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p21経路のモディファイヤーとしてのHADHsおよび使用方法
説明

p21経路のモディファイヤーとしてのHADHsおよび使用方法

【課題】ヒトHADH遺伝子はp21経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥p21機能に関連する疾患の治療上の標的である。HADHの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、p21のモジュレーターを同定する方法の提供。
【解決手段】(a)精製したHADHポリペプチドまたは核酸、あるいは機能的に活性のあるその断片または誘導体を含むアッセイ系を提供するステップと、(b)試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させるステップと、(c)試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補p21経路調節剤として同定するステップとを含む、候補p21経路調節剤を同定する方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願への言及)
本出願は、2001年7月12日出願の米国特許仮出願第60/305,017号、2001年10月10日出願の米国特許仮出願第60/328,491号、および2002年2月15日出願の米国特許仮出願第60/357,452の優先権を主張するものである。先の出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
(発明の分野)
p21/CDKN1/WAF1/CIP1タンパク質(El-Deiry, W. S.; 他, Cell 75:817-825, 1993; Harper, J. W.; 他 Cell 75:805-816, 1993; Huppi, K他 Oncogene 9: 3017-3020, 1994)は、サイクリン−キナーゼ活性を阻害する細胞周期制御タンパク質であり、p21により転写レベルにおいて高度に制御されており、p21による腫瘍細胞の成長抑制を媒介する。p21は、ヒト細胞のG2チェックポイントを維持するために必須と思われる(Bunz, F.; Dutriaux, A.; 他, Science 282: 1497-1501, 1998)。P21の配列は進化を通してよく保存されており、ヒト(Genbank識別(Identifier)番号13643057)、ショウジョウバエメラノガスター(melanogaster)(GI#1684911)、線虫(Caenorhabditis elegans)(GI#4966283)および酵母(GI#2656016)に相当する種に同定されている。
【0003】
加水分解デハロゲナーゼは、水を唯一の共基質として、、求核置換反応を触媒する。それらはハロアルカンデハロゲナーゼとハロ酸デハロゲナーゼ(HAD)に分割される。HADは多様な基質特性を持つヒドロラーゼの大きなスーパーファミリーに属し、それにはエポキシドヒドロラーゼ、ホスホグリコール酸塩ホスファターゼ、ヒスチジノールリン酸ホスファターゼ、ニトロフェノールホスファターゼおよび多数の推定タンパク質も含まれる。エポキシドヒドロラーゼ(EH)はエポキシドに水を加え、対応するジオールを形成する。HADH(C20orf147)は、ハロ酸デハロゲナーゼまたはエポキシドヒドロラーゼファミリーのメンバーである。
【0004】
ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子および経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与およびこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路およびこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる(たとえば、Mechler BM他、1985年、EMBO J、4:1551〜1557;Gateff E.、1982年、Adv.Cancer Res.、37:33〜74;Watson KL.他、1994年、J Cell Sci.、18:19〜33;Miklos GLおよびRubin GM.、1996年、Cell、86:521〜529;Wassarman DA他、1995年、Curr Opin Gen Dev、5:44〜50及び; Booth DR.、1999年、Cancer Metastasis Rev.、18:261〜284参照)。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現(たとえばノックアウト)または過剰発現(「遺伝的エントリーポイント(genetic entry point)」と呼ばれる)を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントにより引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがp21などの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
【0005】
参照したGenbank識別番号およびウェブサイトの参照を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【非特許文献1】El-Deiry, W. S.; 他, Cell 75:817-825, 1993
【非特許文献2】Harper, J. W.; 他 Cell 75:805-816, 1993
【非特許文献3】Huppi, K他 Oncogene 9: 3017-3020, 1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
(発明の概要)
本発明者らは、ショウジョウバエでp21経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをHADHと呼ぶ。本発明は、これらのp21モディファイヤー遺伝子およびポリペプチドを利用して、p21機能および/またはHADH欠陥または不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるHADH-調節剤(modulating agent)を同定する方法を提供する。好ましいHADH調節剤は、HADHポリペプチドに特異的に結合してp21機能を修復する。他の好ましいHADH調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、たとえば対応する核酸(すなわちDNAまたはmRNA)に結合してそれを阻害することによってHADH遺伝子発現または生成物の活性を抑制するRNAiである。
【0007】
HADH調節剤は、HADHポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいin vitroまたはin vivoのアッセイによって評価することができる。一実施形態では、HADHポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補p21調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補p21調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。HADH調節剤には、HADH関連タンパク質(たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬);HADHに特異的な抗体;HADHと特異的なアンチセンスオリゴマーおよび他の核酸モジュレーター;HADHに特異的に結合するか、相互作用する、または(例えばHADH結合パートナーに結合することにより)HADH結合パートナーと競合する化学剤が含まれる。特定の一実施形態では、結合アッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施形態では、スクリーニングアッセイは、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管形成アッセイ、および低酸素誘発アッセイから選択される。
【0008】
別の実施形態では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の変化など、p21経路における変化を検出する第2アッセイ系を使用して、候補p21経路調節剤をさらに試験する。第2アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施形態では、この二次アッセイ系は、血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の疾患(たとえば癌)などp21経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【0009】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をHADHポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のHADH機能および/またはp21経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、p21経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0010】
(発明の詳細な記載)
サイクリン依存キナーゼ阻害剤、p21と相互作用する遺伝子を同定するために、ショウジョウバエで過剰発現スクリーニングを実行した(Bourne HR, 他, Nature, 1990, 348(6297):125-132; Marshall CJ, Trends Genet, 1991, 7(3):91-95)。眼にp21遺伝子が発現したことにより、通常の眼形態に劣化が生じた。CG15771遺伝子は、p21経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、これらモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるHADH遺伝子(すなわち核酸およびポリペプチド)は、癌など欠陥p21シグナル伝達経路に関連する病状の治療における魅力的な薬剤標的である。
【0011】
本発明では、HADH機能を評価するin vitroおよびin vivoの方法を提供する。HADHまたはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態および病態におけるp21経路とそのメンバーとの関連性を理解し、p21に関連する病状の診断方法および治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば酵素(たとえば触媒)活性または結合活性などのHADH機能に影響を与えてHADHの発現を阻害または亢進することによって作用するHADH調節剤を同定することができる。したがって、HADH調節剤は、診断、治療、および製薬の開発に有用である。
【0012】
本発明の核酸およびポリペプチド
本発明で使用することができるHADH核酸およびポリペプチドに関連する配列は、核酸はGI#11968366、18490373(配列番号:1)、及び20405373(配列番号:2)、ポリペプチドはGI#4902680(配列番号:3)として、Genbankに開示されている(Genbank識別(GI)番号により参照)。加えて、配列番号:4のポリペプチド配列は配列番号:1の翻訳であり、本発明に使用できる。
【0013】
HADHは、ヒドロラーゼドメインを有するヒドロラーゼタンパク質である。用語「HADHポリペプチド」とは、完全長のHADHタンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」HADH断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型HADHタンパク質に関連する機能活性を1つまたは複数示す。HADHタンパク質、誘導体および断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって(Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット)また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、ヒドロラーゼドメインや結合ドメインなどHADHの構造ドメインを1つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、PFAMプログラムを使用して同定することができる(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2)。たとえば、GI#4902680(配列番号:3)由来のHADHのヒドロラーゼドメインはアミノ酸残基約9〜212に位置している(PFAM00702)。HADHポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施形態では、好ましい断片は、機能的に活性のある、配列番号:3または4(HADH)の少なくとも25個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも50個、より好ましくは75個、最も好ましくは100個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施形態では、この断片はヒドロラーゼ(の機能的に活性のある)ドメインの全体を含む。
【0014】
用語「HADH核酸」とは、HADHポリペプチドをコードするDNAまたはRNA分子を言う。好ましくは、このHADHポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、HADHと少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは85%、さらに好ましくは90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。通常、異なる種のオルソログは、1つ以上のタンパク質モチーフの存在および/または3次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、BLAST分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードBLAST結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースBLASTの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する(Huynen MAおよびBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210)。CLUSTAL(Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680)など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域および/または残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同シーケンス(例えばBLAST分析により取り出されたもの)を表す系統樹において、2種のオルソログシーケンスは、それら2種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法(例えばProCeryon、バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルクを使用したもの)により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある(パラログ)。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント(%)配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムWU−BLAST−2.0a19(Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410)によって作成されたギャップを導入した後の、対象配列(またはその特定の一部分)中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。HSP SおよびHSP S2パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。%同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント(%)アミノ酸配列類似性」は、%アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【0015】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミンおよびアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システインおよびグリシンである。
【0016】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される(SmithおよびWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute;SmithおよびWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197;Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)およびこれに引用される参考文献であるW.R.Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650)。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され(Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.)、及びGribskovによって正規化された(Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763)スコアマトリックス(scoring matrix)を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたSmith−Watermanアルゴリズムを使用することができる(たとえば、ギャップ隙間ペナルティー(gap open penalty)12、ギャップ伸張ペナルティー(gap extension penalty)2)。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【0017】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、配列番号:1または2の核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、pH、ならびにハイブリダイズおよび洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている(たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年)。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、6×単位強度クエン酸(single strength citrate)(SSC)(1×SSCは0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸Na、pH7.0である)、5×デンハルト溶液、0.05%のピロリン酸ナトリウムおよび100μg/mlのニシン精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを8時間〜終夜、65℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと;6×SSC、1×デンハルト溶液、100μg/mlの酵母tRNAおよび0.05%のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、18〜20時間、65℃でハイブリダイゼーションを行うこと、および;0.2×SSCおよび0.1%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む溶液で、65℃で1時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:1または2のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【0018】
他の実施形態では、35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.1%のPVP、0.1%のフィコール、1%のBSA、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを6時間、40℃で前処理すること;35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.02%のPVP、0.02%のフィコール、0.2%のBSA、100μg/mlのサケ精子DNA、および10%(重量/体積)のデキストラン硫酸を含む溶液中で、18〜20時間、40℃でハイブリダイゼーションを行うこと;次いで、2×SSCおよび0.1%のSDSを含む溶液で2度、1時間55℃で洗浄することを含む、中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。
【0019】
あるいは、20%のホルムアミド、5×SSC、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%のデキストラン硫酸、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、8時間〜終夜、37℃でインキュベートすること;同じ緩衝液中で18〜20時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、および;1×SSCで、約37℃で1時間フィルターを洗浄することを含む、低いストリンジェントな条件を使用することができる。
【0020】
HADH核酸およびポリペプチドの単離、生成、発現、およびミスエクスプレッション
HADH核酸およびポリペプチドは、HADH機能を調節する薬剤の同定および試験、ならびにp21経路におけるHADHの関与に関連する他の用途に有用である。HADH核酸ならびにその誘導体およびオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、DNAライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、目的のcDNAまたはゲノムDNA配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、および精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない(たとえば融合タンパク質の生成)。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などHADH機能を評価するのに使用するアッセイのためのHADHタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、および精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる(たとえば、Higgins SJおよびHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク)。具体的な実施形態では、組換えHADHは、欠陥p21機能を有することで知られている細胞系(たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、バージニア州マナッサスから入手可能なHCT大腸癌細胞)中で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
【0021】
HADHポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター/エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、ネイティブHADH遺伝子および/またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス(たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)で感染させた哺乳動物細胞系;ウイルス(たとえばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNAで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、および/または特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【0022】
HADH遺伝子産物の発現を検出するために、発現ベクターは、HADH遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、1つまたは複数の複製起点、および1つまたは複数の選択可能なマーカー(たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など)を含むことができる。あるいは、in vitroアッセイ系(たとえば免疫アッセイ)におけるHADHタンパク質の物理的または機能的特性に基づいてHADH遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
【0023】
たとえば精製または検出を促進するために、HADHタンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物(すなわち、HADHタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている)として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用(Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111)によってキメラ産物を作製することもできる。
【0024】
HADH遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法(たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル排除クロマトグラフィー;遠心分離;溶解度差;電気泳動)を使用して遺伝子産物を単離および精製することができる。あるいは、標準の方法(たとえば免疫親和性精製)によって、天然源からネイティブHADHタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
【0025】
本発明の方法では、HADHまたはp21経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように(ミスエクスプレスされるように)操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、および無発現(たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による)を包含する。
【0026】
遺伝子改変動物
候補p21調節剤の活性を試験するため、またはアポトーシスや細胞増殖などp21経路のプロセスにおけるHADHの役割をさらに評価するために、HADHの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、in vivoアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したHADHの発現により、正常なHADH発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管形成、またはアポトーシスのレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、p21発現が変化していてもよい(たとえばp21ノックアウト)。好ましい遺伝子改変動物は、霊長類、げっ歯類(好ましくはマウス)、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌおよびネコなどの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫(C.elegans)、およびショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物(たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照)、または異種核酸が生殖系列DNA内(すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中)に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸配列は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
【0027】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である(トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、Wagner他による米国特許第4,873,191号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照;パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第4,945,050号参照;トランスジェニックショウジョウバエについては、RubinおよびSpradling、Science、1982年、218:348〜53および米国特許第4,670,388号参照;トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照;トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照);魚、両生類卵および鳥でのマイクロインジェクションについては、HoudebineおよびChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照;トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照;胚性幹(ES)細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム/DNA沈降、直接注入などの方法を使用してDNAをES細胞に導入することによるトランスジェニック動物のクローンの作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照)。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる(Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813;PCT国際公開公報WO97/07668号およびWO97/07669号参照)。
【0028】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、好ましくはHADH発現が検出不可能または僅かとなるようにHADH機能の低下をもたらす、内因性HADH遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子(たとえばヒトゲノムクローン由来)でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性HADH遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスHADH遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である(Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照)げっ歯類でない哺乳動物および他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である(HoudebineおよびChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183)。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる(Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400)。
【0029】
別の実施形態では、このトランスジェニック動物は、たとえばHADHの追加のコピーを導入することによって、またはHADH遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を動作可能に挿入することによって、HADH遺伝子の発現の変化(たとえば発現の増大(異所性の増大を含む)および低減)をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーターおよびエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
【0030】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である(Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236;米国特許第4,959,317号)。導入遺伝子の発現を制御するためにcre/loxPリコンビナーゼ系を使用する場合、Creリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む2匹のトランスジェニック動物を交配させることによって「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のFLPリコンビナーゼ系である(O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355;米国特許第5,654,182号)。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Cre−LoxPおよびFlp−Frtの両方が同一系内で使用される(Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6)。
【0031】
遺伝学の研究において欠陥p21機能に関係する疾病および疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のin vivo試験のために、遺伝子改変動物を使用してp21経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をHADH機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物および/または候補治療剤を与えたHADH発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【0032】
HADH機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥p21機能(およびそれ以外は正常なHADH機能)を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するin vitroアッセイのうち1つで同定された候補p21調節剤の活性をin vivoで評価するために、p21ノックアウトマウスを使用することができる。p21ノックアウトマウスは文献に記載されている(Umanoff H, 他、Proc Natl Acad Sci USA 1995年2月28日;92(5):1709-13)。好ましくは、候補p21調節剤をp21機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、p21機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【0033】
調節剤
本発明は、HADHの機能および/またはp21経路と相互作用しおよび/またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定される調節剤もまた、本発明の一部である。このような作用剤は、p21経路に関連する様々な診断および治療用途、ならびにHADHタンパク質およびp21経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、HADH相互作用剤または調節剤を投与することによってHADH活性を特異的に調節するステップを含む、p21経路を調節する方法も提供する。
【0034】
本明細書で使用する「HADH調節剤」という用語は、HADHと相互作用しHADH活性を阻害または増強させるか、あるいは正常なHADH機能に影響を与える薬剤など、HADH機能を調節する任意の薬剤である。HADH機能は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めたあらゆるレベルで影響され得る。好ましい実施形態では、HADH調節剤はHADHの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、HADHポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはHADHの機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、この用語は、(たとえば、HADHの結合パートナーと、またはタンパク質/結合パートナー複合体と結合してHADH機能を変化させることによって)HADHと結合パートナー、基質またはコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施形態では、HADH調節剤はp21経路のモジュレーターであり(例えばp21機能を回復させる、および/または情報制御する)、よって21調節剤でもある。
【0035】
好ましいHADH調節剤には、小分子化合物;抗体およびその他生物療法剤を含むHADH相互作用タンパク質;およびアンチセンスやRNA阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分および/または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第19版に出ている。
【0036】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有しおよび/またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が10,000未満、好ましくは5,000未満、より好ましくは1,000未満、最も好ましくは500未満である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定HADHタンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてHADH変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である(Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969;Radmann JおよびGunther J、Science、2000、151:1947〜1948)。
【0037】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、p21経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、および候補モジュレーターの改変および試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的および薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、in vitroおよびin vivoアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【0038】
タンパク質モジュレーター
特異的なHADH相互作用タンパク質は、p21経路および関連疾患に関連する様々な診断上および治療上の用途、ならびに他のHADH調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施形態では、HADH相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なHADH機能に影響を与える。別の実施形態では、HADH相互作用タンパク質は、癌などp21に関連する疾患に関連性があるので、HADHタンパク質の機能に関する情報を検出および提供するのに有用である(たとえば診断上の手段用)。
【0039】
HADH相互作用タンパク質は、HADH発現、局在化、および/または活性を調節するHADH経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちHADHと自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。HADHモジュレーターには、HADH相互作用タンパク質およびHADHタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母2ハイブリッドおよび変異体スクリーニングにより、内因性HADH相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている(Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.およびHames B.D編、(Oxford University Press、英国オックスフォード)、ページ169〜203; Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14;Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70;Vidal MおよびLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29;米国特許第5,928,868号)。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である(たとえば、Pandley AおよびMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説)。
【0040】
HADH相互作用タンパク質は、HADHに特異的な抗体やT細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい(たとえば、HarlowおよびLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory;HarlowおよびLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー:Cold Spring Harbor Loboratory Press参照)。HADH抗体については以下でさらに論じる。
【0041】
好ましい実施形態では、HADH相互作用タンパク質はHADHタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施形態では、HADH調節剤はHADH基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
【0042】
抗体
別の実施形態では、このタンパク質モジュレーターはHADHに特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上および診断上の用途を有しており、HADHモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにHADHの通常のプロセッシングおよび成熟を担当するHADH経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【0043】
周知の方法を使用してHADHポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はHADHポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトHADHに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)断片、FAb発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、配列番号:10、11、12、13、または14に示すアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のHADHポリペプチドスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるHADHのエピトープを選択することができる(HoppおよびWood、(1981) Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.、78:3824〜28;HoppおよびWood、(1983) Mol.Immunol.、20:483〜89;Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66)。記載の標準手順によって、10−1、好ましくは10−1〜1010−1、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる(HarlowおよびLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク;米国特許第4,381,292号;第4,451,570号;及び第4,618,577号)。HADHの粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。HADH断片を使用する場合は、これらは、好ましくはHADHタンパク質の少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、HADHに特異的な抗原および/または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【0044】
固定した対応するHADHポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)など適切なアッセイによって、HADHに特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
【0045】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、HADHポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミmAbの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する(Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、1984、81:6851〜6855;Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454)。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えDNA技術によって(Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327)マウス抗体の相補性決定領域(CDR)をヒトフレームワーク領域および定常領域のバックグラウンドに移植することによって(Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101)作製することができる。ヒト化抗体は10%までのネズミ配列および90%までのヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される(Co MSおよびQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501;Morrison SL.、1992年、Ann.Rev.Immun.、10:239〜265)。ヒト化抗体およびそれらを産生させる方法は当分野で周知である(米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第6,180,370号)。
【0046】
アミノ酸架橋によってFv領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるHADH特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる(米国特許第4,946,778号;Bird、Science、1988年、242:423〜426;Huston他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1988年、85:5879〜5883;Ward他、Nature、1989、334:544〜546)。
【0047】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をin vitroで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む(Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281)。本明細書中で使用するT細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる(HarlowおよびLane、1988年、上掲)。
【0048】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する(Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134)。幅広い種類の標識およびコンジュゲーション技術が知られており、科学文献および特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分(moiety)、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる(米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;第4,366,241号)。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい(米国特許第4,816,567号)。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる(米国特許第6,086,900号)。
【0049】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量および投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量1kgあたり約0.1mg〜約10mgである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態(たとえば溶液、懸濁液、乳濁液)で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、および5%のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約1mg/ml〜約10mg/mlである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている(米国特許第5,859,206;国際公開公報WO0073469号)。
【0050】
核酸モジュレーター
他の好ましいHADH調節剤としては、一般的にHADH活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖RNA(dsRNA)などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、DNAの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのHADH RNAの転位、HADH RNAからのタンパク質の翻訳、HADH RNAをスプライシングして1つまたは複数のmRNA種を得ること、またはHADH RNAに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、HADH核酸の機能を妨げる。
【0051】
一実施形態では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは5’非翻訳領域に結合することによってHADH mRNAと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。HADHに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも6〜約200個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、15、または20ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは50未満、40、または30ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【0052】
別の実施形態では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー(PMO)である。PMOは、それぞれがモルフォリンの六員環に結合している4種の遺伝子塩基(A、C、G、またはT)のうちの1つを含む、4種の異なるモルフォリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。PMOおよび他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作成方法および使用方法は、当分野で周知である(たとえば、WO99/18193号;Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、(2000) 22(3):271〜281;Summerton JおよびWeller D.、1997 Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95;米国特許第5,235,033号;米国特許第5,378,841号参照)。
【0053】
好ましい代替HADH核酸モジュレーターは、RNA干渉(RNAi)を媒介する二本鎖RNA種である。RNAiは、動物および植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖RNA(dsRNA)によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、およびヒトで遺伝子をサイレンシングするためのRNAiの使用に関する方法は、当分野で周知である(Fire A他、1998 Nature、391:806〜811;Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、(1999);Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、(2001);Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、(2001);Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、(2001);Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、(1999);Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、(2000);Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、(2000);Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、(2001);Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、(2001);WO0129058号;WO9932619号;Elbashir SM他、(2001) Nature、411:494〜498)。
【0054】
核酸モジュレーターは一般的に、探索試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される(たとえば、米国特許第6,165,790号参照)。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物および人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた(Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、(1993)36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、(1996) 14:54〜65)。したがって、本発明の一態様では、p21経路におけるHADHの役割、および/またはHADHとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、HADHに特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、p21に関連する病態を処置する治療剤として、HADHに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【0055】
アッセイ系
本発明は、HADH活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出および/または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、HADH核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたHADH調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がp21経路に関連する方式でHADHに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、HADHモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
【0056】
好ましい実施形態では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性(たとえば結合活性)が系によってもたらされる条件下で、HADHポリペプチドまたは核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がHADH活性を、したがってp21経路を調節することが示される。このアッセイに使用されるHADHポリペプチドまたは核酸は、上述の核酸またはポリペプチドのいずれをも含み得る。
【0057】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【0058】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい(Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91および付随の参考文献に総説がある)。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質(内因性または組換えによって生成された)、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用(たとえば受容体−リガンド結合)、転写活性(たとえばレポーター遺伝子)、酵素活性(たとえば基質の特徴を介するもの)、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、および細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、および電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
【0059】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、HADHを組換えによって発現する系および個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母2ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニングおよび質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにHADH相互作用タンパク質を使用する場合、HADHタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理(たとえば候補HADHに特異的に結合する作用剤の、HADH発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力)、結合平衡定数(通常少なくとも約10−1、好ましくは少なくとも約10−1、より好ましくは少なくとも約10−1)、免疫原性(たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でHADHに特異的な抗体を誘発する能力)など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素および受容体について、結合はそれぞれ基質およびリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【0060】
スクリーニングアッセイでは、HADHポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。HADHポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なHADH活性を保持しているその断片でもよい。HADHポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。HADHポリペプチドは、好ましくはヒトHADH、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイで、HADHと内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはHADHに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なHADH遺伝子機能を評価することができる。
【0061】
HADHモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイは高スループットまたは超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する(Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、(1998) 2:597〜603;Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、(2000) 11:47〜53)。好ましい一実施形態では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはDNA−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する(たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、(2000) 7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RPおよびPope AJ、Curr Opin Chem Biol、(2000) 4:445〜451)。
【0062】
候補HADHおよびp21経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる(たとえば、米国特許第5,550,019および第6,133,437号(アポトーシスアッセイ))。特に好ましいアッセイを以下に詳述する。
【0063】
ヒドロラーゼアッセイ。ヒドロラーゼは、例えば、エステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレオチダーゼ、およびホスファターゼなどの基質の加水分解を触媒する。酵素活性アッセイを使用して、ヒドロラーゼ活性を測定することができる。酵素の活性は、基質の過剰存在下で、反応産物の出現率を分光光度計で測定することにより決定される。ハイスループットアッセイ、およびヒドロラーゼのアッセイは、当技術分野において既知である(Park CBおよびClark DS, (2002) Biotech BioTech 78:229-235)。
【0064】
アポトーシスアッセイ。アポトーシス用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−11−dUTPニックエンド標識(TUNEL)アッセイによって実施することができる。TUNELアッセイは、フルオレセイン−dUTPの取り込み(Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747)を追跡することによってアポトーシスに特徴的な核DNAの断片化を測定すること(Lazebnik他、1994、Nature、371、346)に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によってアポトーシスをさらにアッセイすることができる(Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41)。アポトーシスアッセイ系は、HADHを発現する細胞、および任意選択で欠陥p21機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp21が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較したアポトーシスの誘発における変化により、候補p21調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞系を使用して最初に同定された候補p21調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、HADH機能がアポトーシスにおいて直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてHADHを過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較したアポトーシス応答の差により、HADHがアポトーシス応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第6,133,437号にさらに記載されている。
【0065】
細胞増殖および細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BRDU)の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたDNAにBRDUが取り込まれることにより、DNAが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗BRDU抗体を用いて(Hoshino他、1986 Int.J.Cancer、38、369; Campana他、1988 J.Immunol.Meth.、107、79)、または他の手段によって、新しく合成されたDNAを検出することができる。
【0066】
また、[H]−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる(Chen, J.、1996 Oncogene、13:1395〜403;Jeoung, J.、1995 J.Biol.Chem.、270:18367〜73)。このアッセイにより、S期のDNA合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、DNAを合成している細胞が新しく合成されるDNA中に[H]−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器(たとえば、Beckman LS 3800液体シンチレーション計数器)による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。
【0067】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる(Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、(1989))。たとえば、HADHで形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、2週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
【0068】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる(Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55)。HADHで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリー(Becton Dickinsonから入手可能)で評価することができる。
【0069】
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、HADHを発現する細胞、および任意選択で欠陥p21機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp21が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補p21調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞アッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p21調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、HADH機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてHADHを過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、HADHが細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【0070】
血管形成。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管形成をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ(Biosource Internationalから入手可能);血管形成エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するBecton Dickinson Falcon HTS FluoroBlockセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ;Matrigel(登録商標)(Becton Dickinson)上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管形成アッセイ系は、HADHを発現する細胞、および任意選択で欠陥p21機能を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp21が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。この血管形成アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管形成の変化により候補p21調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p21調節剤を試験する二次アッセイとして、血管形成アッセイを使用することができる。また、HADH機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管形成アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてHADHを過剰発現または過少発現する細胞で血管形成アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管形成の差により、HADHが血管形成において直接役割を果たすことが示唆される。
【0071】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−1(HIF−1)のαサブユニットは、in vitroで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、HIF−1は、糖分解酵素やVEGFをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、HADHで形質移入させた細胞を(たとえばNapco7001インキュベーター(Precision Scientific)で発生させた0.1%のO2、5%のCO2、および残りはN2を用いた)低酸素条件下および正常酸素(normoxic)条件下で増殖させ、その後Taqman(登録商標)によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、HADHを発現する細胞、および任意選択で変異したp21を有する(たとえば、野生型細胞に比べてp21が過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補p21調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補p21調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、HADH機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてHADHを過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、HADHが低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【0072】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、PBSで2.5g/mLまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、1%のBSAで遮断し、再度洗浄する。化合物を2×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングした、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−AMなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【0073】
細胞−細胞接着アッセイでは、ネイティブリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をBCECFなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
【0074】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの1つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンドおよびペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチドおよびモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をin situで使用して測定される(Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53)。
【0075】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、HADHタンパク質に対する抗体の親和性および特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性および特異性を試験する方法は当分野で周知である(HarlowおよびLane、1988年、1999年、上掲)。HADHに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)である。他の方法には、FACSアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
【0076】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがHADH遺伝子の発現、好ましくはmRNAの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってHADHを発現する2種の細胞プール)中のHADH発現を比較することが含まれる。mRNAおよびタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR(たとえばTaqMan(登録商標)、PE Applied Biosystemsを使用)、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でHADH mRNAの発現が低減していることを確認することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、(1994) Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、(1999)26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm DHおよびGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001 12:41〜47)。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはHADHタンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ELISA、in situ検出を含めた様々な手段が利用可能である(Harlow EおよびLane D、1988年および1999年、上掲)。
【0077】
二次アッセイ
調節剤がp21経路に関連する様式でHADHに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したHADH調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するHADH調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がHADHと相互作用する特異性を試験することもできる。
【0078】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってHADHを発現する2種の細胞プール)を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補HADH調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない(あるいはモック処置または偽薬で処置した)細胞や動物と比較してp21経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、p21または相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【0079】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは、欠陥p21機能を有することで知られている様々な細胞系(たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、バージニア州マナッサスから入手可能であるHTC116大腸癌細胞)を使用してもよい。細胞に基づいたアッセイでは内因性p21経路活性を検出するか、あるいはこれはp21経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【0080】
動物アッセイ
候補HADHモジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるp21経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥p21経路のモデルでは、p21経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる(たとえば過剰発現または発現が欠けている)ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
【0081】
好ましい実施形態では、新血管新生および血管形成をモニターすることによってp21経路の活性を評価する。Matrigel(登録商標)アッセイにおける、HADHに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるp21および正常なp21を有する動物モデルを使用する。Matrigel(登録商標)は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、4℃の無菌的な液体として提供されるが、37℃で迅速にゲルを形成する。液体のMatrigel(登録商標)を、bFGFおよびVEGFなど様々な血管形成剤、またはHADHを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス(Taconic、ニューヨーク州ジャーマンタウン)に皮下注入(SC)する。Matrigel(登録商標)ペレットを有するマウスに、経口(PO)、腹腔内(IP)、または静脈内(IV)経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後5〜12日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにMatrigel(登録商標)ペレットを回収する(Sigma plasma hemoglobin kit)。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新血管新生の程度と相関していることが判明した。
【0082】
別の好ましい実施形態では、HADHにおける候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。一例では、異種移植ヒト腫瘍をSCで、既存の腫瘍由来またはin vitro培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、6〜7週齢の雌の無胸腺マウスに移植する。内因的にHADHを発現する腫瘍を、マウス1匹あたり1×10〜1×10個の細胞を100μLの体積で、27ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週2回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が100mgに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、ボーラス投与によってIV(静脈注射)、SC(皮下注射)、IP(腹腔内)、またはPO(経口)で送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、1日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、2つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を4%のパラホルムアルデヒド、0.1Mのリン酸、pH7.2で6時間、4℃に固定し、PBS中30%のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
【0083】
診断および治療上の使用
特異的なHADH調節剤は、疾病または疾病予後が血管形成、アポトーシス、または増殖疾患などp21経路の欠陥に関連している様々な診断および治療用途に有用である。したがって、本発明は、HADH活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与するステップを含む、細胞、好ましくは(例えばp21の過剰発現、発現不足、またはミスエクスプレッション、あるいは遺伝子突然変異に起因する)欠陥または不全p21機能を有することが事前に確定されている細胞におけるp21経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、p21機能が修復されたことが示される。「機能の回復」という表現、およびそれに相当する表現は、本明細書で使用する場合、所望の表現型が達成されること、または未処理細胞と比較して正常に近い状態になることを意味する。例えば、p21機能が回復すると、細胞が正常な増殖または進行で細胞周期を経ることが示されるか、または未処理細胞と比較して正常に近い状態となる。本発明は、p21経路を調節するHADH調節剤の製薬的有効量を投与することによる、p21機能不全に関連する疾患または疾病の治療法も提供する。さらに、本発明は、HADH調節剤を投与することによる、細胞、好ましくは欠陥または不全HADH機能を有することが事前に確定されている細胞におけるHADH機能の調節法も提供する。加えて、本発明は、HADH調節剤の製薬的有効量を投与することによる、HADH機能不全に関連する疾患または疾病の治療法を提供する。
【0084】
HADHがp21経路に関係しているという発見により、p21経路の欠陥に関与する疾病および疾患の診断および予後評価、ならびにこのような疾病および疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【0085】
特定の試料でHADHが発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR、およびマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、(1994) Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、(1999) 26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;BlohmおよびGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、(2001) 12:41〜47)。HADHを発現する欠陥p21シグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、HADH調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、p21欠陥組織は正常組織に比べてHADHを過剰発現する。たとえば、完全または部分HADH cDNA配列をプローブとして使用した、腫瘍および正常細胞系由来、または腫瘍および同一患者からの対応する正常組織試料由来のmRNAのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がHADHを発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織および腫瘍試料中のHADH発現の定量的RT−PCR分析のために、TaqMan(登録商標)を使用する(PE Applied Biosystems)。
【0086】
たとえばHADHオリゴヌクレオチドなどの試薬、およびHADHに対する抗体を利用して、上に記載した(1)HADH遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したHADH mRNAの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、(2)疾患でない状態と比較したHADH遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに(3)HADHに媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【0087】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、(a)患者から生体試料を得ること、(b)試料をHADH発現用のプローブと接触させること、(c)ステップ(b)からの結果を対照と比較すること、および(d)ステップ(c)が疾病または疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、HADH発現の変化に関連する、患者の疾病または疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは、大腸癌または卵巣癌である。プローブは、DNAまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【0088】
以下の実験セクションおよび実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【0089】
I.ショウジョウバエp21のスクリーニング
サイクリン依存キナーゼインヒビターであるp21と相互作用する遺伝子を同定するため、ショウジョウバエにおいて過剰発現スクリーニングを行った(Bourne HR, 他、Nature, 1990年、348(6297):125-132; Marshall CJ, Trends Genet, 1991年、7(3):91-95)。眼にp21遺伝子が発現したことにより、正常な眼形態に劣化が生じた。眼表現型のモディファイヤーがp21経路のメンバーとして同定された。CG15771は、小規模の眼の欠陥のサプレッサーであった。
【0090】
BLAST分析(Altschul他、上掲)を行ってショウジョウバエのモディファイヤーのターゲットを同定した。例えば、HADHの代表的配列GI#4902680(配列番号:3)は、ショウジョウバエCG15771と34%のアミノ酸同一性を共有している。
【0091】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、および機能的サブユニットを、PSORT(Nakai K.およびHorton P.、Trends Biochem Sci、1999 24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、(2000))、PFAM(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999 27:260-2)、SMART(Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32)、TM−HMM(Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、およびAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998)、およびクラスト(clust)(Remm MおよびSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89)プログラムを使用して分析した。例えば、GI#4902680(配列番号:3)からのHADHのヒドロラーゼドメインは、それぞれ、概ねアミノ酸残基9−212に位置している(PFAM00702)。
【0092】
配列番号:4の詳細な機能分析は、HADHが、ホスホヒドロラーゼ/ホスホトランスフェラーゼを利用するHADHアスパラチルリン酸のファミリーのメンバーらしいことを示した。スレディングアルゴリズム(ニューヨーク州Proceryon)を使用して、HADHの構造ファミリー関係を同定した。スレディングアラインメントにより、このファミリーのメンバーにとって鍵となる複数の残基、D12、T16、T131、N132、K164、D189、T193、D194が同定された。配列番号:4では、D12が高度に保存されてリン酸化の部位であり;T16はいくらか可変であってDリン酸の自動加水分解率に影響すると思われ;K164はアシル中間体を加水分解する水分子の活性化に関与している、および/または、アシルリン酸中の酸素の調整/リン酸化状態の安定化に関与している可能性があり;D189、D194はMgまたはその他金属カオチンを調整している可能性がある。(Mgまたはその他金属カオチンは、エポキシヒドロラーゼおよびデハロゲナーゼに保存されないが、ホスホヒドロラーゼ/ホスホトランスフェラーゼの活性化のために保存され、必要とされる。)
【0093】
II.ハイスループットのIn Vitro蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したHADHペプチド/基質を、試験緩衝液(10mMのHEPES、10mMのNaCl、6mMの塩化マグネシウム、pH7.6)中の試験剤と共に96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Fluorolite FPM−2 Fluorescence Polarization Microtiter System(Dynatech Laboratories,Inc)を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がHADH活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【0094】
III.ハイスループットのIn Vitro結合アッセイ
33P標識のHADHペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液(100mMのKCl、20mMのHEPES pH7.6、1mMのMgCl、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤の反応混液)中で、Neutralite−アビジンでコーティングしたアッセイプレートに加え、25℃で1時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、1時間インキュベートした。PBSで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補p21調節剤として同定された。
【0095】
IV.免疫沈降および免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、HADHタンパク質を含む3×10個の適切な組換え細胞を10cmのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総DNA量を一定に保った。24時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、50mMのHepes、pH7.9、250mMのNaCl、20mMのグリセロホスフェート、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、5mMのp−ニトロフェニルリン酸、2mMのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤(complete、Roche Molecular Biochemicals)、および1%のノニデットP−40を含む溶解緩衝液1ml中、氷上で20分間溶解させた。15,000×g、15分間の遠心分離2回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を25μlのM2ビーズ(Sigma)と共に2時間、4℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【0096】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、SDS試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼおよび高感度化学発光(ECL)ウエスタンブロッティング検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【0097】
V.発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はNCI(米国立癌センター)の系であり、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナッサス、20110〜2209)から入手可能である。正常組織および腫瘍組織は、Impath、UC Davis、Clontech、Stratagene、およびAmbionから得た。
【0098】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、TaqMan分析を使用した。
【0099】
Qiagen(カリフォルニア州バレンシア)のRNeasy kitを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からRNAを抽出して最終濃度50ng/μlにした。その後、ランダムの六量体および各反応500ngの全RNAを使用して、Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティー)のプロトコル4304965に従ってRNA試料を逆転写させることによって一本鎖cDNAを合成した。
【0100】
TaqManプロトコルならびに以下の基準に従って、TaqManアッセイ(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、a)ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、およびb)各プライマーの対が1つの産物のみを生成することである。
【0101】
製造者のプロトコルに従って、300nMのプライマーおよび250nMのプローブならびに約25ngのcDNAを、96ウェルプレートでは25μlの全体積、384ウェルプレートでは10μlの全体積で使用して、Taqman反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のcDNAを含む混合物である、ヒトcDNA試料のユニバーサルプール(universal pool)を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。18SのrRNA(すべての組織および細胞中で普遍的に発現される)を使用して生データを正規化した。
【0102】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが2倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、cDNA試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差(すなわち、腫瘍−平均(すべての正常試料)>2×STDEV(すべての試料))の2倍を超える場合に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【0103】
HADH(配列番号:1)は、対応する大腸腫瘍30例のうち10例に、対応する卵巣腫瘍7例のうち2例に、それぞれ過剰発現した。下線を引いたデータは、試験した腫瘍試料のうち25%〜49%が過剰発現を示したことを示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子(または複数の遺伝子)の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)精製したHADHポリペプチドまたは核酸、あるいは機能的に活性のあるその断片または誘導体を含むアッセイ系を提供するステップと、
(b)試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させるステップと、
(c)試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補p21経路調節剤として同定するステップと
を含む、候補p21経路調節剤を同定する方法。
【請求項2】
アッセイ系がHADHポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
培養細胞がさらに欠陥p21機能を有する、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
アッセイ系がHADHポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
【請求項5】
アッセイが結合アッセイである、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、および低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項7】
アッセイ系がHADHポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項8】
アッセイ系がHADH核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
核酸モジュレーターがPMOである、請求項8に記載の方法。
【請求項11】
(d)(c)で同定された候補p21経路調節剤を、p21機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、p21機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出するステップ
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
モデル系が欠陥p21機能を有するマウスモデルである、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
p21機能に欠陥がある細胞を、配列番号:3および4からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むHADHポリペプチドと特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりp21機能が修復される、細胞のp21経路を調節する方法。
【請求項14】
p21機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
候補モジュレーターが抗体および小分子からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項16】
(d)HADHを発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供するステップと、
(e)二次アッセイ系を(b)の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させるステップと、
(f)作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性を検出するステップと
をさらに含み、作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補p21経路調節剤であることが同定され、
ここで第2アッセイが作用剤の影響を受けたp21経路における変化を検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項17】
二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項19】
非ヒト動物がp21経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項18に記載の方法。
【請求項20】
哺乳動物の細胞をHADHポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のp21経路を調節する方法。
【請求項21】
p21経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項20に記載の方法。
【請求項22】
作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項20に記載の方法。
【請求項23】
(a)患者から生体試料を得ること、
(b)試料をHADH発現用のプローブと接触させること、
(c)ステップ(b)からの結果を対照と比較すること、および
(d)ステップ(c)が疾病の可能性を示しているかどうかを決定すること
を含む、患者の疾病を診断する方法。
【請求項24】
前記疾病が癌である、請求項23に記載の方法。
【請求項25】
前記癌が、大腸癌または卵巣癌である、請求項24に記載の方法。

【公開番号】特開2009−82131(P2009−82131A)
【公開日】平成21年4月23日(2009.4.23)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2008−261712(P2008−261712)
【出願日】平成20年10月8日(2008.10.8)
【分割の表示】特願2003−512708(P2003−512708)の分割
【原出願日】平成14年7月10日(2002.7.10)
【出願人】(504408797)エクセリクシス, インク. (65)
【Fターム(参考)】