ｂｃｌ−ＸＬタンパク質レベルを調節することによる、Ｔ細胞生存の調節法
【課題】Ｔ細胞を細胞死から防御する。
【解決手段】本発明は、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法を提供する。この方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する作用物質と接触させて、Ｔ細胞を細胞死から防御することを含んでなる。本発明は、さらに、細胞死に対するＴ細胞の感受性を増大させる方法を提供し、Ｔ細胞を、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する少なくとも１つの作用物質と接触させることを含む、インビトロ法およびインビボ法の両方を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法を提供する。この方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する作用物質と接触させて、Ｔ細胞を細胞死から防御することを含んでなる。本発明は、さらに、細胞死に対するＴ細胞の感受性を増大させる方法を提供し、Ｔ細胞を、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する少なくとも１つの作用物質と接触させることを含む、インビトロ法およびインビボ法の両方を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
bcl−ＸＬタンパク質レベルを調節することによる、Ｔ細胞生存の調節法
政府支持
本明細書に記載した研究は、ＮＩＨ認可ＰＯ１ＡＩ３５２９４およびＮＭＲＤＳ認可６１１５３ＮＡＥ.４１２０.００１.１４０２により一部支持されている。従って、米国政府は、本発明の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
末梢血Ｔ細胞生存の制御は、効果的な末梢性免疫レパトアーの維持に重要である。Ｔ細胞生存の幾つかの態様は、Ｔ細胞活性化の状態と関連しているようである。Ｔ細胞活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチド−抗原によるＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体（ＴＣＲ／ＣＤ３）の結合により開始される（Schwartz,R.H.(1990)Science 248,1349）。これはＴ細胞活性化の一次シグナルであるが、ＡＰＣとＴ細胞との間のその他の受容体リガンド相互作用が完全な活性化には要求される。例えば、他の分子相互作用なしでのＴＣＲ刺激は、アネルギー状態を誘発することがあり、そのため、これらの細胞は、再刺激時に完全な活性化シグナルに応答できない（Schwartz,R.H.(1990)Science 248,1349；Harding,F.A.,McArthur J.G.,Gross,J.A.,Raulet,D.H.,およびAllinson,J.P.(1992)Nature 356,607）。また、Ｔ細胞は、ＴＣＲ結合（engagement）のみにより活性化される時、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）により死滅することが示されている（Webb,S.,Morris,C.,およびSprent,J.(1990)Cell 63,1249;Kawabe,Y.,およびOchi,Ａ.(1991）Nature 349,245;Kabelitz,D.,およびWesselborg,S.(1992)Int.Immunol 4,1381;Groux,H.,Monte,D.,Plouvier,B.,Capron,A.,およびAmeisen,J-C(1993)Eur.J.Immunol.23,1623）。
【０００３】
Ｔ細胞とＡＰＣの間には複合的な受容体−リガンド相互作用が起こる。多くの相互作用は、自然に密着したものであり、かつ２つの細胞間の接触を強化するものである（Spinger,T.A.,Dustin,M.L.,Kishimoto,T.K.,およびMarlin,S.D.(1987)Annual,Rev.Immunol.5,223）のに対し、その他の相互作用はＴ細胞に更なる活性化シグナルを形質導入するものである（Bierer,B.E.,およびBurakoff,S.J.(1991)Adv,Cancer Res.56,49）。ＣＤ２８は、ヒトの末梢Ｔ細胞の８０％に存在する表面糖タンパク質であり、重要な共刺激性（コスティミュラトリー）受容体であることが示されている（June,C.H.,Bluestone,J.A.,Nadler,L.M.およびThompson,C.B.(1994)Immunol.Today 15,321;Linsley,P.S.Ledbetter，J.A.(1993)Annu.Rev.Immunol.11,191）。コスティミュラトリー・シグナルは、Ｔ細胞がＣＤ２８リガンドＢ７−１またはＢ７−２のいずれかを発現する抗原提示細胞と遭遇するときにＣＤ２８を介して形質導入される。
【０００４】
Ｔ細胞の共刺激（コスティミュレーション）は、Ｔ細胞活性化の多くの態様に影響を与えることが示されている（June,C.H.,Bluestone,J.A.,Nadler,L.M.およびThompson,C.B.(1994)Immunol.Today 15,321)。共刺激は、培養物中の増殖応答を誘導するのに必要な抗ＣＤ３の濃度を低減させる（Gimmi,C.D.Freeman,G.J.,Gribben,J.G.,Sugita,K.,Freedman,A.S.,Morimoto,C.,およびNadler,L.M.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,6575)。ＣＤ２８共刺激はまた、遺伝子発現の転写調節および転写後調節を介するヘルパーＴ細胞によるリンパ球産生を著しく高め(Lindsten,T.,June,C.H.,Ledbetter,J.A.,Stella,G.,およびThompson,C.B.(1989)Science 244，339;Fraser,J.D.,Irving,B.A.,Crabtree,G.R.,およびWeiss,A.(1991)Science 251,313)、細胞毒性Ｔ細胞の細胞溶解能を活性化し得る。ＣＤ２８共刺激をインビトロで阻害することにより、異種移植片拒絶を遮断でき、また同種移植片拒絶が顕著に遅延する（Lenschow,D.J.,Zeng,Y.,Thistlethwaite,J.R.,Montag,A.,Brady,W.，Gibson,M.G.,Linsley,P.S.,およびBluestone,J.A.,(1992)Science257,789;Turka,L.A.,Linsley,P.S.,Lin,H.,Brady,W.,Leiden,J.M.Wei,R-Q.,Gibson,M.L.,Zheng,X-G.,Mydral,S.,Gordon,D.,Bailey,T.,Bolling,S.F.,およびThompson,C.B.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11102)。更に、腫瘍細胞系列へのＢ７のトランスフェクションにより、腫瘍増殖の認識および防止が容易になる（Chen,L.,Ashe,S.,Brady,W.A.,Hellstrom,I.,Hellstrom,K.e.,Ledbetter,J.A.,McGowan,P.,およびLinsley P.S.(1992)Cell 71,1093;Townsend,S.E.,およびAllinson,J.P.(1993)Science 259,368)。
【０００５】
最近まで、Ｔ細胞生存がどのように制御されているかについてほとんど知られていなかった。各研究により、Ｔ細胞のマイトジェン活性化が、放射能などの作用物質での処理により開始されるプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）に対するその耐性を強化することが示された（Schrek,R.およびStefani,S.(1964)J.Nat.Cancer Inst.32,507;Lowenthal,J.W.およびHarris,A.W.(1985)J.Immunol.135,1119;Stewart,C.C.,Stevenson,A.P.,およびHabbersett,R.C.(1988)J.Radiat.Biol.53,77)。反対に、ＴＣＲのみによるＴ細胞活性化は、ＰＣＤを被るＴ細胞の感受性を増大させることが報告されている（Kabelitz,D.,およびWesselborg,S.(1992）Int.Immunol 4.1381;Groux,H.,Monte,D.,Plouvier,B.,Capron,A.,およびAmeisen,J-C(1993),Eur.J.Immunol.23,1623）。
【０００６】
近年、Ｔ細胞生存を調節する役割を果すと思われる数種の遺伝子が同定された。マウスにおける休止リンパ球の生存は、bcl−２遺伝子の発現に依存する（Nakayama,K-I.,Nakayama,K.,Negishi,I.,Kuida,K.,Shinkai,Y.,Louie,M.C. Fields,L.E.,Lucas,P.J.Stewart,V.,Alt,F.W.,およびLoh,D.Y.(1993）Science 261,1584）。bcl−２遺伝子を欠く動物は、培養したときにＰＣＤを被る感受性の高いＴ細胞を有する。Ｂcl−２欠損動物は寿命の最初の数週間以内に深刻なリンパ球減少状態になる（Veis,D.J.,Sorenson,C.M.,Shutter,J.R.,およびKorsmeyer,S.J.(1993a)Cell 75,229)。反対に、Fas細胞表面受容体に突然変異を持つ動物は、免疫応答過程に産生される過剰な免疫細胞を除去できない（Watanabe-Fugunaga,R.,Brannan,C.I.Copeland,N.G.,Jenkins,N.A.,およびNagata,S.(1992)Nature 356,314)。Ｆas欠損動物は、最終的に深刻な自己免疫疾患を発症する。これらのデータは、Ｔ細胞生存が、Ｔ細胞増殖と同じく厳密に調節され得ることを示している。
【０００７】
Ｔ細胞死を不適切に調節すると免疫系異常（例えば、免疫不全または自己免疫）を引き起こすこともある。更に、Ｔ細胞がある種の感染性微生物に感染するとＴ細胞は殺傷される。特に、Ｔ細胞がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染するとプログラムされた細胞死により誘発される細胞死が起こる。したがって、Ｔ細胞死を制御する方法および特に、そのような死を阻害する方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００８】
概要
本発明は、Ｔ細胞生存を調整する方法、特に、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法を提供する。本発明の方法は、少なくともその一部で、Ｔ細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８による）がＴ細胞中のタンパク質bcl−ＸＬの産生増大およびＴ細胞生存強化をもたらすという発見に基づくものである。更に、その他の手段（例えば、Ｔ細胞へのbcl−ＸＬ遺伝子のトランスフェクション）によるＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の産生増大もまた、Ｔ細胞生存強化をもたらす。したがって、Ｔ細胞を細胞死から保護するために、本発明の方法に従い、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を増大して、Ｔ細胞生存を強化する。
【０００９】
一実施態様では、Ｔ細胞生存を、Ｔ細胞をbcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する作用物質と接触させることにより強化する。本方法の好ましい実施態様では、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入することにより増大する。本方法の別の実施態様では、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞を、細胞内に作用して内生bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する作用物質と接触させることにより増大する。bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大するその他の好ましい作用物質は、Ｔ細胞表面上の分子と相互作用する物質である。本発明の方法は、増大したまたは不適切なＴ細胞死に関連する異常または症状、例えば、ＨＩＶによるＴ細胞感染、を処置するのに有用である。本方法は、また、Ｔ細胞生存を強化し、それによって、免疫反応を刺激する、例えば、病原性微生物の排除を加速する、のにも有用である。
【００１０】
本発明は、Ｔ細胞死を誘導する、またはＴ細胞を細胞死に対して感受性にする方法にも関連する。これらの方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する作用物質と接触させることを含む。これらの方法は、免疫反応をダウンレギュレーションするのに有用である。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、γ−照射（パネルＢ）前、または未処理（パネルＡ）のままで、培地のみ（白抜き四角)、抗ＣＤ３の存在下（白抜き菱形)、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の存在下（黒塗り四角）で１２時間Ｔ細胞をインキュベーション後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００１２】
図２Ａ−Ｄは、γ−照射（パネルＢおよびＤ）前、または未処理（パネルＡおよびＣ）のままで、抗ＣＤ３のみ（パネルＡおよびＢ）または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（パネルＣおよびＤ）と共に１２時間Ｔ細胞をインキュベーションし、その後、それらをならし培地に残す（白抜き四角)か、洗浄して新たな培地に懸濁する（白抜き菱形)か、または洗浄して２００Ｕ／mlのrＩＬ−２を加えた新たな培地に懸濁した（黒塗り四角）後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００１３】
図３パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれ、培地のみ（ＭＥＤ）でインキュベーションするか、抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）の存在下で１、６または１２時間インキュベーションするか、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）の存在下でインキュベーションしたＴ細胞中でのbcl−ＸＬ発現、bcl−２発現およびＨＬＡ発現のレベルを示すノーザン・ブロットを表す。パネルＡは、非変性アガロースゲルでの電気泳動後に各ＲＮＡ試料のアリコートをエチジウムブロマイド染色したものを示す。
【００１４】
図３Ｅは、単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６または１２時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６または１２時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびbcl−ＸＳタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００１５】
図４は、単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６、１２または２４時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６１２、または２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびＢcl−２タンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００１６】
図５は、培地単独で（Medium）または抗ＣＤ２８（αＣＤ２８）、抗ＣＤ３（αＣＤ３）、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（αＣＤ３／αＣＤ２８）、または抗ＣＤ３＋ＩＬ−２（１００units／ml)(αＣＤ３／ＩＬ−２）の存在下、２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００１７】
図６は、培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。パネル下部は、培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションし、抗Fas抗体を添加してさらに２４時間インキュベーションしたＴ細胞の生存能力パーセントを示す。
【００１８】
図７Ａ−Ｂは、抗Fas抗体（αFas、パネルＡ）または抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３、パネルＢ）で処理後０、１２、２４、４８および７２時間でbcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミドでトランスフェクションさせたJurkatクローンの生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００１９】
図７パネルＣは、bcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミド（Neoクローン１、２および３）でトランスフェクションさせたJurkatクローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウェスタン・ブロットの写真である。
【００２０】
図７パネルＤは、ＩＬ−２回収後０、１２、２４、３６および４８時間でbcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローンの生存パーセントのグラフ表示である。
【００２１】
図７パネルＥは、bcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００２２】
図８は、培地単独で、抗ＣＤ３の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下、および抗ＣＤ３およびＣＴＬＡ４Ｉgの存在下、２４時間インキュベーションしたマウスリンパ節細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００２３】
図９は、bcl−ＸＬ発現ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均bcl−ＸＬ）、または対照ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均neo）でトランスフェクションし、さまざまな量のＨＩＶで感染させたJurkat細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００２４】
図１０パネルＡ−Ｄは、ＰＷＭ（パネルＡおよびＢ）でまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ３／ＣＤ２８、パネルＣおよびＤ）で０、２４、４８または７２時間処理した対照およびＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣにおいて、アポトーシスを被った細胞の割合（％アポトーシス）およびbcl−Ｘタンパク質を発現する細胞の割合（％bcl−ｘ）のグラフ表示である。
【００２５】
詳細な説明
本発明はＴ細胞の生存を調節する方法を提供する。好ましい実施態様において、Ｔ細胞を細胞死から防御する。細胞死からＴ細胞を防御する本発明方法は、Ｔ細胞の生存を強化するように、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する少なくとも一つの作用物質でＴ細胞を処理することを含む。本発明の一つの実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する物質はbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸であって、これはＴ細胞中へ導入されると発現する。本発明の他の実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルは、例えば外来bcl−ＸＬ遺伝子からのbcl−ＸＬタンパク質産生を増大せしめる少なくとも一つの作用物質とＴ細胞を接触させることによりＴ細胞中において増加される。１つの実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する少なくとも一つの作用物質は、ＣＤ２８などのＴ細胞の表面上の分子と相互作用をする作用物質を含む。Ｔ細胞はさらに、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質と接触させ得る。他の実施態様において、少なくとも一つの作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大するために細胞内に作用する物質である。他の実施態様において、本発明は、さらに、Ｔ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルを低下することによりＴ細胞を細胞死に対して感受性にする方法に関する。bcl−ＸＬタンパク質レベルが本発明方法により調節されているＴ細胞は、被験体に存在するＴ細胞またはエクスビボで培養されたＴ細胞であり得る。本発明の方法は、免疫応答の調節、すなわち免疫応答の強化または抑制のために有用である。このように本発明方法は、免疫反応を刺激する（例えば、感染に抵抗する）、あるいは生存寿命が短くなっている（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染などの感染結果として）Ｔ細胞の生存を刺激するなどの数多くの応用性を有する。
【００２６】
bcl−ＸＬがＩＬ−３欠乏誘導化アポトーシスからネズミＩＬ−３依存性前リンパ球細胞系を防御し得ることは、以前から知られている（Ｂoise, H.B. et al.(1993)Cell 74,597 および ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／００６４２）。アポトーシスが個体発生におけるネガティブおよびポジティブセレクションを調節する重要なメカニズムであるので、著者は、Ｔ細胞におけるbcl−ＸＬmＲＮＡレベルを解析した。胸腺細胞も、休止Ｔ細胞も、ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化したＴ細胞も、bcl−ＸＬmＲＮＡを含有していなかった。しかし、胸腺細胞および活性化Ｔ細胞は、アポトーシスに役立つことが示されている（Ｂoise, H.B. et al，後出、およびＰＣＴ出願ＷＯ９５／００６４２）タンパク質bcl−ＸＬをコードするbcl−Ｘ遺伝子の別のスプライス形態、bcl−ＸＳmＲＮＡを含んでいた。これらの結果は、Ｔ細胞個体発生におけるアポトーシス誘導細胞死の制御がbcl−ＸＬタンパク質レベルの制御によるよりもむしろ、bcl−ＸＳタンパク質レベルの制御によって少なくとも部分的には調節されることを示唆している。
【００２７】
本発明は、bcl−ＸＬタンパク質レベルをＴ細胞中で増加する、ヒトbcl−ＸＬをコードする核酸によるＴ細胞のトランスフェクションにより、Ｔ細胞が細胞死から防御されるという発見に少なくとも部分的に基づいている。このようにして修飾されたＴ細胞は、γ−照射、Ｔ細胞受容体架橋、Ｆas架橋および成長因子欠乏などの種々の刺激によって誘導される細胞死から防御される。Ｔ細胞が細胞死から防御され得る、または、細胞死に対し感受性にするように、Ｔ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルを調節する作用物質とＴ細胞とを接触させることによりＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルを調節することは、本発明の一つの目的である。本発明方法は、被験体のＴ細胞、例えば感染への抵抗に関与するＴ細胞の少なくともいくらかの生存を長引かせることを望む症状において医療上有用である。他方、本発明方法は、自己免疫疾患などの、Ｔ細胞の死が望まれる状態においても医療上有用である。
【００２８】
１．細胞死からＴ細胞を防御する方法
本発明方法は、細胞死からＴ細胞を防御することを含む。“Ｔ細胞”は、一般的に認識されているものであって、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図している。Ｔ細胞はＴヘルパー（Ｔｈ）細胞であることができ、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞またはＴ細胞の他のサブセットである。“細胞死からＴ細胞を防御する”なる文言は、Ｔ細胞における細胞死が起きるのを阻害または少なくとも遅延することを含む。細胞死は、なんらかのメカニズムによって細胞死がおきることを含む。細胞死はプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）であって、“アポトーシス”と称することもできる。アポトーシスによるＴ細胞死は、核ヘテロクロマチンの凝縮、細胞の縮小、細胞質の濃縮、およびアポトーシスの後期段階においてはＴ細胞ＤＮＡの分離フラグメントへのエンドヌクレアーゼ仲介切断を含み、これらを特徴とするものである。アポトーシスが起きた細胞のＤＮＡの電気泳動解析では、分離フラグメントの特徴的な“ラダー（ladder）”が見られる。
【００２９】
本発明は、自然に起きる細胞死または細胞中に誘導されたシグナルに起因する細胞死からＴ細胞を防御する方法に関する。例えば、アポトーシスは、普通、Ｔ細胞中の特定のシグナルの誘導からもたらされる。このように本発明の方法は、コスティミュラトリー・シグナルの不在下でＴ細胞受容体の架橋に起因する細胞死からＴ細胞を防御することを提供する。Ｔ細胞受容体の架橋は、抗ＣＤ３抗体などのポリクローナル・アクチベーターにより、あるいは抗原提示細胞上の抗原によって、コスティミュラトリー・シグナルの不在下に（例えばＣＤ２８／ＣＴＬＡ４によるシグナルの不在下において)、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞死をもたらすことが当分野では知られている。
【００３０】
本発明方法は、成長因子減少に起因する細胞死からＴ細胞を防御することも提供する。例えば、Ｔ細胞は増殖にＩＬ−２を必要とし、ＩＬ−２の不在は細胞死をもたらす。このように、本発明方法によりＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質のレベルを増加することは、ＩＬ−２不在における細胞死から正常なＩＬ−２依存性Ｔ細胞を防御する（すなわち、本発明はＩＬ−２の不在下で生存できるＴ細胞を提供する)。本発明の範囲には、Ｔ細胞生存に普通に必要な他の成長因子類、サイトカイン類、リンホカイン類の不在に起因する細胞死からＴ細胞を防御する方法も含まれる。このような因子の例には、インターロイキン類、コロニー刺激因子類およびインターフェロン類がある。
【００３１】
本発明方法はさらに、Ｆasまたは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）架橋に起因する細胞死からＴ細胞を防御することを可能にする。Ｔ細胞上のＦas受容体の架橋がＴ細胞のアポトーシス性細胞死をもたらすことが示されている。ＦasおよびＴＮＦＲタンパク質はかなりの相同性を共有しており、これらは架橋すると細胞死を誘導するタンパク質の拡大ファミリーに属せしめることができる。このように、本発明方法は、このファミリーに属するいかなる受容体の架橋に起因する細胞死からもＴ細胞を防御するのに有用である。
【００３２】
本発明方法はまた、グルココルチコイドなどのある種のホルモン、例えばデキサメタゾンにより誘導される細胞死からＴ細胞を防御する手段を提供する。さらに細胞死は、被験体においてグルココルチコイドレベル上昇を誘導することが知られているストレスの結果としても起こり得る。このように本発明方法は、ストレスを被った被験体に起きるＴ細胞死に対する防御も提供する。
【００３３】
さらに本発明方法は、ＤＮＡ障害剤により誘導される細胞死からＴ細胞を防御することを可能にする。
【００３４】
Ｔ細胞はまたＴ細胞個体発生中に細胞死を被る。Ｔ細胞の増殖および分化の過程は厳密に調節されており、Ｔ細胞のポジティブおよびネガティブセレクションを誘導する。この過程中のＴ細胞生存に影響を与える方法も本発明の範囲内である。
【００３５】
Ｔ細胞死は、Ｔ細胞中のアポトーシス誘導タンパク質、例えば、bcl−ＸＳ，Bad，p５３，c−myc，またはインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）（Savilel,J.(1994) Eur. J.Clin. Investigat. 24,715)の活性によっても生ずる。従って、本発明の範囲内の方法は、これらのタンパク質に関係する細胞死を防御する方法も含む。
【００３６】
１.２.Ｔ細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入することよりなる、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法
【００３７】
本発明の一実施態様では、Ｔ細胞を、その細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入し、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増大させることにより、細胞死から防御する。このbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、Ｔ細胞中で遺伝子を発現させる形態で存在するので、bcl−ＸＬタンパク質がＴ細胞中で産生される。
【００３８】
１.２.１.bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸またはそれらの修飾形態
“bcl−ＸＬをコードする核酸分子”なる用語は、Ｔ細胞中にその核酸分子を導入したときにbcl−ＸＬタンパク質へ転写および翻訳される全ての核酸分子を含むことを意図している（例えば、この分子は、bcl−ＸＬの発現を調節する適当な制御配列をも含み得る)。 このbcl−ＸＬをコードする核酸分子は、対応するbcl−ＸＬ遺伝子のコード領域のみからなるものであってよく、あるいは、例えば５'または３'非翻訳領域、イントロン、それらのフラグメント、または他の配列のような、非コード領域を含むものであってもよい。
【００３９】
bcl−ＸＬタンパク質はbcl−Ｘ遺伝子によってコードされている。分化スプライシングの結果、このbcl−Ｘ遺伝子は２種の異なるmＲＮＡ分子を生成し、そのひとつはbcl−ＸＬ（bcl−Ｘの長い形態に対応）タンパク質をコードし、他のものは小さい方のbcl−ＸＳ（bcl−Ｘの短い形態に対応）をコードしている。このbcl−ＸＳは、bcl−ＸＬタンパク質とは６３アミノ酸ストレッチ（stretch）を欠く点で異なる。この欠失は、bcl−ＸＬに存在する第２コードエクソンを、第１コードエクソン内のより５'末端に近いスプライス供与体へとスプライシングする結果として起こる。このように、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬの発現には、bcl−ＸＬとbcl−ＸＳタンパク質の両方の産生をもたらし得る、bcl−Ｘ遺伝子を含有するゲノムフラグメントよりもむしろ、bcl−ＸＬ ｃＤＮＡを使用する方が好ましい。
【００４０】
ヒトの細胞処理では、bcl−ＸＬをコードする核酸は、他の動物種由来の核酸も本発明の範囲内であるが、ヒト由来のものが好ましい。さらに、bcl−ＸＬ核酸は、その核酸をＴ細胞中に導入したとき、その核酸によってコードされるタンパク質がＴ細胞を細胞死から防御する限り、各種を通して使用できる。本発明の好ましい態様では、bcl−ＸＬタンパク質をコードしている核酸は、ヒトｃＤＮＡ（配列番号１）である。本発明の範囲内であるbcl−ＸＬタンパク質をコードしている核酸は、ＰＣＴ出願国際公開ＷＯ９５／００６４２や下記の文献類に記載されている：Boise et al.(1993) Cell 74,597;およびFang et al.(1994) J. Immunol. 153,4388。さらに、ヒトbcl−ＸＬ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびヒトbcl−ＸＬタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１および２にそれぞれ示してある。この核酸分子は、bcl−ＸＬタンパク質全長をコードするものであってもよく、あるいは、この核酸は、それをＴ細胞中に導入したとき、Ｔ細胞を細胞死から防御するに充分なだけのbcl−ＸＬのペプチドフラグメントをコードしているものであってもよい。この核酸は、天然のbcl−ＸＬまたはそのフラグメントをコードするものであってもよく、あるいは、bcl−ＸＬタンパク質の修飾形態またはそのフラグメントであってもよい。本発明の範囲内である、天然bcl−ＸＬタンパク質の修飾形態は、以下に記載する。
【００４１】
本発明の方法は、Ｔ細胞を細胞死から防御する能力を保持している、bcl−ＸＬタンパク質の各フラグメント、各変異体、または各変種（例えば、修飾形態）の使用を含むことを意図している。“bcl−ＸＬタンパク質の形態”は、天然bcl−ＸＬタンパク質との顕著な相同性を共有し、かつＴ細胞を細胞死から防御し得るタンパク質を意味することを意図している。“bcl−ＸＬタンパク質の形態”は、タンパク質Ｂcl−２を含めることは意図していない。“生物学的に活性なbcl−ＸＬタンパク質”または“bcl−ＸＬタンパク質の生物学的に活性な形態”または“bcl−ＸＬタンパク質の機能的に活性な形態”の用語は、本書中では、Ｔ細胞を細胞死から防御し得る、bcl−ＸＬタンパク質類の各形態を含むことを意味している。当業者は、Ｔ細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入した際に、Ｔ細胞を細胞死から防御する能力に基づき、bcl−ＸＬタンパク質のそのような形態を選ぶことができる。Ｔ細胞を細胞死から防御するbcl−ＸＬの特定形態の能力は、例えば、Ｔ細胞中にbcl−ＸＬの特定形態をコードする核酸をトランスフェクションし、通常、Ｔ細胞中で細胞死が誘発される条件下でＴ細胞にてbcl−ＸＬタンパク質を合成させることにより測定できる。細胞死の導入に際しても、もしbcl−ＸＬの形態を発現するように修飾したＴ細胞集団中での細胞死が、bcl−ＸＬの形態を発現するように修飾していないＴ細胞集団中よりも少なくなれば、bcl−ＸＬタンパク質のその形態は、Ｔ細胞中の細胞死に対して防御効果を有する。細胞死は種々の手段でモニターできる。細胞集団中の細胞死の程度は、例えば、両方の集団中でのＴ細胞の数を、血球計またはコウルター計数器を用いて数えることにより測定できる。Ｔ細胞集団中の細胞死の程度を測定する好ましい方法は、プロピジウムヨージド(propidium iodide)排除アッセイによるものである。プロピジウムヨージド排除アッセイは、Ｔ細胞をプロピジウムヨージドとともに培養することにより実施でき、このプロピジウムヨージド染料は、死亡細胞に優先的に吸収され、生存細胞から排除される。細胞死の程度は、次いで、本願の実施例６に記載しているように、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析により測定される。付加的に使用できる染料には、アクリジンオレンジやヘキスト３３３４２が含まれる。Ｔ細胞集団中の細胞死の程度を測定する他の方法には、切断ＤＮＡの末端をラベルする（Gavrieli, Y. et al.(1992) J. Cell Biol. 119,493)の種々の方法が含まれる。Ｔ細胞集団中の細胞死の程度を測定する他の方法には、Ｔ細胞の核酸の電気泳動分析がある。この方法では、精製されているかまたは精製されていない形態のＴ細胞の核酸を、ゲル電気泳動に付し、次いで、エチジウムブロマイドによるゲル染色し、さらに紫外線下で核酸の可視化を行う。少なくとも相当数のＴ細胞がアポトーシスを受けているＴ細胞集団由来の核酸は、"ラダー（ladder)”即ち、ＤＮＡの分離フラグメントの集団、が現れるであろう。反面、アポトーシスを受けていないＴ細胞のＤＮＡは、単一の高分子量バンドとして現れる。
【００４２】
bcl−ＸＬタンパク質の形態について、細胞死からＴ細胞を防御する能力を測定するために、数種のアッセイが使用できる。これらのアッセイには、Ｔ細胞集団を特定の作用物質と接触させて、Ｔ細胞集団がアポトーシスを受けるよう誘導するアッセイが含まれる。そのような作用物質には、Ｔ細胞レセプターを架橋する作用物質類、例えば抗ＣＤ３抗体、ＦasまたはＴＮＦレセプターを架橋する作用物質類、グルココルチコイド類、が含まれる。場合によっては、成長因子欠乏、例えばＩＬ−２欠乏により、Ｔ細胞に細胞死を誘導できる。これらのアッセイは本明細書中、殊に実施例６および７に記載する。
【００４３】
Ｔ細胞中のbcl−ＸＬフラグメントは、bcl−ＸＬタンパク質フラグメントをコードする核酸フラグメントを導入することにより、産生できる。この核酸はｃＤＮＡであってもよく、またはゲノムＤＮＡフラグメントであってもよい。bcl−ＸＬの変異体は、例えば、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子（例えば、bcl−ＸＬ ｃＤＮＡ）中に、標準法、例えば部位指向性突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応経由突然変異誘発により、ヌクレオチド塩基対修飾（例えば、置換、欠失、付加等）を導入することにより調製できる。bcl−ＸＬの好ましい修飾は、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の半減期を修飾するものを含む。従って、本方法の他の実施態様では、長い半減期を有するbcl−ＸＬの形態をＴ細胞中に導入することが望ましい場合もあるが、具体的な実施態様では、非常に短い半減期を有するbcl−ＸＬタンパク質の形態をＴ細胞中に導入することが望ましい。
【００４４】
好ましい態様では、bcl−ＸＬタンパク質を、“Ｂax”タンパク質との相互作用を促進し、そして“Ｂad”タンパク質との相互作用を阻害または減少させるように修飾する。bcl−ＸＬの細胞中のアポトーシスに対する防御効果は、一つのbcl−ＸＬタンパク質と他の“Ｂax”と名付けたタンパク質とにより構成されるヘテロ二量体により媒介され得ることが示されている。しかしながら、さらなるデータは、“Ｂad”と称したタンパク質がbcl−ＸＬとも相互作用し得ること、およびbcl−ＸＬとＢadから構成されるヘテロ二量体がbcl−ＸＬの細胞死に対する防御効果を不活性化し得ることを示している(Yang, et al.(1995) Cell 80,285)。さらに、Ｂadは、Ｂax／bcl−ＸＬヘテロ二量体のＢaxタンパク質と置き換えて、bcl−ＸＬ／Ｂadヘテロ二量体を形成する能力があることが示されている。このように、本方法の好ましい実施態様では、bcl−ＸＬの修飾形態のＢadへの結合を阻害するかまたは少なくとも減少するように修飾したが、野生型bcl−ＸＬタンパク質と比較して、bcl−ＸＬの修飾形態のＢaxへの結合には有意に影響されない、bcl−ＸＬタンパク質をコードしている核酸をＴ細胞中に導入することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する。本発明の好ましい実施態様においては、bcl−ＸＬタンパク質の修飾は、Ｂcl−２相同性（ＢＨ）ドメイン１または２（それぞれ、“ＢＨ１”および“ＢＨ２”）中に位置している、bcl−ＸＬの少なくとも１つのアミノ酸を置換することを含む。ＢＨ１は、ヒトbcl−ＸＬタンパク質（配列番号２）のアミノ酸１２９と１４８の間に位置しており、ＢＨ２はヒトbcl−ＸＬタンパク質（配列番号２）のアミノ酸１８０と１９１との間に位置している(Yang, E. et al.(1995) Cell 80,285)。
【００４５】
さらに、bcl−ＸＬの一次アミノ酸配列の変化は、細胞死からＴ細胞を防御するbcl−ＸＬ分子の能力を有意に損なうことなく許容されるようであることは、当業者により評価されるであろう。従って、天然に存在するbcl−ＸＬ分子のアミノ酸の配列と比較して、アミノ酸置換、欠失、および／または付加を有し、なお機能的活性を保持している、本書中に記載したbcl−ＸＬの変異体形態は、本発明の範囲内に属するものである。bcl−ＸＬの機能的性質を保持するために、好ましくは、保存性アミノ酸置換はひとつまたはそれ以上のアミノ酸残基で行われる。“保存性アミノ酸置換”とは、アミノ酸残基が同種の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。同種の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含むものとして定義されている。
【００４６】
１.２.２.Ｔ細胞中でbcl−ＸＬコード核酸の発現のための調節配列
Ｔ細胞中でbcl−ＸＬをコードする核酸分子を発現させ、Ｔ細胞中でbcl−ＸＬタンパク質のレベルを増大させる（細胞死からＴ細胞を防御する）ためには、該核酸を調節配列に作動可能に連結させなければならない。“作動可能に連結させた”とは、Ｔ細胞中でヌクレオチド配列が発現できるような態様でbcl−ＸＬをコードするヌクレオチド配列を少なくとも一つの調節配列に連結させたという意味であることを意図している。調節配列は、適当なＴ細胞中で所望のタンパク質の発現を指向するように選ばれる。従って、“調節配列”の用語は、プロモーター類、エンハンサー類、および他の発現制御配列類を含む。そのような調節配列は当業者に知られており、またGoeddel, gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、 Academic Press, San Diego, CA(1990)に記載されている。
【００４７】
これらの調節配列は、bcl−ＸＬをコードする核酸の転写および翻訳に必要とされるものを含み、さらに、プロモーター類、エンハンサー類、ポリアデニル化シグナル類、および好ましくはミトコンドリア膜外である、適切な細胞コンパートメントへ分子を伝達するのに必要な配列を含み得る(Gonzales-Garcia, M. et al.(1994) Development 120,3033)。核酸が組換え発現ベクター中のcＤＮＡである場合、cＤＮＡの転写および／または翻訳を担う調節機能は、しばしばウイルスの配列により提供される。一般に使用されるウイルスのプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびレトロウイルスＬＴＲｓ由来のものが含まれる。
【００４８】
cＤＮＡに連結させる調節配列は、構成的または誘導的転写を与えるものを選択できる。誘導的転写は、例えば誘導性エンハンサーを使用することにより達成され得る。このように、本発明の具体的な実施態様において、bcl−ＸＬの形態をコードする核酸分子は、誘導性制御配列に影響を与える作用物質を用いてbcl−ＸＬの形態の発現をオンまたはオフにできる（またはその中間のレベルにする）ように、誘導性制御配列の制御下にある（例えば、発現は、Ｔ細胞の存在下で、誘導性作用物質の濃度を調節することにより調節できる）。このことにより、Ｔ細胞中での細胞死に対するbcl−ＸＬの防御効果を有効または無効に切り替えることが可能である。実際には、ある症状においてのみ、またはある時間のみＴ細胞の生存を促進することが望ましい。例えば、被験体における感染部位で、限られた時間枠に感染作用物質を除去するために免疫反応を強化することが望ましい。しかしながら、感染作用物質を除去する際に、Ｔ細胞を除去することが望ましい。このように、感染部位に位置するＴ細胞中のbcl−ＸＬの発現は、Ｔ細胞を誘導性作用物質と接触させることにより、誘導制御配列を介して刺激され得る。ついで、感染の除去時に、誘導性作用物質を除去してＴ細胞中のbcl−ＸＬの産生を停止できる。
【００４９】
哺乳動物細胞に使用する誘導性調節システムは、当分野では知られており、例えば、遺伝子発現を重金属イオン（Mayo et al.(1982)Cell29:99-108;Brinster et al.(1982)Nature296:39-42;Searle et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:1480-1489)、熱ショック（Nouer et al.(1991)in Heat Shock Response、Nouer,L.編、ＣＲＣ、Boca Raton、FL、ppl167-220）、ホルモン（Lee et al.(1981)Nature294:228-232;Hynes et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2038-2042；Klock et al.(1987)Nature329:734-736;Israel&Kaufman(1989)Nucl.Acids.Res17:2589-2604）またはテトラサイクリン（Gossen,M.およびBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551）により調節するシステムがある。Ｔ細胞を特定の誘導性作用物質に接触させることにより制御可能な誘導的遺伝子発現をもたらすその他の機構は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／１８３１７およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／２３４３１に記載されている。
【００５０】
誘導性制御配列は、全てのＴ細胞において機能でき、または、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などの特定のＴ細胞サブセットにおいてのみ機能できる。誘導性制御配列は、また、１タイプのＴ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）においては１つの作用物質により調節されるが、他のタイプのＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）においては他の作用物質により調節されるように、選択し得る。
【００５１】
本発明のその他の態様においては、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、核酸分子の発現を構成的に起こす調節配列の制御下にある。本発明の具体的な実施態様において、ＨＩＶ感染した被験体由来のＴ細胞を修飾してbcl−ＸＬタンパク質を発現させ、被験体のＴ細胞を細胞死から構成的に防御するようにする。核酸分子の構成的発現を起こすために核酸分子に作動可能に連結させた制御配列は、好ましくはウイルスプロモーターである。一般的に使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲ由来のものがある。その他に、例えばＴ細胞受容体エンハンサー（例えば、WinotoおよびBaltimore(1989)EMBOJ.8:729-733）などのＴ細胞特異的エンハンサーを使用できる。
調節配列に作動可能に連結させたbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、典型的にベクターに移し得る。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスまたは、例えば細菌中の核酸分子の選択および増幅に必要な配列を含むその他の核酸分子がある。このように、調節制御配列に作動可能に連結させたbcl−ＸＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子はまた、本明細書中では“bcl−ＸＬ発現ベクター”と呼ぶ。例えばウイルスベクターなどのベクターは、下記で更に議論する。
【００５２】
１.２.３.bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子をＴ細胞に導入する方法
bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、典型的にトランスフェクションと呼ばれる様々な方法によりＴ細胞に導入され得る。“トランスフェクション”または“でトランスフェクションさせる”なる語は、外来核酸を哺乳動物細胞に導入することを意味し、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染を含む、核酸の哺乳動物細胞への導入に有用な数多くの技術を含むことを意図する。哺乳動物細胞をトランスフェクションする適当な方法は、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual第２版、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）およびその他の実験書に見ることができる。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子はウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入される。このようなウイルスベクターには、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス１がある。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボでの特にヒトへの外来遺伝子の導入に優れた組換え遺伝子運搬系であると一般的に考えられている。その他に、そのようなベクターは、外来遺伝子をエクスビボでＴ細胞に導入するのにも使用できる。これらのベクターは、効果的に遺伝子をＴ細胞に運搬し、導入された核酸分子は、安定に宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれる。レトルウイルスの使用における重要な必要条件は、特に細胞集団において野生型ウイルスが蔓延する可能性について、その使用の安全性を確認することである。複製欠損性レトロウイルスのみを産生する分化した細胞系（“パッケージング細胞”と呼ぶ）の開発により、遺伝子療法におけるレトロウイルスの用途が拡大し、欠損レトロウイルスは遺伝子療法の目的における遺伝子導入における使用について十分に特徴づけられている（Miller,A.D.(1990)Blood76:271参照）。このように、レトロウイルスコード配列の一部（gag、pol、env）を本発明のbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸で置換えて、レトロウイルス複製欠損性にすることにより、組換えレトロウイルスを構築し得る。この場合、複製欠損性レトロウイルスはビリオン中にパッケージングさせるので、これを標準的な技術によりヘルパーウイルスを使用して標的細胞を感染させるのに使用できる。組換えレトロウイルスの産生およびインビトロまたはインビボでこのようなウイルスで細胞を感染させる方法は、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel,F.M.et al.編Greene Publishing Associates、(1989)、9.10−9.14章および標準的な実験マニュアルにおいて見いだされ得る。適当なレトロウイルスの例は、当業者に良く知られているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含む。同種指向性および両種指向性レトロウイルス系を両方調製するための適当なパーケージングウイルス系の例は、ψＣｒｉｐ、φＣｒｅ、ψ２およびψＡｍを含む。
【００５４】
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を修飾することにより、レトロウイルスの、更にはレトロウイルスを基礎としたベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えばＰＣＴ発行物ＷＯ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの修飾方法は：細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスのenvタンパク質に結合させる（Roux et al.(1989)PNAS86:9079-9083;Julan et al.(1992)J.Gen Virol73:3251-3255;およびGoud et al.(1983)Virology163:251-254)；または細胞表面受容体リガンド類をウイルスのenvタンパク質に結合させる（Nada et al.(1991)J.Biol.Chem.266:14143-14146）ことを含む。結合は、タンパク質またはその他のさまざまなもの（例えば、envタンパク質をアジアロ糖タンパク質に変換するラクトース）との化学的架橋形態であることができ、並びに融合タンパク質（例えば、単鎖抗体／env融合タンパク質）を作成することによる。このように、本発明の具体的な実施態様では、bcl−ＸＬの形態をコードする核酸分子を含むウイルス粒子を、例えば、上記した方法に従い、それらが特異的にＴ細胞のサブセットを標的とすることができるように修飾する。例えば、ウイルス粒子をあるタイプのＴ細胞に特異的な表面分子に対する抗体で被覆できる。特に、Ｔ細胞のＣＤ４分子を認識するウイルス粒子抗体に連結させることにより選択的にＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とすることが可能である。このように、ＣＤ４＋細胞の感染は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の感染よりも優先的に起こる。本法は、Ｔ細胞の特定のサブセットのみを細胞死から防御することを望む場合に、特に有用である。さらに、本発明の方法をインビボで使用する具体的な実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子のＴ細胞または特定のサブセットへの導入を制限することが望ましい。
【００５５】
一次Ｔ細胞を含むＴ細胞のbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子を導入し、かつ発現させるための更なるレトロウイルス系は、Kasid,A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,473；Morecki,S.et al(1991)Cancer Immunol.Immunother.32,342;Culver,K.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,3155;およびFiner,M.H.et al.(1994)Blood、83,43に記載されている。
【００５６】
本発明で有用な他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス由来のベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、対象となる遺伝子産物をコードし、発現するが、正常細胞溶解ウイルスライフサイクルで複製する能力に関しては不活性化されているように、操作できる。例えば、Ｂerkner et al. (1988) ＢioＴechniques 6:616；Ｒosenfeld et al. (1991) Ｓcience 252:431-434；およびＲosenfeld et al. (1992) Ｃell 68:143-155参照。アデノウイルス株Ａｄタイプ５dl324またはアデノウイルスの他の株(例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等)由来の適当なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。組換えアデノウイルスは、それらが細胞分裂していない細胞に感染できないため、ある環境で有利である。更に、ウイルス粒子は、相対的に安定であり、精製および濃縮を受けることができ、上記のように、感染スペクトルに影響を与えるように修飾できる。更に、導入アデノウイルスＤＮＡ(およびそれを含む外来ＤＮＡ)は、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソームのままであり、それにより、導入ＤＮＡが宿主ゲノム(例えば、レトロウイルスＤＮＡ)に組み込まれる状況下、挿入突然変異誘発の結果起こり得る可能性のある問題を回避できる。更に、アデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを運搬する能力は、他の遺伝子運搬ベクターと比較して大きい(８キロ塩基まで)(Ｂerkner et al. 前掲；Ｈaj-ＡhmandおよびＧraham(1986) Ｊ. Ｖirol. 57;267)。現在使用され、そして本発明の好ましい殆どの複製欠損性アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３ゲノムの全てまたは一部を欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程を残している(例えば、Ｊones et al. (1979) Ｃell 16:683；Ｂerkner et al., 前掲；およびＧraham et al., Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology, Ｅ. Ｊ. Ｍurray編(Ｈumana, Ｃlifton, ＮＬ, 1991) vol. 7 pp. 109-127参照)。bcl−ＸＬタンパク質をコードする対象となる核酸分子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要遅延プロモーター(ＭＬＰ)および関連リーダー配列、Ｅ３プロモーターまたは外来的に付加したプロモーター配列の制御下にあり得る。
【００５７】
bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子のインビトロ運搬に有用な更に別のウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような他のウイルスを有効な複製および増殖的ライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。(レビューのために、Ｍuzyczka et al. Ｃurr. Ｔopics in Ｍicro. and Ｉmmunol. (1992) 158:97-129参照)。そのＤＮＡを細胞分裂していない細胞に組み込むことができ、安定な高頻度の組み込み(インテグレーション)を示す幾つかのウイルスの一つがまた存在する(例えば、Ｆlotte et al. (1992) Ａm. Ｊ. Ｒespir. Ｃell. Ｍol. Ｂiol. 7:349-356；Ｓamulski et al. (1989) Ｊ. Ｖirol. 63:3822-3828；およびＭcＬaughlin et al. (1989) Ｊ. Ｖirol. 62:1963-1973参照)。ＡＡＶの３００塩基対程を含有するベクターは、パッケージでき、組み込みことができる。外来ＤＮＡのための領域は、約４.５ｋｂに限定される。Ｔratschin et al. (1985) Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 5:3251-3260に記載のようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するのに使用できる。種々の核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞タイプに導入されている(例えば、Ｈermonat et al. (1984) Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 81:6466-6470；Ｔratschin et al. (1985) Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 4:2072-2081；Ｗondisford et al. (1988) Ｍol. Ｅndocrinol. 2:32-39；Ｔratschin et al. (1984) Ｊ. Ｖirol. 51:611-619；およびＦlotte et al. (1993) Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. 268:3781-3790参照)。遺伝子治療に適用し得る他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよび幾つかのＲＮＡウイルスに由来する。
【００５８】
bcl−ＸＬ−コード配列に加えて、発現ベクターはまた選択マーカーをコードする遺伝子も含み得る。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような医薬に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子と同じベクター(例えば、プラスミド)に導入し得るか、または別のベクター(例えば、プラスミド)に導入し得る。
【００５９】
あるいは、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、細胞運搬媒体により運ばれ、細胞に輸送され得る。このような媒体は、例えば、カチオン性リポソーム(リポフェクチン)または誘導体化(例えば、抗体コンジュゲート)ポリリジンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープを含む。これらの媒体は、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスＤＮＡにより運ばれるbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を、運搬できる。具体的態様において、一次Ｔリンパ球、特にＣＤ３＋、ＣＴ４＋およびＣＴ８＋Ｔ細胞で発現する有効な遺伝子は、Ｐhilip Ｒ. et al. (1994) Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 14, 2411に記載のように、カチオン性リポソームと複合体形成させたアデノ随伴ウイルスプラスミドＤＮＡを使用して得られる。
【００６０】
本発明の他の態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子を、可溶性分子複合体の形態で特定の細胞に運搬する。複合体は、特定の細胞の表面分子に結合し、細胞により続いてインターナリゼーションされ得るサイズである、核酸結合剤および細胞特異的結合剤を含む担体に解離可能に結合した核酸を含む。このような複合体は、米国特許出願第５,１６６,３２０号に記載されている。
本発明の他の態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸は、Ｙang, Ｎ.−Ｓ.およびＳun, Ｗ. Ｈ. (1995) Ｎature Ｍedicine 1, 481に記載のように、Ｔ細胞に粒子衝撃により挿入する。
【００６１】
１.１ blc−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質を使用する方法
一つの態様において、本発明の方法は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する少なくとも一つの作用物質にＴ細胞を接触させることにより、Ｔ細胞の生存を強化させる方法を含む。本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞と相互作用して、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる少なくとも一つの作用物質は、Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８のような、Ｔ細胞の表面の分子と相互作用する、１またはそれ以上の作用物質を含む。本発明の他の態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる少なくとも一つの作用物質は、例えば、bcl−Ｘ遺伝子の発現の増加により、細胞内に作用する作用物質である。"Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するために細胞内に作用する作用物質”なる用語は、Ｔ細胞の表面受容体には結合しないが、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加をもたらす、Ｔ細胞の受容体の結合により誘導される細胞内シグナル(例えば、第２メッセンジャー)を模倣するか、または誘導する作用物質を含むことを意図する。作用物質は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質の製造を、bcl−Ｘ遺伝子転写の増加、bcl−ＸＬｍＲＮＡの安定化またはbcl−ＸＬｍＲＮＡの翻訳の増加による、種々の機構により刺激し得る。好ましい態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルは、選択的に、すなわち、Ｂcl−ＸＳタンパク質レベルの付随的増加なしに増加される。
【００６２】
"内生遺伝子の発現を刺激する”なる用語は、遺伝子によりコードされるbcl−ＸＬタンパク質のレベルが細胞内で増加するように、細胞内のbcl−Ｘ遺伝子に作用することを含むことを意図する。“転写を刺激する”なる用語は、ｍＲＮＡ転写の量が増加するように、転写に影響を与えることを含むことを意図する。"内生bcl−Ｘ遺伝子”なる用語は、Ｔ細胞に本来あるbcl−Ｘ遺伝子を意味することを意図し、Ｔ細胞に導入された“外来bcl−Ｘ遺伝子”と反対である。
【００６３】
本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞を少なくとも一つの作用物質と接触させ、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加および細胞死からのＴ細胞の防御をもたらす。好ましい態様において、Ｔ細胞の生存は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞を刺激する作用物質の組み合わせと接触させることにより増加する。作用物質の好ましい組み合わせは、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞に共刺激性分子を提供する作用物質を含む作用物質の組み合わせである。例えば、Ｔ細胞生存は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する第１作用物質およびＴ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供する第２作用物質と接触させることにより促進される。より好ましい組み合わせは、Ｔ細胞内でbcl−ＸＬタンパク質レベルが増加するようにＴ細胞受容体を刺激する作用物質およびＴ細胞へのコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質を含む。
【００６４】
"一次活性化シグナル”なる用語は、典型的にＴ細胞受容体(ＴＣＲ)／ＣＤ３複合体により誘発される、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナルを含むことを意図する。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が、コスティミュラトリー・シグナルのような第２シグナルを受けて、増殖および分化が誘導されるような、Ｔ細胞の修飾を含むことを意図する。具体的態様において、一次活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体に関連するＣＤ３複合体と接触させる作用物質により提供される。好ましい態様において、作用物質は、モノクローナル抗体ＯＫＴ３(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection, Ｒockvill, ＭＤ；Ｎo. ＣＲＬ 8001から入手可能)のようなＣＤ３に対して反応性の抗体である。本発明の他の態様において、刺激性作用物質は、抗体の組み合わせ、例えば、Ｔ１１.３＋Ｔ１１.１またはＴ１１.３＋Ｔ１１.２(例えば、Ｍeuer, Ｓ.Ｃ. et al. (1984) Ｃell 36:897-906参照)のような、Ｔ細胞のＣＤ２複合体を刺激する作用物質である。更に別の態様において、一次活性化シグナルは、抗原または抗原提示細胞により提供される。従って、Ｔ細胞を１またはそれ以上の抗原または１またはそれ以上の抗原提示細胞と接触させることにより、および所望により、コスティミュラトリー・シグナルを提供する第２作用物質と接触させることにより、Ｔ細胞の集団における特定のＴ細胞クローンの生存を刺激することが可能である。
【００６５】
本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルの両方を刺激する作用物質の組み合わせを用いて刺激する。“共刺激性作用物質”なる用語は、一次活性化シグナルを受けたＴ細胞(例えば、活性化Ｔ細胞)を刺激して、増殖させるか、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはインターフェロン−γのようなサイトカインを分泌させる、コスティミュラトリー・シグナルをＴ細胞に提供する作用物質を含むことを意図する。具体的な態様において、共刺激性作用物質は、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４分子と相互作用する。更により具体的な態様において、コスティミュラトリー・シグナルは、Ｂ−リンパ球抗原Ｂ７−１またはＢ７−２のようなＣＤ２８またはＣＴＬＡ４のリガンドである。“ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態”なる用語は、Ｔ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供できる、Ｂ７−１およびＢ７−２分子、それらのフラグメントまたはそれらの修飾物を含むことを意図する。ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態は、例えば、活性化Ｔ細胞をＣＤ２８の天然リガンドの形態と接触させ、標準Ｔ細胞増殖アッセイを行うことにより同定できる。従って、ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態はＴ細胞の増殖を刺激できる。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４の天然リガンドの刺激は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４０８に記載される。
【００６６】
Ｔ細胞を細胞死から防御するのに使用できる他の作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルをＴ細胞内で増加させるような、Ｔ細胞活性化および／または共刺激に関与する１またはそれ以上の細胞内シグナル伝達経路を刺激する作用物質を含む。本発明の好ましい態様において、刺激性作用物質は、イオノマイシンまたはＡ２３１８７のようなカルシウムイオン性透過体である。あるいは、刺激性作用物質は、ホルボールエステルのようなプロテインキナーゼＣを刺激する作用物質であり得る。好ましいホルボールエステルは、ホルボール−１２,１３−ジブチレートである。本発明のより更に好ましい組み合わせにおいて、Ｔ細胞をカルシウムイオノホアおよびホルボールエステルの組み合わせと接触させる。刺激性作用物質は、プロテインチロシンキナーゼを活性化する作用物質であり得る。プロテインチロシンキナーゼを活性化する好ましい作用物質は、ペルバナデート(Ｏ'Ｓhea, Ｊ. Ｉ., et al. (1992) Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89:10306)である。
【００６７】
Ｔ細胞生存を刺激するのに使用できる他の作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる、ポリクローナルアクチベーターのような作用物質を含む。ポリクローナルアクチベーターは、Ｔ細胞の原形質膜上で発現する糖タンパク質に結合する作用物質を含み、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、コンカナバリン(ＣonＡ)およびアメリカヤマゴボウマイトジェン(ＰＷＭ)を含む。
【００６８】
Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加できるスーパー抗原は、また本発明の範囲内である。本明細書で定義される“スーパー抗原”なる用語は、細菌エンテロトキシンまたはＴ細胞の増殖を刺激できる他の細菌タンパク質を含むことを意図する。スーパー抗原は、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤおよびＳＥＥのようなスタフィロコッカスエンテロトキシン(ＳＥ)を含む。スーパー抗原はまたはレトロウイルススーパー抗原のようなウイルス起源であり得る。
【００６９】
Ｔ細胞生存の刺激に使用し得る更に別の抗原は、リンホカインを含み、それは単独または他の作用物質と組み合わせて、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる。従って、本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の一次活性化シグナルを提供する作用物質(例えば、抗ＣＤ３抗体)およびbcl−ＸＬタンパク質レベルをＴ細胞内で増加させる有効量のＩＬ−２と接触させる。
【００７０】
単独または他の作用物質と組み合わせて、Ｔ細胞死をbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加により予防できる更なる作用物質は、Ｔ細胞を作用物質単独または他の作用物質と共に接触させ、bcl−ＸＬタンパク質レベルを、本明細書に記載のように、例えば、ウエスタンブロット分析により追跡することにより同定し得る。
【００７１】
本発明の範囲内の作用物質は、溶液で、または固体表面に結合させて使用できる。固体表面は、例えば、組織培養皿またはビーズの表面であり得る。刺激性作用物質の性質に依存して、固体表面への結合は、当分野で既知の方法により行うことができる。例えば、タンパク質を商業的に入手可能な架橋剤(Ｐierce, Ｒokford ＩＬ)を使用して化学的に細胞表面に架橋するか、または一晩４℃でインキュベーションすることによりプラスチック上に固定化できる。数個の作用物質をＴ細胞内のbcl−ＸＬレベルの増加に使用する場合、ある作用物質は溶液状であってよく、ある作用物質は固体支持体に結合させてもよい。好ましい態様において、Ｔ細胞は固相結合抗ＣＤ３抗体および可溶性抗ＣＤ２８抗体の組み合わせと接触させる。
【００７２】
細胞内に作用してbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質は、細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの欠乏についての標準アッセイを使用して同定できる。例えば、Ｔ細胞を試験作用物質の存在下または不在下にインキュベーションでき、異なる時間に細胞により製造されたbcl−ＸＬタンパク質の量を、本発明に参考として包含する、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／００６４２の実施例部分に記載のように、ウエスタンブロット分析により測定できる。従って、本発明の方法を行うのに好ましい作用物質は、ウエスタンブロット分析で測定した際に、bcl−ＸＬタンパク質レベルの著しい増加を誘導するものを含む。
【００７３】
更に、Ｔ細胞のbcl−ＸＬのタンパク質レベルの増加に使用できる作用物質は、同定用のbcl−Ｘ遺伝子の調節領域の分析により同定できる。ＤＮＡは、特定の作用物質により、遺伝子の転写を調節するように配列している。例えば、これらの配列に特異的に結合する転写アクチベーターは、bd−Ｘ遺伝子発現の刺激に使用できる。次いで、これらの作用物質が細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するか、ウエスタンブロット分析により確認できる。
【００７４】
本発明の具体的態様において、作用物質は、選択的に、または少なくとも優勢にＴ細胞に作用し、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる。従って、作用物質の投与は、Ｔ細胞内のみのまたは少なくとも好ましくはＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加を得るようにする。Ｔ細胞特異的作用物質は、インビトロで、異なる細胞タイプを作用物質に接触させ、細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの測定をウエスタンブロット分析により行うことにより同定できる。従って、好ましい作用物質は、Ｔ細胞内のみのまたは少なくとも好ましくはＴ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加をもたらすものである。
【００７５】
本発明の好ましい態様において、細胞内に作用してbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質は、相対的に短い半減期を有するものである。このような作用物質により、作用物質の効果が良好に制御される。特に、このような作用物質は、Ｔ細胞の細胞生存を短期間、中期間、または長期間刺激できる。実際、本発明の具体的態様において、Ｔ細胞生存は、一時的に、例えば、作用物質を感染部位の免疫応答のブースターに使用する条件下のみで、増加するのが好ましい。免疫応答は、Ｔ細胞の半減期の制御により少なくとも一部分制御される。ある条件下ではＴ細胞死が起こらないと、実際的には、有害な作用をもたらす場合がある。しかしながら、本発明の他の態様において、細胞内に作用して、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質は、作用物質の被験体へのより少ない投与でもＴ細胞死に対する有効な長期防御を得ることができるように、長い半減期を有する。
【００７６】
１.３. Ｔ細胞にタンパク質を導入することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法
本発明の他の態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞による摂取に適した形態のbcl−ＸＬタンパク質と接触させることを含む方法により、Ｔ細胞を細胞死から防御する。従って、本発明の具体的態様において、bcl−ＸＬタンパク質は、細菌発現システムおよび適当な媒体でのＴ細胞への輸送のような、慣用法によりインビトロで合成される。適当な媒体は、特定の細胞、特にＴ細胞またはＴ細胞の選択的サブセットを標的とするように修飾できるリポソームを含む。
【００７７】
bcl−ＸＬタンパク質は、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子またはbcl−ＸＬの生理学的に活性な形態を、その後種々の宿主、特に哺乳動物または昆虫細胞培養物のような真核細胞だけでなく、Ｅ. coliのような原核細胞での対応するタンパク質の合成を指向する、種々の発現ベクターに挿入することによりインビトロで製造できる。本発明の範囲内の発現ベクターは、本明細書に記載の核酸および核酸に作動可能に連結させたプロモーターを含む。このような発現ベクターは、宿主細胞をトランスフェクションするのに使用でき、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされるタンパク質が製造される。本明細書に記載の本発明の発現ベクターは、典型的に、少なくとも一つの調節配列に作動可能に連結させたbcl−ＸＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。調節配列は、上記である。発現ベクターの設計は、トランスフェクションすべき宿主細胞の選択および／または発現することが望ましいタンパク質のタイプおよび／または量のような因子に依存し得る。
【００７８】
本発明の発現ベクターは、真核または原核(例えば、哺乳類、昆虫または酵母細胞)の細胞のトランスフェクションに使用でき、それにより、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質を合成する。原核細胞における発現は、多くの場合、Ｅ. coliにて構成性または誘導性プロモーターと共に行う。あるＥ. coli発現ベクター(いわゆる融合ベクター)は、多くのアミノ酸残基を発現組換えタンパク質に、通常は、発現タンパク質のアミノ末端に付加するために設計される。このような融合ベクターは、３つの目的で働く：１）組換えタンパク質の発現の増加のため；２）標的組換えタンパク質の溶解性の増加のため；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、標的組換えタンパク質の精製における補助のため。融合発現ベクターの例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびマルトースＥ結合タンパク質を、それぞれ、標的組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ(Ａmrad Ｃorp., Ｍelbourne, Ａustralia)およびｐＭＡＬ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs, Ｂerberly, ＭＡ)がある。従って、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、真核融合ベクター中の更なるコード配列に結合でき、融合タンパク質の発現、溶解性または精製を補助する。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位を、融合分子と標的組換えタンパク質の結合部で挿入することにより、融合タンパク質の精製に続く標的組換えタンパク質を融合分子から分離することが可能である。このような酵素およびそれらの連結認識配列は、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。
【００７９】
誘導性非融合発現ベクターには、pＴrc(Ａmann et al. (1988) Ｇene 69:301-315)およびpＥＴ11d(Ｓtudier et al., Ｇene Ｅxpression Ｔechnology：Ｍethods in Ｅnzymology 185, Ａcademic Ｐress, Ｓan Ｄiego, Ｃalifornia (1990)60-89)がある。pＴrcベクター４からの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現（coexpressed）ウイルスＲＮＡポリメラーゼ(Ｔ７gn１)により媒介されるＴ７gn10-lac0融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、Ｔ７gn１を有する非活性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００８０】
Ｅ. coli内のbcl−ＸＬタンパク質の発現を最大にする一つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を低下させて、宿主細菌中のタンパク質を発現させることである(Ｇottesman, Ｓ., Ｇene Ｅxpression Ｔechnology：Ｍethods in Ｅnzymology 185, Ａcademic Ｐress, Ｓan Ｄiego, Ｃalifornia (1990) 119-128)。他の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが、高度に発現したＥ. coliタンパク質において優先的に利用されるものであるように、発現ベクター内に挿入されるbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を変えることである(Ｗada et al., (1992) Ｎuc. Ａcids Ｒes. 20:2111-2118)。このような核酸配列の置換は、本発明に含まれ、標準ＤＮＡ技術により行うことができる。
【００８１】
あるいは、bcl−ＸＬタンパク質は、哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＮＳＯ細胞)、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルスベクターを使用して)または酵母細胞のような真核宿主細胞で発現できる。他の適当な宿主細胞は、Ｇoeddel, (1990)前掲に見られるか、当業者に既知であり得る。真核細胞における真核細胞性タンパク質の発現が、組換えタンパク質の部分的または完全グリコシル化および／または対応する鎖内または鎖間ジスルフィド結合の形成を導くため、真核よりむしろ原核でのbcl−ＸＬタンパク質の発現が好ましいことがある。哺乳動物細胞で発現させる場合、ベクターの制御機能は、ウイルス性の物質により提供されることが多い。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。哺乳動物細胞でbcl−ＸＬタンパク質を発現させる場合、一般にＣＯＳ細胞(Ｇluzman, Ｙ. (1981) Ｃell 23:175-182)は一過性増幅／発現のためにｐＣＤＭ８(Ｓeed, Ｂ. (1987) Ｎature 329:740)のようなベクターとの複合体で使用するのに対し、ＣＨＯ(dhfr Ｃhinese Ｈamster Ｏvary)細胞は哺乳動物細胞での安定な増幅／発現のためにＰＭＴ２ＰＣ(Ｋaufman et al., (1987) ＥＭＢＯ Ｊ. 6:187-195)のようなベクターと共に使用する。組換えタンパク質の製造のための好ましい細胞系は、ＥＣＡＣＣ(カタログ番号85110503)から入手可能であり、Ｇalfre, Ｇ.およびMｉlstein, Ｃ.((1981) Ｍethods in Ｅnzymology 73(13):3-46；およびＰreparation of Ｍonoclonal Ａntibodies:Ｓtrategies and Ｐrocedures, Ａcademic Ｐress, Ｎ.Ｙ., Ｎ.Ｙ.)記載のＮＳＯミエローマ細胞である。酵母での組換えタンパク質の発現に適当なベクターの例は、pＹepＳec１(Ｂaldari et al., (1987) Ｅmbo Ｊ. 6:229-234)、ｐＭＡ(ＫurjanおよびＨerskowitz, (1982) Ｃell 30:933-943)、pJRY88(Ｓchultz et al., (1987) Ｇene 54:113-123)、pYES2(Ｉnvitrogen Ｃorporation, Ｓan Ｄiego, ＣＡ)を含む。培養昆虫細胞(ＳＦ９細胞)中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ(Ｓmith et al., (1983) Ｍol. Ｃell Ｂiol. 3:2156-2165)およびｐＶＬシリーズ(Ｌucklow, Ｖ.Ａ.,およびＳummers, Ｍ.Ｄ., (1989) Ｖirology 170:31-39)を含む。
【００８２】
ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒体トンラスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションのような慣用の形質転換またはトランスフェクション法により、真核または原核細胞に挿入できる。宿主細胞を形質転換する適当な方法は、Ｓambrook et al. (Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 2nd Ｅdition, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory press(1989))および他の研究用テキストに見ることができる。
【００８３】
哺乳動物細胞を安定にトランスフェクションさせる場合、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術にもよるが、小さいフラクションの細胞のみがＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体（インテグレート）の同定および選択のために、一般的に、選択マーカー(例えば、抗生物質への耐性)をコードする遺伝子を、対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような医薬に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、対象となる遺伝子と同じプラスミドにより宿主細胞内に挿入できるかまたは別のプラスミドにより挿入できる。これらの対象となる遺伝子を含む細胞は、医薬選択（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んた細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)により同定できる。次いで生存細胞を、bcl−ＸＬタンパク質の製造について、例えば、抗bcl−ＸＬ抗体の細胞上清からの免疫沈殿によりスクリーニングできる。
【００８４】
組換え技術により製造されるbcl−ＸＬタンパク質は、細胞の混合物およびタンパク質を含む培地から分泌および単離できる。bcl−ＸＬタンパク質の選択のために、適当なシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をbcl−ＸＬをコードするヌクレオチド配列の５'末端に連結させて、bcl−ＸＬタンパク質を、細胞からのタンパク質の分泌をもたらすシグナルペプチドに連結させる。あるいは、タンパク質を細胞質に残すこともでき、その細胞を回収し、溶解してタンパク質を単離し得る。細胞培養に適当な培地は当分野で既知である。タンパク質は、細胞培養培地、宿主細胞または両方から、タンパク質精製の分野で既知の技術を使用して単離できる。
【００８５】
組換え的に製造されたbcl−ＸＬタンパク質は、被験体に投与するための適当な医薬媒体にパッケージでき、そうして、bcl−ＸＬタンパク質を被験体のＴ細胞に導入し、細胞死に対するＴ細胞の防御をもたらす。組換えbcl−ＸＬタンパク質をＴ細胞へインビボおよびエクスビボ導入する場合、組換えタンパク質は、好ましくはリポソームにパッケージされる。しかしながら、他の担体システムも使用できる。
【００８６】
この方法のその他の実施態様において、Ｔ細胞生存は、Ｂadのbcl−ＸＳタンパク質のようなbcl−ＸＬのアンタゴニストのタンパク質レベルの減少により、促進される。bcl−ＸＬアンタゴニストのタンパク質レベル減少は、Ｔ細胞を、アンタゴニストをコードする遺伝子の発現を減少させる少なくとも一つの作用物質と接触させることにより、またはＴ細胞に、アンタゴニストの生理学的活性を減少させる核酸または他の化合物を挿入することにより、達成できる。bcl−ＸＳおよびＢadタンパク質レベルをダウンレギュレーションする方法は、bcl−ＸＬタンパク質レベルをダウンレギュレーションするための本明細書に記載の方法から改作できる。
【００８７】
Ｔ細胞死を減少させるために、上記方法を組み合わせることができる。
【００８８】
２.Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする方法
本発明の具体的な実施態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質のレベルを阻害または減少させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対してより感受性にする。例えば、Ｔ細胞の細胞死への感受性は、Ｔ細胞を、bcl−ＸＬ機能を不活性にするかまたはbcl−ＸＬの生物学的活性を減少させる作用物質と接触させることにより、増加できる。“Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする”なる用語は、Ｔ細胞の細胞死への感受性が、非修飾Ｔ細胞と比較して増加するように、Ｔ細胞内の生物学的に活性なbcl−ＸＬタンパク質の量が減少されるようにＴ細胞を修飾することを含むことを意図する。"機能的bcl−ＸＬタンパク質”および“生物学的活性bcl−ＸＬタンパク質”なる用語は、野生型bcl−ＸＬタンパク質または、あるいは、野生型bcl−ＸＬタンパク質の生物学的機能を遂行できるbcl−ＸＬタンパク質の修飾形態を含むことを意図する。Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする本発明の方法は、Ｔ細胞のポリクローナル集団または特異的Ｔ細胞クローンの欠失を引き起こしたい場合に多くの治療的応用性を有する。従って、本発明の方法は、例えば、自己免疫疾患の処置に有用である。
【００８９】
Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する方法は、Ｔ細胞を、bcl−Ｘ遺伝子の転写のレベルを減少させる作用物質、bcl−ＸＬｍＲＮＡを脱安定化する作用物質、bcl−ＸpremＲＮＡのbcl−ＸＬｍＲＮＡへのスプライシングを阻止する作用物質、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する作用物質またはこれらの作用物質の組み合わせと接触させることから成る方法を含む。あるいは、bcl−ＸＬと相互作用し、bcl−ＸＬの生物学的活性を阻害または減少させるタンパク質のタンパク質レベルを増加させることによりbcl−ＸＬタンパク質の防御効果に打ち勝つことができる。一つの実施態様において、Ｂadまたはbcl−ＸＳタンパク質のタンパク質レベルを、Ｔ細胞が細胞死に対して感受性となるように、Ｔ細胞内で増加させる。
【００９０】
本発明の具体的実施態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞に、bcl−ＸＬ機能を妨害するＲＮＡまたはタンパク質を発現する核酸を挿入することにより減少する。例えば、一つの実施態様では、bcl−ＸＬタンパク質の製造を阻害するアンチセンス核酸をＴ細胞に導入する。“アンチセンス”核酸は、“センス”核酸に相補的な、例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列を含み、ワトソンとクリックの塩基対形成規則に従い構築される。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコード領域に相補的であり得るか、またはｍＲＮＡの５'または３'非翻訳領域に相補的であり得る。ヒトbcl−ＸＬをコードするヌクレオチド配列のコード領域は配列番号１に示す。好ましくは、アンチセンス核酸は、開始コドンの前にあるかまたはそのコドンにまたがる領域と相補的であるか、またはｍＲＮＡの３'非翻訳領域にある。アンチセンス核酸は、配列番号１に示すヌクレオチド配列、または当分野で既知の他のbcl−ＸＬコード配列に基づいて設計できる。例えば、核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列のコード領域または非翻訳領域に相補的な配列を有するように設計する。
【００９１】
本発明のアンチセンス核酸は、当分野で既知の方法を使用した化学的合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築できる。アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは、分子の生物学的安定性を増加するためにまたはアンチセンスとセンス核酸の間に形成された二本鎖の物理的安定性を増加するために設計した種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養中のＴ細胞に導入でき、bcl−ＸＬの発現を阻害する。オリゴヌクレオチドのような１またはそれ以上のアンチセンス核酸を培養培地中の細胞に、典型的には約２００μg／mlで添加できる。
【００９２】
あるいは、bcl−ＸＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくともフラグメントに対応する核酸が、アンチセンス配向(すなわち、挿入した核酸から転写されるＲＮＡが対象となる標的核酸に対してアンチセンス配向である)でサブクローンされている発現ベクターを使用して、アンチセンス核酸をＴ細胞内で生物学的に製造できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸を非常に有効な調節領域の制御下に製造する、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得る。調節領域は、核酸分子の構成的または誘導的発現を刺激できる。核酸分子の発現を制御する調節領域、このような配列を有するベクター、および核酸分子をＴ細胞に導入する方法は上記である。bcl−ＸＬアンチセンスｍＲＮＡをコードする核酸分子は、Ｔ細胞にエクスビボまたはインビボで導入できる。核酸をＴ細胞にインビボで導入する方法は上記である。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の調節の記載は、Ｗeintraub, Ｈ. et al., Ａntisense ＲＮＡ as a molecular tool for genetic analysis, Ｒeviews-Ｔrends in Ｇenetics, Ｖol. 1(1) 1986参照。
【００９３】
本発明の他の態様において、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞に、リボザイムであるアンチセンス核酸の形態をコードする核酸を導入することにより減少する。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡ分子であり、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸に対して相補的な領域を有してそれらを切断する能力がある。bcl−ＸＬコード配列に特異性を有するリボザイムは、bcl−ＸＬコードｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、テトラヒメナL-19IVS RNAの誘導体は、活性部位の塩基配列が、bcl−ＸＬコードｍＲＮＡで切断すべき塩基配列と相補的であるように構築できる。例えば、Ｃech et al.米国特許第４,９８７,０７１号；およびＣhech et al.米国特許第５,１１６,７４２号参照。あるいは、bcl−ＸＬコード配列は、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するのに使用できる、例えば、Ｂartel, Ｄ.およびＳzostak, Ｊ. Ｗ. (1993) Ｓcience 261:1411-1418参照。
【００９４】
この方法の更に別の態様において、Ｔ細胞にbcl−ＸＬと相互作用してbcl−ＸＬの生理学的機能を阻害する阻害性タンパク質をコードする核酸分子を導入することにより、bcl−ＸＬタンパク質のレベルを減少させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする。本発明の具体的実施態様において、阻害性タンパク質はＢadタンパク質または、bcl−ＸＬの生理学的活性の減少をできるそれらのフラグメントである(Ｙang Ｅ. et al.(1995) Ｃell 80, 285)。他の態様において、阻害性タンパク質は、bcl−ＸＬと相互作用する細胞内抗体である。細胞内抗体分子は、Ｔ細胞内に一本鎖抗体分子を本明細書に記載の方法により導入および発現することを含む方法でＴ細胞に導入できる。このような方法は、例えば、Ｂiocca, Ｓ. et al. (1993) Ｂiochemical and Ｂiophysical Ｒesearch Ｃommunications 197, 422；Ｂiocca, Ｓ. et al. (1994) Ｂio/Ｔechnology 12, 396；Ｍarasco, Ｗ. Ａ., et al. (1993) Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 90, pp. 7889；およびＷerge et al. (1990) ＦＥＢＳ 274, 193に記載されている。
【００９５】
本発明の他の実施態様では、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞を、内因性bcl−ＸＬタンパク質レベルをダウンレギュレーションするする作用物質と接触させることにより減少させる。具体的実施態様において、作用物質は、bcl−ＸＬ遺伝子の転写を減少させるものである。Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルをダウンレギュレーションする作用物質は、試験すべき作用物質をＴ細胞とインキュベーションし、bcl−ＸＬタンパク質レベルを本明細書に記載のようにウエスタンブロット分析で測定するアッセイを使用して同定できる。
【００９６】
bcl−ＸＳまたはＢadのようなbcl−ＸＬのアンタゴニストのレベルを増加させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする方法もまた本発明の範囲内である。これらのタンパク質のいずれかまたは両方のタンパク質レベルは、Ｔ細胞を例えば、bcl−ＸＳおよび／またはＢadをコードする遺伝子の発現を刺激する作用物質と接触させることにより、Ｔ細胞内で増加させることができる。一つの実施態様において、bcl−ＸＳをコードするbcl−Ｘ遺伝子の発現を刺激する作用物質は、bcl−ＸＬ産生を刺激しない。あるいは、これらのタンパク質をコードする核酸は、bcl−ＸＬタンパク質レベルの増加について本明細書に記載の方法と同様にしてＴ細胞に導入できる。bcl−ＸＬのアンタゴニストをコードする核酸配列は、例えば、Ｙang, Ｅ.et al. (1995) Ｃell 80, 285に記載されている。bcl−ＸＳまたはＢadタンパク質レベルを増加させる方法は、bcl−ＸＬタンパク質レベルの増加について本明細書に記載した方法を応用できる。
【００９７】
本発明の一つの態様では、Ｔ細胞を、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する作用物質と一次Ｔ細胞活性化シグナルを提供してＴ細胞死を刺激する作用物質と共に接触させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする。一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体のようなポリクローナルアクチベーターであり得る。本発明の好ましい態様において、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗原提示細胞上の抗原である。本発明の更に別の態様では、少なくとも一つのＴ細胞クローンを細胞死に対して感受性にするように、Ｔ細胞をさらに抗原提示細胞の更なる抗原と接触させる。更なる態様では、Ｔ細胞を、コスティミュラトリー・シグナルを阻止する作用物質と接触させる。従って、本発明の一つの実施態様において、Ｔ細胞死は、本発明の方法に従ったＴ細胞における一次活性化シグナルの刺激、Ｔ細胞の共刺激の阻害およびＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルの減少により誘発される。本発明の方法は、従って、Ｔ細胞のポリクローナル集団のＴ細胞死を可能にし、または、あるいは、限定された数のＴ細胞クローン(例えば、Ｔ細胞集団中の抗原特異的Ｔ細胞クローン)のＴ細胞死の誘導を可能にする。
【００９８】
Ｔ細胞の細胞死に対する感受性を増加する上記の方法は、組み合わせることができる。
【００９９】
３.医薬組成物
本発明は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法を提供する。Ｔ細胞内のbcl−ＸＬのレベルの増加は、内生bcl−ＸＬタンパク質のレベルの増加、またはＴ細胞へのbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸の導入、または両方の組み合わせにより達成できる。具体的態様では、内生bcl−ＸＬタンパク質のレベルを、Ｔ細胞を細胞内に作用する作用物質と接触させることにより増加させる。本発明の他の態様では、Ｔ細胞の細胞死に対する感受性は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少させる作用物質と接触させることにより増加させる。本発明の方法は、インビボ、エクスビボまたは両方の組み合わせにより実施できる。本発明の方法をエクスビボで実施するには、Ｔ細胞集団を被験体から得、インビトロでbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加または減少させる作用物質と接触させ、所望により、被験体に再投与する（この態様は更に下に記載する)。bcl−ＸＬタンパク質のレベルは、本明細書に記載のようにウエスタンブロット分析により追跡できる。
【０１００】
本発明の方法をインビボで実施する場合、作用物質をインビボの医薬投与に適した生物学的適合形態で被験体に投与する。“インビボで投与に適した生物学的適合形態”は、作用物質の治療的効果が毒性効果より重いような、投与すべき作用物質の形態を意味する。投与すべき作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子または細胞内のbcl−ＸＬタンパク質の産生を阻害するアンチセンス核酸分子をコードする核酸分子、細胞内に作用してbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加または減少する作用物質、およびbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子にまたはbcl−ＸＬアンチセンス核酸分子をコードする核酸分子に作動可能に連結させた誘導性制御配列を調節する作用物質、を含む。
【０１０１】
“被験体”なる用語は、免疫応答を誘導できる生存生物、例えば哺乳動物を含むことを意図する。被験体の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種である。例えば、本発明の範囲内の動物は、家畜および家禽のような農業的対象となる動物を含む。あるいは、本発明の方法はまた植物に応用できる。
【０１０２】
本発明の作用物質の治療的有効量の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量と定義する。例えば、作用物質の治療的有効量は、病気の状態、年令、性別、および被験体の体重および被験体に所望の応答を誘発する作用物質の能力などの要因に依存して変化し得る。用量レジメは、最適な治療的応答を提供するように調節し得る。例えば、数回に分割した用量を、毎日投与してもよく、またその用量を治療的状態の緊急性に合わせて徐々に減少させてもよい。
【０１０３】
作用物質は、注射(皮下、静脈内等)、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与のような慣用法で投与し得る。投与経路によるが、作用物質を不活性化し得る、酵素、酸および他の自然条件の作用から防御するために、作用物質をある物質で被覆してもよい。
【０１０４】
非経口投与以外で作用物質を投与するために、作用物質を、その不活性化を防御する物質でコートするか、その作用物質と同時投与する。例えば、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子を含む発現プラスミドは、酵素阻害剤と共に適当な担体または希釈剤で、またはリポソームのような適当な担体で、被験体に投与し得る。薬学的に許容される希釈剤は、食塩水および水性緩衝化溶液を含む、酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(ＤＥＰ)およびトラシロールを含む。リポソームは、水中油中水(water-in-oil-in-water)エマルジョンおよび慣用のリポソームを含む(Ｓtrejan et al., (1984) Ｊ. Ｎeuroimmunol. 7:27)。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中、および油中で製造できる。貯蔵および使用の慣用条件下で、これらの製剤は微生物の生長を防ぐ防腐剤を含み得る。
注射使用に適当な医薬組成物は、滅菌水性溶液(水溶性の場合)または分散剤および滅菌注射溶液または分散剤の即席製造用の滅菌粉末を含む。全ての場合、組成物は滅菌状態でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に液体でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から防御されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体プロピレングリコール等)およびそれらの適当な混合物を含む溶剤または分散媒体であり得る。適当な溶解性は、例えば、レシチンコーティングの使用により、分散剤の場合では、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物活性の阻止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射組成物の吸収延長は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことにより達成できる。
【０１０５】
滅菌注射溶液は、必要な量の作用物質を、適当な溶媒に、必要に応じて上述の１またはそれ以上の成分と組み合わせて包含させ、続いて滅菌濾過することにより製造できる。一般に、分散剤は、作用物質を塩基性分散媒体および上述からの必要な他の成分を含む滅菌媒体に包含させることにより製造する。滅菌注射溶液の製造における滅菌粉末の場合、好ましい製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過した溶液から、有効成分(例えば、ペプチド)＋他の所望の成分の粉末を製造する。
【０１０６】
作用物質が上記のように適切に保護されている場合、例えば、不活性希釈剤または吸収可能食用担体と共に、経口投与し得る。本明細書で使用する限り、"薬学的に許容される担体”は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。このような媒体および作用物質の薬学的活性物質への使用は当分野で既知である。慣用の媒体または試薬が作用物質と不適合である場合を除いて、治療用組成物へのその使用が期待される。補足的有効化合物もまた組成物に包含できる。
【０１０７】
非経口投与組成物を、投与が容易であり、均一の量である投与単位形態に調剤するのが特に有利である。本明細書で使用する投与単位形態は、処置すべき哺乳動物被験体に均一に投与するのに適した物質的に別の単位を意味する；各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生むと計算された予定量の有効化合物を含む。本発明の投与単位形態の詳細は、(ａ)作用物質の独自の特性および達成すべき具体的な治療効果、およびｂ）被験体における感受性処置剤のような調剤の分野で固有の限界により規定されており、それに直接依存している。
【０１０８】
４.本発明の方法の応用
本発明は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法に関する。本発明はまたＴ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にすることにも関する。これらの方法は、インビボおよびエクソビボの両方で実施できる。エクソビボで実施する時、末梢血単核細胞を被験体から得、密度勾配遠心、例えば、フィコール／ハイパークにより単離できる。具体的態様において、純粋な末梢血細胞を次いでbcl−ＸＬタンパク質のレベルを修飾する作用物質と接触させる。この方法の他の態様において、末梢血単核細胞をbcl−ＸＬタンパク質のレベルを調節する作用物質と接触させる前に特異的細胞タイプで豊富化させる。単核細胞は、例えば、プラスチック上への接着により枯渇できる。所望により、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、残りの単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＣＴ８＋Ｔ細胞から、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)および商業的に入手可能なｍＡｂ(例えば、抗ＣＤ１４(Ｍｏ２)、抗ＣＤ１１ｂ(Ｍｏ１)、抗ＣＤ２０(Ｂ１)、抗ＣＤ１６(３Ｇ８)および抗ＣＤ８(７ＰＴ３Ｆ９)ｍＡｂ)を使用した抗マウスＩｇ被覆磁気ビーズを使用して分離できる。本発明の方法は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋(自生ＣＤ４＋Ｔ細胞)およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋(記憶Ｔ細胞)Ｔ細胞サブセットのようなＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットに適応できる。これらは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の製造については、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体(ＵＣＨＬＩ)の更なる使用と共に、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の製造については抗ＣＤ４５ＲＡ抗体(２Ｈ４)の更なる使用と共に、上記のように製造できる。
【０１０９】
精製の効果は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および抗ＣＤ１４ｍＡｂまたはＴ細胞の特異的サブセットを認識する付加的抗体、続くフルオレセインイソチオシアネート接合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Ｆisher, Ｐittsburgh, ＰＡ)または他の二次抗体を使用したフローサイトメトリー(Ｃoulter, ＥＰＩＣＳ Ｅlite)により分析できる。
【０１１０】
エクスビボで使用する細胞集団のタイプは、bcl−ＸＬタンパク質レベルの修飾に使用する作用物質のタイプ、作用物質をＴ細胞に運搬するのに使用する媒体のタイプ、bcl−ＸＬタンパク質レベルの増加が望ましいＴ細胞のサブセットを含む種々の因子に依存する。従って、作用物質がＴ細胞のサブセットに特異的に影響を与える場合、(例えば、Ｔ細胞の特異的サブセットのみを標的にする運搬媒体の使用により)、Ｔ細胞の特異的サブセットの精製は必要ではない。作用物質が細胞の特異的サブセットを標的とするようにさせる媒体は、リポソームまたは所望の細胞タイプを認識する分子が結合した組換えウイルス粒子を含む。このような分子には、表面分子に対する抗体または受容体に対するリガンドがある。Ｔ細胞の選択的サブセットのみを、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞のみを標的としたい場合、および使用する作用物質がこのＴ細胞のサブセットを選択的に標的とできない場合、細胞を作用物質と接触させる前にＴ細胞の特異的サブセットを単離する必要があり得る。
【０１１１】
被験体から得るＴ細胞のような末梢血細胞またはその精製サブセットを、次いで、インビトロで、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを調節する作用物質の存在下にインキュベーションする。作用物質の量は、作用物質のタイプ、所望の効果および作用物質と接触させる細胞の集団などの種々の要因によって変わる。細胞集団に添加すべき作用物質の適当な量は、作用物質の種々の量を細胞培養物に添加し、種々の時間でのbcl−ＸＬタンパク質の量を、本明細書に記載のようにウエスタンブロット分析により測定するアッセイを行うことにより決定できる。細胞の異種集団を作用物質と接触させる場合、細胞をウエスタンブロット分析にかける前に、bcl−ＸＬの修飾が望まれるＴ細胞のサブセットを最初に単離することが必要であり得る。Ｔ細胞の特異的サブセットは、上記のようにネガティブセレクションにより細胞集団から単離できるか、またはあるいは、Ｔ細胞の特異的サブセットをＦＡＣＳを使用して単離できる。
【０１１２】
本発明の具体的態様において、被験体から単離されたＴ細胞を、bcl−ＸＬのタンパク質レベルを修飾する作用物質と接触させ、更に、インビトロでＴ細胞の集団を拡張する(即ち、集団内のＴ細胞の数を増加させる)ために培養する。Ｔ細胞の集団のインビトロ拡張は、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６に記載され、その内容は本明細書に参考として包含させる。
【０１１３】
Ｔ細胞またはそのサブセット内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの修飾に続いて、細胞を被験体に再投与できる。具体的態様では、まず細胞を精製して、被験体への投与に望ましくない培養培地中の物質を除去する。精製は、例えば、フィコールハイパーク勾配遠心により行うことができる。
【０１１４】
あるいは、本発明の方法はインビボで実施できる。この態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを修飾する作用物質は、薬学的に許容可能な媒体中で、所望の治療効果を得るのに充分な量で被験体に投与する。作用物質は、本発明の方法により処置すべき症状タイプによって、局所的または全身的に投与する。作用物質の投与に適当な媒体および経路は、本明細書３項に記載している。
【０１１５】
４.１.本発明の方法のＴ細胞死からの防御が有利な状態への適用
本発明の方法は、Ｔ細胞の細胞死を防止するのに有用である。本発明の方法により、全てのＴ細胞で細胞死が防止予防できるか、またはあるいは、細胞死をＴ細胞の特異的サブセット中で選択的に防止できる。更に、Ｔ細胞を、長期間、または短期間、細胞死から防御できる。局所的に存在するＴ細胞または全身的に(例えば、末梢血に)存在するＴ細胞を、細胞死から防御できる。
【０１１６】
好ましい態様において、本発明の方法は、ＨＩＶ感染個体のＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を防止し、ＨＩＶ感染からＴ細胞を防御するのに使用する。ＨＩＶ感染中、ウイルスはＣＤ４＋Ｔ細胞に感染し、これを殺傷する。従って、個体中のＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、被験体の微生物からの感染を防止するのに不十分な量まで段々に減少する。bcl−ＸＬタンパク質レベルが増加しているＴ細胞は、Ｔ細胞の生存率増加を測定したところ、ＨＩＶ感染に対して著しい防御を示すことが観察される(実施例９参照)。従って、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベル増加は、Ｔ細胞をＨＩＶ誘導細胞死から防御する。従って、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬ過発現は、ＨＩＶ感染被験体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数を維持する有効な方法を提供する。更に、本発明の方法は、ＨＩＶ感染被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加および／またはＨＩＶ感染個体におけるＴ細胞枯渇の速度減少をもたらし得る。
【０１１７】
本発明の方法は、ＨＩＶ感染、またはＴ細胞を細胞死に対して感受性にする他の感染物の感染ような、Ｔ細胞関連疾患を有する個体由来のＴ細胞の集団の拡張を可能にする方法を提供する。従って、この方法は、インビトロで細胞を拡張する方法を提供する。この場合、拡張Ｔ細胞集団を、被験体に投与し戻すことができる。好ましい態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質およびＴ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質の組み合わせで刺激する。より好ましい態様において、Ｔ細胞をＴ細胞上のＣＤ２８と相互作用する作用物質およびＴ細胞受容体を介してbcl−ＸＬタンパク質レベルが増加され、細胞が細胞死から防御されるようにＴ細胞を刺激する作用物質の組み合わせと共に培養する。
【０１１８】
ＨＩＶ感染被験体のＴ細胞死を防止する本発明の具体的実施態様では、末梢血細胞を被験体から入手し、インビトロで修飾して、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を増加させ、個体に再投与する。本発明の好ましい態様では、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子をＴ細胞に挿入することにより、被験体由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を修飾して、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するようにする。より更に好ましい態様では、bcl−ＸＬをコードする核酸分子は、細胞をウイルス粒子で感染させるような方法により、Ｔ細胞に導入されるウイルスベクター内に含有される。方法の他の好ましい態様は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、被験体に再投与する前に培養で更に拡張する。従って、本発明の方法は、ＨＩＶに感染した被験体の免疫系をＣＤ４＋Ｔ細胞で再集合させ、同時にこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞をウイルスによる感染に対して耐性にすることを可能にする。
【０１１９】
被験体に、個体のＣＤ４＋Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質のレベルを増加させる作用物質を投与することにより、ＨＩＶに感染した被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞死から防御することもまた可能である。この作用物質は、生理学的に許容される媒体に含まれたbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子であり得る。本発明のより好ましい態様において、媒体を更に核酸がＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とするように操作する。あるいは、作用物質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させるように細胞内に作用する作用物質である。
【０１２０】
他の態様において、ＨＩＶで感染させた被験体のＴ細胞を、上記のエクスビボおよびインビボ法を組み合わせた方法により細胞死から防御する。本方法は、個体のＣＤ４＋Ｔ細胞を、インビボおよび／またはエクスビボでbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する幾つかの作用物質と接触させることを含む。例えば、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸をＴ細胞に導入し、Ｔ細胞を更に内生bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するために細胞内に作用する作用物質と接触させる。
【０１２１】
あるいは、本発明の方法は、より迅速な感染の除去のために、免疫応答を強化するのに有用である。従って、本発明の具体的態様は、活性化Ｔ細胞をＴ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質と接触させて、細胞死から防御する。Ｔ細胞の活性化に続き、ＣＴ４＋Ｔ細胞を細胞死から防御することにより、ヘルパーＴ細胞が、Ｔヘルパー細胞が通常提供し得る以上の有効な“ヘルプ”を提供できる。同様に、延長寿命を有するＣＤ８＋Ｔ細胞は、通常の寿命のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも標的細胞を溶解できる。本発明の範囲内の方法は、全身感染および局所感染を処置する方法である。従って、作用物質を全身または局所的に投与できる。本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するために細胞内に作用する作用物質である。本発明のより更に好ましい態様において、作用物質は、活性化Ｔ細胞の寿命が必要以上に(例えば、活性化Ｔ細胞が記憶Ｔ細胞になるかまたは感染の除去後に死滅する)長くならないような短い半減期を有する作用物質である。
【０１２２】
４.２.Ｔ細胞死に対する感受性増大が有利な状態への本発明方法の応用
本発明の方法はまた、Ｔ細胞の細胞死に対する感受性の増大にも有用である。従って、通常、内生bcl−ＸＬタンパク質レベル増加により細胞死から防御される状態に遭遇するＴ細胞は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質のレベルが著しく減少すれば死滅する。本発明の方法は、Ｔ細胞関連疾患の被験体の処置に有用である。“Ｔ細胞関連疾患”は、延長寿命を有するＴ細胞に関連する疾患を意味する。
【０１２３】
具体的実施態様において、本発明の方法は、被験者の自己免疫疾患の処置にも有用である。細胞死に対する感受性を自己反応性Ｔ細胞中で増大させ、自己免疫疾患の作用を改善する。処置し得る自己免疫疾患の例は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、関節炎(例えば、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節炎)、ミエスシェニア・グラビス(myesthenia gravis)、心筋炎、ギラン・バレー症候群、全身性紅斑狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、ショーグレン症候群、円形脱毛症、クーロン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚性紅斑狼瘡、硬皮症、膣炎、直腸肛門炎、薬疹、癩反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫葡萄膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳疾患、特発性両側性進行性感音難聴、形成不全貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブン・ジョンソン症候群、特発性スプルー、偏平苔癬、グレーブス眼病、結節症、原発性胆汁性肝硬変、後部葡萄膜炎および肺内部線維症を含む。
【０１２４】
他の態様において、本発明の方法は、移植片拒絶反応の低減に使用する。例えば、移植細胞を、移植片に反応性のＴ細胞を細胞死に対して感受性にするように、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する作用物質と共に宿主に投与する。この方法は、宿主に、ＣＴＬＡ４Ｉｇのような共刺激を遮断する作用物質を投与することも含み得る。同様に、本発明の方法は、移植片対宿主病の予防にも使用できる。好ましい方法において、ドナー骨髄を移植前に宿主細胞およびＴ細胞内のbcl−ＸＬタンパクを減少する作用物質と接触させる。こうして、ドナー骨髄のＴ細胞を細胞死に対して感受性にし、共刺激を阻害する作用物質と併用することで宿主特異的抗原に反応性のＴ細胞の細胞死を増大できる。
【０１２５】
以下は、本発明を更に下記実施例により説明するものであり、これは更に限定するものと見なすべきではない。本出願明細書に引用の全ての参考文献、継続特許出願および公開特許は、参考として本明細書に明示包含する。
【実施例】
【０１２６】
実施例１： 活性化がγ−照射後のＴ細胞の生存を高める
Ｔ細胞生存に対するＴ細胞活性化経路の効果を調べるために、休止Ｔ細胞をヒト末梢血から前から知られているネガティブセレクション法（Ｊune,Ｃ.Ｈ.et.al.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.7：4472−4481）により、分離した。簡単に言うと、細胞を抗体の反応混液の対象とし、休止ＣＤ２８−ポジティブＴ細胞以外のすべての細胞を除去する。ウシ胎児血清（１０％)、Ｌ−グルタミン（２mＭ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ml，１００μg／ml）およびＨＥＰＥＳ（２０mＭ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中でＴ細胞を培養した。細胞は、活性化または照射の前に一夜置いた。
【０１２７】
ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８特異モノクローナル抗体により提供される共刺激の存在または不在下に、培地のみで培養するか、あるいはＴＣＲ／ＣＤ３複合体を１２時間架橋することにより刺激した。Ｔ細胞の架橋はプレート固定化抗−ＣＤ３（Ｇ１９.４〔１μg／mlで〕）を用いて行い、Ｔ細胞の共刺激はＣＤ２８に対する可溶性抗体（モノクローナル抗体(mＡb)９.３）により１μg／mlで実施された。これらの各グループからの細胞はグループに分けた。１つのグループはさらに操作を行わないで培養し、他のグループはセシウム源γ−照射（Ｊ.Ｌ.Ｓhepherd Ｉnc.）による１５Ｇyのγ照射を行った。照射後、細胞は９６ウエル培養皿(Ｃostar)中に100,000細胞／ウエルで入れ、細胞の生存能力および全数をトリパンブルー排除法およびプロピジウムヨージド排除法により調べた。
【０１２８】
プロピジウムヨージド排除法について、２×１０５細胞の２つの分離サンプルを１％ＢＳＡおよび０.０１％ナトリウムアジドを補充したＰＢＳ ０.５mlに入れて、再懸濁した。プロピリジウムヨージド２ml（０.５mg／ml）を細胞に加え、サンプルをＦＡＣＳortおよびＬysis IIソフトウエアを用いたＦＡＣＳで分析した。生存能力パーセントは、プロピジウムヨージドを排除した細胞数を全細胞数で割ることにより求めた。解析による破片を除くために、生存細胞の前進光散布特性を利用した。
【０１２９】
結果を図１に図示する。全３集団の細胞が４日以上の培養期間において高い生存能力を保持した（図１、パネルＡ)。休止および活性化Ｔ細胞の生存もγ−照射後に調べた（図１、パネルＢ)。γ−照射誘発アポトーシスは、特殊なレセプターリガンド干渉を必要とせず、特殊レセプターレベルについてのコントロールの必要性なしに細胞の生存に細胞の活性化がどのように影響するのかを調べる手段とし得る。これらのアッセイに用いた照射量（１５Ｇy）は、実際に全群のすべての細胞に致命的なＤＮＡ損傷を与えるのに充分である。従って、細胞が確保された日数を越えて死ぬ率は、ＤＮＡ障害に対する応答において被ったＰＣＤに抵抗する能力を測定するのに用いられる。
【０１３０】
図１、パネルＢに示されるように、照射後、休止Ｔ細胞の生存能力は、刺激されたリンパ球のいかなる集団にみられるよりも、非常に速く低下した。照射４日後、いずれかの活性化集団におけるＴ細胞は、休止集団の細胞よりも統計的により生存し得た（p＜０.０２)。ＣＤ２８レセプターによって共刺激された細胞は、抗−ＣＤ３のみで刺激された細胞よりも、生存能力の僅かな、しかし再現性ある上昇を示した。抗−ＣＤ３刺激および抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８刺激細胞における細胞生存性が保持されることは、生存能力アッセイに平行してなされた細胞数の測定が細胞の絶対数の変化を示さなかったから、後のＴ細胞増殖の結果ではなかった。さらに、活性化された集団における全細胞は、遅Ｇ１またはＧ２のいずれかにおける細胞周期内に止まった。３母集団における細胞死は、細胞が最初に円鋸歯状になり、次いで核の凝縮およびＤＮＡフラグメンテーションをおこす典型的なアポトーシス性パターンに続いておきる。
【０１３１】
このように、本実施例は、Ｔ細胞の活性化がγ−照射後のＴ細胞生存を高めることを示す。
【０１３２】
実施例２： ＣＤ２８共刺激は抗−ＣＤ３活性化Ｔ細胞の生存能力を増加する
ＣＤ２８共刺激の存在または不在により刺激された細胞間における一つの相違は、これらの細胞により産生されたリンホカインのレベルである（Ｌindsten,Ｔ.et.al.(1989)Ｓince244：339−343)。従来から、生長因子が多様な細胞タイプにおける細胞生存の外的調節で重要な役割を果すことが示唆されている（Ｇroux,Ｈ.et.al.(1993)Ｅur.Ｊ.Ｉmmunol.23：1623−1629),Ｎunez,Ｇ.et.al.(1990)Ｊ.Ｉmmunol.144：3602−3610)。生長因子が共刺激の保護作用の因であるかどうかを決めるために、次の実施例が行われた。
【０１３３】
ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、実施例１記載のように、１２時間、抗−ＣＤ３の存在下にＣＤ２８モノクローナル抗体との共刺激の存在または不在で培養された。細胞は、そのならし培地にそのまま残し、洗い、次いで新しい培地に再懸濁するか、あるいは洗って、組換えＩＬ−２(rＩＬ−２)(Ｂoehringer-Ｍannheim）２００μ／mlを補充した新しい培地に再懸濁された。各グループからのアリコートを無操作のままにするか、または１２Ｇyのγ−照射にさらした。細胞生存能力は、実施例１に記載したように、操作後４日間毎日、プロピジウムヨージド排除法により測定した。
【０１３４】
結果を図２に図示する。図２のパネルＡによると、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のみで活性化されたＴ細胞は、活性化後培養において高い生存能力を保持していた。しかし、刺激細胞を水洗することによるならし培地の除去は、培養中に生存する細胞の能力を著しく低下せしめることにつながった。このインビトロ培養中に生存する能力の低下は、ＩＬ−２の添加により逆転され得る。抗−ＣＤ３刺激細胞に１５Ｇyのγ−照射がなされたとき（図２、パネルＢ)、一夜刺激後のならし培地の除去は、ＩＬ−２添加により逆転された細胞生存性の激しい低下をもたらした。このことは、生存が抗原レセプター活性化細胞における外的生長因子のレベルによって第一義的に決定されることを示している。従って、活性Ｔ細胞が培養中で生存し得る能力は、それがＩＬ−２などの生長因子を生産するオートクリン能力に基づいている。これらのデータは、ＩＬ−２がＴ細胞生存の外的レギュレーターであることを確認する。
【０１３５】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のみで刺激されたＴ細胞についての結果と対照的に、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８併用で刺激されたＴ細胞は内因リンホカインを洗出しても、さらにＩＬ−２を培養上澄液に加えても、その生存に変わりはない（図２、パネルＣおよびＤ）。
【０１３６】
本実施例の結果は、ＣＤ−２８仲介共刺激が細胞生存の外的メディエーターの産生に影響を及ぼさないだけでなく、ＰＣＤを受けた細胞の内因的感受性を調節する役割を演じる（次の実施例でさらに調べる）ことを表している。
【０１３７】
実施例３： Ｔ細胞活性化中のbcl−２およびbcl−Ｘ mＲＮＡ発現
ＰＣＤを受けたＴ細胞の内因的感受性に関与する遺伝子の発現を調節するときのＣＤ２８の役割について調べるために、休止ヒトＴ細胞および抗−ＣＤ２８の存在または不在下のＴＣＲ抗原レセプター複合物の架橋により活性化されたＴ細胞についてbcl−Ｘおよびbcl−２発現レベルを解析した。
【０１３８】
ＲＮＡは、培地のみで培養されたＣＤ２８＋Ｔ細胞から単離され、次いで１,６および１２時間、抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ３と抗−ＣＤ２８で刺激され、ノーザンブロット・ハイブリダイゼイションにより解析された。ＲＮＡは、すでに記述されているように（Ｊune,Ｃ.Ｈ.et.al.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.7：4472-4481)、勾配グアニジウム／ＣsＣl２による遠心分離でＴ細胞から分離した。等量のＲＮＡ（非変性アガロースゲル上で電気泳動した２８ＳリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド着色で検定）をアガロース／ホルムアルデヒド変性ゲル上に充填し、大きさによって分離した。ゲルをニトロセルロース（ＳchleicherおよびＳchuell）に移して、真空で２時間８０℃に加熱する。ブロットは、４２℃６時間Ｓtark液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１×ＳＳＣは０.１５Ｍ Ｎacl，０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)１×Ｄenhardt液，２５mＭ リン酸ナトリウム，pＨ６.５，Ｔorula ＲＮＡ ２５０μg／ml）中でプレハイブリダイズし、次いでＳtark液中で１０％硫酸デキストランおよび３２Ｐ−ラベルニック翻訳プローブ（１×１０６dpm／ml）で一夜４２℃ハイブリダイズした。ブロットをプローブし、次いでヒトbcl−ＸＬ cＤＮＡおよびネズミbcl−２ cＤＮＡに特異なプローブ（Ｓ.Ｋorsmeyer）で剥離した。
【０１３９】
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーションの結果を図３、パネルＡに示す。その結果によると、bcl−Ｘまたはbcl−２ mＲＮＡのいずれも、休止Ｔ細胞において検出レベルでは発現されなかった。しかし、両bcl−２およびbcl−Ｘ mＲＮＡの発現はＴ細胞活性化６時間後に誘導される。ＣＤ２８共刺激はbcl−２ mＲＮＡの発現に顕著な作用を有しなかった。一方ＣＤ２８共刺激はのbcl−Ｘ mＲＮＡ発現を高めた。抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激された細胞は、レベルが低下し始めた後４８時間、bcl−Ｘの高レベルの発現を維持した。bcl−２機能調節等に負の役割を有すと思われるbcl−２ファミリーの第３ナンバーは、遺伝子baxである。共刺激もbax mＲＮＡレベルに影響を与えなかった。
【０１４０】
bcl−Ｘの第１エクソンにおける２つの５'スプライス供与体の代替使用は２つの明白なmＲＮＡ種を生成する。bcl−ＸＬはエクソン１の完全コード領域を保持し、細胞の生存を高めるように機能する。一方、エクソン１内の上流スプライス供与体部位の利用は、エクソン１コード領域内で１８９bp欠失を含むbcl−ＸＳ mＲＮＡをもたらす。Ｂcl−ＸＳタンパク質は、両機能の優性ネガティブレギュレーターとして作用する（Ｂoise,Ｌ.Ｈ.et.al.(1993)Ｃell 74：597−608）。bcl−ＸＳおよびbcl−ＸＬ mＲＮＡは１８９bpによってのみ相違するので、ＲＮase保護は、Ｔ細胞活性および共刺激においてどのbcl−Ｘ mＲＮＡが誘導されたかを決定するために、行われた。
【０１４１】
Ｒnase保護検定は、休止細胞あるいは抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で６または１２時間刺激されたＴ細胞から分離されたＲＮＡについて実施された。Ｒnase保護アッセイは、市販キット（Ａmbion）の説明書に従って実施された。Ｔ細胞ＲＮＡ ３μgを放射性標識リボプローブでハイブリダイズした。このプローブは、bcl−ＸＬ cＤＮＡ＋プラスミド中のpＢluesript ＳＫをＡccＩで切断し、Ｐromegaからのキットを用いてプロモータよりインビトロで転写体を生成せしめて、つくられた。３３６ヌクレオチド・リボプローブはゲル電気泳動により精製され、抽出され、次いで、ＲＮaseＡおよびＲＮaseＴ１の反応混液の添加前に１６時間４２℃でＴ細胞ＲＮＡにハイブリダイズされた。bcl−ＸＬ mＲＮＡによるプローブの保護は２６４ヌクレオチドのフラグメントを生成し、bcl−ＸＳメッセージへのハイブリダイゼイションは放射性標識プローブの１６３ヌクレオチドフラグメントを保護する。保護産物を５％アクリルアミド／７Ｍ尿素シーフェンス・ゲル上で分離した。末端ラベルpＢluescript ＳＫII＋ＨpaII消化はマーカーとして用いた。ゲルを乾燥し、ＸＡＲ−５フィルム（Ｋodak）に感光した。
【０１４２】
Ｒnase保護アッセイの結果を図３パネルＢに示す。その結果によると、ＣＤ２８共刺激により調節が上昇された主なbcl−Ｘ mＲＮＡは、bcl−ＸＬである。小さい誘導もbcl−ＸＳのレベル上でみられる。
【０１４３】
そのように、本実施例の結果は、ＣＤ２８による活性Ｔ細胞の共刺激がbcl−ＸＬ mＲＮＡに顕著な増加をもたらすことを示している。
【０１４４】
実施例４： Ｔ細胞がＢcl−２タンパク質の構成的発現を発揮する
bcl−２ mＲＮＡのレベルがbcl−２タンパク質のレベルとあまり相関しないことは前に報告されているので（Ｃhleq-Ｄechamps,Ｃ.Ｍ.et.al.(1993)Ｂlood,81：293−298)、抗−ＣＤ２８で共刺激されるか、またはされない活性Ｔ細胞中のbcl−２タンパク質の量を測定した。
【０１４５】
この実施例において、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は上記のように抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体と共に０、６、１２または２４時間培養され、bc−２タンパク質レベルが免疫沈降法およびウエスタンブロット法により測定された。各時点で、各培養条件の細胞４×１０７が分離され、１.０ml ＮＥＴ−Ｎ（１００mＭ ＮaＣl，１mＭ ＥＤＴＡ ２０mＭ Ｔris，pＨ８.０，０.２％ＮＰ−４０）中に溶解された。核および細片は２分間４℃の微遠心で除去された。上澄液を３０分間パンソルビン（Ｃalbiochem）５０mlで処理した。遠心でパンソルビンを除いた後、上澄液を２つの等量（４５０μl）に分け、それに抗−bcl−Ｘウサギ血清（実施例５参照）１μgまたはハムスター抗−Ｂcl−２モノクローナル６Ｃ８（Ｈockenbery,Ｄ,et.al.(1990)Ｎature348：334−336）２.５μgのいずれかを加えた。溶解生成物を４℃で１時間振動し、次いで３０分間でタンパク質Ａアガロース（Ｇibco ＢＲＬ）２５μlを加えた。免疫沈降物を採取し、ＮＥＴ−Ｎで２回、ＮＥＴで１回洗った。２×ＳＤＳ充填緩衝液１００μlを加え、素早く凍らせ、ゲル電気泳動を行うまで−２０℃に保持した。
【０１４６】
免疫沈降物を煮沸し、１５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルは、２００mＡで３時間、ＢioＲad移送器を用いて電気ブロットによりニトロセルロースに移した。ブロットを一夜４℃で５％非脂肪ミルク／０.２％ツイン２０中でブロックし、上記のブロット液中で精製６Ｃ８ mＡb(１：200）とハイブリダイズした。ウエスタン・ブロットをＨyperfilm（Ａmersham）を有するＥＣＬシステム（Ａmersham）を用いて展開した。
【０１４７】
ウエスタン・ブロットの結果を図４に示す。休止末梢血Ｔ細胞がＢcl−２タンパク質を高レベルで発現することが分かる。さらに、Ｂcl−２タンパク質のレベルがＴＣＲ／ＣＤ３レセプターの抗−ＣＤ３抗体での架橋後の最初の２４時間以後あまり変動しない。ＣＤ２８レセプターでの共刺激もＢcl−２タンパク質レベルに影響を与えないようであった。
【０１４８】
本実施例は、休止Ｔ細胞がＢcl−２タンパク質を発現し、共刺激あり、または、なしのＴ細胞レセプターでのＴ細胞刺激がＢcl−２タンパク質レベルを上昇しないことを示す。
【０１４９】
実施例５：ＣＤ２８共刺激はbcl−Ｘ１タンパク質発現を高める
本実施例において、休止Ｔ細胞およびＣＤ２８２の共刺激の存在または不在でＴ細胞レセプターで活性化されたＴ細胞におけるbcl−Ｘ１のタンパク質レベルを解析した。
【０１５０】
bcl−Ｘ１のタンパク質レベルは、Ｂcl−２のタンパク質レベルの測定と平行して、実施例４に記載されたアッセイ法によって測定された。あらかじめ清澄化した後、上澄液を２等量（４５０μl）に分け、抗−bcl−Ｘウサギ血清１μlをこれらのアリコートの１つに加えた。タンパク質レベルは、モノクローナル抗−bcl−Ｘ抗体２Ａ１（１：１希釈）を用いて実施例４のように測定した。
【０１５１】
bcl−Ｘに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を次のように製造した。bcl−ＸＳのオープン・リーディング・フレーム(転写解読枠)をプライマー（５'−ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ−３’および５'−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＴＣ ＡＴＴ ＴＣＣ ＧＡＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＣＡ Ｇ−３’）でのＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ−３ｂのＮdeＩおよびＢamＨＩ部位（Novagen）にクローン化した。組換えタンパク質を０.４mＭ ＩＰＴＧでの誘導によりＢＬ２１細胞中で製造した。このタンパク質は、細菌溶解の不可溶フラクション中にあると測定され、次のように部分的に精製された。不可溶フラクションを２Ｍ尿素で洗い、６Ｍグアニジン−ＨＣｌで安定化した。タンパク質は、３Ｍおよび１Ｍグアニジン−ＨＣｌによる段階透析により再生し、次いでpＨ８.３で５００mＭ ＫＣｌでＰＢＳに対する透析を行った。タンパク質濃度は、市販キット（ＢioＲad）を用いたＢradfordアッセイ法により測定し、タンパク質純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコーマシックブルー着色法によりアッセイした。
【０１５２】
ウサギポリクローナルの抗体の製造のために、組換えタンパク質１mgを完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）に懸濁し、ウサギの脊中の数箇所に皮下注射した。不完全フロイント・アジュバント中のタンパク質２００μgで追加免疫した。インビトロ翻訳タンパク質およびトランスフェクトション細胞系列を用いて、組換えタンパク質に対して、および特異的免疫沈降についてのウエスタンブロット法で血清を選別した。
【０１５３】
モノクローナル抗体の製造のために、ＣＦＡ中に乳化したポリアクリルアミドゲル中の組換えbcl−ＸＳを後足の皮下および腹腔内投与して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した。マウスの免疫は、不完全フロイント・アジュバント中に乳化した可溶性のアクリルアミド基底ゲル結合タンパク質の混合物で、３０日の間隔をおいて２度、追加免疫した。最後の追加免疫から３日後に、脾臓およびリンパ節細胞を採取し、標準的技術（Kearney,J.F.(1984)In Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,NY,751-766）を用いて、Ｐ３Ｘ６３−Ａg８.６５３ミエローマ細胞と融合せしめた。融合１５日後、ハイブリドーマ上澄液について、ホウ酸塩緩衝液中（ｐＨ８.４）５μg／mlで組換えbcl−ＸＳによりコートされたウエルにおいてＥＬＩＳＡによる活性を調べた。ＥＬＩＳＡに陽性であったハイブリドーマをbcl−ＸＬまたはbcl−２でトランスフェクションさせたＦＬ５.１２に対するウエスタンブロットにより選別した。陽性ハイブリドーマ系は、制限希釈によりクローンし、再選別し、腹水製造のためにプリスタン−初回免疫ＢＡＬＢ／Ｃマウスに注射した。
【０１５４】
bcl−Ｘのタンパク質レベルを表すウエスタンブロット解析の結果を図４に示す。bcl−Ｘのタンパク質レベルは、Ｔ細胞活性化のレベルによって非常に変化する。検出可能なbcl−Ｘタンパク質産物は休止末梢Ｔ細胞において測定されなかった。ウエスタンブロットで抗体により認識されたタンパク質は、対応ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞中に合成されるbcl−ＸＬと同様にインビトロ翻訳bcl−ＸＬが約２９kＤaであるので（Ｂoise,Ｌ.Ｈ.et al.(1993)Ｃell 74:597-608)、bcl−ＸＬに対応し、bcl−ＸＳに対応していない。
【０１５５】
図４はさらに、休止Ｔ細胞の抗−ＣＤ３刺激が、刺激６時間後に最初にみられ、次いで分析の２４時間を通して細胞中に蓄積する検出可能なbcl−ＸＬタンパク質の発現を誘発することを表している。さらに抗−ＣＤ３刺激細胞のＣＤ２８共刺激は、bcl−ＸＬの発現を有意に高めた。bcl−ＸＳではいかなる時点でもみられなかった。
【０１５６】
他の例では、休止Ｔ細胞は、培地のみ、抗−ＣＤ２８，抗−ＣＤ３，抗−ＣＤ３，および抗−ＣＤ２８または抗−ＣＤ３およびＩＬ−２（１００μ／ml）により２４時間で活性化された。細胞質抽出物を記載のように調製し、タンパク質１００μgをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびポリクローナルbcl−Ｘ血清と共にウエスタンブロット分析に供した。
【０１５７】
その結果を図５に示すが、休止Ｔ細胞および抗−ＣＤ２８でインキュベートしたＴ細胞は、bcl−ＸＬタンパク質を発現しなかった。しかし、抗−ＣＤ３刺激細胞のＣＤ２８共刺激は、bcl−ＸＬタンパク質の発現を有意に高めた。２４時間点の抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８刺激細胞におけるbcl−ＸＬ発現レベルは、脾臓ホーカス形成ウイルス長期リピートのコントロール下で、bcl−ＸＬの発現がなされている安定なトランスフェクタントのレベルと同じであった（図５の最終欄）。
【０１５８】
ＣＤ２８共刺激は、早ければ刺激６時間後に観測され、２４時間培養中継続するbcl−ＸＬタンパク質の蓄積を高めた（図４および５）。一方、抗−ＣＤ３およびＩＬ−２（１００units／ml）での細胞処理は、抗−ＣＤ３のみで処理されたレベル以上にはbcl−ＸＬ発現をさらに高めなかった（図５）。さらに、ＣＤ２，ＣＤ５，ＣＤ１１a，ＣＤ１８に対するまたはＭＨＣクラスＩに対するモノクローナル抗体で抗−ＣＤ３−活性Ｔ細胞を処理しても、bcl−ＸＬレベルは抗−ＣＤ３のみで処理した細胞以上には高まらない。
【０１５９】
これらの結果は、休止Ｔ細胞がbcl−Ｘタンパク質を発現せず、抗−ＣＤ３で活性化されたＴ細胞がbcl−Ｘタンパク質を発現し、抗−ＣＤ３で活性化され、および抗−ＣＤ２８で共刺激されたＴ細胞がより顕著にbcl−Ｘタンパク質を発現することを示している。
【０１６０】
実施例６：bcl−ＸＬはJurkat Ｔ細胞におけるＦas−および抗−ＣＤ３誘導ＰＣＤを防止する
Ｔ細胞系に対するＦas架橋はアポトーシスの速い誘導をもたらす。しかし、正常Ｔ細胞は、長い時間がかかって活性化されるまでは、Ｆas−架橋に対する応答において細胞死に対し感受性にならない（Klas,C.et al.(1993)Int. Immunol. 5:625-630）。細胞は迅速に誘導されて、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８による活性化の２４時間中に細胞表面に高レベルのＦasを発現する。Ｆasレベルは、培養中、次の数日間一定である。これにもかかわらず、アポトーシスを誘導するＦas−架橋の能力は、刺激７２時間後まで明らかでなく、次いで培養中次の数日間以上でより効果的に増大する。本例は、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルがＦas誘導細胞死に対する抵抗性と相関することを表している。
【０１６１】
Ｔ細胞は、１２０時間かけて培地のみまたは抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化された。細胞質溶解産物が調製され、上記のようにポリクローナル抗−bcl−ＸＬ抗体で着色したウエスタンブロット法で分析された。同時に、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８刺激Ｔ細胞を０.５μg／ml ＣＨ−１１抗−Ｆasモノクローナル抗体（Ｐanvera）またはアイソタイプ・コントロール（ＩgＭ）で１２０時間の２４時間の間隔で２４時間、処理した。生存性を上記のようにプロピジウムヨージド排除法により調べた。Ｆas表面発現は、３０分間のＦＩＴＣ共役抗マウスＩｇＭ（Sigma）に続けて、３０分間ＣＨ−１１で着色することにより、確認された。着色細胞は、ＬysisＩＩソフトウェアを用いた流細胞計算（FACSort, Becton-Dickinson）により分析した。
【０１６２】
抗Ｆas抗体で架橋したＴ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルよび生存性を図６に示す。抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８共刺激後、Ｔ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルのピークは２４−４８時間にあって、その後徐々に低下した。図の下半分に示すように、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で２４または４８時間処理され、次いでＦasで架橋された細胞は、細胞死に対して完全に耐性である。しかし、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８での刺激後のかなり遅い時点で、抗−Ｆas抗体でＴ細胞が架橋されたときは、細胞生存能力が低下した。このようにbcl−ＸＬの存在はＦas誘導細胞死に対するＴ細胞の防御と相関する。
【０１６３】
bcl−ＸＬタンパク質がＦas−架橋誘導細胞死に対する耐性を誘導することをさらに明らかにするために、Ｊurkat細胞をbcl−ＸＬコードする発現ベクターでトランスフェクトし、細胞生存能力を抗Ｆas抗体を加えて測定した。
【０１６４】
Ｊurkat細胞は上記のように培地中に保持し、ｐＳＦＦＶＮeo−bcl−ＸＬ（Ｂoise,Ｌ.Ｈ．et.al.(1993)Ｃell 74：597−608）またはＧene ＰulserでのエレクトロポレーションによるｐＳＦＦＶＮeo（ＢioＲad）で２５０Ｖおよび９６０μＦにおいてトランスフェクションした。トランスフェクション体をＧ４１８（Ｓigma）で１mg／mlにおいて選択し、いくつかの独立クローンを制限希釈によって分離した。ウエスタン・ブロット分析は、高いbcl−ＸＬタンパク質レベルがbcl−ＸＬ発現ベクターでトランスフェクションさせたクローン中に存在すること、および対照ベクター（Ｎeoクローン）でトランスフェクションさせたクローン（Ｎeoクローン）がbcl−ＸＬタンパク質を発現しないことを表している（図７、パネルＣ）。bcl−ＸＬトランスフェクション体中のbcl−ＸＬレベルは、共刺激２４時間にＴ細胞中の発現レベル匹敵した（参照、例えば図５）。クローン上のＦas発現は上記した着色によって確認された。
【０１６５】
表面で比較可能レベルのＦasを発現した３つのbcl−ＸＬおよび３つのＮeoは、培地中２.５×１０５細胞／mlでインキュベートされ、１０ng／mlのＦas抗体またはアイソタイプ適合対照で処理され、次いで生存性がプロピジウムヨージド排除法により調べられた。Ｊurkat細胞クローンの生存能力を図７、パネルＡに示す。グラフから、Ｆasが全３対照トランスフェクション体に迅速な細胞死（４８時間で１０％の生存能力）をもたらし、一方、３bcl−ＸＬトランスフェクション体は実験中を通じて６０％以上の生存能力であることが分かる。neo−およびbcl−ＸＬ−トランスフェクション体のいずれも、抗体もあるいはアイソタイプ適合対照mＡb(ＩgＭ）が用いられなかったときは、生存能力が低下することを示している。このようにbcl−ＸＬはＪurkat細胞におけるＦas−誘導細胞死を実質的に阻止する。
【０１６６】
抗−ＣＤ３−架橋がＴ細胞クローンおよび細胞ラインにおいてアポトーシスを誘導することは報告されている（Ｓhi,Ｙ.et.al.(1989) Ｎature339：625−626)，Ｕcker,Ｄ.Ｓ.et.al.(1989)Ｊ.Ｉmmunol.143：3461−3469）。ＴＣＲ誘導細胞死を防止するbcl−ＸＬの能力を検討するために、Ｊurkatトランスフェクション体を抗−ＣＤ３で刺激し、その生存を調べた。抗−ＣＤ３誘導細胞死は１μg／mlでプレート結合抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）でもって行われ、プロピジウムヨージド排除法により毎日、調べられた。
【０１６７】
結果を図７、パネルＢに図示する。８４時間で抗−ＣＤ３処理は、Ｎeoクローン培養において３０−６０％の細胞死をもたらした。一方、抗−ＣＤ３誘導細胞死は、bcl−ＸＬの存在によってほとんど完全に阻止された（図７、パネルＢ)。
【０１６８】
このようにbcl−ＸＬタンパク質は、Ｆas−およびＴ細胞レセプター架橋誘導細胞死からＴ細胞を保護することができる。
【０１６９】
実施例７：ｂｃｌ−ＸＬはＩＬ−２とは無関係に機能してＴ細胞生存を強化し得る
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の架橋により活性化されたＴ細胞の生存に対するＩＬ−２の効果のアッセイに基づくと、ＩＬ−２は抗原活性化Ｔ細胞の生存能力の維持における生存因子として機能し得るようである。ＣＤ２８共刺激は、上清中の成長因子レベルとは無関係にＴ細胞の生存をもたらすようであるが、ＣＤ２８刺激化細胞の生存強化は、単にＣＤ２８共刺激により産生された高いレベルのＩＬ−２の結果だけではないということを除外することは難しい。ＣＤ２８共刺激細胞中で産生された高いレベルのＩＬ−２があると、充分に洗浄してもリンホカインの効果を完全に除くことは不可能である。ＣＤ２８−共刺激細胞により産生された高いレベルのリンホカインは、培養上清中に検知可能なリンホカインの蓄積がなくても、オートクリン様式で細胞に影響を与えることができる場合もある。本実施例は、bcl−ＸＬタンパク質は、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系がＩＬ−２使用中止によリＰＣＤを受けるのを防御し得ることを実証する。
【０１７０】
ＣＴＬＬ−２は、培養中での生存および増殖がＩＬ−２に依存しているＴ細胞系である（Gillis,S.およびSmith,K.A.(1977)Nature 268:154-156）。これらの細胞は、それら自身のＩＬ−２を分泌するように誘導され得ないので、ＩＬ−２のバイオアッセイにしばしば使用される。ＣＴＬＬ−２細胞はβ−メルカプトエタノール（50μＭ）および組換えＩＬ−２（100単位／ｍｌ）を加えて、上記成長培地中で維持した（Nunez,G.et al.(1990)J.Immunol.144:3602-3610）。細胞を、２５０Ｖおよび９６０μＦにて、ジーンパルサー（Gene Pulser、Bio Rad）を用いた電気処理により発現ベクターｐＳＦＦＶＮｅｏ−bcl−ＸＬ（Boise,L.H.et al.(1993)Cell 74:597-608）を用いてトランスフェクションさせた。トランスフェクション体を、２５０μｇ/ｍｌＧ４１８で選別し、bcl−ＸＬ陽性クローンをウエスタンブロット解析により同定した。ＣＴＬＬ−２細胞（２.５×１０６）を５０ｍｌＮＥＴ−Ｎに溶解し、核および残骸を上記のように除去した。５０μｌの２×ＳＤＳローディング緩衝液を上清に加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを上記のように行った。
【０１７１】
高いレベルのbcl−ＸＬタンパク質を発現する２つのbcl−ＸＬクローン（図７パネルＥ）をＩＬ−２の不在下、培養液中での生存能力について試験した。これらのクローンは、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８活性化Ｔ細胞と似たレベルのbcl−ＸＬを発現した。bcl−ＸＬ発現細胞を欠乏の１日前に３×１０５細胞／ｍｌの新鮮培地中で培養した。ついで細胞をＩＬ−２を含まない新鮮培地中で３回洗浄し、同培地に再懸濁した。指定された日にプロピジウムヨージドを排除することにより生存能力を測定した。結果は、図７のパネルＤにグラフで示す。親細胞系と比較した場合に比べて、ＩＬ−２の不在下で両方のbcl−ＸＬトランスフェクションクローンの生存が強化された（図７、パネルＤ）。このように、bcl−ＸＬはＩＬ−２の不在下でＴ細胞の生存を強化するように機能し得る。またこれらのクローンについて、図２で示されたアッセイと似たアッセイ系において、照射誘導死に関する試験を行った。ＩＬ−２の不在下または存在下のいずれかで試験した対照細胞と比較した場合、bcl−ＸＬを発現するクローンは、照射誘導死から顕著に防御されることを示した。このように、本実施例は、bcl−ＸＬタンパク質は、Ｔ細胞をＩＬ−２欠乏により誘導された細胞死から防御することを実証する。
【０１７２】
実施例８：ＣＤ２８共刺激によるbcl−ＸＬの発現は進化的に保存されている
bcl−ＸＬ発現を調節するＣＤ２８共刺激の能力は、マウスおよびヒトの間で保存されているかどうかを決定するために、ネズミリンパ節から単離した細胞を、可溶性抗−ＣＤ３を用いて活性化し、bcl−ＸＬ発現を測定した。
【０１７３】
リンパ節をＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson laboratories）から採取し、単一の細胞懸濁液をナイロン網を通過させて調製した。細胞を、１０％ウシ胎児血清アルブミン、ペニシリン（100Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（100Ｕ／ｍｌ）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭβ−ＭＥおよび０.１ｍＭ非必須アミノ酸を追加したＤＭＥＭ（GIBCO BRL）からなる完全培地中２×１０６／ｍｌで培養した。可溶性抗−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、１０μｇ／ｍｌ J.Bluestoneから）を単独、または抗−ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（100μｇ／ｍｌ、Repligenから）との組み合わせで加えた。培養液を２４時間で３７℃、７％ＣＯ２でインキューベートし、ウエスタンブロット解析用に採取した。ネズミリンパ球（５×１０６）を、５０μｌＮＥＴ−Ｎで溶解し、核および残骸を上記のように除去した。５０μｌの２×ＳＤＳローディング緩衝液を上清に加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを上記のように行った。生存能力を研究するために、細胞を上記のように処理した。活性化後のＴ細胞の生存能力を、Ｔｈｙ−１陽性細胞からプロピジウムヨージドを排除することにより測定した。
【０１７４】
結果は、図８に示されているように、ヒトＴ細胞の場合と同じように、休止ネズミリンパ球は全く検知可能なbcl−ＸＬを発現しないことを示す。共刺激シグナルを伝達するためにアクセサリー細胞が存在する場合、２４時間の可溶性抗−ＣＤ３処置により、Ｔ細胞にbcl−ＸＬ発現を誘導した。このbcl−ＸＬのレベルは、この共刺激シグナルが抗−ＣＤ２８の添加により増幅される場合に上昇した。対照的に、アクセサリー細胞の存在下における可溶性抗−ＣＤ３のbcl−ＸＬ発現をアップレギュレーションする能力は、ＣＤ２８リガンドＢ７−１およびＢ７−２がＣＤ２８と相互作用するのを競争的に阻害することによりＣＤ２８の共刺激を妨げる試薬である、ＣＴＬＡ４Ｉｇを加えることによりほぼ完全に阻害される。これらのデータは、マウスＴ細胞におけるbcl−ＸＬ発現は細胞が活性化される間に誘導されることを実証する。さらに、抗ＣＤ３の副次的な細胞分裂誘導性用量において、bcl−ＸＬ発現の誘導はほぼ完全にＣＤ２８共刺激に依存する。この発現パターンは、bcl−ＸＬがマウスの活性化Ｔ細胞生存において役割を果していることを実証する。この可能性と合致して、抗−ＣＤ３のみで刺激した未分離のリンパ節細胞集合由来のＴｈｙ−１陽性細胞の生存能力は、７２時間後に６２％であった。対照的に、抗−ＣＤ２８の添加により、Ｔｈｙ−１陽性細胞の生存能力は８８％に上昇した。逆に、ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いてリンパ節細胞内のＣＤ２８／Ｂ７仲介共刺激を阻害することにより、活性化Ｔ細胞の生存能力は７２時間で２０％に減少する。
【０１７５】
このように、本実施例は、bcl−ＸＬはヒトＴ細胞と同様に、マウスＴ細胞においても同じ発現パターンを有すことが示され、すなわち、bcl−ＸＬタンパク質は休止Ｔ細胞に存在せず、bcl−ＸＬタンパク質はＴ細胞受容体の架橋を介して活性化されたＴ細胞中に発現され、bcl−ＸＬタンパク質レベルはＣＤ２８を通した共刺激によりさらに増加することを示す。
【０１７６】
実施例９：bcl−ＸＬ発現はＨＩＶ−１−誘導細胞死を妨げ得る
bcl−ＸＬ発現はＴ細胞をＨＩＶ−１−誘導細胞死から防御するかどうかを決定するために、上記のｐＳＦＦＶＮｅｏ−bcl−ＸＬ（bcl−ＸＬ）、またはベクターのみ（Ｎｅｏ）を用いてトランスフェクションさせたJurkat細胞クローンをＨＩＶを用いて感染させ、生存能力を測定した。
【０１７７】
bcl−ＸＬ発現ベクターを用いてトランスフェクションさせた３つのJurkat細胞クローンおよび対照ベクターを用いてトランスフェクションさせた３つのJurkat細胞クローンをＨＩＶ−ＲＦ単離物の細胞を含まないウイルスストックの様々な希釈液を用いて感染させた。感染の１２日後、細胞死をテトラゾリン／ホルマザンアッセイにより定量した（Shearman,M.S.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1470-1474;Hansen,M.B.et al.(1989)J.Immun.Methods 119:203-210 参照)。
【０１７８】
３つの細胞系の平均生存能力を図９にグラフで示す。１：４から１：２５６で希釈したウイルスストックを用いて感染させた場合、対照Jurkat細胞において細胞死の割合が高かった。対照的に、bcl−ＸＬ遺伝子を発現するトランスフェクションJurkat細胞はこれらの同じウイルス希釈において、生存能力における欠陥は全くなかった。
【０１７９】
bcl−ＸＬ発現の防御効果は、ＨＩＶ−１感染への耐性に起因するか、または細胞死の誘導における、より特定した効果に起因するかどうかを決定するために、感染細胞の上清中のウイルス量をSpearmanおよびKarberの方法により感染７日後に定量した。Spearman-Karber法は、『Richman D.B.,Johnson V.A.,Mayrs V.L.(1993）抗ＨＩＶ活性に対する実験作用物質のin vitro評価』に記載されている。Current Protocols in Immunology ch.12.9.,Colligan J.E.et al.、GreeneおよびWiley編、Interscience ＮＹ。
【０１８０】
結果は表１に示す。対照細胞に比較し、bcl−ＸＬ発現細胞の上清中のウイルス量は約４倍減少した。
【０１８１】
【表１】
【０１８２】
これらの例の結果は、bcl−ＸＬタンパク質は、ＨＩＶ誘導細胞死からＴ細胞を防御することを実証する。この効果はＨＩＶ感染の間のＣＤ４細胞の減少を防御するのに有益であり得る。本結果は、ＨＩＶ感染をもつ患者における過剰細胞死の１つの機構は、これらの患者におけるＴ細胞活性化のある形は非感染個体と匹敵するレベルのbcl−ＸＬ発現を誘導できないであろうことを示唆している。このように、ＨＩＶ感染の治療法の１つは、ex vivoでの細胞活性化および増幅、またはＣＤ２８シグナル形質導入のin vivo誘導により、bcl−ＸＬ発現の誘導を回復することである。その他に、bcl−ＸＬ発現の誘導は、ＣＤ２８を刺激する作用物質以外の作用物質を用いて刺激することにより達成され得る。これらのデータにより、ＣＤ２８のbcl−ＸＬ発現を亢進する能力は、過剰リンパ細胞死が起こる免疫不全の状態時、特にプログラム化細胞死が末梢血Ｔ細胞およびリンパ節Ｔ細胞で起こるＨＩＶ感染時における臨床用途になり得ることを示す。
【０１８３】
実施例１０：ＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣの抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８刺激は、細胞を細胞死から防御するに充分なレベルのbcl−ＸＬタンパク質を増加させる結果となる
本実施例は、ＰＢＭＣまたはＨＩＶ感染個体由来のリンパ球を、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激すると、細胞をアポトーシスから防御するに充分なレベルのbcl−ＸＬタンパク質になるように増加することを実証する。
【０１８４】
無症候性のＨＩＶ感染個体における臨床的免疫不全の経緯は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の段階的なしかし進行性の欠失により特徴づけられる。ＨＩＶ感染患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の減少機構は現在のところ知られていないが、最近の証拠により、これらの細胞は活性化シグナルに応答してアポトーシスに対して異常に感受性をもつことが示される。ＨＩＶ疾患におけるアポトーシス防御タンパク質であるｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘの役割を、ＨＩＶ感染無症候性個体由来の非刺激アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）刺激および抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えた刺激試料において測定した。
【０１８５】
ＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣを以下のように得た。ヘパリン化血液サンプルを、インフォームドコンセントの後に、ＨＩＶ感染（ｎ＝２５）およびＨＩＶ負の対照（ｎ＝１５）から静脈穿刺により得た。患者を、ウォルターリードステージングシステム（Redfield,R.R.et al.(1986)New Engl.J.Med.314:131-132）に基づく、無症候性初期および中期段階の患者（＞５００および２００−５００ ＣＤ４細胞／ｍｍ３）として特徴づけた。サンプルをすぐに処理した。新しく単離した単核細胞を、無菌ＨＢＳＳ（Bio Whittaker、Walkersvile MD）で１：１に希釈しておいた血液軟膜から得、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）で遠心分離した。サンプルの生存能力は、一般的に９５％よりも大きかった。特記しない限り、ＰＢＭＣは、２４穴プレート中で１０％ＦＣＳ（Ｔ細胞培地）を追加したＲＰＭＩ１６４０中で１×１０６細胞／ｍｌで４８時間培養した。ＰＷＭ（Sigma Chemical Company、セントルイス ＭＯ）を用いて１０μｇ／ｍｌで細胞を刺激した。ＣＤ３のみ、またはＣＤ２８を介する細胞の刺激は、Weng,N.P.et al.(1995)PNAS USA92:11091-11094に記載されているように、磁気ビーズに結合しているヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体により架橋された抗−ＣＤ３、または抗−ＣＤ３およびＣＤ２８ｍＡｂの組み合わせを用いて行なった。Jurkat細胞を、ここで記載されているｐＳＦＦＮｅｏ−bcl−ＸＬまたはｐＳＦＦＶＮｅｏ構築物のいずれかでトランスフェクションさせ、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Sigma Chemical Company）を含有するＴ細胞培地に維持し、ｂｃｌ−ｘ染色の陽性対照として保存した。
【０１８６】
細胞中のｂｃｌ−Ｘおよびｂｃｌ−２タンパク質の量を、以下のように行う分子内染色およびフローサイトメーターに基づいたｂｃｌ−Ｘの単一の細胞の検知を可能とする方法により決定した。ＰＢＭＣを採取し、１×１０６細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液（ｐＨ７.２）で３０分間室温で固定した。サンプルをＰＢＳ中で洗浄し、ついで、細胞を浸透させるために５分間ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中に再懸濁した。ＰＢＳで洗浄後、２０％ヒトＡＢ型血清（Sigma Chemical Company）および１μｇ／ｍｌ抗−ｂｃｌ−Ｘモノクローナル抗体７Ｂ２（Craig Thompson、シカゴ大学）、または１μｇ／ｍｌハムスター抗−ｂｃｌ−２ｍＡｂ ６Ｃ８（PharMingen、Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア）を含む１００μｌＰＢＳ中に１時間４℃で再懸濁した。ＩｇＥアイソタイプ適合ｍＡｂｓは、抗−Ｂｃｌ−ｘおよび抗−Ｂｃｌ−２で染色したサンプルの対照として使用した。一次抗体を用いてインキュベーションした後、サンプルをＰＢＳ＋０.０５Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で洗浄し、１００μｌＰＢＳ＋０.０５％ヤギＦ(ａｂ)２抗−マウス（Ｈ＋Ｌ）中に再懸濁した。ＦＩＴＣ（Gibro Life Technologies）を３０分間４℃で加えた。抗−Ｂｃｌ−２で染色したサンプルを３０分間４℃で、２０μｇ／ｍｌＦＩＴＣ−抗−ハムスターＩｇＧ混合（PharMingen）を用いてインキュベーションした。最後に、サンプルをＰＢＳ中で洗浄し、染色後、２〜４８時間フローサイトメーターにより解析した。この時間枠の中では、ｂｃｌ−ｘで染色した細胞のパーセンテージが減少した事実はなく、また、平均蛍光強度も変化はなかった。
【０１８７】
このアッセイは実質的にbcl−ｘＬのレベルよりもむしろ、ｂｃｌ−ｘ（すなわちbcl−ｘＬおよびｂｃｌ−ｘＳ）のレベルを測定するものであるが、免疫沈降実験により示されたところによると、これらの条件下で測定したｂｃｌ−ｘタンパク質の大部分はbcl−ｘＬに対応する。
【０１８８】
ＨＩＶ感染サンプル由来の非刺激ＰＢＭＣにおけるｂｃｌ−ｘで染色した細胞の平均蛍光強度およびパーセンテージは、ＨＩＶ非感染対照においてみられるレベルと差はないが、ｂｃｌ−Ｘ発現は、ＰＷＭおよび抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたものを用いて活性化後の非感染対照におけるものよりも、ＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣにおける方が低かったことを示す。しかしながら、このｂｃｌ−Ｘタンパク質レベルは、細胞を細胞死から防御するのに十分である。これは、例えば、下記のように、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８またはＰＷＭを用いて様々な場合に刺激した後にＨＩＶ感染個体および非ＨＩＶ感染対照個体由来のｂｃｌ−Ｘタンパク質の量およびＰＢＭＣのアポトーシスのレベルを比較することにより実証された。
【０１８９】
ＰＢＭＣにおけるアポトーシスは、ＴｄＴにより触媒されたｄＵＴＰを用いてＤＮＡ一本鎖崩壊をラベルすることにより測定した（Li、X、et al(1995)Cytometry20:172-180)。フローサイトメーター解析を使用してＰＷＭまたは抗ＣＤ３に抗ＣＤ２８を加えたもののいずれかを用いて刺激したＰＢＭＣの培養中における消滅細胞を定量した。このアッセイは以下のように行った。ＰＢＭＣを採取し、トリパンブルー排除により生存能力を測定し、１×１０６細胞を１０分間、氷上で１％ホルムアルデヒド（ｐＨ７.４）溶液を用いて固定した。サンプルをＨＢＳＳ中で洗浄し、細胞ペレットを７０％エタノール中に再懸濁し、−２０℃で２時間〜３日貯蔵した。ＨＢＳＳで１回洗浄した後サンプルを３０分間３７℃で、０.５ｎＭビオチン１６−ｄＵＴＰ（Boehringer、Indianapolis IN）および１０単位のＴｄＴ（Boehringer）を含有する５０μlターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応混合物（０.１Ｍカルボン酸、１ｍＭＣｏＣｌ２、０.１ｍＭジチオトレイトールおよび５０μlＢＳＡ）中に再懸濁した。ＨＢＳＳで洗浄後、２.５μｇ／ｍｌＦＩＴＣアビジン（Gibco Life Technologies、Gaithersburg、MD）を染色溶液（４×ＳＳＣ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および５％非脂肪乾燥ミルク）に加え、サンプルを１５分間室温でインキュベーションした。０.５μｇ／ｍｌヒト抗−Ｆａｓ抗体（Upstate Biotechnology Inc.Lake Placid NY）で２４時間処理したJurkat細胞をアッセイの陽性対照として使用し、一方、ＴｄＴを欠損しているサンプルを負の対照として使用した。サンプルをELITE-ESP（Coulter Inc.、Kindal FL）フローサイトメーターを用いた細胞蛍光アッセイにより解析した。５千から１万の細胞を、ｌｏｇ９０度散乱とｌｏｇＦＩＦＣ強度のパラメーターを用いて計算した。消滅細胞を、低い前角および低い９０度散乱を有するＦＩＴＣ陽性細胞として定義した。トリパンブルー排除に基づく生存能力により、ＴｄＴを基礎とするアッセイの信頼性が確認された。
【０１９０】
ＰＷＭおよび抗−ＣＤ３を抗−ＣＤ２８に加えた刺激サンプルに起こるアポトーシスに関連したｂｃｌ−ｘ誘導の動力学を測定するために、３つのＨＩＶ感染および３つのＨＩＶ負の対照を培養の０時間、２４時間、４８時間および７２時間目に実験した。平均パーセンテージとして示したように、結果は図１０、パネルＡ−Ｄに示す。ＰＷＭで処理した対照サンプルでは、ｂｃｌ−ｘ発現は、２４時間から４８時間の間で増加したが、アポトーシスのレベルは低いままであった。抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので処理した対照サンプルにおいて、アポトーシスの低いレベルのみは明白であるが（図１０、パネルＡ）、ｂｃｌ−ｘのレベルは急激に増加した。これらのＨＩＶ負の対照においては、芽球化反応および細胞数の増加が両方の培養条件下で起こり、これは細胞が増殖していることを示す。ＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣのＰＷＭ刺激培養は、４８時間で高いレベルのアポトーシスを有し、下降する前に４０％でピークに達した（図１０、パネルＢ）。ＨＩＶ感染個体由来のＰＷＭ刺激ＰＢＭＣは、０から４８時間の間にわずかな量のｂｃｌ−ｘしか発現しなかった。興味深いことに、ｂｃｌ−ｘ発現細胞の分画におけるわずかな増加が、４８時間から７２時間の間で見られ、おそらくこれは、これは４８時間以上生存した細胞が増えたことを反映する（図１０、パネルＢ）。ｂｃｌ−ｘ発現は低く、ＨＩＶ負の対照に比べて、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので培養したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣにおいて誘導の遅延がみられた（図１０、パネルＤ）。アポトーシスレベルは抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えた刺激培養において低いが、それらはＨＩＶ負の対照におけるものより高かった(図１０、パネルＣおよびＤ)。ＰＷＭで培養したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣにおいては、ほとんど増殖が見られなかったが、細胞数および細胞の大きさの増大が、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えた培養中で見られた。
【０１９１】
アポトーシスおよびｂｃｌ−ｘ誘導を、４８時間培養後にＨＩＶ負の対照（ｎ＝５）およびＨＩＶ感染個体（ｎ＝２０）においてさらに解析した。サンプルを、培地のみ、ＰＷＭを加えて、または上記のように抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えて培養した。結果を表２に示す。ＨＩＶ陰性の対照における、アポトーシスレベルは様々な刺激に応答して類似であった。アポトーシスレベルはＰＷＭ処理に応答して基線よりわずかに上昇し、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたものに応答して幾分減少した。同サンプルにおいて、ｂｃｌ−ｘ発現はＰＷＭ処理培養中で穏やかに増加し、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えて処理した培養中で劇的に増加した。対照的に、アポトーシスの基線レベルを越えた顕著な増加は、ＰＷＭと共に培養した４８時間後にＨＩＶ感染個体由来ＰＢＭＣ中で見られた。アポトーシスにおける増加は抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので培養したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣ中においては観察されなかった。
【０１９２】
【表２】
【０１９３】
結論として、ｂｃｌ−ｘ発現は、刺激非感染サンプルにおいて経時的に劇的に増加するが、刺激ＨＩＶ感染サンプルにおいて遅延し減少した応答が、観察された。加えて、ｂｃｌ−ｘの単一細胞内染色は、ＰＷＭ誘導ｂｃｌ−ｘ発現およびアポトーシスの間に強い逆相関がみられた（ｒ＝０.６９５；ｐ＝０.００５）。同様な相関が抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激したＰＢＭＣ中では観察されず、これは、共刺激はｂｃｌ−ｘ誘導の防御レベルへと導くことを示唆している。結果はまた、ＰＢＭＣの代わりにリンパ球を用いたときにも得られ、すなわち、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので刺激したＨＩＶ感染個体由来のリンパ球は、非感染個体由来のリンパ球に比較して低いｂｃｌ−ｘ発現を示した。遅延し減少したｂｃｌ−ｘの発現は試験サンプル中のＣＤ３＋ＣＤ２８＋細胞のパーセンテージの減少に起因するものではない。なぜなら、ｂｃｌ−ｘの発現の減少はＰＷＭで刺激したＣＤ２８＋ＨＩＶ感染部分集合において明白だからである。さらに、低いｂｃｌ−ｘ発現はリンパ球活性化の減少に起因するものではない。なぜなら、ＰＷＭ刺激はＨＩＶ感染患者において早い活性化マーカーであるＣＤ６９の発現を誘導するからである。
【０１９４】
このように、ＨＩＶ感染個体由来のリンパ球は、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激時に、非ＨＩＶ感染個体よりも、bcl−ＸＬタンパク質レベルが低いが、このレベルは細胞を細胞死から防御するに必要なbcl−ＸＬタンパク質の限界値を上回っている。
等価体
【０１９５】
当業者は慣用的な実験法以外を用いて、ここで記載された本発明の特別の態様に関する数多くの等価体が存在すると認識または確認することができるだろう。このような等価体は以下の請求の範囲に含まれる。
【０１９６】
【表３】
【０１９７】
【表４】
【０１９８】
【表５】
【０１９９】
【表６】
【０２００】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】γ−照射（パネルＢ）前、または未処理（パネルＡ）のままで、培地のみ（白抜き四角)、抗ＣＤ３の存在下（白抜き菱形)、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の存在下（黒塗り四角）で１２時間Ｔ細胞をインキュベーション後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【図２】γ−照射（パネルＢおよびＤ）前、または未処理（パネルＡおよびＣ）のままで、抗ＣＤ３のみ（パネルＡおよびＢ）または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（パネルＣおよびＤ）と共に１２時間Ｔ細胞をインキュベーションし、その後、それらをならし培地に残す（白抜き四角)か、洗浄して新たな培地に懸濁する（白抜き菱形)か、または洗浄して２００Ｕ／mlのrＩＬ−２を加えた新たな培地に懸濁した（黒塗り四角）後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【図３】図３パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれ、培地のみ（ＭＥＤ）でインキュベーションするか、抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）の存在下で１、６または１２時間インキュベーションするか、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）の存在下でインキュベーションしたＴ細胞中でのbcl−ＸＬ発現、bcl−２発現およびＨＬＡ発現のレベルを示すノーザン・ブロットを表す。パネルＡは、非変性アガロースゲルでの電気泳動後に各ＲＮＡ試料のアリコートをエチジウムブロマイド染色したものを示す。 図３Ｅは、単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６または１２時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６または１２時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびbcl−ＸＳタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図４】単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６、１２または２４時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６１２、または２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびＢcl−２タンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図５】培地単独で（Medium）または抗ＣＤ２８（αＣＤ２８）、抗ＣＤ３（αＣＤ３）、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（αＣＤ３／αＣＤ２８）、または抗ＣＤ３＋ＩＬ−２（１００units／ml)(αＣＤ３／ＩＬ−２）の存在下、２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図６】培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。パネル下部は、培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションし、抗Fas抗体を添加してさらに２４時間インキュベーションしたＴ細胞の生存能力パーセントを示す。
【図７】図７Ａ−Ｂは、抗Fas抗体（αFas、パネルＡ）または抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３、パネルＢ）で処理後０、１２、２４、４８および７２時間でbcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミドでトランスフェクションさせたJurkatクローンの生存能力パーセントのグラフ表示である。 図７パネルＣは、bcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミド（Neoクローン１、２および３）でトランスフェクションさせたJurkatクローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウェスタン・ブロットの写真である。 図７パネルＤは、ＩＬ−２回収後０、１２、２４、３６および４８時間でbcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローンの生存パーセントのグラフ表示である。 図７パネルＥは、bcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図８】培地単独で、抗ＣＤ３の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下、および抗ＣＤ３およびＣＴＬＡ４Ｉgの存在下、２４時間インキュベーションしたマウスリンパ節細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図９】bcl−ＸＬ発現ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均bcl−ＸＬ）、または対照ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均neo）でトランスフェクションし、さまざまな量のＨＩＶで感染させたJurkat細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【図１０】図１０パネルＡ−Ｄは、ＰＷＭ（パネルＡおよびＢ）でまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ３／ＣＤ２８、パネルＣおよびＤ）で０、２４、４８または７２時間処理した対照およびＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣにおいて、アポトーシスを被った細胞の割合（％アポトーシス）およびbcl−Ｘタンパク質を発現する細胞の割合（％bcl−ｘ）のグラフ表示である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ−Ｄ】
【図３Ｅ】
【技術分野】
【０００１】
bcl−ＸＬタンパク質レベルを調節することによる、Ｔ細胞生存の調節法
政府支持
本明細書に記載した研究は、ＮＩＨ認可ＰＯ１ＡＩ３５２９４およびＮＭＲＤＳ認可６１１５３ＮＡＥ.４１２０.００１.１４０２により一部支持されている。従って、米国政府は、本発明の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
末梢血Ｔ細胞生存の制御は、効果的な末梢性免疫レパトアーの維持に重要である。Ｔ細胞生存の幾つかの態様は、Ｔ細胞活性化の状態と関連しているようである。Ｔ細胞活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチド−抗原によるＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体（ＴＣＲ／ＣＤ３）の結合により開始される（Schwartz,R.H.(1990)Science 248,1349）。これはＴ細胞活性化の一次シグナルであるが、ＡＰＣとＴ細胞との間のその他の受容体リガンド相互作用が完全な活性化には要求される。例えば、他の分子相互作用なしでのＴＣＲ刺激は、アネルギー状態を誘発することがあり、そのため、これらの細胞は、再刺激時に完全な活性化シグナルに応答できない（Schwartz,R.H.(1990)Science 248,1349；Harding,F.A.,McArthur J.G.,Gross,J.A.,Raulet,D.H.,およびAllinson,J.P.(1992)Nature 356,607）。また、Ｔ細胞は、ＴＣＲ結合（engagement）のみにより活性化される時、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）により死滅することが示されている（Webb,S.,Morris,C.,およびSprent,J.(1990)Cell 63,1249;Kawabe,Y.,およびOchi,Ａ.(1991）Nature 349,245;Kabelitz,D.,およびWesselborg,S.(1992)Int.Immunol 4,1381;Groux,H.,Monte,D.,Plouvier,B.,Capron,A.,およびAmeisen,J-C(1993)Eur.J.Immunol.23,1623）。
【０００３】
Ｔ細胞とＡＰＣの間には複合的な受容体−リガンド相互作用が起こる。多くの相互作用は、自然に密着したものであり、かつ２つの細胞間の接触を強化するものである（Spinger,T.A.,Dustin,M.L.,Kishimoto,T.K.,およびMarlin,S.D.(1987)Annual,Rev.Immunol.5,223）のに対し、その他の相互作用はＴ細胞に更なる活性化シグナルを形質導入するものである（Bierer,B.E.,およびBurakoff,S.J.(1991)Adv,Cancer Res.56,49）。ＣＤ２８は、ヒトの末梢Ｔ細胞の８０％に存在する表面糖タンパク質であり、重要な共刺激性（コスティミュラトリー）受容体であることが示されている（June,C.H.,Bluestone,J.A.,Nadler,L.M.およびThompson,C.B.(1994)Immunol.Today 15,321;Linsley,P.S.Ledbetter，J.A.(1993)Annu.Rev.Immunol.11,191）。コスティミュラトリー・シグナルは、Ｔ細胞がＣＤ２８リガンドＢ７−１またはＢ７−２のいずれかを発現する抗原提示細胞と遭遇するときにＣＤ２８を介して形質導入される。
【０００４】
Ｔ細胞の共刺激（コスティミュレーション）は、Ｔ細胞活性化の多くの態様に影響を与えることが示されている（June,C.H.,Bluestone,J.A.,Nadler,L.M.およびThompson,C.B.(1994)Immunol.Today 15,321)。共刺激は、培養物中の増殖応答を誘導するのに必要な抗ＣＤ３の濃度を低減させる（Gimmi,C.D.Freeman,G.J.,Gribben,J.G.,Sugita,K.,Freedman,A.S.,Morimoto,C.,およびNadler,L.M.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,6575)。ＣＤ２８共刺激はまた、遺伝子発現の転写調節および転写後調節を介するヘルパーＴ細胞によるリンパ球産生を著しく高め(Lindsten,T.,June,C.H.,Ledbetter,J.A.,Stella,G.,およびThompson,C.B.(1989)Science 244，339;Fraser,J.D.,Irving,B.A.,Crabtree,G.R.,およびWeiss,A.(1991)Science 251,313)、細胞毒性Ｔ細胞の細胞溶解能を活性化し得る。ＣＤ２８共刺激をインビトロで阻害することにより、異種移植片拒絶を遮断でき、また同種移植片拒絶が顕著に遅延する（Lenschow,D.J.,Zeng,Y.,Thistlethwaite,J.R.,Montag,A.,Brady,W.，Gibson,M.G.,Linsley,P.S.,およびBluestone,J.A.,(1992)Science257,789;Turka,L.A.,Linsley,P.S.,Lin,H.,Brady,W.,Leiden,J.M.Wei,R-Q.,Gibson,M.L.,Zheng,X-G.,Mydral,S.,Gordon,D.,Bailey,T.,Bolling,S.F.,およびThompson,C.B.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11102)。更に、腫瘍細胞系列へのＢ７のトランスフェクションにより、腫瘍増殖の認識および防止が容易になる（Chen,L.,Ashe,S.,Brady,W.A.,Hellstrom,I.,Hellstrom,K.e.,Ledbetter,J.A.,McGowan,P.,およびLinsley P.S.(1992)Cell 71,1093;Townsend,S.E.,およびAllinson,J.P.(1993)Science 259,368)。
【０００５】
最近まで、Ｔ細胞生存がどのように制御されているかについてほとんど知られていなかった。各研究により、Ｔ細胞のマイトジェン活性化が、放射能などの作用物質での処理により開始されるプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）に対するその耐性を強化することが示された（Schrek,R.およびStefani,S.(1964)J.Nat.Cancer Inst.32,507;Lowenthal,J.W.およびHarris,A.W.(1985)J.Immunol.135,1119;Stewart,C.C.,Stevenson,A.P.,およびHabbersett,R.C.(1988)J.Radiat.Biol.53,77)。反対に、ＴＣＲのみによるＴ細胞活性化は、ＰＣＤを被るＴ細胞の感受性を増大させることが報告されている（Kabelitz,D.,およびWesselborg,S.(1992）Int.Immunol 4.1381;Groux,H.,Monte,D.,Plouvier,B.,Capron,A.,およびAmeisen,J-C(1993),Eur.J.Immunol.23,1623）。
【０００６】
近年、Ｔ細胞生存を調節する役割を果すと思われる数種の遺伝子が同定された。マウスにおける休止リンパ球の生存は、bcl−２遺伝子の発現に依存する（Nakayama,K-I.,Nakayama,K.,Negishi,I.,Kuida,K.,Shinkai,Y.,Louie,M.C. Fields,L.E.,Lucas,P.J.Stewart,V.,Alt,F.W.,およびLoh,D.Y.(1993）Science 261,1584）。bcl−２遺伝子を欠く動物は、培養したときにＰＣＤを被る感受性の高いＴ細胞を有する。Ｂcl−２欠損動物は寿命の最初の数週間以内に深刻なリンパ球減少状態になる（Veis,D.J.,Sorenson,C.M.,Shutter,J.R.,およびKorsmeyer,S.J.(1993a)Cell 75,229)。反対に、Fas細胞表面受容体に突然変異を持つ動物は、免疫応答過程に産生される過剰な免疫細胞を除去できない（Watanabe-Fugunaga,R.,Brannan,C.I.Copeland,N.G.,Jenkins,N.A.,およびNagata,S.(1992)Nature 356,314)。Ｆas欠損動物は、最終的に深刻な自己免疫疾患を発症する。これらのデータは、Ｔ細胞生存が、Ｔ細胞増殖と同じく厳密に調節され得ることを示している。
【０００７】
Ｔ細胞死を不適切に調節すると免疫系異常（例えば、免疫不全または自己免疫）を引き起こすこともある。更に、Ｔ細胞がある種の感染性微生物に感染するとＴ細胞は殺傷される。特に、Ｔ細胞がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染するとプログラムされた細胞死により誘発される細胞死が起こる。したがって、Ｔ細胞死を制御する方法および特に、そのような死を阻害する方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００８】
概要
本発明は、Ｔ細胞生存を調整する方法、特に、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法を提供する。本発明の方法は、少なくともその一部で、Ｔ細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８による）がＴ細胞中のタンパク質bcl−ＸＬの産生増大およびＴ細胞生存強化をもたらすという発見に基づくものである。更に、その他の手段（例えば、Ｔ細胞へのbcl−ＸＬ遺伝子のトランスフェクション）によるＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の産生増大もまた、Ｔ細胞生存強化をもたらす。したがって、Ｔ細胞を細胞死から保護するために、本発明の方法に従い、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を増大して、Ｔ細胞生存を強化する。
【０００９】
一実施態様では、Ｔ細胞生存を、Ｔ細胞をbcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する作用物質と接触させることにより強化する。本方法の好ましい実施態様では、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入することにより増大する。本方法の別の実施態様では、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞を、細胞内に作用して内生bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する作用物質と接触させることにより増大する。bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大するその他の好ましい作用物質は、Ｔ細胞表面上の分子と相互作用する物質である。本発明の方法は、増大したまたは不適切なＴ細胞死に関連する異常または症状、例えば、ＨＩＶによるＴ細胞感染、を処置するのに有用である。本方法は、また、Ｔ細胞生存を強化し、それによって、免疫反応を刺激する、例えば、病原性微生物の排除を加速する、のにも有用である。
【００１０】
本発明は、Ｔ細胞死を誘導する、またはＴ細胞を細胞死に対して感受性にする方法にも関連する。これらの方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する作用物質と接触させることを含む。これらの方法は、免疫反応をダウンレギュレーションするのに有用である。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、γ−照射（パネルＢ）前、または未処理（パネルＡ）のままで、培地のみ（白抜き四角)、抗ＣＤ３の存在下（白抜き菱形)、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の存在下（黒塗り四角）で１２時間Ｔ細胞をインキュベーション後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００１２】
図２Ａ−Ｄは、γ−照射（パネルＢおよびＤ）前、または未処理（パネルＡおよびＣ）のままで、抗ＣＤ３のみ（パネルＡおよびＢ）または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（パネルＣおよびＤ）と共に１２時間Ｔ細胞をインキュベーションし、その後、それらをならし培地に残す（白抜き四角)か、洗浄して新たな培地に懸濁する（白抜き菱形)か、または洗浄して２００Ｕ／mlのrＩＬ−２を加えた新たな培地に懸濁した（黒塗り四角）後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００１３】
図３パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれ、培地のみ（ＭＥＤ）でインキュベーションするか、抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）の存在下で１、６または１２時間インキュベーションするか、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）の存在下でインキュベーションしたＴ細胞中でのbcl−ＸＬ発現、bcl−２発現およびＨＬＡ発現のレベルを示すノーザン・ブロットを表す。パネルＡは、非変性アガロースゲルでの電気泳動後に各ＲＮＡ試料のアリコートをエチジウムブロマイド染色したものを示す。
【００１４】
図３Ｅは、単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６または１２時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６または１２時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびbcl−ＸＳタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００１５】
図４は、単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６、１２または２４時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６１２、または２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびＢcl−２タンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００１６】
図５は、培地単独で（Medium）または抗ＣＤ２８（αＣＤ２８）、抗ＣＤ３（αＣＤ３）、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（αＣＤ３／αＣＤ２８）、または抗ＣＤ３＋ＩＬ−２（１００units／ml)(αＣＤ３／ＩＬ−２）の存在下、２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００１７】
図６は、培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。パネル下部は、培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションし、抗Fas抗体を添加してさらに２４時間インキュベーションしたＴ細胞の生存能力パーセントを示す。
【００１８】
図７Ａ−Ｂは、抗Fas抗体（αFas、パネルＡ）または抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３、パネルＢ）で処理後０、１２、２４、４８および７２時間でbcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミドでトランスフェクションさせたJurkatクローンの生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００１９】
図７パネルＣは、bcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミド（Neoクローン１、２および３）でトランスフェクションさせたJurkatクローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウェスタン・ブロットの写真である。
【００２０】
図７パネルＤは、ＩＬ−２回収後０、１２、２４、３６および４８時間でbcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローンの生存パーセントのグラフ表示である。
【００２１】
図７パネルＥは、bcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００２２】
図８は、培地単独で、抗ＣＤ３の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下、および抗ＣＤ３およびＣＴＬＡ４Ｉgの存在下、２４時間インキュベーションしたマウスリンパ節細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【００２３】
図９は、bcl−ＸＬ発現ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均bcl−ＸＬ）、または対照ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均neo）でトランスフェクションし、さまざまな量のＨＩＶで感染させたJurkat細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【００２４】
図１０パネルＡ−Ｄは、ＰＷＭ（パネルＡおよびＢ）でまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ３／ＣＤ２８、パネルＣおよびＤ）で０、２４、４８または７２時間処理した対照およびＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣにおいて、アポトーシスを被った細胞の割合（％アポトーシス）およびbcl−Ｘタンパク質を発現する細胞の割合（％bcl−ｘ）のグラフ表示である。
【００２５】
詳細な説明
本発明はＴ細胞の生存を調節する方法を提供する。好ましい実施態様において、Ｔ細胞を細胞死から防御する。細胞死からＴ細胞を防御する本発明方法は、Ｔ細胞の生存を強化するように、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する少なくとも一つの作用物質でＴ細胞を処理することを含む。本発明の一つの実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大する物質はbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸であって、これはＴ細胞中へ導入されると発現する。本発明の他の実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルは、例えば外来bcl−ＸＬ遺伝子からのbcl−ＸＬタンパク質産生を増大せしめる少なくとも一つの作用物質とＴ細胞を接触させることによりＴ細胞中において増加される。１つの実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する少なくとも一つの作用物質は、ＣＤ２８などのＴ細胞の表面上の分子と相互作用をする作用物質を含む。Ｔ細胞はさらに、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質と接触させ得る。他の実施態様において、少なくとも一つの作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増大するために細胞内に作用する物質である。他の実施態様において、本発明は、さらに、Ｔ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルを低下することによりＴ細胞を細胞死に対して感受性にする方法に関する。bcl−ＸＬタンパク質レベルが本発明方法により調節されているＴ細胞は、被験体に存在するＴ細胞またはエクスビボで培養されたＴ細胞であり得る。本発明の方法は、免疫応答の調節、すなわち免疫応答の強化または抑制のために有用である。このように本発明方法は、免疫反応を刺激する（例えば、感染に抵抗する）、あるいは生存寿命が短くなっている（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染などの感染結果として）Ｔ細胞の生存を刺激するなどの数多くの応用性を有する。
【００２６】
bcl−ＸＬがＩＬ−３欠乏誘導化アポトーシスからネズミＩＬ−３依存性前リンパ球細胞系を防御し得ることは、以前から知られている（Ｂoise, H.B. et al.(1993)Cell 74,597 および ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／００６４２）。アポトーシスが個体発生におけるネガティブおよびポジティブセレクションを調節する重要なメカニズムであるので、著者は、Ｔ細胞におけるbcl−ＸＬmＲＮＡレベルを解析した。胸腺細胞も、休止Ｔ細胞も、ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化したＴ細胞も、bcl−ＸＬmＲＮＡを含有していなかった。しかし、胸腺細胞および活性化Ｔ細胞は、アポトーシスに役立つことが示されている（Ｂoise, H.B. et al，後出、およびＰＣＴ出願ＷＯ９５／００６４２）タンパク質bcl−ＸＬをコードするbcl−Ｘ遺伝子の別のスプライス形態、bcl−ＸＳmＲＮＡを含んでいた。これらの結果は、Ｔ細胞個体発生におけるアポトーシス誘導細胞死の制御がbcl−ＸＬタンパク質レベルの制御によるよりもむしろ、bcl−ＸＳタンパク質レベルの制御によって少なくとも部分的には調節されることを示唆している。
【００２７】
本発明は、bcl−ＸＬタンパク質レベルをＴ細胞中で増加する、ヒトbcl−ＸＬをコードする核酸によるＴ細胞のトランスフェクションにより、Ｔ細胞が細胞死から防御されるという発見に少なくとも部分的に基づいている。このようにして修飾されたＴ細胞は、γ−照射、Ｔ細胞受容体架橋、Ｆas架橋および成長因子欠乏などの種々の刺激によって誘導される細胞死から防御される。Ｔ細胞が細胞死から防御され得る、または、細胞死に対し感受性にするように、Ｔ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルを調節する作用物質とＴ細胞とを接触させることによりＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルを調節することは、本発明の一つの目的である。本発明方法は、被験体のＴ細胞、例えば感染への抵抗に関与するＴ細胞の少なくともいくらかの生存を長引かせることを望む症状において医療上有用である。他方、本発明方法は、自己免疫疾患などの、Ｔ細胞の死が望まれる状態においても医療上有用である。
【００２８】
１．細胞死からＴ細胞を防御する方法
本発明方法は、細胞死からＴ細胞を防御することを含む。“Ｔ細胞”は、一般的に認識されているものであって、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図している。Ｔ細胞はＴヘルパー（Ｔｈ）細胞であることができ、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞またはＴ細胞の他のサブセットである。“細胞死からＴ細胞を防御する”なる文言は、Ｔ細胞における細胞死が起きるのを阻害または少なくとも遅延することを含む。細胞死は、なんらかのメカニズムによって細胞死がおきることを含む。細胞死はプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）であって、“アポトーシス”と称することもできる。アポトーシスによるＴ細胞死は、核ヘテロクロマチンの凝縮、細胞の縮小、細胞質の濃縮、およびアポトーシスの後期段階においてはＴ細胞ＤＮＡの分離フラグメントへのエンドヌクレアーゼ仲介切断を含み、これらを特徴とするものである。アポトーシスが起きた細胞のＤＮＡの電気泳動解析では、分離フラグメントの特徴的な“ラダー（ladder）”が見られる。
【００２９】
本発明は、自然に起きる細胞死または細胞中に誘導されたシグナルに起因する細胞死からＴ細胞を防御する方法に関する。例えば、アポトーシスは、普通、Ｔ細胞中の特定のシグナルの誘導からもたらされる。このように本発明の方法は、コスティミュラトリー・シグナルの不在下でＴ細胞受容体の架橋に起因する細胞死からＴ細胞を防御することを提供する。Ｔ細胞受容体の架橋は、抗ＣＤ３抗体などのポリクローナル・アクチベーターにより、あるいは抗原提示細胞上の抗原によって、コスティミュラトリー・シグナルの不在下に（例えばＣＤ２８／ＣＴＬＡ４によるシグナルの不在下において)、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞死をもたらすことが当分野では知られている。
【００３０】
本発明方法は、成長因子減少に起因する細胞死からＴ細胞を防御することも提供する。例えば、Ｔ細胞は増殖にＩＬ−２を必要とし、ＩＬ−２の不在は細胞死をもたらす。このように、本発明方法によりＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質のレベルを増加することは、ＩＬ−２不在における細胞死から正常なＩＬ−２依存性Ｔ細胞を防御する（すなわち、本発明はＩＬ−２の不在下で生存できるＴ細胞を提供する)。本発明の範囲には、Ｔ細胞生存に普通に必要な他の成長因子類、サイトカイン類、リンホカイン類の不在に起因する細胞死からＴ細胞を防御する方法も含まれる。このような因子の例には、インターロイキン類、コロニー刺激因子類およびインターフェロン類がある。
【００３１】
本発明方法はさらに、Ｆasまたは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）架橋に起因する細胞死からＴ細胞を防御することを可能にする。Ｔ細胞上のＦas受容体の架橋がＴ細胞のアポトーシス性細胞死をもたらすことが示されている。ＦasおよびＴＮＦＲタンパク質はかなりの相同性を共有しており、これらは架橋すると細胞死を誘導するタンパク質の拡大ファミリーに属せしめることができる。このように、本発明方法は、このファミリーに属するいかなる受容体の架橋に起因する細胞死からもＴ細胞を防御するのに有用である。
【００３２】
本発明方法はまた、グルココルチコイドなどのある種のホルモン、例えばデキサメタゾンにより誘導される細胞死からＴ細胞を防御する手段を提供する。さらに細胞死は、被験体においてグルココルチコイドレベル上昇を誘導することが知られているストレスの結果としても起こり得る。このように本発明方法は、ストレスを被った被験体に起きるＴ細胞死に対する防御も提供する。
【００３３】
さらに本発明方法は、ＤＮＡ障害剤により誘導される細胞死からＴ細胞を防御することを可能にする。
【００３４】
Ｔ細胞はまたＴ細胞個体発生中に細胞死を被る。Ｔ細胞の増殖および分化の過程は厳密に調節されており、Ｔ細胞のポジティブおよびネガティブセレクションを誘導する。この過程中のＴ細胞生存に影響を与える方法も本発明の範囲内である。
【００３５】
Ｔ細胞死は、Ｔ細胞中のアポトーシス誘導タンパク質、例えば、bcl−ＸＳ，Bad，p５３，c−myc，またはインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）（Savilel,J.(1994) Eur. J.Clin. Investigat. 24,715)の活性によっても生ずる。従って、本発明の範囲内の方法は、これらのタンパク質に関係する細胞死を防御する方法も含む。
【００３６】
１.２.Ｔ細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入することよりなる、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法
【００３７】
本発明の一実施態様では、Ｔ細胞を、その細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入し、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増大させることにより、細胞死から防御する。このbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、Ｔ細胞中で遺伝子を発現させる形態で存在するので、bcl−ＸＬタンパク質がＴ細胞中で産生される。
【００３８】
１.２.１.bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸またはそれらの修飾形態
“bcl−ＸＬをコードする核酸分子”なる用語は、Ｔ細胞中にその核酸分子を導入したときにbcl−ＸＬタンパク質へ転写および翻訳される全ての核酸分子を含むことを意図している（例えば、この分子は、bcl−ＸＬの発現を調節する適当な制御配列をも含み得る)。 このbcl−ＸＬをコードする核酸分子は、対応するbcl−ＸＬ遺伝子のコード領域のみからなるものであってよく、あるいは、例えば５'または３'非翻訳領域、イントロン、それらのフラグメント、または他の配列のような、非コード領域を含むものであってもよい。
【００３９】
bcl−ＸＬタンパク質はbcl−Ｘ遺伝子によってコードされている。分化スプライシングの結果、このbcl−Ｘ遺伝子は２種の異なるmＲＮＡ分子を生成し、そのひとつはbcl−ＸＬ（bcl−Ｘの長い形態に対応）タンパク質をコードし、他のものは小さい方のbcl−ＸＳ（bcl−Ｘの短い形態に対応）をコードしている。このbcl−ＸＳは、bcl−ＸＬタンパク質とは６３アミノ酸ストレッチ（stretch）を欠く点で異なる。この欠失は、bcl−ＸＬに存在する第２コードエクソンを、第１コードエクソン内のより５'末端に近いスプライス供与体へとスプライシングする結果として起こる。このように、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬの発現には、bcl−ＸＬとbcl−ＸＳタンパク質の両方の産生をもたらし得る、bcl−Ｘ遺伝子を含有するゲノムフラグメントよりもむしろ、bcl−ＸＬ ｃＤＮＡを使用する方が好ましい。
【００４０】
ヒトの細胞処理では、bcl−ＸＬをコードする核酸は、他の動物種由来の核酸も本発明の範囲内であるが、ヒト由来のものが好ましい。さらに、bcl−ＸＬ核酸は、その核酸をＴ細胞中に導入したとき、その核酸によってコードされるタンパク質がＴ細胞を細胞死から防御する限り、各種を通して使用できる。本発明の好ましい態様では、bcl−ＸＬタンパク質をコードしている核酸は、ヒトｃＤＮＡ（配列番号１）である。本発明の範囲内であるbcl−ＸＬタンパク質をコードしている核酸は、ＰＣＴ出願国際公開ＷＯ９５／００６４２や下記の文献類に記載されている：Boise et al.(1993) Cell 74,597;およびFang et al.(1994) J. Immunol. 153,4388。さらに、ヒトbcl−ＸＬ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびヒトbcl−ＸＬタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１および２にそれぞれ示してある。この核酸分子は、bcl−ＸＬタンパク質全長をコードするものであってもよく、あるいは、この核酸は、それをＴ細胞中に導入したとき、Ｔ細胞を細胞死から防御するに充分なだけのbcl−ＸＬのペプチドフラグメントをコードしているものであってもよい。この核酸は、天然のbcl−ＸＬまたはそのフラグメントをコードするものであってもよく、あるいは、bcl−ＸＬタンパク質の修飾形態またはそのフラグメントであってもよい。本発明の範囲内である、天然bcl−ＸＬタンパク質の修飾形態は、以下に記載する。
【００４１】
本発明の方法は、Ｔ細胞を細胞死から防御する能力を保持している、bcl−ＸＬタンパク質の各フラグメント、各変異体、または各変種（例えば、修飾形態）の使用を含むことを意図している。“bcl−ＸＬタンパク質の形態”は、天然bcl−ＸＬタンパク質との顕著な相同性を共有し、かつＴ細胞を細胞死から防御し得るタンパク質を意味することを意図している。“bcl−ＸＬタンパク質の形態”は、タンパク質Ｂcl−２を含めることは意図していない。“生物学的に活性なbcl−ＸＬタンパク質”または“bcl−ＸＬタンパク質の生物学的に活性な形態”または“bcl−ＸＬタンパク質の機能的に活性な形態”の用語は、本書中では、Ｔ細胞を細胞死から防御し得る、bcl−ＸＬタンパク質類の各形態を含むことを意味している。当業者は、Ｔ細胞中にbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を導入した際に、Ｔ細胞を細胞死から防御する能力に基づき、bcl−ＸＬタンパク質のそのような形態を選ぶことができる。Ｔ細胞を細胞死から防御するbcl−ＸＬの特定形態の能力は、例えば、Ｔ細胞中にbcl−ＸＬの特定形態をコードする核酸をトランスフェクションし、通常、Ｔ細胞中で細胞死が誘発される条件下でＴ細胞にてbcl−ＸＬタンパク質を合成させることにより測定できる。細胞死の導入に際しても、もしbcl−ＸＬの形態を発現するように修飾したＴ細胞集団中での細胞死が、bcl−ＸＬの形態を発現するように修飾していないＴ細胞集団中よりも少なくなれば、bcl−ＸＬタンパク質のその形態は、Ｔ細胞中の細胞死に対して防御効果を有する。細胞死は種々の手段でモニターできる。細胞集団中の細胞死の程度は、例えば、両方の集団中でのＴ細胞の数を、血球計またはコウルター計数器を用いて数えることにより測定できる。Ｔ細胞集団中の細胞死の程度を測定する好ましい方法は、プロピジウムヨージド(propidium iodide)排除アッセイによるものである。プロピジウムヨージド排除アッセイは、Ｔ細胞をプロピジウムヨージドとともに培養することにより実施でき、このプロピジウムヨージド染料は、死亡細胞に優先的に吸収され、生存細胞から排除される。細胞死の程度は、次いで、本願の実施例６に記載しているように、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析により測定される。付加的に使用できる染料には、アクリジンオレンジやヘキスト３３３４２が含まれる。Ｔ細胞集団中の細胞死の程度を測定する他の方法には、切断ＤＮＡの末端をラベルする（Gavrieli, Y. et al.(1992) J. Cell Biol. 119,493)の種々の方法が含まれる。Ｔ細胞集団中の細胞死の程度を測定する他の方法には、Ｔ細胞の核酸の電気泳動分析がある。この方法では、精製されているかまたは精製されていない形態のＴ細胞の核酸を、ゲル電気泳動に付し、次いで、エチジウムブロマイドによるゲル染色し、さらに紫外線下で核酸の可視化を行う。少なくとも相当数のＴ細胞がアポトーシスを受けているＴ細胞集団由来の核酸は、"ラダー（ladder)”即ち、ＤＮＡの分離フラグメントの集団、が現れるであろう。反面、アポトーシスを受けていないＴ細胞のＤＮＡは、単一の高分子量バンドとして現れる。
【００４２】
bcl−ＸＬタンパク質の形態について、細胞死からＴ細胞を防御する能力を測定するために、数種のアッセイが使用できる。これらのアッセイには、Ｔ細胞集団を特定の作用物質と接触させて、Ｔ細胞集団がアポトーシスを受けるよう誘導するアッセイが含まれる。そのような作用物質には、Ｔ細胞レセプターを架橋する作用物質類、例えば抗ＣＤ３抗体、ＦasまたはＴＮＦレセプターを架橋する作用物質類、グルココルチコイド類、が含まれる。場合によっては、成長因子欠乏、例えばＩＬ−２欠乏により、Ｔ細胞に細胞死を誘導できる。これらのアッセイは本明細書中、殊に実施例６および７に記載する。
【００４３】
Ｔ細胞中のbcl−ＸＬフラグメントは、bcl−ＸＬタンパク質フラグメントをコードする核酸フラグメントを導入することにより、産生できる。この核酸はｃＤＮＡであってもよく、またはゲノムＤＮＡフラグメントであってもよい。bcl−ＸＬの変異体は、例えば、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子（例えば、bcl−ＸＬ ｃＤＮＡ）中に、標準法、例えば部位指向性突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応経由突然変異誘発により、ヌクレオチド塩基対修飾（例えば、置換、欠失、付加等）を導入することにより調製できる。bcl−ＸＬの好ましい修飾は、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の半減期を修飾するものを含む。従って、本方法の他の実施態様では、長い半減期を有するbcl−ＸＬの形態をＴ細胞中に導入することが望ましい場合もあるが、具体的な実施態様では、非常に短い半減期を有するbcl−ＸＬタンパク質の形態をＴ細胞中に導入することが望ましい。
【００４４】
好ましい態様では、bcl−ＸＬタンパク質を、“Ｂax”タンパク質との相互作用を促進し、そして“Ｂad”タンパク質との相互作用を阻害または減少させるように修飾する。bcl−ＸＬの細胞中のアポトーシスに対する防御効果は、一つのbcl−ＸＬタンパク質と他の“Ｂax”と名付けたタンパク質とにより構成されるヘテロ二量体により媒介され得ることが示されている。しかしながら、さらなるデータは、“Ｂad”と称したタンパク質がbcl−ＸＬとも相互作用し得ること、およびbcl−ＸＬとＢadから構成されるヘテロ二量体がbcl−ＸＬの細胞死に対する防御効果を不活性化し得ることを示している(Yang, et al.(1995) Cell 80,285)。さらに、Ｂadは、Ｂax／bcl−ＸＬヘテロ二量体のＢaxタンパク質と置き換えて、bcl−ＸＬ／Ｂadヘテロ二量体を形成する能力があることが示されている。このように、本方法の好ましい実施態様では、bcl−ＸＬの修飾形態のＢadへの結合を阻害するかまたは少なくとも減少するように修飾したが、野生型bcl−ＸＬタンパク質と比較して、bcl−ＸＬの修飾形態のＢaxへの結合には有意に影響されない、bcl−ＸＬタンパク質をコードしている核酸をＴ細胞中に導入することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する。本発明の好ましい実施態様においては、bcl−ＸＬタンパク質の修飾は、Ｂcl−２相同性（ＢＨ）ドメイン１または２（それぞれ、“ＢＨ１”および“ＢＨ２”）中に位置している、bcl−ＸＬの少なくとも１つのアミノ酸を置換することを含む。ＢＨ１は、ヒトbcl−ＸＬタンパク質（配列番号２）のアミノ酸１２９と１４８の間に位置しており、ＢＨ２はヒトbcl−ＸＬタンパク質（配列番号２）のアミノ酸１８０と１９１との間に位置している(Yang, E. et al.(1995) Cell 80,285)。
【００４５】
さらに、bcl−ＸＬの一次アミノ酸配列の変化は、細胞死からＴ細胞を防御するbcl−ＸＬ分子の能力を有意に損なうことなく許容されるようであることは、当業者により評価されるであろう。従って、天然に存在するbcl−ＸＬ分子のアミノ酸の配列と比較して、アミノ酸置換、欠失、および／または付加を有し、なお機能的活性を保持している、本書中に記載したbcl−ＸＬの変異体形態は、本発明の範囲内に属するものである。bcl−ＸＬの機能的性質を保持するために、好ましくは、保存性アミノ酸置換はひとつまたはそれ以上のアミノ酸残基で行われる。“保存性アミノ酸置換”とは、アミノ酸残基が同種の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。同種の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含むものとして定義されている。
【００４６】
１.２.２.Ｔ細胞中でbcl−ＸＬコード核酸の発現のための調節配列
Ｔ細胞中でbcl−ＸＬをコードする核酸分子を発現させ、Ｔ細胞中でbcl−ＸＬタンパク質のレベルを増大させる（細胞死からＴ細胞を防御する）ためには、該核酸を調節配列に作動可能に連結させなければならない。“作動可能に連結させた”とは、Ｔ細胞中でヌクレオチド配列が発現できるような態様でbcl−ＸＬをコードするヌクレオチド配列を少なくとも一つの調節配列に連結させたという意味であることを意図している。調節配列は、適当なＴ細胞中で所望のタンパク質の発現を指向するように選ばれる。従って、“調節配列”の用語は、プロモーター類、エンハンサー類、および他の発現制御配列類を含む。そのような調節配列は当業者に知られており、またGoeddel, gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、 Academic Press, San Diego, CA(1990)に記載されている。
【００４７】
これらの調節配列は、bcl−ＸＬをコードする核酸の転写および翻訳に必要とされるものを含み、さらに、プロモーター類、エンハンサー類、ポリアデニル化シグナル類、および好ましくはミトコンドリア膜外である、適切な細胞コンパートメントへ分子を伝達するのに必要な配列を含み得る(Gonzales-Garcia, M. et al.(1994) Development 120,3033)。核酸が組換え発現ベクター中のcＤＮＡである場合、cＤＮＡの転写および／または翻訳を担う調節機能は、しばしばウイルスの配列により提供される。一般に使用されるウイルスのプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびレトロウイルスＬＴＲｓ由来のものが含まれる。
【００４８】
cＤＮＡに連結させる調節配列は、構成的または誘導的転写を与えるものを選択できる。誘導的転写は、例えば誘導性エンハンサーを使用することにより達成され得る。このように、本発明の具体的な実施態様において、bcl−ＸＬの形態をコードする核酸分子は、誘導性制御配列に影響を与える作用物質を用いてbcl−ＸＬの形態の発現をオンまたはオフにできる（またはその中間のレベルにする）ように、誘導性制御配列の制御下にある（例えば、発現は、Ｔ細胞の存在下で、誘導性作用物質の濃度を調節することにより調節できる）。このことにより、Ｔ細胞中での細胞死に対するbcl−ＸＬの防御効果を有効または無効に切り替えることが可能である。実際には、ある症状においてのみ、またはある時間のみＴ細胞の生存を促進することが望ましい。例えば、被験体における感染部位で、限られた時間枠に感染作用物質を除去するために免疫反応を強化することが望ましい。しかしながら、感染作用物質を除去する際に、Ｔ細胞を除去することが望ましい。このように、感染部位に位置するＴ細胞中のbcl−ＸＬの発現は、Ｔ細胞を誘導性作用物質と接触させることにより、誘導制御配列を介して刺激され得る。ついで、感染の除去時に、誘導性作用物質を除去してＴ細胞中のbcl−ＸＬの産生を停止できる。
【００４９】
哺乳動物細胞に使用する誘導性調節システムは、当分野では知られており、例えば、遺伝子発現を重金属イオン（Mayo et al.(1982)Cell29:99-108;Brinster et al.(1982)Nature296:39-42;Searle et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:1480-1489)、熱ショック（Nouer et al.(1991)in Heat Shock Response、Nouer,L.編、ＣＲＣ、Boca Raton、FL、ppl167-220）、ホルモン（Lee et al.(1981)Nature294:228-232;Hynes et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2038-2042；Klock et al.(1987)Nature329:734-736;Israel&Kaufman(1989)Nucl.Acids.Res17:2589-2604）またはテトラサイクリン（Gossen,M.およびBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551）により調節するシステムがある。Ｔ細胞を特定の誘導性作用物質に接触させることにより制御可能な誘導的遺伝子発現をもたらすその他の機構は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／１８３１７およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／２３４３１に記載されている。
【００５０】
誘導性制御配列は、全てのＴ細胞において機能でき、または、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などの特定のＴ細胞サブセットにおいてのみ機能できる。誘導性制御配列は、また、１タイプのＴ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）においては１つの作用物質により調節されるが、他のタイプのＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）においては他の作用物質により調節されるように、選択し得る。
【００５１】
本発明のその他の態様においては、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、核酸分子の発現を構成的に起こす調節配列の制御下にある。本発明の具体的な実施態様において、ＨＩＶ感染した被験体由来のＴ細胞を修飾してbcl−ＸＬタンパク質を発現させ、被験体のＴ細胞を細胞死から構成的に防御するようにする。核酸分子の構成的発現を起こすために核酸分子に作動可能に連結させた制御配列は、好ましくはウイルスプロモーターである。一般的に使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲ由来のものがある。その他に、例えばＴ細胞受容体エンハンサー（例えば、WinotoおよびBaltimore(1989)EMBOJ.8:729-733）などのＴ細胞特異的エンハンサーを使用できる。
調節配列に作動可能に連結させたbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、典型的にベクターに移し得る。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスまたは、例えば細菌中の核酸分子の選択および増幅に必要な配列を含むその他の核酸分子がある。このように、調節制御配列に作動可能に連結させたbcl−ＸＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子はまた、本明細書中では“bcl−ＸＬ発現ベクター”と呼ぶ。例えばウイルスベクターなどのベクターは、下記で更に議論する。
【００５２】
１.２.３.bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子をＴ細胞に導入する方法
bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、典型的にトランスフェクションと呼ばれる様々な方法によりＴ細胞に導入され得る。“トランスフェクション”または“でトランスフェクションさせる”なる語は、外来核酸を哺乳動物細胞に導入することを意味し、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染を含む、核酸の哺乳動物細胞への導入に有用な数多くの技術を含むことを意図する。哺乳動物細胞をトランスフェクションする適当な方法は、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual第２版、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）およびその他の実験書に見ることができる。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子はウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入される。このようなウイルスベクターには、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス１がある。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボでの特にヒトへの外来遺伝子の導入に優れた組換え遺伝子運搬系であると一般的に考えられている。その他に、そのようなベクターは、外来遺伝子をエクスビボでＴ細胞に導入するのにも使用できる。これらのベクターは、効果的に遺伝子をＴ細胞に運搬し、導入された核酸分子は、安定に宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれる。レトルウイルスの使用における重要な必要条件は、特に細胞集団において野生型ウイルスが蔓延する可能性について、その使用の安全性を確認することである。複製欠損性レトロウイルスのみを産生する分化した細胞系（“パッケージング細胞”と呼ぶ）の開発により、遺伝子療法におけるレトロウイルスの用途が拡大し、欠損レトロウイルスは遺伝子療法の目的における遺伝子導入における使用について十分に特徴づけられている（Miller,A.D.(1990)Blood76:271参照）。このように、レトロウイルスコード配列の一部（gag、pol、env）を本発明のbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸で置換えて、レトロウイルス複製欠損性にすることにより、組換えレトロウイルスを構築し得る。この場合、複製欠損性レトロウイルスはビリオン中にパッケージングさせるので、これを標準的な技術によりヘルパーウイルスを使用して標的細胞を感染させるのに使用できる。組換えレトロウイルスの産生およびインビトロまたはインビボでこのようなウイルスで細胞を感染させる方法は、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel,F.M.et al.編Greene Publishing Associates、(1989)、9.10−9.14章および標準的な実験マニュアルにおいて見いだされ得る。適当なレトロウイルスの例は、当業者に良く知られているｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含む。同種指向性および両種指向性レトロウイルス系を両方調製するための適当なパーケージングウイルス系の例は、ψＣｒｉｐ、φＣｒｅ、ψ２およびψＡｍを含む。
【００５４】
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を修飾することにより、レトロウイルスの、更にはレトロウイルスを基礎としたベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えばＰＣＴ発行物ＷＯ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの修飾方法は：細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスのenvタンパク質に結合させる（Roux et al.(1989)PNAS86:9079-9083;Julan et al.(1992)J.Gen Virol73:3251-3255;およびGoud et al.(1983)Virology163:251-254)；または細胞表面受容体リガンド類をウイルスのenvタンパク質に結合させる（Nada et al.(1991)J.Biol.Chem.266:14143-14146）ことを含む。結合は、タンパク質またはその他のさまざまなもの（例えば、envタンパク質をアジアロ糖タンパク質に変換するラクトース）との化学的架橋形態であることができ、並びに融合タンパク質（例えば、単鎖抗体／env融合タンパク質）を作成することによる。このように、本発明の具体的な実施態様では、bcl−ＸＬの形態をコードする核酸分子を含むウイルス粒子を、例えば、上記した方法に従い、それらが特異的にＴ細胞のサブセットを標的とすることができるように修飾する。例えば、ウイルス粒子をあるタイプのＴ細胞に特異的な表面分子に対する抗体で被覆できる。特に、Ｔ細胞のＣＤ４分子を認識するウイルス粒子抗体に連結させることにより選択的にＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とすることが可能である。このように、ＣＤ４＋細胞の感染は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の感染よりも優先的に起こる。本法は、Ｔ細胞の特定のサブセットのみを細胞死から防御することを望む場合に、特に有用である。さらに、本発明の方法をインビボで使用する具体的な実施態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子のＴ細胞または特定のサブセットへの導入を制限することが望ましい。
【００５５】
一次Ｔ細胞を含むＴ細胞のbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子を導入し、かつ発現させるための更なるレトロウイルス系は、Kasid,A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,473；Morecki,S.et al(1991)Cancer Immunol.Immunother.32,342;Culver,K.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,3155;およびFiner,M.H.et al.(1994)Blood、83,43に記載されている。
【００５６】
本発明で有用な他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス由来のベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、対象となる遺伝子産物をコードし、発現するが、正常細胞溶解ウイルスライフサイクルで複製する能力に関しては不活性化されているように、操作できる。例えば、Ｂerkner et al. (1988) ＢioＴechniques 6:616；Ｒosenfeld et al. (1991) Ｓcience 252:431-434；およびＲosenfeld et al. (1992) Ｃell 68:143-155参照。アデノウイルス株Ａｄタイプ５dl324またはアデノウイルスの他の株(例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等)由来の適当なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。組換えアデノウイルスは、それらが細胞分裂していない細胞に感染できないため、ある環境で有利である。更に、ウイルス粒子は、相対的に安定であり、精製および濃縮を受けることができ、上記のように、感染スペクトルに影響を与えるように修飾できる。更に、導入アデノウイルスＤＮＡ(およびそれを含む外来ＤＮＡ)は、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソームのままであり、それにより、導入ＤＮＡが宿主ゲノム(例えば、レトロウイルスＤＮＡ)に組み込まれる状況下、挿入突然変異誘発の結果起こり得る可能性のある問題を回避できる。更に、アデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを運搬する能力は、他の遺伝子運搬ベクターと比較して大きい(８キロ塩基まで)(Ｂerkner et al. 前掲；Ｈaj-ＡhmandおよびＧraham(1986) Ｊ. Ｖirol. 57;267)。現在使用され、そして本発明の好ましい殆どの複製欠損性アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３ゲノムの全てまたは一部を欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程を残している(例えば、Ｊones et al. (1979) Ｃell 16:683；Ｂerkner et al., 前掲；およびＧraham et al., Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology, Ｅ. Ｊ. Ｍurray編(Ｈumana, Ｃlifton, ＮＬ, 1991) vol. 7 pp. 109-127参照)。bcl−ＸＬタンパク質をコードする対象となる核酸分子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要遅延プロモーター(ＭＬＰ)および関連リーダー配列、Ｅ３プロモーターまたは外来的に付加したプロモーター配列の制御下にあり得る。
【００５７】
bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子のインビトロ運搬に有用な更に別のウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような他のウイルスを有効な複製および増殖的ライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。(レビューのために、Ｍuzyczka et al. Ｃurr. Ｔopics in Ｍicro. and Ｉmmunol. (1992) 158:97-129参照)。そのＤＮＡを細胞分裂していない細胞に組み込むことができ、安定な高頻度の組み込み(インテグレーション)を示す幾つかのウイルスの一つがまた存在する(例えば、Ｆlotte et al. (1992) Ａm. Ｊ. Ｒespir. Ｃell. Ｍol. Ｂiol. 7:349-356；Ｓamulski et al. (1989) Ｊ. Ｖirol. 63:3822-3828；およびＭcＬaughlin et al. (1989) Ｊ. Ｖirol. 62:1963-1973参照)。ＡＡＶの３００塩基対程を含有するベクターは、パッケージでき、組み込みことができる。外来ＤＮＡのための領域は、約４.５ｋｂに限定される。Ｔratschin et al. (1985) Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 5:3251-3260に記載のようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するのに使用できる。種々の核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞タイプに導入されている(例えば、Ｈermonat et al. (1984) Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 81:6466-6470；Ｔratschin et al. (1985) Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 4:2072-2081；Ｗondisford et al. (1988) Ｍol. Ｅndocrinol. 2:32-39；Ｔratschin et al. (1984) Ｊ. Ｖirol. 51:611-619；およびＦlotte et al. (1993) Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. 268:3781-3790参照)。遺伝子治療に適用し得る他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよび幾つかのＲＮＡウイルスに由来する。
【００５８】
bcl−ＸＬ−コード配列に加えて、発現ベクターはまた選択マーカーをコードする遺伝子も含み得る。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような医薬に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子と同じベクター(例えば、プラスミド)に導入し得るか、または別のベクター(例えば、プラスミド)に導入し得る。
【００５９】
あるいは、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、細胞運搬媒体により運ばれ、細胞に輸送され得る。このような媒体は、例えば、カチオン性リポソーム(リポフェクチン)または誘導体化(例えば、抗体コンジュゲート)ポリリジンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープを含む。これらの媒体は、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスＤＮＡにより運ばれるbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸を、運搬できる。具体的態様において、一次Ｔリンパ球、特にＣＤ３＋、ＣＴ４＋およびＣＴ８＋Ｔ細胞で発現する有効な遺伝子は、Ｐhilip Ｒ. et al. (1994) Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 14, 2411に記載のように、カチオン性リポソームと複合体形成させたアデノ随伴ウイルスプラスミドＤＮＡを使用して得られる。
【００６０】
本発明の他の態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子を、可溶性分子複合体の形態で特定の細胞に運搬する。複合体は、特定の細胞の表面分子に結合し、細胞により続いてインターナリゼーションされ得るサイズである、核酸結合剤および細胞特異的結合剤を含む担体に解離可能に結合した核酸を含む。このような複合体は、米国特許出願第５,１６６,３２０号に記載されている。
本発明の他の態様において、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸は、Ｙang, Ｎ.−Ｓ.およびＳun, Ｗ. Ｈ. (1995) Ｎature Ｍedicine 1, 481に記載のように、Ｔ細胞に粒子衝撃により挿入する。
【００６１】
１.１ blc−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質を使用する方法
一つの態様において、本発明の方法は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する少なくとも一つの作用物質にＴ細胞を接触させることにより、Ｔ細胞の生存を強化させる方法を含む。本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞と相互作用して、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる少なくとも一つの作用物質は、Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８のような、Ｔ細胞の表面の分子と相互作用する、１またはそれ以上の作用物質を含む。本発明の他の態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる少なくとも一つの作用物質は、例えば、bcl−Ｘ遺伝子の発現の増加により、細胞内に作用する作用物質である。"Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するために細胞内に作用する作用物質”なる用語は、Ｔ細胞の表面受容体には結合しないが、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加をもたらす、Ｔ細胞の受容体の結合により誘導される細胞内シグナル(例えば、第２メッセンジャー)を模倣するか、または誘導する作用物質を含むことを意図する。作用物質は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質の製造を、bcl−Ｘ遺伝子転写の増加、bcl−ＸＬｍＲＮＡの安定化またはbcl−ＸＬｍＲＮＡの翻訳の増加による、種々の機構により刺激し得る。好ましい態様において、bcl−ＸＬタンパク質レベルは、選択的に、すなわち、Ｂcl−ＸＳタンパク質レベルの付随的増加なしに増加される。
【００６２】
"内生遺伝子の発現を刺激する”なる用語は、遺伝子によりコードされるbcl−ＸＬタンパク質のレベルが細胞内で増加するように、細胞内のbcl−Ｘ遺伝子に作用することを含むことを意図する。“転写を刺激する”なる用語は、ｍＲＮＡ転写の量が増加するように、転写に影響を与えることを含むことを意図する。"内生bcl−Ｘ遺伝子”なる用語は、Ｔ細胞に本来あるbcl−Ｘ遺伝子を意味することを意図し、Ｔ細胞に導入された“外来bcl−Ｘ遺伝子”と反対である。
【００６３】
本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞を少なくとも一つの作用物質と接触させ、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加および細胞死からのＴ細胞の防御をもたらす。好ましい態様において、Ｔ細胞の生存は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞を刺激する作用物質の組み合わせと接触させることにより増加する。作用物質の好ましい組み合わせは、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞に共刺激性分子を提供する作用物質を含む作用物質の組み合わせである。例えば、Ｔ細胞生存は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する第１作用物質およびＴ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供する第２作用物質と接触させることにより促進される。より好ましい組み合わせは、Ｔ細胞内でbcl−ＸＬタンパク質レベルが増加するようにＴ細胞受容体を刺激する作用物質およびＴ細胞へのコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質を含む。
【００６４】
"一次活性化シグナル”なる用語は、典型的にＴ細胞受容体(ＴＣＲ)／ＣＤ３複合体により誘発される、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナルを含むことを意図する。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が、コスティミュラトリー・シグナルのような第２シグナルを受けて、増殖および分化が誘導されるような、Ｔ細胞の修飾を含むことを意図する。具体的態様において、一次活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体に関連するＣＤ３複合体と接触させる作用物質により提供される。好ましい態様において、作用物質は、モノクローナル抗体ＯＫＴ３(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection, Ｒockvill, ＭＤ；Ｎo. ＣＲＬ 8001から入手可能)のようなＣＤ３に対して反応性の抗体である。本発明の他の態様において、刺激性作用物質は、抗体の組み合わせ、例えば、Ｔ１１.３＋Ｔ１１.１またはＴ１１.３＋Ｔ１１.２(例えば、Ｍeuer, Ｓ.Ｃ. et al. (1984) Ｃell 36:897-906参照)のような、Ｔ細胞のＣＤ２複合体を刺激する作用物質である。更に別の態様において、一次活性化シグナルは、抗原または抗原提示細胞により提供される。従って、Ｔ細胞を１またはそれ以上の抗原または１またはそれ以上の抗原提示細胞と接触させることにより、および所望により、コスティミュラトリー・シグナルを提供する第２作用物質と接触させることにより、Ｔ細胞の集団における特定のＴ細胞クローンの生存を刺激することが可能である。
【００６５】
本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルの両方を刺激する作用物質の組み合わせを用いて刺激する。“共刺激性作用物質”なる用語は、一次活性化シグナルを受けたＴ細胞(例えば、活性化Ｔ細胞)を刺激して、増殖させるか、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはインターフェロン−γのようなサイトカインを分泌させる、コスティミュラトリー・シグナルをＴ細胞に提供する作用物質を含むことを意図する。具体的な態様において、共刺激性作用物質は、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４分子と相互作用する。更により具体的な態様において、コスティミュラトリー・シグナルは、Ｂ−リンパ球抗原Ｂ７−１またはＢ７−２のようなＣＤ２８またはＣＴＬＡ４のリガンドである。“ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態”なる用語は、Ｔ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供できる、Ｂ７−１およびＢ７−２分子、それらのフラグメントまたはそれらの修飾物を含むことを意図する。ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態は、例えば、活性化Ｔ細胞をＣＤ２８の天然リガンドの形態と接触させ、標準Ｔ細胞増殖アッセイを行うことにより同定できる。従って、ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態はＴ細胞の増殖を刺激できる。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４の天然リガンドの刺激は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４０８に記載される。
【００６６】
Ｔ細胞を細胞死から防御するのに使用できる他の作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルをＴ細胞内で増加させるような、Ｔ細胞活性化および／または共刺激に関与する１またはそれ以上の細胞内シグナル伝達経路を刺激する作用物質を含む。本発明の好ましい態様において、刺激性作用物質は、イオノマイシンまたはＡ２３１８７のようなカルシウムイオン性透過体である。あるいは、刺激性作用物質は、ホルボールエステルのようなプロテインキナーゼＣを刺激する作用物質であり得る。好ましいホルボールエステルは、ホルボール−１２,１３−ジブチレートである。本発明のより更に好ましい組み合わせにおいて、Ｔ細胞をカルシウムイオノホアおよびホルボールエステルの組み合わせと接触させる。刺激性作用物質は、プロテインチロシンキナーゼを活性化する作用物質であり得る。プロテインチロシンキナーゼを活性化する好ましい作用物質は、ペルバナデート(Ｏ'Ｓhea, Ｊ. Ｉ., et al. (1992) Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89:10306)である。
【００６７】
Ｔ細胞生存を刺激するのに使用できる他の作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる、ポリクローナルアクチベーターのような作用物質を含む。ポリクローナルアクチベーターは、Ｔ細胞の原形質膜上で発現する糖タンパク質に結合する作用物質を含み、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、コンカナバリン(ＣonＡ)およびアメリカヤマゴボウマイトジェン(ＰＷＭ)を含む。
【００６８】
Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加できるスーパー抗原は、また本発明の範囲内である。本明細書で定義される“スーパー抗原”なる用語は、細菌エンテロトキシンまたはＴ細胞の増殖を刺激できる他の細菌タンパク質を含むことを意図する。スーパー抗原は、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤおよびＳＥＥのようなスタフィロコッカスエンテロトキシン(ＳＥ)を含む。スーパー抗原はまたはレトロウイルススーパー抗原のようなウイルス起源であり得る。
【００６９】
Ｔ細胞生存の刺激に使用し得る更に別の抗原は、リンホカインを含み、それは単独または他の作用物質と組み合わせて、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる。従って、本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の一次活性化シグナルを提供する作用物質(例えば、抗ＣＤ３抗体)およびbcl−ＸＬタンパク質レベルをＴ細胞内で増加させる有効量のＩＬ−２と接触させる。
【００７０】
単独または他の作用物質と組み合わせて、Ｔ細胞死をbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加により予防できる更なる作用物質は、Ｔ細胞を作用物質単独または他の作用物質と共に接触させ、bcl−ＸＬタンパク質レベルを、本明細書に記載のように、例えば、ウエスタンブロット分析により追跡することにより同定し得る。
【００７１】
本発明の範囲内の作用物質は、溶液で、または固体表面に結合させて使用できる。固体表面は、例えば、組織培養皿またはビーズの表面であり得る。刺激性作用物質の性質に依存して、固体表面への結合は、当分野で既知の方法により行うことができる。例えば、タンパク質を商業的に入手可能な架橋剤(Ｐierce, Ｒokford ＩＬ)を使用して化学的に細胞表面に架橋するか、または一晩４℃でインキュベーションすることによりプラスチック上に固定化できる。数個の作用物質をＴ細胞内のbcl−ＸＬレベルの増加に使用する場合、ある作用物質は溶液状であってよく、ある作用物質は固体支持体に結合させてもよい。好ましい態様において、Ｔ細胞は固相結合抗ＣＤ３抗体および可溶性抗ＣＤ２８抗体の組み合わせと接触させる。
【００７２】
細胞内に作用してbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質は、細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの欠乏についての標準アッセイを使用して同定できる。例えば、Ｔ細胞を試験作用物質の存在下または不在下にインキュベーションでき、異なる時間に細胞により製造されたbcl−ＸＬタンパク質の量を、本発明に参考として包含する、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／００６４２の実施例部分に記載のように、ウエスタンブロット分析により測定できる。従って、本発明の方法を行うのに好ましい作用物質は、ウエスタンブロット分析で測定した際に、bcl−ＸＬタンパク質レベルの著しい増加を誘導するものを含む。
【００７３】
更に、Ｔ細胞のbcl−ＸＬのタンパク質レベルの増加に使用できる作用物質は、同定用のbcl−Ｘ遺伝子の調節領域の分析により同定できる。ＤＮＡは、特定の作用物質により、遺伝子の転写を調節するように配列している。例えば、これらの配列に特異的に結合する転写アクチベーターは、bd−Ｘ遺伝子発現の刺激に使用できる。次いで、これらの作用物質が細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するか、ウエスタンブロット分析により確認できる。
【００７４】
本発明の具体的態様において、作用物質は、選択的に、または少なくとも優勢にＴ細胞に作用し、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる。従って、作用物質の投与は、Ｔ細胞内のみのまたは少なくとも好ましくはＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加を得るようにする。Ｔ細胞特異的作用物質は、インビトロで、異なる細胞タイプを作用物質に接触させ、細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの測定をウエスタンブロット分析により行うことにより同定できる。従って、好ましい作用物質は、Ｔ細胞内のみのまたは少なくとも好ましくはＴ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルの増加をもたらすものである。
【００７５】
本発明の好ましい態様において、細胞内に作用してbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質は、相対的に短い半減期を有するものである。このような作用物質により、作用物質の効果が良好に制御される。特に、このような作用物質は、Ｔ細胞の細胞生存を短期間、中期間、または長期間刺激できる。実際、本発明の具体的態様において、Ｔ細胞生存は、一時的に、例えば、作用物質を感染部位の免疫応答のブースターに使用する条件下のみで、増加するのが好ましい。免疫応答は、Ｔ細胞の半減期の制御により少なくとも一部分制御される。ある条件下ではＴ細胞死が起こらないと、実際的には、有害な作用をもたらす場合がある。しかしながら、本発明の他の態様において、細胞内に作用して、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質は、作用物質の被験体へのより少ない投与でもＴ細胞死に対する有効な長期防御を得ることができるように、長い半減期を有する。
【００７６】
１.３. Ｔ細胞にタンパク質を導入することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法
本発明の他の態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞による摂取に適した形態のbcl−ＸＬタンパク質と接触させることを含む方法により、Ｔ細胞を細胞死から防御する。従って、本発明の具体的態様において、bcl−ＸＬタンパク質は、細菌発現システムおよび適当な媒体でのＴ細胞への輸送のような、慣用法によりインビトロで合成される。適当な媒体は、特定の細胞、特にＴ細胞またはＴ細胞の選択的サブセットを標的とするように修飾できるリポソームを含む。
【００７７】
bcl−ＸＬタンパク質は、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子またはbcl−ＸＬの生理学的に活性な形態を、その後種々の宿主、特に哺乳動物または昆虫細胞培養物のような真核細胞だけでなく、Ｅ. coliのような原核細胞での対応するタンパク質の合成を指向する、種々の発現ベクターに挿入することによりインビトロで製造できる。本発明の範囲内の発現ベクターは、本明細書に記載の核酸および核酸に作動可能に連結させたプロモーターを含む。このような発現ベクターは、宿主細胞をトランスフェクションするのに使用でき、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされるタンパク質が製造される。本明細書に記載の本発明の発現ベクターは、典型的に、少なくとも一つの調節配列に作動可能に連結させたbcl−ＸＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。調節配列は、上記である。発現ベクターの設計は、トランスフェクションすべき宿主細胞の選択および／または発現することが望ましいタンパク質のタイプおよび／または量のような因子に依存し得る。
【００７８】
本発明の発現ベクターは、真核または原核(例えば、哺乳類、昆虫または酵母細胞)の細胞のトランスフェクションに使用でき、それにより、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質を合成する。原核細胞における発現は、多くの場合、Ｅ. coliにて構成性または誘導性プロモーターと共に行う。あるＥ. coli発現ベクター(いわゆる融合ベクター)は、多くのアミノ酸残基を発現組換えタンパク質に、通常は、発現タンパク質のアミノ末端に付加するために設計される。このような融合ベクターは、３つの目的で働く：１）組換えタンパク質の発現の増加のため；２）標的組換えタンパク質の溶解性の増加のため；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、標的組換えタンパク質の精製における補助のため。融合発現ベクターの例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびマルトースＥ結合タンパク質を、それぞれ、標的組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ(Ａmrad Ｃorp., Ｍelbourne, Ａustralia)およびｐＭＡＬ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs, Ｂerberly, ＭＡ)がある。従って、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子は、真核融合ベクター中の更なるコード配列に結合でき、融合タンパク質の発現、溶解性または精製を補助する。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位を、融合分子と標的組換えタンパク質の結合部で挿入することにより、融合タンパク質の精製に続く標的組換えタンパク質を融合分子から分離することが可能である。このような酵素およびそれらの連結認識配列は、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。
【００７９】
誘導性非融合発現ベクターには、pＴrc(Ａmann et al. (1988) Ｇene 69:301-315)およびpＥＴ11d(Ｓtudier et al., Ｇene Ｅxpression Ｔechnology：Ｍethods in Ｅnzymology 185, Ａcademic Ｐress, Ｓan Ｄiego, Ｃalifornia (1990)60-89)がある。pＴrcベクター４からの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現（coexpressed）ウイルスＲＮＡポリメラーゼ(Ｔ７gn１)により媒介されるＴ７gn10-lac0融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、Ｔ７gn１を有する非活性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００８０】
Ｅ. coli内のbcl−ＸＬタンパク質の発現を最大にする一つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を低下させて、宿主細菌中のタンパク質を発現させることである(Ｇottesman, Ｓ., Ｇene Ｅxpression Ｔechnology：Ｍethods in Ｅnzymology 185, Ａcademic Ｐress, Ｓan Ｄiego, Ｃalifornia (1990) 119-128)。他の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが、高度に発現したＥ. coliタンパク質において優先的に利用されるものであるように、発現ベクター内に挿入されるbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を変えることである(Ｗada et al., (1992) Ｎuc. Ａcids Ｒes. 20:2111-2118)。このような核酸配列の置換は、本発明に含まれ、標準ＤＮＡ技術により行うことができる。
【００８１】
あるいは、bcl−ＸＬタンパク質は、哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＮＳＯ細胞)、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルスベクターを使用して)または酵母細胞のような真核宿主細胞で発現できる。他の適当な宿主細胞は、Ｇoeddel, (1990)前掲に見られるか、当業者に既知であり得る。真核細胞における真核細胞性タンパク質の発現が、組換えタンパク質の部分的または完全グリコシル化および／または対応する鎖内または鎖間ジスルフィド結合の形成を導くため、真核よりむしろ原核でのbcl−ＸＬタンパク質の発現が好ましいことがある。哺乳動物細胞で発現させる場合、ベクターの制御機能は、ウイルス性の物質により提供されることが多い。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。哺乳動物細胞でbcl−ＸＬタンパク質を発現させる場合、一般にＣＯＳ細胞(Ｇluzman, Ｙ. (1981) Ｃell 23:175-182)は一過性増幅／発現のためにｐＣＤＭ８(Ｓeed, Ｂ. (1987) Ｎature 329:740)のようなベクターとの複合体で使用するのに対し、ＣＨＯ(dhfr Ｃhinese Ｈamster Ｏvary)細胞は哺乳動物細胞での安定な増幅／発現のためにＰＭＴ２ＰＣ(Ｋaufman et al., (1987) ＥＭＢＯ Ｊ. 6:187-195)のようなベクターと共に使用する。組換えタンパク質の製造のための好ましい細胞系は、ＥＣＡＣＣ(カタログ番号85110503)から入手可能であり、Ｇalfre, Ｇ.およびMｉlstein, Ｃ.((1981) Ｍethods in Ｅnzymology 73(13):3-46；およびＰreparation of Ｍonoclonal Ａntibodies:Ｓtrategies and Ｐrocedures, Ａcademic Ｐress, Ｎ.Ｙ., Ｎ.Ｙ.)記載のＮＳＯミエローマ細胞である。酵母での組換えタンパク質の発現に適当なベクターの例は、pＹepＳec１(Ｂaldari et al., (1987) Ｅmbo Ｊ. 6:229-234)、ｐＭＡ(ＫurjanおよびＨerskowitz, (1982) Ｃell 30:933-943)、pJRY88(Ｓchultz et al., (1987) Ｇene 54:113-123)、pYES2(Ｉnvitrogen Ｃorporation, Ｓan Ｄiego, ＣＡ)を含む。培養昆虫細胞(ＳＦ９細胞)中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ(Ｓmith et al., (1983) Ｍol. Ｃell Ｂiol. 3:2156-2165)およびｐＶＬシリーズ(Ｌucklow, Ｖ.Ａ.,およびＳummers, Ｍ.Ｄ., (1989) Ｖirology 170:31-39)を含む。
【００８２】
ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒体トンラスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションのような慣用の形質転換またはトランスフェクション法により、真核または原核細胞に挿入できる。宿主細胞を形質転換する適当な方法は、Ｓambrook et al. (Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 2nd Ｅdition, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory press(1989))および他の研究用テキストに見ることができる。
【００８３】
哺乳動物細胞を安定にトランスフェクションさせる場合、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術にもよるが、小さいフラクションの細胞のみがＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体（インテグレート）の同定および選択のために、一般的に、選択マーカー(例えば、抗生物質への耐性)をコードする遺伝子を、対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような医薬に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、対象となる遺伝子と同じプラスミドにより宿主細胞内に挿入できるかまたは別のプラスミドにより挿入できる。これらの対象となる遺伝子を含む細胞は、医薬選択（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んた細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)により同定できる。次いで生存細胞を、bcl−ＸＬタンパク質の製造について、例えば、抗bcl−ＸＬ抗体の細胞上清からの免疫沈殿によりスクリーニングできる。
【００８４】
組換え技術により製造されるbcl−ＸＬタンパク質は、細胞の混合物およびタンパク質を含む培地から分泌および単離できる。bcl−ＸＬタンパク質の選択のために、適当なシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をbcl−ＸＬをコードするヌクレオチド配列の５'末端に連結させて、bcl−ＸＬタンパク質を、細胞からのタンパク質の分泌をもたらすシグナルペプチドに連結させる。あるいは、タンパク質を細胞質に残すこともでき、その細胞を回収し、溶解してタンパク質を単離し得る。細胞培養に適当な培地は当分野で既知である。タンパク質は、細胞培養培地、宿主細胞または両方から、タンパク質精製の分野で既知の技術を使用して単離できる。
【００８５】
組換え的に製造されたbcl−ＸＬタンパク質は、被験体に投与するための適当な医薬媒体にパッケージでき、そうして、bcl−ＸＬタンパク質を被験体のＴ細胞に導入し、細胞死に対するＴ細胞の防御をもたらす。組換えbcl−ＸＬタンパク質をＴ細胞へインビボおよびエクスビボ導入する場合、組換えタンパク質は、好ましくはリポソームにパッケージされる。しかしながら、他の担体システムも使用できる。
【００８６】
この方法のその他の実施態様において、Ｔ細胞生存は、Ｂadのbcl−ＸＳタンパク質のようなbcl−ＸＬのアンタゴニストのタンパク質レベルの減少により、促進される。bcl−ＸＬアンタゴニストのタンパク質レベル減少は、Ｔ細胞を、アンタゴニストをコードする遺伝子の発現を減少させる少なくとも一つの作用物質と接触させることにより、またはＴ細胞に、アンタゴニストの生理学的活性を減少させる核酸または他の化合物を挿入することにより、達成できる。bcl−ＸＳおよびＢadタンパク質レベルをダウンレギュレーションする方法は、bcl−ＸＬタンパク質レベルをダウンレギュレーションするための本明細書に記載の方法から改作できる。
【００８７】
Ｔ細胞死を減少させるために、上記方法を組み合わせることができる。
【００８８】
２.Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする方法
本発明の具体的な実施態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質のレベルを阻害または減少させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対してより感受性にする。例えば、Ｔ細胞の細胞死への感受性は、Ｔ細胞を、bcl−ＸＬ機能を不活性にするかまたはbcl−ＸＬの生物学的活性を減少させる作用物質と接触させることにより、増加できる。“Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする”なる用語は、Ｔ細胞の細胞死への感受性が、非修飾Ｔ細胞と比較して増加するように、Ｔ細胞内の生物学的に活性なbcl−ＸＬタンパク質の量が減少されるようにＴ細胞を修飾することを含むことを意図する。"機能的bcl−ＸＬタンパク質”および“生物学的活性bcl−ＸＬタンパク質”なる用語は、野生型bcl−ＸＬタンパク質または、あるいは、野生型bcl−ＸＬタンパク質の生物学的機能を遂行できるbcl−ＸＬタンパク質の修飾形態を含むことを意図する。Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする本発明の方法は、Ｔ細胞のポリクローナル集団または特異的Ｔ細胞クローンの欠失を引き起こしたい場合に多くの治療的応用性を有する。従って、本発明の方法は、例えば、自己免疫疾患の処置に有用である。
【００８９】
Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する方法は、Ｔ細胞を、bcl−Ｘ遺伝子の転写のレベルを減少させる作用物質、bcl−ＸＬｍＲＮＡを脱安定化する作用物質、bcl−ＸpremＲＮＡのbcl−ＸＬｍＲＮＡへのスプライシングを阻止する作用物質、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する作用物質またはこれらの作用物質の組み合わせと接触させることから成る方法を含む。あるいは、bcl−ＸＬと相互作用し、bcl−ＸＬの生物学的活性を阻害または減少させるタンパク質のタンパク質レベルを増加させることによりbcl−ＸＬタンパク質の防御効果に打ち勝つことができる。一つの実施態様において、Ｂadまたはbcl−ＸＳタンパク質のタンパク質レベルを、Ｔ細胞が細胞死に対して感受性となるように、Ｔ細胞内で増加させる。
【００９０】
本発明の具体的実施態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞に、bcl−ＸＬ機能を妨害するＲＮＡまたはタンパク質を発現する核酸を挿入することにより減少する。例えば、一つの実施態様では、bcl−ＸＬタンパク質の製造を阻害するアンチセンス核酸をＴ細胞に導入する。“アンチセンス”核酸は、“センス”核酸に相補的な、例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列を含み、ワトソンとクリックの塩基対形成規則に従い構築される。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコード領域に相補的であり得るか、またはｍＲＮＡの５'または３'非翻訳領域に相補的であり得る。ヒトbcl−ＸＬをコードするヌクレオチド配列のコード領域は配列番号１に示す。好ましくは、アンチセンス核酸は、開始コドンの前にあるかまたはそのコドンにまたがる領域と相補的であるか、またはｍＲＮＡの３'非翻訳領域にある。アンチセンス核酸は、配列番号１に示すヌクレオチド配列、または当分野で既知の他のbcl−ＸＬコード配列に基づいて設計できる。例えば、核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列のコード領域または非翻訳領域に相補的な配列を有するように設計する。
【００９１】
本発明のアンチセンス核酸は、当分野で既知の方法を使用した化学的合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築できる。アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは、分子の生物学的安定性を増加するためにまたはアンチセンスとセンス核酸の間に形成された二本鎖の物理的安定性を増加するために設計した種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養中のＴ細胞に導入でき、bcl−ＸＬの発現を阻害する。オリゴヌクレオチドのような１またはそれ以上のアンチセンス核酸を培養培地中の細胞に、典型的には約２００μg／mlで添加できる。
【００９２】
あるいは、bcl−ＸＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくともフラグメントに対応する核酸が、アンチセンス配向(すなわち、挿入した核酸から転写されるＲＮＡが対象となる標的核酸に対してアンチセンス配向である)でサブクローンされている発現ベクターを使用して、アンチセンス核酸をＴ細胞内で生物学的に製造できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸を非常に有効な調節領域の制御下に製造する、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得る。調節領域は、核酸分子の構成的または誘導的発現を刺激できる。核酸分子の発現を制御する調節領域、このような配列を有するベクター、および核酸分子をＴ細胞に導入する方法は上記である。bcl−ＸＬアンチセンスｍＲＮＡをコードする核酸分子は、Ｔ細胞にエクスビボまたはインビボで導入できる。核酸をＴ細胞にインビボで導入する方法は上記である。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の調節の記載は、Ｗeintraub, Ｈ. et al., Ａntisense ＲＮＡ as a molecular tool for genetic analysis, Ｒeviews-Ｔrends in Ｇenetics, Ｖol. 1(1) 1986参照。
【００９３】
本発明の他の態様において、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞に、リボザイムであるアンチセンス核酸の形態をコードする核酸を導入することにより減少する。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡ分子であり、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸に対して相補的な領域を有してそれらを切断する能力がある。bcl−ＸＬコード配列に特異性を有するリボザイムは、bcl−ＸＬコードｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、テトラヒメナL-19IVS RNAの誘導体は、活性部位の塩基配列が、bcl−ＸＬコードｍＲＮＡで切断すべき塩基配列と相補的であるように構築できる。例えば、Ｃech et al.米国特許第４,９８７,０７１号；およびＣhech et al.米国特許第５,１１６,７４２号参照。あるいは、bcl−ＸＬコード配列は、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するのに使用できる、例えば、Ｂartel, Ｄ.およびＳzostak, Ｊ. Ｗ. (1993) Ｓcience 261:1411-1418参照。
【００９４】
この方法の更に別の態様において、Ｔ細胞にbcl−ＸＬと相互作用してbcl−ＸＬの生理学的機能を阻害する阻害性タンパク質をコードする核酸分子を導入することにより、bcl−ＸＬタンパク質のレベルを減少させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする。本発明の具体的実施態様において、阻害性タンパク質はＢadタンパク質または、bcl−ＸＬの生理学的活性の減少をできるそれらのフラグメントである(Ｙang Ｅ. et al.(1995) Ｃell 80, 285)。他の態様において、阻害性タンパク質は、bcl−ＸＬと相互作用する細胞内抗体である。細胞内抗体分子は、Ｔ細胞内に一本鎖抗体分子を本明細書に記載の方法により導入および発現することを含む方法でＴ細胞に導入できる。このような方法は、例えば、Ｂiocca, Ｓ. et al. (1993) Ｂiochemical and Ｂiophysical Ｒesearch Ｃommunications 197, 422；Ｂiocca, Ｓ. et al. (1994) Ｂio/Ｔechnology 12, 396；Ｍarasco, Ｗ. Ａ., et al. (1993) Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 90, pp. 7889；およびＷerge et al. (1990) ＦＥＢＳ 274, 193に記載されている。
【００９５】
本発明の他の実施態様では、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルは、Ｔ細胞を、内因性bcl−ＸＬタンパク質レベルをダウンレギュレーションするする作用物質と接触させることにより減少させる。具体的実施態様において、作用物質は、bcl−ＸＬ遺伝子の転写を減少させるものである。Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルをダウンレギュレーションする作用物質は、試験すべき作用物質をＴ細胞とインキュベーションし、bcl−ＸＬタンパク質レベルを本明細書に記載のようにウエスタンブロット分析で測定するアッセイを使用して同定できる。
【００９６】
bcl−ＸＳまたはＢadのようなbcl−ＸＬのアンタゴニストのレベルを増加させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする方法もまた本発明の範囲内である。これらのタンパク質のいずれかまたは両方のタンパク質レベルは、Ｔ細胞を例えば、bcl−ＸＳおよび／またはＢadをコードする遺伝子の発現を刺激する作用物質と接触させることにより、Ｔ細胞内で増加させることができる。一つの実施態様において、bcl−ＸＳをコードするbcl−Ｘ遺伝子の発現を刺激する作用物質は、bcl−ＸＬ産生を刺激しない。あるいは、これらのタンパク質をコードする核酸は、bcl−ＸＬタンパク質レベルの増加について本明細書に記載の方法と同様にしてＴ細胞に導入できる。bcl−ＸＬのアンタゴニストをコードする核酸配列は、例えば、Ｙang, Ｅ.et al. (1995) Ｃell 80, 285に記載されている。bcl−ＸＳまたはＢadタンパク質レベルを増加させる方法は、bcl−ＸＬタンパク質レベルの増加について本明細書に記載した方法を応用できる。
【００９７】
本発明の一つの態様では、Ｔ細胞を、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する作用物質と一次Ｔ細胞活性化シグナルを提供してＴ細胞死を刺激する作用物質と共に接触させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にする。一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体のようなポリクローナルアクチベーターであり得る。本発明の好ましい態様において、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗原提示細胞上の抗原である。本発明の更に別の態様では、少なくとも一つのＴ細胞クローンを細胞死に対して感受性にするように、Ｔ細胞をさらに抗原提示細胞の更なる抗原と接触させる。更なる態様では、Ｔ細胞を、コスティミュラトリー・シグナルを阻止する作用物質と接触させる。従って、本発明の一つの実施態様において、Ｔ細胞死は、本発明の方法に従ったＴ細胞における一次活性化シグナルの刺激、Ｔ細胞の共刺激の阻害およびＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルの減少により誘発される。本発明の方法は、従って、Ｔ細胞のポリクローナル集団のＴ細胞死を可能にし、または、あるいは、限定された数のＴ細胞クローン(例えば、Ｔ細胞集団中の抗原特異的Ｔ細胞クローン)のＴ細胞死の誘導を可能にする。
【００９８】
Ｔ細胞の細胞死に対する感受性を増加する上記の方法は、組み合わせることができる。
【００９９】
３.医薬組成物
本発明は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法を提供する。Ｔ細胞内のbcl−ＸＬのレベルの増加は、内生bcl−ＸＬタンパク質のレベルの増加、またはＴ細胞へのbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸の導入、または両方の組み合わせにより達成できる。具体的態様では、内生bcl−ＸＬタンパク質のレベルを、Ｔ細胞を細胞内に作用する作用物質と接触させることにより増加させる。本発明の他の態様では、Ｔ細胞の細胞死に対する感受性は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少させる作用物質と接触させることにより増加させる。本発明の方法は、インビボ、エクスビボまたは両方の組み合わせにより実施できる。本発明の方法をエクスビボで実施するには、Ｔ細胞集団を被験体から得、インビトロでbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加または減少させる作用物質と接触させ、所望により、被験体に再投与する（この態様は更に下に記載する)。bcl−ＸＬタンパク質のレベルは、本明細書に記載のようにウエスタンブロット分析により追跡できる。
【０１００】
本発明の方法をインビボで実施する場合、作用物質をインビボの医薬投与に適した生物学的適合形態で被験体に投与する。“インビボで投与に適した生物学的適合形態”は、作用物質の治療的効果が毒性効果より重いような、投与すべき作用物質の形態を意味する。投与すべき作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子または細胞内のbcl−ＸＬタンパク質の産生を阻害するアンチセンス核酸分子をコードする核酸分子、細胞内に作用してbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加または減少する作用物質、およびbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子にまたはbcl−ＸＬアンチセンス核酸分子をコードする核酸分子に作動可能に連結させた誘導性制御配列を調節する作用物質、を含む。
【０１０１】
“被験体”なる用語は、免疫応答を誘導できる生存生物、例えば哺乳動物を含むことを意図する。被験体の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種である。例えば、本発明の範囲内の動物は、家畜および家禽のような農業的対象となる動物を含む。あるいは、本発明の方法はまた植物に応用できる。
【０１０２】
本発明の作用物質の治療的有効量の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量と定義する。例えば、作用物質の治療的有効量は、病気の状態、年令、性別、および被験体の体重および被験体に所望の応答を誘発する作用物質の能力などの要因に依存して変化し得る。用量レジメは、最適な治療的応答を提供するように調節し得る。例えば、数回に分割した用量を、毎日投与してもよく、またその用量を治療的状態の緊急性に合わせて徐々に減少させてもよい。
【０１０３】
作用物質は、注射(皮下、静脈内等)、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与のような慣用法で投与し得る。投与経路によるが、作用物質を不活性化し得る、酵素、酸および他の自然条件の作用から防御するために、作用物質をある物質で被覆してもよい。
【０１０４】
非経口投与以外で作用物質を投与するために、作用物質を、その不活性化を防御する物質でコートするか、その作用物質と同時投与する。例えば、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子を含む発現プラスミドは、酵素阻害剤と共に適当な担体または希釈剤で、またはリポソームのような適当な担体で、被験体に投与し得る。薬学的に許容される希釈剤は、食塩水および水性緩衝化溶液を含む、酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(ＤＥＰ)およびトラシロールを含む。リポソームは、水中油中水(water-in-oil-in-water)エマルジョンおよび慣用のリポソームを含む(Ｓtrejan et al., (1984) Ｊ. Ｎeuroimmunol. 7:27)。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中、および油中で製造できる。貯蔵および使用の慣用条件下で、これらの製剤は微生物の生長を防ぐ防腐剤を含み得る。
注射使用に適当な医薬組成物は、滅菌水性溶液(水溶性の場合)または分散剤および滅菌注射溶液または分散剤の即席製造用の滅菌粉末を含む。全ての場合、組成物は滅菌状態でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に液体でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から防御されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体プロピレングリコール等)およびそれらの適当な混合物を含む溶剤または分散媒体であり得る。適当な溶解性は、例えば、レシチンコーティングの使用により、分散剤の場合では、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物活性の阻止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射組成物の吸収延長は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことにより達成できる。
【０１０５】
滅菌注射溶液は、必要な量の作用物質を、適当な溶媒に、必要に応じて上述の１またはそれ以上の成分と組み合わせて包含させ、続いて滅菌濾過することにより製造できる。一般に、分散剤は、作用物質を塩基性分散媒体および上述からの必要な他の成分を含む滅菌媒体に包含させることにより製造する。滅菌注射溶液の製造における滅菌粉末の場合、好ましい製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過した溶液から、有効成分(例えば、ペプチド)＋他の所望の成分の粉末を製造する。
【０１０６】
作用物質が上記のように適切に保護されている場合、例えば、不活性希釈剤または吸収可能食用担体と共に、経口投与し得る。本明細書で使用する限り、"薬学的に許容される担体”は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。このような媒体および作用物質の薬学的活性物質への使用は当分野で既知である。慣用の媒体または試薬が作用物質と不適合である場合を除いて、治療用組成物へのその使用が期待される。補足的有効化合物もまた組成物に包含できる。
【０１０７】
非経口投与組成物を、投与が容易であり、均一の量である投与単位形態に調剤するのが特に有利である。本明細書で使用する投与単位形態は、処置すべき哺乳動物被験体に均一に投与するのに適した物質的に別の単位を意味する；各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生むと計算された予定量の有効化合物を含む。本発明の投与単位形態の詳細は、(ａ)作用物質の独自の特性および達成すべき具体的な治療効果、およびｂ）被験体における感受性処置剤のような調剤の分野で固有の限界により規定されており、それに直接依存している。
【０１０８】
４.本発明の方法の応用
本発明は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加することにより、Ｔ細胞を細胞死から防御する方法に関する。本発明はまたＴ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少させることにより、Ｔ細胞を細胞死に対して感受性にすることにも関する。これらの方法は、インビボおよびエクソビボの両方で実施できる。エクソビボで実施する時、末梢血単核細胞を被験体から得、密度勾配遠心、例えば、フィコール／ハイパークにより単離できる。具体的態様において、純粋な末梢血細胞を次いでbcl−ＸＬタンパク質のレベルを修飾する作用物質と接触させる。この方法の他の態様において、末梢血単核細胞をbcl−ＸＬタンパク質のレベルを調節する作用物質と接触させる前に特異的細胞タイプで豊富化させる。単核細胞は、例えば、プラスチック上への接着により枯渇できる。所望により、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、残りの単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＣＴ８＋Ｔ細胞から、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)および商業的に入手可能なｍＡｂ(例えば、抗ＣＤ１４(Ｍｏ２)、抗ＣＤ１１ｂ(Ｍｏ１)、抗ＣＤ２０(Ｂ１)、抗ＣＤ１６(３Ｇ８)および抗ＣＤ８(７ＰＴ３Ｆ９)ｍＡｂ)を使用した抗マウスＩｇ被覆磁気ビーズを使用して分離できる。本発明の方法は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋(自生ＣＤ４＋Ｔ細胞)およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋(記憶Ｔ細胞)Ｔ細胞サブセットのようなＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットに適応できる。これらは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の製造については、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体(ＵＣＨＬＩ)の更なる使用と共に、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の製造については抗ＣＤ４５ＲＡ抗体(２Ｈ４)の更なる使用と共に、上記のように製造できる。
【０１０９】
精製の効果は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および抗ＣＤ１４ｍＡｂまたはＴ細胞の特異的サブセットを認識する付加的抗体、続くフルオレセインイソチオシアネート接合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Ｆisher, Ｐittsburgh, ＰＡ)または他の二次抗体を使用したフローサイトメトリー(Ｃoulter, ＥＰＩＣＳ Ｅlite)により分析できる。
【０１１０】
エクスビボで使用する細胞集団のタイプは、bcl−ＸＬタンパク質レベルの修飾に使用する作用物質のタイプ、作用物質をＴ細胞に運搬するのに使用する媒体のタイプ、bcl−ＸＬタンパク質レベルの増加が望ましいＴ細胞のサブセットを含む種々の因子に依存する。従って、作用物質がＴ細胞のサブセットに特異的に影響を与える場合、(例えば、Ｔ細胞の特異的サブセットのみを標的にする運搬媒体の使用により)、Ｔ細胞の特異的サブセットの精製は必要ではない。作用物質が細胞の特異的サブセットを標的とするようにさせる媒体は、リポソームまたは所望の細胞タイプを認識する分子が結合した組換えウイルス粒子を含む。このような分子には、表面分子に対する抗体または受容体に対するリガンドがある。Ｔ細胞の選択的サブセットのみを、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞のみを標的としたい場合、および使用する作用物質がこのＴ細胞のサブセットを選択的に標的とできない場合、細胞を作用物質と接触させる前にＴ細胞の特異的サブセットを単離する必要があり得る。
【０１１１】
被験体から得るＴ細胞のような末梢血細胞またはその精製サブセットを、次いで、インビトロで、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを調節する作用物質の存在下にインキュベーションする。作用物質の量は、作用物質のタイプ、所望の効果および作用物質と接触させる細胞の集団などの種々の要因によって変わる。細胞集団に添加すべき作用物質の適当な量は、作用物質の種々の量を細胞培養物に添加し、種々の時間でのbcl−ＸＬタンパク質の量を、本明細書に記載のようにウエスタンブロット分析により測定するアッセイを行うことにより決定できる。細胞の異種集団を作用物質と接触させる場合、細胞をウエスタンブロット分析にかける前に、bcl−ＸＬの修飾が望まれるＴ細胞のサブセットを最初に単離することが必要であり得る。Ｔ細胞の特異的サブセットは、上記のようにネガティブセレクションにより細胞集団から単離できるか、またはあるいは、Ｔ細胞の特異的サブセットをＦＡＣＳを使用して単離できる。
【０１１２】
本発明の具体的態様において、被験体から単離されたＴ細胞を、bcl−ＸＬのタンパク質レベルを修飾する作用物質と接触させ、更に、インビトロでＴ細胞の集団を拡張する(即ち、集団内のＴ細胞の数を増加させる)ために培養する。Ｔ細胞の集団のインビトロ拡張は、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６に記載され、その内容は本明細書に参考として包含させる。
【０１１３】
Ｔ細胞またはそのサブセット内のbcl−ＸＬタンパク質レベルの修飾に続いて、細胞を被験体に再投与できる。具体的態様では、まず細胞を精製して、被験体への投与に望ましくない培養培地中の物質を除去する。精製は、例えば、フィコールハイパーク勾配遠心により行うことができる。
【０１１４】
あるいは、本発明の方法はインビボで実施できる。この態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを修飾する作用物質は、薬学的に許容可能な媒体中で、所望の治療効果を得るのに充分な量で被験体に投与する。作用物質は、本発明の方法により処置すべき症状タイプによって、局所的または全身的に投与する。作用物質の投与に適当な媒体および経路は、本明細書３項に記載している。
【０１１５】
４.１.本発明の方法のＴ細胞死からの防御が有利な状態への適用
本発明の方法は、Ｔ細胞の細胞死を防止するのに有用である。本発明の方法により、全てのＴ細胞で細胞死が防止予防できるか、またはあるいは、細胞死をＴ細胞の特異的サブセット中で選択的に防止できる。更に、Ｔ細胞を、長期間、または短期間、細胞死から防御できる。局所的に存在するＴ細胞または全身的に(例えば、末梢血に)存在するＴ細胞を、細胞死から防御できる。
【０１１６】
好ましい態様において、本発明の方法は、ＨＩＶ感染個体のＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を防止し、ＨＩＶ感染からＴ細胞を防御するのに使用する。ＨＩＶ感染中、ウイルスはＣＤ４＋Ｔ細胞に感染し、これを殺傷する。従って、個体中のＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、被験体の微生物からの感染を防止するのに不十分な量まで段々に減少する。bcl−ＸＬタンパク質レベルが増加しているＴ細胞は、Ｔ細胞の生存率増加を測定したところ、ＨＩＶ感染に対して著しい防御を示すことが観察される(実施例９参照)。従って、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベル増加は、Ｔ細胞をＨＩＶ誘導細胞死から防御する。従って、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬ過発現は、ＨＩＶ感染被験体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数を維持する有効な方法を提供する。更に、本発明の方法は、ＨＩＶ感染被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加および／またはＨＩＶ感染個体におけるＴ細胞枯渇の速度減少をもたらし得る。
【０１１７】
本発明の方法は、ＨＩＶ感染、またはＴ細胞を細胞死に対して感受性にする他の感染物の感染ような、Ｔ細胞関連疾患を有する個体由来のＴ細胞の集団の拡張を可能にする方法を提供する。従って、この方法は、インビトロで細胞を拡張する方法を提供する。この場合、拡張Ｔ細胞集団を、被験体に投与し戻すことができる。好ましい態様において、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質およびＴ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質の組み合わせで刺激する。より好ましい態様において、Ｔ細胞をＴ細胞上のＣＤ２８と相互作用する作用物質およびＴ細胞受容体を介してbcl−ＸＬタンパク質レベルが増加され、細胞が細胞死から防御されるようにＴ細胞を刺激する作用物質の組み合わせと共に培養する。
【０１１８】
ＨＩＶ感染被験体のＴ細胞死を防止する本発明の具体的実施態様では、末梢血細胞を被験体から入手し、インビトロで修飾して、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を増加させ、個体に再投与する。本発明の好ましい態様では、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子をＴ細胞に挿入することにより、被験体由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を修飾して、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するようにする。より更に好ましい態様では、bcl−ＸＬをコードする核酸分子は、細胞をウイルス粒子で感染させるような方法により、Ｔ細胞に導入されるウイルスベクター内に含有される。方法の他の好ましい態様は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、被験体に再投与する前に培養で更に拡張する。従って、本発明の方法は、ＨＩＶに感染した被験体の免疫系をＣＤ４＋Ｔ細胞で再集合させ、同時にこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞をウイルスによる感染に対して耐性にすることを可能にする。
【０１１９】
被験体に、個体のＣＤ４＋Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質のレベルを増加させる作用物質を投与することにより、ＨＩＶに感染した被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞死から防御することもまた可能である。この作用物質は、生理学的に許容される媒体に含まれたbcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸分子であり得る。本発明のより好ましい態様において、媒体を更に核酸がＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とするように操作する。あるいは、作用物質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させるように細胞内に作用する作用物質である。
【０１２０】
他の態様において、ＨＩＶで感染させた被験体のＴ細胞を、上記のエクスビボおよびインビボ法を組み合わせた方法により細胞死から防御する。本方法は、個体のＣＤ４＋Ｔ細胞を、インビボおよび／またはエクスビボでbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する幾つかの作用物質と接触させることを含む。例えば、bcl−ＸＬタンパク質をコードする核酸をＴ細胞に導入し、Ｔ細胞を更に内生bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するために細胞内に作用する作用物質と接触させる。
【０１２１】
あるいは、本発明の方法は、より迅速な感染の除去のために、免疫応答を強化するのに有用である。従って、本発明の具体的態様は、活性化Ｔ細胞をＴ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加させる作用物質と接触させて、細胞死から防御する。Ｔ細胞の活性化に続き、ＣＴ４＋Ｔ細胞を細胞死から防御することにより、ヘルパーＴ細胞が、Ｔヘルパー細胞が通常提供し得る以上の有効な“ヘルプ”を提供できる。同様に、延長寿命を有するＣＤ８＋Ｔ細胞は、通常の寿命のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも標的細胞を溶解できる。本発明の範囲内の方法は、全身感染および局所感染を処置する方法である。従って、作用物質を全身または局所的に投与できる。本発明の好ましい態様において、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを増加する作用物質は、bcl−ＸＬタンパク質レベルを増加するために細胞内に作用する作用物質である。本発明のより更に好ましい態様において、作用物質は、活性化Ｔ細胞の寿命が必要以上に(例えば、活性化Ｔ細胞が記憶Ｔ細胞になるかまたは感染の除去後に死滅する)長くならないような短い半減期を有する作用物質である。
【０１２２】
４.２.Ｔ細胞死に対する感受性増大が有利な状態への本発明方法の応用
本発明の方法はまた、Ｔ細胞の細胞死に対する感受性の増大にも有用である。従って、通常、内生bcl−ＸＬタンパク質レベル増加により細胞死から防御される状態に遭遇するＴ細胞は、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質のレベルが著しく減少すれば死滅する。本発明の方法は、Ｔ細胞関連疾患の被験体の処置に有用である。“Ｔ細胞関連疾患”は、延長寿命を有するＴ細胞に関連する疾患を意味する。
【０１２３】
具体的実施態様において、本発明の方法は、被験者の自己免疫疾患の処置にも有用である。細胞死に対する感受性を自己反応性Ｔ細胞中で増大させ、自己免疫疾患の作用を改善する。処置し得る自己免疫疾患の例は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、関節炎(例えば、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節炎)、ミエスシェニア・グラビス(myesthenia gravis)、心筋炎、ギラン・バレー症候群、全身性紅斑狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、ショーグレン症候群、円形脱毛症、クーロン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚性紅斑狼瘡、硬皮症、膣炎、直腸肛門炎、薬疹、癩反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫葡萄膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳疾患、特発性両側性進行性感音難聴、形成不全貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブン・ジョンソン症候群、特発性スプルー、偏平苔癬、グレーブス眼病、結節症、原発性胆汁性肝硬変、後部葡萄膜炎および肺内部線維症を含む。
【０１２４】
他の態様において、本発明の方法は、移植片拒絶反応の低減に使用する。例えば、移植細胞を、移植片に反応性のＴ細胞を細胞死に対して感受性にするように、Ｔ細胞内のbcl−ＸＬタンパク質レベルを減少する作用物質と共に宿主に投与する。この方法は、宿主に、ＣＴＬＡ４Ｉｇのような共刺激を遮断する作用物質を投与することも含み得る。同様に、本発明の方法は、移植片対宿主病の予防にも使用できる。好ましい方法において、ドナー骨髄を移植前に宿主細胞およびＴ細胞内のbcl−ＸＬタンパクを減少する作用物質と接触させる。こうして、ドナー骨髄のＴ細胞を細胞死に対して感受性にし、共刺激を阻害する作用物質と併用することで宿主特異的抗原に反応性のＴ細胞の細胞死を増大できる。
【０１２５】
以下は、本発明を更に下記実施例により説明するものであり、これは更に限定するものと見なすべきではない。本出願明細書に引用の全ての参考文献、継続特許出願および公開特許は、参考として本明細書に明示包含する。
【実施例】
【０１２６】
実施例１： 活性化がγ−照射後のＴ細胞の生存を高める
Ｔ細胞生存に対するＴ細胞活性化経路の効果を調べるために、休止Ｔ細胞をヒト末梢血から前から知られているネガティブセレクション法（Ｊune,Ｃ.Ｈ.et.al.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.7：4472−4481）により、分離した。簡単に言うと、細胞を抗体の反応混液の対象とし、休止ＣＤ２８−ポジティブＴ細胞以外のすべての細胞を除去する。ウシ胎児血清（１０％)、Ｌ−グルタミン（２mＭ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ml，１００μg／ml）およびＨＥＰＥＳ（２０mＭ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中でＴ細胞を培養した。細胞は、活性化または照射の前に一夜置いた。
【０１２７】
ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８特異モノクローナル抗体により提供される共刺激の存在または不在下に、培地のみで培養するか、あるいはＴＣＲ／ＣＤ３複合体を１２時間架橋することにより刺激した。Ｔ細胞の架橋はプレート固定化抗−ＣＤ３（Ｇ１９.４〔１μg／mlで〕）を用いて行い、Ｔ細胞の共刺激はＣＤ２８に対する可溶性抗体（モノクローナル抗体(mＡb)９.３）により１μg／mlで実施された。これらの各グループからの細胞はグループに分けた。１つのグループはさらに操作を行わないで培養し、他のグループはセシウム源γ−照射（Ｊ.Ｌ.Ｓhepherd Ｉnc.）による１５Ｇyのγ照射を行った。照射後、細胞は９６ウエル培養皿(Ｃostar)中に100,000細胞／ウエルで入れ、細胞の生存能力および全数をトリパンブルー排除法およびプロピジウムヨージド排除法により調べた。
【０１２８】
プロピジウムヨージド排除法について、２×１０５細胞の２つの分離サンプルを１％ＢＳＡおよび０.０１％ナトリウムアジドを補充したＰＢＳ ０.５mlに入れて、再懸濁した。プロピリジウムヨージド２ml（０.５mg／ml）を細胞に加え、サンプルをＦＡＣＳortおよびＬysis IIソフトウエアを用いたＦＡＣＳで分析した。生存能力パーセントは、プロピジウムヨージドを排除した細胞数を全細胞数で割ることにより求めた。解析による破片を除くために、生存細胞の前進光散布特性を利用した。
【０１２９】
結果を図１に図示する。全３集団の細胞が４日以上の培養期間において高い生存能力を保持した（図１、パネルＡ)。休止および活性化Ｔ細胞の生存もγ−照射後に調べた（図１、パネルＢ)。γ−照射誘発アポトーシスは、特殊なレセプターリガンド干渉を必要とせず、特殊レセプターレベルについてのコントロールの必要性なしに細胞の生存に細胞の活性化がどのように影響するのかを調べる手段とし得る。これらのアッセイに用いた照射量（１５Ｇy）は、実際に全群のすべての細胞に致命的なＤＮＡ損傷を与えるのに充分である。従って、細胞が確保された日数を越えて死ぬ率は、ＤＮＡ障害に対する応答において被ったＰＣＤに抵抗する能力を測定するのに用いられる。
【０１３０】
図１、パネルＢに示されるように、照射後、休止Ｔ細胞の生存能力は、刺激されたリンパ球のいかなる集団にみられるよりも、非常に速く低下した。照射４日後、いずれかの活性化集団におけるＴ細胞は、休止集団の細胞よりも統計的により生存し得た（p＜０.０２)。ＣＤ２８レセプターによって共刺激された細胞は、抗−ＣＤ３のみで刺激された細胞よりも、生存能力の僅かな、しかし再現性ある上昇を示した。抗−ＣＤ３刺激および抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８刺激細胞における細胞生存性が保持されることは、生存能力アッセイに平行してなされた細胞数の測定が細胞の絶対数の変化を示さなかったから、後のＴ細胞増殖の結果ではなかった。さらに、活性化された集団における全細胞は、遅Ｇ１またはＧ２のいずれかにおける細胞周期内に止まった。３母集団における細胞死は、細胞が最初に円鋸歯状になり、次いで核の凝縮およびＤＮＡフラグメンテーションをおこす典型的なアポトーシス性パターンに続いておきる。
【０１３１】
このように、本実施例は、Ｔ細胞の活性化がγ−照射後のＴ細胞生存を高めることを示す。
【０１３２】
実施例２： ＣＤ２８共刺激は抗−ＣＤ３活性化Ｔ細胞の生存能力を増加する
ＣＤ２８共刺激の存在または不在により刺激された細胞間における一つの相違は、これらの細胞により産生されたリンホカインのレベルである（Ｌindsten,Ｔ.et.al.(1989)Ｓince244：339−343)。従来から、生長因子が多様な細胞タイプにおける細胞生存の外的調節で重要な役割を果すことが示唆されている（Ｇroux,Ｈ.et.al.(1993)Ｅur.Ｊ.Ｉmmunol.23：1623−1629),Ｎunez,Ｇ.et.al.(1990)Ｊ.Ｉmmunol.144：3602−3610)。生長因子が共刺激の保護作用の因であるかどうかを決めるために、次の実施例が行われた。
【０１３３】
ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、実施例１記載のように、１２時間、抗−ＣＤ３の存在下にＣＤ２８モノクローナル抗体との共刺激の存在または不在で培養された。細胞は、そのならし培地にそのまま残し、洗い、次いで新しい培地に再懸濁するか、あるいは洗って、組換えＩＬ−２(rＩＬ−２)(Ｂoehringer-Ｍannheim）２００μ／mlを補充した新しい培地に再懸濁された。各グループからのアリコートを無操作のままにするか、または１２Ｇyのγ−照射にさらした。細胞生存能力は、実施例１に記載したように、操作後４日間毎日、プロピジウムヨージド排除法により測定した。
【０１３４】
結果を図２に図示する。図２のパネルＡによると、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のみで活性化されたＴ細胞は、活性化後培養において高い生存能力を保持していた。しかし、刺激細胞を水洗することによるならし培地の除去は、培養中に生存する細胞の能力を著しく低下せしめることにつながった。このインビトロ培養中に生存する能力の低下は、ＩＬ−２の添加により逆転され得る。抗−ＣＤ３刺激細胞に１５Ｇyのγ−照射がなされたとき（図２、パネルＢ)、一夜刺激後のならし培地の除去は、ＩＬ−２添加により逆転された細胞生存性の激しい低下をもたらした。このことは、生存が抗原レセプター活性化細胞における外的生長因子のレベルによって第一義的に決定されることを示している。従って、活性Ｔ細胞が培養中で生存し得る能力は、それがＩＬ−２などの生長因子を生産するオートクリン能力に基づいている。これらのデータは、ＩＬ−２がＴ細胞生存の外的レギュレーターであることを確認する。
【０１３５】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のみで刺激されたＴ細胞についての結果と対照的に、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８併用で刺激されたＴ細胞は内因リンホカインを洗出しても、さらにＩＬ−２を培養上澄液に加えても、その生存に変わりはない（図２、パネルＣおよびＤ）。
【０１３６】
本実施例の結果は、ＣＤ−２８仲介共刺激が細胞生存の外的メディエーターの産生に影響を及ぼさないだけでなく、ＰＣＤを受けた細胞の内因的感受性を調節する役割を演じる（次の実施例でさらに調べる）ことを表している。
【０１３７】
実施例３： Ｔ細胞活性化中のbcl−２およびbcl−Ｘ mＲＮＡ発現
ＰＣＤを受けたＴ細胞の内因的感受性に関与する遺伝子の発現を調節するときのＣＤ２８の役割について調べるために、休止ヒトＴ細胞および抗−ＣＤ２８の存在または不在下のＴＣＲ抗原レセプター複合物の架橋により活性化されたＴ細胞についてbcl−Ｘおよびbcl−２発現レベルを解析した。
【０１３８】
ＲＮＡは、培地のみで培養されたＣＤ２８＋Ｔ細胞から単離され、次いで１,６および１２時間、抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ３と抗−ＣＤ２８で刺激され、ノーザンブロット・ハイブリダイゼイションにより解析された。ＲＮＡは、すでに記述されているように（Ｊune,Ｃ.Ｈ.et.al.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.7：4472-4481)、勾配グアニジウム／ＣsＣl２による遠心分離でＴ細胞から分離した。等量のＲＮＡ（非変性アガロースゲル上で電気泳動した２８ＳリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド着色で検定）をアガロース／ホルムアルデヒド変性ゲル上に充填し、大きさによって分離した。ゲルをニトロセルロース（ＳchleicherおよびＳchuell）に移して、真空で２時間８０℃に加熱する。ブロットは、４２℃６時間Ｓtark液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１×ＳＳＣは０.１５Ｍ Ｎacl，０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)１×Ｄenhardt液，２５mＭ リン酸ナトリウム，pＨ６.５，Ｔorula ＲＮＡ ２５０μg／ml）中でプレハイブリダイズし、次いでＳtark液中で１０％硫酸デキストランおよび３２Ｐ−ラベルニック翻訳プローブ（１×１０６dpm／ml）で一夜４２℃ハイブリダイズした。ブロットをプローブし、次いでヒトbcl−ＸＬ cＤＮＡおよびネズミbcl−２ cＤＮＡに特異なプローブ（Ｓ.Ｋorsmeyer）で剥離した。
【０１３９】
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーションの結果を図３、パネルＡに示す。その結果によると、bcl−Ｘまたはbcl−２ mＲＮＡのいずれも、休止Ｔ細胞において検出レベルでは発現されなかった。しかし、両bcl−２およびbcl−Ｘ mＲＮＡの発現はＴ細胞活性化６時間後に誘導される。ＣＤ２８共刺激はbcl−２ mＲＮＡの発現に顕著な作用を有しなかった。一方ＣＤ２８共刺激はのbcl−Ｘ mＲＮＡ発現を高めた。抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激された細胞は、レベルが低下し始めた後４８時間、bcl−Ｘの高レベルの発現を維持した。bcl−２機能調節等に負の役割を有すと思われるbcl−２ファミリーの第３ナンバーは、遺伝子baxである。共刺激もbax mＲＮＡレベルに影響を与えなかった。
【０１４０】
bcl−Ｘの第１エクソンにおける２つの５'スプライス供与体の代替使用は２つの明白なmＲＮＡ種を生成する。bcl−ＸＬはエクソン１の完全コード領域を保持し、細胞の生存を高めるように機能する。一方、エクソン１内の上流スプライス供与体部位の利用は、エクソン１コード領域内で１８９bp欠失を含むbcl−ＸＳ mＲＮＡをもたらす。Ｂcl−ＸＳタンパク質は、両機能の優性ネガティブレギュレーターとして作用する（Ｂoise,Ｌ.Ｈ.et.al.(1993)Ｃell 74：597−608）。bcl−ＸＳおよびbcl−ＸＬ mＲＮＡは１８９bpによってのみ相違するので、ＲＮase保護は、Ｔ細胞活性および共刺激においてどのbcl−Ｘ mＲＮＡが誘導されたかを決定するために、行われた。
【０１４１】
Ｒnase保護検定は、休止細胞あるいは抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で６または１２時間刺激されたＴ細胞から分離されたＲＮＡについて実施された。Ｒnase保護アッセイは、市販キット（Ａmbion）の説明書に従って実施された。Ｔ細胞ＲＮＡ ３μgを放射性標識リボプローブでハイブリダイズした。このプローブは、bcl−ＸＬ cＤＮＡ＋プラスミド中のpＢluesript ＳＫをＡccＩで切断し、Ｐromegaからのキットを用いてプロモータよりインビトロで転写体を生成せしめて、つくられた。３３６ヌクレオチド・リボプローブはゲル電気泳動により精製され、抽出され、次いで、ＲＮaseＡおよびＲＮaseＴ１の反応混液の添加前に１６時間４２℃でＴ細胞ＲＮＡにハイブリダイズされた。bcl−ＸＬ mＲＮＡによるプローブの保護は２６４ヌクレオチドのフラグメントを生成し、bcl−ＸＳメッセージへのハイブリダイゼイションは放射性標識プローブの１６３ヌクレオチドフラグメントを保護する。保護産物を５％アクリルアミド／７Ｍ尿素シーフェンス・ゲル上で分離した。末端ラベルpＢluescript ＳＫII＋ＨpaII消化はマーカーとして用いた。ゲルを乾燥し、ＸＡＲ−５フィルム（Ｋodak）に感光した。
【０１４２】
Ｒnase保護アッセイの結果を図３パネルＢに示す。その結果によると、ＣＤ２８共刺激により調節が上昇された主なbcl−Ｘ mＲＮＡは、bcl−ＸＬである。小さい誘導もbcl−ＸＳのレベル上でみられる。
【０１４３】
そのように、本実施例の結果は、ＣＤ２８による活性Ｔ細胞の共刺激がbcl−ＸＬ mＲＮＡに顕著な増加をもたらすことを示している。
【０１４４】
実施例４： Ｔ細胞がＢcl−２タンパク質の構成的発現を発揮する
bcl−２ mＲＮＡのレベルがbcl−２タンパク質のレベルとあまり相関しないことは前に報告されているので（Ｃhleq-Ｄechamps,Ｃ.Ｍ.et.al.(1993)Ｂlood,81：293−298)、抗−ＣＤ２８で共刺激されるか、またはされない活性Ｔ細胞中のbcl−２タンパク質の量を測定した。
【０１４５】
この実施例において、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は上記のように抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体と共に０、６、１２または２４時間培養され、bc−２タンパク質レベルが免疫沈降法およびウエスタンブロット法により測定された。各時点で、各培養条件の細胞４×１０７が分離され、１.０ml ＮＥＴ−Ｎ（１００mＭ ＮaＣl，１mＭ ＥＤＴＡ ２０mＭ Ｔris，pＨ８.０，０.２％ＮＰ−４０）中に溶解された。核および細片は２分間４℃の微遠心で除去された。上澄液を３０分間パンソルビン（Ｃalbiochem）５０mlで処理した。遠心でパンソルビンを除いた後、上澄液を２つの等量（４５０μl）に分け、それに抗−bcl−Ｘウサギ血清（実施例５参照）１μgまたはハムスター抗−Ｂcl−２モノクローナル６Ｃ８（Ｈockenbery,Ｄ,et.al.(1990)Ｎature348：334−336）２.５μgのいずれかを加えた。溶解生成物を４℃で１時間振動し、次いで３０分間でタンパク質Ａアガロース（Ｇibco ＢＲＬ）２５μlを加えた。免疫沈降物を採取し、ＮＥＴ−Ｎで２回、ＮＥＴで１回洗った。２×ＳＤＳ充填緩衝液１００μlを加え、素早く凍らせ、ゲル電気泳動を行うまで−２０℃に保持した。
【０１４６】
免疫沈降物を煮沸し、１５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルは、２００mＡで３時間、ＢioＲad移送器を用いて電気ブロットによりニトロセルロースに移した。ブロットを一夜４℃で５％非脂肪ミルク／０.２％ツイン２０中でブロックし、上記のブロット液中で精製６Ｃ８ mＡb(１：200）とハイブリダイズした。ウエスタン・ブロットをＨyperfilm（Ａmersham）を有するＥＣＬシステム（Ａmersham）を用いて展開した。
【０１４７】
ウエスタン・ブロットの結果を図４に示す。休止末梢血Ｔ細胞がＢcl−２タンパク質を高レベルで発現することが分かる。さらに、Ｂcl−２タンパク質のレベルがＴＣＲ／ＣＤ３レセプターの抗−ＣＤ３抗体での架橋後の最初の２４時間以後あまり変動しない。ＣＤ２８レセプターでの共刺激もＢcl−２タンパク質レベルに影響を与えないようであった。
【０１４８】
本実施例は、休止Ｔ細胞がＢcl−２タンパク質を発現し、共刺激あり、または、なしのＴ細胞レセプターでのＴ細胞刺激がＢcl−２タンパク質レベルを上昇しないことを示す。
【０１４９】
実施例５：ＣＤ２８共刺激はbcl−Ｘ１タンパク質発現を高める
本実施例において、休止Ｔ細胞およびＣＤ２８２の共刺激の存在または不在でＴ細胞レセプターで活性化されたＴ細胞におけるbcl−Ｘ１のタンパク質レベルを解析した。
【０１５０】
bcl−Ｘ１のタンパク質レベルは、Ｂcl−２のタンパク質レベルの測定と平行して、実施例４に記載されたアッセイ法によって測定された。あらかじめ清澄化した後、上澄液を２等量（４５０μl）に分け、抗−bcl−Ｘウサギ血清１μlをこれらのアリコートの１つに加えた。タンパク質レベルは、モノクローナル抗−bcl−Ｘ抗体２Ａ１（１：１希釈）を用いて実施例４のように測定した。
【０１５１】
bcl−Ｘに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を次のように製造した。bcl−ＸＳのオープン・リーディング・フレーム(転写解読枠)をプライマー（５'−ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ−３’および５'−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＴＣ ＡＴＴ ＴＣＣ ＧＡＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＣＡ Ｇ−３’）でのＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ−３ｂのＮdeＩおよびＢamＨＩ部位（Novagen）にクローン化した。組換えタンパク質を０.４mＭ ＩＰＴＧでの誘導によりＢＬ２１細胞中で製造した。このタンパク質は、細菌溶解の不可溶フラクション中にあると測定され、次のように部分的に精製された。不可溶フラクションを２Ｍ尿素で洗い、６Ｍグアニジン−ＨＣｌで安定化した。タンパク質は、３Ｍおよび１Ｍグアニジン−ＨＣｌによる段階透析により再生し、次いでpＨ８.３で５００mＭ ＫＣｌでＰＢＳに対する透析を行った。タンパク質濃度は、市販キット（ＢioＲad）を用いたＢradfordアッセイ法により測定し、タンパク質純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコーマシックブルー着色法によりアッセイした。
【０１５２】
ウサギポリクローナルの抗体の製造のために、組換えタンパク質１mgを完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）に懸濁し、ウサギの脊中の数箇所に皮下注射した。不完全フロイント・アジュバント中のタンパク質２００μgで追加免疫した。インビトロ翻訳タンパク質およびトランスフェクトション細胞系列を用いて、組換えタンパク質に対して、および特異的免疫沈降についてのウエスタンブロット法で血清を選別した。
【０１５３】
モノクローナル抗体の製造のために、ＣＦＡ中に乳化したポリアクリルアミドゲル中の組換えbcl−ＸＳを後足の皮下および腹腔内投与して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した。マウスの免疫は、不完全フロイント・アジュバント中に乳化した可溶性のアクリルアミド基底ゲル結合タンパク質の混合物で、３０日の間隔をおいて２度、追加免疫した。最後の追加免疫から３日後に、脾臓およびリンパ節細胞を採取し、標準的技術（Kearney,J.F.(1984)In Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,NY,751-766）を用いて、Ｐ３Ｘ６３−Ａg８.６５３ミエローマ細胞と融合せしめた。融合１５日後、ハイブリドーマ上澄液について、ホウ酸塩緩衝液中（ｐＨ８.４）５μg／mlで組換えbcl−ＸＳによりコートされたウエルにおいてＥＬＩＳＡによる活性を調べた。ＥＬＩＳＡに陽性であったハイブリドーマをbcl−ＸＬまたはbcl−２でトランスフェクションさせたＦＬ５.１２に対するウエスタンブロットにより選別した。陽性ハイブリドーマ系は、制限希釈によりクローンし、再選別し、腹水製造のためにプリスタン−初回免疫ＢＡＬＢ／Ｃマウスに注射した。
【０１５４】
bcl−Ｘのタンパク質レベルを表すウエスタンブロット解析の結果を図４に示す。bcl−Ｘのタンパク質レベルは、Ｔ細胞活性化のレベルによって非常に変化する。検出可能なbcl−Ｘタンパク質産物は休止末梢Ｔ細胞において測定されなかった。ウエスタンブロットで抗体により認識されたタンパク質は、対応ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞中に合成されるbcl−ＸＬと同様にインビトロ翻訳bcl−ＸＬが約２９kＤaであるので（Ｂoise,Ｌ.Ｈ.et al.(1993)Ｃell 74:597-608)、bcl−ＸＬに対応し、bcl−ＸＳに対応していない。
【０１５５】
図４はさらに、休止Ｔ細胞の抗−ＣＤ３刺激が、刺激６時間後に最初にみられ、次いで分析の２４時間を通して細胞中に蓄積する検出可能なbcl−ＸＬタンパク質の発現を誘発することを表している。さらに抗−ＣＤ３刺激細胞のＣＤ２８共刺激は、bcl−ＸＬの発現を有意に高めた。bcl−ＸＳではいかなる時点でもみられなかった。
【０１５６】
他の例では、休止Ｔ細胞は、培地のみ、抗−ＣＤ２８，抗−ＣＤ３，抗−ＣＤ３，および抗−ＣＤ２８または抗−ＣＤ３およびＩＬ−２（１００μ／ml）により２４時間で活性化された。細胞質抽出物を記載のように調製し、タンパク質１００μgをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびポリクローナルbcl−Ｘ血清と共にウエスタンブロット分析に供した。
【０１５７】
その結果を図５に示すが、休止Ｔ細胞および抗−ＣＤ２８でインキュベートしたＴ細胞は、bcl−ＸＬタンパク質を発現しなかった。しかし、抗−ＣＤ３刺激細胞のＣＤ２８共刺激は、bcl−ＸＬタンパク質の発現を有意に高めた。２４時間点の抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８刺激細胞におけるbcl−ＸＬ発現レベルは、脾臓ホーカス形成ウイルス長期リピートのコントロール下で、bcl−ＸＬの発現がなされている安定なトランスフェクタントのレベルと同じであった（図５の最終欄）。
【０１５８】
ＣＤ２８共刺激は、早ければ刺激６時間後に観測され、２４時間培養中継続するbcl−ＸＬタンパク質の蓄積を高めた（図４および５）。一方、抗−ＣＤ３およびＩＬ−２（１００units／ml）での細胞処理は、抗−ＣＤ３のみで処理されたレベル以上にはbcl−ＸＬ発現をさらに高めなかった（図５）。さらに、ＣＤ２，ＣＤ５，ＣＤ１１a，ＣＤ１８に対するまたはＭＨＣクラスＩに対するモノクローナル抗体で抗−ＣＤ３−活性Ｔ細胞を処理しても、bcl−ＸＬレベルは抗−ＣＤ３のみで処理した細胞以上には高まらない。
【０１５９】
これらの結果は、休止Ｔ細胞がbcl−Ｘタンパク質を発現せず、抗−ＣＤ３で活性化されたＴ細胞がbcl−Ｘタンパク質を発現し、抗−ＣＤ３で活性化され、および抗−ＣＤ２８で共刺激されたＴ細胞がより顕著にbcl−Ｘタンパク質を発現することを示している。
【０１６０】
実施例６：bcl−ＸＬはJurkat Ｔ細胞におけるＦas−および抗−ＣＤ３誘導ＰＣＤを防止する
Ｔ細胞系に対するＦas架橋はアポトーシスの速い誘導をもたらす。しかし、正常Ｔ細胞は、長い時間がかかって活性化されるまでは、Ｆas−架橋に対する応答において細胞死に対し感受性にならない（Klas,C.et al.(1993)Int. Immunol. 5:625-630）。細胞は迅速に誘導されて、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８による活性化の２４時間中に細胞表面に高レベルのＦasを発現する。Ｆasレベルは、培養中、次の数日間一定である。これにもかかわらず、アポトーシスを誘導するＦas−架橋の能力は、刺激７２時間後まで明らかでなく、次いで培養中次の数日間以上でより効果的に増大する。本例は、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞におけるbcl−ＸＬタンパク質レベルがＦas誘導細胞死に対する抵抗性と相関することを表している。
【０１６１】
Ｔ細胞は、１２０時間かけて培地のみまたは抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化された。細胞質溶解産物が調製され、上記のようにポリクローナル抗−bcl−ＸＬ抗体で着色したウエスタンブロット法で分析された。同時に、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８刺激Ｔ細胞を０.５μg／ml ＣＨ−１１抗−Ｆasモノクローナル抗体（Ｐanvera）またはアイソタイプ・コントロール（ＩgＭ）で１２０時間の２４時間の間隔で２４時間、処理した。生存性を上記のようにプロピジウムヨージド排除法により調べた。Ｆas表面発現は、３０分間のＦＩＴＣ共役抗マウスＩｇＭ（Sigma）に続けて、３０分間ＣＨ−１１で着色することにより、確認された。着色細胞は、ＬysisＩＩソフトウェアを用いた流細胞計算（FACSort, Becton-Dickinson）により分析した。
【０１６２】
抗Ｆas抗体で架橋したＴ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルよび生存性を図６に示す。抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８共刺激後、Ｔ細胞のbcl−ＸＬタンパク質レベルのピークは２４−４８時間にあって、その後徐々に低下した。図の下半分に示すように、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で２４または４８時間処理され、次いでＦasで架橋された細胞は、細胞死に対して完全に耐性である。しかし、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８での刺激後のかなり遅い時点で、抗−Ｆas抗体でＴ細胞が架橋されたときは、細胞生存能力が低下した。このようにbcl−ＸＬの存在はＦas誘導細胞死に対するＴ細胞の防御と相関する。
【０１６３】
bcl−ＸＬタンパク質がＦas−架橋誘導細胞死に対する耐性を誘導することをさらに明らかにするために、Ｊurkat細胞をbcl−ＸＬコードする発現ベクターでトランスフェクトし、細胞生存能力を抗Ｆas抗体を加えて測定した。
【０１６４】
Ｊurkat細胞は上記のように培地中に保持し、ｐＳＦＦＶＮeo−bcl−ＸＬ（Ｂoise,Ｌ.Ｈ．et.al.(1993)Ｃell 74：597−608）またはＧene ＰulserでのエレクトロポレーションによるｐＳＦＦＶＮeo（ＢioＲad）で２５０Ｖおよび９６０μＦにおいてトランスフェクションした。トランスフェクション体をＧ４１８（Ｓigma）で１mg／mlにおいて選択し、いくつかの独立クローンを制限希釈によって分離した。ウエスタン・ブロット分析は、高いbcl−ＸＬタンパク質レベルがbcl−ＸＬ発現ベクターでトランスフェクションさせたクローン中に存在すること、および対照ベクター（Ｎeoクローン）でトランスフェクションさせたクローン（Ｎeoクローン）がbcl−ＸＬタンパク質を発現しないことを表している（図７、パネルＣ）。bcl−ＸＬトランスフェクション体中のbcl−ＸＬレベルは、共刺激２４時間にＴ細胞中の発現レベル匹敵した（参照、例えば図５）。クローン上のＦas発現は上記した着色によって確認された。
【０１６５】
表面で比較可能レベルのＦasを発現した３つのbcl−ＸＬおよび３つのＮeoは、培地中２.５×１０５細胞／mlでインキュベートされ、１０ng／mlのＦas抗体またはアイソタイプ適合対照で処理され、次いで生存性がプロピジウムヨージド排除法により調べられた。Ｊurkat細胞クローンの生存能力を図７、パネルＡに示す。グラフから、Ｆasが全３対照トランスフェクション体に迅速な細胞死（４８時間で１０％の生存能力）をもたらし、一方、３bcl−ＸＬトランスフェクション体は実験中を通じて６０％以上の生存能力であることが分かる。neo−およびbcl−ＸＬ−トランスフェクション体のいずれも、抗体もあるいはアイソタイプ適合対照mＡb(ＩgＭ）が用いられなかったときは、生存能力が低下することを示している。このようにbcl−ＸＬはＪurkat細胞におけるＦas−誘導細胞死を実質的に阻止する。
【０１６６】
抗−ＣＤ３−架橋がＴ細胞クローンおよび細胞ラインにおいてアポトーシスを誘導することは報告されている（Ｓhi,Ｙ.et.al.(1989) Ｎature339：625−626)，Ｕcker,Ｄ.Ｓ.et.al.(1989)Ｊ.Ｉmmunol.143：3461−3469）。ＴＣＲ誘導細胞死を防止するbcl−ＸＬの能力を検討するために、Ｊurkatトランスフェクション体を抗−ＣＤ３で刺激し、その生存を調べた。抗−ＣＤ３誘導細胞死は１μg／mlでプレート結合抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）でもって行われ、プロピジウムヨージド排除法により毎日、調べられた。
【０１６７】
結果を図７、パネルＢに図示する。８４時間で抗−ＣＤ３処理は、Ｎeoクローン培養において３０−６０％の細胞死をもたらした。一方、抗−ＣＤ３誘導細胞死は、bcl−ＸＬの存在によってほとんど完全に阻止された（図７、パネルＢ)。
【０１６８】
このようにbcl−ＸＬタンパク質は、Ｆas−およびＴ細胞レセプター架橋誘導細胞死からＴ細胞を保護することができる。
【０１６９】
実施例７：ｂｃｌ−ＸＬはＩＬ−２とは無関係に機能してＴ細胞生存を強化し得る
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の架橋により活性化されたＴ細胞の生存に対するＩＬ−２の効果のアッセイに基づくと、ＩＬ−２は抗原活性化Ｔ細胞の生存能力の維持における生存因子として機能し得るようである。ＣＤ２８共刺激は、上清中の成長因子レベルとは無関係にＴ細胞の生存をもたらすようであるが、ＣＤ２８刺激化細胞の生存強化は、単にＣＤ２８共刺激により産生された高いレベルのＩＬ−２の結果だけではないということを除外することは難しい。ＣＤ２８共刺激細胞中で産生された高いレベルのＩＬ−２があると、充分に洗浄してもリンホカインの効果を完全に除くことは不可能である。ＣＤ２８−共刺激細胞により産生された高いレベルのリンホカインは、培養上清中に検知可能なリンホカインの蓄積がなくても、オートクリン様式で細胞に影響を与えることができる場合もある。本実施例は、bcl−ＸＬタンパク質は、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系がＩＬ−２使用中止によリＰＣＤを受けるのを防御し得ることを実証する。
【０１７０】
ＣＴＬＬ−２は、培養中での生存および増殖がＩＬ−２に依存しているＴ細胞系である（Gillis,S.およびSmith,K.A.(1977)Nature 268:154-156）。これらの細胞は、それら自身のＩＬ−２を分泌するように誘導され得ないので、ＩＬ−２のバイオアッセイにしばしば使用される。ＣＴＬＬ−２細胞はβ−メルカプトエタノール（50μＭ）および組換えＩＬ−２（100単位／ｍｌ）を加えて、上記成長培地中で維持した（Nunez,G.et al.(1990)J.Immunol.144:3602-3610）。細胞を、２５０Ｖおよび９６０μＦにて、ジーンパルサー（Gene Pulser、Bio Rad）を用いた電気処理により発現ベクターｐＳＦＦＶＮｅｏ−bcl−ＸＬ（Boise,L.H.et al.(1993)Cell 74:597-608）を用いてトランスフェクションさせた。トランスフェクション体を、２５０μｇ/ｍｌＧ４１８で選別し、bcl−ＸＬ陽性クローンをウエスタンブロット解析により同定した。ＣＴＬＬ−２細胞（２.５×１０６）を５０ｍｌＮＥＴ−Ｎに溶解し、核および残骸を上記のように除去した。５０μｌの２×ＳＤＳローディング緩衝液を上清に加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを上記のように行った。
【０１７１】
高いレベルのbcl−ＸＬタンパク質を発現する２つのbcl−ＸＬクローン（図７パネルＥ）をＩＬ−２の不在下、培養液中での生存能力について試験した。これらのクローンは、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８活性化Ｔ細胞と似たレベルのbcl−ＸＬを発現した。bcl−ＸＬ発現細胞を欠乏の１日前に３×１０５細胞／ｍｌの新鮮培地中で培養した。ついで細胞をＩＬ−２を含まない新鮮培地中で３回洗浄し、同培地に再懸濁した。指定された日にプロピジウムヨージドを排除することにより生存能力を測定した。結果は、図７のパネルＤにグラフで示す。親細胞系と比較した場合に比べて、ＩＬ−２の不在下で両方のbcl−ＸＬトランスフェクションクローンの生存が強化された（図７、パネルＤ）。このように、bcl−ＸＬはＩＬ−２の不在下でＴ細胞の生存を強化するように機能し得る。またこれらのクローンについて、図２で示されたアッセイと似たアッセイ系において、照射誘導死に関する試験を行った。ＩＬ−２の不在下または存在下のいずれかで試験した対照細胞と比較した場合、bcl−ＸＬを発現するクローンは、照射誘導死から顕著に防御されることを示した。このように、本実施例は、bcl−ＸＬタンパク質は、Ｔ細胞をＩＬ−２欠乏により誘導された細胞死から防御することを実証する。
【０１７２】
実施例８：ＣＤ２８共刺激によるbcl−ＸＬの発現は進化的に保存されている
bcl−ＸＬ発現を調節するＣＤ２８共刺激の能力は、マウスおよびヒトの間で保存されているかどうかを決定するために、ネズミリンパ節から単離した細胞を、可溶性抗−ＣＤ３を用いて活性化し、bcl−ＸＬ発現を測定した。
【０１７３】
リンパ節をＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson laboratories）から採取し、単一の細胞懸濁液をナイロン網を通過させて調製した。細胞を、１０％ウシ胎児血清アルブミン、ペニシリン（100Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（100Ｕ／ｍｌ）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭβ−ＭＥおよび０.１ｍＭ非必須アミノ酸を追加したＤＭＥＭ（GIBCO BRL）からなる完全培地中２×１０６／ｍｌで培養した。可溶性抗−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、１０μｇ／ｍｌ J.Bluestoneから）を単独、または抗−ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（100μｇ／ｍｌ、Repligenから）との組み合わせで加えた。培養液を２４時間で３７℃、７％ＣＯ２でインキューベートし、ウエスタンブロット解析用に採取した。ネズミリンパ球（５×１０６）を、５０μｌＮＥＴ−Ｎで溶解し、核および残骸を上記のように除去した。５０μｌの２×ＳＤＳローディング緩衝液を上清に加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを上記のように行った。生存能力を研究するために、細胞を上記のように処理した。活性化後のＴ細胞の生存能力を、Ｔｈｙ−１陽性細胞からプロピジウムヨージドを排除することにより測定した。
【０１７４】
結果は、図８に示されているように、ヒトＴ細胞の場合と同じように、休止ネズミリンパ球は全く検知可能なbcl−ＸＬを発現しないことを示す。共刺激シグナルを伝達するためにアクセサリー細胞が存在する場合、２４時間の可溶性抗−ＣＤ３処置により、Ｔ細胞にbcl−ＸＬ発現を誘導した。このbcl−ＸＬのレベルは、この共刺激シグナルが抗−ＣＤ２８の添加により増幅される場合に上昇した。対照的に、アクセサリー細胞の存在下における可溶性抗−ＣＤ３のbcl−ＸＬ発現をアップレギュレーションする能力は、ＣＤ２８リガンドＢ７−１およびＢ７−２がＣＤ２８と相互作用するのを競争的に阻害することによりＣＤ２８の共刺激を妨げる試薬である、ＣＴＬＡ４Ｉｇを加えることによりほぼ完全に阻害される。これらのデータは、マウスＴ細胞におけるbcl−ＸＬ発現は細胞が活性化される間に誘導されることを実証する。さらに、抗ＣＤ３の副次的な細胞分裂誘導性用量において、bcl−ＸＬ発現の誘導はほぼ完全にＣＤ２８共刺激に依存する。この発現パターンは、bcl−ＸＬがマウスの活性化Ｔ細胞生存において役割を果していることを実証する。この可能性と合致して、抗−ＣＤ３のみで刺激した未分離のリンパ節細胞集合由来のＴｈｙ−１陽性細胞の生存能力は、７２時間後に６２％であった。対照的に、抗−ＣＤ２８の添加により、Ｔｈｙ−１陽性細胞の生存能力は８８％に上昇した。逆に、ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いてリンパ節細胞内のＣＤ２８／Ｂ７仲介共刺激を阻害することにより、活性化Ｔ細胞の生存能力は７２時間で２０％に減少する。
【０１７５】
このように、本実施例は、bcl−ＸＬはヒトＴ細胞と同様に、マウスＴ細胞においても同じ発現パターンを有すことが示され、すなわち、bcl−ＸＬタンパク質は休止Ｔ細胞に存在せず、bcl−ＸＬタンパク質はＴ細胞受容体の架橋を介して活性化されたＴ細胞中に発現され、bcl−ＸＬタンパク質レベルはＣＤ２８を通した共刺激によりさらに増加することを示す。
【０１７６】
実施例９：bcl−ＸＬ発現はＨＩＶ−１−誘導細胞死を妨げ得る
bcl−ＸＬ発現はＴ細胞をＨＩＶ−１−誘導細胞死から防御するかどうかを決定するために、上記のｐＳＦＦＶＮｅｏ−bcl−ＸＬ（bcl−ＸＬ）、またはベクターのみ（Ｎｅｏ）を用いてトランスフェクションさせたJurkat細胞クローンをＨＩＶを用いて感染させ、生存能力を測定した。
【０１７７】
bcl−ＸＬ発現ベクターを用いてトランスフェクションさせた３つのJurkat細胞クローンおよび対照ベクターを用いてトランスフェクションさせた３つのJurkat細胞クローンをＨＩＶ−ＲＦ単離物の細胞を含まないウイルスストックの様々な希釈液を用いて感染させた。感染の１２日後、細胞死をテトラゾリン／ホルマザンアッセイにより定量した（Shearman,M.S.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1470-1474;Hansen,M.B.et al.(1989)J.Immun.Methods 119:203-210 参照)。
【０１７８】
３つの細胞系の平均生存能力を図９にグラフで示す。１：４から１：２５６で希釈したウイルスストックを用いて感染させた場合、対照Jurkat細胞において細胞死の割合が高かった。対照的に、bcl−ＸＬ遺伝子を発現するトランスフェクションJurkat細胞はこれらの同じウイルス希釈において、生存能力における欠陥は全くなかった。
【０１７９】
bcl−ＸＬ発現の防御効果は、ＨＩＶ−１感染への耐性に起因するか、または細胞死の誘導における、より特定した効果に起因するかどうかを決定するために、感染細胞の上清中のウイルス量をSpearmanおよびKarberの方法により感染７日後に定量した。Spearman-Karber法は、『Richman D.B.,Johnson V.A.,Mayrs V.L.(1993）抗ＨＩＶ活性に対する実験作用物質のin vitro評価』に記載されている。Current Protocols in Immunology ch.12.9.,Colligan J.E.et al.、GreeneおよびWiley編、Interscience ＮＹ。
【０１８０】
結果は表１に示す。対照細胞に比較し、bcl−ＸＬ発現細胞の上清中のウイルス量は約４倍減少した。
【０１８１】
【表１】
【０１８２】
これらの例の結果は、bcl−ＸＬタンパク質は、ＨＩＶ誘導細胞死からＴ細胞を防御することを実証する。この効果はＨＩＶ感染の間のＣＤ４細胞の減少を防御するのに有益であり得る。本結果は、ＨＩＶ感染をもつ患者における過剰細胞死の１つの機構は、これらの患者におけるＴ細胞活性化のある形は非感染個体と匹敵するレベルのbcl−ＸＬ発現を誘導できないであろうことを示唆している。このように、ＨＩＶ感染の治療法の１つは、ex vivoでの細胞活性化および増幅、またはＣＤ２８シグナル形質導入のin vivo誘導により、bcl−ＸＬ発現の誘導を回復することである。その他に、bcl−ＸＬ発現の誘導は、ＣＤ２８を刺激する作用物質以外の作用物質を用いて刺激することにより達成され得る。これらのデータにより、ＣＤ２８のbcl−ＸＬ発現を亢進する能力は、過剰リンパ細胞死が起こる免疫不全の状態時、特にプログラム化細胞死が末梢血Ｔ細胞およびリンパ節Ｔ細胞で起こるＨＩＶ感染時における臨床用途になり得ることを示す。
【０１８３】
実施例１０：ＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣの抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８刺激は、細胞を細胞死から防御するに充分なレベルのbcl−ＸＬタンパク質を増加させる結果となる
本実施例は、ＰＢＭＣまたはＨＩＶ感染個体由来のリンパ球を、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激すると、細胞をアポトーシスから防御するに充分なレベルのbcl−ＸＬタンパク質になるように増加することを実証する。
【０１８４】
無症候性のＨＩＶ感染個体における臨床的免疫不全の経緯は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の段階的なしかし進行性の欠失により特徴づけられる。ＨＩＶ感染患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の減少機構は現在のところ知られていないが、最近の証拠により、これらの細胞は活性化シグナルに応答してアポトーシスに対して異常に感受性をもつことが示される。ＨＩＶ疾患におけるアポトーシス防御タンパク質であるｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘの役割を、ＨＩＶ感染無症候性個体由来の非刺激アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）刺激および抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えた刺激試料において測定した。
【０１８５】
ＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣを以下のように得た。ヘパリン化血液サンプルを、インフォームドコンセントの後に、ＨＩＶ感染（ｎ＝２５）およびＨＩＶ負の対照（ｎ＝１５）から静脈穿刺により得た。患者を、ウォルターリードステージングシステム（Redfield,R.R.et al.(1986)New Engl.J.Med.314:131-132）に基づく、無症候性初期および中期段階の患者（＞５００および２００−５００ ＣＤ４細胞／ｍｍ３）として特徴づけた。サンプルをすぐに処理した。新しく単離した単核細胞を、無菌ＨＢＳＳ（Bio Whittaker、Walkersvile MD）で１：１に希釈しておいた血液軟膜から得、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）で遠心分離した。サンプルの生存能力は、一般的に９５％よりも大きかった。特記しない限り、ＰＢＭＣは、２４穴プレート中で１０％ＦＣＳ（Ｔ細胞培地）を追加したＲＰＭＩ１６４０中で１×１０６細胞／ｍｌで４８時間培養した。ＰＷＭ（Sigma Chemical Company、セントルイス ＭＯ）を用いて１０μｇ／ｍｌで細胞を刺激した。ＣＤ３のみ、またはＣＤ２８を介する細胞の刺激は、Weng,N.P.et al.(1995)PNAS USA92:11091-11094に記載されているように、磁気ビーズに結合しているヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体により架橋された抗−ＣＤ３、または抗−ＣＤ３およびＣＤ２８ｍＡｂの組み合わせを用いて行なった。Jurkat細胞を、ここで記載されているｐＳＦＦＮｅｏ−bcl−ＸＬまたはｐＳＦＦＶＮｅｏ構築物のいずれかでトランスフェクションさせ、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Sigma Chemical Company）を含有するＴ細胞培地に維持し、ｂｃｌ−ｘ染色の陽性対照として保存した。
【０１８６】
細胞中のｂｃｌ−Ｘおよびｂｃｌ−２タンパク質の量を、以下のように行う分子内染色およびフローサイトメーターに基づいたｂｃｌ−Ｘの単一の細胞の検知を可能とする方法により決定した。ＰＢＭＣを採取し、１×１０６細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液（ｐＨ７.２）で３０分間室温で固定した。サンプルをＰＢＳ中で洗浄し、ついで、細胞を浸透させるために５分間ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中に再懸濁した。ＰＢＳで洗浄後、２０％ヒトＡＢ型血清（Sigma Chemical Company）および１μｇ／ｍｌ抗−ｂｃｌ−Ｘモノクローナル抗体７Ｂ２（Craig Thompson、シカゴ大学）、または１μｇ／ｍｌハムスター抗−ｂｃｌ−２ｍＡｂ ６Ｃ８（PharMingen、Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア）を含む１００μｌＰＢＳ中に１時間４℃で再懸濁した。ＩｇＥアイソタイプ適合ｍＡｂｓは、抗−Ｂｃｌ−ｘおよび抗−Ｂｃｌ−２で染色したサンプルの対照として使用した。一次抗体を用いてインキュベーションした後、サンプルをＰＢＳ＋０.０５Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で洗浄し、１００μｌＰＢＳ＋０.０５％ヤギＦ(ａｂ)２抗−マウス（Ｈ＋Ｌ）中に再懸濁した。ＦＩＴＣ（Gibro Life Technologies）を３０分間４℃で加えた。抗−Ｂｃｌ−２で染色したサンプルを３０分間４℃で、２０μｇ／ｍｌＦＩＴＣ−抗−ハムスターＩｇＧ混合（PharMingen）を用いてインキュベーションした。最後に、サンプルをＰＢＳ中で洗浄し、染色後、２〜４８時間フローサイトメーターにより解析した。この時間枠の中では、ｂｃｌ−ｘで染色した細胞のパーセンテージが減少した事実はなく、また、平均蛍光強度も変化はなかった。
【０１８７】
このアッセイは実質的にbcl−ｘＬのレベルよりもむしろ、ｂｃｌ−ｘ（すなわちbcl−ｘＬおよびｂｃｌ−ｘＳ）のレベルを測定するものであるが、免疫沈降実験により示されたところによると、これらの条件下で測定したｂｃｌ−ｘタンパク質の大部分はbcl−ｘＬに対応する。
【０１８８】
ＨＩＶ感染サンプル由来の非刺激ＰＢＭＣにおけるｂｃｌ−ｘで染色した細胞の平均蛍光強度およびパーセンテージは、ＨＩＶ非感染対照においてみられるレベルと差はないが、ｂｃｌ−Ｘ発現は、ＰＷＭおよび抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたものを用いて活性化後の非感染対照におけるものよりも、ＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣにおける方が低かったことを示す。しかしながら、このｂｃｌ−Ｘタンパク質レベルは、細胞を細胞死から防御するのに十分である。これは、例えば、下記のように、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８またはＰＷＭを用いて様々な場合に刺激した後にＨＩＶ感染個体および非ＨＩＶ感染対照個体由来のｂｃｌ−Ｘタンパク質の量およびＰＢＭＣのアポトーシスのレベルを比較することにより実証された。
【０１８９】
ＰＢＭＣにおけるアポトーシスは、ＴｄＴにより触媒されたｄＵＴＰを用いてＤＮＡ一本鎖崩壊をラベルすることにより測定した（Li、X、et al(1995)Cytometry20:172-180)。フローサイトメーター解析を使用してＰＷＭまたは抗ＣＤ３に抗ＣＤ２８を加えたもののいずれかを用いて刺激したＰＢＭＣの培養中における消滅細胞を定量した。このアッセイは以下のように行った。ＰＢＭＣを採取し、トリパンブルー排除により生存能力を測定し、１×１０６細胞を１０分間、氷上で１％ホルムアルデヒド（ｐＨ７.４）溶液を用いて固定した。サンプルをＨＢＳＳ中で洗浄し、細胞ペレットを７０％エタノール中に再懸濁し、−２０℃で２時間〜３日貯蔵した。ＨＢＳＳで１回洗浄した後サンプルを３０分間３７℃で、０.５ｎＭビオチン１６−ｄＵＴＰ（Boehringer、Indianapolis IN）および１０単位のＴｄＴ（Boehringer）を含有する５０μlターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応混合物（０.１Ｍカルボン酸、１ｍＭＣｏＣｌ２、０.１ｍＭジチオトレイトールおよび５０μlＢＳＡ）中に再懸濁した。ＨＢＳＳで洗浄後、２.５μｇ／ｍｌＦＩＴＣアビジン（Gibco Life Technologies、Gaithersburg、MD）を染色溶液（４×ＳＳＣ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および５％非脂肪乾燥ミルク）に加え、サンプルを１５分間室温でインキュベーションした。０.５μｇ／ｍｌヒト抗−Ｆａｓ抗体（Upstate Biotechnology Inc.Lake Placid NY）で２４時間処理したJurkat細胞をアッセイの陽性対照として使用し、一方、ＴｄＴを欠損しているサンプルを負の対照として使用した。サンプルをELITE-ESP（Coulter Inc.、Kindal FL）フローサイトメーターを用いた細胞蛍光アッセイにより解析した。５千から１万の細胞を、ｌｏｇ９０度散乱とｌｏｇＦＩＦＣ強度のパラメーターを用いて計算した。消滅細胞を、低い前角および低い９０度散乱を有するＦＩＴＣ陽性細胞として定義した。トリパンブルー排除に基づく生存能力により、ＴｄＴを基礎とするアッセイの信頼性が確認された。
【０１９０】
ＰＷＭおよび抗−ＣＤ３を抗−ＣＤ２８に加えた刺激サンプルに起こるアポトーシスに関連したｂｃｌ−ｘ誘導の動力学を測定するために、３つのＨＩＶ感染および３つのＨＩＶ負の対照を培養の０時間、２４時間、４８時間および７２時間目に実験した。平均パーセンテージとして示したように、結果は図１０、パネルＡ−Ｄに示す。ＰＷＭで処理した対照サンプルでは、ｂｃｌ−ｘ発現は、２４時間から４８時間の間で増加したが、アポトーシスのレベルは低いままであった。抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので処理した対照サンプルにおいて、アポトーシスの低いレベルのみは明白であるが（図１０、パネルＡ）、ｂｃｌ−ｘのレベルは急激に増加した。これらのＨＩＶ負の対照においては、芽球化反応および細胞数の増加が両方の培養条件下で起こり、これは細胞が増殖していることを示す。ＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣのＰＷＭ刺激培養は、４８時間で高いレベルのアポトーシスを有し、下降する前に４０％でピークに達した（図１０、パネルＢ）。ＨＩＶ感染個体由来のＰＷＭ刺激ＰＢＭＣは、０から４８時間の間にわずかな量のｂｃｌ−ｘしか発現しなかった。興味深いことに、ｂｃｌ−ｘ発現細胞の分画におけるわずかな増加が、４８時間から７２時間の間で見られ、おそらくこれは、これは４８時間以上生存した細胞が増えたことを反映する（図１０、パネルＢ）。ｂｃｌ−ｘ発現は低く、ＨＩＶ負の対照に比べて、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので培養したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣにおいて誘導の遅延がみられた（図１０、パネルＤ）。アポトーシスレベルは抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えた刺激培養において低いが、それらはＨＩＶ負の対照におけるものより高かった(図１０、パネルＣおよびＤ)。ＰＷＭで培養したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣにおいては、ほとんど増殖が見られなかったが、細胞数および細胞の大きさの増大が、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えた培養中で見られた。
【０１９１】
アポトーシスおよびｂｃｌ−ｘ誘導を、４８時間培養後にＨＩＶ負の対照（ｎ＝５）およびＨＩＶ感染個体（ｎ＝２０）においてさらに解析した。サンプルを、培地のみ、ＰＷＭを加えて、または上記のように抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えて培養した。結果を表２に示す。ＨＩＶ陰性の対照における、アポトーシスレベルは様々な刺激に応答して類似であった。アポトーシスレベルはＰＷＭ処理に応答して基線よりわずかに上昇し、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたものに応答して幾分減少した。同サンプルにおいて、ｂｃｌ−ｘ発現はＰＷＭ処理培養中で穏やかに増加し、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えて処理した培養中で劇的に増加した。対照的に、アポトーシスの基線レベルを越えた顕著な増加は、ＰＷＭと共に培養した４８時間後にＨＩＶ感染個体由来ＰＢＭＣ中で見られた。アポトーシスにおける増加は抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので培養したＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣ中においては観察されなかった。
【０１９２】
【表２】
【０１９３】
結論として、ｂｃｌ−ｘ発現は、刺激非感染サンプルにおいて経時的に劇的に増加するが、刺激ＨＩＶ感染サンプルにおいて遅延し減少した応答が、観察された。加えて、ｂｃｌ−ｘの単一細胞内染色は、ＰＷＭ誘導ｂｃｌ−ｘ発現およびアポトーシスの間に強い逆相関がみられた（ｒ＝０.６９５；ｐ＝０.００５）。同様な相関が抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激したＰＢＭＣ中では観察されず、これは、共刺激はｂｃｌ−ｘ誘導の防御レベルへと導くことを示唆している。結果はまた、ＰＢＭＣの代わりにリンパ球を用いたときにも得られ、すなわち、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８を加えたもので刺激したＨＩＶ感染個体由来のリンパ球は、非感染個体由来のリンパ球に比較して低いｂｃｌ−ｘ発現を示した。遅延し減少したｂｃｌ−ｘの発現は試験サンプル中のＣＤ３＋ＣＤ２８＋細胞のパーセンテージの減少に起因するものではない。なぜなら、ｂｃｌ−ｘの発現の減少はＰＷＭで刺激したＣＤ２８＋ＨＩＶ感染部分集合において明白だからである。さらに、低いｂｃｌ−ｘ発現はリンパ球活性化の減少に起因するものではない。なぜなら、ＰＷＭ刺激はＨＩＶ感染患者において早い活性化マーカーであるＣＤ６９の発現を誘導するからである。
【０１９４】
このように、ＨＩＶ感染個体由来のリンパ球は、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激時に、非ＨＩＶ感染個体よりも、bcl−ＸＬタンパク質レベルが低いが、このレベルは細胞を細胞死から防御するに必要なbcl−ＸＬタンパク質の限界値を上回っている。
等価体
【０１９５】
当業者は慣用的な実験法以外を用いて、ここで記載された本発明の特別の態様に関する数多くの等価体が存在すると認識または確認することができるだろう。このような等価体は以下の請求の範囲に含まれる。
【０１９６】
【表３】
【０１９７】
【表４】
【０１９８】
【表５】
【０１９９】
【表６】
【０２００】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】γ−照射（パネルＢ）前、または未処理（パネルＡ）のままで、培地のみ（白抜き四角)、抗ＣＤ３の存在下（白抜き菱形)、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の存在下（黒塗り四角）で１２時間Ｔ細胞をインキュベーション後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【図２】γ−照射（パネルＢおよびＤ）前、または未処理（パネルＡおよびＣ）のままで、抗ＣＤ３のみ（パネルＡおよびＢ）または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（パネルＣおよびＤ）と共に１２時間Ｔ細胞をインキュベーションし、その後、それらをならし培地に残す（白抜き四角)か、洗浄して新たな培地に懸濁する（白抜き菱形)か、または洗浄して２００Ｕ／mlのrＩＬ−２を加えた新たな培地に懸濁した（黒塗り四角）後１、２、３、４および５日目のＣＤ２８＋Ｔ細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【図３】図３パネルＢ、ＣおよびＤは、それぞれ、培地のみ（ＭＥＤ）でインキュベーションするか、抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）の存在下で１、６または１２時間インキュベーションするか、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）の存在下でインキュベーションしたＴ細胞中でのbcl−ＸＬ発現、bcl−２発現およびＨＬＡ発現のレベルを示すノーザン・ブロットを表す。パネルＡは、非変性アガロースゲルでの電気泳動後に各ＲＮＡ試料のアリコートをエチジウムブロマイド染色したものを示す。 図３Ｅは、単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６または１２時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６または１２時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびbcl−ＸＳタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図４】単独で（０）または抗ＣＤ３（αＣＤ３）と共に６、１２または２４時間、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に６１２、または２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬおよびＢcl−２タンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図５】培地単独で（Medium）または抗ＣＤ２８（αＣＤ２８）、抗ＣＤ３（αＣＤ３）、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８（αＣＤ３／αＣＤ２８）、または抗ＣＤ３＋ＩＬ−２（１００units／ml)(αＣＤ３／ＩＬ−２）の存在下、２４時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図６】培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションしたＴ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。パネル下部は、培地単独（Resting）でインキュベーションした、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で２４、４８、７２、９６または１２０時間インキュベーションし、抗Fas抗体を添加してさらに２４時間インキュベーションしたＴ細胞の生存能力パーセントを示す。
【図７】図７Ａ−Ｂは、抗Fas抗体（αFas、パネルＡ）または抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３、パネルＢ）で処理後０、１２、２４、４８および７２時間でbcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミドでトランスフェクションさせたJurkatクローンの生存能力パーセントのグラフ表示である。 図７パネルＣは、bcl−ＸＬ発現プラスミド（bcl−ＸＬクローン１、２および３）または対照プラスミド（Neoクローン１、２および３）でトランスフェクションさせたJurkatクローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウェスタン・ブロットの写真である。 図７パネルＤは、ＩＬ−２回収後０、１２、２４、３６および４８時間でbcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローンの生存パーセントのグラフ表示である。 図７パネルＥは、bcl−ＸＬ発現プラスミドでトランスフェクション（ＣＴＬＬ−２bcl−ＸＬクローン１および２）させた、またはトランスフェクションさせなかった（ＣＴＬＬ−２）ＣＴＬＬ−２細胞クローン中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図８】培地単独で、抗ＣＤ３の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下、および抗ＣＤ３およびＣＴＬＡ４Ｉgの存在下、２４時間インキュベーションしたマウスリンパ節細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の量を示すウエスタン・ブロットの写真である。
【図９】bcl−ＸＬ発現ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均bcl−ＸＬ）、または対照ベクター（ウイルス希釈率ｖ平均neo）でトランスフェクションし、さまざまな量のＨＩＶで感染させたJurkat細胞の生存能力パーセントのグラフ表示である。
【図１０】図１０パネルＡ−Ｄは、ＰＷＭ（パネルＡおよびＢ）でまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ３／ＣＤ２８、パネルＣおよびＤ）で０、２４、４８または７２時間処理した対照およびＨＩＶ感染個体由来のＰＢＭＣにおいて、アポトーシスを被った細胞の割合（％アポトーシス）およびbcl−Ｘタンパク質を発現する細胞の割合（％bcl−ｘ）のグラフ表示である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ−Ｄ】
【図３Ｅ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞受容体およびＣＤ２８を介して共刺激されることにより活性化されたＴ細胞の集団において、エクスビボで細胞死を誘発する方法であって、活性化されたＴ細胞の集団においてＴ細胞死を誘発するために、活性化されたＴ細胞の集団に、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の産生を阻害する少なくとも一つの作用物質を接触させることを含む、方法。
【請求項２】
少なくとも一つの作用物質がアンチセンス核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの作用物質が、細胞内抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、T細胞の集団に一次活性化シグナルを提供する作用物質を接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
T細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質が、抗原提示細胞上に提示された抗原である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
T細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質が、抗ＣＤ３抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
さらに、Ｔ細胞の集団に、Ｔ細胞においてコスティミュラトリー・シグナルを遮断する第二作用物質を接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの作用物質が、bcl−ＸＬタンパク質のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
作用物質が、bcl−ＸＳまたはBadである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
T細胞において細胞死を誘発する医薬組成物の調製のための、T細胞の使用、ただし、該T細胞は、T細胞受容体およびＣＤ２８を介した共刺激により活性化されるものであり、そして、被験体から入手された該Ｔ細胞は、インビトロでＴ細胞においてbcl−ＸＬタンパク質の産生を阻害する少なくとも一つの作用物質で処理されるものである。
【請求項１１】
さらに、該被験体から入手された該T細胞を、インビトロでT細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質で処理することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
作用物質が抗原である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
さらに、該被験体から入手された該T細胞を、T細胞においてコスティミュラトリー・シグナルを遮断する第二作用物質で処理することを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１】
T細胞受容体およびＣＤ２８を介して共刺激されることにより活性化されたＴ細胞の集団において、エクスビボで細胞死を誘発する方法であって、活性化されたＴ細胞の集団においてＴ細胞死を誘発するために、活性化されたＴ細胞の集団に、Ｔ細胞中のbcl−ＸＬタンパク質の産生を阻害する少なくとも一つの作用物質を接触させることを含む、方法。
【請求項２】
少なくとも一つの作用物質がアンチセンス核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの作用物質が、細胞内抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、T細胞の集団に一次活性化シグナルを提供する作用物質を接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
T細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質が、抗原提示細胞上に提示された抗原である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
T細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質が、抗ＣＤ３抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
さらに、Ｔ細胞の集団に、Ｔ細胞においてコスティミュラトリー・シグナルを遮断する第二作用物質を接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの作用物質が、bcl−ＸＬタンパク質のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
作用物質が、bcl−ＸＳまたはBadである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
T細胞において細胞死を誘発する医薬組成物の調製のための、T細胞の使用、ただし、該T細胞は、T細胞受容体およびＣＤ２８を介した共刺激により活性化されるものであり、そして、被験体から入手された該Ｔ細胞は、インビトロでＴ細胞においてbcl−ＸＬタンパク質の産生を阻害する少なくとも一つの作用物質で処理されるものである。
【請求項１１】
さらに、該被験体から入手された該T細胞を、インビトロでT細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質で処理することを含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
作用物質が抗原である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
さらに、該被験体から入手された該T細胞を、T細胞においてコスティミュラトリー・シグナルを遮断する第二作用物質で処理することを含む、請求項１１に記載の使用。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ−Ｃ】
【図７Ｄ−Ｅ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ−Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ−Ｃ】
【図７Ｄ−Ｅ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ−Ｄ】
【公開番号】特開２００８−１０１００３（Ｐ２００８−１０１００３Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７７８８２（Ｐ２００７−２７７８８２）
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【分割の表示】特願平８−５３３５１２の分割
【原出願日】平成８年５月２日（１９９６．５．２）
【出願人】（５０５４７７４０８）アメリカ合衆国 (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【出願人】（５０３３１６８２４）アーチ・ディベロプメント・コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【分割の表示】特願平８−５３３５１２の分割
【原出願日】平成８年５月２日（１９９６．５．２）
【出願人】（５０５４７７４０８）アメリカ合衆国 (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【出願人】（５０３３１６８２４）アーチ・ディベロプメント・コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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