細胞もエフェクター機能を果たすために感染部位に移動し、異種抗原を識別し、そして細胞活性化を受ける必要がある。接着性相互作用が白血球の補充のために果たす役割とは別に、炎症における間隙の（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）接着性相互作用の重要性を直接評価するために、本発明者らはインテグリンファミリーの接着分子およびそのフラグメントの重要性、および動物炎症（特に関節炎）モデル、におけるそれらの役割に焦点を当てた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：１１−２５
【非特許文献２】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．、１９９２、Ｃｅｌｌ ７６：３０１−３１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は被験体の炎症性障害の治療法を提供する。特に本発明は関節炎の治療法を提供する。
【０００４】
より詳細には、本発明の被験体に有効量のα１β１機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含んでいる薬学的組成物を被験体に投与することを含む、被験体における炎症性障害の処置法を提供する。ここで、α１β１機能ブロッキング抗体またはフラグメントはアミノ酸残基９２−９７、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含むＶＬＡ−１のエピトープに結合することができる。
【０００５】
上記抗インテグリン抗体はヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそのフラグメントからなる群から選択され得る。抗インテグリン抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。
【０００６】
本発明はさらに、ヒトまたは動物被験体である被験体の炎症性障害の治療法を提供する。
【０００７】
前節に記載した全ての文献並びに下記の開示に含まれる引用文献は全て参考として本明細書に援用される。
【０００８】
本発明はさらに、例えば、以下を提供する。
（項目１）
被験体における炎症性障害の処置のための方法であって、その方法は、その被験体に薬学的組成物を投与する工程を包含し、その薬学的組成物は、その炎症性障害を処置するのに有効な量のα１β１機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含み、ここでそのα１β１機能ブロッキング抗体またはそのフラグメントは、ＶＬＡ−１のエピトープと結合し得、そしてここでそのエピトープは、図１５のアミノ酸残基９２〜９７を含む、方法。
（項目２）
関節炎の処置のための方法であって、その方法は、関節炎に罹患している被験体に、コントロール抗体処置した被験体と比較して約６５％以上の関節炎スコアの減少を提供するに有効な量で、機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含む組成物を投与する工程を包含し、ここでその機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントは、ＶＬＡ−１のエピトープと結合し得、ここでそのエピトープは、図１５のアミノ酸残基９２〜９７を含む、方法。
（項目３）
前記関節炎スコアの減少が約７９％以上である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記関節炎スコアの減少が約８５％以上である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記関節炎スコアの減少が約９０％以上である、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記抗体がモノクローナルである、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記被験体がヒトである、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記被験体が、慢性関節リウマチに罹患している、項目２〜７のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
モノクローナル抗体ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ番号 ）。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】活性化白血球上のコラーゲン結合インテグリンα１β１およびα２β１。（Ａ）ＩＬ２−活性化脾細胞（ｄ１１）上のα１およびα２β１インテグリン発現のフローサイトメトリー分析。細胞を、抗−α１ ｍＡｂ、抗α２ ｍＡｂ、または非結合コントロールｍＡｂ（灰色の線）のいずれかで標識し、その後ＦＩＴＣ−抗ハムスター免疫グロブリンで標識した。（Ｂ）コラーゲンへの白血球接着における抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの効果。１０5ＩＬ２活性化脾細胞を、上記のｍＡｂで１５分間処理し、その後ＩＶ型またはＩ型コラーゲン被覆ウェルのいずれかで３７℃で１時間培養した。実施例１に例示されるように接着を計算し、そしてコントロールｍＡｂ処理細胞と比較して、％接着としてあらわした。接着アッセイは３重に行われ、少なくとも３回の独立実験が行われた。代表的一実験が示される。
【図１Ｂ】活性化白血球上のコラーゲン結合インテグリンα１β１およびα２β１。（Ａ）ＩＬ２−活性化脾細胞（ｄ１１）上のα１およびα２β１インテグリン発現のフローサイトメトリー分析。細胞を、抗−α１ ｍＡｂ、抗α２ ｍＡｂ、または非結合コントロールｍＡｂ（灰色の線）のいずれかで標識し、その後ＦＩＴＣ−抗ハムスター免疫グロブリンで標識した。（Ｂ）コラーゲンへの白血球接着における抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの効果。１０5ＩＬ２活性化脾細胞を、上記のｍＡｂで１５分間処理し、その後ＩＶ型またはＩ型コラーゲン被覆ウェルのいずれかで３７℃で１時間培養した。実施例１に例示されるように接着を計算し、そしてコントロールｍＡｂ処理細胞と比較して、％接着としてあらわした。接着アッセイは３重に行われ、少なくとも３回の独立実験が行われた。代表的一実験が示される。
【図２】遅延型過敏症のエフェクター相における抗インテグリンｍＡｂの効果。ＳＲＢＣ感作マウスに、ＳＲＢＣチャレンジの１時間前に上記ｍＡｂを腹腔内注射した。抗原チャレンジの２０時間後に足蹠の厚さを測定し、実施例２に示すように結果を、足蹠の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。これらのデータはｎ＝７９（ＰＢＳ）、６８（コントロールハムスターＩｇ）、６８（抗−α１）、２９（抗−α２）、１８（抗−α１＋抗−α２）、４５（抗−α４）、１８（抗−α５）、２０（抗−α６）、および１０（抗−β１）の８実験をまとめたものである。使用したｍＡｂは、Ｈａ４／８（コントロールハムスターＩｇグループ２）、Ｈａ３１／８（抗−α１）、Ｈａ１／２９（抗−α２）、ＰＳ／２（抗−α４）、５Ｈ１０−２７（抗−α５）、ＧｏＨ３（抗−α６）、およびＨＭβ１−１（抗−β１）であった。
【図３】接触過敏症のエフェクター相における抗−インテグリンｍＡｂの効果。ＦＩＴＣ−感作マウスに、ＦＩＴＣチャレンジ４時間前に上記ｍＡｂを腹腔内注射した。耳の厚さをベースラインと２４時間後に測定し、結果を、実施例３に示すように耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。これらのデータは、９実験をまとめたものであり、 ｎ＝７４（ＰＢＳ）、６０（コントロールハムスターＩｇ）、２６（抗−ＩＣＡＭ−１）、４４（抗−α１）、４４（抗−α２）、３８（抗−α１＋抗−α２）、３６（抗−α４）、１６（抗−α５）、２６（抗−α４＋抗−α５）、２４（抗−α６）、および２２（抗−β１）である。使用したハムスターｍＡｂは、Ｈａ４／８（コントロールハムスターＩｇグループ２）、Ｈａ３１／８（抗−α１）、Ｈａ１／２９（抗−α２）、ＨＭβ１−１（抗β−１）、３Ｅ２（抗−ＩＣＡＭ−１）であった；使用したラットｍＡｂは、Ｒ３５−９５およびＲ３５−３８（それぞれコントロールラットＩｇＧ２ａおよびラットＩｇＧ２ｂ）、ＰＳ／２（抗−α４）、５Ｈ１０−２７（抗−α５）、ＧｏＨ３（抗−α６）であった。
【図４】野生型マウスに比較したα１−欠乏マウスにおける接触過敏症反応。ＦＩＴＣ感作マウスに、ＦＩＴＣチャレンジの４時間前に上記ｍＡｂを腹腔内注射した。耳の厚さをベースラインと２４時間後に測定し、結果を実施例４に示すように、耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。状態ごとに４〜５匹のマウス群を用い、全実験を少なくとも３回行った。代表的１実験が示される。
【図５】クロトン油誘起性非特異的炎症における抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの効果。耳にクロトン油を塗る４時間前に、マウスに上記ｍＡｂを腹腔内注射した。耳の厚さをベースラインと２４時間後に測定し、結果を、実施例５に示すように耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。状態ごとに４ないし５匹ののマウス群を用い、全実験を少なくとも３回行った。代表的一実験が示される。
【図６】コラーゲンｍＡｂ誘起性関節炎における抗−α１および抗−α２の効果。マウスに０日目に抗−コラーゲンｍＡｂを腹腔内注射し、その後３日目にＬＰＳを注射した。マウスに０日目から始めて３日目ごとに上記ｍＡｂを腹腔内注射した。臨床的関節炎がＬＰＳ注射後２−３日目に明らかになり、数週間続いた。四肢の各々を実施例６に示すように３日目ごとに０−４スケールで評価し、結果を全四肢の９日目と１５日目の間の平均関節炎スコア（±ＳＥＭ）としてあらわした。これらのデータは４実験をまとめたものであり、各実験は状態ごとに３ないし４匹のマウス群からなっている。
【図７】抗−α１または抗−α２ ｍＡｂの投与は、ＤＴＨ反応中の白血球の足蹠への侵潤を阻止する。実験は図２に記載のように行われた。抗原チャレンジの２０時間後に足蹠を切り取り、そして組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織切片は、非チャレンジマウス（Ａ）またはＳＲＢＣでチャレンジしたＳＲＢＣ感作マウス（Ｂ−Ｈ）のいずれかの足蹠から得たものである。マウスはチャレンジの１時間前にＰＢＳ（Ｂ）、コントロールハムスターＩｇ（Ｃ、Ｇ）、抗−α１（Ｄ）、抗−α２（Ｅ）または抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの組み合わせ（Ｆ、Ｈ）のいずれかで処理した。倍率：×１００（Ａ−Ｆ）、×４００（Ｇ−Ｈ）。
【図８】α１β１は、ＤＴＨ反応中の足蹠における侵潤白血球に発現する。抗原チャレンジの２０時間後の未処理炎症足蹠からの侵潤白血球の免疫組織学的染色。（Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−結合コントロールｍＡｂおよび抗−α１ ｍＡｂで直接染色した連続切片。（Ｂ）Ａｌｅｘａ４８８−結合抗−α１ ｍＡｂおよびフィコエリトリン（ＰＥ）−結合細胞系−特異的ｍＡｂによる二重免疫蛍光染色。使用したＰＥ結合ｍＡｂは顆粒球／単球（抗−ＣＤ１１ｂ）、好中球（抗−Ｌｙ６Ｇ／Ｇｒ−１）、およびＴリンパ球（抗−ＣＤ３）に特異的であった。倍率：×４００。
【図９】コラーゲンｍＡｂ−誘導性関節炎における抗−α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの効果。（Ａ）抗−α１または抗−α２ ｍＡｂのいずれかによるマウスの予防的処置は関節炎スコアを減らす。マウスを０日目に抗−コラーゲンｍＡｂで、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり、その後数週間続いた。マウスに０日目から始めて３日目ごとに上記ｍＡｂで処理した。３日目ごとに各四肢を評価し、０−４スケールで採点した。結果を、平均関節炎スコアとしてあらわす。結果を、全四肢の９日目から１５日目までの平均関節炎スコア（±ＳＥＭ）（最大スコア１６）としてあらわす。状態ごとに４匹のマウス群を用いた；１２実験の平均を示す。（Ｂ）α１−欠乏マウスは、抗−α１ ｍＡｂ処理野生型マウスに比較して減少した関節炎スコアを有した。実験の詳細および採点法は上記のようである。状態ごとに４匹のマウス群を用いた：２実験の平均を示す。
【図１０】関節炎の関節の免疫病態学における抗−α１ ｍＡｂ処理の効果。 抗−α１ ｍＡｂ処理は、白血球侵潤、細胞の関節表面への接着、およびプロテオグリカン喪失によって証明される軟骨破壊を減らす。コントロールハムスターＩｇ（Ｅ−Ｈ）または抗−α１ ｍＡｂ処理（Ｉ−Ｌ）のいずれかを受けた正常マウス（Ａ−Ｄ）または関節炎マウス（ｄ８）からの後肢。肢の写真を撮り（Ａ、Ｅ、Ｉ）、切り取り、組織切片をヘマトキシリン／エオシンのいずれかで染色するか（Ｂ−Ｃ、Ｆ−Ｇ、Ｊ−Ｋ）、またはトルイジンブルーで染色してプロテオグリカンを検出した（Ｄ、Ｈ、Ｌ）。倍率：×１６（Ｂ、Ｆ、Ｊ）；×１６０（Ｃ、Ｇ、Ｋ）；×２００（Ｄ、Ｈ、Ｌ）。
【図１１】関節炎の発生はリンパ球不在下では遅れ、抗−α１ ｍＡｂによる関節炎の阻止がリンパ球不在下で起きる。野生型Ｂ６，１２９またはＲＡＧ−１欠乏Ｂ６，１２９マウスを０日目に抗−コラーゲンｍＡｂで処理し、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり、数週間続いた。マウスに上記ｍＡｂを０日目から始めて、３日目ごとに処理した。各四肢を３日目ごとに０−４スケールで評価し、そして採点した。結果を１本の肢についての平均関節炎スコアであらわす（最大スコア４）。状態ごとに４匹のマウス群を用いた。
【図１２】抗−α１ ｍＡｂによる関節炎阻止の用量反応。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗−コラーゲンｍＡｂを用いて０日目に処理し、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり、数週間続いた。マウスにＨａ４／８（アイソタイプコントロール）またはＨａ３１／８（抗−α１）ｍＡｂの指示量を０日目から始めて３日目毎に腹腔内投与した。各肢を３日目ごとに評価し、０−４スケールで採点した。結果を１本の肢につき平均関節炎スコアとしてあらわす（最大スコア４）。状態ごとに４匹のマウス群を用いた。
【図１３】抗−α１ ｍＡｂの治療的処理は関節炎スコアを減らす。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目に抗−コラーゲンｍＡｂで処理し、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり数週間続いた。マウスにｍＡｂ（２５０μｇ）またはＩｇ融合タンパク質（２００μｇ）を４日目から始めて、３日目ごとに腹腔内投与した。マウスは、ｍＡｂ（Ｈａ４／８アイソタイプコントロールまたはＨａ３１／８抗−α１）、Ｉｇ融合タンパク質（アイソタイプコントロールＩｇまたはＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ）、または両者の組み合わせ（２５０μｇ Ｈａ３１／８および２００μｇ ＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ）のいずれかを受容した。各肢を３日目ごとに評価し、０−４スケールで採点した。結果を１本の肢につき平均関節炎スコアとしてあらわす（最大スコア４）。状態ごとに４匹のマウス群を使用した。
【図１４】抗−α１ ＩドメインブロッキングｍＡｂのためのエピトープの位置。Ａ．ラット（最上部）およびヒト（下）α１−Ｉドメインのアミノ酸配列。ＭＩＤＡＳ（金属イオン依存性接着部位）モチーフ含む残基が太線で示される。対応するラット残基（Ｒ△Ｈ）に代わるヒトアミノ酸はボックス領域のラット配列の下に示される。明白にするために、本文中にナンバーをつけた残基は、この図を参照する。Ｂ．増加する濃度のｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）を、３０μｇ／ｍｌ ヒト（丸）、ラット（三角）またはＲ△Ｈ（四角）α１−Ｉドメインを塗布したプレートに結合させた。示したデータは３実験をあらわす。
【図１５】ヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列。
【図１６】α１−Ｉドメインに対するブロッキングｍＡｂの同一化。Ａ．漸増濃度のｍＡｂ ＡＥＦ３（三角）またはＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（丸）を、３０μｇ／ｍｌ α１−Ｉドメインで被覆したプレートに結合させる。Ｂ．α１−Ｉドメインを、漸増濃度のｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（ダイヤモンド）またはｍＡｂ ＢＧＣ５（四角）で処理し、コラーゲンＩＶ（２μｇ／ｍｌ）被覆プレートに結合させた。Ｃ．Ｋ５６２−α１細胞を、漸増濃度のｍＡｂ ＡＥＦ３（三角）またはＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（丸）で処理し、コラーゲンＩＶ（５μｇ／ｍｌ）被覆プレートに結合させた。各ウェルに加えた細胞の４５−５０％が、コラーゲンＩＶに付着した。示されるデータは独立的３実験をあらわす。
【図１７】ブロッキングｍＡｂの種交差反応性。Ａ．（１）ヒツジ血管平滑筋、（２）ヒト白血病Ｋ５６２−α１細胞、 または（３）精製Ｒ△Ｈ ＧＳＴ−Ｉドメインからの界面活性剤溶解物；（４）ラットＧＳＴ−α１Ｉドメイン；および（５）ヒトＧＳＴ−α１Ｉドメインを、非還元的条件下で１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、機能ブロッキングｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）で免疫ブロットした。分子量マーカーを左側に示す；非還元α１β１インテグリンは〜１８０ｋＤａに移動する；ＧＳＴ−Ｉドメインは〜４５ｋＤａに移動する。Ｂ．ウサギ血管平滑筋細胞をｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（底部）かまたはネズミＩｇＧコントロール（頂上）かのいずれかと共にインキュベートし、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）によって分析した。
【図１８】α１−Ｉドメインはコラーゲンに結合する。Ａ．漸増濃度のヒトα１−Ｉドメインを、１μｇ／ｍｌコラーゲンＩ（四角）またはコラーゲンＩＶ（丸）であらかじめ被覆したプレートに結合した。示される数値はＢＳＡとのバックグラウンド結合に対して補正してある。Ｂ．２μ／ｍｌヒトα１−Ｉドメインを漸増濃度の抗−ヒトα１インテグリン抗体５Ｅ８Ｄ９（四角）または抗−ヒトα２−インテグリン抗体Ａ２ＩＩＥ１０（丸）と混合し、次いで、あらかじめ１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶを塗布したプレートに結合した。Ｃ．プレートに１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶまたは３％ＢＳＡを塗布した。α１−Ｉドメイン（２μｇ／ｍｌ）をその後１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｍＭ Ｍｇ2+、または５ｍＭ ＥＤＴＡの存在のもとで被覆プレートに結合させた。示されるデータは、独立した３実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
インテグリンおよびそのフラグメント、特にα１−インテグリンサブユニットに対する抗体が前炎症性白血球と細胞外基質の諸成分（限定しないが、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンを含む）との相互作用をブロックし得ることが本発明の発見である。本発明は任意の単一の作用機構に制限することを意図しないが、インテグリンおよびそのフラグメントと、周囲のマトリックスとの相互作用の崩壊が前炎症性サイトカイン類の発現を減少させ得ることが提起される。さらに、インテグリンおよびそのフラグメントに対する抗体は、抗原特異的Ｔ−細胞のレベルに作用することによって、炎症反応のエフェクター相を調節し得ることが提起される。さらに、インテグリンおよびそのフラグメントに対する抗体は、組織内の細胞移動および組織内の細胞性プライミングおよび／または活性化を中断することによって作用し得ることが提起される。
【００１１】
この発見は、炎症に関連する条件の間、インテグリンファミリーの接着分子（特にα１β１）が、末梢組織環境において重要であることを例示する。この発見はまた、免疫反応に対するマトリックス富化（ｍａｔｒｉｘ−ｒｉｃｈ）末梢組織環境の重要性を強調することによって、インテグリンファミリーおよびそのフラグメントの炎症における役割を白血球の内皮境界面における付着および遊出を超えてさらに広げ、そしてこのことは、接着を基礎とする療法のインターベンションの新しい観点として、末梢組織を明らかにする。
【００１２】
本発明の方法は、インテグリンに対する抗体の使用を意図する；その際意図されるインテグリンは、α鎖（α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、αＩＩｂを含むがこれらに限定されない）と非共役結合されるのβ鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８を含むがこれらに限定されない）を含む分子を含む。本発明に使用するために意図される種々のインテグリンの例には、以下を含むがこれらに限定されない：
α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、αＶβ１、αＬβ１、αＭβ１、αＸβ１、αＤβ１、αＩＩｂβ１、αＥβ１；
α１β２、α２β２、α３β２、α４β２、α５β２、α６β２、α７β２、α８β２、α９β２、α１０β２、αＶβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＸβ２、αＤβ２、αＩＩｂβ２、αＥβ２；
α１β３、α２β３、α３β３、α４β３、α５β３、α６β３、α７β３、α８β３、α９β３、α１０β３、αＶβ３、αＬβ３、αＭβ３、αＸβ３、αＤβ３、αＩＩｂβ３、αＥβ３；
α１β４、α２β４、α３β４、α４β４、α５β４、α６β４、α７β４、α８β４、α９β４、α１０β４、αＶβ４、αＬβ４、αＭβ４、αＸβ４、αＤβ４、αＩＩｂβ４、αＥβ４；
α１β５、α２β５、α３β５、α４β５、α５β５、α６β５、α７β５、α８β５、α９β５、α１０β５、αＶβ５、αＬβ５、αＭβ５、αＸβ５、αＤβ５、αＩＩｂβ５、αＥβ５；
α１β６、α２β６、α３β６、α４β６、α５β６、α６β６、α７β６、α８β６、α９β６、α１０β６、αＶβ６、αＬβ６、αＭβ６、αＸβ６、αＤβ６、αＩＩｂβ６、αＥβ６；
α１β７、α２β７、α３β７、α４β７、α５β７、α６β７、α７β７、α８β７、α９β７、α１０β７、αＶβ７、αＬβ７、αＭβ７、αＸβ７、αＤβ７、αＩＩｂβ７、αＥβ７；
α１β８、α２β８、α３β８、α４β８、α５β８、α６β８、α７β８、α８β８、α９β８、α１０β８、αＶβ８、αＬβ８、αＭβ８、αＸβ８、αＤβ８、αＩＩｂβ８、αＥβ８。
【００１３】
本発明の方法はまた、例えば以下を含むインテグリンフラグメントの使用も考慮する：β鎖単独（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８を含むがこれらに限定されない）に対する抗体、ならびにα鎖単独（α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、αＩＩｂを含むがこれらに限定されない）に対する抗体。加えて、本発明の方法はさらに、例えば以下を含むがそれらに限定されないα鎖のＩドメインに対する抗体を含む、インテグリンフラグメントに対する抗体の使用を意図する：α１β１由来のＩドメイン（Ｂｒｉｅｓｅｗｉｔｚら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８９）；α２β１由来のＩドメイン（ＴａｋａｄａおよびＨｅｍｌｅｒ、１９８９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：３９７）、αＬβ２由来のＩドメイン（Ｌａｒｓｏｎら、１９８９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：７０３）、αＭβ２由来のＩドメイン（Ｃｏｒｂｉら、１９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２４０３）、αＸβ２由来のＩドメイン（Ｃｏｒｂｉら、１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ ６：４０２３）、αＤβ２由来のＩドメイン（Ｇｒａｙｓｏｎら、１９８８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：２１８７）、αＥβ７由来のＩドメイン（Ｓｈａｗら、１９４４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：６０１６）。好ましい実施形態において、α１−Ｉドメイン抗原決定基は少なくとも６個の隣接アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ここで上記隣接配列は図１５の配列内に見いだされる。さらに、好ましい実施形態において、上記隣接配列はＶａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇである。
【００１４】
本発明の使用のためのインテグリンを生成する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５−４３４頁を参照のこと）。
【００１５】
さらに、本発明の実施形態は抗インテグリンポリクローナル抗体および抗インテグリンモノクローナル抗体を含む。本発明の好ましい実施形態は、抗−α１モノクローナル抗体のようなモノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本明細書中で用いられるようなα１β１機能ブロッキング抗体は、α１−Ｉドメイン（特に、図１５の残基９２−９７）に結合し、かつ例えば、コラーゲンＩＶに対するＫ５６２−α１依存性接着を阻害する能力によって試験されたようにα１β１機能をブロックする抗体をいう（実施例１５を参照のこと）。
【００１７】
治療、特にヒトの治療のための好ましい抗体およびホモログとしては、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）抗体フラグメント、ならびに抗体重鎖または軽鎖のモノマーまたはダイマー、またはこれらの混合物が挙げられる。従って、インテグリン分子およびそのフラグメントに対するモノクローナル抗体は、本発明の方法における好ましい結合剤である。
【００１８】
本明細書中に使用される場合、用語「抗体ホモログ」は、ジスルフィド結合を介して連結される結合した免疫グロブリン軽鎖および重鎖からなるインタクトな抗体を含む。用語「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖およびそれらの抗原結合性フラグメント（それらは一つ以上の抗原（すなわち、α１、α２、α６またはα−Ｉドメインを含むインテグリンサブユニット）に結合可能である）から選択される一つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を含むことが意図される。一つより多いポリペプチドから構成される抗体ホモログの成分のポリペプチドは必要に応じてジスルフィド結合していてもよいし、さもなくば共有結合で架橋していてもよい。
【００１９】
従って、それゆえ「抗体ホモログ」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（並びにそのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含む。ここで、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型であり得る。
【００２０】
「抗体ホモログ」はまた、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなるダイマーなど）も含む。従って、上記の抗体由来の抗原結合性フラグメント、ならびに全長ダイマーポリペプチドまたはトリマーポリペプチドもそれ自体有用である。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体ホモログ」は、組み換えＤＮＡ技術により産生される抗体ホモログである。この抗体ホモログにおいて、抗原結合のためには必要とされないヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくつかまたは全てが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来のその対応するアミノ酸の代わりに置換されている。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体ホモログ」は、組み換えＤＮＡ技術により産生される抗体ホモログであり、このホモログにおいて免疫グロブリン軽鎖、重鎖、またはその両方のヒンジ領域および定常領域の全てまたは一部分が、別の免疫グロブリン軽鎖または重鎖からの対応領域の代わりに置換されている。別の局面において、本発明は、（１）インテグリン標的化部分；（２）必要に応じて、第２のペプチド、例えばインテグリン標的化部分の溶解度またはインビボでの寿命を増加するもの、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメントまたはその一部、例えばＩｇＧの一部またはフラグメント、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常部、例えばＣＨ２およびＣＨ３ヒンジ領域；およびトキシン部分を含むキメラ分子の改変体を特徴とする。キメラ分子を用いて、毛包などの上皮細胞の増殖に関連する疾患の危険のある被験体（例えば、ヒト）を処置し得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体ホモログ」とは、組み換えＤＮＡ技術によって産生された抗体ホモログであり、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の全ては、供給源がヒトに由来する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「炎症性障害」としては、乾癬、湿疹、火傷および皮膚炎などの皮膚関連の状態のような障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法による処置において意図される他の炎症性障害としては、喘息、気管支炎、月経性痙攣、腱炎、滑液包炎の処置、ならびに痛みおよび頭痛の処置、または高熱を処置する解熱薬としての使用が含まれる。本発明の方法はまた、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎などのような胃腸障害および直腸結腸癌の予防にも有用である。本発明の方法は血管性疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、リウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、外傷後腫脹、心筋虚血などの疾患における炎症性障害の処置に有用である。本発明の方法は、アレルギー性鼻炎、呼吸困難症候群、内毒素ショック症候群、およびアテローム性硬化症の処置にも有用である。
【００２５】
好適な実施形態において、本発明の方法はリウマチ性関節炎および骨関節炎などを含む関節炎の治療に有用である。
【００２６】
“有効量”とは、好都合なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は１回または数回に投与できる。炎症性疾患の治療のためには、抗インテグリン抗体の“有効量”は、治療すべき障害に対して、または美容的目的のために臨床的に容認できる基準にしたがって、炎症関連性状態の進行を和らげ、軽くし、安定させ、逆転させ、緩徐にし、または遅らせるために十分な量である。効果のインジケータの検出および測定は、多数の利用可能な診断ツール、例えば非制限的に血液検査、肺機能試験、および胸部Ｘ線；ＣＴスキャン；気管支鏡；気管支肺胞洗浄法；肺生検およびＣＴスキャン等を含む身体検査によって測定され得る。
【００２７】
例えば、抗インテグリン モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の製造技術は公知である。例えばＭｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２巻：３６７−３７５頁（マウス抗α１β１および抗α２β１ ｍＡｂ）；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１０３７６−１０３８３頁（マウス抗α６β１ ｍＡｂ）；Ｙａｏら、１９９６、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９６ １０９巻：３１３９−５０頁（マウス抗α７β１ ｍＡｂ）；Ｈｅｍｌｅｒら、１９８４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３２巻：３０１１−８頁（ヒトα１β１に対するｍＡｂ）；Ｐｉｓｃｈｅｌら、 １９８７ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３８巻：２２６−３３頁（ヒトα２β１に対するｍＡｂ）；Ｗａｙｎｅｒら、１９８８、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７巻：１８８１−９１頁（ヒトα３β１に対するｍＡｂ）；Ｈｅｍｌｅｒら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１１４７８−８５頁（ヒトα４β１に対するｍＡｂ）；Ｗａｙｎｅｒら １９８８ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７巻：１８８１−９１頁（ヒトα５β１に対するｍＡｂ）；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１０３７６−１０３８３頁（ヒトα６β１に対するｍＡｂ）；Ａ．Ｗａｎｇら、 １９９６ Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５巻：６６４−６７２頁（ヒトα９β１に対するｍＡｂ）；Ｄａｖｉｓら、１９８９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０９巻：１８１７−２６頁（ヒトαＶβ１に対するｍＡｂ）；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、 １９８２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９巻：７４８９−９３頁（ヒトαＬβ２に対するｍＡｂ）；Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９３：Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２０巻：１０３１−４３頁（ヒトαＭβ２に対するｍＡｂ）；Ｓｔａｃｋｅｒら、１９９１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６巻：６４８−５５頁（ヒトαＸβ２に対するｍＡｂ）；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｉｅｒｅｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３巻：６８３−９０頁（ヒトαＤβ２に対するｍＡｂ）；Ｂｅｎｎｅｔｔら、 １９８３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０巻：２４１７−２１頁（ヒトαＩＩβ３に対するｍＡｂ）；Ｈｅｓｓｌｅら、１９８４、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２６巻：４９−５４頁（ヒトα６β４に対するｍＡｂ）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：６９４０−８頁（ヒトαＶβ５に対するｍＡｂ）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：６９４０−８頁（ヒトαＶβ６に対するｍＡｂ）；Ｃｅｒｆ−Ｂｅｎｓｕｓｓａｎら、１９９２、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２巻：２７３−７頁（ヒトαＥβ７に対するｍＡｂ）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：２８７０８−１５頁（ヒトαＶβ８に対するｍＡｂ）；Ｂｏｓｓｙら、 １９９１ ＥＭＢＯ Ｊ １０巻：２３７５−８５頁（ヒトα８β１に対するポリクローナル抗血清）；Ｃａｍｐｅｒら、 １９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻：２０３８３−２０３８９頁（ヒトα１０β１に対するポリクローナル抗血清）を参照されたい。
【００２８】
一般に、不死細胞系統（典型的には骨髄腫細胞）を、所定の抗原、例えばインテグリンを発現する全細胞で免疫した哺乳動物から得たリンパ球（典型的には脾細胞）に融合する。そして、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清液を上記抗原に対する抗体についてスクリーニングする。一般的にはＫｏｈｌｅｒら、 １９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２６５巻：２９５−４９７頁“所定の特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養”を参照されたい。
【００２９】
免疫は標準手順を用いて達成される。単位量および免疫レジメンは免疫される哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。典型的には、免疫した哺乳動物を繁殖させ、そして適切なスクリーニングアッセイを用いて各血液サンプルからの血清を特定の抗体についてアッセイする。例えば抗インテグリン抗体はインテグリン発現細胞からの１２５Ｉ標識細胞溶解液の免疫沈殿によって同定され得る。例えば、抗インテグリン抗体が挙げられる抗体を、フローサイトメトリーによって例えばインテグリン分子を認識すると考えられる抗体とインキュベートした抗体発現細胞の蛍光染色を測定することによって同定し得る。ハイブリドーマ細胞の生産に用いるリンパ球は、典型的には免疫哺乳動物から単離され得る。この哺乳動物の血清は、このようなスクリーニングアッセイを使用して、抗インテグリン抗体の存在が陽性であることがすでに試験ずみである。
【００３０】
代表的には、不死細胞系統（例えば骨髄腫細胞系統）は上記リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。好ましい不死細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（“ＨＡＴ培地”）を含む培養培地に大して感受性であるマウス骨髄腫細胞系統である。一般的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を１５００分子量のポリエチレングリコール（“ＰＥＧ１５００”）を用いてマウス脾細胞に融合する。次いで、融合により生成したハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地を用いて選択する。ＨＡＴ培地は未融合骨髄腫細胞や非生産的融合骨髄腫細胞を殺す（未融合脾細胞は形質転換されないことから、数日後には死滅する）。ハイブリドーマ培養上清液をスクリーニングすることによって、所望抗体を産生するハイブリドーマを検出する。例えば抗インテグリン抗体を産生するために調製されたハイブリドーマは、そのハイブリドーマ培養上清液に、組み換えインテグリン発現細胞系統に結合する能力を有する分泌抗体を検査することによってスクリーニングされ得る。
【００３１】
抗インテグリン抗体ホモログを含む抗体ホモログ（それらはインタクトな免疫グロブリンである）を産生するために、このようなスクリーニングアッセイで陽性の検査結果の出たハイブリドーマ細胞を、栄養培地中で上記ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を上記培養培地中に分泌できる十分な条件下でかつ十分な時間培養した。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術および培養培地は周知である。馴化ハイブリドーマ培養上清液を集め、そして抗インテグリン抗体を必要に応じて周知の方法によってさらに精製してもよい。
【００３２】
あるいは、上記ハイブリドーマ細胞を、免疫していないマウスの腹腔内に注入することによって、所望抗体を産生してもよい。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し、抗体を分泌する。それは腹水として蓄積する。上記腹水をで腹腔から吸い出すことによって抗体を採取できる。
【００３３】
例えばインテグリンに対する完全ヒトモノクローナル抗体ホモログ類は、本発明の方法において抗原類をブロックし得る別の好ましい結合剤である。これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻：８６−９５頁、“インビトロでプライムされたヒト脾細胞から抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の産生”に記載されているように、インビトロでプライムされたヒト脾細胞を用いてインタクトな形態で調製される。
【００３４】
あるいは、それらはＰｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：２４３２−２４３６頁“レパートリークローニングによる多様な高親和性ヒトモノクローナル抗体の生成”およびＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ １４１巻：２２７−２３６頁、“インビトロ刺激を行わずにヒト末梢血リンパ球から典型的免疫グロブリン可変領域ＣＤＮＡライブラリーの構成”により記載されているように、レパートリークローニングによって調製することもできる。米国特許第５，７９８，２３０号（１９９８年８月２５日“ヒトモノクローナル抗体の製法およびその使用”）はヒトＢ細胞からヒトモノクローナル抗体の調製を記載している。このプロセスに従って、ヒト抗体産生Ｂ細胞を、エプスタイン−バーウィルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン−バーウィルス、またはその誘導体での感染によって不死化する。不死化のために必要なＥＢＮＡ２機能は引き続いて停止し、その結果、抗体産生の増加を生じる。
【００３５】
完全ヒト抗体を産生するなお別の方法において、米国特許第５，７８９，６５０号（１９９８年８月４日“異種抗体産生のためのトランスジェニック非ヒト動物”）は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物および不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を記載している。内因性免疫グロブリン遺伝子は、内因性免疫グロブリンに対するアンチセンス ポリヌクレオチド類および／または抗血清によって抑制される。異種抗体は、非ヒト動物の種のゲノムには普通は見いだされない免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。非再配列異種ヒト免疫グロブリン重鎖の配列を含む１つ以上の導入遺伝子が非ヒト動物に導入され、それによって、トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配列することができ、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプの抗体レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物を生成する。このような異種ヒト抗体はＢ細胞において産生される。Ｂ細胞は、その後例えば骨髄腫のような不死化細胞系統と融合するとか、またはこのようなＢ細胞を他の技術によって操作して、モノクローナルの異種完全ヒト抗体ホモログを産生できる細胞系統を不朽化するという方法で、不死化される。
【００３６】
本発明の方法でインテグリン抗原またはそのフラグメントをブロックし得るなお別の好ましい結合剤は、インテグリンタンパク質またはそのフラグメントに結合する能力を有するヒト化抗体ホモログである。キメラ抗体を調製する初期の方法にしたがって、新しいアプローチがＥＰ０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）において記載された。それによると或る種の相補的決定部領域（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＣＤＲ）を別の種からのＣＤＲで置き換えることによって、抗体を変化させる。このプロセスを用いて、例えばヒト重鎖および軽鎖Ｉｇ可変領域ドメインからのＣＤＲをマウス可変領域ドメインからの代替のに置き換えることができる。これらの変化したＩｇ可変領域を引き続きヒトＩｇ定常部と組み合わせて、置換されたマウスＣＤＲを除く組成が総合的にヒトである抗体を作り出すことができる。このようなＣＤＲ−置換抗体は、キメラ抗体に比較してヒトでは免疫反応を誘起しそうもないと推定される。なぜならばＣＤＲ−置換抗体は明らかにより少ない非ヒト成分を含むからである。ＣＤＲ“グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）”を介してモノクローナル抗体をヒト化するプロセスは“再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）”と呼ばれる。（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３−３２７頁、“治療のためのヒト抗体のリシェイピング”；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４−１５３６頁、“モノクローナル抗体にＣＤＲグラフティングを用いるヒト抗体のリシェイピング”）。
【００３７】
代表的には、マウス抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体中の対応する領域に移植される。なぜならば特異抗原に結合するマウス抗体の領域がＣＤＲだからである（抗体重鎖に３つ、軽鎖に３つ）。ＣＤＲの移植は遺伝子工学によって達成される。これによりＣＤＲ ＤＮＡ配列はマウス重鎖および軽鎖可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントのクローニングによって決定され、その後対応するヒトＶ領域に部位指向変異誘発によって移される。このプロセスの最後の段階では、所望アイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメント（通常、ＣＨではγＩ、ＣＬではκ）が付加され、ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子が哺乳動物細胞に同時発現し、可溶性ヒト化抗体を生成する。
【００３８】
これらＣＤＲのヒト抗体への移動が、この抗体に、本来のマウス抗体の抗原結合特性を伝える。マウス抗体における６つのＣＤＲが構造的にＶ領域“フレームワーク”領域に取り付けられる。ＣＤＲ−グラフティングが成功する理由は、マウスとヒト抗体との間のフレームワーク領域が、類似のＣＤＲ付着点を有する非常に似た三次元構造を有し得、その結果ＣＤＲが交換可能だからである。このようなヒト化抗体ホモログは、Ｊｏｎｅｓら、 １９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁、“ヒト抗体の相補的決定領域の、マウスのそれらによる置換”；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３−３２７頁、“治療のためのヒト抗体のリシェイピング”；Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：１００２９頁、“インターロイキン２レセプターに結合するヒト化抗体”およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：３８３３頁“ポリメラーゼ連鎖反応法によって発現するための免疫グロブリン可変ドメインのクローニング”に例示されるようにして調製することができる。
【００３９】
それにもかかわらず、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸はＣＤＲと相互作用し、抗原結合親和性全体に影響を与えると考えられている。いかなるヒトＶ領域フレームワークの改変を伴わずにヒト化抗体を作るためにマウス抗体からのＣＤＲを直接移すと、しばしば結合親和性の部分的または完全な損失を生じる。多くの場合、結合活性を得るためにはアクセプター抗体のフレームワーク領域による残基を変えることが重要であるようである。
【００４０】
Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：１００２９−１００３３頁、“インターロイキン２レセプターに結合するヒト化抗体”およびＷＯ ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）は、マウスｍＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲとヒト免疫グロブリンのフレームワークおよび定常部とを組み合わせることによって、アクセプター抗体のフレームワーク領域ににおける改変された残基を含むヒト化抗体を調製する方法を記載している。彼らは、ヒトＶ領域フレームワーク残基のいかなる改変をも伴わずに直接的なＣＤＲ移動からしばしば生じる結合親和性の喪失の問題に対する一つの解決策を示した；彼らの解決策は二つの重要な段階を含む。第一に、本来のマウス抗体（この場合は抗Ｔａｃ ＭＡｂ）のＶ領域フレームワークに対する最適タンパク配列ホモログに対してヒトＶフレームワーク領域をコンピューター分析によって選び出す。第二段階では、マウスＣＤＲと相互作用しそうなフレームワークアミノ酸残基を可視化し、次いで、これらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワークに重ねるために、マウスＶ領域の三次構造をコンピューターによってモデル化する。推定的マウス接触残基を有する相同ヒトフレームワークを用いるこれらのアプローチは、インターロイキン２レセプターに特異的な抗体類（Ｑｕｅｅｎら、１９８９［前出］）およびまた、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）に特異的な抗体類（Ｃｏ．ら １９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：２８６９−２８７３頁、“抗ウィルス治療のためのヒト化抗体”）に関して、本来のマウス抗体に対する同様な結合親和性を有するヒト化抗体を生成する。
【００４１】
ＷＯ ９０／０７８６１の上記の２段階のアプローチにより、Ｑｕｅｅｎらはヒト化免疫グロブリンを設計するための幾つかの基準を概説した。第一の基準はヒトアクセプターとして、通常は、ヒト化すべき非ヒトドナー免疫グロブリンに普通は相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを用いるか、または多くのヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを用いることである。第二の基準は、もしもヒトアクセプター残基が異常であり、そしてドナー残基がフレームワークの特定残基においてヒト配列に典型的である場合、上記アクセプターよりもむしろ上記ドナーアミノ酸を使用することである。第三の基準は、ＣＤＲＳに直に隣接する部分ではアクセプターよりもむしろドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【００４２】
極端なマウス残基導入なしでＣＤＲグラフティングに、異なるアプローチ（Ｔｅｍｐｅｓｔ、 １９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻：２６６−２７１頁、“インビボでのヒトＲＳウィルス感染を阻止するためにヒトモノクローナル抗体の再形成”）を使用し得、そして標準として、ＮＥＷＭおよびＲＥＩ重鎖および軽鎖からそれぞれ誘導されるＶ領域フレームワークを使用し得る。Ｔｅｍｐｅｓｔらの１９９１年のアプローチを用いてＮＥＷＭおよびＲＥＩベースのヒト化抗体を構築する利点は、ｘ線結晶学からＮＥＷＭおよびＲＥＩ可変領域の三次元構造が知られており、そのためＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用がモデル化できることである。
【００４３】
本治療はこれらの状態に罹患したヒトおよび動物被験体両方に有効である。本発明が適用できる動物被験体は、ペットとしても商業的目的のためにも飼育される家畜および牧畜の両方にわたる。例としてはイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギが挙げられる。
【００４４】
本発明の方法において、抗体（例えば抗ＶＬＡ−１抗体）は非経口投与してもよい。本明細書中で用いる用語“非経口”として、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下、肝内、損傷内および頭蓋内注射または注入技術が挙げられる。
【００４５】
本発明の薬学的組成物は本発明の化合物のいずれか、またはその薬物学的に受容可能な誘導体を、薬物学的に受容可能なキャリアと共に含む。本明細書中で用いられる用語“キャリア”は公知の受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む。
【００４６】
本発明によると、医薬組成物は無菌の注射用調製物（例えば無菌の注射用水性または油性懸濁液）の形態であり得る。この懸濁液は適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用い、当業者に公知の技術に従って処方される。
【００４７】
本発明の医薬組成物は経口的に得られ得る。経口的に与えられる場合、それらは、非制限的に、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液等の経口的に受容可能な投与型で投与できる。
【００４８】
局所的適用について、上記医薬組成物は活性成分を一種類以上のキャリアに懸濁または溶解して含む適切な軟膏に処方することができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、ネブライザー、乾燥粉末吸入器または定量吸入器を介して鼻孔内噴霧または吸入によってもまた投与することもできる。
【００５０】
所望効果をもたらす本発明の化合物の投与量および投与速度は、インヒビターの性質、被験体のサイズ、治療の目標、治療すべき病態の性質、使用する特定の医薬組成物、および治療医師の判断等、種々の要因に依存する。１日あたり約０．００１と約１００ｍｇ／ｋｇとの間の体重、好ましくは１日あたり約０．１と約５０ｍｇ／ｋｇとの間の体重の活性成分化合物という投与レベルが有用である。最も好ましいのは、抗体ホモログが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の投与量範囲、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲で、かつ１−１４日間毎の間隔で投与される。別の好ましい実施形態では、腹腔内投与の際には上記抗体は約０．３〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の好ましい実施形態では抗体は静脈内投与の際に約５〜１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。少なくとも１μｇ／ｍｌの抗体の血漿レベルを提供するのに効果的な量の抗体組成物を投与するのが好ましい。
【００５１】
当業者は、本発明のアンタゴニストがその意図する効果を有するか否かを容易に試験することができる。例えば、個体の上皮のサンプルに含まれる細胞について、投与された上記作用物質を検出する第二の試薬を用いて、インビトロで（またはエキソビボで）上記作用物質の存在を検査する。これは例えば、投与された作用物質に特異的な蛍光色素標識抗体（これは、次いでその後標準ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析によって測定される）でもよい。あるいは、投与された作用物質の存在をインビトロ（エキソビボ）で、個々の細胞の、それ自体標識された（例えば蛍光色素で）同じ作用物質との結合能力の消失または低下によって検出する。好ましい投与量はハリマウスポジティブ細胞の大部分の検出可能コーティングをもたらすべきである。コーティングは抗体ホモログの場合、１−１４日間持続するのが好ましい。
【００５２】
本発明の実施は、他に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来技術を利用する。これらは当業者の範囲内である。このような技術は文献に記載されている。例えば、下記を参照されたい。分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＤＮＡクローニング、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）、１９８４：米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；転写と翻訳（ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；動物細胞の培養（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８７；固定細胞および酵素、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６；分子クローニングの実際的指針Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４；酵素学における方法、１５４および１５５巻（Ｗｕら、編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；哺乳動物細胞の遺伝子伝達ベクター（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；細胞および分子生物学における免疫化学的方法（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８７；実験免疫学ハンドブック、Ｉ−ＩＶ 巻Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、 １９８６；マウス胚の操作、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓＰｒｅｓｓ、１９８６。
【００５３】
下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、それを制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例）
（化学的試薬）
蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。クロトン油はＩＣＮＢｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ（オーロラ、ＯＨ）から購入した。Ａｌｓｅｖｅｒｓ溶液中の全ヒツジ血液はＥａｓｔ Ａｃｒｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（サウスブリッジ、ＭＡ）から得た。Ｉ型ラット尾コラーゲンおよびＩＶ型マウスコラーゲンはそれぞＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓ．（ベドフォード、ＭＡ）およびＧｉｂｃｏ（ゲイザースバーグ、 ＭＤ）から購入した。
【００５５】
齢６−８週のＢａｌｂ／ｃ雌マウスはタコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）（ゲルマンタウン、 ＮＹ）から購入し、そしてＢａｌｂ／ｃバックグラウンドのα１β１インテグリン−欠乏マウスは前述のようであった（３）。
【００５６】
（実施例１）
（モノクローナル抗体）マウス抗原に対する機能ブロッキングｍＡｂをアジドを含まない形式および低エンドトキシン形式で作製した：Ｈａ３１／８（ハムスター抗ＣＤ４９ａ；インテグリンα１）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２巻：３６７−３７５頁）、Ｈａｌ／２９（ハムスター抗ＣＤ４９ｂ；インテグリンα２）（β１）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９５、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２巻３６７−３７５頁；ＭｅｎｄｒｉｃｋおよびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ１９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９巻：６９０−７０２頁）、ハムスターＩＩ群コントロールｍＡｂ Ｈａ４／８（ハムスター抗ＫＬＨ）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．およびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９巻：６９０−７０２頁）、およびＰＳ／２（ラット抗ＣＤ４９ｄ；インテグリンα４β１鎖）（Ｍｉｙａｋｅら、１９９１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７３巻：５９９−６０７頁）。さらに、下記のマウス抗原に対する機能ブロッキングｍＡｂをアジドなし／低エンドトキシン調製物としてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した：ＨＭβ１−１（ハムスター抗ＣＤ２９；インテグリンβ１鎖）（Ｎｏｔｏら、１９９５ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７巻：８３５−８４２頁）、Ｈａ２／５（ハムスター抗ＣＤ２９；インテグリンβ１鎖）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．ＬおよびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９巻：６９０−７０２頁）、３Ｅ２（ハムスター抗ＣＤ５４、ＩＣＡＭ−１）Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓら、１９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０巻：６５５−６６３頁）、５Ｈ１０−２７（ラット抗ＣＤ４９ｅ；インテグリンα５）（Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｔ．およびＴ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９４、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ２０巻：２５−４４頁）、ＧｏＨ３（ラット抗ＣＤ４９ｆ；インテグリンα６）（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１０３７６−１０３８３頁）およびラット アイソタイプコントロールｍＡｂ Ｒ３５−９５（ラットＩｇＧ２ａ）およびＲ３５−３８（ラットＩｇＧ２ｂ）。
【００５７】
（接着アッセイ）Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞を２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２と共に７−１２日間培養した。Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンに対する細胞の接着は既述のようであった（Ｇｏｔｗａｌ）ら、１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７巻：２４６９−２４７７頁）。つまり、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｉｅｒｖｉｌｌ、ＩＬ）に１０μｇ／ｍｌのＩＶ型または５μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンのいすれかをコーティングし、そして非特異的部位を１％ＢＳＡでブロックした。ＩＬ−２活性化脾細胞を２μＭ ＢＣＥＣＦ［２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）カルボキシル フルオレセイン ペンタ アセトキシメチルエステル］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユーゲン、ＯＲ）で標識化し、示したｍＡｂ１０μｇ／ｍｌと共に１５分間インキュベートした。次いで、コーティングしたウェルにＲＰＭＩ中０．２５％ＢＳＡ中１０5細胞を加え、そして３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ中０．２５％ＢＳＡで３回洗って未結合細胞を除去した。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ２３５０蛍光プレート・リーダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベドフォード、ＭＡ）を用いて接着を定量した。入力した細胞に対する結合細胞の割合を測定し、コントロールｍＡｂ処理細胞（１００％に正規化した）に対するパーセント接着を計算した。ＢＳＡのみでコーティングしたウェルに起因する細胞接着によるバックグラウンド値を差し引いた。
【００５８】
（活性化白血球上のα１β１およびα２β１の発現および機能遮断）炎症において白血球が重要な役割を演ずると仮定して、本発明者は抗α１および抗α２ｍＡｂが白血球のコラーゲンへの接着をブロックすることができるかどうかを試験した。α１およびα２の両方の高レベルを発現する白血球を得るために、マウスＴ細胞をインビトロでＩＬ−２で７−１２日間刺激した。これらの細胞はα１もα２も高レベルに発現し（図１Ａ）、コラーゲンＩＶ型およびＩ型をコーティングした両方の表面にも良好に結合した（図１Ｂ）。ＩＶ型コラーゲンへの接着は抗α１ ｍＡｂ単独によって一部分阻止され、抗α２ ｍＡｂ単独では阻止されなかった。対照的に、Ｉ型コラーゲンへの接着は抗α２ ｍＡｂによって完全に阻止され、抗α１ ｍＡｂ単独では部分的阻止のみを示した。抗β１ｍＡｂおよび抗α１と抗α２との組み合わせの両方は、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンへの接着を完全に阻止した。α１β１およびα２β１インテグリンが活性化Ｔ細胞に発現され、抗α１およびα２ ｍＡｂがコラーゲンへの白血球接着を機能的にブロックし得ることが証明されたので、本発明者はこれらのｍＡｂを用いて炎症性疾患の動物モデルにおけるこれらインテグリンのインビボでの役割を研究した。
【００５９】
（実施例２）
（抗インテグリンｍＡｂによるＤＴＨ応答の阻止）以前刊行されたプロトコル（（Ｈｕｒｔｒｅｌら、１９９２、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２巻：２５２−２６３頁）を若干変えて、ＳＲＢＣ誘起性遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を起こした。つまり、０日目にマウスの背中に１００μｌ ＰＢＳ中２×１０7ＳＲＢＣを皮下注射することによってマウスを免疫した。そのマウスを、５日目に、右後肢の足蹠に２５μｌＰＢＳ中１×１０8ＳＲＢＣを皮下注射することによってチャレンジした。足蹠の厚さを抗原チャレンジの２０時間後に工学的ノギス（ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ ｃａｌｉｐｅｒ）（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ／ＭＴＩ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）で測定し、足蹠の腫脹程度を計算した。結果を足蹠厚さの平均増加パーセント±ＳＥＭとして報告し、％増加＝［１−（抗原チャレンジの２０時間後の右足蹠厚さ／抗原チャレンジの２０時間後の注射しなかった左足蹠厚さ）］×１００として計算した。ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨ応答のエフェクター相をブロックするために、治療的またはコントロールｍＡｂ（１００μｇ）（実施例１に記載の方法で作製された）を、５日目に抗原チャレンジする１時間前に腹腔内投与した。
【００６０】
ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨは炎症、特に乾癬のよく特徴づけられたインビボモデルである。これは炎症における種々のサイトカインおよび接着分子の重要性を示すために用いられている（Ｔｅｄｄｅｒら、１９９５ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１巻：２２５９−２２６４頁、Ｔｅｒａｓｈｉｔａら、１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５６巻：４６３８−４６４３頁）。ＳＲＢＣ感作マウスに足蹠抗原チャレンジの１時間前に抗インテグリンｍＡｂを受けさせ、２０時間後に増加した足蹠厚によって炎症を測定し、評価した。ＰＢＳおよびコントロールハムスターＩｇ処理マウスは抗原チャレンジの２０時間後に足蹠厚さの６０−７０％の増加を示した（図２）。コントロールハムスターＩｇ処理に比較して、抗α１または抗α２ ｍＡｂは足蹠厚において６８％および６０％阻止をそれぞれ生じた。抗α１およびα２ ｍＡｂの組み合わせは７１％阻止し、抗α１または抗α２ ｍＡｂ単独を超える付加的効果はほとんど示さなかった。他の抗インテグリンｍＡｂでの処置もＤＴＨエフェクター応答を有効に阻止した。種々のｍＡｂ処理でみられる阻止程度は４９％（抗α４）、２３％（抗α５）、および５７％（抗α６）であった。最後に、一般的β１インテグリン・サブユニットのｍＡｂ遮断（ｍＡｂ ＨＭＢＩ−１）はエフェクターＤＴＨ応答を６７％阻止した。
【００６１】
（実施例３）
（抗インテグリンｍＡｂによるＣＨＳエフェクター応答の阻止）ＦＩＴＣに対する接触過敏症（ＣＨＳ）を前述のようにアッセイした（Ｇａｓｐａｒｉら、 １９９１“免疫学における最新プロトコル”、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ニューヨーク。章４．２：１）。つまり、マウスの毛を剃った背中に０日目に１：１アセトン／ジブチルフタレート中０．５％ＦＩＴＣ １００μｌを塗ることによりマウスを感作させた。１０日後、動物を各耳の両側に０．５％ＦＩＴＣ５μｌを塗布することによりチャレンジした。耳の腫脹応答を工学的ノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ／ＭＴＩ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）で、抗原チャレンジ時（１０日目）および２４時間後に測定した耳の厚さにより決定し、そして結果をベースラインの耳の厚さの平均増加パーセント±ＳＥＭとして報告した。耳の厚さの増加は、％増加＝［１−（抗原チャレンジの２４時間後の耳の厚さ／抗原チャレンジ時の耳の厚さ）］×１００として計算した。ＣＨＳ応答のエフェクター相をブロックするために、治療的またはコントロールｍＡｂ（２５０μｇ）を１０日目の抗原チャレンジの４時間前に腹腔内に与えた。抗原に感作し、そしてビヒクルのみを耳にチャレンジしたマウス（ビヒクルコントロール）、またはあらかじめ感作させずに耳をチャレンジしたマウス（刺激性コントロール）をネガティブコントロールとした（耳の厚さは２％以上増加することはなかった）。
【００６２】
ＣＨＳが機構的にＤＴＨと区別され、そして異なるエフェクター細胞を含むと仮定して、本発明者はＣＨＳ応答のエフェクター相に対して抗インテグリンｍＡｂがどんな影響を有するかを研究した。マウスの毛を剃った背中へのＦＩＴＣ塗布を用いてマウスをハプテン感作した。１０日後に耳にＦＩＴＣチャレンジすると翌日炎症性応答が起きた。ＦＩＴＣ感作マウスは抗原チャレンジの２４時間後には厚さの６０−７０％の増加を示した（図３）。公開されている結果（Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０巻：６５５−６６３頁）と一致して、抗ＩＣＡＭ−１ ｍＡｂ処置は耳の腫脹の５１％阻止を起こした。コントロールハムスターｍＡｂと比較して、抗α１または抗α２ｍＡｂを抗原チャレンジの４時間前のマウスの処置は、耳の腫脹のそれぞれ３７％および５７％の阻止を起こした（図３）。抗α１および抗α２ ｍＡｂの組み合わせは耳の腫脹の若干大きい阻止を起こした（６５％）。β１インテグリンに対する他のｍＡｂでの処置は、抗α４および抗５ｍＡｂがコントロールラットｍＡｂに比較する場合、ＦＩＴＣ誘起性ＣＨＳエフェクター応答を阻止しなかったのに対し、抗α６ ｍＡｂでの投与はエフェクター応答を８６％阻止することが明らかになった。最後に、一般的β１インテグリンサブユニットのｍＡｂ遮断はＣＨＳエフェクター応答を７４％阻止した。異なる種のマウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２９／Ｓｖ）および異なる感作剤（オキサゾロン）を用いて同様のＣＨＳ結果が得られた（データは示されず）。ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨモデルにみられる結果と同様に、炎症耳の組織学的分析は、浮腫形成も白血球浸潤も両方とも抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置によって阻止されることを明らかにした。
【００６３】
α１β１およびα２β１がＩＬ−２活性化脾細胞上に発現し得るという発見と一致して、抗原感作マウス（ＦＩＴＣまたはオキサゾロン）からのリンパ節の分析は、α１β１およびα２β１が専らＣＤ４４hiＬＦＡ−１hi活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に発現されることを明らかにした（データは示されず）。抗α１および抗α２ ｍＡｂを用いるマウスの処置は、これら細胞の消失を生じなかった；ＣＨＳモデルにおいて抗原感作に対して見られる脾臓およびリンパ節の両方の活性化Ｔ細胞の数が影響を受けなかったからである。それに加えて、抗原感作マウスに抗α１および抗α２ ｍＡｂで長期処置した際（１０−１６日）、２０日目に抗原でチャレンジしたマウスの炎症性応答には影響がなかったように、エフェクター細胞は機能的には欠失していなかった（データは示されず）。
【００６４】
（実施例４）
（ＣＨＳエフェクター応答はα１β１欠乏マウスでは減少する）ＦＩＴＣ仲介性ＣＨＳのエフェクター応答においてα１β１の阻止的役割がｍＡｂ仲介性である可能性を排除するために、野生型およびα１β１インテグリン欠乏マウスで実験を行った（図４）。野生型マウスにおけるエフェクター相のｍＡｂ阻止はこれまでの結果と一致し、抗α１では耳の厚さの５６％阻止を伴い、抗α２では５６％阻止が、抗α１と抗α２との組み合わせでは６２％の阻止を伴った。ＣＨＳのエフェクター相は未処置α１β１欠乏マウスでは未処置野生型マウスと比較して有意に減少した（耳の厚さの増加においてそれぞれ３０％ 対 ７１％）。予想通り、未処置α１β１欠乏マウスにおける耳の腫脹レベルは抗α１ ｍＡｂ処置−野生型マウスに見られる耳の腫脹レベルに匹敵した。最後に、α１β１欠乏マウスにおけるα２β１のｍＡｂ遮断は、抗α１と抗α２ ｍＡｂとの組み合わせで処置した野生型マウスに見られる結果と一致して、耳の腫脹の阻止をごくわずか高めたに過ぎなかった。
【００６５】
（実施例５）
炎症のＤＴＨおよびＣＨＳモデル両方に見られる抗インテグリンｍＡｂの阻止効果が抗α１および抗α２ ｍＡｂによって仲介される一般的抗α１炎症効果によって引き起こされる可能性もさらに排除するために、これらｍＡｂの刺激性皮膚炎に対する効果を研究した。
【００６６】
刺激性皮膚炎を評価するために、マウスの各耳の両側にアセトン中０．８％クロトン油５μｌを塗った。治療的またはコントロール抗体を刺激適用の４時間前に与えた。２４時間後に耳の腫脹を前記のように測定し、そしてクロトン油塗布前の耳の厚さと比較した。結果は上記のようにベースラインの耳の厚さの平均増加パーセント±ＳＥＭとして報告する。アセトンのみを塗布したマウス（ビヒクルコントロール）をネガティブコントロールとした。
【００６７】
２４時間後、クロトン油で処置したマウスの耳は、ビヒクルのみ（アセトン）を塗布したマウスに比較する場合、耳の厚さの有意な増加を示した（４８％）。クロトン油によって誘起される毒性耳腫脹は、抗α１または抗α２ ｍＡｂで前処置したマウスでは、ＰＢＳまたはコントロールｍＡｂ処置動物のいずれかと比較して有意な影響を受けなかった（図５）。クロトン油処置した耳の組織検査は、抗α１または抗α２ ｍＡｂ処置マウスと、コントロールｍＡｂ処置マウスまたはＰＢＳ処置マウスとを比較して、浸潤細胞の数またはタイプ、または浮腫生成において何ら差を示さなかった（データは示されず）。
【００６８】
（実施例６）
（α１β１およびα２β１による関節炎の阻止）α１β１は関節炎患者の滑液中の浸潤細胞によく発現することから、本発明者は以前に記載された加速性関節炎モデル（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２２巻：１３７−１４７頁）において抗α１または抗α２ ｍＡｂが阻止的に作用するかどうかを試験することにした。
【００６９】
アルスロゲン−ＣＩＡ抗体キットをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョラ、ＣＡ）から購入し、そして十分確立されたプロトコルを用いて関節炎を誘発した（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２２巻：１３７−１４７頁）。つまり、４種類の抗コラーゲン ＩＩ型ｍＡｂ（各１ｍｇづつ）の混合物を０日目に腹腔内注射し、続いて３日目に５０μｇＬＰＳを腹腔内注射することによって関節炎を誘発した。次の３−４日間にマウスは、腫脹した手首、足首およびを発生した。治療的またはコントロールｍＡｂ（２５０μｇ）の腹腔内注射を、０日目の抗コラーゲンｍＡｂの注射４時間前および３日目のＬＰＳ投与の４時間前に再度行われ、続いて実験期間中、３日目ごとに続けられた。３日目からマウスの関節炎発生を評価した。各肢の関節炎の重症度を４ポイント系を用いてスコア付けした。０＝正常；１＝足首または手首に軽度の赤み、またはわずかの腫脹；２＝足首または手首の中程度の腫脹；３＝いくつかの指、足首および足を含む重度の腫脹：４＝最大炎症。
【００７０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの重度の関節炎がＬＰＳ注射後７２時間以内に発生し、３週間を超えて持続した。抗コラーゲンｍＡｂ単独注射もＬＰＳ単独注射も、関節炎を誘発しなかった。コントロールｍＡｂ処置を受けたマウスはＰＢＳ処置マウスにみられるものと同程度の関節炎を示した（図６）。対照的に、抗α１ ｍＡｂ単独での処置は関節炎の実験期間中持続する顕著な減少（７８％）を示した。抗α２ｍＡｂ単独での処置は有益な効果を示し、コントロールｍＡｂ処置マウスと比較して関節炎スコアの３２％の減少を生じた。抗α１と抗α２ ｍＡｂとの組み合わせは抗α１ ｍＡｂ単独でみられるのと同様な程度の阻止を生じた。
【００７１】
（実施例７）
（抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置の炎症性細胞浸潤に与える影響の組織学的分析）ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨ応答のさらなる組織学的分析は、抗α１および抗α２ ｍＡｂ治療の、誘起された炎症性応答を調節する能力を確認した（図７）。ＳＲＢＣ感作マウスからの非チャレンジ足蹠（図７パネルＡ）は、同じマウスからのＳＲＢＣチャレンジ足蹠（図７パネルＢ）に比較して炎症性細胞性浸潤物を実質的には示さなかった。抗α１および抗α２を単独または組み合わせでのＳＲＢＣ感作マウスの処置は、ＳＲＢＣチャレンジ足蹠に見いだされるこれら浸潤細胞の数を、コントロールｍＡｂ−処置マウスと比較する場合、著しく減少した（図７パネルＣ−Ｆ）。浸潤細胞をより綿密に試験は、大部分の細胞が好中球からなり、若干の単球とリンパ球が存在していることを明らかにし、そして抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置がこれらの細胞数を著しく減らすことが確認された（図７パネルＧ−Ｈ）。
【００７２】
（実施例８）
（炎症性細胞浸潤物中のα１発現細胞の免疫組織化学的証明）浸潤細胞の性質をより精細に決定し、それらがコラーゲン結合インテグリンを発現するかどうかを決定するために免疫組織化学を行った（図８）。非処置マウスの炎症足蹠からの浸潤細胞についてα１β１インテグリンおよび細胞系統マーカーの発現について試験した（図８）。α１β１インテグリンは多くの浸潤白血球上に発現することが見出された（図８Ａ）。二重免疫組織化学を用いて浸潤細胞の性質およびα１β１発現の分布を同定した（図８Ｂ）。細胞系統マーカーを用いて、浸潤物がほとんど顆粒球／単球（Ｍａｃ−１＋）からなり、これら細胞の多くが好中球（Ｇｒ１＋）であり、加えて、少数がＴリンパ球（ＣＤ３＋）であることを見いだした（図８Ｂ）。α１β１インテグリンの発現は細胞の３サブセット全ての間に見いだされ、α１はＭａｃ−１＋顆粒球／単球のサブセット、Ｇｒ１＋好中球のサブセット、および浸潤ＣＤ３＋ Ｔリンパ球の大部分に発現した（図８Ｂ）。詳細な免疫組織化学分析は、抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置が浸潤細胞数を減らすとはいえ、浸潤物中の細胞組成には変化が見られないことを明らかにした（データは示されず）。ＦＩＴＣ抗ハムスターｍＡｂでの免疫組成化学的染色は、抗α１および抗α２ ｍＡｂが炎症足蹠に局在化する能力を確認した（データは示されず）。
【００７３】
（実施例９）
（α１β１およびα２β１に対するｍＡｂによる関節炎の阻止およびα１欠乏マウスにおける関節炎の阻止）α１β１は関節炎患者の滑液中に浸潤する細胞に良好に発現されることから、本発明者は抗α１または抗α２ ｍＡｂがこれまで記載された（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２２巻：１３７−１４７頁）加速性関節炎モデルにおいて阻止的であるかを試験することにした。このモデルは、抗コラーゲンＩＩ型ｍＡｂの混合物をマウスに注射し、続いて、ＬＰＳを投与し、次の３−７日間に関節炎を発生させることを含む。マウスに０日から始めて、３日目ごとにｍＡｂを投与し、３日目ごとに関節炎の発生をスコア付けした。ＬＰＳ注射後７２時間以内に全てのマウスに重症な関節炎が発生し、３週間以上持続した。抗コラーゲンｍＡｂ単独の注射も、ＬＰＳ単独の注射も関節炎を引き起こさなかった。コントロールｍＡｂ処置を受けたマウスはＰＢＳ処置マウスに見られるのと同様にひどい関節炎を示した。これに対し、抗α１ｍＡｂ単独での処置は関節炎の顕著な減少（７９％以上）を示し、それは実験期間中持続した。抗α２ ｍＡｂ単独での処置もまた有益な効果を有し、コントロールｍＡｂ処置マウスに比較して関節炎スコアの３７％の減少を起こした。抗α１および抗α２ｍＡｂの組み合わせは抗α１ｍＡｂ単独で見られるものと同様程度の阻止を生じた。抗α１ｍＡｂ処置での関節炎スコアの減少は全てのマウスに見られ、そして以下のようないくつかの他のｍＡｂベースの関節炎治療に好都合に匹敵する：可溶性ＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質（Ｍｏｒｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７巻：３１７８−３１８２頁）、抗Ｍａｃ−１（Ｔａｙｌｏｒら、１９９６ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８８巻：３１５−３２１頁）、抗α４（Ｓｅｉｆｆｇｅ １９９６ Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２３巻：２０８６−２０９１頁）、および抗ＩＣＡＭ−１（カキモトら、１９９２ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２巻：３２６−３３７頁）（図９Ａ）。関節炎におけるα１β１の重要な役割を示すｍＡｂベースのデータと一致して、非処置α１欠乏マウスは野生型マウスに比較して関節炎スコアの顕著な減少を示した（図９Ｂ）。
【００７４】
（実施例１０）
（関節炎関節の免疫病態学に与える抗α１ｍＡｂ処置の影響）コントロールｍＡｂまたは抗α１ｍＡｂのどちらかの投与を受けた野生型関節炎マウス（８日目）からの関節を視覚的に、および組織学的に、正常非投与マウスからの関節と比較した（図１０）。視覚的に、コントロールｍＡｂ処置マウスからの関節は、指を含む足全体の赤さおよび腫脹を示したが、抗α１ ｍＡｂ処置マウスは関節または指のいずれかに炎症の兆候をほとんどまたは全く示さなかった。組織検査はコントロールｍＡｂ処置した関節炎関節に重度の変化を示し、それは炎症細胞を含む滑膜下組織の広範な浸潤、細胞の関節表面への付着、およびプロテオグリカン消失によって証明される著しい軟骨破壊を伴った（図１０）。これまでの報告（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２巻：１３７−１４７頁）と一致して、このモデルにおける浸潤細胞の大部分は好中球である。マウスの抗α１ ｍＡｂ投与は炎症性浸潤物の量および軟骨破壊の程度を劇的に減らした（図１０）。
【００７５】
（実施例１１）
（関節炎の発生はリンパ球の非存在下では遅れ、そして抗α１ ｍＡｂによる関節炎の阻止はリンパ球の非存在下で起きる）コラーゲンｍＡｂ−誘起性関節炎モデルにおいて重要な細胞型を確認するために、野生型Ｂ６−１２９マウスおよびＲＡＧ−１−欠乏Ｂ６−１２９マウスの関節炎発生能力を比較した（図１１）。ＲＡＧ−１（組み換え活性遺伝子−１）の遺伝子欠失は成熟ＴおよびＢリンパ球の完全な消失を起こす（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９２ Ｃｅｌｌ ６８巻：８６９−８７７頁）。野生型およびＲＡＧ−１−欠乏マウスの両方に関節炎が発生したが、ＲＡＧ−１−欠乏マウスにおける誘発速度の方が有意により遅い（図１１）。これらの結果は、リンパ球がこの関節炎モデルに関係はしているが、それらはこの疾患の発生および進行のためには必要ないことを示唆する。他の関節炎モデルでＲＡＧ−１欠乏マウスの効果を試験した公表された報告も、ＴおよびＢリンパ球の喪失が関節炎の発生を遅らせることを見いだした（Ｐｌｏｗｓら、１９９９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２巻：１０１８−１０２３頁）。抗α１ ｍＡｂでの野生型またはＲＡＧ−１−欠乏マウスのいずれの処置も関節炎を完全に阻止した（図１１）。これらの結果は、このモデルでは抗α１ ｍＡｂの有効性はリンパ球の存在には依存せず、前の実験が示唆したように（図９）、抗α１ ｍＡｂの疾患防止効果は他のα１発現細胞（例えばマクロファージおよび好中球）に対するその作用を介し得ることを示している。
【００７６】
（実施例１２）
（関節炎の抗α１ ｍＡｂ阻止の用量応答）抗α１ ｍＡｂ処置が関節炎予防に対して明らかな効果を有すると仮定して、本発明者はこれらの研究を用量応答分析にまでひろげた（図１２）。異なる用量のｍＡｂを０日目から始めて３日目ごとに腹腔内投与した。以前のデータと一致して、抗α１ ｍＡｂ２５０μｇ用量はほぼ完全に関節炎を予防した。１００μｇのより少量の抗α１ｍＡｂはこのモデルにおいて関節炎予防に一部有効であったが、これより少い用量は関節炎スコアにいかなる認め得る効果を与えなかった（図１２）。
【００７７】
（実施例１３）
（抗α１ ｍＡｂでの治療的処置は関節炎スコアを減らすことができる）関節炎予防における抗α１ ｍＡｂの効果を仮定して、本発明者は、この疾患を発生しつつあるマウスを治療することを試みた。０日目に抗コラーゲン ＩＩ型ｍＡｂの混合物を注射し、続いて、３日目にＬＰＳを投与することによってマウスに関節炎を誘発させた。次いで４日目から開始して、マウスに抗α１ｍＡｂまたは可溶性ＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質のどちらかを投与した。４日目から抗α１ ｍＡｂを受けたマウスでは、４日目から開始して、コントロールハムスターｍＡｂを受けたマウスに比較する場合、関節炎の進行は完全に阻止された（図１３）。抗α１ｍＡｂの治療的投与で見られる阻止の程度は完全であり、抗α１ ｍＡｂの予防的投与（０日目に開始）で見られるものに匹敵した（図１３）。比較して、４日目からのＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパクでの処置は、コントロールＩｇ融合タンパクに比較する場合、関節炎スコアの６０−７０％の抑制しか生じなかった（図１３）。抗α１ ｍＡｂとＴＮＦレセプターＩｇ融合との一緒の組み合わせは、関節炎スコアの完全阻止に有効であった。これは、関節炎の抑制による抗α１ ｍＡｂ処置単独での完全な効果を考慮すると、驚くにあたらない。以上をまとめると、これらの結果は、抗α１ ｍＡｂでの治療的処置が関節炎スコアの抑制に効果的であり、ＴＮＦアンタゴニストの治療的処置に好都合に匹敵することを示す。
【００７８】
（実施例１４）
（α１−Ｉドメインのクローニングおよび変異誘発）ヒトおよびラットα１β１インテグリンＩドメイン配列を、全長ｃＤＮＡｓから（Ｋｅｒｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、２２８１１−２２８１６頁；Ｉｇｎａｔｉｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１巻、７０９−７２０頁）ポリメラーゼ連鎖応答法（ＰＣＲ）（ＰＣＲ ＣＯＲＥキット；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、ドイツ）によって、下記のヒト特異的（５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＡ−３’［順方向］；５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴ−３’［逆方向］）またはラット特異的（５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＣＡＡ−３’［順方向］；５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＣＧＡＡＴＡＴ−３’［逆方向］）プライマーを用いて増幅した。生成したＰＣＲ増幅生成物を精製し、ｐＧＥＸ４ｔ−ｉ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合し、コンピテントなＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを、約４５ｋＤａグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−Ｉドメイン融合タンパク質の発現に関してスクリーニングした。さらに特徴づけるために選択したクローンのプラスミドＤＮＡの挿入物からの配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００７９】
ラット／ヒト キメラα１−Ｉドメイン（ＲΔＨ）を生成し（ＭＯＲＰＨ変異誘発キット；５プライム−３プライム）、ラット残基Ｇ９２、Ｒ９３、Ｑ９４、およびＬ９７（図１４）を対応するヒト残基、Ｖ、Ｑ、Ｒ、およびＲにそれぞれ交換した。上記ＲΔＨＩドメインを有するクローンは、診断的Ｓｔｕ１制限酵素部位の欠失によって同定され、挿入物はＤＮＡ配列決定によって確認された。ヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列は図１５に示される。
【００８０】
（実施例１５）
（α１Ｉドメインに特異的なｍＡｂの生成）モノクローナル抗体はインテグリンサブユニットの構造と機能との関連性の研究において非常に有用なプローブであることが証明された。例えばｍＡｂを広く用いて、活性化コンホメーションと関連するβ１サブユニットの領域が研究された（Ｑｕ，ＡおよびＬｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４巻、９３１−９４２頁）。従って、α１−Ｉドメインのコンホメーション変化のための潜在的プローブを同定するために、本発明者はヒトα１−Ｉドメインに対するｍＡｂのパネルを作成した。
【００８１】
（抗α１Ｉドメイン モノクローナル抗体の作製）雌ロバートソンマウス（ジャクソン研究所）を完全フロイントアジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｉｅｓ）で乳濁化した２５μｇ精製ヒトα１β１（エドワーズら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻：１２６３５−１２６４０頁）で腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫した。これらを、不完全フロイントアジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｉｅｓ）で乳濁化した２５μｇα１β１を３回腹腔内ブーストした。最も高い抗α１−Ｉドメイン力価を有するマウスに、融合の３日前に１００μｇのα１β１を腹腔内ブーストし、そして融合の前日に５０μｇのα１β１を静脈内注射した。脾細胞をＦＬ６５３骨髄腫細胞と１：６の比率で融合し、９６ウェル組織培養プレートに1ウェルあたり１００，０００および３３，０００で培養した。
【００８２】
上清液について、単色ＦＡＣＳによってα１β１インテグリンへの結合性をアッセイした。ＦＡＣＳ分析の前に、上清液を非トランスフェクトしたＫ５６２細胞と共にインキュベートして、βサブユニットに単に結合しているＩｇＧを除去した。続いて、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＮａＮ3を含むＰＢＳ中１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））に懸濁したα１インテグリンサブユニット（Ｋ５６２−α１）でトランスフェクトした３−５×１０4個のＫ５６２細胞を上清液と共に４℃で４５分間インキュベートし、洗浄し、そしてフィコエリスリンに結合した抗α１マウスＩｇＧと共にインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗った後、細胞をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。
【００８３】
生成したハイブリドーマからの上清液を、α１−Ｉドメインへの結合性に関してスクリーニングした。つまり、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌヒトα１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合体５０μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｋ）のウェル上に４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックし、そしてハイブリドーマ上清液をＩドメインと共に室温で１時間インキュベートした。０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでよく洗った後、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｊａｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、さらに１時間インキュベートした。最後の洗浄後、０．１Ｍグリシン、１ｍＭ ＺｎＣｌ2、および１ｍＭ ＭｇＣｌ2中１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を室温で３０分間加え、プレートをＯ．Ｄ．４０５で読み取った。
【００８４】
選択した上清液について、コラーゲンＩＶへのＫ５６２−α１依存性接着を阻止するそれらの能力を試験した。Ｋ５６２−α１細胞を、０．２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中２ｍＭの２’，７’（ビス−２−カルボキシエチル−５および６）（ｂｉｓ−２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ−５ ａｎｄ ６）カルボキシフルオレッセイン ペンタアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で３７℃で３０分間標識化した。標識細胞を結合緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、 ｐＨ７．４；０．９％ＮａＣｌ；および２％グルコース）で洗い、結合緩衝液プラス５ｍＭ ＭｇＣｌ2中に最終濃度１×１０6細胞／ｍｌになるように再懸濁した。上清液５０μｌを、９６ウェルプレートで１ウェルあたり、等容量の２×１０5個のＫ５６２−α１細胞と共にインキュベートした。次いで、そのプレートを遠心分離し、上清液を除去した。細胞を結合緩衝液に再懸濁し、コラーゲンコーティングプレートのウェルに移し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、結合緩衝液で３回洗うことにより未接着細胞を除去した。接着した細胞をＣｙｔｏｆｌｕｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。
【００８５】
本発明者は最初に１９ハイブリドーマを同定した。その上清液はα１β１インテグリン（Ｋ５６２−α１）を発現するヒト白血病Ｋ５６２細胞に、そしてα１−Ｉドメインに結合した。これらのハイブリドーマの各々から免疫グロブリンを精製し、コラーゲンＩＶに結合するＫ５６２−α１またはα１−Ｉドメインのいずれかをブロックする能力について試験した。ｍＡｂは２クラスに分けられた：α１β１機能をブロックするクラスとブロックしないクラス。例えばクローンＡＥＦ３、ＢＧＣ５およびＡＪＨ１０によって産生するｍＡｂはα１−Ｉドメインに結合するが（図１６Ａ、ＢＧＣ５に関してはデータは示されず）、ｍＡｂ ＡＪＨ１０だけがコラーゲンＩＶに対するα１−Ｉドメイン−依存性（図１６Ｂ）またはＫ５６２−α１（図１６Ｃ）接着を阻止する。
【００８６】
（相補的決定領域の配列決定）このｍＡｂパネルのクローン起源を確立するために、本発明者はＰＣＲによって増幅し、そして１９抗体のうち１２抗体からのＣＤＲを配列決定した（データは示されず）。
【００８７】
１０7ハイブリドーマ（ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ分離キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から分離したｍＲＮＡ２μｇを、下記のプライマーそれぞれ２５ｐＭを用いて逆転写した（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ）：重鎖ＶＨ１ＦＯＲ−２（Ｍｉｄｈｉｓｈｉｔａら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２巻、８５７−８６７頁）；軽鎖、ＶＫ４ＦＯＲ（これは４個の別々のオリゴを決める）（Ｋｅｒｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：２２８１１−２２８１６頁）。各ハイブリドーマで、重鎖および軽鎖を下記のオリゴの種々の組み合わせを用いて４つの別個のＰＣＲ応答で増幅した：１）重鎖：ＶＨ１ＦＲ１Ｋ（Ｋａｍａｔａら（１９９５）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻：１２５３１−１２５３５頁）、ＶＨ１ＢＡＣＫ（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６巻：９２３−９３５頁）、ＶHｆｒ１ａ、ＶHｆｒ１ｂ、ＶHｆｒ１ｅ、ＶHｆｒ１ｆ、ＶHｆｒ１ｇ（Ｉｇｎａｔｉｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１巻：７０９−７２０頁）、またはＶＨ１ＦＯＲ−２（Ｍｉｃｈｉｓｉｔａ，Ｍ．、Ｖｉｄｅｍ，Ｖ．、およびアルノート（Ａｒｎａｏｕｔ，Ｍ．Ａ．）ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２巻、８５７−８６７頁）；２）軽鎖：ＶＫ１ＢＡＣＫ（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６巻：９２３−９３５頁）、ＶＫ４ＦＯＲ、ＶＫ２ＢＡＣＫオリゴ（ケルンら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：２２８１１−２２８１６頁）またはＶkｆｒ１ａ、ＶHｆｒ１ｃ、ＶHｆｒ１ｅ、ＶHｆｒ１ｆ（イグナチウスら（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．１１１巻：７０９−７２０頁）。生成物を増幅し（９５℃で５分、９４℃で１分を５０サイクル、５５℃で２分、７２℃で２分、最終サイクルは７２℃で１０分）、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ）、列挙せる種々のオリゴを用いてＡＢＩ３７７ Ａｅｑｕｅｎｃｅｒで直接配列決定した。
【００８８】
機能ブロッキングｍＡｂを産生するクローンからの配列は全ての相補的決定領域（ＣＤＲ）および介在フレームワーク領域にわたりほぼ一致し、これらのハイブリドーマがクローン的（Ｃｌｏｎａｌｌｙ）に関連があることを示唆する。
【００８９】
（実施例１６）
（免疫ブロッテイングおよびＦＡＣＳ分析）非ブロッキング抗体（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の可変領域の配列は、阻止抗体で見いだされるクローン的に関連がある配列のファミリーとは著しく異なっていた。阻止抗体が単一クローンに由来するようにみえることから、本発明者は一つ（ＡＪＨ１０）を選択し、さらに詳しく特徴づける。
【００９０】
（免疫ブロッテイング）ヒツジ大動脈から切り取った平滑筋細胞層およびＫ５６２−α１細胞を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）２０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で抽出した。サンプルを４−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロッテイング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）した。それらのブロットをＴＢＳ中５％ドライミルクでブロックした；０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ中で洗い、０．０５％ＮａＮ3を含むブロッキング緩衝液中の抗体と２時間共にインキュベートした。次いで、ブロットを前のように洗い、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧと共に１時間インキュベートし、再び洗い、次いで、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理した。次いで、ブロットをフィルム（Ｋｏｄａｋ）に３０〜６０秒間曝し、現像した。
【００９１】
免疫ブロッテイング（図１７Ａ）およびＦＡＣＳ分析（図１７Ｂ）は、ＡＪＨ１０がヒト、ウサギ、およびヒツジα１β１インテグリンとは応答するが、ラットα１β１インテグリンとは応答しないことを示し、これは、ブロッキングｍＡｂが進化的に保存された線状エピトープに結合することを示唆する。非ブロッキングｍＡｂは免疫ブロッテイングにおいても効率的でなく、またヒト以外の種とも応答しなかった。
【００９２】
（実施例１７）
（α１−Ｉドメインのコラーゲンへの結合は二価カチオン依存性である）
（Ａ．α１−Ｉドメインの精製）
α１−ＩドメインはＥ．ｃｏｌｉにおいて配列の結合部にトロンビン切断部位を含むＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として発現される。ＰＢＳ中で溶解した細胞からの清澄な上清液を、ＰＢＳでよく洗ったグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。α１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５ｍＭグルタチオン（還元型）で溶出した。変性研究では、Ｉドメインは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中のトロンビンで切断され、ＧＳＴ融合パートナーから精製された。ＤＴＴを２ｍＭになるように付加し、そのサンプルをグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムにロードした。フロースルーおよび洗浄フラクションをプールし、ＱセファロースＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。α１−Ｉドメインを５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、７５ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。精製Ｉドメインはエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、その予想質量（Ｌｅｅら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３巻、１３３３−１３４０頁、８７１Ｄａ）を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一バンドとして移動し、そして上記タンパク質はＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のサイズ排除クロマトグラフィーによって、 適切なサイズの単一ピークとして溶出した。
【００９３】
（Ｂ．機能分析）
９６ウェルプレートを１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）またはコラーゲンＩ型（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で４℃で一晩コーティングし、Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１ｍＭ ＭｎＣｌ2；２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗い、そして２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）でブロックした。１ｍＭ ＭｎＣｌ2および３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中のα１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質の一連の希釈物を、ものを、コーティングプレート上で室温で１時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝液で洗った。結合α１−Ｉドメインを１０μｇ／ｍｌビオチン化抗ＧＳＴポリクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；１ｍＭ ＭｎＣｌ2および３％ＢＳＡを含むＴＢＳで１：３０００に希釈したＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、および１−Ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ（２、２’−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリン スルホネート］；Ｐｉｅｒｃｅ）の連続添加によって検出した。プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でＯ．Ｄ．４０５で読み取った。
【００９４】
（結果）
ヒトおよびラット（ヒトに９５％同一）α１−ＩドメインをＥ．ｃｏｌｉでＧＳＴ−融合タンパクとして発現させ、そしてグルタチオン セファロース上で精製した。両タンパクについて、以前に記載されたＥＬＩＳＡベースのアッセイのバリエーションを用いてコラーゲンＩおよびＩＶへの結合を試験した（Ｑｕ，Ａ．およびＬｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２巻、１０２７７−１０２８１頁）。ヒトα１−ＩドメインはコラーゲンＩよりもコラーゲンＩＶにより効率的に結合する（図１８Ａ）。α１−Ｉドメインに特異的な抗体は両リガンドに対する結合を排除したが、α２−Ｉドメインに特異的な抗体は排除しなかった（図１８Ｂ）（コラーゲンＩのデータは示されず）。Ｍｎ2+もＭｇ2+も結合を刺激し、ＥＤＴＡはバックグラウンドレベルへの結合を減らした（図１８Ｃ）。ヒトおよびラットα１−Ｉドメインの間で、リガンド結合の顕著な差は検出されなかった。これは種間の配列の差は機能的に関係しないことを示唆する（データは示されず）。このように、 α１−Ｉドメインは特異的に、効率的リガンド結合のためのカチオンを必要とする。
【００９５】
（実施例１８）
（ＭＩＤＡＳモチーフ近くのカチオン依存性エピトープ残基）本発明者はＡＪＨ１０がヒトのα１−Ｉドメイン配列を識別するが、ラットのα１−Ｉドメイン配列は識別せず、α１β１機能ブロッキングｍＡｂのためのエピトープをマッピング（位置解析）するという知見を活用した。ヒトおよびラット配列は１２アミノ酸だけ異なり、そのうち４アミノ酸はＭＩＤＡＳモチーフ内の重要なスレオニン（図１４Ａ、ａａ９８）に隣接した６アミノ酸（ａａ９２−９７、図１４Ａ）の範囲にある。この６アミノ酸残基、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡｒｇがブロッキングｍＡｂのためのエピトープを含む、という仮定を試験するために、ラット残基Ｇ９２，Ｒ９３、Ｑ９４、およびＬ９７を、対応するヒト残基、Ｖ、Ｑ、Ｒ、およびＲにそれぞれ交換して、キメラＩドメイン（ＲΔＨ）を構成した。ＡＪＨ１０は、全ての機能ブロッキングｍＡｂと共に、キメラＩドメインを認識する（ＲΔＨ；図１４Ｂ）。
【００９６】
これらの残基を、α１−Ｉドメインの三次元構造のＭＩＤＡＳドメインに関して方向づけるために、本発明者はα２−Ｉドメインの結晶構造の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を用いてα１−Ｉドメインをモデル化した。
【００９７】
ヒトα１Ｉドメインのホモログモデルをヒトα２Ｉ−ドメインのＸ線結晶構造を用いて作製した（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻、５４４−５４６頁）。そのモデルはＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ のホモログモデル化モジュール（バージョン２．３．５；Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作製された。プログラムＣＨＡＲＭＭ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４−６２８頁）を、全水素パラメーターセット２２において原子間距離（ａｔｏｍ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）の２倍の距離依存性誘電率と共に用いた。本発明者は先ず最初に、α１−Ｉドメインの全ての原子に１ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ2）の質量調和位置制約を用いて、１０００段階の最急降下法による最小化を行った。この最小化の後に、さらに１０００段階の最急降下法および、５０００段階のＡｄｏｐｔｅｄ−Ｂａｓｉｓ Ｎｅｗｔｏｎ Ｒａｐｈｓｏｎ法による計算を行い、α１−ＩドメインのＣ−α原子を０．１ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ2）に制約し、α２−ＩドメインＸ線結晶構造からの有意な偏差を避けた。
【００９８】
α１β１およびα２β１インテグリン配列は５１％の同一性を示し、挿入または決失は示さなかった。これは２つのＩドメインの全体的構造が類似していることを示唆する。金属配位部位はα１−Ｉドメイン内の、α２−Ｉドメインの場合と同じ場所にあると予想される。そしてブロッキングｍＡｂのためのエピトープを含む残基類はヘリックスα３とヘリックスα４との間のループ（ここにはカチオン結合のために重要なＭＩＤＡＳモチーフ内のスレオニンが含まれる）上に位置する。上記のα１−Ｉドメインモデルは、Ｑ９２（図１４Ａ）のアミド窒素が、Ｉ３３（Ｓ３２に隣接する残基）のカルボニル基と水素結合することを予想する。従って、このエピトープを含む上記ループはＭＩＤＡＳ領域の安定化において機能的役割を果たし得る。
【００９９】
上記の発明を明確にするために図および実施例によって若干詳細に述べたが、或る種の変化および変更がなされることは当業者には明らかである。従って、上記説明および実施例は発明の範囲を制限すると解釈されるべきでなく、本発明は添付のクレームによって輪郭づけられるものとする。
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
インテグリンは、細胞相互のおよび細胞の周囲への接着を仲介する細胞表面分子の大きいクラスを形成する細胞表面タンパク複合体である。細胞類は多くの発達過程および生理的過程において互いに、およびその環境内のその他分子に、接着する必要がある。その例は組織および器官の形成およびそれらの統合維持を含む。これらの生理的過程には炎症性障害が含まれる。
炎症性過程における重要な工程の一つは、細胞が血管から組織に、そして感染部位に向かって遊出する段階を含む。この過程における接着分子の役割はしばしば以下を含む三段階モデルに分けられる；最初、白血球が炎症中の内皮に運搬され、次の段階でこれにしっかりと付着し、そして白血球の炎症組織への経内皮的移動を生じる（非特許文献１；非特許文献２）。炎症カスケードにおけるさらなる重要な段階で、そしてこれまで広くは研究されていない段階は、末梢組織内に起こる；ここでは既存の細胞と同様侵潤細胞もエフェクター機能を果たすために感染部位に移動し、異種抗原を識別し、そして細胞活性化を受ける必要がある。接着性相互作用が白血球の補充のために果たす役割とは別に、炎症における間隙の（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）接着性相互作用の重要性を直接評価するために、本発明者らはインテグリンファミリーの接着分子およびそのフラグメントの重要性、および動物炎症（特に関節炎）モデル、におけるそれらの役割に焦点を当てた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：１１−２５
【非特許文献２】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．、１９９２、Ｃｅｌｌ ７６：３０１−３１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は被験体の炎症性障害の治療法を提供する。特に本発明は関節炎の治療法を提供する。
【０００４】
より詳細には、本発明の被験体に有効量のα１β１機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含んでいる薬学的組成物を被験体に投与することを含む、被験体における炎症性障害の処置法を提供する。ここで、α１β１機能ブロッキング抗体またはフラグメントはアミノ酸残基９２−９７、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含むＶＬＡ−１のエピトープに結合することができる。
【０００５】
上記抗インテグリン抗体はヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそのフラグメントからなる群から選択され得る。抗インテグリン抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。
【０００６】
本発明はさらに、ヒトまたは動物被験体である被験体の炎症性障害の治療法を提供する。
【０００７】
前節に記載した全ての文献並びに下記の開示に含まれる引用文献は全て参考として本明細書に援用される。
【０００８】
本発明はさらに、例えば、以下を提供する。
（項目１）
被験体における炎症性障害の処置のための方法であって、その方法は、その被験体に薬学的組成物を投与する工程を包含し、その薬学的組成物は、その炎症性障害を処置するのに有効な量のα１β１機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含み、ここでそのα１β１機能ブロッキング抗体またはそのフラグメントは、ＶＬＡ−１のエピトープと結合し得、そしてここでそのエピトープは、図１５のアミノ酸残基９２〜９７を含む、方法。
（項目２）
関節炎の処置のための方法であって、その方法は、関節炎に罹患している被験体に、コントロール抗体処置した被験体と比較して約６５％以上の関節炎スコアの減少を提供するに有効な量で、機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含む組成物を投与する工程を包含し、ここでその機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントは、ＶＬＡ−１のエピトープと結合し得、ここでそのエピトープは、図１５のアミノ酸残基９２〜９７を含む、方法。
（項目３）
前記関節炎スコアの減少が約７９％以上である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記関節炎スコアの減少が約８５％以上である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記関節炎スコアの減少が約９０％以上である、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記抗体がモノクローナルである、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記被験体がヒトである、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記被験体が、慢性関節リウマチに罹患している、項目２〜７のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
モノクローナル抗体ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ番号 ）。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】活性化白血球上のコラーゲン結合インテグリンα１β１およびα２β１。（Ａ）ＩＬ２−活性化脾細胞（ｄ１１）上のα１およびα２β１インテグリン発現のフローサイトメトリー分析。細胞を、抗−α１ ｍＡｂ、抗α２ ｍＡｂ、または非結合コントロールｍＡｂ（灰色の線）のいずれかで標識し、その後ＦＩＴＣ−抗ハムスター免疫グロブリンで標識した。（Ｂ）コラーゲンへの白血球接着における抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの効果。１０5ＩＬ２活性化脾細胞を、上記のｍＡｂで１５分間処理し、その後ＩＶ型またはＩ型コラーゲン被覆ウェルのいずれかで３７℃で１時間培養した。実施例１に例示されるように接着を計算し、そしてコントロールｍＡｂ処理細胞と比較して、％接着としてあらわした。接着アッセイは３重に行われ、少なくとも３回の独立実験が行われた。代表的一実験が示される。
【図１Ｂ】活性化白血球上のコラーゲン結合インテグリンα１β１およびα２β１。（Ａ）ＩＬ２−活性化脾細胞（ｄ１１）上のα１およびα２β１インテグリン発現のフローサイトメトリー分析。細胞を、抗−α１ ｍＡｂ、抗α２ ｍＡｂ、または非結合コントロールｍＡｂ（灰色の線）のいずれかで標識し、その後ＦＩＴＣ−抗ハムスター免疫グロブリンで標識した。（Ｂ）コラーゲンへの白血球接着における抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの効果。１０5ＩＬ２活性化脾細胞を、上記のｍＡｂで１５分間処理し、その後ＩＶ型またはＩ型コラーゲン被覆ウェルのいずれかで３７℃で１時間培養した。実施例１に例示されるように接着を計算し、そしてコントロールｍＡｂ処理細胞と比較して、％接着としてあらわした。接着アッセイは３重に行われ、少なくとも３回の独立実験が行われた。代表的一実験が示される。
【図２】遅延型過敏症のエフェクター相における抗インテグリンｍＡｂの効果。ＳＲＢＣ感作マウスに、ＳＲＢＣチャレンジの１時間前に上記ｍＡｂを腹腔内注射した。抗原チャレンジの２０時間後に足蹠の厚さを測定し、実施例２に示すように結果を、足蹠の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。これらのデータはｎ＝７９（ＰＢＳ）、６８（コントロールハムスターＩｇ）、６８（抗−α１）、２９（抗−α２）、１８（抗−α１＋抗−α２）、４５（抗−α４）、１８（抗−α５）、２０（抗−α６）、および１０（抗−β１）の８実験をまとめたものである。使用したｍＡｂは、Ｈａ４／８（コントロールハムスターＩｇグループ２）、Ｈａ３１／８（抗−α１）、Ｈａ１／２９（抗−α２）、ＰＳ／２（抗−α４）、５Ｈ１０−２７（抗−α５）、ＧｏＨ３（抗−α６）、およびＨＭβ１−１（抗−β１）であった。
【図３】接触過敏症のエフェクター相における抗−インテグリンｍＡｂの効果。ＦＩＴＣ−感作マウスに、ＦＩＴＣチャレンジ４時間前に上記ｍＡｂを腹腔内注射した。耳の厚さをベースラインと２４時間後に測定し、結果を、実施例３に示すように耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。これらのデータは、９実験をまとめたものであり、 ｎ＝７４（ＰＢＳ）、６０（コントロールハムスターＩｇ）、２６（抗−ＩＣＡＭ−１）、４４（抗−α１）、４４（抗−α２）、３８（抗−α１＋抗−α２）、３６（抗−α４）、１６（抗−α５）、２６（抗−α４＋抗−α５）、２４（抗−α６）、および２２（抗−β１）である。使用したハムスターｍＡｂは、Ｈａ４／８（コントロールハムスターＩｇグループ２）、Ｈａ３１／８（抗−α１）、Ｈａ１／２９（抗−α２）、ＨＭβ１−１（抗β−１）、３Ｅ２（抗−ＩＣＡＭ−１）であった；使用したラットｍＡｂは、Ｒ３５−９５およびＲ３５−３８（それぞれコントロールラットＩｇＧ２ａおよびラットＩｇＧ２ｂ）、ＰＳ／２（抗−α４）、５Ｈ１０−２７（抗−α５）、ＧｏＨ３（抗−α６）であった。
【図４】野生型マウスに比較したα１−欠乏マウスにおける接触過敏症反応。ＦＩＴＣ感作マウスに、ＦＩＴＣチャレンジの４時間前に上記ｍＡｂを腹腔内注射した。耳の厚さをベースラインと２４時間後に測定し、結果を実施例４に示すように、耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。状態ごとに４〜５匹のマウス群を用い、全実験を少なくとも３回行った。代表的１実験が示される。
【図５】クロトン油誘起性非特異的炎症における抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの効果。耳にクロトン油を塗る４時間前に、マウスに上記ｍＡｂを腹腔内注射した。耳の厚さをベースラインと２４時間後に測定し、結果を、実施例５に示すように耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示した。状態ごとに４ないし５匹ののマウス群を用い、全実験を少なくとも３回行った。代表的一実験が示される。
【図６】コラーゲンｍＡｂ誘起性関節炎における抗−α１および抗−α２の効果。マウスに０日目に抗−コラーゲンｍＡｂを腹腔内注射し、その後３日目にＬＰＳを注射した。マウスに０日目から始めて３日目ごとに上記ｍＡｂを腹腔内注射した。臨床的関節炎がＬＰＳ注射後２−３日目に明らかになり、数週間続いた。四肢の各々を実施例６に示すように３日目ごとに０−４スケールで評価し、結果を全四肢の９日目と１５日目の間の平均関節炎スコア（±ＳＥＭ）としてあらわした。これらのデータは４実験をまとめたものであり、各実験は状態ごとに３ないし４匹のマウス群からなっている。
【図７】抗−α１または抗−α２ ｍＡｂの投与は、ＤＴＨ反応中の白血球の足蹠への侵潤を阻止する。実験は図２に記載のように行われた。抗原チャレンジの２０時間後に足蹠を切り取り、そして組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織切片は、非チャレンジマウス（Ａ）またはＳＲＢＣでチャレンジしたＳＲＢＣ感作マウス（Ｂ−Ｈ）のいずれかの足蹠から得たものである。マウスはチャレンジの１時間前にＰＢＳ（Ｂ）、コントロールハムスターＩｇ（Ｃ、Ｇ）、抗−α１（Ｄ）、抗−α２（Ｅ）または抗−α１および抗−α２ ｍＡｂの組み合わせ（Ｆ、Ｈ）のいずれかで処理した。倍率：×１００（Ａ−Ｆ）、×４００（Ｇ−Ｈ）。
【図８】α１β１は、ＤＴＨ反応中の足蹠における侵潤白血球に発現する。抗原チャレンジの２０時間後の未処理炎症足蹠からの侵潤白血球の免疫組織学的染色。（Ａ）Ａｌｅｘａ４８８−結合コントロールｍＡｂおよび抗−α１ ｍＡｂで直接染色した連続切片。（Ｂ）Ａｌｅｘａ４８８−結合抗−α１ ｍＡｂおよびフィコエリトリン（ＰＥ）−結合細胞系−特異的ｍＡｂによる二重免疫蛍光染色。使用したＰＥ結合ｍＡｂは顆粒球／単球（抗−ＣＤ１１ｂ）、好中球（抗−Ｌｙ６Ｇ／Ｇｒ−１）、およびＴリンパ球（抗−ＣＤ３）に特異的であった。倍率：×４００。
【図９】コラーゲンｍＡｂ−誘導性関節炎における抗−α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの効果。（Ａ）抗−α１または抗−α２ ｍＡｂのいずれかによるマウスの予防的処置は関節炎スコアを減らす。マウスを０日目に抗−コラーゲンｍＡｂで、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり、その後数週間続いた。マウスに０日目から始めて３日目ごとに上記ｍＡｂで処理した。３日目ごとに各四肢を評価し、０−４スケールで採点した。結果を、平均関節炎スコアとしてあらわす。結果を、全四肢の９日目から１５日目までの平均関節炎スコア（±ＳＥＭ）（最大スコア１６）としてあらわす。状態ごとに４匹のマウス群を用いた；１２実験の平均を示す。（Ｂ）α１−欠乏マウスは、抗−α１ ｍＡｂ処理野生型マウスに比較して減少した関節炎スコアを有した。実験の詳細および採点法は上記のようである。状態ごとに４匹のマウス群を用いた：２実験の平均を示す。
【図１０】関節炎の関節の免疫病態学における抗−α１ ｍＡｂ処理の効果。 抗−α１ ｍＡｂ処理は、白血球侵潤、細胞の関節表面への接着、およびプロテオグリカン喪失によって証明される軟骨破壊を減らす。コントロールハムスターＩｇ（Ｅ−Ｈ）または抗−α１ ｍＡｂ処理（Ｉ−Ｌ）のいずれかを受けた正常マウス（Ａ−Ｄ）または関節炎マウス（ｄ８）からの後肢。肢の写真を撮り（Ａ、Ｅ、Ｉ）、切り取り、組織切片をヘマトキシリン／エオシンのいずれかで染色するか（Ｂ−Ｃ、Ｆ−Ｇ、Ｊ−Ｋ）、またはトルイジンブルーで染色してプロテオグリカンを検出した（Ｄ、Ｈ、Ｌ）。倍率：×１６（Ｂ、Ｆ、Ｊ）；×１６０（Ｃ、Ｇ、Ｋ）；×２００（Ｄ、Ｈ、Ｌ）。
【図１１】関節炎の発生はリンパ球不在下では遅れ、抗−α１ ｍＡｂによる関節炎の阻止がリンパ球不在下で起きる。野生型Ｂ６，１２９またはＲＡＧ−１欠乏Ｂ６，１２９マウスを０日目に抗−コラーゲンｍＡｂで処理し、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり、数週間続いた。マウスに上記ｍＡｂを０日目から始めて、３日目ごとに処理した。各四肢を３日目ごとに０−４スケールで評価し、そして採点した。結果を１本の肢についての平均関節炎スコアであらわす（最大スコア４）。状態ごとに４匹のマウス群を用いた。
【図１２】抗−α１ ｍＡｂによる関節炎阻止の用量反応。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗−コラーゲンｍＡｂを用いて０日目に処理し、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり、数週間続いた。マウスにＨａ４／８（アイソタイプコントロール）またはＨａ３１／８（抗−α１）ｍＡｂの指示量を０日目から始めて３日目毎に腹腔内投与した。各肢を３日目ごとに評価し、０−４スケールで採点した。結果を１本の肢につき平均関節炎スコアとしてあらわす（最大スコア４）。状態ごとに４匹のマウス群を用いた。
【図１３】抗−α１ ｍＡｂの治療的処理は関節炎スコアを減らす。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目に抗−コラーゲンｍＡｂで処理し、３日目にＬＰＳで処理した。関節炎は６日目までに明らかになり数週間続いた。マウスにｍＡｂ（２５０μｇ）またはＩｇ融合タンパク質（２００μｇ）を４日目から始めて、３日目ごとに腹腔内投与した。マウスは、ｍＡｂ（Ｈａ４／８アイソタイプコントロールまたはＨａ３１／８抗−α１）、Ｉｇ融合タンパク質（アイソタイプコントロールＩｇまたはＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ）、または両者の組み合わせ（２５０μｇ Ｈａ３１／８および２００μｇ ＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ）のいずれかを受容した。各肢を３日目ごとに評価し、０−４スケールで採点した。結果を１本の肢につき平均関節炎スコアとしてあらわす（最大スコア４）。状態ごとに４匹のマウス群を使用した。
【図１４】抗−α１ ＩドメインブロッキングｍＡｂのためのエピトープの位置。Ａ．ラット（最上部）およびヒト（下）α１−Ｉドメインのアミノ酸配列。ＭＩＤＡＳ（金属イオン依存性接着部位）モチーフ含む残基が太線で示される。対応するラット残基（Ｒ△Ｈ）に代わるヒトアミノ酸はボックス領域のラット配列の下に示される。明白にするために、本文中にナンバーをつけた残基は、この図を参照する。Ｂ．増加する濃度のｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）を、３０μｇ／ｍｌ ヒト（丸）、ラット（三角）またはＲ△Ｈ（四角）α１−Ｉドメインを塗布したプレートに結合させた。示したデータは３実験をあらわす。
【図１５】ヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列。
【図１６】α１−Ｉドメインに対するブロッキングｍＡｂの同一化。Ａ．漸増濃度のｍＡｂ ＡＥＦ３（三角）またはＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（丸）を、３０μｇ／ｍｌ α１−Ｉドメインで被覆したプレートに結合させる。Ｂ．α１−Ｉドメインを、漸増濃度のｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（ダイヤモンド）またはｍＡｂ ＢＧＣ５（四角）で処理し、コラーゲンＩＶ（２μｇ／ｍｌ）被覆プレートに結合させた。Ｃ．Ｋ５６２−α１細胞を、漸増濃度のｍＡｂ ＡＥＦ３（三角）またはＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（丸）で処理し、コラーゲンＩＶ（５μｇ／ｍｌ）被覆プレートに結合させた。各ウェルに加えた細胞の４５−５０％が、コラーゲンＩＶに付着した。示されるデータは独立的３実験をあらわす。
【図１７】ブロッキングｍＡｂの種交差反応性。Ａ．（１）ヒツジ血管平滑筋、（２）ヒト白血病Ｋ５６２−α１細胞、 または（３）精製Ｒ△Ｈ ＧＳＴ−Ｉドメインからの界面活性剤溶解物；（４）ラットＧＳＴ−α１Ｉドメイン；および（５）ヒトＧＳＴ−α１Ｉドメインを、非還元的条件下で１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、機能ブロッキングｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）で免疫ブロットした。分子量マーカーを左側に示す；非還元α１β１インテグリンは〜１８０ｋＤａに移動する；ＧＳＴ−Ｉドメインは〜４５ｋＤａに移動する。Ｂ．ウサギ血管平滑筋細胞をｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ ＮＯ．）（底部）かまたはネズミＩｇＧコントロール（頂上）かのいずれかと共にインキュベートし、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）によって分析した。
【図１８】α１−Ｉドメインはコラーゲンに結合する。Ａ．漸増濃度のヒトα１−Ｉドメインを、１μｇ／ｍｌコラーゲンＩ（四角）またはコラーゲンＩＶ（丸）であらかじめ被覆したプレートに結合した。示される数値はＢＳＡとのバックグラウンド結合に対して補正してある。Ｂ．２μ／ｍｌヒトα１−Ｉドメインを漸増濃度の抗−ヒトα１インテグリン抗体５Ｅ８Ｄ９（四角）または抗−ヒトα２−インテグリン抗体Ａ２ＩＩＥ１０（丸）と混合し、次いで、あらかじめ１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶを塗布したプレートに結合した。Ｃ．プレートに１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶまたは３％ＢＳＡを塗布した。α１−Ｉドメイン（２μｇ／ｍｌ）をその後１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｍＭ Ｍｇ2+、または５ｍＭ ＥＤＴＡの存在のもとで被覆プレートに結合させた。示されるデータは、独立した３実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
インテグリンおよびそのフラグメント、特にα１−インテグリンサブユニットに対する抗体が前炎症性白血球と細胞外基質の諸成分（限定しないが、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンを含む）との相互作用をブロックし得ることが本発明の発見である。本発明は任意の単一の作用機構に制限することを意図しないが、インテグリンおよびそのフラグメントと、周囲のマトリックスとの相互作用の崩壊が前炎症性サイトカイン類の発現を減少させ得ることが提起される。さらに、インテグリンおよびそのフラグメントに対する抗体は、抗原特異的Ｔ−細胞のレベルに作用することによって、炎症反応のエフェクター相を調節し得ることが提起される。さらに、インテグリンおよびそのフラグメントに対する抗体は、組織内の細胞移動および組織内の細胞性プライミングおよび／または活性化を中断することによって作用し得ることが提起される。
【００１１】
この発見は、炎症に関連する条件の間、インテグリンファミリーの接着分子（特にα１β１）が、末梢組織環境において重要であることを例示する。この発見はまた、免疫反応に対するマトリックス富化（ｍａｔｒｉｘ−ｒｉｃｈ）末梢組織環境の重要性を強調することによって、インテグリンファミリーおよびそのフラグメントの炎症における役割を白血球の内皮境界面における付着および遊出を超えてさらに広げ、そしてこのことは、接着を基礎とする療法のインターベンションの新しい観点として、末梢組織を明らかにする。
【００１２】
本発明の方法は、インテグリンに対する抗体の使用を意図する；その際意図されるインテグリンは、α鎖（α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、αＩＩｂを含むがこれらに限定されない）と非共役結合されるのβ鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８を含むがこれらに限定されない）を含む分子を含む。本発明に使用するために意図される種々のインテグリンの例には、以下を含むがこれらに限定されない：
α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、αＶβ１、αＬβ１、αＭβ１、αＸβ１、αＤβ１、αＩＩｂβ１、αＥβ１；
α１β２、α２β２、α３β２、α４β２、α５β２、α６β２、α７β２、α８β２、α９β２、α１０β２、αＶβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＸβ２、αＤβ２、αＩＩｂβ２、αＥβ２；
α１β３、α２β３、α３β３、α４β３、α５β３、α６β３、α７β３、α８β３、α９β３、α１０β３、αＶβ３、αＬβ３、αＭβ３、αＸβ３、αＤβ３、αＩＩｂβ３、αＥβ３；
α１β４、α２β４、α３β４、α４β４、α５β４、α６β４、α７β４、α８β４、α９β４、α１０β４、αＶβ４、αＬβ４、αＭβ４、αＸβ４、αＤβ４、αＩＩｂβ４、αＥβ４；
α１β５、α２β５、α３β５、α４β５、α５β５、α６β５、α７β５、α８β５、α９β５、α１０β５、αＶβ５、αＬβ５、αＭβ５、αＸβ５、αＤβ５、αＩＩｂβ５、αＥβ５；
α１β６、α２β６、α３β６、α４β６、α５β６、α６β６、α７β６、α８β６、α９β６、α１０β６、αＶβ６、αＬβ６、αＭβ６、αＸβ６、αＤβ６、αＩＩｂβ６、αＥβ６；
α１β７、α２β７、α３β７、α４β７、α５β７、α６β７、α７β７、α８β７、α９β７、α１０β７、αＶβ７、αＬβ７、αＭβ７、αＸβ７、αＤβ７、αＩＩｂβ７、αＥβ７；
α１β８、α２β８、α３β８、α４β８、α５β８、α６β８、α７β８、α８β８、α９β８、α１０β８、αＶβ８、αＬβ８、αＭβ８、αＸβ８、αＤβ８、αＩＩｂβ８、αＥβ８。
【００１３】
本発明の方法はまた、例えば以下を含むインテグリンフラグメントの使用も考慮する：β鎖単独（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８を含むがこれらに限定されない）に対する抗体、ならびにα鎖単独（α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、αＩＩｂを含むがこれらに限定されない）に対する抗体。加えて、本発明の方法はさらに、例えば以下を含むがそれらに限定されないα鎖のＩドメインに対する抗体を含む、インテグリンフラグメントに対する抗体の使用を意図する：α１β１由来のＩドメイン（Ｂｒｉｅｓｅｗｉｔｚら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８９）；α２β１由来のＩドメイン（ＴａｋａｄａおよびＨｅｍｌｅｒ、１９８９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：３９７）、αＬβ２由来のＩドメイン（Ｌａｒｓｏｎら、１９８９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：７０３）、αＭβ２由来のＩドメイン（Ｃｏｒｂｉら、１９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２４０３）、αＸβ２由来のＩドメイン（Ｃｏｒｂｉら、１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ ６：４０２３）、αＤβ２由来のＩドメイン（Ｇｒａｙｓｏｎら、１９８８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：２１８７）、αＥβ７由来のＩドメイン（Ｓｈａｗら、１９４４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：６０１６）。好ましい実施形態において、α１−Ｉドメイン抗原決定基は少なくとも６個の隣接アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ここで上記隣接配列は図１５の配列内に見いだされる。さらに、好ましい実施形態において、上記隣接配列はＶａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇである。
【００１４】
本発明の使用のためのインテグリンを生成する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５−４３４頁を参照のこと）。
【００１５】
さらに、本発明の実施形態は抗インテグリンポリクローナル抗体および抗インテグリンモノクローナル抗体を含む。本発明の好ましい実施形態は、抗−α１モノクローナル抗体のようなモノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本明細書中で用いられるようなα１β１機能ブロッキング抗体は、α１−Ｉドメイン（特に、図１５の残基９２−９７）に結合し、かつ例えば、コラーゲンＩＶに対するＫ５６２−α１依存性接着を阻害する能力によって試験されたようにα１β１機能をブロックする抗体をいう（実施例１５を参照のこと）。
【００１７】
治療、特にヒトの治療のための好ましい抗体およびホモログとしては、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）抗体フラグメント、ならびに抗体重鎖または軽鎖のモノマーまたはダイマー、またはこれらの混合物が挙げられる。従って、インテグリン分子およびそのフラグメントに対するモノクローナル抗体は、本発明の方法における好ましい結合剤である。
【００１８】
本明細書中に使用される場合、用語「抗体ホモログ」は、ジスルフィド結合を介して連結される結合した免疫グロブリン軽鎖および重鎖からなるインタクトな抗体を含む。用語「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖およびそれらの抗原結合性フラグメント（それらは一つ以上の抗原（すなわち、α１、α２、α６またはα−Ｉドメインを含むインテグリンサブユニット）に結合可能である）から選択される一つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を含むことが意図される。一つより多いポリペプチドから構成される抗体ホモログの成分のポリペプチドは必要に応じてジスルフィド結合していてもよいし、さもなくば共有結合で架橋していてもよい。
【００１９】
従って、それゆえ「抗体ホモログ」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（並びにそのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含む。ここで、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型であり得る。
【００２０】
「抗体ホモログ」はまた、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなるダイマーなど）も含む。従って、上記の抗体由来の抗原結合性フラグメント、ならびに全長ダイマーポリペプチドまたはトリマーポリペプチドもそれ自体有用である。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体ホモログ」は、組み換えＤＮＡ技術により産生される抗体ホモログである。この抗体ホモログにおいて、抗原結合のためには必要とされないヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくつかまたは全てが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来のその対応するアミノ酸の代わりに置換されている。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体ホモログ」は、組み換えＤＮＡ技術により産生される抗体ホモログであり、このホモログにおいて免疫グロブリン軽鎖、重鎖、またはその両方のヒンジ領域および定常領域の全てまたは一部分が、別の免疫グロブリン軽鎖または重鎖からの対応領域の代わりに置換されている。別の局面において、本発明は、（１）インテグリン標的化部分；（２）必要に応じて、第２のペプチド、例えばインテグリン標的化部分の溶解度またはインビボでの寿命を増加するもの、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメントまたはその一部、例えばＩｇＧの一部またはフラグメント、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常部、例えばＣＨ２およびＣＨ３ヒンジ領域；およびトキシン部分を含むキメラ分子の改変体を特徴とする。キメラ分子を用いて、毛包などの上皮細胞の増殖に関連する疾患の危険のある被験体（例えば、ヒト）を処置し得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体ホモログ」とは、組み換えＤＮＡ技術によって産生された抗体ホモログであり、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の全ては、供給源がヒトに由来する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「炎症性障害」としては、乾癬、湿疹、火傷および皮膚炎などの皮膚関連の状態のような障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法による処置において意図される他の炎症性障害としては、喘息、気管支炎、月経性痙攣、腱炎、滑液包炎の処置、ならびに痛みおよび頭痛の処置、または高熱を処置する解熱薬としての使用が含まれる。本発明の方法はまた、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎などのような胃腸障害および直腸結腸癌の予防にも有用である。本発明の方法は血管性疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、リウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、外傷後腫脹、心筋虚血などの疾患における炎症性障害の処置に有用である。本発明の方法は、アレルギー性鼻炎、呼吸困難症候群、内毒素ショック症候群、およびアテローム性硬化症の処置にも有用である。
【００２５】
好適な実施形態において、本発明の方法はリウマチ性関節炎および骨関節炎などを含む関節炎の治療に有用である。
【００２６】
“有効量”とは、好都合なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は１回または数回に投与できる。炎症性疾患の治療のためには、抗インテグリン抗体の“有効量”は、治療すべき障害に対して、または美容的目的のために臨床的に容認できる基準にしたがって、炎症関連性状態の進行を和らげ、軽くし、安定させ、逆転させ、緩徐にし、または遅らせるために十分な量である。効果のインジケータの検出および測定は、多数の利用可能な診断ツール、例えば非制限的に血液検査、肺機能試験、および胸部Ｘ線；ＣＴスキャン；気管支鏡；気管支肺胞洗浄法；肺生検およびＣＴスキャン等を含む身体検査によって測定され得る。
【００２７】
例えば、抗インテグリン モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の製造技術は公知である。例えばＭｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２巻：３６７−３７５頁（マウス抗α１β１および抗α２β１ ｍＡｂ）；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１０３７６−１０３８３頁（マウス抗α６β１ ｍＡｂ）；Ｙａｏら、１９９６、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９６ １０９巻：３１３９−５０頁（マウス抗α７β１ ｍＡｂ）；Ｈｅｍｌｅｒら、１９８４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３２巻：３０１１−８頁（ヒトα１β１に対するｍＡｂ）；Ｐｉｓｃｈｅｌら、 １９８７ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３８巻：２２６−３３頁（ヒトα２β１に対するｍＡｂ）；Ｗａｙｎｅｒら、１９８８、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７巻：１８８１−９１頁（ヒトα３β１に対するｍＡｂ）；Ｈｅｍｌｅｒら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１１４７８−８５頁（ヒトα４β１に対するｍＡｂ）；Ｗａｙｎｅｒら １９８８ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０７巻：１８８１−９１頁（ヒトα５β１に対するｍＡｂ）；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１０３７６−１０３８３頁（ヒトα６β１に対するｍＡｂ）；Ａ．Ｗａｎｇら、 １９９６ Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５巻：６６４−６７２頁（ヒトα９β１に対するｍＡｂ）；Ｄａｖｉｓら、１９８９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０９巻：１８１７−２６頁（ヒトαＶβ１に対するｍＡｂ）；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、 １９８２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９巻：７４８９−９３頁（ヒトαＬβ２に対するｍＡｂ）；Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９３：Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２０巻：１０３１−４３頁（ヒトαＭβ２に対するｍＡｂ）；Ｓｔａｃｋｅｒら、１９９１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６巻：６４８−５５頁（ヒトαＸβ２に対するｍＡｂ）；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｉｅｒｅｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３巻：６８３−９０頁（ヒトαＤβ２に対するｍＡｂ）；Ｂｅｎｎｅｔｔら、 １９８３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０巻：２４１７−２１頁（ヒトαＩＩβ３に対するｍＡｂ）；Ｈｅｓｓｌｅら、１９８４、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２６巻：４９−５４頁（ヒトα６β４に対するｍＡｂ）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：６９４０−８頁（ヒトαＶβ５に対するｍＡｂ）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：６９４０−８頁（ヒトαＶβ６に対するｍＡｂ）；Ｃｅｒｆ−Ｂｅｎｓｕｓｓａｎら、１９９２、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２巻：２７３−７頁（ヒトαＥβ７に対するｍＡｂ）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：２８７０８−１５頁（ヒトαＶβ８に対するｍＡｂ）；Ｂｏｓｓｙら、 １９９１ ＥＭＢＯ Ｊ １０巻：２３７５−８５頁（ヒトα８β１に対するポリクローナル抗血清）；Ｃａｍｐｅｒら、 １９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻：２０３８３−２０３８９頁（ヒトα１０β１に対するポリクローナル抗血清）を参照されたい。
【００２８】
一般に、不死細胞系統（典型的には骨髄腫細胞）を、所定の抗原、例えばインテグリンを発現する全細胞で免疫した哺乳動物から得たリンパ球（典型的には脾細胞）に融合する。そして、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清液を上記抗原に対する抗体についてスクリーニングする。一般的にはＫｏｈｌｅｒら、 １９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２６５巻：２９５−４９７頁“所定の特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養”を参照されたい。
【００２９】
免疫は標準手順を用いて達成される。単位量および免疫レジメンは免疫される哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。典型的には、免疫した哺乳動物を繁殖させ、そして適切なスクリーニングアッセイを用いて各血液サンプルからの血清を特定の抗体についてアッセイする。例えば抗インテグリン抗体はインテグリン発現細胞からの１２５Ｉ標識細胞溶解液の免疫沈殿によって同定され得る。例えば、抗インテグリン抗体が挙げられる抗体を、フローサイトメトリーによって例えばインテグリン分子を認識すると考えられる抗体とインキュベートした抗体発現細胞の蛍光染色を測定することによって同定し得る。ハイブリドーマ細胞の生産に用いるリンパ球は、典型的には免疫哺乳動物から単離され得る。この哺乳動物の血清は、このようなスクリーニングアッセイを使用して、抗インテグリン抗体の存在が陽性であることがすでに試験ずみである。
【００３０】
代表的には、不死細胞系統（例えば骨髄腫細胞系統）は上記リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。好ましい不死細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（“ＨＡＴ培地”）を含む培養培地に大して感受性であるマウス骨髄腫細胞系統である。一般的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を１５００分子量のポリエチレングリコール（“ＰＥＧ１５００”）を用いてマウス脾細胞に融合する。次いで、融合により生成したハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地を用いて選択する。ＨＡＴ培地は未融合骨髄腫細胞や非生産的融合骨髄腫細胞を殺す（未融合脾細胞は形質転換されないことから、数日後には死滅する）。ハイブリドーマ培養上清液をスクリーニングすることによって、所望抗体を産生するハイブリドーマを検出する。例えば抗インテグリン抗体を産生するために調製されたハイブリドーマは、そのハイブリドーマ培養上清液に、組み換えインテグリン発現細胞系統に結合する能力を有する分泌抗体を検査することによってスクリーニングされ得る。
【００３１】
抗インテグリン抗体ホモログを含む抗体ホモログ（それらはインタクトな免疫グロブリンである）を産生するために、このようなスクリーニングアッセイで陽性の検査結果の出たハイブリドーマ細胞を、栄養培地中で上記ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を上記培養培地中に分泌できる十分な条件下でかつ十分な時間培養した。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術および培養培地は周知である。馴化ハイブリドーマ培養上清液を集め、そして抗インテグリン抗体を必要に応じて周知の方法によってさらに精製してもよい。
【００３２】
あるいは、上記ハイブリドーマ細胞を、免疫していないマウスの腹腔内に注入することによって、所望抗体を産生してもよい。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し、抗体を分泌する。それは腹水として蓄積する。上記腹水をで腹腔から吸い出すことによって抗体を採取できる。
【００３３】
例えばインテグリンに対する完全ヒトモノクローナル抗体ホモログ類は、本発明の方法において抗原類をブロックし得る別の好ましい結合剤である。これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻：８６−９５頁、“インビトロでプライムされたヒト脾細胞から抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の産生”に記載されているように、インビトロでプライムされたヒト脾細胞を用いてインタクトな形態で調製される。
【００３４】
あるいは、それらはＰｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：２４３２−２４３６頁“レパートリークローニングによる多様な高親和性ヒトモノクローナル抗体の生成”およびＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ １４１巻：２２７−２３６頁、“インビトロ刺激を行わずにヒト末梢血リンパ球から典型的免疫グロブリン可変領域ＣＤＮＡライブラリーの構成”により記載されているように、レパートリークローニングによって調製することもできる。米国特許第５，７９８，２３０号（１９９８年８月２５日“ヒトモノクローナル抗体の製法およびその使用”）はヒトＢ細胞からヒトモノクローナル抗体の調製を記載している。このプロセスに従って、ヒト抗体産生Ｂ細胞を、エプスタイン−バーウィルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン−バーウィルス、またはその誘導体での感染によって不死化する。不死化のために必要なＥＢＮＡ２機能は引き続いて停止し、その結果、抗体産生の増加を生じる。
【００３５】
完全ヒト抗体を産生するなお別の方法において、米国特許第５，７８９，６５０号（１９９８年８月４日“異種抗体産生のためのトランスジェニック非ヒト動物”）は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物および不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を記載している。内因性免疫グロブリン遺伝子は、内因性免疫グロブリンに対するアンチセンス ポリヌクレオチド類および／または抗血清によって抑制される。異種抗体は、非ヒト動物の種のゲノムには普通は見いだされない免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。非再配列異種ヒト免疫グロブリン重鎖の配列を含む１つ以上の導入遺伝子が非ヒト動物に導入され、それによって、トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配列することができ、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプの抗体レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物を生成する。このような異種ヒト抗体はＢ細胞において産生される。Ｂ細胞は、その後例えば骨髄腫のような不死化細胞系統と融合するとか、またはこのようなＢ細胞を他の技術によって操作して、モノクローナルの異種完全ヒト抗体ホモログを産生できる細胞系統を不朽化するという方法で、不死化される。
【００３６】
本発明の方法でインテグリン抗原またはそのフラグメントをブロックし得るなお別の好ましい結合剤は、インテグリンタンパク質またはそのフラグメントに結合する能力を有するヒト化抗体ホモログである。キメラ抗体を調製する初期の方法にしたがって、新しいアプローチがＥＰ０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）において記載された。それによると或る種の相補的決定部領域（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＣＤＲ）を別の種からのＣＤＲで置き換えることによって、抗体を変化させる。このプロセスを用いて、例えばヒト重鎖および軽鎖Ｉｇ可変領域ドメインからのＣＤＲをマウス可変領域ドメインからの代替のに置き換えることができる。これらの変化したＩｇ可変領域を引き続きヒトＩｇ定常部と組み合わせて、置換されたマウスＣＤＲを除く組成が総合的にヒトである抗体を作り出すことができる。このようなＣＤＲ−置換抗体は、キメラ抗体に比較してヒトでは免疫反応を誘起しそうもないと推定される。なぜならばＣＤＲ−置換抗体は明らかにより少ない非ヒト成分を含むからである。ＣＤＲ“グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）”を介してモノクローナル抗体をヒト化するプロセスは“再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）”と呼ばれる。（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３−３２７頁、“治療のためのヒト抗体のリシェイピング”；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４−１５３６頁、“モノクローナル抗体にＣＤＲグラフティングを用いるヒト抗体のリシェイピング”）。
【００３７】
代表的には、マウス抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体中の対応する領域に移植される。なぜならば特異抗原に結合するマウス抗体の領域がＣＤＲだからである（抗体重鎖に３つ、軽鎖に３つ）。ＣＤＲの移植は遺伝子工学によって達成される。これによりＣＤＲ ＤＮＡ配列はマウス重鎖および軽鎖可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントのクローニングによって決定され、その後対応するヒトＶ領域に部位指向変異誘発によって移される。このプロセスの最後の段階では、所望アイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメント（通常、ＣＨではγＩ、ＣＬではκ）が付加され、ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子が哺乳動物細胞に同時発現し、可溶性ヒト化抗体を生成する。
【００３８】
これらＣＤＲのヒト抗体への移動が、この抗体に、本来のマウス抗体の抗原結合特性を伝える。マウス抗体における６つのＣＤＲが構造的にＶ領域“フレームワーク”領域に取り付けられる。ＣＤＲ−グラフティングが成功する理由は、マウスとヒト抗体との間のフレームワーク領域が、類似のＣＤＲ付着点を有する非常に似た三次元構造を有し得、その結果ＣＤＲが交換可能だからである。このようなヒト化抗体ホモログは、Ｊｏｎｅｓら、 １９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁、“ヒト抗体の相補的決定領域の、マウスのそれらによる置換”；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３−３２７頁、“治療のためのヒト抗体のリシェイピング”；Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：１００２９頁、“インターロイキン２レセプターに結合するヒト化抗体”およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：３８３３頁“ポリメラーゼ連鎖反応法によって発現するための免疫グロブリン可変ドメインのクローニング”に例示されるようにして調製することができる。
【００３９】
それにもかかわらず、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸はＣＤＲと相互作用し、抗原結合親和性全体に影響を与えると考えられている。いかなるヒトＶ領域フレームワークの改変を伴わずにヒト化抗体を作るためにマウス抗体からのＣＤＲを直接移すと、しばしば結合親和性の部分的または完全な損失を生じる。多くの場合、結合活性を得るためにはアクセプター抗体のフレームワーク領域による残基を変えることが重要であるようである。
【００４０】
Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：１００２９−１００３３頁、“インターロイキン２レセプターに結合するヒト化抗体”およびＷＯ ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）は、マウスｍＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲとヒト免疫グロブリンのフレームワークおよび定常部とを組み合わせることによって、アクセプター抗体のフレームワーク領域ににおける改変された残基を含むヒト化抗体を調製する方法を記載している。彼らは、ヒトＶ領域フレームワーク残基のいかなる改変をも伴わずに直接的なＣＤＲ移動からしばしば生じる結合親和性の喪失の問題に対する一つの解決策を示した；彼らの解決策は二つの重要な段階を含む。第一に、本来のマウス抗体（この場合は抗Ｔａｃ ＭＡｂ）のＶ領域フレームワークに対する最適タンパク配列ホモログに対してヒトＶフレームワーク領域をコンピューター分析によって選び出す。第二段階では、マウスＣＤＲと相互作用しそうなフレームワークアミノ酸残基を可視化し、次いで、これらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワークに重ねるために、マウスＶ領域の三次構造をコンピューターによってモデル化する。推定的マウス接触残基を有する相同ヒトフレームワークを用いるこれらのアプローチは、インターロイキン２レセプターに特異的な抗体類（Ｑｕｅｅｎら、１９８９［前出］）およびまた、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）に特異的な抗体類（Ｃｏ．ら １９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：２８６９−２８７３頁、“抗ウィルス治療のためのヒト化抗体”）に関して、本来のマウス抗体に対する同様な結合親和性を有するヒト化抗体を生成する。
【００４１】
ＷＯ ９０／０７８６１の上記の２段階のアプローチにより、Ｑｕｅｅｎらはヒト化免疫グロブリンを設計するための幾つかの基準を概説した。第一の基準はヒトアクセプターとして、通常は、ヒト化すべき非ヒトドナー免疫グロブリンに普通は相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを用いるか、または多くのヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを用いることである。第二の基準は、もしもヒトアクセプター残基が異常であり、そしてドナー残基がフレームワークの特定残基においてヒト配列に典型的である場合、上記アクセプターよりもむしろ上記ドナーアミノ酸を使用することである。第三の基準は、ＣＤＲＳに直に隣接する部分ではアクセプターよりもむしろドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【００４２】
極端なマウス残基導入なしでＣＤＲグラフティングに、異なるアプローチ（Ｔｅｍｐｅｓｔ、 １９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻：２６６−２７１頁、“インビボでのヒトＲＳウィルス感染を阻止するためにヒトモノクローナル抗体の再形成”）を使用し得、そして標準として、ＮＥＷＭおよびＲＥＩ重鎖および軽鎖からそれぞれ誘導されるＶ領域フレームワークを使用し得る。Ｔｅｍｐｅｓｔらの１９９１年のアプローチを用いてＮＥＷＭおよびＲＥＩベースのヒト化抗体を構築する利点は、ｘ線結晶学からＮＥＷＭおよびＲＥＩ可変領域の三次元構造が知られており、そのためＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用がモデル化できることである。
【００４３】
本治療はこれらの状態に罹患したヒトおよび動物被験体両方に有効である。本発明が適用できる動物被験体は、ペットとしても商業的目的のためにも飼育される家畜および牧畜の両方にわたる。例としてはイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギが挙げられる。
【００４４】
本発明の方法において、抗体（例えば抗ＶＬＡ−１抗体）は非経口投与してもよい。本明細書中で用いる用語“非経口”として、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑膜内、胸骨内、クモ膜下、肝内、損傷内および頭蓋内注射または注入技術が挙げられる。
【００４５】
本発明の薬学的組成物は本発明の化合物のいずれか、またはその薬物学的に受容可能な誘導体を、薬物学的に受容可能なキャリアと共に含む。本明細書中で用いられる用語“キャリア”は公知の受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む。
【００４６】
本発明によると、医薬組成物は無菌の注射用調製物（例えば無菌の注射用水性または油性懸濁液）の形態であり得る。この懸濁液は適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用い、当業者に公知の技術に従って処方される。
【００４７】
本発明の医薬組成物は経口的に得られ得る。経口的に与えられる場合、それらは、非制限的に、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液等の経口的に受容可能な投与型で投与できる。
【００４８】
局所的適用について、上記医薬組成物は活性成分を一種類以上のキャリアに懸濁または溶解して含む適切な軟膏に処方することができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、ネブライザー、乾燥粉末吸入器または定量吸入器を介して鼻孔内噴霧または吸入によってもまた投与することもできる。
【００５０】
所望効果をもたらす本発明の化合物の投与量および投与速度は、インヒビターの性質、被験体のサイズ、治療の目標、治療すべき病態の性質、使用する特定の医薬組成物、および治療医師の判断等、種々の要因に依存する。１日あたり約０．００１と約１００ｍｇ／ｋｇとの間の体重、好ましくは１日あたり約０．１と約５０ｍｇ／ｋｇとの間の体重の活性成分化合物という投与レベルが有用である。最も好ましいのは、抗体ホモログが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の投与量範囲、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲で、かつ１−１４日間毎の間隔で投与される。別の好ましい実施形態では、腹腔内投与の際には上記抗体は約０．３〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の好ましい実施形態では抗体は静脈内投与の際に約５〜１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。少なくとも１μｇ／ｍｌの抗体の血漿レベルを提供するのに効果的な量の抗体組成物を投与するのが好ましい。
【００５１】
当業者は、本発明のアンタゴニストがその意図する効果を有するか否かを容易に試験することができる。例えば、個体の上皮のサンプルに含まれる細胞について、投与された上記作用物質を検出する第二の試薬を用いて、インビトロで（またはエキソビボで）上記作用物質の存在を検査する。これは例えば、投与された作用物質に特異的な蛍光色素標識抗体（これは、次いでその後標準ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）分析によって測定される）でもよい。あるいは、投与された作用物質の存在をインビトロ（エキソビボ）で、個々の細胞の、それ自体標識された（例えば蛍光色素で）同じ作用物質との結合能力の消失または低下によって検出する。好ましい投与量はハリマウスポジティブ細胞の大部分の検出可能コーティングをもたらすべきである。コーティングは抗体ホモログの場合、１−１４日間持続するのが好ましい。
【００５２】
本発明の実施は、他に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来技術を利用する。これらは当業者の範囲内である。このような技術は文献に記載されている。例えば、下記を参照されたい。分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＤＮＡクローニング、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）、１９８４：米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；転写と翻訳（ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；動物細胞の培養（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８７；固定細胞および酵素、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６；分子クローニングの実際的指針Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４；酵素学における方法、１５４および１５５巻（Ｗｕら、編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；哺乳動物細胞の遺伝子伝達ベクター（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；細胞および分子生物学における免疫化学的方法（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８７；実験免疫学ハンドブック、Ｉ−ＩＶ 巻Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、 １９８６；マウス胚の操作、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓＰｒｅｓｓ、１９８６。
【００５３】
下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、それを制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５４】
（実施例）
（化学的試薬）
蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。クロトン油はＩＣＮＢｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ（オーロラ、ＯＨ）から購入した。Ａｌｓｅｖｅｒｓ溶液中の全ヒツジ血液はＥａｓｔ Ａｃｒｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（サウスブリッジ、ＭＡ）から得た。Ｉ型ラット尾コラーゲンおよびＩＶ型マウスコラーゲンはそれぞＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓ．（ベドフォード、ＭＡ）およびＧｉｂｃｏ（ゲイザースバーグ、 ＭＤ）から購入した。
【００５５】
齢６−８週のＢａｌｂ／ｃ雌マウスはタコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）（ゲルマンタウン、 ＮＹ）から購入し、そしてＢａｌｂ／ｃバックグラウンドのα１β１インテグリン−欠乏マウスは前述のようであった（３）。
【００５６】
（実施例１）
（モノクローナル抗体）マウス抗原に対する機能ブロッキングｍＡｂをアジドを含まない形式および低エンドトキシン形式で作製した：Ｈａ３１／８（ハムスター抗ＣＤ４９ａ；インテグリンα１）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２巻：３６７−３７５頁）、Ｈａｌ／２９（ハムスター抗ＣＤ４９ｂ；インテグリンα２）（β１）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９５、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２巻３６７−３７５頁；ＭｅｎｄｒｉｃｋおよびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ１９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９巻：６９０−７０２頁）、ハムスターＩＩ群コントロールｍＡｂ Ｈａ４／８（ハムスター抗ＫＬＨ）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．およびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９巻：６９０−７０２頁）、およびＰＳ／２（ラット抗ＣＤ４９ｄ；インテグリンα４β１鎖）（Ｍｉｙａｋｅら、１９９１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７３巻：５９９−６０７頁）。さらに、下記のマウス抗原に対する機能ブロッキングｍＡｂをアジドなし／低エンドトキシン調製物としてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した：ＨＭβ１−１（ハムスター抗ＣＤ２９；インテグリンβ１鎖）（Ｎｏｔｏら、１９９５ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７巻：８３５−８４２頁）、Ｈａ２／５（ハムスター抗ＣＤ２９；インテグリンβ１鎖）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．ＬおよびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９巻：６９０−７０２頁）、３Ｅ２（ハムスター抗ＣＤ５４、ＩＣＡＭ−１）Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓら、１９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０巻：６５５−６６３頁）、５Ｈ１０−２７（ラット抗ＣＤ４９ｅ；インテグリンα５）（Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｔ．およびＴ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９４、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ２０巻：２５−４４頁）、ＧｏＨ３（ラット抗ＣＤ４９ｆ；インテグリンα６）（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１０３７６−１０３８３頁）およびラット アイソタイプコントロールｍＡｂ Ｒ３５−９５（ラットＩｇＧ２ａ）およびＲ３５−３８（ラットＩｇＧ２ｂ）。
【００５７】
（接着アッセイ）Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞を２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２と共に７−１２日間培養した。Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンに対する細胞の接着は既述のようであった（Ｇｏｔｗａｌ）ら、１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７巻：２４６９−２４７７頁）。つまり、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｉｅｒｖｉｌｌ、ＩＬ）に１０μｇ／ｍｌのＩＶ型または５μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンのいすれかをコーティングし、そして非特異的部位を１％ＢＳＡでブロックした。ＩＬ−２活性化脾細胞を２μＭ ＢＣＥＣＦ［２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）カルボキシル フルオレセイン ペンタ アセトキシメチルエステル］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユーゲン、ＯＲ）で標識化し、示したｍＡｂ１０μｇ／ｍｌと共に１５分間インキュベートした。次いで、コーティングしたウェルにＲＰＭＩ中０．２５％ＢＳＡ中１０5細胞を加え、そして３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ中０．２５％ＢＳＡで３回洗って未結合細胞を除去した。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ２３５０蛍光プレート・リーダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベドフォード、ＭＡ）を用いて接着を定量した。入力した細胞に対する結合細胞の割合を測定し、コントロールｍＡｂ処理細胞（１００％に正規化した）に対するパーセント接着を計算した。ＢＳＡのみでコーティングしたウェルに起因する細胞接着によるバックグラウンド値を差し引いた。
【００５８】
（活性化白血球上のα１β１およびα２β１の発現および機能遮断）炎症において白血球が重要な役割を演ずると仮定して、本発明者は抗α１および抗α２ｍＡｂが白血球のコラーゲンへの接着をブロックすることができるかどうかを試験した。α１およびα２の両方の高レベルを発現する白血球を得るために、マウスＴ細胞をインビトロでＩＬ−２で７−１２日間刺激した。これらの細胞はα１もα２も高レベルに発現し（図１Ａ）、コラーゲンＩＶ型およびＩ型をコーティングした両方の表面にも良好に結合した（図１Ｂ）。ＩＶ型コラーゲンへの接着は抗α１ ｍＡｂ単独によって一部分阻止され、抗α２ ｍＡｂ単独では阻止されなかった。対照的に、Ｉ型コラーゲンへの接着は抗α２ ｍＡｂによって完全に阻止され、抗α１ ｍＡｂ単独では部分的阻止のみを示した。抗β１ｍＡｂおよび抗α１と抗α２との組み合わせの両方は、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンへの接着を完全に阻止した。α１β１およびα２β１インテグリンが活性化Ｔ細胞に発現され、抗α１およびα２ ｍＡｂがコラーゲンへの白血球接着を機能的にブロックし得ることが証明されたので、本発明者はこれらのｍＡｂを用いて炎症性疾患の動物モデルにおけるこれらインテグリンのインビボでの役割を研究した。
【００５９】
（実施例２）
（抗インテグリンｍＡｂによるＤＴＨ応答の阻止）以前刊行されたプロトコル（（Ｈｕｒｔｒｅｌら、１９９２、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２巻：２５２−２６３頁）を若干変えて、ＳＲＢＣ誘起性遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を起こした。つまり、０日目にマウスの背中に１００μｌ ＰＢＳ中２×１０7ＳＲＢＣを皮下注射することによってマウスを免疫した。そのマウスを、５日目に、右後肢の足蹠に２５μｌＰＢＳ中１×１０8ＳＲＢＣを皮下注射することによってチャレンジした。足蹠の厚さを抗原チャレンジの２０時間後に工学的ノギス（ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ ｃａｌｉｐｅｒ）（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ／ＭＴＩ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）で測定し、足蹠の腫脹程度を計算した。結果を足蹠厚さの平均増加パーセント±ＳＥＭとして報告し、％増加＝［１−（抗原チャレンジの２０時間後の右足蹠厚さ／抗原チャレンジの２０時間後の注射しなかった左足蹠厚さ）］×１００として計算した。ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨ応答のエフェクター相をブロックするために、治療的またはコントロールｍＡｂ（１００μｇ）（実施例１に記載の方法で作製された）を、５日目に抗原チャレンジする１時間前に腹腔内投与した。
【００６０】
ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨは炎症、特に乾癬のよく特徴づけられたインビボモデルである。これは炎症における種々のサイトカインおよび接着分子の重要性を示すために用いられている（Ｔｅｄｄｅｒら、１９９５ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１巻：２２５９−２２６４頁、Ｔｅｒａｓｈｉｔａら、１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５６巻：４６３８−４６４３頁）。ＳＲＢＣ感作マウスに足蹠抗原チャレンジの１時間前に抗インテグリンｍＡｂを受けさせ、２０時間後に増加した足蹠厚によって炎症を測定し、評価した。ＰＢＳおよびコントロールハムスターＩｇ処理マウスは抗原チャレンジの２０時間後に足蹠厚さの６０−７０％の増加を示した（図２）。コントロールハムスターＩｇ処理に比較して、抗α１または抗α２ ｍＡｂは足蹠厚において６８％および６０％阻止をそれぞれ生じた。抗α１およびα２ ｍＡｂの組み合わせは７１％阻止し、抗α１または抗α２ ｍＡｂ単独を超える付加的効果はほとんど示さなかった。他の抗インテグリンｍＡｂでの処置もＤＴＨエフェクター応答を有効に阻止した。種々のｍＡｂ処理でみられる阻止程度は４９％（抗α４）、２３％（抗α５）、および５７％（抗α６）であった。最後に、一般的β１インテグリン・サブユニットのｍＡｂ遮断（ｍＡｂ ＨＭＢＩ−１）はエフェクターＤＴＨ応答を６７％阻止した。
【００６１】
（実施例３）
（抗インテグリンｍＡｂによるＣＨＳエフェクター応答の阻止）ＦＩＴＣに対する接触過敏症（ＣＨＳ）を前述のようにアッセイした（Ｇａｓｐａｒｉら、 １９９１“免疫学における最新プロトコル”、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ニューヨーク。章４．２：１）。つまり、マウスの毛を剃った背中に０日目に１：１アセトン／ジブチルフタレート中０．５％ＦＩＴＣ １００μｌを塗ることによりマウスを感作させた。１０日後、動物を各耳の両側に０．５％ＦＩＴＣ５μｌを塗布することによりチャレンジした。耳の腫脹応答を工学的ノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ／ＭＴＩ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）で、抗原チャレンジ時（１０日目）および２４時間後に測定した耳の厚さにより決定し、そして結果をベースラインの耳の厚さの平均増加パーセント±ＳＥＭとして報告した。耳の厚さの増加は、％増加＝［１−（抗原チャレンジの２４時間後の耳の厚さ／抗原チャレンジ時の耳の厚さ）］×１００として計算した。ＣＨＳ応答のエフェクター相をブロックするために、治療的またはコントロールｍＡｂ（２５０μｇ）を１０日目の抗原チャレンジの４時間前に腹腔内に与えた。抗原に感作し、そしてビヒクルのみを耳にチャレンジしたマウス（ビヒクルコントロール）、またはあらかじめ感作させずに耳をチャレンジしたマウス（刺激性コントロール）をネガティブコントロールとした（耳の厚さは２％以上増加することはなかった）。
【００６２】
ＣＨＳが機構的にＤＴＨと区別され、そして異なるエフェクター細胞を含むと仮定して、本発明者はＣＨＳ応答のエフェクター相に対して抗インテグリンｍＡｂがどんな影響を有するかを研究した。マウスの毛を剃った背中へのＦＩＴＣ塗布を用いてマウスをハプテン感作した。１０日後に耳にＦＩＴＣチャレンジすると翌日炎症性応答が起きた。ＦＩＴＣ感作マウスは抗原チャレンジの２４時間後には厚さの６０−７０％の増加を示した（図３）。公開されている結果（Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０巻：６５５−６６３頁）と一致して、抗ＩＣＡＭ−１ ｍＡｂ処置は耳の腫脹の５１％阻止を起こした。コントロールハムスターｍＡｂと比較して、抗α１または抗α２ｍＡｂを抗原チャレンジの４時間前のマウスの処置は、耳の腫脹のそれぞれ３７％および５７％の阻止を起こした（図３）。抗α１および抗α２ ｍＡｂの組み合わせは耳の腫脹の若干大きい阻止を起こした（６５％）。β１インテグリンに対する他のｍＡｂでの処置は、抗α４および抗５ｍＡｂがコントロールラットｍＡｂに比較する場合、ＦＩＴＣ誘起性ＣＨＳエフェクター応答を阻止しなかったのに対し、抗α６ ｍＡｂでの投与はエフェクター応答を８６％阻止することが明らかになった。最後に、一般的β１インテグリンサブユニットのｍＡｂ遮断はＣＨＳエフェクター応答を７４％阻止した。異なる種のマウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２９／Ｓｖ）および異なる感作剤（オキサゾロン）を用いて同様のＣＨＳ結果が得られた（データは示されず）。ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨモデルにみられる結果と同様に、炎症耳の組織学的分析は、浮腫形成も白血球浸潤も両方とも抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置によって阻止されることを明らかにした。
【００６３】
α１β１およびα２β１がＩＬ−２活性化脾細胞上に発現し得るという発見と一致して、抗原感作マウス（ＦＩＴＣまたはオキサゾロン）からのリンパ節の分析は、α１β１およびα２β１が専らＣＤ４４hiＬＦＡ−１hi活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に発現されることを明らかにした（データは示されず）。抗α１および抗α２ ｍＡｂを用いるマウスの処置は、これら細胞の消失を生じなかった；ＣＨＳモデルにおいて抗原感作に対して見られる脾臓およびリンパ節の両方の活性化Ｔ細胞の数が影響を受けなかったからである。それに加えて、抗原感作マウスに抗α１および抗α２ ｍＡｂで長期処置した際（１０−１６日）、２０日目に抗原でチャレンジしたマウスの炎症性応答には影響がなかったように、エフェクター細胞は機能的には欠失していなかった（データは示されず）。
【００６４】
（実施例４）
（ＣＨＳエフェクター応答はα１β１欠乏マウスでは減少する）ＦＩＴＣ仲介性ＣＨＳのエフェクター応答においてα１β１の阻止的役割がｍＡｂ仲介性である可能性を排除するために、野生型およびα１β１インテグリン欠乏マウスで実験を行った（図４）。野生型マウスにおけるエフェクター相のｍＡｂ阻止はこれまでの結果と一致し、抗α１では耳の厚さの５６％阻止を伴い、抗α２では５６％阻止が、抗α１と抗α２との組み合わせでは６２％の阻止を伴った。ＣＨＳのエフェクター相は未処置α１β１欠乏マウスでは未処置野生型マウスと比較して有意に減少した（耳の厚さの増加においてそれぞれ３０％ 対 ７１％）。予想通り、未処置α１β１欠乏マウスにおける耳の腫脹レベルは抗α１ ｍＡｂ処置−野生型マウスに見られる耳の腫脹レベルに匹敵した。最後に、α１β１欠乏マウスにおけるα２β１のｍＡｂ遮断は、抗α１と抗α２ ｍＡｂとの組み合わせで処置した野生型マウスに見られる結果と一致して、耳の腫脹の阻止をごくわずか高めたに過ぎなかった。
【００６５】
（実施例５）
炎症のＤＴＨおよびＣＨＳモデル両方に見られる抗インテグリンｍＡｂの阻止効果が抗α１および抗α２ ｍＡｂによって仲介される一般的抗α１炎症効果によって引き起こされる可能性もさらに排除するために、これらｍＡｂの刺激性皮膚炎に対する効果を研究した。
【００６６】
刺激性皮膚炎を評価するために、マウスの各耳の両側にアセトン中０．８％クロトン油５μｌを塗った。治療的またはコントロール抗体を刺激適用の４時間前に与えた。２４時間後に耳の腫脹を前記のように測定し、そしてクロトン油塗布前の耳の厚さと比較した。結果は上記のようにベースラインの耳の厚さの平均増加パーセント±ＳＥＭとして報告する。アセトンのみを塗布したマウス（ビヒクルコントロール）をネガティブコントロールとした。
【００６７】
２４時間後、クロトン油で処置したマウスの耳は、ビヒクルのみ（アセトン）を塗布したマウスに比較する場合、耳の厚さの有意な増加を示した（４８％）。クロトン油によって誘起される毒性耳腫脹は、抗α１または抗α２ ｍＡｂで前処置したマウスでは、ＰＢＳまたはコントロールｍＡｂ処置動物のいずれかと比較して有意な影響を受けなかった（図５）。クロトン油処置した耳の組織検査は、抗α１または抗α２ ｍＡｂ処置マウスと、コントロールｍＡｂ処置マウスまたはＰＢＳ処置マウスとを比較して、浸潤細胞の数またはタイプ、または浮腫生成において何ら差を示さなかった（データは示されず）。
【００６８】
（実施例６）
（α１β１およびα２β１による関節炎の阻止）α１β１は関節炎患者の滑液中の浸潤細胞によく発現することから、本発明者は以前に記載された加速性関節炎モデル（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２２巻：１３７−１４７頁）において抗α１または抗α２ ｍＡｂが阻止的に作用するかどうかを試験することにした。
【００６９】
アルスロゲン−ＣＩＡ抗体キットをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョラ、ＣＡ）から購入し、そして十分確立されたプロトコルを用いて関節炎を誘発した（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２２巻：１３７−１４７頁）。つまり、４種類の抗コラーゲン ＩＩ型ｍＡｂ（各１ｍｇづつ）の混合物を０日目に腹腔内注射し、続いて３日目に５０μｇＬＰＳを腹腔内注射することによって関節炎を誘発した。次の３−４日間にマウスは、腫脹した手首、足首およびを発生した。治療的またはコントロールｍＡｂ（２５０μｇ）の腹腔内注射を、０日目の抗コラーゲンｍＡｂの注射４時間前および３日目のＬＰＳ投与の４時間前に再度行われ、続いて実験期間中、３日目ごとに続けられた。３日目からマウスの関節炎発生を評価した。各肢の関節炎の重症度を４ポイント系を用いてスコア付けした。０＝正常；１＝足首または手首に軽度の赤み、またはわずかの腫脹；２＝足首または手首の中程度の腫脹；３＝いくつかの指、足首および足を含む重度の腫脹：４＝最大炎症。
【００７０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの重度の関節炎がＬＰＳ注射後７２時間以内に発生し、３週間を超えて持続した。抗コラーゲンｍＡｂ単独注射もＬＰＳ単独注射も、関節炎を誘発しなかった。コントロールｍＡｂ処置を受けたマウスはＰＢＳ処置マウスにみられるものと同程度の関節炎を示した（図６）。対照的に、抗α１ ｍＡｂ単独での処置は関節炎の実験期間中持続する顕著な減少（７８％）を示した。抗α２ｍＡｂ単独での処置は有益な効果を示し、コントロールｍＡｂ処置マウスと比較して関節炎スコアの３２％の減少を生じた。抗α１と抗α２ ｍＡｂとの組み合わせは抗α１ ｍＡｂ単独でみられるのと同様な程度の阻止を生じた。
【００７１】
（実施例７）
（抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置の炎症性細胞浸潤に与える影響の組織学的分析）ＳＲＢＣ誘起性ＤＴＨ応答のさらなる組織学的分析は、抗α１および抗α２ ｍＡｂ治療の、誘起された炎症性応答を調節する能力を確認した（図７）。ＳＲＢＣ感作マウスからの非チャレンジ足蹠（図７パネルＡ）は、同じマウスからのＳＲＢＣチャレンジ足蹠（図７パネルＢ）に比較して炎症性細胞性浸潤物を実質的には示さなかった。抗α１および抗α２を単独または組み合わせでのＳＲＢＣ感作マウスの処置は、ＳＲＢＣチャレンジ足蹠に見いだされるこれら浸潤細胞の数を、コントロールｍＡｂ−処置マウスと比較する場合、著しく減少した（図７パネルＣ−Ｆ）。浸潤細胞をより綿密に試験は、大部分の細胞が好中球からなり、若干の単球とリンパ球が存在していることを明らかにし、そして抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置がこれらの細胞数を著しく減らすことが確認された（図７パネルＧ−Ｈ）。
【００７２】
（実施例８）
（炎症性細胞浸潤物中のα１発現細胞の免疫組織化学的証明）浸潤細胞の性質をより精細に決定し、それらがコラーゲン結合インテグリンを発現するかどうかを決定するために免疫組織化学を行った（図８）。非処置マウスの炎症足蹠からの浸潤細胞についてα１β１インテグリンおよび細胞系統マーカーの発現について試験した（図８）。α１β１インテグリンは多くの浸潤白血球上に発現することが見出された（図８Ａ）。二重免疫組織化学を用いて浸潤細胞の性質およびα１β１発現の分布を同定した（図８Ｂ）。細胞系統マーカーを用いて、浸潤物がほとんど顆粒球／単球（Ｍａｃ−１＋）からなり、これら細胞の多くが好中球（Ｇｒ１＋）であり、加えて、少数がＴリンパ球（ＣＤ３＋）であることを見いだした（図８Ｂ）。α１β１インテグリンの発現は細胞の３サブセット全ての間に見いだされ、α１はＭａｃ−１＋顆粒球／単球のサブセット、Ｇｒ１＋好中球のサブセット、および浸潤ＣＤ３＋ Ｔリンパ球の大部分に発現した（図８Ｂ）。詳細な免疫組織化学分析は、抗α１および抗α２ ｍＡｂ処置が浸潤細胞数を減らすとはいえ、浸潤物中の細胞組成には変化が見られないことを明らかにした（データは示されず）。ＦＩＴＣ抗ハムスターｍＡｂでの免疫組成化学的染色は、抗α１および抗α２ ｍＡｂが炎症足蹠に局在化する能力を確認した（データは示されず）。
【００７３】
（実施例９）
（α１β１およびα２β１に対するｍＡｂによる関節炎の阻止およびα１欠乏マウスにおける関節炎の阻止）α１β１は関節炎患者の滑液中に浸潤する細胞に良好に発現されることから、本発明者は抗α１または抗α２ ｍＡｂがこれまで記載された（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２２巻：１３７−１４７頁）加速性関節炎モデルにおいて阻止的であるかを試験することにした。このモデルは、抗コラーゲンＩＩ型ｍＡｂの混合物をマウスに注射し、続いて、ＬＰＳを投与し、次の３−７日間に関節炎を発生させることを含む。マウスに０日から始めて、３日目ごとにｍＡｂを投与し、３日目ごとに関節炎の発生をスコア付けした。ＬＰＳ注射後７２時間以内に全てのマウスに重症な関節炎が発生し、３週間以上持続した。抗コラーゲンｍＡｂ単独の注射も、ＬＰＳ単独の注射も関節炎を引き起こさなかった。コントロールｍＡｂ処置を受けたマウスはＰＢＳ処置マウスに見られるのと同様にひどい関節炎を示した。これに対し、抗α１ｍＡｂ単独での処置は関節炎の顕著な減少（７９％以上）を示し、それは実験期間中持続した。抗α２ ｍＡｂ単独での処置もまた有益な効果を有し、コントロールｍＡｂ処置マウスに比較して関節炎スコアの３７％の減少を起こした。抗α１および抗α２ｍＡｂの組み合わせは抗α１ｍＡｂ単独で見られるものと同様程度の阻止を生じた。抗α１ｍＡｂ処置での関節炎スコアの減少は全てのマウスに見られ、そして以下のようないくつかの他のｍＡｂベースの関節炎治療に好都合に匹敵する：可溶性ＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質（Ｍｏｒｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７巻：３１７８−３１８２頁）、抗Ｍａｃ−１（Ｔａｙｌｏｒら、１９９６ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８８巻：３１５−３２１頁）、抗α４（Ｓｅｉｆｆｇｅ １９９６ Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２３巻：２０８６−２０９１頁）、および抗ＩＣＡＭ−１（カキモトら、１９９２ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２巻：３２６−３３７頁）（図９Ａ）。関節炎におけるα１β１の重要な役割を示すｍＡｂベースのデータと一致して、非処置α１欠乏マウスは野生型マウスに比較して関節炎スコアの顕著な減少を示した（図９Ｂ）。
【００７４】
（実施例１０）
（関節炎関節の免疫病態学に与える抗α１ｍＡｂ処置の影響）コントロールｍＡｂまたは抗α１ｍＡｂのどちらかの投与を受けた野生型関節炎マウス（８日目）からの関節を視覚的に、および組織学的に、正常非投与マウスからの関節と比較した（図１０）。視覚的に、コントロールｍＡｂ処置マウスからの関節は、指を含む足全体の赤さおよび腫脹を示したが、抗α１ ｍＡｂ処置マウスは関節または指のいずれかに炎症の兆候をほとんどまたは全く示さなかった。組織検査はコントロールｍＡｂ処置した関節炎関節に重度の変化を示し、それは炎症細胞を含む滑膜下組織の広範な浸潤、細胞の関節表面への付着、およびプロテオグリカン消失によって証明される著しい軟骨破壊を伴った（図１０）。これまでの報告（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８巻：２１０３−２１０８頁；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２巻：１３７−１４７頁）と一致して、このモデルにおける浸潤細胞の大部分は好中球である。マウスの抗α１ ｍＡｂ投与は炎症性浸潤物の量および軟骨破壊の程度を劇的に減らした（図１０）。
【００７５】
（実施例１１）
（関節炎の発生はリンパ球の非存在下では遅れ、そして抗α１ ｍＡｂによる関節炎の阻止はリンパ球の非存在下で起きる）コラーゲンｍＡｂ−誘起性関節炎モデルにおいて重要な細胞型を確認するために、野生型Ｂ６−１２９マウスおよびＲＡＧ−１−欠乏Ｂ６−１２９マウスの関節炎発生能力を比較した（図１１）。ＲＡＧ−１（組み換え活性遺伝子−１）の遺伝子欠失は成熟ＴおよびＢリンパ球の完全な消失を起こす（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９２ Ｃｅｌｌ ６８巻：８６９−８７７頁）。野生型およびＲＡＧ−１−欠乏マウスの両方に関節炎が発生したが、ＲＡＧ−１−欠乏マウスにおける誘発速度の方が有意により遅い（図１１）。これらの結果は、リンパ球がこの関節炎モデルに関係はしているが、それらはこの疾患の発生および進行のためには必要ないことを示唆する。他の関節炎モデルでＲＡＧ−１欠乏マウスの効果を試験した公表された報告も、ＴおよびＢリンパ球の喪失が関節炎の発生を遅らせることを見いだした（Ｐｌｏｗｓら、１９９９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２巻：１０１８−１０２３頁）。抗α１ ｍＡｂでの野生型またはＲＡＧ−１−欠乏マウスのいずれの処置も関節炎を完全に阻止した（図１１）。これらの結果は、このモデルでは抗α１ ｍＡｂの有効性はリンパ球の存在には依存せず、前の実験が示唆したように（図９）、抗α１ ｍＡｂの疾患防止効果は他のα１発現細胞（例えばマクロファージおよび好中球）に対するその作用を介し得ることを示している。
【００７６】
（実施例１２）
（関節炎の抗α１ ｍＡｂ阻止の用量応答）抗α１ ｍＡｂ処置が関節炎予防に対して明らかな効果を有すると仮定して、本発明者はこれらの研究を用量応答分析にまでひろげた（図１２）。異なる用量のｍＡｂを０日目から始めて３日目ごとに腹腔内投与した。以前のデータと一致して、抗α１ ｍＡｂ２５０μｇ用量はほぼ完全に関節炎を予防した。１００μｇのより少量の抗α１ｍＡｂはこのモデルにおいて関節炎予防に一部有効であったが、これより少い用量は関節炎スコアにいかなる認め得る効果を与えなかった（図１２）。
【００７７】
（実施例１３）
（抗α１ ｍＡｂでの治療的処置は関節炎スコアを減らすことができる）関節炎予防における抗α１ ｍＡｂの効果を仮定して、本発明者は、この疾患を発生しつつあるマウスを治療することを試みた。０日目に抗コラーゲン ＩＩ型ｍＡｂの混合物を注射し、続いて、３日目にＬＰＳを投与することによってマウスに関節炎を誘発させた。次いで４日目から開始して、マウスに抗α１ｍＡｂまたは可溶性ＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質のどちらかを投与した。４日目から抗α１ ｍＡｂを受けたマウスでは、４日目から開始して、コントロールハムスターｍＡｂを受けたマウスに比較する場合、関節炎の進行は完全に阻止された（図１３）。抗α１ｍＡｂの治療的投与で見られる阻止の程度は完全であり、抗α１ ｍＡｂの予防的投与（０日目に開始）で見られるものに匹敵した（図１３）。比較して、４日目からのＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパクでの処置は、コントロールＩｇ融合タンパクに比較する場合、関節炎スコアの６０−７０％の抑制しか生じなかった（図１３）。抗α１ ｍＡｂとＴＮＦレセプターＩｇ融合との一緒の組み合わせは、関節炎スコアの完全阻止に有効であった。これは、関節炎の抑制による抗α１ ｍＡｂ処置単独での完全な効果を考慮すると、驚くにあたらない。以上をまとめると、これらの結果は、抗α１ ｍＡｂでの治療的処置が関節炎スコアの抑制に効果的であり、ＴＮＦアンタゴニストの治療的処置に好都合に匹敵することを示す。
【００７８】
（実施例１４）
（α１−Ｉドメインのクローニングおよび変異誘発）ヒトおよびラットα１β１インテグリンＩドメイン配列を、全長ｃＤＮＡｓから（Ｋｅｒｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、２２８１１−２２８１６頁；Ｉｇｎａｔｉｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１巻、７０９−７２０頁）ポリメラーゼ連鎖応答法（ＰＣＲ）（ＰＣＲ ＣＯＲＥキット；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、ドイツ）によって、下記のヒト特異的（５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＡ−３’［順方向］；５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴ−３’［逆方向］）またはラット特異的（５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＣＡＡ−３’［順方向］；５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＣＧＡＡＴＡＴ−３’［逆方向］）プライマーを用いて増幅した。生成したＰＣＲ増幅生成物を精製し、ｐＧＥＸ４ｔ−ｉ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合し、コンピテントなＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを、約４５ｋＤａグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−Ｉドメイン融合タンパク質の発現に関してスクリーニングした。さらに特徴づけるために選択したクローンのプラスミドＤＮＡの挿入物からの配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００７９】
ラット／ヒト キメラα１−Ｉドメイン（ＲΔＨ）を生成し（ＭＯＲＰＨ変異誘発キット；５プライム−３プライム）、ラット残基Ｇ９２、Ｒ９３、Ｑ９４、およびＬ９７（図１４）を対応するヒト残基、Ｖ、Ｑ、Ｒ、およびＲにそれぞれ交換した。上記ＲΔＨＩドメインを有するクローンは、診断的Ｓｔｕ１制限酵素部位の欠失によって同定され、挿入物はＤＮＡ配列決定によって確認された。ヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列は図１５に示される。
【００８０】
（実施例１５）
（α１Ｉドメインに特異的なｍＡｂの生成）モノクローナル抗体はインテグリンサブユニットの構造と機能との関連性の研究において非常に有用なプローブであることが証明された。例えばｍＡｂを広く用いて、活性化コンホメーションと関連するβ１サブユニットの領域が研究された（Ｑｕ，ＡおよびＬｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４巻、９３１−９４２頁）。従って、α１−Ｉドメインのコンホメーション変化のための潜在的プローブを同定するために、本発明者はヒトα１−Ｉドメインに対するｍＡｂのパネルを作成した。
【００８１】
（抗α１Ｉドメイン モノクローナル抗体の作製）雌ロバートソンマウス（ジャクソン研究所）を完全フロイントアジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｉｅｓ）で乳濁化した２５μｇ精製ヒトα１β１（エドワーズら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻：１２６３５−１２６４０頁）で腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫した。これらを、不完全フロイントアジュバント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｉｅｓ）で乳濁化した２５μｇα１β１を３回腹腔内ブーストした。最も高い抗α１−Ｉドメイン力価を有するマウスに、融合の３日前に１００μｇのα１β１を腹腔内ブーストし、そして融合の前日に５０μｇのα１β１を静脈内注射した。脾細胞をＦＬ６５３骨髄腫細胞と１：６の比率で融合し、９６ウェル組織培養プレートに1ウェルあたり１００，０００および３３，０００で培養した。
【００８２】
上清液について、単色ＦＡＣＳによってα１β１インテグリンへの結合性をアッセイした。ＦＡＣＳ分析の前に、上清液を非トランスフェクトしたＫ５６２細胞と共にインキュベートして、βサブユニットに単に結合しているＩｇＧを除去した。続いて、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＮａＮ3を含むＰＢＳ中１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））に懸濁したα１インテグリンサブユニット（Ｋ５６２−α１）でトランスフェクトした３−５×１０4個のＫ５６２細胞を上清液と共に４℃で４５分間インキュベートし、洗浄し、そしてフィコエリスリンに結合した抗α１マウスＩｇＧと共にインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗った後、細胞をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。
【００８３】
生成したハイブリドーマからの上清液を、α１−Ｉドメインへの結合性に関してスクリーニングした。つまり、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌヒトα１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合体５０μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｋ）のウェル上に４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックし、そしてハイブリドーマ上清液をＩドメインと共に室温で１時間インキュベートした。０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでよく洗った後、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｊａｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、さらに１時間インキュベートした。最後の洗浄後、０．１Ｍグリシン、１ｍＭ ＺｎＣｌ2、および１ｍＭ ＭｇＣｌ2中１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を室温で３０分間加え、プレートをＯ．Ｄ．４０５で読み取った。
【００８４】
選択した上清液について、コラーゲンＩＶへのＫ５６２−α１依存性接着を阻止するそれらの能力を試験した。Ｋ５６２−α１細胞を、０．２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中２ｍＭの２’，７’（ビス−２−カルボキシエチル−５および６）（ｂｉｓ−２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ−５ ａｎｄ ６）カルボキシフルオレッセイン ペンタアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で３７℃で３０分間標識化した。標識細胞を結合緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、 ｐＨ７．４；０．９％ＮａＣｌ；および２％グルコース）で洗い、結合緩衝液プラス５ｍＭ ＭｇＣｌ2中に最終濃度１×１０6細胞／ｍｌになるように再懸濁した。上清液５０μｌを、９６ウェルプレートで１ウェルあたり、等容量の２×１０5個のＫ５６２−α１細胞と共にインキュベートした。次いで、そのプレートを遠心分離し、上清液を除去した。細胞を結合緩衝液に再懸濁し、コラーゲンコーティングプレートのウェルに移し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、結合緩衝液で３回洗うことにより未接着細胞を除去した。接着した細胞をＣｙｔｏｆｌｕｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。
【００８５】
本発明者は最初に１９ハイブリドーマを同定した。その上清液はα１β１インテグリン（Ｋ５６２−α１）を発現するヒト白血病Ｋ５６２細胞に、そしてα１−Ｉドメインに結合した。これらのハイブリドーマの各々から免疫グロブリンを精製し、コラーゲンＩＶに結合するＫ５６２−α１またはα１−Ｉドメインのいずれかをブロックする能力について試験した。ｍＡｂは２クラスに分けられた：α１β１機能をブロックするクラスとブロックしないクラス。例えばクローンＡＥＦ３、ＢＧＣ５およびＡＪＨ１０によって産生するｍＡｂはα１−Ｉドメインに結合するが（図１６Ａ、ＢＧＣ５に関してはデータは示されず）、ｍＡｂ ＡＪＨ１０だけがコラーゲンＩＶに対するα１−Ｉドメイン−依存性（図１６Ｂ）またはＫ５６２−α１（図１６Ｃ）接着を阻止する。
【００８６】
（相補的決定領域の配列決定）このｍＡｂパネルのクローン起源を確立するために、本発明者はＰＣＲによって増幅し、そして１９抗体のうち１２抗体からのＣＤＲを配列決定した（データは示されず）。
【００８７】
１０7ハイブリドーマ（ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ分離キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から分離したｍＲＮＡ２μｇを、下記のプライマーそれぞれ２５ｐＭを用いて逆転写した（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ）：重鎖ＶＨ１ＦＯＲ−２（Ｍｉｄｈｉｓｈｉｔａら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２巻、８５７−８６７頁）；軽鎖、ＶＫ４ＦＯＲ（これは４個の別々のオリゴを決める）（Ｋｅｒｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：２２８１１−２２８１６頁）。各ハイブリドーマで、重鎖および軽鎖を下記のオリゴの種々の組み合わせを用いて４つの別個のＰＣＲ応答で増幅した：１）重鎖：ＶＨ１ＦＲ１Ｋ（Ｋａｍａｔａら（１９９５）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻：１２５３１−１２５３５頁）、ＶＨ１ＢＡＣＫ（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６巻：９２３−９３５頁）、ＶHｆｒ１ａ、ＶHｆｒ１ｂ、ＶHｆｒ１ｅ、ＶHｆｒ１ｆ、ＶHｆｒ１ｇ（Ｉｇｎａｔｉｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１巻：７０９−７２０頁）、またはＶＨ１ＦＯＲ−２（Ｍｉｃｈｉｓｉｔａ，Ｍ．、Ｖｉｄｅｍ，Ｖ．、およびアルノート（Ａｒｎａｏｕｔ，Ｍ．Ａ．）ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２巻、８５７−８６７頁）；２）軽鎖：ＶＫ１ＢＡＣＫ（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６巻：９２３−９３５頁）、ＶＫ４ＦＯＲ、ＶＫ２ＢＡＣＫオリゴ（ケルンら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：２２８１１−２２８１６頁）またはＶkｆｒ１ａ、ＶHｆｒ１ｃ、ＶHｆｒ１ｅ、ＶHｆｒ１ｆ（イグナチウスら（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．１１１巻：７０９−７２０頁）。生成物を増幅し（９５℃で５分、９４℃で１分を５０サイクル、５５℃で２分、７２℃で２分、最終サイクルは７２℃で１０分）、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ）、列挙せる種々のオリゴを用いてＡＢＩ３７７ Ａｅｑｕｅｎｃｅｒで直接配列決定した。
【００８８】
機能ブロッキングｍＡｂを産生するクローンからの配列は全ての相補的決定領域（ＣＤＲ）および介在フレームワーク領域にわたりほぼ一致し、これらのハイブリドーマがクローン的（Ｃｌｏｎａｌｌｙ）に関連があることを示唆する。
【００８９】
（実施例１６）
（免疫ブロッテイングおよびＦＡＣＳ分析）非ブロッキング抗体（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の可変領域の配列は、阻止抗体で見いだされるクローン的に関連がある配列のファミリーとは著しく異なっていた。阻止抗体が単一クローンに由来するようにみえることから、本発明者は一つ（ＡＪＨ１０）を選択し、さらに詳しく特徴づける。
【００９０】
（免疫ブロッテイング）ヒツジ大動脈から切り取った平滑筋細胞層およびＫ５６２−α１細胞を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）２０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で抽出した。サンプルを４−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロッテイング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）した。それらのブロットをＴＢＳ中５％ドライミルクでブロックした；０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ中で洗い、０．０５％ＮａＮ3を含むブロッキング緩衝液中の抗体と２時間共にインキュベートした。次いで、ブロットを前のように洗い、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧと共に１時間インキュベートし、再び洗い、次いで、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理した。次いで、ブロットをフィルム（Ｋｏｄａｋ）に３０〜６０秒間曝し、現像した。
【００９１】
免疫ブロッテイング（図１７Ａ）およびＦＡＣＳ分析（図１７Ｂ）は、ＡＪＨ１０がヒト、ウサギ、およびヒツジα１β１インテグリンとは応答するが、ラットα１β１インテグリンとは応答しないことを示し、これは、ブロッキングｍＡｂが進化的に保存された線状エピトープに結合することを示唆する。非ブロッキングｍＡｂは免疫ブロッテイングにおいても効率的でなく、またヒト以外の種とも応答しなかった。
【００９２】
（実施例１７）
（α１−Ｉドメインのコラーゲンへの結合は二価カチオン依存性である）
（Ａ．α１−Ｉドメインの精製）
α１−ＩドメインはＥ．ｃｏｌｉにおいて配列の結合部にトロンビン切断部位を含むＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として発現される。ＰＢＳ中で溶解した細胞からの清澄な上清液を、ＰＢＳでよく洗ったグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。α１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５ｍＭグルタチオン（還元型）で溶出した。変性研究では、Ｉドメインは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中のトロンビンで切断され、ＧＳＴ融合パートナーから精製された。ＤＴＴを２ｍＭになるように付加し、そのサンプルをグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムにロードした。フロースルーおよび洗浄フラクションをプールし、ＱセファロースＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。α１−Ｉドメインを５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、７５ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。精製Ｉドメインはエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、その予想質量（Ｌｅｅら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３巻、１３３３−１３４０頁、８７１Ｄａ）を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一バンドとして移動し、そして上記タンパク質はＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のサイズ排除クロマトグラフィーによって、 適切なサイズの単一ピークとして溶出した。
【００９３】
（Ｂ．機能分析）
９６ウェルプレートを１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）またはコラーゲンＩ型（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で４℃で一晩コーティングし、Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１ｍＭ ＭｎＣｌ2；２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗い、そして２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）でブロックした。１ｍＭ ＭｎＣｌ2および３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中のα１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質の一連の希釈物を、ものを、コーティングプレート上で室温で１時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝液で洗った。結合α１−Ｉドメインを１０μｇ／ｍｌビオチン化抗ＧＳＴポリクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；１ｍＭ ＭｎＣｌ2および３％ＢＳＡを含むＴＢＳで１：３０００に希釈したＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、および１−Ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ（２、２’−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリン スルホネート］；Ｐｉｅｒｃｅ）の連続添加によって検出した。プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でＯ．Ｄ．４０５で読み取った。
【００９４】
（結果）
ヒトおよびラット（ヒトに９５％同一）α１−ＩドメインをＥ．ｃｏｌｉでＧＳＴ−融合タンパクとして発現させ、そしてグルタチオン セファロース上で精製した。両タンパクについて、以前に記載されたＥＬＩＳＡベースのアッセイのバリエーションを用いてコラーゲンＩおよびＩＶへの結合を試験した（Ｑｕ，Ａ．およびＬｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２巻、１０２７７−１０２８１頁）。ヒトα１−ＩドメインはコラーゲンＩよりもコラーゲンＩＶにより効率的に結合する（図１８Ａ）。α１−Ｉドメインに特異的な抗体は両リガンドに対する結合を排除したが、α２−Ｉドメインに特異的な抗体は排除しなかった（図１８Ｂ）（コラーゲンＩのデータは示されず）。Ｍｎ2+もＭｇ2+も結合を刺激し、ＥＤＴＡはバックグラウンドレベルへの結合を減らした（図１８Ｃ）。ヒトおよびラットα１−Ｉドメインの間で、リガンド結合の顕著な差は検出されなかった。これは種間の配列の差は機能的に関係しないことを示唆する（データは示されず）。このように、 α１−Ｉドメインは特異的に、効率的リガンド結合のためのカチオンを必要とする。
【００９５】
（実施例１８）
（ＭＩＤＡＳモチーフ近くのカチオン依存性エピトープ残基）本発明者はＡＪＨ１０がヒトのα１−Ｉドメイン配列を識別するが、ラットのα１−Ｉドメイン配列は識別せず、α１β１機能ブロッキングｍＡｂのためのエピトープをマッピング（位置解析）するという知見を活用した。ヒトおよびラット配列は１２アミノ酸だけ異なり、そのうち４アミノ酸はＭＩＤＡＳモチーフ内の重要なスレオニン（図１４Ａ、ａａ９８）に隣接した６アミノ酸（ａａ９２−９７、図１４Ａ）の範囲にある。この６アミノ酸残基、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡｒｇがブロッキングｍＡｂのためのエピトープを含む、という仮定を試験するために、ラット残基Ｇ９２，Ｒ９３、Ｑ９４、およびＬ９７を、対応するヒト残基、Ｖ、Ｑ、Ｒ、およびＲにそれぞれ交換して、キメラＩドメイン（ＲΔＨ）を構成した。ＡＪＨ１０は、全ての機能ブロッキングｍＡｂと共に、キメラＩドメインを認識する（ＲΔＨ；図１４Ｂ）。
【００９６】
これらの残基を、α１−Ｉドメインの三次元構造のＭＩＤＡＳドメインに関して方向づけるために、本発明者はα２−Ｉドメインの結晶構造の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を用いてα１−Ｉドメインをモデル化した。
【００９７】
ヒトα１Ｉドメインのホモログモデルをヒトα２Ｉ−ドメインのＸ線結晶構造を用いて作製した（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻、５４４−５４６頁）。そのモデルはＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ のホモログモデル化モジュール（バージョン２．３．５；Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作製された。プログラムＣＨＡＲＭＭ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４−６２８頁）を、全水素パラメーターセット２２において原子間距離（ａｔｏｍ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）の２倍の距離依存性誘電率と共に用いた。本発明者は先ず最初に、α１−Ｉドメインの全ての原子に１ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ2）の質量調和位置制約を用いて、１０００段階の最急降下法による最小化を行った。この最小化の後に、さらに１０００段階の最急降下法および、５０００段階のＡｄｏｐｔｅｄ−Ｂａｓｉｓ Ｎｅｗｔｏｎ Ｒａｐｈｓｏｎ法による計算を行い、α１−ＩドメインのＣ−α原子を０．１ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ2）に制約し、α２−ＩドメインＸ線結晶構造からの有意な偏差を避けた。
【００９８】
α１β１およびα２β１インテグリン配列は５１％の同一性を示し、挿入または決失は示さなかった。これは２つのＩドメインの全体的構造が類似していることを示唆する。金属配位部位はα１−Ｉドメイン内の、α２−Ｉドメインの場合と同じ場所にあると予想される。そしてブロッキングｍＡｂのためのエピトープを含む残基類はヘリックスα３とヘリックスα４との間のループ（ここにはカチオン結合のために重要なＭＩＤＡＳモチーフ内のスレオニンが含まれる）上に位置する。上記のα１−Ｉドメインモデルは、Ｑ９２（図１４Ａ）のアミド窒素が、Ｉ３３（Ｓ３２に隣接する残基）のカルボニル基と水素結合することを予想する。従って、このエピトープを含む上記ループはＭＩＤＡＳ領域の安定化において機能的役割を果たし得る。
【００９９】
上記の発明を明確にするために図および実施例によって若干詳細に述べたが、或る種の変化および変更がなされることは当業者には明らかである。従って、上記説明および実施例は発明の範囲を制限すると解釈されるべきでなく、本発明は添付のクレームによって輪郭づけられるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載される発明。
【請求項１】
明細書に記載される発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−１７６９８３（Ｐ２０１２−１７６９８３Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１３０１７７（Ｐ２０１２−１３０１７７）
【出願日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【分割の表示】特願２０１１−１１６３６６（Ｐ２０１１−１１６３６６）の分割
【原出願日】平成１２年６月１日（２０００．６．１）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３０１７７（Ｐ２０１２−１３０１７７）
【出願日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【分割の表示】特願２０１１−１１６３６６（Ｐ２０１１−１１６３６６）の分割
【原出願日】平成１２年６月１日（２０００．６．１）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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