ａｒｅＡ，ｐｅｐＣ及び／又はｐｅｐＥ遺伝子及びプロテアーゼ
【課題】新規プロテアーゼフリーの宿主となる糸状菌の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、そしてPepEプロテアーゼ及び/又はＰｅｐＣの活性を維持しているタンパク質をコードする塩基配列、及びこれら遺伝子の不活性化、たとえばアンチセンス技法による、宿主となるアスペルギラス属、特にオリザエである糸状菌の改良法。
【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、そしてPepEプロテアーゼ及び/又はＰｅｐＣの活性を維持しているタンパク質をコードする塩基配列、及びこれら遺伝子の不活性化、たとえばアンチセンス技法による、宿主となるアスペルギラス属、特にオリザエである糸状菌の改良法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼを生産しない菌類(fungi) に関する。本発明の菌類は、通常生産されるプロテアーゼによるタンパク質加水分解を受けやすいタンパク質の生産のための宿主として有用であり、そして従って、本発明は、本発明の菌類を用いることによる注目のタンパク質の高収率での製造方法を包含する。本発明はまた、そのような菌類の生成方法及びそれらの方法に使用されるべきDNA 構造体も包含する。
【背景技術】
【０００２】
菌類(fungi) 、及び特に糸状菌(filamentous fungi) は、著しく高いレベルのタンパク質を分泌するそれらの能力のために、商業的に広く使用されている。
糸状菌の中で、アスペルギラス(Aspergillus) 属に属する種が、内因性タンパク質、及び後にはまた、異種タンパク質製造のための商業的使用の長い歴史を有する。
タンパク質の製造のために使用されるほとんどの微生物に関する１つの欠点は、注目のタンパク質生成物をタンパク質加水分解による分解にゆだねるであろうプロテアーゼの生来の生成である。
【０００３】
これを回避する種々の手段が考えられて来た。他の解決法の中で、種々のプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失し又は破壊することが提案されて来た。不運なことには、菌類は、そのような解決法を多かれ少なかれ、非現実質にする多数のプロテアーゼを生成する。
従って、全く生産しないか、又は非常に低いレベルのプロテアーゼ生成を示す糸状菌株についての必要性が存在する。
【０００４】
長年、Ａ．ニジュランス（A. nidulans)において窒素代謝物抑制を調節する調節遺伝子areAが、細胞外プロテアーゼの生成に影響を及ぼすことは知られている（Arst & Cove, Molec. Gen. Genet. 126, (1973) 111-141)。
【０００５】
Ａ．ニジュランスからのareA遺伝子がクローン化されており（Caddick など., EMBO Journal 5, (1986) 1087-1090)、そして種々の修飾がこの遺伝子によりコードされる活性化因子タンパク質における異なった領域の機能の評価を可能にして来た（Stankovitch など., Mol. Microbiol. 7, (1993) 81-87) 。さらに、Ａ．フミガタス（A. fumigatus) におけるその対応する機能をコードする遺伝子が、最近クローン化されている（Henselなど. 2nd European Conference on Fungal Genetics, April 28 to May 1, Book of Abstracts, E11)。
【０００６】
文献から、ｔ−PAの生産のための宿主として遺伝子型argB areA1のＡ．ニジュランスの株の単一使用もまた知られている（Upshall など., Biotechnology 5, (1987), 1301-1304)。この例においては、argB遺伝子型のみがそのアルギニン原栄養性を通して選択マーカーとして使用され、ところがareA遺伝子型は単純に同時発生現象である。
国際特許公開WO95/35385は、糸状菌におけるプロテアーゼレベルを低めるための手段としてareA遺伝子の欠失を開示する。
細胞外プロテアーゼの他に、菌類はまた、多くの細胞内プロテアーゼ（また、内内性とも呼ばれる）を生成する。
【０００７】
それらの中で、Ａ．ニガーにより生成され、そしてPepCと呼ばれるズブチリシン型のセリンプロテアーゼが記載されており、それを発現する遺伝子がクローン化され、そして欠失変異体がヨーロッパ特許第574,347 号及びFrederick など., Gene, 125, 57-64 (1993)に記載されている。
【０００８】
PepEと称するアスパラギン酸型の追加のそのようなプロテアーゼが、Jarai など., Gene, 145, 171-178 (1994)に開示されている。その文献は、pepE遺伝子のクローニング及び特性決定を開示し、そしてpepE及びpepC遺伝子の調節について述べている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、プロテアーゼフリーの糸状菌のための必要性の軽減を目的として有する。
発明の要約
従って、本発明は、areA，pepC、及び／又はpepE遺伝子が、機能的AreA活性化因子及び機能的PepC及び／又はPepEプロテアーゼを供給する手段で発現され得ないよう、それらの遺伝子が組換えDNA 技法により修飾されている菌類に関する。
さらに、本発明は、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の欠失により得られるそのような菌類の生成方法にも関する。
【００１０】
これは、
ｉ）注目の菌類からのareA, pepC及び／又はpepE遺伝子をクローニングし、
ii）内部部分が置換され、欠失され、又は特別なDNA が挿入されている、前記areA遺伝子、PepC遺伝子及びPepE遺伝子間の１つをそれぞれ含んで成るDNA 構造体を生成し、
iii ）前記構造体により前記菌類を形質転換し、そして
iv）areA− ，pepC− 及び／又はpepE− である形質転換体を単離すること；
を含んで成る方法により得られる。
【００１１】
前記areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の上記クローニングから得られる情報はまた、前記areA, pepC及び／又はpepE遺伝子から転写されるmRNAに対して相補的なRNA 分子の合成を生ぜしめる発現プラスミドを構成するために、及びそれにより興味ある菌類を形質転換するために、良く知れているアンチ−センス技法に関して使用され得る。
さらに、本発明は、上記方法への使用のために意図されたDNA 構造体にも関する。
【００１２】
さらに、本発明は、所望のタンパク質又は遺伝子生成物、特に分泌されたタンパク質の生成方法に関し、それにより、注目の前記タンパク質又は遺伝子生成物をコードするDNA 配列を少なくとも含んで成るDNA 構造体により修飾され、そして任意には形質転換された菌類宿主が適切な条件下で適切な増殖培地において培養され、そして所望する遺伝子生成物が回収され、そして精製される。
【００１３】
本発明を用いる場合、驚くべきことには、本発明の菌類がそのような分泌されたタンパク質を、より改良された収率で生成することが見出された。
また、驚くべきことには、Ａ．オリザエareA− 株の良好な増殖を付与することができる唯一の窒素源がグルタミンであることも見出された。
さらに、本発明は、上記方法により生成されるタンパク質生成物にも関する。
また、本発明は、Ａ．オリザエからのpepC遺伝子（配列番号１）又はその機能的対立遺伝子をコードするDNA 配列にも関する。
【００１４】
本発明はまた、Ａ．オリザエからのPepCプロテアーゼ（配列番号２）、及び前記PepCプロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体により適切な宿主を形質転換し、前記PepCプロテアーゼを生成することができる形質転換体を選択し、前記形質転換体を適切な増殖培地において培養し、そして前記培養物から前記PepCプロテアーゼを回収することを含んで成る、PepCプロテアーゼの生成方法にも関する。
さらに、本発明は、Ａ．オリザエからのpepE遺伝子（配列番号３）又はその機能的対立遺伝子をコードするDNA 配列にも関する。
【００１５】
本発明はまた、Ａ．オリザエからのPepEプロテアーゼ（配列番号４）、及び前記PepEプロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体により適切な宿主を形質転換し、前記PepEプロテアーゼを生成することができる形質転換体を選択し、前記形質転換体を適切な増殖培地において培養し、そして前記培養物から前記PepEプロテアーゼを回収することを含んで成る、PepEプロテアーゼの生成方法にも関する。
【００１６】
それらの観点によれば、前記宿主は好ましくは菌類、本発明によれば、特にＡ．オリザエであり、そして前記DNA 構造体は、前記PepC又はPepEプロテアーゼのいづれかをコードする遺伝子の余分のコピーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
定義
本明細書においては、次の定義が用いられる：
発現areAD とは、areA遺伝子が欠失されている株を意味する。類似する表示が、pepC及び／又はpepE遺伝子が欠失されている株に関して使用される。
発現areA-とは、機能的AreA活性化因子を生成しない株を意味する。用語“機能の損失”とはまた、しばしばこのためにも使用される。類似する表示が、機能的PepC及び／又はPepEプロテアーゼを生成しない株のためにも使用される。
表現“アンチセンス技法”とは、アメリカ特許第 5,190,931号に
開示されるような方法を記載する。
【００１８】
発明の特定の記載
示されるように、本発明は、第１の観点においては、areA遺伝子が、機能的AreA活性化因子を供給する態様で発現され得ないように組換えDNA 技法により修飾されており、そして細胞外プロテアーゼPepC及び／又はPepEをコードする遺伝子が、機能的プロテアーゼを生産するために発現されないような態様で不活性化されている菌類に関する。
この目的は、特に、areA，pepC及び／又はpepE遺伝子の欠失又は破壊により得られる。
areA, pepC及び／又はpepE遺伝子のクローニングは、例に記載されている。
【００１９】
他の菌類からのAreA類似体は、すでに知られている遺伝子の１つとの交差ハイブリダイゼーションにより、又はareA変異体、たとえばＡ．ニジュランスareA−18又は本出願に記載されるＡ．オリザエareA欠失株の相補性によりクローン化され得る。
遺伝子を欠失し、又は破壊するための方法は特に、WO90/00192 (Genencor) に記載されている。
【００２０】
遺伝子におけるDNA を置換するための方法はまた一般的に知られており、そして前記遺伝子の１又は複数の連続した部分を置換することによって達成され得るが、しかしそれはまた、機能的でないAreA活性化因子変異体をコードするDNA 配列を生成する特定部位の突然変異誘発により得られる。
【００２１】
そのような目的が達成されるもう１つの方法は、アンチセンス技法を用いることによってである。
アンチセンス技法及びそれをいかにして使用するかは、前述のアメリカ特許第 5,190,931号（University of New York）に詳細に記載されている。
前記不活性化を得るためのさらなる方法は、areA遺伝子の内部に余分のDNA を挿入することによってであり、それにより、機能不全活性化因子タンパク質の発現を生ぜしめる。
【００２２】
この方法に関しては、クローニングにより提供される情報は、areA遺伝子中に組込まれ得、そしてさらに、それをもう１つの遺伝子、たとえばpyrG遺伝子により置換することができるDNA 構造体を製造するために使用され得る。
areA活性化因子の存在を回避するさらなる方法は、areA遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによってである。
上記の原理は、pepC、及び／又はpepE遺伝子に同等に適用する。
【００２３】
本発明によれば、菌類は好ましくは、アスペルギラス(Aspergillus) 、トリコダーマ(Trichoderma) 、ヒュミコラ（Humicola) 、カンジダ(Candida) 、アクレモニウム (Acremonium) 、フサリウム（Fusarium) 、及びペニシリウム(Penicillium) から成る群から選択された属に属する。
【００２４】
それらの属の中で、Ａ．オリザエ（A. oryzae)、Ａ．ニガー（A. niger) 、Ａ．アワモリ（A. awamori) 、Ａ．ホエニシス（A. phoenicis) 、Ａ．ジャポニカス（A. japonicus) 、Ａ．ホエチダス（A. foetidus)、Ａ．ニジュランス（A. nidulans)、Ｔ．リーセイ（T. reesei)、Ｔ．ハルジアナム（T. harzianum) 、Ｈ．インソレンス（H. insolens)、Ｈ．ラヌギノサ（H. lanuginosa)、Ｆ．グラミネアラム（F. graminearum) 、Ｆ．ソラニ（F. solani)、Ｐ．クリソゲナム（P. chrysogenum) 及び他のものから成る群から選択された種が好ましい。
【００２５】
示されるように、本発明はまた、不活性化がareA, pepC及び／又はpepE遺伝子の欠失により得られている、本発明の第１の観点の菌類を生成するための方法を包含し、ここで前記方法は、
ｉ）注目の菌類からのareA, pepC及び／又はpepE遺伝子をクローニングし、
ii）内部部分が置換され、欠失され、又は余分なDNA が挿入されている、areA遺伝子、pepC遺伝子、及び／又はpepE遺伝子間の１つをそれぞれ含んで成るDNA 構造体を生成し、
iii ）前記構造体により前記菌類を形質転換し、そして
iv）areA- ，pepC- 、及び／又はpepE- である形質転換体を単離することを含んで成る。
【００２６】
PepCプロテアーゼの成熟はPepEプロテアーゼにより制御されると思われるので、本発明はまた、不活性化がareA及びPepE遺伝子の欠失により得られている本発明の菌類を生成するための方法を包含し、ここで前記方法は、
ｉ）興味ある菌類からのareA及びpepE遺伝子をクローニングし、
ii）内部部分が置換され、欠失され、又は特別なDNA が挿入されている、areA及びpepE遺伝子間の１つをそれぞれ含んで成るDNA 構造体を生成し、
iii ）前記構造体により前記菌類を形質転換し、そして
iv）areA- 及びpepE- である形質転換体を単離することを含んで成る。
【００２７】
不活性化がアンチセンス技法を用いることによって得られている菌類を生成するための方法がまた包含される。そのような方法は、
ｉ）areA遺伝子、pepC遺伝子及び／又はpepE遺伝子から転写されるmRNAに対して相補的なRNA 分子の合成を生ぜしめる個々の発現プラスミドの構成、
ii）前記発現プラスミド、及び別のプラスミド又は前記同じプラスミドのいづれか上の適切なマーカーによる宿主菌類の形質転換、
iii ）前記マーカーを用いての形質転換体の選択、及び
iv）AreA，PepC及び／又はPepE生成物の合成の低下を示す株についての選択された形質転換体のスクリーニングを包含する。
【００２８】
本発明のさらなる観点は、上記方法への使用のためのDNA 構造体の包含を意味する。
前者の方法に関して、前記DNA 構造体は、内部部分が置換され、欠失され、又は余分なDNA が挿入されている、areA, pepC、及び／又はpepE遺伝子を含んで成ることができる。
さらに、DNA 構造体の少なくとも１つはまた、注目のタンパク質生成物をコードするDNA 配列、たとえば後で言及されるものを含んで成ることができる。
【００２９】
後者のアンチセンス方法に関しては、DNA 構造体は、機能的プロモーターに連結される、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の逆方向DNA 配列を含んで成り、それにより、mRNAは前記areA，pepC及び／又はpepE遺伝子から生成されるmRNAに対して少なくとも部分的に相補的である。
【００３０】
本発明のさらなる観点は、所望の遺伝子生成物、好ましくは分泌される遺伝子生成物の製造方法に関し、それにより、本発明の菌類が、適切な条件下で適切な増殖培地において培養され、そして所望の遺伝子生成物が回収され、そして精製される。
異種遺伝子により発現される遺伝子生成物の場合、所望の遺伝子生成物をコードするDNA 配列が、前記菌類を生成するために使用されるDNA 構造体の一部であり得る。
【００３１】
しかしながら、通常、本発明の菌類の別の形質転換が、所望の生成物を生成することができる菌類を製造するために行なわれる。
菌類を形質転換するための方法は、当業界において、たとえばヨーロッパ特許第0 184 438 A2号（Gist-Brocades N. V.)及びヨーロッパ特許公開第098993号（Novo Nordisk A/S) において良く知られている。
【００３２】
固有の生成物に関しては、これはもちろん必要ではないが、しかし生成を高めるために、宿主中に組込まれるべき注目のタンパク質をコードする遺伝子の複数コピーを供給することは好都合である。
所望の遺伝子生成物は一般的に、ペプチド又はタンパク質、好ましくは酵素である。
酵素の中では、それは好ましくは、プロテアーゼ、たとえばトリプシン及びキモシン；リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、等から成る群から選択される。
【００３３】
もう１つの型の所望の遺伝子生成物は一般的に、治療的活性ペプチド又はタンパク質である。
その治療的活性ペプチド又はタンパク質の中では、タンパク質は好ましくは、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、第VII 因子、第VIII因子、ウロキナーゼ、ｔ−PA、CSF 、ラクトフェリン、TPO 、等から成る群から選択される。
【００３４】
本発明のさらなる観点は、Ａ．オリザエからのpepC遺伝子（配列番号１）、Ａ．オリザエからのpepE遺伝子（配列番号３）又はその機能的対立遺伝子をコードするDNA 配列に関する。また、対応するPepC及びPepEプロテアーゼ、及び好ましくは組換え手段によるそれらの製造が本発明により包含される。
【００３５】
この観点においては、本発明は、注目のプロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体により適切な宿主を形質転換し、プロテアーゼを生成することができる形質転換体を選択し、前記形質転換体を適切な増殖培地において培養し、そして前記培養物からPepC又はPepEプロテアーゼを回収することを含んで成る、Ａ．オリザエからのPepCプロテアーゼ又はPepEプロテアーゼの製造方法に関する。
【００３６】
そのような工程に使用される宿主は好ましくは、本発明の上記観点の宿主である。
PepC又はPepEプロテアーゼを生成するための方法のある観点においては、宿主は、Ａ．オリザエである。この場合、プロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体が宿主にすでに存在する遺伝子の余分なコピーを供給することが好ましい。
プロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体はまた、通常、宿主におけるプロテアーゼの適切な発現及びプロセッシングを提供するために調節要素を含むであろう。
【実施例】
【００３７】
本発明は、下記例においてより詳細に説明される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を制限するものではない。
例
材料及び方法
株
Ａ．オリザエ、IFO4177 : Institute for Fermentation, Osaka, 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-Ku, Osaka, Japanから入手できる。
ToC913：この株の構成は、例に記載されている。
【００３８】
遺伝子
areA：この遺伝子は、窒素異化を制御する調節タンパク質をコードする。
pepC：この遺伝子は、ズブチリシン型のセリンプロテアーゼをコードする。
pepE：この遺伝子は、アスパラギン酸プロテアーゼをコードする。
pyrG：この遺伝子は、オロチジン−Ｓ’−リン酸デカルボキシラーゼ、すなわちウリジンの生合成に関与する酵素をコードする。
bar ：この遺伝子は元来、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus) から単離され、そしてホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする。この酵素はホスフィノトリシン（＝グルホシネート）を変性し、そしてそれにより、細菌、菌類及び植物に対して毒性であるこの化合物を不活性化する。
【００３９】
プラスミド
pUC118：Viera and Mesing J. Meth. Enzymol. 1987, 153, 3-11
pSO2 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
pJers4：pUC118におけるpSO2の 2.0kbサブクローン。pJers4は機能的Ａ．オリザエpyrG遺伝子を含む。
pSO5 ：pSO2からのこのプラスミドの構成は例に記載される。
pToC56：このプラスミドの構成は、ヨーロッパ特許公開第098,993 号に記載される。
pToC68：このプラスミドの構成は、WO91/17243に記載される。
【００４０】
pToC90：WO91/17243に記載のようにして調製された、pUC19 ベクター〔Yannisch-Perron など., GENE 1985, 33, 103-119 〕上に 2.7kbの XbaＩフラグメント〔Corrick など., GENE 1987, 53, 63-71 〕としてアスペルギラス ニジュランスからのamdS遺伝子を有する、p3SR2 のサブクローン。
pToC266 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
pToC299 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
pToC338 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
【００４１】
pMT1606 ：pBP1T (B. Straubinger など., Fungal Genetics Newsletter 39 (1992) : 82-83)及びヨーロッパ特許公開第098993号）からのこのプラスミドの構成は、例に記載される。
p775 ：このプラスミドの構成は、ヨーロッパ特許公開第098993号に記載される。
p777 ：このプラスミドの構成は、ヨーロッパ特許公開第098993号に記載される。
pHW470：このプラスミドの構成は、例に記載される。
【００４２】
例１．Ａ．オリザエpepE遺伝子のクローニング及び欠失
Ａ．オリザエpepE遺伝子を、Ａ．ニガー遺伝子との交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した。部分的なＡ．ニガー遺伝子を、G. Jaraiなど、Gene145 (1994) 171-178により公開されたpepE配列に従って製造されたpepE特異的プライマー及びＡ．ニガー染色体DNA とのPCR 反応から 700bpのPCR フラグメントとして得た。このフラグメントは、DNA 配列決定によりpepE配列を含むことが示された。それは、緊縮条件下でＡ．オリザエ染色体DNA にハイブリダイズし、そしてサザン分析は、Ａ．オリザエが単一のpepE株遺伝子を含むことを示した。
【００４３】
pepE遺伝子を、遺伝子置換法及び２段階遺伝子置換法（G. May, “Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi ”（1992）pp. 1-25, Eds. J. R. Kinghorn and G. Turner ; Blackie Academic and Professional)の両者により欠失せしめた。マーカーとして、Ａ．オリザエpyrG遺伝子が使用されるので、Ａ．オリザエ株は、そのpyrG遺伝子の欠失により製造されたpyrG- 株であった。
【００４４】
Ａ．オリザエpepE遺伝子のクローニング
アスペルギラス・オリザエのコスミド ライブラリーを、“SuperCos１コスミドベクターキット”の供給者（Stratagene) からの説明書に従って、実質的に構成した。
Ａ．オリザエIFO4177 のゲノムDNA を、標準的方法（Christensen, T.,など., Biotechnology 6 (1988) 1419-1422)により製造されたプロトプラストから調製した。プロトプラスドの単離の後、それらをLabofuge T (Heto) において５分間、2500rpm での遠心分離によりペレット化し、そのペレットを、Supercos１コスミドベクターキットからのマニュアルに言及しているようにして、10mMのNaCl, 20mMのトリス−HCl (pH8.0) 、１mMのEDTA， 100μｇ／mlのプロティナーゼＫ及び 0.5％のSDS 溶液に懸濁し、そして前記DNA 調製物の残りを前記キットの説明書に従って行なった。
【００４５】
ゲノムDNA のサイズを、BioradからのCHEF−ゲル装置を用いての電気泳動により分析した。１％アガロースゲルを、10〜50秒のパルスを伴って、 200ボルトで20時間、実施した。ゲルを臭化エチジウムにより染色し、そして写真を取った。DNA は50〜100kb のサイズであった。そのDNA を、Sau3A により部分的に制限した。その制限されたDNA のサイズは、上記と同じタイプのCHEF−ゲル分析により20〜50kbであることが決定された。CsClグラジエント バンド化されたSuperCos１ベクターを前記マニュアルに従って調製した。
【００４６】
連結及びパッケージングを上記のようにして行なった。ライブラリーの滴定の後、１つの連結及びパッケージングからのすべてのパッケージング混合物を宿主細胞XL１−Blue MR 中にトランスフェクトし、そして50μｇ／mlのアンピシリンLBプレート上にプレートした。約3800のコロニーを得た。10のコロニーからのコスミド調製物は、それらすべてが予測されるサイズの挿入体を有したことを示した。コロニーを個々に、取り、そして10μｌのLB(100μｇ／mlのアンピシリン）を有するマイクロタイタープレートウェルに接種し、そして37℃で一晩インキュベートした。50％グリセロール 100μｌを個々のウェルに添加し、そして完全なライブラリーを−80℃で凍結した。全3822のコロニーを貯蔵した。これは、約 4.4倍のＡ．オリザエゲノムを示す。
【００４７】
ライブラリーにおける個々に凍結されたコロニーを、マイクロタイタープレートの半分に適合する６×８のピンを有する複数ピン装置を用いることにより、LB−プレート(100μｇ／mlのアンピシリン）上に接種した。ライブラリーにおけるすべてのクローンからのコロニーを含むプレートを製造した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。ペトリ皿のサイズに切断された無菌Whatman 540 フィルターを、37℃でさらに２時間インキュベートされたコロニー上に配置した。フィルターを、 200μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むLBプレートに移し、そしてプレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日、フィルターを、 0.5ＭのNaOHにより５分間２度、次に 0.5Ｍのトリス−HCl(pH＝7.4)により５分間２度、及び次に、２×SSC により５分間２度洗浄した。フィルターをエタノールにより湿潤し、そして空気乾燥せしめた。
【００４８】
フィルターを、Ａ．ニガーからのpepE遺伝子の一部を含む、 0.7kbの３２Ｐ−ラベルされたPCR フラグメントによりハイブリダイズした。PCR フラグメントは、DNA 配列において異なる２種の 700bpプライマーと共にＡ．ニガーからの染色体DNA 上でのPCR を実施することによって得られた。ハイブリダイゼーションを、10×Denhart ，５×SSC ，0.02ＭのEDTA，１％のSDS ，0.15mg／mlのポリＡ及び0.05mg／mlの酵母tRNAにおいて65℃で16時間、行なった。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２×SSC, 0.1％ SDSにより45℃で２度洗浄し、そしてＸ線フィルム上に置いた。
【００４９】
５つのコロニーがプローブとハイブリダイズし、それらのうち４個は、同じプローブを用いての単離されたコスミドのDNA のサザン分析によりＡ．オリザエpepE遺伝子を含むことが示された。３個のコスミドは同一であり、従って、pepEを含む２種の異なったコスミドクローンが単離され、それらは貯蔵されるライブラリーにおけるそれらの位置に関して、7C7 及び33C1と呼ばれた。２種のオーバーラッピングフラグメント、すなわち 4.3kbのEcoRＩフラグメント(pToC299) 及び 2.4kbのHindIII (pToC301) フラグメントをサブクローン化し、そして部分的に配列決定した。配列番号１は、プロテアーゼのためのDNA 配列及び推定されるaa配列を示す。その遺伝子は、Ａ．ニガー遺伝子に対する強い相同性を示す。
【００５０】
Ａ．オリザエpyrG遺伝子のクローニング
Ａ．オリザエpyrG遺伝子を、Ａ．ニガーpyrG遺伝子との交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した（W. van Hartingsveldtなど., Mol. Gen. Genet 206 : 71-75 (1987））。部分的 SauIII Ａ消化されたＡ．オリザエIFO4177 DNA のλライブラリーを、Ａ．ニガーpyrG遺伝子からの１kbのDNA フラグメントにより低い緊縮性でプローブした。陽性クローンからの 3.8kbのHindIII フラグメントを、pUC118ベクター中にサブクローン化した。得られるプラスミドpSO2は、Ａ．ニガーpyrG変異体の相補性によりpyrG遺伝子を含むことが示された。
【００５１】
Ａ．オリザエpyrG- 株の構成
個々の末端上に約１kbのpyrGフランキング配列を含むpyrG欠失プラスミドpSO5を、プラスミドpSO2から構成した。Ａ．オリザエIFO4177 を、この構造体により形質転換し、そして形質転換体を、５−フルオロ−オロト酸(FOA) に対する耐性、すなわちpyrG変異体に特徴的な表現型により選択した。１つの形質転換体How B101は、pyrG遺伝子座で予測される欠失を有することがサザン分析により示された。pyrG変異体How B101の増殖のためには、ウリジンを必要とする。How B101は、ウリジンなしに増殖する能力についての選択によりwt pyrG 遺伝子により形質転換され得る。
How B101の構成に関与する段階は、図１に例示される。
【００５２】
遺伝子置換法によるＡ．オリザエにおけるpepE遺伝子の欠失
pepE遺伝子をpyrG遺伝子により置換することを企画されたプラスミドpToC345 を構成した。
２種のPCR 反応を、鋳型としてpToC299 を用いて行なった。
第１のプライマー組は次の通りであった：
19819 GAAGATCTGCGCGGATGTACATTGTAG
19821 TTAGTCAGAAATTCGTCCCG
第２のプライマー組は次の通りであった：
19820 CCCAAGCTTCATGCTCGACCAGGGCCTCCT
19818 GGTCTGTGTTAACCAAAGAAC
【００５３】
19819/19821 により得られた約 800bpのフラグメントを、 BalII／HindIII により切断し、そして19820/19818 により得られ、そしてHindIII ／ pstＩにより切断された 1.1kbのフラグメントと一緒に、 BglII／ PstＩ切断されたpIC19R (J. L. Marsh など, Gene 32 (1984) 481-484) 中にクローン化した。得られるプラスミドを、ユニークHindIII 部位で切断し、脱リン酸化し、そしてpJaL335(例２に記載される）からの 3.5kbのpyrG含有フラグメントを挿入した。pToC345 の構成は図２に示される。
【００５４】
How B101を、標準の方法を用いて、EcoRＩ切断されたpToC345 により形質転換し、そして形質転換体を、ウリジンの添加を伴わないで増殖するそれらの能力により選択した。100 の形質転換体を、分生子を通して１度再単離した。胞子を、その再単離プレート上の単一コロニーから取り、そして0.01％のTriton X-100を含む水溶液 100mlに懸濁した。個々の形質転換体及びIFO4177(対照株として含まれる）からの胞子懸濁液１mlを、個々のそれらのYPD プレート上の上部に配置されるWhatmann 540フィルター上にスポットを付けた。
【００５５】
プレートを30℃で18時間インキュベートした。フィルターをプレートから除去し、そして室温で２時間、20％ SDSに置いた。次に、それらを 600Ｗのマイクロ波オーブンにおいて３分間ベークした。次に、フィルターを、10％ SDSにより５分間、 0.5Ｍの NaOH, 1.5ＭのNaClにより５分間２度、 0.5Ｍのトリス−HCl (pH7.5) 、 1.5ＭのNaClにより５分間１度、及び20×SSC により５分間１度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。２組のフィルターを、個々のそれらの３２Ｐ−ラベルされたプローブを用いて、標準の方法によりハイブリダイズせしめた。
【００５６】
１組を、欠失されることが試みられたpepE遺伝子の一部を含むpToC299 からの 600bpの BbuＩ／HindIII フラグメントによりハイブリダイズせしめた。他の組のフィルターを、Ａ．オリザエtpi 遺伝子からのDNA フラグメントによりハイブリダイズせしめた。pepEを除く、１つのコピーに存在するいづれかの遺伝子が、これはフィルターに結合されるDNA の量の対照であるので、使用され得る。
【００５７】
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、 0.1×SSC, 0.1％ SDSにより65℃で洗浄し、そしてフィルターに結合される放射能をPhospo Imager により可視化した。13の形質転換体をさらなる分析のために採取した。なぜならば、それらは対照のプローブに対するハイブリダイゼーションに比較して、pepEプローブに対するハイブリダイゼーションをほとんど示さなかったからであった。染色体DNA を標準の方法により調製し、そしてEcoRＩ制限されたDNA のサザンブロットを、欠失される予定でないpepE遺伝子の３’側部分を含むpToC299 からの32Ｐ−ラベルされた 1.1kbの BbuＩフラグメントによりハイブリダイズせしめた。
【００５８】
wt株においては、 4.3kbのフラグメントが、プローブにハイブリダイズすべきであり、正しい置換の株においては、 4.3kbのフラグメントは 7.2kbのフラグメントにより置換されるべきである。２種の形質転換体が正しく見え、すなわち１つはまったくハイブリダイズするバンドを有さず、そしてほとんどのwtバンド+ は１つの他のバンドを有し、このことは、非相同遺伝子座での形質転換DNA の組込みを示す。
【００５９】
pepE欠失された株のpyrG- 誘導体を単離するために、107 個の分生子を、FOA 含有プレート上に広げ、そして耐性コロニーを選択した。FOA 耐性コロニーを再単離し、DNA を調製し、そしてサザン分析を行ない、pyrG遺伝子がpToC345 における遺伝子を端に有する反復配列間での組合せを通して失なわれている株を同定した。
【００６０】
二段階遺伝子置換法によるＡ．オリザエにおけるpepE遺伝子の欠失
pepE遺伝子の２段階遺伝子欠失のために企画されたプラスミドpToC315 を構成した。pepE遺伝子から上流の配列を含むpToC299 からの 1.6kbのEcoRＩ／HindIII （HindIII 部位はDNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントによる処理によりブラント末端化されている）を、pepE遺伝子の３’末端を含む 1.4kbの SalＩ／ BbuＩフラグメントはブラント末端化されている）と共に、EcoRＩ／ SalＩ切断されたベクターpUC19 中にクローン化した。得られるプラスミドを、pUC19 リンカーにおけるユニークHindIII 部位で切断し、脱リン酸化し、そしてpJers4からの 1.8kbのpyrG含有フラグメントを挿入した。pToC315 の構成は図３に示される。
【００６１】
How B101を、標準の方法を用いてpToC315 により形質転換し、そして形質転換体を、クリジンの添加なしに増殖するそれらの能力により選択した。再単離の後、染色体DNA を12の形質転換体から調製し、DNA をAsp718により切断し、そして放射性ラベルされたプローブとしてpepE遺伝子の一部を含むpToC301 からの BbuＩフラグメントによるサザン分析により分析した。１つの形質転換体は、pToC315 がpepE遺伝子座での相同組換えにより単一のコピーとして組込まれている場合、予測されるように２つの新規のバンドにより置換されている、pepE特異的Asp718フラグメントの消出により示されるような内因性pepE遺伝子に組込まれるプラスミドを有した。
【００６２】
形質転換体は、ToC1089 として命名された。ToC1089 の５×107 個の分生子を、５−フルオロ−オロト酸を含むプレート上に広げ、pyrG遺伝子の損失について選択した。これは、二段階遺伝子欠失における第２段階であり、pyrG遺伝子は２対の同一配列のいづれかとの組合せにより失なわれ得、この１つは同様にpepE遺伝子の欠失をもたらすであろう。前記方法は図４に示される。５−フルオロ−オロト酸耐性の頻度は、約10-5であった。５−フルオロ−オロト酸耐性コロニーを再単離し、そしてpepE遺伝子について欠失された株をサザン分析により同定した。
【００６３】
例２．アスペルギラス・オリザエ セリンプロテアーゼpepCのクローニング及び破壊
Ａ．オリザエpepC遺伝子を、Ａ．ニガー遺伝子との交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した。Ａ．ニガー遺伝子は、Ａ．ニガー染色体DNA 、及びFrederick G. Dなど. Gene 125 (1993) 57-64 により公開されたpepC配列に従って製造されたpepC特異的プライマーとのPCR 反応から 1.1kbのPCR フラグメントとして得られた。そのフラグメントは、DNA 配列決定によりpepC配列を含むことが示された。それを、緊縮条件下でＡ．オリザエ染色体DNA にハイブリダイズせしめ、そしてサザン分析は、Ａ．オリザエが単一のpepC様遺伝子を含むことを示した。
【００６４】
pepC遺伝子を、二段階遺伝子置換法（G. May, “Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi ”(1992) pp. 1-25, Eds. J. R. Kinghorn and G. Turner ; Blackie Academic and Professional) により欠失せしめた。マーカーとして、Ａ．オリザエpyrG遺伝子を使用し、Ａ．オリザエ株はそのpyrG遺伝子の欠失により製造されるpyrG株であった。
【００６５】
Ａ．ニガーセリンプロテアーゼpepCのクローニング
Ａ．ニガーpepCをコードする公開されたcDNAヌクレオチド配列（Frederick G. D. など. Gene 125 (1993) 57-64)から、pepC遺伝子のコード部分がPCR 反応において増幅されるよう、２種のオリゴヌクレオチドを企画した。ヌクレオチド配列の３’−末端がpepC遺伝子のＮ−末端部分に対応し（下線）、そしてその５’−末端がクローニングを促進するためである（BamHＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）ようなプライマー＃5258（5'-CTAGGATCCAAGGCATTTATGAAGGGCATCCTCGGCCTTTCC)を製造した。ヌクレオチド配列の３’末端がpepC遺伝子のＣ−末端部分に対応し、そして５’−末端がクローニングを促進するためである(XhoＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）ようなプライマー＃5259（5'-CTACTCGAGTCAAAAAAAAACCAAGTCTTCCGATCTACG) を製造した。
【００６６】
Ａ．ニガーからのゲノムDNA を、PCR 反応における鋳型として使用した。増幅反応を、 2.5単位の Taq−ポリメラーゼ、 100ngのＡ．ニガーゲノムDNA ，50mMのKCl, 10mM のトリス−HCl, pH8.0, 1.5mM のMgCl2, 250nMの個々のdNTP、及び 100pMの上記２種のプライマーの個々を含む溶液 100μｌ体積において行なった。
【００６７】
増幅を、Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480 において実施し、そして94℃で３分間の１回のサイクル、94℃で１分間、55℃で30秒間、及び72℃で１分間の続く25回のサイクルから成った。PCR 反応は、長さ約 1.1kbの１つのDNA フラグメントを生成する。このフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、精製し、ベクターpCR II（Invitrogen Corporation）中にクローン化し、そして分子生物学の分野において知られている標準方法を用いて配列決定した。得られるプラスミドをpJaL197 と命名した。
【００６８】
Ａ．オリザエセリンプロテアーゼpepCのクローニング
Ａ．オリザエIFO4177 からのゲノムDNA のサザンブロットを、Ａ．ニガーpepC遺伝子を含むpJaL197 クローンからの11kbの３２Ｐ−ラベルされたEcoRＩ DNAフラグメントによりハイブリダイズによりハイブリダイズせしめた。ゲノムDNA を次の制限酵素により切断した：EcoRＩ，BamHＩ， XhoＩ及びHindIII 。ハイブリダイゼーションを、10×Denhart ，５×SSC ，0.02ＭのEDTA，１％のSDS ，0.15mg／mlのポリＡ及び0.05mg／mlの酵母tRNAにおいて65℃で16時間、実施した。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２×SSC, 0.1％のSDS により65℃で２度洗浄し、そしてＸ線フィルム上に置いた。プローブは前記４種の消化物の個々における単一サイズのフラグメントに対してハイブリダイズし、この事は、pepC遺伝子がＡ．オリザエIFO4177 において単一コピーで存在することを示す。
【００６９】
4.5〜5.5kb のサイズのBamHＩフラグメントを含む、Ａ．オリザエゲノムDNA の部分的ライブラリーを構成し、そしてベクターpIC19H中に連結した。上記Ａ．ニガーpepC遺伝子クローンを放射性ラベルし、そして部分的Ａ．オリザエBamHＩゲノムライブラリーをプローブするために使用した。ハイブリダイゼーションを、上記のようにして実施した。約4000のＥ．コリコロニーをスクリーンし、そして４種の陽性コロニーを得た。
【００７０】
前記４種のクローンは、制限酵素消化により同じであることが示された。 4.6kbの挿入体を有する、pJaL235(図５）と称するそれらのクローンの１つを、制限マッピング及びサザンブロットによりさらに分析した。これは、pepC遺伝子が、 2.9kbのBamHＩ／ SalＩフラグメントに位置することを示す。 2.9kbのBamHＩ／ SalＩフラグメントの配列決定は、イントロンスプライシングを示すコンセンサス配列と共に２個のイントロンにより中断される 495個のアミノ酸の長い読取り枠の存在を示す。Ａ．オリザエpepC遺伝子の配列は、配列番号３に示される。
【００７１】
反復された配列を端に有するＡ．オリザエpyrG遺伝子の構成
ヌクレオチド配列の３’末端がpSO2における位置７−26に対応し（下線）、そして５’−末端がクローニングを促進せしめるためである(BglII制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）プライマー＃7659（5'-GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC)、及びヌクレオチド配列番号の３’末端がpSO2における位置 385−407 に対応し（下線）、そして５’−末端がクローニングを促進せしめるためである（EcoRＩ及びHindIII 制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）プライマー＃7656（5'-GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC) によるPCR によって、 432bpのフラグメントを増幅した。そのフラグメントを BglII及びEcoRＩにより消化し、そしてゲル電気泳動により単離し、精製し、そしてpSO2におけるその対応する部位中にクローン化し、プラスミドpJaL335 をもたらした（その構成は図６に概略されている）。
【００７２】
Ａ．オリザエpepC破壊プラスミドの構成
プラスミドpJaL235 を PvuＩにより消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブラント化し、そして次に、HindIII により消化した。 2.6kbのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。 2.6kbのフラグメントを、 SmaＩ及びHindIII により消化されたpUC12 中にクローン化し、プラスミドpJaL308 を得た。
プラスミドpJaL308 を SamＩにより消化し、そして製造業者の説明書に従って、５’リン酸基を除去するために細菌性アルカリホスファターゼにより処理し、そしてフェノール抽出し、そして沈殿せしめた。
【００７３】
プラスミドpSO2をHindIII により消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブライン化した。Ａ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.8kbのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。
２つのフラグメントを一緒に混合し、そして連結した。Ｅ．コリの形質転換の後、正しいプラスミドを担持するコロニーを、ミニプラスミド調製物の制限酵素消化により同定した。pJaL363 の構成は図７に示される。
プラスミドpJaL363 は、EcoRＩ部位及びHindIII を端に有するpepC遺伝子を担持し、そして前記pepCがＡ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.8kbのDNA フラグメントにより中断されているフラグメントを含むpUC12 ベクターから成る。
【００７４】
プラスミドpJaL335 をHindIII により消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブラント化した。Ａ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.5kbのフラグメントをゲル電気泳動により単離し、そして精製する。そのフラグメントを、pJaL308 の SmaＩ制限部位中にクローン化する。pJaLz の構成は図８に概略されている。そのプラスミドは、EcoRＩ部位及びHindIII を端に有するpepC遺伝子を担持し、そして前記pepCがＡ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.5kbのDNA フラグメントにより中断されているフラグメントを含むpUC12 ベクターから成る。
【００７５】
Ａ．オリザエ株How B101の形質転換
破壊プラスミドのいづれか１つ（15μｇ）を、HindIII 及びEcoRＩにより完全に消化する。消化の完結を、ゲル上でアリコートを処理することによって調べ、そしてDNA の残りをフェノール抽出し、沈殿せしめ、そして滅菌水10μｌに再懸濁する。
【００７６】
Ａ．オリザエHow B101宿主株の形質転換を、プロトプラスト方法（Christensen など. Biotechnology (1988) 6 : 1419-1422) により行なう。典型的には、Ａ．オリザエ菌糸体を栄養に富んだブイヨンにおいて増殖する。菌糸体を濾過によりブイヨンから分離する。酵素調製物NovozymeＲ（Novo Nordisk) を、浸透圧的に安定した緩衝液、たとえばリン酸ナトリウムによりpH5.0 に緩衝された 1.2ＭのMgSO４ における菌糸体に添加する。その懸濁液を、撹拌しながら、37℃で60分間インキュベートした。プロトプラストを、mira−布を通して濾過し、菌糸体残骸を除去する。プロトプラストを収穫し、そしてSTC (1.2Ｍのソルビトール、10mMのCaCl２, 10mM のトリス−HCl, pH7.5) により２度洗浄する。最終的に、プロトプラストを200〜1000μｌのSTC に再懸濁する。
【００７７】
形質転換のために、DNA ５μｇを、プロトプラスト懸濁液 100μｌに添加し、そして次に、PEG 溶液（60％ PEG 4000, 10mM のCaCl2, 10mM のトリス−HCl, pH7.5) 200μｌを添加し、そしてその混合物を室温で20分間インキュベートする。プロトプラストを収穫し、そして 1.2Ｍのソルビトールにより２度洗浄する。最後に、プロトプラストを 1.2Ｍのソルビトール 200mlに再懸濁し、選択プレート（最少培地＋10ｇ／ｌの Bacto−寒天（Difco)）上にプレートし、そして37℃でインキュベートする。37℃での増殖の３〜４日後、安定した形質転換体は、激しく増殖し、そして胞子形成するコロニーとして出現する。
【００７８】
pepC欠失株の同定
安定したコロニーから、個々の胞子を、新鮮な最少プレート上に画線培養する。単一のコロニーを選択し、そして再画線培養し、純粋な培養物を得る。それらを用いて、10mlの液体YPM 培地（１％の酵母抽出物、１％のペプトン、２％マルトース）を接種する。180rpmで振盪しながら30℃で18時間の後、菌糸体をフィルター紙上に収穫する。次に、菌糸体を２mlのEppendorf 管に移し、そして凍結乾燥せしめる。凍結乾燥の後、DNA を個々の菌糸体から、その菌糸体を管において乳棒により細かな粉末に粉砕することによって調製する。
【００７９】
この粉末を、50mMのEDTA, pH8.0, 0.2％のSDS ，１μｌのDEP の溶液 0.5mlに再懸濁する。それらを65℃で20分間インキュベートする。この後、５ＭのKAc (pH6.5) 0.1ml を添加し、その溶液を混合し、そして氷上で５分間インキュベートする。細胞残骸を、20,000rpm で５分間の遠心分離によりDNA 溶液から分離し、 0.4mlの上清液を 0.3mlのイソプロパノールにより沈殿せしめ、そして20,000rpm で10分間、遠心分離する。DNA ペレットを、 0.1mg／mlのRNアーゼＡを含む無菌TE緩衝液 100μｌに再溶解する。
【００８０】
個々のDNA ３μｇをEcoRＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により分別し、 Immobilan−Ｎ膜フィルターに移し、そしてpepCプロテアーゼ遺伝子の一部を含むpJaL335 からの 1.5kbの32Ｐ−ラベルされた NcoＩ DNAフラグメントによりプローブする。pepCの破壊を担持する株は、 3.6kb上の野生型バンドが形質転換体における7.4kbのバンドにシフトされることにより容易に認識される。
【００８１】
破壊されたＡ．オリザエpepC株を、５−フルオロ−オロト酸に対する耐性の自発的変異体、すなわちpyrG変異体の特徴的な表現型を選択することによって、pyrG− にする。pyrG変異体であるためには、株は増殖のためにウリジンを必要とする。その株は、ウリジンなしに増殖する能力についての選択によりwt pyrG 遺伝子により形質転換され得る。
【００８２】
例３．アスペルギラスオリザエareAΔ株の構成
areAΔ株を次の通りにして構成した。Ａ．オリザエからのareA遺伝子をクローン化した。pepC又はpepE、又はpepC及びpepEのいづれかを欠失するpyrG- 株を、areA遺伝子から上流の及び下流のDNA フラグメント間に挿入されるpyrG遺伝子を担持するプラスミドにより形質転換した。areAのためのコード領域は、プラスミド上に存在しなかった。形質転換体を、ウリジンの不在及びクロレートの存在下で増殖するそれらの能力について選択した。この二重選択は、機能的pyrG遺伝子及びareA- の両者について選択する。この選択方法により得られた株を、最終的に、サザン分析によりスクリーンし、染色体areA遺伝子がpyrG遺伝子により置換されている株を同定した。
【００８３】
areA遺伝子のクローニング
Ａ．オリザエareA遺伝子を、Ａ．ニジュランスareA遺伝子に対する交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した（B. Kudlaなど., EMBO J. 9 : 1355-1364 (1990））。Ａ．オリザエIFO4177 のゲノムライブラリーを、 SauIII Ａによる染色体DNA の部分消化、及びその得られたDNA フラグメントのベクター１ GEM−II（Promega から得られる）中へのクローニングにより調製した。Ａ．ニジュランスareA遺伝子によるライブラリーの交差ハイブリダイゼーションを、40％ホルムアミドにおいて37℃で実施した。
【００８４】
ハイブリダイジング１クローンを単離し、そしてそれらからのフラグメントを、ベクターpBluescript SK+ (Stratagene から得られる）中にサブクローン化し、図９に示されるプラスミドpSK5及びpSK9を生ぜしめた。クローン化された遺伝子は、それが実際、Ａ．オリザエareA相同体である場合、Ａ．ニジュランスareA変異体を補足することができた。クローンの5643bpを配列決定し、そしてＡ．オリザエ及びＡ．ニジュランスareA遺伝子の配列の比較は、それらが高い相同性であることを示す。Ａ．オリザエareA遺伝子の配列は、配列番号５に示される。
【００８５】
areA欠失プラスミドの構成
Ａ．オリザエ染色体からareA遺伝子を欠失するために、プラスミドpToC266 を構成した。pToC266 は、areA遺伝子の上流に起因する 2.1kbのDNA フラグメント（pSK5から単離された）、及びareA遺伝子の下流に起因する 1.4kbのDNA フラグメント（pSK9から単離された）を含む。それらの２種のフラグメントは、ゲノムにおいて約 3.2kbにより分離され、コード領域は遺伝子のこの部分に位置する。pJers4からのＡ．オリザエpyrG遺伝子を、areA上流及び下流DNA フラグメント間に挿入した。pToC266 の構成は図10ａ及び10ｂに示される。pToC266 は、ユニークEcoRＩ部位を有し、そして形質転換に使用される前、この制限酵素により切断することによって線状化された。
【００８６】
Ａ．オリザエareA株の選択
pepC又はpepE、又はpepC＋pepEのいづれかを欠失しているpyrG− 株を、線状化されたpToC266 により形質転換する。形質転換体を、窒素源としてグルタミン及び炭素源としてグルコースを含む最少プレート（Cove Biochem. Biophy. Acta (1966) 113 : 51-56)上で選択する。形質転換体を、同じタイプのプレート上で２度、再単離し、そして次に、異なった窒素源上での増殖試験にゆだねる。グルタミン上で良く増殖するが、しかし硝酸塩、アンモニア又は尿素上では増殖しない形質転換体は、areAを欠失していることが予測される。欠失は、サザン分析により確かめられる。
【００８７】
例４．pMT1606 の構成
Ａ．オリザエTAKA−アミラーゼプロモーターの後に挿入されるストレプトマイセス ヒグロスコピカスからのbar 遺伝子（C. J. Thompsonなど, EMBO J. 6 : 2519-2523 (1987)）、続いて、Ａ．ニガーgla 遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルを含むフラグメントを含むプラスミドを構成した。
【００８８】
プラスミドpMT1606 を、Ａ．オリザエのグルホシネート耐性形質転換体の選択のために使用することができる。pMT1606 を、プラスミドpBP1T (B. Straubinger など, Fungal Genetics Newsletter 39 : 82-83 (1992)) からbar 遺伝子を単離し、そしてヨーロッパ特許公開第0 098 993 A1号に記載される菌類発現プラスミドp775中にそれをクローニングすることによって構成した。図11は、pMT1606 の構成を示す。
【００８９】
例５．Ａ．オリザエ（areAΔ，pepEΔ，pepC- ）におけるキモシンの生成
Ａ．オリザエareAΔ，pepEΔ，pepC- 株を、哺乳類酵素キモシンのための菌類発現プラスミドであるプラスミドpToC56（図12）と共に、pMT1606 による同時形質転換により形質転換する。プラスミドpToC56の構成は、ヨーロッパ特許公開第098993号に記載される。
形質転換体を、10mMのアンモニウム及び１mg／mlのグルホシネートを含む最少培地上での増殖により選択し、そしてキモシンを生成する能力によりpToC56の存在についてスクリーンする。形質転換体を、マルトデキストリン及びグルタミンを含む最少培地を有する振盪フラスコにおいて30℃で４日間、増殖する。上清液におけるキモシンの含有量を、 SDS−PAGE及びウェスターンプロットにより分析した。
【００９０】
例６．Ａ．オリザエにおけるPepCの生成
pepCのための発現プラスミドの構成。プラスミドpJaL235 を AatII及び NsiＩにより消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブラント化した。 1.7kbのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。その 1.7kbのフラグメントを、 SmaＩにより消化されたpIC19H中にクローン化し、pJaL365 を付与した。
【００９１】
プラスミドpJaL365 を、BamHＩ及び XhoＩにより消化し、そして 1.7kbのフラグメントをゲル電気泳動により単離し、そして精製した。その 1.7kbのフラグメントを、BamHＩ及び XhoＩにより消化されたpToC68中にクローン化し、pJaL368 を付与した（図13ａ及び13ｂ）。
【００９２】
Ａ．オリザエ株を、プロテアーゼPepCのための菌類発現プラスミドであるプラスミドpJaL368 と共に、pToC90による同時形質転換により形質転換する。
形質転換体を、10mMのアセトアミドを含む最少培地上での増殖により選択し、そしてプロテアーゼPepCを生成する能力によりpJaL368 の存在についてスクリーンする。
【００９３】
例７．pepEの過剰発現
Ａ．オリザエからのTAKA−アミラーゼプロモーターに融合されるpepE遺伝子を担持するpToC338 と称するプラスミドを構成した。図14ａ及び14ｂは、その構成を示す。
コード領域のほとんど及び３’未翻訳領域の約 430bpを含むpToC299 からのEcoRＩ／ SalＩフラグメントを、次の配列の合成DNA フラグメントと一緒に、EcoRＩ／BamHＩ切断のpUC19 中にクローン化した：
8681 GATCCACCATGAAG
8747 GTGGTACTTCAGCT
【００９４】
pToC334 と称するその得られるプラスミドを、BamHＩ／EcoRＩにより切断し、そして開始コドンのすぐ上流に融合されるBamHＩ部位と共にpepE遺伝子の完全な構造遺伝子を含むフラグメントを単離し、約 430bpの未翻訳３’配列がまた、そのフラグメントに存在した。前記フラグメントを、Ａ．オリザエからのTAKA−アミラーゼプロモーターを含むプラスミドp775からの約 1.1kbの SalＩ／BamHＩフラグメントと一緒に、EcoRＩ／ SalＩ切断pUC19 中にクローン化した。その得られるプラスミドを、pToC338 と命名した。
【００９５】
pToC338 を、Ａ．ニジュランスアセトアミダーゼ（amdS) 遺伝子を含むpToC90と共に、Ａ．オリザエpJaL125(デンマーク特許出願第 0354196号に記載されるＡ．オリザエ alp− 株）中に、標準の方法（たとえば、ヨーロッパ特許第0 098 993 A1号に記載されるような）を用いて、同時形質転換した。形質転換体を、単一の窒素源としてアセトアミドを使用するそれらの能力により選択した。11の形質転換体を、菌糸体を通して２度、再単離した。形質転換体を、10mlのYPM(２％のマルトースを含むYP）において30℃で３日間、発酵せしめ、そしてその発酵ブイヨンを SDS−PAGEにより分析した。
【００９６】
形質転換体の１つは、pepE遺伝子によりコードされるタンパク質と同じサイズのタンパク質を生成し、そしてプロテアーゼ活性の測定は、その形質転換体からのブイヨンが、宿主株JaL125に比較して、pH＝5.5 でカゼインに対して高い活性を含むことを確認した。タンパク質を精製し、そしてＮ−末端配列決定は、それが実際、pepE遺伝子によりコードされるタンパク質であることを示した。分泌されたタンパク質のＮ−末端は次の通りであった：
gly＊ -arg-his-asp-val-leu-val-asp-asn-phe-leu-asn-ala-gln-tyr-phe-ser-glu-ile-glu-ile-gly-thr-pro-pro-gln-lys-phe-lys。
＊ の残基はまた、リシンでもあり得る。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、HowB101 の構成に関与する段階を示す。
【図２】図２は、pToC345 の構成を示す。
【図３】図３は、pToC315 の構成に関与する段階を示す。
【図４】図４は、pyrG遺伝子の２段階遺伝子欠失を図的に示す。
【図５】図５は、pJaL235 の構成を示す。
【図６】図６は、pJaL335 の構成に関与する段階を示す。
【図７】図７は、pJaL363 の構成に関与する段階を示す。
【図８】図８は、pJaLz の構成に関与する段階を示す。
【図９】図９は、pSK5及びpSK9の構成を示す。
【００９８】
【図１０ａ】図10ａは、pToC243の構成に関与する段階を示す。
【図１０ｂ】図10ｂは、pToC266 の構成に関与する段階を示す。
【図１１】図11は、pMT1606 の構成に関与する段階を示す。
【図１２】図12は、pToC56の構成を示す。
【図１３ａ】図13ａは、pJaL365の構成に関与する段階を示す。
【図１３ｂ】図13ｂは、pJaL368 の構成に関与する段階を示す。
【図１４ａ】図14ａは、pToC334の構成に示す。
【図１４ｂ】図14ｂは、pToC338 の構成に示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼを生産しない菌類(fungi) に関する。本発明の菌類は、通常生産されるプロテアーゼによるタンパク質加水分解を受けやすいタンパク質の生産のための宿主として有用であり、そして従って、本発明は、本発明の菌類を用いることによる注目のタンパク質の高収率での製造方法を包含する。本発明はまた、そのような菌類の生成方法及びそれらの方法に使用されるべきDNA 構造体も包含する。
【背景技術】
【０００２】
菌類(fungi) 、及び特に糸状菌(filamentous fungi) は、著しく高いレベルのタンパク質を分泌するそれらの能力のために、商業的に広く使用されている。
糸状菌の中で、アスペルギラス(Aspergillus) 属に属する種が、内因性タンパク質、及び後にはまた、異種タンパク質製造のための商業的使用の長い歴史を有する。
タンパク質の製造のために使用されるほとんどの微生物に関する１つの欠点は、注目のタンパク質生成物をタンパク質加水分解による分解にゆだねるであろうプロテアーゼの生来の生成である。
【０００３】
これを回避する種々の手段が考えられて来た。他の解決法の中で、種々のプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失し又は破壊することが提案されて来た。不運なことには、菌類は、そのような解決法を多かれ少なかれ、非現実質にする多数のプロテアーゼを生成する。
従って、全く生産しないか、又は非常に低いレベルのプロテアーゼ生成を示す糸状菌株についての必要性が存在する。
【０００４】
長年、Ａ．ニジュランス（A. nidulans)において窒素代謝物抑制を調節する調節遺伝子areAが、細胞外プロテアーゼの生成に影響を及ぼすことは知られている（Arst & Cove, Molec. Gen. Genet. 126, (1973) 111-141)。
【０００５】
Ａ．ニジュランスからのareA遺伝子がクローン化されており（Caddick など., EMBO Journal 5, (1986) 1087-1090)、そして種々の修飾がこの遺伝子によりコードされる活性化因子タンパク質における異なった領域の機能の評価を可能にして来た（Stankovitch など., Mol. Microbiol. 7, (1993) 81-87) 。さらに、Ａ．フミガタス（A. fumigatus) におけるその対応する機能をコードする遺伝子が、最近クローン化されている（Henselなど. 2nd European Conference on Fungal Genetics, April 28 to May 1, Book of Abstracts, E11)。
【０００６】
文献から、ｔ−PAの生産のための宿主として遺伝子型argB areA1のＡ．ニジュランスの株の単一使用もまた知られている（Upshall など., Biotechnology 5, (1987), 1301-1304)。この例においては、argB遺伝子型のみがそのアルギニン原栄養性を通して選択マーカーとして使用され、ところがareA遺伝子型は単純に同時発生現象である。
国際特許公開WO95/35385は、糸状菌におけるプロテアーゼレベルを低めるための手段としてareA遺伝子の欠失を開示する。
細胞外プロテアーゼの他に、菌類はまた、多くの細胞内プロテアーゼ（また、内内性とも呼ばれる）を生成する。
【０００７】
それらの中で、Ａ．ニガーにより生成され、そしてPepCと呼ばれるズブチリシン型のセリンプロテアーゼが記載されており、それを発現する遺伝子がクローン化され、そして欠失変異体がヨーロッパ特許第574,347 号及びFrederick など., Gene, 125, 57-64 (1993)に記載されている。
【０００８】
PepEと称するアスパラギン酸型の追加のそのようなプロテアーゼが、Jarai など., Gene, 145, 171-178 (1994)に開示されている。その文献は、pepE遺伝子のクローニング及び特性決定を開示し、そしてpepE及びpepC遺伝子の調節について述べている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、プロテアーゼフリーの糸状菌のための必要性の軽減を目的として有する。
発明の要約
従って、本発明は、areA，pepC、及び／又はpepE遺伝子が、機能的AreA活性化因子及び機能的PepC及び／又はPepEプロテアーゼを供給する手段で発現され得ないよう、それらの遺伝子が組換えDNA 技法により修飾されている菌類に関する。
さらに、本発明は、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の欠失により得られるそのような菌類の生成方法にも関する。
【００１０】
これは、
ｉ）注目の菌類からのareA, pepC及び／又はpepE遺伝子をクローニングし、
ii）内部部分が置換され、欠失され、又は特別なDNA が挿入されている、前記areA遺伝子、PepC遺伝子及びPepE遺伝子間の１つをそれぞれ含んで成るDNA 構造体を生成し、
iii ）前記構造体により前記菌類を形質転換し、そして
iv）areA− ，pepC− 及び／又はpepE− である形質転換体を単離すること；
を含んで成る方法により得られる。
【００１１】
前記areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の上記クローニングから得られる情報はまた、前記areA, pepC及び／又はpepE遺伝子から転写されるmRNAに対して相補的なRNA 分子の合成を生ぜしめる発現プラスミドを構成するために、及びそれにより興味ある菌類を形質転換するために、良く知れているアンチ−センス技法に関して使用され得る。
さらに、本発明は、上記方法への使用のために意図されたDNA 構造体にも関する。
【００１２】
さらに、本発明は、所望のタンパク質又は遺伝子生成物、特に分泌されたタンパク質の生成方法に関し、それにより、注目の前記タンパク質又は遺伝子生成物をコードするDNA 配列を少なくとも含んで成るDNA 構造体により修飾され、そして任意には形質転換された菌類宿主が適切な条件下で適切な増殖培地において培養され、そして所望する遺伝子生成物が回収され、そして精製される。
【００１３】
本発明を用いる場合、驚くべきことには、本発明の菌類がそのような分泌されたタンパク質を、より改良された収率で生成することが見出された。
また、驚くべきことには、Ａ．オリザエareA− 株の良好な増殖を付与することができる唯一の窒素源がグルタミンであることも見出された。
さらに、本発明は、上記方法により生成されるタンパク質生成物にも関する。
また、本発明は、Ａ．オリザエからのpepC遺伝子（配列番号１）又はその機能的対立遺伝子をコードするDNA 配列にも関する。
【００１４】
本発明はまた、Ａ．オリザエからのPepCプロテアーゼ（配列番号２）、及び前記PepCプロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体により適切な宿主を形質転換し、前記PepCプロテアーゼを生成することができる形質転換体を選択し、前記形質転換体を適切な増殖培地において培養し、そして前記培養物から前記PepCプロテアーゼを回収することを含んで成る、PepCプロテアーゼの生成方法にも関する。
さらに、本発明は、Ａ．オリザエからのpepE遺伝子（配列番号３）又はその機能的対立遺伝子をコードするDNA 配列にも関する。
【００１５】
本発明はまた、Ａ．オリザエからのPepEプロテアーゼ（配列番号４）、及び前記PepEプロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体により適切な宿主を形質転換し、前記PepEプロテアーゼを生成することができる形質転換体を選択し、前記形質転換体を適切な増殖培地において培養し、そして前記培養物から前記PepEプロテアーゼを回収することを含んで成る、PepEプロテアーゼの生成方法にも関する。
【００１６】
それらの観点によれば、前記宿主は好ましくは菌類、本発明によれば、特にＡ．オリザエであり、そして前記DNA 構造体は、前記PepC又はPepEプロテアーゼのいづれかをコードする遺伝子の余分のコピーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
定義
本明細書においては、次の定義が用いられる：
発現areAD とは、areA遺伝子が欠失されている株を意味する。類似する表示が、pepC及び／又はpepE遺伝子が欠失されている株に関して使用される。
発現areA-とは、機能的AreA活性化因子を生成しない株を意味する。用語“機能の損失”とはまた、しばしばこのためにも使用される。類似する表示が、機能的PepC及び／又はPepEプロテアーゼを生成しない株のためにも使用される。
表現“アンチセンス技法”とは、アメリカ特許第 5,190,931号に
開示されるような方法を記載する。
【００１８】
発明の特定の記載
示されるように、本発明は、第１の観点においては、areA遺伝子が、機能的AreA活性化因子を供給する態様で発現され得ないように組換えDNA 技法により修飾されており、そして細胞外プロテアーゼPepC及び／又はPepEをコードする遺伝子が、機能的プロテアーゼを生産するために発現されないような態様で不活性化されている菌類に関する。
この目的は、特に、areA，pepC及び／又はpepE遺伝子の欠失又は破壊により得られる。
areA, pepC及び／又はpepE遺伝子のクローニングは、例に記載されている。
【００１９】
他の菌類からのAreA類似体は、すでに知られている遺伝子の１つとの交差ハイブリダイゼーションにより、又はareA変異体、たとえばＡ．ニジュランスareA−18又は本出願に記載されるＡ．オリザエareA欠失株の相補性によりクローン化され得る。
遺伝子を欠失し、又は破壊するための方法は特に、WO90/00192 (Genencor) に記載されている。
【００２０】
遺伝子におけるDNA を置換するための方法はまた一般的に知られており、そして前記遺伝子の１又は複数の連続した部分を置換することによって達成され得るが、しかしそれはまた、機能的でないAreA活性化因子変異体をコードするDNA 配列を生成する特定部位の突然変異誘発により得られる。
【００２１】
そのような目的が達成されるもう１つの方法は、アンチセンス技法を用いることによってである。
アンチセンス技法及びそれをいかにして使用するかは、前述のアメリカ特許第 5,190,931号（University of New York）に詳細に記載されている。
前記不活性化を得るためのさらなる方法は、areA遺伝子の内部に余分のDNA を挿入することによってであり、それにより、機能不全活性化因子タンパク質の発現を生ぜしめる。
【００２２】
この方法に関しては、クローニングにより提供される情報は、areA遺伝子中に組込まれ得、そしてさらに、それをもう１つの遺伝子、たとえばpyrG遺伝子により置換することができるDNA 構造体を製造するために使用され得る。
areA活性化因子の存在を回避するさらなる方法は、areA遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによってである。
上記の原理は、pepC、及び／又はpepE遺伝子に同等に適用する。
【００２３】
本発明によれば、菌類は好ましくは、アスペルギラス(Aspergillus) 、トリコダーマ(Trichoderma) 、ヒュミコラ（Humicola) 、カンジダ(Candida) 、アクレモニウム (Acremonium) 、フサリウム（Fusarium) 、及びペニシリウム(Penicillium) から成る群から選択された属に属する。
【００２４】
それらの属の中で、Ａ．オリザエ（A. oryzae)、Ａ．ニガー（A. niger) 、Ａ．アワモリ（A. awamori) 、Ａ．ホエニシス（A. phoenicis) 、Ａ．ジャポニカス（A. japonicus) 、Ａ．ホエチダス（A. foetidus)、Ａ．ニジュランス（A. nidulans)、Ｔ．リーセイ（T. reesei)、Ｔ．ハルジアナム（T. harzianum) 、Ｈ．インソレンス（H. insolens)、Ｈ．ラヌギノサ（H. lanuginosa)、Ｆ．グラミネアラム（F. graminearum) 、Ｆ．ソラニ（F. solani)、Ｐ．クリソゲナム（P. chrysogenum) 及び他のものから成る群から選択された種が好ましい。
【００２５】
示されるように、本発明はまた、不活性化がareA, pepC及び／又はpepE遺伝子の欠失により得られている、本発明の第１の観点の菌類を生成するための方法を包含し、ここで前記方法は、
ｉ）注目の菌類からのareA, pepC及び／又はpepE遺伝子をクローニングし、
ii）内部部分が置換され、欠失され、又は余分なDNA が挿入されている、areA遺伝子、pepC遺伝子、及び／又はpepE遺伝子間の１つをそれぞれ含んで成るDNA 構造体を生成し、
iii ）前記構造体により前記菌類を形質転換し、そして
iv）areA- ，pepC- 、及び／又はpepE- である形質転換体を単離することを含んで成る。
【００２６】
PepCプロテアーゼの成熟はPepEプロテアーゼにより制御されると思われるので、本発明はまた、不活性化がareA及びPepE遺伝子の欠失により得られている本発明の菌類を生成するための方法を包含し、ここで前記方法は、
ｉ）興味ある菌類からのareA及びpepE遺伝子をクローニングし、
ii）内部部分が置換され、欠失され、又は特別なDNA が挿入されている、areA及びpepE遺伝子間の１つをそれぞれ含んで成るDNA 構造体を生成し、
iii ）前記構造体により前記菌類を形質転換し、そして
iv）areA- 及びpepE- である形質転換体を単離することを含んで成る。
【００２７】
不活性化がアンチセンス技法を用いることによって得られている菌類を生成するための方法がまた包含される。そのような方法は、
ｉ）areA遺伝子、pepC遺伝子及び／又はpepE遺伝子から転写されるmRNAに対して相補的なRNA 分子の合成を生ぜしめる個々の発現プラスミドの構成、
ii）前記発現プラスミド、及び別のプラスミド又は前記同じプラスミドのいづれか上の適切なマーカーによる宿主菌類の形質転換、
iii ）前記マーカーを用いての形質転換体の選択、及び
iv）AreA，PepC及び／又はPepE生成物の合成の低下を示す株についての選択された形質転換体のスクリーニングを包含する。
【００２８】
本発明のさらなる観点は、上記方法への使用のためのDNA 構造体の包含を意味する。
前者の方法に関して、前記DNA 構造体は、内部部分が置換され、欠失され、又は余分なDNA が挿入されている、areA, pepC、及び／又はpepE遺伝子を含んで成ることができる。
さらに、DNA 構造体の少なくとも１つはまた、注目のタンパク質生成物をコードするDNA 配列、たとえば後で言及されるものを含んで成ることができる。
【００２９】
後者のアンチセンス方法に関しては、DNA 構造体は、機能的プロモーターに連結される、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の逆方向DNA 配列を含んで成り、それにより、mRNAは前記areA，pepC及び／又はpepE遺伝子から生成されるmRNAに対して少なくとも部分的に相補的である。
【００３０】
本発明のさらなる観点は、所望の遺伝子生成物、好ましくは分泌される遺伝子生成物の製造方法に関し、それにより、本発明の菌類が、適切な条件下で適切な増殖培地において培養され、そして所望の遺伝子生成物が回収され、そして精製される。
異種遺伝子により発現される遺伝子生成物の場合、所望の遺伝子生成物をコードするDNA 配列が、前記菌類を生成するために使用されるDNA 構造体の一部であり得る。
【００３１】
しかしながら、通常、本発明の菌類の別の形質転換が、所望の生成物を生成することができる菌類を製造するために行なわれる。
菌類を形質転換するための方法は、当業界において、たとえばヨーロッパ特許第0 184 438 A2号（Gist-Brocades N. V.)及びヨーロッパ特許公開第098993号（Novo Nordisk A/S) において良く知られている。
【００３２】
固有の生成物に関しては、これはもちろん必要ではないが、しかし生成を高めるために、宿主中に組込まれるべき注目のタンパク質をコードする遺伝子の複数コピーを供給することは好都合である。
所望の遺伝子生成物は一般的に、ペプチド又はタンパク質、好ましくは酵素である。
酵素の中では、それは好ましくは、プロテアーゼ、たとえばトリプシン及びキモシン；リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、等から成る群から選択される。
【００３３】
もう１つの型の所望の遺伝子生成物は一般的に、治療的活性ペプチド又はタンパク質である。
その治療的活性ペプチド又はタンパク質の中では、タンパク質は好ましくは、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF、第VII 因子、第VIII因子、ウロキナーゼ、ｔ−PA、CSF 、ラクトフェリン、TPO 、等から成る群から選択される。
【００３４】
本発明のさらなる観点は、Ａ．オリザエからのpepC遺伝子（配列番号１）、Ａ．オリザエからのpepE遺伝子（配列番号３）又はその機能的対立遺伝子をコードするDNA 配列に関する。また、対応するPepC及びPepEプロテアーゼ、及び好ましくは組換え手段によるそれらの製造が本発明により包含される。
【００３５】
この観点においては、本発明は、注目のプロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体により適切な宿主を形質転換し、プロテアーゼを生成することができる形質転換体を選択し、前記形質転換体を適切な増殖培地において培養し、そして前記培養物からPepC又はPepEプロテアーゼを回収することを含んで成る、Ａ．オリザエからのPepCプロテアーゼ又はPepEプロテアーゼの製造方法に関する。
【００３６】
そのような工程に使用される宿主は好ましくは、本発明の上記観点の宿主である。
PepC又はPepEプロテアーゼを生成するための方法のある観点においては、宿主は、Ａ．オリザエである。この場合、プロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体が宿主にすでに存在する遺伝子の余分なコピーを供給することが好ましい。
プロテアーゼをコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体はまた、通常、宿主におけるプロテアーゼの適切な発現及びプロセッシングを提供するために調節要素を含むであろう。
【実施例】
【００３７】
本発明は、下記例においてより詳細に説明される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を制限するものではない。
例
材料及び方法
株
Ａ．オリザエ、IFO4177 : Institute for Fermentation, Osaka, 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-Ku, Osaka, Japanから入手できる。
ToC913：この株の構成は、例に記載されている。
【００３８】
遺伝子
areA：この遺伝子は、窒素異化を制御する調節タンパク質をコードする。
pepC：この遺伝子は、ズブチリシン型のセリンプロテアーゼをコードする。
pepE：この遺伝子は、アスパラギン酸プロテアーゼをコードする。
pyrG：この遺伝子は、オロチジン−Ｓ’−リン酸デカルボキシラーゼ、すなわちウリジンの生合成に関与する酵素をコードする。
bar ：この遺伝子は元来、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus) から単離され、そしてホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする。この酵素はホスフィノトリシン（＝グルホシネート）を変性し、そしてそれにより、細菌、菌類及び植物に対して毒性であるこの化合物を不活性化する。
【００３９】
プラスミド
pUC118：Viera and Mesing J. Meth. Enzymol. 1987, 153, 3-11
pSO2 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
pJers4：pUC118におけるpSO2の 2.0kbサブクローン。pJers4は機能的Ａ．オリザエpyrG遺伝子を含む。
pSO5 ：pSO2からのこのプラスミドの構成は例に記載される。
pToC56：このプラスミドの構成は、ヨーロッパ特許公開第098,993 号に記載される。
pToC68：このプラスミドの構成は、WO91/17243に記載される。
【００４０】
pToC90：WO91/17243に記載のようにして調製された、pUC19 ベクター〔Yannisch-Perron など., GENE 1985, 33, 103-119 〕上に 2.7kbの XbaＩフラグメント〔Corrick など., GENE 1987, 53, 63-71 〕としてアスペルギラス ニジュランスからのamdS遺伝子を有する、p3SR2 のサブクローン。
pToC266 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
pToC299 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
pToC338 ：このプラスミドの構成は、例に記載される。
【００４１】
pMT1606 ：pBP1T (B. Straubinger など., Fungal Genetics Newsletter 39 (1992) : 82-83)及びヨーロッパ特許公開第098993号）からのこのプラスミドの構成は、例に記載される。
p775 ：このプラスミドの構成は、ヨーロッパ特許公開第098993号に記載される。
p777 ：このプラスミドの構成は、ヨーロッパ特許公開第098993号に記載される。
pHW470：このプラスミドの構成は、例に記載される。
【００４２】
例１．Ａ．オリザエpepE遺伝子のクローニング及び欠失
Ａ．オリザエpepE遺伝子を、Ａ．ニガー遺伝子との交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した。部分的なＡ．ニガー遺伝子を、G. Jaraiなど、Gene145 (1994) 171-178により公開されたpepE配列に従って製造されたpepE特異的プライマー及びＡ．ニガー染色体DNA とのPCR 反応から 700bpのPCR フラグメントとして得た。このフラグメントは、DNA 配列決定によりpepE配列を含むことが示された。それは、緊縮条件下でＡ．オリザエ染色体DNA にハイブリダイズし、そしてサザン分析は、Ａ．オリザエが単一のpepE株遺伝子を含むことを示した。
【００４３】
pepE遺伝子を、遺伝子置換法及び２段階遺伝子置換法（G. May, “Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi ”（1992）pp. 1-25, Eds. J. R. Kinghorn and G. Turner ; Blackie Academic and Professional)の両者により欠失せしめた。マーカーとして、Ａ．オリザエpyrG遺伝子が使用されるので、Ａ．オリザエ株は、そのpyrG遺伝子の欠失により製造されたpyrG- 株であった。
【００４４】
Ａ．オリザエpepE遺伝子のクローニング
アスペルギラス・オリザエのコスミド ライブラリーを、“SuperCos１コスミドベクターキット”の供給者（Stratagene) からの説明書に従って、実質的に構成した。
Ａ．オリザエIFO4177 のゲノムDNA を、標準的方法（Christensen, T.,など., Biotechnology 6 (1988) 1419-1422)により製造されたプロトプラストから調製した。プロトプラスドの単離の後、それらをLabofuge T (Heto) において５分間、2500rpm での遠心分離によりペレット化し、そのペレットを、Supercos１コスミドベクターキットからのマニュアルに言及しているようにして、10mMのNaCl, 20mMのトリス−HCl (pH8.0) 、１mMのEDTA， 100μｇ／mlのプロティナーゼＫ及び 0.5％のSDS 溶液に懸濁し、そして前記DNA 調製物の残りを前記キットの説明書に従って行なった。
【００４５】
ゲノムDNA のサイズを、BioradからのCHEF−ゲル装置を用いての電気泳動により分析した。１％アガロースゲルを、10〜50秒のパルスを伴って、 200ボルトで20時間、実施した。ゲルを臭化エチジウムにより染色し、そして写真を取った。DNA は50〜100kb のサイズであった。そのDNA を、Sau3A により部分的に制限した。その制限されたDNA のサイズは、上記と同じタイプのCHEF−ゲル分析により20〜50kbであることが決定された。CsClグラジエント バンド化されたSuperCos１ベクターを前記マニュアルに従って調製した。
【００４６】
連結及びパッケージングを上記のようにして行なった。ライブラリーの滴定の後、１つの連結及びパッケージングからのすべてのパッケージング混合物を宿主細胞XL１−Blue MR 中にトランスフェクトし、そして50μｇ／mlのアンピシリンLBプレート上にプレートした。約3800のコロニーを得た。10のコロニーからのコスミド調製物は、それらすべてが予測されるサイズの挿入体を有したことを示した。コロニーを個々に、取り、そして10μｌのLB(100μｇ／mlのアンピシリン）を有するマイクロタイタープレートウェルに接種し、そして37℃で一晩インキュベートした。50％グリセロール 100μｌを個々のウェルに添加し、そして完全なライブラリーを−80℃で凍結した。全3822のコロニーを貯蔵した。これは、約 4.4倍のＡ．オリザエゲノムを示す。
【００４７】
ライブラリーにおける個々に凍結されたコロニーを、マイクロタイタープレートの半分に適合する６×８のピンを有する複数ピン装置を用いることにより、LB−プレート(100μｇ／mlのアンピシリン）上に接種した。ライブラリーにおけるすべてのクローンからのコロニーを含むプレートを製造した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。ペトリ皿のサイズに切断された無菌Whatman 540 フィルターを、37℃でさらに２時間インキュベートされたコロニー上に配置した。フィルターを、 200μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むLBプレートに移し、そしてプレートを37℃で一晩インキュベートした。次の日、フィルターを、 0.5ＭのNaOHにより５分間２度、次に 0.5Ｍのトリス−HCl(pH＝7.4)により５分間２度、及び次に、２×SSC により５分間２度洗浄した。フィルターをエタノールにより湿潤し、そして空気乾燥せしめた。
【００４８】
フィルターを、Ａ．ニガーからのpepE遺伝子の一部を含む、 0.7kbの３２Ｐ−ラベルされたPCR フラグメントによりハイブリダイズした。PCR フラグメントは、DNA 配列において異なる２種の 700bpプライマーと共にＡ．ニガーからの染色体DNA 上でのPCR を実施することによって得られた。ハイブリダイゼーションを、10×Denhart ，５×SSC ，0.02ＭのEDTA，１％のSDS ，0.15mg／mlのポリＡ及び0.05mg／mlの酵母tRNAにおいて65℃で16時間、行なった。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２×SSC, 0.1％ SDSにより45℃で２度洗浄し、そしてＸ線フィルム上に置いた。
【００４９】
５つのコロニーがプローブとハイブリダイズし、それらのうち４個は、同じプローブを用いての単離されたコスミドのDNA のサザン分析によりＡ．オリザエpepE遺伝子を含むことが示された。３個のコスミドは同一であり、従って、pepEを含む２種の異なったコスミドクローンが単離され、それらは貯蔵されるライブラリーにおけるそれらの位置に関して、7C7 及び33C1と呼ばれた。２種のオーバーラッピングフラグメント、すなわち 4.3kbのEcoRＩフラグメント(pToC299) 及び 2.4kbのHindIII (pToC301) フラグメントをサブクローン化し、そして部分的に配列決定した。配列番号１は、プロテアーゼのためのDNA 配列及び推定されるaa配列を示す。その遺伝子は、Ａ．ニガー遺伝子に対する強い相同性を示す。
【００５０】
Ａ．オリザエpyrG遺伝子のクローニング
Ａ．オリザエpyrG遺伝子を、Ａ．ニガーpyrG遺伝子との交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した（W. van Hartingsveldtなど., Mol. Gen. Genet 206 : 71-75 (1987））。部分的 SauIII Ａ消化されたＡ．オリザエIFO4177 DNA のλライブラリーを、Ａ．ニガーpyrG遺伝子からの１kbのDNA フラグメントにより低い緊縮性でプローブした。陽性クローンからの 3.8kbのHindIII フラグメントを、pUC118ベクター中にサブクローン化した。得られるプラスミドpSO2は、Ａ．ニガーpyrG変異体の相補性によりpyrG遺伝子を含むことが示された。
【００５１】
Ａ．オリザエpyrG- 株の構成
個々の末端上に約１kbのpyrGフランキング配列を含むpyrG欠失プラスミドpSO5を、プラスミドpSO2から構成した。Ａ．オリザエIFO4177 を、この構造体により形質転換し、そして形質転換体を、５−フルオロ−オロト酸(FOA) に対する耐性、すなわちpyrG変異体に特徴的な表現型により選択した。１つの形質転換体How B101は、pyrG遺伝子座で予測される欠失を有することがサザン分析により示された。pyrG変異体How B101の増殖のためには、ウリジンを必要とする。How B101は、ウリジンなしに増殖する能力についての選択によりwt pyrG 遺伝子により形質転換され得る。
How B101の構成に関与する段階は、図１に例示される。
【００５２】
遺伝子置換法によるＡ．オリザエにおけるpepE遺伝子の欠失
pepE遺伝子をpyrG遺伝子により置換することを企画されたプラスミドpToC345 を構成した。
２種のPCR 反応を、鋳型としてpToC299 を用いて行なった。
第１のプライマー組は次の通りであった：
19819 GAAGATCTGCGCGGATGTACATTGTAG
19821 TTAGTCAGAAATTCGTCCCG
第２のプライマー組は次の通りであった：
19820 CCCAAGCTTCATGCTCGACCAGGGCCTCCT
19818 GGTCTGTGTTAACCAAAGAAC
【００５３】
19819/19821 により得られた約 800bpのフラグメントを、 BalII／HindIII により切断し、そして19820/19818 により得られ、そしてHindIII ／ pstＩにより切断された 1.1kbのフラグメントと一緒に、 BglII／ PstＩ切断されたpIC19R (J. L. Marsh など, Gene 32 (1984) 481-484) 中にクローン化した。得られるプラスミドを、ユニークHindIII 部位で切断し、脱リン酸化し、そしてpJaL335(例２に記載される）からの 3.5kbのpyrG含有フラグメントを挿入した。pToC345 の構成は図２に示される。
【００５４】
How B101を、標準の方法を用いて、EcoRＩ切断されたpToC345 により形質転換し、そして形質転換体を、ウリジンの添加を伴わないで増殖するそれらの能力により選択した。100 の形質転換体を、分生子を通して１度再単離した。胞子を、その再単離プレート上の単一コロニーから取り、そして0.01％のTriton X-100を含む水溶液 100mlに懸濁した。個々の形質転換体及びIFO4177(対照株として含まれる）からの胞子懸濁液１mlを、個々のそれらのYPD プレート上の上部に配置されるWhatmann 540フィルター上にスポットを付けた。
【００５５】
プレートを30℃で18時間インキュベートした。フィルターをプレートから除去し、そして室温で２時間、20％ SDSに置いた。次に、それらを 600Ｗのマイクロ波オーブンにおいて３分間ベークした。次に、フィルターを、10％ SDSにより５分間、 0.5Ｍの NaOH, 1.5ＭのNaClにより５分間２度、 0.5Ｍのトリス−HCl (pH7.5) 、 1.5ＭのNaClにより５分間１度、及び20×SSC により５分間１度洗浄し、そして空気乾燥せしめた。２組のフィルターを、個々のそれらの３２Ｐ−ラベルされたプローブを用いて、標準の方法によりハイブリダイズせしめた。
【００５６】
１組を、欠失されることが試みられたpepE遺伝子の一部を含むpToC299 からの 600bpの BbuＩ／HindIII フラグメントによりハイブリダイズせしめた。他の組のフィルターを、Ａ．オリザエtpi 遺伝子からのDNA フラグメントによりハイブリダイズせしめた。pepEを除く、１つのコピーに存在するいづれかの遺伝子が、これはフィルターに結合されるDNA の量の対照であるので、使用され得る。
【００５７】
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、 0.1×SSC, 0.1％ SDSにより65℃で洗浄し、そしてフィルターに結合される放射能をPhospo Imager により可視化した。13の形質転換体をさらなる分析のために採取した。なぜならば、それらは対照のプローブに対するハイブリダイゼーションに比較して、pepEプローブに対するハイブリダイゼーションをほとんど示さなかったからであった。染色体DNA を標準の方法により調製し、そしてEcoRＩ制限されたDNA のサザンブロットを、欠失される予定でないpepE遺伝子の３’側部分を含むpToC299 からの32Ｐ−ラベルされた 1.1kbの BbuＩフラグメントによりハイブリダイズせしめた。
【００５８】
wt株においては、 4.3kbのフラグメントが、プローブにハイブリダイズすべきであり、正しい置換の株においては、 4.3kbのフラグメントは 7.2kbのフラグメントにより置換されるべきである。２種の形質転換体が正しく見え、すなわち１つはまったくハイブリダイズするバンドを有さず、そしてほとんどのwtバンド+ は１つの他のバンドを有し、このことは、非相同遺伝子座での形質転換DNA の組込みを示す。
【００５９】
pepE欠失された株のpyrG- 誘導体を単離するために、107 個の分生子を、FOA 含有プレート上に広げ、そして耐性コロニーを選択した。FOA 耐性コロニーを再単離し、DNA を調製し、そしてサザン分析を行ない、pyrG遺伝子がpToC345 における遺伝子を端に有する反復配列間での組合せを通して失なわれている株を同定した。
【００６０】
二段階遺伝子置換法によるＡ．オリザエにおけるpepE遺伝子の欠失
pepE遺伝子の２段階遺伝子欠失のために企画されたプラスミドpToC315 を構成した。pepE遺伝子から上流の配列を含むpToC299 からの 1.6kbのEcoRＩ／HindIII （HindIII 部位はDNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントによる処理によりブラント末端化されている）を、pepE遺伝子の３’末端を含む 1.4kbの SalＩ／ BbuＩフラグメントはブラント末端化されている）と共に、EcoRＩ／ SalＩ切断されたベクターpUC19 中にクローン化した。得られるプラスミドを、pUC19 リンカーにおけるユニークHindIII 部位で切断し、脱リン酸化し、そしてpJers4からの 1.8kbのpyrG含有フラグメントを挿入した。pToC315 の構成は図３に示される。
【００６１】
How B101を、標準の方法を用いてpToC315 により形質転換し、そして形質転換体を、クリジンの添加なしに増殖するそれらの能力により選択した。再単離の後、染色体DNA を12の形質転換体から調製し、DNA をAsp718により切断し、そして放射性ラベルされたプローブとしてpepE遺伝子の一部を含むpToC301 からの BbuＩフラグメントによるサザン分析により分析した。１つの形質転換体は、pToC315 がpepE遺伝子座での相同組換えにより単一のコピーとして組込まれている場合、予測されるように２つの新規のバンドにより置換されている、pepE特異的Asp718フラグメントの消出により示されるような内因性pepE遺伝子に組込まれるプラスミドを有した。
【００６２】
形質転換体は、ToC1089 として命名された。ToC1089 の５×107 個の分生子を、５−フルオロ−オロト酸を含むプレート上に広げ、pyrG遺伝子の損失について選択した。これは、二段階遺伝子欠失における第２段階であり、pyrG遺伝子は２対の同一配列のいづれかとの組合せにより失なわれ得、この１つは同様にpepE遺伝子の欠失をもたらすであろう。前記方法は図４に示される。５−フルオロ−オロト酸耐性の頻度は、約10-5であった。５−フルオロ−オロト酸耐性コロニーを再単離し、そしてpepE遺伝子について欠失された株をサザン分析により同定した。
【００６３】
例２．アスペルギラス・オリザエ セリンプロテアーゼpepCのクローニング及び破壊
Ａ．オリザエpepC遺伝子を、Ａ．ニガー遺伝子との交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した。Ａ．ニガー遺伝子は、Ａ．ニガー染色体DNA 、及びFrederick G. Dなど. Gene 125 (1993) 57-64 により公開されたpepC配列に従って製造されたpepC特異的プライマーとのPCR 反応から 1.1kbのPCR フラグメントとして得られた。そのフラグメントは、DNA 配列決定によりpepC配列を含むことが示された。それを、緊縮条件下でＡ．オリザエ染色体DNA にハイブリダイズせしめ、そしてサザン分析は、Ａ．オリザエが単一のpepC様遺伝子を含むことを示した。
【００６４】
pepC遺伝子を、二段階遺伝子置換法（G. May, “Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi ”(1992) pp. 1-25, Eds. J. R. Kinghorn and G. Turner ; Blackie Academic and Professional) により欠失せしめた。マーカーとして、Ａ．オリザエpyrG遺伝子を使用し、Ａ．オリザエ株はそのpyrG遺伝子の欠失により製造されるpyrG株であった。
【００６５】
Ａ．ニガーセリンプロテアーゼpepCのクローニング
Ａ．ニガーpepCをコードする公開されたcDNAヌクレオチド配列（Frederick G. D. など. Gene 125 (1993) 57-64)から、pepC遺伝子のコード部分がPCR 反応において増幅されるよう、２種のオリゴヌクレオチドを企画した。ヌクレオチド配列の３’−末端がpepC遺伝子のＮ−末端部分に対応し（下線）、そしてその５’−末端がクローニングを促進するためである（BamHＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）ようなプライマー＃5258（5'-CTAGGATCCAAGGCATTTATGAAGGGCATCCTCGGCCTTTCC)を製造した。ヌクレオチド配列の３’末端がpepC遺伝子のＣ−末端部分に対応し、そして５’−末端がクローニングを促進するためである(XhoＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）ようなプライマー＃5259（5'-CTACTCGAGTCAAAAAAAAACCAAGTCTTCCGATCTACG) を製造した。
【００６６】
Ａ．ニガーからのゲノムDNA を、PCR 反応における鋳型として使用した。増幅反応を、 2.5単位の Taq−ポリメラーゼ、 100ngのＡ．ニガーゲノムDNA ，50mMのKCl, 10mM のトリス−HCl, pH8.0, 1.5mM のMgCl2, 250nMの個々のdNTP、及び 100pMの上記２種のプライマーの個々を含む溶液 100μｌ体積において行なった。
【００６７】
増幅を、Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480 において実施し、そして94℃で３分間の１回のサイクル、94℃で１分間、55℃で30秒間、及び72℃で１分間の続く25回のサイクルから成った。PCR 反応は、長さ約 1.1kbの１つのDNA フラグメントを生成する。このフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、精製し、ベクターpCR II（Invitrogen Corporation）中にクローン化し、そして分子生物学の分野において知られている標準方法を用いて配列決定した。得られるプラスミドをpJaL197 と命名した。
【００６８】
Ａ．オリザエセリンプロテアーゼpepCのクローニング
Ａ．オリザエIFO4177 からのゲノムDNA のサザンブロットを、Ａ．ニガーpepC遺伝子を含むpJaL197 クローンからの11kbの３２Ｐ−ラベルされたEcoRＩ DNAフラグメントによりハイブリダイズによりハイブリダイズせしめた。ゲノムDNA を次の制限酵素により切断した：EcoRＩ，BamHＩ， XhoＩ及びHindIII 。ハイブリダイゼーションを、10×Denhart ，５×SSC ，0.02ＭのEDTA，１％のSDS ，0.15mg／mlのポリＡ及び0.05mg／mlの酵母tRNAにおいて65℃で16時間、実施した。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２×SSC, 0.1％のSDS により65℃で２度洗浄し、そしてＸ線フィルム上に置いた。プローブは前記４種の消化物の個々における単一サイズのフラグメントに対してハイブリダイズし、この事は、pepC遺伝子がＡ．オリザエIFO4177 において単一コピーで存在することを示す。
【００６９】
4.5〜5.5kb のサイズのBamHＩフラグメントを含む、Ａ．オリザエゲノムDNA の部分的ライブラリーを構成し、そしてベクターpIC19H中に連結した。上記Ａ．ニガーpepC遺伝子クローンを放射性ラベルし、そして部分的Ａ．オリザエBamHＩゲノムライブラリーをプローブするために使用した。ハイブリダイゼーションを、上記のようにして実施した。約4000のＥ．コリコロニーをスクリーンし、そして４種の陽性コロニーを得た。
【００７０】
前記４種のクローンは、制限酵素消化により同じであることが示された。 4.6kbの挿入体を有する、pJaL235(図５）と称するそれらのクローンの１つを、制限マッピング及びサザンブロットによりさらに分析した。これは、pepC遺伝子が、 2.9kbのBamHＩ／ SalＩフラグメントに位置することを示す。 2.9kbのBamHＩ／ SalＩフラグメントの配列決定は、イントロンスプライシングを示すコンセンサス配列と共に２個のイントロンにより中断される 495個のアミノ酸の長い読取り枠の存在を示す。Ａ．オリザエpepC遺伝子の配列は、配列番号３に示される。
【００７１】
反復された配列を端に有するＡ．オリザエpyrG遺伝子の構成
ヌクレオチド配列の３’末端がpSO2における位置７−26に対応し（下線）、そして５’−末端がクローニングを促進せしめるためである(BglII制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）プライマー＃7659（5'-GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC)、及びヌクレオチド配列番号の３’末端がpSO2における位置 385−407 に対応し（下線）、そして５’−末端がクローニングを促進せしめるためである（EcoRＩ及びHindIII 制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）プライマー＃7656（5'-GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC) によるPCR によって、 432bpのフラグメントを増幅した。そのフラグメントを BglII及びEcoRＩにより消化し、そしてゲル電気泳動により単離し、精製し、そしてpSO2におけるその対応する部位中にクローン化し、プラスミドpJaL335 をもたらした（その構成は図６に概略されている）。
【００７２】
Ａ．オリザエpepC破壊プラスミドの構成
プラスミドpJaL235 を PvuＩにより消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブラント化し、そして次に、HindIII により消化した。 2.6kbのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。 2.6kbのフラグメントを、 SmaＩ及びHindIII により消化されたpUC12 中にクローン化し、プラスミドpJaL308 を得た。
プラスミドpJaL308 を SamＩにより消化し、そして製造業者の説明書に従って、５’リン酸基を除去するために細菌性アルカリホスファターゼにより処理し、そしてフェノール抽出し、そして沈殿せしめた。
【００７３】
プラスミドpSO2をHindIII により消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブライン化した。Ａ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.8kbのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。
２つのフラグメントを一緒に混合し、そして連結した。Ｅ．コリの形質転換の後、正しいプラスミドを担持するコロニーを、ミニプラスミド調製物の制限酵素消化により同定した。pJaL363 の構成は図７に示される。
プラスミドpJaL363 は、EcoRＩ部位及びHindIII を端に有するpepC遺伝子を担持し、そして前記pepCがＡ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.8kbのDNA フラグメントにより中断されているフラグメントを含むpUC12 ベクターから成る。
【００７４】
プラスミドpJaL335 をHindIII により消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブラント化した。Ａ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.5kbのフラグメントをゲル電気泳動により単離し、そして精製する。そのフラグメントを、pJaL308 の SmaＩ制限部位中にクローン化する。pJaLz の構成は図８に概略されている。そのプラスミドは、EcoRＩ部位及びHindIII を端に有するpepC遺伝子を担持し、そして前記pepCがＡ．オリザエpyrG遺伝子をコードする 3.5kbのDNA フラグメントにより中断されているフラグメントを含むpUC12 ベクターから成る。
【００７５】
Ａ．オリザエ株How B101の形質転換
破壊プラスミドのいづれか１つ（15μｇ）を、HindIII 及びEcoRＩにより完全に消化する。消化の完結を、ゲル上でアリコートを処理することによって調べ、そしてDNA の残りをフェノール抽出し、沈殿せしめ、そして滅菌水10μｌに再懸濁する。
【００７６】
Ａ．オリザエHow B101宿主株の形質転換を、プロトプラスト方法（Christensen など. Biotechnology (1988) 6 : 1419-1422) により行なう。典型的には、Ａ．オリザエ菌糸体を栄養に富んだブイヨンにおいて増殖する。菌糸体を濾過によりブイヨンから分離する。酵素調製物NovozymeＲ（Novo Nordisk) を、浸透圧的に安定した緩衝液、たとえばリン酸ナトリウムによりpH5.0 に緩衝された 1.2ＭのMgSO４ における菌糸体に添加する。その懸濁液を、撹拌しながら、37℃で60分間インキュベートした。プロトプラストを、mira−布を通して濾過し、菌糸体残骸を除去する。プロトプラストを収穫し、そしてSTC (1.2Ｍのソルビトール、10mMのCaCl２, 10mM のトリス−HCl, pH7.5) により２度洗浄する。最終的に、プロトプラストを200〜1000μｌのSTC に再懸濁する。
【００７７】
形質転換のために、DNA ５μｇを、プロトプラスト懸濁液 100μｌに添加し、そして次に、PEG 溶液（60％ PEG 4000, 10mM のCaCl2, 10mM のトリス−HCl, pH7.5) 200μｌを添加し、そしてその混合物を室温で20分間インキュベートする。プロトプラストを収穫し、そして 1.2Ｍのソルビトールにより２度洗浄する。最後に、プロトプラストを 1.2Ｍのソルビトール 200mlに再懸濁し、選択プレート（最少培地＋10ｇ／ｌの Bacto−寒天（Difco)）上にプレートし、そして37℃でインキュベートする。37℃での増殖の３〜４日後、安定した形質転換体は、激しく増殖し、そして胞子形成するコロニーとして出現する。
【００７８】
pepC欠失株の同定
安定したコロニーから、個々の胞子を、新鮮な最少プレート上に画線培養する。単一のコロニーを選択し、そして再画線培養し、純粋な培養物を得る。それらを用いて、10mlの液体YPM 培地（１％の酵母抽出物、１％のペプトン、２％マルトース）を接種する。180rpmで振盪しながら30℃で18時間の後、菌糸体をフィルター紙上に収穫する。次に、菌糸体を２mlのEppendorf 管に移し、そして凍結乾燥せしめる。凍結乾燥の後、DNA を個々の菌糸体から、その菌糸体を管において乳棒により細かな粉末に粉砕することによって調製する。
【００７９】
この粉末を、50mMのEDTA, pH8.0, 0.2％のSDS ，１μｌのDEP の溶液 0.5mlに再懸濁する。それらを65℃で20分間インキュベートする。この後、５ＭのKAc (pH6.5) 0.1ml を添加し、その溶液を混合し、そして氷上で５分間インキュベートする。細胞残骸を、20,000rpm で５分間の遠心分離によりDNA 溶液から分離し、 0.4mlの上清液を 0.3mlのイソプロパノールにより沈殿せしめ、そして20,000rpm で10分間、遠心分離する。DNA ペレットを、 0.1mg／mlのRNアーゼＡを含む無菌TE緩衝液 100μｌに再溶解する。
【００８０】
個々のDNA ３μｇをEcoRＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により分別し、 Immobilan−Ｎ膜フィルターに移し、そしてpepCプロテアーゼ遺伝子の一部を含むpJaL335 からの 1.5kbの32Ｐ−ラベルされた NcoＩ DNAフラグメントによりプローブする。pepCの破壊を担持する株は、 3.6kb上の野生型バンドが形質転換体における7.4kbのバンドにシフトされることにより容易に認識される。
【００８１】
破壊されたＡ．オリザエpepC株を、５−フルオロ−オロト酸に対する耐性の自発的変異体、すなわちpyrG変異体の特徴的な表現型を選択することによって、pyrG− にする。pyrG変異体であるためには、株は増殖のためにウリジンを必要とする。その株は、ウリジンなしに増殖する能力についての選択によりwt pyrG 遺伝子により形質転換され得る。
【００８２】
例３．アスペルギラスオリザエareAΔ株の構成
areAΔ株を次の通りにして構成した。Ａ．オリザエからのareA遺伝子をクローン化した。pepC又はpepE、又はpepC及びpepEのいづれかを欠失するpyrG- 株を、areA遺伝子から上流の及び下流のDNA フラグメント間に挿入されるpyrG遺伝子を担持するプラスミドにより形質転換した。areAのためのコード領域は、プラスミド上に存在しなかった。形質転換体を、ウリジンの不在及びクロレートの存在下で増殖するそれらの能力について選択した。この二重選択は、機能的pyrG遺伝子及びareA- の両者について選択する。この選択方法により得られた株を、最終的に、サザン分析によりスクリーンし、染色体areA遺伝子がpyrG遺伝子により置換されている株を同定した。
【００８３】
areA遺伝子のクローニング
Ａ．オリザエareA遺伝子を、Ａ．ニジュランスareA遺伝子に対する交差ハイブリダイゼーションによりクローン化した（B. Kudlaなど., EMBO J. 9 : 1355-1364 (1990））。Ａ．オリザエIFO4177 のゲノムライブラリーを、 SauIII Ａによる染色体DNA の部分消化、及びその得られたDNA フラグメントのベクター１ GEM−II（Promega から得られる）中へのクローニングにより調製した。Ａ．ニジュランスareA遺伝子によるライブラリーの交差ハイブリダイゼーションを、40％ホルムアミドにおいて37℃で実施した。
【００８４】
ハイブリダイジング１クローンを単離し、そしてそれらからのフラグメントを、ベクターpBluescript SK+ (Stratagene から得られる）中にサブクローン化し、図９に示されるプラスミドpSK5及びpSK9を生ぜしめた。クローン化された遺伝子は、それが実際、Ａ．オリザエareA相同体である場合、Ａ．ニジュランスareA変異体を補足することができた。クローンの5643bpを配列決定し、そしてＡ．オリザエ及びＡ．ニジュランスareA遺伝子の配列の比較は、それらが高い相同性であることを示す。Ａ．オリザエareA遺伝子の配列は、配列番号５に示される。
【００８５】
areA欠失プラスミドの構成
Ａ．オリザエ染色体からareA遺伝子を欠失するために、プラスミドpToC266 を構成した。pToC266 は、areA遺伝子の上流に起因する 2.1kbのDNA フラグメント（pSK5から単離された）、及びareA遺伝子の下流に起因する 1.4kbのDNA フラグメント（pSK9から単離された）を含む。それらの２種のフラグメントは、ゲノムにおいて約 3.2kbにより分離され、コード領域は遺伝子のこの部分に位置する。pJers4からのＡ．オリザエpyrG遺伝子を、areA上流及び下流DNA フラグメント間に挿入した。pToC266 の構成は図10ａ及び10ｂに示される。pToC266 は、ユニークEcoRＩ部位を有し、そして形質転換に使用される前、この制限酵素により切断することによって線状化された。
【００８６】
Ａ．オリザエareA株の選択
pepC又はpepE、又はpepC＋pepEのいづれかを欠失しているpyrG− 株を、線状化されたpToC266 により形質転換する。形質転換体を、窒素源としてグルタミン及び炭素源としてグルコースを含む最少プレート（Cove Biochem. Biophy. Acta (1966) 113 : 51-56)上で選択する。形質転換体を、同じタイプのプレート上で２度、再単離し、そして次に、異なった窒素源上での増殖試験にゆだねる。グルタミン上で良く増殖するが、しかし硝酸塩、アンモニア又は尿素上では増殖しない形質転換体は、areAを欠失していることが予測される。欠失は、サザン分析により確かめられる。
【００８７】
例４．pMT1606 の構成
Ａ．オリザエTAKA−アミラーゼプロモーターの後に挿入されるストレプトマイセス ヒグロスコピカスからのbar 遺伝子（C. J. Thompsonなど, EMBO J. 6 : 2519-2523 (1987)）、続いて、Ａ．ニガーgla 遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルを含むフラグメントを含むプラスミドを構成した。
【００８８】
プラスミドpMT1606 を、Ａ．オリザエのグルホシネート耐性形質転換体の選択のために使用することができる。pMT1606 を、プラスミドpBP1T (B. Straubinger など, Fungal Genetics Newsletter 39 : 82-83 (1992)) からbar 遺伝子を単離し、そしてヨーロッパ特許公開第0 098 993 A1号に記載される菌類発現プラスミドp775中にそれをクローニングすることによって構成した。図11は、pMT1606 の構成を示す。
【００８９】
例５．Ａ．オリザエ（areAΔ，pepEΔ，pepC- ）におけるキモシンの生成
Ａ．オリザエareAΔ，pepEΔ，pepC- 株を、哺乳類酵素キモシンのための菌類発現プラスミドであるプラスミドpToC56（図12）と共に、pMT1606 による同時形質転換により形質転換する。プラスミドpToC56の構成は、ヨーロッパ特許公開第098993号に記載される。
形質転換体を、10mMのアンモニウム及び１mg／mlのグルホシネートを含む最少培地上での増殖により選択し、そしてキモシンを生成する能力によりpToC56の存在についてスクリーンする。形質転換体を、マルトデキストリン及びグルタミンを含む最少培地を有する振盪フラスコにおいて30℃で４日間、増殖する。上清液におけるキモシンの含有量を、 SDS−PAGE及びウェスターンプロットにより分析した。
【００９０】
例６．Ａ．オリザエにおけるPepCの生成
pepCのための発現プラスミドの構成。プラスミドpJaL235 を AatII及び NsiＩにより消化し、そしてクレノウポリメラーゼにより処理し、末端をブラント化した。 1.7kbのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。その 1.7kbのフラグメントを、 SmaＩにより消化されたpIC19H中にクローン化し、pJaL365 を付与した。
【００９１】
プラスミドpJaL365 を、BamHＩ及び XhoＩにより消化し、そして 1.7kbのフラグメントをゲル電気泳動により単離し、そして精製した。その 1.7kbのフラグメントを、BamHＩ及び XhoＩにより消化されたpToC68中にクローン化し、pJaL368 を付与した（図13ａ及び13ｂ）。
【００９２】
Ａ．オリザエ株を、プロテアーゼPepCのための菌類発現プラスミドであるプラスミドpJaL368 と共に、pToC90による同時形質転換により形質転換する。
形質転換体を、10mMのアセトアミドを含む最少培地上での増殖により選択し、そしてプロテアーゼPepCを生成する能力によりpJaL368 の存在についてスクリーンする。
【００９３】
例７．pepEの過剰発現
Ａ．オリザエからのTAKA−アミラーゼプロモーターに融合されるpepE遺伝子を担持するpToC338 と称するプラスミドを構成した。図14ａ及び14ｂは、その構成を示す。
コード領域のほとんど及び３’未翻訳領域の約 430bpを含むpToC299 からのEcoRＩ／ SalＩフラグメントを、次の配列の合成DNA フラグメントと一緒に、EcoRＩ／BamHＩ切断のpUC19 中にクローン化した：
8681 GATCCACCATGAAG
8747 GTGGTACTTCAGCT
【００９４】
pToC334 と称するその得られるプラスミドを、BamHＩ／EcoRＩにより切断し、そして開始コドンのすぐ上流に融合されるBamHＩ部位と共にpepE遺伝子の完全な構造遺伝子を含むフラグメントを単離し、約 430bpの未翻訳３’配列がまた、そのフラグメントに存在した。前記フラグメントを、Ａ．オリザエからのTAKA−アミラーゼプロモーターを含むプラスミドp775からの約 1.1kbの SalＩ／BamHＩフラグメントと一緒に、EcoRＩ／ SalＩ切断pUC19 中にクローン化した。その得られるプラスミドを、pToC338 と命名した。
【００９５】
pToC338 を、Ａ．ニジュランスアセトアミダーゼ（amdS) 遺伝子を含むpToC90と共に、Ａ．オリザエpJaL125(デンマーク特許出願第 0354196号に記載されるＡ．オリザエ alp− 株）中に、標準の方法（たとえば、ヨーロッパ特許第0 098 993 A1号に記載されるような）を用いて、同時形質転換した。形質転換体を、単一の窒素源としてアセトアミドを使用するそれらの能力により選択した。11の形質転換体を、菌糸体を通して２度、再単離した。形質転換体を、10mlのYPM(２％のマルトースを含むYP）において30℃で３日間、発酵せしめ、そしてその発酵ブイヨンを SDS−PAGEにより分析した。
【００９６】
形質転換体の１つは、pepE遺伝子によりコードされるタンパク質と同じサイズのタンパク質を生成し、そしてプロテアーゼ活性の測定は、その形質転換体からのブイヨンが、宿主株JaL125に比較して、pH＝5.5 でカゼインに対して高い活性を含むことを確認した。タンパク質を精製し、そしてＮ−末端配列決定は、それが実際、pepE遺伝子によりコードされるタンパク質であることを示した。分泌されたタンパク質のＮ−末端は次の通りであった：
gly＊ -arg-his-asp-val-leu-val-asp-asn-phe-leu-asn-ala-gln-tyr-phe-ser-glu-ile-glu-ile-gly-thr-pro-pro-gln-lys-phe-lys。
＊ の残基はまた、リシンでもあり得る。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、HowB101 の構成に関与する段階を示す。
【図２】図２は、pToC345 の構成を示す。
【図３】図３は、pToC315 の構成に関与する段階を示す。
【図４】図４は、pyrG遺伝子の２段階遺伝子欠失を図的に示す。
【図５】図５は、pJaL235 の構成を示す。
【図６】図６は、pJaL335 の構成に関与する段階を示す。
【図７】図７は、pJaL363 の構成に関与する段階を示す。
【図８】図８は、pJaLz の構成に関与する段階を示す。
【図９】図９は、pSK5及びpSK9の構成を示す。
【００９８】
【図１０ａ】図10ａは、pToC243の構成に関与する段階を示す。
【図１０ｂ】図10ｂは、pToC266 の構成に関与する段階を示す。
【図１１】図11は、pMT1606 の構成に関与する段階を示す。
【図１２】図12は、pToC56の構成を示す。
【図１３ａ】図13ａは、pJaL365の構成に関与する段階を示す。
【図１３ｂ】図13ｂは、pJaL368 の構成に関与する段階を示す。
【図１４ａ】図14ａは、pToC334の構成に示す。
【図１４ｂ】図14ｂは、pToC338 の構成に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載にアミノ酸配列、又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、そしてPepEプロテアーゼの活性を維持しているタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のPepEプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質の製造方法において、当該タンパク質をコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、そして培養物から前記タンパク質を採取することを特徴とする方法。
【請求項４】
配列番号：４に記載にアミノ酸配列、又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、そしてPepCプロテアーゼの活性を維持しているタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のPepCプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項６】
請求項４に記載のタンパク質の製造方法において、当該タンパク質をコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、そして培養物から前記タンパク質を採取することを特徴とする方法。
【請求項７】
前記宿主が、areA遺伝子が機能的AreA活性化因子を供給するような態様で発現され得ないように、組換えDNA 技法により修飾されており、そして細胞外プロテアーゼPecC及び／又はPepEをコードする遺伝子が、機能的プロテアーゼを生成するために発現され得ない態様で不活性化されている菌類である請求項３又は６記載の方法。
【請求項８】
前記宿主がアスペルギルス・オリザエであり、そしてPepC又はPepEプロテアーゼをコードする遺伝子の余分なコピーを含む、請求の範囲第３、６又は７項記載の方法。
【請求項９】
前記不活性化が、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子のすべて又は一部の欠失により得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記不活性化が、areA及びpepE遺伝子のすべて又は一部の欠失により得られる請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記不活性化が、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによって得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１２】
前記不活性化が、areA及びpepE遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによって得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１３】
前記不活性化が、アンチセンス技法を用いることによって得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１４】
前記不活性化が、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の内部に余分のDNA を挿入することによって得られる、請求７又は８記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主が糸状菌である、請求項３及び６〜14のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記糸状菌が、アスペルギラス、トリコダーマ、ヒュミコラ、カンジダ、アクレモニウム、フサリウム及びペニシリウムから成る群から選択された属に属する請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記糸状菌が、Ａ．オリザエ、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリ、Ａ．ホエニシス、Ａ．ジャポニカス、Ａ．ホエチダス、Ａ．ニジュランス、Ｔ．リーセイ、Ｔ．ハルジアナム、Ｈ．インソレンス、Ｈ．ラヌギノサ、Ｆ．グラミネアラム、Ｆ．ソラニ、Ｐ．クリソゲナム及び他のものから成る群から選択された種に属する請求項16記載の方法。
【請求項１】
配列番号：２に記載にアミノ酸配列、又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、そしてPepEプロテアーゼの活性を維持しているタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のPepEプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質の製造方法において、当該タンパク質をコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、そして培養物から前記タンパク質を採取することを特徴とする方法。
【請求項４】
配列番号：４に記載にアミノ酸配列、又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、そしてPepCプロテアーゼの活性を維持しているタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のPepCプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項６】
請求項４に記載のタンパク質の製造方法において、当該タンパク質をコードするDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、そして培養物から前記タンパク質を採取することを特徴とする方法。
【請求項７】
前記宿主が、areA遺伝子が機能的AreA活性化因子を供給するような態様で発現され得ないように、組換えDNA 技法により修飾されており、そして細胞外プロテアーゼPecC及び／又はPepEをコードする遺伝子が、機能的プロテアーゼを生成するために発現され得ない態様で不活性化されている菌類である請求項３又は６記載の方法。
【請求項８】
前記宿主がアスペルギルス・オリザエであり、そしてPepC又はPepEプロテアーゼをコードする遺伝子の余分なコピーを含む、請求の範囲第３、６又は７項記載の方法。
【請求項９】
前記不活性化が、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子のすべて又は一部の欠失により得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記不活性化が、areA及びpepE遺伝子のすべて又は一部の欠失により得られる請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記不活性化が、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによって得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１２】
前記不活性化が、areA及びpepE遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによって得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１３】
前記不活性化が、アンチセンス技法を用いることによって得られる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１４】
前記不活性化が、areA, pepC及び／又はpepE遺伝子の内部に余分のDNA を挿入することによって得られる、請求７又は８記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主が糸状菌である、請求項３及び６〜14のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記糸状菌が、アスペルギラス、トリコダーマ、ヒュミコラ、カンジダ、アクレモニウム、フサリウム及びペニシリウムから成る群から選択された属に属する請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記糸状菌が、Ａ．オリザエ、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリ、Ａ．ホエニシス、Ａ．ジャポニカス、Ａ．ホエチダス、Ａ．ニジュランス、Ｔ．リーセイ、Ｔ．ハルジアナム、Ｈ．インソレンス、Ｈ．ラヌギノサ、Ｆ．グラミネアラム、Ｆ．ソラニ、Ｐ．クリソゲナム及び他のものから成る群から選択された種に属する請求項16記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【公開番号】特開２００７−２６７７５２（Ｐ２００７−２６７７５２Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５５７１５（Ｐ２００７−１５５７１５）
【出願日】平成１９年６月１２日（２００７．６．１２）
【分割の表示】特願平９−５２２４３０の分割
【原出願日】平成８年１２月１６日（１９９６．１２．１６）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１２日（２００７．６．１２）
【分割の表示】特願平９−５２２４３０の分割
【原出願日】平成８年１２月１６日（１９９６．１２．１６）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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