Ｙ群髄膜炎菌ワクチン及びそれらの髄膜炎菌組合せワクチン
本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体（ＧＹＭＰ）、改変多糖体と担体を含む複合体、Ｙ群髄膜炎菌に対するヒトを含めた温血動物の免疫用ワクチンに関し、これらの改変多糖体、複合体及びワクチンを製造する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体（ＧＹＭＰ）、改変多糖体と担体を含む複合体、Ｙ群髄膜炎菌に対するヒトを含めた温血動物の免疫用ワクチンに関し、これらの改変多糖体、複合体及びワクチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性髄膜炎は、世界規模での健康に対する重大な脅威である。髄膜炎菌は、細菌性髄膜炎及び敗血症の主要な原因である。髄膜炎菌は、多糖きょう膜で被包されている。髄膜炎菌単離体は、その化学的及び抗原性的に異なる多糖きょう膜に基づいて１２の群に分類することができる。これらの群のうちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の５種類は、ヒトにおける細菌性髄膜炎及び敗血症の実質的にすべての症例の原因である。
【０００３】
Ｙ群髄膜炎菌によって引き起こされる細菌性髄膜炎の発生率は増加している。米国のいくつかの郡において１９８９年から１９９５年に実施された活動的な研究室によるサーベイランスによれば、血清型Ｙ髄膜炎菌性疾患の比率は１９８９年の０％から１９９５年の３２．５％に急激に増加した。この期間中、髄膜炎菌性疾患の全発生率は一定していた（Anonymous 1996, Serogroup Y meningococcal disease - Illinois, Connecticut, and selected areas, USA 1989-1996, Morb. Mortal. Rep. 45, 1010-1013）。
【０００４】
Ｙ群髄膜炎菌によって引き起こされる細菌性髄膜炎は、子供や若年成人においても起こり得るが、高齢者において発症し易い傾向にあり、細菌性髄膜炎の他の系統よりも肺炎を引き起こす可能性が高い。
【０００５】
多糖体ワクチンは、いくつかの血清型の髄膜炎菌によって引き起こされる疾患を予防するために使用されてきた。しかし、これらのワクチンは、一部の人種においては髄膜炎菌によって引き起こされる疾患の予防に有効ではない。
【０００６】
多糖体はＴ非依存性（胸腺非依存性）抗原である。多糖体は、タンパク質に対する免疫応答を誘導するときに遭遇しないいくつかの免疫学的諸特性を有する。これらの諸特性としては、免疫応答を誘導するＴ細胞が存在する明白な必要性がないこと、ＩｇＭの優勢、免疫後の記憶誘導（ｍｅｍｏｒｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）や親和性成熟がないこと、乳児、高齢者及び免疫無防備状態の人における低免疫原性などが挙げられる。その結果、純粋な多糖体ワクチンは、これらの患者に対して有効に使用することができない。
【０００７】
血清型Ｙ多糖体は、等モルのＮ−アセチルノイラミン酸とＤ−グルコースからなり、部分的にＯ−アセチル化されていることが、１９７０年代にＪｅｎｎｉｎｇｓによって報告された（Bhattacharjee et al,. Can. J. Biochem. 54: 1-8, 1976）。
【０００８】
ほとんどのＹ群髄膜炎菌単離体は、Ｏ−アセチル基がもっぱらそのシアル酸残基のＣ−７とＣ−９の間に分布するＯ−アセチル陽性（ＯＡ）多糖体を産生することが見出された。Ｏ−アセチル基分布の位置及び濃度におけるこの不均一性は、多糖複合体の処方を複雑にしている。
【非特許文献１】Anonymous 1996, Serogroup Y meningococcal disease - Illinois, Connecticut, and selected areas, USA 1989-1996, Morb. Mortal. Rep. 45, 1010-1013
【非特許文献２】Bhattacharjee et al,. Can. J. Biochem. 54: 1-8, 1976
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一目的は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化への使用に適切なワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、少なくとも１個の改変髄膜炎菌Ｙ多糖体又は改変髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片又は髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片を含むワクチンを提供する。以下の文において、「髄膜炎菌Ｙ多糖体」という用語及びその語形（ｆｏｒｍｓ）は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片及び髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片を含む。これらの多糖体は単独で使用して、Ｔ非依存性応答を誘発する抗原組成物を産生することができる。
【００１１】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体は、一般に、Ｔ依存性免疫応答を誘発するために担体タンパク質と複合化される。したがって、本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体と担体タンパク質を含む複合材料及びその複合材料を製造する方法も提供する。
【００１２】
本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を製造する方法も提供する。髄膜炎菌Ｙ多糖体は、そのシアル酸残基のＣ−７とＣ−９の間にもっぱら分布するＯ−アセチル基を含有するので、脱Ｏ−アセチル化によって改変することができる。したがって、本発明は、髄膜炎菌Ｙ多糖体の脱Ｏ−アセチル化方法も提供する。一実施形態においては、塩基加水分解を使用してこの多糖体を脱Ｏ−アセチル化することができる。
【００１３】
本発明は、脱Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体又はＯ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体を断片化する方法も提供する。一実施形態においては、弱酸加水分解を使用して多糖体を断片化する。多糖体のグリコシド結合を切断する他の方法としては、オゾン分解、超音波処理、塩基加水分解などが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、髄膜炎菌Ｙ多糖体は、塩基加水分解によって脱Ｏ−アセチル化することができる。塩基加水分解は、多糖体の溶液を塩基と一緒に加熱することによって実施することができる。
【００１５】
適切な塩基としては、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属アルキル酸化物などの強塩基が挙げられる。適切な塩基の具体例としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ及びＫＯｔＢｕが挙げられる。
【００１６】
使用される塩基の濃度は、塩基の解離定数などの考慮事項を含めて、使用される塩基の性質によって決まることはいうまでもない。当業者は、適切な塩基濃度を容易に決定することができるはずである。塩基がＮａＯＨである場合、多糖体と混合されたときの適切な塩基濃度は０．１から１０Ｎである。様々な例示的実施形態において、適切な濃度は２Ｎ、３Ｎ、４Ｎなどの１から５Ｎである。
【００１７】
適切な反応温度は、使用される塩基及び選択される濃度によって決まる。一般に、５０℃から１００℃の反応温度が適切である。特に、約８０℃などの７５℃から８５℃の温度が適切である。
【００１８】
反応時間は、使用される塩基、塩基濃度、反応温度などいくつかの要因によって決まる。一般に、反応時間は塩基濃度又は温度の低下とともに長くなる。適切な反応時間は一般に１０から２５時間であり、より典型的には１５から２０時間、例えば、１６、１７、１８又は１９時間である。
【００１９】
炭水化物化学の当業者は、特定のパラメータを最適化し、収率を最適化するために上記パラメータを操作できることを理解されたい。そうすることによって、化学薬品消費（塩基）、温度、時間などの商業的に関連する変数を特定のシステムにおける製造に対して最適化することができる。例えば、脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体を製造するのに必要な時間を最小限に抑え、かくして塩基濃度及び温度の好ましい範囲の上部を使用することを選択したい場合がある。本明細書に提供される例は、これらの多糖体の比較的小規模な製造を説明するものであり、より大規模な製造システムに適合させるために、上記パラメータを示された範囲内で変えることができる。
【００２０】
この方法によって達成される脱Ｏ−アセチル化度は、Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定して完全である。脱Ｏ−アセチル化多糖体は酸加水分解に場合によっては供されてもよい。このステップは、大きい分子多糖体をより小さなＭｗの断片に分解し、出発材料１グラムにつきより多くの個体Ｙ群髄膜炎菌多糖体エピトープ提示分子を提供するために使用される。
【００２１】
酸加水分解は、多糖体溶液を酸又は緩衝剤形成化合物と一緒に撹拌することによって実施することができる。適切な酸又は緩衝剤形成化合物としては、約３〜６の酸性ｐＨにわたって緩衝する、酢酸ナトリウムなどのアルカリ金属アセタートなどが挙げられる。化学の当業者は、他の弱酸塩を使用してこのｐＨ範囲の適切な緩衝剤を調製できることを理解されたい。緩衝剤は、水素イオン（Ｈ＋）源を全反応期間にわたって比較的一定した濃度に維持するので、本発明の方法において特に有用である。
【００２２】
使用される酸又は緩衝剤形成化合物の濃度が、使用される酸又は緩衝剤形成化合物の性質によって決まることはいうまでもない。当業者は、適切な酸及び緩衝剤形成化合物濃度を容易に決定することができるはずである。酢酸ナトリウムが多糖体と混合されるときの適切な濃度は、０．１Ｎ酢酸ナトリウムなどの０．０１から１Ｎ、例えば０．０５から０．５Ｎである。
【００２３】
適切な反応温度も使用される酸又は緩衝剤形成化合物によって決まる。一般に、５０℃から１００℃、より典型的には約７０℃など約６５℃から８０℃の反応温度が適切である。
【００２４】
本発明の様々な実施形態においては、反応混合物を撹拌することができる。撹拌速度は、使用される酸又は緩衝剤形成化合物、酸又は緩衝剤形成化合物の濃度、使用される撹拌機のタイプ、反応温度などいくつかの要因によって決まる。反応器が回転振とうされる場合には、適切な撹拌速度は一般に５０から１００ｒｐｍ、例えば、６５ｒｐｍである。
【００２５】
脱Ｏ−アセチル化多糖体は、酸加水分解に供されたかどうかにかかわらず、再Ｎ−アセチル化（ｒｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）を場合によっては起こすことができる。このステップによって、塩基加水分解中に生成され得る遊離第一級アミンがすべて確実に再Ｎ−アセチル化される。
【００２６】
再Ｎ−アセチル化は、無水酢酸を用いて実施することができる。一般に、このステップは中性又は塩基性溶液中で起こり、例えば、溶液のｐＨは７から９などの７から１３、例えば８とすることができる。他の再Ｎ−アセチル化用化学薬品としては、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニル、酢酸４−ニトロフェニルなどが挙げられる。これらの薬剤の使用は化学分野において公知である。
【００２７】
適切な反応温度は、反応混合物のｐＨ、使用される試薬の性質などの要因によって決まる。一般に、反応は１５℃から３５℃などの室温付近で起こり、より典型的には２０℃から２５℃で起こる。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、脱Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体断片を調製する方法は、
ａ）少なくともある程度精製された髄膜炎菌Ｙ多糖体を用意するステップと、
ｂ）前記多糖体の塩基加水分解ステップと、
ｃ）ステップ（ａ）の生成物の酸加水分解ステップと
を含む。
【００２９】
ステップ（ｂ）の生成物は場合によっては再Ｎ−アセチル化してもよい。
【００３０】
多糖体を精製するための強塩基処理の使用は、参照により全体を本明細書に援用する米国特許第６２４８５７０号に記載されている。
【００３１】
Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体は、上記酸加水分解プロセスによって断片化することができる。
【００３２】
脱Ｏ−アセチル化多糖体は、酸加水分解に供されたかどうかにかかわらず、上記再Ｎ−アセチル化プロセスを場合によっては受けてもよい。
【００３３】
上記方法に使用される髄膜炎菌Ｙ多糖体は、使用前に髄膜炎菌性細菌から単離することができる。当分野で公知の任意の単離方法を使用することができる（米国特許第６２４８５７０号参照）。適切な単離方法としては、遠心分離とそれに続く限外ろ過などが挙げられる。単離された多糖体の本質の確認及び定量は、Ｈ−ＮＭＲ分光法、糖成分のＧＣ−ＭＳ分析、タイピング抗血清を用いたＥＬＩＳＡ、又は当業者に公知の他の方法によって実施することができる。
【００３４】
酸加水分解ステップを含む上記方法によって改変された多糖体は一般に低分子量である。本明細書では、「低分子量」という用語は、多角度レーザー光散乱に接続されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）によって測定して５から５０ｋＤａなどの１００ｋＤａ未満、例えば１０から２０ｋＤａの分子量を意味する。
【００３５】
脱Ｏ−アセチル化多糖体とＯ−アセチル化多糖体の両方は、酸化により還元性基を生成させることによって活性化することができる。還元性基の適切な生成方法としては、アルデヒド末端を生成する過ヨウ素酸塩（又はパラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸カリウムなどの関係する試薬）による限定的酸化切断（ｌｉｍｉｔｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ）などが挙げられる。
【００３６】
特定の理論に拘泥するものではないが、出願人らは、アルデヒド基がＣ−８において多糖体のシアル酸環外側鎖に選択的に導入されることを提唱する。すなわち、酸化はＣ−８位とＣ−９位の間で起こると考えられる。
【００３７】
活性化された多糖体群は、適切な担体タンパク質との複合に適切である。したがって、本発明は、適切な担体タンパク質と複合化された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体又はその断片を含む複合産物（conjugated product）も提供する。Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体は活性化することができるので、開示された方法は、適切な担体タンパク質と複合化されたＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体又はその断片も提供する。
【００３８】
任意の適切なタンパク質を担体タンパク質として使用することができる。本発明における使用に適切であるために、担体タンパク質は、治療すべき哺乳動物、例えば乳児に投与するのに安全でなければならず、免疫学的に有効でなければならない。安全性要件としては、主要な毒性がないこと、アレルギー反応のリスクが最小であることなどが挙げられる。
【００３９】
適切な担体タンパク質としては、細菌毒素、トキソイドなどが挙げられる。適切な細菌毒素及びトキソイドの例としては、ジフテリア、破傷風、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、（米国特許第５４３９８０８号に記載の）ｒＰｏｒＢなどのＰｏｒＢ及びすべての他のそれらの誘導体、百日咳菌、並びに大腸菌を含めた腸毒素原性細菌の毒素又はトキソイドが挙げられるが、これらだけに限定されない。全毒素及びトキソイドに加えて、適切な免疫賦活性効果を示すタンパク質トキソイドの断片又は一部も使用することができる。例えば、破傷風トキソイドの断片Ｃを担体として使用することができる。使用される毒素又はトキソイドは、その自然の出所（例えば、百日咳トキソイドの場合は百日咳菌）に由来することができ、又は組換えによって産生することができる。
【００４０】
適切な担体タンパク質を選択することによって、「担体効果」効果が得られる。「担体効果」によって、Ｙ髄膜炎菌多糖体は、Ｙ髄膜炎菌多糖体が単独で存在する場合よりも担体付着のためにより免疫原性になる。
【００４１】
免疫される哺乳動物が担体のみで以前に免疫されている場合には、より大きな応答が得られることがある。乳児は、慣例的に破傷風及びジフテリアトキソイドの予防接種を受ける。したがって、Ｙ髄膜炎菌に対して乳児を免疫するように意図されたワクチン中にこれらのトキソイドを使用することによって、効果が増大すると予想することができる。「担体効果」が得られたかどうかは、多糖体−担体タンパク質複合体による暴露に対する動物モデル又はヒトの免疫応答を監視することによって確認することができる。
【００４２】
破傷風毒素、ジフテリア毒素などの一部の細菌毒素は、２個以上のタンパク質で構成される。これらのタンパク質の１個は、哺乳動物細胞表面への結合に対して強い親和性を有する。やはり理論に拘泥するものではないが、この強い結合能力を有するタンパク質を使用することによって、免疫系からの応答をより効果的に惹起することが可能である。
【００４３】
担体タンパク質は、未変性毒素又は無毒化毒素（トキソイド）とすることができる。或いは、毒素に抗原性的に類似しているが無毒であるタンパク質を与える突然変異技術によって遺伝子改変されたタンパク質を使用することができる。このようにして改変されたタンパク質は「交差反応性材料」又はＣＲＭとして知られる。本発明に使用することができるかかる材料の１つはＣＲＭ１９７である。ＣＲＭ１９７は未変性ジフテリア毒素に基づく。ＣＲＭ１９７は単一のアミノ酸変化を有し、すなわち野生型毒素中のグリシン５２がＣＲＭ１９７ではグルタミン酸で置換され、未変性ジフテリア毒素から免疫学的に識別不能である。
【００４４】
本発明の一態様においては、細菌毒素又はトキソイドは破傷風毒素又はトキソイド或いはジフテリア毒素又はトキソイドである。
【００４５】
したがって、本発明は、破傷風毒素又はトキソイド或いはジフテリア毒素又はトキソイドに複合化された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体若しくはＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体を含む複合産物を提供する。
【００４６】
未変性毒素が使用されるときには、Ｙ髄膜炎菌多糖体との複合化によって未変性毒素の毒性は低下することがある。しかし、残留毒性レベルは高すぎる恐れがある。したがって、さらに解毒が必要になることがある。当分野で公知の任意の適切な方法を使用してこのタンパク質を解毒することができる。従来の方法としては、タンパク質上の遊離アミノ基と反応するホルマリンの使用などが挙げられる。
【００４７】
或いは、未変性毒素は、Ｙ髄膜炎菌多糖体と複合化する前に、例えばホルマリンで解毒してトキソイドを生成することができる。
【００４８】
Ｙ髄膜炎菌多糖体と適切な担体タンパク質の複合体は、活性化多糖体を適切な担体と接触させることによって得ることができる。通常、タンパク質担体よりも過剰の多糖体が使用され、一般に重量で２から３倍過剰の多糖体が使用される。当業者は、多糖体とタンパク質担体の比を変更して、複合体１個当たり異なる数の抗原多糖体成分を得ることができる。複合体１個当たりの多糖体成分の比がより高い場合には、担体タンパク質１個につきより多量の多糖体から出発する。より低い比を得るには、担体タンパク質１個につきより少量の多糖体から出発する。
【００４９】
還元的アミノ化は、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第４３５６１７０号に記載のように好ましいカップリング形式である。したがって、活性化された多糖体と担体を還元性カップリング剤の存在下で接触させることが好ましい。適切なカップリング剤としては、シアノ水素化ホウ素イオンなどの還元剤又はその等価物などが挙げられ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの適切な塩の形で得ることができる。目的とする還元末端を還元せず、担体タンパク質にも多糖体にも悪影響を及ぼさない任意の還元剤をカップリング剤として使用することができる。例えば、ピリジンボランは、この目的に適切な別の選択的還元剤である。他の適切な還元剤も当業者には明白なはずである。
【００５０】
選択的還元性カップリング剤は、多糖体のカルボニル基と担体タンパク質のアミノ基の間で形成されるシッフ塩基中間体の穏和な選択的還元剤として作用すると考えられる。これらのイオンは、複合化された後に多糖体上に残留する任意の活性なアルデヒド基の還元を遅らせる副次的効果を有すると考えられる。
【００５１】
カップリング剤は、通常は、複合産物の一部を形成せず、カップリング反応中に消費される。次いで、複合体を精製して残留カップリング剤及び反応副生物を除去することができる。精製された複合体は、炭水化物をタンパク質に複合化するために以前に使用された、アジピン酸ジヒドラジド、ｐ−ニトロ−フェニル−エチルアミンなどの潜在的毒性連結剤を含まないことが好ましい。
【００５２】
活性化多糖体と担体を接触させる条件は担体の性質によって決まる。例えば、担体が破傷風トキソイドであるときには、活性化多糖体と担体は、約７．４などのほぼ中性のｐＨで３０℃から４０℃などの約２０℃から５０℃、例えば３７℃の温度で接触させることができる。
【００５３】
カップリング反応が終了した後に、多糖体上のあらゆる残留アルデヒド基をキャップすることができる。これによって、活性化ステップ中に生成されたが、多糖体を担体タンパク質に複合化するのに利用されなかった髄膜炎菌多糖鎖上のあらゆる残留アルデヒド基が還元される。適切なキャッピング剤としては、ＮａＢＨ４、残留アルデヒド基をアルコール基に還元することができる当業者に公知の他の還元剤などが挙げられる。
【００５４】
本発明の方法によって生成される脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体は、ワクチン調製物中の抗原として利用することができるが、この調製物はＴ依存性免疫応答をもたらさない。Ｙ髄膜炎菌多糖体と適切な担体タンパク質の複合体は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンとして又はワクチン組成物中でより好ましく使用される。したがって、一部の好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは、脱Ｏ−アセチル化多糖体を含む複合体を含む。実施例のデータに示されたとおり、脱Ｏ−アセチル化多糖複合体は、Ｏ−アセチル化多糖体と交差反応性の抗体を産生する動物において免疫応答を誘発することができる。
【００５５】
通常の製剤操作によれば、多糖体又は複合体は安定化され、ワクチンとして処方される前又は処方後に発熱原性がないことが確認される。一態様においては、本発明は、破傷風毒素又はトキソイド或いはジフテリア毒素又はトキソイドと複合化された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体を含むワクチンを提供する。このワクチンは、ワクチン組成物中に従来含まれる成分を含有することができる。例えば、このワクチンは、適切な担体媒体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントの１種類若しくは複数を含むことができる。
【００５６】
適切な担体としては、生理的リン酸ナトリウム緩衝食塩水（ｐＨ７．４）などが挙げられる。アジュバントを含む担体の例は、ｐＨ６のリン酸ナトリウム緩衝食塩水に懸濁された０．１２５Ｍリン酸アルミニウムゲルである。ワクチンでの使用に適切な他の薬剤として許容される担体は当分野で公知であり、本発明に使用することができる。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、当業者に公知の他のアジュバント、例えば概して免疫原性である核酸、ペプチド化合物などが挙げられる。
【００５７】
本発明のワクチンは任意の適切な方法によって投与することができる。例えば、本発明のワクチンは注射、例えば、筋肉内又は皮下注射によって投与することができる。適切な担体を用いた無針経皮、鼻腔内又は粘膜投与を利用することもできる。
【００５８】
一般に、本発明のワクチンは５から１００μｇ、好ましくは１０から５０μｇの複合材料を含む。正確な投与量は、通常の用量／応答実験によって決定することができる。ワクチンは単一投与量又は２回以上、例えば３回のより少ない投与量で投与することができる。
【００５９】
本発明の複合産物は、１系統を超える髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンに使用することもできる。例えば、本発明の複合産物は、髄膜炎菌Ｙに加えて髄膜炎菌Ａ、Ｃ及びＷ１３５の１種類又は複数に対して免疫化が意図されたワクチンに使用することができる。複合産物は、髄膜炎菌に加えて他の疾患に対して免疫化が意図されたワクチンに使用することもできる。例えば、本発明の複合体をヘモフィルスインフルエンザ複合体と併用して組合せＨｉｂ−髄膜炎菌性ワクチンを製造することができる。
【００６０】
本発明の複合産物をワクチンとして使用すると「担体効果」が得られる。Ｙ髄膜炎菌多糖体は、Ｙ髄膜炎菌多糖体が単独で存在する場合よりも、担体としてより強力な抗原に付着するためにより免疫原性になる。特に、本発明のワクチンは、ヒトを含めた若年哺乳動物において有効なレベルの抗髄膜炎菌Ｙ抗体形成を誘発するために使用することができ、非複合多糖を含むワクチンよりも年齢依存性が極めて低い。
【００６１】
担体タンパク質が、本発明のワクチンのレシピエントがワクチン接種された疾患、例えば、破傷風又はジフテリアの細菌毒素又はトキソイドであるときには、髄膜炎菌Ｙに対する免疫と同時に担体毒素又はトキソイドに対する所望の免疫を得ることができる。
【００６２】
或いは、本発明の複合産物を含有するワクチンのレシピエントが、担体毒素又はトキソイドに関連する疾患に対して以前にワクチン接種を受けた場合には、「追加免疫」効果によって髄膜炎菌Ｙに対する抗体の産生を増大させることができる。
【００６３】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンの製造における、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体及び／又はＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体の使用も提供する。
【００６４】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンの製造における、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物及び／或いはＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物の使用も提供する。
【００６５】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンとしての、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体及び／又はＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体の使用も提供する。
【００６６】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンとしての、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物及び／或いはＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物の使用も提供する。
【００６７】
以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【００６８】
様々な髄膜炎菌性Ｙ系統に由来する多糖体のＯ−アセチル体の評価
未変性多糖体の調製：
髄膜炎菌性Ｙ系統Ｓ１９７５、Ｓ２２５、Ｓ３５３６及びＳ３７９０はＣａｒｌ Ｆｒａｓｃｈ博士（ＣＢＥＲ／ＦＤＡ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の厚意によって提供された。Ｙスラテラス（Ｓｌａｔｅｒｕｓ）系統は、Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ Ｃｏｌｌｉｎｓ博士（ＬＣＤＣ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）によって提供された。これらの系統は、振とうフラスコ中、撹拌下、グルコース及び酵母抽出物を含む培地中で３７℃で増殖された。培養物を８０００ｒｐｍの遠心分離によって収集し、上清を回収し、０．２２μｍフィルターユニットによってろ過滅菌した。
【００６９】
マイクロろ過された培養上清は、Ｂｉｏｍａｘ ３００ｋＤａ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を備えたフィルター装置によって限外ろ過されて濃縮された。濃縮された保持液を１Ｍ ＮａＣｌで１２回、次いで脱イオン（ＤＩ）水で１０回透析ろ過し、凍結乾燥させた。高分子量精製「未変性」多糖体は、ＧＣ−ＭＳによって糖組成が分析され、Ｈ−ＮＭＲ分光法によって５００ＭＨｚでＯ−アセチル含量及び位置が分析された。
【００７０】
表１にＧＣ−ＭＳ及びＨ−ＮＭＲ分析結果を要約する。
【００７１】
【表１】
【００７２】
この表からわかるように、それらのきょう膜多糖体のＯ−アセチル含量並びに存在する場合のこれらのＯ−アセチル基の位置に関連して系統間の不均一性がかなりある。例えば、系統Ｓ３７９０とスラテラスはＯＡｃ含量がほぼ同じであるが、それらのシアル酸残基上のこれらの基（Ｃ−７対Ｃ−９）の百分率はまったく異なる。系統Ｓ３７９０由来の多糖体はそのシアル酸のほぼ１個の位置（Ｃ−７）にのみＯＡｃ基を有するのに対して、スラテラス由来の多糖体はそれらを主にＣ−９上に有する。
【実施例２】
【００７３】
Ｙ群髄膜炎菌多糖体（ＧＹＭＰ）の精製
ｄＯＡ ＧＹＭＰの調製：
３００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いたＵＦによる多糖体の捕捉：
細胞を含まないマイクロろ過発酵透過液約１３Ｌを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘ ３００ｋＤａ膜（０．５ｍ２）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を備えたフィルター装置を用いて限外ろ過によって約１リットルに濃縮した。濃縮された保持液を１Ｍ ＮａＣｌで１２回、次いでＤＩ水で１０回透析ろ過した。それをさらに約０．２Ｌに濃縮し、回収した。
【００７４】
多糖体の塩基加水分解:
３００ｋＤａ保持溶液（約５ｍｇ ＰＳ／ｍＬ）を最終濃度２Ｎ ＮａＯＨに調節し、８０℃に設定された乾燥器に１６〜１８時間置いた。反応混合物を５０℃未満に冷却した後にＤＩ水１０Ｌ中に希釈した。３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜を通して濃縮した後に、濃縮された保持液を１Ｍ ＮａＣｌで１２回、次いでＤＩ水で１０回透析ろ過した。それをさらに約０．２Ｌに濃縮し、回収した。
【００７５】
ｄＯＡ ＧＹＭＰの酸加水分解：
保持溶液をテフロン反応器に移し、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を最終濃度０．１Ｎまで添加した。反応混合物を６Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ５に調節し、７０℃に設定された水浴中に置いた。多糖体がＳｕｐｅｒｏｓｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱に接続されたサイズ排除クロマトグラフィー）によって測定して２０，０００ダルトンの目標ＭＷに達するまで６５ｒｐｍで振とうした。
【００７６】
断片化されたｄＯＡ多糖体の再Ｎ−アセチル化：
溶液のｐＨを６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて８に調節し、次いで無水酢酸を０．８Ｍ無水酢酸の最終濃度まで室温で滴下した。５Ｎ ＮａＯＨを用いて反応混合物をｐＨ７から９に維持した。反応終了後、反応混合物のｐＨを１３に上昇させ、混合物をさらに１．５時間撹拌した。次いで、６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて反応ｐＨをｐＨ８に調節した。反応混合物を１Ｍ ＮａＣｌ ４Ｌに注ぎ、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘ １００ｋＤａ膜（０．５ｍ２）を備えた装置を用いて約１Ｌに濃縮し、透過液を収集した。１００Ｋ最終透過液を、Ｂｉｏｍａｘ ５Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を用いてＵＰによって約１リットルに濃縮した。濃縮保持液をＤＩ水で１０回透析ろ過し、次いで約０．２Ｌに濃縮し、収集した。
【００７７】
ＯＡ ＧＹＭＰの調製：
ＯＡ ＧＹＭＰの精製プロセスは、プロセスから省略されたアルカリ分解（２Ｎ ＮａＯＨ）ステップ以外、ｄＯＡ多糖体に対して上述されたものと同様であった。このプロセスから得られたＧＹＭＰは、それらのシアル酸のＣ７位とＣ９位の間に一様に分布する繰返し単位１個につきＯ−アセチル基約０．６Ｍ（又はシアル酸のＮ−アセチル基に対して６０％）を有した。
【００７８】
複合化前のＧＹＭＰの活性化：
低分子量（ＬＭＷ）ＯＡ及びｄＯＡｃ多糖体（１０〜２０ｋＤａ）をメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化して、アルデヒド基をＣ−８においてそれらの多糖体のシアル酸環外側鎖に選択的に導入した（Ｃ−９とＣ−８の間の酸化）。
【００７９】
Ｙ群髄膜炎菌多糖（ＧＹＭＰ）複合体の調製
破傷風トキソイドへの髄膜炎菌Ｙ多糖体の複合化：
過ヨウ素酸塩酸化型ＬＭＷ ＧＹＭＰ多糖体（２５ｍｇ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）（１０ｍｇ）（Ｓｅｒｕｍ Ｓｔａｔｅｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を０．２Ｍホスフェート緩衝剤（ｐＨ７．４）０．５ｍｌに溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５ｍｇ）を添加し、その混合物を３７℃で１日インキュベートした。複合化が終了した後に、溶液のｐＨを１Ｍ酢酸を用いて７から９に維持しながら新たに調製された１ｍＭ ＮａＯＨ中の１００ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４溶液４０〜６０μｌを氷浴中で極めてゆっくり添加することによって残留アルデヒドのキャッピングを実施した。
【００８０】
生成した複合体は、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜及びタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外ろ過によって１Ｍ ＮａＣｌで、次いでダイアフィルトレーション法によって食塩水で精製された。
【００８１】
バルク複合体は、処方される前に２℃〜４℃で貯蔵された。
【実施例３】
【００８２】
マウスにおけるＧＹＭＰ複合体の効力
免疫化：
４〜６週齢のメスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着した結合型ワクチンを皮下注射した。各マウスに複合多糖２μｇを０、２８及び４２日の３回投与した。０、２８、３８及び５２日目にマウスから採血した。
【００８３】
ＥＬＩＳＡによるＧＹＭＰ特異抗体：
ＧＹＭＰ特異的ＩｇＧ力価は、被覆抗原としてヒト血清アルブミンに連結されたＬＭＷ ＧＹＭＰ（ＯＡｃ又はｄＯＡ）を用いてＥＬＩＳＡによって推定された。
【００８４】
１回目及び２回目の注射後にＧＹＭＰ−ＴＴ複合体によって誘発されるｍｅｎＹ ＰＳ特異的ＩｇＧ力価（相乗平均）を図１に示す。これらは被覆抗原としてｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡを用いたＥＬＩＳＡによって測定された。図１からわかるとおり、両方のタイプのＧＹＭＰ複合体（ＯＡ及びｄＯＡ）はほぼ同じレベルのＧＹＭＰ特異的ＩｇＧを産生し、ＰＳ上のＯＡ基が免疫原性にさほど重要ではないことを示唆している。図２及び図３に、それぞれＯＡ及びｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレート上のＯＡ及びｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴ抗血清のＥＬＩＳＡ結合（３８日目）を示す。両方の抗原被覆プレート上で、抗ｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴ抗血清は、対応するＯＡ複合抗血清よりも反応性がわずかに高く、ＰＳ上のＯＡが免疫原性に必ずしも必要でないことを示している。
【００８５】
血清殺菌活性（ＳＢＡ）：
血清の血清殺菌活性は、様々なレベルのＯＡを有する多糖体を発現する表１に記載されたＧＹＭ系統を用いて試験された。図４に、ウサギ補体並びにＯＡ及びｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴ複合体を用いて誘導されたマウス抗血清のＯＡ ｍｅｎＹ系統３７９０を用いて測定されたＳＢＡ力価を示す。図４に示されたとおり、ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体は、（ＯＡきょう膜ＰＳを発現する）ｍｅｎＹ系統３７９０に対して、対応するＯＡ複合体と類似したＳＢＡレベルを誘導し、ＰＳ上のＯＡ基が免疫原性及び効力にさほど重要でないことを示している。
【００８６】
また、ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体によって誘導された抗体は、様々なＯＡ率のきょう膜ＰＳを発現するＧＹＭ系統を死滅させることができる（表２）。
【００８７】
【表２】
【実施例４】
【００８８】
結合型ワクチンによって誘導される抗体の特異性、多糖体上のＯＡ基の役割
結合型ワクチン誘導抗体の結合の特異性：
ＯＡ ＧＹＭＰ ＨＡＳ複合体又はｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ複合体に対するワクチン誘導抗体（ＯＡ ＧＹＭＰ複合体又はｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体を含むワクチン）のＥＬＩＳＡ結合の競合阻害は、主としてＣ９（ＧＹＭスラテラス）又はＣ７（ＧＹＭ Ｓ３７９０）にシアル酸ＯＡを含む、又はＯＡを全く含まない（ＧＹＭ Ｓ１９７５）高分子量（ＨＭＷ）ＧＹＭＰ阻害剤を用いて実施された。
【００８９】
図５に、ｄＯＡ ＧＹＭＰ、主としてＣ７のＯＡ ＧＹＭＰ及び主としてＣ９のＯＡ ＧＹＭＰに対するｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清の特異性を示す。全３種類の多糖体阻害剤は、ＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートへのこれらの抗血清の結合を完全に阻害することができる。ＯＡ ＧＹＭＰ（Ｃ９）は最も有効ではなく、ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体に対して産生された抗体がＯＡ多糖体とｄＯＡ多糖体で実際に識別されないことを示している。
【００９０】
図６に、上記同じ多糖体阻害剤に対するｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清の特異性を示す。ただし、今回は、ｄＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートに対する結合である。ここでもやはり、多糖体阻害剤は結合を完全に阻害することができ、ｄＯＡ多糖体が最良の阻害剤である。
【００９１】
図７に、ＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートを用いたＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清の特異性を示す。３種類の多糖体阻害剤は被覆プレートへの抗体の結合を十分に阻害することができるが、この場合は、Ｃ９のＯＡ ＧＹＭＰが最良の阻害剤であり、続いてｄＯＡ ＧＹＭＰ、次いでＣ７のＯＡ ＧＹＭＰと考えられ、ＯＡ複合体はエピトープ特異性がＣ９のＧＹＭＰ ＯＡに向かってわずかに増加する抗体を産生したことがおそらくは示唆される。しかし、これらの抗体は、ｄＯＡエピトープを極めて明確に認識する。
【００９２】
図８は、ｄＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートへの抗ＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清結合の特異性を検討したものである。３種類の多糖体阻害剤は、被覆プレートへのこの抗血清の結合を十分に阻害することができる。ｄＯＡ ＧＹＭＰとＣ７のＯＡ ＧＹＭＰが最良であり効力が等しい阻害剤である。
【００９３】
まとめると、これらのデータによれば、マウスにおいてはＧＹＭＰ複合体のｄＯＡ体はＯＡ ＧＹＭ多糖体とｄＯＡ ＧＹＭ多糖体（それぞれ図５及び図６）の両方を同様に認識する抗体を誘導する。
【００９４】
抗ＧＹＭＰ機能性抗体の特異性、ＯＡの役割：
シアル酸上のＯＡを主としてＣ７又はＣ９に有する可溶性ＧＹＭＰ阻害剤、或いはシアル酸上のＯＡをまったく持たない可溶性ＧＹＭＰ阻害剤を用いたＯＡ ＧＹＭ系統（３７９０）に対する（ウサギ補体を用いた）ＳＢＡの競合阻害によって、ＯＡ又はｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体によって誘導される機能性抗体の特異性を検討した。
【００９５】
図９に、マウス抗ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清を用いたかかる阻害の結果を示す。３種類の多糖体阻害剤は系統３７９０の死滅を完全に阻害することができる。ｄＯＡ ＰＳは（５０％において）両方のＯＡ多糖体阻害剤のほぼ５倍有効である。両方のＯＡ多糖体阻害剤は互いに同じように阻害するように見える。これらのデータによれば、ＯＡ多糖体を発現する生きたＧＹＭ生物の表面では、ｄＯＡ ＧＹＭＰに対する抗体が、ｄＯＡシアル酸（多糖体上約１０％）を含む多糖体エピトープを認識し、或いは産生される抗体の親和性が高いことを示している。
【００９６】
図１０に、マウス抗ＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清を用いたＳＢＡの競合阻害の結果を示す。ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清に関しては、ｄＯＡ ＧＹＭＰがＧＹＭ ３７９０生物に対してＳＢＡを阻害する最良の多糖体であり、他の２種類のＯＡ ＧＹＭＰがそれに続く。これらのデータによれば、多糖体上のＯＡ基は機能性抗体によって認識される防御エピトープにさほど重要ではないことが強く示唆される。
【実施例５】
【００９７】
ＧＹＭＰエピトープのサイズの決定
ｄＯＡ ＧＹＭＰからの長さの異なる（１個から９個の繰返し）オリゴ糖阻害剤の生成：
ｄＯＡ ＧＹＭＰを０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ３を用いて８０℃で２時間部分加水分解した。次いで、生成した長さの異なる（１個から９個の繰返し単位）オリゴ糖をサイズ排除クロマトグラフィーによってＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ−３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにかけて分離した。オリゴ糖の溶出を２１４ｎｍにおけるＵＶ検出によって監視した。長さの異なる個々のオリゴ糖を含む画分を混合し、凍結乾燥させた。かくして得られた阻害剤の純度及びサイズをＨ−ＮＭＲ分光法によって６００ＭＨｚで実施した。各ＧＹＭオリゴ糖阻害剤は、その還元末端に還元性ベータシアル酸を有し、もう一方の非還元性末端にα−Ｄ−グルコースを有する。
【００９８】
オリゴ糖阻害剤を用いたＥＬＩＳＡによる競合阻害：
ＧＹＭＰエピトープのサイズは、長さが漸増するＧＹＭオリゴ糖によるＧＹＭＰ特異的ウサギ抗体とＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレートの結合の競合阻害（ＥＬＩＳＡ）によって決定された。
【００９９】
図１１は、ｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレートへのウサギ抗全ＧＹＭ抗体（ＤＩＦＣＯ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）結合のＥＬＩＳＡ阻害である。ｄＯＡ ＧＹＭオリゴ糖は１個から１０個の繰返し単位の範囲にある。この図からわかるように、１個及び２個の繰返し単位は不十分な結合阻害剤であり、３個の繰返し単位オリゴ糖（６個のグリコシル残基）は結合を完全に阻害することができる。これらのデータによれば、６番目の残基の還元性シアル酸はエクアトリアル位のカルボキシラート基とベータコンホメーションの関係にあるので、抗体の結合部位はおそらく５個の糖残基と接触する。オリゴ糖のサイズが増加すると（４から１０ＲＵ）、モル／モル基準での阻害が増大し、長さが漸増する抗体によって認識されるエピトープコンホメーションが安定化することが示唆される。
【０１００】
図１２は、同じ阻害剤によるＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレート上の同じ抗体の結合阻害である。阻害パターンは図１１において認められた阻害パターンと類似しており、３ＲＵオリゴ糖構造を超えると結合が増加する。これらのデータはＧＹＭＰ複合体を設計する上で意味がある。というのは、担体タンパク質と複合化されるＧＹＭＰハプテンの最小サイズが１０個の繰返し単位であることをこれらのデータは示唆しているからである。
【実施例６】
【０１０１】
組み合わせられた髄膜炎菌性Ｙ結合型ワクチンの効力
ｄＯＡ ＧＣＭＰ−ＴＴとｄＯＡ ＧＷＭＰ ｒＰｏｒＢ結合型ワクチンと組み合わせられたｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴの組合せの効力をＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて試験した。各多糖体複合抗原２μｇを組み合わせて、又は単独で０日及び２８日にマウスに皮下投与した。０、２８及び３８日に採血し、ＯＡ ＧＹＭＰを発現するＧＹＭ系統３７９０に対するＳＢＡについて血清を分析した。
【０１０２】
図１３にかかる実験の結果を示す。組合せ複合抗血清におけるＧＹＭに対するＳＢＡは、単独ＧＹＭＰ複合抗血清において測定されたＳＢＡと大きく異ならず、３種類の複合体間に免疫学的干渉が認められないことが示された。同様に、組合せ複合体でも単独複合体でも、ＧＣＭＰ複合体成分とＧＷＭＰ複合体成分から生じるＳＢＡに免疫学的干渉は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】繰返し単位脱Ｏ−アセチル化Ｙ群（「ｄｅＯＡｃ−Ｙ」）髄膜炎菌多糖体の構造、下図及び未変性Ｏ−アセチル化Ｙ群（「ＯＡｃ−Ｙ」）髄膜炎菌多糖体、上図からのその調製を示す図である。
【図２】メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて１回又は２回の注射後に実施例３に記載されたように測定された、ＯＡｃ−Ｙ（上図）及びｄｅＯＡｃ−Ｙ（下図）髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘発されたＹ髄膜炎菌多糖体特異的ＩｇＧ力価の相乗平均を示すグラフである。
【図３】実施例３において測定された、ＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレート上のＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘導されるマウス抗血清の３８日目におけるＥＬＩＳＡ滴定を示すグラフである。
【図４】実施例３において測定された、ｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレート上のＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘導されるマウス抗血清の３８日目におけるＥＬＩＳＡ滴定を示すグラフである。
【図５】実施例３において測定された、ウサギ補体と、ＯＡｃ−Ｙ（上図）及びｄｅＯＡｃ−Ｙ（下図）髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘導されたマウス抗血清のＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌系統３７９０とを用いて測定された血清の殺菌活性力価を示す図である。
【図６】実施例４において測定された、炭素９（＊９／７）又は炭素７（＊７／９）におけるＯ−アセチル化量の多いＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ＯＡｃ−ＧＹＭＰ−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図７】実施例４において測定された、ＯＡｃ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ｄｅＯＡｃ−ＧＹＭＰ−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図８】実施例４において測定された、ＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図９】実施例４において測定された、ＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図１０】実施例４において測定され、マウス抗ｄＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清を用いて可溶性Ｙ髄膜炎菌多糖体阻害剤によるＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体系統（３７９０）に対する（ウサギ補体を用いた）ＳＢＡの競合阻害によって測定された、ＯＡｃ−Ｙ又はｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合体によって誘導される機能性抗体の特異性を示すグラフである。
【図１１】実施例４において測定された、マウス抗ＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清を用いたＳＢＡの競合阻害の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例５において測定された、１個から１０個の繰返し単位のｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌オリゴ糖によるｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレートに対するウサギ抗ホールセルＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体抗体の結合のＥＬＩＳＡ阻害を示すグラフである。
【図１３】実施例５において測定された、１個から１０個の繰返し単位のｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌オリゴ糖によるＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレートに対するウサギ抗ホールセルＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体抗体の結合のＥＬＩＳＡ阻害を示すグラフである。
【図１４】実施例６において測定された、Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおいてｄｅＯＡｃ−Ｃ髄膜炎菌多糖体及び破傷風トキソイド複合体及びｄｅＯＡｃ−Ｗ髄膜炎菌多糖体及びｒＰｏｒＢ複合体と組み合わせられたｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風トキソイドの複合体の効力に関する試験結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体（ＧＹＭＰ）、改変多糖体と担体を含む複合体、Ｙ群髄膜炎菌に対するヒトを含めた温血動物の免疫用ワクチンに関し、これらの改変多糖体、複合体及びワクチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性髄膜炎は、世界規模での健康に対する重大な脅威である。髄膜炎菌は、細菌性髄膜炎及び敗血症の主要な原因である。髄膜炎菌は、多糖きょう膜で被包されている。髄膜炎菌単離体は、その化学的及び抗原性的に異なる多糖きょう膜に基づいて１２の群に分類することができる。これらの群のうちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の５種類は、ヒトにおける細菌性髄膜炎及び敗血症の実質的にすべての症例の原因である。
【０００３】
Ｙ群髄膜炎菌によって引き起こされる細菌性髄膜炎の発生率は増加している。米国のいくつかの郡において１９８９年から１９９５年に実施された活動的な研究室によるサーベイランスによれば、血清型Ｙ髄膜炎菌性疾患の比率は１９８９年の０％から１９９５年の３２．５％に急激に増加した。この期間中、髄膜炎菌性疾患の全発生率は一定していた（Anonymous 1996, Serogroup Y meningococcal disease - Illinois, Connecticut, and selected areas, USA 1989-1996, Morb. Mortal. Rep. 45, 1010-1013）。
【０００４】
Ｙ群髄膜炎菌によって引き起こされる細菌性髄膜炎は、子供や若年成人においても起こり得るが、高齢者において発症し易い傾向にあり、細菌性髄膜炎の他の系統よりも肺炎を引き起こす可能性が高い。
【０００５】
多糖体ワクチンは、いくつかの血清型の髄膜炎菌によって引き起こされる疾患を予防するために使用されてきた。しかし、これらのワクチンは、一部の人種においては髄膜炎菌によって引き起こされる疾患の予防に有効ではない。
【０００６】
多糖体はＴ非依存性（胸腺非依存性）抗原である。多糖体は、タンパク質に対する免疫応答を誘導するときに遭遇しないいくつかの免疫学的諸特性を有する。これらの諸特性としては、免疫応答を誘導するＴ細胞が存在する明白な必要性がないこと、ＩｇＭの優勢、免疫後の記憶誘導（ｍｅｍｏｒｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）や親和性成熟がないこと、乳児、高齢者及び免疫無防備状態の人における低免疫原性などが挙げられる。その結果、純粋な多糖体ワクチンは、これらの患者に対して有効に使用することができない。
【０００７】
血清型Ｙ多糖体は、等モルのＮ−アセチルノイラミン酸とＤ−グルコースからなり、部分的にＯ−アセチル化されていることが、１９７０年代にＪｅｎｎｉｎｇｓによって報告された（Bhattacharjee et al,. Can. J. Biochem. 54: 1-8, 1976）。
【０００８】
ほとんどのＹ群髄膜炎菌単離体は、Ｏ−アセチル基がもっぱらそのシアル酸残基のＣ−７とＣ−９の間に分布するＯ−アセチル陽性（ＯＡ）多糖体を産生することが見出された。Ｏ−アセチル基分布の位置及び濃度におけるこの不均一性は、多糖複合体の処方を複雑にしている。
【非特許文献１】Anonymous 1996, Serogroup Y meningococcal disease - Illinois, Connecticut, and selected areas, USA 1989-1996, Morb. Mortal. Rep. 45, 1010-1013
【非特許文献２】Bhattacharjee et al,. Can. J. Biochem. 54: 1-8, 1976
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一目的は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化への使用に適切なワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、少なくとも１個の改変髄膜炎菌Ｙ多糖体又は改変髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片又は髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片を含むワクチンを提供する。以下の文において、「髄膜炎菌Ｙ多糖体」という用語及びその語形（ｆｏｒｍｓ）は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片及び髄膜炎菌Ｙ多糖体の断片を含む。これらの多糖体は単独で使用して、Ｔ非依存性応答を誘発する抗原組成物を産生することができる。
【００１１】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体は、一般に、Ｔ依存性免疫応答を誘発するために担体タンパク質と複合化される。したがって、本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体と担体タンパク質を含む複合材料及びその複合材料を製造する方法も提供する。
【００１２】
本発明は、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を製造する方法も提供する。髄膜炎菌Ｙ多糖体は、そのシアル酸残基のＣ−７とＣ−９の間にもっぱら分布するＯ−アセチル基を含有するので、脱Ｏ−アセチル化によって改変することができる。したがって、本発明は、髄膜炎菌Ｙ多糖体の脱Ｏ−アセチル化方法も提供する。一実施形態においては、塩基加水分解を使用してこの多糖体を脱Ｏ−アセチル化することができる。
【００１３】
本発明は、脱Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体又はＯ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体を断片化する方法も提供する。一実施形態においては、弱酸加水分解を使用して多糖体を断片化する。多糖体のグリコシド結合を切断する他の方法としては、オゾン分解、超音波処理、塩基加水分解などが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、髄膜炎菌Ｙ多糖体は、塩基加水分解によって脱Ｏ−アセチル化することができる。塩基加水分解は、多糖体の溶液を塩基と一緒に加熱することによって実施することができる。
【００１５】
適切な塩基としては、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属アルキル酸化物などの強塩基が挙げられる。適切な塩基の具体例としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ及びＫＯｔＢｕが挙げられる。
【００１６】
使用される塩基の濃度は、塩基の解離定数などの考慮事項を含めて、使用される塩基の性質によって決まることはいうまでもない。当業者は、適切な塩基濃度を容易に決定することができるはずである。塩基がＮａＯＨである場合、多糖体と混合されたときの適切な塩基濃度は０．１から１０Ｎである。様々な例示的実施形態において、適切な濃度は２Ｎ、３Ｎ、４Ｎなどの１から５Ｎである。
【００１７】
適切な反応温度は、使用される塩基及び選択される濃度によって決まる。一般に、５０℃から１００℃の反応温度が適切である。特に、約８０℃などの７５℃から８５℃の温度が適切である。
【００１８】
反応時間は、使用される塩基、塩基濃度、反応温度などいくつかの要因によって決まる。一般に、反応時間は塩基濃度又は温度の低下とともに長くなる。適切な反応時間は一般に１０から２５時間であり、より典型的には１５から２０時間、例えば、１６、１７、１８又は１９時間である。
【００１９】
炭水化物化学の当業者は、特定のパラメータを最適化し、収率を最適化するために上記パラメータを操作できることを理解されたい。そうすることによって、化学薬品消費（塩基）、温度、時間などの商業的に関連する変数を特定のシステムにおける製造に対して最適化することができる。例えば、脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体を製造するのに必要な時間を最小限に抑え、かくして塩基濃度及び温度の好ましい範囲の上部を使用することを選択したい場合がある。本明細書に提供される例は、これらの多糖体の比較的小規模な製造を説明するものであり、より大規模な製造システムに適合させるために、上記パラメータを示された範囲内で変えることができる。
【００２０】
この方法によって達成される脱Ｏ−アセチル化度は、Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定して完全である。脱Ｏ−アセチル化多糖体は酸加水分解に場合によっては供されてもよい。このステップは、大きい分子多糖体をより小さなＭｗの断片に分解し、出発材料１グラムにつきより多くの個体Ｙ群髄膜炎菌多糖体エピトープ提示分子を提供するために使用される。
【００２１】
酸加水分解は、多糖体溶液を酸又は緩衝剤形成化合物と一緒に撹拌することによって実施することができる。適切な酸又は緩衝剤形成化合物としては、約３〜６の酸性ｐＨにわたって緩衝する、酢酸ナトリウムなどのアルカリ金属アセタートなどが挙げられる。化学の当業者は、他の弱酸塩を使用してこのｐＨ範囲の適切な緩衝剤を調製できることを理解されたい。緩衝剤は、水素イオン（Ｈ＋）源を全反応期間にわたって比較的一定した濃度に維持するので、本発明の方法において特に有用である。
【００２２】
使用される酸又は緩衝剤形成化合物の濃度が、使用される酸又は緩衝剤形成化合物の性質によって決まることはいうまでもない。当業者は、適切な酸及び緩衝剤形成化合物濃度を容易に決定することができるはずである。酢酸ナトリウムが多糖体と混合されるときの適切な濃度は、０．１Ｎ酢酸ナトリウムなどの０．０１から１Ｎ、例えば０．０５から０．５Ｎである。
【００２３】
適切な反応温度も使用される酸又は緩衝剤形成化合物によって決まる。一般に、５０℃から１００℃、より典型的には約７０℃など約６５℃から８０℃の反応温度が適切である。
【００２４】
本発明の様々な実施形態においては、反応混合物を撹拌することができる。撹拌速度は、使用される酸又は緩衝剤形成化合物、酸又は緩衝剤形成化合物の濃度、使用される撹拌機のタイプ、反応温度などいくつかの要因によって決まる。反応器が回転振とうされる場合には、適切な撹拌速度は一般に５０から１００ｒｐｍ、例えば、６５ｒｐｍである。
【００２５】
脱Ｏ−アセチル化多糖体は、酸加水分解に供されたかどうかにかかわらず、再Ｎ−アセチル化（ｒｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）を場合によっては起こすことができる。このステップによって、塩基加水分解中に生成され得る遊離第一級アミンがすべて確実に再Ｎ−アセチル化される。
【００２６】
再Ｎ−アセチル化は、無水酢酸を用いて実施することができる。一般に、このステップは中性又は塩基性溶液中で起こり、例えば、溶液のｐＨは７から９などの７から１３、例えば８とすることができる。他の再Ｎ−アセチル化用化学薬品としては、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニル、酢酸４−ニトロフェニルなどが挙げられる。これらの薬剤の使用は化学分野において公知である。
【００２７】
適切な反応温度は、反応混合物のｐＨ、使用される試薬の性質などの要因によって決まる。一般に、反応は１５℃から３５℃などの室温付近で起こり、より典型的には２０℃から２５℃で起こる。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、脱Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体断片を調製する方法は、
ａ）少なくともある程度精製された髄膜炎菌Ｙ多糖体を用意するステップと、
ｂ）前記多糖体の塩基加水分解ステップと、
ｃ）ステップ（ａ）の生成物の酸加水分解ステップと
を含む。
【００２９】
ステップ（ｂ）の生成物は場合によっては再Ｎ−アセチル化してもよい。
【００３０】
多糖体を精製するための強塩基処理の使用は、参照により全体を本明細書に援用する米国特許第６２４８５７０号に記載されている。
【００３１】
Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体は、上記酸加水分解プロセスによって断片化することができる。
【００３２】
脱Ｏ−アセチル化多糖体は、酸加水分解に供されたかどうかにかかわらず、上記再Ｎ−アセチル化プロセスを場合によっては受けてもよい。
【００３３】
上記方法に使用される髄膜炎菌Ｙ多糖体は、使用前に髄膜炎菌性細菌から単離することができる。当分野で公知の任意の単離方法を使用することができる（米国特許第６２４８５７０号参照）。適切な単離方法としては、遠心分離とそれに続く限外ろ過などが挙げられる。単離された多糖体の本質の確認及び定量は、Ｈ−ＮＭＲ分光法、糖成分のＧＣ−ＭＳ分析、タイピング抗血清を用いたＥＬＩＳＡ、又は当業者に公知の他の方法によって実施することができる。
【００３４】
酸加水分解ステップを含む上記方法によって改変された多糖体は一般に低分子量である。本明細書では、「低分子量」という用語は、多角度レーザー光散乱に接続されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）によって測定して５から５０ｋＤａなどの１００ｋＤａ未満、例えば１０から２０ｋＤａの分子量を意味する。
【００３５】
脱Ｏ−アセチル化多糖体とＯ−アセチル化多糖体の両方は、酸化により還元性基を生成させることによって活性化することができる。還元性基の適切な生成方法としては、アルデヒド末端を生成する過ヨウ素酸塩（又はパラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸カリウムなどの関係する試薬）による限定的酸化切断（ｌｉｍｉｔｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ）などが挙げられる。
【００３６】
特定の理論に拘泥するものではないが、出願人らは、アルデヒド基がＣ−８において多糖体のシアル酸環外側鎖に選択的に導入されることを提唱する。すなわち、酸化はＣ−８位とＣ−９位の間で起こると考えられる。
【００３７】
活性化された多糖体群は、適切な担体タンパク質との複合に適切である。したがって、本発明は、適切な担体タンパク質と複合化された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体又はその断片を含む複合産物（conjugated product）も提供する。Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体は活性化することができるので、開示された方法は、適切な担体タンパク質と複合化されたＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体又はその断片も提供する。
【００３８】
任意の適切なタンパク質を担体タンパク質として使用することができる。本発明における使用に適切であるために、担体タンパク質は、治療すべき哺乳動物、例えば乳児に投与するのに安全でなければならず、免疫学的に有効でなければならない。安全性要件としては、主要な毒性がないこと、アレルギー反応のリスクが最小であることなどが挙げられる。
【００３９】
適切な担体タンパク質としては、細菌毒素、トキソイドなどが挙げられる。適切な細菌毒素及びトキソイドの例としては、ジフテリア、破傷風、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、（米国特許第５４３９８０８号に記載の）ｒＰｏｒＢなどのＰｏｒＢ及びすべての他のそれらの誘導体、百日咳菌、並びに大腸菌を含めた腸毒素原性細菌の毒素又はトキソイドが挙げられるが、これらだけに限定されない。全毒素及びトキソイドに加えて、適切な免疫賦活性効果を示すタンパク質トキソイドの断片又は一部も使用することができる。例えば、破傷風トキソイドの断片Ｃを担体として使用することができる。使用される毒素又はトキソイドは、その自然の出所（例えば、百日咳トキソイドの場合は百日咳菌）に由来することができ、又は組換えによって産生することができる。
【００４０】
適切な担体タンパク質を選択することによって、「担体効果」効果が得られる。「担体効果」によって、Ｙ髄膜炎菌多糖体は、Ｙ髄膜炎菌多糖体が単独で存在する場合よりも担体付着のためにより免疫原性になる。
【００４１】
免疫される哺乳動物が担体のみで以前に免疫されている場合には、より大きな応答が得られることがある。乳児は、慣例的に破傷風及びジフテリアトキソイドの予防接種を受ける。したがって、Ｙ髄膜炎菌に対して乳児を免疫するように意図されたワクチン中にこれらのトキソイドを使用することによって、効果が増大すると予想することができる。「担体効果」が得られたかどうかは、多糖体−担体タンパク質複合体による暴露に対する動物モデル又はヒトの免疫応答を監視することによって確認することができる。
【００４２】
破傷風毒素、ジフテリア毒素などの一部の細菌毒素は、２個以上のタンパク質で構成される。これらのタンパク質の１個は、哺乳動物細胞表面への結合に対して強い親和性を有する。やはり理論に拘泥するものではないが、この強い結合能力を有するタンパク質を使用することによって、免疫系からの応答をより効果的に惹起することが可能である。
【００４３】
担体タンパク質は、未変性毒素又は無毒化毒素（トキソイド）とすることができる。或いは、毒素に抗原性的に類似しているが無毒であるタンパク質を与える突然変異技術によって遺伝子改変されたタンパク質を使用することができる。このようにして改変されたタンパク質は「交差反応性材料」又はＣＲＭとして知られる。本発明に使用することができるかかる材料の１つはＣＲＭ１９７である。ＣＲＭ１９７は未変性ジフテリア毒素に基づく。ＣＲＭ１９７は単一のアミノ酸変化を有し、すなわち野生型毒素中のグリシン５２がＣＲＭ１９７ではグルタミン酸で置換され、未変性ジフテリア毒素から免疫学的に識別不能である。
【００４４】
本発明の一態様においては、細菌毒素又はトキソイドは破傷風毒素又はトキソイド或いはジフテリア毒素又はトキソイドである。
【００４５】
したがって、本発明は、破傷風毒素又はトキソイド或いはジフテリア毒素又はトキソイドに複合化された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体若しくはＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体を含む複合産物を提供する。
【００４６】
未変性毒素が使用されるときには、Ｙ髄膜炎菌多糖体との複合化によって未変性毒素の毒性は低下することがある。しかし、残留毒性レベルは高すぎる恐れがある。したがって、さらに解毒が必要になることがある。当分野で公知の任意の適切な方法を使用してこのタンパク質を解毒することができる。従来の方法としては、タンパク質上の遊離アミノ基と反応するホルマリンの使用などが挙げられる。
【００４７】
或いは、未変性毒素は、Ｙ髄膜炎菌多糖体と複合化する前に、例えばホルマリンで解毒してトキソイドを生成することができる。
【００４８】
Ｙ髄膜炎菌多糖体と適切な担体タンパク質の複合体は、活性化多糖体を適切な担体と接触させることによって得ることができる。通常、タンパク質担体よりも過剰の多糖体が使用され、一般に重量で２から３倍過剰の多糖体が使用される。当業者は、多糖体とタンパク質担体の比を変更して、複合体１個当たり異なる数の抗原多糖体成分を得ることができる。複合体１個当たりの多糖体成分の比がより高い場合には、担体タンパク質１個につきより多量の多糖体から出発する。より低い比を得るには、担体タンパク質１個につきより少量の多糖体から出発する。
【００４９】
還元的アミノ化は、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第４３５６１７０号に記載のように好ましいカップリング形式である。したがって、活性化された多糖体と担体を還元性カップリング剤の存在下で接触させることが好ましい。適切なカップリング剤としては、シアノ水素化ホウ素イオンなどの還元剤又はその等価物などが挙げられ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの適切な塩の形で得ることができる。目的とする還元末端を還元せず、担体タンパク質にも多糖体にも悪影響を及ぼさない任意の還元剤をカップリング剤として使用することができる。例えば、ピリジンボランは、この目的に適切な別の選択的還元剤である。他の適切な還元剤も当業者には明白なはずである。
【００５０】
選択的還元性カップリング剤は、多糖体のカルボニル基と担体タンパク質のアミノ基の間で形成されるシッフ塩基中間体の穏和な選択的還元剤として作用すると考えられる。これらのイオンは、複合化された後に多糖体上に残留する任意の活性なアルデヒド基の還元を遅らせる副次的効果を有すると考えられる。
【００５１】
カップリング剤は、通常は、複合産物の一部を形成せず、カップリング反応中に消費される。次いで、複合体を精製して残留カップリング剤及び反応副生物を除去することができる。精製された複合体は、炭水化物をタンパク質に複合化するために以前に使用された、アジピン酸ジヒドラジド、ｐ−ニトロ−フェニル−エチルアミンなどの潜在的毒性連結剤を含まないことが好ましい。
【００５２】
活性化多糖体と担体を接触させる条件は担体の性質によって決まる。例えば、担体が破傷風トキソイドであるときには、活性化多糖体と担体は、約７．４などのほぼ中性のｐＨで３０℃から４０℃などの約２０℃から５０℃、例えば３７℃の温度で接触させることができる。
【００５３】
カップリング反応が終了した後に、多糖体上のあらゆる残留アルデヒド基をキャップすることができる。これによって、活性化ステップ中に生成されたが、多糖体を担体タンパク質に複合化するのに利用されなかった髄膜炎菌多糖鎖上のあらゆる残留アルデヒド基が還元される。適切なキャッピング剤としては、ＮａＢＨ４、残留アルデヒド基をアルコール基に還元することができる当業者に公知の他の還元剤などが挙げられる。
【００５４】
本発明の方法によって生成される脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体は、ワクチン調製物中の抗原として利用することができるが、この調製物はＴ依存性免疫応答をもたらさない。Ｙ髄膜炎菌多糖体と適切な担体タンパク質の複合体は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンとして又はワクチン組成物中でより好ましく使用される。したがって、一部の好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは、脱Ｏ−アセチル化多糖体を含む複合体を含む。実施例のデータに示されたとおり、脱Ｏ−アセチル化多糖複合体は、Ｏ−アセチル化多糖体と交差反応性の抗体を産生する動物において免疫応答を誘発することができる。
【００５５】
通常の製剤操作によれば、多糖体又は複合体は安定化され、ワクチンとして処方される前又は処方後に発熱原性がないことが確認される。一態様においては、本発明は、破傷風毒素又はトキソイド或いはジフテリア毒素又はトキソイドと複合化された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体を含むワクチンを提供する。このワクチンは、ワクチン組成物中に従来含まれる成分を含有することができる。例えば、このワクチンは、適切な担体媒体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントの１種類若しくは複数を含むことができる。
【００５６】
適切な担体としては、生理的リン酸ナトリウム緩衝食塩水（ｐＨ７．４）などが挙げられる。アジュバントを含む担体の例は、ｐＨ６のリン酸ナトリウム緩衝食塩水に懸濁された０．１２５Ｍリン酸アルミニウムゲルである。ワクチンでの使用に適切な他の薬剤として許容される担体は当分野で公知であり、本発明に使用することができる。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、当業者に公知の他のアジュバント、例えば概して免疫原性である核酸、ペプチド化合物などが挙げられる。
【００５７】
本発明のワクチンは任意の適切な方法によって投与することができる。例えば、本発明のワクチンは注射、例えば、筋肉内又は皮下注射によって投与することができる。適切な担体を用いた無針経皮、鼻腔内又は粘膜投与を利用することもできる。
【００５８】
一般に、本発明のワクチンは５から１００μｇ、好ましくは１０から５０μｇの複合材料を含む。正確な投与量は、通常の用量／応答実験によって決定することができる。ワクチンは単一投与量又は２回以上、例えば３回のより少ない投与量で投与することができる。
【００５９】
本発明の複合産物は、１系統を超える髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンに使用することもできる。例えば、本発明の複合産物は、髄膜炎菌Ｙに加えて髄膜炎菌Ａ、Ｃ及びＷ１３５の１種類又は複数に対して免疫化が意図されたワクチンに使用することができる。複合産物は、髄膜炎菌に加えて他の疾患に対して免疫化が意図されたワクチンに使用することもできる。例えば、本発明の複合体をヘモフィルスインフルエンザ複合体と併用して組合せＨｉｂ−髄膜炎菌性ワクチンを製造することができる。
【００６０】
本発明の複合産物をワクチンとして使用すると「担体効果」が得られる。Ｙ髄膜炎菌多糖体は、Ｙ髄膜炎菌多糖体が単独で存在する場合よりも、担体としてより強力な抗原に付着するためにより免疫原性になる。特に、本発明のワクチンは、ヒトを含めた若年哺乳動物において有効なレベルの抗髄膜炎菌Ｙ抗体形成を誘発するために使用することができ、非複合多糖を含むワクチンよりも年齢依存性が極めて低い。
【００６１】
担体タンパク質が、本発明のワクチンのレシピエントがワクチン接種された疾患、例えば、破傷風又はジフテリアの細菌毒素又はトキソイドであるときには、髄膜炎菌Ｙに対する免疫と同時に担体毒素又はトキソイドに対する所望の免疫を得ることができる。
【００６２】
或いは、本発明の複合産物を含有するワクチンのレシピエントが、担体毒素又はトキソイドに関連する疾患に対して以前にワクチン接種を受けた場合には、「追加免疫」効果によって髄膜炎菌Ｙに対する抗体の産生を増大させることができる。
【００６３】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンの製造における、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体及び／又はＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体の使用も提供する。
【００６４】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンの製造における、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物及び／或いはＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物の使用も提供する。
【００６５】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンとしての、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体及び／又はＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体の使用も提供する。
【００６６】
本発明は、Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンとしての、上述された脱Ｏ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物及び／或いはＯ−アセチル化Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風毒素又はトキソイド、ジフテリア毒素又はトキソイドなどの適切な担体とを含む複合産物の使用も提供する。
【００６７】
以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【００６８】
様々な髄膜炎菌性Ｙ系統に由来する多糖体のＯ−アセチル体の評価
未変性多糖体の調製：
髄膜炎菌性Ｙ系統Ｓ１９７５、Ｓ２２５、Ｓ３５３６及びＳ３７９０はＣａｒｌ Ｆｒａｓｃｈ博士（ＣＢＥＲ／ＦＤＡ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の厚意によって提供された。Ｙスラテラス（Ｓｌａｔｅｒｕｓ）系統は、Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ Ｃｏｌｌｉｎｓ博士（ＬＣＤＣ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）によって提供された。これらの系統は、振とうフラスコ中、撹拌下、グルコース及び酵母抽出物を含む培地中で３７℃で増殖された。培養物を８０００ｒｐｍの遠心分離によって収集し、上清を回収し、０．２２μｍフィルターユニットによってろ過滅菌した。
【００６９】
マイクロろ過された培養上清は、Ｂｉｏｍａｘ ３００ｋＤａ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を備えたフィルター装置によって限外ろ過されて濃縮された。濃縮された保持液を１Ｍ ＮａＣｌで１２回、次いで脱イオン（ＤＩ）水で１０回透析ろ過し、凍結乾燥させた。高分子量精製「未変性」多糖体は、ＧＣ−ＭＳによって糖組成が分析され、Ｈ−ＮＭＲ分光法によって５００ＭＨｚでＯ−アセチル含量及び位置が分析された。
【００７０】
表１にＧＣ−ＭＳ及びＨ−ＮＭＲ分析結果を要約する。
【００７１】
【表１】
【００７２】
この表からわかるように、それらのきょう膜多糖体のＯ−アセチル含量並びに存在する場合のこれらのＯ−アセチル基の位置に関連して系統間の不均一性がかなりある。例えば、系統Ｓ３７９０とスラテラスはＯＡｃ含量がほぼ同じであるが、それらのシアル酸残基上のこれらの基（Ｃ−７対Ｃ−９）の百分率はまったく異なる。系統Ｓ３７９０由来の多糖体はそのシアル酸のほぼ１個の位置（Ｃ−７）にのみＯＡｃ基を有するのに対して、スラテラス由来の多糖体はそれらを主にＣ−９上に有する。
【実施例２】
【００７３】
Ｙ群髄膜炎菌多糖体（ＧＹＭＰ）の精製
ｄＯＡ ＧＹＭＰの調製：
３００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いたＵＦによる多糖体の捕捉：
細胞を含まないマイクロろ過発酵透過液約１３Ｌを、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘ ３００ｋＤａ膜（０．５ｍ２）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を備えたフィルター装置を用いて限外ろ過によって約１リットルに濃縮した。濃縮された保持液を１Ｍ ＮａＣｌで１２回、次いでＤＩ水で１０回透析ろ過した。それをさらに約０．２Ｌに濃縮し、回収した。
【００７４】
多糖体の塩基加水分解:
３００ｋＤａ保持溶液（約５ｍｇ ＰＳ／ｍＬ）を最終濃度２Ｎ ＮａＯＨに調節し、８０℃に設定された乾燥器に１６〜１８時間置いた。反応混合物を５０℃未満に冷却した後にＤＩ水１０Ｌ中に希釈した。３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜を通して濃縮した後に、濃縮された保持液を１Ｍ ＮａＣｌで１２回、次いでＤＩ水で１０回透析ろ過した。それをさらに約０．２Ｌに濃縮し、回収した。
【００７５】
ｄＯＡ ＧＹＭＰの酸加水分解：
保持溶液をテフロン反応器に移し、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を最終濃度０．１Ｎまで添加した。反応混合物を６Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ５に調節し、７０℃に設定された水浴中に置いた。多糖体がＳｕｐｅｒｏｓｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱に接続されたサイズ排除クロマトグラフィー）によって測定して２０，０００ダルトンの目標ＭＷに達するまで６５ｒｐｍで振とうした。
【００７６】
断片化されたｄＯＡ多糖体の再Ｎ−アセチル化：
溶液のｐＨを６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて８に調節し、次いで無水酢酸を０．８Ｍ無水酢酸の最終濃度まで室温で滴下した。５Ｎ ＮａＯＨを用いて反応混合物をｐＨ７から９に維持した。反応終了後、反応混合物のｐＨを１３に上昇させ、混合物をさらに１．５時間撹拌した。次いで、６Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて反応ｐＨをｐＨ８に調節した。反応混合物を１Ｍ ＮａＣｌ ４Ｌに注ぎ、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｍａｘ １００ｋＤａ膜（０．５ｍ２）を備えた装置を用いて約１Ｌに濃縮し、透過液を収集した。１００Ｋ最終透過液を、Ｂｉｏｍａｘ ５Ｋ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ膜（０．５ｍ２）を用いてＵＰによって約１リットルに濃縮した。濃縮保持液をＤＩ水で１０回透析ろ過し、次いで約０．２Ｌに濃縮し、収集した。
【００７７】
ＯＡ ＧＹＭＰの調製：
ＯＡ ＧＹＭＰの精製プロセスは、プロセスから省略されたアルカリ分解（２Ｎ ＮａＯＨ）ステップ以外、ｄＯＡ多糖体に対して上述されたものと同様であった。このプロセスから得られたＧＹＭＰは、それらのシアル酸のＣ７位とＣ９位の間に一様に分布する繰返し単位１個につきＯ−アセチル基約０．６Ｍ（又はシアル酸のＮ−アセチル基に対して６０％）を有した。
【００７８】
複合化前のＧＹＭＰの活性化：
低分子量（ＬＭＷ）ＯＡ及びｄＯＡｃ多糖体（１０〜２０ｋＤａ）をメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化して、アルデヒド基をＣ−８においてそれらの多糖体のシアル酸環外側鎖に選択的に導入した（Ｃ−９とＣ−８の間の酸化）。
【００７９】
Ｙ群髄膜炎菌多糖（ＧＹＭＰ）複合体の調製
破傷風トキソイドへの髄膜炎菌Ｙ多糖体の複合化：
過ヨウ素酸塩酸化型ＬＭＷ ＧＹＭＰ多糖体（２５ｍｇ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）（１０ｍｇ）（Ｓｅｒｕｍ Ｓｔａｔｅｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を０．２Ｍホスフェート緩衝剤（ｐＨ７．４）０．５ｍｌに溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５ｍｇ）を添加し、その混合物を３７℃で１日インキュベートした。複合化が終了した後に、溶液のｐＨを１Ｍ酢酸を用いて７から９に維持しながら新たに調製された１ｍＭ ＮａＯＨ中の１００ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４溶液４０〜６０μｌを氷浴中で極めてゆっくり添加することによって残留アルデヒドのキャッピングを実施した。
【００８０】
生成した複合体は、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜及びタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外ろ過によって１Ｍ ＮａＣｌで、次いでダイアフィルトレーション法によって食塩水で精製された。
【００８１】
バルク複合体は、処方される前に２℃〜４℃で貯蔵された。
【実施例３】
【００８２】
マウスにおけるＧＹＭＰ複合体の効力
免疫化：
４〜６週齢のメスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着した結合型ワクチンを皮下注射した。各マウスに複合多糖２μｇを０、２８及び４２日の３回投与した。０、２８、３８及び５２日目にマウスから採血した。
【００８３】
ＥＬＩＳＡによるＧＹＭＰ特異抗体：
ＧＹＭＰ特異的ＩｇＧ力価は、被覆抗原としてヒト血清アルブミンに連結されたＬＭＷ ＧＹＭＰ（ＯＡｃ又はｄＯＡ）を用いてＥＬＩＳＡによって推定された。
【００８４】
１回目及び２回目の注射後にＧＹＭＰ−ＴＴ複合体によって誘発されるｍｅｎＹ ＰＳ特異的ＩｇＧ力価（相乗平均）を図１に示す。これらは被覆抗原としてｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡを用いたＥＬＩＳＡによって測定された。図１からわかるとおり、両方のタイプのＧＹＭＰ複合体（ＯＡ及びｄＯＡ）はほぼ同じレベルのＧＹＭＰ特異的ＩｇＧを産生し、ＰＳ上のＯＡ基が免疫原性にさほど重要ではないことを示唆している。図２及び図３に、それぞれＯＡ及びｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレート上のＯＡ及びｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴ抗血清のＥＬＩＳＡ結合（３８日目）を示す。両方の抗原被覆プレート上で、抗ｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴ抗血清は、対応するＯＡ複合抗血清よりも反応性がわずかに高く、ＰＳ上のＯＡが免疫原性に必ずしも必要でないことを示している。
【００８５】
血清殺菌活性（ＳＢＡ）：
血清の血清殺菌活性は、様々なレベルのＯＡを有する多糖体を発現する表１に記載されたＧＹＭ系統を用いて試験された。図４に、ウサギ補体並びにＯＡ及びｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴ複合体を用いて誘導されたマウス抗血清のＯＡ ｍｅｎＹ系統３７９０を用いて測定されたＳＢＡ力価を示す。図４に示されたとおり、ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体は、（ＯＡきょう膜ＰＳを発現する）ｍｅｎＹ系統３７９０に対して、対応するＯＡ複合体と類似したＳＢＡレベルを誘導し、ＰＳ上のＯＡ基が免疫原性及び効力にさほど重要でないことを示している。
【００８６】
また、ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体によって誘導された抗体は、様々なＯＡ率のきょう膜ＰＳを発現するＧＹＭ系統を死滅させることができる（表２）。
【００８７】
【表２】
【実施例４】
【００８８】
結合型ワクチンによって誘導される抗体の特異性、多糖体上のＯＡ基の役割
結合型ワクチン誘導抗体の結合の特異性：
ＯＡ ＧＹＭＰ ＨＡＳ複合体又はｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ複合体に対するワクチン誘導抗体（ＯＡ ＧＹＭＰ複合体又はｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体を含むワクチン）のＥＬＩＳＡ結合の競合阻害は、主としてＣ９（ＧＹＭスラテラス）又はＣ７（ＧＹＭ Ｓ３７９０）にシアル酸ＯＡを含む、又はＯＡを全く含まない（ＧＹＭ Ｓ１９７５）高分子量（ＨＭＷ）ＧＹＭＰ阻害剤を用いて実施された。
【００８９】
図５に、ｄＯＡ ＧＹＭＰ、主としてＣ７のＯＡ ＧＹＭＰ及び主としてＣ９のＯＡ ＧＹＭＰに対するｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清の特異性を示す。全３種類の多糖体阻害剤は、ＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートへのこれらの抗血清の結合を完全に阻害することができる。ＯＡ ＧＹＭＰ（Ｃ９）は最も有効ではなく、ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体に対して産生された抗体がＯＡ多糖体とｄＯＡ多糖体で実際に識別されないことを示している。
【００９０】
図６に、上記同じ多糖体阻害剤に対するｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清の特異性を示す。ただし、今回は、ｄＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートに対する結合である。ここでもやはり、多糖体阻害剤は結合を完全に阻害することができ、ｄＯＡ多糖体が最良の阻害剤である。
【００９１】
図７に、ＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートを用いたＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清の特異性を示す。３種類の多糖体阻害剤は被覆プレートへの抗体の結合を十分に阻害することができるが、この場合は、Ｃ９のＯＡ ＧＹＭＰが最良の阻害剤であり、続いてｄＯＡ ＧＹＭＰ、次いでＣ７のＯＡ ＧＹＭＰと考えられ、ＯＡ複合体はエピトープ特異性がＣ９のＧＹＭＰ ＯＡに向かってわずかに増加する抗体を産生したことがおそらくは示唆される。しかし、これらの抗体は、ｄＯＡエピトープを極めて明確に認識する。
【００９２】
図８は、ｄＯＡ ＧＹＭＰ ＨＳＡ被覆プレートへの抗ＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清結合の特異性を検討したものである。３種類の多糖体阻害剤は、被覆プレートへのこの抗血清の結合を十分に阻害することができる。ｄＯＡ ＧＹＭＰとＣ７のＯＡ ＧＹＭＰが最良であり効力が等しい阻害剤である。
【００９３】
まとめると、これらのデータによれば、マウスにおいてはＧＹＭＰ複合体のｄＯＡ体はＯＡ ＧＹＭ多糖体とｄＯＡ ＧＹＭ多糖体（それぞれ図５及び図６）の両方を同様に認識する抗体を誘導する。
【００９４】
抗ＧＹＭＰ機能性抗体の特異性、ＯＡの役割：
シアル酸上のＯＡを主としてＣ７又はＣ９に有する可溶性ＧＹＭＰ阻害剤、或いはシアル酸上のＯＡをまったく持たない可溶性ＧＹＭＰ阻害剤を用いたＯＡ ＧＹＭ系統（３７９０）に対する（ウサギ補体を用いた）ＳＢＡの競合阻害によって、ＯＡ又はｄＯＡ ＧＹＭＰ複合体によって誘導される機能性抗体の特異性を検討した。
【００９５】
図９に、マウス抗ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清を用いたかかる阻害の結果を示す。３種類の多糖体阻害剤は系統３７９０の死滅を完全に阻害することができる。ｄＯＡ ＰＳは（５０％において）両方のＯＡ多糖体阻害剤のほぼ５倍有効である。両方のＯＡ多糖体阻害剤は互いに同じように阻害するように見える。これらのデータによれば、ＯＡ多糖体を発現する生きたＧＹＭ生物の表面では、ｄＯＡ ＧＹＭＰに対する抗体が、ｄＯＡシアル酸（多糖体上約１０％）を含む多糖体エピトープを認識し、或いは産生される抗体の親和性が高いことを示している。
【００９６】
図１０に、マウス抗ＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清を用いたＳＢＡの競合阻害の結果を示す。ｄＯＡ ＧＹＭＰ複合抗血清に関しては、ｄＯＡ ＧＹＭＰがＧＹＭ ３７９０生物に対してＳＢＡを阻害する最良の多糖体であり、他の２種類のＯＡ ＧＹＭＰがそれに続く。これらのデータによれば、多糖体上のＯＡ基は機能性抗体によって認識される防御エピトープにさほど重要ではないことが強く示唆される。
【実施例５】
【００９７】
ＧＹＭＰエピトープのサイズの決定
ｄＯＡ ＧＹＭＰからの長さの異なる（１個から９個の繰返し）オリゴ糖阻害剤の生成：
ｄＯＡ ＧＹＭＰを０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ３を用いて８０℃で２時間部分加水分解した。次いで、生成した長さの異なる（１個から９個の繰返し単位）オリゴ糖をサイズ排除クロマトグラフィーによってＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ−３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにかけて分離した。オリゴ糖の溶出を２１４ｎｍにおけるＵＶ検出によって監視した。長さの異なる個々のオリゴ糖を含む画分を混合し、凍結乾燥させた。かくして得られた阻害剤の純度及びサイズをＨ−ＮＭＲ分光法によって６００ＭＨｚで実施した。各ＧＹＭオリゴ糖阻害剤は、その還元末端に還元性ベータシアル酸を有し、もう一方の非還元性末端にα−Ｄ−グルコースを有する。
【００９８】
オリゴ糖阻害剤を用いたＥＬＩＳＡによる競合阻害：
ＧＹＭＰエピトープのサイズは、長さが漸増するＧＹＭオリゴ糖によるＧＹＭＰ特異的ウサギ抗体とＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレートの結合の競合阻害（ＥＬＩＳＡ）によって決定された。
【００９９】
図１１は、ｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレートへのウサギ抗全ＧＹＭ抗体（ＤＩＦＣＯ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）結合のＥＬＩＳＡ阻害である。ｄＯＡ ＧＹＭオリゴ糖は１個から１０個の繰返し単位の範囲にある。この図からわかるように、１個及び２個の繰返し単位は不十分な結合阻害剤であり、３個の繰返し単位オリゴ糖（６個のグリコシル残基）は結合を完全に阻害することができる。これらのデータによれば、６番目の残基の還元性シアル酸はエクアトリアル位のカルボキシラート基とベータコンホメーションの関係にあるので、抗体の結合部位はおそらく５個の糖残基と接触する。オリゴ糖のサイズが増加すると（４から１０ＲＵ）、モル／モル基準での阻害が増大し、長さが漸増する抗体によって認識されるエピトープコンホメーションが安定化することが示唆される。
【０１００】
図１２は、同じ阻害剤によるＯＡ ＧＹＭＰ−ＨＳＡ被覆プレート上の同じ抗体の結合阻害である。阻害パターンは図１１において認められた阻害パターンと類似しており、３ＲＵオリゴ糖構造を超えると結合が増加する。これらのデータはＧＹＭＰ複合体を設計する上で意味がある。というのは、担体タンパク質と複合化されるＧＹＭＰハプテンの最小サイズが１０個の繰返し単位であることをこれらのデータは示唆しているからである。
【実施例６】
【０１０１】
組み合わせられた髄膜炎菌性Ｙ結合型ワクチンの効力
ｄＯＡ ＧＣＭＰ−ＴＴとｄＯＡ ＧＷＭＰ ｒＰｏｒＢ結合型ワクチンと組み合わせられたｄＯＡ ＧＹＭＰ−ＴＴの組合せの効力をＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて試験した。各多糖体複合抗原２μｇを組み合わせて、又は単独で０日及び２８日にマウスに皮下投与した。０、２８及び３８日に採血し、ＯＡ ＧＹＭＰを発現するＧＹＭ系統３７９０に対するＳＢＡについて血清を分析した。
【０１０２】
図１３にかかる実験の結果を示す。組合せ複合抗血清におけるＧＹＭに対するＳＢＡは、単独ＧＹＭＰ複合抗血清において測定されたＳＢＡと大きく異ならず、３種類の複合体間に免疫学的干渉が認められないことが示された。同様に、組合せ複合体でも単独複合体でも、ＧＣＭＰ複合体成分とＧＷＭＰ複合体成分から生じるＳＢＡに免疫学的干渉は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】繰返し単位脱Ｏ−アセチル化Ｙ群（「ｄｅＯＡｃ−Ｙ」）髄膜炎菌多糖体の構造、下図及び未変性Ｏ−アセチル化Ｙ群（「ＯＡｃ−Ｙ」）髄膜炎菌多糖体、上図からのその調製を示す図である。
【図２】メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて１回又は２回の注射後に実施例３に記載されたように測定された、ＯＡｃ−Ｙ（上図）及びｄｅＯＡｃ−Ｙ（下図）髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘発されたＹ髄膜炎菌多糖体特異的ＩｇＧ力価の相乗平均を示すグラフである。
【図３】実施例３において測定された、ＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレート上のＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘導されるマウス抗血清の３８日目におけるＥＬＩＳＡ滴定を示すグラフである。
【図４】実施例３において測定された、ｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレート上のＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘導されるマウス抗血清の３８日目におけるＥＬＩＳＡ滴定を示すグラフである。
【図５】実施例３において測定された、ウサギ補体と、ＯＡｃ−Ｙ（上図）及びｄｅＯＡｃ−Ｙ（下図）髄膜炎菌多糖体−破傷風トキソイド複合体によって誘導されたマウス抗血清のＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌系統３７９０とを用いて測定された血清の殺菌活性力価を示す図である。
【図６】実施例４において測定された、炭素９（＊９／７）又は炭素７（＊７／９）におけるＯ−アセチル化量の多いＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ＯＡｃ−ＧＹＭＰ−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図７】実施例４において測定された、ＯＡｃ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ｄｅＯＡｃ−ＧＹＭＰ−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図８】実施例４において測定された、ＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図９】実施例４において測定された、ＯＡｃ−Ｙ及びｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体に対する、ｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ複合体で被覆されたマイクロタイタープレート上でのＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清の結合阻害を示すグラフである。
【図１０】実施例４において測定され、マウス抗ｄＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清を用いて可溶性Ｙ髄膜炎菌多糖体阻害剤によるＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体系統（３７９０）に対する（ウサギ補体を用いた）ＳＢＡの競合阻害によって測定された、ＯＡｃ−Ｙ又はｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合体によって誘導される機能性抗体の特異性を示すグラフである。
【図１１】実施例４において測定された、マウス抗ＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体複合抗血清を用いたＳＢＡの競合阻害の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例５において測定された、１個から１０個の繰返し単位のｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌オリゴ糖によるｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレートに対するウサギ抗ホールセルＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体抗体の結合のＥＬＩＳＡ阻害を示すグラフである。
【図１３】実施例５において測定された、１個から１０個の繰返し単位のｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌オリゴ糖によるＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体−ＨＳＡ被覆プレートに対するウサギ抗ホールセルＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体抗体の結合のＥＬＩＳＡ阻害を示すグラフである。
【図１４】実施例６において測定された、Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおいてｄｅＯＡｃ−Ｃ髄膜炎菌多糖体及び破傷風トキソイド複合体及びｄｅＯＡｃ−Ｗ髄膜炎菌多糖体及びｒＰｏｒＢ複合体と組み合わせられたｄｅＯＡｃ−Ｙ髄膜炎菌多糖体と破傷風トキソイドの複合体の効力に関する試験結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌感染に対するワクチンとして使用される、Ｏ−脱アセチル化されたＯ−アセチル陽性Ｙ群髄膜炎菌多糖体又はその断片を含み、重合体担体に共有結合されたＹ群髄膜炎菌多糖体を含有する免疫原性複合体であって、脱Ｏ−アセチル化度が８０％を超える免疫原性複合体。
【請求項２】
脱Ｏ−アセチル化度が１００％であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項３】
分子量平均が１０ｋＤａ、５０ｋＤａ及び１５０ｋＤａからなる群から選択される、請求項１に記載の多糖体。
【請求項４】
断片化され、前記断片サイズが５個の繰返し単位（約２．５ｋＤａ）から２００個の繰返し単位（約１００ｋＤａ）を含む、請求項１又は請求項２に記載の多糖体。
【請求項５】
断片化され、前記断片サイズが２０個の繰返し単位（約１０ｋＤａ）から４０個の繰返し単位（約２０ｋＤａ）を含む、請求項１又は請求項２に記載の多糖体。
【請求項６】
担体タンパク質に複合化された脱Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体を含む複合産物（conjugate product）。
【請求項７】
前記担体タンパク質が細菌毒素又はトキソイドである、請求項４に記載の複合産物。
【請求項８】
前記細菌毒素又はトキソイドが、ジフテリア、破傷風、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、百日咳及び大腸菌毒素又はトキソイドからなる群から選択される、請求項５に記載の複合産物。
【請求項９】
前記細菌毒素又はトキソイドが破傷風毒素又はトキソイドである、請求項６に記載の複合産物。
【請求項１０】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体が請求項２に記載されたものである、複合産物。
【請求項１１】
請求項４に記載の複合産物を含むワクチン。
【請求項１２】
前記細菌毒素又はトキソイドが、ジフテリア、破傷風、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、髄膜炎菌性ポリンＢ、百日咳及び大腸菌毒素又はトキソイドからなる群から選択される、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記細菌毒素又はトキソイドが破傷風毒素又はトキソイドである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
アジュバントを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１６】
注射投与用の請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記複合材料が請求項２に記載の多糖体を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１８】
髄膜炎において使用されるＹ群髄膜炎菌用ワクチンの製造における、請求項１に記載の改変多糖体の使用。
【請求項１９】
髄膜炎において使用されるＹ群髄膜炎菌用ワクチンの製造における、請求項４に記載の複合材料の使用。
【請求項２０】
Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンを製造する方法であって、請求項１に記載の改変多糖体を用意するステップを含み、薬剤として許容される担体媒体、希釈剤又はアジュバントの１個若しくは複数とその改変多糖体を混合するステップを場合によっては含んでもよい方法。
【請求項２１】
Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンを製造する方法であって、請求項４に記載の複合材料を用意するステップを含み、薬剤として許容される担体媒体、希釈剤又はアジュバントの１個若しくは複数とその複合材料を混合するステップを場合によっては含んでもよい方法。
【請求項２２】
髄膜炎に対する請求項９に記載のＹ群髄膜炎菌用ワクチンの使用。
【請求項２３】
Ｙ群髄膜炎菌の免疫になるように温血動物に予防接種をする方法であって、請求項９に記載のワクチンを前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を調製する方法であって、髄膜炎菌Ｙ多糖体が少なくとも部分的に脱Ｏ−アセチル化されるように前記髄膜炎菌Ｙ多糖体を塩基加水分解に供するステップを含む方法。
【請求項２５】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を調製する方法であって、髄膜炎菌Ｙ多糖体が断片化されるように前記髄膜炎菌Ｙ多糖体を酸加水分解に供するステップを含む方法。
【請求項２６】
分子量が１０から２０ｋＤａである改変髄膜炎菌Ｙ多糖体断片を調製する方法であって、
（ａ）少なくともある程度精製された髄膜炎菌Ｙ多糖体を用意するステップと、
（ｂ）前記多糖体の塩基加水分解ステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）の生成物の酸加水分解ステップと
を含み、場合によっては
（ｄ）ステップ（ｂ）の生成物を再Ｎ−アセチル化するステップ
を含んでもよい方法。
【請求項２７】
請求項４に記載の複合産物（conjugated product）を製造する方法であって、場合によってはカップリング剤の存在下で、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を担体タンパク質と接触させるステップを含む方法。
【請求項２８】
髄膜炎菌性Ｙ、Ｃ及びＷ１３５疾患を予防するためのＹ群、Ｃ群及びＷ１３５群髄膜炎菌多糖体の各ｄｅ−ＯＡｃ体を含む、組合せ髄膜炎菌性結合型ワクチン。
【請求項１】
髄膜炎菌感染に対するワクチンとして使用される、Ｏ−脱アセチル化されたＯ−アセチル陽性Ｙ群髄膜炎菌多糖体又はその断片を含み、重合体担体に共有結合されたＹ群髄膜炎菌多糖体を含有する免疫原性複合体であって、脱Ｏ−アセチル化度が８０％を超える免疫原性複合体。
【請求項２】
脱Ｏ−アセチル化度が１００％であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性複合体。
【請求項３】
分子量平均が１０ｋＤａ、５０ｋＤａ及び１５０ｋＤａからなる群から選択される、請求項１に記載の多糖体。
【請求項４】
断片化され、前記断片サイズが５個の繰返し単位（約２．５ｋＤａ）から２００個の繰返し単位（約１００ｋＤａ）を含む、請求項１又は請求項２に記載の多糖体。
【請求項５】
断片化され、前記断片サイズが２０個の繰返し単位（約１０ｋＤａ）から４０個の繰返し単位（約２０ｋＤａ）を含む、請求項１又は請求項２に記載の多糖体。
【請求項６】
担体タンパク質に複合化された脱Ｏ−アセチル化髄膜炎菌Ｙ多糖体を含む複合産物（conjugate product）。
【請求項７】
前記担体タンパク質が細菌毒素又はトキソイドである、請求項４に記載の複合産物。
【請求項８】
前記細菌毒素又はトキソイドが、ジフテリア、破傷風、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、百日咳及び大腸菌毒素又はトキソイドからなる群から選択される、請求項５に記載の複合産物。
【請求項９】
前記細菌毒素又はトキソイドが破傷風毒素又はトキソイドである、請求項６に記載の複合産物。
【請求項１０】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体が請求項２に記載されたものである、複合産物。
【請求項１１】
請求項４に記載の複合産物を含むワクチン。
【請求項１２】
前記細菌毒素又はトキソイドが、ジフテリア、破傷風、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、髄膜炎菌性ポリンＢ、百日咳及び大腸菌毒素又はトキソイドからなる群から選択される、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記細菌毒素又はトキソイドが破傷風毒素又はトキソイドである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
アジュバントを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１６】
注射投与用の請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記複合材料が請求項２に記載の多糖体を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１８】
髄膜炎において使用されるＹ群髄膜炎菌用ワクチンの製造における、請求項１に記載の改変多糖体の使用。
【請求項１９】
髄膜炎において使用されるＹ群髄膜炎菌用ワクチンの製造における、請求項４に記載の複合材料の使用。
【請求項２０】
Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンを製造する方法であって、請求項１に記載の改変多糖体を用意するステップを含み、薬剤として許容される担体媒体、希釈剤又はアジュバントの１個若しくは複数とその改変多糖体を混合するステップを場合によっては含んでもよい方法。
【請求項２１】
Ｙ群髄膜炎菌に対する免疫化に使用されるワクチンを製造する方法であって、請求項４に記載の複合材料を用意するステップを含み、薬剤として許容される担体媒体、希釈剤又はアジュバントの１個若しくは複数とその複合材料を混合するステップを場合によっては含んでもよい方法。
【請求項２２】
髄膜炎に対する請求項９に記載のＹ群髄膜炎菌用ワクチンの使用。
【請求項２３】
Ｙ群髄膜炎菌の免疫になるように温血動物に予防接種をする方法であって、請求項９に記載のワクチンを前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を調製する方法であって、髄膜炎菌Ｙ多糖体が少なくとも部分的に脱Ｏ−アセチル化されるように前記髄膜炎菌Ｙ多糖体を塩基加水分解に供するステップを含む方法。
【請求項２５】
改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を調製する方法であって、髄膜炎菌Ｙ多糖体が断片化されるように前記髄膜炎菌Ｙ多糖体を酸加水分解に供するステップを含む方法。
【請求項２６】
分子量が１０から２０ｋＤａである改変髄膜炎菌Ｙ多糖体断片を調製する方法であって、
（ａ）少なくともある程度精製された髄膜炎菌Ｙ多糖体を用意するステップと、
（ｂ）前記多糖体の塩基加水分解ステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）の生成物の酸加水分解ステップと
を含み、場合によっては
（ｄ）ステップ（ｂ）の生成物を再Ｎ−アセチル化するステップ
を含んでもよい方法。
【請求項２７】
請求項４に記載の複合産物（conjugated product）を製造する方法であって、場合によってはカップリング剤の存在下で、改変髄膜炎菌Ｙ多糖体を担体タンパク質と接触させるステップを含む方法。
【請求項２８】
髄膜炎菌性Ｙ、Ｃ及びＷ１３５疾患を予防するためのＹ群、Ｃ群及びＷ１３５群髄膜炎菌多糖体の各ｄｅ−ＯＡｃ体を含む、組合せ髄膜炎菌性結合型ワクチン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５２４６２３（Ｐ２００７−５２４６２３Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７５５８（Ｐ２００６−５１７５５８）
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２００４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００３４７
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０５４７４９２４）バクスター ヘルスケア エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２００４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００３４７
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０５４７４９２４）バクスター ヘルスケア エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
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