ｃＤＮＡにコードされるＯＲＦの効率的な組換え方法、並びにそれに用いる鋳型ベクター、トラップベクター及びプライマー
本発明は、従来の制限酵素によるＤＮＡ領域（又は遺伝子）の切り出し、又はＰＣＲによるＤＮＡ領域の増幅にみられる上記の問題点を解決することを目的とする。本発明は、相同組換え反応を利用し、標的ＯＲＦ、例えば、蛋白質をコードしているような標的ＯＲＦであって、特に、ｃＤＮＡ中の数千ｂｐにも及ぶ長鎖ＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングする方法、及びそれに用いる各種ベクター等の手段を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ｃＤＮＡにコードされるＯＲＦの効率的な組換え方法、並びにそれに用いる鋳型ベクター、トラップベクター及びプライマー等に関する。
【背景技術】
遺伝子のクローニングは特定遺伝子又はＤＮＡを分離・増幅させるための手段として、遺伝子研究に必須の技術である。特に、ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、２００１年２月にヒトゲノムドラフト配列が公開された今日、次の大きな課題の一つである「ファンクショナル・ゲノミクス」とも呼ばれるような、ゲノムに含まれる遺伝子の機能を解析する研究において、数千ｂｐに達する大きな塩基配列を有する遺伝子を正確にクローニングすることが非常に重要な課題となっている。
従来、遺伝子のクローニングにおいては、目的遺伝子を含む断片を適当な制限酵素で切断し、その断片を同じく制限酵素で切断したプラスミドベクター及びλバクテリオファージ由来のコスミドベクター、バクテリオファージＰ１ベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の適当なクローニングベクターに挿入して組換えＤＮＡ分子（組換えベクター）を作成し、この組換えＤＮＡ分子を大腸菌等の細菌、ファージ等の宿主を利用して増殖させて大量の組換えＤＮＡ分子を得ていた。
しかしながら、この方法ではクローニングの対象となる遺伝子（標的ＤＮＡ領域）を含む断片を適切に切り出す為に適当な位置に制限酵素部位が存在している必要があり、更に、制限酵素で切り出した断片をクローニングベクターに挿入する前にそれらを精製することが必要である。その為に、数千ｂｐに達する大きな塩基配列を有する遺伝子をクローニングすることは技術的に困難であった。
或いは、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成を利用し、既知のアミノ酸配列又は塩基配列に基づき設計されたプライマーを用いて試験管内反応であるＰＣＲと呼ばれる方法によって、目的とする遺伝子等のＤＮＡ配列が大量得られるようになっている。
しかしながら、このＰＣＲにおいては、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成に際して、４００〜５０００塩基に一つの割合で読み違いが起こるといわれ、その結果、増幅された遺伝子配列の正確性・再現性に問題がある。
最近、このような問題点を解決する技術として、下記の非特許文献１及び非特許文献２に記載されたような、相同組換えの原理を利用した新たな遺伝子クローニング方法が提案された。
【非特許文献１】 Ｙｏｕｍｉｎｇ Ｚｈａｎｇ他著、ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１８，”ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，２０００，ｐｐ．１３１４−１３１７
【非特許文献２】Ｊｏｅｐ Ｐ．Ｐ．Ｍｕｙｒｅｒｓ他著、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．２６，“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｎｅｗ ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ”，ｐｐ．３２５−３３１．
本発明は、従来の制限酵素によるＤＮＡ領域（又は遺伝子）の切り出し、又はＰＣＲによるＤＮＡ領域の増幅にみられる上記の問題点を解決することを目的とする。即ち、本発明においては、相同組換え反応を利用し、標的ＯＲＦ、例えば、蛋白質をコードしているような標的ＯＲＦ（遺伝子）であって、特に、ｃＤＮＡ中の数千ｂｐにも及ぶ長鎖ＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングする方法、及びそれに用いる各種ベクター等の手段を提供することを目的とする。
【発明の開示】
即ち、本発明は第一の態様として、複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、第一プライマー結合配列、第二プライマー結合配列及び、第一及び第二のプライマー結合配列に挟まれた自殺遺伝子を含むことを特徴とする、トラップベクター用鋳型ベクターに係る。
本発明は第二の態様として、標的ＯＲＦの５’末端配列のアンチセンス配列及びその３’側に結合した第一のプライマー結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、該ＯＲＦの３’末端配列のセンス配列及びその３’側に結合した第二のプライマー結合配列のセンス配列から成る第二プライマーから成る、トラップベクター作成用ＰＣＲプライマーに係る。
本発明は第三の態様として、上記トラップベクター用鋳型ベクター及びＰＣＲプライマーを含むトラップベクター作成用キット、並びに、該トラップベクター作成用キットを用いてＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成する方法に係る。
更に、第四の態様として、上記トラップベクターと標的ＯＲＦのとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦをトラップベクター内に含むクローニングベクターを作成する方法に係る。
更に、第五の態様として、上記クローニング法により得られたクローニングベクターに係る。
更に、第六の態様として、上記クローニングベクターを増殖させることから成る、標的ＯＲＦのクローニング法に係る。
又、第七の態様として、こうしてクローニングされた標的ＯＲＦにコードされる遺伝子自体に係る。
【図面の簡単な説明】
図１はａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物の構造を示す。
図２は本発明の相同組換えを利用した標的ＯＲＦを含むクローニングベクターを作成する各工程のスキームを示す。
図３は図２の続きであって、本発明の相同組換えを利用した標的ＯＲＦを含むクローニングベクターを作成する各工程のスキームを示す。
図４はＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の試験管内転写翻訳反応産物（約２１０ｋＤａバンド）を確認する電気泳動の結果を示す写真である。
図５は本発明のＯＲＦＴ ｔｒａｐ法で得られたクローンを発現させた培養細胞から得た蛋白質を抗ＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロッティング解析して得られた写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の第一の態様であるトラップベクター用鋳型ベクターにおいて、「複製起点」は鋳型ベクター及びそれから作成されるトラップベクターが宿主内で複製される為に必要な配列であり、使用する宿主に応じて当業者に周知の任意の配列を選択することが出来る。「薬物耐性遺伝子」とは、この遺伝子を含むベクターを適当な選択培地で増殖可能とさせる機能を有する任意の配列であり、例えば、カナマイシン、アンピシリン、及びクロラムフェニコールのような抗生物質に対する耐性遺伝子を挙げることが出来る。
本明細書において、「第一プライマー結合配列」及び「第二プライマー結合配列」は、夫々、本発明の第一プライマー及び第二プライマーと相補的に結合し、ＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成するために必要な配列を意味する。従って、このような配列はプライマーと相補的な結合を形成することが出来る配列であれば特に制限はないが、その好適例として、例えば、第一プライマー結合配列が真核生物の翻訳開始コドンを含むコザックコンセンサス配列の少なくとも一部を含むことによって、最終的にクローニングされた標的ＯＲＦを真核細胞内で翻訳させることが可能となる。更に、このコザックコンセンサス配列の５’上流側の適当な位置（例えば、開始コドンから３〜１０塩基離れた位置）に大腸菌におけるリボソーム結合部位であるシャイン・ダルガーノ配列を含むことによって、ＯＲＦ領域を大腸菌内で翻訳させることも可能となる。
一方、第二プライマー結合配列にはＴＧＮ又はＴＡＮ（ＮはＧ，Ａ，Ｔ又はＣ）配列が含まれていることが好ましい。終止コドンであるＴＧＡ、ＴＡＡ又はＴＡＧの配列を含む第二プライマー結合配列を使用した場合には、標的ＯＲＦのみが蛋白質として翻訳されるトラップベクター（Ｎａｔｉｖｅ型）が得られ、又、ＴＧＴ等のその他の配列を含む場合には、この部分がリードスルーされてその後ろに更に適当なＯＲＦが続く場合には融合蛋白質として翻訳されるトラップベクター（Ｆｕｓｉｏｎ型）が得られる。従って、例えば、標的ＯＲＦの下流に、適当なタグペプチド（６×Ｈｉｓ，ＦＬＡＧ，及びＨＡ等）をコードする塩基配列を結合させることによって、標的ＯＲＦがコードする蛋白質とタグペプチドとの融合蛋白質が発現され、タグペプチドに対する抗体又はアフィニティクロマトグラフィ等を利用してこれらを容易に精製したり、又は培養細胞内で発現ないし認識させ細胞内での局在などを解析することが出来る。上記各配列を含む２種類の第二プライマー結合配列をミックスプライマーとして合成して使用することにより、同時にＮａｔｉｖｅ型及びＦｕｓｉｏｎ型のトラップベクターを得ることが出来る。最終的に得られる２種類のクローニングベクターは、ＴＧＮ又はＴＡＮ配列を含む制限酵素部位を更に含ませることによって、その制限酵素部位で切断することにより、この両方の型のクローンを容易に同定・分離することが出来る。この制限酵素部位に特に制限はなく、終止コドンとの１〜２塩基の置換によって得られるものが好ましい。例えば、Ｘｂａｌ，ＳｒａＢＩ，ＢｃｌＩ，ＦｓｐＩ，ＭｓｃＩ，ＮｒｕＩ，及びＢｓｐＨＩ等を挙げることが出来る。
プライマーとの結合が特異的に行われる限り、第一プライマー結合配列及び第二のプライマー結合配列の塩基配列の数に特に制限はないが、少なくとも５個の塩基から成り、より好ましくは７〜２５塩基から成り、第一プライマー結合配列はコザックコンセンサス配列及びシャイン・ダルガーノ配列の少なくとも一部を含むことが好ましい。
第一及び第二のプライマー結合配列に挾まれた「自殺遺伝子」は、この遺伝子を含むトラップベクター用鋳型ベクターで形質転換された宿主細胞を増殖させないようにする為に使用するものであり、当業者に周知の任意の遺伝子、例えば、ｃｃｄＢ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏ．１４８，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ｃｃｄＢ ｋｉｌｌｅｒ ｇｅｎｅ，ｐｐ．７１−７４）等を挙げることが出来る。
更に、本発明のトラップベクター用鋳型ベクターにおいて、第一及び第二のプライマー結合配列の間に更に第一の薬物耐性遺伝子とは別の種類の第二の薬物耐性遺伝子を挟むことによって、トラップベクター用鋳型ベクターの調製を容易に行うことが出来る。
本発明のトラップベクター用鋳型ベクターは、当業者であれば、遺伝子工学において公知の手段で容易に作成することが出来る。即ち、当業者に公知の適当な大腸菌のプラスミドベクター又はファージ由来のベクターから出発して本発明のトラップベクター用鋳型ベクターを作成することが出来る。或いは、制限酵素、ＰＣＲ、又はＧａｔｅｗａｙ（商標）テクノロジーを利用して本発明のトラップベクター用鋳型ベクターを作成することも可能である。
例えば、以下の実施例に示すように、λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて本発明のトラップベクター用鋳型ベクターを作成することが出来る。
この場合には、複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、並びに、ａｔｔＰ１及びａｔｔＰ２領域を有する適当な出発ベクターと、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２領域の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列として機能する配列（例えば、コザックコンセンサス配列の少なくとも一部、シャイン・ダルガーノ配列の少なくとも一部、ＴＧＮ又はＴＡＮ等を含む塩基配列断片）との間でλファージの部位特異的組換え反応であるＢＰ反応を行わせ、更に、第二の薬物耐性遺伝子と自殺遺伝子をａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に制限酵素処理を用いて挿入することにより、ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含むトラップベクター用鋳型ベクターを作成することが出来る。尚、上記塩基配列断片は、例えば、ＰＣＲ等の当業者に公知の適当な方法で作成することが出来る。
本発明のトラップベクター作成用ＰＣＲプライマーとして、標的ＯＲＦの５’末端配列のアンチセンス配列及びその３’側に結合した第一のプライマー結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、該標的ＯＲＦの３’末端配列のセンス配列及びその３’側に結合した第二のプライマー結合配列のセンス配列から成る第二プライマーを使用する。ＰＣＲ反応で得られるトラップベクターと標的ＱＲＦとの間で相同組換え反応が有意に生起し、その結果、該標的ＯＲＦをトラップベクター内に正確かつ効率的に取り込むことができる限り、標的ＯＲＦの５’末端配列及び３’末端配列の塩基の数に特に制限はない。通常、夫々、少なくとも１０個の塩基を有することが好ましく、夫々、２５個〜６０個程度の塩基を有していることが更に好ましい。
鋳型として上記トラップベクター用鋳型ベクター及び上記ＰＣＲプライマーを含むキット使用してＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成することができる。ＰＣＲ自体は当該技術分野において周知の技術であり、ＰＣＲの条件など当業者が適宜選択して容易に実施することが出来る。尚、該キットには緩衝液、ポリメラーゼ等のその他のＰＣＲに必要な試薬類が適宜含むことが出来る。
こうして作成された直鎖状のトラップベクターの両端には、該標的ＯＲＦの５’末端配列及び該標的ＯＲＦの３’末端配列があるので、このトラップベクターと標的ＯＲＦとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦのみをトラップベクター内に取り込み、その結果、クローニングベクターを作成することが出来る。通常の発現系においては、ＯＲＦ領域の上流及び下流には非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在し、ＯＲＦ領域が蛋白質に翻訳される際にこのＵＴＲが様々な影饗を及ぼし、蛋白質発現の妨げとなる場合が知られている。これに対して、本発明で作成したクローニングベクターに含まれる標的ＯＲＦの上流及び下流には不要な非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在しないようにすることが可能であり、各発現系で発現する際に上記のような問題が回避することができる。
本発明において、標的ＯＲＦは任意の形態で提供することができる。例えば、標的ＯＲＦはゲノムの一部であってもよいし、又は、プラスミドベクター、λバクテリオファージ由来のコスミドベクター、バクテリオファージＰ１ベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の各種クローニングベクターに挿入されたｃＤＮＡの状態で提供することが出来る。或いは、合成されたＤＮＡの一部でも良い。
標的ＯＲＦには蛋白質の遺伝情報をコードする遺伝子が含まれている可能性が高い。本発明において、好ましい標的ＯＲＦはベクターに含有されたｃＤＮＡであり、特に、数千ｂｐ以上で一万数千ｂｐにも及ぶ長さの塩基を有する長鎖ｃＤＮＡである標的ＯＲＦを有利にクローニングすることが出来る。
相同組換え反応自体は当業者に公知である。具体的には、例えば、エレクトロポレーション等の当業者に周知の適当な方法を用いて、トラップベクターとＯＲＦ領域領域を含有するベクターで細菌を共形質転換し、該細菌内で相同組換え反応を行わせることが出来る。相同組換え反応において、ＲｅｃＢＣＤを利用するとその強力なエクソヌクレアーゼ活性により直鎖状ＤＮＡ断片が消化されてしまう虞があるために、ＲｅｃＥ及びＲｅｃＴ酵素による相同組換え反応が好ましい。
このようにして形質転換した細菌を適当な温度及び時間の条件下、例えば、３７℃で１〜数時間程度培養することによって、再生コロニーを得ることができる。こうして得られた再生コロニーの一部を第一の薬物耐性遺伝子に対応する薬物を含む適当な培地中で培養することによって、本発明のクローニングベクターを含む細菌を増殖させることにより、標的ＯＲＦのクローニングを行うことが出来る。又、上記の共形質転換に使用するコンピテント細胞の調製時において、集菌時の濁度（波長６００ｎｍ）を通常の値（約０．５−０．６）に比べて低め（約０．３−０．４）に設定することよって、再生コロニー数がより多く得られる。
従って、本発明において、相同組換え反応により標的ＯＲＦを含むクローニングベクターを作成する際に使用する細菌としては、このような相同組換え活性の高い大腸菌等の細菌が好ましい。このような相同組換え活性の高い大腸菌の例として、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴを発現するｓｂｃＡ株（Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲｅｃＥ ａｎｄ ＲｅｃＦ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４９，４５３−４６２；Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，Ｋａｎｅ，Ｍ．Ｆ．＆ Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲｅｃＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＲｅｃＥ ｒｅｇｉｏｎ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，２７７−２８７）、具体的には、ＪＣ８６７９及びＪＣ９６０４等を挙げることが出来る。更に、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ遺伝子を有するプラスミドで適当な大腸菌株を形質転換し、それを利用することも可能である。このようにして形質転換して得られた相同組換え活性の高い大腸菌の幾つかの例が、前記非特許文献１及び２に記載されている。
このように、本発明のクローニングベクターを適当な宿主系で増殖させることにより、標的ＯＲＦのクローニングを行うことが出来る。従って、本発明のクローニング法では、制限酵素を使用してＤＮＡをクローニングする従来の方法とは異なり、予め標的ＯＲＦを含むＤＮＡ等を精製・単離する必要がなく、又、大腸菌体内の複製メカニズムを利用して標的ＯＲＦを増幅するので、従来のＰＣＲによる増幅に見られるＴａｑポリメラーゼによる塩基配列の変異が発生する可能性がない。
更に、既に記載したように、λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて作成された、ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含むトラップベクター用鋳型ベクターを用いた場合には、本発明のクローニングベクターはＧａｔｅｗａｙ（商標）テクノロジー（クローニング技術）におけるエントリークローンとして機能することが出来る。このＧａｔｅｗａｙテクノロジーにおいては、エントリークローンと各種デスティネーションベクターとの間のλファージの部位特異的組換え反応であるＬＲ反応によって、標的ＯＲＦを維持しながら、所望の各発現系に対するプロモーター、タグ等に連結した発現クローンがハイスループットに得られる。
尚、このようなＧａｔｅｗａｙテクノロジーで使用するエントリークローンとしての機能は持たないが、本発明のトラップベクター用鋳型ベクターの適当な位置にプロモーター等の転写調節配列を予め挿入させておくことにより、本発明のクローニングベクターはそのプロモーター等に応じた発現系で機能する発現ベクターとして直ちに使用することが出来る。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。実施例における各種遺伝子操作は、上記の「分子生物学の最新プロトコール」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））等に記載されている当業者に周知の方法に従った。
尚、図に以下の実施例に記載する各工程のスキーム（１）〜（７）を示す。
【実施例１】
（１）ａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の作成
ＰＣＲは５０μｌの容量（５μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ），５μｌの１０ｘＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ），１μｌのＰ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ），１μｌのＰ２（１００ｐｍｏｌ／ｕｌ），０．５μｌ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ），３７．５μｌのＤＤＷ）でおこなった。ＰＣＲ反応は、９４℃ ３ｍｉｎで変性後、９４℃ １５ｓｅｃ変性、３０℃ ３０ｓｅｃアニーリング、６８℃ １５ｓｅｃ伸長を１０ｃｙｃｌｅ行い、続けて９４℃ １５ｓｅｃ変性、５５℃ ３０ｓｅｃアニーリング、６８℃ １５ｓｅｃ伸長を２０ｃｙｃｌｅ行い、４℃で保冷した。こうして得られたａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物（図１の（１）で示される配列）を含むＰＣＲ溶液の精製は、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用い、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出した。
（２）ｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の作成
ＢＰ反応により、ａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ２２１ドナーベクター（インビトロジェン社）に挿入した。反応は１０μｌの容量（５μｌのａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物１μｌのｐＤＯＮＲ２０１（１５０ｎｇ／μｌ），２μｌの５ｘＢＰｂｕｆｆｅｒ，２μｌのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）でおこなった。室温で１ｈｒ放置した後、１μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて３７℃で１０ｍｉｎ保温した。１μｌのＢＰ反応液と２５μｌのＤＨ５αカルシウム法用コンピテントセル（インビトロジェン社ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＤＨ５α）を混合した後、氷上で３０ｍｉｎ放置した。４２℃で３０ｓｅｃヒートショックを行った後、氷上で２ｍｉｎ冷却した。ＳＯＣを２００μｌ加え３７℃で１ｈｒ培養し、１０μｌを５０μｇ／ｍｌカナマイシンプレートに塗布し８７個の再生コロニーを得た。コロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）した後、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用してｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物を７５μｌ（１１９ｎｇ／μｌ）得た。
（３）及び（４）トラップベクター用鋳型ベクター（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ Ｔｒａｐ ｖｅｃｔｏｒ）の作成
ｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物のＮｏｔＩサイトにｃｃｄ遺伝子を導入した。ｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物を５０μｌの容量（４３μｌのｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ，２μｌのＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ），５μｌのＨｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ））でＮｏｔＩ消化（３７℃，３ｈｒ）した後、ＰＣＩ処理（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで処理）し、エタノール沈澱を行った。これを１００μｌの容量（８８μｌのＤＮＡ溶液，１０μｌの１０ｘＡＰｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ），２μｌのＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ））で脱リン酸化処理（６５℃，３０ｍｉｎ）し、ＰＣＩ処理した後３０μｌのＴＥに溶解した。両端にＮｏｔＩサイトを付加したＣｍｒｃｃｄ断片（ｐＤＯＮＲ２０１の８４３ｂｐ−２６１７ｂｐをＮｏｔＩサイト付きＰＣＲプライマーで増幅したもの）を準備した。これらを８μｌの容量（０．５μｌのｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔのＮｏｔＩ消化産物（脱リン酸化処理）と２．５μｌのＮｏｔＩサイトを付加したＣｍｒｃｃｄ断片，２μｌの２ｘＬｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社ｐＧＥＭＴ−Ｅ Ｋｉｔ），１μｌのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭＴ−Ｅ Ｋｉｔ））でｌｉｇａｔｉｏｎ（室温，３．５ｈｒ）した。このｌｉｇａｔｉｏｎ液１μｌと１０μｌのＤＢ３．１カルシウム法用コンピテントセル（インビトロジェン社ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＤＢ３．１ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ）を混合し、氷上に３０ｍｉｎ保冷後、４２℃で４５ｓｅｃヒートショックを行い、氷上で２ｍｉｎ冷却した。ＳＯＣを１００μｌ加え３７℃で３０ｍｉｎ培養した後、１００μｌを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むプレートに塗布した。再生したコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２ｍｌのＬＢ液体培地中で振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）し、ＢＲＬ社のｋｉｔを使用してプラスミドを調製した。結果、トラップベクター用鋳型ベクターを７５μｌ（３６７ｎｇ／μｌ）得た。
（５）及び（６）トラップベクター（Ｔｒａｐ ｖｅｃｔｏｒ）の作成
ミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子を含むクローンｈｇ００２９５からそのＯＲＦをサブクローニングするためのトラップベクターをＰＣＲにより作成した。ＰＣＲは５０μｌの容量（５μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ），５μｌの１０ｘＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ），５μｌのＰ３（１０ｐｍｏｌ／μｌ），５μｌのＰ４（１０ｐｍｏｌ／μｌ），０．５μｌ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ），２４．５μｌのＤＤＷ）でおこなった。ＰＣＲ反応は、９４℃ ５ｍｉｎで変性後、９４℃ ３０ｓｅｃ変性、４０℃ ３０ｓｅｃアニーリング、７２℃ ２ｍｉｎ伸長を５ｃｙｃｌｅ行い、続けて９４℃ ３０ｓｅｃ変性、５５℃ ３０ｓｅｃアニーリング、７２℃２ｍｉｎ伸長を２０ｃｙｃｌｅ行い、４℃で保冷した。トラップベクターを含むＰＣＲ溶液の精製は、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用い５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出した。
尚、ＰＣＲに用いた第一プライマー（Ｐ３）及び第二プライマー（Ｐ４）の塩基配列は下記の通りであり、その構成は図３中、（５）に示した。
（下線部は、Ｐ３に含まれるミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の５’末端配列のアンチセンス配列を示す）
（下線部は、Ｐ４に含まれるミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の３’末端配列のセンス配列を示す）
（７）ｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１の作成
大腸菌内の相同組み換え反応により、ミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子含むクローンｈｇ００２９５からそのＯＲＦをＧａｔｅｗａｙシステムのエントリーベクターにサブクローニングしたｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１（エントリークローン）を得た。２μｌの滅菌水に溶解した５μｇのクローンｈｇ００２９５のＮｏｔＩ消化物と、上記で作成した５００ｎｇのｈｇ００２９５用のトラップベクターを、２０μｌの大腸菌ＪＣ８６７９株（ヒューマンサイエンス研究資源バンクから分譲（登録番号：ＹＧ−ＨＴ０１７））に、エレクトロポーレーション法（ＢｉｏＲａｄ社製Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｕｌｓｅｒ １．６７ｋｖ，５．０ｍｓｅｃ，１ｍｍ ｃｕｖｅｔｔｅ）で形質転換した。２００μｌのＳＯＣを加え、培養（３７℃，１ｈｒ）した後、１００μｌを５０μｌ／ｍｌカナマイシンプレートに塗布し、３００個余りの再生コロニーを得た。１０個のコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）した後、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用してプラスミドを調製した。ＸｂａＩ消化を行った結果、４個がＸｂａＩ消化され６個がＸｂａＩ消化できなかった。これらのクローンに関してはＯＲＦの末端とベクターの境界領域をチェックすることにより、ＸｂａＩ消化されたクローンは、Ｆｕｓｉｏｎ型、ＸｂａＩ消化されなかったものは、Ｎａｔｉｖｅ型であることが分かった。６個のＮａｔｉｖｅ型のクローンの一つをｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１（２７９ｎｇ／μｌ）とした。
ｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の作成
ＬＲ反応によりｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１のｈｇ００２９５のＯＲＦ部分をデスティネーション（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターであるｐＴ７ＤＥＳＴ（ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２（インビトロジェン社）のＮｒｕＩ−ＮｃｏＩサイトをｐＤＥＳＴ２４（インビトロジェン社）のＮｒｕＩ−ＮｃｏＩサイトに変換したもの）に移した。ＬＲ反応は、２０μｌの系（１μｌのｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１（２７９ｎｇ／μｌ），２μｌのｐＴ７ＤＥＳＴのＥｃｏＲ消化物（２０ｎｇ／μｌ），４μｌの５ｘＬＲ Ｂｕｆｆｅｒ，９ｕｌの滅菌水，４μｌのＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ）で室温で一時間行った。その後、２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて３７℃で１０ｍｉｎ保温した。１μｌのＬＲ反応液と５０ｕｌのＤＨ５αカルシウム法用コンピテントセル（インビトロジェン社ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＤＨ５α）を混合した後、氷上で３０ｍｉｎ放置した。４２℃で３０ｓｅｃヒートショックを行った後、氷上で２ｍｉｎ冷却した。ＳＯＣを４５０μｌ加え３７℃で１ｈｒ培養し、２００μｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンプレートに塗布し３００個余りの再生コロニーを得た。コロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）した後、ＢＲＬ社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して発現クローンであるｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１を７５μｌ（１２０ｎｇ／μｌ）得た。このプラスミド溶液をＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（ＰＣＩ）処理した後、ＥｔＯＨ沈澱を行い１０μｌ（２０８ｎｇ／μｌ）のヌクレアーゼフリーウォーターに溶解した。
ｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の試験管内転写翻訳反応産物の確認
試験管内転写翻訳反応によりｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の産物を確認した。プロメガ社のＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いた。転写翻訳反応は、５０μｌの系（４０μｌのＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，１μｌの１ｍＭ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，５μｌのｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１（２０８ｎｇ／μｌ），２μｌのＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（プロメガ社），２μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）で３０℃，９０ｍｉｎ行った。続いて、レムリのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験管内転写翻訳反応産物を確認した。２μｌの転写翻訳産物と３μｌのリン酸バッファー液と１μｌの６ｘサンプルバッファーと０．１μｌの２−メルカプトエタノール（１４．４Ｍ）を混合した泳動サンプルを、３分間沸騰水中で変性し、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（８．５ｃｍｘ８．５ｃｍ）で、電気泳動（４０ｍＡで１時間）した。マーカーは、バイオラド社のカレイドスコープＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓを５μｌ泳動した。ゲルを無蛍光ガラス板にのせた後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ５９５（モレキュラーダイナミクス社、検出条件ＰＭＴ Ｖｏｌｔａｇｅ ７００，Ｅｘｉｔａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ ４８８ｎｍ，Ｅｍ．Ｆｉｌｔｅｒ ５３０ＤＦ３０）を用いていて約２１０ｋＤａバンドを検出した（図４）。この結果は、ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の計算上の分子量は、２１０，１３０Ｄａによく一致していた。
【実施例２】
実施例１と同様にして、更に１０種の遺伝子を本発明方法によってクローニングした。その結果を以下の表１にまとめて示す。表１の結果から明らかなように、約７，０００〜１万数千の範囲の非常に多数の塩基数から成るＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングすることに成功した。
【実施例３】
培養細胞での発現、完全長蛋白質の発現
実施例１と同様の方法で、トラップベクター用鋳型ベクター及び以下の表２に示したプライマーを使用して、夫々、ＯＬ−プロトカドヘリン（ＯＬ−ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ：Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３７８２１）及びナトリウムチャンネルβサブユニット（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ β ｓｕｂｕｎｉｔ：Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３２９８４）のＯＲＦをサブクローニングするためのトラップベクターをＰＣＲにより作成した。更に、大腸菌内の組換え反応により、上記各遺伝子を含むクローン（ｈｋ０８１３６）及びクローン（ｈｊ０００８１）からそれらのＯＲＦをＧａｔｅｗａｙシステムのエントリーベクターにサブクローニングしエントリークローンである、（ｐＥＮＴＲＡ１４００Ｆ１）及び（ｐＥＮＴＲＡ１１５８Ｆ１）を得た。
更に実施例１と同様に、上記の各エントリークローンに含まれる夫々の遺伝子のＯＲＦをＬＲ反応によりｐｃＤＮＡＤＥＳＴ４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ、ＣＭＶプロモーターを有し、目的の蛋白質のＣ末にＧＦＰを融合させた蛋白質を生成する）に移した。プラスミドの希釈液２０μｌ（４μｇ）に２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を加えた。１０μｌのカチオン脂質トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを混ぜ合わせた。プラスミドとトランスフェクション試薬の溶液を混合し、室温に３０分間置いた後、６ウェルプレート中で８０−９０％コンフルエントになったＦｌｐ Ｉｎ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）にふりかけトランスフェクションした。
トランスフェクションから３日後、１００μｌの４ｘＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ．）を細胞に加えることにより細胞を溶解し、ポリスマンを使って細胞液を回収した。超音波を加え（ＴＡＩＴＥＣ ＶＰ−５Ｓ型、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ１０、２０秒間）、細胞液の粘性がなくなることを確認した（ＤＮＡの断片化）。次に、８％のアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをブロッティングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）に１５分間浸した後、ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）に１００ｍＡ定電流で１時間転写した（ＢＥ−３００型、ＢＩＯＣＲＡＦＴ、ＴＯＫＹＯ、ＪＡＰＡＮ）。膜をＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ））に１０分間浸した後、ブロッキング液（１０％ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳ）に１時間浸した。ブロッキング液で５０００倍に希釈した一次抗体（ＧＦＰ抗血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）液に１時間浸した後、ＴＢＳＴで１０分間、ＴＢＳで５分間４回の洗浄をおこなった。次にブロッキング液で４０００倍に希釈した二次抗体（アルカリホスファターゼ融合抗ウサギＩｇＧ抗体、ＣＡＰＰＥＬ、Ａｕｒｏｒａ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）液に１時間浸した。ＴＢＳＴで１０分間、ＴＢＳで５分間４回の洗浄をおこなった後、基質溶液（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｕｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加え６０分間発色反応した。その結果を図５に示す。
図５のレーン１にはＯＬ−プロトカドヘリン（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３７８２１）とＧＦＰとの融合蛋白質、レーン２にはナトリウムチャンネルβサブユニット（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３２９８４）とＧＦＰとの融合蛋白質が泳動されているが、それぞれ約１４０ｋＤａおよび約５０ｋＤａの陽性バンドが確認でき、それぞれの予想された分子量である１４１，１８８Ｄａ及び５３，１４６Ｄａに一致していたため、それぞれの蛋白質とＧＦＰとの融合蛋白質の全長が発現していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
本発明によって、該標的ＯＲＦ、例えば、ベクターに含有されたｃＤＮＡであって、特に、数千ｂｐ以上を有する長鎖ＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングすることが可能となる。
本発明で作成される直鎖状のトラップベクターの両端には、該標的ＯＲＦの５’末端配列及び３’末端配列があるので、このトラップベクターと標的ＯＲＦとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦのみをトラップベクター内に取り込んだクローニングベクターを作成することが出来る。その結果、ＯＲＦ領域の上流及び下流に存在する非翻訳領域（ＵＴＲ）の転写による悪影響を回避することが出来る。
更に、本発明のクローニング法では、予め標的ＯＲＦを含むＤＮＡ等を精製・単離する必要がなく、又、標的ＯＲＦを大腸菌体内の複製メカニズムを利用して増幅するので、従来のＰＣＲによる増幅に見られる変異が発生する可能性がない。
特に、λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて作成した、ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含むトラップベクター用鋳型ベクターを用いて作成された本発明のクローニングベクターは、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー（クローニング技術）におけるエントリークローンとして機能することが出来る。このＧａｔｅｗａｙテクノロジーにおいて、エントリークローンと各種デスティネーションベクターとの間の相同組換え（ＬＲ反応）によって、標的ＯＲＦを維持しながら、所望の各種発現系に対するプロモーター、タグ等に連結した発現クローンがハイスループットに得られる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、ｃＤＮＡにコードされるＯＲＦの効率的な組換え方法、並びにそれに用いる鋳型ベクター、トラップベクター及びプライマー等に関する。
【背景技術】
遺伝子のクローニングは特定遺伝子又はＤＮＡを分離・増幅させるための手段として、遺伝子研究に必須の技術である。特に、ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、２００１年２月にヒトゲノムドラフト配列が公開された今日、次の大きな課題の一つである「ファンクショナル・ゲノミクス」とも呼ばれるような、ゲノムに含まれる遺伝子の機能を解析する研究において、数千ｂｐに達する大きな塩基配列を有する遺伝子を正確にクローニングすることが非常に重要な課題となっている。
従来、遺伝子のクローニングにおいては、目的遺伝子を含む断片を適当な制限酵素で切断し、その断片を同じく制限酵素で切断したプラスミドベクター及びλバクテリオファージ由来のコスミドベクター、バクテリオファージＰ１ベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の適当なクローニングベクターに挿入して組換えＤＮＡ分子（組換えベクター）を作成し、この組換えＤＮＡ分子を大腸菌等の細菌、ファージ等の宿主を利用して増殖させて大量の組換えＤＮＡ分子を得ていた。
しかしながら、この方法ではクローニングの対象となる遺伝子（標的ＤＮＡ領域）を含む断片を適切に切り出す為に適当な位置に制限酵素部位が存在している必要があり、更に、制限酵素で切り出した断片をクローニングベクターに挿入する前にそれらを精製することが必要である。その為に、数千ｂｐに達する大きな塩基配列を有する遺伝子をクローニングすることは技術的に困難であった。
或いは、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成を利用し、既知のアミノ酸配列又は塩基配列に基づき設計されたプライマーを用いて試験管内反応であるＰＣＲと呼ばれる方法によって、目的とする遺伝子等のＤＮＡ配列が大量得られるようになっている。
しかしながら、このＰＣＲにおいては、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成に際して、４００〜５０００塩基に一つの割合で読み違いが起こるといわれ、その結果、増幅された遺伝子配列の正確性・再現性に問題がある。
最近、このような問題点を解決する技術として、下記の非特許文献１及び非特許文献２に記載されたような、相同組換えの原理を利用した新たな遺伝子クローニング方法が提案された。
【非特許文献１】 Ｙｏｕｍｉｎｇ Ｚｈａｎｇ他著、ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１８，”ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，２０００，ｐｐ．１３１４−１３１７
【非特許文献２】Ｊｏｅｐ Ｐ．Ｐ．Ｍｕｙｒｅｒｓ他著、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．２６，“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｎｅｗ ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ”，ｐｐ．３２５−３３１．
本発明は、従来の制限酵素によるＤＮＡ領域（又は遺伝子）の切り出し、又はＰＣＲによるＤＮＡ領域の増幅にみられる上記の問題点を解決することを目的とする。即ち、本発明においては、相同組換え反応を利用し、標的ＯＲＦ、例えば、蛋白質をコードしているような標的ＯＲＦ（遺伝子）であって、特に、ｃＤＮＡ中の数千ｂｐにも及ぶ長鎖ＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングする方法、及びそれに用いる各種ベクター等の手段を提供することを目的とする。
【発明の開示】
即ち、本発明は第一の態様として、複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、第一プライマー結合配列、第二プライマー結合配列及び、第一及び第二のプライマー結合配列に挟まれた自殺遺伝子を含むことを特徴とする、トラップベクター用鋳型ベクターに係る。
本発明は第二の態様として、標的ＯＲＦの５’末端配列のアンチセンス配列及びその３’側に結合した第一のプライマー結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、該ＯＲＦの３’末端配列のセンス配列及びその３’側に結合した第二のプライマー結合配列のセンス配列から成る第二プライマーから成る、トラップベクター作成用ＰＣＲプライマーに係る。
本発明は第三の態様として、上記トラップベクター用鋳型ベクター及びＰＣＲプライマーを含むトラップベクター作成用キット、並びに、該トラップベクター作成用キットを用いてＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成する方法に係る。
更に、第四の態様として、上記トラップベクターと標的ＯＲＦのとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦをトラップベクター内に含むクローニングベクターを作成する方法に係る。
更に、第五の態様として、上記クローニング法により得られたクローニングベクターに係る。
更に、第六の態様として、上記クローニングベクターを増殖させることから成る、標的ＯＲＦのクローニング法に係る。
又、第七の態様として、こうしてクローニングされた標的ＯＲＦにコードされる遺伝子自体に係る。
【図面の簡単な説明】
図１はａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物の構造を示す。
図２は本発明の相同組換えを利用した標的ＯＲＦを含むクローニングベクターを作成する各工程のスキームを示す。
図３は図２の続きであって、本発明の相同組換えを利用した標的ＯＲＦを含むクローニングベクターを作成する各工程のスキームを示す。
図４はＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の試験管内転写翻訳反応産物（約２１０ｋＤａバンド）を確認する電気泳動の結果を示す写真である。
図５は本発明のＯＲＦＴ ｔｒａｐ法で得られたクローンを発現させた培養細胞から得た蛋白質を抗ＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロッティング解析して得られた写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の第一の態様であるトラップベクター用鋳型ベクターにおいて、「複製起点」は鋳型ベクター及びそれから作成されるトラップベクターが宿主内で複製される為に必要な配列であり、使用する宿主に応じて当業者に周知の任意の配列を選択することが出来る。「薬物耐性遺伝子」とは、この遺伝子を含むベクターを適当な選択培地で増殖可能とさせる機能を有する任意の配列であり、例えば、カナマイシン、アンピシリン、及びクロラムフェニコールのような抗生物質に対する耐性遺伝子を挙げることが出来る。
本明細書において、「第一プライマー結合配列」及び「第二プライマー結合配列」は、夫々、本発明の第一プライマー及び第二プライマーと相補的に結合し、ＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成するために必要な配列を意味する。従って、このような配列はプライマーと相補的な結合を形成することが出来る配列であれば特に制限はないが、その好適例として、例えば、第一プライマー結合配列が真核生物の翻訳開始コドンを含むコザックコンセンサス配列の少なくとも一部を含むことによって、最終的にクローニングされた標的ＯＲＦを真核細胞内で翻訳させることが可能となる。更に、このコザックコンセンサス配列の５’上流側の適当な位置（例えば、開始コドンから３〜１０塩基離れた位置）に大腸菌におけるリボソーム結合部位であるシャイン・ダルガーノ配列を含むことによって、ＯＲＦ領域を大腸菌内で翻訳させることも可能となる。
一方、第二プライマー結合配列にはＴＧＮ又はＴＡＮ（ＮはＧ，Ａ，Ｔ又はＣ）配列が含まれていることが好ましい。終止コドンであるＴＧＡ、ＴＡＡ又はＴＡＧの配列を含む第二プライマー結合配列を使用した場合には、標的ＯＲＦのみが蛋白質として翻訳されるトラップベクター（Ｎａｔｉｖｅ型）が得られ、又、ＴＧＴ等のその他の配列を含む場合には、この部分がリードスルーされてその後ろに更に適当なＯＲＦが続く場合には融合蛋白質として翻訳されるトラップベクター（Ｆｕｓｉｏｎ型）が得られる。従って、例えば、標的ＯＲＦの下流に、適当なタグペプチド（６×Ｈｉｓ，ＦＬＡＧ，及びＨＡ等）をコードする塩基配列を結合させることによって、標的ＯＲＦがコードする蛋白質とタグペプチドとの融合蛋白質が発現され、タグペプチドに対する抗体又はアフィニティクロマトグラフィ等を利用してこれらを容易に精製したり、又は培養細胞内で発現ないし認識させ細胞内での局在などを解析することが出来る。上記各配列を含む２種類の第二プライマー結合配列をミックスプライマーとして合成して使用することにより、同時にＮａｔｉｖｅ型及びＦｕｓｉｏｎ型のトラップベクターを得ることが出来る。最終的に得られる２種類のクローニングベクターは、ＴＧＮ又はＴＡＮ配列を含む制限酵素部位を更に含ませることによって、その制限酵素部位で切断することにより、この両方の型のクローンを容易に同定・分離することが出来る。この制限酵素部位に特に制限はなく、終止コドンとの１〜２塩基の置換によって得られるものが好ましい。例えば、Ｘｂａｌ，ＳｒａＢＩ，ＢｃｌＩ，ＦｓｐＩ，ＭｓｃＩ，ＮｒｕＩ，及びＢｓｐＨＩ等を挙げることが出来る。
プライマーとの結合が特異的に行われる限り、第一プライマー結合配列及び第二のプライマー結合配列の塩基配列の数に特に制限はないが、少なくとも５個の塩基から成り、より好ましくは７〜２５塩基から成り、第一プライマー結合配列はコザックコンセンサス配列及びシャイン・ダルガーノ配列の少なくとも一部を含むことが好ましい。
第一及び第二のプライマー結合配列に挾まれた「自殺遺伝子」は、この遺伝子を含むトラップベクター用鋳型ベクターで形質転換された宿主細胞を増殖させないようにする為に使用するものであり、当業者に周知の任意の遺伝子、例えば、ｃｃｄＢ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏ．１４８，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ｃｃｄＢ ｋｉｌｌｅｒ ｇｅｎｅ，ｐｐ．７１−７４）等を挙げることが出来る。
更に、本発明のトラップベクター用鋳型ベクターにおいて、第一及び第二のプライマー結合配列の間に更に第一の薬物耐性遺伝子とは別の種類の第二の薬物耐性遺伝子を挟むことによって、トラップベクター用鋳型ベクターの調製を容易に行うことが出来る。
本発明のトラップベクター用鋳型ベクターは、当業者であれば、遺伝子工学において公知の手段で容易に作成することが出来る。即ち、当業者に公知の適当な大腸菌のプラスミドベクター又はファージ由来のベクターから出発して本発明のトラップベクター用鋳型ベクターを作成することが出来る。或いは、制限酵素、ＰＣＲ、又はＧａｔｅｗａｙ（商標）テクノロジーを利用して本発明のトラップベクター用鋳型ベクターを作成することも可能である。
例えば、以下の実施例に示すように、λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて本発明のトラップベクター用鋳型ベクターを作成することが出来る。
この場合には、複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、並びに、ａｔｔＰ１及びａｔｔＰ２領域を有する適当な出発ベクターと、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２領域の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列として機能する配列（例えば、コザックコンセンサス配列の少なくとも一部、シャイン・ダルガーノ配列の少なくとも一部、ＴＧＮ又はＴＡＮ等を含む塩基配列断片）との間でλファージの部位特異的組換え反応であるＢＰ反応を行わせ、更に、第二の薬物耐性遺伝子と自殺遺伝子をａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に制限酵素処理を用いて挿入することにより、ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含むトラップベクター用鋳型ベクターを作成することが出来る。尚、上記塩基配列断片は、例えば、ＰＣＲ等の当業者に公知の適当な方法で作成することが出来る。
本発明のトラップベクター作成用ＰＣＲプライマーとして、標的ＯＲＦの５’末端配列のアンチセンス配列及びその３’側に結合した第一のプライマー結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、該標的ＯＲＦの３’末端配列のセンス配列及びその３’側に結合した第二のプライマー結合配列のセンス配列から成る第二プライマーを使用する。ＰＣＲ反応で得られるトラップベクターと標的ＱＲＦとの間で相同組換え反応が有意に生起し、その結果、該標的ＯＲＦをトラップベクター内に正確かつ効率的に取り込むことができる限り、標的ＯＲＦの５’末端配列及び３’末端配列の塩基の数に特に制限はない。通常、夫々、少なくとも１０個の塩基を有することが好ましく、夫々、２５個〜６０個程度の塩基を有していることが更に好ましい。
鋳型として上記トラップベクター用鋳型ベクター及び上記ＰＣＲプライマーを含むキット使用してＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成することができる。ＰＣＲ自体は当該技術分野において周知の技術であり、ＰＣＲの条件など当業者が適宜選択して容易に実施することが出来る。尚、該キットには緩衝液、ポリメラーゼ等のその他のＰＣＲに必要な試薬類が適宜含むことが出来る。
こうして作成された直鎖状のトラップベクターの両端には、該標的ＯＲＦの５’末端配列及び該標的ＯＲＦの３’末端配列があるので、このトラップベクターと標的ＯＲＦとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦのみをトラップベクター内に取り込み、その結果、クローニングベクターを作成することが出来る。通常の発現系においては、ＯＲＦ領域の上流及び下流には非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在し、ＯＲＦ領域が蛋白質に翻訳される際にこのＵＴＲが様々な影饗を及ぼし、蛋白質発現の妨げとなる場合が知られている。これに対して、本発明で作成したクローニングベクターに含まれる標的ＯＲＦの上流及び下流には不要な非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在しないようにすることが可能であり、各発現系で発現する際に上記のような問題が回避することができる。
本発明において、標的ＯＲＦは任意の形態で提供することができる。例えば、標的ＯＲＦはゲノムの一部であってもよいし、又は、プラスミドベクター、λバクテリオファージ由来のコスミドベクター、バクテリオファージＰ１ベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の各種クローニングベクターに挿入されたｃＤＮＡの状態で提供することが出来る。或いは、合成されたＤＮＡの一部でも良い。
標的ＯＲＦには蛋白質の遺伝情報をコードする遺伝子が含まれている可能性が高い。本発明において、好ましい標的ＯＲＦはベクターに含有されたｃＤＮＡであり、特に、数千ｂｐ以上で一万数千ｂｐにも及ぶ長さの塩基を有する長鎖ｃＤＮＡである標的ＯＲＦを有利にクローニングすることが出来る。
相同組換え反応自体は当業者に公知である。具体的には、例えば、エレクトロポレーション等の当業者に周知の適当な方法を用いて、トラップベクターとＯＲＦ領域領域を含有するベクターで細菌を共形質転換し、該細菌内で相同組換え反応を行わせることが出来る。相同組換え反応において、ＲｅｃＢＣＤを利用するとその強力なエクソヌクレアーゼ活性により直鎖状ＤＮＡ断片が消化されてしまう虞があるために、ＲｅｃＥ及びＲｅｃＴ酵素による相同組換え反応が好ましい。
このようにして形質転換した細菌を適当な温度及び時間の条件下、例えば、３７℃で１〜数時間程度培養することによって、再生コロニーを得ることができる。こうして得られた再生コロニーの一部を第一の薬物耐性遺伝子に対応する薬物を含む適当な培地中で培養することによって、本発明のクローニングベクターを含む細菌を増殖させることにより、標的ＯＲＦのクローニングを行うことが出来る。又、上記の共形質転換に使用するコンピテント細胞の調製時において、集菌時の濁度（波長６００ｎｍ）を通常の値（約０．５−０．６）に比べて低め（約０．３−０．４）に設定することよって、再生コロニー数がより多く得られる。
従って、本発明において、相同組換え反応により標的ＯＲＦを含むクローニングベクターを作成する際に使用する細菌としては、このような相同組換え活性の高い大腸菌等の細菌が好ましい。このような相同組換え活性の高い大腸菌の例として、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴを発現するｓｂｃＡ株（Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲｅｃＥ ａｎｄ ＲｅｃＦ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４９，４５３−４６２；Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，Ｋａｎｅ，Ｍ．Ｆ．＆ Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲｅｃＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＲｅｃＥ ｒｅｇｉｏｎ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５，２７７−２８７）、具体的には、ＪＣ８６７９及びＪＣ９６０４等を挙げることが出来る。更に、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ遺伝子を有するプラスミドで適当な大腸菌株を形質転換し、それを利用することも可能である。このようにして形質転換して得られた相同組換え活性の高い大腸菌の幾つかの例が、前記非特許文献１及び２に記載されている。
このように、本発明のクローニングベクターを適当な宿主系で増殖させることにより、標的ＯＲＦのクローニングを行うことが出来る。従って、本発明のクローニング法では、制限酵素を使用してＤＮＡをクローニングする従来の方法とは異なり、予め標的ＯＲＦを含むＤＮＡ等を精製・単離する必要がなく、又、大腸菌体内の複製メカニズムを利用して標的ＯＲＦを増幅するので、従来のＰＣＲによる増幅に見られるＴａｑポリメラーゼによる塩基配列の変異が発生する可能性がない。
更に、既に記載したように、λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて作成された、ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含むトラップベクター用鋳型ベクターを用いた場合には、本発明のクローニングベクターはＧａｔｅｗａｙ（商標）テクノロジー（クローニング技術）におけるエントリークローンとして機能することが出来る。このＧａｔｅｗａｙテクノロジーにおいては、エントリークローンと各種デスティネーションベクターとの間のλファージの部位特異的組換え反応であるＬＲ反応によって、標的ＯＲＦを維持しながら、所望の各発現系に対するプロモーター、タグ等に連結した発現クローンがハイスループットに得られる。
尚、このようなＧａｔｅｗａｙテクノロジーで使用するエントリークローンとしての機能は持たないが、本発明のトラップベクター用鋳型ベクターの適当な位置にプロモーター等の転写調節配列を予め挿入させておくことにより、本発明のクローニングベクターはそのプロモーター等に応じた発現系で機能する発現ベクターとして直ちに使用することが出来る。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。実施例における各種遺伝子操作は、上記の「分子生物学の最新プロトコール」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））等に記載されている当業者に周知の方法に従った。
尚、図に以下の実施例に記載する各工程のスキーム（１）〜（７）を示す。
【実施例１】
（１）ａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の作成
ＰＣＲは５０μｌの容量（５μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ），５μｌの１０ｘＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ），１μｌのＰ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ），１μｌのＰ２（１００ｐｍｏｌ／ｕｌ），０．５μｌ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ），３７．５μｌのＤＤＷ）でおこなった。ＰＣＲ反応は、９４℃ ３ｍｉｎで変性後、９４℃ １５ｓｅｃ変性、３０℃ ３０ｓｅｃアニーリング、６８℃ １５ｓｅｃ伸長を１０ｃｙｃｌｅ行い、続けて９４℃ １５ｓｅｃ変性、５５℃ ３０ｓｅｃアニーリング、６８℃ １５ｓｅｃ伸長を２０ｃｙｃｌｅ行い、４℃で保冷した。こうして得られたａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物（図１の（１）で示される配列）を含むＰＣＲ溶液の精製は、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用い、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出した。
（２）ｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の作成
ＢＰ反応により、ａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ２２１ドナーベクター（インビトロジェン社）に挿入した。反応は１０μｌの容量（５μｌのａｔｔＢ部位入りＰＣＲ産物１μｌのｐＤＯＮＲ２０１（１５０ｎｇ／μｌ），２μｌの５ｘＢＰｂｕｆｆｅｒ，２μｌのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）でおこなった。室温で１ｈｒ放置した後、１μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて３７℃で１０ｍｉｎ保温した。１μｌのＢＰ反応液と２５μｌのＤＨ５αカルシウム法用コンピテントセル（インビトロジェン社ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＤＨ５α）を混合した後、氷上で３０ｍｉｎ放置した。４２℃で３０ｓｅｃヒートショックを行った後、氷上で２ｍｉｎ冷却した。ＳＯＣを２００μｌ加え３７℃で１ｈｒ培養し、１０μｌを５０μｇ／ｍｌカナマイシンプレートに塗布し８７個の再生コロニーを得た。コロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）した後、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用してｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物を７５μｌ（１１９ｎｇ／μｌ）得た。
（３）及び（４）トラップベクター用鋳型ベクター（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ Ｔｒａｐ ｖｅｃｔｏｒ）の作成
ｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物のＮｏｔＩサイトにｃｃｄ遺伝子を導入した。ｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ産物を５０μｌの容量（４３μｌのｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ，２μｌのＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ），５μｌのＨｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ））でＮｏｔＩ消化（３７℃，３ｈｒ）した後、ＰＣＩ処理（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで処理）し、エタノール沈澱を行った。これを１００μｌの容量（８８μｌのＤＮＡ溶液，１０μｌの１０ｘＡＰｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ），２μｌのＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ））で脱リン酸化処理（６５℃，３０ｍｉｎ）し、ＰＣＩ処理した後３０μｌのＴＥに溶解した。両端にＮｏｔＩサイトを付加したＣｍｒｃｃｄ断片（ｐＤＯＮＲ２０１の８４３ｂｐ−２６１７ｂｐをＮｏｔＩサイト付きＰＣＲプライマーで増幅したもの）を準備した。これらを８μｌの容量（０．５μｌのｐＥＮＴＲ＋ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔのＮｏｔＩ消化産物（脱リン酸化処理）と２．５μｌのＮｏｔＩサイトを付加したＣｍｒｃｃｄ断片，２μｌの２ｘＬｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社ｐＧＥＭＴ−Ｅ Ｋｉｔ），１μｌのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭＴ−Ｅ Ｋｉｔ））でｌｉｇａｔｉｏｎ（室温，３．５ｈｒ）した。このｌｉｇａｔｉｏｎ液１μｌと１０μｌのＤＢ３．１カルシウム法用コンピテントセル（インビトロジェン社ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＤＢ３．１ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ）を混合し、氷上に３０ｍｉｎ保冷後、４２℃で４５ｓｅｃヒートショックを行い、氷上で２ｍｉｎ冷却した。ＳＯＣを１００μｌ加え３７℃で３０ｍｉｎ培養した後、１００μｌを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むプレートに塗布した。再生したコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２ｍｌのＬＢ液体培地中で振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）し、ＢＲＬ社のｋｉｔを使用してプラスミドを調製した。結果、トラップベクター用鋳型ベクターを７５μｌ（３６７ｎｇ／μｌ）得た。
（５）及び（６）トラップベクター（Ｔｒａｐ ｖｅｃｔｏｒ）の作成
ミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子を含むクローンｈｇ００２９５からそのＯＲＦをサブクローニングするためのトラップベクターをＰＣＲにより作成した。ＰＣＲは５０μｌの容量（５μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ），５μｌの１０ｘＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ），５μｌのＰ３（１０ｐｍｏｌ／μｌ），５μｌのＰ４（１０ｐｍｏｌ／μｌ），０．５μｌ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ），２４．５μｌのＤＤＷ）でおこなった。ＰＣＲ反応は、９４℃ ５ｍｉｎで変性後、９４℃ ３０ｓｅｃ変性、４０℃ ３０ｓｅｃアニーリング、７２℃ ２ｍｉｎ伸長を５ｃｙｃｌｅ行い、続けて９４℃ ３０ｓｅｃ変性、５５℃ ３０ｓｅｃアニーリング、７２℃２ｍｉｎ伸長を２０ｃｙｃｌｅ行い、４℃で保冷した。トラップベクターを含むＰＣＲ溶液の精製は、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用い５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶出した。
尚、ＰＣＲに用いた第一プライマー（Ｐ３）及び第二プライマー（Ｐ４）の塩基配列は下記の通りであり、その構成は図３中、（５）に示した。
（下線部は、Ｐ３に含まれるミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の５’末端配列のアンチセンス配列を示す）
（下線部は、Ｐ４に含まれるミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の３’末端配列のセンス配列を示す）
（７）ｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１の作成
大腸菌内の相同組み換え反応により、ミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子含むクローンｈｇ００２９５からそのＯＲＦをＧａｔｅｗａｙシステムのエントリーベクターにサブクローニングしたｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１（エントリークローン）を得た。２μｌの滅菌水に溶解した５μｇのクローンｈｇ００２９５のＮｏｔＩ消化物と、上記で作成した５００ｎｇのｈｇ００２９５用のトラップベクターを、２０μｌの大腸菌ＪＣ８６７９株（ヒューマンサイエンス研究資源バンクから分譲（登録番号：ＹＧ−ＨＴ０１７））に、エレクトロポーレーション法（ＢｉｏＲａｄ社製Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｕｌｓｅｒ １．６７ｋｖ，５．０ｍｓｅｃ，１ｍｍ ｃｕｖｅｔｔｅ）で形質転換した。２００μｌのＳＯＣを加え、培養（３７℃，１ｈｒ）した後、１００μｌを５０μｌ／ｍｌカナマイシンプレートに塗布し、３００個余りの再生コロニーを得た。１０個のコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）した後、インビトロジェン社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用してプラスミドを調製した。ＸｂａＩ消化を行った結果、４個がＸｂａＩ消化され６個がＸｂａＩ消化できなかった。これらのクローンに関してはＯＲＦの末端とベクターの境界領域をチェックすることにより、ＸｂａＩ消化されたクローンは、Ｆｕｓｉｏｎ型、ＸｂａＩ消化されなかったものは、Ｎａｔｉｖｅ型であることが分かった。６個のＮａｔｉｖｅ型のクローンの一つをｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１（２７９ｎｇ／μｌ）とした。
ｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の作成
ＬＲ反応によりｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１のｈｇ００２９５のＯＲＦ部分をデスティネーション（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターであるｐＴ７ＤＥＳＴ（ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２（インビトロジェン社）のＮｒｕＩ−ＮｃｏＩサイトをｐＤＥＳＴ２４（インビトロジェン社）のＮｒｕＩ−ＮｃｏＩサイトに変換したもの）に移した。ＬＲ反応は、２０μｌの系（１μｌのｐＥＮＴＲｈｇ００２９５Ｎ１（２７９ｎｇ／μｌ），２μｌのｐＴ７ＤＥＳＴのＥｃｏＲ消化物（２０ｎｇ／μｌ），４μｌの５ｘＬＲ Ｂｕｆｆｅｒ，９ｕｌの滅菌水，４μｌのＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ）で室温で一時間行った。その後、２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて３７℃で１０ｍｉｎ保温した。１μｌのＬＲ反応液と５０ｕｌのＤＨ５αカルシウム法用コンピテントセル（インビトロジェン社ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＤＨ５α）を混合した後、氷上で３０ｍｉｎ放置した。４２℃で３０ｓｅｃヒートショックを行った後、氷上で２ｍｉｎ冷却した。ＳＯＣを４５０μｌ加え３７℃で１ｈｒ培養し、２００μｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンプレートに塗布し３００個余りの再生コロニーを得た。コロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、振盪培養（３７℃，Ｏ／Ｎ）した後、ＢＲＬ社のＣｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して発現クローンであるｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１を７５μｌ（１２０ｎｇ／μｌ）得た。このプラスミド溶液をＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（ＰＣＩ）処理した後、ＥｔＯＨ沈澱を行い１０μｌ（２０８ｎｇ／μｌ）のヌクレアーゼフリーウォーターに溶解した。
ｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の試験管内転写翻訳反応産物の確認
試験管内転写翻訳反応によりｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１の産物を確認した。プロメガ社のＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いた。転写翻訳反応は、５０μｌの系（４０μｌのＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，１μｌの１ｍＭ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，５μｌのｐＴ７ＤＥＳＴｈｇ００２９５Ｎ１（２０８ｎｇ／μｌ），２μｌのＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（プロメガ社），２μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）で３０℃，９０ｍｉｎ行った。続いて、レムリのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験管内転写翻訳反応産物を確認した。２μｌの転写翻訳産物と３μｌのリン酸バッファー液と１μｌの６ｘサンプルバッファーと０．１μｌの２−メルカプトエタノール（１４．４Ｍ）を混合した泳動サンプルを、３分間沸騰水中で変性し、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（８．５ｃｍｘ８．５ｃｍ）で、電気泳動（４０ｍＡで１時間）した。マーカーは、バイオラド社のカレイドスコープＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓを５μｌ泳動した。ゲルを無蛍光ガラス板にのせた後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ５９５（モレキュラーダイナミクス社、検出条件ＰＭＴ Ｖｏｌｔａｇｅ ７００，Ｅｘｉｔａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ ４８８ｎｍ，Ｅｍ．Ｆｉｌｔｅｒ ５３０ＤＦ３０）を用いていて約２１０ｋＤａバンドを検出した（図４）。この結果は、ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の計算上の分子量は、２１０，１３０Ｄａによく一致していた。
【実施例２】
実施例１と同様にして、更に１０種の遺伝子を本発明方法によってクローニングした。その結果を以下の表１にまとめて示す。表１の結果から明らかなように、約７，０００〜１万数千の範囲の非常に多数の塩基数から成るＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングすることに成功した。
【実施例３】
培養細胞での発現、完全長蛋白質の発現
実施例１と同様の方法で、トラップベクター用鋳型ベクター及び以下の表２に示したプライマーを使用して、夫々、ＯＬ−プロトカドヘリン（ＯＬ−ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ：Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３７８２１）及びナトリウムチャンネルβサブユニット（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ β ｓｕｂｕｎｉｔ：Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３２９８４）のＯＲＦをサブクローニングするためのトラップベクターをＰＣＲにより作成した。更に、大腸菌内の組換え反応により、上記各遺伝子を含むクローン（ｈｋ０８１３６）及びクローン（ｈｊ０００８１）からそれらのＯＲＦをＧａｔｅｗａｙシステムのエントリーベクターにサブクローニングしエントリークローンである、（ｐＥＮＴＲＡ１４００Ｆ１）及び（ｐＥＮＴＲＡ１１５８Ｆ１）を得た。
更に実施例１と同様に、上記の各エントリークローンに含まれる夫々の遺伝子のＯＲＦをＬＲ反応によりｐｃＤＮＡＤＥＳＴ４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ、ＣＭＶプロモーターを有し、目的の蛋白質のＣ末にＧＦＰを融合させた蛋白質を生成する）に移した。プラスミドの希釈液２０μｌ（４μｇ）に２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を加えた。１０μｌのカチオン脂質トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と２５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを混ぜ合わせた。プラスミドとトランスフェクション試薬の溶液を混合し、室温に３０分間置いた後、６ウェルプレート中で８０−９０％コンフルエントになったＦｌｐ Ｉｎ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）にふりかけトランスフェクションした。
トランスフェクションから３日後、１００μｌの４ｘＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ．）を細胞に加えることにより細胞を溶解し、ポリスマンを使って細胞液を回収した。超音波を加え（ＴＡＩＴＥＣ ＶＰ−５Ｓ型、ＯＵＴＰＵＴ ＣＯＮＴＲＯＬ１０、２０秒間）、細胞液の粘性がなくなることを確認した（ＤＮＡの断片化）。次に、８％のアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをブロッティングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）に１５分間浸した後、ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）に１００ｍＡ定電流で１時間転写した（ＢＥ−３００型、ＢＩＯＣＲＡＦＴ、ＴＯＫＹＯ、ＪＡＰＡＮ）。膜をＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ））に１０分間浸した後、ブロッキング液（１０％ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳ）に１時間浸した。ブロッキング液で５０００倍に希釈した一次抗体（ＧＦＰ抗血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）液に１時間浸した後、ＴＢＳＴで１０分間、ＴＢＳで５分間４回の洗浄をおこなった。次にブロッキング液で４０００倍に希釈した二次抗体（アルカリホスファターゼ融合抗ウサギＩｇＧ抗体、ＣＡＰＰＥＬ、Ａｕｒｏｒａ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）液に１時間浸した。ＴＢＳＴで１０分間、ＴＢＳで５分間４回の洗浄をおこなった後、基質溶液（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｕｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加え６０分間発色反応した。その結果を図５に示す。
図５のレーン１にはＯＬ−プロトカドヘリン（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３７８２１）とＧＦＰとの融合蛋白質、レーン２にはナトリウムチャンネルβサブユニット（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０３２９８４）とＧＦＰとの融合蛋白質が泳動されているが、それぞれ約１４０ｋＤａおよび約５０ｋＤａの陽性バンドが確認でき、それぞれの予想された分子量である１４１，１８８Ｄａ及び５３，１４６Ｄａに一致していたため、それぞれの蛋白質とＧＦＰとの融合蛋白質の全長が発現していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
本発明によって、該標的ＯＲＦ、例えば、ベクターに含有されたｃＤＮＡであって、特に、数千ｂｐ以上を有する長鎖ＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングすることが可能となる。
本発明で作成される直鎖状のトラップベクターの両端には、該標的ＯＲＦの５’末端配列及び３’末端配列があるので、このトラップベクターと標的ＯＲＦとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦのみをトラップベクター内に取り込んだクローニングベクターを作成することが出来る。その結果、ＯＲＦ領域の上流及び下流に存在する非翻訳領域（ＵＴＲ）の転写による悪影響を回避することが出来る。
更に、本発明のクローニング法では、予め標的ＯＲＦを含むＤＮＡ等を精製・単離する必要がなく、又、標的ＯＲＦを大腸菌体内の複製メカニズムを利用して増幅するので、従来のＰＣＲによる増幅に見られる変異が発生する可能性がない。
特に、λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて作成した、ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含むトラップベクター用鋳型ベクターを用いて作成された本発明のクローニングベクターは、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー（クローニング技術）におけるエントリークローンとして機能することが出来る。このＧａｔｅｗａｙテクノロジーにおいて、エントリークローンと各種デスティネーションベクターとの間の相同組換え（ＬＲ反応）によって、標的ＯＲＦを維持しながら、所望の各種発現系に対するプロモーター、タグ等に連結した発現クローンがハイスループットに得られる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、第一プライマー結合配列、第二プライマー結合配列及び、第一及び第二のプライマー結合配列に挟まれた自殺遺伝子を含むことを特徴とする、トラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項２】
第一プライマー結合配列がコザックコンセンサス配列の少なくとも一部を含み、及び、第二プライマー結合配列がＴＧＮ又はＴＡＮ（ＮはＧ，Ａ，Ｔ又はＣ）配列を含む、請求項１に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項３】
コザックコンセンサス配列の５’上流側にシャイン・ダルガーノ配列を含む、請求項１または２に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項４】
ＴＧＮ又はＴＡＮ配列を含む制限酵素部位を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項５】
第一プライマー結合配列及び第二のプライマー結合配列が少なくとも５個の塩基から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型。
【請求項６】
第一及び第二のプライマー結合配列の間に更に第二の薬物耐性遺伝子が挟まれた、上記請求項のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項７】
ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項８】
λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて作成されたことを特徴とする、請求項７記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項９】
標的ＯＲＦの５’末端配列のアンチセンス配列及びその３’側に結合した第一のプライマー結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、該標的ＯＲＦの３’末端配列のセンス配列及びその３’側に結合した第二のプライマー結合配列のセンス配列から成る第二プライマーから成る、トラップベクター作成用ＰＣＲプライマー。
【請求項１０】
標的ＯＲＦの５’末端配列及び３’末端配列が夫々、少なくとも１０個の塩基を有する、請求項９に記載のトラップベクター作成用ＰＣＲプライマー。
【請求項１１】
請求項１〜８記載のトラップベクター用鋳型ベクター、及び、請求項９又は１０に記載のＰＣＲプライマーを含む、トラップベクター作成用キット。
【請求項１２】
請求項１１記載のトラップベクター作成用キットを用いてＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により得られたトラップベクターと標的ＯＲＦとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦをトラップベクター内に含むクローニングベクターを作成する方法。
【請求項１４】
相同組換え反応がＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ酵素によるものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
標的ＯＲＦがｃＤＮＡである、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
標的ＯＲＦがベクターに含有されている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的ＯＲＦに蛋白質の遺伝情報をコードする遺伝子が含まれていことを特徴する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
トラップベクターと標的ＯＲＦを含有するベクターで細菌を共形質転換し、該細菌内で相同組換え反応を行う、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
共形質転換した細菌を１〜数時間程度培養することによって再生コロニーを得ることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細菌が相同組換え活性の高い大腸菌である、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法により得られたクローニングベクター。
【請求項２２】
Ｇａｔｅｗａｙテクノロジーにおけるエントリークローンとして機能することを特徴とする、請求項２１記載のクローニングベクター。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載のクローニングベクターを増殖させることから成る、標的ＯＲＦのクローニング法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法でクローニングされた標的ＯＲＦにコードされる遺伝子。
【請求項１】
複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、第一プライマー結合配列、第二プライマー結合配列及び、第一及び第二のプライマー結合配列に挟まれた自殺遺伝子を含むことを特徴とする、トラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項２】
第一プライマー結合配列がコザックコンセンサス配列の少なくとも一部を含み、及び、第二プライマー結合配列がＴＧＮ又はＴＡＮ（ＮはＧ，Ａ，Ｔ又はＣ）配列を含む、請求項１に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項３】
コザックコンセンサス配列の５’上流側にシャイン・ダルガーノ配列を含む、請求項１または２に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項４】
ＴＧＮ又はＴＡＮ配列を含む制限酵素部位を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項５】
第一プライマー結合配列及び第二のプライマー結合配列が少なくとも５個の塩基から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型。
【請求項６】
第一及び第二のプライマー結合配列の間に更に第二の薬物耐性遺伝子が挟まれた、上記請求項のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項７】
ａｔｔＬ１及びにａｔｔＬ２の間に第一プライマー結合配列及び第二プライマー結合配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項８】
λファージの部位特異的組換えシステムにおけるＢＰ反応を用いて作成されたことを特徴とする、請求項７記載のトラップベクター用鋳型ベクター。
【請求項９】
標的ＯＲＦの５’末端配列のアンチセンス配列及びその３’側に結合した第一のプライマー結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、該標的ＯＲＦの３’末端配列のセンス配列及びその３’側に結合した第二のプライマー結合配列のセンス配列から成る第二プライマーから成る、トラップベクター作成用ＰＣＲプライマー。
【請求項１０】
標的ＯＲＦの５’末端配列及び３’末端配列が夫々、少なくとも１０個の塩基を有する、請求項９に記載のトラップベクター作成用ＰＣＲプライマー。
【請求項１１】
請求項１〜８記載のトラップベクター用鋳型ベクター、及び、請求項９又は１０に記載のＰＣＲプライマーを含む、トラップベクター作成用キット。
【請求項１２】
請求項１１記載のトラップベクター作成用キットを用いてＰＣＲにより直鎖状のトラップベクターを作成する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により得られたトラップベクターと標的ＯＲＦとの間での相同組換え反応により、該標的ＯＲＦをトラップベクター内に含むクローニングベクターを作成する方法。
【請求項１４】
相同組換え反応がＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ酵素によるものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
標的ＯＲＦがｃＤＮＡである、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
標的ＯＲＦがベクターに含有されている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的ＯＲＦに蛋白質の遺伝情報をコードする遺伝子が含まれていことを特徴する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
トラップベクターと標的ＯＲＦを含有するベクターで細菌を共形質転換し、該細菌内で相同組換え反応を行う、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
共形質転換した細菌を１〜数時間程度培養することによって再生コロニーを得ることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細菌が相同組換え活性の高い大腸菌である、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法により得られたクローニングベクター。
【請求項２２】
Ｇａｔｅｗａｙテクノロジーにおけるエントリークローンとして機能することを特徴とする、請求項２１記載のクローニングベクター。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載のクローニングベクターを増殖させることから成る、標的ＯＲＦのクローニング法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法でクローニングされた標的ＯＲＦにコードされる遺伝子。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５３１２３
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５８４１４（Ｐ２００４−５５８４１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５５７１
【国際出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（５９６１７５８１０）財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所 (40)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５５７１
【国際出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（５９６１７５８１０）財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所 (40)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]