ｃＡＭＰ分析
本発明は、サンプル中のｃＡＭＰを分析する方法の提供であり、前記方法は、未知ｃＡＭＰ含量のサンプルと、ポリペプチドｃＡＭＰ結合剤、任意に標識化ｃＡＭＰとを接触させる工程、および、ｃＡＭＰまたは標識化ｃＡＭＰと前記結合剤とのコンジュゲートを検出する工程を含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ結合部位のみを含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）、他の環状ヌクレオチドおよび環状ヌクレオチド類似体の分析方法に関し、また、このような方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰまたはアデノシン３',５'-環状モノホスフェートは、１位にプリン基が結合し、３'位および５’位にリン酸基が結合したリボフラノースモノサッカライドユニットを含む。ｃＡＭＰは、ＡＴＰの環化により形成され、ホルモンの分布域で、ホルモン作用のメディエータとして機能する第２メセンジャーである。特に、プロテインキナーゼとして知られるキー酵素の活性化を担っている。
【０００３】
ｃＡＭＰは、体内に広く分布しており、例えば、甲状腺不全（thyroid malfunction）、カルシウム代謝欠損等、広い範囲でのコンディションとの関連において分析されている。
【０００４】
ｃＡＭＰの様々な分析が、商業的に利用可能となっており、特に英国のAmarsham plcより利用可能となっている。最も広く使用されている分析は、イミノグロブリンまたは天然に生じたｃＡＭＰ結合タンパク質（特にｃＡＭＰ依存型プロテインキナーゼイソエンザイムＩ型（ｃＡＰＫＩ））のいずれか一方の高親和性の結合部位に対する、ｃＡＭＰと、標識化（例えば、放射線標識化）ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰ類似体との間における競合に基づくものである。
【０００５】
現在このような分析が数十年間利用されているが、それにもかかわらず、これらは望まれる程度よりも正確さに欠ける。また、抗体に基づく分析は、分析が行われる前にｃＡＭＰが分解することを防ぐためにｃＡＭＰ含有試料に添加される試薬（例えば、ＥＤＴＡ）にセンシティブである。
【発明の開示】
【０００６】
このようにｃＡＭＰの改良された分析方法が必要とされている。
【０００７】
我々は、このような改良分析方法が、ｃＡＭＰ結合剤として、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ｃＡＰＫ）のｃＡＭＰ結合部位の一つのタイプのみの機能形態を含むポリペプチドを使用することによって達成できることを見出した。Ｉ型（ｃＡＰＫＩ）およびII型（ｃＡＰＫII）として存在するｃＡＰＫは、それぞれ、Ｃ末端付近、また、Ｃ末端に位置する制御（Ｒ）サブユニットに、２種類のｃＡＭＰ結合サイト（Ａ部位、Ｂ部位）を有する。このように、２量体であるｃＡＰＫＩには、４つの結合部位（Ａα、Ａβ、ＢαおよびＢβ）が存在する。αおよびβ鎖におけるＡ部位のアミノ酸配列末端は、αおよびβ鎖におけるＢ部位の配列と同様である。
【０００８】
ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼは、例えば、Taylorらにおいて論じられている（非特許文献１：Taylor et al. Ann. Rev. Biochem. 59: 971 (1990), Doskeland et al. Biochim. Biophys. Acta 1178: 249-258 (1993)、非特許文献２：Francis et al. Ann. Rev. Physiol. 56: 237-272 (1994)、非特許文献３Johnson et al. Chem. Rev. 101: 2243-2270 (2001)）。ポリペプチドＲＩα（ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼＩ型のα鎖における制御（Ｒ）サブユニット）のＡ部位およびＢ部位は、共結晶（co-crystallized）ｃＡＭＰおよび完全なＡおよびＢ部位で切断されたＲＩαが、Ｙｕらによって述べられている（非特許文献４：Yu et al. in Science 269: 807-813 (1995)）。ＲＩは、二つの形態ＲＩαおよびＲＩβを有しており、これらはｃＡＭＰ結合ドメインにおけるアミノ酸配列末端が非常に類似している。ｃＡＭＰ依存型プロテインキナーゼII型のＲサブユニット（例えば、ＲIIαおよびＲIIβ）は、Ａ部位およびＢ部位を有し、これらはＲＩαにおける相当する部位と類似している（非特許文献５：Diller et al. Structure 9: 73-82 (2001)参照）。
【０００９】
哺乳類のＲサブユニットにおいて、Ａ部位は、約１４３-２６０（ＲＩα）または１５８-２７７（ＲIIβ）のアミノ酸残基を含み、Ｂ部位は、約２６０-３７４（ＲＩα）または２７７-４２６（ＲIIβ）のアミノ酸残基を含む。
【００１０】
このように本発明の一つの形態から考慮して、本発明は、試料中のｃＡＭＰを分析する方法であって、前記方法は、未知含有量のｃＡＭＰを含む試料に、ポリペプチドのｃＡＭＰ結合剤および任意に標識化ｃＡＭＰを接触させる工程と、ｃＡＭＰまたは標識化ｃＡＭＰと前記結合剤とのコンジュゲートを検出する工程とを含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とする分析方法を提供する。
【００１１】
前記機能性部位は、Ｂ部位であり、好ましくはＲＩ Ｂ部位であり、特に好ましくはＲＩα Ｂ部位である。
【００１２】
ここで「機能性部位」とは、結合部位が、天然ヒトｃＡＰＫにおける部位のＫDに対して３００％未満のＫDでｃＡＭＰに結合できる部位であることを意味し、好ましくは２００％未満、より好ましくは１５０％未満、特に好ましくは１１０％未満である（低いＫD、高い結合親和性）。
【００１３】
機能性ｃＡＭＰ結合部位の他に、結合剤は、非機能性ｃＡＭＰ結合部位（例えば、異なるタイプ）を含んでもよい。非機能性部位は、いくつかのまたはすべてのアミノ酸配列における天然ｃＡＭＰ結合部位に相当する部位を意味するが、これは、天然ヒトｃＡＰＫにおける相当する部位のＫDに対して３００％以上のＡＭＰ結合についてのＫDを有し、より好ましくは５００％以上、特に好ましくは１００００％以上である。
【００１４】
ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位は、ｃＡＭＰとの結合能力を有し、天然哺乳類ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す配列（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％）を有するポリペプチド配列を意味する。本発明の分析方法に使用する前記結合剤におけるｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位は、例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠損、置換または転移により、天然哺乳類ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位と同一である必要はない。前記結合剤におけるｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位は、ヒトおよびウシｃＡＰＫに共通するｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に相当するアミノ酸配列（例えば、配列の高保存部分）の少なくとも９５％を含むことが好ましい。機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位という用語は、また、例えば、ｃＡＭＰ結合ポケット内において同じまたは同等の官能基（functional groups）で表される四次構造が類似する合成ポリペプチド配列のような、天然のｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位と均等である機能性トポロジーを有するｃＡＭＰ結合ポリペプチド配列に拡張すると考えられる。
【００１５】
診断法における慣例として、分析物：結合剤コンジュゲートの検出は、直接的でも間接的であってもよい。このように、例えば、標識化ｃＡＭＰが分析方法において使用される場合、標識化ｃＡＭＰ：結合剤コンジュゲートにおける標識からのシグナル（例えば、放射線放出）は、直接的に検出され、試料中のｃＡＭＰ含量は、これから推測できる。また、非複合である標識化ｃＡＭＰにおける標識からのシグナルは、直接的に検出でき、試料中のｃＡＭＰ含量は、また、これから推測できる。さらに、ｃＡＭＰ：第１結合剤コンジュゲートまたは非複合である第１結合剤に結合し、直接的に検出可能なシグナルまたは現象の増加を与える第２結合剤が使用でき、検出されたシグナルから、試料中のｃＡＭＰ含量が再度推測できる。このような分析物検出のシステムの全ては、本発明の分析方法により達成できる。
【００１６】
本発明のさらなる形態は、ｃＡＭＰ分析用のキットを提供し、前記キットは、ｃＡＭＰに結合可能なポリペプチド第１結合剤、任意に標識化ｃＡＭＰ、および、任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位のみを含むことを特徴とする。本発明のキットは、前記分析方法の実施のための指示書を含むことが好ましい。
【００１７】
本発明のさらなる形態は、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位のみを含むポリペプチドｃＡＭＰ結合剤、前記結合剤を含む組成物やアイテムを提供する。
【００１８】
前記結合剤を含む組成物は、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体（例えば、粉末）の組成物を含み、一般的に、さらに、液体もしくは固体キャリアーまたはゲル形成剤、防腐剤、ｐＨ調節剤等のような物質を含む。前記結合剤を含むアイテムは、例えば、前記結合剤でコーティングされた、または、前記結合剤を浸透させた、固体もしくは半固体構造を含み、例えば、前記結合剤が固定化されたビーズ、プレート、チューブ、メンブラン、ファイバー等である。
【００１９】
本発明で使用する前記ｃＡＭＰ結合剤は、１つ以上（例えば、１,２,３）のｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位を含む組換えタンパク質であることが好ましく、特に好ましくは、ウシｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位であり、任意に、基質表面に結合可能な部分（表面結合領域）を含む融合タンパク質を含む。前記結合剤が２以上の機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位を含む場合、これらは同じタイプであり、例えば、両方もしくは全てが、ＲＩα-Ｂ結合部位であってもよい。しかし、前記タンパク質は、必然的ではないが、機能しないｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位を含んでもよい。ここで「機能しない（disabled）」とは、ｃＡＭＰ結合部位のアミノ酸配列が、部位のｃＡＭＰ結合能を実質的に減少または消失する修飾（例えば、部位の四次構造または機能性トポロジーを変化するような１以上のアミノ酸の置換、挿入または欠損）をされたことを意味する。好ましい形態において、前記結合剤は、１つの機能性ＲＩ Ｂ部位および1つの機能しないＡ部位を有する。Ａ部位の欠陥は、例えば、ヒトまたはウシのような哺乳類で高く保存されているＲＩαのＧｌｙ残基（種に依存し、１９９、２００または２０１残基）のＧｌｕによる突然変異置換で達成できる。これはＰＣＲおよび標準変異キット（Strategene Quick Change）を用いて行うことができる。Ａ部位欠陥の効力は、例えば、Hummelら（BBA 63: 530-532 (1962)）の方法を使用した平衡結合により、または、さらに以下に示すように、トリチウムを含むｃＡＭＰの結合や硫酸アンモニウムとの沈殿により変化できる。前記結合剤は、特に好ましくは、１つ以上のｃＡＰＫ Ｂ部位（特にＲＩα Ｂ部位）、および、特異的結合パートナー対の１つ（one member）であるポリペプチド領域（例えば、ストレプトアビジンのビオチン結合部位）もしくは表面結合伸長（extension）であるポリペプチド領域（例えば、Ｇｌｙ ＧＬｙ ＣｙｓまたはＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ））を有するキメラ融合タンパク質である。欠陥ｃＡＰＫ Ａ部位および１つ以上のｃＡＰＫ Ｂ部位を有するこのようなキメラ融合タンパク質は、例えば、使用可能なリーディングフレームが適当にコードされた核酸配列が挿入されたプラスミドをＥ.ｃｏｌｉような細菌宿主へトランスフェクションする等の公知の方法によって容易に準備できる。本発明の特に好ましい形態において、前記結合剤は、Ａｌａもしくはジスルフィド結合を形成できない他のアミノ酸残基でＣｙｓを置換することにより、天然哺乳類ｃＡＰＫ Ｂ部位に相当する修飾されたＢ部位を含む。これは、Ａ部位の無力化に関する上述のような突然変異により行うことができる。Ｃｙｓ-ｆｒｅｅのＢ部位を有するこのような結合剤は、保存の際、Ｂ部位にＣｙｓ残基を有する結合剤よりも安定である。
【００２０】
前記結合剤は、非酸化条件下において、水溶液として使用することが好ましく、一般的に前記溶液は、安定化剤としてＥＤＴＡやＥＧＴＡのような１以上のキレート剤およびＤＴＥ、ＤＴＴ、２-メルカプトエタノールまたはグルタチオンのような還元剤を含んでもよい。
【００２１】
本発明の分析方法は、サンプル中のｃＡＭＰと標識化ｃＡＭＰとの間における結合競合に関連するが、標識がトリチウム（3Ｈ）であり、および／または、標識が８位の置換基（例えば、アデノシン環構造における置換基として）に結合していることが好ましい。８位が125Ｉで標識化されているｃＡＭＰ（通常、リンカー基を介して結合される）は新規であり、本発明のさらなる形態となる。
【００２２】
3Ｈ-ｃＡＭＰは、アマシャム（英国）より商業的に入手できる。
【００２３】
標識化ｃＡＭＰにおける標識は、検出可能（例えば、放射線放射力または吸収）、または、検出可能な種や現象（例えば、酵素活性力により）を生じる様々な種があげられる。放射ラベル、発色団および蛍光団が、ｃＡＭＰ結合剤に結合する標識化ｃＡＭＰの能力を邪魔しない、若しくは、最小限に邪魔しないように置換できるラベルとして好ましい。本発明の一形態において、標識化ｃＡＭＰは、例えば、表面プラスモン共鳴による検出可能な表面結合ｃＡＭＰへのｃＡＭＰ結合剤の結合によって形成されたコンジュゲートとの表面結合ｃＡＭＰである。このようなｃＡＭＰの表面結合は、例えば、表面カルボキシル基または活性化カルボキシル基を有する基質と、８-アミノアルカノイルアミノ-ｃＡＭＰ（例えば、８-アミノオクタノイルアミノ-ｃＡＭＰ、BioLog, Bremen, DE）との反応によって、生じてもよい。この形態において、表面（例えば、ポリマー基質のポリマー骨格）とペンダントｃＡＭＰ基との間のリンカーは、好ましくは１０００Ｄ以下の分子量であり、より好ましくは１００〜５００Ｄである（この場合、結合剤が表面に結合する際のＳＰＲシグナル相違は最適化される）。本発明の他の形態において、標識化ｃＡＭＰは、ペンダントｃＡＭＰ基（好ましくは８位に結合）を有するポリマーである（例えば、デンドリマー）。標識化ｃＡＭＰ：結合剤コンジュゲートは、この形態において、光散乱により検出できる（例えば、比濁法または比濁分析）。標識化ｃＡＭＰが放射ラベルされている場合、3Ｈ-ｃＡＭＰ（シンチレーションにより検出可能）または８-（125Ｉ-Ｘ）-ｃＡＭＰ（Ｘは、８位にヨウ素が結合するために、２５原子以下の鎖である有機基、例えば、チロシン-アルカノイルアミノ基）が好ましい。また、32Ｐ-標識化ｃＡＭＰ（ICN Pharmaceuticals）が使用できる。標識化ｃＡＭＰの調製は、公知の化学合成技術によって行うことができる。このように、例えば、８-アミノ-オクタノイル-アミノｃＡＭＰ（BioLog, Bremen, DE）は、チロシン残基を８位に挿入するためにチロシンと反応させてもよい。これは、標準キットを用いて、125Ｉでヨウ素化してもよい（例えば、無機125Ｉ化合物を用いてペルオキシダーゼで触媒するヨウ素化）。８位の嵩高い置換は、ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合物に対するｃＡＭＰの結合の阻害が見られない。
【００２４】
特に好ましい本発明の一形態において、ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合剤とのコンジュゲートおよび標識化ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合剤とのコンジュゲートを沈殿させ、例えば、メンブランフィルター等のろ過によって回収できる。この形態において、コンジュゲート沈殿は、例えば、硫酸アンモニア溶液のような硫酸塩溶液を用いて容易に得られる。ｃＡＰＫのｃＡＭＰ結合部位は、ｃＡＭＰ交換（例えば、複合体分離）させ、沈殿物における標識化ｃＡＭＰの量を“freeze（固定）”することが望ましい。これは、ｃＡＭＰと硫酸塩の溶液を含む沈殿剤の使用により容易に行うことができる。前記溶液は、ほとんど硫酸塩で飽和されていることが好ましく、例えば、５５‐９５％飽和であり、より好ましくは７５‐９２％飽和であり、また、例えば、サンプルに添加されたサンプル中の過剰量標識化ｃＡＭＰ量であるｃＡＭＰを含むことが好ましい（例えば、０．１ｍＭ濃度）。一般に、この停止溶液は、低温で、サンプルに対して約２０：１〜１：２、好ましくは約１５：１〜５：１の範囲の体積比で添加される。一般に、停止溶液は、１０℃以下の温度、例えば、０℃で添加され、停止溶液の添加と上清からの沈殿コンジュゲートの分離との間で遅延しても、サンプルは、遅延期間の間、冷却状態、例えば、０℃に保たれることが望ましい。停止溶液は、好ましくは緩衝液であり、例えば、ｐＨ７である。
【００２５】
この実施形態において、続くコンジュゲート沈殿は、沈殿および上清をろ過、例えば、マイクロメータのポアサイズであるフィルター（０．４５μｍポアサイズ）を通して、分離することが好ましい。適当なフィルターメンブランは、Milliporeより商業的に入手可能である（例えば、ＨＡＷＰまたはより好ましくはＨＡＭＫフィルター）。
【００２６】
ろ過後、前記フィルターメンブランは、非複合標識化ｃＡＭＰを除去するために洗浄することが好ましい。これは、ろ過後、迅速に行うことが好ましく、また、例えば、１または２回さらなる洗浄を繰り返すことが好ましい。希釈した停止溶液は、洗浄溶液として使用できるが、一般的にｃＡＭＰを含まないことが必要である。
【００２７】
サンプルは、高塩濃度であるため、沈殿後できるだけ早くろ過を行うことが望ましく、例えば、３０分以内である。
【００２８】
試験中のサンプルが低結合剤濃度である場合、沈殿を促進するために、停止溶液にカゼインを添加することが望ましい。試験中のサンプルが高結合剤濃度である場合、ガラスファイバープレフィルターを使用することが望ましい。
【００２９】
沈殿と洗浄に続き、フィルターメンブランに残存する標識化ｃＡＭＰ量を検出してもよい。発色団もしくは蛍光団ラベル、またはシンチレーションカウンティングを必要とする以外の放射標識での標識化の場合、シグナルは、前記メンブランより測定でき、また、前記メンブランから放出したコンジュゲートもしくは標識化ｃＡＭＰを測定できる。例えば、トリチウム標識化ｃＡＭＰのように、シンチレーションカウンティングが関与する検出の場合、コンジュゲートまたは標識化ｃＡＭＰは、メンブランから放出しなければならない。これは、メンブランに、ドデシル硫酸ナトリウム溶液等の水性界面活性剤溶液を接触させることにより行うことができ、一般に、１‐５％ｗ/ｖ溶液、このましくは２％ｗ/ｖ溶液である。溶液に放出された前記コンジュゲートまたは標識化ｃＡＭＰは、それから、例えば、3H-cAMPの場合、シンチレーション流体の添加により（例えば、「Emulsifier safe for aqueous samples」、Packard）、溶液中で検出できる。
【００３０】
診断用分析として、本発明における分析システムは、一般的に、既知ｃＡＭＰ濃度範囲の標準（例えば、ｃＡＭＰ溶液）に対するキャリブレーションが必要である。本発明の分析キットは、一般的に、試験サンプルのｃＡＭＰ含量を決定するための標準として、キャリブレーション用の標準セットおよび/またはキャリブレーションチャートおよび/またはコンピュータープログラム、またはシグナル値からの補間若しくは補外のためのデータセットが補充されてもよい。
【００３１】
本発明の方法を用いて試験するサンプルは、一般的に、生物学的または生物学的に発生する材料、例えば、微生物、細胞、組織、体液、体器官等である。特に興味深いのは、微生物、特に細菌および酵母、またはそれらから発生するサンプルである。また、多細胞生物、例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類および魚類、特にヒト、またはそれらから発生するサンプルである。しかしながら、ｃＡＭＰ値は、一般に、体細胞中よりも、無細胞体サンプル中で低いことに留意する（例えば、細胞内液においてマイクロモルレベルであるのに対して、血清において約ナノモルレベル）。
【００３２】
多くの生物学的サンプルにおいて、一度宿主種から除去されると、ｃＡＭＰ含量は迅速に減少する。このため、本発明の分析方法に使用するサンプルは、ｃＡＭＰ分解を減少または除くために前処理がなされる。一般に、これは、緩衝剤および/またはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の添加を伴ってもよい。体細胞や器官サンプルの分析のため、ｃＡＭＰレベルは、サンプル抽出または患者の死亡もしくは患者のストレスへの暴露において、非常に迅速に減少するので、抽出後、出来るだけ早急にサンプルを凍結することが望ましい（例えば、液体窒素に投ずることにより）。さらに、サンプルは、例えば、分析実行前に、粉砕し（ground）、溶媒抽出等を行ってもよい。
【００３３】
本発明の方法は、ｃＡＭＰ分析の方法である。これは、定量的、半定量的または定性的結果の発生に関わり、例えば、サンプル中のｃＡＭＰ濃度、他の分析物に対する相対的なｃＡＭＰ濃度、ｃＡＭＰ濃度のマルチバンド表示におけるバンド結果の配分（allocation）、所定の限界値以上（または以下）のようなｃＡＭＰ濃度の表示（正常/異常または軽度/過酷な境界線）、または、予想結果の表示（例えば、輸液への使用に適している間、全血サンプルが冷却下で保存され続ける期間である）（後者にとって、検査サンプルは、一般に、溶血されたクエン酸全血または赤血球濃縮物）である。このようなｃＡＭＰ含量の測定は、本発明の分析方法において行われるよう考慮される。
【００３４】
ｃＡＭＰ分析の他に、本発明の分析方法は、ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に結合可能な、他の環状ヌクレオチド（例えば、ｃＧＭＰ）や環状ヌクレオチド類似体の分析に使用することもできる。このような分析が競合分析の場合、競合標識化分析物は、標識化ｃＡＭＰ、または、より好ましくは、所望の分析物の標識化物である。このような分析は、候補物または現実の環状ヌクレオチド（類似体）薬剤化合物もしくは前駆体の生体分布および薬物速度論の研究において特に重要である。
【００３５】
前述のような従来のｃＡＭＰ分析とは異なり、本発明の分析方法は、このような化合物を検出するのに十分に感度および精度に優れる。このような方法において、所望の場合、サンプルに、妨害するｃＡＭＰ含量を減少または除去する処理を行ってもよく、例えば、ｃＡＭＰが結合するが、候補物質または薬剤が結合せず、ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に結合しない種にｃＡＭＰを変換するために働く作用物質、例えば、ｃＡＭＰ（候補物または薬物ではない）をｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に結合しない種に変換するホスホジエステラーゼ活性を有する酵素またはｃＡＭＰに結合するが、候補物や薬剤には結合しない抗体で、サンプルを処理してもよい。
【００３６】
この方法で分析できる環状ヌクレオチドおよび類似体の例は、8-アミノヘキシルアミノ-ｃＡＭＰ、8-ブロモ-ｃＡＭＰ、8-クロロ-ｃＡＭＰ、8-クロロフェニルチオ-ｃＡＭＰ、N6-モノブチリル-ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰが含まれる。
【００３７】
本発明のさらなる形態として、環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析方法があげられ、前記方法は、サンプルに、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体と結合可能なポリペプチド結合剤、および、任意に、前記結合剤に結合可能な標識化競争種を接触させる工程と、前記結合剤と前記環状ヌクレオチドもしくは環状ヌクレオチド類似体または前記競争種とのコンジュゲートを検出する工程とを含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ結合部位のみを含むことを特徴とする。
【００３８】
また、本発明のさらなる分析は、環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析用キットを提供し、前記キットは、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体に結合可能なポリペプチド第１結合剤、任意に前記結合剤に結合可能な標識化競争種、および任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ結合部位のみを含むことを特徴とする。
【００３９】
このキットおよび分析方法は、好ましくは、ｃＡＭＰ分析およびキットと関連して上述した特徴を利用できる。
【００４０】
本発明の分析方法は、抗体に基づく分析である先行技術とは異なり、比較的高濃度（例えば、１０ｍＭ）の２価金属イオン存在下で反応しない。このような金属イオン（例えば、Ｃａ2+およびＭｇ2+）の不安定な濃度は、分析を行う前に、サンプル中のｃＡＭＰ濃度の安定化に必要であるキレート剤の存在により強く影響をうけるため重要である。
【００４１】
ここで述べる全ての文献は、この方法で参照により組み込まれる。
【００４２】
本発明の分析方法を、さらに以下の制限されない実施例の参照により述べる。
【実施例１】
【００４３】
ｃＡＭＰ結合剤の調製
ＧＳＴの融合ポリペプチドに対するｃＤＮＡのＮｃｏＩブラントエンド断片、および、ＧＳＴとＲＩαの間にトロンビン切断部位を含む非変異化ヒトＲＩαを、プラスミドｐＧＥＸ-ＫＧのＮｃｏＩ-ＨｉｎｄIII部位に挿入した。挿入は、公知配列のヌクレオチド１０３〜１４７４に相当する。
【００４４】
突然変異には、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を使用した。ＲＩαをコードする二本鎖プラスミドと、所望の変異を有する二つの合成オリゴヌクレオチドプライマーとをアニールし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させた。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-GGAGGGAGCTTTGAAGAACTTGCTTTG および 3'-CCTCCCTCGAAACTTCTTGAACGAAACである。温度サイクルの後、parent ＤＮＡテンプレートをＤｐｎ１を用いて切断した。変異ＤＮＡは、Epicurian Coli XL1-Blue supercompetent cellsに導入した。変異はシーケンシングにより確認した（ABI Prism 3700）。
【００４５】
プラスミドをE. coli BL21に導入し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘導する前に、２時間プレインキュベートした。細菌のインキュベーは、２５℃で行った。
【００４６】
発現したＧＳＴ ｈＲＩα融合タンパク質は、メーカーのプロトコールに従って、グルタチオン-アガロース（Pharmacia）への結合により精製した。融合タンパク質は、さらにSuperdex 200ゲルろ過カラム（Pharmacia FPLC system）で精製した。ＧＳＴ-tagは、トロンビンにより切断し、続いて、付加的なＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【００４７】
ＧＳＴ-ｈＲＩａ融合タンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ移動度は、キャリブレーション用の、ウシ血清アルブミン、雌鶏オバルブミンおよびBio-Rad high molecular weight standardsを用いた予想値８１ｋＤａに相当した。トロンビン切断タンパク質は、５１ｋＤａのＳＤＳ-ＰＡＧＥ移動度を示した。
【実施例２】
【００４８】
分析操作
サンプル調製
オスWistarラット(120-400 g)に麻酔をかけて肝臓を暴露し、液体窒素で予冷したWollenberger tongの金属クランプ間で、生体材料を急激に凍結させた。凍結組織を粉砕した（パウダーは、ｃＡＭＰ分解なしに液体窒素内で数ヶ月間保存できた）。ｃＡＭＰを抽出するため、前記パウダーを氷冷した５％(w/v)水性トリクロロ酢酸を含む０．１Ｍ ＨＣｌ内で沈殿させた（１ｍｌ／５０ｍｇ組織パウダー）。そして、１０分間遠心した（平均20,000xg）。トリクロロ酢酸は、少なくとも４倍の水飽和ジエチルエーテルで抽出を繰り返すこと（４×）により、上清から除去した。サンプルは、２０μｌの１０Ｍ ＮａＯＨの添加により中和した。
【００４９】
分析操作
１００μｌのサンプルを、５０μｌの３ｎＭ 3Ｈ-ｃＡＭＰ(Amersham plc, 米国)と混合し、それから、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（リン酸２カリウムでｐＨ７．４に調整され、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍｇ/ｍｌ血清アルブミン、０．２ｍｇ/ｍｌダイズトリプシンインヒビターおよび０．５ｍＭ ＤＴＥを含む）中の前記実施例１におけるトロンビン切断された結合剤５０μｌ（ｃＡＭＰ結合部位１．２ｎＭ）と混合した。混合物を２〜１８時間インキュベートし、それから１ｍｌの氷冷８０％飽和硫酸アンモニウムと勢いよく混合した。
【００５０】
２×２ｍｌの氷冷６５％硫酸アンモニウムを直径２５ｍｍメンブランフィルター(孔径０．４５μｍ、例えば、MilliporeのHAMK)を通し、その後、沈殿したサンプルを同じフィルターに吸引して通した。サンプルを通した後、迅速に、氷冷した６５％飽和硫酸アンモニウム２ｍｌを供し、続いて、さらに２ｍｌの氷冷６５％飽和硫酸アンモニウム２ｍｌで２回洗浄した。
【００５１】
前記フィルターを、１ｍｌの２％ ｗ/ｖ水性ドデシル硫酸ナトリウム溶液を含むシンチレーションバイアルに移した。沈殿は、１０分間のミキシングにより溶解させた。それから、７ｍｌのシンチレーション流体（"Emulsifier Safe for aqueous samples" from Packard）を添加し、前記バイアルを、少なくとも４分間ベータカウンターでカウントした。
【００５２】
同じ分析工程と５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（リン酸２カリウムでｐＨ７．４に調整し、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍｇ/ｍｌ血清アルブミン、０．２ｍｇ/ｍｌダイズトリプシンインヒビターおよび０．５ｍＭ ＤＴＥを含む）中のｃＡＭＰ標準溶液を用いて作成した検量線を、サンプルのｃＡＭＰ含量を測定するために使用した。
【実施例３】
【００５３】
分析操作
サンプルが、インキュベーション後、結合剤を解離できる少量のｃＡＭＰまたは高濃度（例えば、１０ｍＭ）の弱い結合基質（例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰ）を含む場合、実施例２の分析は、3Ｈ-ｃＡＭＰの開始インキュベートを省き、代わりに１０ｎＭ 3Ｈ-ｃＡＭＰの存在下、１時間のポストインキュベートを行うことにより実行できる。その工程は変化しない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）、他の環状ヌクレオチドおよび環状ヌクレオチド類似体の分析方法に関し、また、このような方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰまたはアデノシン３',５'-環状モノホスフェートは、１位にプリン基が結合し、３'位および５’位にリン酸基が結合したリボフラノースモノサッカライドユニットを含む。ｃＡＭＰは、ＡＴＰの環化により形成され、ホルモンの分布域で、ホルモン作用のメディエータとして機能する第２メセンジャーである。特に、プロテインキナーゼとして知られるキー酵素の活性化を担っている。
【０００３】
ｃＡＭＰは、体内に広く分布しており、例えば、甲状腺不全（thyroid malfunction）、カルシウム代謝欠損等、広い範囲でのコンディションとの関連において分析されている。
【０００４】
ｃＡＭＰの様々な分析が、商業的に利用可能となっており、特に英国のAmarsham plcより利用可能となっている。最も広く使用されている分析は、イミノグロブリンまたは天然に生じたｃＡＭＰ結合タンパク質（特にｃＡＭＰ依存型プロテインキナーゼイソエンザイムＩ型（ｃＡＰＫＩ））のいずれか一方の高親和性の結合部位に対する、ｃＡＭＰと、標識化（例えば、放射線標識化）ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰ類似体との間における競合に基づくものである。
【０００５】
現在このような分析が数十年間利用されているが、それにもかかわらず、これらは望まれる程度よりも正確さに欠ける。また、抗体に基づく分析は、分析が行われる前にｃＡＭＰが分解することを防ぐためにｃＡＭＰ含有試料に添加される試薬（例えば、ＥＤＴＡ）にセンシティブである。
【発明の開示】
【０００６】
このようにｃＡＭＰの改良された分析方法が必要とされている。
【０００７】
我々は、このような改良分析方法が、ｃＡＭＰ結合剤として、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ｃＡＰＫ）のｃＡＭＰ結合部位の一つのタイプのみの機能形態を含むポリペプチドを使用することによって達成できることを見出した。Ｉ型（ｃＡＰＫＩ）およびII型（ｃＡＰＫII）として存在するｃＡＰＫは、それぞれ、Ｃ末端付近、また、Ｃ末端に位置する制御（Ｒ）サブユニットに、２種類のｃＡＭＰ結合サイト（Ａ部位、Ｂ部位）を有する。このように、２量体であるｃＡＰＫＩには、４つの結合部位（Ａα、Ａβ、ＢαおよびＢβ）が存在する。αおよびβ鎖におけるＡ部位のアミノ酸配列末端は、αおよびβ鎖におけるＢ部位の配列と同様である。
【０００８】
ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼは、例えば、Taylorらにおいて論じられている（非特許文献１：Taylor et al. Ann. Rev. Biochem. 59: 971 (1990), Doskeland et al. Biochim. Biophys. Acta 1178: 249-258 (1993)、非特許文献２：Francis et al. Ann. Rev. Physiol. 56: 237-272 (1994)、非特許文献３Johnson et al. Chem. Rev. 101: 2243-2270 (2001)）。ポリペプチドＲＩα（ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼＩ型のα鎖における制御（Ｒ）サブユニット）のＡ部位およびＢ部位は、共結晶（co-crystallized）ｃＡＭＰおよび完全なＡおよびＢ部位で切断されたＲＩαが、Ｙｕらによって述べられている（非特許文献４：Yu et al. in Science 269: 807-813 (1995)）。ＲＩは、二つの形態ＲＩαおよびＲＩβを有しており、これらはｃＡＭＰ結合ドメインにおけるアミノ酸配列末端が非常に類似している。ｃＡＭＰ依存型プロテインキナーゼII型のＲサブユニット（例えば、ＲIIαおよびＲIIβ）は、Ａ部位およびＢ部位を有し、これらはＲＩαにおける相当する部位と類似している（非特許文献５：Diller et al. Structure 9: 73-82 (2001)参照）。
【０００９】
哺乳類のＲサブユニットにおいて、Ａ部位は、約１４３-２６０（ＲＩα）または１５８-２７７（ＲIIβ）のアミノ酸残基を含み、Ｂ部位は、約２６０-３７４（ＲＩα）または２７７-４２６（ＲIIβ）のアミノ酸残基を含む。
【００１０】
このように本発明の一つの形態から考慮して、本発明は、試料中のｃＡＭＰを分析する方法であって、前記方法は、未知含有量のｃＡＭＰを含む試料に、ポリペプチドのｃＡＭＰ結合剤および任意に標識化ｃＡＭＰを接触させる工程と、ｃＡＭＰまたは標識化ｃＡＭＰと前記結合剤とのコンジュゲートを検出する工程とを含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とする分析方法を提供する。
【００１１】
前記機能性部位は、Ｂ部位であり、好ましくはＲＩ Ｂ部位であり、特に好ましくはＲＩα Ｂ部位である。
【００１２】
ここで「機能性部位」とは、結合部位が、天然ヒトｃＡＰＫにおける部位のＫDに対して３００％未満のＫDでｃＡＭＰに結合できる部位であることを意味し、好ましくは２００％未満、より好ましくは１５０％未満、特に好ましくは１１０％未満である（低いＫD、高い結合親和性）。
【００１３】
機能性ｃＡＭＰ結合部位の他に、結合剤は、非機能性ｃＡＭＰ結合部位（例えば、異なるタイプ）を含んでもよい。非機能性部位は、いくつかのまたはすべてのアミノ酸配列における天然ｃＡＭＰ結合部位に相当する部位を意味するが、これは、天然ヒトｃＡＰＫにおける相当する部位のＫDに対して３００％以上のＡＭＰ結合についてのＫDを有し、より好ましくは５００％以上、特に好ましくは１００００％以上である。
【００１４】
ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位は、ｃＡＭＰとの結合能力を有し、天然哺乳類ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位配列と少なくとも６０％のホモロジーを示す配列（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％）を有するポリペプチド配列を意味する。本発明の分析方法に使用する前記結合剤におけるｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位は、例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠損、置換または転移により、天然哺乳類ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位と同一である必要はない。前記結合剤におけるｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位は、ヒトおよびウシｃＡＰＫに共通するｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に相当するアミノ酸配列（例えば、配列の高保存部分）の少なくとも９５％を含むことが好ましい。機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位という用語は、また、例えば、ｃＡＭＰ結合ポケット内において同じまたは同等の官能基（functional groups）で表される四次構造が類似する合成ポリペプチド配列のような、天然のｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位と均等である機能性トポロジーを有するｃＡＭＰ結合ポリペプチド配列に拡張すると考えられる。
【００１５】
診断法における慣例として、分析物：結合剤コンジュゲートの検出は、直接的でも間接的であってもよい。このように、例えば、標識化ｃＡＭＰが分析方法において使用される場合、標識化ｃＡＭＰ：結合剤コンジュゲートにおける標識からのシグナル（例えば、放射線放出）は、直接的に検出され、試料中のｃＡＭＰ含量は、これから推測できる。また、非複合である標識化ｃＡＭＰにおける標識からのシグナルは、直接的に検出でき、試料中のｃＡＭＰ含量は、また、これから推測できる。さらに、ｃＡＭＰ：第１結合剤コンジュゲートまたは非複合である第１結合剤に結合し、直接的に検出可能なシグナルまたは現象の増加を与える第２結合剤が使用でき、検出されたシグナルから、試料中のｃＡＭＰ含量が再度推測できる。このような分析物検出のシステムの全ては、本発明の分析方法により達成できる。
【００１６】
本発明のさらなる形態は、ｃＡＭＰ分析用のキットを提供し、前記キットは、ｃＡＭＰに結合可能なポリペプチド第１結合剤、任意に標識化ｃＡＭＰ、および、任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位のみを含むことを特徴とする。本発明のキットは、前記分析方法の実施のための指示書を含むことが好ましい。
【００１７】
本発明のさらなる形態は、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位のみを含むポリペプチドｃＡＭＰ結合剤、前記結合剤を含む組成物やアイテムを提供する。
【００１８】
前記結合剤を含む組成物は、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体（例えば、粉末）の組成物を含み、一般的に、さらに、液体もしくは固体キャリアーまたはゲル形成剤、防腐剤、ｐＨ調節剤等のような物質を含む。前記結合剤を含むアイテムは、例えば、前記結合剤でコーティングされた、または、前記結合剤を浸透させた、固体もしくは半固体構造を含み、例えば、前記結合剤が固定化されたビーズ、プレート、チューブ、メンブラン、ファイバー等である。
【００１９】
本発明で使用する前記ｃＡＭＰ結合剤は、１つ以上（例えば、１,２,３）のｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位を含む組換えタンパク質であることが好ましく、特に好ましくは、ウシｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位であり、任意に、基質表面に結合可能な部分（表面結合領域）を含む融合タンパク質を含む。前記結合剤が２以上の機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位を含む場合、これらは同じタイプであり、例えば、両方もしくは全てが、ＲＩα-Ｂ結合部位であってもよい。しかし、前記タンパク質は、必然的ではないが、機能しないｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位を含んでもよい。ここで「機能しない（disabled）」とは、ｃＡＭＰ結合部位のアミノ酸配列が、部位のｃＡＭＰ結合能を実質的に減少または消失する修飾（例えば、部位の四次構造または機能性トポロジーを変化するような１以上のアミノ酸の置換、挿入または欠損）をされたことを意味する。好ましい形態において、前記結合剤は、１つの機能性ＲＩ Ｂ部位および1つの機能しないＡ部位を有する。Ａ部位の欠陥は、例えば、ヒトまたはウシのような哺乳類で高く保存されているＲＩαのＧｌｙ残基（種に依存し、１９９、２００または２０１残基）のＧｌｕによる突然変異置換で達成できる。これはＰＣＲおよび標準変異キット（Strategene Quick Change）を用いて行うことができる。Ａ部位欠陥の効力は、例えば、Hummelら（BBA 63: 530-532 (1962)）の方法を使用した平衡結合により、または、さらに以下に示すように、トリチウムを含むｃＡＭＰの結合や硫酸アンモニウムとの沈殿により変化できる。前記結合剤は、特に好ましくは、１つ以上のｃＡＰＫ Ｂ部位（特にＲＩα Ｂ部位）、および、特異的結合パートナー対の１つ（one member）であるポリペプチド領域（例えば、ストレプトアビジンのビオチン結合部位）もしくは表面結合伸長（extension）であるポリペプチド領域（例えば、Ｇｌｙ ＧＬｙ ＣｙｓまたはＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ））を有するキメラ融合タンパク質である。欠陥ｃＡＰＫ Ａ部位および１つ以上のｃＡＰＫ Ｂ部位を有するこのようなキメラ融合タンパク質は、例えば、使用可能なリーディングフレームが適当にコードされた核酸配列が挿入されたプラスミドをＥ.ｃｏｌｉような細菌宿主へトランスフェクションする等の公知の方法によって容易に準備できる。本発明の特に好ましい形態において、前記結合剤は、Ａｌａもしくはジスルフィド結合を形成できない他のアミノ酸残基でＣｙｓを置換することにより、天然哺乳類ｃＡＰＫ Ｂ部位に相当する修飾されたＢ部位を含む。これは、Ａ部位の無力化に関する上述のような突然変異により行うことができる。Ｃｙｓ-ｆｒｅｅのＢ部位を有するこのような結合剤は、保存の際、Ｂ部位にＣｙｓ残基を有する結合剤よりも安定である。
【００２０】
前記結合剤は、非酸化条件下において、水溶液として使用することが好ましく、一般的に前記溶液は、安定化剤としてＥＤＴＡやＥＧＴＡのような１以上のキレート剤およびＤＴＥ、ＤＴＴ、２-メルカプトエタノールまたはグルタチオンのような還元剤を含んでもよい。
【００２１】
本発明の分析方法は、サンプル中のｃＡＭＰと標識化ｃＡＭＰとの間における結合競合に関連するが、標識がトリチウム（3Ｈ）であり、および／または、標識が８位の置換基（例えば、アデノシン環構造における置換基として）に結合していることが好ましい。８位が125Ｉで標識化されているｃＡＭＰ（通常、リンカー基を介して結合される）は新規であり、本発明のさらなる形態となる。
【００２２】
3Ｈ-ｃＡＭＰは、アマシャム（英国）より商業的に入手できる。
【００２３】
標識化ｃＡＭＰにおける標識は、検出可能（例えば、放射線放射力または吸収）、または、検出可能な種や現象（例えば、酵素活性力により）を生じる様々な種があげられる。放射ラベル、発色団および蛍光団が、ｃＡＭＰ結合剤に結合する標識化ｃＡＭＰの能力を邪魔しない、若しくは、最小限に邪魔しないように置換できるラベルとして好ましい。本発明の一形態において、標識化ｃＡＭＰは、例えば、表面プラスモン共鳴による検出可能な表面結合ｃＡＭＰへのｃＡＭＰ結合剤の結合によって形成されたコンジュゲートとの表面結合ｃＡＭＰである。このようなｃＡＭＰの表面結合は、例えば、表面カルボキシル基または活性化カルボキシル基を有する基質と、８-アミノアルカノイルアミノ-ｃＡＭＰ（例えば、８-アミノオクタノイルアミノ-ｃＡＭＰ、BioLog, Bremen, DE）との反応によって、生じてもよい。この形態において、表面（例えば、ポリマー基質のポリマー骨格）とペンダントｃＡＭＰ基との間のリンカーは、好ましくは１０００Ｄ以下の分子量であり、より好ましくは１００〜５００Ｄである（この場合、結合剤が表面に結合する際のＳＰＲシグナル相違は最適化される）。本発明の他の形態において、標識化ｃＡＭＰは、ペンダントｃＡＭＰ基（好ましくは８位に結合）を有するポリマーである（例えば、デンドリマー）。標識化ｃＡＭＰ：結合剤コンジュゲートは、この形態において、光散乱により検出できる（例えば、比濁法または比濁分析）。標識化ｃＡＭＰが放射ラベルされている場合、3Ｈ-ｃＡＭＰ（シンチレーションにより検出可能）または８-（125Ｉ-Ｘ）-ｃＡＭＰ（Ｘは、８位にヨウ素が結合するために、２５原子以下の鎖である有機基、例えば、チロシン-アルカノイルアミノ基）が好ましい。また、32Ｐ-標識化ｃＡＭＰ（ICN Pharmaceuticals）が使用できる。標識化ｃＡＭＰの調製は、公知の化学合成技術によって行うことができる。このように、例えば、８-アミノ-オクタノイル-アミノｃＡＭＰ（BioLog, Bremen, DE）は、チロシン残基を８位に挿入するためにチロシンと反応させてもよい。これは、標準キットを用いて、125Ｉでヨウ素化してもよい（例えば、無機125Ｉ化合物を用いてペルオキシダーゼで触媒するヨウ素化）。８位の嵩高い置換は、ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合物に対するｃＡＭＰの結合の阻害が見られない。
【００２４】
特に好ましい本発明の一形態において、ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合剤とのコンジュゲートおよび標識化ｃＡＭＰとｃＡＭＰ結合剤とのコンジュゲートを沈殿させ、例えば、メンブランフィルター等のろ過によって回収できる。この形態において、コンジュゲート沈殿は、例えば、硫酸アンモニア溶液のような硫酸塩溶液を用いて容易に得られる。ｃＡＰＫのｃＡＭＰ結合部位は、ｃＡＭＰ交換（例えば、複合体分離）させ、沈殿物における標識化ｃＡＭＰの量を“freeze（固定）”することが望ましい。これは、ｃＡＭＰと硫酸塩の溶液を含む沈殿剤の使用により容易に行うことができる。前記溶液は、ほとんど硫酸塩で飽和されていることが好ましく、例えば、５５‐９５％飽和であり、より好ましくは７５‐９２％飽和であり、また、例えば、サンプルに添加されたサンプル中の過剰量標識化ｃＡＭＰ量であるｃＡＭＰを含むことが好ましい（例えば、０．１ｍＭ濃度）。一般に、この停止溶液は、低温で、サンプルに対して約２０：１〜１：２、好ましくは約１５：１〜５：１の範囲の体積比で添加される。一般に、停止溶液は、１０℃以下の温度、例えば、０℃で添加され、停止溶液の添加と上清からの沈殿コンジュゲートの分離との間で遅延しても、サンプルは、遅延期間の間、冷却状態、例えば、０℃に保たれることが望ましい。停止溶液は、好ましくは緩衝液であり、例えば、ｐＨ７である。
【００２５】
この実施形態において、続くコンジュゲート沈殿は、沈殿および上清をろ過、例えば、マイクロメータのポアサイズであるフィルター（０．４５μｍポアサイズ）を通して、分離することが好ましい。適当なフィルターメンブランは、Milliporeより商業的に入手可能である（例えば、ＨＡＷＰまたはより好ましくはＨＡＭＫフィルター）。
【００２６】
ろ過後、前記フィルターメンブランは、非複合標識化ｃＡＭＰを除去するために洗浄することが好ましい。これは、ろ過後、迅速に行うことが好ましく、また、例えば、１または２回さらなる洗浄を繰り返すことが好ましい。希釈した停止溶液は、洗浄溶液として使用できるが、一般的にｃＡＭＰを含まないことが必要である。
【００２７】
サンプルは、高塩濃度であるため、沈殿後できるだけ早くろ過を行うことが望ましく、例えば、３０分以内である。
【００２８】
試験中のサンプルが低結合剤濃度である場合、沈殿を促進するために、停止溶液にカゼインを添加することが望ましい。試験中のサンプルが高結合剤濃度である場合、ガラスファイバープレフィルターを使用することが望ましい。
【００２９】
沈殿と洗浄に続き、フィルターメンブランに残存する標識化ｃＡＭＰ量を検出してもよい。発色団もしくは蛍光団ラベル、またはシンチレーションカウンティングを必要とする以外の放射標識での標識化の場合、シグナルは、前記メンブランより測定でき、また、前記メンブランから放出したコンジュゲートもしくは標識化ｃＡＭＰを測定できる。例えば、トリチウム標識化ｃＡＭＰのように、シンチレーションカウンティングが関与する検出の場合、コンジュゲートまたは標識化ｃＡＭＰは、メンブランから放出しなければならない。これは、メンブランに、ドデシル硫酸ナトリウム溶液等の水性界面活性剤溶液を接触させることにより行うことができ、一般に、１‐５％ｗ/ｖ溶液、このましくは２％ｗ/ｖ溶液である。溶液に放出された前記コンジュゲートまたは標識化ｃＡＭＰは、それから、例えば、3H-cAMPの場合、シンチレーション流体の添加により（例えば、「Emulsifier safe for aqueous samples」、Packard）、溶液中で検出できる。
【００３０】
診断用分析として、本発明における分析システムは、一般的に、既知ｃＡＭＰ濃度範囲の標準（例えば、ｃＡＭＰ溶液）に対するキャリブレーションが必要である。本発明の分析キットは、一般的に、試験サンプルのｃＡＭＰ含量を決定するための標準として、キャリブレーション用の標準セットおよび/またはキャリブレーションチャートおよび/またはコンピュータープログラム、またはシグナル値からの補間若しくは補外のためのデータセットが補充されてもよい。
【００３１】
本発明の方法を用いて試験するサンプルは、一般的に、生物学的または生物学的に発生する材料、例えば、微生物、細胞、組織、体液、体器官等である。特に興味深いのは、微生物、特に細菌および酵母、またはそれらから発生するサンプルである。また、多細胞生物、例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類および魚類、特にヒト、またはそれらから発生するサンプルである。しかしながら、ｃＡＭＰ値は、一般に、体細胞中よりも、無細胞体サンプル中で低いことに留意する（例えば、細胞内液においてマイクロモルレベルであるのに対して、血清において約ナノモルレベル）。
【００３２】
多くの生物学的サンプルにおいて、一度宿主種から除去されると、ｃＡＭＰ含量は迅速に減少する。このため、本発明の分析方法に使用するサンプルは、ｃＡＭＰ分解を減少または除くために前処理がなされる。一般に、これは、緩衝剤および/またはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の添加を伴ってもよい。体細胞や器官サンプルの分析のため、ｃＡＭＰレベルは、サンプル抽出または患者の死亡もしくは患者のストレスへの暴露において、非常に迅速に減少するので、抽出後、出来るだけ早急にサンプルを凍結することが望ましい（例えば、液体窒素に投ずることにより）。さらに、サンプルは、例えば、分析実行前に、粉砕し（ground）、溶媒抽出等を行ってもよい。
【００３３】
本発明の方法は、ｃＡＭＰ分析の方法である。これは、定量的、半定量的または定性的結果の発生に関わり、例えば、サンプル中のｃＡＭＰ濃度、他の分析物に対する相対的なｃＡＭＰ濃度、ｃＡＭＰ濃度のマルチバンド表示におけるバンド結果の配分（allocation）、所定の限界値以上（または以下）のようなｃＡＭＰ濃度の表示（正常/異常または軽度/過酷な境界線）、または、予想結果の表示（例えば、輸液への使用に適している間、全血サンプルが冷却下で保存され続ける期間である）（後者にとって、検査サンプルは、一般に、溶血されたクエン酸全血または赤血球濃縮物）である。このようなｃＡＭＰ含量の測定は、本発明の分析方法において行われるよう考慮される。
【００３４】
ｃＡＭＰ分析の他に、本発明の分析方法は、ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に結合可能な、他の環状ヌクレオチド（例えば、ｃＧＭＰ）や環状ヌクレオチド類似体の分析に使用することもできる。このような分析が競合分析の場合、競合標識化分析物は、標識化ｃＡＭＰ、または、より好ましくは、所望の分析物の標識化物である。このような分析は、候補物または現実の環状ヌクレオチド（類似体）薬剤化合物もしくは前駆体の生体分布および薬物速度論の研究において特に重要である。
【００３５】
前述のような従来のｃＡＭＰ分析とは異なり、本発明の分析方法は、このような化合物を検出するのに十分に感度および精度に優れる。このような方法において、所望の場合、サンプルに、妨害するｃＡＭＰ含量を減少または除去する処理を行ってもよく、例えば、ｃＡＭＰが結合するが、候補物質または薬剤が結合せず、ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に結合しない種にｃＡＭＰを変換するために働く作用物質、例えば、ｃＡＭＰ（候補物または薬物ではない）をｃＡＰＫ ｃＡＭＰ結合部位に結合しない種に変換するホスホジエステラーゼ活性を有する酵素またはｃＡＭＰに結合するが、候補物や薬剤には結合しない抗体で、サンプルを処理してもよい。
【００３６】
この方法で分析できる環状ヌクレオチドおよび類似体の例は、8-アミノヘキシルアミノ-ｃＡＭＰ、8-ブロモ-ｃＡＭＰ、8-クロロ-ｃＡＭＰ、8-クロロフェニルチオ-ｃＡＭＰ、N6-モノブチリル-ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰが含まれる。
【００３７】
本発明のさらなる形態として、環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析方法があげられ、前記方法は、サンプルに、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体と結合可能なポリペプチド結合剤、および、任意に、前記結合剤に結合可能な標識化競争種を接触させる工程と、前記結合剤と前記環状ヌクレオチドもしくは環状ヌクレオチド類似体または前記競争種とのコンジュゲートを検出する工程とを含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ結合部位のみを含むことを特徴とする。
【００３８】
また、本発明のさらなる分析は、環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析用キットを提供し、前記キットは、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体に結合可能なポリペプチド第１結合剤、任意に前記結合剤に結合可能な標識化競争種、および任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ結合部位のみを含むことを特徴とする。
【００３９】
このキットおよび分析方法は、好ましくは、ｃＡＭＰ分析およびキットと関連して上述した特徴を利用できる。
【００４０】
本発明の分析方法は、抗体に基づく分析である先行技術とは異なり、比較的高濃度（例えば、１０ｍＭ）の２価金属イオン存在下で反応しない。このような金属イオン（例えば、Ｃａ2+およびＭｇ2+）の不安定な濃度は、分析を行う前に、サンプル中のｃＡＭＰ濃度の安定化に必要であるキレート剤の存在により強く影響をうけるため重要である。
【００４１】
ここで述べる全ての文献は、この方法で参照により組み込まれる。
【００４２】
本発明の分析方法を、さらに以下の制限されない実施例の参照により述べる。
【実施例１】
【００４３】
ｃＡＭＰ結合剤の調製
ＧＳＴの融合ポリペプチドに対するｃＤＮＡのＮｃｏＩブラントエンド断片、および、ＧＳＴとＲＩαの間にトロンビン切断部位を含む非変異化ヒトＲＩαを、プラスミドｐＧＥＸ-ＫＧのＮｃｏＩ-ＨｉｎｄIII部位に挿入した。挿入は、公知配列のヌクレオチド１０３〜１４７４に相当する。
【００４４】
突然変異には、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を使用した。ＲＩαをコードする二本鎖プラスミドと、所望の変異を有する二つの合成オリゴヌクレオチドプライマーとをアニールし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させた。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-GGAGGGAGCTTTGAAGAACTTGCTTTG および 3'-CCTCCCTCGAAACTTCTTGAACGAAACである。温度サイクルの後、parent ＤＮＡテンプレートをＤｐｎ１を用いて切断した。変異ＤＮＡは、Epicurian Coli XL1-Blue supercompetent cellsに導入した。変異はシーケンシングにより確認した（ABI Prism 3700）。
【００４５】
プラスミドをE. coli BL21に導入し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘導する前に、２時間プレインキュベートした。細菌のインキュベーは、２５℃で行った。
【００４６】
発現したＧＳＴ ｈＲＩα融合タンパク質は、メーカーのプロトコールに従って、グルタチオン-アガロース（Pharmacia）への結合により精製した。融合タンパク質は、さらにSuperdex 200ゲルろ過カラム（Pharmacia FPLC system）で精製した。ＧＳＴ-tagは、トロンビンにより切断し、続いて、付加的なＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【００４７】
ＧＳＴ-ｈＲＩａ融合タンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ移動度は、キャリブレーション用の、ウシ血清アルブミン、雌鶏オバルブミンおよびBio-Rad high molecular weight standardsを用いた予想値８１ｋＤａに相当した。トロンビン切断タンパク質は、５１ｋＤａのＳＤＳ-ＰＡＧＥ移動度を示した。
【実施例２】
【００４８】
分析操作
サンプル調製
オスWistarラット(120-400 g)に麻酔をかけて肝臓を暴露し、液体窒素で予冷したWollenberger tongの金属クランプ間で、生体材料を急激に凍結させた。凍結組織を粉砕した（パウダーは、ｃＡＭＰ分解なしに液体窒素内で数ヶ月間保存できた）。ｃＡＭＰを抽出するため、前記パウダーを氷冷した５％(w/v)水性トリクロロ酢酸を含む０．１Ｍ ＨＣｌ内で沈殿させた（１ｍｌ／５０ｍｇ組織パウダー）。そして、１０分間遠心した（平均20,000xg）。トリクロロ酢酸は、少なくとも４倍の水飽和ジエチルエーテルで抽出を繰り返すこと（４×）により、上清から除去した。サンプルは、２０μｌの１０Ｍ ＮａＯＨの添加により中和した。
【００４９】
分析操作
１００μｌのサンプルを、５０μｌの３ｎＭ 3Ｈ-ｃＡＭＰ(Amersham plc, 米国)と混合し、それから、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（リン酸２カリウムでｐＨ７．４に調整され、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍｇ/ｍｌ血清アルブミン、０．２ｍｇ/ｍｌダイズトリプシンインヒビターおよび０．５ｍＭ ＤＴＥを含む）中の前記実施例１におけるトロンビン切断された結合剤５０μｌ（ｃＡＭＰ結合部位１．２ｎＭ）と混合した。混合物を２〜１８時間インキュベートし、それから１ｍｌの氷冷８０％飽和硫酸アンモニウムと勢いよく混合した。
【００５０】
２×２ｍｌの氷冷６５％硫酸アンモニウムを直径２５ｍｍメンブランフィルター(孔径０．４５μｍ、例えば、MilliporeのHAMK)を通し、その後、沈殿したサンプルを同じフィルターに吸引して通した。サンプルを通した後、迅速に、氷冷した６５％飽和硫酸アンモニウム２ｍｌを供し、続いて、さらに２ｍｌの氷冷６５％飽和硫酸アンモニウム２ｍｌで２回洗浄した。
【００５１】
前記フィルターを、１ｍｌの２％ ｗ/ｖ水性ドデシル硫酸ナトリウム溶液を含むシンチレーションバイアルに移した。沈殿は、１０分間のミキシングにより溶解させた。それから、７ｍｌのシンチレーション流体（"Emulsifier Safe for aqueous samples" from Packard）を添加し、前記バイアルを、少なくとも４分間ベータカウンターでカウントした。
【００５２】
同じ分析工程と５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（リン酸２カリウムでｐＨ７．４に調整し、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍｇ/ｍｌ血清アルブミン、０．２ｍｇ/ｍｌダイズトリプシンインヒビターおよび０．５ｍＭ ＤＴＥを含む）中のｃＡＭＰ標準溶液を用いて作成した検量線を、サンプルのｃＡＭＰ含量を測定するために使用した。
【実施例３】
【００５３】
分析操作
サンプルが、インキュベーション後、結合剤を解離できる少量のｃＡＭＰまたは高濃度（例えば、１０ｍＭ）の弱い結合基質（例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰ）を含む場合、実施例２の分析は、3Ｈ-ｃＡＭＰの開始インキュベートを省き、代わりに１０ｎＭ 3Ｈ-ｃＡＭＰの存在下、１時間のポストインキュベートを行うことにより実行できる。その工程は変化しない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のｃＡＭＰを分析する方法であって、未知含有量のｃＡＭＰを含む試料に、ポリペプチドのｃＡＭＰ結合剤および任意に標識化ｃＡＭＰを接触させる工程、および、ｃＡＭＰまたは標識化ｃＡＭＰと前記結合剤とのコンジュゲートを検出する工程を含み、前記結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記結合剤が、機能しない（disabled）Ａ-結合部位を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記結合部位が、ＲＩα Ｂ-部位である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記標識化ｃＡＭＰが、ヨウ素-１２５により８位が標識されている請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記標識化ｃＡＭＰが、８位において基質表面に結合する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ｃＡＭＰコンジュゲートが、表面プラズモン共鳴を用いて検出される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記標識化ｃＡＭＰが、トリチウムで標識されている請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記結合部位が、天然ヒトｃＡＰＫにおける部位のＫDに対して３００％未満のＫDで、ｃＡＭＰと結合可能である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記結合部位が、天然ヒトｃＡＰＫにおける部位のＫDに対して１１０％未満のＫDで、ｃＡＭＰと結合可能である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｃＡＭＰ分析用のキットであって、前記キットが、ｃＡＭＰに結合可能なポリペプチドの第１結合剤、任意に標識化ｃＡＭＰ、および、任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むポリペプチドのｃＡＭＰ結合剤、および前記結合剤を含む組成物ならびにアイテム。
【請求項１２】
ヨウ素-１２５により８位が標識化されたｃＡＭＰおよびその組成物。
【請求項１３】
ｃＡＭＰの分析方法における、ヨウ素-１２５により８位が標識化されたｃＡＭＰの使用。
【請求項１４】
ｃＡＭＰの分析方法における、基質表面に８位で結合したｃＡＭＰの使用。
【請求項１５】
環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析方法であり、サンプルに、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体に結合可能なポリペプチドの結合剤、および、任意に前記結合剤に結合可能な標識化競争種を接触させる工程、および、前記結合剤と、前記環状ヌクレオチドもしくは環状ヌクレオチド類似体または前記競争種とのコンジュゲートを検出する工程を含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１６】
環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析用キットであり、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体に結合可能なポリヌクレオチドの第１結合剤、任意に、前記結合剤と結合可能な標識化競争種、および任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
試料中のｃＡＭＰを分析する方法であって、未知含有量のｃＡＭＰを含む試料に、ポリペプチドのｃＡＭＰ結合剤および任意に標識化ｃＡＭＰを接触させる工程、および、ｃＡＭＰまたは標識化ｃＡＭＰと前記結合剤とのコンジュゲートを検出する工程を含み、前記結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記結合剤が、機能しない（disabled）Ａ-結合部位を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記結合部位が、ＲＩα Ｂ-部位である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記標識化ｃＡＭＰが、ヨウ素-１２５により８位が標識されている請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記標識化ｃＡＭＰが、８位において基質表面に結合する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ｃＡＭＰコンジュゲートが、表面プラズモン共鳴を用いて検出される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記標識化ｃＡＭＰが、トリチウムで標識されている請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記結合部位が、天然ヒトｃＡＰＫにおける部位のＫDに対して３００％未満のＫDで、ｃＡＭＰと結合可能である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記結合部位が、天然ヒトｃＡＰＫにおける部位のＫDに対して１１０％未満のＫDで、ｃＡＭＰと結合可能である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｃＡＭＰ分析用のキットであって、前記キットが、ｃＡＭＰに結合可能なポリペプチドの第１結合剤、任意に標識化ｃＡＭＰ、および、任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が、機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むポリペプチドのｃＡＭＰ結合剤、および前記結合剤を含む組成物ならびにアイテム。
【請求項１２】
ヨウ素-１２５により８位が標識化されたｃＡＭＰおよびその組成物。
【請求項１３】
ｃＡＭＰの分析方法における、ヨウ素-１２５により８位が標識化されたｃＡＭＰの使用。
【請求項１４】
ｃＡＭＰの分析方法における、基質表面に８位で結合したｃＡＭＰの使用。
【請求項１５】
環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析方法であり、サンプルに、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体に結合可能なポリペプチドの結合剤、および、任意に前記結合剤に結合可能な標識化競争種を接触させる工程、および、前記結合剤と、前記環状ヌクレオチドもしくは環状ヌクレオチド類似体または前記競争種とのコンジュゲートを検出する工程を含み、前記結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１６】
環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体の分析用キットであり、前記環状ヌクレオチドまたは環状ヌクレオチド類似体に結合可能なポリヌクレオチドの第１結合剤、任意に、前記結合剤と結合可能な標識化競争種、および任意に第２結合剤を含み、前記第１結合剤が機能性ｃＡＰＫ ｃＡＭＰ Ｂ-結合部位のみを含むことを特徴とするキット。
【公表番号】特表２００６−５０００２１（Ｐ２００６−５０００２１Ａ）
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３７３０３（Ｐ２００４−５３７３０３）
【出願日】平成１５年９月２２日（２００３．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４０４４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０９４
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５１０４９２８）キン セラピューティクス エーエス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２２日（２００３．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４０４４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０９４
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５１０４９２８）キン セラピューティクス エーエス (1)
【Ｆターム（参考）】
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