ｍＲＮＡの安定化方法
ステムループを形成することができ、そして１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大することができるＤＮＡ配列を、コード化ＤＮＡ遺伝子配列の５’末端に導入することによって、微生物における所望の化合物の産生を増大するための方法、このようにして安定化されたｍＲＮＡ、対応するＤＮＡ配列および微生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
パントテネートはビタミンＢ群の一員であり、人間および家畜を含む哺乳類のための栄養的な要件である。細胞内でパントテネートは、補因子の生物学的に活性な形態である補酵素Ａ（ＣｏＡ）およびアシルキャリアタンパク質に転化される。これらの２つの補酵素は、細胞内の１００を超える様々な酵素反応に関与する。
【０００２】
公開されたＰＴＣ特許出願、国際公開第０１／２１７７２号パンフレット、国際公開第０２／０５７４７４号パンフレット、国際公開第０２／０６１１０８号パンフレット、および国際公開第０４／００５５２７号パンフレット（全て、米国のＯｍｎｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．による出願）には、パントテネート産生に関与する生合成遺伝子の発現レベルがより高い枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の菌株を用いてパントテネートを産生するための方法が記載されている。これらの遺伝子には、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｇｌｙＡ、およびｓｅｒＡが含まれる。これらの遺伝子のより高い発現レベルを達成するために、当該技術分野において既知の標準的な遺伝子組換え法を用いて、前記遺伝子の転写を制御するネイティブプロモーターが除去され、内在性バクテリオファージ、ＳＰＯ１に由来するより強力な構成的プロモーターによって置換された。遺伝子の転写レベルの増大は当該技術分野においてよく知られており、過剰発現された遺伝子によりコードされるタンパク質をより高いレベルでもたらす。
【０００３】
また、転写過剰発現によるタンパク質の過剰産生が細胞代謝に対して望ましくない影響をもたらし得ることは当該技術分野においてよく知られている（国際公開第９８／０７８４６号パンフレット）。さらに、タンパク質の過剰産生が、宿主細胞の翻訳機構における有害な影響（ヘンジアン（Ｈｅｎｇｊｉａｎｇ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１４９７−１５０４頁）、および／またはストレス応答により仲介されるタンパク質分解活性の誘発（ラミレス（Ｒａｍｉｒｅｚ）Ｄ．Ｍ．およびＷ．Ｅ．ベントリー（Ｂｅｎｔｌｅｙ）、１９９５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７：５９６−６０８頁）（より低い産生力価の結果であり得る）をもたらし得ることも記載されている。従って、強力な構成的プロモーターの使用に代わるタンパク質過剰産生のための方法を考案することは、パントテネートなどのようなファインケミカルの工業規模での産生のために有利であろう。
【０００４】
転写物の分解は、細胞のタンパク質含量を制御するための手段として微生物によって利用される。一方、微生物は、所与の転写物の安定性を強化するメカニズムを発達させている。これを達成するために、転写物には、ｍＲＮＡ分解酵素がその作用を発揮することを妨害する二次構造を形成することができるヌクレオチド配列が備わっている。ｍＲＮＡの分解および安定性についての十分な知識にもかかわらず、ファインケミカルの産生のための細菌の炭素流動を再指示するという明示された目的のためにこの知識が適用された例はほんのわずかしかない。
【０００５】
スモルク（Ｓｍｏｌｋｅ）ら（２００１年、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３：３１３−３２１頁）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるフィトエン産生を増大するために、２つのプラスミド由来のｃｒｔ遺伝子によりコードされる転写物の定常状態レベルを増大するためのｍＲＮＡ安定性エレメントとして、ステムループ構造の形成能力がある人工的に作成された配列の使用について記載している。この方法が有用であるために、上記のｍＲＮＡ安定性エレメントは、プロモーター転写開始部位からわずか１ヌクレオチドだけ離れて正確に配置されなければならない（キャリア（Ｃａｒｒｉｅｒ）およびキースリング（Ｋｅａｓｌｉｎｇ）１９９９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｂ．１５：５８−６４頁）。あるいは、ネイティブなｍＲＮＡ分子内の部位で切断が所望される場合には、ｍＲＮＡ安定化エレメントは、ＲＮａｓｅ Ｅ−特異的切断が同様の構造（すなわち、５’末端から１ヌクレオチドにおけるＲＮＡ安定性エレメントの配置）の新しいｍＲＮＡ分子をもたらすように、ＲＮａｓｅ Ｅ切断部位と同時に導入されることが必要である。いずれの例も骨の折れる実験研究を必要とし、本方法の有用性が制限される。従って、プロモーターの転写開始部位に関係なく、あるいはＲＮａｓｅ Ｅ切断に関係なく、ｍＲＮＡの安定化の開発は、工業レベルでのファインケミカルおよび／またはタンパク質の製造のために興味深い微生物を設計するためのより優れた代替法を提供し得る。
【０００６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ Ｅに対する遺伝子オルソログは、工業規模での代謝産物および／またはタンパク質の製造のために興味深い微生物において発見されていない（コンドン（Ｃｏｎｄｏｎ）、２００３年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６７：１５７−１７４頁）。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合、この細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ Ｅに対して機能的に相同であり得るが、顕著なヌクレオチドまたはアミノ酸配列の類似性を示さない２つの遺伝子（ｙｋｑＣ［ＲＮＡｓｅＪ１］およびｙｍｆＡ［ＲＮＡｓｅＪ２］）を含有することは、証拠によって示唆される（エベン（Ｅｖｅｎ）ら、２００５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：２１４１−２１５２頁）。従って、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の転写物の分解機構はかなり異なっており、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ＲＮＡ分解活性に関与する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような酵素であるとみなされる１７の酵素のうち６つしか同定されていない。
【０００７】
上記のｍＲＮＡ安定化方法を、まず１つの遺伝子のみを含有するプラスミドに基づくレプリコンに適用した。ウィドナー（Ｗｉｄｎｅｒ）ら（１９９９年、国際公開第９９／４３８３５号パンフレット）は、タンデムプロモーターとポリペプチドをコードする構造遺伝子との間に挿入されたＢ．チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子からの安定化エレメントの付加によって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてポリペプチドを産生するための方法を開示する。しかしながら、２つのプロモーターの存在は、「ｍＲＮＡの飽和レベル」を達成するために必要であった（国際公開第９９／４３８３５号パンフレット）。ヒュー（Ｈｕｅ）ら（１９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３４６５−３４７１頁）は、１６ＳＲＮＡの３’末端との相同性によってｍＲＮＡ配列を安定化する５’ｍＲＮＡ安定剤を開示する。また、ダグエル（Ｄａｇｕｅｒ）ら（２００５年、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２２１−２２６頁）は、リボソームがリボソーム結合部位と結合してＲＮＡの安定性が生じる、プラスミドに基づくｍＲＮＡ安定化方法を開示する。この方法は、産物形成のかなりわずかな増大（すなわち、レバンスクラーゼ産生の１．５倍の増大）しか達成せず、場合によっては、タンパク質産物の形成は実際に減少した。
【０００８】
さらに、ファインケミカル、タンパク質、および他の化合物の生合成は、染色体上の異なる部位に位置し、多数のｍＲＮＡ転写物を作成する複雑な多遺伝子集団（すなわち、オペロン）を利用することが多い。その結果、プラスミドからのクローン化多遺伝子集団の発現は不安定な場合があるので、このような前述のｍＲＮＡ安定化方法はタンパク質合成を増大するために適さないであろう（キム（Ｋｉｍ）ら、１９８２年、Ｈａｎ’ｇｕｋ Ｓａｅｎｇｈｗａ Ｈａｋｈｏｅｃｈｉ １５：３０５−３１４頁、グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ）、１９８２年、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ［ドゥブナウ（Ｄｕｂｎａｕ）編］、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、３０７−３２９頁、ピース（Ｐｉｅｃｅ）およびガターリッジ（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ）、１９８５年、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１０９４−１１００頁、ニューウェル（Ｎｅｗｅｌｌ）ら、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１５：２８１−２８２頁、ヘセリヤー（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ）、１９９４年、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：６８３−３８７頁、アルアラフ（Ａｌ−Ａｌｌａｆ）ら、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：１４２−１４６頁）。それにもかかわらず、親出願の国際公開第０２／０５５７１１号パンフレットは、これらのｍＲＮＡ転写物の寿命を延ばすことによって、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のパントテネート産生に関与する遺伝子（すなわち、ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、およびｐａｎＤのうちの少なくとも１つ）の発現を改善する可能性を開示しているが、これが達成され得る方法は開示されていない。
【０００９】
その結果、本発明の目的は、前記構造遺伝子配列の転写を制御するネイティブプロモーターシグナルを強化することなく、すなわち、ステムループを形成することができ、そして１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大することができるＤＮＡ配列をコード化ＤＮＡ遺伝子配列の５’末端に導入することによって、微生物における所望の化合物の産生を増大するための方法を提供することである。この方法は、ループ形成ＤＮＡ配列が、微生物の関連遺伝子の転写の開始部位から７ＤＮＡ不対ヌクレオチド以上下流に導入されることを特徴とする。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、その５’末端に安定化エレメントを含有する安定化ｍＲＮＡ配列を提供することである。安定化エレメントは、微生物の関連遺伝子の転写の開始点より７ＤＮＡ不対ヌクレオチド以上下流に導入されたＤＮＡ配列から転写される。この安定化エレメントの付加は、ｍＲＮＡがもはや酵素分解を利用できない、あるいはあまり利用できず、従って微生物における所望の化合物のより高い産生が得られるという効果をもたらす。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、これらのｍＲＮＡ安定化配列を含有し、微生物による転写の際に安定化されたｍＲＮＡ転写物をもたらす対応するＤＮＡ配列と、このようなＤＮＡ配列を含む形質転換微生物とに関する。
【００１２】
最後に、多数のｍＲＮＡ転写物を作成し、染色体、プラスミドまたは他の自己複製ＤＮＡ分子上に位置する１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の安定性を増大するための方法、あるいは形質転換微生物による所望の化合物の産生を増大するための方法のそれぞれにおけるこのＤＮＡまたは安定化ｍＲＮＡ転写物の使用も本発明の目的である。
【００１３】
「化合物」という用語は、細胞代謝、すなわち、生物活性を有する細胞内で１つ以上の酵素によって促進される反応における１つ以上の化学結合の切断および／または形成に由来する炭素に基づく物質を意味する。このような化合物の例は、タンパク質、酵素、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノ酸、ビタミン（例えば、アスコルビン酸、パントテン酸）、ビタミン様物質（例えば、補酵素Ｑ１０）、カロテノイド、脂質および脂肪酸である。
【００１４】
「微生物」という用語は、細菌、真菌（酵母を含む）および藻類を含むがこれらに限定されない微視的な自己再生する呼吸生物体を意味する。細菌という用語は、グラム陰性微生物およびグラム陽性微生物の両方を含む。グラム陰性細菌の例は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）からのいずれかの細菌である。グラム陽性細菌は、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、および連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃａｃｅａｅ）のいずれかから選択されるが、これらに限定されず、特に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の中で、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびＢ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕ）が本発明との関連において好ましい微生物である。グルコノバクター属、ロドバクター属およびパラコッカス属の中で、Ｇ．オキシダンス（ｏｘｙｄａｎｓ）、Ｒ．スファエロイデス（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）およびＰ．ゼアキサンチニファシエンス（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）がそれぞれ好ましい。酵母の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にＳ．セレビシア（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。好ましい他の真菌の例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）である。
【００１５】
「ネイティブプロモーターシグナルの強化」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼと相互に作用をする連続的なＤＮＡ配列（例えば、「−３５」および「−１０」結合部位であるがこれらに限定されない）内の１つ以上のヌクレオチドの遺伝子変化を指し、無改変ＤＮＡ配列と比較してより多数のメッセンジャーＲＮＡ分子（すなわち、ＲＮＡ転写物）の合成をもたらす。この語句は、より強いものによるプロモーターの置換も含む。ネイティブプロモーターシグナルを強化する方法は当該技術分野においてよく知られており、一般に使用されている。「ネイティブプロモーターシグナルを強化することなく」という語句は、本発明に従って微生物における所望の化合物の産生を増大する方法が、これらの周知の方法とは異なることを示すために使用される。しかしながら、この語句は、本発明の新しい方法と、周知の方法とを組み合わせた方法が本発明によって包含されないことは意味しない。
【００１６】
「プロモーターシグナル」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼと特異的に相互に作用する連続的なＤＮＡヌクレオチド配列（例えば、「−３５」および「−１０」結合部位であるが、これらに限定されない）を意味し、メッセンジャーＲＮＡの合成（すなわち、ＲＮＡ転写物の合成）の開始を可能にする。
【００１７】
「ネイティブプロモーターシグナル」という用語は、微生物において見られる天然に存在するプロモーターシグナルを意味する。
【００１８】
「ＤＮＡ配列の導入」という用語は、ＤＮＡ形質転換、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）または形質導入による微生物の染色体へのＤＮＡ配列の付加または挿入を示す。前記付加または挿入は、染色体ＤＮＡヌクレオチドの除去または欠失ももたらす、またはもたらさないＤＮＡ組換えによって生じる。特に部位特異的な導入によって微生物へのＤＮＡ配列の導入が達成される方法は、当該技術分野においてよく知られており、テキストブックおよび科学文献に記載されている。これらは、当業者によって実施される標準的な手順である。１つ以上のステムループを形成することができるＤＮＡ配列は、微生物の関連遺伝子の転写の開始部位より７不対ＤＮＡヌクレオチド以上（すなわち、少なくとも７、例えば８、９、１０または１１）下流に導入される。ヌクレオチド変化の数および種類は、ＲＮａｓｅ Ｅ特異的なヌクレアーゼ切断部位を表す配列が形成されないという事実によって制限される。
【００１９】
「ｍＲＮＡの安定性の増大」という用語は、ｍＲＮＡ配列の半減期の延長またはその分解の遮断／遅延を意味する。
【００２０】
導入すべきＤＮＡ配列（すなわち、ｍＲＮＡ安定化エレメント）は二本鎖ステムループを形成することができるどんな配列でもよく、すなわち、天然に存在する配列、または天然に存在する配列に由来する配列、もしくは当該技術分野においてよく知られた方法を用いて完全または部分的に合成された配列である。配列は任意の長さでよいが、好ましくは、最低１５ヌクレオチド、より好ましくは２３〜１００ヌクレオチドからなる。ステムは、少なくとも６塩基対、好ましくは少なくとも１０塩基対（ミスマッチヌクレオチドまたはバルジループが存在する可能性がある）からなるべきであり、ループは３〜３０ヌクレオチドからなり得る。ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）（２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３４０６−３４１５頁）によって開発されたアルゴリズムに従って計算されるステムループの熱力学的な安定性（ΔＧ）は、−２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下でなければならず、好ましくはそれよりも低い、すなわち−３、−４、−５または−６であり、好ましくは−７よりも低く、例えば−８、−９、−１０、−１１または−１２ｋｃａｌ／ｍｏｌである。本発明の好ましい実施形態では、導入すべきＤＮＡ配列は、ゲノム配列または微生物のゲノムに由来する配列であり、すなわち同じまたは異なる微生物が所望の化合物を産生するために使用される。
【００２１】
本発明の特定の／好ましい実施形態では、ＤＮＡ配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムに由来する。このような配列の例は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の遺伝子ｃｇｇＲ〜遺伝子ｇａｐＡ、遺伝子ｈｒｃＡ〜遺伝子ｇｒｐＥ、遺伝子ｉｌｖＮ〜遺伝子ｉｌｖＣ、遺伝子ａｐｒＥ〜遺伝子ｙｈｆＯ、遺伝子ｙｂｄＡ〜遺伝子ｇｓｉＢおよび遺伝子ｙｔｘＣ〜遺伝子ｔｈｒＳの配列、特に配列番号１〜６で表される配列において生じる連続的な配列である。「遺伝子・・・〜遺伝子・・・の配列において生じる配列」という用語は、これらの２つの遺伝子の間の配列を意味し、すなわち完全な配列またはその一部であり、遺伝子自体まで広がる配列が含まれる。
【００２２】
一般に、ｍＲＮＡ安定化エレメントを作成することができる天然に存在する核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％相同であれば、核酸は本発明の範囲内にあると考えられる。このような相同性は、以下の条件下でサザンハイブリダイゼーション分析によって実験的に決定することができる：３７〜４２℃において、５×ＳＳＣ、１０〜５０％のホルムアミド、１×デンハート液、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション。
【００２３】
配列番号１ ｃｇｇＲ〜ｇａｐＡ遺伝子配列を表す。
配列番号２ 遺伝子ｃｇｇＲとｇａｐＡとの間の特定の配列を表す。
配列番号３ ｈｒｃＡ〜ｇｒｐＥ遺伝子配列を表す。
配列番号４ 遺伝子ｈｒｃＡとｇｒｐＥとの間の特定の配列を表す。
配列番号５ ｃｇｇＲ〜ｇａｐＡ安定化エレメントがオペロンｉｌｖＢＮＣにおいてｉｌｖＢ遺伝子の５’リーダー配列内に挿入された染色体ＤＮＡ配列を表す。
配列番号６ ｈｒｃＡ〜ｇｒｐＥ安定化エレメントがｉｌｖＤ遺伝子の５’リーダー配列内に挿入された染色体ＤＮＡ配列を表す。
【００２４】
本発明の方法はパントテン酸の発現に関連して詳細に記載されるが、当業者は、微生物の代謝産物の産生、もしくは基質（例えば、グルコース）または前駆体（たとえば、ピルベート）を化合物に転化する遺伝子コードされた生合成酵素を利用する微生物細胞により合成される化合物および／またはタンパク質の産生を増大するため、あるいは任意のタンパク質の産生を増大するためにこの方法を広く適用できることを認識するであろう。
【００２５】
［実施例］
［一般的な方法論］
［菌株およびプラスミド］
本発明の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（ｔｒｐＣ２）の誘導体である菌株ＣＵ５５０（ｔｒｐＣ２ ｉｌｖＣ ｌｅｕＣ）および１Ａ７４７（ＳＰβｃ、原栄養体）に由来する。菌株は両方とも、米国４３２１０オハイオ州、コロンバスのオハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。定型的なクローニングのために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いた。汎用性のクローニングベクターとしてプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、およびｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。クロラムフェニコール（ｃａｔ）、テトラサイクリン（ｔｅｔ）、エリスロマイシン（ｅｒｍ）、およびスペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）に対する耐性を与える抗生物質耐性遺伝子は、プラスミドｐＣ１９４（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｍ１９４６５、Ｃａｔ＃１Ｅ１７ 米国４３２１０オハイオ州、コロンバスのオハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｐＢＣ１６（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｘ５１３６６、Ｃａｔ＃１Ｅ９ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｐＤＧ６４６およびｐＤＧ１７２６（グロット−フロイリー（Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６７：３３５−３３６頁）から得た。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＳＰＯ１のＰ２６およびＰ１５プロモーター（リー（Ｌｅｅ）ら、１９８０年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８０：５７−６５頁）はそれぞれ、プラスミドｐＵＣ１８ＳＰ０１−２６およびプラスミドｐＸ１２の誘導体であるｐＸＩ２３ｒｏＤＴＤ−ＳＰＯ１−１５から得た（ハムベリン（Ｈｕｅｍｂｅｌｉｎ）ら、１９９９年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１−７頁）。
【００２６】
［培地］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のための標準的な最少培地（ＭＭ）は、１×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、０．０４％のグルタミン酸ナトリウム、および０．５％のグルコースを含有する。標準的な固体完全培地は、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢＡＢ、Ｄｉｆｃｏ）である。標準的な液体完全培地は、Ｖｅａｌ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ｂｒｏｔｈ（ＶＹ）である。これらの培地の組成は以下に記載される。
ＴＢＡＢ培地：３３ｇのＤｉｆｃｏ Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ（カタログ＃０２３２）、１Ｌの水、オートクレーブ処理。
ＶＹ培地：２５ｇのＤｉｆｃｏ Ｖｅａｌ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｂｒｏｔｈ（カタログ＃０３４４）、５ｇのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（カタログ＃０１２７）、１Ｌの水、オートクレーブ処理。
最少培地（ＭＭ）：１００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、１０ｍｌの５０％グルコース、１ｍｌの４０％グルタミン酸ナトリウム、ｑｓｐ１Ｌの水。
１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩：１４０ｇのＫ２ＨＰＯ４、２０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、水によりｑｓｐ１Ｌ。
ＶＦＢ ＭＭＧＴ培地：１００ｍｌの１０×ＶＦＢ ＭＭ、１００ｍｌの０．５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、４４ｍｌの５０％グルコース、２ｍｌの微量元素溶液、２ｍｌのＦｅ溶液、２ｍｌのＣａＣｌ２溶液、２ｍｌのＭｇ／Ｚｎ溶液、７４８ｍｌの無菌蒸留水。
１０×ＶＦＢ最少培地（１０×ＶＦＢ ＭＭ）：２．５ｇのＮａ−グルタミン酸、１５．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、１５．７ｇのＫ２ＨＰＯ４、２７．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、４０ｇのＮＨ４Ｃｌ、１ｇのクエン酸、６８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｑｓｐ１Ｌの水。
微量元素溶液：１．４ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０７５ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ２００ｍｌの水。
Ｆｅ溶液：０．２１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ１０ｍｌの水。
ＣａＣｌ２溶液：１５．６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ５００ｍｌの水。
Ｍｇ／Ｚｎ溶液：１００ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ２００ｍｌの水。
ＳＭＧ培地：６２．７８ｇのＭＯＰＳ、２０ｇのＣａｒｇｉｌｌ大豆粉（ｓｏｙ ｆｏｕｒ）（２００／２０）、１ｍｌのＰＳＴＥ−１０００Ｘ溶液、５ｇのＮａ−グルタミン酸および８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、７３５ｍｌまでの水（ｐＨ７．２）、オートクレーブ処理（１２１℃で３０分）。オートクレーブ処理の後、１００ｍｌの１ＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１２０ｍｌの５０％グルコース、１０ｍｌの１ＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．４ｍｌの１ＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび３５ｍｌの無菌蒸留水を添加した。
ＰＳＴＥ−１０００Ｘ溶液：０．２ｇのＭｎＣ１・４Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ１００ｍｌの水。
抗生物質：アンピシリン（Ａｍｐ）またはカナマイシン（Ｋｍ）をそれぞれ１００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で用いて、ＬＢ複合培地で成長させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞においてプラスミドを形質転換および増殖させた。抗生物質遺伝子含有ＤＮＡフラグメントを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換するために、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔｃ）および５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）を培地に添加した。エリスロマイシン（Ｅｒｍ）遺伝子選択のためには、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシン／２５μｇ／ｍｌのリンコマイシンの混合物を使用した。
【００２７】
［振とうフラスコにおけるパントテネートアッセイ：］
振とうフラスコ培養条件：ＶＹ豊富な培地中で一晩成長させた細胞培養物を用いて、ＶＦＢ ＭＭＧＴ培地（１：１００希釈）に播種した。細胞が約０．６〜０．８のＯＤ６００に到達するまで成長を監視し、その時点で同じ培地中にもう一度希釈し、ＯＤ６００を０．０３にした。さらに１８時間成長を続行させ、その後サンプルを採取し、細胞を除去し、ＨＰＬＣにより上澄みを分析した。あるいは、一晩成長させた細胞培養物を用いて、ＳＭＧ培地に播種し、２４時間成長させた後、ＨＰＬＣにより上澄みを分析することもできる。
【００２８】
ＨＰＬＣアッセイ：フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ＬＵＮＡ Ｃ８カラムにおいて、サーモスタットで維持されたオートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステムを用いてサンプルのクロマトグラフィを実施した。カラムの寸法は、１５０×４．６ｍｍ、粒径５ミクロンである。カラム温度は２０℃で一定に保持した。移動相は、０．１％の酢酸（Ａ）およびメタノール（Ｂ）の混合物である。１５分間に１％のＢから４５％のＢまで至る勾配溶離が適用される。流速は１ｍｌ／分である。２２０ｎｍにおけるＵＶ吸収を用いてパントテネートを監視し、約９．６分で溶出した。本方法の較正範囲は、１〜１００ｍｇ／ｌのパントテネートである。
【００２９】
［分子および遺伝子技法］
標準的な遺伝子および分子生物学的技法は当該技術分野において一般に知られており、既に記載されている。ＤＮＡ形質転換、ＰＢＳ１普遍形質導入、および他の標準的な枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子技法も当該技術分野において一般に知られており、既に記載されている（ハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）およびカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）（編）、１９９２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ニューヨーク、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）。
【００３０】
［ノーザンブロット分析］
対数期のＶＦＢ ＭＭＧＴ培地において成長させた細胞（ＯＤ６００＝約０．６）を４℃で収集し、上澄みをデカントした後液体窒素中で直ちに凍結させた。全ＲＮＡを以下のように抽出した。氷冷したＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中にペレットを再懸濁させた。ビードビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）（ＢｉｏＳｐｅｃ）内で２分間振とうさせることによって、マカロイド（ｍａｃａｌｏｉｄ）、フェノール／クロロホルム、ＳＤＳおよび酸洗浄したガラスビーズを含有する混合物中に細胞を溶解した。遠心分離の後、上澄みにフェノール／クロロホルム抽出を３回行った。２段階の沈殿および洗浄の後、全ＲＮＡをジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理したＨ２Ｏ中に再懸濁した。デオキシリボヌクレアーゼＩ処理の後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて全ＲＮＡを精製した。このステップで、ｔＲＮＡのようなより小さいＲＮＡ分子を除去した。品質管理のために、一定分量の全ＲＮＡに１．２％アガロースゲル分析を行い、そして／あるいはＲＮＡ６０００ＮａｎｏＣｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）において分析した。等量の全ＲＮＡを１．２％アガロースゲルに負荷し、電気泳動法により転写物を分離した。ＲＮＡをアガロースゲルからナイロン膜へ移した後、これらをＤＩＧ−標識化アンチセンスｍＲＮＡプローブに対して探索した。プローブは、プライマー対の使用によって、適切なＴ７ポリメラーゼ結合部位を含むＰＣＲ断片から作成した。これらのＰＣＲ断片からのプローブの作成、およびブロット化膜試験（ｂｌｏｔｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）は、製造者の使用説明書に従ってＤＩＧノーザン・スターター・キット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することにより開発した。
【００３１】
［実施例Ｉ］
［タンパク質合成の増大をもたらす枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｉｌｖＤのネイティブプロモーターの下流でのｍＲＮＡ安定化エレメントの導入］
安定化転写物から翻訳すべき遺伝子を発現する無改変プロモーターによって仲介されるタンパク質の過剰産生の可能性を分析するために、ネイティブｉｌｖＤプロモーターとｉｌｖＤ遺伝子との間の５’非翻訳リーダー領域としてｍＲＮＡ安定化エレメントを挿入した。ＰＣＲを用いて、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子ｙｐｇＲとｉｌｖＤとの間に存在する遺伝子間領域を含むＤＮＡ断片を作成した。ｉｌｖＤ翻訳開始コドンより２１ｂｐ上流にＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ連続制限部位を含むように、５１９ｂｐのこの断片を操作した。プライマーＰｉｌｖＤ＋７およびＰｉｌｖＤ−２（表１）を用いて、ｉｌｖＤ翻訳開始コドンから２５０ｂｐで始まるｙｐｇＲ−ｉｌｖＤ遺伝子間領域全体に及ぶ枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡからの断片を増幅した。ｐＣＲＸＬＴＯＰＯ（インビトロジェン）においてＤＮＡ断片をクローニングし、配列解析によってその同一性を確認し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩカセットとしてベクター骨格から単離した。同様に消化されたプラスミドｐＤＧ１７２８（グロウト−フロイリー（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら、１９９６年、Ｇｅｎｅ １８０：５７−６１頁）と連結した後、得られたｐＰＡ４７５プラスミドを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７において形質転換して菌株ＰＡ４９４をもたらし、これは、ｉｌｖＤの推定上のＲＢＳより上流にＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、ａｍｙＥ遺伝子内に組み込まれたｌａｃＺ遺伝子に転写的に融合されたｉｌｖＤプロモーター領域の単一のコピーを含有した。第２のプロモータープローブを作成して、非翻訳リーダー配列としてのｍＲＮＡ安定化エレメントの導入によるタンパク質産生における効果をさらに分析した。従って、プライマー２ＨｒｃＬｏｏｐ＋および２ＨｒｃＬｏｏｐ−（表１）を用いるＰＣＲによって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体ＤＮＡからｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ遺伝子間領域を含有するＤＮＡ断片を増幅した。合成した断片１２７ｂｐをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＰＡ４７５ＤＮＡに連結した。次に、得られたプラスミドｐＰＡ４７７を１Ａ７４７において形質転換し、スペクチノマイシン耐性について選択した。これにより、菌株ＰＡ５１７が産生された。菌株ＰＡ４９４およびＰＡ５１７は、ＰＡ４９４が野生型５’非翻訳リーダー領域とのｉｌｖＤ−ｌａｃＺ融合物を含有し、ＰＡ５１７が、ｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ ＲＮＡ安定化エレメントを有する５’非翻訳リーダー領域とのｉｌｖＤ−ｌａｃＺ融合物を含有することを除いて、同質遺伝子的な菌株である。当業者によく知られている標準的なＯＮＰＧアッセイでは、最少培地の振とうフラスコ培養において４８時間の成長の後、菌株ＰＡ５１７は、菌株ＰＡ４９４よりも４倍多いβ−ガラクトシダーゼ活性を産生した。β−ガラクトシダーゼ活性のこの増大は、ｉｌｖＤ構造遺伝子の前のｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ安定化エレメントの存在にのみ起因し得る。
【００３２】
【表１】
【００３３】
［実施例ＩＩ］
［高いパントテネート産生力価は、構成的に発現される外因性プロモーターまたはｍＲＮＡ安定化エレメントを含有するネイティブプロモーターのいずれかを用いてＩｌｖＤタンパク質が過剰産生される場合に達成され得る。］
ネイティブプロモーターの制御下で発現されるｍＲＮＡの安定化により仲介される酵素過剰発現の代謝産物の産生における効果を、構成的に発現された強力なものの代わりにネイティブプロモーターを用いる従来技術において十分に記載されている方法と比較するために、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｉｌｖＤ遺伝子より上流の染色体ＤＮＡ領域を操作することによって２つの菌株を得た。第１の菌株を構築して、強力な構成的なＳＰ０１−２６プロモーターの制御下でＩｌｖＤタンパク質を過剰発現させた。そうするために、パントテネートの生合成遺伝子ｐａｎＢＣＤおよびｐａｎＥのＳＰ０１−１５プロモーター改変を含有する菌株ＣＵ５５０の誘導体である枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＡ４９（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ）（国際公開第２００４／１１３５１０号パンフレット）をさらに改変して、ｉｌｖＤ遺伝子（その発現はＳＰ０１−２６プロモーターによって制御される）を含有させた。これを達成するために、ロング・フランキング・ホモロジー（Ｌｏｎｇ Ｆｌａｎｋｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ＰＣＲ（ＬＦＨ−ＰＣＲ）の使用によって、まず枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１Ａ７４７からｉｌｖＤのプロモーター領域（ｉｌｖＤｐ）を欠失させた。プライマー対Ｐ１／ｉｌｖＤ／ｆｏｒ、Ｐ２／ｉｌｖＤ／ｒ／ｓｐおよびＰ３／ｉｌｖＤ／ｆ／ｓｐ、Ｐ４／ｉｌｖＤ／ｒｅｖ（表２）、ならびにテンプレートとしての枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ作成断片Ｆ１およびＦ２を得た。次に、これらの断片を、テンプレートとしてプラスミドｐＳＰＥＣ１２ｆｌｉｐからのスペクチノマイシン耐性遺伝子カセット（ウェイド（Ｗａｄｅ）ら、１９９９年、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４３６５−４３７３頁）を用いる第２のＰＣＲ反応においてプライマーとして用いた。この最終ＰＣＲのＤＮＡ産物を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７に形質転換し、スペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃｒ）について選択した。多くのＳｐｅｃｒコロニーを回収し、いくつかは、プライマーＰ１ｉｌｖＤ／ｆｏｒおよびＰ４ｉｌｖＤ／ｒｅｖを用いるＰＣＲ分析によってｉｌｖＤプロモーター領域の欠失を有することを確認した。Ｓｐｅｃｒコロニーから単離したＤＮＡを用いて４０００ｂｐのＰＣＲ断片（ｉｌｖＤプロモーター領域の欠失の表示）を検出したが、非形質転換細胞からのＤＮＡ（欠失なし）は３０００ｂｐ断片を生じた。また、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびバリン（Ｖａｌ）アミノ酸に対する予想される栄養要求性についてコロニーを試験し、全てのＳｐｅｃｒ、ＰＣＲ陽性コロニーは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌアミノ酸が欠乏した最少培地において成長できなかった。１つのＳｐｅｃｒ、ＰＣＲ陽性のＩｌｖ−栄養要求体をＰＡ２４（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ）と名づけ、さらなる使用のために保存した。次に、ＰＡ２４のＰＢＳ１ライセートでＰＡ４９を形質導入し、スペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃ）について選択した。Ｓｐｅｃｒコロニーを回収し、１つは、ＰＣＲおよびＩｌｖ栄養要求体によってΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ変異を含有することを確認した。このコロニーは新たにＰＡ６０（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ）と命名した。
【００３４】
次に、菌株ＰＡ２４を用いて、ＳＰ０１−２６プロモーターの発現下でｉｌｖＤ遺伝子を作成した。プライマー対Ｐ１／ｉｌｖＤ／ｆｏｒおよびＰ２／ｉｌｖＤ／ｆ／２６、ならびにＰ３／ｉｌｖＤ／ｒ／２６およびＰ４／ｉｌｖＤ／ｒｅｖ（表２）をそれぞれ用い、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いるＬＦＨ−ＰＣＲによって、２つのＤＮＡ断片Ｆ１およびＦ２を作成した。次に、これらの断片を、テンプレートとしてＳＰ０１−２６含有プラスミドｐＵＣ１８ＳＰ０１−２６を用いる第２のＰＣＲ反応において用いた。この最終ＰＣＲのＤＮＡ産物をＰＡ２４に形質転換し、Ｉｌｖ＋原栄養性について選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーを回収し、Ｐ２６プロモーター断片によるｓｐｅｃ遺伝子の置換によって予想されるようにスペクチノマイシン耐性の耐性を失った（すなわち、Ｓｐｅｃｓ）ことを示した。さらに、プライマーＰ２６−ｓｅｑおよびＰ４ｉｌｖＤ／ｒｅｖを用いるいくつかのＩｌｖ＋Ｓｐｅｃｓコロニーの診断ＰＣＲ分析によりｉｌｖＤ構造遺伝子に隣接するＰ２６プロモーターの存在を確認した。Ｉｌｖ＋Ｓｐｅｃｓコロニーから単離したＤＮＡを用いて２０００ｂｐのＰＣＲ断片（Ｐ２６の存在の表示）を検出したが、非形質転換細胞からのＤＮＡ（ＳＰ０１−２６プロモーターなし）は、同じプライマーでＰＣＲ断片を生じなかった。非形質転換細胞からのＤＮＡは、プライマーｉｌｖＤｗｔ−ｐｒｏｍおよびＰ４ｉｌｖＤ／ｒｅｖで２０００ｂｐのＰＣＲ断片（Ｐｗｔの存在の表示）を生じたが、Ｉｌｖ＋ＳｐｅｃｓコロニーからのＤＮＡは、ＰＣＲ産物を生じなかった。１つのＩｌｖ＋ＳｐｅｃｓＰＣＲ陽性コロニーを新たにＰＡ２７（Ｐ２６ｉｌｖＤ）と命名した。次に、当業者によって既知の方法を用いるＰＢＳ１形質導入によって、Ｐ２６ｉｌｖＤ改変遺伝子を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＡ６０（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ）に移した。Ｉｌｖ＋原栄養性について選択し、Ｓｐｅｃｓコロニーから選別することによって、ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃをＰ２６ｉｌｖＤで置換し、菌株ＰＡ６２（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ Ｐ２６ｉｌｖＤ）をもたらした。ＰＡ６２の染色体Ｐ２６ｉｌｖＤ領域のＤＮＡ配列決定はｉｌｖＤコード領域内の単一の点変異を検出し、これは、残基３２０にＧｌｙからＡｓｐへのアミノ酸変化を生じた。次に、当業者によく知られた方法を用いて、まずこの変異を包含するｉｌｖＤ遺伝子の内部セグメントを除去し、ＰＡ６２の栄養要求性のＩｌｖＤ−変異体（ＰＡ６４と改名）を作成し、次に、野生型染色体ＤＮＡを用いてＰＡ６４をＩｌｖ＋原栄養性に換えることによって、ｉｌｖＤコード配列を野生型に回復させた。これにより、菌株ＰＡ７３（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐｌ５ｐａｎＥ Ｐ２６ｉｌｖＤ）が作成された。
【００３５】
ＰＡ７３と同質遺伝子的であるが、ｉｌｖＤ遺伝子とそのネイティブプロモーター（強力な構成的なプロモーターの代わりに）との間に無改変ｉｌｖＤ遺伝子プロモーター領域およびｍＲＮＡ安定化エレメントを含有する第２の菌株は、以下のように構築した。３つの重複ＤＮＡ断片、２７２ｂｐ断片Ｆ１、１６８３ｂｐ断片Ｆ２および１１０２ｂｐ断片Ｆ３をそれぞれＰＣＲによって作成した。断片Ｆ１は、テンプレートとしてプラスミドｐＰＡ４７７、そしてプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＨｒｃＬｏｏｐ−およびＰｉｌｖＤＵＰ＋（表２）を用いることによって得た。断片Ｆ２は、テンプレートとして枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体ＤＮＡ、そしてプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＰ４／ｉｌｖＤ／ｒｅｖおよびＨｒｃＡＬｏｏｐＰｉｌｖＤ＋（表２）を用いることによって得た。断片Ｆ３は、テンプレートとして枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８、そしてプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＵＰ−およびＰ１／ｉｌｖＤ／ｆｏｒ（表２）を用いることによって得た。断片Ｆ１およびＦ３をアガロースゲルにより精製し、混合し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＨｒｃＬｏｏｐ−およびＰ’１ｉｌｖＤを含むさらに第４のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。これにより、１３５４ｂｐの断片Ｆ１３が作成された。断片２をゲル精製し、断片Ｆ１と混合し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＵＰ＋およびＰ’４ｉｌｖＤを含む第５の反応において混合物をテンプレートとして用いた。これにより、１９３５ｂｐの断片Ｆ１２が作成された。断片Ｆ１２およびＦ１３をｐＣＲＸＬＴＯＰＯ（インビトロジェン）において製造業者の使用説明書に従ってクローニングした。これにより、プラスミドｐＦ１２（ｐＣＲＸＬＴＯＰＯにおいてクローニングされた断片Ｆ１２）およびｐＦ１３（ｐＣＲＸＬＴＯＰＯにおいてクローニングされた断片Ｆ１３）が作成された。テンプレートとしてｐＦ１３、そしてプライマーとしてオリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＨｃｒｌ３＋およびＰｉｌｖＤＨｃｒ１３−を用いてもう一度断片Ｆ１３を増幅した。これにより、断片Ｆ１３ ２が作成された。断片Ｆ１３ ２をＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化されたｐＵＣ１９プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結した。これによって、プラスミドｐＵＣＰｉｌｖＤＨｃｒ１３が得られた。ＫｐｎＩおよびＸｂａＩによる消化の後、断片Ｆ１２を同様に消化されたプラスミドｐＵＣＰｉｌｖＤＨｃｒ１３に連結した。連結混合物をＰＡ６０コンピテント細胞内に直接形質転換し、このように菌株ＰＡ５９０が得られた。ＳＭＧ培地における振とうフラスコ分析によって、ＰＡ４９については１．７ｇ／ｌ、ＰＡ７３については２．５ｇ／ｌ、そしてＰＡ５９０については２．６ｇ／ｌの産生力価が明らかになり、安定化転写物を有する操作菌株は、構成的に発現された強力なプロモーターで操作されたものと同様の力価をもたらすことができると証明された。
【００３６】
【表２】
【００３７】
［実施例ＩＩＩ］
［ｉｌｖオペロンのネイティブプロモーターより下流でのｍＲＮＡ安定化エレメントの導入は、タンパク質の合成を増大する。］
ｍＲＮＡ安定化エレメントがタンパク質の過剰産生を誘発する能力は、もう１つのネイティブプロモーター発現遺伝子がパントテネート合成に関与する環境下で試験した。そうするために、非翻訳リーダー領域を含むｉｌｖＢのプロモーター領域（ｉｌｖＢｐ）を操作して、その後の改変を可能にする２つの制限部位を含有させた。２つの制限部位は、ｉｌｖＢ構造遺伝子翻訳開始コドンより４７４ｂｐ（ＰｓｈＡＩ）および７ｂｐ（ＮｈｅＩ）上流に位置した。プライマー対ＰｉｌｖＵＰ２＋、ＰｉｌｖＵＰ−およびＰｉｌｖ＋、Ｐｉｌｖ−（表３）によって枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体ＤＮＡから２つの重複ＰＣＲ断片を作成した。第３のＰＣＲ反応によりプライマーとして２つのより短い重複断片を用いて単一のＤＮＡ断片を作成するように構築した後、製造業者の使用説明書に従ってｐＣＲＸＬＴＯＰＯ（インビトロジェン）において、得られた断片をＴＡクローニングし、その配列を確認した。次に、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化によってクローン化断片を除去し、当業者に既知の手順に従ってｌａｃＺプロモータープローブベクターｐＤＧ１７２８にサブクローニングし（グロウト−フロイリー、１９９６年、Ｇｅｎｅ １８０：５７−６１頁）、プラスミドｐＰＡ４１５が得られた。このプラスミドを次に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７において形質転換し、スペクチノマイシン耐性について選択し、ＰｉｌｖＢ＊−ｌａｃＺ融合物をａｍｙＥ染色体座位に組み込み、菌株ＰＡ４３１を作成した。
【００３８】
ｍＲＮＡ安定化エレメントを含有するようにプラスミドｐＰＡ４１５をさらに改変した。これを達成するために、このプラスミドをＰｓｈＡＩ／ＮｈｅＩで消化して、ｉｌｖ−ｌｅｕリーダー領域を、ベクター配列の残部、ｉｌｖＢネイティブプロモーター領域および上流領域、ならびにｌａｃＺ構造遺伝子セグメント（すなわち、骨格断片）から解放した。この骨格ＤＮＡ断片を精製し、ｍＲＮＡ安定化ＤＮＡ配列（すなわち、安定化エレメント、メインケン（Ｍｅｉｎｋｅｎ）ら、２００３年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４９：７５１−７６頁）を内部に有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ領域を含有する配列に連結した。プライマー対ＣｇｇＲＬｏｏｐ＋／ＣｇｇＲＬｏｏｐ−（表３）を用いることにより枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８からこの断片をＰＣＲ増幅し、精製し、ＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩにより消化した。連結したＤＮＡを、アンピシリン耐性について選択する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換した。この結果、ｉｌｖＢプロモーターとｌａｃＺレポーター遺伝子との間の非翻訳リーダー領域がｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＲＮＡ安定化エレメント（すなわち、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）によって置換されたプラスミドｐＰＡ４２２がもたらされた。ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺカセットを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｍｙＥ染色体座位に挿入するために、次に、ｐＰＡ４２２プラスミドＤＮＡを１Ａ７４７に形質転換し、スペクチノマイシン耐性について選択した。これによって、菌株ＰＡ４３２がもたらされた。指数関数的に成長させた最少培地を含有する振とうフラスコ培養物と共に開発された標準的なＯＮＰＧアッセイにおいて、菌株ＰＡ４３２は、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ遺伝子間領域がなくても、野生型プロモーター融合物（すなわち、ＰｉｌｖＢ＊−ｌａｃＺ）を含有する同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３１よりも７倍高いβ−ガラクトシダーゼレベルを産生した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
［実施例ＩＶ］
［そのネイティブプロモーター、および５’リーダー領域を有する外因性ｍＲＮＡ安定化エレメントを用いてｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを発現する菌株は、構成的に強力な外因性プロモーターの転写制御下でｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを含有する菌株と同様のタンパク質レベルを達成することができる。］
ネイティブｉｌｖＢプロモーターを強力な構成的プロモーターで置換するために、あるいはネイティブｉｌｖＢプロモーター領域とｉｌｖＢ構造遺伝子との間にｍＲＮＡ安定化エレメントを導入するために、まずネイティブｉｌｖＢプロモーター領域（ＰｉｌｖＢ）の欠失を以下のように構築した。ＰｉｌｖＢの上流および下流の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体セクションによって隣接されたクロラムフェニコール（ｃａｔ）耐性遺伝子カセットを含有するプラスミドを初めに構築した。これを達成するために、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８から、テンプレートとして染色体ＤＮＡおよびプライマーｙｓｎＤ３−およびｙｓｎＤ＋（表４）を用いるＰＣＲによって、ｙｓｎＤ遺伝子（ＰｉｌｖＢプロモーターより上流に位置する）の５’末端を含有するＤＮＡ断片を合成した。第２のＰＣＲで作成されたｃａｔ耐性コード化遺伝子を含む断片は、プライマーｉｌｖＢＣａｔ＋およびｉｌｖＢＣａｔ−（表４）、ならびにプラスミドｐＤＧ１６６１（グロウト−フロイリーら、１９９６年、Ｇｅｎｅ ５７−６１頁）をテンプレートとして用いて調製した。この断片は、ｙｓｎＤ含有ＰＣＲ断片の３’末端と重複する。精製した後、プライマーｉｌｖＢＣａｔ＋およびｙｓｎＤ３−による第３のＰＣＲ反応において両方のＰＣＲ断片をテンプレートとして使用して、ｙｓｄＤ’−ｃａｔ断片が得られた。第４のＰＣＲ反応を用いて、ＰｉｌｖＢより下流のｉｌｖＢ構造遺伝子の５’末端を増幅した。このようにしてプライマーｉｌｖＢ＋およびｉｌｖＢ−（表４）の使用によって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体ＤＮＡからＰＣＲ産物を得た。製造業者の使用説明書に従い、ｐＣＸＬＴＯＰＯキット（インビトロジェン）によってこのｉｌｖＢ’断片をクローニングした。クローン化断片を、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。制限分析によってその完全性を確認した後、ｉｌｖＢ’セグメントより上流に上記のｙｓｎＤ’−ｃａｔ断片を挿入し（ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位を用いて）、最終プラスミドｐＰＡ４０１が得られた。ｃａｔ遺伝子配列がＫｐｎＩ／ＭｌｕＩ消化によってｙｓｎＤ’−ｃａｔ−ｉｌｖＢ’カセットから除去され、他の任意のＤＮＡエレメントによって置換されるような形でこのプラスミドを操作した。次に、プラスミドｐＰＡ４０１を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）原栄養性の野生型菌株（１Ａ７４７）およびパントテネート産生株（ＰＡ７３）に形質転換し、クロラムフェニコール耐性について選択した。Ｃｍｒコロニーは、Ｉｌｖ−栄養要求体（すなわち、バリン、ロイシン、およびイソロイシンアミノ酸を添加しないと最少培地で成長することができない細菌）であることが分かった。得られた菌株をＰＡ４０１（Δｉｌｖｐ：：ｃａｔ）およびＰＡ４４１（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ Ｐ２６ｉｌｖＤ Δｉｌｖｐ：：ｃａｔ）と名づけた。
【００４１】
そのネイティブプロモーター（しかし、改変されたリーダー領域を含む）の制御下でｉｌｖ−ｌｅｕオペロンを含有する菌株を作成するために、プライマーＰｉｌｖＵＰ３＋およびＣｇｇＲＬｏｏｐ２−、ならびにテンプレートとしてのｐＰＡ４２２プラスミドＤＮＡ（上記を参照）によるプラスミドｐＰＡ４２２（上記を参照）からのＰＣＲによって、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡカセットを含有するＤＮＡ断片を増幅した。このようにして作成されたＰＣＲ断片をＫｐｎＩ／ＭｌｕＩで消化し、ｐＰＡ４０１の精製したＫｐｎＩ／ＭｌｕＩｃａｔを含有しない断片（すなわち、構造、５’−ＫｐｎＩ−ｙｓｎＤ−ベクター複製配列−ｉｌｖＢ’−ＭｌｕＩ−３’を有するＤＮＡ断片）に連結した。連結混合物をＰＡ４４１に直接形質転換し、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬｅｕアミノ酸の補給のない最少培地における成長についてコロニーを選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーが得られ、いくつかの遺伝的背景をＰＣＲにより確認した。これらに加えて、Ｉｌｖ＋ＰＣＲ＋コロニーも、ＰｉｌｖＢプロモーター−ｍＲＮＡ安定化エレメント領域によるｃａｔ遺伝子の置換の予想通りクロラムフェニコール（Ｃｍｓ）に対して感受性であった。１つのＩｌｖ＋ＰＣＲ＋Ｃｍｓコロニーを更なる研究のために保存した（ＰＡ４４５）。
【００４２】
ＳＰ０１−２６（Ｐ２６）の制御下でｉｌｖ−ｌｅｕオペロンを含有する菌株を作成するために、プライマーＰ２６＋１およびＰ２６−ならびにテンプレートとしてｐＵＣ１９ＳＰ０１−２６プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ２６プロモーターを含有するＤＮＡ断片をまずＰＣＲ増幅した。得られるＤＮＡ産物をＫｐｎＩ／ＭｌｕＩで消化し、ｐＰＡ４０１の精製ＫｐｎＩ／ＭｌｕＩｃａｔを含まない断片（すなわち、厳密な、５’−ＫｐｎＩ−ｙｓｎＤ−ベクター複製配列−ｉｌｖＢ’−ＭｌｕＩ−３’を有するＤＮＡ断片）に連結した。連結混合物をＰＡ４０１（Δｉｌｖｐ：：ｃａｔ）に直接形質転換し、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬｅｕが補充されない最少培地における成長についてコロニーを選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーが得られ、いくつかの遺伝的背景をＰＣＲにより確認した。これらに加えて、Ｉｌｖ＋ＰＣＲ＋コロニーも、ｃｇｇＲ改変ＰｉｌｖＢプロモーター領域によるｃａｔ遺伝子の置換の予想通りクロラムフェニコール（Ｃｍｓ）に対して感受性であった。１つのＩｌｖ＋ＰＣＲ＋Ｃｍｓコロニーを保存し、ＰＡ４０２と名づけた。ＤＮＡ配列決定により、ｉｌｖＢプロモーター領域（すなわち、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤ）より下流にｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントが挿入された改変ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの存在が確認された。次に以下のような方法でＰＢＳ１普遍形質導入を用いて、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンをパントテネート産生菌株ＰＡ７３に移した：ＰＡ４０２および当業者に既知の方法を用いてＰＢＳ１ファージライセートを調製した。このライセートを用いてＰＡ４４１を感染させ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬｅｕの補給のない最少培地における成長についてコロニーを選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーが得られ、いくつかの遺伝的背景をＰＣＲにより確認した。これらに加えて、Ｉｌｖ＋ＰＣＲ＋コロニーも、ＰｉｌｖＢプロモーター−ｍＲＮＡ安定化エレメント領域によるｃａｔ遺伝子の置換の予想通りクロラムフェニコール（Ｃｍｓ）に対して感受性であった。さらなる研究のために１つのＩｌｖ＋ＰＣＲ＋Ｃｍｓコロニーを保存した（ＰＡ４４４）。
【００４３】
二次元タンパク質ゲルを用いて、強力な構成的ＳＰ０１−２６プロモーターおよび野生型５’非翻訳リーダー領域を含有する菌株ＰＡ４４４と、野生型プロモーターおよびｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＲＮＡ安定化エレメントで改変された５’非翻訳リーダー領域を含有する菌株ＰＡ４４５との間で、当業者に既知の方法を用いてｉｌｖ−およびｌｅｗ−コード化遺伝子のタンパク質合成のレベルを比較した。ＰＡ４４４およびＰＡ４４５の両方において、親ＰＡ７３菌株に関してタンパク質レベルの著しい増大が観察された。
ＰＡ４４４−ＩｌｖＢ５６％、ＩｌｖＣ４７３％、ＬｅｕＡ２７１％、ＬｅｕＢ５７９％、ＬｅｕＣ１５３％、およびＬｅｕＤ３０６％、
ＰＡ４４５、ＩｌｖＢ６０％、ＩｌｖＣ６４８％、ＬｅｕＡ２７４％、ＬｅｕＢ４９９％、ＬｅｕＣ１９５％、およびＬｅｕＤ５２３％。
【００４４】
これらの結果から、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンからの遺伝子によってコードされたタンパク質レベルの増大は、ＰＡ４４４およびＰＡ４４５の両方の菌株について同じ範囲内であると結論付けることができる。
【００４５】
【表４】
【００４６】
［実施例Ｖ］
［内在性ｍＲＮＡ安定化エレメントの導入は、ネイティブプロモーターによりコードされるｍＲＮＡの転写物存在量を増大することができる。］
ＰＡ４４４およびＰＡ４５５は、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの転写を制御する、異なるＤＮＡエレメントの存在を除いて同質遺伝子的な菌株である。ＰＡ４４４は強力な構成的ＳＰ０１−２６プロモーターおよび野生型５’非翻訳リーダー領域を含有し、ＰＡ４４５は、野生型プロモーターおよびｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＲＮＡ安定化エレメントを有する改変５’非翻訳リーダー領域を含有する。ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの転写に対するに対する２つの異なるＤＮＡエレメントの効果を分析するために、標準ノーザンブロットを用いて、両方の菌株のｍＲＮＡ転写プロファイルを分析した。プライマーＩｌｖＢＦｏｒ／ＩｌｖＢＲｅｖ（ＩｌｖＢプローブ）、ＩｌｖＣＦｏｒ／ＩｌｖＣＲｅｖ（ＩｌｖＣプローブ）、およびＬｅｕＤＦｏｒ／ＬｅｕＤＲｅｖ（ＬｅｕＤプローブ）（表５）を用いて得られるＰＣＲ断片からのｉｌｖＢ、ｉｌｖＣ、およびｌｅｕＤ遺伝子に対する標識化アンチセンスｍＲＮＡプローブを作成し、標準条件下、変性アガロースゲル上で分離される全ＲＮＡに対して別々にハイブリッド形成した。結果は、２つの菌株が異なる転写物プロファイルを生じたことを示した。ｉｌｖＢおよびｉｌｖＣプローブの両方とハイブリッド形成するが、ｌｅｕＤプローブとはハイブリッド形成しない高存在量の３．５ｋｂのｍＲＮＡ種をＰＡ４４５全ＲＮＡにおいて検出したが、ＰＡ４４４全ＲＮＡでは検出しなかった。マーダー（Ｍａｅｄｅｒ）らによると、この３．５ｋｂ転写物はｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、およびｉｌｖＣ遺伝子を包含し、野生型細菌からの全ＲＮＡからは検出されない（マーダーら、２００４年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２２４０−２２５２頁）。さらに、このＲＮＡ種はＰＡ４４５において検出されないので、当業者は、このｍＲＮＡ種の存在量の増大が、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＤＮＡエレメントによるｍＲＮＡメッセージの安定性を増大することによって生じたものであり、転写のレベルを増大することによってではないことを認識するであろう。
【００４７】
同様に、８．５ｋｂおよび２．５ｋｂの２つの付加的な転写物の存在量は、菌株ＰＡ４４４よりもＰＡ４４５において大きかった。２．５ｋｂ転写物はｉｌｖＢプローブとハイブリッド形成するがｉｌｖＣおよびｌｅｕＤプローブとはしないので、このｍＲＮＡはｉｌｖＢおよびｉｌｖＮ遺伝子を包含すると結論付けることができる。８．５ｋｂ転写物はｌｅｕＤプローブとハイブリッド形成するので、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロン全体を包含するはずである。上記と同じ論拠を用いて、ＰＡ４４４よりもＰＡ４４５においてより大きいこれらの２つのＲＮＡ種の存在量はこれらのより高い安定性にのみ起因し、そしてこれはｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの５’リーダー配列へのｃｇｇＲ−ｇａｐＡエレメントの導入の結果として生じるに違いない。
【００４８】
【表５】
【００４９】
［実施例ＶＩ］
［ｍＲＮＡ安定化エレメントの使用によるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンでコードされたタンパク質のレベルの増大は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるパントテネートの産生を増大させる。］
菌株ＰＡ７３、ＰＡ４４４、およびＰＡ４４５をＶＦＢ ＭＭＧＴ最少培地を含有する振とうフラスコ培養におけるパントテネート産生について評価し、４８時間成長させた。これらの振とうフラスコ培養から調製した無細胞の上澄みのＨＰＬＣ分析によって、以下のレベルのパントテネートの存在が明らかになった。
ＰＡ７３、５５０ｍｇ／ｌ、
ＰＡ４４４、１５０ｍｇ／ｌ、
ＰＡ４４５、７５０ｍｇ／ｌ。
【００５０】
結果は、構成的な強力プロモーターによるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの転写レベルの増大は親菌株よりも低いパントテネートの産生をもたらすことを示した。逆に、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントによるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤｍＲＮＡ転写物の安定性の増大は、ＰＡ７３親菌株により生じるよりも高いパントテネート力価をもたらした。タンパク質含量はＰＡ４４４およびＰＡ４４５の両方においてほぼ同一であることが示されたので、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化を用いるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤ転写物の安定性の増大は、パントテネート産生の強化において、構成的なＳＰＯ１プロモーターの使用により転写のレベルを増大するよりも効果的であった。この結論と十分に一致して、菌株ＰＡ４４４はＰＡ４４５よりもゆっくり成長し、長期の成長の間に、より高い細胞溶解速度を有した。
【００５１】
［実施例ＶＩＩ］
［ｍＲＮＡの安定化は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＲＮａｓｅ Ｅ活性とは無関係である。］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８は、推定では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ Ｅの機能的相同体をコードする２つの遺伝子（ｙｍｆＡおよびｙｋｑＣ）を含有すると記載されている。菌株ＳＳＢ３４８は、野生型枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の誘導体であり、遺伝子ｙｍｆＡが欠失され、ｙｋｑＣ発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルガラクトピラノシド）誘導性プロモーター（Ｐｓｐａｃ）の制御下に置かれる（エベン（Ｅｖｅｎ）ら、２００５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：２１４１頁）。菌株ＰＡ４３１、ＰＡ４３２、ＰＡ４９４、およびＰＡ５１７から抽出したＤＮＡで菌株ＳＳＢ３４８を形質転換し、それぞれ、菌株ＰＡ６０２（ネイティブｉｌｖＢプロモーターシグナルの制御下で発現されたｉｌｖＢ−ｌａｃＺ融合物）、ＰＡ６０３（ネイティブｉｌｖＢプロモーターシグナルの制御下で発現された５’末端におけるｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントの付加によって、安定化転写物として発現されたｉｌｖＢ−ｌａｃＺ融合物）、ＰＡ６０４（ネイティブｉｌｖＢプロモーターシグナルの制御下で発現された５’末端におけるｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントの付加によって安定化転写物として発現されたｉｌｖＢ−ｌａｃＺ融合物）、およびＰＡ６０５（５’末端におけるｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ安定化エレメントの組み込みによって安定化転写物としてネイティブプロモーターシグナルｉｌｖＤ遺伝子の制御下で転写されたｉｌｖＤ−ｌａｃＺ融合物）をもたらした。３７℃で１８時間の２５ｍｌ振とうフラスコ培養において各菌株を成長させ、標準（ＯＮＰＧアッセイ）法を用いてβ−ガラクトシダーゼレベルを測定した。これらの結果は表６で要約される。各菌株において、ＩＰＴＧ誘発の存在または不在下で細胞が成長される場合に、β−ガラクトシダーゼレベルの差は少しも観察されなかった。これらの結果は、遺伝子ｙｍｆＡおよびｙｋｑＣによりコードされる活性が、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｍＲＮＡ安定化エレメントの機能のために必要とされないことを実証する。
【００５２】
【表６】
【００５３】
［実施例ＶＩＩＩ］
［ｍＲＮＡ安定化により仲介される強化されたタンパク質合成に対する安定化エレメントの二次構造および不対５’配列の長さの効果。］
シャープ（Ｓｈａｒｐ）およびベックホファー（Ｂｅｃｈｈｏｆｅｒ）（２００５年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７：４８４−４９５頁）は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における効率的なｍＲＮＡの安定化のために、（ｉ）５’末端二次構造が、極小値（−２．８および−４．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）未満の自由エネルギー（ΔＧ）を有さなければならないこと、ならびに（ｉｉ）転写物の５’末端から４および７不対ヌクレオチド（ｎｔ）に満たない位置にあることを実証した。４つの不対ヌクレオチド（ｅｒｍＣ安定化エレメントにおいて）および７つの不対ヌクレオチド（ＳＰ８２安定化エレメントにおいて）の存在は、安定化の完全な損失をもたらす。
【００５４】
実施例ＩＩＩにおいて、ｌａｃＺレポーター遺伝子より上流にｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントを含有するＰＡ４３２（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）は、野生型ｉｌｖＢプロモーターｌａｃＺ融合物（ＰｉｌｖＢ−ｌａｃＺ）のみを含有する同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３１よりも７倍多いβ−ガラクトシダーゼを産生することが示された。ＰＡ４３２において、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントの２つの安定化ステムループ構造はｌａｃＺ転写物の＋１転写開始部位より９３ヌクレオチド下流に位置した。ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントの二次構造を予想するため、そして転写物の５’末端における不対配列の長さを決定するために、ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）（２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３４０６−３４１５頁）のｍｆｏｌｄ構造予測プログラムを用いてＰＡ４３２におけるｌａｃＺ ｍＲＮＡのリーダー領域を分析した。２６０ｎｔリーダー領域（＋１転写開始からｌａｃＺの翻訳のためのｓｐｏＶＧＲＢＳ配列までであるが、これは含まない）は、８個の不対ヌクレオチドを転写物の５’末端に含有し、そして非常に弱いステムループ（ΔＧ＝−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が続く。ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントの第１の安定化ステムループ（ＳＬ１）（ルートヴィヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）ら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４１：４０９−４２２頁における予測構造）は、ＰＡ４３２では切断された。切断されたＳＬ１（ＳＬ１Ｔ）は、ΔＧ＝−４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、二本鎖ステムに８ｎｔ、１ｎｔのバルジループ、および３ｎｔのヘアピンループという特徴を有した。
【００５５】
ｍｆｏｌｄプログラムを用いて、ＳＬ１安定化ステムループ（ΔＧ＝−１１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、二本鎖ステムに１１ｎｔ、２ｎｔのバルジループ、および３ｎｔのヘアピンループ）は、ＰＡ４３２においてｌａｃＺ ｍＲＮＡの２７７ｎｔのリーダー領域（配列番号４７）から７５ｎｔ（＋１９ｎｔ〜＋９３ｎｔ）を除去することによって回復され得ることが予測された。ＳＬ１がＳＬ１Ｔよりも高いｍＲＮＡ安定化レベルを与えるかどうかを試験するために、ｌａｃＺより上流に、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１０と呼ばれるリーダー欠失誘導体を構築した。まず、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントを含有する１３０ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＰＡ４２２をテンプレートＤＮＡとして用いてプライマーＧＡＰ＃１０−ＦＯＲおよびＧＡＰ＃１０−ＲＥＶ（表７）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩ酵素で消化し、ｐＰＡ４１５プラスミドのＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩ部位にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の形質転換の後、ＡｍｐｒおよびＳｐｅｃｒ形質転換体を選択した。次に、得られたｐＢｅｓｔ１０を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７に形質転換し、Ｓｐｅｃｒについて選択し、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１０−ｌａｃＺ融合物をａｍｙＥ染色体座位に組み込んで、菌株ＢＥ１０を作成した。振とうフラスコアッセイでは、培養物をＬＢ培地および最少培地の両方において成長させ、ＢＥ１０（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１０−ｌａｃＺ）菌株は、同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３２（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）と同等レベルのβ−ガラクトシダーゼを産生した。データは、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡエレメントにより仲介される効率的なｍＲＮＡ安定化が、（ｉ）５’終端から安定化配列までの距離（１９ｎｔ対９３ｎｔ）、および（ｉｉ）二次構造の強度（ＳＬ１Ｔ対ＳＬ１安定化ステムループ）に無関係であることを示した。
【００５６】
不対５’末端ヌクレオチドの効果を研究するために、ＰＡ４３２におけるｌａｃＺ ｍＲＮＡの２７７ｎｔリーダー領域から３９ｎｔ（＋１８０ｎｔ〜＋２１８ｎｔ）を除去（配列番号４７）し、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４と呼ばれる２３８ｎｔリーダー欠失誘導体の構造を、ｍｆｏｌｄプログラムを用いて予想した。２７７ｎｔのオリジナルリーダー配列は８個の不対ヌクレオチドを含有し、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４欠失リーダーは転写物の５’末端に１６個の不対ヌクレオチドを含有した。ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４欠失リーダーを有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異体を構築するために、まず、ｐＰＡ４２２プラスミドにおいて安定化エレメントとｌａｃＺ遺伝子との間でＢａｍＨＩ消化により３９ｂｐ断片を除去した。消化されたプラスミドの自己連結および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の形質転換の後、ＡｍｐｒおよびＳｐｅｃｒ形質転換体を選択した。次に、得られたｐＢｅｓｔ１４を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７に形質転換してＳｐｅｃｒについて選択し、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４−ｌａｃＺ融合物をａｍｙＥ染色体座位に組み込み、菌株ＢＥ１４を作成した。振とうフラスコアッセイにおいてＬＢ培地および最少培地の両方で細菌培養物を成長させ、ＢＥ１４（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４−ｌａｃＺ）菌株は、同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３２（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）と同等レベルのβ−ガラクトシダーゼを産生した。データは、１６の不対ヌクレオチドがＢＥ１４菌株においてｌａｃＺ転写物の５’末端にある場合に効率的なｍＲＮＡの安定化が達成されることを示した。
【００５７】
【表７】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
パントテネートはビタミンＢ群の一員であり、人間および家畜を含む哺乳類のための栄養的な要件である。細胞内でパントテネートは、補因子の生物学的に活性な形態である補酵素Ａ（ＣｏＡ）およびアシルキャリアタンパク質に転化される。これらの２つの補酵素は、細胞内の１００を超える様々な酵素反応に関与する。
【０００２】
公開されたＰＴＣ特許出願、国際公開第０１／２１７７２号パンフレット、国際公開第０２／０５７４７４号パンフレット、国際公開第０２／０６１１０８号パンフレット、および国際公開第０４／００５５２７号パンフレット（全て、米国のＯｍｎｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．による出願）には、パントテネート産生に関与する生合成遺伝子の発現レベルがより高い枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の菌株を用いてパントテネートを産生するための方法が記載されている。これらの遺伝子には、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、ｐａｎＤ、ｐａｎＥ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｇｌｙＡ、およびｓｅｒＡが含まれる。これらの遺伝子のより高い発現レベルを達成するために、当該技術分野において既知の標準的な遺伝子組換え法を用いて、前記遺伝子の転写を制御するネイティブプロモーターが除去され、内在性バクテリオファージ、ＳＰＯ１に由来するより強力な構成的プロモーターによって置換された。遺伝子の転写レベルの増大は当該技術分野においてよく知られており、過剰発現された遺伝子によりコードされるタンパク質をより高いレベルでもたらす。
【０００３】
また、転写過剰発現によるタンパク質の過剰産生が細胞代謝に対して望ましくない影響をもたらし得ることは当該技術分野においてよく知られている（国際公開第９８／０７８４６号パンフレット）。さらに、タンパク質の過剰産生が、宿主細胞の翻訳機構における有害な影響（ヘンジアン（Ｈｅｎｇｊｉａｎｇ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１４９７−１５０４頁）、および／またはストレス応答により仲介されるタンパク質分解活性の誘発（ラミレス（Ｒａｍｉｒｅｚ）Ｄ．Ｍ．およびＷ．Ｅ．ベントリー（Ｂｅｎｔｌｅｙ）、１９９５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７：５９６−６０８頁）（より低い産生力価の結果であり得る）をもたらし得ることも記載されている。従って、強力な構成的プロモーターの使用に代わるタンパク質過剰産生のための方法を考案することは、パントテネートなどのようなファインケミカルの工業規模での産生のために有利であろう。
【０００４】
転写物の分解は、細胞のタンパク質含量を制御するための手段として微生物によって利用される。一方、微生物は、所与の転写物の安定性を強化するメカニズムを発達させている。これを達成するために、転写物には、ｍＲＮＡ分解酵素がその作用を発揮することを妨害する二次構造を形成することができるヌクレオチド配列が備わっている。ｍＲＮＡの分解および安定性についての十分な知識にもかかわらず、ファインケミカルの産生のための細菌の炭素流動を再指示するという明示された目的のためにこの知識が適用された例はほんのわずかしかない。
【０００５】
スモルク（Ｓｍｏｌｋｅ）ら（２００１年、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３：３１３−３２１頁）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるフィトエン産生を増大するために、２つのプラスミド由来のｃｒｔ遺伝子によりコードされる転写物の定常状態レベルを増大するためのｍＲＮＡ安定性エレメントとして、ステムループ構造の形成能力がある人工的に作成された配列の使用について記載している。この方法が有用であるために、上記のｍＲＮＡ安定性エレメントは、プロモーター転写開始部位からわずか１ヌクレオチドだけ離れて正確に配置されなければならない（キャリア（Ｃａｒｒｉｅｒ）およびキースリング（Ｋｅａｓｌｉｎｇ）１９９９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｂ．１５：５８−６４頁）。あるいは、ネイティブなｍＲＮＡ分子内の部位で切断が所望される場合には、ｍＲＮＡ安定化エレメントは、ＲＮａｓｅ Ｅ−特異的切断が同様の構造（すなわち、５’末端から１ヌクレオチドにおけるＲＮＡ安定性エレメントの配置）の新しいｍＲＮＡ分子をもたらすように、ＲＮａｓｅ Ｅ切断部位と同時に導入されることが必要である。いずれの例も骨の折れる実験研究を必要とし、本方法の有用性が制限される。従って、プロモーターの転写開始部位に関係なく、あるいはＲＮａｓｅ Ｅ切断に関係なく、ｍＲＮＡの安定化の開発は、工業レベルでのファインケミカルおよび／またはタンパク質の製造のために興味深い微生物を設計するためのより優れた代替法を提供し得る。
【０００６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ Ｅに対する遺伝子オルソログは、工業規模での代謝産物および／またはタンパク質の製造のために興味深い微生物において発見されていない（コンドン（Ｃｏｎｄｏｎ）、２００３年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６７：１５７−１７４頁）。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合、この細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ Ｅに対して機能的に相同であり得るが、顕著なヌクレオチドまたはアミノ酸配列の類似性を示さない２つの遺伝子（ｙｋｑＣ［ＲＮＡｓｅＪ１］およびｙｍｆＡ［ＲＮＡｓｅＪ２］）を含有することは、証拠によって示唆される（エベン（Ｅｖｅｎ）ら、２００５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：２１４１−２１５２頁）。従って、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の転写物の分解機構はかなり異なっており、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ＲＮＡ分解活性に関与する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような酵素であるとみなされる１７の酵素のうち６つしか同定されていない。
【０００７】
上記のｍＲＮＡ安定化方法を、まず１つの遺伝子のみを含有するプラスミドに基づくレプリコンに適用した。ウィドナー（Ｗｉｄｎｅｒ）ら（１９９９年、国際公開第９９／４３８３５号パンフレット）は、タンデムプロモーターとポリペプチドをコードする構造遺伝子との間に挿入されたＢ．チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子からの安定化エレメントの付加によって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてポリペプチドを産生するための方法を開示する。しかしながら、２つのプロモーターの存在は、「ｍＲＮＡの飽和レベル」を達成するために必要であった（国際公開第９９／４３８３５号パンフレット）。ヒュー（Ｈｕｅ）ら（１９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３４６５−３４７１頁）は、１６ＳＲＮＡの３’末端との相同性によってｍＲＮＡ配列を安定化する５’ｍＲＮＡ安定剤を開示する。また、ダグエル（Ｄａｇｕｅｒ）ら（２００５年、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２２１−２２６頁）は、リボソームがリボソーム結合部位と結合してＲＮＡの安定性が生じる、プラスミドに基づくｍＲＮＡ安定化方法を開示する。この方法は、産物形成のかなりわずかな増大（すなわち、レバンスクラーゼ産生の１．５倍の増大）しか達成せず、場合によっては、タンパク質産物の形成は実際に減少した。
【０００８】
さらに、ファインケミカル、タンパク質、および他の化合物の生合成は、染色体上の異なる部位に位置し、多数のｍＲＮＡ転写物を作成する複雑な多遺伝子集団（すなわち、オペロン）を利用することが多い。その結果、プラスミドからのクローン化多遺伝子集団の発現は不安定な場合があるので、このような前述のｍＲＮＡ安定化方法はタンパク質合成を増大するために適さないであろう（キム（Ｋｉｍ）ら、１９８２年、Ｈａｎ’ｇｕｋ Ｓａｅｎｇｈｗａ Ｈａｋｈｏｅｃｈｉ １５：３０５−３１４頁、グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ）、１９８２年、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ［ドゥブナウ（Ｄｕｂｎａｕ）編］、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、３０７−３２９頁、ピース（Ｐｉｅｃｅ）およびガターリッジ（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ）、１９８５年、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１０９４−１１００頁、ニューウェル（Ｎｅｗｅｌｌ）ら、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１５：２８１−２８２頁、ヘセリヤー（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ）、１９９４年、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：６８３−３８７頁、アルアラフ（Ａｌ−Ａｌｌａｆ）ら、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：１４２−１４６頁）。それにもかかわらず、親出願の国際公開第０２／０５５７１１号パンフレットは、これらのｍＲＮＡ転写物の寿命を延ばすことによって、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のパントテネート産生に関与する遺伝子（すなわち、ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｐａｎＢ、ｐａｎＣ、およびｐａｎＤのうちの少なくとも１つ）の発現を改善する可能性を開示しているが、これが達成され得る方法は開示されていない。
【０００９】
その結果、本発明の目的は、前記構造遺伝子配列の転写を制御するネイティブプロモーターシグナルを強化することなく、すなわち、ステムループを形成することができ、そして１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大することができるＤＮＡ配列をコード化ＤＮＡ遺伝子配列の５’末端に導入することによって、微生物における所望の化合物の産生を増大するための方法を提供することである。この方法は、ループ形成ＤＮＡ配列が、微生物の関連遺伝子の転写の開始部位から７ＤＮＡ不対ヌクレオチド以上下流に導入されることを特徴とする。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、その５’末端に安定化エレメントを含有する安定化ｍＲＮＡ配列を提供することである。安定化エレメントは、微生物の関連遺伝子の転写の開始点より７ＤＮＡ不対ヌクレオチド以上下流に導入されたＤＮＡ配列から転写される。この安定化エレメントの付加は、ｍＲＮＡがもはや酵素分解を利用できない、あるいはあまり利用できず、従って微生物における所望の化合物のより高い産生が得られるという効果をもたらす。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、これらのｍＲＮＡ安定化配列を含有し、微生物による転写の際に安定化されたｍＲＮＡ転写物をもたらす対応するＤＮＡ配列と、このようなＤＮＡ配列を含む形質転換微生物とに関する。
【００１２】
最後に、多数のｍＲＮＡ転写物を作成し、染色体、プラスミドまたは他の自己複製ＤＮＡ分子上に位置する１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の安定性を増大するための方法、あるいは形質転換微生物による所望の化合物の産生を増大するための方法のそれぞれにおけるこのＤＮＡまたは安定化ｍＲＮＡ転写物の使用も本発明の目的である。
【００１３】
「化合物」という用語は、細胞代謝、すなわち、生物活性を有する細胞内で１つ以上の酵素によって促進される反応における１つ以上の化学結合の切断および／または形成に由来する炭素に基づく物質を意味する。このような化合物の例は、タンパク質、酵素、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノ酸、ビタミン（例えば、アスコルビン酸、パントテン酸）、ビタミン様物質（例えば、補酵素Ｑ１０）、カロテノイド、脂質および脂肪酸である。
【００１４】
「微生物」という用語は、細菌、真菌（酵母を含む）および藻類を含むがこれらに限定されない微視的な自己再生する呼吸生物体を意味する。細菌という用語は、グラム陰性微生物およびグラム陽性微生物の両方を含む。グラム陰性細菌の例は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）からのいずれかの細菌である。グラム陽性細菌は、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、および連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃａｃｅａｅ）のいずれかから選択されるが、これらに限定されず、特に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の中で、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびＢ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕ）が本発明との関連において好ましい微生物である。グルコノバクター属、ロドバクター属およびパラコッカス属の中で、Ｇ．オキシダンス（ｏｘｙｄａｎｓ）、Ｒ．スファエロイデス（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）およびＰ．ゼアキサンチニファシエンス（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）がそれぞれ好ましい。酵母の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にＳ．セレビシア（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。好ましい他の真菌の例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）である。
【００１５】
「ネイティブプロモーターシグナルの強化」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼと相互に作用をする連続的なＤＮＡ配列（例えば、「−３５」および「−１０」結合部位であるがこれらに限定されない）内の１つ以上のヌクレオチドの遺伝子変化を指し、無改変ＤＮＡ配列と比較してより多数のメッセンジャーＲＮＡ分子（すなわち、ＲＮＡ転写物）の合成をもたらす。この語句は、より強いものによるプロモーターの置換も含む。ネイティブプロモーターシグナルを強化する方法は当該技術分野においてよく知られており、一般に使用されている。「ネイティブプロモーターシグナルを強化することなく」という語句は、本発明に従って微生物における所望の化合物の産生を増大する方法が、これらの周知の方法とは異なることを示すために使用される。しかしながら、この語句は、本発明の新しい方法と、周知の方法とを組み合わせた方法が本発明によって包含されないことは意味しない。
【００１６】
「プロモーターシグナル」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼと特異的に相互に作用する連続的なＤＮＡヌクレオチド配列（例えば、「−３５」および「−１０」結合部位であるが、これらに限定されない）を意味し、メッセンジャーＲＮＡの合成（すなわち、ＲＮＡ転写物の合成）の開始を可能にする。
【００１７】
「ネイティブプロモーターシグナル」という用語は、微生物において見られる天然に存在するプロモーターシグナルを意味する。
【００１８】
「ＤＮＡ配列の導入」という用語は、ＤＮＡ形質転換、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）または形質導入による微生物の染色体へのＤＮＡ配列の付加または挿入を示す。前記付加または挿入は、染色体ＤＮＡヌクレオチドの除去または欠失ももたらす、またはもたらさないＤＮＡ組換えによって生じる。特に部位特異的な導入によって微生物へのＤＮＡ配列の導入が達成される方法は、当該技術分野においてよく知られており、テキストブックおよび科学文献に記載されている。これらは、当業者によって実施される標準的な手順である。１つ以上のステムループを形成することができるＤＮＡ配列は、微生物の関連遺伝子の転写の開始部位より７不対ＤＮＡヌクレオチド以上（すなわち、少なくとも７、例えば８、９、１０または１１）下流に導入される。ヌクレオチド変化の数および種類は、ＲＮａｓｅ Ｅ特異的なヌクレアーゼ切断部位を表す配列が形成されないという事実によって制限される。
【００１９】
「ｍＲＮＡの安定性の増大」という用語は、ｍＲＮＡ配列の半減期の延長またはその分解の遮断／遅延を意味する。
【００２０】
導入すべきＤＮＡ配列（すなわち、ｍＲＮＡ安定化エレメント）は二本鎖ステムループを形成することができるどんな配列でもよく、すなわち、天然に存在する配列、または天然に存在する配列に由来する配列、もしくは当該技術分野においてよく知られた方法を用いて完全または部分的に合成された配列である。配列は任意の長さでよいが、好ましくは、最低１５ヌクレオチド、より好ましくは２３〜１００ヌクレオチドからなる。ステムは、少なくとも６塩基対、好ましくは少なくとも１０塩基対（ミスマッチヌクレオチドまたはバルジループが存在する可能性がある）からなるべきであり、ループは３〜３０ヌクレオチドからなり得る。ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）（２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３４０６−３４１５頁）によって開発されたアルゴリズムに従って計算されるステムループの熱力学的な安定性（ΔＧ）は、−２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下でなければならず、好ましくはそれよりも低い、すなわち−３、−４、−５または−６であり、好ましくは−７よりも低く、例えば−８、−９、−１０、−１１または−１２ｋｃａｌ／ｍｏｌである。本発明の好ましい実施形態では、導入すべきＤＮＡ配列は、ゲノム配列または微生物のゲノムに由来する配列であり、すなわち同じまたは異なる微生物が所望の化合物を産生するために使用される。
【００２１】
本発明の特定の／好ましい実施形態では、ＤＮＡ配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムに由来する。このような配列の例は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の遺伝子ｃｇｇＲ〜遺伝子ｇａｐＡ、遺伝子ｈｒｃＡ〜遺伝子ｇｒｐＥ、遺伝子ｉｌｖＮ〜遺伝子ｉｌｖＣ、遺伝子ａｐｒＥ〜遺伝子ｙｈｆＯ、遺伝子ｙｂｄＡ〜遺伝子ｇｓｉＢおよび遺伝子ｙｔｘＣ〜遺伝子ｔｈｒＳの配列、特に配列番号１〜６で表される配列において生じる連続的な配列である。「遺伝子・・・〜遺伝子・・・の配列において生じる配列」という用語は、これらの２つの遺伝子の間の配列を意味し、すなわち完全な配列またはその一部であり、遺伝子自体まで広がる配列が含まれる。
【００２２】
一般に、ｍＲＮＡ安定化エレメントを作成することができる天然に存在する核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％相同であれば、核酸は本発明の範囲内にあると考えられる。このような相同性は、以下の条件下でサザンハイブリダイゼーション分析によって実験的に決定することができる：３７〜４２℃において、５×ＳＳＣ、１０〜５０％のホルムアミド、１×デンハート液、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション。
【００２３】
配列番号１ ｃｇｇＲ〜ｇａｐＡ遺伝子配列を表す。
配列番号２ 遺伝子ｃｇｇＲとｇａｐＡとの間の特定の配列を表す。
配列番号３ ｈｒｃＡ〜ｇｒｐＥ遺伝子配列を表す。
配列番号４ 遺伝子ｈｒｃＡとｇｒｐＥとの間の特定の配列を表す。
配列番号５ ｃｇｇＲ〜ｇａｐＡ安定化エレメントがオペロンｉｌｖＢＮＣにおいてｉｌｖＢ遺伝子の５’リーダー配列内に挿入された染色体ＤＮＡ配列を表す。
配列番号６ ｈｒｃＡ〜ｇｒｐＥ安定化エレメントがｉｌｖＤ遺伝子の５’リーダー配列内に挿入された染色体ＤＮＡ配列を表す。
【００２４】
本発明の方法はパントテン酸の発現に関連して詳細に記載されるが、当業者は、微生物の代謝産物の産生、もしくは基質（例えば、グルコース）または前駆体（たとえば、ピルベート）を化合物に転化する遺伝子コードされた生合成酵素を利用する微生物細胞により合成される化合物および／またはタンパク質の産生を増大するため、あるいは任意のタンパク質の産生を増大するためにこの方法を広く適用できることを認識するであろう。
【００２５】
［実施例］
［一般的な方法論］
［菌株およびプラスミド］
本発明の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（ｔｒｐＣ２）の誘導体である菌株ＣＵ５５０（ｔｒｐＣ２ ｉｌｖＣ ｌｅｕＣ）および１Ａ７４７（ＳＰβｃ、原栄養体）に由来する。菌株は両方とも、米国４３２１０オハイオ州、コロンバスのオハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。定型的なクローニングのために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｔｏｐ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いた。汎用性のクローニングベクターとしてプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、およびｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。クロラムフェニコール（ｃａｔ）、テトラサイクリン（ｔｅｔ）、エリスロマイシン（ｅｒｍ）、およびスペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）に対する耐性を与える抗生物質耐性遺伝子は、プラスミドｐＣ１９４（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｍ１９４６５、Ｃａｔ＃１Ｅ１７ 米国４３２１０オハイオ州、コロンバスのオハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｐＢＣ１６（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｘ５１３６６、Ｃａｔ＃１Ｅ９ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｐＤＧ６４６およびｐＤＧ１７２６（グロット−フロイリー（Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６７：３３５−３３６頁）から得た。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＳＰＯ１のＰ２６およびＰ１５プロモーター（リー（Ｌｅｅ）ら、１９８０年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８０：５７−６５頁）はそれぞれ、プラスミドｐＵＣ１８ＳＰ０１−２６およびプラスミドｐＸ１２の誘導体であるｐＸＩ２３ｒｏＤＴＤ−ＳＰＯ１−１５から得た（ハムベリン（Ｈｕｅｍｂｅｌｉｎ）ら、１９９９年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１−７頁）。
【００２６】
［培地］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のための標準的な最少培地（ＭＭ）は、１×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、０．０４％のグルタミン酸ナトリウム、および０．５％のグルコースを含有する。標準的な固体完全培地は、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢＡＢ、Ｄｉｆｃｏ）である。標準的な液体完全培地は、Ｖｅａｌ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ｂｒｏｔｈ（ＶＹ）である。これらの培地の組成は以下に記載される。
ＴＢＡＢ培地：３３ｇのＤｉｆｃｏ Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ（カタログ＃０２３２）、１Ｌの水、オートクレーブ処理。
ＶＹ培地：２５ｇのＤｉｆｃｏ Ｖｅａｌ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｂｒｏｔｈ（カタログ＃０３４４）、５ｇのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（カタログ＃０１２７）、１Ｌの水、オートクレーブ処理。
最少培地（ＭＭ）：１００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、１０ｍｌの５０％グルコース、１ｍｌの４０％グルタミン酸ナトリウム、ｑｓｐ１Ｌの水。
１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩：１４０ｇのＫ２ＨＰＯ４、２０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、水によりｑｓｐ１Ｌ。
ＶＦＢ ＭＭＧＴ培地：１００ｍｌの１０×ＶＦＢ ＭＭ、１００ｍｌの０．５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、４４ｍｌの５０％グルコース、２ｍｌの微量元素溶液、２ｍｌのＦｅ溶液、２ｍｌのＣａＣｌ２溶液、２ｍｌのＭｇ／Ｚｎ溶液、７４８ｍｌの無菌蒸留水。
１０×ＶＦＢ最少培地（１０×ＶＦＢ ＭＭ）：２．５ｇのＮａ−グルタミン酸、１５．７ｇのＫＨ２ＰＯ４、１５．７ｇのＫ２ＨＰＯ４、２７．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、４０ｇのＮＨ４Ｃｌ、１ｇのクエン酸、６８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｑｓｐ１Ｌの水。
微量元素溶液：１．４ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０７５ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ２００ｍｌの水。
Ｆｅ溶液：０．２１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ１０ｍｌの水。
ＣａＣｌ２溶液：１５．６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ５００ｍｌの水。
Ｍｇ／Ｚｎ溶液：１００ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ２００ｍｌの水。
ＳＭＧ培地：６２．７８ｇのＭＯＰＳ、２０ｇのＣａｒｇｉｌｌ大豆粉（ｓｏｙ ｆｏｕｒ）（２００／２０）、１ｍｌのＰＳＴＥ−１０００Ｘ溶液、５ｇのＮａ−グルタミン酸および８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、７３５ｍｌまでの水（ｐＨ７．２）、オートクレーブ処理（１２１℃で３０分）。オートクレーブ処理の後、１００ｍｌの１ＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１２０ｍｌの５０％グルコース、１０ｍｌの１ＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．４ｍｌの１ＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび３５ｍｌの無菌蒸留水を添加した。
ＰＳＴＥ−１０００Ｘ溶液：０．２ｇのＭｎＣ１・４Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｑｓｐ１００ｍｌの水。
抗生物質：アンピシリン（Ａｍｐ）またはカナマイシン（Ｋｍ）をそれぞれ１００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で用いて、ＬＢ複合培地で成長させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞においてプラスミドを形質転換および増殖させた。抗生物質遺伝子含有ＤＮＡフラグメントを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換するために、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔｃ）および５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）を培地に添加した。エリスロマイシン（Ｅｒｍ）遺伝子選択のためには、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシン／２５μｇ／ｍｌのリンコマイシンの混合物を使用した。
【００２７】
［振とうフラスコにおけるパントテネートアッセイ：］
振とうフラスコ培養条件：ＶＹ豊富な培地中で一晩成長させた細胞培養物を用いて、ＶＦＢ ＭＭＧＴ培地（１：１００希釈）に播種した。細胞が約０．６〜０．８のＯＤ６００に到達するまで成長を監視し、その時点で同じ培地中にもう一度希釈し、ＯＤ６００を０．０３にした。さらに１８時間成長を続行させ、その後サンプルを採取し、細胞を除去し、ＨＰＬＣにより上澄みを分析した。あるいは、一晩成長させた細胞培養物を用いて、ＳＭＧ培地に播種し、２４時間成長させた後、ＨＰＬＣにより上澄みを分析することもできる。
【００２８】
ＨＰＬＣアッセイ：フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ＬＵＮＡ Ｃ８カラムにおいて、サーモスタットで維持されたオートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステムを用いてサンプルのクロマトグラフィを実施した。カラムの寸法は、１５０×４．６ｍｍ、粒径５ミクロンである。カラム温度は２０℃で一定に保持した。移動相は、０．１％の酢酸（Ａ）およびメタノール（Ｂ）の混合物である。１５分間に１％のＢから４５％のＢまで至る勾配溶離が適用される。流速は１ｍｌ／分である。２２０ｎｍにおけるＵＶ吸収を用いてパントテネートを監視し、約９．６分で溶出した。本方法の較正範囲は、１〜１００ｍｇ／ｌのパントテネートである。
【００２９】
［分子および遺伝子技法］
標準的な遺伝子および分子生物学的技法は当該技術分野において一般に知られており、既に記載されている。ＤＮＡ形質転換、ＰＢＳ１普遍形質導入、および他の標準的な枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子技法も当該技術分野において一般に知られており、既に記載されている（ハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）およびカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）（編）、１９９２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ニューヨーク、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）。
【００３０】
［ノーザンブロット分析］
対数期のＶＦＢ ＭＭＧＴ培地において成長させた細胞（ＯＤ６００＝約０．６）を４℃で収集し、上澄みをデカントした後液体窒素中で直ちに凍結させた。全ＲＮＡを以下のように抽出した。氷冷したＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中にペレットを再懸濁させた。ビードビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）（ＢｉｏＳｐｅｃ）内で２分間振とうさせることによって、マカロイド（ｍａｃａｌｏｉｄ）、フェノール／クロロホルム、ＳＤＳおよび酸洗浄したガラスビーズを含有する混合物中に細胞を溶解した。遠心分離の後、上澄みにフェノール／クロロホルム抽出を３回行った。２段階の沈殿および洗浄の後、全ＲＮＡをジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理したＨ２Ｏ中に再懸濁した。デオキシリボヌクレアーゼＩ処理の後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて全ＲＮＡを精製した。このステップで、ｔＲＮＡのようなより小さいＲＮＡ分子を除去した。品質管理のために、一定分量の全ＲＮＡに１．２％アガロースゲル分析を行い、そして／あるいはＲＮＡ６０００ＮａｎｏＣｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）において分析した。等量の全ＲＮＡを１．２％アガロースゲルに負荷し、電気泳動法により転写物を分離した。ＲＮＡをアガロースゲルからナイロン膜へ移した後、これらをＤＩＧ−標識化アンチセンスｍＲＮＡプローブに対して探索した。プローブは、プライマー対の使用によって、適切なＴ７ポリメラーゼ結合部位を含むＰＣＲ断片から作成した。これらのＰＣＲ断片からのプローブの作成、およびブロット化膜試験（ｂｌｏｔｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）は、製造者の使用説明書に従ってＤＩＧノーザン・スターター・キット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することにより開発した。
【００３１】
［実施例Ｉ］
［タンパク質合成の増大をもたらす枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｉｌｖＤのネイティブプロモーターの下流でのｍＲＮＡ安定化エレメントの導入］
安定化転写物から翻訳すべき遺伝子を発現する無改変プロモーターによって仲介されるタンパク質の過剰産生の可能性を分析するために、ネイティブｉｌｖＤプロモーターとｉｌｖＤ遺伝子との間の５’非翻訳リーダー領域としてｍＲＮＡ安定化エレメントを挿入した。ＰＣＲを用いて、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子ｙｐｇＲとｉｌｖＤとの間に存在する遺伝子間領域を含むＤＮＡ断片を作成した。ｉｌｖＤ翻訳開始コドンより２１ｂｐ上流にＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ連続制限部位を含むように、５１９ｂｐのこの断片を操作した。プライマーＰｉｌｖＤ＋７およびＰｉｌｖＤ−２（表１）を用いて、ｉｌｖＤ翻訳開始コドンから２５０ｂｐで始まるｙｐｇＲ−ｉｌｖＤ遺伝子間領域全体に及ぶ枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡからの断片を増幅した。ｐＣＲＸＬＴＯＰＯ（インビトロジェン）においてＤＮＡ断片をクローニングし、配列解析によってその同一性を確認し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩカセットとしてベクター骨格から単離した。同様に消化されたプラスミドｐＤＧ１７２８（グロウト−フロイリー（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら、１９９６年、Ｇｅｎｅ １８０：５７−６１頁）と連結した後、得られたｐＰＡ４７５プラスミドを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７において形質転換して菌株ＰＡ４９４をもたらし、これは、ｉｌｖＤの推定上のＲＢＳより上流にＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、ａｍｙＥ遺伝子内に組み込まれたｌａｃＺ遺伝子に転写的に融合されたｉｌｖＤプロモーター領域の単一のコピーを含有した。第２のプロモータープローブを作成して、非翻訳リーダー配列としてのｍＲＮＡ安定化エレメントの導入によるタンパク質産生における効果をさらに分析した。従って、プライマー２ＨｒｃＬｏｏｐ＋および２ＨｒｃＬｏｏｐ−（表１）を用いるＰＣＲによって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体ＤＮＡからｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ遺伝子間領域を含有するＤＮＡ断片を増幅した。合成した断片１２７ｂｐをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＰＡ４７５ＤＮＡに連結した。次に、得られたプラスミドｐＰＡ４７７を１Ａ７４７において形質転換し、スペクチノマイシン耐性について選択した。これにより、菌株ＰＡ５１７が産生された。菌株ＰＡ４９４およびＰＡ５１７は、ＰＡ４９４が野生型５’非翻訳リーダー領域とのｉｌｖＤ−ｌａｃＺ融合物を含有し、ＰＡ５１７が、ｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ ＲＮＡ安定化エレメントを有する５’非翻訳リーダー領域とのｉｌｖＤ−ｌａｃＺ融合物を含有することを除いて、同質遺伝子的な菌株である。当業者によく知られている標準的なＯＮＰＧアッセイでは、最少培地の振とうフラスコ培養において４８時間の成長の後、菌株ＰＡ５１７は、菌株ＰＡ４９４よりも４倍多いβ−ガラクトシダーゼ活性を産生した。β−ガラクトシダーゼ活性のこの増大は、ｉｌｖＤ構造遺伝子の前のｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ安定化エレメントの存在にのみ起因し得る。
【００３２】
【表１】
【００３３】
［実施例ＩＩ］
［高いパントテネート産生力価は、構成的に発現される外因性プロモーターまたはｍＲＮＡ安定化エレメントを含有するネイティブプロモーターのいずれかを用いてＩｌｖＤタンパク質が過剰産生される場合に達成され得る。］
ネイティブプロモーターの制御下で発現されるｍＲＮＡの安定化により仲介される酵素過剰発現の代謝産物の産生における効果を、構成的に発現された強力なものの代わりにネイティブプロモーターを用いる従来技術において十分に記載されている方法と比較するために、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｉｌｖＤ遺伝子より上流の染色体ＤＮＡ領域を操作することによって２つの菌株を得た。第１の菌株を構築して、強力な構成的なＳＰ０１−２６プロモーターの制御下でＩｌｖＤタンパク質を過剰発現させた。そうするために、パントテネートの生合成遺伝子ｐａｎＢＣＤおよびｐａｎＥのＳＰ０１−１５プロモーター改変を含有する菌株ＣＵ５５０の誘導体である枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＡ４９（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ）（国際公開第２００４／１１３５１０号パンフレット）をさらに改変して、ｉｌｖＤ遺伝子（その発現はＳＰ０１−２６プロモーターによって制御される）を含有させた。これを達成するために、ロング・フランキング・ホモロジー（Ｌｏｎｇ Ｆｌａｎｋｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ＰＣＲ（ＬＦＨ−ＰＣＲ）の使用によって、まず枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１Ａ７４７からｉｌｖＤのプロモーター領域（ｉｌｖＤｐ）を欠失させた。プライマー対Ｐ１／ｉｌｖＤ／ｆｏｒ、Ｐ２／ｉｌｖＤ／ｒ／ｓｐおよびＰ３／ｉｌｖＤ／ｆ／ｓｐ、Ｐ４／ｉｌｖＤ／ｒｅｖ（表２）、ならびにテンプレートとしての枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ作成断片Ｆ１およびＦ２を得た。次に、これらの断片を、テンプレートとしてプラスミドｐＳＰＥＣ１２ｆｌｉｐからのスペクチノマイシン耐性遺伝子カセット（ウェイド（Ｗａｄｅ）ら、１９９９年、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４３６５−４３７３頁）を用いる第２のＰＣＲ反応においてプライマーとして用いた。この最終ＰＣＲのＤＮＡ産物を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７に形質転換し、スペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃｒ）について選択した。多くのＳｐｅｃｒコロニーを回収し、いくつかは、プライマーＰ１ｉｌｖＤ／ｆｏｒおよびＰ４ｉｌｖＤ／ｒｅｖを用いるＰＣＲ分析によってｉｌｖＤプロモーター領域の欠失を有することを確認した。Ｓｐｅｃｒコロニーから単離したＤＮＡを用いて４０００ｂｐのＰＣＲ断片（ｉｌｖＤプロモーター領域の欠失の表示）を検出したが、非形質転換細胞からのＤＮＡ（欠失なし）は３０００ｂｐ断片を生じた。また、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびバリン（Ｖａｌ）アミノ酸に対する予想される栄養要求性についてコロニーを試験し、全てのＳｐｅｃｒ、ＰＣＲ陽性コロニーは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌアミノ酸が欠乏した最少培地において成長できなかった。１つのＳｐｅｃｒ、ＰＣＲ陽性のＩｌｖ−栄養要求体をＰＡ２４（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ）と名づけ、さらなる使用のために保存した。次に、ＰＡ２４のＰＢＳ１ライセートでＰＡ４９を形質導入し、スペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃ）について選択した。Ｓｐｅｃｒコロニーを回収し、１つは、ＰＣＲおよびＩｌｖ栄養要求体によってΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ変異を含有することを確認した。このコロニーは新たにＰＡ６０（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ）と命名した。
【００３４】
次に、菌株ＰＡ２４を用いて、ＳＰ０１−２６プロモーターの発現下でｉｌｖＤ遺伝子を作成した。プライマー対Ｐ１／ｉｌｖＤ／ｆｏｒおよびＰ２／ｉｌｖＤ／ｆ／２６、ならびにＰ３／ｉｌｖＤ／ｒ／２６およびＰ４／ｉｌｖＤ／ｒｅｖ（表２）をそれぞれ用い、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いるＬＦＨ−ＰＣＲによって、２つのＤＮＡ断片Ｆ１およびＦ２を作成した。次に、これらの断片を、テンプレートとしてＳＰ０１−２６含有プラスミドｐＵＣ１８ＳＰ０１−２６を用いる第２のＰＣＲ反応において用いた。この最終ＰＣＲのＤＮＡ産物をＰＡ２４に形質転換し、Ｉｌｖ＋原栄養性について選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーを回収し、Ｐ２６プロモーター断片によるｓｐｅｃ遺伝子の置換によって予想されるようにスペクチノマイシン耐性の耐性を失った（すなわち、Ｓｐｅｃｓ）ことを示した。さらに、プライマーＰ２６−ｓｅｑおよびＰ４ｉｌｖＤ／ｒｅｖを用いるいくつかのＩｌｖ＋Ｓｐｅｃｓコロニーの診断ＰＣＲ分析によりｉｌｖＤ構造遺伝子に隣接するＰ２６プロモーターの存在を確認した。Ｉｌｖ＋Ｓｐｅｃｓコロニーから単離したＤＮＡを用いて２０００ｂｐのＰＣＲ断片（Ｐ２６の存在の表示）を検出したが、非形質転換細胞からのＤＮＡ（ＳＰ０１−２６プロモーターなし）は、同じプライマーでＰＣＲ断片を生じなかった。非形質転換細胞からのＤＮＡは、プライマーｉｌｖＤｗｔ−ｐｒｏｍおよびＰ４ｉｌｖＤ／ｒｅｖで２０００ｂｐのＰＣＲ断片（Ｐｗｔの存在の表示）を生じたが、Ｉｌｖ＋ＳｐｅｃｓコロニーからのＤＮＡは、ＰＣＲ産物を生じなかった。１つのＩｌｖ＋ＳｐｅｃｓＰＣＲ陽性コロニーを新たにＰＡ２７（Ｐ２６ｉｌｖＤ）と命名した。次に、当業者によって既知の方法を用いるＰＢＳ１形質導入によって、Ｐ２６ｉｌｖＤ改変遺伝子を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＡ６０（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃ）に移した。Ｉｌｖ＋原栄養性について選択し、Ｓｐｅｃｓコロニーから選別することによって、ΔｉｌｖＤｐ：：ｓｐｅｃをＰ２６ｉｌｖＤで置換し、菌株ＰＡ６２（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ Ｐ２６ｉｌｖＤ）をもたらした。ＰＡ６２の染色体Ｐ２６ｉｌｖＤ領域のＤＮＡ配列決定はｉｌｖＤコード領域内の単一の点変異を検出し、これは、残基３２０にＧｌｙからＡｓｐへのアミノ酸変化を生じた。次に、当業者によく知られた方法を用いて、まずこの変異を包含するｉｌｖＤ遺伝子の内部セグメントを除去し、ＰＡ６２の栄養要求性のＩｌｖＤ−変異体（ＰＡ６４と改名）を作成し、次に、野生型染色体ＤＮＡを用いてＰＡ６４をＩｌｖ＋原栄養性に換えることによって、ｉｌｖＤコード配列を野生型に回復させた。これにより、菌株ＰＡ７３（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐｌ５ｐａｎＥ Ｐ２６ｉｌｖＤ）が作成された。
【００３５】
ＰＡ７３と同質遺伝子的であるが、ｉｌｖＤ遺伝子とそのネイティブプロモーター（強力な構成的なプロモーターの代わりに）との間に無改変ｉｌｖＤ遺伝子プロモーター領域およびｍＲＮＡ安定化エレメントを含有する第２の菌株は、以下のように構築した。３つの重複ＤＮＡ断片、２７２ｂｐ断片Ｆ１、１６８３ｂｐ断片Ｆ２および１１０２ｂｐ断片Ｆ３をそれぞれＰＣＲによって作成した。断片Ｆ１は、テンプレートとしてプラスミドｐＰＡ４７７、そしてプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＨｒｃＬｏｏｐ−およびＰｉｌｖＤＵＰ＋（表２）を用いることによって得た。断片Ｆ２は、テンプレートとして枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体ＤＮＡ、そしてプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＰ４／ｉｌｖＤ／ｒｅｖおよびＨｒｃＡＬｏｏｐＰｉｌｖＤ＋（表２）を用いることによって得た。断片Ｆ３は、テンプレートとして枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８、そしてプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＵＰ−およびＰ１／ｉｌｖＤ／ｆｏｒ（表２）を用いることによって得た。断片Ｆ１およびＦ３をアガロースゲルにより精製し、混合し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＨｒｃＬｏｏｐ−およびＰ’１ｉｌｖＤを含むさらに第４のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。これにより、１３５４ｂｐの断片Ｆ１３が作成された。断片２をゲル精製し、断片Ｆ１と混合し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＵＰ＋およびＰ’４ｉｌｖＤを含む第５の反応において混合物をテンプレートとして用いた。これにより、１９３５ｂｐの断片Ｆ１２が作成された。断片Ｆ１２およびＦ１３をｐＣＲＸＬＴＯＰＯ（インビトロジェン）において製造業者の使用説明書に従ってクローニングした。これにより、プラスミドｐＦ１２（ｐＣＲＸＬＴＯＰＯにおいてクローニングされた断片Ｆ１２）およびｐＦ１３（ｐＣＲＸＬＴＯＰＯにおいてクローニングされた断片Ｆ１３）が作成された。テンプレートとしてｐＦ１３、そしてプライマーとしてオリゴヌクレオチドＰｉｌｖＤＨｃｒｌ３＋およびＰｉｌｖＤＨｃｒ１３−を用いてもう一度断片Ｆ１３を増幅した。これにより、断片Ｆ１３ ２が作成された。断片Ｆ１３ ２をＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化されたｐＵＣ１９プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結した。これによって、プラスミドｐＵＣＰｉｌｖＤＨｃｒ１３が得られた。ＫｐｎＩおよびＸｂａＩによる消化の後、断片Ｆ１２を同様に消化されたプラスミドｐＵＣＰｉｌｖＤＨｃｒ１３に連結した。連結混合物をＰＡ６０コンピテント細胞内に直接形質転換し、このように菌株ＰＡ５９０が得られた。ＳＭＧ培地における振とうフラスコ分析によって、ＰＡ４９については１．７ｇ／ｌ、ＰＡ７３については２．５ｇ／ｌ、そしてＰＡ５９０については２．６ｇ／ｌの産生力価が明らかになり、安定化転写物を有する操作菌株は、構成的に発現された強力なプロモーターで操作されたものと同様の力価をもたらすことができると証明された。
【００３６】
【表２】
【００３７】
［実施例ＩＩＩ］
［ｉｌｖオペロンのネイティブプロモーターより下流でのｍＲＮＡ安定化エレメントの導入は、タンパク質の合成を増大する。］
ｍＲＮＡ安定化エレメントがタンパク質の過剰産生を誘発する能力は、もう１つのネイティブプロモーター発現遺伝子がパントテネート合成に関与する環境下で試験した。そうするために、非翻訳リーダー領域を含むｉｌｖＢのプロモーター領域（ｉｌｖＢｐ）を操作して、その後の改変を可能にする２つの制限部位を含有させた。２つの制限部位は、ｉｌｖＢ構造遺伝子翻訳開始コドンより４７４ｂｐ（ＰｓｈＡＩ）および７ｂｐ（ＮｈｅＩ）上流に位置した。プライマー対ＰｉｌｖＵＰ２＋、ＰｉｌｖＵＰ−およびＰｉｌｖ＋、Ｐｉｌｖ−（表３）によって枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体ＤＮＡから２つの重複ＰＣＲ断片を作成した。第３のＰＣＲ反応によりプライマーとして２つのより短い重複断片を用いて単一のＤＮＡ断片を作成するように構築した後、製造業者の使用説明書に従ってｐＣＲＸＬＴＯＰＯ（インビトロジェン）において、得られた断片をＴＡクローニングし、その配列を確認した。次に、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化によってクローン化断片を除去し、当業者に既知の手順に従ってｌａｃＺプロモータープローブベクターｐＤＧ１７２８にサブクローニングし（グロウト−フロイリー、１９９６年、Ｇｅｎｅ １８０：５７−６１頁）、プラスミドｐＰＡ４１５が得られた。このプラスミドを次に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７において形質転換し、スペクチノマイシン耐性について選択し、ＰｉｌｖＢ＊−ｌａｃＺ融合物をａｍｙＥ染色体座位に組み込み、菌株ＰＡ４３１を作成した。
【００３８】
ｍＲＮＡ安定化エレメントを含有するようにプラスミドｐＰＡ４１５をさらに改変した。これを達成するために、このプラスミドをＰｓｈＡＩ／ＮｈｅＩで消化して、ｉｌｖ−ｌｅｕリーダー領域を、ベクター配列の残部、ｉｌｖＢネイティブプロモーター領域および上流領域、ならびにｌａｃＺ構造遺伝子セグメント（すなわち、骨格断片）から解放した。この骨格ＤＮＡ断片を精製し、ｍＲＮＡ安定化ＤＮＡ配列（すなわち、安定化エレメント、メインケン（Ｍｅｉｎｋｅｎ）ら、２００３年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４９：７５１−７６頁）を内部に有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ領域を含有する配列に連結した。プライマー対ＣｇｇＲＬｏｏｐ＋／ＣｇｇＲＬｏｏｐ−（表３）を用いることにより枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８からこの断片をＰＣＲ増幅し、精製し、ＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩにより消化した。連結したＤＮＡを、アンピシリン耐性について選択する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換した。この結果、ｉｌｖＢプロモーターとｌａｃＺレポーター遺伝子との間の非翻訳リーダー領域がｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＲＮＡ安定化エレメント（すなわち、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）によって置換されたプラスミドｐＰＡ４２２がもたらされた。ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺカセットを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｍｙＥ染色体座位に挿入するために、次に、ｐＰＡ４２２プラスミドＤＮＡを１Ａ７４７に形質転換し、スペクチノマイシン耐性について選択した。これによって、菌株ＰＡ４３２がもたらされた。指数関数的に成長させた最少培地を含有する振とうフラスコ培養物と共に開発された標準的なＯＮＰＧアッセイにおいて、菌株ＰＡ４３２は、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ遺伝子間領域がなくても、野生型プロモーター融合物（すなわち、ＰｉｌｖＢ＊−ｌａｃＺ）を含有する同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３１よりも７倍高いβ−ガラクトシダーゼレベルを産生した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
［実施例ＩＶ］
［そのネイティブプロモーター、および５’リーダー領域を有する外因性ｍＲＮＡ安定化エレメントを用いてｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを発現する菌株は、構成的に強力な外因性プロモーターの転写制御下でｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを含有する菌株と同様のタンパク質レベルを達成することができる。］
ネイティブｉｌｖＢプロモーターを強力な構成的プロモーターで置換するために、あるいはネイティブｉｌｖＢプロモーター領域とｉｌｖＢ構造遺伝子との間にｍＲＮＡ安定化エレメントを導入するために、まずネイティブｉｌｖＢプロモーター領域（ＰｉｌｖＢ）の欠失を以下のように構築した。ＰｉｌｖＢの上流および下流の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体セクションによって隣接されたクロラムフェニコール（ｃａｔ）耐性遺伝子カセットを含有するプラスミドを初めに構築した。これを達成するために、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８から、テンプレートとして染色体ＤＮＡおよびプライマーｙｓｎＤ３−およびｙｓｎＤ＋（表４）を用いるＰＣＲによって、ｙｓｎＤ遺伝子（ＰｉｌｖＢプロモーターより上流に位置する）の５’末端を含有するＤＮＡ断片を合成した。第２のＰＣＲで作成されたｃａｔ耐性コード化遺伝子を含む断片は、プライマーｉｌｖＢＣａｔ＋およびｉｌｖＢＣａｔ−（表４）、ならびにプラスミドｐＤＧ１６６１（グロウト−フロイリーら、１９９６年、Ｇｅｎｅ ５７−６１頁）をテンプレートとして用いて調製した。この断片は、ｙｓｎＤ含有ＰＣＲ断片の３’末端と重複する。精製した後、プライマーｉｌｖＢＣａｔ＋およびｙｓｎＤ３−による第３のＰＣＲ反応において両方のＰＣＲ断片をテンプレートとして使用して、ｙｓｄＤ’−ｃａｔ断片が得られた。第４のＰＣＲ反応を用いて、ＰｉｌｖＢより下流のｉｌｖＢ構造遺伝子の５’末端を増幅した。このようにしてプライマーｉｌｖＢ＋およびｉｌｖＢ−（表４）の使用によって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体ＤＮＡからＰＣＲ産物を得た。製造業者の使用説明書に従い、ｐＣＸＬＴＯＰＯキット（インビトロジェン）によってこのｉｌｖＢ’断片をクローニングした。クローン化断片を、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ断片としてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。制限分析によってその完全性を確認した後、ｉｌｖＢ’セグメントより上流に上記のｙｓｎＤ’−ｃａｔ断片を挿入し（ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位を用いて）、最終プラスミドｐＰＡ４０１が得られた。ｃａｔ遺伝子配列がＫｐｎＩ／ＭｌｕＩ消化によってｙｓｎＤ’−ｃａｔ−ｉｌｖＢ’カセットから除去され、他の任意のＤＮＡエレメントによって置換されるような形でこのプラスミドを操作した。次に、プラスミドｐＰＡ４０１を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）原栄養性の野生型菌株（１Ａ７４７）およびパントテネート産生株（ＰＡ７３）に形質転換し、クロラムフェニコール耐性について選択した。Ｃｍｒコロニーは、Ｉｌｖ−栄養要求体（すなわち、バリン、ロイシン、およびイソロイシンアミノ酸を添加しないと最少培地で成長することができない細菌）であることが分かった。得られた菌株をＰＡ４０１（Δｉｌｖｐ：：ｃａｔ）およびＰＡ４４１（Ｐ１５ｐａｎＢＣＤ Ｐ１５ｐａｎＥ Ｐ２６ｉｌｖＤ Δｉｌｖｐ：：ｃａｔ）と名づけた。
【００４１】
そのネイティブプロモーター（しかし、改変されたリーダー領域を含む）の制御下でｉｌｖ−ｌｅｕオペロンを含有する菌株を作成するために、プライマーＰｉｌｖＵＰ３＋およびＣｇｇＲＬｏｏｐ２−、ならびにテンプレートとしてのｐＰＡ４２２プラスミドＤＮＡ（上記を参照）によるプラスミドｐＰＡ４２２（上記を参照）からのＰＣＲによって、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡカセットを含有するＤＮＡ断片を増幅した。このようにして作成されたＰＣＲ断片をＫｐｎＩ／ＭｌｕＩで消化し、ｐＰＡ４０１の精製したＫｐｎＩ／ＭｌｕＩｃａｔを含有しない断片（すなわち、構造、５’−ＫｐｎＩ−ｙｓｎＤ−ベクター複製配列−ｉｌｖＢ’−ＭｌｕＩ−３’を有するＤＮＡ断片）に連結した。連結混合物をＰＡ４４１に直接形質転換し、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬｅｕアミノ酸の補給のない最少培地における成長についてコロニーを選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーが得られ、いくつかの遺伝的背景をＰＣＲにより確認した。これらに加えて、Ｉｌｖ＋ＰＣＲ＋コロニーも、ＰｉｌｖＢプロモーター−ｍＲＮＡ安定化エレメント領域によるｃａｔ遺伝子の置換の予想通りクロラムフェニコール（Ｃｍｓ）に対して感受性であった。１つのＩｌｖ＋ＰＣＲ＋Ｃｍｓコロニーを更なる研究のために保存した（ＰＡ４４５）。
【００４２】
ＳＰ０１−２６（Ｐ２６）の制御下でｉｌｖ−ｌｅｕオペロンを含有する菌株を作成するために、プライマーＰ２６＋１およびＰ２６−ならびにテンプレートとしてｐＵＣ１９ＳＰ０１−２６プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ２６プロモーターを含有するＤＮＡ断片をまずＰＣＲ増幅した。得られるＤＮＡ産物をＫｐｎＩ／ＭｌｕＩで消化し、ｐＰＡ４０１の精製ＫｐｎＩ／ＭｌｕＩｃａｔを含まない断片（すなわち、厳密な、５’−ＫｐｎＩ−ｙｓｎＤ−ベクター複製配列−ｉｌｖＢ’−ＭｌｕＩ−３’を有するＤＮＡ断片）に連結した。連結混合物をＰＡ４０１（Δｉｌｖｐ：：ｃａｔ）に直接形質転換し、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬｅｕが補充されない最少培地における成長についてコロニーを選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーが得られ、いくつかの遺伝的背景をＰＣＲにより確認した。これらに加えて、Ｉｌｖ＋ＰＣＲ＋コロニーも、ｃｇｇＲ改変ＰｉｌｖＢプロモーター領域によるｃａｔ遺伝子の置換の予想通りクロラムフェニコール（Ｃｍｓ）に対して感受性であった。１つのＩｌｖ＋ＰＣＲ＋Ｃｍｓコロニーを保存し、ＰＡ４０２と名づけた。ＤＮＡ配列決定により、ｉｌｖＢプロモーター領域（すなわち、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤ）より下流にｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントが挿入された改変ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの存在が確認された。次に以下のような方法でＰＢＳ１普遍形質導入を用いて、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンをパントテネート産生菌株ＰＡ７３に移した：ＰＡ４０２および当業者に既知の方法を用いてＰＢＳ１ファージライセートを調製した。このライセートを用いてＰＡ４４１を感染させ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＬｅｕの補給のない最少培地における成長についてコロニーを選択した。多くのＩｌｖ＋コロニーが得られ、いくつかの遺伝的背景をＰＣＲにより確認した。これらに加えて、Ｉｌｖ＋ＰＣＲ＋コロニーも、ＰｉｌｖＢプロモーター−ｍＲＮＡ安定化エレメント領域によるｃａｔ遺伝子の置換の予想通りクロラムフェニコール（Ｃｍｓ）に対して感受性であった。さらなる研究のために１つのＩｌｖ＋ＰＣＲ＋Ｃｍｓコロニーを保存した（ＰＡ４４４）。
【００４３】
二次元タンパク質ゲルを用いて、強力な構成的ＳＰ０１−２６プロモーターおよび野生型５’非翻訳リーダー領域を含有する菌株ＰＡ４４４と、野生型プロモーターおよびｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＲＮＡ安定化エレメントで改変された５’非翻訳リーダー領域を含有する菌株ＰＡ４４５との間で、当業者に既知の方法を用いてｉｌｖ−およびｌｅｗ−コード化遺伝子のタンパク質合成のレベルを比較した。ＰＡ４４４およびＰＡ４４５の両方において、親ＰＡ７３菌株に関してタンパク質レベルの著しい増大が観察された。
ＰＡ４４４−ＩｌｖＢ５６％、ＩｌｖＣ４７３％、ＬｅｕＡ２７１％、ＬｅｕＢ５７９％、ＬｅｕＣ１５３％、およびＬｅｕＤ３０６％、
ＰＡ４４５、ＩｌｖＢ６０％、ＩｌｖＣ６４８％、ＬｅｕＡ２７４％、ＬｅｕＢ４９９％、ＬｅｕＣ１９５％、およびＬｅｕＤ５２３％。
【００４４】
これらの結果から、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンからの遺伝子によってコードされたタンパク質レベルの増大は、ＰＡ４４４およびＰＡ４４５の両方の菌株について同じ範囲内であると結論付けることができる。
【００４５】
【表４】
【００４６】
［実施例Ｖ］
［内在性ｍＲＮＡ安定化エレメントの導入は、ネイティブプロモーターによりコードされるｍＲＮＡの転写物存在量を増大することができる。］
ＰＡ４４４およびＰＡ４５５は、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの転写を制御する、異なるＤＮＡエレメントの存在を除いて同質遺伝子的な菌株である。ＰＡ４４４は強力な構成的ＳＰ０１−２６プロモーターおよび野生型５’非翻訳リーダー領域を含有し、ＰＡ４４５は、野生型プロモーターおよびｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＲＮＡ安定化エレメントを有する改変５’非翻訳リーダー領域を含有する。ｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの転写に対するに対する２つの異なるＤＮＡエレメントの効果を分析するために、標準ノーザンブロットを用いて、両方の菌株のｍＲＮＡ転写プロファイルを分析した。プライマーＩｌｖＢＦｏｒ／ＩｌｖＢＲｅｖ（ＩｌｖＢプローブ）、ＩｌｖＣＦｏｒ／ＩｌｖＣＲｅｖ（ＩｌｖＣプローブ）、およびＬｅｕＤＦｏｒ／ＬｅｕＤＲｅｖ（ＬｅｕＤプローブ）（表５）を用いて得られるＰＣＲ断片からのｉｌｖＢ、ｉｌｖＣ、およびｌｅｕＤ遺伝子に対する標識化アンチセンスｍＲＮＡプローブを作成し、標準条件下、変性アガロースゲル上で分離される全ＲＮＡに対して別々にハイブリッド形成した。結果は、２つの菌株が異なる転写物プロファイルを生じたことを示した。ｉｌｖＢおよびｉｌｖＣプローブの両方とハイブリッド形成するが、ｌｅｕＤプローブとはハイブリッド形成しない高存在量の３．５ｋｂのｍＲＮＡ種をＰＡ４４５全ＲＮＡにおいて検出したが、ＰＡ４４４全ＲＮＡでは検出しなかった。マーダー（Ｍａｅｄｅｒ）らによると、この３．５ｋｂ転写物はｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、およびｉｌｖＣ遺伝子を包含し、野生型細菌からの全ＲＮＡからは検出されない（マーダーら、２００４年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２２４０−２２５２頁）。さらに、このＲＮＡ種はＰＡ４４５において検出されないので、当業者は、このｍＲＮＡ種の存在量の増大が、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ＤＮＡエレメントによるｍＲＮＡメッセージの安定性を増大することによって生じたものであり、転写のレベルを増大することによってではないことを認識するであろう。
【００４７】
同様に、８．５ｋｂおよび２．５ｋｂの２つの付加的な転写物の存在量は、菌株ＰＡ４４４よりもＰＡ４４５において大きかった。２．５ｋｂ転写物はｉｌｖＢプローブとハイブリッド形成するがｉｌｖＣおよびｌｅｕＤプローブとはしないので、このｍＲＮＡはｉｌｖＢおよびｉｌｖＮ遺伝子を包含すると結論付けることができる。８．５ｋｂ転写物はｌｅｕＤプローブとハイブリッド形成するので、ｉｌｖ−ｌｅｕオペロン全体を包含するはずである。上記と同じ論拠を用いて、ＰＡ４４４よりもＰＡ４４５においてより大きいこれらの２つのＲＮＡ種の存在量はこれらのより高い安定性にのみ起因し、そしてこれはｉｌｖ−ｌｅｕオペロンの５’リーダー配列へのｃｇｇＲ−ｇａｐＡエレメントの導入の結果として生じるに違いない。
【００４８】
【表５】
【００４９】
［実施例ＶＩ］
［ｍＲＮＡ安定化エレメントの使用によるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンでコードされたタンパク質のレベルの増大は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるパントテネートの産生を増大させる。］
菌株ＰＡ７３、ＰＡ４４４、およびＰＡ４４５をＶＦＢ ＭＭＧＴ最少培地を含有する振とうフラスコ培養におけるパントテネート産生について評価し、４８時間成長させた。これらの振とうフラスコ培養から調製した無細胞の上澄みのＨＰＬＣ分析によって、以下のレベルのパントテネートの存在が明らかになった。
ＰＡ７３、５５０ｍｇ／ｌ、
ＰＡ４４４、１５０ｍｇ／ｌ、
ＰＡ４４５、７５０ｍｇ／ｌ。
【００５０】
結果は、構成的な強力プロモーターによるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの転写レベルの増大は親菌株よりも低いパントテネートの産生をもたらすことを示した。逆に、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントによるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤｍＲＮＡ転写物の安定性の増大は、ＰＡ７３親菌株により生じるよりも高いパントテネート力価をもたらした。タンパク質含量はＰＡ４４４およびＰＡ４４５の両方においてほぼ同一であることが示されたので、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化を用いるｉｌｖＢＮＣ−ｌｅｕＡＢＣＤ転写物の安定性の増大は、パントテネート産生の強化において、構成的なＳＰＯ１プロモーターの使用により転写のレベルを増大するよりも効果的であった。この結論と十分に一致して、菌株ＰＡ４４４はＰＡ４４５よりもゆっくり成長し、長期の成長の間に、より高い細胞溶解速度を有した。
【００５１】
［実施例ＶＩＩ］
［ｍＲＮＡの安定化は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＲＮａｓｅ Ｅ活性とは無関係である。］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８は、推定では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ Ｅの機能的相同体をコードする２つの遺伝子（ｙｍｆＡおよびｙｋｑＣ）を含有すると記載されている。菌株ＳＳＢ３４８は、野生型枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の誘導体であり、遺伝子ｙｍｆＡが欠失され、ｙｋｑＣ発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルガラクトピラノシド）誘導性プロモーター（Ｐｓｐａｃ）の制御下に置かれる（エベン（Ｅｖｅｎ）ら、２００５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：２１４１頁）。菌株ＰＡ４３１、ＰＡ４３２、ＰＡ４９４、およびＰＡ５１７から抽出したＤＮＡで菌株ＳＳＢ３４８を形質転換し、それぞれ、菌株ＰＡ６０２（ネイティブｉｌｖＢプロモーターシグナルの制御下で発現されたｉｌｖＢ−ｌａｃＺ融合物）、ＰＡ６０３（ネイティブｉｌｖＢプロモーターシグナルの制御下で発現された５’末端におけるｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントの付加によって、安定化転写物として発現されたｉｌｖＢ−ｌａｃＺ融合物）、ＰＡ６０４（ネイティブｉｌｖＢプロモーターシグナルの制御下で発現された５’末端におけるｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントの付加によって安定化転写物として発現されたｉｌｖＢ−ｌａｃＺ融合物）、およびＰＡ６０５（５’末端におけるｈｒｃＡ−ｇｒｐＥ安定化エレメントの組み込みによって安定化転写物としてネイティブプロモーターシグナルｉｌｖＤ遺伝子の制御下で転写されたｉｌｖＤ−ｌａｃＺ融合物）をもたらした。３７℃で１８時間の２５ｍｌ振とうフラスコ培養において各菌株を成長させ、標準（ＯＮＰＧアッセイ）法を用いてβ−ガラクトシダーゼレベルを測定した。これらの結果は表６で要約される。各菌株において、ＩＰＴＧ誘発の存在または不在下で細胞が成長される場合に、β−ガラクトシダーゼレベルの差は少しも観察されなかった。これらの結果は、遺伝子ｙｍｆＡおよびｙｋｑＣによりコードされる活性が、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｍＲＮＡ安定化エレメントの機能のために必要とされないことを実証する。
【００５２】
【表６】
【００５３】
［実施例ＶＩＩＩ］
［ｍＲＮＡ安定化により仲介される強化されたタンパク質合成に対する安定化エレメントの二次構造および不対５’配列の長さの効果。］
シャープ（Ｓｈａｒｐ）およびベックホファー（Ｂｅｃｈｈｏｆｅｒ）（２００５年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７：４８４−４９５頁）は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における効率的なｍＲＮＡの安定化のために、（ｉ）５’末端二次構造が、極小値（−２．８および−４．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）未満の自由エネルギー（ΔＧ）を有さなければならないこと、ならびに（ｉｉ）転写物の５’末端から４および７不対ヌクレオチド（ｎｔ）に満たない位置にあることを実証した。４つの不対ヌクレオチド（ｅｒｍＣ安定化エレメントにおいて）および７つの不対ヌクレオチド（ＳＰ８２安定化エレメントにおいて）の存在は、安定化の完全な損失をもたらす。
【００５４】
実施例ＩＩＩにおいて、ｌａｃＺレポーター遺伝子より上流にｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントを含有するＰＡ４３２（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）は、野生型ｉｌｖＢプロモーターｌａｃＺ融合物（ＰｉｌｖＢ−ｌａｃＺ）のみを含有する同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３１よりも７倍多いβ−ガラクトシダーゼを産生することが示された。ＰＡ４３２において、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ ｍＲＮＡ安定化エレメントの２つの安定化ステムループ構造はｌａｃＺ転写物の＋１転写開始部位より９３ヌクレオチド下流に位置した。ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントの二次構造を予想するため、そして転写物の５’末端における不対配列の長さを決定するために、ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）（２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３４０６−３４１５頁）のｍｆｏｌｄ構造予測プログラムを用いてＰＡ４３２におけるｌａｃＺ ｍＲＮＡのリーダー領域を分析した。２６０ｎｔリーダー領域（＋１転写開始からｌａｃＺの翻訳のためのｓｐｏＶＧＲＢＳ配列までであるが、これは含まない）は、８個の不対ヌクレオチドを転写物の５’末端に含有し、そして非常に弱いステムループ（ΔＧ＝−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が続く。ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントの第１の安定化ステムループ（ＳＬ１）（ルートヴィヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）ら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４１：４０９−４２２頁における予測構造）は、ＰＡ４３２では切断された。切断されたＳＬ１（ＳＬ１Ｔ）は、ΔＧ＝−４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、二本鎖ステムに８ｎｔ、１ｎｔのバルジループ、および３ｎｔのヘアピンループという特徴を有した。
【００５５】
ｍｆｏｌｄプログラムを用いて、ＳＬ１安定化ステムループ（ΔＧ＝−１１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、二本鎖ステムに１１ｎｔ、２ｎｔのバルジループ、および３ｎｔのヘアピンループ）は、ＰＡ４３２においてｌａｃＺ ｍＲＮＡの２７７ｎｔのリーダー領域（配列番号４７）から７５ｎｔ（＋１９ｎｔ〜＋９３ｎｔ）を除去することによって回復され得ることが予測された。ＳＬ１がＳＬ１Ｔよりも高いｍＲＮＡ安定化レベルを与えるかどうかを試験するために、ｌａｃＺより上流に、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１０と呼ばれるリーダー欠失誘導体を構築した。まず、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ安定化エレメントを含有する１３０ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＰＡ４２２をテンプレートＤＮＡとして用いてプライマーＧＡＰ＃１０−ＦＯＲおよびＧＡＰ＃１０−ＲＥＶ（表７）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩ酵素で消化し、ｐＰＡ４１５プラスミドのＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩ部位にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の形質転換の後、ＡｍｐｒおよびＳｐｅｃｒ形質転換体を選択した。次に、得られたｐＢｅｓｔ１０を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７に形質転換し、Ｓｐｅｃｒについて選択し、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１０−ｌａｃＺ融合物をａｍｙＥ染色体座位に組み込んで、菌株ＢＥ１０を作成した。振とうフラスコアッセイでは、培養物をＬＢ培地および最少培地の両方において成長させ、ＢＥ１０（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１０−ｌａｃＺ）菌株は、同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３２（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）と同等レベルのβ−ガラクトシダーゼを産生した。データは、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡエレメントにより仲介される効率的なｍＲＮＡ安定化が、（ｉ）５’終端から安定化配列までの距離（１９ｎｔ対９３ｎｔ）、および（ｉｉ）二次構造の強度（ＳＬ１Ｔ対ＳＬ１安定化ステムループ）に無関係であることを示した。
【００５６】
不対５’末端ヌクレオチドの効果を研究するために、ＰＡ４３２におけるｌａｃＺ ｍＲＮＡの２７７ｎｔリーダー領域から３９ｎｔ（＋１８０ｎｔ〜＋２１８ｎｔ）を除去（配列番号４７）し、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４と呼ばれる２３８ｎｔリーダー欠失誘導体の構造を、ｍｆｏｌｄプログラムを用いて予想した。２７７ｎｔのオリジナルリーダー配列は８個の不対ヌクレオチドを含有し、ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４欠失リーダーは転写物の５’末端に１６個の不対ヌクレオチドを含有した。ｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４欠失リーダーを有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異体を構築するために、まず、ｐＰＡ４２２プラスミドにおいて安定化エレメントとｌａｃＺ遺伝子との間でＢａｍＨＩ消化により３９ｂｐ断片を除去した。消化されたプラスミドの自己連結および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の形質転換の後、ＡｍｐｒおよびＳｐｅｃｒ形質転換体を選択した。次に、得られたｐＢｅｓｔ１４を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７４７に形質転換してＳｐｅｃｒについて選択し、ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４−ｌａｃＺ融合物をａｍｙＥ染色体座位に組み込み、菌株ＢＥ１４を作成した。振とうフラスコアッセイにおいてＬＢ培地および最少培地の両方で細菌培養物を成長させ、ＢＥ１４（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ＃１４−ｌａｃＺ）菌株は、同質遺伝子的な菌株ＰＡ４３２（ＰｉｌｖΩｃｇｇＲ−ｇａｐＡ−ｌａｃＺ）と同等レベルのβ−ガラクトシダーゼを産生した。データは、１６の不対ヌクレオチドがＢＥ１４菌株においてｌａｃＺ転写物の５’末端にある場合に効率的なｍＲＮＡの安定化が達成されることを示した。
【００５７】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステムループを形成することができ、そして１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大することができるＤＮＡ配列を、コード化ＤＮＡ遺伝子配列の５’末端に導入することによって、前記構造遺伝子配列の転写を制御するネイティブプロモーターシグナルを強化することなく、微生物における所望の化合物の産生を増大するための方法であって、
ループ形成ＤＮＡ配列が、微生物の関連遺伝子の転写の開始部位より７ＤＮＡヌクレオチドまたはそれ以上下流に導入されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステムループ形成ＤＮＡ配列が天然に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列が、以下の特性：
少なくとも６塩基対の二本鎖ステム構造および３〜３０ヌクレオチドのヘアピンループ構造と、
−２．８ｋｃｌ／ｍｏｌ以下である前記構造の計算された熱力学的安定性（ΔＧ）と
を有する１つ以上のステムループ二次構造を形成する最低１５ヌクレオチドからなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ループ形成ＤＮＡ配列が、微生物の染色体に由来する請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が枯草菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ配列が、遺伝子ｃｇｇＲ〜遺伝子ｇａｐＡの配列、遺伝子ｈｒｃＡ〜遺伝子ｇｒｐＥの配列、遺伝子ｉｌｖＮ〜遺伝子ｉｌｖＣの配列、遺伝子ａｐｒＥ〜遺伝子ｙｈｆＯの配列、遺伝子ｙｂｄＡ〜遺伝子ｇｓｉＢの配列、および遺伝子ｙｔｘＣ〜遺伝子ｔｈｒＳの配列からなる群の一員において生じる連続的な配列からなる、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体ヌクレオチド領域であると定義される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ配列が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の天然に存在する遺伝子ｃｇｇＲ〜遺伝子ｇａｐＡの配列、好ましくは遺伝子ｃｇｇＲの３’末端およびｃｇｇＲ遺伝子の終止コドンより１０ヌクレオチド以上下流の配列であり、配列番号１またはその一部によって表される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ配列が配列番号２である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ配列が、配列番号３で表される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の天然に存在する遺伝子ｈｒｃＡ〜遺伝子ｇｒｐＥの配列、好ましくはこれらの遺伝子の間の配列である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ配列が配列番号４である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ配列が配列番号５または配列番号６である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
微生物の関連遺伝子の転写の開始点より７ＤＮＡヌクレオチドまたはそれ以上下流に導入されたＤＮＡ配列から転写される安定化エレメントをその５’末端に含有することを特徴とするｍＲＮＡ配列。
【請求項１４】
前記安定化エレメントがステムループであり、以下の特性：
少なくとも６塩基対の二本鎖ステム構造および３〜３０ヌクレオチドのヘアピンループ構造と、
−２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である前記構造の計算された熱力学的安定性（ΔＧ）と
を有する１つ以上のステムループ二次構造を形成する最低１５ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１３に記載のｍＲＮＡ配列。
【請求項１５】
微生物による転写の際に、請求項１３または１４に記載の安定化ｍＲＮＡ配列を形成するＤＮＡ配列。
【請求項１６】
配列番号１〜６のいずれか１つを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列を含む形質転換微生物。
【請求項１８】
微生物における所望の化合物の産生を増大するための請求項１３または１４に記載の安定化ｍＲＮＡ配列の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法において、１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大するための請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列の使用。
【請求項２０】
特に実施例に関連して以下に記載されるような発明。
【請求項１】
ステムループを形成することができ、そして１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大することができるＤＮＡ配列を、コード化ＤＮＡ遺伝子配列の５’末端に導入することによって、前記構造遺伝子配列の転写を制御するネイティブプロモーターシグナルを強化することなく、微生物における所望の化合物の産生を増大するための方法であって、
ループ形成ＤＮＡ配列が、微生物の関連遺伝子の転写の開始部位より７ＤＮＡヌクレオチドまたはそれ以上下流に導入されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステムループ形成ＤＮＡ配列が天然に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列が、以下の特性：
少なくとも６塩基対の二本鎖ステム構造および３〜３０ヌクレオチドのヘアピンループ構造と、
−２．８ｋｃｌ／ｍｏｌ以下である前記構造の計算された熱力学的安定性（ΔＧ）と
を有する１つ以上のステムループ二次構造を形成する最低１５ヌクレオチドからなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ループ形成ＤＮＡ配列が、微生物の染色体に由来する請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が枯草菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ配列が、遺伝子ｃｇｇＲ〜遺伝子ｇａｐＡの配列、遺伝子ｈｒｃＡ〜遺伝子ｇｒｐＥの配列、遺伝子ｉｌｖＮ〜遺伝子ｉｌｖＣの配列、遺伝子ａｐｒＥ〜遺伝子ｙｈｆＯの配列、遺伝子ｙｂｄＡ〜遺伝子ｇｓｉＢの配列、および遺伝子ｙｔｘＣ〜遺伝子ｔｈｒＳの配列からなる群の一員において生じる連続的な配列からなる、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体ヌクレオチド領域であると定義される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ配列が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の天然に存在する遺伝子ｃｇｇＲ〜遺伝子ｇａｐＡの配列、好ましくは遺伝子ｃｇｇＲの３’末端およびｃｇｇＲ遺伝子の終止コドンより１０ヌクレオチド以上下流の配列であり、配列番号１またはその一部によって表される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ配列が配列番号２である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ配列が、配列番号３で表される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の天然に存在する遺伝子ｈｒｃＡ〜遺伝子ｇｒｐＥの配列、好ましくはこれらの遺伝子の間の配列である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ配列が配列番号４である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ配列が配列番号５または配列番号６である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
微生物の関連遺伝子の転写の開始点より７ＤＮＡヌクレオチドまたはそれ以上下流に導入されたＤＮＡ配列から転写される安定化エレメントをその５’末端に含有することを特徴とするｍＲＮＡ配列。
【請求項１４】
前記安定化エレメントがステムループであり、以下の特性：
少なくとも６塩基対の二本鎖ステム構造および３〜３０ヌクレオチドのヘアピンループ構造と、
−２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である前記構造の計算された熱力学的安定性（ΔＧ）と
を有する１つ以上のステムループ二次構造を形成する最低１５ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１３に記載のｍＲＮＡ配列。
【請求項１５】
微生物による転写の際に、請求項１３または１４に記載の安定化ｍＲＮＡ配列を形成するＤＮＡ配列。
【請求項１６】
配列番号１〜６のいずれか１つを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列を含む形質転換微生物。
【請求項１８】
微生物における所望の化合物の産生を増大するための請求項１３または１４に記載の安定化ｍＲＮＡ配列の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法において、１つ以上の遺伝子からのｍＲＮＡ転写物の安定性を増大するための請求項１５または１６に記載のＤＮＡ配列の使用。
【請求項２０】
特に実施例に関連して以下に記載されるような発明。
【公表番号】特表２００９−５１８０１９（Ｐ２００９−５１８０１９Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３７０５（Ｐ２００８−５４３７０５）
【出願日】平成１８年１２月１日（２００６．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１５４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５６０２
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１日（２００６．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１５４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５６０２
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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