ｍＲＮＡ分取方法および装置
【課題】生きた細胞から損傷が少なく、かつ成熟したｍＲＮＡを採取する方法および装置を提供すること。
【解決手段】ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺し、前記中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に接触させ、前記中空キャピラリー内を陰圧にして、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取する。
【解決手段】ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺し、前記中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に接触させ、前記中空キャピラリー内を陰圧にして、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内のｍＲＮＡ、あるいは特に成熟ｍＲＮＡを細胞を殺すこと無しに得る方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている（非特許文献１あるいは非特許文献２）。あるいは、採取した試料に含まれる特定の配列のｍＲＮＡ（あるいはｃＤＮＡ）をＰＣＲ増幅して得られる産物の量やＰＣＲ産物長、塩基配列を調べる方法が用いられている。
【０００３】
これら分離したｍＲＮＡは単に分析目的で用いられる以外にこれをｃＤＮＡに変換し、ベクターに組み込んだりして色々の目的に利用されている。一例として言えば、採取したｍＲＮＡをベクターに組み込み、クローニングした後、ベクターを鋳型にして部分的に異なる塩基を持つプライマーで相補鎖合成し、任意の遺伝子改変を施す遺伝子組換えに用いられている。
【０００４】
ところが、多くの生命は外界の状況や細胞自身の分化、加齢により、同一遺伝子から異なるｍＲＮＡが産出されることが数多く報告されている。この現象はスプライシングバリアントとかオルターナティブスプライシングと呼ばれている。これは、プレマチュアーなｍＲＮＡがゲノムより転写された後、エピジェネティックな制御（遺伝子では完全に制御されないで、酵素などの反応で成り立つ制御）により状況に応じて異なるエキソンが使われて成熟ｍＲＮＡが作られるためである。あるいは免疫細胞系のＴ細胞やＢ細胞のように、免疫幹細胞からの分化の過程で、ゲノムそのものの配列が再構成されたり変異が導入されたりするためである。
【０００５】
さらに、細胞のガン化においては、遺伝子の配列において、タンパク質翻訳レベルでのアミノ酸変異やタンパク質が作られなくなってしまうような変異が起きたり、ＬＯＨ（loss of heterozygosity）のように１対の遺伝子のうち片方の遺伝子が消失してしまったりするケースが数多く存在する。
【０００６】
このような変異は、細胞にとって普遍的なことではないので、理想的には同一細胞から連続的にｍＲＡＮなりタンパク質を分離して分析できるようにする必要がある。
【０００７】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術でｍＲＮＡを分取しようとすると、試料である細胞や組織を破砕して細胞内に存在するｍＲＮＡを抽出するので、もとの細胞は死んでしまう。このため、同一細胞から異なった時点に複数回に亘ってｍＲＮＡを得ることができなくなってしまう。また、細胞や組織を破砕した全体からｍＲＮＡを抽出するのでゲノムのコンタミネーション防止に細心の注意を払って行う必要がある。さらに、ゲノムから転写されたプレマチュアーなプレカーサーｍＲＮＡと実際に細胞質で機能する成熟ｍＲＮＡはその長さも配列も異なる。
【０００９】
このため、細胞をすりつぶした試料からｍＲＮＡを得ようとすると解析が困難になり、あるいは、得たｍＲＮＡを利用しようとすると必ずしも希望のものが得られないケースがあり、問題となっている。
【００１０】
これを解決する技術として、界面活性剤であるＮＰ−４０を利用して細胞膜にランダムに穴を開け、細胞質に含まれるｍＲＮＡを細胞の外に溶出させて回収する方法がある。確かにこの方法でプレカーサーｍＲＮＡの分取に成功する可能性が高いが、一旦、核から細胞質に移行したｍＲＮＡはＲＮａｓｅの攻撃を受けやすくなる。事実、成熟ｍＲＮＡのキャップ構造からポリＡまでを含む完全長ｍＲＮＡを得ようとすると、キャップを認識して切断、ライゲーションによる既知配列の導入、逆転写ＰＣＲと行った複雑な工程が必要で、完全長ｍＲＮＡの回収率も悪い。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの問題点を解決するために、本発明では、生きた細胞から損傷が少なく、かつ成熟したｍＲＮＡを採取する方法および装置を提供することにある。細胞は使い切りではなく生かしたまま、必要に応じて複数回ｍＲＮＡやタンパク質の解析ができる方法を提案することを目的とする。
【００１２】
ｍＲＮＡは核内ではプレカーサーｍＲＮＡの形で存在し、核膜を通過するときに成熟ｍＲＮＡとなる。また、核膜を通過した後は、一方的にＲＮａｓｅの攻撃を受け分解されるだけである。よって、発明者らは成熟ｍＲＮＡを得るには核膜を通過した直後に、細胞質と接触しない状態で回収すれば、プレカーサーｍＲＮＡを含まないで成熟ｍＲＮＡを採取できることに気づいた。具体的には、中空キャピラリーを核膜を突き破らないで核膜に密着させ、細胞質からシールドされた状態で成熟ｍＲＮＡを得ることができる。中空キャピラリーを核膜に密着させる方法としては、たとえば中空キャピラリー先端を核膜に接触させた後、中空キャピラリー内を陰圧にすることで達成できる。成熟ｍＲＮＡを核膜を通過させ、中空キャピラリー内に回収する方法には、中空キャピラリーを核膜に密着させた状態で一定時間インキュベーションすればよい。より積極的に、キャピラリー内部をプラス、キャピラリー外部をマイナスにすることで成熟ｍＲＮＡを強制的に中空キャピラリー内に引き込んでもよい。ただし、この場合は細胞に何等かの影響を与える可能性がある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生きた細胞から損傷が少なく、かつ成熟したｍＲＮＡを採取する方法および装置を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施例１）
図１は本発明の成熟ｍＲＮＡ取得の実施例１の処理の流れを示す概略図である。
【００１５】
工程１は準備過程を示す図であり、ｍＲＮＡを採取する対象の細胞とｍＲＮＡ分取装置のキャピラリーとを目視のための顕微鏡の視野の部分に配置したときの概要を示す。１は細胞（ここではヒトやマウスや植物などの核を有する細胞を想定している）。２は細胞質、３は細胞核、４は細胞質と核を仕切る核膜をあらわす。５はキャピラリーであり、細胞に与える物理的なダメージを少なくするために、先端７（細胞に挿入される部分）の直径を細胞に対して１／５以下程度とする。キャピラリー５はＸ、Ｙ、Ｘ軸の移動に加え、先端角度が変えられる冶具８に取り付けられている。また、キャピラリー５の内部には、細胞の培養に使用される種類のバッファが入れられている。冶具８は水圧で駆動される駆動装置９に取り付けられている。駆動装置９から冶具８への動力伝達は水圧を利用する。さらにキャピラリー５にはマイクロシリンジポンプ１０が取り付けられており、キャピラリー５の内部を自在に陰陽圧状態とすることができる。
【００１６】
ここでは、図示されていないが、細胞１の損傷を防ぐためにも、細胞１とキャピラリー５の先端部は、顕微鏡の視野の部分に設けられた観察ガラス板の上に形成された細胞の培養に使用される種類のバッファの液滴の中にあるようになされ、以下の処理は、全て、液滴中で行われる。
【００１７】
工程２に示すように、顕微鏡で目視しながらキャピラリー５の先端７で標的細胞１の細胞膜を突き破る。
【００１８】
次に、工程３で、顕微鏡で目視しながらキャピラリー先端７を核膜４に接触させる。参照番号１１で示すように、キャピラリー先端７の核膜４への接触が確認されたら、キャピラリー先端７を核膜４に密着させる。この際、核膜４を破らないように、駆動装置９の操作は、慎重に行う。次いで、マイクロシリンジポンプ１０を作動させキャピラリー５の内部を陰圧とする。ここで、重要なのは、マイクロシリンジポンプでの陰圧の度合いである。核膜４が敗れない程度の圧力で、吸引するわけであるが、細胞の種類や状態により、実施者が顕微鏡で観察しながら、慎重に行う必要がある。これで、キャピラリー先端と核膜の密着が確保される。この状態で所定時間（たとえば５分間）キャピラリー先端を核膜に密着させて吸引をした後、キャピラリー５の内部を常圧に戻し、キャピラリーを静かに細胞１から引き抜く。
【００１９】
次に、工程４でキャピラリーの周りを１５ｍＭのＮａＯＨですばやく洗浄した後、水で洗浄し、キャピラリー５の周りに付着している核酸成分やタンパク質成分などを除去する。
【００２０】
次に、核膜４を通過したｍＲＮＡを含むと考えられるキャピラリー５の内部溶液を３８４ウェルマイクロプレートのウェル１２に排出する。
【００２１】
以上の処理により、核膜４を通過したｍＲＮＡを得ることができる。
【００２２】
図２は、図１の工程１から工程５までで得られるｍＲＮＡの内、ほぼ完全長のものだけをｃＤＮＡに変換する工程の概要を説明する図である。この工程で採用された反応はY.Suzuki, K.Y.Nakagawa, K. Murayama, A. Suyama, and S. Sugano, Gene 200, 146-156 (1997)記載の方法を改変して用いた。すなわち、実施例１では、採取されるｍＲＮＡ量がサブピコグラム以下と想定されるので、通常のマイクログラムスケールのｍＲＮＡを扱うプロトコールでは対処できない。そこで、反応体積を極限までに少なくするのが有効であり、この考え方で処理される。
【００２３】
まず、ステップＡは、工程５で得られマイクロプレートのウェル１２に入れられたキャピラリー５の内液のｍＲＮＡ１４の構造を示す。キャピラリー５の内液に、直ちに０．１ユニットのtobacco acid pyrophospataseを反応させる（ステップＢ）。反応は、１ｍＭのＥＤＴＡと５ｍＭの２−メルカプトエタノールとＲＮａｓｅインヒビターである１ユニットのＲＮａｓｉｎを含む５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０分間行う。反応容積は０．５μｌである。この処理で、ｍＲＮＡ１４のキャップ構造１５が除去され、５’末端がリン酸化（１６）されたｍＲＮＡ１７を得る。
【００２４】
次に、ｍＲＮＡ１７に対して、ＲＮＡリガーゼ（１０ユニット）を用いて、アダプター配列１８を導入した改変ｍＲＮＡ１９を得る（ステップＣ）。アダプター配列は、例えば、
５’−ＡＧＣＡＵＣＧＡＧＵＣＧＧＣＣＵＵＧＵＵＧＧＣＣＵＡＣＵＧＧ−３’ （配列番号１）
である。反応は、５ｍＭのＭｇＣｌ２と２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＡＴＰ、２５％ＰＲＧ８０００と１ユニットのＲＮａｓｉｎを含む５ｍＭの５０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ７．５）を１６時間作用させる。反応体積は５μｌである。次に２６塩基長のポリＴ（Ｔ２６）の３’末端に５塩基長のランダム配列が結合したオリゴＤＮＡプライマー付磁気ビーズ（粒径２．１μｍ、実行プライマー量２ｐｍｌ）と逆転写酵素を添加し４２℃２時間で逆転写を行い、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成する（ステップＤ）。ここで、ランダム配列付ポリＴを使う理由は、ポリＴだけではｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの安定性が十分確保できないためである。
【００２５】
次に１５ｍＭのＮａＯＨで洗浄し、さらに１５ｍＭのＮａＯＨ中で６５℃１０分間反応させることで、ＲＮＡを分解除去する。以上で１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ２０が得られる。必要に応じてアダプター配列とランダム配列付ポリＴ（Ｔ２６）各々２ｐｍｏｌを加え１０μｌスケールでＰＣＲし、２本鎖ｃＤＮＡを得る。ランダム配列付ポリＴ（Ｔ２６）を磁気ビーズのついていないものを使えば溶液中に多量のｃＤＮＡ増幅生成物が得られる。このようにして得られるｃＤＮＡのほとんどはキャップ構造からポリＡ配列までの完全長ｃＤＮＡである。
【００２６】
実施例１で、具体的に、大腸がん細胞の核膜を通過するｍＲＮＡを得る例を具体的に検証すると以下のようである。
【００２７】
実施例１で得られる、実質的に完全長と思われる１本鎖ｃＤＮＡの混合物に、アダプター配列の一部
５’−ＡＧＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧ−３’（Ｔｍ＝６９℃） （配列番号２）
と、Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 1（ＴＡＣＳＴＤ１）に特異的な配列
５’−ＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＡ−３’（Ｔｍ＝６６℃） （配列番号３）
をプライマーとしてＰＣＲ増幅を試みる。ＴＡＣＳＴＤ１由来の完全長のｍＲＮＡが含まれる場合は、配列から予想して８５０ｂｐ程度のＰＣＲ産物が得られるはずである。
【００２８】
ここでＴｍはBreslauer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83, 3746-50(1986)記載の方法にしたがってプログラムされたインターネットサイト：Ｔｍ Determination, Virtual Genome Center, 7 Aug 1995作成、http://alces.med.umn.edu/rawtm.htmlを使用して、プライマー濃度２００ｎＭ、塩濃度５０ｍＭとして計算した。ＴＡＣＳＴＤ１に関する配列情報は、ＴＡＣＳＴＤ１に関するｍＲＮＡコード名ＮＭ＿００２３５４を用いて、National Institute of Helth作成のNational Center for Biotechnology Informationホームページ（Revised: July 16, 2004.）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を用いて検索した。実際のＰＣＲに関しては、前記した用に最初１０μｌスケールで、プライマー濃度２００ｎＭ、９４℃変性３０秒間、アニール６０℃３０秒間、ポリメラーゼ反応７２℃２分間で１５回行う。
【００２９】
次にこの増幅産物を含むサンプル１μｌをＰＣＲ反応液５０μｌに加え、同じ条件で３５回行う２段階ＰＣＲで増幅する。ＰＣＲ増幅によって得られた溶液を日立ハイテクノロジーズ販売のｉ−チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。
【００３０】
その結果、複数のバンドが検出されるが、そのうち一本は８５０ｂｐの位置に電気泳動分離バンドが得られる。これは、データベースから予想されるｍＲＮＡ産物の塩基長とほぼ一致する。上記プライマーの配列上の位置は、完全長ｍＲＮＡの５’末端に導入したアダプター配列と、コード名ＮＭ＿００２３５４記載のｍＲＮＡ配列の７９６〜８１８番目に相補である。この配列部分はエキソン６の中にある。上記ＮＣＢＩのデータベースによればＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡは１５２８塩基長であるので、ｍＲＮＡの５’末端側の半分以上の部分をカバーしていることになる。逆転写のときにポリエテールを含むものを調製するプロトコールを使用しているので、実施例１のように５’末端近傍の配列が増幅できれば、実質完全長ｃＤＮＡが得られていると考えて良い。
【００３１】
また、核内のプレカーサーｍＲＮＡやゲノムがコンタミしている場合は、イントロン部分に対応するプライマーでＰＣＲを行ってみることで判断することができる。上記配列番号３のプライマーとエキソン５とエキソン６の間に位置するイントロン配列
ＡＡＧＧＡＡＣＡＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＴＡＧＡＴＴ （Ｔｍ＝６１℃）（配列番号４）
で増幅を試みる。上記ＰＣＲ条件と同じ条件で２段階増幅を行ったが、データベースより予想される２１１ｂｐ前後にピークは検出されない。
【００３２】
以上の結果より、実施例１の方法で、核膜４を通過するｍＲＮＡを直接回収することで、完全長ｍＲＮＡを効率よく得ることができる。細胞全体をすりつぶすと、核に含まれるプレカーサーｍＲＮＡも同時に回収されてしまうが、実施例１を用いるとそのような問題を回避することができる。また、キャピラリー５の先端７は核膜４に接触（密着）しているだけなので、細胞をそのままの状態で生かしておくことができる。あるいは、一旦、キャピラリー５を抜いて、所要の時間後に再度キャピラリー５をさしてｍＲＮＡを得ることもできる。このように細胞を殺さずにｍＲＮＡを得ることができるメリットがある。
【００３３】
（実施例２）
図３は、実施例２の成熟ｍＲＮＡ取得の処理の流れの最初の段階（工程１）を示す概略図である。図３は、図１の工程１に対応する図であり、両者を対比して明らかなように、細胞１とキャピラリー５が、観察ガラス板３９の上におかれ、これらが液滴４０内におかれるものであることを模式的示す。さらに、キャピラリー５内には電極４１が配置され、これに接続されている導線４２が引き出されるとともに、細胞１の細胞質２の部分に電極４３が配置され、これに接続されている導線４４が引き出される状態を示す。導線４４は、バッファの液滴４０とは電気的に絶縁されている。実施例２における、実施例１に対応する他の工程は、図３において説明した電極と導線が加わっているだけなので、図示は省略する。
【００３４】
実施例２においては、新たに導入された電極と導線とが、実施例１で説明した工程３で威力を発する。すなわち、実施例１では、顕微鏡で目視しながらキャピラリー先端７を核膜４に接触させるのみであったが、実施例２では、電極４１と電極４３との間の電気伝導度を利用することができるので、キャピラリー先端７を核膜４に接触させ、密着させる過程を電気伝導度で監視できる。すなわち、キャピラリー５の先端７が細胞質２にあるうちは、電極４１と電極４３との間の電気伝導度はきわめて大きい（短絡状態）が、キャピラリー５の先端７が細胞１の核膜４へ接触すると、電極４１と電極４３との間の電気伝導度は大きくなる。しかも、ある程度密着させることで電気伝導度はより大きくなる。
【００３５】
従って、実施例２においては、目視によりキャピラリー５の先端７が細胞１の核膜４への接触を制御するとともに、電極４１と電極４３との間の電気伝導度をチェックすることにより、より容易にキャピラリー５の先端７が細胞１の核膜４への接触および密着を管理することができる。
【００３６】
さらに、電極４１と４３を設けることは、成熟ｍＲＮＡをキャピラリー５の中に引き込む上で利用することができる。すなわち、電極４１を正極、電極４３を負極とし、両者の間に１０Ｖ／ｃｍ程度の電圧をかけることで、本来負電荷をもつｍＲＮＡをキャピラリー内に電気泳動的に引き込むことができる。このとき細胞には数十ｍＶの電界がかかるので、細胞によっては影響を受けるものがあるが、ｍＲＮＡを短時間で回収できるメリットがある。
【００３７】
（実施例３）
図４（ａ）−（ｃ）は、実施例１あるいは実施例２で使用できるキャピラリー５の先端部の構成例を説明する図である。
【００３８】
図４−ａ）ではキャピラリー５の内側に仕切り２１が、キャピラリー５の先端近くまで形成されている例である。これによれば、キャピラリー５内に、仕切り２１で区分された流路２２−１と２２−２が形成される。したがって、工程３でマイクロシリンジポンプ１０を作動させキャピラリー５の内部を陰圧として密着させ、核３内のｍＲＮＡを採取する時に、キャピラリー内の液を２３のように片方の流路から他方の流路に流して採取することができる。
【００３９】
図４−ｂ）はキャピラリー５の先端近くまでに第２のキャピラリー２６を挿入した構造で流路２７−１と２７−２を形成している。工程３でマイクロシリンジポンプ１０を作動させキャピラリー５の内部を陰圧として、核３内のｍＲＮＡを採取する。その後、キャピラリー内の液を先端部の隙間を使って２８のように外側の流路から内側の流路に流して採取することができる。第２のキャピラリー２６はキャピラリー５の中に差し込まれておればよく、別段固定しなくても上記機能を発揮する。
【００４０】
図４−ｃ）は図４−ｂ）と同様であるが、キャピラリー５の中に設ける内側のキャピラリー３２が３２−１から３２−５までの５本とされた例である。この例では、たとえば、５分間の吸引の時間のうち、１分間ずつ３２−２から３２−４の各１本のみを所定の陰圧として吸引を行い、３２−１からバッファを供給する。他のキャピラリーは弱い陰圧としておき、実質、液の移動がないようにしておく。そうすると、４本のキャピラリーにそれぞれ異なった時点のｍＲＮＡが吸引されることになる。
【００４１】
さらに、図５はキャピラリー５を細胞に挿入する操作により細胞が受ける損傷を低減するための工夫について説明する図である。
【００４２】
図５（Ａ）は、キャピラリー５の先端部に、酸化チタンＴｉＯ２が固定された領域５０を設けた例である。こうすると、キャピラリー５の先端部を細胞１に刺すときに、３３５ｎｍの紫外線を照射すると、コートされた酸化チタンの有機物分解作用により容易に細胞１に刺さり、細胞１の損傷も少ない。具体的には、細胞膜にキャピラリー５の先端に上記紫外線を照射しながら細胞膜を通過させる。先端が細胞膜を通過し、細胞質に達したところで紫外線照射を停止する。続けてキャピラリー先端を核膜に接触させる。核膜に接触させるときは核膜の損傷を防ぐために紫外線を照射しない。先端が核膜に達したところで、実施例１と同様に慎重に吸引し、核膜とキャピラリー先端を密着させる。5分間放置し、核膜を通過してくるｍＲＮＡをキャピラリー内部に拡散させ回収する。
【００４３】
図５（Ｂ）は、キャピラリー５の先端部に、酸化チタンＴｉＯ２が固定された領域５０を設けるのに加えて、アルギニン４８が固定されている例である。固定するアルギニンはアミノ酸１個でも良いし、オクタマーまでの長さでも良い。固定法はＰＮＡ（ペプチドヌクレイックアシド）を固定する溶液に１／４０モル比で加えておいて、キャピラリー５の先端部全体に満遍なく固定するのが良い。この例でも、先端部のＴｉＯ２が固定された先端部が細胞膜を通過するときに３３５ｎｍの紫外線を照射する。その後は紫外線照射を停止し、引き続き先端が核膜に達するまでキャピラリーを細胞に差し込む。アルギニン４８と細胞膜の脂質二重層のリン酸基部分との相互作用によりスムーズにキャピラリーを差し込むことができる。
【００４４】
ここで、図５で説明したキャピラリー５の先端部は、図４（ａ）−（ｃ）で説明した構造であっても良いことは言うまでも無い。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> A method of Preparation of ｍＲＮＡ and its preparation device
<130> NT04P0968
<160> 4
<210> 1
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg 30
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agcatcgagt cggccttgtt g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagccacatc agctatgtcc aca 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaggaacagt gatgcatgta gatt 24
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の成熟ｍＲＮＡ取得の実施例１の処理の流れを示す概略図。
【図２】図１の工程１から工程５までで得られるｍＲＮＡの内、ほぼ完全長のものだけをｃＤＮＡに変換する工程の概要を説明する図。
【図３】実施例２の成熟ｍＲＮＡ取得の処理の流れの最初の段階（工程１）を示す概略図。
【図４】（ａ）−（ｃ）は実施例１あるいは実施例２で使用できるキャピラリー５の先端部の構成例を説明する図。
【図５】（Ａ）、（Ｂ）はキャピラリー５を細胞に挿入する操作により細胞が受ける損傷を低減するための工夫について説明する図。
【符号の説明】
【００４６】
１…細胞、２…細胞質、３…細胞核、４…細胞質と核を仕切る核膜、５…キャピラリー、７…キャピラリーの先端、８…冶具、９…駆動装置、１０…マイクロシリンジポンプ、１２…マイクロプレートのウェル、１４…ｍＲＮＡ、１５…ｍＲＮＡのキャップ構造、１７…５’末端がリン酸化されたｍＲＮＡ、１８…アダプター配列、１９…アダプター配列を導入した改変ｍＲＮＡ、２０…１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ、２１…仕切り、２２−１，２２−２…流路、２３…液の流れ、２６…第２のキャピラリー、２７−１，２７−２…流路、２８…液の流れ、３２−１〜３２−５…内側のキャピラリー、４１，４３…電極、４２，４４…導線、３９…観察ガラス板、４８…アルギニン、５０…酸化チタンＴｉＯ２が固定された領域。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内のｍＲＮＡ、あるいは特に成熟ｍＲＮＡを細胞を殺すこと無しに得る方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている（非特許文献１あるいは非特許文献２）。あるいは、採取した試料に含まれる特定の配列のｍＲＮＡ（あるいはｃＤＮＡ）をＰＣＲ増幅して得られる産物の量やＰＣＲ産物長、塩基配列を調べる方法が用いられている。
【０００３】
これら分離したｍＲＮＡは単に分析目的で用いられる以外にこれをｃＤＮＡに変換し、ベクターに組み込んだりして色々の目的に利用されている。一例として言えば、採取したｍＲＮＡをベクターに組み込み、クローニングした後、ベクターを鋳型にして部分的に異なる塩基を持つプライマーで相補鎖合成し、任意の遺伝子改変を施す遺伝子組換えに用いられている。
【０００４】
ところが、多くの生命は外界の状況や細胞自身の分化、加齢により、同一遺伝子から異なるｍＲＮＡが産出されることが数多く報告されている。この現象はスプライシングバリアントとかオルターナティブスプライシングと呼ばれている。これは、プレマチュアーなｍＲＮＡがゲノムより転写された後、エピジェネティックな制御（遺伝子では完全に制御されないで、酵素などの反応で成り立つ制御）により状況に応じて異なるエキソンが使われて成熟ｍＲＮＡが作られるためである。あるいは免疫細胞系のＴ細胞やＢ細胞のように、免疫幹細胞からの分化の過程で、ゲノムそのものの配列が再構成されたり変異が導入されたりするためである。
【０００５】
さらに、細胞のガン化においては、遺伝子の配列において、タンパク質翻訳レベルでのアミノ酸変異やタンパク質が作られなくなってしまうような変異が起きたり、ＬＯＨ（loss of heterozygosity）のように１対の遺伝子のうち片方の遺伝子が消失してしまったりするケースが数多く存在する。
【０００６】
このような変異は、細胞にとって普遍的なことではないので、理想的には同一細胞から連続的にｍＲＡＮなりタンパク質を分離して分析できるようにする必要がある。
【０００７】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術でｍＲＮＡを分取しようとすると、試料である細胞や組織を破砕して細胞内に存在するｍＲＮＡを抽出するので、もとの細胞は死んでしまう。このため、同一細胞から異なった時点に複数回に亘ってｍＲＮＡを得ることができなくなってしまう。また、細胞や組織を破砕した全体からｍＲＮＡを抽出するのでゲノムのコンタミネーション防止に細心の注意を払って行う必要がある。さらに、ゲノムから転写されたプレマチュアーなプレカーサーｍＲＮＡと実際に細胞質で機能する成熟ｍＲＮＡはその長さも配列も異なる。
【０００９】
このため、細胞をすりつぶした試料からｍＲＮＡを得ようとすると解析が困難になり、あるいは、得たｍＲＮＡを利用しようとすると必ずしも希望のものが得られないケースがあり、問題となっている。
【００１０】
これを解決する技術として、界面活性剤であるＮＰ−４０を利用して細胞膜にランダムに穴を開け、細胞質に含まれるｍＲＮＡを細胞の外に溶出させて回収する方法がある。確かにこの方法でプレカーサーｍＲＮＡの分取に成功する可能性が高いが、一旦、核から細胞質に移行したｍＲＮＡはＲＮａｓｅの攻撃を受けやすくなる。事実、成熟ｍＲＮＡのキャップ構造からポリＡまでを含む完全長ｍＲＮＡを得ようとすると、キャップを認識して切断、ライゲーションによる既知配列の導入、逆転写ＰＣＲと行った複雑な工程が必要で、完全長ｍＲＮＡの回収率も悪い。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの問題点を解決するために、本発明では、生きた細胞から損傷が少なく、かつ成熟したｍＲＮＡを採取する方法および装置を提供することにある。細胞は使い切りではなく生かしたまま、必要に応じて複数回ｍＲＮＡやタンパク質の解析ができる方法を提案することを目的とする。
【００１２】
ｍＲＮＡは核内ではプレカーサーｍＲＮＡの形で存在し、核膜を通過するときに成熟ｍＲＮＡとなる。また、核膜を通過した後は、一方的にＲＮａｓｅの攻撃を受け分解されるだけである。よって、発明者らは成熟ｍＲＮＡを得るには核膜を通過した直後に、細胞質と接触しない状態で回収すれば、プレカーサーｍＲＮＡを含まないで成熟ｍＲＮＡを採取できることに気づいた。具体的には、中空キャピラリーを核膜を突き破らないで核膜に密着させ、細胞質からシールドされた状態で成熟ｍＲＮＡを得ることができる。中空キャピラリーを核膜に密着させる方法としては、たとえば中空キャピラリー先端を核膜に接触させた後、中空キャピラリー内を陰圧にすることで達成できる。成熟ｍＲＮＡを核膜を通過させ、中空キャピラリー内に回収する方法には、中空キャピラリーを核膜に密着させた状態で一定時間インキュベーションすればよい。より積極的に、キャピラリー内部をプラス、キャピラリー外部をマイナスにすることで成熟ｍＲＮＡを強制的に中空キャピラリー内に引き込んでもよい。ただし、この場合は細胞に何等かの影響を与える可能性がある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生きた細胞から損傷が少なく、かつ成熟したｍＲＮＡを採取する方法および装置を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施例１）
図１は本発明の成熟ｍＲＮＡ取得の実施例１の処理の流れを示す概略図である。
【００１５】
工程１は準備過程を示す図であり、ｍＲＮＡを採取する対象の細胞とｍＲＮＡ分取装置のキャピラリーとを目視のための顕微鏡の視野の部分に配置したときの概要を示す。１は細胞（ここではヒトやマウスや植物などの核を有する細胞を想定している）。２は細胞質、３は細胞核、４は細胞質と核を仕切る核膜をあらわす。５はキャピラリーであり、細胞に与える物理的なダメージを少なくするために、先端７（細胞に挿入される部分）の直径を細胞に対して１／５以下程度とする。キャピラリー５はＸ、Ｙ、Ｘ軸の移動に加え、先端角度が変えられる冶具８に取り付けられている。また、キャピラリー５の内部には、細胞の培養に使用される種類のバッファが入れられている。冶具８は水圧で駆動される駆動装置９に取り付けられている。駆動装置９から冶具８への動力伝達は水圧を利用する。さらにキャピラリー５にはマイクロシリンジポンプ１０が取り付けられており、キャピラリー５の内部を自在に陰陽圧状態とすることができる。
【００１６】
ここでは、図示されていないが、細胞１の損傷を防ぐためにも、細胞１とキャピラリー５の先端部は、顕微鏡の視野の部分に設けられた観察ガラス板の上に形成された細胞の培養に使用される種類のバッファの液滴の中にあるようになされ、以下の処理は、全て、液滴中で行われる。
【００１７】
工程２に示すように、顕微鏡で目視しながらキャピラリー５の先端７で標的細胞１の細胞膜を突き破る。
【００１８】
次に、工程３で、顕微鏡で目視しながらキャピラリー先端７を核膜４に接触させる。参照番号１１で示すように、キャピラリー先端７の核膜４への接触が確認されたら、キャピラリー先端７を核膜４に密着させる。この際、核膜４を破らないように、駆動装置９の操作は、慎重に行う。次いで、マイクロシリンジポンプ１０を作動させキャピラリー５の内部を陰圧とする。ここで、重要なのは、マイクロシリンジポンプでの陰圧の度合いである。核膜４が敗れない程度の圧力で、吸引するわけであるが、細胞の種類や状態により、実施者が顕微鏡で観察しながら、慎重に行う必要がある。これで、キャピラリー先端と核膜の密着が確保される。この状態で所定時間（たとえば５分間）キャピラリー先端を核膜に密着させて吸引をした後、キャピラリー５の内部を常圧に戻し、キャピラリーを静かに細胞１から引き抜く。
【００１９】
次に、工程４でキャピラリーの周りを１５ｍＭのＮａＯＨですばやく洗浄した後、水で洗浄し、キャピラリー５の周りに付着している核酸成分やタンパク質成分などを除去する。
【００２０】
次に、核膜４を通過したｍＲＮＡを含むと考えられるキャピラリー５の内部溶液を３８４ウェルマイクロプレートのウェル１２に排出する。
【００２１】
以上の処理により、核膜４を通過したｍＲＮＡを得ることができる。
【００２２】
図２は、図１の工程１から工程５までで得られるｍＲＮＡの内、ほぼ完全長のものだけをｃＤＮＡに変換する工程の概要を説明する図である。この工程で採用された反応はY.Suzuki, K.Y.Nakagawa, K. Murayama, A. Suyama, and S. Sugano, Gene 200, 146-156 (1997)記載の方法を改変して用いた。すなわち、実施例１では、採取されるｍＲＮＡ量がサブピコグラム以下と想定されるので、通常のマイクログラムスケールのｍＲＮＡを扱うプロトコールでは対処できない。そこで、反応体積を極限までに少なくするのが有効であり、この考え方で処理される。
【００２３】
まず、ステップＡは、工程５で得られマイクロプレートのウェル１２に入れられたキャピラリー５の内液のｍＲＮＡ１４の構造を示す。キャピラリー５の内液に、直ちに０．１ユニットのtobacco acid pyrophospataseを反応させる（ステップＢ）。反応は、１ｍＭのＥＤＴＡと５ｍＭの２−メルカプトエタノールとＲＮａｓｅインヒビターである１ユニットのＲＮａｓｉｎを含む５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０分間行う。反応容積は０．５μｌである。この処理で、ｍＲＮＡ１４のキャップ構造１５が除去され、５’末端がリン酸化（１６）されたｍＲＮＡ１７を得る。
【００２４】
次に、ｍＲＮＡ１７に対して、ＲＮＡリガーゼ（１０ユニット）を用いて、アダプター配列１８を導入した改変ｍＲＮＡ１９を得る（ステップＣ）。アダプター配列は、例えば、
５’−ＡＧＣＡＵＣＧＡＧＵＣＧＧＣＣＵＵＧＵＵＧＧＣＣＵＡＣＵＧＧ−３’ （配列番号１）
である。反応は、５ｍＭのＭｇＣｌ２と２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＡＴＰ、２５％ＰＲＧ８０００と１ユニットのＲＮａｓｉｎを含む５ｍＭの５０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ７．５）を１６時間作用させる。反応体積は５μｌである。次に２６塩基長のポリＴ（Ｔ２６）の３’末端に５塩基長のランダム配列が結合したオリゴＤＮＡプライマー付磁気ビーズ（粒径２．１μｍ、実行プライマー量２ｐｍｌ）と逆転写酵素を添加し４２℃２時間で逆転写を行い、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成する（ステップＤ）。ここで、ランダム配列付ポリＴを使う理由は、ポリＴだけではｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの安定性が十分確保できないためである。
【００２５】
次に１５ｍＭのＮａＯＨで洗浄し、さらに１５ｍＭのＮａＯＨ中で６５℃１０分間反応させることで、ＲＮＡを分解除去する。以上で１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ２０が得られる。必要に応じてアダプター配列とランダム配列付ポリＴ（Ｔ２６）各々２ｐｍｏｌを加え１０μｌスケールでＰＣＲし、２本鎖ｃＤＮＡを得る。ランダム配列付ポリＴ（Ｔ２６）を磁気ビーズのついていないものを使えば溶液中に多量のｃＤＮＡ増幅生成物が得られる。このようにして得られるｃＤＮＡのほとんどはキャップ構造からポリＡ配列までの完全長ｃＤＮＡである。
【００２６】
実施例１で、具体的に、大腸がん細胞の核膜を通過するｍＲＮＡを得る例を具体的に検証すると以下のようである。
【００２７】
実施例１で得られる、実質的に完全長と思われる１本鎖ｃＤＮＡの混合物に、アダプター配列の一部
５’−ＡＧＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧ−３’（Ｔｍ＝６９℃） （配列番号２）
と、Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 1（ＴＡＣＳＴＤ１）に特異的な配列
５’−ＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＣＡＣＡ−３’（Ｔｍ＝６６℃） （配列番号３）
をプライマーとしてＰＣＲ増幅を試みる。ＴＡＣＳＴＤ１由来の完全長のｍＲＮＡが含まれる場合は、配列から予想して８５０ｂｐ程度のＰＣＲ産物が得られるはずである。
【００２８】
ここでＴｍはBreslauer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83, 3746-50(1986)記載の方法にしたがってプログラムされたインターネットサイト：Ｔｍ Determination, Virtual Genome Center, 7 Aug 1995作成、http://alces.med.umn.edu/rawtm.htmlを使用して、プライマー濃度２００ｎＭ、塩濃度５０ｍＭとして計算した。ＴＡＣＳＴＤ１に関する配列情報は、ＴＡＣＳＴＤ１に関するｍＲＮＡコード名ＮＭ＿００２３５４を用いて、National Institute of Helth作成のNational Center for Biotechnology Informationホームページ（Revised: July 16, 2004.）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を用いて検索した。実際のＰＣＲに関しては、前記した用に最初１０μｌスケールで、プライマー濃度２００ｎＭ、９４℃変性３０秒間、アニール６０℃３０秒間、ポリメラーゼ反応７２℃２分間で１５回行う。
【００２９】
次にこの増幅産物を含むサンプル１μｌをＰＣＲ反応液５０μｌに加え、同じ条件で３５回行う２段階ＰＣＲで増幅する。ＰＣＲ増幅によって得られた溶液を日立ハイテクノロジーズ販売のｉ−チップ（マイクロ電気泳動チップ）とコスモ−ｉチップ電気泳動装置で解析する。
【００３０】
その結果、複数のバンドが検出されるが、そのうち一本は８５０ｂｐの位置に電気泳動分離バンドが得られる。これは、データベースから予想されるｍＲＮＡ産物の塩基長とほぼ一致する。上記プライマーの配列上の位置は、完全長ｍＲＮＡの５’末端に導入したアダプター配列と、コード名ＮＭ＿００２３５４記載のｍＲＮＡ配列の７９６〜８１８番目に相補である。この配列部分はエキソン６の中にある。上記ＮＣＢＩのデータベースによればＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡは１５２８塩基長であるので、ｍＲＮＡの５’末端側の半分以上の部分をカバーしていることになる。逆転写のときにポリエテールを含むものを調製するプロトコールを使用しているので、実施例１のように５’末端近傍の配列が増幅できれば、実質完全長ｃＤＮＡが得られていると考えて良い。
【００３１】
また、核内のプレカーサーｍＲＮＡやゲノムがコンタミしている場合は、イントロン部分に対応するプライマーでＰＣＲを行ってみることで判断することができる。上記配列番号３のプライマーとエキソン５とエキソン６の間に位置するイントロン配列
ＡＡＧＧＡＡＣＡＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＴＡＧＡＴＴ （Ｔｍ＝６１℃）（配列番号４）
で増幅を試みる。上記ＰＣＲ条件と同じ条件で２段階増幅を行ったが、データベースより予想される２１１ｂｐ前後にピークは検出されない。
【００３２】
以上の結果より、実施例１の方法で、核膜４を通過するｍＲＮＡを直接回収することで、完全長ｍＲＮＡを効率よく得ることができる。細胞全体をすりつぶすと、核に含まれるプレカーサーｍＲＮＡも同時に回収されてしまうが、実施例１を用いるとそのような問題を回避することができる。また、キャピラリー５の先端７は核膜４に接触（密着）しているだけなので、細胞をそのままの状態で生かしておくことができる。あるいは、一旦、キャピラリー５を抜いて、所要の時間後に再度キャピラリー５をさしてｍＲＮＡを得ることもできる。このように細胞を殺さずにｍＲＮＡを得ることができるメリットがある。
【００３３】
（実施例２）
図３は、実施例２の成熟ｍＲＮＡ取得の処理の流れの最初の段階（工程１）を示す概略図である。図３は、図１の工程１に対応する図であり、両者を対比して明らかなように、細胞１とキャピラリー５が、観察ガラス板３９の上におかれ、これらが液滴４０内におかれるものであることを模式的示す。さらに、キャピラリー５内には電極４１が配置され、これに接続されている導線４２が引き出されるとともに、細胞１の細胞質２の部分に電極４３が配置され、これに接続されている導線４４が引き出される状態を示す。導線４４は、バッファの液滴４０とは電気的に絶縁されている。実施例２における、実施例１に対応する他の工程は、図３において説明した電極と導線が加わっているだけなので、図示は省略する。
【００３４】
実施例２においては、新たに導入された電極と導線とが、実施例１で説明した工程３で威力を発する。すなわち、実施例１では、顕微鏡で目視しながらキャピラリー先端７を核膜４に接触させるのみであったが、実施例２では、電極４１と電極４３との間の電気伝導度を利用することができるので、キャピラリー先端７を核膜４に接触させ、密着させる過程を電気伝導度で監視できる。すなわち、キャピラリー５の先端７が細胞質２にあるうちは、電極４１と電極４３との間の電気伝導度はきわめて大きい（短絡状態）が、キャピラリー５の先端７が細胞１の核膜４へ接触すると、電極４１と電極４３との間の電気伝導度は大きくなる。しかも、ある程度密着させることで電気伝導度はより大きくなる。
【００３５】
従って、実施例２においては、目視によりキャピラリー５の先端７が細胞１の核膜４への接触を制御するとともに、電極４１と電極４３との間の電気伝導度をチェックすることにより、より容易にキャピラリー５の先端７が細胞１の核膜４への接触および密着を管理することができる。
【００３６】
さらに、電極４１と４３を設けることは、成熟ｍＲＮＡをキャピラリー５の中に引き込む上で利用することができる。すなわち、電極４１を正極、電極４３を負極とし、両者の間に１０Ｖ／ｃｍ程度の電圧をかけることで、本来負電荷をもつｍＲＮＡをキャピラリー内に電気泳動的に引き込むことができる。このとき細胞には数十ｍＶの電界がかかるので、細胞によっては影響を受けるものがあるが、ｍＲＮＡを短時間で回収できるメリットがある。
【００３７】
（実施例３）
図４（ａ）−（ｃ）は、実施例１あるいは実施例２で使用できるキャピラリー５の先端部の構成例を説明する図である。
【００３８】
図４−ａ）ではキャピラリー５の内側に仕切り２１が、キャピラリー５の先端近くまで形成されている例である。これによれば、キャピラリー５内に、仕切り２１で区分された流路２２−１と２２−２が形成される。したがって、工程３でマイクロシリンジポンプ１０を作動させキャピラリー５の内部を陰圧として密着させ、核３内のｍＲＮＡを採取する時に、キャピラリー内の液を２３のように片方の流路から他方の流路に流して採取することができる。
【００３９】
図４−ｂ）はキャピラリー５の先端近くまでに第２のキャピラリー２６を挿入した構造で流路２７−１と２７−２を形成している。工程３でマイクロシリンジポンプ１０を作動させキャピラリー５の内部を陰圧として、核３内のｍＲＮＡを採取する。その後、キャピラリー内の液を先端部の隙間を使って２８のように外側の流路から内側の流路に流して採取することができる。第２のキャピラリー２６はキャピラリー５の中に差し込まれておればよく、別段固定しなくても上記機能を発揮する。
【００４０】
図４−ｃ）は図４−ｂ）と同様であるが、キャピラリー５の中に設ける内側のキャピラリー３２が３２−１から３２−５までの５本とされた例である。この例では、たとえば、５分間の吸引の時間のうち、１分間ずつ３２−２から３２−４の各１本のみを所定の陰圧として吸引を行い、３２−１からバッファを供給する。他のキャピラリーは弱い陰圧としておき、実質、液の移動がないようにしておく。そうすると、４本のキャピラリーにそれぞれ異なった時点のｍＲＮＡが吸引されることになる。
【００４１】
さらに、図５はキャピラリー５を細胞に挿入する操作により細胞が受ける損傷を低減するための工夫について説明する図である。
【００４２】
図５（Ａ）は、キャピラリー５の先端部に、酸化チタンＴｉＯ２が固定された領域５０を設けた例である。こうすると、キャピラリー５の先端部を細胞１に刺すときに、３３５ｎｍの紫外線を照射すると、コートされた酸化チタンの有機物分解作用により容易に細胞１に刺さり、細胞１の損傷も少ない。具体的には、細胞膜にキャピラリー５の先端に上記紫外線を照射しながら細胞膜を通過させる。先端が細胞膜を通過し、細胞質に達したところで紫外線照射を停止する。続けてキャピラリー先端を核膜に接触させる。核膜に接触させるときは核膜の損傷を防ぐために紫外線を照射しない。先端が核膜に達したところで、実施例１と同様に慎重に吸引し、核膜とキャピラリー先端を密着させる。5分間放置し、核膜を通過してくるｍＲＮＡをキャピラリー内部に拡散させ回収する。
【００４３】
図５（Ｂ）は、キャピラリー５の先端部に、酸化チタンＴｉＯ２が固定された領域５０を設けるのに加えて、アルギニン４８が固定されている例である。固定するアルギニンはアミノ酸１個でも良いし、オクタマーまでの長さでも良い。固定法はＰＮＡ（ペプチドヌクレイックアシド）を固定する溶液に１／４０モル比で加えておいて、キャピラリー５の先端部全体に満遍なく固定するのが良い。この例でも、先端部のＴｉＯ２が固定された先端部が細胞膜を通過するときに３３５ｎｍの紫外線を照射する。その後は紫外線照射を停止し、引き続き先端が核膜に達するまでキャピラリーを細胞に差し込む。アルギニン４８と細胞膜の脂質二重層のリン酸基部分との相互作用によりスムーズにキャピラリーを差し込むことができる。
【００４４】
ここで、図５で説明したキャピラリー５の先端部は、図４（ａ）−（ｃ）で説明した構造であっても良いことは言うまでも無い。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110> Onchip Cellomics Consortium
<120> A method of Preparation of ｍＲＮＡ and its preparation device
<130> NT04P0968
<160> 4
<210> 1
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg 30
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agcatcgagt cggccttgtt g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagccacatc agctatgtcc aca 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaggaacagt gatgcatgta gatt 24
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の成熟ｍＲＮＡ取得の実施例１の処理の流れを示す概略図。
【図２】図１の工程１から工程５までで得られるｍＲＮＡの内、ほぼ完全長のものだけをｃＤＮＡに変換する工程の概要を説明する図。
【図３】実施例２の成熟ｍＲＮＡ取得の処理の流れの最初の段階（工程１）を示す概略図。
【図４】（ａ）−（ｃ）は実施例１あるいは実施例２で使用できるキャピラリー５の先端部の構成例を説明する図。
【図５】（Ａ）、（Ｂ）はキャピラリー５を細胞に挿入する操作により細胞が受ける損傷を低減するための工夫について説明する図。
【符号の説明】
【００４６】
１…細胞、２…細胞質、３…細胞核、４…細胞質と核を仕切る核膜、５…キャピラリー、７…キャピラリーの先端、８…冶具、９…駆動装置、１０…マイクロシリンジポンプ、１２…マイクロプレートのウェル、１４…ｍＲＮＡ、１５…ｍＲＮＡのキャップ構造、１７…５’末端がリン酸化されたｍＲＮＡ、１８…アダプター配列、１９…アダプター配列を導入した改変ｍＲＮＡ、２０…１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ、２１…仕切り、２２−１，２２−２…流路、２３…液の流れ、２６…第２のキャピラリー、２７−１，２７−２…流路、２８…液の流れ、３２−１〜３２−５…内側のキャピラリー、４１，４３…電極、４２，４４…導線、３９…観察ガラス板、４８…アルギニン、５０…酸化チタンＴｉＯ２が固定された領域。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端部が細胞の核膜に接触させられる中空キャピラリー構造のチップ先端部と、
前記チップの内部を陰圧にするための手段と、
前記細胞の核膜と前記中空キャピラリー構造のチップ先端部との接触状態を目視するための手段と、
前記細胞の核膜と前記中空キャピラリー構造のチップ先端部との接触状態を目視による管理の下で中空キャピラリー構造のチップ先端部の位置を制御するための手段と、
を備えたことを特徴とする細胞の成熟ｍＲＮＡを採取するためのｍＲＮＡ分取装置。
【請求項２】
前記中空キャピラリー構造のチップ先端部内に保持されたバッファと前記細胞の一部との間の電気伝導度を計測する手段が付加された請求項１記載の細胞の成熟ｍＲＮＡを採取するためのｍＲＮＡ分取装置。
【請求項３】
ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺すこと、
前記中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に密着させること、
により、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取するｍＲＮＡ分取方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺す前に、中空キャピラリー内をバッファで充填する請求項３記載の細胞の成熟ｍＲＮＡを採取するためのｍＲＮＡ分取方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺し、該中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に密着させ、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取するｍＲＮＡ分取方法に使用される中空キャピラリーであって、該中空キャピラリーの先端部は（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）が外壁に固定されていることを特徴とする中空キャピラリー。
【請求項６】
前記（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）に代え、先端部にＴｉＯ２を固定した請求項５記載の中空キャピラリー。
【請求項７】
前記（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）とともに先端部にＴｉＯ２を固定した請求項５記載の中空キャピラリー。
【請求項８】
前記中空キャピラリーは、内部が同軸ないし仕切りにより独立した少なくとも２系統の空洞を有する構造のチップ先端部を有し、仕切りにより独立した少なくとも２系統の空洞のひとつないし複数からバッファを流し、他の空洞から連続的にｍＲＮＡを採取する請求項５ないし７のいずれかに記載の中空キャピラリー。
【請求項９】
前記採取されたｍＲＮＡをＰＣＲで増幅して特定遺伝子のｃＤＮＡを得る請求項３または４記載のｍＲＮＡ分取方法。
【請求項１０】
ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺すこと、
前記中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に密着させること、
中空キャピラリー内に設けた電極に正電圧をかけ、キャピラリー外部で細胞核に設置した電極に負電圧をかけることでｍＲＮＡを移動させること、
により、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取するｍＲＮＡ分取方法。
【請求項１】
先端部が細胞の核膜に接触させられる中空キャピラリー構造のチップ先端部と、
前記チップの内部を陰圧にするための手段と、
前記細胞の核膜と前記中空キャピラリー構造のチップ先端部との接触状態を目視するための手段と、
前記細胞の核膜と前記中空キャピラリー構造のチップ先端部との接触状態を目視による管理の下で中空キャピラリー構造のチップ先端部の位置を制御するための手段と、
を備えたことを特徴とする細胞の成熟ｍＲＮＡを採取するためのｍＲＮＡ分取装置。
【請求項２】
前記中空キャピラリー構造のチップ先端部内に保持されたバッファと前記細胞の一部との間の電気伝導度を計測する手段が付加された請求項１記載の細胞の成熟ｍＲＮＡを採取するためのｍＲＮＡ分取装置。
【請求項３】
ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺すこと、
前記中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に密着させること、
により、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取するｍＲＮＡ分取方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺す前に、中空キャピラリー内をバッファで充填する請求項３記載の細胞の成熟ｍＲＮＡを採取するためのｍＲＮＡ分取方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺し、該中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に密着させ、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取するｍＲＮＡ分取方法に使用される中空キャピラリーであって、該中空キャピラリーの先端部は（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）が外壁に固定されていることを特徴とする中空キャピラリー。
【請求項６】
前記（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）に代え、先端部にＴｉＯ２を固定した請求項５記載の中空キャピラリー。
【請求項７】
前記（Ａｒｇ）ｎ（ｎ：１〜８）とともに先端部にＴｉＯ２を固定した請求項５記載の中空キャピラリー。
【請求項８】
前記中空キャピラリーは、内部が同軸ないし仕切りにより独立した少なくとも２系統の空洞を有する構造のチップ先端部を有し、仕切りにより独立した少なくとも２系統の空洞のひとつないし複数からバッファを流し、他の空洞から連続的にｍＲＮＡを採取する請求項５ないし７のいずれかに記載の中空キャピラリー。
【請求項９】
前記採取されたｍＲＮＡをＰＣＲで増幅して特定遺伝子のｃＤＮＡを得る請求項３または４記載のｍＲＮＡ分取方法。
【請求項１０】
ｍＲＮＡを採取すべき細胞に中空キャピラリーを刺すこと、
前記中空キャピラリーの先端を前記細胞内の核膜に密着させること、
中空キャピラリー内に設けた電極に正電圧をかけ、キャピラリー外部で細胞核に設置した電極に負電圧をかけることでｍＲＮＡを移動させること、
により、前記細胞の核膜を通過してくるｍＲＮＡを中空キャピラリー内に採取するｍＲＮＡ分取方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−７５０３５（Ｐ２００６−７５０３５Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６０５０１（Ｐ２００４−２６０５０１）
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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