ｉｎｖｉｔｒｏでのタンパク質の連続的な目的に適合した進化のための方法
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化方法におけるタンパク質の変異体の製造方法であって、次の工程：（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、（ｉ）変異すべきタンパク質Ｙをコードする核酸配列Ｓ、（ｉｉ）タンパク質Ｙ及び／又は少なくとも１種のこの変異体Ｙに結合することができる目的分子Ｘ1、（ｉｉｉ）核酸配列Ｓを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、（ｉｖ）核酸配列Ｓの転写産物を逆転写することができる逆転写酵素（ＲＴ）、その際、目的分子ＸはＰｏｌに、そしてタンパク質ＹはＲＴにカップリングしているか、又は目的分子ＸはＲＴに、そしてタンパク質ＹはＰｏｌにカップリングしている、（Ｂ） タンパク質Ｙの変異体Ｙ及び、これをコードする核酸配列Ｓ′の形成下での転写、逆転写及び翻訳を可能にし、かつ、目的分子Ｘのための改善された結合特性を有する変異体Ｙの形成を促進する条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙの単離工程及び場合により特性決定工程及び／又はＹをコードする核酸配列変異体Ｓの単離工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化方法におけるタンパク質の変異体の製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化方法におけるタンパク質の変異体の製造に関する。
【０００２】
発明の背景
医薬、化学産業及び農業経済の範囲におけるバイオテクノロジーの増加する重要性は、そのつどのその使用目的に最適に適合しているタンパク質をますます求めている。まずこれらのタンパク質は主として環境から、大抵はいわゆるメタゲノムスクリーニングの範囲内で単離される。ますます前記タンパク質は将来には様々な方法を介して予定される「人工的な」使用条件に適用される。
【０００３】
従って、例えば、天然の変異体よりもより耐熱性であり、他の基質特異性を有するか又はより高い活性を示す酵素が必要とされる。医薬的タンパク質は例えば、より少なく投薬されることができるようにより長い半減期を示すか、又は、目的分子に対する高親和性かつ特異的な結合を介して、疾病に関連した物質代謝経路又は感染経路を阻害することが望ましい。
【０００４】
技術水準
この適合は部分的には、合理的タンパク質設計アプローチ（rationale Protein Design Ansaetze）を介して行われる。しかしながらこれまでには、タンパク質の所望の機能−表現型−からその構造を推定するか又はタンパク質の３次元構造から相応する一次配列を導く、極めて限定された手段のみが存在する。それにもかかわらずタンパク質の機能向上を達成すべく、現在のところ、「目的に指向した進化」（Directed Evolution）との概念にまとめられる部分的進化アプローチが使用される。
【０００５】
現在の技術水準によれば、Directed Evolutionのこれまでの方法は実質的に、改良すべきタンパク質の多数の変異体（子孫）の産生及び改善された誘導体に応じたその選択に基づく。この際、検査すべき突然変異体の数は、部分的に極めて巨大である可能性があり、しかしながら通常は１０11未満である。１００個のみのアミノ酸のタンパク質を考慮する場合には、理論的に２０100＝１０130個のこの相違する変異体が存在する。１０11の大きさのライブラリーはこれに応じて、可能性のある変異体の極めて少ない部分のみをカバーする。このようなライブラリー中に理論的に最良の変異体が見出されることができる確率はほぼゼロである。
【０００６】
目的分子に対して最大の親和性で多数の変異体をスクリーニングするために、既に多数のプロトコールが開発されている（例えば、酵母ツーハイブリッド（Yeast Two-Hybrid）、細菌ディスプレイ（Bacterial Display）、ファージディスプレイ（Phage Display）、リボソームディスプレイ（Ribosomal Display）、ｍＲＮＡディスプレイ（mRNA Display））。
【０００７】
他の特性、例えば酵素活性のスクリーニングのためには、大抵はアッセイフォーマット（Assay-Formate）が必要とされ、これは比較的少ない数の変異体（＜１０6）のみの検査を可能にする。この方法は、突然変異体のライブラリーの産生並びに引き続くその選択に限定されている点で共通している。複製（＝最後に行われる選択の「当選者」の突然変異体のすぐ次の世代）は、このプロトコールを用いて確かに手動で可能であるが、しかしながら先行する工程と同様に手間がかかる。従って、相応するアプローチは通例は、１〜２つの世代にわたるのみである。この理由から、述べられたプロトコールは、本来の意味合いにおける進化的アプローチではなく、むしろ存在する変異体プールの排他的選択である。従って、多数の世代を越えた段階的な適合の潜在能力は利用されることができず、これはしかしながら、場合によっては最も活性のある変異体を天文学的に巨大な数の可能性から同定するための必要な前提条件であるかも知れない。
【０００８】
その３つの前提条件−複製、突然変異及び選択−を用いた進化の原則は、所定の系のうちでの、単純にそして高度にまで適合された構造の指向された発達を引き起こすことを可能にする。いわゆる「ブラインドウォッチメーカー」のこのモデルは、計画的な助力無しに、かつ、構造データの必要とされる知識無しに、複雑性の作成を可能にする。
【０００９】
Bauer et al.は１９８９年に（PNAS (1989) 86, 7937-7941）、Ｑβ−レプリカーゼが見出されかつ任意のＲＮＡで末端で接種（animpfen）される細管中で連続的な進化プロセスが生じることを示した。重合フロントがこの細管に沿って生じ、この経過において生じるＲＮＡポリメラーゼはファージ特異的な配列／二次構造へと進化し、というのもこれらはレプリカーゼによりより迅速に複製されるからである。この実験が直接的な実際的な有用性を示さないにもかかわらず、この実験は３つの因子、複製、突然変異及び選択の潜在能力を顕著にカバーする（belegen）。
【００１０】
WO 02/22869は、分子ライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ進化の際の使用方法を記載する。この際、「ツーハイブリッド系（Two Hybrid - System）」系が使用される。ここで、高められたエラー頻度を有するポリメラーゼが単に使用されることができるが、しかし逆転写酵素は使用されない。この刊行物は従って、いわゆる「エラープローンＰＣＲ（Error-Prone-PCR）」に関する。
【００１１】
WO 2004/024917は、酵素の指向された進化方法を記載し、その際このタンパク質及びそのコードＤＮＡは空間的にカップリングされていて、かつ一区画中に閉じこめられている。このタンパク質はペプチドタグを有する融合コンストラクトとして存在する。出発材料はＤＮＡライブラリーである。しかしながら、リガンド−タンパク質相互作用は選択のために使用されず、かつ、ＲＮＡポリメラーゼにより突然変異は導入されない。
【００１２】
WO 2005/030957は、融合タンパク質としてコードＤＮＡにカップリングしているタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を開示する。
【００１３】
類似の系は、Bernath, K. et al.によっても記載されている（J,Mol. Biol. (04.02.2005) 345 (5), 1015-1026）。
【００１４】
WO 01/51663は、統合された系及び核酸の修飾方法を開示する。特にここでは、Ｑβ−レプリカーゼの使用下でのＮＡＳＢＡ方法が使用される。ＲＮＡポリメラーゼによる突然変異の導入に関する示唆はしかしながら開示されていない。
【００１５】
逆転写酵素及び他のタンパク質からの融合タンパク質は既に公知であるにもかかわらず、ＲＴ−融合タンパク質又はＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ−融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ進化における使用についての示唆は存在しない。
【００１６】
Ｑβ−レプリカーゼ系もまた既に詳細に試験されている（McCaskill及びBauer (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 4191-4195）。この刊行物は、Ｑβ−レプリカーゼ系中での進化波（Evolutionswelle）を記載する。このＲＮＡフロントは、レプリコンの「フィット性」が高いほどより迅速に移動する。本発明による系は、しかしながらこの刊行物から取り出すことができない。
【００１７】
WO 2004/108926は、改善された結合能を有するタンパク質の人工的な進化を開示する。前記タンパク質はＲＮＡレプリコン中でコードされ、これは欠点のある複製により準種（Quasi-Spezies）を形成する。これはこの際しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏ発現である。
【００１８】
これまでには、タンパク質を進化させることを可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ系はいまだ存在しない。突然変異体ライブライリーの手間のかかる作成及びスクリーニングを回避する、改善した特性を有するタンパク質の目的に指向した進化のための系及び方法に関する要求がいまだに存在する。
【００１９】
本発明の主題は、次の工程；
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ｉ）変異すべきタンパク質Ｙをコードする核酸配列Ｓ、
（ｉｉ）タンパク質Ｙ及び／又は少なくとも１種のこの変異体Ｙ′に結合することができる目的分子Ｘ、
（ｉｉｉ）核酸配列Ｓを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
（ｉｖ）核酸配列Ｓの転写産物を逆転写することができる逆転写酵素（ＲＴ）、
その際、目的分子ＸはＰｏｌに、そしてタンパク質ＹはＲＴにカップリングしているか、
又は目的分子ＸはＲＴに、そしてタンパク質ＹはＰｏｌにカップリングしている、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′及び、これをコードする核酸配列Ｓ′の形成下での転写、逆転写及び翻訳を可能にし、かつ、目的分子Ｘのための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の形成を促進する条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び場合により特性決定工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程を含む、タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法である。
【００２０】
特に、本発明は、タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法であって、次の工程；
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ａ）次のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ａ１）ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）によりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ａ２）変異すべきタンパク質Ｙ、及び
（ａ３）逆転写酵素（ＲＴ）、
又は
（ａ３′）ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
その際、（ａ２）及び（ａ３）又は（ａ３′）をコードする配列断片は、（ａ１）によるｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列の制御下で融合タンパク質をコードする、
（ｂ）次のものを含有するタンパク質複合体、
（ｂ１）変異すべきタンパク質Ｙの変異体少なくとも１種に結合することができる成分Ｘ、及び
（ｂ２）（ａ）からの核酸配列Ｓの転写のためのＲＮＡポリメラーゼＰｏｌ、
又は
（ｂ２′）逆転写酵素ＲＴ、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の形成を可能にする条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び場合により特性決定工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程を含むタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法に関する。
【００２１】
本発明の内容は従って、一方では所定の変異体ライブラリーの選択を実験室中で可能にし、かつ同時に複製機構を包含する自律系である。この際、この選択は−天然の進化と同様に−、より良好に適合された変異体の有利な複製を介して実現されることが望ましい。
【００２２】
本発明は従って、改善された特性、特に改善された結合特性を有するタンパク質の進化を可能にする方法を提供する。この本発明による系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び逆転写を組み合わせる。意外にも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系中においてはこの３つの工程を１つの天然の進化方法へと組み合わせることが可能であることが強調される。この系においては、変異すべきタンパク質をコードする核酸配列のｍＲＮＡ転写産物が産生され、この転写産物は引き続き逆転写により再度ｃＤＮＡへと書き換えられ、これは次いで新たに転写されかつ逆転写されることができる。
【００２３】
ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素の使用下でのこの増幅方法は、ＰＣＲの代替品として既に公知である。この既に公知の核酸−増幅方法の１つは、ＮＡＳＢＡ原則（参照、例えばRomano et al., 1995, J. Virol. Methods, 54 (2-3); 109-119; Romano et al., 1997, Immunol. Invest. 26 (1-2): 15-28）である。
【００２４】
有利には、逆転写酵素を用いるこの逆転写工程により、これは公知のとおり、プルーフリーディング機能のエラーのために所定のエラー率を有するが、転写産物から出発してｃＤＮＡが産生され、このうち少なくとも若干のものは突然変異によりこの当初のテンプレートとは相違する。このｃＤＮＡが繰り返し転写及び逆転写される場合には、核酸レベルで多数の変異体が得られ、これは変異すべきタンパク質の変異体をコードする。
【００２５】
本発明によるｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、この転写産物は、タンパク質及びこの当初のコードされるタンパク質の変異体の形成下で翻訳される。
【００２６】
本発明による発現系においては、定義された空間中で、転写、逆転写及び翻訳に必要とされる剤（例えばプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｔＲＮＡｓ、アミノ酸その他）が、十分な量で存在する。この定義された空間中に一定の部位で核酸配列Ｓ、目的分子Ｘ、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素が提供される場合には、例えば接種により提供される場合には、転写、逆転写及び翻訳の経過の際に、この接種部位で相応する剤が調達され、かつ、進行するいわゆる反応フロント（ここで転写産物、タンパク質及び逆転写産物（ｃＤＮＡ）が存在する、（これは最後に形成される））が形成される。
【００２７】
使用される複製系は有利には、十分な突然変異率が複製の間に許可されるように構成される。このようにして理論的に試験される、出発コンストラクトの突然変異体の数は、１世代の当選者の子孫の数から、実験の世代の総数の累乗に対して計算される（例えば、１世代につき１０個の子孫が４００世代では＝１０400個の可能性のある変異体）。但し、この１０400の個々の変異体の各々は明らかに実験において物理的に存在することは不可能であり、しかしながらこの系は自体で、複合体の仮想的な地帯の内部の「小道（Pfad）」を探索し、これは常に、絶対的な最大値へと導く。前記小道に沿った変異体のみが実験の間に存在していて、理論的には前記地帯の全ての点（変異体）が可能である。
【００２８】
本発明の発明者は、改善された特性を有するタンパク質変異体をコードする、形成され、突然変異された核酸の特定のものの転写、逆転写及び翻訳が有利に進行するように、このタンパク質変異体の形成を制御するための手段を見出した。これにより、改善されたタンパク質変異体をコードする及びｃＤＮＡ及び転写産物が、多数存在し、かつ、重合フロントでより迅速に前方に移動する。
【００２９】
極めて特定の、改善された変異体の形成に必要とされる進化圧力（Evolutionsdruck）は次のように産生される。
【００３０】
変異すべきタンパク質Ｙは、目的分子Ｘに結合することができる。前記タンパク質Ｙを本発明の範囲内で変異させる場合には、変異体Ｙ′が生じ、このうち少なくとも幾つかは目的分子Ｘに対する結合のための改善された結合特性を示すことができる。このような変異体の産生を促進するため、及び場合によりこのような変異体をまた更に変異させるため、この結合特性を更に改善するために、本発明による方法においてこの条件は、Ｘ及び改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の間での結合が、改善された結合特性を有する変異体Ｙ′をコードする転写産物を生じるように選択され、有利には逆転写される。これにより、改善された結合特性を有する変異体Ｙ′をコードするｃＤＮＡｓが生じる。改善された結合特性を有する変異体Ｙ′のための転写産物の逆転写が促進されることにより、変異体の新規の転写及び翻訳もまた定量的に促進される。
【００３１】
これを達成するために、有利には、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｘ及び変異体Ｙ′からなる複合体が形成され、これはこの変異体Ｙ′をコードする転写産物の逆転写を可能にする。Ｘに対する改善された結合特性を有する変異体Ｙ′をコードする転写産物に対するＲＴの空間的近位のために、この転写産物は、改善された変異体Ｙ′と複合化されている（又はこれらと融合タンパク質を形成する）ＲＴにより逆に転写される。図１は、本方法の本発明による代替法を図式により示す。
【００３２】
有利には本発明による方法において、Ｙは核酸Ｓによりタンパク質Ｐを有する融合タンパク質としてコードされ、その際このタンパク質Ｐは、転写又は逆転写に関与するタンパク質である。Ｐは従って、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）又は逆転写酵素（ＲＴ）であることができ、又はＰは、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素と会合（assozieren）しているか又はこれらに結合されることができるタンパク質であることができる。
【００３３】
本発明による方法の２つの有利な代替法（１及び２）において、前記タンパク質Ｙは（１）ＲＴと会合しているか又はＲＴを有する融合タンパク質としてコードされるか、又は（２）Ｐｏｌと会合するか又はＰｏｌを有する融合タンパク質としてコードされる。
【００３４】
有利にはＹは融合タンパク質として核酸配列Ｓによりコードされる。これはしかしながら、タンパク質Ｙとして核酸配列Ｓによりコードされ、かつ翻訳の後に相応する更なる成分と関連させられることもできる。これは、タンパク質相互作用を介して又は結合分子（例えばビオチン／アビジン、ビオチン ストレプトアビジンその他）を介して達成されることができる。Ｙ又はＹ′のＲＴ又はＰｏｌに対するカップリングの更なる手段は、とりわけ、共有結合的連結を介した化学的カップリング又は架橋性分子、例えばいわゆるリンカー、例えば二官能性クロスリンカーを介した連結をも包含する。この際適した架橋剤は当業者によりこの分野で問題なく選択されることができる。
【００３５】
本発明による方法の第１の代替法に対する変法において、タンパク質Ｙ及びＲＴからなる複合体はまた、２つの異なる核酸配列Ｓ１及びＳ２によっても、そのつど適した転写制御配列の制御下でコードされることができ、その際この場合には、融合タンパク質は生じないが、Ｙ及びＲＴの間での結合は他の方法で引き起こされることができ、例えばビオチン／アビジン又はストレプトアビジンを介して引き起こされることができる。即ち、核酸配列Ｓはこの場合に、２つの核酸配列Ｓ１及びＳ２の形で存在する。重要なのは、この翻訳の終了時に、この変異すべきタンパク質Ｙが、ＲＴタンパク質に結合しているか又はこれと複合化して存在することである。
【００３６】
目的分子Ｘは、前述の代替法に相応して、（１）Ｐｏｌと又は（２）ＲＴと会合しているか又はそのつどの成分を有する融合タンパク質を形成する。
【００３７】
目的分子Ｘは、タンパク質、ペプチド又は核酸であるか、又は他の分子であることができる。従って、前記分子は、核酸（例えば、プラスミドでコードされる）として提供され、かつ本発明による発現系で発現されるか、又は、分子として提供されることができる。
【００３８】
第１の代替法においては、変異すべきタンパク質Ｙは、逆転写酵素を有する融合タンパク質の形で発現カセットによりコードされる。発現カセットは、核酸配列Ｓの形で提供され、これは本発明による進化方法の経過において転写及び翻訳される。転写及び逆転写の他に、本方法は、核酸Ｓの転写産物の翻訳を可能にする。これにより、この第１の代替法において、この変異すべきタンパク質Ｙ並びに逆転写酵素ＲＴを含有する融合タンパク質が生じる。
【００３９】
この逆転写酵素はしかしながら、第２の代替法に応じて、Ｘを有する複合体として提供され、同様にＲＴがその他の様式でＸにカップリングしている融合タンパク質として又は複合体として提供されることもできる。第２の代替法によれば、核酸Ｓによりコードされる融合タンパク質が、ＲＴの代わりにＲＮＡポリメラーゼを含有する。この場合には、反応の開始時に、ＲＮＡポリメラーゼが提供されなくてはならない。この方法が次いで、転写及び翻訳を可能にする条件下で実施される場合には、この翻訳により産出される、ＳによりコードされるポリメラーゼＰｏｌは次のサイクルにおいて、出発核酸Ｓ並びに場合によりこの変異体Ｓ′を転写のためのテンプレートとして使用することができる。
【００４０】
転写制御配列は有利には、全ての慣用の、ＲＮＡ重合反応に適したプロモーターから選択されることができるプロモーターである。有利には、本発明の目的のために、Ｔ７−、Ｔ３−及びＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。しかしながら他のプロモーターが選択されることもできる。
【００４１】
転写の実施のために、相応してＲＮＡポリメラーゼが提供され、有利にはこれはＲＮＡポリメラーゼＴ７、ＲＮＡポリメラーゼＴ３及びＲＮＡポリメラーゼＳＰ６から選択される。ＲＮＡポリメラーゼは、本発明による方法の選択される代替法に応じて、核酸によりコードされて存在することができるか、又はタンパク質（又は融合タンパク質又は複合体）として発現系中に導入されることができる。
【００４２】
重要なのは、本発明の目的のためには、Ｘ及びＹ又はＸ及びＹ′の間での結合が成功することであり、この結合により逆転写酵素ＲＴはこの転写産物の空間的近傍にもたらされる。即ち、Ｐ／Ｘ／（Ｙ又はＹ′）／ＲＴからなる立体複合体が生じる。これは、転写反応及び翻訳反応の経過後にまさに転写された、Ｙ′をコードするｍＲＮＡ分子が、ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌに対して空間的近傍に存在し、これはタンパク質Ｘとカップリングしていることを意味する。タンパク質Ｘ及びＹまたはＹ′の間の結合が生じる場合には、その際ＹまたはＹ′はＲＴと複合化されて存在するが、有利にはＲＴタンパク質は転写産物に対する直接的な空間的近傍に見出される。ＹまたはＹ′を介したＲＮＡ転写産物及びタンパク質ＲＴの間の空間的近位により、Ｙ′のためのこの転写産物の逆転写が促進される。
【００４３】
従って、ｍＲＮＡレベルで核酸配列Ｓの変異体が産生されることができ、これは次いで、同様に変異体を作出する翻訳産物を生じる。このようにして、変異すべきタンパク質Ｙの変異体、即ち変異体Ｙ′が生じる。この際、より良好に又はより劣悪に、前記タンパク質Ｘに結合する変異体が生じる。
【００４４】
タンパク質Ｘに対する結合に関してより良好な特性を有する変異体Ｙ′のための進化の利点は、有利な一実施態様において、転写の直ぐ後に、機能的なＲＴがその固有の転写産物の直ぐ近傍中で、そして従ってＹ′について見出され、かつこれが有利には逆転写されることにある。これにより、より迅速に及び／又はより多くの、改善された変異体Ｙ′をコードするｃＤＮＡが生じる。
【００４５】
選択利点を有するこの変異体は次いで再度、出発核酸配列Ｓ′として使用され、これは再度転写、逆転写、かつ翻訳されることができる。このようにして、有利なかつ従って増強した、タンパク質Ｙの核酸配列変異体Ｓ′及び変異体Ｙ′の産生が生じ、これは本方法の経過の後に、適切な間隔の後に単離されることができる。同様に、逆転写酵素の変異体の産生の際のＲＴのエラー率も利用されることができる。
【００４６】
この効果を、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素及び／又は条件の選択により、当初提供される核酸配列Ｓの変異体Ｓ′及び従って前記核酸によりコードされるタンパク質、特にタンパク質Ｙの変異体Ｙ′を産生することにより、本発明の系は利用する。
【００４７】
有利には、特定のエラー率を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが使用され、これにより突然変異を有する転写産物が生じる。この突然変異は例えば点突然変異であることができ、例えばポリメラーゼにより置換、欠失又は挿入が生じる可能性がある。
【００４８】
ＲＮＡポリメラーゼもＲＴも、プルーフリーディング機能を有さず、かつ従ってプルーフリーディング機能を有するポリメラーゼと比較してより高い突然変異率を有する。
【００４９】
この理由から従って、有利には、相応する野生型ポリメラーゼと比較してより高いエラー率を有するポリメラーゼが使用される。技術水準においては、高められた突然変異率を有するポリメラーゼが既に公知である。有利には、Ｔ７ポリメラーゼ及びＴ３ポリメラーゼ、またしかしＳＰ６ポリメラーゼでもある。Ｔ７ポリメラーゼのうち、高められたエラー率を有する変異体が既に存在する（Brakmann及びGrzeszik, 2001, Chem. Biochem. 2, 212-219）。
【００５０】
様に、所定の突然変異率を有する転写産物を産生することができる逆転写酵素も使用されることができる。
【００５１】
有利には、Ｐｏｌ及びＲＴポリメラーゼ又は逆転写酵素のために５′−３′−エキソヌクレアーゼ活性無しで使用される。本発明の目的のためには、ＲＮＡポリメラーゼのエラー率又は逆転写酵素のいずれかが、又はしかしながら両方もが使用されることができる。
【００５２】
転写産物又は／及び逆転写産物の産生のために、高められたエラー率を有する前述のＰｏｌ分子及びＲＴ分子に代替的に又は補足的に、突然変異率（エラー率）がその他の様式で高められることも可能である。例えば、突然変異作成剤、ヌクレオチド類似体が、Ｐｏｌ及び／又はＲＴの基質として又は／及びＵＶ線も使用されることができる。当業者はこのような変異原物質を自体で選択することができ、というのもこれらは技術水準において公知であるからである。
【００５３】
本発明による方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実施に適している。この発現環境はこのために適した全ての発現環境であることができ、有利には細管が使用される。細管の代わりにしかしながら、２次元の発現環境、例えば２つのガラスプレートの間の環境を選択することも可能である。また３次元の発現環境を使用することもできる。
【００５４】
細管が使用される場合には、これらは末端でいわゆる接種領域で核酸配列Ｓでもって接種される。
【００５５】
２次元系が使用される場合には、この系を、隅で又は他の部位でも、例えば中間部で、核酸配列Ｓでもって接種することも可能である。このような２次元系により、小道の自由度及び数は向上し、これは変異すべきタンパク質Ｙの進化に関連する（einschlagen）。このプロセスは両方の場合において、重合フロントの観察を介して制御可能なままである。これは例えば、マーカー剤、例えばインターカレーション剤により行われることができる。新規の変異体は次いで、より迅速な、線形に細管系中で又は円形に２次元系中で伸展するフロントを形成する。所望の変異体の試料取り出し又は単離は次いで、細管の末端で又は２次元系の周辺で又は任意の他の部位で行われることができる。
【００５６】
また、より大きな容量の３次元の発現系を使用することも可能である。このために次いで、反応媒体がより粘性な状態であるように発現環境条件が選択されることが望ましく、というのもこの液体はより大きな容量の系中で毛管力によりあまり安定化されないからである。
【００５７】
細管又は２次元又は３次元系に沿った重合フロントの速度は変異体の発生の前進のための、そして従って変異すべきタンパク質Ｙ及びその変異体Ｙ′の結合特性の改善のための指標として用いられることができる。
【００５８】
更に、転写及び翻訳のための全ての必要な反応条件は相応して調節される。特にこのために、プライマーとしての相応するオリゴヌクレオチド、及び、ヌクレオチド、特にｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓその他の作成が属する。翻訳のために相応する酵素及び剤が必要とされ、例えばリボソーム、ｔＲＮＡｓ、アミノ酸、エネルギーキャリア（例えばＧＴＰ及び類似物）その他が必要とされる。
【００５９】
この種の反応条件は、当業者により問題無しに調整されることができ、かつ、この相応するプライマーヌクレオチドは当業者により選択されることもできる。
【００６０】
本発明による方法は、提供される系中での自体によるタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の産生を可能にする。従って、変異すべきタンパク質Ｙを自体で特定の方向に発達させることが可能であり、これは目的分子Ｘに対する変異体Ｙ′の結合能により制御されることができる。
【００６１】
従って、そのつど任意のタンパク質Ｙを本発明による方法において進化させることが可能である。このために単に、Ｙに結合することができる相応する目的分子Ｘが選択され、かつ、Ｘのための改善された結合特性を有する変異体が手間のかかるスクリーニング無しに得られる。
【００６２】
有利には、核酸配列変異体Ｓ′（ＲＮＡ又はＤＮＡ又は両方）は、反応フロントで単離される。しかしながら、Ｙ′を単離することもできる。
【００６３】
更に、本発明は、改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な発現制御配列をコードする核酸配列Ｓ、変異すべきタンパク質Ｙ、逆転写酵素ＲＴ、
（ｃ）Ｐｏｌ及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができるタンパク質Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列
を含有する改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットに関する。
【００６４】
更に本発明は、改善された特性を有するタンパク質の製造のための代替的なキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ｉｉ）変異すべきタンパク質Ｙ、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌ、
（ｃ）逆転写酵素ＲＴ及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができるタンパク質Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列
を含有する改善された特性を有するタンパク質の製造のための代替的なキットに関する。
【００６５】
図の説明
図１は、請求項１による方法を図式により示す。ＮＡＳＢＡ反応混合物で充填された細管系中で、重合フロント及び進化フロントが進行する。ここでは、空間的に有利には分子が産生され、これは、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼに対してカップリングしたタンパク質Ｘと相互作用できる変異体をコードする。
【００６６】
実施例
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（NCBI遺伝子バンク, Acc. No. P00573）及びタンパク質Ａ（Acc. No. CAA43604）からなる融合タンパク質大腸菌（E. coli）中で発現させ、アフィニティクロマトグラフィにより精製し、かつ、５μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ／１０％グリセロール中で調整した。引き続き、抗ＨＩＶ Ｅｎｖ抗体２Ｆ５(Hofmann-Lehmann et al., 2001; Ferrantelli et al., 2003)を１：１の比で、キメラ融合タンパク質のこのタンパク質Ａ−ドメインに対して結合させた（＝ＲＮＡ−Ｐｏｌ／２Ｆ５複合体）。
【００６７】
シラン化した、両末端で開放している、１ｍｍの内径及び１０ｃｍの長さを有するガラスキャピラリーを約８０μｌの次の反応混合物で充填した。
【００６８】
大腸菌 ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳−反応混合物（Rapid Translation System RTS）、Roche, Penzbergによる、１；１の比で、ＰＢＳを用いて
＋ＲＮＡ−Ｐｏｌ／２Ｆ５複合体、終濃度０．０５μｇ／ｍｌで、
＋１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ４０００、粘度向上のため、
＋ＲＴプライマー及び２本鎖プライマー、終濃度２ｐｍｏｌ／μｌで、
＋ｄＮＴＰヌクレオチド、そのつど０．１ｎｍｏｌ／μｌの終濃度で、
＋ＮＴＰヌクレオチド、そのつど０．１ｎｍｏｌ／μｌの終濃度で、
＋場合により、エチジウムブロミド、終濃度０．１ｎｇ／μｌで。
【００６９】
この充填された細管を３７℃に加熱したチャンバー中に水平に固定し、末端で１μＭの、２本鎖ＤＮＡ分子溶液０．５μｌで接種した。このＤＮＡ分子は、ＨＩＶ−Ｅｎｖ及びモロニーマウス白血病ウィルス（Acc. No. AAO46154）の逆転写酵素からの融合タンパク質のためのオープンリーディングフレームを含む。
【００７０】
この反応チャンバーを閉鎖し、かつ接種されたＤＮＡの複製は重合フロントとして交互に転写産物（ＲＮＡ）及び逆転写産物（ＤＮＡ）としてこの細管に沿って、存在する剤の方向に（他の末端へと）伝播することができる。
【００７１】
この混合物にエチジウムブロミドを添加する場合には、ＵＶハンドランプを用いて毎時間この目下の重合フロントの位置を確認し、かつこの反応の終点（この細管の末端への到達）を決定した。
【００７２】
この細管末端への到達後に、重合フロント（ＲＮＡ及びＤＮＡ）を含有する反応混合物２μｌをこの細管から取り出し、かつこの含有されるＤＮＡを、特異的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応を介して増幅した。このＰＣＲ産物を適したベクター中でサブクローニングし、かつ大腸菌中で形質転換した。
【００７３】
この３８４クローンの配列評価は、進化したＨＩＶ−Ｅｎｖ変異体をコードする相違する配列の統計学的分布を生じ、この変異体は抗体２Ｆ５に対する高められた親和性を示す。より詳細な検査は、この変異体中の繰り返されるタンパク質モチーフを示し、これは高められた親和性を担う。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、請求項１による方法を図式により示す図である。
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化方法におけるタンパク質の変異体の製造に関する。
【０００２】
発明の背景
医薬、化学産業及び農業経済の範囲におけるバイオテクノロジーの増加する重要性は、そのつどのその使用目的に最適に適合しているタンパク質をますます求めている。まずこれらのタンパク質は主として環境から、大抵はいわゆるメタゲノムスクリーニングの範囲内で単離される。ますます前記タンパク質は将来には様々な方法を介して予定される「人工的な」使用条件に適用される。
【０００３】
従って、例えば、天然の変異体よりもより耐熱性であり、他の基質特異性を有するか又はより高い活性を示す酵素が必要とされる。医薬的タンパク質は例えば、より少なく投薬されることができるようにより長い半減期を示すか、又は、目的分子に対する高親和性かつ特異的な結合を介して、疾病に関連した物質代謝経路又は感染経路を阻害することが望ましい。
【０００４】
技術水準
この適合は部分的には、合理的タンパク質設計アプローチ（rationale Protein Design Ansaetze）を介して行われる。しかしながらこれまでには、タンパク質の所望の機能−表現型−からその構造を推定するか又はタンパク質の３次元構造から相応する一次配列を導く、極めて限定された手段のみが存在する。それにもかかわらずタンパク質の機能向上を達成すべく、現在のところ、「目的に指向した進化」（Directed Evolution）との概念にまとめられる部分的進化アプローチが使用される。
【０００５】
現在の技術水準によれば、Directed Evolutionのこれまでの方法は実質的に、改良すべきタンパク質の多数の変異体（子孫）の産生及び改善された誘導体に応じたその選択に基づく。この際、検査すべき突然変異体の数は、部分的に極めて巨大である可能性があり、しかしながら通常は１０11未満である。１００個のみのアミノ酸のタンパク質を考慮する場合には、理論的に２０100＝１０130個のこの相違する変異体が存在する。１０11の大きさのライブラリーはこれに応じて、可能性のある変異体の極めて少ない部分のみをカバーする。このようなライブラリー中に理論的に最良の変異体が見出されることができる確率はほぼゼロである。
【０００６】
目的分子に対して最大の親和性で多数の変異体をスクリーニングするために、既に多数のプロトコールが開発されている（例えば、酵母ツーハイブリッド（Yeast Two-Hybrid）、細菌ディスプレイ（Bacterial Display）、ファージディスプレイ（Phage Display）、リボソームディスプレイ（Ribosomal Display）、ｍＲＮＡディスプレイ（mRNA Display））。
【０００７】
他の特性、例えば酵素活性のスクリーニングのためには、大抵はアッセイフォーマット（Assay-Formate）が必要とされ、これは比較的少ない数の変異体（＜１０6）のみの検査を可能にする。この方法は、突然変異体のライブラリーの産生並びに引き続くその選択に限定されている点で共通している。複製（＝最後に行われる選択の「当選者」の突然変異体のすぐ次の世代）は、このプロトコールを用いて確かに手動で可能であるが、しかしながら先行する工程と同様に手間がかかる。従って、相応するアプローチは通例は、１〜２つの世代にわたるのみである。この理由から、述べられたプロトコールは、本来の意味合いにおける進化的アプローチではなく、むしろ存在する変異体プールの排他的選択である。従って、多数の世代を越えた段階的な適合の潜在能力は利用されることができず、これはしかしながら、場合によっては最も活性のある変異体を天文学的に巨大な数の可能性から同定するための必要な前提条件であるかも知れない。
【０００８】
その３つの前提条件−複製、突然変異及び選択−を用いた進化の原則は、所定の系のうちでの、単純にそして高度にまで適合された構造の指向された発達を引き起こすことを可能にする。いわゆる「ブラインドウォッチメーカー」のこのモデルは、計画的な助力無しに、かつ、構造データの必要とされる知識無しに、複雑性の作成を可能にする。
【０００９】
Bauer et al.は１９８９年に（PNAS (1989) 86, 7937-7941）、Ｑβ−レプリカーゼが見出されかつ任意のＲＮＡで末端で接種（animpfen）される細管中で連続的な進化プロセスが生じることを示した。重合フロントがこの細管に沿って生じ、この経過において生じるＲＮＡポリメラーゼはファージ特異的な配列／二次構造へと進化し、というのもこれらはレプリカーゼによりより迅速に複製されるからである。この実験が直接的な実際的な有用性を示さないにもかかわらず、この実験は３つの因子、複製、突然変異及び選択の潜在能力を顕著にカバーする（belegen）。
【００１０】
WO 02/22869は、分子ライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ進化の際の使用方法を記載する。この際、「ツーハイブリッド系（Two Hybrid - System）」系が使用される。ここで、高められたエラー頻度を有するポリメラーゼが単に使用されることができるが、しかし逆転写酵素は使用されない。この刊行物は従って、いわゆる「エラープローンＰＣＲ（Error-Prone-PCR）」に関する。
【００１１】
WO 2004/024917は、酵素の指向された進化方法を記載し、その際このタンパク質及びそのコードＤＮＡは空間的にカップリングされていて、かつ一区画中に閉じこめられている。このタンパク質はペプチドタグを有する融合コンストラクトとして存在する。出発材料はＤＮＡライブラリーである。しかしながら、リガンド−タンパク質相互作用は選択のために使用されず、かつ、ＲＮＡポリメラーゼにより突然変異は導入されない。
【００１２】
WO 2005/030957は、融合タンパク質としてコードＤＮＡにカップリングしているタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を開示する。
【００１３】
類似の系は、Bernath, K. et al.によっても記載されている（J,Mol. Biol. (04.02.2005) 345 (5), 1015-1026）。
【００１４】
WO 01/51663は、統合された系及び核酸の修飾方法を開示する。特にここでは、Ｑβ−レプリカーゼの使用下でのＮＡＳＢＡ方法が使用される。ＲＮＡポリメラーゼによる突然変異の導入に関する示唆はしかしながら開示されていない。
【００１５】
逆転写酵素及び他のタンパク質からの融合タンパク質は既に公知であるにもかかわらず、ＲＴ−融合タンパク質又はＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ−融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ進化における使用についての示唆は存在しない。
【００１６】
Ｑβ−レプリカーゼ系もまた既に詳細に試験されている（McCaskill及びBauer (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 4191-4195）。この刊行物は、Ｑβ−レプリカーゼ系中での進化波（Evolutionswelle）を記載する。このＲＮＡフロントは、レプリコンの「フィット性」が高いほどより迅速に移動する。本発明による系は、しかしながらこの刊行物から取り出すことができない。
【００１７】
WO 2004/108926は、改善された結合能を有するタンパク質の人工的な進化を開示する。前記タンパク質はＲＮＡレプリコン中でコードされ、これは欠点のある複製により準種（Quasi-Spezies）を形成する。これはこの際しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏ発現である。
【００１８】
これまでには、タンパク質を進化させることを可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ系はいまだ存在しない。突然変異体ライブライリーの手間のかかる作成及びスクリーニングを回避する、改善した特性を有するタンパク質の目的に指向した進化のための系及び方法に関する要求がいまだに存在する。
【００１９】
本発明の主題は、次の工程；
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ｉ）変異すべきタンパク質Ｙをコードする核酸配列Ｓ、
（ｉｉ）タンパク質Ｙ及び／又は少なくとも１種のこの変異体Ｙ′に結合することができる目的分子Ｘ、
（ｉｉｉ）核酸配列Ｓを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
（ｉｖ）核酸配列Ｓの転写産物を逆転写することができる逆転写酵素（ＲＴ）、
その際、目的分子ＸはＰｏｌに、そしてタンパク質ＹはＲＴにカップリングしているか、
又は目的分子ＸはＲＴに、そしてタンパク質ＹはＰｏｌにカップリングしている、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′及び、これをコードする核酸配列Ｓ′の形成下での転写、逆転写及び翻訳を可能にし、かつ、目的分子Ｘのための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の形成を促進する条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び場合により特性決定工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程を含む、タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法である。
【００２０】
特に、本発明は、タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法であって、次の工程；
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ａ）次のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ａ１）ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）によりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ａ２）変異すべきタンパク質Ｙ、及び
（ａ３）逆転写酵素（ＲＴ）、
又は
（ａ３′）ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
その際、（ａ２）及び（ａ３）又は（ａ３′）をコードする配列断片は、（ａ１）によるｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列の制御下で融合タンパク質をコードする、
（ｂ）次のものを含有するタンパク質複合体、
（ｂ１）変異すべきタンパク質Ｙの変異体少なくとも１種に結合することができる成分Ｘ、及び
（ｂ２）（ａ）からの核酸配列Ｓの転写のためのＲＮＡポリメラーゼＰｏｌ、
又は
（ｂ２′）逆転写酵素ＲＴ、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の形成を可能にする条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び場合により特性決定工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程を含むタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法に関する。
【００２１】
本発明の内容は従って、一方では所定の変異体ライブラリーの選択を実験室中で可能にし、かつ同時に複製機構を包含する自律系である。この際、この選択は−天然の進化と同様に−、より良好に適合された変異体の有利な複製を介して実現されることが望ましい。
【００２２】
本発明は従って、改善された特性、特に改善された結合特性を有するタンパク質の進化を可能にする方法を提供する。この本発明による系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び逆転写を組み合わせる。意外にも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系中においてはこの３つの工程を１つの天然の進化方法へと組み合わせることが可能であることが強調される。この系においては、変異すべきタンパク質をコードする核酸配列のｍＲＮＡ転写産物が産生され、この転写産物は引き続き逆転写により再度ｃＤＮＡへと書き換えられ、これは次いで新たに転写されかつ逆転写されることができる。
【００２３】
ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素の使用下でのこの増幅方法は、ＰＣＲの代替品として既に公知である。この既に公知の核酸−増幅方法の１つは、ＮＡＳＢＡ原則（参照、例えばRomano et al., 1995, J. Virol. Methods, 54 (2-3); 109-119; Romano et al., 1997, Immunol. Invest. 26 (1-2): 15-28）である。
【００２４】
有利には、逆転写酵素を用いるこの逆転写工程により、これは公知のとおり、プルーフリーディング機能のエラーのために所定のエラー率を有するが、転写産物から出発してｃＤＮＡが産生され、このうち少なくとも若干のものは突然変異によりこの当初のテンプレートとは相違する。このｃＤＮＡが繰り返し転写及び逆転写される場合には、核酸レベルで多数の変異体が得られ、これは変異すべきタンパク質の変異体をコードする。
【００２５】
本発明によるｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、この転写産物は、タンパク質及びこの当初のコードされるタンパク質の変異体の形成下で翻訳される。
【００２６】
本発明による発現系においては、定義された空間中で、転写、逆転写及び翻訳に必要とされる剤（例えばプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｔＲＮＡｓ、アミノ酸その他）が、十分な量で存在する。この定義された空間中に一定の部位で核酸配列Ｓ、目的分子Ｘ、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素が提供される場合には、例えば接種により提供される場合には、転写、逆転写及び翻訳の経過の際に、この接種部位で相応する剤が調達され、かつ、進行するいわゆる反応フロント（ここで転写産物、タンパク質及び逆転写産物（ｃＤＮＡ）が存在する、（これは最後に形成される））が形成される。
【００２７】
使用される複製系は有利には、十分な突然変異率が複製の間に許可されるように構成される。このようにして理論的に試験される、出発コンストラクトの突然変異体の数は、１世代の当選者の子孫の数から、実験の世代の総数の累乗に対して計算される（例えば、１世代につき１０個の子孫が４００世代では＝１０400個の可能性のある変異体）。但し、この１０400の個々の変異体の各々は明らかに実験において物理的に存在することは不可能であり、しかしながらこの系は自体で、複合体の仮想的な地帯の内部の「小道（Pfad）」を探索し、これは常に、絶対的な最大値へと導く。前記小道に沿った変異体のみが実験の間に存在していて、理論的には前記地帯の全ての点（変異体）が可能である。
【００２８】
本発明の発明者は、改善された特性を有するタンパク質変異体をコードする、形成され、突然変異された核酸の特定のものの転写、逆転写及び翻訳が有利に進行するように、このタンパク質変異体の形成を制御するための手段を見出した。これにより、改善されたタンパク質変異体をコードする及びｃＤＮＡ及び転写産物が、多数存在し、かつ、重合フロントでより迅速に前方に移動する。
【００２９】
極めて特定の、改善された変異体の形成に必要とされる進化圧力（Evolutionsdruck）は次のように産生される。
【００３０】
変異すべきタンパク質Ｙは、目的分子Ｘに結合することができる。前記タンパク質Ｙを本発明の範囲内で変異させる場合には、変異体Ｙ′が生じ、このうち少なくとも幾つかは目的分子Ｘに対する結合のための改善された結合特性を示すことができる。このような変異体の産生を促進するため、及び場合によりこのような変異体をまた更に変異させるため、この結合特性を更に改善するために、本発明による方法においてこの条件は、Ｘ及び改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の間での結合が、改善された結合特性を有する変異体Ｙ′をコードする転写産物を生じるように選択され、有利には逆転写される。これにより、改善された結合特性を有する変異体Ｙ′をコードするｃＤＮＡｓが生じる。改善された結合特性を有する変異体Ｙ′のための転写産物の逆転写が促進されることにより、変異体の新規の転写及び翻訳もまた定量的に促進される。
【００３１】
これを達成するために、有利には、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｘ及び変異体Ｙ′からなる複合体が形成され、これはこの変異体Ｙ′をコードする転写産物の逆転写を可能にする。Ｘに対する改善された結合特性を有する変異体Ｙ′をコードする転写産物に対するＲＴの空間的近位のために、この転写産物は、改善された変異体Ｙ′と複合化されている（又はこれらと融合タンパク質を形成する）ＲＴにより逆に転写される。図１は、本方法の本発明による代替法を図式により示す。
【００３２】
有利には本発明による方法において、Ｙは核酸Ｓによりタンパク質Ｐを有する融合タンパク質としてコードされ、その際このタンパク質Ｐは、転写又は逆転写に関与するタンパク質である。Ｐは従って、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）又は逆転写酵素（ＲＴ）であることができ、又はＰは、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素と会合（assozieren）しているか又はこれらに結合されることができるタンパク質であることができる。
【００３３】
本発明による方法の２つの有利な代替法（１及び２）において、前記タンパク質Ｙは（１）ＲＴと会合しているか又はＲＴを有する融合タンパク質としてコードされるか、又は（２）Ｐｏｌと会合するか又はＰｏｌを有する融合タンパク質としてコードされる。
【００３４】
有利にはＹは融合タンパク質として核酸配列Ｓによりコードされる。これはしかしながら、タンパク質Ｙとして核酸配列Ｓによりコードされ、かつ翻訳の後に相応する更なる成分と関連させられることもできる。これは、タンパク質相互作用を介して又は結合分子（例えばビオチン／アビジン、ビオチン ストレプトアビジンその他）を介して達成されることができる。Ｙ又はＹ′のＲＴ又はＰｏｌに対するカップリングの更なる手段は、とりわけ、共有結合的連結を介した化学的カップリング又は架橋性分子、例えばいわゆるリンカー、例えば二官能性クロスリンカーを介した連結をも包含する。この際適した架橋剤は当業者によりこの分野で問題なく選択されることができる。
【００３５】
本発明による方法の第１の代替法に対する変法において、タンパク質Ｙ及びＲＴからなる複合体はまた、２つの異なる核酸配列Ｓ１及びＳ２によっても、そのつど適した転写制御配列の制御下でコードされることができ、その際この場合には、融合タンパク質は生じないが、Ｙ及びＲＴの間での結合は他の方法で引き起こされることができ、例えばビオチン／アビジン又はストレプトアビジンを介して引き起こされることができる。即ち、核酸配列Ｓはこの場合に、２つの核酸配列Ｓ１及びＳ２の形で存在する。重要なのは、この翻訳の終了時に、この変異すべきタンパク質Ｙが、ＲＴタンパク質に結合しているか又はこれと複合化して存在することである。
【００３６】
目的分子Ｘは、前述の代替法に相応して、（１）Ｐｏｌと又は（２）ＲＴと会合しているか又はそのつどの成分を有する融合タンパク質を形成する。
【００３７】
目的分子Ｘは、タンパク質、ペプチド又は核酸であるか、又は他の分子であることができる。従って、前記分子は、核酸（例えば、プラスミドでコードされる）として提供され、かつ本発明による発現系で発現されるか、又は、分子として提供されることができる。
【００３８】
第１の代替法においては、変異すべきタンパク質Ｙは、逆転写酵素を有する融合タンパク質の形で発現カセットによりコードされる。発現カセットは、核酸配列Ｓの形で提供され、これは本発明による進化方法の経過において転写及び翻訳される。転写及び逆転写の他に、本方法は、核酸Ｓの転写産物の翻訳を可能にする。これにより、この第１の代替法において、この変異すべきタンパク質Ｙ並びに逆転写酵素ＲＴを含有する融合タンパク質が生じる。
【００３９】
この逆転写酵素はしかしながら、第２の代替法に応じて、Ｘを有する複合体として提供され、同様にＲＴがその他の様式でＸにカップリングしている融合タンパク質として又は複合体として提供されることもできる。第２の代替法によれば、核酸Ｓによりコードされる融合タンパク質が、ＲＴの代わりにＲＮＡポリメラーゼを含有する。この場合には、反応の開始時に、ＲＮＡポリメラーゼが提供されなくてはならない。この方法が次いで、転写及び翻訳を可能にする条件下で実施される場合には、この翻訳により産出される、ＳによりコードされるポリメラーゼＰｏｌは次のサイクルにおいて、出発核酸Ｓ並びに場合によりこの変異体Ｓ′を転写のためのテンプレートとして使用することができる。
【００４０】
転写制御配列は有利には、全ての慣用の、ＲＮＡ重合反応に適したプロモーターから選択されることができるプロモーターである。有利には、本発明の目的のために、Ｔ７−、Ｔ３−及びＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。しかしながら他のプロモーターが選択されることもできる。
【００４１】
転写の実施のために、相応してＲＮＡポリメラーゼが提供され、有利にはこれはＲＮＡポリメラーゼＴ７、ＲＮＡポリメラーゼＴ３及びＲＮＡポリメラーゼＳＰ６から選択される。ＲＮＡポリメラーゼは、本発明による方法の選択される代替法に応じて、核酸によりコードされて存在することができるか、又はタンパク質（又は融合タンパク質又は複合体）として発現系中に導入されることができる。
【００４２】
重要なのは、本発明の目的のためには、Ｘ及びＹ又はＸ及びＹ′の間での結合が成功することであり、この結合により逆転写酵素ＲＴはこの転写産物の空間的近傍にもたらされる。即ち、Ｐ／Ｘ／（Ｙ又はＹ′）／ＲＴからなる立体複合体が生じる。これは、転写反応及び翻訳反応の経過後にまさに転写された、Ｙ′をコードするｍＲＮＡ分子が、ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌに対して空間的近傍に存在し、これはタンパク質Ｘとカップリングしていることを意味する。タンパク質Ｘ及びＹまたはＹ′の間の結合が生じる場合には、その際ＹまたはＹ′はＲＴと複合化されて存在するが、有利にはＲＴタンパク質は転写産物に対する直接的な空間的近傍に見出される。ＹまたはＹ′を介したＲＮＡ転写産物及びタンパク質ＲＴの間の空間的近位により、Ｙ′のためのこの転写産物の逆転写が促進される。
【００４３】
従って、ｍＲＮＡレベルで核酸配列Ｓの変異体が産生されることができ、これは次いで、同様に変異体を作出する翻訳産物を生じる。このようにして、変異すべきタンパク質Ｙの変異体、即ち変異体Ｙ′が生じる。この際、より良好に又はより劣悪に、前記タンパク質Ｘに結合する変異体が生じる。
【００４４】
タンパク質Ｘに対する結合に関してより良好な特性を有する変異体Ｙ′のための進化の利点は、有利な一実施態様において、転写の直ぐ後に、機能的なＲＴがその固有の転写産物の直ぐ近傍中で、そして従ってＹ′について見出され、かつこれが有利には逆転写されることにある。これにより、より迅速に及び／又はより多くの、改善された変異体Ｙ′をコードするｃＤＮＡが生じる。
【００４５】
選択利点を有するこの変異体は次いで再度、出発核酸配列Ｓ′として使用され、これは再度転写、逆転写、かつ翻訳されることができる。このようにして、有利なかつ従って増強した、タンパク質Ｙの核酸配列変異体Ｓ′及び変異体Ｙ′の産生が生じ、これは本方法の経過の後に、適切な間隔の後に単離されることができる。同様に、逆転写酵素の変異体の産生の際のＲＴのエラー率も利用されることができる。
【００４６】
この効果を、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素及び／又は条件の選択により、当初提供される核酸配列Ｓの変異体Ｓ′及び従って前記核酸によりコードされるタンパク質、特にタンパク質Ｙの変異体Ｙ′を産生することにより、本発明の系は利用する。
【００４７】
有利には、特定のエラー率を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが使用され、これにより突然変異を有する転写産物が生じる。この突然変異は例えば点突然変異であることができ、例えばポリメラーゼにより置換、欠失又は挿入が生じる可能性がある。
【００４８】
ＲＮＡポリメラーゼもＲＴも、プルーフリーディング機能を有さず、かつ従ってプルーフリーディング機能を有するポリメラーゼと比較してより高い突然変異率を有する。
【００４９】
この理由から従って、有利には、相応する野生型ポリメラーゼと比較してより高いエラー率を有するポリメラーゼが使用される。技術水準においては、高められた突然変異率を有するポリメラーゼが既に公知である。有利には、Ｔ７ポリメラーゼ及びＴ３ポリメラーゼ、またしかしＳＰ６ポリメラーゼでもある。Ｔ７ポリメラーゼのうち、高められたエラー率を有する変異体が既に存在する（Brakmann及びGrzeszik, 2001, Chem. Biochem. 2, 212-219）。
【００５０】
様に、所定の突然変異率を有する転写産物を産生することができる逆転写酵素も使用されることができる。
【００５１】
有利には、Ｐｏｌ及びＲＴポリメラーゼ又は逆転写酵素のために５′−３′−エキソヌクレアーゼ活性無しで使用される。本発明の目的のためには、ＲＮＡポリメラーゼのエラー率又は逆転写酵素のいずれかが、又はしかしながら両方もが使用されることができる。
【００５２】
転写産物又は／及び逆転写産物の産生のために、高められたエラー率を有する前述のＰｏｌ分子及びＲＴ分子に代替的に又は補足的に、突然変異率（エラー率）がその他の様式で高められることも可能である。例えば、突然変異作成剤、ヌクレオチド類似体が、Ｐｏｌ及び／又はＲＴの基質として又は／及びＵＶ線も使用されることができる。当業者はこのような変異原物質を自体で選択することができ、というのもこれらは技術水準において公知であるからである。
【００５３】
本発明による方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実施に適している。この発現環境はこのために適した全ての発現環境であることができ、有利には細管が使用される。細管の代わりにしかしながら、２次元の発現環境、例えば２つのガラスプレートの間の環境を選択することも可能である。また３次元の発現環境を使用することもできる。
【００５４】
細管が使用される場合には、これらは末端でいわゆる接種領域で核酸配列Ｓでもって接種される。
【００５５】
２次元系が使用される場合には、この系を、隅で又は他の部位でも、例えば中間部で、核酸配列Ｓでもって接種することも可能である。このような２次元系により、小道の自由度及び数は向上し、これは変異すべきタンパク質Ｙの進化に関連する（einschlagen）。このプロセスは両方の場合において、重合フロントの観察を介して制御可能なままである。これは例えば、マーカー剤、例えばインターカレーション剤により行われることができる。新規の変異体は次いで、より迅速な、線形に細管系中で又は円形に２次元系中で伸展するフロントを形成する。所望の変異体の試料取り出し又は単離は次いで、細管の末端で又は２次元系の周辺で又は任意の他の部位で行われることができる。
【００５６】
また、より大きな容量の３次元の発現系を使用することも可能である。このために次いで、反応媒体がより粘性な状態であるように発現環境条件が選択されることが望ましく、というのもこの液体はより大きな容量の系中で毛管力によりあまり安定化されないからである。
【００５７】
細管又は２次元又は３次元系に沿った重合フロントの速度は変異体の発生の前進のための、そして従って変異すべきタンパク質Ｙ及びその変異体Ｙ′の結合特性の改善のための指標として用いられることができる。
【００５８】
更に、転写及び翻訳のための全ての必要な反応条件は相応して調節される。特にこのために、プライマーとしての相応するオリゴヌクレオチド、及び、ヌクレオチド、特にｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓその他の作成が属する。翻訳のために相応する酵素及び剤が必要とされ、例えばリボソーム、ｔＲＮＡｓ、アミノ酸、エネルギーキャリア（例えばＧＴＰ及び類似物）その他が必要とされる。
【００５９】
この種の反応条件は、当業者により問題無しに調整されることができ、かつ、この相応するプライマーヌクレオチドは当業者により選択されることもできる。
【００６０】
本発明による方法は、提供される系中での自体によるタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の産生を可能にする。従って、変異すべきタンパク質Ｙを自体で特定の方向に発達させることが可能であり、これは目的分子Ｘに対する変異体Ｙ′の結合能により制御されることができる。
【００６１】
従って、そのつど任意のタンパク質Ｙを本発明による方法において進化させることが可能である。このために単に、Ｙに結合することができる相応する目的分子Ｘが選択され、かつ、Ｘのための改善された結合特性を有する変異体が手間のかかるスクリーニング無しに得られる。
【００６２】
有利には、核酸配列変異体Ｓ′（ＲＮＡ又はＤＮＡ又は両方）は、反応フロントで単離される。しかしながら、Ｙ′を単離することもできる。
【００６３】
更に、本発明は、改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な発現制御配列をコードする核酸配列Ｓ、変異すべきタンパク質Ｙ、逆転写酵素ＲＴ、
（ｃ）Ｐｏｌ及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができるタンパク質Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列
を含有する改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットに関する。
【００６４】
更に本発明は、改善された特性を有するタンパク質の製造のための代替的なキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ｉｉ）変異すべきタンパク質Ｙ、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌ、
（ｃ）逆転写酵素ＲＴ及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができるタンパク質Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列
を含有する改善された特性を有するタンパク質の製造のための代替的なキットに関する。
【００６５】
図の説明
図１は、請求項１による方法を図式により示す。ＮＡＳＢＡ反応混合物で充填された細管系中で、重合フロント及び進化フロントが進行する。ここでは、空間的に有利には分子が産生され、これは、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼに対してカップリングしたタンパク質Ｘと相互作用できる変異体をコードする。
【００６６】
実施例
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（NCBI遺伝子バンク, Acc. No. P00573）及びタンパク質Ａ（Acc. No. CAA43604）からなる融合タンパク質大腸菌（E. coli）中で発現させ、アフィニティクロマトグラフィにより精製し、かつ、５μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ／１０％グリセロール中で調整した。引き続き、抗ＨＩＶ Ｅｎｖ抗体２Ｆ５(Hofmann-Lehmann et al., 2001; Ferrantelli et al., 2003)を１：１の比で、キメラ融合タンパク質のこのタンパク質Ａ−ドメインに対して結合させた（＝ＲＮＡ−Ｐｏｌ／２Ｆ５複合体）。
【００６７】
シラン化した、両末端で開放している、１ｍｍの内径及び１０ｃｍの長さを有するガラスキャピラリーを約８０μｌの次の反応混合物で充填した。
【００６８】
大腸菌 ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳−反応混合物（Rapid Translation System RTS）、Roche, Penzbergによる、１；１の比で、ＰＢＳを用いて
＋ＲＮＡ−Ｐｏｌ／２Ｆ５複合体、終濃度０．０５μｇ／ｍｌで、
＋１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ４０００、粘度向上のため、
＋ＲＴプライマー及び２本鎖プライマー、終濃度２ｐｍｏｌ／μｌで、
＋ｄＮＴＰヌクレオチド、そのつど０．１ｎｍｏｌ／μｌの終濃度で、
＋ＮＴＰヌクレオチド、そのつど０．１ｎｍｏｌ／μｌの終濃度で、
＋場合により、エチジウムブロミド、終濃度０．１ｎｇ／μｌで。
【００６９】
この充填された細管を３７℃に加熱したチャンバー中に水平に固定し、末端で１μＭの、２本鎖ＤＮＡ分子溶液０．５μｌで接種した。このＤＮＡ分子は、ＨＩＶ−Ｅｎｖ及びモロニーマウス白血病ウィルス（Acc. No. AAO46154）の逆転写酵素からの融合タンパク質のためのオープンリーディングフレームを含む。
【００７０】
この反応チャンバーを閉鎖し、かつ接種されたＤＮＡの複製は重合フロントとして交互に転写産物（ＲＮＡ）及び逆転写産物（ＤＮＡ）としてこの細管に沿って、存在する剤の方向に（他の末端へと）伝播することができる。
【００７１】
この混合物にエチジウムブロミドを添加する場合には、ＵＶハンドランプを用いて毎時間この目下の重合フロントの位置を確認し、かつこの反応の終点（この細管の末端への到達）を決定した。
【００７２】
この細管末端への到達後に、重合フロント（ＲＮＡ及びＤＮＡ）を含有する反応混合物２μｌをこの細管から取り出し、かつこの含有されるＤＮＡを、特異的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応を介して増幅した。このＰＣＲ産物を適したベクター中でサブクローニングし、かつ大腸菌中で形質転換した。
【００７３】
この３８４クローンの配列評価は、進化したＨＩＶ−Ｅｎｖ変異体をコードする相違する配列の統計学的分布を生じ、この変異体は抗体２Ｆ５に対する高められた親和性を示す。より詳細な検査は、この変異体中の繰り返されるタンパク質モチーフを示し、これは高められた親和性を担う。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、請求項１による方法を図式により示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法であって、次の工程：
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ｉ）変異すべきタンパク質Ｙをコードする核酸配列Ｓ、
（ｉｉ）タンパク質Ｙ及び／又は少なくとも１種のこの変異体Ｙ′に結合することができる目的分子Ｘ、
（ｉｉｉ）核酸配列Ｓを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
（ｉｖ）核酸配列Ｓの転写産物を逆転写することができる逆転写酵素（ＲＴ）、
その際、目的分子ＸはＰｏｌに、そしてタンパク質ＹはＲＴにカップリングしているか、
又は目的分子ＸはＲＴに、そしてタンパク質ＹはＰｏｌにカップリングしている、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′及び、これをコードする核酸配列Ｓ′の形成下での転写、逆転写及び翻訳を可能にし、かつ、目的分子Ｘのための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の形成を促進する条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程を含む、タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法。
【請求項２】
次の工程：
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ａ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ａ１）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ａ２）変異すべきタンパク質Ｙ、及び
（ａ３）逆転写酵素（ＲＴ）、
又は
（ａ３′）ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
その際、（ａ２）及び（ａ３）又は（ａ３′）をコードする配列断片は、（ａ１）によるｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列の制御下で融合タンパク質をコードする、
（ｂ）次のものを含有するタンパク質複合体、
（ｂ１）タンパク質Ｙ及び／又は変異すべきタンパク質Ｙの少なくとも１種の変異体Ｙ′に結合することができる成分Ｘ、及び
（ｂ２）（ａ）からの核酸配列Ｓの転写のためのＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
又は
（ｂ２′）逆転写酵素（ＲＴ）、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の形成を可能にする条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｘ及び変異体Ｙ′から複合体が形成され、これはこの変異体Ｙ′をコードする転写産物の逆転写を可能にする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
核酸配列ＳがＹ及びＲＴからなる融合タンパク質又はＹ及びＰｏｌからなる融合タンパク質をコードする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｐｏｌ、ＲＴ及び／又はＸが核酸によりコードされるか又はタンパク質又は融合タンパク質として提供される、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系として、細管、２次元の発現環境又は３次元の発現環境が使用される、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
転写制御配列が、ＲＮＡ−ポリメラーゼ−Ｔ７−プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ−Ｔ３−プロモーター及びＲＮＡ−ポリメラーゼ−ＳＰ６−プロモーターから選択される、請求項２から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ＰｏｌとしてＲＮＡ−ポリメラーゼ−Ｔ７、ＲＮＡ−ポリメラーゼ−Ｔ３又はＲＮＡポリメラーゼ−ＳＰ６が使用される、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｐｏｌとして、相応する野生型ポリメラーゼが示すエラー率と比較して高められたエラー率を示すＲＮＡポリメラーゼが使用される、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ｂ１）ＲＮＡポリメラーゼによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な発現制御配列、
（ｂ２）変異すべきタンパク質Ｙ、
（ｂ３）逆転写酵素、
（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼ及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができる目的分子Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列、
を含有する、改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキット。
【請求項１１】
改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ｂ１）タンパク質Ｐによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ｂ２）変異すべきタンパク質Ｙ、
（ｂ３′）ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｃ）逆転写酵素及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができる目的分子Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列、
を含有する、改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキット。
【請求項１２】
発現環境が、細管、２次元の発現環境及び３次元の発現環境から選択されている、請求項１０又は１１記載のキット。
【請求項１３】
適したプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、及び／又は緩衝液を更に含有する、請求項１０から１２までのいずれか１項記載のキット。
【請求項１】
タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法であって、次の工程：
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ｉ）変異すべきタンパク質Ｙをコードする核酸配列Ｓ、
（ｉｉ）タンパク質Ｙ及び／又は少なくとも１種のこの変異体Ｙ′に結合することができる目的分子Ｘ、
（ｉｉｉ）核酸配列Ｓを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
（ｉｖ）核酸配列Ｓの転写産物を逆転写することができる逆転写酵素（ＲＴ）、
その際、目的分子ＸはＰｏｌに、そしてタンパク質ＹはＲＴにカップリングしているか、
又は目的分子ＸはＲＴに、そしてタンパク質ＹはＰｏｌにカップリングしている、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′及び、これをコードする核酸配列Ｓ′の形成下での転写、逆転写及び翻訳を可能にし、かつ、目的分子Ｘのための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の形成を促進する条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程を含む、タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の製造方法。
【請求項２】
次の工程：
（Ａ）次のものを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の作成工程、
（ａ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ａ１）ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ａ２）変異すべきタンパク質Ｙ、及び
（ａ３）逆転写酵素（ＲＴ）、
又は
（ａ３′）ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
その際、（ａ２）及び（ａ３）又は（ａ３′）をコードする配列断片は、（ａ１）によるｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列の制御下で融合タンパク質をコードする、
（ｂ）次のものを含有するタンパク質複合体、
（ｂ１）タンパク質Ｙ及び／又は変異すべきタンパク質Ｙの少なくとも１種の変異体Ｙ′に結合することができる成分Ｘ、及び
（ｂ２）（ａ）からの核酸配列Ｓの転写のためのＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、
又は
（ｂ２′）逆転写酵素（ＲＴ）、
（Ｂ）タンパク質Ｙの変異体Ｙ′の形成を可能にする条件下での、（Ａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系のインキュベーション工程、
（Ｃ）Ｘに対する結合のための改善された結合特性を有する変異体Ｙ′の単離工程及び／又はＹ′をコードする核酸配列変異体Ｓ′の単離工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｐｏｌ、ＲＴ、Ｘ及び変異体Ｙ′から複合体が形成され、これはこの変異体Ｙ′をコードする転写産物の逆転写を可能にする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
核酸配列ＳがＹ及びＲＴからなる融合タンパク質又はＹ及びＰｏｌからなる融合タンパク質をコードする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｐｏｌ、ＲＴ及び／又はＸが核酸によりコードされるか又はタンパク質又は融合タンパク質として提供される、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系として、細管、２次元の発現環境又は３次元の発現環境が使用される、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
転写制御配列が、ＲＮＡ−ポリメラーゼ−Ｔ７−プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ−Ｔ３−プロモーター及びＲＮＡ−ポリメラーゼ−ＳＰ６−プロモーターから選択される、請求項２から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ＰｏｌとしてＲＮＡ−ポリメラーゼ−Ｔ７、ＲＮＡ−ポリメラーゼ−Ｔ３又はＲＮＡポリメラーゼ−ＳＰ６が使用される、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｐｏｌとして、相応する野生型ポリメラーゼが示すエラー率と比較して高められたエラー率を示すＲＮＡポリメラーゼが使用される、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ｂ１）ＲＮＡポリメラーゼによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な発現制御配列、
（ｂ２）変異すべきタンパク質Ｙ、
（ｂ３）逆転写酵素、
（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼ及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができる目的分子Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列、
を含有する、改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキット。
【請求項１１】
改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキットであって、
（ａ）発現環境、
（ｂ）以下のものをコードする核酸配列Ｓ、
（ｂ１）タンパク質Ｐによりｉｎ ｔｒａｎｓに活性化可能な転写制御配列、
（ｂ２）変異すべきタンパク質Ｙ、
（ｂ３′）ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｃ）逆転写酵素及び変異すべきタンパク質Ｙの変異体Ｙ′の少なくとも１種に結合することができる目的分子Ｘを含有する複合体、又は、この種の複合体をコードする核酸配列、
を含有する、改善された特性を有するタンパク質の製造のためのキット。
【請求項１２】
発現環境が、細管、２次元の発現環境及び３次元の発現環境から選択されている、請求項１０又は１１記載のキット。
【請求項１３】
適したプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、及び／又は緩衝液を更に含有する、請求項１０から１２までのいずれか１項記載のキット。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５０４１４５（Ｐ２００９−５０４１４５Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２５４５８（Ｐ２００８−５２５４５８）
【出願日】平成１８年８月７日（２００６．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７７９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１７２２９
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５０８０４２０３２）ゲネアルト アクチエンゲゼルシャフト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒａｓｓｅ １１， Ｄ−９３０５３ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月７日（２００６．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７７９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１７２２９
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５０８０４２０３２）ゲネアルト アクチエンゲゼルシャフト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒａｓｓｅ １１， Ｄ−９３０５３ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]