ｍＣＭＶＩＥ２プロモーターを含んで成る発現ベクター
【課題】ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子の新規エンハンサーを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列を有する機能的な発現促進フラグメントから成るｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサーであって、前記配列の機能的な発現促進フラグメントが、ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−３８７〜−１８９又はヌクレオチド−５８７〜−１８９、あるいはヌクレオチド−５８７〜−１８９又はヌクレオチド−３８７〜−１８９の間の、増強活性を保持する任意のフラグメント、から成り、当該ヌクレオチドの番号付けが前記ＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー。
【解決手段】特定の塩基配列を有する機能的な発現促進フラグメントから成るｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサーであって、前記配列の機能的な発現促進フラグメントが、ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−３８７〜−１８９又はヌクレオチド−５８７〜−１８９、あるいはヌクレオチド−５８７〜−１８９又はヌクレオチド−３８７〜−１８９の間の、増強活性を保持する任意のフラグメント、から成り、当該ヌクレオチドの番号付けが前記ＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメント、及び／又はｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、当該ベクターを含む宿主細胞、当該発現ベクターを用いて所望のポリペプチドを産生する方法、及び当該発現ベクターの使用、に関する。
【０００２】
ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーター及びｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと、任意に新規ｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーとを含んで成る発現ベクターは本発明において好ましく、特に両プロモーターが両方向的構造において配列されている場合に好ましい。
【背景技術】
【０００３】
数十年前から、発現ベクターは、注目のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡを宿主細胞で発現させるための媒体として使用されている。強力なウイルス性又は細胞性のプロモーター及びエンハンサーは、宿主細胞への組換えＤＮＡの一過性又は安定性のトランスフェクションを用いることにより高レベルで注目の遺伝子を発現させるために使用されている。ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）領域は、この点特に適していることが証明されており、そしてこの領域由来の遺伝子因子を含んで成る発現ベクターは、例えばＥＰ０３２３９９７Ｂ１で知られている。
【０００４】
今日まで、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）由来の遺伝子制御配列は、ｍＣＭＶ由来制御エレメントが非常に強力で、且つヒトの対応物と比較して遥かに強いことが確認されているが(Kim et al. 2002)、ほとんど使用されていない。
【０００５】
ＵＳ４，９６３，４８１(de Villiers)は、ウイルスゲノムから単離された約２２７０塩基対（ｂｐ）の制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩフラグメントを含むｍＣＭＶ ＩＥ領域由来のＤＮＡフラグメントの転写制御下にある異種タンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを開示している。このフラグメントの１３８７ｂｐの切断バージョンは、当該異種タンパク質の発現のためのプロモーターとしての前記ＤＮＡフラグメントの有効性における有意な向上をもたらした。
【０００６】
ＵＳ４，９６８，６１５(Kozinowski)は、真核細胞において構造遺伝子の転写を増強するために使用されうるマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）由来の転写エンハンサーを含む組換えＤＮＡ分子を記載している。当該ｍＣＭＶエンハンサーは、de Villiers（ＵＳ４，９６３，４８１）により同定された２．２７ｋｂのＰｓｔＩフラグメント内に位置しているといわれている。
【０００７】
Manning及びMocarski(1988)は、マウスサイトメガロウイルスの複製についてのｍＣＭＶ ＩＥ２領域の機能的重要性を分析した。このために、ｍＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターの転写制御下にあるｌａｃＺレポーター遺伝子を有し、その結果ＩＥ２遺伝子が破壊されている組換えウイルスが構築された。実際にＩＥ２遺伝子発現が無いことを観察することができ、そしてウイルスは普通に複製された。その結果、著者等は、サイトメガロウイルス、例えばｍＣＭＶ及びｈＣＭＶの中で保存されていないＩＥ２遺伝子がウイルス複製に必須ではなかったと結論付けた。ＩＥ２エンハンサー／プロモーター領域の何らかの特定の有用性についての指摘はManning及びMocarskiによって全く開示も示唆もされていない。
【０００８】
最近の文献は、マウスとヒトとの間のＣＭＶ ＩＥ領域の更なる差異を示している。マウスの遺伝子座は、第一のＩＥ遺伝子の反対方向に第二の主要なｍＲＮＡを発現している。この第二の前初期遺伝子はＩＥ２と名づけられ、そのプロモーター配列はＩＥ２プロモーターと称されている(Messerle et al. 1991)。
【０００９】
ｍＣＭＶ由来のＩＥ２領域は、これまでのところ異種タンパク質の発現のためのベクターに使用されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｍＣＭＶのＩＥ２プロモーター領域を含んで成るＤＮＡエレメントを有するベクターがトランスフェクションした宿主細胞における注目の遺伝子の発現を効率的に駆動させることができるという知見に基づいている。
【００１１】
本発明は更にｍＣＭＶ ＩＥ２領域における新規エンハンサーの同定に基づいており、これを本明細書ではｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーと称する。このエンハンサーは、エンハンサーの定義に一般的に適用される基準を満たし、すなわち、（１）位置、（２）配向、及び（３）異種プロモーターからの発現の増強、とは無関係に発現を増強させる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の第一の側面は、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメント、及び／又はｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、に関する。
【００１３】
第二の側面において、本発明は、本発明のベクターを含んで成る宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明の第三の側面は、注目のポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞に本発明のベクターをトランスフェクションする工程を含んで成る方法に関する。
【００１５】
第四の側面において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養する工程を含んで成る方法に関する。
【００１６】
本発明の第五の側面は、注目の１又は複数の遺伝子又はｃＤＮＡの発現のための本発明のベクターの使用に関する。
【００１７】
第六の側面において、本発明は、注目の遺伝子を大量に発現するクローンの選択のための本発明のベクターの使用に関する。
【００１８】
第七の側面は、ＤＮＡベースの治療における本発明のベクターの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、発現コンストラクトに使用するためのｍＣＭＶ ＩＲ領域由来の両方向性ＤＮＡエレメントの配列を示す。ＩＥ２及びＩＥ１プロモーターの＋１部位及びＴＡＴＡボックスをそれぞれ示す。両遺伝子のコアプロモーターを四角の中に示す。ＨｐａＩ及びＸｈｏＩ制限部位を太字で示す。−６８２位はＩＥ１の＋１に対して示す。
【図２】図２は、レポーターコンストラクトＡ〜Ｇを示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は太線として示し、そしてプロモーターは白抜きの矢印として示す。Ａ：ネガティブなプロモーター無しの制御（ｐＧＬ３ベーシック）。Ｂ：ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー駆動のルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３コントロール）。Ｃ：ＩＥ１プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現（ｐｍＣＭＶルシフェラーゼ、ＩＥ１駆動）。Ｄ：ＩＥ２プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現（ｐｒｅｖｍＣＭＶルシフェラーゼ、ＩＥ２駆動）。Ｅ：ＩＥ２プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現、ＩＥ１プロモーターは欠失（ｐｒｅｖｍＣＭＶルシフェラーゼ（ΔＸｈｏＩ）、ＩＥ２駆動、ＩＥ１マイナス）。Ｆ：ＩＥ１プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現、ＩＥ２プロモーターは欠失（ｐＢＳ．ＭＣＭＶ３ルシフェラーゼ、ＩＥ１駆動（１．４ｋｂ）、ＩＥ２マイナス）。Ｇ：ＩＥ１プロモーターの短縮版によるルシフェラーゼ発現の駆動（ｐ−６８０ルシフェラーゼ、ＩＥ１駆動（短いバージョン、０．６８ｋｂ））。
【図３】図３は、ＩＥ２プロモーターと連結したＩＬ−１８ＢＰのコード配列（太線）を有する、図２のコンストラクトに類似の両方向性コンストラクト（コンストラクトＣ−２）を示す。従って、このコンストラクトにおいて、ｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターがルシフェラーゼ発現を駆動させ、そして同時にｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターがＩＬ−１８ＢＰ発現を駆動させる。三角：イントロン。黒の楕円：ポリＡ。
【図４】図４は、図２においてコンストラクトＡ〜Ｇで表した異なるレポーターコンストラクトからのルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を示す。無血清培地（ＳＦＭ）で生育したＣＨＯ−Ｓ細胞はコンストラクトＡ〜Ｇで一過性トランスフェクションし、あるいはモックトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性は、ＲＬＵ＝相対光単位として表す。
【図５】図５は、トランスフェクションしたＣＨＯ−Ｓ細胞の安定なプールにおいてＲＬＵとして測定したルシフェラーゼ発現を示す。細胞は、図２でコンストラクトＤ、Ｃ、Ｆ及びＥでトランスフェクションした後にＳＦＭ培地で生育した。ルシフェラーゼ発現は、選択してから２１日後に評価した。
【図６】図６は、９００、５００、３００及び１００ｎｇの、図３で示した両方向性コンストラクトＣ−２による一過性トランスフェクション後のＲＬＵとして測定したルシフェラーゼ発現を示す。
【図７】図７は、図６の一過性トランスフェクション実験（コンストラクトＣ−２）由来の細胞培養上清中のＩＬ−１８ＢＰ量（ｎｇ／ｌ）を示す。
【図８】図８は、図６及び７の実験で測定したＩＬ−１８ＢＰ量対ルシフェラーゼ量の比率を示す。
【図９】図９は、両方向性コンストラクトＣ−２（図３に示すとおり）によるトランスフェクションから８日後に選択した４８の個々のクローンによって発現したルシフェラーゼの量（ＲＬＵ）（左のｙ軸）及びＩＬ−１８ＢＰの量（ｎｇ／ｍｌ）（右のｙ軸）を示す。ルシフェラーゼの検出限界は約５００ＲＬＵ、そしてＩＬ−１８ＢＰは２．５ｎｇ／ｍｌであった。Ｘ軸上のそれぞれの増加分は１つの単一のクローンを示している。
【図１０．ａ】図１０．ａはレポーターコンストラクトＨ〜Ｎを示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）は太線で示し、そしてそれぞれのＩＥ１、ＩＥ２プロモーターは白抜きの矢印で示す。エンハンサーはグレーの楕円で示す：既知のＩＥ１エンハンサーはライトグレー、そして新規ＩＥ２エンハンサーはダークグレー。Ｈ：ルシフェラーゼ発現を駆動させるＩＥ２プロモーターを有する両方向性コンストラクト。Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ：短縮したｍＣＭＶプロモーターを含むコンストラクト。位置は、基準としてのＩＥ２の＋１に対するｍＣＭＶｐからの塩基対の数に相当する。Ｊ：−１０７６からＫ：−７８３からＬ：−５８７からＭ：−３８７からＮ：−１８９から
【図１０．ｂ】図１０．ｂは、無血清培地で生育したＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクション後の、図１０．ａのレポーターコンストラクトＨ〜Ｎからのルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示す。
【図１１．ａ】図１１．ａは、新規ＩＥ２エンハンサー（グレーの楕円）とＳＶ４０プロモーターとを組み合わせた追加のレポーターコンストラクトＯ〜Ｙを示す。グレーの楕円は−５８７〜−１８９のＩＥ２エンハンサーを表し、半分のグレーの楕円は−３８７〜−１８９のＩＥ２エンハンサーを表す。ＩＥ２エンハンサーの上の矢印は、エンハンサー配列の方向を示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は太線で示し、ＳＶ４０プロモーターは白抜きのは矢印で示す。黒の楕円：ポリＡ。Ｏ：ＳＶ４０プロモーターの５’側にクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｐ：ＳＶ４０プロモーターの５’側にクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｑ：ＳＶ４０プロモーターの５’側に逆の配向でクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｒ：ＳＶ４０プロモーターの５’側に逆の配向でクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｓ：ＳＶ４０プロモーターの３’側にクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｔ：ＳＶ４０プロモーターの３’側にクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｕ：ＳＶ４０プロモーターの３’側に逆の配向でクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｖ：ＳＶ４０プロモーターの３’側に逆の配向でクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｗ：コントロール。ルシフェラーゼのコード配列の３’側にＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０エンハンサー。Ｘ：コントロール。何らエンハンサー無しでＳＶ４０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ発現。Ｙ：ネガティブコントロール。プロモーター無し。
【図１１．ｂ】図１１．ｂは、図１１．ａに示したレポーターコンストラクトＯ〜Ｙからのルシフェラーゼ発現を示す。無血清培地（ＳＦＭ）中で生育したＣＨＯ−Ｓ細胞をコンストラクトＯ〜Ｙで一過性トランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性はコントロールＸ（値１）、すなわち、何らエンハンサー無しでＳＶ４０プロモーターにより駆動される発現と比較した場合の誘導の倍数として表す。白抜きの棒：長いＩＥ２エンハンサー（−５８７〜−１８９）、網掛けの棒：短いＩＥ２エンハンサー（−３８７〜−１８９）。Ｘ軸は対数尺である。
【図１２】図１２は、新規ＩＥ２エンハンサーと既知のｈＣＭＶエンハンサーとを比較する実験である。細胞はコントロールのコンストラクトＡ（ｐＧＬ３ベーシック、図２のプロモーター無しのものを参照のこと）、コントロールのコンストラクトＢ（ｐＧＬ３ｃｔｒｌ、図２を参照のこと。ルシフェラーゼのコード領域の３’側にＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０エンハンサー配列を有する）、コントロールのコンストラクトＸ（ＳＶ−Ｌｕｃ＋。図１１．ａを参照のこと。ＳＶ４０プロモーター。エンハンサー無し）、並びにコンストラクトＯ及びＱ（図１１．ａを参照のこと）又はコンストラクトＯ−２又はＱ−２（ＩＥ２エンハンサー配列（長いバージョン、−５８７〜−１８９）が既知のｈＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）で置換されている）でトランスフェクションされた。ルシフェラーゼが測定された（ＲＬＵ）（ｘ軸）。網掛けの棒：既知のｈＣＭＶエンハンサーによるもの。グレーの棒：新規ＩＥ２エンハンサーによるもの。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１８ＢＰとルシフェラーゼの同時発現に使用する両方向性ベクターを示す。ＩＥ１及びＩＥ２プロモーターは白抜きの矢印で示す。三角はｈＣＭＶのＩＥ領域由来のイントロンＡを表し、そしてグレーの楕円はポリアデニル化シグナルを表す。黒の四角はシグナルペプチドを表す。コンストラクト♯２６：ルシフェラーゼはＩＥ１プロモーターから発現し、そしてＩＬ−１８ＢＰはＩＥ２プロモーターから発現した。両プロモーター間の配列は図１０．ａのコンストラクトＨにあるものである。コンストラクト♯１４０：ルシフェラーゼはＩＥ２プロモーターにより発現し、そしてＩＬ−１８ＢＰはＩＥ１プロモーターから発現した。ＩＥ２エンハンサー（−５８７〜−１８９）は２つのプロモーターの間に位置する。
【図１４】図１４は、無血清培地中で生育したＣＨＯ細胞を図１３のコンストラクト♯２６又は♯１４０のいずれかで一過性トランスフェクションした後に発現したルシフェラーゼ量（ＲＬＵ、左のｙ軸）及びＩＬ−１８Ｂｐ量（ｎｇ／ｍｌ、右のｙ軸）を示す。棒：ルシフェラーゼ発現。黒のひし形：ＩＬ−１８ＢＰ発現。
【図１５】図１５は、図１３のコンストラクト♯２６又は♯１４０のいずれかでトランスフェクションした安定なプール中でのルシフェラーゼの発現（ＲＬＵ、左のｙ軸）及びＩＬ−１８Ｂｐの発現（ｎｇ／ｍｌ、右のｙ軸）を示す。発現は、トランスフェクションから７週間後に測定した。細胞は、ピューロマイシンによる選択の下で維持するか（＋ｐｕｒｏ）、あるいはピューロマイシン選択無しで３週間維持した（−ｐｕｒｏ）。棒：ルシフェラーゼ発現。黒のひし形：ＩＬ−１８ＢＰ発現。
【図１６】図１６は、図１５の実験で見られるルシフェラーゼ発現の時間的経過を示す。ｘ軸は時間（週）を表す。図１５で示したデータは図１６の３週のデータに相当する。黒のひし形：♯２６＋ｐｕｒｏ、小さい四角：♯１４０＋ｐｕｒｏ、黒い三角：♯２６−ｐｕｒｏ、大きい四角：♯１４０−ｐｕｒｏ。
【図１７】図１７は、図１６の実験におけるＩＬ−１８ＢＰ発現の時間的経過を示す。レジェンドは図１６のとおりである。
【図１８】個々のプロトクローンをルシフェラーゼ発現（四角）（ＲＬＵ）（左のｙ軸）及びＩＬ−１８ＢＰ発現（ひし形）（ｎｇ／ｍｌ）（右のｙ軸）について解析した。ｘ軸上の増分は個々のプロトクローンを表す。プロトクローンはコンストラクト♯２６で安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞から樹立し、そしてピューロマイシン選択の下維持した。
【図１９】図１９は、図１８と同様であるが、プロトクローンはコンストラクト♯１４０でトランスフェクションした細胞から樹立した。
【図２０】コンストラクト♯２６又は♯１４０のいずれかをトランスフェクションしたプロトクローンを、ルシフェラーゼ発現について９６ウェルフォーマットのinverted ChemiDoc viewにおいて解析した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の詳細な説明
本発明によると、驚くべきことに、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）２遺伝子のプロモーターがｍＣＭＶ ＩＥ２タンパク質自体以外の注目のポリペプチド、すなわち異種ポリペプチド又はタンパク質の発現を促進するのに効率的であることが明らかとなった。この発現ベクターは、マウスサイトメガロウイルス自体であることはなく、あるいは完全なｍＣＭＶウイルス遺伝子を全く含まないが、組換えタンパク質発現のために着想されたベクターである。
【００２１】
従って、本発明は、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、又はその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、に関する。
【００２２】
これに加え、新規エンハンサーがｍＣＭＶ ＩＥ２領域において同定されており、これを本明細書でｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサー、又はＩＥ２エンハンサーと称する。このエンハンサーは、遺伝子に対するその位置又は配向に関係なく発現を増強し、そして異種プロモーターからの発現を増強し、その結果エンハンサーの一般的基準を満たす。
【００２３】
従って、本発明では、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、又はその機能的な発現増強フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、に関する。
【００２４】
当業者は、本発明のベクターがｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターを単独で、又は任意の適切な既知のエンハンサーと組み合わせて含んで成ることがあることを理解するであろう。当業者はまた、本発明のベクターがｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーを単独で、又は任意の適当なプロモーターと組み合わせて含んで成ることがあることを理解するであろう。更に、本発明のベクターは、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターをｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーと組み合わせて含んで成ることがある。
【００２５】
ｍＣＭＶ ＩＥ２遺伝子自体は、例えばMesserle et al., 1991により知られている。
【００２６】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、１又は複数のＤＮＡ配列の転写を調節するよう機能し、且つＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位及びプロモーター機能を制御するよう相互作用する他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定されるＤＮＡの領域を意味する。プロモーターの機能的発現促進フラグメントは、プロモーターとしての活性を保持する短縮又は切断されたプロモーター配列である。プロモーター活性は、当業界で既知のあらゆるアッセイ、例えばレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いるレポーターアッセイで測定されうる(Wood,1991 ; Seliger and McElroy, 1960 ; de Wet et al.(1985)、又はPromega（登録商標）より市販されているもの）。
【００２７】
本発明によると、ＩＥ２プロモーターは、例えば、図１に示す通り、＋１位からＴＡＴＡボックスに及ぶ配列を含んで成ることがある。ＩＥ２プロモーターはまた、図１で表す配列のヌクレオチド１〜３９に及ぶ（四角）、本明細書で「コアプロモーター」と称する配列を含んで成ることがある。当業者は、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターの配列がそれを作用可能に連結したＤＮＡ配列の転写を駆動する限りコアプロモーターよりも長いか、又は短いことがありうることを理解するであろう。例えば、ＩＥ２プロモーターはまた、コアプロモーターの上流に１００〜２００塩基対含んで成ることがある。そのようなプロモーター領域はまた「近位プロモーター」と称される。当業者は更に、用語「プロモーター」と「エンハンサー」（以下を参照のこと）とが正確に定義されておらず、その結果、命名法及び文脈によって、プロモーターがエンハンサー領域を含んで成ることがあり、あるいはエンハンサー領域がプロモーター領域を含んで成ることがある。
【００２８】
用語「ベクター」は、宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製及び／又は適切な発現のための宿主細胞への外因性ＤＮＡの伝達にとって有用な外因性ＤＮＡ又はＲＮＡのあらゆる担体を意味する。
【００２９】
用語「作用可能に連結」は、本明細書で使用する場合、プロモーターの制御下で、遺伝子、ｃＤＮＡ又は他のＤＮＡを発現するよう適切なフレーム内で転写される構造遺伝子又はｃＤＮＡ又は他のあらゆるＤＮＡ配列とプロモーターとが機能的に融合していることを意味する。用語「作用可能に連結」とは、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ配列の直接的な融合に限定されない。
【００３０】
用語「ｍＣＭＶの完全な遺伝子」とは、自身（内因性、ウイルス性）の５’及び３’制御エレメントを有するマウスサイトメガロウイルスのウイルス遺伝子を意味する。
【００３１】
「エンハンサー領域」は、１又は複数の遺伝子の転写を増大させるよう機能するＤＮＡの領域を意味する。更に具体的には、用語「エンハンサー」は、本明細書で使用する場合、発現する遺伝子に対するその位置及び配向に関係なく遺伝子の発現を増強、増大、改善、又は回復させるＤＮＡ制御エレメントであり、そして複数のプロモーターの発現を増強、増大、改善、又は回復させることがある。好ましくは、エンハンサーは、複数のプロモーターからの発現を同時に増強させる。エンハンサーの機能的発現増強フラグメントは、増強活性を保持する短縮又は切断されたエンハンサー配列である。
【００３２】
本発明のベクターは、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−３８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである。これは、エンハンサー機能を有するフラグメントであり、そして本明細書ではＩＥ２エンハンサーの短いバージョンとも称される。
【００３３】
更に好ましい態様において、ベクターは、ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−５８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである。このフラグメントはエンハンサー機能を有し、そして本明細書ではまたＩＥ２エンハンサーの長いバージョンとも称される。
【００３４】
本発明のベクターはまた、更に追加のｍＣＭＶ ＩＥエンハンサー、又はその機能的発現増強フラグメントを含んで成ることがあり、これは、本明細書では「ＣＭＶ ＩＥ１エンハンサー」と称する。
【００３５】
そのようなｍＣＭＶ ＩＥ１エンハンサーは当業界で知られており、例えばＵＳ４，９６８，６１５号による。それは、例えば図１に示す配列の−５８７〜−１４７位、又は−６８２〜−１４７位に及び、ここで、この番号付けはＩＥ１遺伝子の＋１位に対するものである。本発明に従い使用されうるｍＣＭＶ ＩＥ１エンハンサーは更に、図１のＩＥ１の＋１位に対し、塩基対−１３３０〜−４８８に及ぶ配列を含んで成ることがある。エンハンサー領域は、更にプロモーターの全部又は一部を含んで成ることがある。
【００３６】
ＩＥ２プロモーターに加えｍＣＭＶエンハンサーを用いることによって、注目のポリペプチドの発現は更に増大しうる。
【００３７】
本発明によると、ベクターは更に、ｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーターと異なるプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントを含んで成る。
【００３８】
好ましい態様において、本発明のベクターは、ウイルス起源、細胞起源又は人工起源の第一及び第二プロモーター、又はそれらの機能的発現促進フラグメントを含んで成る。
【００３９】
本発明により、第二プロモーターの存在がｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターからの注目のポリペプチドの効率的な発現をもたらすことが示されている。従って、本発明の好ましい態様において、ベクターは、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターを、第二プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントと組み合わせて含んで成る。追加の適当なプロモーターの例には、ｈＣＭＶプロモーター、メタロチオネインプロモーター（ＭＴ）、ＳＶ４０プロモーター、又は人工プロモーターが含まれる。好ましくは、第二プロモーターはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターの追加のコピーである。そのような追加のプロモーターは、構成的な又は制御された発現を促進することがある。制御された発現は、誘導性又は抑制性の発現、あるいはその両方であってもよい。
【００４０】
好ましくは、そのような第二プロモーターは、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子のプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントである。従って、第一プロモーターがｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントであり、且つ第二プロモーターがｎＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントであることが好ましい。
【００４１】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーターは、例えばＷＯ８７／０３９０５より知られている。これは、図１の配列の最後の４７ｂｐ（四角）、又は追加の１００〜２００ｂｐ上流配列（すなわち近位プロモーター）を含むコアプロモーターを含んで成ることがあり、あるいは最大−１３３０位（ＩＥ１の＋１位に対して。図１を参照のこと）の全遺伝子間領域を含んで成ることがある。
【００４２】
好ましい態様において、ベクターは、ＩＥ１プロモーター及びＩＥ２プロモーターの両方並びにＩＥ１エンハンサー及び新規ＩＥ２エンハンサー、あるいはそれらの任意な機能的発現促進フラグメントを含む配列番号１のＤＮＡ配列を含んで成る。
【００４３】
非常に好ましい態様において、本発明のベクターにおけるプロモーター、又はそれらの機能的な発現促進フラグメントは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と作用可能に連結している。本発明の更に好ましい態様において、本発明のエンハンサーは少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と一緒に発現ベクター上に存在する。
【００４４】
好ましくは、前記ＤＮＡ配列は注目のタンパク質をコードしている。
【００４５】
更に好ましくは、前記ＤＮＡ配列はマーカータンパク質をコードしているか、あるいは増幅可能な遺伝子である。
【００４６】
前記ＤＮＡ配列がレポータータンパク質をコードしているのも好ましい。
【００４７】
本発明のベクターが複数のプロモーターを含む場合、注目のタンパク質、マーカー、レポーター、増幅可能な遺伝子等のあらゆるコンビネーション又はサブコンビネーションが同一のプラスミドから発現されることがある。
【００４８】
本発明によると、注目のポリペプチドは、ＩＥ２ポリペプチド自体と異なる任意のポリペプチドであってもよく、細胞外タンパク質、例えばペプチドホルモン、サイトカイン又は増殖因子、あるいは膜貫通タンパク質、例えば増殖因子受容体又はホルモン受容体、あるいは細胞内タンパク質、例えばキナーゼ、ホスファターゼ又はＤＮＡ結合タンパク質であってもよく、これは注目のポリペプチド又はそれが発現される宿主細胞の用途によって左右される。
【００４９】
本発明に従う適当なマーカータンパク質は、例えばネガティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカー、あるいは増幅可能な遺伝子である。例としては、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）、又はピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）が含まれる。更なる例には、特定の代謝経路の使用による選択に使用される遺伝子、例えばガラクトキナーゼ(Schumperli et al., 1982)、葉酸受容体(Zhu et al., 2001)、又は還元葉酸担体(Assaraf et al., 1992)、が含まれる。
【００５０】
また更に好ましい態様において、注目のポリペプチドはレポーター遺伝子である。
【００５１】
用語「レポーター遺伝子」又は「レポータータンパク質」は、本明細書で使用する場合、単純であり高価でない方法又は試薬を用いて同定することができ、且つ本発明のプロモーター領域又はその活性フラグメントに作用可能に連結することができる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味することが意図される。レポーター遺伝子は、スクリーニングアッセイにおいて転写活性を決定するのに使用されることがあり（例えば、Goeddel (ed. ), Methods Enymol., Vol. 185, San Diego. Academic Press, Inc. (1990)を参照のこと）、例えばレポーター遺伝子としてルシフェラーゼが用いられる(Wood, 1991; Seliger and McElroy, 1960 ; de Wet et al. (1985), 又はPromega（登録商標）より市販されているもの)。
【００５２】
例は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、Ｏ−ガラクトシダーゼ、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他のタンパク質との分子内組み合わせ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(Abbate et al., 2001)、あるいはそれらの組み合わせから選択される。
【００５３】
本発明の基となる実験データは、注目のポリペプチドの効率的な同時発現が、共に同一のプラスミド上に存在するＩＥ２プロモーター及びＩＥ１プロモーターで達成されうることを示した。従って、更に好ましい態様において、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーター、及びｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーターの両方、又はそれらの機能的発現促進フラグメントは、それぞれポリペプチドと作用可能に連結している。
【００５４】
高い発現レベルは、両プロモーターが両方向的構造に存在する場合に達成されうる。従って、ｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、及びプロモーター、特に、ｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター、あるいはその機能的発現促進フラグメントは、両方向的に配列される。
【００５５】
用語「両方向的に配列」とは、本明細書で使用する場合、プロモーターが相対する方向に転写を駆動させることを意味することが意図される。このプラスミドＤＮＡの配列は、ベクターの「両方向的構造」とも称される。
【００５６】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１若しくはｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、あるいはｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーターと組み合わせて又はＩＥ２エンハンサーと組み合わせて使用されうる任意な追加のプロモーターは、更に翻訳開始シグナルを含むことがある。
【００５７】
更に好ましい態様において、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、あるいはｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーは、転写を制御し、又は転写に影響を及ぼす他のエレメントと連結される。そのようなエレメントは、ＲＮＡのプロセシング、安定性又は翻訳の効率に影響を及ぼすことがある。適当なエレメントの例は、５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ（例えば、Mazumder et al., 2003を参照のこと）、ｍＲＮＡ３’末端プロセシング配列（例えば、ポリアデニル化部位）、及びポリシストロン性の発現のためのＩＲＥＳ配列（例えば、Mountford and Smith, 1995）から成る群から選択される。
【００５８】
ポリシストロン性ｍＲＮＡの発現のためにＩＲＥＳエレメントを使用するのが好ましく、ここで、コード配列は当該ＩＲＥＳによって分離されている。この利点は、複数の注目のポリペプチドが同一のｍＲＮＡから、そしてその結果同一のプロモーターから発現しうることである。
【００５９】
より更に好ましい態様において、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーターは、単独で、あるいはｍＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のプロモーター、又は任意な他の天然プロモーター若しくは人工プロモーター、又はＩＥ２エンハンサーと組み合わせて、追加の発現促進配列、例えばインスレーター、境界エレメント、ＬＣＲ（例えば、Blackwood and Kadonga (1998)により説明されているもの）又はマトリックス／足場付着領域（例えば、Li et al., 1999により説明されているもの）と連結されることがある。
【００６０】
当業者は、本発明のベクターがまた、追加のエンハンサー、例えば周知のＳＶ４０エンハンサー又はｈＣＭＶエンハンサーを含むことがあることを理解するであろう。
【００６１】
本発明によると、第一プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと作用可能に連結したポリペプチド、と、第二プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと作用可能に連結したポリペプチド、とは同一であってもよい。この場合、同一の遺伝子の２つのコピーが同一のベクター上に存在するが、これらは２つの異なるプロモーターの調節下にある。従って、注目のポリペプチドをコードする遺伝子の単一のコピーからの発現よりも優れている発現率を達成するのが可能な場合がある。
【００６２】
別の態様において、第一プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと作用可能に連結したポリペプチド、と、第二プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドとは異なる。従って、互いに別々に、しかし同一の宿主細胞において発現させることが望ましい場合、本発明は、２つの異なるポリペプチド、例えば選択マーカーと注目のタンパク質の同時発現のための効率的なベクター、同一タンパク質の２又はそれ以上のサブユニットの同時発現のための効率的なベクターを提供し、あるいは同一タンパク質の異なるドメインのものでさえも提供する。
【００６３】
当業者は、本発明の複数の発現ベクターが、同一細胞内に同時トランスフェクションされることがあり、そして多数のタンパク質及び／又は極めて複雑な多量体タンパク質のサブユニットの発現について役割を果たすことがあることを理解するであろう。
【００６４】
好ましくは、第一プロモーター、例えばｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドは、二量体又は多量体タンパク質の第一サブユニットであり、そして第二プロモーター、例えばｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドは、二量体又は多量体タンパク質の第二サブユニットである。二量体タンパク質の２つのサブユニットの同時発現は本発明において好ましい。同一タンパク質の２つのサブユニットの同時発現は特に有利であり、これは、両プロモーターからの発現が、使用するプロモーターの強度によって同程度の量のサブユニットの産生、又は既定の比率の両ポリペプチドの産生をもたらしうるためである。当該サブユニットは、続いて、同一細胞内で構築されて成熟タンパク質を形成しうる。
【００６５】
本発明のベクターを用いて発現するのに適した二量体タンパク質の好ましい例は、ペプチドホルモン、例えばヒトＦＳＨ、ヒトＬＨ、ヒトＴＳＨ及びヒトＣＧのα鎖及びβ鎖である。２つのサブユニットのうちいずれかは、本発明におけるプロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと連結されうる。当業者は、他の種由来のホルモン、例えばウマ、ブタ、ウシのホルモンが、例えば組換えポリペプチドの用途によって、本発明に従い同等に使用されうることを理解するであろう。
【００６６】
本発明の別の態様において、第一サブユニットはイムノグロブリンの重鎖であり、そして第二サブユニットは軽鎖であり、あるいはその反対も同様である。適当なイムノグロブリンの好ましい例はＩｇＧである。そのようなイムノグロブリンは治療用のヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。そのようなヒト化抗体の非常に好ましい例は、Ｒａｐｔｉｖｅ（登録商標）の商標名を有するヒト化抗ＣＤ１１抗体である。
【００６７】
多くの注目のポリペプチドが本発明のベクターを用いて発現されうる。好ましい態様において、当該ポリペプチドは、絨毛性ゴナドトロピン(chorionic gonadotropin)、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピン(choriogonadotropic)ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ６５、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗ＣＤ１１ａ抗体、並びにそれらの突然変異タンパク質、フラグメント、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質から成る群から選択される。
【００６８】
他の好ましい注目のポリペプチドには、例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経ゴナドトロピン、インスリン様増殖因子（例えば、ソマトメジンＣ）、ケラチノサイト増殖因子、グリア細胞系由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質−２、血小板由来増殖因子、ヒルジン、エポイエチン(epoitetin)、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、並びにそれらの突然変異タンパク質、フラグメント、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質が含まれる。
【００６９】
本発明の第二の側面は、少なくとも１つの上述のベクターでトランスフェクションされた宿主細胞に関する。当業者は、当該宿主細胞が本発明の２又はそれ以上のベクターで同等に同時トランスフェクションされうることを理解するであろう。
【００７０】
多くの宿主細胞が本発明に適しており、例えば広範な真核生物由来の一次又は樹立細胞系、例えば植物動物細胞及び動物細胞、哺乳類又はヒト細胞である。例えば、適当な宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞、ＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ細胞等、Namalwa細胞、ＰＲＭＩ−８２２６細胞、ベロ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞あるいは他の不死化細胞及び／又は形質転換細胞を含む。
【００７１】
好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、そして更に好ましくはＣＨＯ−Ｓ細胞であり、これは例えば、Shotwellら(1982, J. Biol. Chem. 257: 2974-2980)により説明されている。ＣＨＯ細胞は、雌のチャイニーズハムスター由来の卵巣の生検からPuck(J.Exp.Med. 108, 945, 1958)により最初に培養された。これらの最初の細胞から、種々の特徴を有する多数の亜系統が調製された。これらのＣＨＯ細胞系の１つであるＣＨＯ−Ｋ１はプロリン要求性であり、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子について二倍体である。この細胞系由来の別の系は、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ ＤＵＫ Ｂ１１）(PNAS 77, 1980, 4216-4220)であり、これは１つのＤＨＦＲ遺伝子の突然変異、続いて、その他の遺伝子の損失の結果としてＤＨＦＲ機能の損失を特徴とする。
【００７２】
これらの細胞の全てが、本発明のベクターにより、一過性、又は半安定（例えば、ベクターがエピソームである場合）又は安定（例えば、ゲノム内に組み込まれている状態）の様式でトランスフェクションされうる。注目のポリペプチドを構成的に発現するクローンを樹立するためには、安定トランスフェクションが好ましい。
【００７３】
本発明のＩＥ２プロモーター、又はＩＥ２エンハンサーは、「内因性遺伝子活性化(endogenous gene activation)」と称される技術の枠内で制御エレメントとして使用されることがある。本発明のベクターは、相同組換えにより活性化されることが予想されるゲノムの遺伝子座に導入されることがあり、その結果制御配列（ＩＥ２プロモーター及び／又はエンハンサー）が、誘導又は増強に発現を必要とする注目の遺伝子と作用可能に連結される。この技術は、例えばＷＯ９１／０９９５５に記載されている。
【００７４】
第三の側面において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞を本発明のベクターでトランスフェクションする工程を含んで成る方法に関する。
【００７５】
注目のポリペプチドの性質によって、本発明の方法は、細胞培養の上清から収集されうる分泌タンパク質又はポリペプチド、あるいは既知の方法により細胞から単離されうる細胞膜タンパク質又は細胞内タンパク質をもたらす。本発明により産生されるポリペプチドは、あらゆる目的について役割を果たすことがあり、そして好ましくはそれはヒト又は動物に対する投与が意図される治療用のタンパク質である。
【００７６】
用途によって、自身に前記ポリペプチドを組み込ませている細胞は、本発明の方法の産物でありうる。そのような細胞は、例えば細胞ベースの治療に使用されうる。
【００７７】
第四の側面において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養する工程を含んで成る方法に関する。
【００７８】
好ましい態様において、前記方法は更に、注目のポリペプチドを宿主細胞又は細胞培養上清から単離する工程を含んで成る。この工程は、細胞培養上清から単純に単離されうる分泌タンパク質の場合に実施するのが特に有利であり、そして簡便である。しかしながら、この工程は、宿主細胞から単離されうる細胞膜、又は細胞内区画からポリペプチドを単離するのに同等に適用される。
【００７９】
当該工程は、一過性、安定性、エピソーム又はウイルスの発現系において使用されうる。以下の実施例に示す通り、本発明のベクターは、安定な発現系において使用される場合、所望のタンパク質の特に強力な発現をもたらした。従って、好ましい態様において、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。
【００８０】
第五の側面において、本発明のベクターは、注目の遺伝子の発現に使用される。注目の遺伝子は、例えば、上述の注目のポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子であってもよい。本発明のベクターはまた、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、増幅可能な遺伝子等の発現に使用されうる。
【００８１】
好ましくは、ベクターは、２又はそれ以上の注目の遺伝子又はｃＤＮＡの同時発現に使用される。それはまた、１つの注目の遺伝子及び１つのマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は増幅可能な遺伝子等の同時発現に使用されうる。
【００８２】
本発明の枠内で、驚くべきことに、本発明のベクター、特にＩＥ２プロモーター、ＩＥ２エンハンサー及びＩＥ１プロモーターを含んで成るベクターが、レポーター遺伝子及び注目の遺伝子を高度に発現したクローンの同定をもたらしたことが示された。従って、第六の側面において、本発明は、大量の注目の遺伝子を発現するクローンの選択のための本発明のベクターの使用に関する。
【００８３】
第七の側面において、本発明は、プラスミド又はＤＮＡベースの治療あるいは遺伝子治療における使用のための薬物の製造のための本発明のベクターの使用に関する。
【００８４】
第八の側面において、本発明の宿主細胞は、細胞ベースの治療のための薬物の製造に使用される。細胞ベースの治療がヒトの治療を意図する場合、宿主細胞がヒト細胞又は細胞系であることが好ましく、更に好ましくは処置される患者由来の細胞又は細胞系である。
【００８５】
本発明を十分に説明してきたが、当業者は、広範囲の同等のパラメーター又は濃度及び条件において、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験を必要とすることなく実施されうることが理解されよう。
【００８６】
本発明はその特定の態様と関連して説明してきたが、更なる修正が可能であることが理解されよう。本願は、本発明が関連する業界内の既知のプラクティス又は慣行に入る場合、そして特許請求の範囲に従い上述の本質的特徴に適用されうる場合、通常本発明の原理に従い、且つ本願の開示からの前記逸脱を含む本発明のあらゆる変更、使用又は脚色を網羅することが意図される。
【００８７】
本明細書で引用する全ての参考文献、例えば論文又は抄録、公開された又は公開されてない米国又は外国特許出願、交付された米国又は外国特許あるいはあらゆる他の参考文献が、引用により本明細書にその全体、例えば引用された参考文献において提示されている全てのデータ、表、図及び文書が組み入れられる。更に、当該参考文献において引用された参考文献の全内容も、引用によりその全体が組み入れられる。
【００８８】
既知の方法の工程、常用の方法の工程、既知の方法又は常用の方法への言及は、本発明のあらゆる観点、記載又は態様が関連技術において開示され、教示され又は示唆されていることを承認するものではない。
【００８９】
具体的な態様の前述の記載は、他の者が当業界の技術範囲内の知識（本明細書で引用する参考文献の内容を含む）を応用することにより、過度の実験無しに、本発明の一般的概念を逸脱することなく、種々の応用のためにそのような具体的な態様を容易に修飾及び／又は採用することができる本発明の一般的な性質を非常に十分に明らかにしている。従って、そのような採用及び修飾は、本明細書に示す教示及び手引きに基づき、開示された態様の均等の範囲内の意味の範囲内であることが意図される。本明細書の用語及び語法は説明目的であって、限定目的ではなく、その結果、本明細書の用語及び語法は、当業界の通常の技術のうちの１つの知識と組み合わせて、本明細書で示す教示及び手引きを考慮して当業者によって解釈されるべきである。
【実施例１】
【００９０】
実施例１：一過性トランスフェクションにおける発現ベクターの評価
材料と方法
材料
細胞：ＣＨＯ−Ｓ、起源Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１６１９）
図２及び３に表すように構築したプラスミドＤＮＡは、Nucleobond PC 500キット(Macherey-Nagelカタログ番号７４０７５４)を用い、製品プロトコールに従い、一晩生育した標準培地から単離した。
【００９１】
トランスフェクション：リポフェクタミン（Invitrogen、カタログ番号１８３２４−０１２）
フォーマット：２４ウェルプレート
細胞：指数増殖期のＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクション２４時間前に継代した。低い細胞密度での定常期を回避するために、細胞を０．７５ｘ１０6細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクションする細胞の総計は１，５ｘ１０5であり、これを２４ウェルプレート内でウェル当たり１００μｌの無血清培地ＳＦＭ ＩＩ（Invitrogen、カタログ番号１２０５２−１１４）中で再懸濁した。
【００９２】
トランスフェクション混合物は以下の通りである：
Ａ）リポフェクタミン：２μｌ
ＳＦＭ ＩＩ培地：４８μｌ
全量５０μｌ
Ｂ）ＤＮＡ：１μｇ（５０ｎｇ発現ベクター＋９５０ｎｇのキャリアプラスミド、pBluescript II KS(+), Stratagene、カタログ番号２１２２０５−０１）
ＳＦＭ ＩＩ培地：５０μｌに達するまで補足。
【００９３】
溶液ＡとＢを混合し、そして３０分間室温でインキュベートした。
【００９４】
この混合物を、１．５ｘ１０5細胞を含む１００μｌのＳＦＭ ＩＩ培地に添加した。細胞をインキュベーターに戻し、そして３７℃、５％ＣＯ2で３時間インキュベートした。続いて、４００μｌのＳＦＭ ＩＩ培地を添加してリポフェクタミンを希釈した。続いて、細胞を解析のための試料採取前に更に４８時間インキュベートした。全てのトランスフェクションは３回一組で実施した。
【００９５】
ルシフェラーゼ測定
PromegaのBright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号Ｅ２６１０）をルシフェラーゼ測定のために製品ガイドラインに従い使用した。
【００９６】
要約すると、細胞懸濁液を複数回上下にピペッティングすることでホモジェナイズし、そして５０μｌのアリコートを抜き取り、そしてそれを白い９６ウェルプレート(Nunc、カタログ番号２３６１０８）内に据えた。続いて、５０μｌの再構成したBright-Glo試薬を添加し、そして５分間室温でインキュベートした。発光をCentro LB 960ルミノメーター(Berthold Technologies)上で５秒の収集時間の間に測定した。
【００９７】
結果
ＣＨＯ−Ｓ細胞ベースの一過性発現系において使用した発現ベクターコンストラクトを図２に表す。この一連の実験において、ルシフェラーゼは遺伝子発現の評価のためのレポーター遺伝子として使用した。ＣＨＯ−Ｓ細胞内でほとんど活性がない、プロモーターを全く有さないベクター（コンストラクトＡ）又はＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを有するベクター（コンストラクトＢ）のいずれかをコントロールとして使用した。
【００９８】
ベクターＡ〜Ｇによる一過性トランスフェクション実験の結果を図４に示す。コンストラクトＣ及びＦにおいて、ルシフェラーゼ発現はＩＥ１プロモーターにより駆動される。両コンストラクトはルシフェラーゼ発現をもたらした。コンストラクトＣは更に、ＩＥ１プロモーターに対し両方向性に配列されたＩＥ２プロモーターを含んだ。この両方向的な配列は、ＩＥ１プロモーター単独の使用（コンストラクトＦ）と比較して、ＩＥ１プロモーター（コンストラクトＣ）からの発現効率を低下させた。０．６８ｋｂの短いバージョンのＩＥ１プロモーター（コンストラクトＧ）は、より長いバージョン（コンストラクトＦ）よりも効率的でなかった。
【００９９】
同一コンストラクト内の第二プロモーターの存在、不在に関係なく、ＩＥ２プロモーターは効率的にルシフェラーゼ発現を駆動させ（コンストラクトＤ及びＥ）、そしてその結果注目のポリペプチドの発現のための発現ベクターにおけるプロモーターエレメントとして使用されうる。
【０１００】
ＩＥ１プロモーターと対照的に、ＩＥ２プロモーターは、単独で使用した場合（コンストラクトＥ）、両方向的構造において使用する場合（コンストラクトＤ）よりもあまり効率的でなかった。従って、これは両方向性の発現における使用に特に適している。
【０１０１】
実施例２：安定トランスフェクションにおける発現ベクターの評価
材料と方法
材料
細胞：ＣＨＯ−Ｓ、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１６１９）由来
プラスミドＤＮＡ（図２に従う）は、Nucleobond PC 500キット(Macherey-Nagelカタログ番号７４０７５４)を用い、製品プロトコールに従い、一晩生育した標準培地から単離した。
【０１０２】
トランスフェクション：リポフェクタミン（Invitrogen、カタログ番号１８３２４−０１２）
安定トランスフェクションのために、Ｔ７５フラスコを使用した。指数増殖期のＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクション２４時間前に継代した。低い細胞密度での定常期を回避するために、細胞を０．７５ｘ１０6細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクションする細胞の総計は５ｘ１０6であり、これをＴ７５フラスコ中７ｍｌのＳＦＭ ＩＩ培地（Invitrogen、カタログ番号１２０５２−１１４）中で再懸濁した。
【０１０３】
トランスフェクション混合物は以下の通りである：
Ａ）リポフェクタミン：５２．１μｌ
ＳＦＭ ＩＩ培地：５１７．９μｌ
全量５７０μｌ
Ｂ）ＤＮＡ：１０μｇの直線型プラスミドＤＮＡ（９μｇのＬｕｃ発現ベクター＋１μｇの選択用プラスミド：ＳＶ４０駆動ピューロマイシン耐性遺伝子。全てのプラスミドをＰｖｕＩで直線化した）。
ＳＦＭ ＩＩ培地は５７０μｌになるよう補足された。
【０１０４】
ＡとＢを混合し、そして３０分間室温でインキュベートした。５ｘ１０6細胞を含む７ｍｌのものを添加し、そして細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内に３時間戻した。続いて、培養物を８００ｇで３分間遠心し、そして細胞のペレットを５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３２５（ＪＲＨ、カタログ番号１４３３５−１０００Ｍ）中で再懸濁し、１ｘＨＴ及び４．５ｍＭのＬ−グルタミン（１００ｘＨＴ、Invitrogen、カタログ番号１１０６７−０３０、Ｌ−グルタミン２００ｎｍ、Sigma、G-7513）を補充した。５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３２５を直接Ｔ７５フラスコに添加して接着している細胞を再懸濁し、そして当該懸濁液に添加した。合計で５ｘ１０6細胞が１０ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３２５培地中にあった。
【０１０５】
選択手順：
選択は、培地を交換し、そして１０μｇ／ｍｌピューロマイシン(Sigma, P8833)を含む１ｘ１０6細胞／ｍｌ（ＥＸ−ＣＥＬＬ３２５）になるよう希釈することによりトランスフェクションから４８時間後に行った。２日毎に、細胞を計数し、遠心し、そして新しい選択培地中で１ｘ１０6生細胞に再懸濁した。生存度はこれらの時点で調べた。２１〜３５日後、選択は完了し、そして細胞の生存度は８０％超であった。
【０１０６】
ルシフェラーゼ測定
培養物をサンプリングする２時間前に、細胞を計数し、そして培養物を０．２ｘ１０6生細胞／ｍｌに希釈した。
【０１０７】
PromegaのBright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号Ｅ２６１０）をルシフェラーゼ測定のために製品ガイドラインに従い使用した。
【０１０８】
要約すると、細胞懸濁液を複数回上下にピペッティングすることでホモジェナイズし、そして５０μｌのアリコートを抜き取り、そしてそれを白い９６ウェルプレート(Nunc、カタログ番号２３６１０８）内に据えた。続いて、５０μｌの再構成したBright-Glo試薬を添加し、そして５分間室温でインキュベートした。発光をCentro LB 960ルミノメーター(Berthold Technologies)上で５秒の収集時間の間に測定した。
【０１０９】
続いてルシフェラーゼ活性を試験した試料中の生細胞の数、すなわち典型的には１ｘ１０4細胞で正規化した。
【０１１０】
結果
コンストラクトＣ，Ｄ，Ｅ及びＦ（図２を参照のこと）を安定な発現系で試験した。結果を図５に表す。ＩＥ２プロモーターを単独で含んで成るコンストラクトＥは、この系において最も強力な発現をもたらした。両方向の配列にＩＥ１プロモーターが一緒に存在する場合（コンストラクトＤ）、ＩＥ２プロモーターは尚も、ＩＥ１プロモーターが単独で（コンストラクトＦ）又はＩＥ２プロモーターとの両方向の配置で（コンストラクトＣ）駆動させる発現よりも優れたルシフェラーゼ発現をもたらした。
【０１１１】
実施例３：両方向性発現ベクターからの注目の２つのポリペプチドの同時発現
材料と方法
トランスフェクションは実施例１及び２に記載のとおり実施した。要約すると、ＣＨＯ−Ｓ細胞（懸濁液中。Gibco SFMII）を９００、５００、３００及び１００ｎｇのベクターＤＮＡ（コンストラクトＣ−２、図３を参照のこと）を２４ウェルプレートにおいて一過性トランスフェクションした（各条件につき３回一組）。トランスフェクションの２日後、ルシフェラーゼアッセイは３回一組のものに由来する細胞抽出物を用いて行い、ＲＬＵ（相対光単位）で表した。同じウェルからの上清を細胞の溶解前に採取し、プールし、そしてＥＬＩＳＡでＩＬ１８ＢＰについてアッセイした（下文を参照のこと）。
【０１１２】
ＩＬ−１８ＢＰ ＥＬＩＳＡ
上清中の組換えヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｒｈＩＬ−１８ＢＰ）の量を、標準的なＥＬＩＳＡにより、ビオチンとカップリングした、プロテインＧ精製モノクローナル抗ｒｈ−ＩＬ−１８ＢＰ抗体を用いて測定した。Extravidine-HRP (Sigma)を検出試薬として用いた。
【０１１３】
図９は、両方向性ｍＣＭＶプロモーターコンストラクト（図３を参照のこと）による安定トランスフェクションから９０日目に４８個のクローンが発現したＩＬ−１８ＢＰの量（ｎｇ／ｍｌ）及びルシフェラーゼの量（ＲＬＵ）を示す。ルシフェラーゼの検出限界は約５０００ＲＬＵであり、そしてＩＬ−１８ＢＰは２．５ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１４】
結果
この一連の実験において、図３で表すコンストラクトＣ−２からの２つの遺伝子の同時発現がアッセイされた。マーカー遺伝子（ルシフェラーゼ）はＩＥ１プロモーターから発現し、そして注目の遺伝子であるＩＬ−１８ＢＰはＩＥ２プロモーターから発現した。ＩＬ−１８ＢＰは分泌タンパク質である。プロモーターは両方向的構造において配列され、すなわち両プロモーターは同時に反対方向に発現を駆動させた。
【０１１５】
この研究結果を図６〜９に表す。図６は、一過性発現系において測定される、ＲＬＵで表されるルシフェラーゼ発現の程度を示す。同一の一過性発現系において、ＩＬ−１８ＢＰは、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清において測定した。図７は、分泌されたＩＬ−１８ＢＰの結果（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図８は、各一過性発現実験におけるＩＬ−１８ＢＰ対ルシフェラーゼの比率を示す。
【０１１６】
図６〜８に示す通り、異なる量のプラスミドＤＮＡをトランスフェクションに使用した。使用した全ての量のＤＮＡがルシフェラーゼとＩＬ−１８ＢＰの両方の発現をもたらした。驚いたことに、ＩＬ−１８ＢＰ及びルシフェラーゼについて一貫して、最低量のトランスフェクションされたＤＮＡ、すなわち１００ｎｇのベクターＤＮＡにより最良の結果が得られた。
【０１１７】
更に、安定な比率（図８）は、両プロモーターの発現能力間の一定の関係を示す。
【０１１８】
結論として、これらのデータは、両遺伝子が２つのプロモーター単位から同時に発現することを証明し、更に、両発現単位が両方向性のプロモーター構造において十分に機能的であることを示している。
【０１１９】
続いて、コンストラクトＣ−２は安定トランスフェクションされ、そしてルシフェラーゼ及びＩＬ−１８ＢＰの発現は４８個の独立したクローンにおいてアッセイされた。
【０１２０】
安定トランスフェクションは、トランスフェクション後に使用した培地がProCho5(Cambrex、カタログ番号１２７６６Ｑ）であったことを除き、実施例２に記載のプロトコールに従い実施した。
【０１２１】
１つの細胞のクローニングのために、プールを３８４ウェルプレート(Nunc、カタログ番号１６４６８８）内に０．５細胞／ウェル（７０μｌ／ウェル）の密度で、Multidropディスペンサー(ThermoLabsystems、カタログ番号５８４０１５０）を用いて配列した。８日後、１９２個のクローンをランダムに選び、そしてルシフェラーゼ発現について解析した。最高のＬｕｃ発現を有する４８個のクローンを選択し、そしてルシフェラーゼ（ルミノメーターで）及びＩＬ−１８ＢＰ（手作業によるＥＬＩＳＡで。上文を参照のこと）について再びアッセイした。
【０１２２】
図９は、この実験結果を示す。４８個全てのクローンが、量の変化はあるが、ルシフェラーゼ及びＩＬ−１８ＢＰを発現した。
【０１２３】
実施例４：最小エンハンサー配列の定義
材料と方法
プラスミドＤＮＡ
短縮されたｍＣＭＶプロモーターを含む一連のベクターが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及びｍＣＭＶｐに沿って一致している特異的プライマー（表１）を用いて構築した。
【０１２４】
ＰＣＲ条件は以下の通りである：
混合液：
１０ｎｇのＤＮＡプラスミド（prevmCMV-ルシフェラーゼ（ΔＸｈｏＩ）、図２のコンストラクトＥ）
５０ｐｍｏｌのセンス、アンチセンス両方のプライマー（以下の表１を参照のこと。全てコモンアンチセンス）
２００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）
１ｘDynazymeバッファー（１．５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む）
４ユニットのDynazyme II ＤＮＡポリメラーゼ (Finnzymes、カタログ番号Ｆ−５０１Ｓ）
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
５μｌの各ＰＣＲ反応液を１％アガロースゲル上に充填した。正確な長さを有するバンドを切り出し、そしてQiagen Minilute Gel Extractionキット（カタログ番号２８６０６）を用いてクローニング前に精製した。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
ｍＣＭＶｐから保持された塩基対の数に相当する位置は、基準としてＩＥ２から＋１の位置を考慮すると、−１０７６、−７８３、−５８７、−３８７及び−１８９である。
【０１２９】
クローニングストラテジーは、プロモーターフラグメントのいずれについても同じであり、ＰＣＲは完全長ｍＣＭＶｐ（ｐｒｅｖｍＣＭＶ−ルシフェラーゼ（ΔＸｈｏＩ）、すなわち図２のコンストラクトＥ）に対し実施した。続いてフラグメントは、特異的プライマー配列の先端に加えられた２つの制限部位をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化された。続いて、プロモーター配列は、それをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化することによりコンストラクトＥから除き、そしてより短いバージョンを全く同じ部位に挿入した。
【０１３０】
コンストラクトの評価は、一過性リポフェクタミントランスフェクション、続くルシフェラーゼ測定により行った。追加の材料と方法は実施例１に記載のとおりである。この実施例で使用したＳＦＭ培地はProCho5(Cambrex、カタログ番号１２７６６Ｑ）であった。
【０１３１】
結果
ルシフェラーゼ遺伝子を駆動させるｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターを含んで成るベクターＨ〜Ｎ（図１０．ａ）は、ＩＥ２プロモーターからの高い発現レベルに必要な最小配列を定義するために構築された。
【０１３２】
７個の発現ベクターコンストラクトＨ〜Ｎは、ＣＨＯ−Ｓ細胞ベースの一過性発現系において使用した。結果を図１０．ｂに表す。コンストラクトＬはこの系において最も強力なルシフェラーゼ発現を保持している最も短いコンストラクトである。コンストラクトＭでさえも、コンストラクトＨ〜Ｌで達成された発現レベルの約３０％のレベルのルシフェラーゼ発現をもたらした。コンストラクトＮで得られたルシフェラーゼ発現は非常に低かったが、尚も有意であり、これはＴＡＴＡボックス及びイニシエーターを含む生産的な転写開始部位について予想される基礎のプロモーター活性を示している。
【０１３３】
結論として、これらの実験は、本明細書でｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーと称するｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域の新規エンハンサーを定義する。上記実験において、当該ＩＥ２エンハンサーは、コンストラクトＮ内で保持された最小ＩＥ２プロモーターからの転写を増大させる。高いレポーター遺伝子発現に必要とされる最小配列は−５８７〜−１８９ｂｐのフラグメント（コンストラクトＬ）内にあり、そして−３８７〜−１８９ｂｐフラグメントを含んで成るコンストラクトもルシフェラーゼ発現を増強させた（コンストラクトＭ）。
【０１３４】
実施例５：ＳＶ４０最小プロモーターを活性化させる新規ＩＥ２エンハンサー。
新規ＩＥ２エンハンサーが実際にエンハンサー活性に必要な全ての基準を満たすか、すなわち、（１）位置、（２）配向、及び（３）プロモーターの同一性、とは無関係に発現を増強させるか否かを評価するために、追加の実験を実施した。そのために、コンストラクトＯ〜Ｖを構築し、新規ＩＥ２エンハンサーが、ＳＶ４０プロモーターに対する配向、距離及び位置（５’又は３’）とは無関係に異種プロモーターであるＳＶ４０プロモーターの発現を増強しうることを評価した。コンストラクトＷ、Ｘ及びＹはコントロールとし、ここで、ＷはＳＶ４０エンハンサーを含み、Ｘは全くエンハンサーを含まないがＳＶ４０プロモーターを含み、そしてＹはエンハンサーもプロモーターも含まない。
【０１３５】
ベクターの構築
ＳＶ４０プロモーターのみを含むｐＳＶ−Ｌｕｃと称されるベクター（図１１（ａ）のコンストラクトＸ）は、ＳＶ４０プロモーター駆動ルシフェラーゼ遺伝子、及び前記遺伝子の３’側に位置するＳＶ４０エンハンサー、を含むｐＧＬ３−Ｃｔｒｌ(Promega, E2741)（コンストラクトＷ）、及びプロモーターとエンハンサーの両方を欠いているｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ(Promega, E1751（コンストラクトＹ）から構築した。
【０１３６】
要約すると、ｐＧＬ３−ＣｔｒｌをＮｏｔＩ／ＸｂａＩで切り出して、ＳＶ４０プロモーターを含むフラグメント、続いてルシフェラーゼ遺伝子を含むフラグメントを単離した。同様に、ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃをＮｏｔＩ／ＸｂａＩで切り出し、そして、３’エンハンサーの無い、ポリＡ領域を含むベクターのバックボーンを単離した。２つのフラグメントを組み合わせることで、ｐＳＶ−Ｌｕｃ（コンストラクトＸ）を得た。
【０１３７】
このベクターのＳＶ４０プロモーターの５’領域は、ＩＥ２エンハンサー配列（−５８７〜−１８９）を両方の配向でクローニングすることにより操作し、これらをp5'enh-SV-Luc（コンストラクトＯ）及びp5'reverse enh-SV.Luc（コンストラクトＱ）と称した。更に、ＩＥ２エンハンサー配列（−５８７〜−１８９）もルシフェラーゼの３’領域に両方の配向でクローニングした。生じたベクターをp3'enh-SV-Luc+（コンストラクトＳ）及びp3'reverseenh-SV.Luc.（コンストラクトＵ）と称した。
【０１３８】
同じ手順をＩＥ２エンハンサーの短いバージョン、すなわち−５８７〜−１８９の代わりに−３８７〜−１８９を有するもので実施し、そしてコンストラクトＰ，Ｒ，Ｔ及びＶと称した。図１１．ａを参照のこと。
【０１３９】
コンストラクトＯ、Ｐ：レシピエントベクターは、ＮｈｅＩ／ＳｍａＩで消化することにより開裂させたｐＳＶ−Ｌｕｃ＋（図１１．ａのコンストラクトＸ）を用いた。完全長のエンハンサーをＮｄｅＩによる消化、続いて、クレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化反応、精製及びＮｈｅＩによる消化により単離した。同じストラテジーを短いエンハンサーコンストラクトの構築に利用した。
【０１４０】
コンストラクトＱ、Ｒ：レシピエントベクターは、ＸｈｏＩ／ＳｍａＩで消化することにより開裂させたｐＳＶ−Ｌｕｃ＋（図１１．ａのコンストラクトＸ）を用いた。完全長のエンハンサーをＮｄｅＩによる消化、続いて、クレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化反応、精製及びＸｈｏＩによる消化により単離した。同じストラテジーを短いエンハンサーコンストラクトの構築に利用した。
【０１４１】
コンストラクトＳ、Ｔ、Ｕ及びＶ：レシピエントベクターは、ＢａｍＨＩによる消化、続くクレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化により開裂させたｐＳＶ−Ｌｕｃ＋（図１１．ａのコンストラクトＸ）を用いる。完全長のエンハンサーをＮｄｅＩ／ＮｈｅＩによる消化、続いて、クレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化反応により単離した。クローニングにより両方の配向が可能となり、これらを制限解析で確認した。両方の配向は解析のために維持された。同じストラテジーを短いエンハンサーコンストラクトの構築に利用した。
【０１４２】
コンストラクトｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（コンストラクトＹ）は発現しないコントロールとしての役割を果たした。ｐＧＬ３−Ｃｔｒｌ（コンストラクトＷ）はＳＶ４０プロモーター／エンハンサーベクターとしての役割を果たした。ｐＳＶ−ＬｕｃはＳＶ４０プロモーターを単独で有するコントロールとした（コンストラクトＸ）。
【０１４３】
トランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は前述の実施例のように実施した。
【０１４４】
結果
図１１．ａのコンストラクトＯ〜Ｙで得られた結果を図１１．ｂに表す。エンハンサー無しのＳＶ４０プロモーターコンストラクトを追加されたエンハンサー活性のための基線として採用し、そしてコンストラクトＸで測定された活性を１と設定した。長い又は短いＩＥ２エンハンサーを有する全てのコンストラクトが、レポーター遺伝子の発現をもたらした。長いバージョンは、ＳＶ４０プロモーターからのレポーター遺伝子の高発現を一貫してもたらし、これはＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０エンハンサーの組み合わせ（コンストラクトＯ）で得られた発現レベルよりもはるかに高かった。従って、この実験は、位置及び配向と無関係に異種プロモーターを活性化させる正規のエンハンサーとして、−５８７〜−１８９の配列及び−３８７〜−１８９の配列を明確に定義する。
【０１４５】
実施例６：長いＩＥ２エンハンサーのバージョン（−５３７〜−１８９）とｈＣＭＶエンハンサーとの比較
リポフェクタミンによるトランスフェクション、その後のルシフェラーゼ測定のための実験プロトコールは実施例１に記載されている。
【０１４６】
結果
この実験において、ＳＶ４０プロモーターの５’側に両方の配向の新規ＩＥ２エンハンサーの長いバージョンを有するコンストラクトＯ及びＱを既知の強力なエンハンサーであるｈＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）エンハンサーとの比較に使用した。このために、ｍＣＭＶ ＩＥ２配列はコンストラクトＯにおいてｈＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）で置換され、その結果コンストラクトＯ−２が生じた。同じことがコンストラクトＱで行われ、その結果コンストラクトＱ−２が生じた。
【０１４７】
クローニングに使用した、ＭｌｕＩ部位（ＭｌｕＩ＝ａｃｇｃｇｔ）を隣接しているｈＣＭＶエンハンサー配列は以下の通りである：
【化１】
【０１４８】
ＳＶ−ＬＵｃ＋は、ＭｌｕＩで消化し、そしてウシ小腸アルカリホスファターゼで処理してセルフライゲーションを防いだ。ｈＣＭＶプロモーター配列をＭｌｕＩ部位でクローニングした。両方の配向のクローンを同等のＩＥ２コンストラクトとの比較のために維持した。
【０１４９】
ルシフェラーゼ発現の結果を図１２に示す。新規ＩＥ２エンハンサー（長いバージョン）で得られたルシフェラーゼ発現レベルは、古典的なｈＣＭＶエンハンサーで得られるルシフェラーゼ発現レベルの少なくとも２倍の高さであった。
【０１５０】
実施例７：両方向性コンストラクトにおけるＩＥ２エンハンサーの能力
図１３に示すようなコンストラクト♯２６及び♯１４０と称する２つの追加のコンストラクトを設計して、両方向的構造の新規エンハンサーを試験した。
【０１５１】
♯２６：このベクターの土台にｍＣＭＶ−Ｌｕｃ＋（コンストラクトＣ、図１３）を使用した。これをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。ＩＬ−１８ＢＰカセットをｐｈＣＭＶ−ＩＬ１８ＢＰ２から取り出した。このベクターをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断することで、イントロンＡ、続いてＩＬ−１８ＢＰオープンリーディングフレーム及びＳＶ４０ポリＡ領域を含むフラグメントを単離した。
【０１５２】
♯１４０：このベクターの土台に図１０．ａのコンストラクトＬを使用した。これをＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで消化してＩＥ２エンハンサーの５’側でベクターを開いた。ＩＥ１プロモーターからＩＬ１８ＢＰを発現するベクターをｐＢＳ．Ｉ ＩＬ１８ＢＰ（ＩＥ１）．Ｉと称し、インサートドナーとして使用した。このベクターをＸｈｏＩ／ＳｐｅＩで消化することにより、ＸｈｏＩからのＩＥ１プロモーター（図１を参照のこと）、続いてイントロンＡ−ＩＬ１８Ｂｐ−ＳＶ４０ポリＡカセットを含むフラグメントを単離した。生じたコンストラクトは、基のｍＣＭＶプロモーター配列の−５８９からＸｈｏＩまでの配列を欠いていた。
【０１５３】
安定トランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は、実施例２に記載の通り実施し、そしてＩＬ１８ＢＰのＥＬＩＳＡは実施例３に記載の通り実施した。
【０１５４】
しかしながら、コンストラクト♯１４０は、ＩＥ１プロモーターとＩＥ２プロモーターが逆の配向にある点でコンストラクト♯２６とは正確には似ていない。従って、ルシフェラーゼ発現は、コンストラクト♯２６においてはＩＥ１プロモーターで、一方、コンストラクト♯１４０においてはＩＥ２プロモーターで駆動させ、そしてＩＬ１８ＢＰ発現は、コンストラクト♯２６においてはＩＥ２プロモーターで、そしてコンストラクト♯１４０においてはＩＥ１プロモーターで駆動させた。
【０１５５】
両コンストラクトで得られた結果は、両方向性の発現ベクター（コンストラクト♯１４０）の２つのプロモーターに対する新規ＩＥ２エンハンサーの同時作用にとって重要であるので、以下に示す。
【０１５６】
図１４は、ルシフェラーゼとＩＬ−１８ＢＰの発現の観点での、コンストラクト♯２６及び♯１４０で安定トランスフェクションしたプール由来の結果を表す。コンストラクト♯１４０は、マーカー遺伝子（ルシフェラーゼ）と注目の遺伝子（ＩＬ−１８ＢＰ）両方のより高い発現をもたらした。
【０１５７】
ルシフェラーゼとＩＬ−１８Ｂｐの発現の安定性を評価するために、プールを選択的条件下、すなわちピューロマイシン処理のもとで維持するか、あるいは選択圧無しで（ピューロマイシン無しで）３週間維持した。結果を図１５〜１７に示す。レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ及びＩＬ−１８ＢＰの発現レベルは長期間有意に変化しなかった。図１６及び１７を参照のこと。
【０１５８】
従って、コンストラクト♯２６及び♯２４０はともに、選択圧に関係なく長期間類似の発現レベルを示したことが証明された。それ故に、新規ＩＥ２エンハンサーを有するコンストラクトは、２つの遺伝子の安定な且つ同時の発現に適している。
【０１５９】
上記結果がプールで得られたので、クローンは両プールからウェル当たり０．５細胞に限界希釈することで導いた。
【０１６０】
クローンはピューロマイシン選択のもとで培養し、クローンの発現レベルを評価した。続いて、単離したクローンをピューロマイシンの存在下、そして不在下で分離し、最終的にそれらの安定性をモニタリングした。図１８及び１９に示した結果は、クローンが＋／−ピューロマイシン条件で分割される前に得られた。ピューロマイシン除去から２週間後の結果は、両コンストラクトについて有意な差異を示さず、これは安定であることを示している。この研究は更に１０〜１２週続けられる。
【０１６１】
両遺伝子の発現を評価するために、ハイスループットのフォーマットを使用し、すなわち９６ウェルプレートで行った。
【０１６２】
１日目：１／２希釈の細胞、１００μｌのＰｒｏＣｈｏ５培養液（無血清）＋５％ウシ胎児血清を含む１００μｌの新鮮なＰｒｏＣｈｏ５。２．５％ＦＢＳの終濃度で、細胞は接着することができた。メンテナンスプレートの毎週の継代は、１／２０希釈係数で、全てＰｒｏＣｈｏ５培地で実施した。
【０１６３】
２日目：培地を捨て、２００μｌの１ｘＰＢＳ(Invitrogen, 10010-015)で一回洗浄し、そして５％ＦＢＳを含む７５μｌの新鮮なＰｒｏＣｈｏ５を添加し、そして２４時間の発現のパルスでインキュベートした。
【０１６４】
３日目：５０μｌの上清を回収し、そして２００μｌのＥＬＩＳＡバッファー（１ｘＰＢＳ、０．１％ｗ／ｖＢＳＡ、０．２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）を添加した。１００μｌをＩＬ−１８ＢＰについてＥＬＩＳＡで解析した。
【０１６５】
ウェルを２００μｌの１ｘＰＢＳで洗浄し（廃棄）、そして１００μｌのＧｌｏ溶解バッファー(Promega, E266a)を添加した。ウェルを３０分間室温でインキュベートして細胞の溶解を評価した。ルシフェラーゼ測定は、白の９６ウェルプレートに移した３０μｌの溶解した細胞及び３０μｌの再構成したＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬を用いて実施した。発光をCentro LB 960ルミノメーター(Berthold Technologies)上で５秒の収集時間の間に測定した。
【０１６６】
コンストラクト♯２６による安定トランスフェクションから得られたクローンの解析を図１８に表し、そしてコンストラクト♯１４０による安定トランスフェクションから生じたものと図１９に表す。
【０１６７】
図１８及び１９に表したクローンは、それらのルシフェラーゼ値により、低下する順にランク付けした。ＩＬ１８ＢＰの発現はＯＤ値として示した。ＥＬＩＳＡをハイスループットのフォーマットで実施したので、ＩＬ−１８ＢＰレベルの実際の定量は得られなかった。しかしながら、２５００ｎｇ／ｍｌ及び２５０ｎｇ／ｍｌのコントロール並びにブランクを含めてプレート間の変動をモニターした。
【０１６８】
図２０は、inverted ChemiDoc viewにおけるプレート上でのルシフェラーゼ発現を示す。このviewにＣＣＤカメラ(Biorad)を使用し、その結果化学発光由来のシグナルを獲得することが可能となる（図２０に示す通り）。Quantity One 4.2.3と称されるソフトウェアは、写真の管理、例えばシグナルの反転等を可能にし、これを本願で利用した。
【０１６９】
図１８〜２０に示す結果から明らかなように、コンストラクト♯１４０は多くの非発現クローンをもたらした。しかしながら、驚くべきことに、幾つかのポジティブクローンが両遺伝子を極度に強く発現した。
【０１７０】
従って、コンストラクト♯１４０は、非常に初期のクローニング段階における非常に高いエクスプレッサーについてのスクリーニングを可能にし、その結果注目の両遺伝子を高度に発現する幾つかのクローンを同定するために、多数のクローンについて試験し、そしてフォローアップする必要がなくなる。
【０１７１】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメント、及び／又はｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、当該ベクターを含む宿主細胞、当該発現ベクターを用いて所望のポリペプチドを産生する方法、及び当該発現ベクターの使用、に関する。
【０００２】
ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーター及びｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと、任意に新規ｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーとを含んで成る発現ベクターは本発明において好ましく、特に両プロモーターが両方向的構造において配列されている場合に好ましい。
【背景技術】
【０００３】
数十年前から、発現ベクターは、注目のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡを宿主細胞で発現させるための媒体として使用されている。強力なウイルス性又は細胞性のプロモーター及びエンハンサーは、宿主細胞への組換えＤＮＡの一過性又は安定性のトランスフェクションを用いることにより高レベルで注目の遺伝子を発現させるために使用されている。ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）領域は、この点特に適していることが証明されており、そしてこの領域由来の遺伝子因子を含んで成る発現ベクターは、例えばＥＰ０３２３９９７Ｂ１で知られている。
【０００４】
今日まで、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）由来の遺伝子制御配列は、ｍＣＭＶ由来制御エレメントが非常に強力で、且つヒトの対応物と比較して遥かに強いことが確認されているが(Kim et al. 2002)、ほとんど使用されていない。
【０００５】
ＵＳ４，９６３，４８１(de Villiers)は、ウイルスゲノムから単離された約２２７０塩基対（ｂｐ）の制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩフラグメントを含むｍＣＭＶ ＩＥ領域由来のＤＮＡフラグメントの転写制御下にある異種タンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを開示している。このフラグメントの１３８７ｂｐの切断バージョンは、当該異種タンパク質の発現のためのプロモーターとしての前記ＤＮＡフラグメントの有効性における有意な向上をもたらした。
【０００６】
ＵＳ４，９６８，６１５(Kozinowski)は、真核細胞において構造遺伝子の転写を増強するために使用されうるマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）由来の転写エンハンサーを含む組換えＤＮＡ分子を記載している。当該ｍＣＭＶエンハンサーは、de Villiers（ＵＳ４，９６３，４８１）により同定された２．２７ｋｂのＰｓｔＩフラグメント内に位置しているといわれている。
【０００７】
Manning及びMocarski(1988)は、マウスサイトメガロウイルスの複製についてのｍＣＭＶ ＩＥ２領域の機能的重要性を分析した。このために、ｍＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターの転写制御下にあるｌａｃＺレポーター遺伝子を有し、その結果ＩＥ２遺伝子が破壊されている組換えウイルスが構築された。実際にＩＥ２遺伝子発現が無いことを観察することができ、そしてウイルスは普通に複製された。その結果、著者等は、サイトメガロウイルス、例えばｍＣＭＶ及びｈＣＭＶの中で保存されていないＩＥ２遺伝子がウイルス複製に必須ではなかったと結論付けた。ＩＥ２エンハンサー／プロモーター領域の何らかの特定の有用性についての指摘はManning及びMocarskiによって全く開示も示唆もされていない。
【０００８】
最近の文献は、マウスとヒトとの間のＣＭＶ ＩＥ領域の更なる差異を示している。マウスの遺伝子座は、第一のＩＥ遺伝子の反対方向に第二の主要なｍＲＮＡを発現している。この第二の前初期遺伝子はＩＥ２と名づけられ、そのプロモーター配列はＩＥ２プロモーターと称されている(Messerle et al. 1991)。
【０００９】
ｍＣＭＶ由来のＩＥ２領域は、これまでのところ異種タンパク質の発現のためのベクターに使用されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｍＣＭＶのＩＥ２プロモーター領域を含んで成るＤＮＡエレメントを有するベクターがトランスフェクションした宿主細胞における注目の遺伝子の発現を効率的に駆動させることができるという知見に基づいている。
【００１１】
本発明は更にｍＣＭＶ ＩＥ２領域における新規エンハンサーの同定に基づいており、これを本明細書ではｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーと称する。このエンハンサーは、エンハンサーの定義に一般的に適用される基準を満たし、すなわち、（１）位置、（２）配向、及び（３）異種プロモーターからの発現の増強、とは無関係に発現を増強させる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の第一の側面は、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメント、及び／又はｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、に関する。
【００１３】
第二の側面において、本発明は、本発明のベクターを含んで成る宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明の第三の側面は、注目のポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞に本発明のベクターをトランスフェクションする工程を含んで成る方法に関する。
【００１５】
第四の側面において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養する工程を含んで成る方法に関する。
【００１６】
本発明の第五の側面は、注目の１又は複数の遺伝子又はｃＤＮＡの発現のための本発明のベクターの使用に関する。
【００１７】
第六の側面において、本発明は、注目の遺伝子を大量に発現するクローンの選択のための本発明のベクターの使用に関する。
【００１８】
第七の側面は、ＤＮＡベースの治療における本発明のベクターの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、発現コンストラクトに使用するためのｍＣＭＶ ＩＲ領域由来の両方向性ＤＮＡエレメントの配列を示す。ＩＥ２及びＩＥ１プロモーターの＋１部位及びＴＡＴＡボックスをそれぞれ示す。両遺伝子のコアプロモーターを四角の中に示す。ＨｐａＩ及びＸｈｏＩ制限部位を太字で示す。−６８２位はＩＥ１の＋１に対して示す。
【図２】図２は、レポーターコンストラクトＡ〜Ｇを示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は太線として示し、そしてプロモーターは白抜きの矢印として示す。Ａ：ネガティブなプロモーター無しの制御（ｐＧＬ３ベーシック）。Ｂ：ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー駆動のルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３コントロール）。Ｃ：ＩＥ１プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現（ｐｍＣＭＶルシフェラーゼ、ＩＥ１駆動）。Ｄ：ＩＥ２プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現（ｐｒｅｖｍＣＭＶルシフェラーゼ、ＩＥ２駆動）。Ｅ：ＩＥ２プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現、ＩＥ１プロモーターは欠失（ｐｒｅｖｍＣＭＶルシフェラーゼ（ΔＸｈｏＩ）、ＩＥ２駆動、ＩＥ１マイナス）。Ｆ：ＩＥ１プロモーター駆動のルシフェラーゼ発現、ＩＥ２プロモーターは欠失（ｐＢＳ．ＭＣＭＶ３ルシフェラーゼ、ＩＥ１駆動（１．４ｋｂ）、ＩＥ２マイナス）。Ｇ：ＩＥ１プロモーターの短縮版によるルシフェラーゼ発現の駆動（ｐ−６８０ルシフェラーゼ、ＩＥ１駆動（短いバージョン、０．６８ｋｂ））。
【図３】図３は、ＩＥ２プロモーターと連結したＩＬ−１８ＢＰのコード配列（太線）を有する、図２のコンストラクトに類似の両方向性コンストラクト（コンストラクトＣ−２）を示す。従って、このコンストラクトにおいて、ｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターがルシフェラーゼ発現を駆動させ、そして同時にｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターがＩＬ−１８ＢＰ発現を駆動させる。三角：イントロン。黒の楕円：ポリＡ。
【図４】図４は、図２においてコンストラクトＡ〜Ｇで表した異なるレポーターコンストラクトからのルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を示す。無血清培地（ＳＦＭ）で生育したＣＨＯ−Ｓ細胞はコンストラクトＡ〜Ｇで一過性トランスフェクションし、あるいはモックトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性は、ＲＬＵ＝相対光単位として表す。
【図５】図５は、トランスフェクションしたＣＨＯ−Ｓ細胞の安定なプールにおいてＲＬＵとして測定したルシフェラーゼ発現を示す。細胞は、図２でコンストラクトＤ、Ｃ、Ｆ及びＥでトランスフェクションした後にＳＦＭ培地で生育した。ルシフェラーゼ発現は、選択してから２１日後に評価した。
【図６】図６は、９００、５００、３００及び１００ｎｇの、図３で示した両方向性コンストラクトＣ−２による一過性トランスフェクション後のＲＬＵとして測定したルシフェラーゼ発現を示す。
【図７】図７は、図６の一過性トランスフェクション実験（コンストラクトＣ−２）由来の細胞培養上清中のＩＬ−１８ＢＰ量（ｎｇ／ｌ）を示す。
【図８】図８は、図６及び７の実験で測定したＩＬ−１８ＢＰ量対ルシフェラーゼ量の比率を示す。
【図９】図９は、両方向性コンストラクトＣ−２（図３に示すとおり）によるトランスフェクションから８日後に選択した４８の個々のクローンによって発現したルシフェラーゼの量（ＲＬＵ）（左のｙ軸）及びＩＬ−１８ＢＰの量（ｎｇ／ｍｌ）（右のｙ軸）を示す。ルシフェラーゼの検出限界は約５００ＲＬＵ、そしてＩＬ−１８ＢＰは２．５ｎｇ／ｍｌであった。Ｘ軸上のそれぞれの増加分は１つの単一のクローンを示している。
【図１０．ａ】図１０．ａはレポーターコンストラクトＨ〜Ｎを示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）は太線で示し、そしてそれぞれのＩＥ１、ＩＥ２プロモーターは白抜きの矢印で示す。エンハンサーはグレーの楕円で示す：既知のＩＥ１エンハンサーはライトグレー、そして新規ＩＥ２エンハンサーはダークグレー。Ｈ：ルシフェラーゼ発現を駆動させるＩＥ２プロモーターを有する両方向性コンストラクト。Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ：短縮したｍＣＭＶプロモーターを含むコンストラクト。位置は、基準としてのＩＥ２の＋１に対するｍＣＭＶｐからの塩基対の数に相当する。Ｊ：−１０７６からＫ：−７８３からＬ：−５８７からＭ：−３８７からＮ：−１８９から
【図１０．ｂ】図１０．ｂは、無血清培地で生育したＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクション後の、図１０．ａのレポーターコンストラクトＨ〜Ｎからのルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示す。
【図１１．ａ】図１１．ａは、新規ＩＥ２エンハンサー（グレーの楕円）とＳＶ４０プロモーターとを組み合わせた追加のレポーターコンストラクトＯ〜Ｙを示す。グレーの楕円は−５８７〜−１８９のＩＥ２エンハンサーを表し、半分のグレーの楕円は−３８７〜−１８９のＩＥ２エンハンサーを表す。ＩＥ２エンハンサーの上の矢印は、エンハンサー配列の方向を示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は太線で示し、ＳＶ４０プロモーターは白抜きのは矢印で示す。黒の楕円：ポリＡ。Ｏ：ＳＶ４０プロモーターの５’側にクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｐ：ＳＶ４０プロモーターの５’側にクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｑ：ＳＶ４０プロモーターの５’側に逆の配向でクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｒ：ＳＶ４０プロモーターの５’側に逆の配向でクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｓ：ＳＶ４０プロモーターの３’側にクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｔ：ＳＶ４０プロモーターの３’側にクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｕ：ＳＶ４０プロモーターの３’側に逆の配向でクローニングされた長いＩＥ２エンハンサー配列（−５８７／−１８９）；Ｖ：ＳＶ４０プロモーターの３’側に逆の配向でクローニングされた短いＩＥ２エンハンサー配列（−３８７／−１８９）；Ｗ：コントロール。ルシフェラーゼのコード配列の３’側にＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０エンハンサー。Ｘ：コントロール。何らエンハンサー無しでＳＶ４０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ発現。Ｙ：ネガティブコントロール。プロモーター無し。
【図１１．ｂ】図１１．ｂは、図１１．ａに示したレポーターコンストラクトＯ〜Ｙからのルシフェラーゼ発現を示す。無血清培地（ＳＦＭ）中で生育したＣＨＯ−Ｓ細胞をコンストラクトＯ〜Ｙで一過性トランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性はコントロールＸ（値１）、すなわち、何らエンハンサー無しでＳＶ４０プロモーターにより駆動される発現と比較した場合の誘導の倍数として表す。白抜きの棒：長いＩＥ２エンハンサー（−５８７〜−１８９）、網掛けの棒：短いＩＥ２エンハンサー（−３８７〜−１８９）。Ｘ軸は対数尺である。
【図１２】図１２は、新規ＩＥ２エンハンサーと既知のｈＣＭＶエンハンサーとを比較する実験である。細胞はコントロールのコンストラクトＡ（ｐＧＬ３ベーシック、図２のプロモーター無しのものを参照のこと）、コントロールのコンストラクトＢ（ｐＧＬ３ｃｔｒｌ、図２を参照のこと。ルシフェラーゼのコード領域の３’側にＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０エンハンサー配列を有する）、コントロールのコンストラクトＸ（ＳＶ−Ｌｕｃ＋。図１１．ａを参照のこと。ＳＶ４０プロモーター。エンハンサー無し）、並びにコンストラクトＯ及びＱ（図１１．ａを参照のこと）又はコンストラクトＯ−２又はＱ−２（ＩＥ２エンハンサー配列（長いバージョン、−５８７〜−１８９）が既知のｈＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）で置換されている）でトランスフェクションされた。ルシフェラーゼが測定された（ＲＬＵ）（ｘ軸）。網掛けの棒：既知のｈＣＭＶエンハンサーによるもの。グレーの棒：新規ＩＥ２エンハンサーによるもの。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１８ＢＰとルシフェラーゼの同時発現に使用する両方向性ベクターを示す。ＩＥ１及びＩＥ２プロモーターは白抜きの矢印で示す。三角はｈＣＭＶのＩＥ領域由来のイントロンＡを表し、そしてグレーの楕円はポリアデニル化シグナルを表す。黒の四角はシグナルペプチドを表す。コンストラクト♯２６：ルシフェラーゼはＩＥ１プロモーターから発現し、そしてＩＬ−１８ＢＰはＩＥ２プロモーターから発現した。両プロモーター間の配列は図１０．ａのコンストラクトＨにあるものである。コンストラクト♯１４０：ルシフェラーゼはＩＥ２プロモーターにより発現し、そしてＩＬ−１８ＢＰはＩＥ１プロモーターから発現した。ＩＥ２エンハンサー（−５８７〜−１８９）は２つのプロモーターの間に位置する。
【図１４】図１４は、無血清培地中で生育したＣＨＯ細胞を図１３のコンストラクト♯２６又は♯１４０のいずれかで一過性トランスフェクションした後に発現したルシフェラーゼ量（ＲＬＵ、左のｙ軸）及びＩＬ−１８Ｂｐ量（ｎｇ／ｍｌ、右のｙ軸）を示す。棒：ルシフェラーゼ発現。黒のひし形：ＩＬ−１８ＢＰ発現。
【図１５】図１５は、図１３のコンストラクト♯２６又は♯１４０のいずれかでトランスフェクションした安定なプール中でのルシフェラーゼの発現（ＲＬＵ、左のｙ軸）及びＩＬ−１８Ｂｐの発現（ｎｇ／ｍｌ、右のｙ軸）を示す。発現は、トランスフェクションから７週間後に測定した。細胞は、ピューロマイシンによる選択の下で維持するか（＋ｐｕｒｏ）、あるいはピューロマイシン選択無しで３週間維持した（−ｐｕｒｏ）。棒：ルシフェラーゼ発現。黒のひし形：ＩＬ−１８ＢＰ発現。
【図１６】図１６は、図１５の実験で見られるルシフェラーゼ発現の時間的経過を示す。ｘ軸は時間（週）を表す。図１５で示したデータは図１６の３週のデータに相当する。黒のひし形：♯２６＋ｐｕｒｏ、小さい四角：♯１４０＋ｐｕｒｏ、黒い三角：♯２６−ｐｕｒｏ、大きい四角：♯１４０−ｐｕｒｏ。
【図１７】図１７は、図１６の実験におけるＩＬ−１８ＢＰ発現の時間的経過を示す。レジェンドは図１６のとおりである。
【図１８】個々のプロトクローンをルシフェラーゼ発現（四角）（ＲＬＵ）（左のｙ軸）及びＩＬ−１８ＢＰ発現（ひし形）（ｎｇ／ｍｌ）（右のｙ軸）について解析した。ｘ軸上の増分は個々のプロトクローンを表す。プロトクローンはコンストラクト♯２６で安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞から樹立し、そしてピューロマイシン選択の下維持した。
【図１９】図１９は、図１８と同様であるが、プロトクローンはコンストラクト♯１４０でトランスフェクションした細胞から樹立した。
【図２０】コンストラクト♯２６又は♯１４０のいずれかをトランスフェクションしたプロトクローンを、ルシフェラーゼ発現について９６ウェルフォーマットのinverted ChemiDoc viewにおいて解析した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の詳細な説明
本発明によると、驚くべきことに、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）２遺伝子のプロモーターがｍＣＭＶ ＩＥ２タンパク質自体以外の注目のポリペプチド、すなわち異種ポリペプチド又はタンパク質の発現を促進するのに効率的であることが明らかとなった。この発現ベクターは、マウスサイトメガロウイルス自体であることはなく、あるいは完全なｍＣＭＶウイルス遺伝子を全く含まないが、組換えタンパク質発現のために着想されたベクターである。
【００２１】
従って、本発明は、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、又はその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、に関する。
【００２２】
これに加え、新規エンハンサーがｍＣＭＶ ＩＥ２領域において同定されており、これを本明細書でｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサー、又はＩＥ２エンハンサーと称する。このエンハンサーは、遺伝子に対するその位置又は配向に関係なく発現を増強し、そして異種プロモーターからの発現を増強し、その結果エンハンサーの一般的基準を満たす。
【００２３】
従って、本発明では、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、又はその機能的な発現増強フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター、に関する。
【００２４】
当業者は、本発明のベクターがｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターを単独で、又は任意の適切な既知のエンハンサーと組み合わせて含んで成ることがあることを理解するであろう。当業者はまた、本発明のベクターがｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーを単独で、又は任意の適当なプロモーターと組み合わせて含んで成ることがあることを理解するであろう。更に、本発明のベクターは、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターをｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーと組み合わせて含んで成ることがある。
【００２５】
ｍＣＭＶ ＩＥ２遺伝子自体は、例えばMesserle et al., 1991により知られている。
【００２６】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、１又は複数のＤＮＡ配列の転写を調節するよう機能し、且つＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位及びプロモーター機能を制御するよう相互作用する他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定されるＤＮＡの領域を意味する。プロモーターの機能的発現促進フラグメントは、プロモーターとしての活性を保持する短縮又は切断されたプロモーター配列である。プロモーター活性は、当業界で既知のあらゆるアッセイ、例えばレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いるレポーターアッセイで測定されうる(Wood,1991 ; Seliger and McElroy, 1960 ; de Wet et al.(1985)、又はPromega（登録商標）より市販されているもの）。
【００２７】
本発明によると、ＩＥ２プロモーターは、例えば、図１に示す通り、＋１位からＴＡＴＡボックスに及ぶ配列を含んで成ることがある。ＩＥ２プロモーターはまた、図１で表す配列のヌクレオチド１〜３９に及ぶ（四角）、本明細書で「コアプロモーター」と称する配列を含んで成ることがある。当業者は、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターの配列がそれを作用可能に連結したＤＮＡ配列の転写を駆動する限りコアプロモーターよりも長いか、又は短いことがありうることを理解するであろう。例えば、ＩＥ２プロモーターはまた、コアプロモーターの上流に１００〜２００塩基対含んで成ることがある。そのようなプロモーター領域はまた「近位プロモーター」と称される。当業者は更に、用語「プロモーター」と「エンハンサー」（以下を参照のこと）とが正確に定義されておらず、その結果、命名法及び文脈によって、プロモーターがエンハンサー領域を含んで成ることがあり、あるいはエンハンサー領域がプロモーター領域を含んで成ることがある。
【００２８】
用語「ベクター」は、宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製及び／又は適切な発現のための宿主細胞への外因性ＤＮＡの伝達にとって有用な外因性ＤＮＡ又はＲＮＡのあらゆる担体を意味する。
【００２９】
用語「作用可能に連結」は、本明細書で使用する場合、プロモーターの制御下で、遺伝子、ｃＤＮＡ又は他のＤＮＡを発現するよう適切なフレーム内で転写される構造遺伝子又はｃＤＮＡ又は他のあらゆるＤＮＡ配列とプロモーターとが機能的に融合していることを意味する。用語「作用可能に連結」とは、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ配列の直接的な融合に限定されない。
【００３０】
用語「ｍＣＭＶの完全な遺伝子」とは、自身（内因性、ウイルス性）の５’及び３’制御エレメントを有するマウスサイトメガロウイルスのウイルス遺伝子を意味する。
【００３１】
「エンハンサー領域」は、１又は複数の遺伝子の転写を増大させるよう機能するＤＮＡの領域を意味する。更に具体的には、用語「エンハンサー」は、本明細書で使用する場合、発現する遺伝子に対するその位置及び配向に関係なく遺伝子の発現を増強、増大、改善、又は回復させるＤＮＡ制御エレメントであり、そして複数のプロモーターの発現を増強、増大、改善、又は回復させることがある。好ましくは、エンハンサーは、複数のプロモーターからの発現を同時に増強させる。エンハンサーの機能的発現増強フラグメントは、増強活性を保持する短縮又は切断されたエンハンサー配列である。
【００３２】
本発明のベクターは、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−３８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである。これは、エンハンサー機能を有するフラグメントであり、そして本明細書ではＩＥ２エンハンサーの短いバージョンとも称される。
【００３３】
更に好ましい態様において、ベクターは、ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−５８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである。このフラグメントはエンハンサー機能を有し、そして本明細書ではまたＩＥ２エンハンサーの長いバージョンとも称される。
【００３４】
本発明のベクターはまた、更に追加のｍＣＭＶ ＩＥエンハンサー、又はその機能的発現増強フラグメントを含んで成ることがあり、これは、本明細書では「ＣＭＶ ＩＥ１エンハンサー」と称する。
【００３５】
そのようなｍＣＭＶ ＩＥ１エンハンサーは当業界で知られており、例えばＵＳ４，９６８，６１５号による。それは、例えば図１に示す配列の−５８７〜−１４７位、又は−６８２〜−１４７位に及び、ここで、この番号付けはＩＥ１遺伝子の＋１位に対するものである。本発明に従い使用されうるｍＣＭＶ ＩＥ１エンハンサーは更に、図１のＩＥ１の＋１位に対し、塩基対−１３３０〜−４８８に及ぶ配列を含んで成ることがある。エンハンサー領域は、更にプロモーターの全部又は一部を含んで成ることがある。
【００３６】
ＩＥ２プロモーターに加えｍＣＭＶエンハンサーを用いることによって、注目のポリペプチドの発現は更に増大しうる。
【００３７】
本発明によると、ベクターは更に、ｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーターと異なるプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントを含んで成る。
【００３８】
好ましい態様において、本発明のベクターは、ウイルス起源、細胞起源又は人工起源の第一及び第二プロモーター、又はそれらの機能的発現促進フラグメントを含んで成る。
【００３９】
本発明により、第二プロモーターの存在がｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターからの注目のポリペプチドの効率的な発現をもたらすことが示されている。従って、本発明の好ましい態様において、ベクターは、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターを、第二プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントと組み合わせて含んで成る。追加の適当なプロモーターの例には、ｈＣＭＶプロモーター、メタロチオネインプロモーター（ＭＴ）、ＳＶ４０プロモーター、又は人工プロモーターが含まれる。好ましくは、第二プロモーターはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターの追加のコピーである。そのような追加のプロモーターは、構成的な又は制御された発現を促進することがある。制御された発現は、誘導性又は抑制性の発現、あるいはその両方であってもよい。
【００４０】
好ましくは、そのような第二プロモーターは、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子のプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントである。従って、第一プロモーターがｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントであり、且つ第二プロモーターがｎＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントであることが好ましい。
【００４１】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーターは、例えばＷＯ８７／０３９０５より知られている。これは、図１の配列の最後の４７ｂｐ（四角）、又は追加の１００〜２００ｂｐ上流配列（すなわち近位プロモーター）を含むコアプロモーターを含んで成ることがあり、あるいは最大−１３３０位（ＩＥ１の＋１位に対して。図１を参照のこと）の全遺伝子間領域を含んで成ることがある。
【００４２】
好ましい態様において、ベクターは、ＩＥ１プロモーター及びＩＥ２プロモーターの両方並びにＩＥ１エンハンサー及び新規ＩＥ２エンハンサー、あるいはそれらの任意な機能的発現促進フラグメントを含む配列番号１のＤＮＡ配列を含んで成る。
【００４３】
非常に好ましい態様において、本発明のベクターにおけるプロモーター、又はそれらの機能的な発現促進フラグメントは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と作用可能に連結している。本発明の更に好ましい態様において、本発明のエンハンサーは少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と一緒に発現ベクター上に存在する。
【００４４】
好ましくは、前記ＤＮＡ配列は注目のタンパク質をコードしている。
【００４５】
更に好ましくは、前記ＤＮＡ配列はマーカータンパク質をコードしているか、あるいは増幅可能な遺伝子である。
【００４６】
前記ＤＮＡ配列がレポータータンパク質をコードしているのも好ましい。
【００４７】
本発明のベクターが複数のプロモーターを含む場合、注目のタンパク質、マーカー、レポーター、増幅可能な遺伝子等のあらゆるコンビネーション又はサブコンビネーションが同一のプラスミドから発現されることがある。
【００４８】
本発明によると、注目のポリペプチドは、ＩＥ２ポリペプチド自体と異なる任意のポリペプチドであってもよく、細胞外タンパク質、例えばペプチドホルモン、サイトカイン又は増殖因子、あるいは膜貫通タンパク質、例えば増殖因子受容体又はホルモン受容体、あるいは細胞内タンパク質、例えばキナーゼ、ホスファターゼ又はＤＮＡ結合タンパク質であってもよく、これは注目のポリペプチド又はそれが発現される宿主細胞の用途によって左右される。
【００４９】
本発明に従う適当なマーカータンパク質は、例えばネガティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカー、あるいは増幅可能な遺伝子である。例としては、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）、又はピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）が含まれる。更なる例には、特定の代謝経路の使用による選択に使用される遺伝子、例えばガラクトキナーゼ(Schumperli et al., 1982)、葉酸受容体(Zhu et al., 2001)、又は還元葉酸担体(Assaraf et al., 1992)、が含まれる。
【００５０】
また更に好ましい態様において、注目のポリペプチドはレポーター遺伝子である。
【００５１】
用語「レポーター遺伝子」又は「レポータータンパク質」は、本明細書で使用する場合、単純であり高価でない方法又は試薬を用いて同定することができ、且つ本発明のプロモーター領域又はその活性フラグメントに作用可能に連結することができる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味することが意図される。レポーター遺伝子は、スクリーニングアッセイにおいて転写活性を決定するのに使用されることがあり（例えば、Goeddel (ed. ), Methods Enymol., Vol. 185, San Diego. Academic Press, Inc. (1990)を参照のこと）、例えばレポーター遺伝子としてルシフェラーゼが用いられる(Wood, 1991; Seliger and McElroy, 1960 ; de Wet et al. (1985), 又はPromega（登録商標）より市販されているもの)。
【００５２】
例は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、Ｏ−ガラクトシダーゼ、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他のタンパク質との分子内組み合わせ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(Abbate et al., 2001)、あるいはそれらの組み合わせから選択される。
【００５３】
本発明の基となる実験データは、注目のポリペプチドの効率的な同時発現が、共に同一のプラスミド上に存在するＩＥ２プロモーター及びＩＥ１プロモーターで達成されうることを示した。従って、更に好ましい態様において、ｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーター、及びｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーターの両方、又はそれらの機能的発現促進フラグメントは、それぞれポリペプチドと作用可能に連結している。
【００５４】
高い発現レベルは、両プロモーターが両方向的構造に存在する場合に達成されうる。従って、ｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、及びプロモーター、特に、ｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター、あるいはその機能的発現促進フラグメントは、両方向的に配列される。
【００５５】
用語「両方向的に配列」とは、本明細書で使用する場合、プロモーターが相対する方向に転写を駆動させることを意味することが意図される。このプラスミドＤＮＡの配列は、ベクターの「両方向的構造」とも称される。
【００５６】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１若しくはｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、あるいはｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーターと組み合わせて又はＩＥ２エンハンサーと組み合わせて使用されうる任意な追加のプロモーターは、更に翻訳開始シグナルを含むことがある。
【００５７】
更に好ましい態様において、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、あるいはｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーは、転写を制御し、又は転写に影響を及ぼす他のエレメントと連結される。そのようなエレメントは、ＲＮＡのプロセシング、安定性又は翻訳の効率に影響を及ぼすことがある。適当なエレメントの例は、５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ（例えば、Mazumder et al., 2003を参照のこと）、ｍＲＮＡ３’末端プロセシング配列（例えば、ポリアデニル化部位）、及びポリシストロン性の発現のためのＩＲＥＳ配列（例えば、Mountford and Smith, 1995）から成る群から選択される。
【００５８】
ポリシストロン性ｍＲＮＡの発現のためにＩＲＥＳエレメントを使用するのが好ましく、ここで、コード配列は当該ＩＲＥＳによって分離されている。この利点は、複数の注目のポリペプチドが同一のｍＲＮＡから、そしてその結果同一のプロモーターから発現しうることである。
【００５９】
より更に好ましい態様において、ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーターは、単独で、あるいはｍＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のプロモーター、又は任意な他の天然プロモーター若しくは人工プロモーター、又はＩＥ２エンハンサーと組み合わせて、追加の発現促進配列、例えばインスレーター、境界エレメント、ＬＣＲ（例えば、Blackwood and Kadonga (1998)により説明されているもの）又はマトリックス／足場付着領域（例えば、Li et al., 1999により説明されているもの）と連結されることがある。
【００６０】
当業者は、本発明のベクターがまた、追加のエンハンサー、例えば周知のＳＶ４０エンハンサー又はｈＣＭＶエンハンサーを含むことがあることを理解するであろう。
【００６１】
本発明によると、第一プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと作用可能に連結したポリペプチド、と、第二プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと作用可能に連結したポリペプチド、とは同一であってもよい。この場合、同一の遺伝子の２つのコピーが同一のベクター上に存在するが、これらは２つの異なるプロモーターの調節下にある。従って、注目のポリペプチドをコードする遺伝子の単一のコピーからの発現よりも優れている発現率を達成するのが可能な場合がある。
【００６２】
別の態様において、第一プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと作用可能に連結したポリペプチド、と、第二プロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドとは異なる。従って、互いに別々に、しかし同一の宿主細胞において発現させることが望ましい場合、本発明は、２つの異なるポリペプチド、例えば選択マーカーと注目のタンパク質の同時発現のための効率的なベクター、同一タンパク質の２又はそれ以上のサブユニットの同時発現のための効率的なベクターを提供し、あるいは同一タンパク質の異なるドメインのものでさえも提供する。
【００６３】
当業者は、本発明の複数の発現ベクターが、同一細胞内に同時トランスフェクションされることがあり、そして多数のタンパク質及び／又は極めて複雑な多量体タンパク質のサブユニットの発現について役割を果たすことがあることを理解するであろう。
【００６４】
好ましくは、第一プロモーター、例えばｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドは、二量体又は多量体タンパク質の第一サブユニットであり、そして第二プロモーター、例えばｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドは、二量体又は多量体タンパク質の第二サブユニットである。二量体タンパク質の２つのサブユニットの同時発現は本発明において好ましい。同一タンパク質の２つのサブユニットの同時発現は特に有利であり、これは、両プロモーターからの発現が、使用するプロモーターの強度によって同程度の量のサブユニットの産生、又は既定の比率の両ポリペプチドの産生をもたらしうるためである。当該サブユニットは、続いて、同一細胞内で構築されて成熟タンパク質を形成しうる。
【００６５】
本発明のベクターを用いて発現するのに適した二量体タンパク質の好ましい例は、ペプチドホルモン、例えばヒトＦＳＨ、ヒトＬＨ、ヒトＴＳＨ及びヒトＣＧのα鎖及びβ鎖である。２つのサブユニットのうちいずれかは、本発明におけるプロモーター、好ましくはｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターと連結されうる。当業者は、他の種由来のホルモン、例えばウマ、ブタ、ウシのホルモンが、例えば組換えポリペプチドの用途によって、本発明に従い同等に使用されうることを理解するであろう。
【００６６】
本発明の別の態様において、第一サブユニットはイムノグロブリンの重鎖であり、そして第二サブユニットは軽鎖であり、あるいはその反対も同様である。適当なイムノグロブリンの好ましい例はＩｇＧである。そのようなイムノグロブリンは治療用のヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。そのようなヒト化抗体の非常に好ましい例は、Ｒａｐｔｉｖｅ（登録商標）の商標名を有するヒト化抗ＣＤ１１抗体である。
【００６７】
多くの注目のポリペプチドが本発明のベクターを用いて発現されうる。好ましい態様において、当該ポリペプチドは、絨毛性ゴナドトロピン(chorionic gonadotropin)、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピン(choriogonadotropic)ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ６５、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗ＣＤ１１ａ抗体、並びにそれらの突然変異タンパク質、フラグメント、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質から成る群から選択される。
【００６８】
他の好ましい注目のポリペプチドには、例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経ゴナドトロピン、インスリン様増殖因子（例えば、ソマトメジンＣ）、ケラチノサイト増殖因子、グリア細胞系由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質−２、血小板由来増殖因子、ヒルジン、エポイエチン(epoitetin)、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、並びにそれらの突然変異タンパク質、フラグメント、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質が含まれる。
【００６９】
本発明の第二の側面は、少なくとも１つの上述のベクターでトランスフェクションされた宿主細胞に関する。当業者は、当該宿主細胞が本発明の２又はそれ以上のベクターで同等に同時トランスフェクションされうることを理解するであろう。
【００７０】
多くの宿主細胞が本発明に適しており、例えば広範な真核生物由来の一次又は樹立細胞系、例えば植物動物細胞及び動物細胞、哺乳類又はヒト細胞である。例えば、適当な宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ細胞、ＹＩ細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウスハイブリドーマ細胞等、Namalwa細胞、ＰＲＭＩ−８２２６細胞、ベロ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞あるいは他の不死化細胞及び／又は形質転換細胞を含む。
【００７１】
好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、そして更に好ましくはＣＨＯ−Ｓ細胞であり、これは例えば、Shotwellら(1982, J. Biol. Chem. 257: 2974-2980)により説明されている。ＣＨＯ細胞は、雌のチャイニーズハムスター由来の卵巣の生検からPuck(J.Exp.Med. 108, 945, 1958)により最初に培養された。これらの最初の細胞から、種々の特徴を有する多数の亜系統が調製された。これらのＣＨＯ細胞系の１つであるＣＨＯ−Ｋ１はプロリン要求性であり、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子について二倍体である。この細胞系由来の別の系は、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ ＤＵＫ Ｂ１１）(PNAS 77, 1980, 4216-4220)であり、これは１つのＤＨＦＲ遺伝子の突然変異、続いて、その他の遺伝子の損失の結果としてＤＨＦＲ機能の損失を特徴とする。
【００７２】
これらの細胞の全てが、本発明のベクターにより、一過性、又は半安定（例えば、ベクターがエピソームである場合）又は安定（例えば、ゲノム内に組み込まれている状態）の様式でトランスフェクションされうる。注目のポリペプチドを構成的に発現するクローンを樹立するためには、安定トランスフェクションが好ましい。
【００７３】
本発明のＩＥ２プロモーター、又はＩＥ２エンハンサーは、「内因性遺伝子活性化(endogenous gene activation)」と称される技術の枠内で制御エレメントとして使用されることがある。本発明のベクターは、相同組換えにより活性化されることが予想されるゲノムの遺伝子座に導入されることがあり、その結果制御配列（ＩＥ２プロモーター及び／又はエンハンサー）が、誘導又は増強に発現を必要とする注目の遺伝子と作用可能に連結される。この技術は、例えばＷＯ９１／０９９５５に記載されている。
【００７４】
第三の側面において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞を本発明のベクターでトランスフェクションする工程を含んで成る方法に関する。
【００７５】
注目のポリペプチドの性質によって、本発明の方法は、細胞培養の上清から収集されうる分泌タンパク質又はポリペプチド、あるいは既知の方法により細胞から単離されうる細胞膜タンパク質又は細胞内タンパク質をもたらす。本発明により産生されるポリペプチドは、あらゆる目的について役割を果たすことがあり、そして好ましくはそれはヒト又は動物に対する投与が意図される治療用のタンパク質である。
【００７６】
用途によって、自身に前記ポリペプチドを組み込ませている細胞は、本発明の方法の産物でありうる。そのような細胞は、例えば細胞ベースの治療に使用されうる。
【００７７】
第四の側面において、本発明は、注目のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を培養する工程を含んで成る方法に関する。
【００７８】
好ましい態様において、前記方法は更に、注目のポリペプチドを宿主細胞又は細胞培養上清から単離する工程を含んで成る。この工程は、細胞培養上清から単純に単離されうる分泌タンパク質の場合に実施するのが特に有利であり、そして簡便である。しかしながら、この工程は、宿主細胞から単離されうる細胞膜、又は細胞内区画からポリペプチドを単離するのに同等に適用される。
【００７９】
当該工程は、一過性、安定性、エピソーム又はウイルスの発現系において使用されうる。以下の実施例に示す通り、本発明のベクターは、安定な発現系において使用される場合、所望のタンパク質の特に強力な発現をもたらした。従って、好ましい態様において、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。
【００８０】
第五の側面において、本発明のベクターは、注目の遺伝子の発現に使用される。注目の遺伝子は、例えば、上述の注目のポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子であってもよい。本発明のベクターはまた、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、増幅可能な遺伝子等の発現に使用されうる。
【００８１】
好ましくは、ベクターは、２又はそれ以上の注目の遺伝子又はｃＤＮＡの同時発現に使用される。それはまた、１つの注目の遺伝子及び１つのマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は増幅可能な遺伝子等の同時発現に使用されうる。
【００８２】
本発明の枠内で、驚くべきことに、本発明のベクター、特にＩＥ２プロモーター、ＩＥ２エンハンサー及びＩＥ１プロモーターを含んで成るベクターが、レポーター遺伝子及び注目の遺伝子を高度に発現したクローンの同定をもたらしたことが示された。従って、第六の側面において、本発明は、大量の注目の遺伝子を発現するクローンの選択のための本発明のベクターの使用に関する。
【００８３】
第七の側面において、本発明は、プラスミド又はＤＮＡベースの治療あるいは遺伝子治療における使用のための薬物の製造のための本発明のベクターの使用に関する。
【００８４】
第八の側面において、本発明の宿主細胞は、細胞ベースの治療のための薬物の製造に使用される。細胞ベースの治療がヒトの治療を意図する場合、宿主細胞がヒト細胞又は細胞系であることが好ましく、更に好ましくは処置される患者由来の細胞又は細胞系である。
【００８５】
本発明を十分に説明してきたが、当業者は、広範囲の同等のパラメーター又は濃度及び条件において、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験を必要とすることなく実施されうることが理解されよう。
【００８６】
本発明はその特定の態様と関連して説明してきたが、更なる修正が可能であることが理解されよう。本願は、本発明が関連する業界内の既知のプラクティス又は慣行に入る場合、そして特許請求の範囲に従い上述の本質的特徴に適用されうる場合、通常本発明の原理に従い、且つ本願の開示からの前記逸脱を含む本発明のあらゆる変更、使用又は脚色を網羅することが意図される。
【００８７】
本明細書で引用する全ての参考文献、例えば論文又は抄録、公開された又は公開されてない米国又は外国特許出願、交付された米国又は外国特許あるいはあらゆる他の参考文献が、引用により本明細書にその全体、例えば引用された参考文献において提示されている全てのデータ、表、図及び文書が組み入れられる。更に、当該参考文献において引用された参考文献の全内容も、引用によりその全体が組み入れられる。
【００８８】
既知の方法の工程、常用の方法の工程、既知の方法又は常用の方法への言及は、本発明のあらゆる観点、記載又は態様が関連技術において開示され、教示され又は示唆されていることを承認するものではない。
【００８９】
具体的な態様の前述の記載は、他の者が当業界の技術範囲内の知識（本明細書で引用する参考文献の内容を含む）を応用することにより、過度の実験無しに、本発明の一般的概念を逸脱することなく、種々の応用のためにそのような具体的な態様を容易に修飾及び／又は採用することができる本発明の一般的な性質を非常に十分に明らかにしている。従って、そのような採用及び修飾は、本明細書に示す教示及び手引きに基づき、開示された態様の均等の範囲内の意味の範囲内であることが意図される。本明細書の用語及び語法は説明目的であって、限定目的ではなく、その結果、本明細書の用語及び語法は、当業界の通常の技術のうちの１つの知識と組み合わせて、本明細書で示す教示及び手引きを考慮して当業者によって解釈されるべきである。
【実施例１】
【００９０】
実施例１：一過性トランスフェクションにおける発現ベクターの評価
材料と方法
材料
細胞：ＣＨＯ−Ｓ、起源Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１６１９）
図２及び３に表すように構築したプラスミドＤＮＡは、Nucleobond PC 500キット(Macherey-Nagelカタログ番号７４０７５４)を用い、製品プロトコールに従い、一晩生育した標準培地から単離した。
【００９１】
トランスフェクション：リポフェクタミン（Invitrogen、カタログ番号１８３２４−０１２）
フォーマット：２４ウェルプレート
細胞：指数増殖期のＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクション２４時間前に継代した。低い細胞密度での定常期を回避するために、細胞を０．７５ｘ１０6細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクションする細胞の総計は１，５ｘ１０5であり、これを２４ウェルプレート内でウェル当たり１００μｌの無血清培地ＳＦＭ ＩＩ（Invitrogen、カタログ番号１２０５２−１１４）中で再懸濁した。
【００９２】
トランスフェクション混合物は以下の通りである：
Ａ）リポフェクタミン：２μｌ
ＳＦＭ ＩＩ培地：４８μｌ
全量５０μｌ
Ｂ）ＤＮＡ：１μｇ（５０ｎｇ発現ベクター＋９５０ｎｇのキャリアプラスミド、pBluescript II KS(+), Stratagene、カタログ番号２１２２０５−０１）
ＳＦＭ ＩＩ培地：５０μｌに達するまで補足。
【００９３】
溶液ＡとＢを混合し、そして３０分間室温でインキュベートした。
【００９４】
この混合物を、１．５ｘ１０5細胞を含む１００μｌのＳＦＭ ＩＩ培地に添加した。細胞をインキュベーターに戻し、そして３７℃、５％ＣＯ2で３時間インキュベートした。続いて、４００μｌのＳＦＭ ＩＩ培地を添加してリポフェクタミンを希釈した。続いて、細胞を解析のための試料採取前に更に４８時間インキュベートした。全てのトランスフェクションは３回一組で実施した。
【００９５】
ルシフェラーゼ測定
PromegaのBright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号Ｅ２６１０）をルシフェラーゼ測定のために製品ガイドラインに従い使用した。
【００９６】
要約すると、細胞懸濁液を複数回上下にピペッティングすることでホモジェナイズし、そして５０μｌのアリコートを抜き取り、そしてそれを白い９６ウェルプレート(Nunc、カタログ番号２３６１０８）内に据えた。続いて、５０μｌの再構成したBright-Glo試薬を添加し、そして５分間室温でインキュベートした。発光をCentro LB 960ルミノメーター(Berthold Technologies)上で５秒の収集時間の間に測定した。
【００９７】
結果
ＣＨＯ−Ｓ細胞ベースの一過性発現系において使用した発現ベクターコンストラクトを図２に表す。この一連の実験において、ルシフェラーゼは遺伝子発現の評価のためのレポーター遺伝子として使用した。ＣＨＯ−Ｓ細胞内でほとんど活性がない、プロモーターを全く有さないベクター（コンストラクトＡ）又はＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを有するベクター（コンストラクトＢ）のいずれかをコントロールとして使用した。
【００９８】
ベクターＡ〜Ｇによる一過性トランスフェクション実験の結果を図４に示す。コンストラクトＣ及びＦにおいて、ルシフェラーゼ発現はＩＥ１プロモーターにより駆動される。両コンストラクトはルシフェラーゼ発現をもたらした。コンストラクトＣは更に、ＩＥ１プロモーターに対し両方向性に配列されたＩＥ２プロモーターを含んだ。この両方向的な配列は、ＩＥ１プロモーター単独の使用（コンストラクトＦ）と比較して、ＩＥ１プロモーター（コンストラクトＣ）からの発現効率を低下させた。０．６８ｋｂの短いバージョンのＩＥ１プロモーター（コンストラクトＧ）は、より長いバージョン（コンストラクトＦ）よりも効率的でなかった。
【００９９】
同一コンストラクト内の第二プロモーターの存在、不在に関係なく、ＩＥ２プロモーターは効率的にルシフェラーゼ発現を駆動させ（コンストラクトＤ及びＥ）、そしてその結果注目のポリペプチドの発現のための発現ベクターにおけるプロモーターエレメントとして使用されうる。
【０１００】
ＩＥ１プロモーターと対照的に、ＩＥ２プロモーターは、単独で使用した場合（コンストラクトＥ）、両方向的構造において使用する場合（コンストラクトＤ）よりもあまり効率的でなかった。従って、これは両方向性の発現における使用に特に適している。
【０１０１】
実施例２：安定トランスフェクションにおける発現ベクターの評価
材料と方法
材料
細胞：ＣＨＯ−Ｓ、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１６１９）由来
プラスミドＤＮＡ（図２に従う）は、Nucleobond PC 500キット(Macherey-Nagelカタログ番号７４０７５４)を用い、製品プロトコールに従い、一晩生育した標準培地から単離した。
【０１０２】
トランスフェクション：リポフェクタミン（Invitrogen、カタログ番号１８３２４−０１２）
安定トランスフェクションのために、Ｔ７５フラスコを使用した。指数増殖期のＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクション２４時間前に継代した。低い細胞密度での定常期を回避するために、細胞を０．７５ｘ１０6細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクションする細胞の総計は５ｘ１０6であり、これをＴ７５フラスコ中７ｍｌのＳＦＭ ＩＩ培地（Invitrogen、カタログ番号１２０５２−１１４）中で再懸濁した。
【０１０３】
トランスフェクション混合物は以下の通りである：
Ａ）リポフェクタミン：５２．１μｌ
ＳＦＭ ＩＩ培地：５１７．９μｌ
全量５７０μｌ
Ｂ）ＤＮＡ：１０μｇの直線型プラスミドＤＮＡ（９μｇのＬｕｃ発現ベクター＋１μｇの選択用プラスミド：ＳＶ４０駆動ピューロマイシン耐性遺伝子。全てのプラスミドをＰｖｕＩで直線化した）。
ＳＦＭ ＩＩ培地は５７０μｌになるよう補足された。
【０１０４】
ＡとＢを混合し、そして３０分間室温でインキュベートした。５ｘ１０6細胞を含む７ｍｌのものを添加し、そして細胞を３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内に３時間戻した。続いて、培養物を８００ｇで３分間遠心し、そして細胞のペレットを５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３２５（ＪＲＨ、カタログ番号１４３３５−１０００Ｍ）中で再懸濁し、１ｘＨＴ及び４．５ｍＭのＬ−グルタミン（１００ｘＨＴ、Invitrogen、カタログ番号１１０６７−０３０、Ｌ−グルタミン２００ｎｍ、Sigma、G-7513）を補充した。５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３２５を直接Ｔ７５フラスコに添加して接着している細胞を再懸濁し、そして当該懸濁液に添加した。合計で５ｘ１０6細胞が１０ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ３２５培地中にあった。
【０１０５】
選択手順：
選択は、培地を交換し、そして１０μｇ／ｍｌピューロマイシン(Sigma, P8833)を含む１ｘ１０6細胞／ｍｌ（ＥＸ−ＣＥＬＬ３２５）になるよう希釈することによりトランスフェクションから４８時間後に行った。２日毎に、細胞を計数し、遠心し、そして新しい選択培地中で１ｘ１０6生細胞に再懸濁した。生存度はこれらの時点で調べた。２１〜３５日後、選択は完了し、そして細胞の生存度は８０％超であった。
【０１０６】
ルシフェラーゼ測定
培養物をサンプリングする２時間前に、細胞を計数し、そして培養物を０．２ｘ１０6生細胞／ｍｌに希釈した。
【０１０７】
PromegaのBright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号Ｅ２６１０）をルシフェラーゼ測定のために製品ガイドラインに従い使用した。
【０１０８】
要約すると、細胞懸濁液を複数回上下にピペッティングすることでホモジェナイズし、そして５０μｌのアリコートを抜き取り、そしてそれを白い９６ウェルプレート(Nunc、カタログ番号２３６１０８）内に据えた。続いて、５０μｌの再構成したBright-Glo試薬を添加し、そして５分間室温でインキュベートした。発光をCentro LB 960ルミノメーター(Berthold Technologies)上で５秒の収集時間の間に測定した。
【０１０９】
続いてルシフェラーゼ活性を試験した試料中の生細胞の数、すなわち典型的には１ｘ１０4細胞で正規化した。
【０１１０】
結果
コンストラクトＣ，Ｄ，Ｅ及びＦ（図２を参照のこと）を安定な発現系で試験した。結果を図５に表す。ＩＥ２プロモーターを単独で含んで成るコンストラクトＥは、この系において最も強力な発現をもたらした。両方向の配列にＩＥ１プロモーターが一緒に存在する場合（コンストラクトＤ）、ＩＥ２プロモーターは尚も、ＩＥ１プロモーターが単独で（コンストラクトＦ）又はＩＥ２プロモーターとの両方向の配置で（コンストラクトＣ）駆動させる発現よりも優れたルシフェラーゼ発現をもたらした。
【０１１１】
実施例３：両方向性発現ベクターからの注目の２つのポリペプチドの同時発現
材料と方法
トランスフェクションは実施例１及び２に記載のとおり実施した。要約すると、ＣＨＯ−Ｓ細胞（懸濁液中。Gibco SFMII）を９００、５００、３００及び１００ｎｇのベクターＤＮＡ（コンストラクトＣ−２、図３を参照のこと）を２４ウェルプレートにおいて一過性トランスフェクションした（各条件につき３回一組）。トランスフェクションの２日後、ルシフェラーゼアッセイは３回一組のものに由来する細胞抽出物を用いて行い、ＲＬＵ（相対光単位）で表した。同じウェルからの上清を細胞の溶解前に採取し、プールし、そしてＥＬＩＳＡでＩＬ１８ＢＰについてアッセイした（下文を参照のこと）。
【０１１２】
ＩＬ−１８ＢＰ ＥＬＩＳＡ
上清中の組換えヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｒｈＩＬ−１８ＢＰ）の量を、標準的なＥＬＩＳＡにより、ビオチンとカップリングした、プロテインＧ精製モノクローナル抗ｒｈ−ＩＬ−１８ＢＰ抗体を用いて測定した。Extravidine-HRP (Sigma)を検出試薬として用いた。
【０１１３】
図９は、両方向性ｍＣＭＶプロモーターコンストラクト（図３を参照のこと）による安定トランスフェクションから９０日目に４８個のクローンが発現したＩＬ−１８ＢＰの量（ｎｇ／ｍｌ）及びルシフェラーゼの量（ＲＬＵ）を示す。ルシフェラーゼの検出限界は約５０００ＲＬＵであり、そしてＩＬ−１８ＢＰは２．５ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１４】
結果
この一連の実験において、図３で表すコンストラクトＣ−２からの２つの遺伝子の同時発現がアッセイされた。マーカー遺伝子（ルシフェラーゼ）はＩＥ１プロモーターから発現し、そして注目の遺伝子であるＩＬ−１８ＢＰはＩＥ２プロモーターから発現した。ＩＬ−１８ＢＰは分泌タンパク質である。プロモーターは両方向的構造において配列され、すなわち両プロモーターは同時に反対方向に発現を駆動させた。
【０１１５】
この研究結果を図６〜９に表す。図６は、一過性発現系において測定される、ＲＬＵで表されるルシフェラーゼ発現の程度を示す。同一の一過性発現系において、ＩＬ−１８ＢＰは、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清において測定した。図７は、分泌されたＩＬ−１８ＢＰの結果（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図８は、各一過性発現実験におけるＩＬ−１８ＢＰ対ルシフェラーゼの比率を示す。
【０１１６】
図６〜８に示す通り、異なる量のプラスミドＤＮＡをトランスフェクションに使用した。使用した全ての量のＤＮＡがルシフェラーゼとＩＬ−１８ＢＰの両方の発現をもたらした。驚いたことに、ＩＬ−１８ＢＰ及びルシフェラーゼについて一貫して、最低量のトランスフェクションされたＤＮＡ、すなわち１００ｎｇのベクターＤＮＡにより最良の結果が得られた。
【０１１７】
更に、安定な比率（図８）は、両プロモーターの発現能力間の一定の関係を示す。
【０１１８】
結論として、これらのデータは、両遺伝子が２つのプロモーター単位から同時に発現することを証明し、更に、両発現単位が両方向性のプロモーター構造において十分に機能的であることを示している。
【０１１９】
続いて、コンストラクトＣ−２は安定トランスフェクションされ、そしてルシフェラーゼ及びＩＬ−１８ＢＰの発現は４８個の独立したクローンにおいてアッセイされた。
【０１２０】
安定トランスフェクションは、トランスフェクション後に使用した培地がProCho5(Cambrex、カタログ番号１２７６６Ｑ）であったことを除き、実施例２に記載のプロトコールに従い実施した。
【０１２１】
１つの細胞のクローニングのために、プールを３８４ウェルプレート(Nunc、カタログ番号１６４６８８）内に０．５細胞／ウェル（７０μｌ／ウェル）の密度で、Multidropディスペンサー(ThermoLabsystems、カタログ番号５８４０１５０）を用いて配列した。８日後、１９２個のクローンをランダムに選び、そしてルシフェラーゼ発現について解析した。最高のＬｕｃ発現を有する４８個のクローンを選択し、そしてルシフェラーゼ（ルミノメーターで）及びＩＬ−１８ＢＰ（手作業によるＥＬＩＳＡで。上文を参照のこと）について再びアッセイした。
【０１２２】
図９は、この実験結果を示す。４８個全てのクローンが、量の変化はあるが、ルシフェラーゼ及びＩＬ−１８ＢＰを発現した。
【０１２３】
実施例４：最小エンハンサー配列の定義
材料と方法
プラスミドＤＮＡ
短縮されたｍＣＭＶプロモーターを含む一連のベクターが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及びｍＣＭＶｐに沿って一致している特異的プライマー（表１）を用いて構築した。
【０１２４】
ＰＣＲ条件は以下の通りである：
混合液：
１０ｎｇのＤＮＡプラスミド（prevmCMV-ルシフェラーゼ（ΔＸｈｏＩ）、図２のコンストラクトＥ）
５０ｐｍｏｌのセンス、アンチセンス両方のプライマー（以下の表１を参照のこと。全てコモンアンチセンス）
２００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）
１ｘDynazymeバッファー（１．５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む）
４ユニットのDynazyme II ＤＮＡポリメラーゼ (Finnzymes、カタログ番号Ｆ−５０１Ｓ）
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
５μｌの各ＰＣＲ反応液を１％アガロースゲル上に充填した。正確な長さを有するバンドを切り出し、そしてQiagen Minilute Gel Extractionキット（カタログ番号２８６０６）を用いてクローニング前に精製した。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
ｍＣＭＶｐから保持された塩基対の数に相当する位置は、基準としてＩＥ２から＋１の位置を考慮すると、−１０７６、−７８３、−５８７、−３８７及び−１８９である。
【０１２９】
クローニングストラテジーは、プロモーターフラグメントのいずれについても同じであり、ＰＣＲは完全長ｍＣＭＶｐ（ｐｒｅｖｍＣＭＶ−ルシフェラーゼ（ΔＸｈｏＩ）、すなわち図２のコンストラクトＥ）に対し実施した。続いてフラグメントは、特異的プライマー配列の先端に加えられた２つの制限部位をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化された。続いて、プロモーター配列は、それをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化することによりコンストラクトＥから除き、そしてより短いバージョンを全く同じ部位に挿入した。
【０１３０】
コンストラクトの評価は、一過性リポフェクタミントランスフェクション、続くルシフェラーゼ測定により行った。追加の材料と方法は実施例１に記載のとおりである。この実施例で使用したＳＦＭ培地はProCho5(Cambrex、カタログ番号１２７６６Ｑ）であった。
【０１３１】
結果
ルシフェラーゼ遺伝子を駆動させるｍＣＭＶ ＩＥ２プロモーターを含んで成るベクターＨ〜Ｎ（図１０．ａ）は、ＩＥ２プロモーターからの高い発現レベルに必要な最小配列を定義するために構築された。
【０１３２】
７個の発現ベクターコンストラクトＨ〜Ｎは、ＣＨＯ−Ｓ細胞ベースの一過性発現系において使用した。結果を図１０．ｂに表す。コンストラクトＬはこの系において最も強力なルシフェラーゼ発現を保持している最も短いコンストラクトである。コンストラクトＭでさえも、コンストラクトＨ〜Ｌで達成された発現レベルの約３０％のレベルのルシフェラーゼ発現をもたらした。コンストラクトＮで得られたルシフェラーゼ発現は非常に低かったが、尚も有意であり、これはＴＡＴＡボックス及びイニシエーターを含む生産的な転写開始部位について予想される基礎のプロモーター活性を示している。
【０１３３】
結論として、これらの実験は、本明細書でｍＣＭＶ ＩＥ２エンハンサーと称するｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域の新規エンハンサーを定義する。上記実験において、当該ＩＥ２エンハンサーは、コンストラクトＮ内で保持された最小ＩＥ２プロモーターからの転写を増大させる。高いレポーター遺伝子発現に必要とされる最小配列は−５８７〜−１８９ｂｐのフラグメント（コンストラクトＬ）内にあり、そして−３８７〜−１８９ｂｐフラグメントを含んで成るコンストラクトもルシフェラーゼ発現を増強させた（コンストラクトＭ）。
【０１３４】
実施例５：ＳＶ４０最小プロモーターを活性化させる新規ＩＥ２エンハンサー。
新規ＩＥ２エンハンサーが実際にエンハンサー活性に必要な全ての基準を満たすか、すなわち、（１）位置、（２）配向、及び（３）プロモーターの同一性、とは無関係に発現を増強させるか否かを評価するために、追加の実験を実施した。そのために、コンストラクトＯ〜Ｖを構築し、新規ＩＥ２エンハンサーが、ＳＶ４０プロモーターに対する配向、距離及び位置（５’又は３’）とは無関係に異種プロモーターであるＳＶ４０プロモーターの発現を増強しうることを評価した。コンストラクトＷ、Ｘ及びＹはコントロールとし、ここで、ＷはＳＶ４０エンハンサーを含み、Ｘは全くエンハンサーを含まないがＳＶ４０プロモーターを含み、そしてＹはエンハンサーもプロモーターも含まない。
【０１３５】
ベクターの構築
ＳＶ４０プロモーターのみを含むｐＳＶ−Ｌｕｃと称されるベクター（図１１（ａ）のコンストラクトＸ）は、ＳＶ４０プロモーター駆動ルシフェラーゼ遺伝子、及び前記遺伝子の３’側に位置するＳＶ４０エンハンサー、を含むｐＧＬ３−Ｃｔｒｌ(Promega, E2741)（コンストラクトＷ）、及びプロモーターとエンハンサーの両方を欠いているｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ(Promega, E1751（コンストラクトＹ）から構築した。
【０１３６】
要約すると、ｐＧＬ３−ＣｔｒｌをＮｏｔＩ／ＸｂａＩで切り出して、ＳＶ４０プロモーターを含むフラグメント、続いてルシフェラーゼ遺伝子を含むフラグメントを単離した。同様に、ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃをＮｏｔＩ／ＸｂａＩで切り出し、そして、３’エンハンサーの無い、ポリＡ領域を含むベクターのバックボーンを単離した。２つのフラグメントを組み合わせることで、ｐＳＶ−Ｌｕｃ（コンストラクトＸ）を得た。
【０１３７】
このベクターのＳＶ４０プロモーターの５’領域は、ＩＥ２エンハンサー配列（−５８７〜−１８９）を両方の配向でクローニングすることにより操作し、これらをp5'enh-SV-Luc（コンストラクトＯ）及びp5'reverse enh-SV.Luc（コンストラクトＱ）と称した。更に、ＩＥ２エンハンサー配列（−５８７〜−１８９）もルシフェラーゼの３’領域に両方の配向でクローニングした。生じたベクターをp3'enh-SV-Luc+（コンストラクトＳ）及びp3'reverseenh-SV.Luc.（コンストラクトＵ）と称した。
【０１３８】
同じ手順をＩＥ２エンハンサーの短いバージョン、すなわち−５８７〜−１８９の代わりに−３８７〜−１８９を有するもので実施し、そしてコンストラクトＰ，Ｒ，Ｔ及びＶと称した。図１１．ａを参照のこと。
【０１３９】
コンストラクトＯ、Ｐ：レシピエントベクターは、ＮｈｅＩ／ＳｍａＩで消化することにより開裂させたｐＳＶ−Ｌｕｃ＋（図１１．ａのコンストラクトＸ）を用いた。完全長のエンハンサーをＮｄｅＩによる消化、続いて、クレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化反応、精製及びＮｈｅＩによる消化により単離した。同じストラテジーを短いエンハンサーコンストラクトの構築に利用した。
【０１４０】
コンストラクトＱ、Ｒ：レシピエントベクターは、ＸｈｏＩ／ＳｍａＩで消化することにより開裂させたｐＳＶ−Ｌｕｃ＋（図１１．ａのコンストラクトＸ）を用いた。完全長のエンハンサーをＮｄｅＩによる消化、続いて、クレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化反応、精製及びＸｈｏＩによる消化により単離した。同じストラテジーを短いエンハンサーコンストラクトの構築に利用した。
【０１４１】
コンストラクトＳ、Ｔ、Ｕ及びＶ：レシピエントベクターは、ＢａｍＨＩによる消化、続くクレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化により開裂させたｐＳＶ−Ｌｕｃ＋（図１１．ａのコンストラクトＸ）を用いる。完全長のエンハンサーをＮｄｅＩ／ＮｈｅＩによる消化、続いて、クレノーポリメラーゼを用いた平滑末端化反応により単離した。クローニングにより両方の配向が可能となり、これらを制限解析で確認した。両方の配向は解析のために維持された。同じストラテジーを短いエンハンサーコンストラクトの構築に利用した。
【０１４２】
コンストラクトｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（コンストラクトＹ）は発現しないコントロールとしての役割を果たした。ｐＧＬ３−Ｃｔｒｌ（コンストラクトＷ）はＳＶ４０プロモーター／エンハンサーベクターとしての役割を果たした。ｐＳＶ−ＬｕｃはＳＶ４０プロモーターを単独で有するコントロールとした（コンストラクトＸ）。
【０１４３】
トランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は前述の実施例のように実施した。
【０１４４】
結果
図１１．ａのコンストラクトＯ〜Ｙで得られた結果を図１１．ｂに表す。エンハンサー無しのＳＶ４０プロモーターコンストラクトを追加されたエンハンサー活性のための基線として採用し、そしてコンストラクトＸで測定された活性を１と設定した。長い又は短いＩＥ２エンハンサーを有する全てのコンストラクトが、レポーター遺伝子の発現をもたらした。長いバージョンは、ＳＶ４０プロモーターからのレポーター遺伝子の高発現を一貫してもたらし、これはＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０エンハンサーの組み合わせ（コンストラクトＯ）で得られた発現レベルよりもはるかに高かった。従って、この実験は、位置及び配向と無関係に異種プロモーターを活性化させる正規のエンハンサーとして、−５８７〜−１８９の配列及び−３８７〜−１８９の配列を明確に定義する。
【０１４５】
実施例６：長いＩＥ２エンハンサーのバージョン（−５３７〜−１８９）とｈＣＭＶエンハンサーとの比較
リポフェクタミンによるトランスフェクション、その後のルシフェラーゼ測定のための実験プロトコールは実施例１に記載されている。
【０１４６】
結果
この実験において、ＳＶ４０プロモーターの５’側に両方の配向の新規ＩＥ２エンハンサーの長いバージョンを有するコンストラクトＯ及びＱを既知の強力なエンハンサーであるｈＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）エンハンサーとの比較に使用した。このために、ｍＣＭＶ ＩＥ２配列はコンストラクトＯにおいてｈＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２）で置換され、その結果コンストラクトＯ−２が生じた。同じことがコンストラクトＱで行われ、その結果コンストラクトＱ−２が生じた。
【０１４７】
クローニングに使用した、ＭｌｕＩ部位（ＭｌｕＩ＝ａｃｇｃｇｔ）を隣接しているｈＣＭＶエンハンサー配列は以下の通りである：
【化１】
【０１４８】
ＳＶ−ＬＵｃ＋は、ＭｌｕＩで消化し、そしてウシ小腸アルカリホスファターゼで処理してセルフライゲーションを防いだ。ｈＣＭＶプロモーター配列をＭｌｕＩ部位でクローニングした。両方の配向のクローンを同等のＩＥ２コンストラクトとの比較のために維持した。
【０１４９】
ルシフェラーゼ発現の結果を図１２に示す。新規ＩＥ２エンハンサー（長いバージョン）で得られたルシフェラーゼ発現レベルは、古典的なｈＣＭＶエンハンサーで得られるルシフェラーゼ発現レベルの少なくとも２倍の高さであった。
【０１５０】
実施例７：両方向性コンストラクトにおけるＩＥ２エンハンサーの能力
図１３に示すようなコンストラクト♯２６及び♯１４０と称する２つの追加のコンストラクトを設計して、両方向的構造の新規エンハンサーを試験した。
【０１５１】
♯２６：このベクターの土台にｍＣＭＶ−Ｌｕｃ＋（コンストラクトＣ、図１３）を使用した。これをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。ＩＬ−１８ＢＰカセットをｐｈＣＭＶ−ＩＬ１８ＢＰ２から取り出した。このベクターをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断することで、イントロンＡ、続いてＩＬ−１８ＢＰオープンリーディングフレーム及びＳＶ４０ポリＡ領域を含むフラグメントを単離した。
【０１５２】
♯１４０：このベクターの土台に図１０．ａのコンストラクトＬを使用した。これをＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで消化してＩＥ２エンハンサーの５’側でベクターを開いた。ＩＥ１プロモーターからＩＬ１８ＢＰを発現するベクターをｐＢＳ．Ｉ ＩＬ１８ＢＰ（ＩＥ１）．Ｉと称し、インサートドナーとして使用した。このベクターをＸｈｏＩ／ＳｐｅＩで消化することにより、ＸｈｏＩからのＩＥ１プロモーター（図１を参照のこと）、続いてイントロンＡ−ＩＬ１８Ｂｐ−ＳＶ４０ポリＡカセットを含むフラグメントを単離した。生じたコンストラクトは、基のｍＣＭＶプロモーター配列の−５８９からＸｈｏＩまでの配列を欠いていた。
【０１５３】
安定トランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は、実施例２に記載の通り実施し、そしてＩＬ１８ＢＰのＥＬＩＳＡは実施例３に記載の通り実施した。
【０１５４】
しかしながら、コンストラクト♯１４０は、ＩＥ１プロモーターとＩＥ２プロモーターが逆の配向にある点でコンストラクト♯２６とは正確には似ていない。従って、ルシフェラーゼ発現は、コンストラクト♯２６においてはＩＥ１プロモーターで、一方、コンストラクト♯１４０においてはＩＥ２プロモーターで駆動させ、そしてＩＬ１８ＢＰ発現は、コンストラクト♯２６においてはＩＥ２プロモーターで、そしてコンストラクト♯１４０においてはＩＥ１プロモーターで駆動させた。
【０１５５】
両コンストラクトで得られた結果は、両方向性の発現ベクター（コンストラクト♯１４０）の２つのプロモーターに対する新規ＩＥ２エンハンサーの同時作用にとって重要であるので、以下に示す。
【０１５６】
図１４は、ルシフェラーゼとＩＬ−１８ＢＰの発現の観点での、コンストラクト♯２６及び♯１４０で安定トランスフェクションしたプール由来の結果を表す。コンストラクト♯１４０は、マーカー遺伝子（ルシフェラーゼ）と注目の遺伝子（ＩＬ−１８ＢＰ）両方のより高い発現をもたらした。
【０１５７】
ルシフェラーゼとＩＬ−１８Ｂｐの発現の安定性を評価するために、プールを選択的条件下、すなわちピューロマイシン処理のもとで維持するか、あるいは選択圧無しで（ピューロマイシン無しで）３週間維持した。結果を図１５〜１７に示す。レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ及びＩＬ−１８ＢＰの発現レベルは長期間有意に変化しなかった。図１６及び１７を参照のこと。
【０１５８】
従って、コンストラクト♯２６及び♯２４０はともに、選択圧に関係なく長期間類似の発現レベルを示したことが証明された。それ故に、新規ＩＥ２エンハンサーを有するコンストラクトは、２つの遺伝子の安定な且つ同時の発現に適している。
【０１５９】
上記結果がプールで得られたので、クローンは両プールからウェル当たり０．５細胞に限界希釈することで導いた。
【０１６０】
クローンはピューロマイシン選択のもとで培養し、クローンの発現レベルを評価した。続いて、単離したクローンをピューロマイシンの存在下、そして不在下で分離し、最終的にそれらの安定性をモニタリングした。図１８及び１９に示した結果は、クローンが＋／−ピューロマイシン条件で分割される前に得られた。ピューロマイシン除去から２週間後の結果は、両コンストラクトについて有意な差異を示さず、これは安定であることを示している。この研究は更に１０〜１２週続けられる。
【０１６１】
両遺伝子の発現を評価するために、ハイスループットのフォーマットを使用し、すなわち９６ウェルプレートで行った。
【０１６２】
１日目：１／２希釈の細胞、１００μｌのＰｒｏＣｈｏ５培養液（無血清）＋５％ウシ胎児血清を含む１００μｌの新鮮なＰｒｏＣｈｏ５。２．５％ＦＢＳの終濃度で、細胞は接着することができた。メンテナンスプレートの毎週の継代は、１／２０希釈係数で、全てＰｒｏＣｈｏ５培地で実施した。
【０１６３】
２日目：培地を捨て、２００μｌの１ｘＰＢＳ(Invitrogen, 10010-015)で一回洗浄し、そして５％ＦＢＳを含む７５μｌの新鮮なＰｒｏＣｈｏ５を添加し、そして２４時間の発現のパルスでインキュベートした。
【０１６４】
３日目：５０μｌの上清を回収し、そして２００μｌのＥＬＩＳＡバッファー（１ｘＰＢＳ、０．１％ｗ／ｖＢＳＡ、０．２％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）を添加した。１００μｌをＩＬ−１８ＢＰについてＥＬＩＳＡで解析した。
【０１６５】
ウェルを２００μｌの１ｘＰＢＳで洗浄し（廃棄）、そして１００μｌのＧｌｏ溶解バッファー(Promega, E266a)を添加した。ウェルを３０分間室温でインキュベートして細胞の溶解を評価した。ルシフェラーゼ測定は、白の９６ウェルプレートに移した３０μｌの溶解した細胞及び３０μｌの再構成したＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬を用いて実施した。発光をCentro LB 960ルミノメーター(Berthold Technologies)上で５秒の収集時間の間に測定した。
【０１６６】
コンストラクト♯２６による安定トランスフェクションから得られたクローンの解析を図１８に表し、そしてコンストラクト♯１４０による安定トランスフェクションから生じたものと図１９に表す。
【０１６７】
図１８及び１９に表したクローンは、それらのルシフェラーゼ値により、低下する順にランク付けした。ＩＬ１８ＢＰの発現はＯＤ値として示した。ＥＬＩＳＡをハイスループットのフォーマットで実施したので、ＩＬ−１８ＢＰレベルの実際の定量は得られなかった。しかしながら、２５００ｎｇ／ｍｌ及び２５０ｎｇ／ｍｌのコントロール並びにブランクを含めてプレート間の変動をモニターした。
【０１６８】
図２０は、inverted ChemiDoc viewにおけるプレート上でのルシフェラーゼ発現を示す。このviewにＣＣＤカメラ(Biorad)を使用し、その結果化学発光由来のシグナルを獲得することが可能となる（図２０に示す通り）。Quantity One 4.2.3と称されるソフトウェアは、写真の管理、例えばシグナルの反転等を可能にし、これを本願で利用した。
【０１６９】
図１８〜２０に示す結果から明らかなように、コンストラクト♯１４０は多くの非発現クローンをもたらした。しかしながら、驚くべきことに、幾つかのポジティブクローンが両遺伝子を極度に強く発現した。
【０１７０】
従って、コンストラクト♯１４０は、非常に初期のクローニング段階における非常に高いエクスプレッサーについてのスクリーニングを可能にし、その結果注目の両遺伝子を高度に発現する幾つかのクローンを同定するために、多数のクローンについて試験し、そしてフォローアップする必要がなくなる。
【０１７１】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメント、及び／又はｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター。
【請求項２】
ｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを更に含んで成る、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ウイルス起源、細胞起源若しくは人工起源の第一及び第二プロモーター、又はそれらの機能的発現促進フラグメントを含んで成る、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
第一プロモーターがｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントであり、且つ第二プロモーターがｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
配列番号１のＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−３８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−５８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
プロモーター、又はその機能的な発現促進フラグメントが、少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と作用可能に連結している、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
ＤＮＡ配列が注目のタンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ＤＮＡ配列がマーカータンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
ＤＮＡ配列がレポータータンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
第一プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、と、第二プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントとが両方向的に配列されている、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡ３’末端プロセシング配列、ポリアデニル化部位、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ配列）から選択される１又は複数の制御エレメントを更に含んで成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
制御エレメントがＩＲＥＳであり、少なくともポリシストロン性ｍＲＭＡをコードするＤＮＡ配列を更に含んで成る、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
インスレーター、境界エレメント、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、並びに組換え及びカセット交換のためのエレメントから選択される１又は複数のＤＮＡエレメントを更に含んで成る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
第一プロモーターに作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と第二プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とが同一のポリペプチドをコードしている、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
第一プロモーターに作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と第二プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とが異なるポリペプチドをコードしている、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
第一プロモーターに作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が二量体又は多量体タンパク質の第一サブユニットをコードし、且つ第二プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が二量体又は多量体タンパク質の第二サブユニットをコードしている、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
一方のサブユニットが、ヒトＦＳＨ、ヒトＬＨ、ヒトＴＳＨ及びヒトＣＧから選択されるホルモンのアルファ鎖であり、且つ他方のサブユニットがβ鎖である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
一方のサブユニットがイムノグロブリンの重鎖であり、且つ他方のサブユニットが軽鎖である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
注目のタンパク質が、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、成長ホルモン、インターフェロン、ＴＮＦ結合タンパク質Ｉ、ＴＮＦ結合タンパク質ＩＩ、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）、ＩＬ−１８ＢＰ、あるいはそれらの突然変異タンパク質、フラグメント、機能的誘導体、融合タンパク質から選択される、請求項９〜２０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２２】
マーカータンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、ガラクトキナーゼ、ヒト葉酸受容体、又は還元葉酸担体から選択される、請求項１０〜２１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２３】
ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１１〜２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２５】
ＣＨＯ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞を、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのベクターでトランスフェクションする工程を含んで成る方法。
【請求項２７】
トランスフェクションが安定トランスフェクションである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドの産生方法であって、請求項２４又は２５に記載の宿主細胞を、ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養する工程を含んで成る方法。
【請求項２９】
宿主細胞又は細胞培養上清からポリペプチドを単離する工程を更に含んで成る、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３０】
注目の遺伝子の発現のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３１】
大量の注目の遺伝子を発現するクローンの選択のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３２】
２又はそれ以上の注目の遺伝子又はＤＮＡの同時発現のための、請求項３〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３３】
ＤＮＡベースの治療のための薬物の製造のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３４】
細胞ベースの治療のための薬物の製造のための、請求項２４又は２５に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１】
ｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のプロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメント、及び／又はｍＣＭＶ−ＩＥ２遺伝子のエンハンサー、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを含んで成る発現ベクターであって、ｍＣＭＶの完全な遺伝子を全く含まない発現ベクター。
【請求項２】
ｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、若しくはその機能的な発現促進フラグメントを更に含んで成る、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ウイルス起源、細胞起源若しくは人工起源の第一及び第二プロモーター、又はそれらの機能的発現促進フラグメントを含んで成る、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
第一プロモーターがｍＣＭＶ−ＩＥ２プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントであり、且つ第二プロモーターがｍＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
配列番号１のＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−３８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
ｍＣＭＶ ＩＥ２上流領域のヌクレオチド−５８７〜−１８９を含むフラグメントを含んで成り、ここで、このヌクレオチドの番号付けはＩＥ２遺伝子の＋１に対するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
プロモーター、又はその機能的な発現促進フラグメントが、少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と作用可能に連結している、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
ＤＮＡ配列が注目のタンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ＤＮＡ配列がマーカータンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
ＤＮＡ配列がレポータータンパク質をコードしている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
第一プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメント、と、第二プロモーター、又はその機能的発現促進フラグメントとが両方向的に配列されている、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
５’ＵＴＲ、イントロン、３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡ３’末端プロセシング配列、ポリアデニル化部位、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ配列）から選択される１又は複数の制御エレメントを更に含んで成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
制御エレメントがＩＲＥＳであり、少なくともポリシストロン性ｍＲＭＡをコードするＤＮＡ配列を更に含んで成る、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
インスレーター、境界エレメント、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、並びに組換え及びカセット交換のためのエレメントから選択される１又は複数のＤＮＡエレメントを更に含んで成る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
第一プロモーターに作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と第二プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とが同一のポリペプチドをコードしている、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
第一プロモーターに作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と第二プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とが異なるポリペプチドをコードしている、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
第一プロモーターに作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が二量体又は多量体タンパク質の第一サブユニットをコードし、且つ第二プロモーターと作用可能に連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が二量体又は多量体タンパク質の第二サブユニットをコードしている、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
一方のサブユニットが、ヒトＦＳＨ、ヒトＬＨ、ヒトＴＳＨ及びヒトＣＧから選択されるホルモンのアルファ鎖であり、且つ他方のサブユニットがβ鎖である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
一方のサブユニットがイムノグロブリンの重鎖であり、且つ他方のサブユニットが軽鎖である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
注目のタンパク質が、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、成長ホルモン、インターフェロン、ＴＮＦ結合タンパク質Ｉ、ＴＮＦ結合タンパク質ＩＩ、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）、ＩＬ−１８ＢＰ、あるいはそれらの突然変異タンパク質、フラグメント、機能的誘導体、融合タンパク質から選択される、請求項９〜２０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２２】
マーカータンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、ガラクトキナーゼ、ヒト葉酸受容体、又は還元葉酸担体から選択される、請求項１０〜２１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２３】
ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１１〜２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２５】
ＣＨＯ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞を、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのベクターでトランスフェクションする工程を含んで成る方法。
【請求項２７】
トランスフェクションが安定トランスフェクションである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドの産生方法であって、請求項２４又は２５に記載の宿主細胞を、ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養する工程を含んで成る方法。
【請求項２９】
宿主細胞又は細胞培養上清からポリペプチドを単離する工程を更に含んで成る、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３０】
注目の遺伝子の発現のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３１】
大量の注目の遺伝子を発現するクローンの選択のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３２】
２又はそれ以上の注目の遺伝子又はＤＮＡの同時発現のための、請求項３〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３３】
ＤＮＡベースの治療のための薬物の製造のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３４】
細胞ベースの治療のための薬物の製造のための、請求項２４又は２５に記載の宿主細胞の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０．ａ】
【図１０．ｂ】
【図１１．ａ】
【図１１．ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０．ａ】
【図１０．ｂ】
【図１１．ａ】
【図１１．ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１２−２３５７８７（Ｐ２０１２−２３５７８７Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１５７５６３（Ｐ２０１２−１５７５６３）
【出願日】平成２４年７月１３日（２０１２．７．１３）
【分割の表示】特願２００６−５０５４５６（Ｐ２００６−５０５４５６）の分割
【原出願日】平成１６年３月１０日（２００４．３．１０）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５７５６３（Ｐ２０１２−１５７５６３）
【出願日】平成２４年７月１３日（２０１２．７．１３）
【分割の表示】特願２００６−５０５４５６（Ｐ２００６−５０５４５６）の分割
【原出願日】平成１６年３月１０日（２００４．３．１０）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
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