ｃＤＮＡ合成の改良
【課題】ｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリーの作製方法を提供する。
【解決手段】少なくとも１つのｍＲＮＡもしくはポリＡ ＲＮＡ鋳型、またはこのような鋳型の集団を、逆転写活性を有する少なくとも１つのポリペプチドと混合する工程；および該混合物を、合成された全長のｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させるために十分な条件下でインキュベートする工程、を包含する、１つ以上のｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団を合成するための方法、前記方法に従って産生されたｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリー、前記ｃＤＮＡ分子およびライブラリーを含有しているベクターおよび宿主細胞、および前記ｃＤＡ分子およびライブラリーを作製するためのキット。
【解決手段】少なくとも１つのｍＲＮＡもしくはポリＡ ＲＮＡ鋳型、またはこのような鋳型の集団を、逆転写活性を有する少なくとも１つのポリペプチドと混合する工程；および該混合物を、合成された全長のｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させるために十分な条件下でインキュベートする工程、を包含する、１つ以上のｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団を合成するための方法、前記方法に従って産生されたｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリー、前記ｃＤＮＡ分子およびライブラリーを含有しているベクターおよび宿主細胞、および前記ｃＤＡ分子およびライブラリーを作製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野に関する。本発明は一般に、ｃＤＮＡの合成方法に関する。より詳細には、本発明は、平均のｃＤＮＡインサートの大きさを増大させる方法に関し、さらに具体的にはｃＤＮＡライブラリー中に存在する全長ｃＤＮＡの百分率を増大させる方法に関する。それゆえ、本発明は遺伝子の発見に有用な改良されたｃＤＮＡライブラリーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物体、組織または細胞の構造および生理機能を検査する際に、その遺伝内容を決定することがしばしば望まれる。生物体の遺伝子のフレームワークは、生物体の体細胞および生殖細胞中に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基の二本鎖配列でコードされる。ＤＮＡの特定のセグメント、すなわち遺伝子の遺伝内容は、その遺伝子がコードするタンパク質の産生でのみ明らかになる。タンパク質を産生するために、ＤＮＡ二重らせんの一本の鎖（「コード」鎖）の相補的なコピーがポリメラーゼ酵素によって産生され、その結果、リボ核酸（ＲＮＡ）の特異的配列がもたらされる。この特定のタイプのＲＮＡは、タンパク質を産生するためのＤＮＡからの遺伝メッセージを含んでいるので、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
【０００３】
所定の細胞、組織または生物体の中には、多くのｍＲＮＡ種が存在し、各々が別個の特異的タンパク質をコードしている。この事実は、組織または細胞における遺伝子の発現の研究に興味を抱く研究者に対して強力なツールを提供する。ｍＲＮＡ分子を単離し、そして種々の分子生物学的技術によってさらに操作することができ、それにより細胞、組織または生物体の機能的遺伝内容の全体を解明することが可能となる。
【０００４】
遺伝子発現の研究に対する共通のアプローチは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの産生である。この技術においては、生物体由来のｍＲＮＡ分子が、その生物体の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離には、チミジン（Ｔ）のオリゴマーを複合体化した、セルロースまたはアガロースのような固体クロマトグラフィーマトリックスを使用することが多い。大部分の真核ｍＲＮＡ分子の３’末端は一連のアデノシン（Ａ）塩基を含み、そしてＡはＴに結合するので、ｍＲＮＡ分子は組織または細胞抽出物中の他の分子および物質から迅速に精製され得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡコピーが、逆転写酵素（ＲＴ）またはＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて作製され得、これにより、一本鎖ｃＤＮＡ分子が産生される。次に、この一本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、元のｍＲＮＡの（従って、このｍＲＮＡをコードする、生物体のゲノムに含まれる元の二本鎖ＤＮＡ配列の）完全な二本鎖ＤＮＡコピー（すなわち二本鎖ｃＤＮＡ）に転換され得る。このタンパク質特異的二本鎖ｃＤＮＡは次に、ベクター中に挿入され、これが次に宿主の細菌、酵母、動物または植物細胞中に導入され、このプロセスは形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる。宿主細胞を次に培地中で増殖させ、その結果、目的の遺伝子または目的の遺伝子の一部を含む（あるいは、多くの場合、それを発現する）宿主細胞の集団がもたらされる。
【０００５】
この全体のプロセスは、ｍＲＮＡの単離から、ｃＤＮＡのベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド等）への挿入、単離された遺伝子または遺伝子の一部を含む宿主細胞集団の増殖までが「ｃＤＮＡクローニング」と呼ばれる。ｃＤＮＡが多数の異なるｍＲＮＡから調製されるならば、得られるｃＤＮＡのセットは「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれ、これは適切な用語である。なぜなら、ｃＤＮＡのセットは、供給源細胞、組織または生物体中に存在する機能的遺伝情報を含む遺伝子または遺伝子の一部の「集団」を表すからである。これらのｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型分析は、それが由来する生物体の構造および機能に対する多くの情報を与え得る。
【０００６】
産生されるｃＤＮＡの総量を増大させる能力、より詳細には、ｃＤＮＡ分子の平均の大きさが増大したｃＤＮＡライブラリーを生成する能力、および／または全長ｃＤＮＡ分子の百分率が増大したｃＤＮＡライブラリーを生成する能力は、ｃＤＮＡライブラリーの構築に顕著な進歩を与える。特に、このような進歩は、目的の全長遺伝子を見いだす確率を大幅に向上させる。
【０００７】
理想的には、ｃＤＮＡ分子の合成を、ｍＲＮＡ分子の３’末端またはその近傍から開始する。ｃＤＮＡ合成をポリＡテールの３’末端でオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてプライミングすることにより、ｍＲＮＡの３’メッセージが、産生されるｃＤＮＡ分子中に示されることを確実にする。ｍＲＮＡ分子内で生じるプライミング（内部プライミング）は、目的の遺伝子についての全長メッセージを含まないｃＤＮＡ分子の合成をもたらす。すなわち、内部プライミングは目的の遺伝子（単数または複数）の一部のみを含む短縮型ｃＤＮＡ分子をもたらす。典型的には、内部プライミングは、メッセージ集団から３’配列の損失を引き起こす。それゆえ、内部プライミングは、産生されるｃＤＮＡの総量を減少させ、ｃＤＮＡライブラリーについてのｃＤＮＡ分子の平均のインサートの大きさを減少させ、および／または所定のｃＤＮＡライブラリーにおける全長ｃＤＮＡ分子の百分率を低下させる。配列決定分析は、多くの真核生物ｍＲＮＡが内部ポリアデニル化区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）を有することを示し、これはオリゴ（ｄＴ）プライマーが逆転写酵素による第１鎖ｃＤＮＡ合成のために用いられる場合にプライミング部位として働き得る。さらに、いくつかのｍＲＮＡは１６個もの内部プライミング部位を有し得ることが研究によって示されている（Ｌｏｖｅｔｔ，Ｍ．ら、Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｏｕｂｌｅ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ主催、第４８回年会、１９９８年１０月２７日〜３１日、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏにて発表）。それゆえ、このような内部ポリＡ配列に対するプライマーの内部プライミングはｃＤＮＡ合成に悪影響を与え得る。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、内部プライミングを軽減、防止、低減または実質的に低減し、それによりｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリー構築の改良を提供する。従って、本発明は、全長遺伝子を高百分率で含むｃＤＮＡライブラリーを提供することによって、遺伝子の発見を大幅に促進する。
【０００９】
従って、本発明は、ｍＲＮＡ鋳型またはｍＲＮＡ鋳型の集団からｃＤＮＡ分子（単数または複数）を、生成されるｃＤＮＡの総量を増大させる、生成されるｃＤＮＡ分子の長さを増大させる、および／または生成される全長ｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させるのに十分な条件下で合成することに関する。本発明によれば、内部プライミングを阻害、防止、低減または実質的に低減する任意の条件が使用され得る。このような条件は、好ましくは、プライマー濃度の至適化、反応温度の至適化および／またはプライマーの長さもしくは特異性の至適化を包含するが、これらに限定されない。このような結果はまた、本発明によれば、至適化することによって、好ましくは至適または所望の反応条件が達成されるまで逆転写反応を阻害または防止することによって、達成され得る。
【００１０】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するための従来法は、第１鎖ｃＤＮＡ合成のために１５：１のオリゴ（ｄＴ）プライマー／ｍＲＮＡ鋳型のモル比を用いる。このような過剰量のオリゴ（ｄＴ）プライマーの使用は、反応中に、１つ以上のプライマーの、１つ以上のｍＲＮＡ鋳型に対する内部プライミングを可能にする。本発明の好適な局面によれば、第１鎖ｃＤＮＡの合成のためのオリゴ（ｄＴ）プライマーの量を低減して、内部プライミングを阻害、防止、低減または実質的に低減する。プライマー対鋳型の好ましいモル比は約１２：１；１０：１；９：１；８：１；７：１；６：１；５：１；４：１；３：１；２：１；１：１；１：２；１：３；１：４；１：５；１：６；１：７；１：８；１：９；１：１０および１：１２の範囲である。好ましくは、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ））対鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）のモル比は約５：１から約１：２０の範囲であるが、それより低いプライマー対鋳型のモル比も本発明に従って用いられ得る。特に、プライマー対鋳型のモル比は、約１：１０；１：１５；１：２０；１：２５；１：５０；１：７５および１：１００未満であり得る。好ましくは、モル比の範囲は、約５：１；４：１；３：１；２：１；１：１；１：２；１：３；１：４；および１：５未満である。最も好ましくは、プライマー対鋳型の比は、約１０：１から１：１０；５：１から１：１０；４：１から１：１０；３：１から１：１０；２．５：１から１：１０；２：１から１：１０；１．５：１から１：１０；および１：１から１：１０の範囲である。プライマー対鋳型の至適な比は、プライマー、ｍＲＮＡ、逆転写酵素および反応条件（アニーリング温度、緩衝剤塩など）に応じて変化し得る。所望のプライマー対鋳型の比は当業者によって容易に決定され得る。
【００１１】
ｃＤＮＡライブラリー構築の従来法において、プライマーの鋳型へのアニールまたはハイブリダイズは、内部プライミングを防止、阻害、低減または実質的に低減する温度では行われない。典型的には、混合物（例えば、ｍＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）プライマー）は変性または加熱の後、氷上で冷却される。このプロセスは典型的には、内部部位へのプライマーのアニーリングまたはハイブリダイゼーションを引き起こす。本発明の好適な局面によれば、プライマーと鋳型との間のアニーリングまたはハイブリダイゼーションの際の温度は、内部プライミングが阻害、防止、低減または実質的に低減するように維持される。本発明によれば、このような結果は、プライマーのアニーリングまたはハイブリダイゼーションをより高い温度で行うことによって達成される。このような条件はまたｃＤＮＡ合成の際のｍＲＮＡ二次構造の形成を低減し得る。好ましくは、プライマーを鋳型にアニールまたはハイブリダイズさせるための温度は、約１０℃から約９０℃；より好ましくは約１０℃から約８０℃；さらに好ましくは約２０℃から約７５℃；より好ましくは約２５℃から約７５℃；さらになお好ましくは約３０℃から約６５℃；さらになお好ましくは約３７℃から約６０℃；さらになお好ましくは約４０℃から約６０℃；さらになお好ましくは約４５℃から約６０℃；さらになお好ましくは約４５℃から約５５℃；そして最も好ましくは約４５℃から約６５℃の範囲である。用いられる温度はプライマーおよび鋳型のタイプおよび量に応じ、そして逆転写酵素の至適温度に応じて、変化し得る。至適温度または温度範囲は当業者によって容易に決定され得る。
【００１２】
ｃＤＮＡ合成のための従来法は、典型的には、特定の長さ（１２〜１８塩基またはマー）のオリゴ（ｄＴ）プライマーの使用を必要とする。しかし、このようなプライマー長はプライマーの特異性を低下させ、これにより内部プライミングを可能にする。それゆえ、本発明はまた、プライマーの特異性を高めて、内部プライミングを防止、阻害、低減または実質的に低減することに関する。好適な局面において、プライマーの特異性はプライマーの長さを延ばすことによって高められる。それゆえ、本発明によれば、ｃＤＮＡ合成のために、長めのオリゴ（ｄＴ）プライマーが用いられ得る。好ましくは、プライマー長は約２０から約１００塩基、約２０から約７５塩基、約２０から約６０塩基、そして約２０から約５０塩基の範囲であり；より好ましくは約２０から約４５塩基；より好ましくは約２０から約４０塩基；そして最も好ましくは約２５から約３５塩基の範囲である。好適な局面において、プライマーの長さは１９塩基より長く；より好ましくは約２０塩基より長く；より好ましくは約２５塩基より長く；そしてさらにより好ましくは約３０塩基より長い。このようなプライマー長は、鋳型にアニールまたはハイブリダイズするプライマーの長さに関連している。プライマーの至適な長さおよび内容（ヌクレオチド配列）は鋳型のタイプ、所望の反応条件、および逆転写酵素に応じて変化し得る。本発明によれば、追加の配列および／または修飾ヌクレオチドを本発明のプライマーに含めることができる。例えば、追加配列（これは必ずしも鋳型にアニールまたはハイブリダイズする必要はない）は、ｃＤＮＡ合成を補助するために本発明のプライマー中に含めることができ、このような追加配列は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、１つ以上の誘導体ヌクレオチド（例えば、ビオチン化ヌクレオチドのようなハプテン含有ヌクレオチド）などを含む配列を包含する。本発明に従って用いられるプライマーのタイプおよび長さは当業者によって容易に決定され得る。
【００１３】
従来のｃＤＮＡ合成法は、逆転写酵素反応を至適化するために逆転写酵素を制御したり、あるいはその活性を変化させたりしない。本発明によれば、逆転写酵素の活性は、好ましくは、反応中の所望の時間に合成を開始するために、制御される。好適な局面において、逆転写酵素活性は、至適または所望の反応条件に到達するまで、阻害または防止される。このような結果は、本発明によれば、逆転写酵素活性を阻害するインヒビター（例えば、抗体または抗体フラグメント）の使用によって達成される。このような逆転写酵素インヒビターは、内部プライミングが防止、阻害、低減または実質的に低減されるように、逆転写酵素活性を低温で防止または阻害する。本発明によれば、このようなインヒビターは好ましくは逆転写酵素活性を３５℃未満、４０℃未満、４５℃未満、５０℃未満、５５℃未満、６０℃未満、６５℃未満、７０℃未満、７５℃未満、８０℃未満、８５℃未満、および９０℃未満で防止する。逆転写酵素活性を有する酵素の熱安定性に応じて、インヒビターは、目的の酵素について至適な温度またはその近傍の点で酵素の活性を阻害するように設計され得る。好ましくは、インヒビターは、使用する酵素の至適温度未満または近傍の温度で不活化され、それにより逆転写が起こることを可能にする。それゆえ、本発明は一般に、ｃＤＮＡ合成における逆転写酵素インヒビターの使用に関する。インヒビターのタイプおよび量は逆転写酵素のタイプおよび量に応じ、そして用いられる反応条件に応じて変化し得る。インヒビターのタイプならびにこのようなインヒビターについて使用する条件は当業者により容易に決定され得る。
【００１４】
本発明によれば、ｃＤＮＡ合成に対する上記の改良のいずれか１つあるいは組合せが用いられ得る。これらの改良のいずれか１つあるいは組合せの使用は、改良された第１鎖ｃＤＮＡ合成を提供する（例えば、総ｃＤＮＡの増加、ｃＤＮＡの増加および／または全長ｃＤＮＡの増加）。本発明によれば、第１鎖ｃＤＮＡ分子は、１つ以上の二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子）を、本発明の方法によって産生される１つ以上の第１鎖ｃＤＮＡ分子をこの第１鎖ｃＤＮＡ分子の全てまたは一部と相補的な１つ以上の核酸分子の作製に十分な条件下でインキュベートすることによって作製するための鋳型として用いられ得る。二本鎖核酸分子の作製のための条件は、好ましくは、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の緩衝化塩、および１つ以上のプライマーからなる１つ以上の成分と共にインキュベートすることを含む。本発明の別の局面において、このような条件は、生成される二本鎖ｃＤＮＡの総量の増大、生成される二本鎖ｃＤＮＡ分子の長さまたは大きさの増大、および／あるいは生成される全長二本鎖ｃＤＮＡ分子の百分率の増大をもたらすように改変される。好ましくは、このような条件は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の後のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）消化の至適化に関連する。第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に、ｍＲＮＡ鋳型に対して相補的な全長ｃＤＮＡ分子が作製されないならば、キャップ構造を含む一本鎖ｍＲＮＡがｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのｍＲＮＡの５’末端に存在する。全長ｃＤＮＡが生成されるならば、二本鎖ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドが生成され、一本鎖ｍＲＮＡは存在しない。好ましくは、このような消化条件は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に形成されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖分子の一本鎖ｍＲＮＡがＲＮａｓｅ消化に供されるように至適化される。このようにして、全長ではないｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド由来のキャップ捕捉構造は除去されるが、全長ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドはキャップ構造を維持する。それゆえ、キャップ捕捉を用いて、全長分子について選択し、そして全長ではない分子に対して選択することができる。好適な局面において、この条件は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖ｍＲＮＡが消化または分解され、他方、二本鎖ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのｍＲＮＡが分解されないかまたは実質的に分解されないような条件である。それゆえ、このようなＲＮａｓｅ消化は、第２鎖合成に実質的に悪影響を与えない条件下で行われる。すなわち、本発明に従う第２鎖合成は従来技術と比べてより大きな二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。従来のＲＮａｓｅＩ条件は典型的には３７℃で２５ｕ／μｇから４０ｕ／μｇ ｍＲＮＡの範囲であり、そしてＲＮａｓｅＡ条件は典型的には３７℃で１０００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡである。従来のＲＮａｓｅ消化を用いると、生成される二本鎖ｃＤＮＡ分子の平均の大きさは約２００塩基である。本発明によれば、生成される二本鎖ｃＤＮＡ分子の平均の大きさは好ましくは約３００塩基を超え、約４００塩基を超え、約５００塩基を超え、約６００塩基を超え、約７００塩基を超え、約８００塩基を超え、約９００塩基を超え、約１キロ塩基を超え、約１．５キロ塩基を超え、そして約２キロ塩基を超える。本発明の１つの実施形態において、リボヌクレアーゼの濃度、リボヌクレアーゼのタイプおよび反応条件は、本発明に従う二本鎖ｃＤＮＡ合成を改良するように至適化される。リボヌクレアーゼ消化において使用するための好ましいリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）および／またはリボヌクレアーゼＩ（ＲＮａｓｅＩ）を包含する。一般に、低めの温度（約４℃から約５０℃）および高めの塩濃度（約５ｍＭから約５Ｍ）は、本発明によるＲＮａｓｅ消化の阻害または制御を補助する。使用される塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウムなどを包含し得る。従って、ＲＮａｓｅ量または濃度の低下を用いて、所望の結果が達成され得る。ＲＮａｓｅＡについてのこのような濃度は約０．００１ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡから約５００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡまでの範囲であり得、そしてＲＮａｓｅＩについては約０．００１ｕ／μｇ ｍＲＮＡから約５００ｕ／μｇ ｍＲＮＡの範囲であり得る。インキュベーション温度、ＲＮａｓｅ濃度および塩濃度は当業者によって容易に決定され得る。好適な局面において、ＲＮａｓｅＡの濃度は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中、３７℃で、０．１ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡから１０ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡの範囲を包含する。あるいは、ＲＮａｓｅＡの濃度は、２５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液中、２５℃で３０分間、０．１ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡから５００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡの範囲を包含し得る。好ましくは、用いられるＲＮａｓｅＩの濃度は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム中、３７℃で、０．１単位／μｇ ｍＲＮＡから１．０単位／μｇ ｍＲＮＡの範囲である。あるいは、ＲＮａｓｅＩの濃度は、同じ緩衝液中、２５℃で３０分間、１．０単位／μｇ ｍＲＮＡから１００単位／μｇ ｍＲＮＡの範囲で用いられ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の前、間あるいは後での、ｍＲＮＡのキャップ構造（例えば、ｍ7ＧｐｐｐＮ）の捕捉または結合に関連する。それゆえ、本発明は、本発明の方法の実施において、キャップ構造を有するｍＲＮＡ（第１鎖合成の前）またはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド（第１鎖合成の後または間）の選択に関連する。このような選択または捕捉は、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅペプチド、ｅＩＦ４Ｅペプチドフラグメント（ＷＯ ９８／０８８６５）のような任意のキャップ結合分子、およびキャップ構造に対して特異的な抗体または抗体フラグメントを用いて達成され得る。好適な局面において、キャップ構造の選択は第１鎖合成の後に達成される。より好ましくは、このようなキャップ捕捉は本発明の方法によるリボヌクレアーゼ消化の後に行われる。例えば、リボヌクレアーゼ消化に供されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは捕捉され、そして次に本発明による第２鎖ｃＤＮＡ合成のために使用される。
【００１６】
それゆえ、本発明は一般に核酸分子の合成方法に関する。本発明はより詳細には、１つ以上の核酸分子、特にｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーの作製方法に関し、この方法は、１つ以上の核酸鋳型（好ましくはｍＲＮＡ、ポリＡ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子の集団）を逆転写酵素活性を有する少なくとも１つのポリペプチドと混合する工程、およびこの混合物を、１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部と相補的な１つ以上の第１の核酸分子（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ）を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。本発明に従うと、このような条件は、改良された改変も本発明の条件をも使用しない従来の手順と比較して増大した総量で産生された核酸分子（ｃＤＮＡ）を提供する。本発明はまた、改良された改変も本発明の条件をも使用しない従来の手順と比較して、産生された核酸分子（ｃＤＮＡ）の長さまたは平均の大きさの増大、および／あるいは産生された全長の核酸分子（ｃＤＮＡ）の百分率または量における増大を提供する。産生されたｃＤＮＡの量、長さ、および全長の含有量の決定は、当業者に周知であり、そして本明細書中に記載されるような従来技術によって決定され得る。本発明に従って産生されたｃＤＮＡライブラリー中の全長のｃＤＮＡの百分率または平均の百分率は、好ましくは、約１５％より高く、より好ましくは約２０％より高く、より好ましくは約２５％より高く、より好ましくは約３０％より高く、より好ましくは約４０％より高く、より好ましくは約５０％より高く、より好ましくは約６０％より高く、より好ましくは約７０％より高く、より好ましくは約８０％より高く、そして最も好ましくは約９０％より高い。このような全長の百分率は、好ましくは、目的のｃＤＮＡライブラリーのクローンの一部（例えば、１００から１０００クローン）のランダムな選択、そのクローンの配列決定、および公知の配列データベースに対する配列の比較によって決定される。
【００１７】
本発明の好ましい局面においては、本発明の改良された結果は、好ましくは、核酸またはｃＤＮＡの合成のための条件に対する改変の１つまたは組合せによって達成される。このような条件は、好ましくは、第１鎖のｃＤＮＡ合成を改良するための改変、および／または第２鎖のｃＤＮＡ合成を改良するための改変を含む。
【００１８】
好ましい局面においては、本発明は、特に、１つ以上の二本鎖のｃＤＮＡ分子を作製する方法に関する。この方法は、１つ以上のｍＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集団）を本発明の１つ以上のプライマーとともに、第１鎖のｃＤＮＡの合成の前またはその間の内部プライミングを防ぐ、阻害する、減少させる、または実質的に減少させるような温度およびプライマー濃度で、インキュベートする工程を包含する。このような反応は、好ましくは、本発明に従って、１つ以上の逆転写酵素活性のインヒビターの存在下で行われる。リボヌクレアーゼ消化は、好ましくは、第２鎖のｃＤＮＡの合成の前に、そして第２鎖の合成の間に産生される二本鎖のｃＤＮＡ分子の長さ、量、および／または大きさを増大させるために十分なリボヌクレアーゼ濃度で、行われる。本発明に従うと、キャップ捕捉は好ましくは、リボヌクレアーゼ消化の間またはその後で達成される。
【００１９】
本発明はまた、上記の方法に従って産生された核酸分子およびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団（一本鎖または二本鎖）、ならびにこれらの核酸分子およびｃＤＮＡ分子を含有しているベクター（詳細には、発現ベクター）に関する。本発明はまた、このようなｃＤＮＡ分子および／またはベクターを含有している宿主細胞に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットに関する。このようなキットは、一本鎖または二本鎖の核酸分子を作製するために使用され得る。本発明のキットは、キャリア（例えば、箱またはカートン）を含み、これは、その中に１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、ボトルなど）を有する。このようなキットは、以下からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含み得る：プライマー（好ましくは、より高い特異性を有するプライマーであり、そして最も好ましくは、２０塩基以上の長さを有するオリゴ（ｄＴ）プライマー）、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド（逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ）、１つ以上の逆転写のインヒビター（例えば、ＲＴ活性を有するポリペプチドに対して指向された抗体および抗体フラグメント）、１つ以上のキャップ結合分子（例えば、キャップ構造に対して指向された抗体または抗体フラグメント）、核酸合成反応の緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のベクター、および本発明の方法を実行するための説明書。
【００２１】
本発明はまた、本発明における使用のための組成物、または本発明の方法を実行しながら作製される組成物に関する。このような組成物は、少なくとも１つのプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）またはその誘導体）および少なくとも１つの鋳型を、本発明に従う量または比でサンプルまたは反応混合物中に含み得る。このような組成物はさらに、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上の逆転写のインヒビター（例えば、抗ＲＴ抗体またはそのフラグメント）、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のキャップ結合分子（例えば、抗キャップ抗体またはそのフラグメント）、１つ以上の緩衝塩などを含み得る。このような組成物はまた、本発明に従って内部プライミングを回避するような温度で維持され得る。
【００２２】
本発明の組成物はまた、本発明に従う量のリボヌクレアーゼを含み得る。このような組成物はさらに、１つ以上のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド、１つ以上のヌクレオチド、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上の緩衝塩、１つ以上のキャップ結合分子（例えば、抗キャップ抗体またはそのフラグメント）などから選択される少なくとも１つの成分を含み得る。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法、組成物、およびキットにおける使用のための、１つ以上の抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）ならびにそれらのフラグメントに関する。このような抗体として、抗キャップおよび／または抗ＲＴ抗体、ならびに抗体フラグメントが挙げられる。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および本発明の記載を参照して当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、１：１、２．５：１、５：１、１０：１、および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いて、５／６Ｋｂの鋳型を用いて４５℃でＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ（ＳＳＩＩ）ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図２】図２は、１：１、２．５：１、５：１、１０：１、および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いて、５／６Ｋｂの鋳型を用いて４５℃、５０℃、および５５℃でＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩ（ＴＳＩＩ）ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図３】図３は、０：１、１：１、および１５：１のビオチン化されたＮｏｔＩ−オリゴ（ｄＴ）25／ｍＲＮＡのモル比を用いて、標準的な反応温度を使用して、および反応温度を変化させて、ＳＳＩＩ ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図４】図４は、標準的な反応条件（ここでは、プライマー／鋳型のアニーリングは、ｃＤＮＡ合成の前に、氷上でインキュベートされる）を使用して、および本発明に従う条件（ここでは、アニーリングおよび合成反応の温度は、約３０℃より高く（好ましくは、３７℃より高く）維持される）を使用して、１：１および１５：１のビオチン化されたＮｏｔＩ−オリゴ（ｄＴ）25／ｍＲＮＡのモル比を用いてＴＳＩＩ ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。本発明に従って、３０℃より高く（好ましくは、３７℃より高く）アニーリングおよび反応の温度を維持することは、「ホットスタート」ともまた呼ばれ得る。
【図５】図５は、種々の量のＲＮａｓｅＡを使用して合成した第２鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図６】図６は、種々の量のＲＮａｓｅＩを使用して合成した第２鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（定義）
このような用語に対して与えられた範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確でかつ一貫した理解を与えるために、以下の定義が提供される。
【００２７】
「内部プライミング」は、本明細書中で使用される場合は、ｍＲＮＡ分子の３’末端に配置されたポリＡテール以外の、１つ以上のｍＲＮＡ分子中の１つ以上の部位での１つ以上のプライマーのハイブリダイゼーションまたはアニーリングをいう。
【００２８】
「ライブラリー」は、本明細書中で使用される場合は、生物のＤＮＡ内容物の全てまたは一部またはかなりの部分の代表である核酸分子（環状および直鎖状）のセット（「ゲノムライブラリー」）、あるいは細胞、組織、器官、または生物体中で発現された遺伝子の全てまたは一部またはかなりの部分の代表である核酸分子のセット（「ｃＤＮＡライブラリー」）をいう。このようなライブラリーは、１つ以上のベクター中に含まれてもよいし含まれなくともよい。
【００２９】
「ベクター」は、本明細書中で使用される場合は、プラスミド、コスミド、ファージミド、またはファージＤＮＡ、あるいは、宿主細胞中で自律的に複製することが可能であり、そして、このようなＤＮＡ配列がベクターの必須の生物学的機能の損失を伴わずに決定可能な様式で切断され得、そしてその中にＤＮＡがその複製およびクローニングを生じるように挿入され得る、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる他のＤＮＡ分子をいう。ベクターは、さらに、ベクターで形質転換された細胞の同定における使用に適切な１つ以上のマーカーを含み得る。マーカーとして、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が挙げられるが、これらに限定されない。このようなベクターはまた、１つ以上の組換え部位、１つ以上の終結部位、１つ以上の複製起点などを含み得る。
【００３０】
「プライマー」は、本明細書中で使用される場合は、ＤＮＡ分子の増幅または重合の間にヌクレオチドの単量体の共有結合によって伸張される、一本鎖のオリゴヌクレオチドをいう。本発明での使用に好ましいプライマーとして、オリゴ（ｄＴ）プライマー、またはその誘導体もしくは改変体が挙げられる。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合は、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの３’位と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの５’位との間でのホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチドの共有結合された配列を含む、合成の分子または天然の分子をいう。
【００３２】
「鋳型」は、本明細書中で使用される場合は、増幅されるか、合成されるか、または配列決定されるべき、二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう。二本鎖の分子の場合においては、第１鎖および第２鎖を形成するその鎖の変性は、好ましくは、これらの分子が増幅され得るか、合成され得るか、または配列決定され得る前に、あるいは、二本鎖の分子が鋳型として直接使用され得る前に、行われる。一本鎖の鋳型については、鋳型の一部に対して相補的なプライマーが、適切な条件下でハイブリダイズされるかまたはアニーリングされ、そして次いで１つ以上のポリメラーゼまたは逆転写酵素が、上記の鋳型の全体または一部に対して相補的な核酸分子を合成し得る。本発明に従って新しく合成された分子は、最初の鋳型と等しい長さであり得るか、または最初の鋳型の長さよりも短い長さであり得る。
【００３３】
「取りこむ」は、本明細書中で使用される場合は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００３４】
「増幅」は、本明細書中で使用される場合は、ポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増大させるための任意のインビトロでの方法をいう。核酸の増幅は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの分子またはプライマーへのヌクレチドの取りこみを生じ、それによって鋳型に対して相補的である新しい分子を形成する。形成された核酸分子およびその鋳型は、さらなる核酸分子を合成するための鋳型として使用され得る。本明細書中で使用される場合は、１回の増幅反応は、複数回の複製から構成され得る。ＤＮＡ増幅反応として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１回のＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の変性および合成の５から１００回の「サイクル」から構成され得る。
【００３５】
「ヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合は、塩基−糖−リン酸の組合せをいう。ヌクレオチドは、核酸配列の単量体単位（ＤＮＡおよびＲＮＡ）である。用語ヌクレオチドは、リボヌクレシド三リン酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、またはそれらの誘導体を含む。このような誘導体として、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、およびビオチン化されたかまたはハプテン化されたヌクレオチドが挙げられる。用語ヌクレオチドは、本明細書中で使用される場合はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、およびそれらの誘導体をいう。デオキシリボヌクレオシド三リン酸の説明的な例として、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従うと、「ヌクレオチド」は、標識されなくともよいし、周知の技術によって検出可能に標識されてもよい。検出可能な標識として、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生体発光標識、および酵素標識が挙げられる。
【００３６】
「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、本明細書中で使用される場合は、二本鎖の分子を生じる２つの相補的な一本鎖の核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基対合をいう。本明細書中で使用される場合は、対合は完全には相補的ではないが、２つの核酸分子がハイブリダイズされ得るかまたはアニーリングされ得る。従って、不一致塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用される限りにおいては、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションもアニーリングをも妨げない。本発明においては、用語ハイブリダイゼーションまたはアニーリングは、好ましくは、１つ以上の鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）に対する１つ以上のプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）またはその誘導体）のハイブリダイゼーションをいう。
【００３７】
「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合には、複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターのレシピエントである、任意の原核生物細胞または真核生物細胞をいう。用語「宿主」または「宿主細胞」は、本明細書中では互換的に使用され得る。このような宿主の例については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと。好ましい原核生物宿主として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｃａｒｙｏｐｈａｎｏｎ属などの細菌が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい原核生物宿主はＥ．ｃｏｌｉである。本発明において特に目的の細菌宿主として、Ｅｃｏｌｉ Ｋ１２株、ＤＨ１０Ｂ株、ＤＨ５α株、Ｓｔｂｌ２株、およびＨＢ１０１株、ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な他の株が挙げられる。好ましい真核生物宿主として、真菌、魚の細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい動物細胞は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞のような昆虫細胞；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞のような線虫細胞；ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞のような哺乳動物細胞である。
【００３８】
「発現ベクター」は、本明細書中で使用される場合は、宿主細胞中への形質転換またはトランスフェクション後に、その中にクローン化されている遺伝子または遺伝子の一部の発現を増強することが可能なベクターをいう。クローン化された遺伝子は、通常は、プロモーター配列のような特定の制御配列の制御下に（すなわち、それに対して作動可能に連結される）配置される。このようなプロモーターとして、ファージλＰLプロモーター、およびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターが当業者に公知である。
【００３９】
本発明に従う逆転写に適切な核酸の鋳型として、任意の核酸分子または核酸分子の集団（好ましくは、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、１つ以上のｍＲＮＡ分子またはポリＡ+ＲＮＡ分子、およびより好ましくはｍＲＮＡ分子の集団）あるいは１つ以上のＤＮＡ分子）が挙げられ、特に、細胞または組織に由来するものが挙げられる。好ましい局面においては、ｍＲＮＡ分子の集団（多数の異なるｍＲＮＡ分子）が、本発明に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される。
【００４０】
１つ以上の鋳型に対して相補的である核酸分子（単数または複数）を作製するために、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）および１つ以上のヌクレオチドが、代表的には３’から５’方向での核酸の合成のために使用される。本発明のこの局面に従う逆転写に適切な核酸分子として、任意の核酸分子、特に、原核生物細胞または真核生物細胞に由来する任意の核酸分子が挙げられる。このような細胞として、正常な細胞、疾患の細胞、形質転換された細胞、樹立された細胞、先祖細胞、前駆細胞、胎児の細胞、胚性の細胞、細菌の細胞、酵母細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）、鳥類の細胞、植物細胞など、あるいは植物（例えば、トウモロコシ、トマト、タバコ、ジャガイモ、ダイズなど）または動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、鳥類、魚、昆虫など）から単離された組織が挙げられ得る。このような核酸分子はまた、ウイルスからも単離され得る。
【００４１】
本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子を調製するために鋳型として使用される核酸分子は、好ましくは、種々の細胞、組織、器官、または生物体のような天然の供給源から得られる。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物細胞（細菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種を含むがこれらに限定されない））、または真核生物（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物、および他の寄生生物、ならびに動物（昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．細胞を含む）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ細胞）、ならびに哺乳動物（特にヒト細胞）を含む）であり得る。
【００４２】
核酸の供給源として使用され得る哺乳動物の体細胞として、血球（網状赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン細胞（中枢神経系または末梢神経系に由来する）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋に由来する筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織の細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の支質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞）が挙げられる。哺乳動物の生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）もまた、上記の体細胞および生殖細胞を生じる先祖細胞、前駆細胞、および幹細胞と同様に、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。脳、腎臓、肝臓、すい臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環、リンパ系、消化管、および結合組織の供給源に由来するもの、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児に由来するもののような、哺乳動物の組織または器官もまた、核酸の供給源としての使用に適切である。
【００４３】
任意の上記の細胞、組織、および器官は、正常なもの、罹患したもの、形質転換されたもの、樹立されたもの、先祖、前駆体、胎児のもの、または胚性のものであり得る。罹患した細胞として、例えば、感染性の疾患（細菌、真菌、または酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）、または寄生生物によって引き起こされる）、遺伝的もしくは生化学的な病因（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、または多発性硬化症）、または癌性のプロセスに関連する罹患した細胞が挙げられ得る。形質転換されたかまたは樹立された動物細胞株として、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などが挙げられ得る。本発明における使用のための核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞株、組織、器官、および生物体は、当業者に明らかである。
【００４４】
一旦、細胞、組織、器官、または他の出発サンプルが得られると、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）が、当該分野で周知の方法によってそれらから単離され得る（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ら、Ｃｅｌｌ １５：６８７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＭｅｓｓａｇｅ ＭａｋｅｒTMｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを参照のこと）。このように単離された核酸分子は、次いで、本発明に従ってｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用され得る。本発明に従って産生されたｃＤＮＡ分子および／またはｃＤＮＡライブラリーは、好ましくは、１つ以上のベクター中に含まれる。このようなベクターは、当該分野で周知の標準的な形質転換またはトランスフェクションの技術によって１つ以上の宿主細胞中に導入され得る。好ましい宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞のような原核生物宿主細胞が挙げられる。
【００４５】
本発明の組成物、方法、およびキット中での使用のための酵素として、逆転写酵素活性を有する任意の酵素が挙げられる。このような酵素として、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌の逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、およびそれらの変異体、フラグメント、改変体、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、共有に係る、同時係属中の米国特許出願番号第０８／７０６，７０２号および０８／７０６，７０６号（両方とも、１９９６年９月９日に出願され、これらはそれらの全体において本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。当業者によって理解されているように、改変された逆転写酵素およびＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で周知である組換えまたは遺伝子操作技術によって得ることができる。変異体の逆転写酵素またはポリメラーゼは、例えば、部位特異的またはランダムな変異誘発によって、目的の逆転写酵素またはポリメラーゼをコードする遺伝子（単数または複数）を変異させることによって得ることができる。このような変異は、点変異、欠失変異、および挿入変異を含み得る。好ましくは、１つ以上の点変異（例えば、１つ以上のアミノ酸の、１つ以上の異なるアミノ酸での置換）が、本発明での使用のための変異体の逆転写酵素またはポリメラーゼを構築するために使用される。逆転写酵素またはポリメラーゼのフラグメントもまた、当該分野で周知である組換え技術による欠失変異によるか、あるいは任意の多数の周知のタンパク質分解酵素を使用する目的の逆転写酵素（単数または複数）またはポリメラーゼ（単数または複数）の酵素消化によって得ることができる。
【００４６】
本発明での使用に好ましい酵素として、ＲＮａｓｅＨ活性が減少しているかまたは実質的に減少している酵素が挙げられる。ＲＮａｓｅＨ活性を減少させるかまたは実質的に減少させるこのような酵素は、目的の逆転写酵素中のＲＮａｓｅＨドメインを変異させることによって、好ましくは、上記のような１つ以上の点変異、１つ以上の欠失変異、および／または１つ以上の挿入変異によって、得ることができる。「ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少している」酵素によって、野生型のモロニーマウ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の逆転写酵素の場合のような対応する野生型またはＲＮａｓｅＨ+酵素のＲＮａｓｅＨ活性の、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、約１０％未満、約７．５％未満、または約５％未満、そして最も好ましくは約５％未満または２％未満を有する酵素を意味する。任意の酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１９９２）、および米国特許第５，６６８，００５号に記載されているような、種々のアッセイによって決定され得る。これらの開示の全ては、本明細書中で参考として完全に援用されている。
【００４７】
本発明での使用のための逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から商業的に入手可能であり得る。あるいは、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知の天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従って、それらの天然のウイルスまたは細菌の供給源から単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に良く知られている組換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。
【００４８】
本発明での使用に好ましい逆転写酵素活性を有するポリペプチドとして、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ラウス関連（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＲＡＶ）の逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写酵素、およびＷＯ９８／４７９２１に記載されている他のもの、ならびにそれらの誘導体、改変体、フラグメント、または変異体、ならびにそれらの組合せが挙げられる。さらに好ましい実施形態においては、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性が減少しているかまたは実質的に減少しており、そして最も好ましくは、Ｍ−ＭＬＶ Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ-逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ-逆転写酵素、およびＨＩＶ Ｈ-逆転写酵素、ならびにそれらの誘導体、改変体、フラグメント、または変異体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。特定の目的の逆転写酵素として、ＡＭＶ ＲＴおよびＭ−ＭＬＶ ＲＴ、そしてより好ましくは、減少したかまたは実質的に減少したＲＮａｓｅＨ活性を有するＡＭＶ ＲＴおよびＭ−ＭＬＶ ＲＴ（好ましくは、ＡＭＶ ＲＴ αＨ-／ＢＨ+およびＭ−ＭＬＶ ＲＴ Ｈ-）が挙げられる。本発明での使用に最も好ましい逆転写酵素として、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTM、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩが挙げられる。一般的には、ＷＯ９８／４７９２１、米国特許第５，２４４，７９７号、および同第５，６６８，００５号を参照のこと。それらのそれぞれの内容の全体は、本明細書中で参考として援用されている。
【００４９】
種々のＤＮＡポリメラーゼは、本発明に従って有用である。このようなポリメラーゼとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ，Ｍｌｅｐ）、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体。
【００５０】
本発明に従って使用されるＤＮＡポリメラーゼは、代表的には５’から３’の方向で、核酸の鋳型からＤＮＡ分子を合成し得る任意の酵素であり得る。このようなポリメラーゼは、中温性または高温性であり得る。中温性のポリメラーゼとして、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎｏｗフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩなどが挙げられる。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴTM、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM、Ｔｔｈ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体が挙げられる（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；第ＷＯ９２／０６１８８号；第ＷＯ９２／０６２００号；第ＷＯ９６／１０６４０号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。
【００５１】
本発明での使用のためのＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から商業的に入手することができる。
【００５２】
本発明はまた、ｃＤＮＡ分子（特に、全長のｃＤＮＡ分子）であり得る本発明の方法によって産生された核酸分子、これらの核酸分子およびｃＤＮＡ分子を含有しているベクター（特に、発現ベクター）、ならびにこれらの核酸分子、ｃＤＮＡ分子、および／またはベクターを含有している宿主細胞に関する。
【００５３】
組換えベクターは、当該分野で周知の方法を使用して、本発明の方法に従って調製された１つ以上のｃＤＮＡ分子または核酸分子を１つ以上のベクター中に挿入することによって、本発明のこの局面に従って産生され得る。本発明のこの局面で使用されるベクターは、例えば、ファージまたはファージミドベクターであり得、そして好ましくは、プラスミドである。目的のポリペプチドをコードする核酸に対するシス作用性制御領域を含有しているベクターが、好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、補完ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。
【００５４】
本発明において有用な発現ベクターとして、染色体に由来するベクター、エピソームに由来するベクター、およびウイルスに由来するベクター（例えば、細菌のプラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター）、ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド、およびファージミド）が挙げられ、そして好ましくは、細菌性宿主細胞中での培養のためにテトラサイクリンまたはアンピシリンの耐性遺伝子のような少なくとも１つの選択マーカーを含む。このような発現ベクターへの挿入の前に、本発明のｃＤＮＡまたは核酸分子は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。
【００５５】
本発明における使用に好ましいベクターの中には、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＯＲＴ２、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、およびｐＣＭＶＳＰＯＲＴが挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００５６】
本発明は、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを産生するために、当該分野で周知の任意のｃＤＮＡの合成方法（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８．６０−８．６３頁（１９８９）；ＰＣＴ ＵＳ９８／１９９４８；ならびにＷＯ９８／５１６９９を参照のこと）と組合せて使用され得る。本発明を有利に使用し得る他のｃＤＮＡ合成方法が、当業者に容易に明らかである。
【００５７】
本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子またはライブラリーを得たら、これらのｃＤＮＡは、さらなる分析または操作のために単離され得る。ｃＤＮＡの精製のための詳細な方法論は、その全体において本明細書中で参考として援用されているＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲTMマニュアル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において教示されているが、当該分野で公知である別の標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８．６０−８．６３頁（１９８９）を参照のこと）もまた使用され得る。本発明によって産生されたｃＤＮＡ分子またはライブラリーもまた、ツーハイブリッド分析、ｃＤＮＡの基準化、配列決定、および増幅のような標準的な分子生物学的技術によってさらに操作され得る。より詳細には、本発明の方法、およびこのような方法によって産生されたｃＤＮＡ分子またはライブラリーは、ＲＴ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにディファレンシャルディスプレイとの組合せにおいて使用され得る。
【００５８】
種々のインヒビターおよび結合分子が、本発明の方法における使用に適切である。逆転写酵素活性を有する上記のポリペプチドに対して結合する抗体（例えば、抗ＡＭＶ ＲＴ抗体、抗Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ抗体、または抗ＲＳＶ ＲＴ抗体を含む抗ＲＴ抗体）、またはキャップ構造に対して結合する抗体（例えば、抗キャップ抗体）、およびそれらのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2フラグメント）が、これらのインヒビターまたは結合分子に含まれる。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして当該分野で周知の方法に従って種々の種において調製され得る。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。任意の上記の逆転写酵素またはキャップ構造について特異的な抗体は、インタクトなポリメラーゼポリペプチドまたはキャップ構造、あるいは１つ以上のそれらのフラグメントに対して惹起され得る。これらのポリペプチドまたはキャップ構造、あるいはそれらのフラグメントは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物の系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得るか、またはこれらのポリペプチドが十分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）の場合には、キャリアを伴わずに動物の系に対して提示され得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合は、用語「抗体」（Ａｂ）は、以下のような特異的な状況が以下を除いて、用語「ポリクローナル抗体」または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）と互換的に使用され得る。これらの用語は、本明細書中で使用される場合は、インタクトな分子、および逆転写酵素活性を有するポリペプチド（ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）またはキャップ構造あるいはそれらの一部に対して特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントのような）を含むことを意味する。
【００６０】
本発明の方法で使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の種々の方法によって調製され得る（例えば、米国特許第５，５８７，２８７号を参照のこと）。例えば、ポリクローナル抗体は、標準的な技術に従って、動物を、逆転写酵素活性またはキャップ構造あるいはそれらの一部を有する１つ以上のポリペプチドで免疫化することによって作製され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、４６８−４６９頁（１９９５）を参照のこと）。あるいは、本発明の方法において使用されるモノクローナル抗体（またはそのフラグメント）は、当該分野で周知のハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、５６３−６８１頁（１９８１）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、４４４−４６７頁（１９９５））。
【００６１】
上記の抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2および他のフラグメントは、本明細書中に記載されている方法において使用され得ることが認識される。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解的切断によって産生される。抗体フラグメントはまた、組換えＤＮＡ技術の適用を通じて、または合成化学を通じて産生され得る。
【００６２】
本発明はまた、本発明に従う使用のためのキットを提供する。このようなキットは、キャリア手段（例えば、箱またはカートン）を含み、その中には１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブ、ボトルなど）が密閉されている。ここでは、キットは、１つ以上の宿主細胞、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上の逆転写のインヒビター、１つ以上のキャップ結合分子、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、および／または１つ以上のプライマー（例えば、逆転写のためのオリゴ（ｄＴ））を、（同じ容器または別の容器中に）含み得る。本発明のこの局面によって含まれるキットは、標準的な核酸の逆転写プロトコールを実行するために必要なさらなる試薬および化合物をさらに含み得る。
【００６３】
本明細書中に記載されている方法および出願に対する他の適切な改変および適応が明らかであり、そして本発明の範囲またはその任意の実施形態を逸脱することなく行われ得ることが、当業者に容易に明らかである。本発明は本明細書中で詳細に記載されているが、本発明が、以下の実施例を参照してより明確に理解される。以下の実施例は、本発明の説明の目的のために本発明中に含まれ、そして本発明を制限することは意図しない。
【実施例】
【００６４】
（実施例１：オリゴ（ｄＴ）プライマー／ｍＲＮＡの様々な比を用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成の比較）
この実施例は、オリゴｄＴプライマー／出発ｍＲＮＡの様々な比を用いた、ＭＡＰ４遺伝子の第１鎖ｃＤＮＡ合成を比較する。全ての成分は、他に指定しなければ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である。
【００６５】
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＳＳＩＩＲＴ）のマスターミックスを、下記の表１で指定したように調製した。
【００６６】
【表１】
ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩＲＴ（ＴＳＲＴ）（ＡＭＶ ＲＴ αＨ-βＨ+）（第ＷＯ９８／４７９２１号を参照のこと）のマスターミックスを、下記の表２で指定したように調製した。
【００６７】
【表２】
マスターアニーリングミックスを、下記の表３で指定する量で５つのチューブに、５ＫｂのＭＡＰ４ ｍＲＮＡ、オリゴ（ｄＴ）25-30および水を加えることによって調製した。
【００６８】
【表３】
混合物を７０℃で１０分間加熱し、そして次いで氷上で５分間冷却した。
【００６９】
下記の表４でまとめたように、全容量２０μｌで、９μｌの適切な逆転写酵素マスターミックス、１０μｌのマスターアニーリングミックス、および１μｌのＳＳＩＩＲＴ（２００単位／μｌ）またはＴＳＩＩＲＴ（１５単位／ｕｌ）のいずれかを加えることによって、第１鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【００７０】
【表４】
反応物を、ＳＳＩＩＲＴでは４５℃、ＴＳＩＩＲＴでは４５、５０または５５℃で１時間インキュベートした。チューブを氷上に置いて反応を終了させた。反応チューブの１８μｌの第１鎖ｃＤＮＡを沈殿させ、そして１０μｌの水に再懸濁した。５μｌの第１鎖ｃＤＮＡを、５μｌの標準ローディング緩衝液（６０ｍＭのＮａＯＨ、４ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のブロモフェノールブルー）と混合し、そして分析のために１．４％アルカリアガロースゲルにローディングした。これらの結果を図１および図２に示す。
【００７１】
図１は、ＳＳＩＩＲＴを用いて４５℃で合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１〜５はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いた反応条件を示す。図２は、ＴＳＩＩＲＴを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１〜５はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いた４５℃での反応条件を示す。レーン６〜１０はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比をを用いた５０℃での反応条件を示す。レーン１１〜１５はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を有する５５℃での反応条件を示す。その結果は、オリゴ（ｄＴ）プライマー／ｍＲＮＡのモル比を減少させることによって（好ましくは１：１）、逆転写酵素による内部プライミングがほとんど完全に除去されたことを示す。
【００７２】
（実施例２：標準およびホットスタート条件下での第１鎖ｃＤＮＡ合成の比較）
標準反応およびホットスタート条件でのＭＡＰ４遺伝子の第１鎖ｃＤＮＡ合成を比較するために、この実験を設計した。
【００７３】
１μｇのＭＡＰ４ ｍＲＮＡおよびビオチン化ＮｏｔＩオリゴ（ｄＴ）25プライマー（（ビオチン）4 ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴ；第ＷＯ９８／５１６９９号を参照のこと）を、薄壁（ｔｈｉｎ−ｗａｌｌｅｄ）ＰＣＲチューブに０：１、１：１、または１５：１のオリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡの望ましいモル比で混合し、そして水で容量を１０μｌにすることによって、アニーリングミックスを調製した。いくつかのチューブが同じである場合、１つのバッチとして作成し、そしてしかるべく等分し得る。アニーリングミックスを氷上で保持した。
【００７４】
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＳＳＩＩＲＴ）についてのマスターミックスを、下記の表５で指定したように調製した。
【００７５】
【表５】
次いでＳＳＩＩＲＴマスターミックスを２つの等量のアリコートに分け、その１つは標準反応温度で処理するためであり（バッチ１）、そして１つはホットスタート反応温度で処理するためである（バッチ２）。凝結を可能にするために、さらに１０％容量の水をバッチ２に加えた。全てのミックスを氷上に保持した。
【００７６】
小滴を回収するためにアニーリングミックスを含むチューブを短時間回転させ、このチューブをサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）中に置き、そして次いで７０℃で１０分間加熱することによって第１鎖ｃＤＮＡの合成を開始した。この７０℃で１０分間のサイクルの後、バッチ１のアニーリングミックスのチューブを、すぐに氷上へ移動させた。バッチ２のマスターミックスをサーモサイクラー中に置き、そして４５℃で５分間インキュベートしながら、バッチ２のアニーリングミックスのチューブを、サーモサイクラー中で４５℃に冷却した。５分間のインキュベーションの後、１１μｌのバッチ２のマスターミックスを、バッチ２アニーリングチューブそれぞれに加え、そしてピペットで２回混合した。温度の低下を避けるために、チューブを回転させないように気をつけた。
【００７７】
１０μｌのバッチ１のマスターミックスを、バッチ１アニーリングチューブそれぞれに加えた。バッチ１チューブを軽くボルテックスして、そして短時間遠心分離して凝結小滴を回収した。次いでバッチ１チューブを、サーモサイクラーに戻して、そしてバッチ１および２両方のチューブを４５℃で１時間インキュベートした。
【００７８】
各チューブからの５μｌの第１鎖ｃＤＮＡを、５μｌの標準ローディング緩衝液（６０ｍＭのＮａＯＨ、４ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のブロモフェノールブルー）と混合し、そして分析のために１．４％のアルカリアガロースゲルにローディングした。結果を図３に示す。
【００７９】
図３は、ＳＳＩＩＲＴを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーン１、３および５はそれぞれ、０：１、１：１および１５：１のビオチン化オリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡのモル比を用いたバッチ１反応条件を示す。レーン２、４および６はそれぞれ、０：１、１：１および１５：１のビオチン化オリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡのモル比を用いたバッチ２反応条件を示す。
【００８０】
第１鎖ＤＮＡをまた、１μｇのｍＲＮＡあたり１５単位のＴＳＩＩＲＴを用いて、１：１および１５：１のビオチン化オリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡ比を用いて、ＴＳＩＩＲＴで合成した。温度を５０℃に変えた以外は、上記で記載した同じプロトコールに従った。結果を図４に示す。図４は、ＴＳＩＩＲＴを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１および３はそれぞれ、１：１比および１５：１比で標準反応温度を用いた反応条件を示す。レーン２および４は、上記で記載したように、それぞれ１：１比および１５：１比でのホットスタート反応条件を示す。
【００８１】
その結果は、プライマーおよびｍＲＮＡ混合物の変性後、反応温度を逆転写酵素反応温度まで下げることによって、反応が直接開始され、そして内部プライミングが完全に避けられたことを示した。
【００８２】
（実施例３：反応温度ならびに塩およびＲＮａｓｅの濃度を制御することによる二本鎖ｃＤＮＡの合成）
この実施例は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の後、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドの処理中に、反応温度ならびに塩および異なるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の濃度を制御することによる、二本鎖ｃＤＮＡの合成を記載する。
【００８３】
第１鎖ｃＤＮＡを、上記の実施例２で記載したように合成し、そして下記でさらに記載するようにＲＮａｓｅＩまたはＲＮａｓｅＡのいずれかで消化した。
【００８４】
第１鎖ｃＤＮＡを、１８０μｌの水および２０μｌの１０×ＲＮａｓｅＩ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの酢酸ナトリウム）に再懸濁することによって、第１鎖ｃＤＮＡのＲＮａｓｅＩ消化を行った。２．５単位のＲＮａｓｅＩ（１単位／μｇ ｍＲＮＡ）を加え、そして混合物をよく混合した。ＲＮａｓｅＩ消化混合物を２５℃で３０分インキュベートし、そしてフェノール／クロロホルムを用いて１回抽出した。上清を１μｌのグリコーゲン、１００μｌの酢酸アンモニウム、および８００μｌのエタノールを用いて沈殿させた。
【００８５】
第１鎖ｃＤＮＡを、２００μｌの消化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁することによって、第１鎖ｃＤＮＡのＲＮａｓｅＡ消化を行った。１２．５ｎｇのＲＮａｓｅＡ（５ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡ）を加え、そして混合物をよく混合した。ＲＮａｓｅＡ消化混合物を２５℃で３０分インキュベートし、そしてフェノール／クロロホルムを用いて１回抽出した。上清を１μｌのグリコーゲン、１００μｌの酢酸アンモニウム、および８００μｌのエタノールを用いて沈殿させた。
【００８６】
（実施例４：キャップ結合タンパク質を用いた全長ｃＤＮＡクローンの富化）
この実施例は、キャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｅを用いた全長ｃＤＮＡクローンの富化を記載する。
【００８７】
上記の実施例３で記載したＲＮａｓｅＩで処理した第１鎖ｃＤＮＡを沈殿させ、そして７０％エタノールを用いて洗浄することによってｃＤＮＡを調製した。得られたペレットを室温で５分間乾燥させ、そして２１０μｌの１０ｍＭ ＫＰＯ4、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロールに再懸濁させた。ｃＤＮＡを氷上に保存した。
【００８８】
ｅＩＦ４Ｅグルタチオンセファロース４Ｂビーズを、最初にグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をよく混合することによって調製した。ｅＩＦ４Ｅビーズを調製するために、ＧＳＴタグｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現する組換え宿主細胞（ｅＩＦ４Ｅ遺伝子をＧＳＴ融合ベクターにクローニングし、Ｎ末端ＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅ融合遺伝子を作成した）を増殖させ、そして融合タンパク質を標準的な技術によって精製した。従って、本発明はまた、ｅＩＦ４Ｅタンパク質（特に融合タンパク質として）を発現する組換え宿主細胞、そのようなタンパク質または融合タンパク質を発現する遺伝子を含むベクター、および産生される組換えタンパク質または融合タンパク質に関連する。本発明において、あらゆるタグを使用し得る（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｔｒｘタグ等）。そのようなタグは、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のカルボキシ末端領域および／またはＮ末端領域に位置し得る。
【００８９】
ＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅ融合タンパク質を、製造会社のプロトコールに従って、グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、グルタチオン結合によって、セファロース４Ｂビーズと複合体化した。２００μｌのビーズを、１．５ｍｌの微量遠心（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）チューブに移し、１秒間遠心分離し、そして７５μｌの上清を除去した。ビーズを１ｍｌの反応緩衝液（１０ｍＭのＫＰＯ4、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロール）を用いて２回洗浄し、そして２５８μｌの反応緩衝液に再懸濁し、続いて４２μｌ（１８ｐｍｏｌ／μｌ）のｅＩＦ４Ｅタンパク質（６００ｐｍｏｌ／１００μｌビーズ）を加えた。混合物を、接近（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）ローラーで、４℃で３０分間混合した。混合物を次いで１秒間遠心分離し、そして上清を除去した。ビーズを１ｍｌの反応緩衝液を用いて２回、そして反応緩衝液中１ｍｌの２５μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを用いて１回洗浄した。次いで２０μｌの反応緩衝液および５μｇの酵母ｔＲＮＡをビーズに加えた。２００μｌのＲＮａｓｅＩ処理ｃＤＮＡをビーズに加え、そして内容物をローラーで、室温で１時間混合した。１時間後、混合物を１秒間遠心分離し、そして上清を除去した。ビーズを１ｍｌの反応緩衝液を用いて２回、そして反応緩衝液中１ｍｌの５００μＭ ＧＤＰを用いて１回洗浄した。ｃＤＮＡを、反応緩衝液中２５０μｌの５００μＭ ＧＤＰで２回溶出した。溶出溶液をプールし、そして１分間遠心分離してビーズを除去した。溶出したｃＤＮＡを、等容量のフェノール／クロロホルムで２回抽出した。ｃＤＮＡを２つのチューブに分け、そして１μｌのグリコーゲン、０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５容量のエタノールを用いて沈殿させた。
【００９０】
（実施例５：ｃＤＮＡライブラリーの評価）
上記で記載した全長法で構築したｃＤＮＡライブラリーの質を評価するために、ＭＡＰ４遺伝子（５〜６ｋｂ）および他の遺伝子を標的遺伝子として選択した。ＭＡＰ４および他のｃＤＮＡクローンを、当該分野で周知の標準的な方法（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｎｕａｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）ならびに３’および５’ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ ｃＤＮＡ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いた上記で記載した全長法によって構築したライブラリーから単離した。陽性のクローンを、ＰＣＲによって大きさを分析した。下記の表６および７は、当該分野で周知の方法（コントロール）および上記で記載した全長法（全長法）で構築したヒト線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーにおける全長ｃＤＮＡクローンの富化の結果をまとめる。
【００９１】
【表６】
コントロールライブラリーを、公知の方法を用いてＳＳＩＩＲＴで構築した。
【００９２】
【表７】
これらの結果は、上記で記載した全長法は、標準的な方法を用いた＜１３％に比べて、５’ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒシステムによって＞９０％の全長ｃＤＮＡクローンを産生したことを示す。さらに、上記で記載した全長法は、標準的な方法を用いた＜７％に比べて、３’ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒシステムによって＞３７％の全長クローンを産生した。
【００９３】
（実施例６：第１鎖ｃＤＮＡ合成、ＲＮａｓｅＩ消化、およびｅＩＦ−４Ｅ捕捉）
以下を除いて、上記の実施例２、３（ＲＮａｓｅＩ）および４で記載した全ての条件およびパラメーターに従った：１反応あたり１０μｇのヒト線維芽細胞細胞質ｍＲＮＡという４つの反応を使用した（第ＷＯ９８／４５３１１号を参照のこと）；ビオチン化プライマー−アダプター（ビオチン）4−ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）25を、１：１のプライマー／ｍＲＮＡモル比で使用した；ＴＳＩＩＲＴを５０℃で使用した；そしてＳＳＩＩＲＴを４５℃で使用した。下記の表８は、第１鎖ｃＤＮＡおよびｅＩＦ−４Ｅ捕捉の結果をまとめる。
【００９４】
（実施例７：第２鎖ｃＤＮＡ合成）
最初に上記の実施例６で得た４つの反応ペレットそれぞれを、１０４μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、そして次いで以下の試薬を各反応に加えることによって、第２鎖ｃＤＮＡを合成した：
４μｌの５×第１鎖緩衝液*
３０μｌの５×第２鎖緩衝液*
２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ
４μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ
１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（１０単位／μｌ）
１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（２単位／μｌ）
４μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（１０単位／μｌ）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍマニュアル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を参照のこと。
【００９５】
これらの反応混合物を、次いで１６℃で２時間インキュベートした。２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｌ）を加え、そして１６℃でのインキュベーションをさらに５分間続けた。
【００９６】
（実施例８：ストレプトアビジンビーズの調製）
上記の実施例７で記載した２時間の第２鎖反応の最後の３０分間に、ストレプトアビジン常磁性体ビーズを以下のように調製した。
【００９７】
ストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ）を、ビーズが完全に再懸濁するまでピペッティングによって静かに混合した。１５０μｌの混合ビーズを、各反応のために微量遠心チューブの底に移した。チューブをＭａｇｎａ−Ｓｅｐ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）（磁石）に挿入して、そして２分間静置した。チューブがマグネット中にある間に、上清をピペッティングによって除去し、そして１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）をすぐにビーズに加えた。
【００９８】
次いでチューブを磁石から取り出し、そして指で軽くたたくか、または一番低い設定でボルテックスして、ビーズを静かに再懸濁した。チューブを磁石に再び挿入した。２分後、上清を除去し、ビーズを１６０μｌの結合緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、そしてチューブを微量遠心チューブラックに置いた。
【００９９】
（実施例９：二本鎖ｃＤＮＡライブラリーの捕捉）
上記の実施例７で記載したように、第２鎖反応物とＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとをインキュベートした後、反応混合物を氷上に置き、そして１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えた。次いでｃＤＮＡライブラリーを以下の手順に従って捕捉した（一般的には第ＷＯ９８／５１６９９号を参照のこと）。
【０１００】
実施例８に従って調製した常磁性ビーズを、第２鎖反応混合物チューブへ移し、そしてピペッティングによって静かに混合し、そして懸濁液を室温で６０分間インキュベートした。次いでチューブを磁石に挿入した。２分後、上清を除去および廃棄した。
【０１０１】
１００μｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌ）をビーズに加え、指で軽くたたくか、または一番低い設定でボルテックスしてビーズを再懸濁し、そしてチューブを２分間磁石へ再び挿入した。上清を除去および廃棄した。この洗浄工程をもう１回反復し、そして次いで１００μｌの洗浄緩衝液をビーズに加えた。次いでチューブを５分間磁石に再び挿入した。
【０１０２】
（実施例１０：ＮｏｔＩ消化）
実施例９の最終工程で記載した５分間のインキュベーション後、常磁性ビーズから上清を除去および廃棄し、そして４１μｌのオートクレーブ処理蒸留水、５μｌのＲＥａｃｔ３緩衝液、４μｌのＮｏｔＩを加え、そしてビーズをピペッティングによってよく混合した。次いで反応物を３７℃で２時間インキュベートした。次いでチューブを２分間磁石に挿入し、そしてｃＤＮＡライブラリーを含む上清を新しいチューブに移した。
【０１０３】
５０μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を上清に加え、溶液を完全にボルテックスし、そして次いで１４，０００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。４５μｌの上部の水層を注意深く取り出し、そして新しい微量遠心チューブへ移した。２３μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウム、１μｌのグリコーゲン（２０μｇ）および１７２μｌのエタノール（−２０℃）を加えた。溶液をよく混合して、そしてドライアイス上（または−７０℃冷凍庫）で１５分間保存した。
【０１０４】
次いでエタノール溶液を１４，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を小さなペレットから注意深く除去した。１００μｌの７０％エタノールを加え、そしてチューブを１４，０００×ｇで２分間、室温で遠心分離した。エタノールを除去し、そしてペレットをスピードバック（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）で２分間、または乾燥するまで乾燥した。次いでペレットを２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した。ｃＤＮＡの最終的な収量を、チェレンコフカウント（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｓ）によって決定した（下記の表８を参照のこと）。
【０１０５】
【表８】
（実施例１１：ｃＤＮＡのベクターへの連結およびＥ．ｃｏｌｉへの導入）
１０から３０ｎｇの非分画またはサイズ分画（低融点ゲル電気泳動によって≧１．５ｋｂ）ｃＤＮＡを、ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に連結した。この連結を、クローニングベクターをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで予め消化した以外は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍマニュアル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）で記載されたように、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉに導入した。
【０１０６】
構築したｃＤＮＡライブラリーから無作為に選んだクローン（３０４クローン）の配列分析を、５’および３’配列決定によって分析し、ｃＤＮＡライブラリー中の全長ランダムクローンの全百分率を決定した。配列をＧｅｎｅＢａｎｋ配列と相同性に関して比較した。結果を下記の表９にまとめる。その結果に基づいて、約６８％のランダムクローンが全長（公知の全長クローンおよび未知の全長クローンを含む）であった。従って、ヒト線維芽細胞細胞質ｍＲＮＡライブラリーから、約１７％の未知全長クローンが得られた。
【０１０７】
【表９】
（実施例１２：ＲＮａｓｅアッセイ）
第１鎖ｃＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で１０００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＡで、およびＴＥＮ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭの酢酸ナトリウム）中で２５から４０ｕ／μｇ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＩで、本質的に実施例３で記載したように３７℃で処理した。しかし、上昇した温度での大量のＲＮａｓｅを用いたこの処理は、非常に小さい平均ｃＤＮＡインサートの大きさ（約２００ｂｐ）を含むライブラリーを生じた。従って、必要なＲＮａｓｅの最適量を決定するために、第２鎖ｃＤＮＡアッセイを開発した。
【０１０８】
第１鎖ｃＤＮＡ（放射性標識および非放射性標識）を、５００ｎｇのＲＮＡ／反応でＨｅＬａ ｍＲＮＡを用いて合成した。第１鎖ｃＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させ、そしてＤＥＰＣ−処理水に溶解した。コールドの第１鎖ｃＤＮＡを、種々の量のＲＮａｓｅを含むＲＮａｓｅ緩衝液に加えた。２５℃で３０分間インキュベートした後、処理したｃＤＮＡをフェノール：クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノールを用いて沈殿させた。処理したｃＤＮＡをＤＥＰＣ処理水に溶解し、32Ｐ−ｄＣＴＰプラスおよびマイナスＲＮａｓｅ Ｈを用いて第２鎖ｃＤＮＡ反応を行った。反応物をフェノール：クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノールを用いて沈殿させた。等量のｃｐｍを１．４％アルカリアガロースゲルに電気泳動した。結果を図５および図６に示す。
【０１０９】
図５は、種々の量のＲＮａｓｅＡを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１は、未処理の第１鎖ｃＤＮＡを示す。レーン２は、未処理の第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン３、５、７、および９は、ＲＮａｓｅ Ｈ無しで、そしてそれぞれ０、１．２５ｎｇ、２．５ｎｇ、および５ｎｇの濃度のＲＮａｓｅＡを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン４、６、８、および１０は、ＲＮａｓｅ Ｈを用いて、そしてそれぞれ０、１．２５ｎｇ、２．５ｎｇ、および５ｎｇの濃度のＲＮａｓｅＡを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。
【０１１０】
図６は、種々の量のＲＮａｓｅＩを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１は、未処理の第１鎖ｃＤＮＡを示す。レーン２は、未処理の第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン３、５、７、および９は、ＲＮａｓｅＨ無しで、そしてそれぞれ０、０．５ｕ、１．２５ｕ、および２．５ｕの濃度のＲＮａｓｅＩを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン４、６、８、および１０は、ＲＮａｓｅ Ｈを用いて、そしてそれぞれ０、０．５ｕ、１．２５ｕ、および２．５ｕの濃度のＲＮａｓｅＩを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。
【０１１１】
これらのゲル分析は、１．２５ｎｇの濃度のＲＮａｓｅＡ（図５を参照のこと）または０．５単位のＲＮａｓｅＩ（図６を参照のこと）が、５００ｎｇの出発ｍＲＮＡについて用いるのに最適であり得ることを証明した。
【０１１２】
（実施例１３：キャップ構造に対する抗体の調製）
キャップに対する抗体を、ｍ７グアノシン−ＫＬＨを抗原として用いて産生した。１２００個のハイブリドーマをプレーティングし、そして１２０個のコロニーのみが産生された。これらのうち６個のコロニーのみがキャップに関して陽性であった。さらなる分析の後、３つが必要な親和性を有すると決定された。最初のスクリーニングＥＬＩＳＡは、ｍ７グアノシン−ＢＳＡのＥＬＩＳＡプレートへの結合、ＢＳＡを用いたブロック、ハイブリドーマ上清の結合、２次抗体との反応、およびＢＣＩＰ／ＮＰＴを用いた比色定量反応による陽性の決定からなる。２次スクリーニングは、ハイブリドーマ上清の適切な希釈物を、０．１ｍＭのｍ７ＧＴＰ、０．１ｍＭのキャップアナログＭ7Ｇ5'ｐｐｐ5'Ｇ、０．５ｍＭのｍ７グアノシンまたは０．５ｍＭのＧＴＰのいずれかとインキュベートすることを含んでいた。前処理した上清を次いで標準的なＥＬＩＳＡ手順で使用した。ＧＴＰはｍ７グアノシン−ＢＳＡと競合しなかったが、ｍ７バージョンは全て効率よく競合した。
【０１１３】
理解の明解さのために、説明および例によってここで本発明をある程度詳細にわたって完全に記載したが、本発明またはそのあらゆる特定の実施態様の範囲に影響を与えることなく、条件、処方および他のパラメーターの広いおよび同じ範囲内で、本発明を改変または変化させることによって本発明を実施し得ること、およびそのような改変または変化は、添付した特許請求の範囲内に含まれると意図されることが、当業者に明らかである。
【０１１４】
本明細書中で言及された全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する、当該分野の技術水準を示し、そして本明細書中で、個々の出版物、特許または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されると示されたのと同じ程度、参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野に関する。本発明は一般に、ｃＤＮＡの合成方法に関する。より詳細には、本発明は、平均のｃＤＮＡインサートの大きさを増大させる方法に関し、さらに具体的にはｃＤＮＡライブラリー中に存在する全長ｃＤＮＡの百分率を増大させる方法に関する。それゆえ、本発明は遺伝子の発見に有用な改良されたｃＤＮＡライブラリーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物体、組織または細胞の構造および生理機能を検査する際に、その遺伝内容を決定することがしばしば望まれる。生物体の遺伝子のフレームワークは、生物体の体細胞および生殖細胞中に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基の二本鎖配列でコードされる。ＤＮＡの特定のセグメント、すなわち遺伝子の遺伝内容は、その遺伝子がコードするタンパク質の産生でのみ明らかになる。タンパク質を産生するために、ＤＮＡ二重らせんの一本の鎖（「コード」鎖）の相補的なコピーがポリメラーゼ酵素によって産生され、その結果、リボ核酸（ＲＮＡ）の特異的配列がもたらされる。この特定のタイプのＲＮＡは、タンパク質を産生するためのＤＮＡからの遺伝メッセージを含んでいるので、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
【０００３】
所定の細胞、組織または生物体の中には、多くのｍＲＮＡ種が存在し、各々が別個の特異的タンパク質をコードしている。この事実は、組織または細胞における遺伝子の発現の研究に興味を抱く研究者に対して強力なツールを提供する。ｍＲＮＡ分子を単離し、そして種々の分子生物学的技術によってさらに操作することができ、それにより細胞、組織または生物体の機能的遺伝内容の全体を解明することが可能となる。
【０００４】
遺伝子発現の研究に対する共通のアプローチは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの産生である。この技術においては、生物体由来のｍＲＮＡ分子が、その生物体の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離には、チミジン（Ｔ）のオリゴマーを複合体化した、セルロースまたはアガロースのような固体クロマトグラフィーマトリックスを使用することが多い。大部分の真核ｍＲＮＡ分子の３’末端は一連のアデノシン（Ａ）塩基を含み、そしてＡはＴに結合するので、ｍＲＮＡ分子は組織または細胞抽出物中の他の分子および物質から迅速に精製され得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡコピーが、逆転写酵素（ＲＴ）またはＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて作製され得、これにより、一本鎖ｃＤＮＡ分子が産生される。次に、この一本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、元のｍＲＮＡの（従って、このｍＲＮＡをコードする、生物体のゲノムに含まれる元の二本鎖ＤＮＡ配列の）完全な二本鎖ＤＮＡコピー（すなわち二本鎖ｃＤＮＡ）に転換され得る。このタンパク質特異的二本鎖ｃＤＮＡは次に、ベクター中に挿入され、これが次に宿主の細菌、酵母、動物または植物細胞中に導入され、このプロセスは形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる。宿主細胞を次に培地中で増殖させ、その結果、目的の遺伝子または目的の遺伝子の一部を含む（あるいは、多くの場合、それを発現する）宿主細胞の集団がもたらされる。
【０００５】
この全体のプロセスは、ｍＲＮＡの単離から、ｃＤＮＡのベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド等）への挿入、単離された遺伝子または遺伝子の一部を含む宿主細胞集団の増殖までが「ｃＤＮＡクローニング」と呼ばれる。ｃＤＮＡが多数の異なるｍＲＮＡから調製されるならば、得られるｃＤＮＡのセットは「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれ、これは適切な用語である。なぜなら、ｃＤＮＡのセットは、供給源細胞、組織または生物体中に存在する機能的遺伝情報を含む遺伝子または遺伝子の一部の「集団」を表すからである。これらのｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型分析は、それが由来する生物体の構造および機能に対する多くの情報を与え得る。
【０００６】
産生されるｃＤＮＡの総量を増大させる能力、より詳細には、ｃＤＮＡ分子の平均の大きさが増大したｃＤＮＡライブラリーを生成する能力、および／または全長ｃＤＮＡ分子の百分率が増大したｃＤＮＡライブラリーを生成する能力は、ｃＤＮＡライブラリーの構築に顕著な進歩を与える。特に、このような進歩は、目的の全長遺伝子を見いだす確率を大幅に向上させる。
【０００７】
理想的には、ｃＤＮＡ分子の合成を、ｍＲＮＡ分子の３’末端またはその近傍から開始する。ｃＤＮＡ合成をポリＡテールの３’末端でオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてプライミングすることにより、ｍＲＮＡの３’メッセージが、産生されるｃＤＮＡ分子中に示されることを確実にする。ｍＲＮＡ分子内で生じるプライミング（内部プライミング）は、目的の遺伝子についての全長メッセージを含まないｃＤＮＡ分子の合成をもたらす。すなわち、内部プライミングは目的の遺伝子（単数または複数）の一部のみを含む短縮型ｃＤＮＡ分子をもたらす。典型的には、内部プライミングは、メッセージ集団から３’配列の損失を引き起こす。それゆえ、内部プライミングは、産生されるｃＤＮＡの総量を減少させ、ｃＤＮＡライブラリーについてのｃＤＮＡ分子の平均のインサートの大きさを減少させ、および／または所定のｃＤＮＡライブラリーにおける全長ｃＤＮＡ分子の百分率を低下させる。配列決定分析は、多くの真核生物ｍＲＮＡが内部ポリアデニル化区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）を有することを示し、これはオリゴ（ｄＴ）プライマーが逆転写酵素による第１鎖ｃＤＮＡ合成のために用いられる場合にプライミング部位として働き得る。さらに、いくつかのｍＲＮＡは１６個もの内部プライミング部位を有し得ることが研究によって示されている（Ｌｏｖｅｔｔ，Ｍ．ら、Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｏｕｂｌｅ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ主催、第４８回年会、１９９８年１０月２７日〜３１日、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏにて発表）。それゆえ、このような内部ポリＡ配列に対するプライマーの内部プライミングはｃＤＮＡ合成に悪影響を与え得る。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、内部プライミングを軽減、防止、低減または実質的に低減し、それによりｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリー構築の改良を提供する。従って、本発明は、全長遺伝子を高百分率で含むｃＤＮＡライブラリーを提供することによって、遺伝子の発見を大幅に促進する。
【０００９】
従って、本発明は、ｍＲＮＡ鋳型またはｍＲＮＡ鋳型の集団からｃＤＮＡ分子（単数または複数）を、生成されるｃＤＮＡの総量を増大させる、生成されるｃＤＮＡ分子の長さを増大させる、および／または生成される全長ｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させるのに十分な条件下で合成することに関する。本発明によれば、内部プライミングを阻害、防止、低減または実質的に低減する任意の条件が使用され得る。このような条件は、好ましくは、プライマー濃度の至適化、反応温度の至適化および／またはプライマーの長さもしくは特異性の至適化を包含するが、これらに限定されない。このような結果はまた、本発明によれば、至適化することによって、好ましくは至適または所望の反応条件が達成されるまで逆転写反応を阻害または防止することによって、達成され得る。
【００１０】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するための従来法は、第１鎖ｃＤＮＡ合成のために１５：１のオリゴ（ｄＴ）プライマー／ｍＲＮＡ鋳型のモル比を用いる。このような過剰量のオリゴ（ｄＴ）プライマーの使用は、反応中に、１つ以上のプライマーの、１つ以上のｍＲＮＡ鋳型に対する内部プライミングを可能にする。本発明の好適な局面によれば、第１鎖ｃＤＮＡの合成のためのオリゴ（ｄＴ）プライマーの量を低減して、内部プライミングを阻害、防止、低減または実質的に低減する。プライマー対鋳型の好ましいモル比は約１２：１；１０：１；９：１；８：１；７：１；６：１；５：１；４：１；３：１；２：１；１：１；１：２；１：３；１：４；１：５；１：６；１：７；１：８；１：９；１：１０および１：１２の範囲である。好ましくは、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ））対鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）のモル比は約５：１から約１：２０の範囲であるが、それより低いプライマー対鋳型のモル比も本発明に従って用いられ得る。特に、プライマー対鋳型のモル比は、約１：１０；１：１５；１：２０；１：２５；１：５０；１：７５および１：１００未満であり得る。好ましくは、モル比の範囲は、約５：１；４：１；３：１；２：１；１：１；１：２；１：３；１：４；および１：５未満である。最も好ましくは、プライマー対鋳型の比は、約１０：１から１：１０；５：１から１：１０；４：１から１：１０；３：１から１：１０；２．５：１から１：１０；２：１から１：１０；１．５：１から１：１０；および１：１から１：１０の範囲である。プライマー対鋳型の至適な比は、プライマー、ｍＲＮＡ、逆転写酵素および反応条件（アニーリング温度、緩衝剤塩など）に応じて変化し得る。所望のプライマー対鋳型の比は当業者によって容易に決定され得る。
【００１１】
ｃＤＮＡライブラリー構築の従来法において、プライマーの鋳型へのアニールまたはハイブリダイズは、内部プライミングを防止、阻害、低減または実質的に低減する温度では行われない。典型的には、混合物（例えば、ｍＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）プライマー）は変性または加熱の後、氷上で冷却される。このプロセスは典型的には、内部部位へのプライマーのアニーリングまたはハイブリダイゼーションを引き起こす。本発明の好適な局面によれば、プライマーと鋳型との間のアニーリングまたはハイブリダイゼーションの際の温度は、内部プライミングが阻害、防止、低減または実質的に低減するように維持される。本発明によれば、このような結果は、プライマーのアニーリングまたはハイブリダイゼーションをより高い温度で行うことによって達成される。このような条件はまたｃＤＮＡ合成の際のｍＲＮＡ二次構造の形成を低減し得る。好ましくは、プライマーを鋳型にアニールまたはハイブリダイズさせるための温度は、約１０℃から約９０℃；より好ましくは約１０℃から約８０℃；さらに好ましくは約２０℃から約７５℃；より好ましくは約２５℃から約７５℃；さらになお好ましくは約３０℃から約６５℃；さらになお好ましくは約３７℃から約６０℃；さらになお好ましくは約４０℃から約６０℃；さらになお好ましくは約４５℃から約６０℃；さらになお好ましくは約４５℃から約５５℃；そして最も好ましくは約４５℃から約６５℃の範囲である。用いられる温度はプライマーおよび鋳型のタイプおよび量に応じ、そして逆転写酵素の至適温度に応じて、変化し得る。至適温度または温度範囲は当業者によって容易に決定され得る。
【００１２】
ｃＤＮＡ合成のための従来法は、典型的には、特定の長さ（１２〜１８塩基またはマー）のオリゴ（ｄＴ）プライマーの使用を必要とする。しかし、このようなプライマー長はプライマーの特異性を低下させ、これにより内部プライミングを可能にする。それゆえ、本発明はまた、プライマーの特異性を高めて、内部プライミングを防止、阻害、低減または実質的に低減することに関する。好適な局面において、プライマーの特異性はプライマーの長さを延ばすことによって高められる。それゆえ、本発明によれば、ｃＤＮＡ合成のために、長めのオリゴ（ｄＴ）プライマーが用いられ得る。好ましくは、プライマー長は約２０から約１００塩基、約２０から約７５塩基、約２０から約６０塩基、そして約２０から約５０塩基の範囲であり；より好ましくは約２０から約４５塩基；より好ましくは約２０から約４０塩基；そして最も好ましくは約２５から約３５塩基の範囲である。好適な局面において、プライマーの長さは１９塩基より長く；より好ましくは約２０塩基より長く；より好ましくは約２５塩基より長く；そしてさらにより好ましくは約３０塩基より長い。このようなプライマー長は、鋳型にアニールまたはハイブリダイズするプライマーの長さに関連している。プライマーの至適な長さおよび内容（ヌクレオチド配列）は鋳型のタイプ、所望の反応条件、および逆転写酵素に応じて変化し得る。本発明によれば、追加の配列および／または修飾ヌクレオチドを本発明のプライマーに含めることができる。例えば、追加配列（これは必ずしも鋳型にアニールまたはハイブリダイズする必要はない）は、ｃＤＮＡ合成を補助するために本発明のプライマー中に含めることができ、このような追加配列は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、１つ以上の誘導体ヌクレオチド（例えば、ビオチン化ヌクレオチドのようなハプテン含有ヌクレオチド）などを含む配列を包含する。本発明に従って用いられるプライマーのタイプおよび長さは当業者によって容易に決定され得る。
【００１３】
従来のｃＤＮＡ合成法は、逆転写酵素反応を至適化するために逆転写酵素を制御したり、あるいはその活性を変化させたりしない。本発明によれば、逆転写酵素の活性は、好ましくは、反応中の所望の時間に合成を開始するために、制御される。好適な局面において、逆転写酵素活性は、至適または所望の反応条件に到達するまで、阻害または防止される。このような結果は、本発明によれば、逆転写酵素活性を阻害するインヒビター（例えば、抗体または抗体フラグメント）の使用によって達成される。このような逆転写酵素インヒビターは、内部プライミングが防止、阻害、低減または実質的に低減されるように、逆転写酵素活性を低温で防止または阻害する。本発明によれば、このようなインヒビターは好ましくは逆転写酵素活性を３５℃未満、４０℃未満、４５℃未満、５０℃未満、５５℃未満、６０℃未満、６５℃未満、７０℃未満、７５℃未満、８０℃未満、８５℃未満、および９０℃未満で防止する。逆転写酵素活性を有する酵素の熱安定性に応じて、インヒビターは、目的の酵素について至適な温度またはその近傍の点で酵素の活性を阻害するように設計され得る。好ましくは、インヒビターは、使用する酵素の至適温度未満または近傍の温度で不活化され、それにより逆転写が起こることを可能にする。それゆえ、本発明は一般に、ｃＤＮＡ合成における逆転写酵素インヒビターの使用に関する。インヒビターのタイプおよび量は逆転写酵素のタイプおよび量に応じ、そして用いられる反応条件に応じて変化し得る。インヒビターのタイプならびにこのようなインヒビターについて使用する条件は当業者により容易に決定され得る。
【００１４】
本発明によれば、ｃＤＮＡ合成に対する上記の改良のいずれか１つあるいは組合せが用いられ得る。これらの改良のいずれか１つあるいは組合せの使用は、改良された第１鎖ｃＤＮＡ合成を提供する（例えば、総ｃＤＮＡの増加、ｃＤＮＡの増加および／または全長ｃＤＮＡの増加）。本発明によれば、第１鎖ｃＤＮＡ分子は、１つ以上の二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子）を、本発明の方法によって産生される１つ以上の第１鎖ｃＤＮＡ分子をこの第１鎖ｃＤＮＡ分子の全てまたは一部と相補的な１つ以上の核酸分子の作製に十分な条件下でインキュベートすることによって作製するための鋳型として用いられ得る。二本鎖核酸分子の作製のための条件は、好ましくは、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の緩衝化塩、および１つ以上のプライマーからなる１つ以上の成分と共にインキュベートすることを含む。本発明の別の局面において、このような条件は、生成される二本鎖ｃＤＮＡの総量の増大、生成される二本鎖ｃＤＮＡ分子の長さまたは大きさの増大、および／あるいは生成される全長二本鎖ｃＤＮＡ分子の百分率の増大をもたらすように改変される。好ましくは、このような条件は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の後のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）消化の至適化に関連する。第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に、ｍＲＮＡ鋳型に対して相補的な全長ｃＤＮＡ分子が作製されないならば、キャップ構造を含む一本鎖ｍＲＮＡがｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのｍＲＮＡの５’末端に存在する。全長ｃＤＮＡが生成されるならば、二本鎖ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドが生成され、一本鎖ｍＲＮＡは存在しない。好ましくは、このような消化条件は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間に形成されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖分子の一本鎖ｍＲＮＡがＲＮａｓｅ消化に供されるように至適化される。このようにして、全長ではないｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド由来のキャップ捕捉構造は除去されるが、全長ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドはキャップ構造を維持する。それゆえ、キャップ捕捉を用いて、全長分子について選択し、そして全長ではない分子に対して選択することができる。好適な局面において、この条件は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖ｍＲＮＡが消化または分解され、他方、二本鎖ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのｍＲＮＡが分解されないかまたは実質的に分解されないような条件である。それゆえ、このようなＲＮａｓｅ消化は、第２鎖合成に実質的に悪影響を与えない条件下で行われる。すなわち、本発明に従う第２鎖合成は従来技術と比べてより大きな二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。従来のＲＮａｓｅＩ条件は典型的には３７℃で２５ｕ／μｇから４０ｕ／μｇ ｍＲＮＡの範囲であり、そしてＲＮａｓｅＡ条件は典型的には３７℃で１０００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡである。従来のＲＮａｓｅ消化を用いると、生成される二本鎖ｃＤＮＡ分子の平均の大きさは約２００塩基である。本発明によれば、生成される二本鎖ｃＤＮＡ分子の平均の大きさは好ましくは約３００塩基を超え、約４００塩基を超え、約５００塩基を超え、約６００塩基を超え、約７００塩基を超え、約８００塩基を超え、約９００塩基を超え、約１キロ塩基を超え、約１．５キロ塩基を超え、そして約２キロ塩基を超える。本発明の１つの実施形態において、リボヌクレアーゼの濃度、リボヌクレアーゼのタイプおよび反応条件は、本発明に従う二本鎖ｃＤＮＡ合成を改良するように至適化される。リボヌクレアーゼ消化において使用するための好ましいリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）および／またはリボヌクレアーゼＩ（ＲＮａｓｅＩ）を包含する。一般に、低めの温度（約４℃から約５０℃）および高めの塩濃度（約５ｍＭから約５Ｍ）は、本発明によるＲＮａｓｅ消化の阻害または制御を補助する。使用される塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウムなどを包含し得る。従って、ＲＮａｓｅ量または濃度の低下を用いて、所望の結果が達成され得る。ＲＮａｓｅＡについてのこのような濃度は約０．００１ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡから約５００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡまでの範囲であり得、そしてＲＮａｓｅＩについては約０．００１ｕ／μｇ ｍＲＮＡから約５００ｕ／μｇ ｍＲＮＡの範囲であり得る。インキュベーション温度、ＲＮａｓｅ濃度および塩濃度は当業者によって容易に決定され得る。好適な局面において、ＲＮａｓｅＡの濃度は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中、３７℃で、０．１ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡから１０ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡの範囲を包含する。あるいは、ＲＮａｓｅＡの濃度は、２５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液中、２５℃で３０分間、０．１ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡから５００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡの範囲を包含し得る。好ましくは、用いられるＲＮａｓｅＩの濃度は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム中、３７℃で、０．１単位／μｇ ｍＲＮＡから１．０単位／μｇ ｍＲＮＡの範囲である。あるいは、ＲＮａｓｅＩの濃度は、同じ緩衝液中、２５℃で３０分間、１．０単位／μｇ ｍＲＮＡから１００単位／μｇ ｍＲＮＡの範囲で用いられ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の前、間あるいは後での、ｍＲＮＡのキャップ構造（例えば、ｍ7ＧｐｐｐＮ）の捕捉または結合に関連する。それゆえ、本発明は、本発明の方法の実施において、キャップ構造を有するｍＲＮＡ（第１鎖合成の前）またはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド（第１鎖合成の後または間）の選択に関連する。このような選択または捕捉は、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅペプチド、ｅＩＦ４Ｅペプチドフラグメント（ＷＯ ９８／０８８６５）のような任意のキャップ結合分子、およびキャップ構造に対して特異的な抗体または抗体フラグメントを用いて達成され得る。好適な局面において、キャップ構造の選択は第１鎖合成の後に達成される。より好ましくは、このようなキャップ捕捉は本発明の方法によるリボヌクレアーゼ消化の後に行われる。例えば、リボヌクレアーゼ消化に供されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは捕捉され、そして次に本発明による第２鎖ｃＤＮＡ合成のために使用される。
【００１６】
それゆえ、本発明は一般に核酸分子の合成方法に関する。本発明はより詳細には、１つ以上の核酸分子、特にｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーの作製方法に関し、この方法は、１つ以上の核酸鋳型（好ましくはｍＲＮＡ、ポリＡ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子の集団）を逆転写酵素活性を有する少なくとも１つのポリペプチドと混合する工程、およびこの混合物を、１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部と相補的な１つ以上の第１の核酸分子（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ）を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。本発明に従うと、このような条件は、改良された改変も本発明の条件をも使用しない従来の手順と比較して増大した総量で産生された核酸分子（ｃＤＮＡ）を提供する。本発明はまた、改良された改変も本発明の条件をも使用しない従来の手順と比較して、産生された核酸分子（ｃＤＮＡ）の長さまたは平均の大きさの増大、および／あるいは産生された全長の核酸分子（ｃＤＮＡ）の百分率または量における増大を提供する。産生されたｃＤＮＡの量、長さ、および全長の含有量の決定は、当業者に周知であり、そして本明細書中に記載されるような従来技術によって決定され得る。本発明に従って産生されたｃＤＮＡライブラリー中の全長のｃＤＮＡの百分率または平均の百分率は、好ましくは、約１５％より高く、より好ましくは約２０％より高く、より好ましくは約２５％より高く、より好ましくは約３０％より高く、より好ましくは約４０％より高く、より好ましくは約５０％より高く、より好ましくは約６０％より高く、より好ましくは約７０％より高く、より好ましくは約８０％より高く、そして最も好ましくは約９０％より高い。このような全長の百分率は、好ましくは、目的のｃＤＮＡライブラリーのクローンの一部（例えば、１００から１０００クローン）のランダムな選択、そのクローンの配列決定、および公知の配列データベースに対する配列の比較によって決定される。
【００１７】
本発明の好ましい局面においては、本発明の改良された結果は、好ましくは、核酸またはｃＤＮＡの合成のための条件に対する改変の１つまたは組合せによって達成される。このような条件は、好ましくは、第１鎖のｃＤＮＡ合成を改良するための改変、および／または第２鎖のｃＤＮＡ合成を改良するための改変を含む。
【００１８】
好ましい局面においては、本発明は、特に、１つ以上の二本鎖のｃＤＮＡ分子を作製する方法に関する。この方法は、１つ以上のｍＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集団）を本発明の１つ以上のプライマーとともに、第１鎖のｃＤＮＡの合成の前またはその間の内部プライミングを防ぐ、阻害する、減少させる、または実質的に減少させるような温度およびプライマー濃度で、インキュベートする工程を包含する。このような反応は、好ましくは、本発明に従って、１つ以上の逆転写酵素活性のインヒビターの存在下で行われる。リボヌクレアーゼ消化は、好ましくは、第２鎖のｃＤＮＡの合成の前に、そして第２鎖の合成の間に産生される二本鎖のｃＤＮＡ分子の長さ、量、および／または大きさを増大させるために十分なリボヌクレアーゼ濃度で、行われる。本発明に従うと、キャップ捕捉は好ましくは、リボヌクレアーゼ消化の間またはその後で達成される。
【００１９】
本発明はまた、上記の方法に従って産生された核酸分子およびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団（一本鎖または二本鎖）、ならびにこれらの核酸分子およびｃＤＮＡ分子を含有しているベクター（詳細には、発現ベクター）に関する。本発明はまた、このようなｃＤＮＡ分子および／またはベクターを含有している宿主細胞に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットに関する。このようなキットは、一本鎖または二本鎖の核酸分子を作製するために使用され得る。本発明のキットは、キャリア（例えば、箱またはカートン）を含み、これは、その中に１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、ボトルなど）を有する。このようなキットは、以下からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含み得る：プライマー（好ましくは、より高い特異性を有するプライマーであり、そして最も好ましくは、２０塩基以上の長さを有するオリゴ（ｄＴ）プライマー）、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド（逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ）、１つ以上の逆転写のインヒビター（例えば、ＲＴ活性を有するポリペプチドに対して指向された抗体および抗体フラグメント）、１つ以上のキャップ結合分子（例えば、キャップ構造に対して指向された抗体または抗体フラグメント）、核酸合成反応の緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のベクター、および本発明の方法を実行するための説明書。
【００２１】
本発明はまた、本発明における使用のための組成物、または本発明の方法を実行しながら作製される組成物に関する。このような組成物は、少なくとも１つのプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）またはその誘導体）および少なくとも１つの鋳型を、本発明に従う量または比でサンプルまたは反応混合物中に含み得る。このような組成物はさらに、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上の逆転写のインヒビター（例えば、抗ＲＴ抗体またはそのフラグメント）、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のキャップ結合分子（例えば、抗キャップ抗体またはそのフラグメント）、１つ以上の緩衝塩などを含み得る。このような組成物はまた、本発明に従って内部プライミングを回避するような温度で維持され得る。
【００２２】
本発明の組成物はまた、本発明に従う量のリボヌクレアーゼを含み得る。このような組成物はさらに、１つ以上のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド、１つ以上のヌクレオチド、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上の緩衝塩、１つ以上のキャップ結合分子（例えば、抗キャップ抗体またはそのフラグメント）などから選択される少なくとも１つの成分を含み得る。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法、組成物、およびキットにおける使用のための、１つ以上の抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）ならびにそれらのフラグメントに関する。このような抗体として、抗キャップおよび／または抗ＲＴ抗体、ならびに抗体フラグメントが挙げられる。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および本発明の記載を参照して当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、１：１、２．５：１、５：１、１０：１、および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いて、５／６Ｋｂの鋳型を用いて４５℃でＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ（ＳＳＩＩ）ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図２】図２は、１：１、２．５：１、５：１、１０：１、および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いて、５／６Ｋｂの鋳型を用いて４５℃、５０℃、および５５℃でＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩ（ＴＳＩＩ）ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図３】図３は、０：１、１：１、および１５：１のビオチン化されたＮｏｔＩ−オリゴ（ｄＴ）25／ｍＲＮＡのモル比を用いて、標準的な反応温度を使用して、および反応温度を変化させて、ＳＳＩＩ ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図４】図４は、標準的な反応条件（ここでは、プライマー／鋳型のアニーリングは、ｃＤＮＡ合成の前に、氷上でインキュベートされる）を使用して、および本発明に従う条件（ここでは、アニーリングおよび合成反応の温度は、約３０℃より高く（好ましくは、３７℃より高く）維持される）を使用して、１：１および１５：１のビオチン化されたＮｏｔＩ−オリゴ（ｄＴ）25／ｍＲＮＡのモル比を用いてＴＳＩＩ ＲＴで合成した第１鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。本発明に従って、３０℃より高く（好ましくは、３７℃より高く）アニーリングおよび反応の温度を維持することは、「ホットスタート」ともまた呼ばれ得る。
【図５】図５は、種々の量のＲＮａｓｅＡを使用して合成した第２鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図６】図６は、種々の量のＲＮａｓｅＩを使用して合成した第２鎖のｃＤＮＡのオートラジオグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（定義）
このような用語に対して与えられた範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確でかつ一貫した理解を与えるために、以下の定義が提供される。
【００２７】
「内部プライミング」は、本明細書中で使用される場合は、ｍＲＮＡ分子の３’末端に配置されたポリＡテール以外の、１つ以上のｍＲＮＡ分子中の１つ以上の部位での１つ以上のプライマーのハイブリダイゼーションまたはアニーリングをいう。
【００２８】
「ライブラリー」は、本明細書中で使用される場合は、生物のＤＮＡ内容物の全てまたは一部またはかなりの部分の代表である核酸分子（環状および直鎖状）のセット（「ゲノムライブラリー」）、あるいは細胞、組織、器官、または生物体中で発現された遺伝子の全てまたは一部またはかなりの部分の代表である核酸分子のセット（「ｃＤＮＡライブラリー」）をいう。このようなライブラリーは、１つ以上のベクター中に含まれてもよいし含まれなくともよい。
【００２９】
「ベクター」は、本明細書中で使用される場合は、プラスミド、コスミド、ファージミド、またはファージＤＮＡ、あるいは、宿主細胞中で自律的に複製することが可能であり、そして、このようなＤＮＡ配列がベクターの必須の生物学的機能の損失を伴わずに決定可能な様式で切断され得、そしてその中にＤＮＡがその複製およびクローニングを生じるように挿入され得る、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる他のＤＮＡ分子をいう。ベクターは、さらに、ベクターで形質転換された細胞の同定における使用に適切な１つ以上のマーカーを含み得る。マーカーとして、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が挙げられるが、これらに限定されない。このようなベクターはまた、１つ以上の組換え部位、１つ以上の終結部位、１つ以上の複製起点などを含み得る。
【００３０】
「プライマー」は、本明細書中で使用される場合は、ＤＮＡ分子の増幅または重合の間にヌクレオチドの単量体の共有結合によって伸張される、一本鎖のオリゴヌクレオチドをいう。本発明での使用に好ましいプライマーとして、オリゴ（ｄＴ）プライマー、またはその誘導体もしくは改変体が挙げられる。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合は、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの３’位と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの５’位との間でのホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチドの共有結合された配列を含む、合成の分子または天然の分子をいう。
【００３２】
「鋳型」は、本明細書中で使用される場合は、増幅されるか、合成されるか、または配列決定されるべき、二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう。二本鎖の分子の場合においては、第１鎖および第２鎖を形成するその鎖の変性は、好ましくは、これらの分子が増幅され得るか、合成され得るか、または配列決定され得る前に、あるいは、二本鎖の分子が鋳型として直接使用され得る前に、行われる。一本鎖の鋳型については、鋳型の一部に対して相補的なプライマーが、適切な条件下でハイブリダイズされるかまたはアニーリングされ、そして次いで１つ以上のポリメラーゼまたは逆転写酵素が、上記の鋳型の全体または一部に対して相補的な核酸分子を合成し得る。本発明に従って新しく合成された分子は、最初の鋳型と等しい長さであり得るか、または最初の鋳型の長さよりも短い長さであり得る。
【００３３】
「取りこむ」は、本明細書中で使用される場合は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００３４】
「増幅」は、本明細書中で使用される場合は、ポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増大させるための任意のインビトロでの方法をいう。核酸の増幅は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの分子またはプライマーへのヌクレチドの取りこみを生じ、それによって鋳型に対して相補的である新しい分子を形成する。形成された核酸分子およびその鋳型は、さらなる核酸分子を合成するための鋳型として使用され得る。本明細書中で使用される場合は、１回の増幅反応は、複数回の複製から構成され得る。ＤＮＡ増幅反応として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１回のＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の変性および合成の５から１００回の「サイクル」から構成され得る。
【００３５】
「ヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合は、塩基−糖−リン酸の組合せをいう。ヌクレオチドは、核酸配列の単量体単位（ＤＮＡおよびＲＮＡ）である。用語ヌクレオチドは、リボヌクレシド三リン酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、またはそれらの誘導体を含む。このような誘導体として、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、およびビオチン化されたかまたはハプテン化されたヌクレオチドが挙げられる。用語ヌクレオチドは、本明細書中で使用される場合はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、およびそれらの誘導体をいう。デオキシリボヌクレオシド三リン酸の説明的な例として、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従うと、「ヌクレオチド」は、標識されなくともよいし、周知の技術によって検出可能に標識されてもよい。検出可能な標識として、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生体発光標識、および酵素標識が挙げられる。
【００３６】
「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、本明細書中で使用される場合は、二本鎖の分子を生じる２つの相補的な一本鎖の核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基対合をいう。本明細書中で使用される場合は、対合は完全には相補的ではないが、２つの核酸分子がハイブリダイズされ得るかまたはアニーリングされ得る。従って、不一致塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用される限りにおいては、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションもアニーリングをも妨げない。本発明においては、用語ハイブリダイゼーションまたはアニーリングは、好ましくは、１つ以上の鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）に対する１つ以上のプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）またはその誘導体）のハイブリダイゼーションをいう。
【００３７】
「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合には、複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターのレシピエントである、任意の原核生物細胞または真核生物細胞をいう。用語「宿主」または「宿主細胞」は、本明細書中では互換的に使用され得る。このような宿主の例については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと。好ましい原核生物宿主として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｃａｒｙｏｐｈａｎｏｎ属などの細菌が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい原核生物宿主はＥ．ｃｏｌｉである。本発明において特に目的の細菌宿主として、Ｅｃｏｌｉ Ｋ１２株、ＤＨ１０Ｂ株、ＤＨ５α株、Ｓｔｂｌ２株、およびＨＢ１０１株、ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な他の株が挙げられる。好ましい真核生物宿主として、真菌、魚の細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい動物細胞は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞のような昆虫細胞；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞のような線虫細胞；ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞のような哺乳動物細胞である。
【００３８】
「発現ベクター」は、本明細書中で使用される場合は、宿主細胞中への形質転換またはトランスフェクション後に、その中にクローン化されている遺伝子または遺伝子の一部の発現を増強することが可能なベクターをいう。クローン化された遺伝子は、通常は、プロモーター配列のような特定の制御配列の制御下に（すなわち、それに対して作動可能に連結される）配置される。このようなプロモーターとして、ファージλＰLプロモーター、およびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターが当業者に公知である。
【００３９】
本発明に従う逆転写に適切な核酸の鋳型として、任意の核酸分子または核酸分子の集団（好ましくは、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、１つ以上のｍＲＮＡ分子またはポリＡ+ＲＮＡ分子、およびより好ましくはｍＲＮＡ分子の集団）あるいは１つ以上のＤＮＡ分子）が挙げられ、特に、細胞または組織に由来するものが挙げられる。好ましい局面においては、ｍＲＮＡ分子の集団（多数の異なるｍＲＮＡ分子）が、本発明に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される。
【００４０】
１つ以上の鋳型に対して相補的である核酸分子（単数または複数）を作製するために、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）および１つ以上のヌクレオチドが、代表的には３’から５’方向での核酸の合成のために使用される。本発明のこの局面に従う逆転写に適切な核酸分子として、任意の核酸分子、特に、原核生物細胞または真核生物細胞に由来する任意の核酸分子が挙げられる。このような細胞として、正常な細胞、疾患の細胞、形質転換された細胞、樹立された細胞、先祖細胞、前駆細胞、胎児の細胞、胚性の細胞、細菌の細胞、酵母細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）、鳥類の細胞、植物細胞など、あるいは植物（例えば、トウモロコシ、トマト、タバコ、ジャガイモ、ダイズなど）または動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、鳥類、魚、昆虫など）から単離された組織が挙げられ得る。このような核酸分子はまた、ウイルスからも単離され得る。
【００４１】
本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子を調製するために鋳型として使用される核酸分子は、好ましくは、種々の細胞、組織、器官、または生物体のような天然の供給源から得られる。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物細胞（細菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種を含むがこれらに限定されない））、または真核生物（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物、および他の寄生生物、ならびに動物（昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．細胞を含む）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ細胞）、ならびに哺乳動物（特にヒト細胞）を含む）であり得る。
【００４２】
核酸の供給源として使用され得る哺乳動物の体細胞として、血球（網状赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン細胞（中枢神経系または末梢神経系に由来する）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋に由来する筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織の細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の支質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞）が挙げられる。哺乳動物の生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）もまた、上記の体細胞および生殖細胞を生じる先祖細胞、前駆細胞、および幹細胞と同様に、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。脳、腎臓、肝臓、すい臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環、リンパ系、消化管、および結合組織の供給源に由来するもの、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎児に由来するもののような、哺乳動物の組織または器官もまた、核酸の供給源としての使用に適切である。
【００４３】
任意の上記の細胞、組織、および器官は、正常なもの、罹患したもの、形質転換されたもの、樹立されたもの、先祖、前駆体、胎児のもの、または胚性のものであり得る。罹患した細胞として、例えば、感染性の疾患（細菌、真菌、または酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）、または寄生生物によって引き起こされる）、遺伝的もしくは生化学的な病因（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、または多発性硬化症）、または癌性のプロセスに関連する罹患した細胞が挙げられ得る。形質転換されたかまたは樹立された動物細胞株として、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などが挙げられ得る。本発明における使用のための核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞株、組織、器官、および生物体は、当業者に明らかである。
【００４４】
一旦、細胞、組織、器官、または他の出発サンプルが得られると、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）が、当該分野で周知の方法によってそれらから単離され得る（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ら、Ｃｅｌｌ １５：６８７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＭｅｓｓａｇｅ ＭａｋｅｒTMｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを参照のこと）。このように単離された核酸分子は、次いで、本発明に従ってｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用され得る。本発明に従って産生されたｃＤＮＡ分子および／またはｃＤＮＡライブラリーは、好ましくは、１つ以上のベクター中に含まれる。このようなベクターは、当該分野で周知の標準的な形質転換またはトランスフェクションの技術によって１つ以上の宿主細胞中に導入され得る。好ましい宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞のような原核生物宿主細胞が挙げられる。
【００４５】
本発明の組成物、方法、およびキット中での使用のための酵素として、逆転写酵素活性を有する任意の酵素が挙げられる。このような酵素として、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌の逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、およびそれらの変異体、フラグメント、改変体、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、共有に係る、同時係属中の米国特許出願番号第０８／７０６，７０２号および０８／７０６，７０６号（両方とも、１９９６年９月９日に出願され、これらはそれらの全体において本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。当業者によって理解されているように、改変された逆転写酵素およびＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で周知である組換えまたは遺伝子操作技術によって得ることができる。変異体の逆転写酵素またはポリメラーゼは、例えば、部位特異的またはランダムな変異誘発によって、目的の逆転写酵素またはポリメラーゼをコードする遺伝子（単数または複数）を変異させることによって得ることができる。このような変異は、点変異、欠失変異、および挿入変異を含み得る。好ましくは、１つ以上の点変異（例えば、１つ以上のアミノ酸の、１つ以上の異なるアミノ酸での置換）が、本発明での使用のための変異体の逆転写酵素またはポリメラーゼを構築するために使用される。逆転写酵素またはポリメラーゼのフラグメントもまた、当該分野で周知である組換え技術による欠失変異によるか、あるいは任意の多数の周知のタンパク質分解酵素を使用する目的の逆転写酵素（単数または複数）またはポリメラーゼ（単数または複数）の酵素消化によって得ることができる。
【００４６】
本発明での使用に好ましい酵素として、ＲＮａｓｅＨ活性が減少しているかまたは実質的に減少している酵素が挙げられる。ＲＮａｓｅＨ活性を減少させるかまたは実質的に減少させるこのような酵素は、目的の逆転写酵素中のＲＮａｓｅＨドメインを変異させることによって、好ましくは、上記のような１つ以上の点変異、１つ以上の欠失変異、および／または１つ以上の挿入変異によって、得ることができる。「ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少している」酵素によって、野生型のモロニーマウ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の逆転写酵素の場合のような対応する野生型またはＲＮａｓｅＨ+酵素のＲＮａｓｅＨ活性の、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、約１０％未満、約７．５％未満、または約５％未満、そして最も好ましくは約５％未満または２％未満を有する酵素を意味する。任意の酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１９９２）、および米国特許第５，６６８，００５号に記載されているような、種々のアッセイによって決定され得る。これらの開示の全ては、本明細書中で参考として完全に援用されている。
【００４７】
本発明での使用のための逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から商業的に入手可能であり得る。あるいは、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知の天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従って、それらの天然のウイルスまたは細菌の供給源から単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に良く知られている組換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。
【００４８】
本発明での使用に好ましい逆転写酵素活性を有するポリペプチドとして、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ラウス関連（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＲＡＶ）の逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写酵素、およびＷＯ９８／４７９２１に記載されている他のもの、ならびにそれらの誘導体、改変体、フラグメント、または変異体、ならびにそれらの組合せが挙げられる。さらに好ましい実施形態においては、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性が減少しているかまたは実質的に減少しており、そして最も好ましくは、Ｍ−ＭＬＶ Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ-逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ-逆転写酵素、およびＨＩＶ Ｈ-逆転写酵素、ならびにそれらの誘導体、改変体、フラグメント、または変異体、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。特定の目的の逆転写酵素として、ＡＭＶ ＲＴおよびＭ−ＭＬＶ ＲＴ、そしてより好ましくは、減少したかまたは実質的に減少したＲＮａｓｅＨ活性を有するＡＭＶ ＲＴおよびＭ−ＭＬＶ ＲＴ（好ましくは、ＡＭＶ ＲＴ αＨ-／ＢＨ+およびＭ−ＭＬＶ ＲＴ Ｈ-）が挙げられる。本発明での使用に最も好ましい逆転写酵素として、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTM、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩが挙げられる。一般的には、ＷＯ９８／４７９２１、米国特許第５，２４４，７９７号、および同第５，６６８，００５号を参照のこと。それらのそれぞれの内容の全体は、本明細書中で参考として援用されている。
【００４９】
種々のＤＮＡポリメラーゼは、本発明に従って有用である。このようなポリメラーゼとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ，Ｍｌｅｐ）、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体。
【００５０】
本発明に従って使用されるＤＮＡポリメラーゼは、代表的には５’から３’の方向で、核酸の鋳型からＤＮＡ分子を合成し得る任意の酵素であり得る。このようなポリメラーゼは、中温性または高温性であり得る。中温性のポリメラーゼとして、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎｏｗフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩなどが挙げられる。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴTM、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM、Ｔｔｈ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体が挙げられる（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；第ＷＯ９２／０６１８８号；第ＷＯ９２／０６２００号；第ＷＯ９６／１０６４０号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。
【００５１】
本発明での使用のためのＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から商業的に入手することができる。
【００５２】
本発明はまた、ｃＤＮＡ分子（特に、全長のｃＤＮＡ分子）であり得る本発明の方法によって産生された核酸分子、これらの核酸分子およびｃＤＮＡ分子を含有しているベクター（特に、発現ベクター）、ならびにこれらの核酸分子、ｃＤＮＡ分子、および／またはベクターを含有している宿主細胞に関する。
【００５３】
組換えベクターは、当該分野で周知の方法を使用して、本発明の方法に従って調製された１つ以上のｃＤＮＡ分子または核酸分子を１つ以上のベクター中に挿入することによって、本発明のこの局面に従って産生され得る。本発明のこの局面で使用されるベクターは、例えば、ファージまたはファージミドベクターであり得、そして好ましくは、プラスミドである。目的のポリペプチドをコードする核酸に対するシス作用性制御領域を含有しているベクターが、好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、補完ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。
【００５４】
本発明において有用な発現ベクターとして、染色体に由来するベクター、エピソームに由来するベクター、およびウイルスに由来するベクター（例えば、細菌のプラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター）、ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド、およびファージミド）が挙げられ、そして好ましくは、細菌性宿主細胞中での培養のためにテトラサイクリンまたはアンピシリンの耐性遺伝子のような少なくとも１つの選択マーカーを含む。このような発現ベクターへの挿入の前に、本発明のｃＤＮＡまたは核酸分子は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。
【００５５】
本発明における使用に好ましいベクターの中には、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＯＲＴ２、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、およびｐＣＭＶＳＰＯＲＴが挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００５６】
本発明は、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを産生するために、当該分野で周知の任意のｃＤＮＡの合成方法（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８．６０−８．６３頁（１９８９）；ＰＣＴ ＵＳ９８／１９９４８；ならびにＷＯ９８／５１６９９を参照のこと）と組合せて使用され得る。本発明を有利に使用し得る他のｃＤＮＡ合成方法が、当業者に容易に明らかである。
【００５７】
本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子またはライブラリーを得たら、これらのｃＤＮＡは、さらなる分析または操作のために単離され得る。ｃＤＮＡの精製のための詳細な方法論は、その全体において本明細書中で参考として援用されているＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲTMマニュアル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において教示されているが、当該分野で公知である別の標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８．６０−８．６３頁（１９８９）を参照のこと）もまた使用され得る。本発明によって産生されたｃＤＮＡ分子またはライブラリーもまた、ツーハイブリッド分析、ｃＤＮＡの基準化、配列決定、および増幅のような標準的な分子生物学的技術によってさらに操作され得る。より詳細には、本発明の方法、およびこのような方法によって産生されたｃＤＮＡ分子またはライブラリーは、ＲＴ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにディファレンシャルディスプレイとの組合せにおいて使用され得る。
【００５８】
種々のインヒビターおよび結合分子が、本発明の方法における使用に適切である。逆転写酵素活性を有する上記のポリペプチドに対して結合する抗体（例えば、抗ＡＭＶ ＲＴ抗体、抗Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ抗体、または抗ＲＳＶ ＲＴ抗体を含む抗ＲＴ抗体）、またはキャップ構造に対して結合する抗体（例えば、抗キャップ抗体）、およびそれらのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2フラグメント）が、これらのインヒビターまたは結合分子に含まれる。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして当該分野で周知の方法に従って種々の種において調製され得る。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。任意の上記の逆転写酵素またはキャップ構造について特異的な抗体は、インタクトなポリメラーゼポリペプチドまたはキャップ構造、あるいは１つ以上のそれらのフラグメントに対して惹起され得る。これらのポリペプチドまたはキャップ構造、あるいはそれらのフラグメントは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物の系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得るか、またはこれらのポリペプチドが十分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）の場合には、キャリアを伴わずに動物の系に対して提示され得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合は、用語「抗体」（Ａｂ）は、以下のような特異的な状況が以下を除いて、用語「ポリクローナル抗体」または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）と互換的に使用され得る。これらの用語は、本明細書中で使用される場合は、インタクトな分子、および逆転写酵素活性を有するポリペプチド（ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）またはキャップ構造あるいはそれらの一部に対して特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントのような）を含むことを意味する。
【００６０】
本発明の方法で使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の種々の方法によって調製され得る（例えば、米国特許第５，５８７，２８７号を参照のこと）。例えば、ポリクローナル抗体は、標準的な技術に従って、動物を、逆転写酵素活性またはキャップ構造あるいはそれらの一部を有する１つ以上のポリペプチドで免疫化することによって作製され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、４６８−４６９頁（１９９５）を参照のこと）。あるいは、本発明の方法において使用されるモノクローナル抗体（またはそのフラグメント）は、当該分野で周知のハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、５６３−６８１頁（１９８１）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、４４４−４６７頁（１９９５））。
【００６１】
上記の抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2および他のフラグメントは、本明細書中に記載されている方法において使用され得ることが認識される。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解的切断によって産生される。抗体フラグメントはまた、組換えＤＮＡ技術の適用を通じて、または合成化学を通じて産生され得る。
【００６２】
本発明はまた、本発明に従う使用のためのキットを提供する。このようなキットは、キャリア手段（例えば、箱またはカートン）を含み、その中には１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブ、ボトルなど）が密閉されている。ここでは、キットは、１つ以上の宿主細胞、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上の逆転写のインヒビター、１つ以上のキャップ結合分子、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、および／または１つ以上のプライマー（例えば、逆転写のためのオリゴ（ｄＴ））を、（同じ容器または別の容器中に）含み得る。本発明のこの局面によって含まれるキットは、標準的な核酸の逆転写プロトコールを実行するために必要なさらなる試薬および化合物をさらに含み得る。
【００６３】
本明細書中に記載されている方法および出願に対する他の適切な改変および適応が明らかであり、そして本発明の範囲またはその任意の実施形態を逸脱することなく行われ得ることが、当業者に容易に明らかである。本発明は本明細書中で詳細に記載されているが、本発明が、以下の実施例を参照してより明確に理解される。以下の実施例は、本発明の説明の目的のために本発明中に含まれ、そして本発明を制限することは意図しない。
【実施例】
【００６４】
（実施例１：オリゴ（ｄＴ）プライマー／ｍＲＮＡの様々な比を用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成の比較）
この実施例は、オリゴｄＴプライマー／出発ｍＲＮＡの様々な比を用いた、ＭＡＰ４遺伝子の第１鎖ｃＤＮＡ合成を比較する。全ての成分は、他に指定しなければ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である。
【００６５】
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＳＳＩＩＲＴ）のマスターミックスを、下記の表１で指定したように調製した。
【００６６】
【表１】
ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩＩＲＴ（ＴＳＲＴ）（ＡＭＶ ＲＴ αＨ-βＨ+）（第ＷＯ９８／４７９２１号を参照のこと）のマスターミックスを、下記の表２で指定したように調製した。
【００６７】
【表２】
マスターアニーリングミックスを、下記の表３で指定する量で５つのチューブに、５ＫｂのＭＡＰ４ ｍＲＮＡ、オリゴ（ｄＴ）25-30および水を加えることによって調製した。
【００６８】
【表３】
混合物を７０℃で１０分間加熱し、そして次いで氷上で５分間冷却した。
【００６９】
下記の表４でまとめたように、全容量２０μｌで、９μｌの適切な逆転写酵素マスターミックス、１０μｌのマスターアニーリングミックス、および１μｌのＳＳＩＩＲＴ（２００単位／μｌ）またはＴＳＩＩＲＴ（１５単位／ｕｌ）のいずれかを加えることによって、第１鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【００７０】
【表４】
反応物を、ＳＳＩＩＲＴでは４５℃、ＴＳＩＩＲＴでは４５、５０または５５℃で１時間インキュベートした。チューブを氷上に置いて反応を終了させた。反応チューブの１８μｌの第１鎖ｃＤＮＡを沈殿させ、そして１０μｌの水に再懸濁した。５μｌの第１鎖ｃＤＮＡを、５μｌの標準ローディング緩衝液（６０ｍＭのＮａＯＨ、４ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のブロモフェノールブルー）と混合し、そして分析のために１．４％アルカリアガロースゲルにローディングした。これらの結果を図１および図２に示す。
【００７１】
図１は、ＳＳＩＩＲＴを用いて４５℃で合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１〜５はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いた反応条件を示す。図２は、ＴＳＩＩＲＴを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１〜５はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を用いた４５℃での反応条件を示す。レーン６〜１０はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比をを用いた５０℃での反応条件を示す。レーン１１〜１５はそれぞれ、１：１、２．５：１、５：１、１０：１および５０：１のオリゴ（ｄＴ）25-30／ｍＲＮＡのモル比を有する５５℃での反応条件を示す。その結果は、オリゴ（ｄＴ）プライマー／ｍＲＮＡのモル比を減少させることによって（好ましくは１：１）、逆転写酵素による内部プライミングがほとんど完全に除去されたことを示す。
【００７２】
（実施例２：標準およびホットスタート条件下での第１鎖ｃＤＮＡ合成の比較）
標準反応およびホットスタート条件でのＭＡＰ４遺伝子の第１鎖ｃＤＮＡ合成を比較するために、この実験を設計した。
【００７３】
１μｇのＭＡＰ４ ｍＲＮＡおよびビオチン化ＮｏｔＩオリゴ（ｄＴ）25プライマー（（ビオチン）4 ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴ；第ＷＯ９８／５１６９９号を参照のこと）を、薄壁（ｔｈｉｎ−ｗａｌｌｅｄ）ＰＣＲチューブに０：１、１：１、または１５：１のオリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡの望ましいモル比で混合し、そして水で容量を１０μｌにすることによって、アニーリングミックスを調製した。いくつかのチューブが同じである場合、１つのバッチとして作成し、そしてしかるべく等分し得る。アニーリングミックスを氷上で保持した。
【００７４】
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＳＳＩＩＲＴ）についてのマスターミックスを、下記の表５で指定したように調製した。
【００７５】
【表５】
次いでＳＳＩＩＲＴマスターミックスを２つの等量のアリコートに分け、その１つは標準反応温度で処理するためであり（バッチ１）、そして１つはホットスタート反応温度で処理するためである（バッチ２）。凝結を可能にするために、さらに１０％容量の水をバッチ２に加えた。全てのミックスを氷上に保持した。
【００７６】
小滴を回収するためにアニーリングミックスを含むチューブを短時間回転させ、このチューブをサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）中に置き、そして次いで７０℃で１０分間加熱することによって第１鎖ｃＤＮＡの合成を開始した。この７０℃で１０分間のサイクルの後、バッチ１のアニーリングミックスのチューブを、すぐに氷上へ移動させた。バッチ２のマスターミックスをサーモサイクラー中に置き、そして４５℃で５分間インキュベートしながら、バッチ２のアニーリングミックスのチューブを、サーモサイクラー中で４５℃に冷却した。５分間のインキュベーションの後、１１μｌのバッチ２のマスターミックスを、バッチ２アニーリングチューブそれぞれに加え、そしてピペットで２回混合した。温度の低下を避けるために、チューブを回転させないように気をつけた。
【００７７】
１０μｌのバッチ１のマスターミックスを、バッチ１アニーリングチューブそれぞれに加えた。バッチ１チューブを軽くボルテックスして、そして短時間遠心分離して凝結小滴を回収した。次いでバッチ１チューブを、サーモサイクラーに戻して、そしてバッチ１および２両方のチューブを４５℃で１時間インキュベートした。
【００７８】
各チューブからの５μｌの第１鎖ｃＤＮＡを、５μｌの標準ローディング緩衝液（６０ｍＭのＮａＯＨ、４ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のブロモフェノールブルー）と混合し、そして分析のために１．４％のアルカリアガロースゲルにローディングした。結果を図３に示す。
【００７９】
図３は、ＳＳＩＩＲＴを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーン１、３および５はそれぞれ、０：１、１：１および１５：１のビオチン化オリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡのモル比を用いたバッチ１反応条件を示す。レーン２、４および６はそれぞれ、０：１、１：１および１５：１のビオチン化オリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡのモル比を用いたバッチ２反応条件を示す。
【００８０】
第１鎖ＤＮＡをまた、１μｇのｍＲＮＡあたり１５単位のＴＳＩＩＲＴを用いて、１：１および１５：１のビオチン化オリゴ（ｄＴ）／ｍＲＮＡ比を用いて、ＴＳＩＩＲＴで合成した。温度を５０℃に変えた以外は、上記で記載した同じプロトコールに従った。結果を図４に示す。図４は、ＴＳＩＩＲＴを用いて合成した第１鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１および３はそれぞれ、１：１比および１５：１比で標準反応温度を用いた反応条件を示す。レーン２および４は、上記で記載したように、それぞれ１：１比および１５：１比でのホットスタート反応条件を示す。
【００８１】
その結果は、プライマーおよびｍＲＮＡ混合物の変性後、反応温度を逆転写酵素反応温度まで下げることによって、反応が直接開始され、そして内部プライミングが完全に避けられたことを示した。
【００８２】
（実施例３：反応温度ならびに塩およびＲＮａｓｅの濃度を制御することによる二本鎖ｃＤＮＡの合成）
この実施例は、第１鎖ｃＤＮＡ合成の後、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドの処理中に、反応温度ならびに塩および異なるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の濃度を制御することによる、二本鎖ｃＤＮＡの合成を記載する。
【００８３】
第１鎖ｃＤＮＡを、上記の実施例２で記載したように合成し、そして下記でさらに記載するようにＲＮａｓｅＩまたはＲＮａｓｅＡのいずれかで消化した。
【００８４】
第１鎖ｃＤＮＡを、１８０μｌの水および２０μｌの１０×ＲＮａｓｅＩ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの酢酸ナトリウム）に再懸濁することによって、第１鎖ｃＤＮＡのＲＮａｓｅＩ消化を行った。２．５単位のＲＮａｓｅＩ（１単位／μｇ ｍＲＮＡ）を加え、そして混合物をよく混合した。ＲＮａｓｅＩ消化混合物を２５℃で３０分インキュベートし、そしてフェノール／クロロホルムを用いて１回抽出した。上清を１μｌのグリコーゲン、１００μｌの酢酸アンモニウム、および８００μｌのエタノールを用いて沈殿させた。
【００８５】
第１鎖ｃＤＮＡを、２００μｌの消化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁することによって、第１鎖ｃＤＮＡのＲＮａｓｅＡ消化を行った。１２．５ｎｇのＲＮａｓｅＡ（５ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡ）を加え、そして混合物をよく混合した。ＲＮａｓｅＡ消化混合物を２５℃で３０分インキュベートし、そしてフェノール／クロロホルムを用いて１回抽出した。上清を１μｌのグリコーゲン、１００μｌの酢酸アンモニウム、および８００μｌのエタノールを用いて沈殿させた。
【００８６】
（実施例４：キャップ結合タンパク質を用いた全長ｃＤＮＡクローンの富化）
この実施例は、キャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｅを用いた全長ｃＤＮＡクローンの富化を記載する。
【００８７】
上記の実施例３で記載したＲＮａｓｅＩで処理した第１鎖ｃＤＮＡを沈殿させ、そして７０％エタノールを用いて洗浄することによってｃＤＮＡを調製した。得られたペレットを室温で５分間乾燥させ、そして２１０μｌの１０ｍＭ ＫＰＯ4、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロールに再懸濁させた。ｃＤＮＡを氷上に保存した。
【００８８】
ｅＩＦ４Ｅグルタチオンセファロース４Ｂビーズを、最初にグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をよく混合することによって調製した。ｅＩＦ４Ｅビーズを調製するために、ＧＳＴタグｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現する組換え宿主細胞（ｅＩＦ４Ｅ遺伝子をＧＳＴ融合ベクターにクローニングし、Ｎ末端ＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅ融合遺伝子を作成した）を増殖させ、そして融合タンパク質を標準的な技術によって精製した。従って、本発明はまた、ｅＩＦ４Ｅタンパク質（特に融合タンパク質として）を発現する組換え宿主細胞、そのようなタンパク質または融合タンパク質を発現する遺伝子を含むベクター、および産生される組換えタンパク質または融合タンパク質に関連する。本発明において、あらゆるタグを使用し得る（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｔｒｘタグ等）。そのようなタグは、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のカルボキシ末端領域および／またはＮ末端領域に位置し得る。
【００８９】
ＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅ融合タンパク質を、製造会社のプロトコールに従って、グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、グルタチオン結合によって、セファロース４Ｂビーズと複合体化した。２００μｌのビーズを、１．５ｍｌの微量遠心（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）チューブに移し、１秒間遠心分離し、そして７５μｌの上清を除去した。ビーズを１ｍｌの反応緩衝液（１０ｍＭのＫＰＯ4、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロール）を用いて２回洗浄し、そして２５８μｌの反応緩衝液に再懸濁し、続いて４２μｌ（１８ｐｍｏｌ／μｌ）のｅＩＦ４Ｅタンパク質（６００ｐｍｏｌ／１００μｌビーズ）を加えた。混合物を、接近（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）ローラーで、４℃で３０分間混合した。混合物を次いで１秒間遠心分離し、そして上清を除去した。ビーズを１ｍｌの反応緩衝液を用いて２回、そして反応緩衝液中１ｍｌの２５μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを用いて１回洗浄した。次いで２０μｌの反応緩衝液および５μｇの酵母ｔＲＮＡをビーズに加えた。２００μｌのＲＮａｓｅＩ処理ｃＤＮＡをビーズに加え、そして内容物をローラーで、室温で１時間混合した。１時間後、混合物を１秒間遠心分離し、そして上清を除去した。ビーズを１ｍｌの反応緩衝液を用いて２回、そして反応緩衝液中１ｍｌの５００μＭ ＧＤＰを用いて１回洗浄した。ｃＤＮＡを、反応緩衝液中２５０μｌの５００μＭ ＧＤＰで２回溶出した。溶出溶液をプールし、そして１分間遠心分離してビーズを除去した。溶出したｃＤＮＡを、等容量のフェノール／クロロホルムで２回抽出した。ｃＤＮＡを２つのチューブに分け、そして１μｌのグリコーゲン、０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５容量のエタノールを用いて沈殿させた。
【００９０】
（実施例５：ｃＤＮＡライブラリーの評価）
上記で記載した全長法で構築したｃＤＮＡライブラリーの質を評価するために、ＭＡＰ４遺伝子（５〜６ｋｂ）および他の遺伝子を標的遺伝子として選択した。ＭＡＰ４および他のｃＤＮＡクローンを、当該分野で周知の標準的な方法（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｎｕａｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）ならびに３’および５’ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ ｃＤＮＡ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いた上記で記載した全長法によって構築したライブラリーから単離した。陽性のクローンを、ＰＣＲによって大きさを分析した。下記の表６および７は、当該分野で周知の方法（コントロール）および上記で記載した全長法（全長法）で構築したヒト線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーにおける全長ｃＤＮＡクローンの富化の結果をまとめる。
【００９１】
【表６】
コントロールライブラリーを、公知の方法を用いてＳＳＩＩＲＴで構築した。
【００９２】
【表７】
これらの結果は、上記で記載した全長法は、標準的な方法を用いた＜１３％に比べて、５’ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒシステムによって＞９０％の全長ｃＤＮＡクローンを産生したことを示す。さらに、上記で記載した全長法は、標準的な方法を用いた＜７％に比べて、３’ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒシステムによって＞３７％の全長クローンを産生した。
【００９３】
（実施例６：第１鎖ｃＤＮＡ合成、ＲＮａｓｅＩ消化、およびｅＩＦ−４Ｅ捕捉）
以下を除いて、上記の実施例２、３（ＲＮａｓｅＩ）および４で記載した全ての条件およびパラメーターに従った：１反応あたり１０μｇのヒト線維芽細胞細胞質ｍＲＮＡという４つの反応を使用した（第ＷＯ９８／４５３１１号を参照のこと）；ビオチン化プライマー−アダプター（ビオチン）4−ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）25を、１：１のプライマー／ｍＲＮＡモル比で使用した；ＴＳＩＩＲＴを５０℃で使用した；そしてＳＳＩＩＲＴを４５℃で使用した。下記の表８は、第１鎖ｃＤＮＡおよびｅＩＦ−４Ｅ捕捉の結果をまとめる。
【００９４】
（実施例７：第２鎖ｃＤＮＡ合成）
最初に上記の実施例６で得た４つの反応ペレットそれぞれを、１０４μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、そして次いで以下の試薬を各反応に加えることによって、第２鎖ｃＤＮＡを合成した：
４μｌの５×第１鎖緩衝液*
３０μｌの５×第２鎖緩衝液*
２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ
４μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ
１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（１０単位／μｌ）
１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（２単位／μｌ）
４μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（１０単位／μｌ）
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍマニュアル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を参照のこと。
【００９５】
これらの反応混合物を、次いで１６℃で２時間インキュベートした。２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μｌ）を加え、そして１６℃でのインキュベーションをさらに５分間続けた。
【００９６】
（実施例８：ストレプトアビジンビーズの調製）
上記の実施例７で記載した２時間の第２鎖反応の最後の３０分間に、ストレプトアビジン常磁性体ビーズを以下のように調製した。
【００９７】
ストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ）を、ビーズが完全に再懸濁するまでピペッティングによって静かに混合した。１５０μｌの混合ビーズを、各反応のために微量遠心チューブの底に移した。チューブをＭａｇｎａ−Ｓｅｐ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）（磁石）に挿入して、そして２分間静置した。チューブがマグネット中にある間に、上清をピペッティングによって除去し、そして１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）をすぐにビーズに加えた。
【００９８】
次いでチューブを磁石から取り出し、そして指で軽くたたくか、または一番低い設定でボルテックスして、ビーズを静かに再懸濁した。チューブを磁石に再び挿入した。２分後、上清を除去し、ビーズを１６０μｌの結合緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、そしてチューブを微量遠心チューブラックに置いた。
【００９９】
（実施例９：二本鎖ｃＤＮＡライブラリーの捕捉）
上記の実施例７で記載したように、第２鎖反応物とＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとをインキュベートした後、反応混合物を氷上に置き、そして１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えた。次いでｃＤＮＡライブラリーを以下の手順に従って捕捉した（一般的には第ＷＯ９８／５１６９９号を参照のこと）。
【０１００】
実施例８に従って調製した常磁性ビーズを、第２鎖反応混合物チューブへ移し、そしてピペッティングによって静かに混合し、そして懸濁液を室温で６０分間インキュベートした。次いでチューブを磁石に挿入した。２分後、上清を除去および廃棄した。
【０１０１】
１００μｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌ）をビーズに加え、指で軽くたたくか、または一番低い設定でボルテックスしてビーズを再懸濁し、そしてチューブを２分間磁石へ再び挿入した。上清を除去および廃棄した。この洗浄工程をもう１回反復し、そして次いで１００μｌの洗浄緩衝液をビーズに加えた。次いでチューブを５分間磁石に再び挿入した。
【０１０２】
（実施例１０：ＮｏｔＩ消化）
実施例９の最終工程で記載した５分間のインキュベーション後、常磁性ビーズから上清を除去および廃棄し、そして４１μｌのオートクレーブ処理蒸留水、５μｌのＲＥａｃｔ３緩衝液、４μｌのＮｏｔＩを加え、そしてビーズをピペッティングによってよく混合した。次いで反応物を３７℃で２時間インキュベートした。次いでチューブを２分間磁石に挿入し、そしてｃＤＮＡライブラリーを含む上清を新しいチューブに移した。
【０１０３】
５０μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を上清に加え、溶液を完全にボルテックスし、そして次いで１４，０００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。４５μｌの上部の水層を注意深く取り出し、そして新しい微量遠心チューブへ移した。２３μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウム、１μｌのグリコーゲン（２０μｇ）および１７２μｌのエタノール（−２０℃）を加えた。溶液をよく混合して、そしてドライアイス上（または−７０℃冷凍庫）で１５分間保存した。
【０１０４】
次いでエタノール溶液を１４，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を小さなペレットから注意深く除去した。１００μｌの７０％エタノールを加え、そしてチューブを１４，０００×ｇで２分間、室温で遠心分離した。エタノールを除去し、そしてペレットをスピードバック（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）で２分間、または乾燥するまで乾燥した。次いでペレットを２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した。ｃＤＮＡの最終的な収量を、チェレンコフカウント（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｓ）によって決定した（下記の表８を参照のこと）。
【０１０５】
【表８】
（実施例１１：ｃＤＮＡのベクターへの連結およびＥ．ｃｏｌｉへの導入）
１０から３０ｎｇの非分画またはサイズ分画（低融点ゲル電気泳動によって≧１．５ｋｂ）ｃＤＮＡを、ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に連結した。この連結を、クローニングベクターをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで予め消化した以外は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍマニュアル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）で記載されたように、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉに導入した。
【０１０６】
構築したｃＤＮＡライブラリーから無作為に選んだクローン（３０４クローン）の配列分析を、５’および３’配列決定によって分析し、ｃＤＮＡライブラリー中の全長ランダムクローンの全百分率を決定した。配列をＧｅｎｅＢａｎｋ配列と相同性に関して比較した。結果を下記の表９にまとめる。その結果に基づいて、約６８％のランダムクローンが全長（公知の全長クローンおよび未知の全長クローンを含む）であった。従って、ヒト線維芽細胞細胞質ｍＲＮＡライブラリーから、約１７％の未知全長クローンが得られた。
【０１０７】
【表９】
（実施例１２：ＲＮａｓｅアッセイ）
第１鎖ｃＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で１０００ｎｇ／μｇ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＡで、およびＴＥＮ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭの酢酸ナトリウム）中で２５から４０ｕ／μｇ ｍＲＮＡのＲＮａｓｅＩで、本質的に実施例３で記載したように３７℃で処理した。しかし、上昇した温度での大量のＲＮａｓｅを用いたこの処理は、非常に小さい平均ｃＤＮＡインサートの大きさ（約２００ｂｐ）を含むライブラリーを生じた。従って、必要なＲＮａｓｅの最適量を決定するために、第２鎖ｃＤＮＡアッセイを開発した。
【０１０８】
第１鎖ｃＤＮＡ（放射性標識および非放射性標識）を、５００ｎｇのＲＮＡ／反応でＨｅＬａ ｍＲＮＡを用いて合成した。第１鎖ｃＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させ、そしてＤＥＰＣ−処理水に溶解した。コールドの第１鎖ｃＤＮＡを、種々の量のＲＮａｓｅを含むＲＮａｓｅ緩衝液に加えた。２５℃で３０分間インキュベートした後、処理したｃＤＮＡをフェノール：クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノールを用いて沈殿させた。処理したｃＤＮＡをＤＥＰＣ処理水に溶解し、32Ｐ−ｄＣＴＰプラスおよびマイナスＲＮａｓｅ Ｈを用いて第２鎖ｃＤＮＡ反応を行った。反応物をフェノール：クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノールを用いて沈殿させた。等量のｃｐｍを１．４％アルカリアガロースゲルに電気泳動した。結果を図５および図６に示す。
【０１０９】
図５は、種々の量のＲＮａｓｅＡを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１は、未処理の第１鎖ｃＤＮＡを示す。レーン２は、未処理の第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン３、５、７、および９は、ＲＮａｓｅ Ｈ無しで、そしてそれぞれ０、１．２５ｎｇ、２．５ｎｇ、および５ｎｇの濃度のＲＮａｓｅＡを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン４、６、８、および１０は、ＲＮａｓｅ Ｈを用いて、そしてそれぞれ０、１．２５ｎｇ、２．５ｎｇ、および５ｎｇの濃度のＲＮａｓｅＡを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。
【０１１０】
図６は、種々の量のＲＮａｓｅＩを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡのオートラジオグラフである。レーンＭは１ｋｂのＤＮＡラダーである。レーン１は、未処理の第１鎖ｃＤＮＡを示す。レーン２は、未処理の第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン３、５、７、および９は、ＲＮａｓｅＨ無しで、そしてそれぞれ０、０．５ｕ、１．２５ｕ、および２．５ｕの濃度のＲＮａｓｅＩを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。レーン４、６、８、および１０は、ＲＮａｓｅ Ｈを用いて、そしてそれぞれ０、０．５ｕ、１．２５ｕ、および２．５ｕの濃度のＲＮａｓｅＩを用いて合成した第２鎖ｃＤＮＡを示す。
【０１１１】
これらのゲル分析は、１．２５ｎｇの濃度のＲＮａｓｅＡ（図５を参照のこと）または０．５単位のＲＮａｓｅＩ（図６を参照のこと）が、５００ｎｇの出発ｍＲＮＡについて用いるのに最適であり得ることを証明した。
【０１１２】
（実施例１３：キャップ構造に対する抗体の調製）
キャップに対する抗体を、ｍ７グアノシン−ＫＬＨを抗原として用いて産生した。１２００個のハイブリドーマをプレーティングし、そして１２０個のコロニーのみが産生された。これらのうち６個のコロニーのみがキャップに関して陽性であった。さらなる分析の後、３つが必要な親和性を有すると決定された。最初のスクリーニングＥＬＩＳＡは、ｍ７グアノシン−ＢＳＡのＥＬＩＳＡプレートへの結合、ＢＳＡを用いたブロック、ハイブリドーマ上清の結合、２次抗体との反応、およびＢＣＩＰ／ＮＰＴを用いた比色定量反応による陽性の決定からなる。２次スクリーニングは、ハイブリドーマ上清の適切な希釈物を、０．１ｍＭのｍ７ＧＴＰ、０．１ｍＭのキャップアナログＭ7Ｇ5'ｐｐｐ5'Ｇ、０．５ｍＭのｍ７グアノシンまたは０．５ｍＭのＧＴＰのいずれかとインキュベートすることを含んでいた。前処理した上清を次いで標準的なＥＬＩＳＡ手順で使用した。ＧＴＰはｍ７グアノシン−ＢＳＡと競合しなかったが、ｍ７バージョンは全て効率よく競合した。
【０１１３】
理解の明解さのために、説明および例によってここで本発明をある程度詳細にわたって完全に記載したが、本発明またはそのあらゆる特定の実施態様の範囲に影響を与えることなく、条件、処方および他のパラメーターの広いおよび同じ範囲内で、本発明を改変または変化させることによって本発明を実施し得ること、およびそのような改変または変化は、添付した特許請求の範囲内に含まれると意図されることが、当業者に明らかである。
【０１１４】
本明細書中で言及された全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する、当該分野の技術水準を示し、そして本明細書中で、個々の出版物、特許または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されると示されたのと同じ程度、参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団を合成するための方法であって、以下の工程：
少なくとも１つのｍＲＮＡもしくはポリＡ ＲＮＡ鋳型、またはこのような鋳型の集団を、逆転写活性を有する少なくとも１つのポリペプチドと混合する工程；および
該混合物を、合成された全長のｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させるために十分な条件下でインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記条件が、内部プライミングを減少させるかまたは実質的に減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、ＲＡＶ ＲＴ、ＭＡＶ ＲＴ、およびＨＩＶ ＲＴ、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、変異体および改変体からなる群より選択される逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写酵素が、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少しているかまたは実質的に減少している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記条件が、上昇させた温度で、前記鋳型に対して１つ以上のプライマーをアニーリングまたはハイブリダイズすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記上昇させた温度が、約２０℃から約９０℃までの範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記条件が、前記鋳型の量と比較して少ない量のプライマーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーの前記鋳型に対する比が、約５：１から約１：２０までの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記条件が、逆転写酵素活性を有する前記ポリペプチドのインヒビターの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インヒビターが、抗体または抗体フラグメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体または抗体フラグメントが、ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記条件が、高い特異性を有するプライマーの使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記条件が、前記プライマーの長さを増大させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型にハイブリダイズする前記プライマーの長さが、約２０塩基から約６０塩基までの範囲である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がさらに、前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の全てまたは一部に対して相補的である少なくとも１つの第２の核酸分子を作製するために十分な条件下で、少なくとも１つの該ｃＤＮＡ分子をインキュベートし、それによって１つ以上の二本鎖のｃＤＮＡ分子を産生する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の核酸分子を作製するための前記条件が、全長の二本鎖のｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記条件が、リボヌクレアーゼ消化を最適化する工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記条件が、第１鎖のｃＤＮＡ合成の後で形成されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドに含まれる一本鎖のｍＲＮＡの消化を可能にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記条件が、二本鎖のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドにおけるｍＲＮＡの消化を妨げる、阻害する、減少させる、または実質的に減少させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅＡおよびＲＮａｓｅＩ、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載される方法に従って作製された、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団。
【請求項２２】
請求項１５に記載される方法に従って作製された、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸分子を含有している、ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸分子を含有している、ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載のベクターを含有している、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２４に記載のベクターを含有している、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２１に記載の分子を含有している、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２２に記載の分子を含有している、宿主細胞。
【請求項２９】
増大した量または百分率の全長のｃＤＮＡを作製するためのキットであって、１つ以上のプライマー、１つ以上の逆転写のインヒビター、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のキャップ結合分子、１つ以上の逆転写緩衝液、および全長のｃＤＮＡを作製するための説明書からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、キット。
【請求項３０】
増大した量または百分率の全長ｃＤＮＡを作製するための、組成物。
【請求項３１】
逆転写活性酵素を有するポリペプチドに対して特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項３２】
ｍＲＮＡキャップ構造に対して特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１】
１つ以上のｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団を合成するための方法であって、以下の工程：
少なくとも１つのｍＲＮＡもしくはポリＡ ＲＮＡ鋳型、またはこのような鋳型の集団を、逆転写活性を有する少なくとも１つのポリペプチドと混合する工程；および
該混合物を、合成された全長のｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させるために十分な条件下でインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記条件が、内部プライミングを減少させるかまたは実質的に減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、ＲＡＶ ＲＴ、ＭＡＶ ＲＴ、およびＨＩＶ ＲＴ、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、変異体および改変体からなる群より選択される逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写酵素が、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が減少しているかまたは実質的に減少している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記条件が、上昇させた温度で、前記鋳型に対して１つ以上のプライマーをアニーリングまたはハイブリダイズすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記上昇させた温度が、約２０℃から約９０℃までの範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記条件が、前記鋳型の量と比較して少ない量のプライマーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーの前記鋳型に対する比が、約５：１から約１：２０までの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記条件が、逆転写酵素活性を有する前記ポリペプチドのインヒビターの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インヒビターが、抗体または抗体フラグメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体または抗体フラグメントが、ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記条件が、高い特異性を有するプライマーの使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記条件が、前記プライマーの長さを増大させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型にハイブリダイズする前記プライマーの長さが、約２０塩基から約６０塩基までの範囲である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がさらに、前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の全てまたは一部に対して相補的である少なくとも１つの第２の核酸分子を作製するために十分な条件下で、少なくとも１つの該ｃＤＮＡ分子をインキュベートし、それによって１つ以上の二本鎖のｃＤＮＡ分子を産生する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の核酸分子を作製するための前記条件が、全長の二本鎖のｃＤＮＡ分子の量または百分率を増大させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記条件が、リボヌクレアーゼ消化を最適化する工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記条件が、第１鎖のｃＤＮＡ合成の後で形成されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドに含まれる一本鎖のｍＲＮＡの消化を可能にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記条件が、二本鎖のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドにおけるｍＲＮＡの消化を妨げる、阻害する、減少させる、または実質的に減少させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リボヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅＡおよびＲＮａｓｅＩ、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載される方法に従って作製された、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団。
【請求項２２】
請求項１５に記載される方法に従って作製された、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸分子を含有している、ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸分子を含有している、ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載のベクターを含有している、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２４に記載のベクターを含有している、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２１に記載の分子を含有している、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２２に記載の分子を含有している、宿主細胞。
【請求項２９】
増大した量または百分率の全長のｃＤＮＡを作製するためのキットであって、１つ以上のプライマー、１つ以上の逆転写のインヒビター、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のキャップ結合分子、１つ以上の逆転写緩衝液、および全長のｃＤＮＡを作製するための説明書からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、キット。
【請求項３０】
増大した量または百分率の全長ｃＤＮＡを作製するための、組成物。
【請求項３１】
逆転写活性酵素を有するポリペプチドに対して特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項３２】
ｍＲＮＡキャップ構造に対して特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２６３９０５（Ｐ２０１０−２６３９０５Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５２７５２（Ｐ２０１０−１５２７５２）
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【分割の表示】特願２０００−６０２８０１（Ｐ２０００−６０２８０１）の分割
【原出願日】平成１２年３月１日（２０００．３．１）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【分割の表示】特願２０００−６０２８０１（Ｐ２０００−６０２８０１）の分割
【原出願日】平成１２年３月１日（２０００．３．１）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】
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