ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンを用いた組成物及び方法
【課題】ｓｉＲＮＡを動物細胞に送達するための組成物を提供する。
【解決手段】両親媒性化合物、ポリカチオン及びｓｉＲＮＡからなる動物細胞、特に哺乳類細胞に送達可能組成物。ここでポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパクであるヒストンＨ１であり、ポリカチオンは、ポリマーであり、両親媒性化合物は以下の構造
を有し、Ｒ１及びＲ２は、炭素数６乃至２４のアルカン、炭素数６乃至２４のアルケン、シクロアルキル、ステロール、ステロイド、置換脂質、脂肪酸のアシルセグメント、疎水性ホルモン及び疎水性ホルモンアナログからなる群から選択される。
【解決手段】両親媒性化合物、ポリカチオン及びｓｉＲＮＡからなる動物細胞、特に哺乳類細胞に送達可能組成物。ここでポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパクであるヒストンＨ１であり、ポリカチオンは、ポリマーであり、両親媒性化合物は以下の構造
を有し、Ｒ１及びＲ２は、炭素数６乃至２４のアルカン、炭素数６乃至２４のアルケン、シクロアルキル、ステロール、ステロイド、置換脂質、脂肪酸のアシルセグメント、疎水性ホルモン及び疎水性ホルモンアナログからなる群から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンからなる組成物並びにｓｉＲＮＡを動物細胞に送達するためにかかる組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞に存在する二本鎖ＲＮＡが特定の配列と同一又はほぼ同一の遺伝子の発現を阻害する現象である。この阻害は、標的遺伝子から翻訳されたメッセンジャーＲＮＡの分解を惹起する(非特許文献１)。ＲＮＡ干渉の誘導に関与する二本鎖ＲＮＡは、干渉ＲＮＡ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれている。ＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を介した機構及び細胞機構は、遺伝的及び生化学的手法の両方を用いて研究されている。生化学的分析が示唆するのは、細胞質に導入されたｄｓＲＮＡが、２１から２５塩基程度のＲＮＡ断片にプロセッシングされることから始まることである(非特許文献２〜６)。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討で示されたのは、スモールインターフェアリングＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるこれらｄｓＲＮＡは、ＤｉｃｅｒなるＲＮＡｓｅＩＩＩ様酵素により部分的に生成されることである(非特許文献７)。これらｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解のガイドとして機能しているようで、これは、標的ｍＲＮＡが特定のｓｉＲＮＡにより覆われる領域の中心の位置で切断されるためである(非特許文献８)。生化学的事実が示唆するのは、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシングコンプレックス（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多重的なヌクレアーゼ複合体の一部であるということである(非特許文献２)。この複合体タンパクの一つであるアルゴナウテ２（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２）は、アルゴナウテ遺伝子ファミリーの産生物として同定された(非特許文献９)。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのホモログであるｒｄｅ−１及び関連する遺伝子であってＮ．ｃｒａｓｓａのホモログであるｑｄｅ−２を含むこの遺伝子ファミリーは、遺伝的検討によりＲＮＡ干渉に必須であることが示された(非特許文献１０〜１２)。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子スクリーニングにおいて、ＲＮＡ干渉に必須な遺伝子としてｍｕｔ−７が同定された。この遺伝子は、ＲＮＡｓｅＤに類似しており、ｍＲＮＡ分解ステップにおいてその遺伝子産物が機能することを示唆している(非特許文献１３)。
【０００３】
遺伝子の機能解析に繁用的なＣ．ｅｌｅｇａｎｓやＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒなどのモデル系により、哺乳動物における新規な薬物標的の可能性に関連する手がかりを得ることが可能であるにもかかわらず、哺乳類のモデル系における遺伝子機能の解析には、より直接的な手法が存在する。従来示されたのは、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導するのに用いられ、且つ、マウス卵母細胞及び初期胚における標的の遺伝子発現を阻害する、ということである(非特許文献１４、１５)。しかしながら、その他の多くの検討により得られたデータが示すのは、培養哺乳類細胞又は初期胚後の組織においてＲＮＡ干渉を誘導すべくｄｓＲＮＡを使用することは、遺伝子サイレンシングの配列特異的な手法として効果的でないということである(非特許文献１６、１７)。この矛盾は、周知であるインターフェロン合成におけるｄｓＲＮＡ媒介誘導の大部分に起因する可能性があり、この反応経路は卵母細胞や初期胚に存在しない。ｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性化は、細胞生理学及び遺伝子発現に配列特異的な効果を及ぼさない(非特許文献１８〜２１)。インターフェロン反応における主要な組成物は、ｄｓＲＮＡ依存性リン酸化タンパクであるプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）であって、これは、伸張因子であるｅＩＦ２ａをリン酸化し且つ不活性化する。加えて、インターフェロンはｄｓＲＮＡ依存性２−５（Ａ）シンテターゼの合成を誘導し、これは、配列非特異的なＲＮＡｓｅＬの活性化を導く２‘−５’ポリアデニル酸を合成する(非特許文献２２)。
【０００４】
しかしながら、このＰＫＲパスウェイは３０塩基対未満のｄｓＲＮＡにより活性化されず、完全な活性化には、８０塩基対以上のｄｓＲＮＡが必要である(非特許文献１９、２０)。この事実が示唆するのは、より長鎖のｄｓＲＮＡに変えて、ＲＮＡ干渉を惹起するのにｓｉＲＮＡを使用する場合、インターフェロンの反応性の少なくとも一部を経由する可能性があるということである。２１から２５塩基対のｓｉＲＮＡを培養条件下にて哺乳類細胞に送達する検討から得られたデータが示すのは、ＲＮＡ干渉を介した配列特異的な阻害が効果的に起こったということである(非特許文献２３、２４)。これらの検討において遺伝子特異的阻害は、種々の不死化細胞及び初代細胞株の両方にて観察された。強力なエンハンサーを含有する、トランジエントにトランスフェクトされたプラスミドから発現されたレポーター遺伝子に対して標的化されたｓｉＲＮＡを用いると、阻害の程度は８０から９６％の間で変化した。関連しない配列のコントロールのレポーター遺伝子の発現は、このｓｉＲＮＡにより影響されず、且つ、関連しない配列に対して、ｓｉＲＮＡを使用しても阻害は観察されなかった。内在性遺伝子の発現もまた、ｓｉＲＮＡの検出限界以下にて観察阻害されなかった。これらのデータは、哺乳類培養細胞株におけるｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉の特異性及び効果を示し、且つ、インターフェロンの反応性はこの塩基対のｓｉＲＮＡにより活性化されないことが示唆される。この結果により、ＲＮＡ干渉は哺乳細胞における遺伝子発現を効果的に阻害するのに使用可能であることが示唆される。
【０００５】
ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の阻害発現能は明らかに有益である。例えば、多くの疾患は特定の遺伝子又は遺伝子群の異常な発現により惹起される。ＲＮＡ干渉は、有害遺伝子の発現を阻害するのに使用することが可能であって、従って、疾患症状を軽減又は治癒を供することになる。例えば、癌状態又はウィルス複製に貢献する遺伝子を阻害することも可能である。加えて、筋ジストロフィーなどの遺伝的疾患を惹き起こす変異遺伝子を阻害することも可能である。リウマチ症などの炎症性疾患もまた、シクロオキシゲナーゼやサイトカインなどの遺伝子を阻害することにより処置可能である。標的臓器の例として含まれるのは、肝臓、膵臓、脾臓、皮膚、脳、前立腺、心臓などである。加えて、ＲＮＡ干渉は、遺伝子機能を検討するための実在の遺伝子「ノックアウト」動物に類似の動物を繁殖するのに使用することも可能である。
【０００６】
薬物創製もまた、ｓｉＲＮＡ技術により促進される可能性がある。標的の評価に関するｓｉＲＮＡ手法は、活性を有する薬物標的をスクリーニングすべくより早く、より安価な手法を提供するであろう。薬物標的に関する情報は、活性を有する薬物標的を阻害するばかりでなく、阻害タンパク及びそのパスウェイが有意な現象論的効果を有するかどうかを同定することにより収集されるであろう。例えば、ＬＤＬ受容体発現の阻害は血清ＬＤＬレベルを上昇させ、従って、この受容体のアップレギュレーションは、治療学的効果を示唆するであろう。標的遺伝子又はパスウェイだけでなく遺伝子の発現における阻害の反応効果を同定するのに発現アレイを使用することが可能である(非特許文献２５)。機能的パスウェイや（パスウェイに相互作用する）ネットワーク内において遺伝子産物を判別するであろう。
【０００７】
生物学的活性物質を細胞内領域へと効果的に送達するのは、種々のベシクルを用いて達成されてきた。特定のタイプのベシクルの一つであるリポソームは、薬物送達における最も開発されたタイプの一つである。１９７０年代から開発されてきたリポソームは、微小なベシクルであって、親水性及び疎水性領域の両方を有する両性分子を有している。リポソームは１つのタイプの両親媒性分子又は複数の異なる両親媒性分子から形成される。リポソームを用いて生物学的に活性な化合物を複合化するのに複数の方法が開発されてきた。特にリポソームで複合化されたポリヌクレオチドは、哺乳細胞に送達されてきた。ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）の後(非特許文献２６)、複数の陽イオン性脂質がこの目的に合成されてきた。本質的に、全ての陽イオン性脂質は、両親媒性化合物であって、疎水性領域、スペーサー及び陽イオン荷電したアミン（類）を有している。この陽イオン性脂質は、時に、リポソームを形成すべく、ＤＯＰＥ（ヂオレイルフォスファチジルエタノールアミン）などの融合誘導因子脂質に混和される。この陽イオン性リポソームは、その後プラスミドＤＮＡ及びＤＮＡの両性複合体に混和され、リポソームは、組織培養ディッシュ中の細胞やｉｎ ｖｉｖｏに適用される。陽イオン性リポソーム形成におけるプラスミドＤＮＡの混合の容易性、ＤＮＡを複合化する陽イオン性脂質の能力及び比較的高いレベルのトランスフェクション効率は、これらの製剤の利用の増加をもたらしてきた。しかしながら、これらの陽イオン性脂質の製剤は、培養細胞及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて典型的に毒性を有しているという一般的な欠点を有している(非特許文献２７、２８)。最近、脂質は、細胞のトランスフェクションを促進すべく、他のＤＮＡ結合化合物に関連して使用されている。本発明は、動物細胞であるｉｎ ｖｉｔｒｏやｉｎ ｖｉｖｏへの送達に関する生物学的に活性を有する新規なポリイオンを有する複合体の調製に使用されるべく、新規な両親媒性化合物及びこれらの調製方法を提供する。この複合体は、低毒性でありながら細胞外から細胞内へとこのポリイオンを高効率にて移行を促進する。
【０００８】
本発明は、動物細胞であるｉｎ ｖｉｔｒｏやｉｎ ｖｉｖｏに、高効率で低毒性にて、ｓｉＲＮＡを送達する、トランスフェクション試薬及び方法について述べる。本発明における方法は、ＲＮＡ干渉の目的に関して、ｓｉＲＮＡを動物細胞に効果的に送達することを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】P.A. Sharp. Genes Dev 15:485-490., 2001.
【非特許文献２】S.M. Hammond, E. Bernstein, D. Beach and G.J. Hannon. Nature 404:293-296., 2000.
【非特許文献３】A.J. Hamilton and D.C. Baulcombe. Science 286:950-952., 1999.
【非特許文献４】P.D. Zamore, T. Tuschl, P.A. Sharp and D.P. Bartel. Cell 101:25-33., 2000.
【非特許文献５】D. Yang, H. Lu and J.W. Erickson. Curr Biol 10:1191-1200., 2000.
【非特許文献６】S. Parrish, J. Fleenor, S. Xu, C. Mello and A. Fire. Mol Cell 6:1077-1087., 2000.
【非特許文献７】E. Bernstein, A.A. Caudy, S.M. Hammond and G.J. Hannon. Nature 409:363-366., 2001.
【非特許文献８】S.M. Elbashir, W. Lendeckel and T. Tuschl. Genes Dev 15:188-200., 2001.
【非特許文献９】S.M. Hammond, A.A. Caudy and G.J. Hannon. Nat Rev Genet 2:110-119., 2001.
【非特許文献１０】H. Tabara, M. Sarkissian, W.G. Kelly, J. Fleenor, A. Grishok, L. Timmons, A. Fire and C.C. Mello. Cell 99:123-132., 1999.
【非特許文献１１】M. Fagard, S. Boutet, J.B. Morel, C. Bellini and H. Vaucheret. Proc Natl Acad Sci U S A 97:11650-11654., 2000.
【非特許文献１２】C. Catalanotto, G. Azzalin, G. Macino and C. Cogoni. Nature 404:245., 2000.
【非特許文献１３】R.F. Ketting, T.H. Haverkamp, H.G. van Luenen and R.H. Plasterk. Cell 99:133-141., 1999.
【非特許文献１４】F. Wianny and M. Zernicka-Goetz. Nat Cell Biol 2:70-75., 2000.
【非特許文献１５】P. Svoboda, P. Stein, H. Hayashi and R.M. Schultz. Development 127:4147-4156., 2000.
【非特許文献１６】N.J. Caplen, J. Fleenor, A. Fire and R.A. Morgan. Gene 252:95-105., 2000.
【非特許文献１７】T. Tuschl, P.D. Zamore, R. Lehmann, D.P. Bartel and P.A. Sharp. Genes Dev 13:3191-3197., 1999.
【非特許文献１８】G.R. Stark, I.M. Kerr, B.R. Williams, R.H. Silverman and R.D. Schreiber. Annu Rev Biochem 67:227-264., 1998.
【非特許文献１９】L. Manche, S.R. Green, C. Schmedt and M.B. Mathews. Mol Cell Biol 12:5238-5248., 1992.
【非特許文献２０】M.A. Minks, D.K. West, S. Benvin and C. Baglioni. J Biol Chem 254:10180-10183., 1979.
【非特許文献２１】M.J. Clemens and A. Elia. J Interferon Cytokine Res 17:503-524., 1997.
【非特許文献２２】M.R. Player and P.F. Torrence. Pharmacol Ther 78:55-113., 1998.
【非特許文献２３】N.J. Caplen, S. Parrish, F. Imani, A. Fire and R.A. Morgan. Proc Natl Acad Sci U S A 98:9742-9747., 2001.
【非特許文献２４】S.M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber and T. Tuschl. Nature 411:494-498., 2001.
【非特許文献２５】J.F. Reidhaar-Olson and J. Hammer. Current Drug Discovery April:20-24., 2001.
【非特許文献２６】Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M. Proc Natl Acad Sci U S A 84(21):7413-7417., 1987.
【非特許文献２７】Gao, X and Huang, L. Biochem. Biophys. Res. Com. 179:280-285., 1991.
【非特許文献２８】Leventis, R and Silvius, JR. Biochim. et Biophys. Acta. 1990;1023:124-132.
【非特許文献２９】J. Summerton, D. Stein, S.B. Huang, P. Matthews, D. Weller and M. Partridge. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:63-70., 1997.
【発明の概要】
【００１０】
（本発明の概略）
本発明は、３つの要素、つまり、ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンからなる複合体を用いて動物細胞へのｓｉＲＮＡ移行を提供する。新規な両親媒性化合物及びこの調製方法を述べる。好適実施例において述べているのは、ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンからなる組成物並びに細胞内における遺伝子発現を阻害する目的で、かかる組成物を用いて、ｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏへとｓｉＲＮＡを送達する方法である。
【００１１】
好適実施例において、述べられている組成物及び化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達を容易にすることである。このｓｉＲＮＡは、細胞内に発現されている標的遺伝子と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を有している。さらに、ポリカチオン及び両親媒性化合物を共に用いることにより、ｓｉＲＮＡの移行効率を有意に増加させ、ｓｉＲＮＡは、選択された標的遺伝子の発現を阻害する。
【００１２】
好適実施例において、ポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾレニウム、ポリアリルアミン及びこれらに類する化合物などのポリマーである。好適な陽イオンポリマーは、エトキシル化ポリエチレンイミン（ｅＰＥＩ）である。
【００１３】
好適実施例において、ポリカチオンはＤＮＡ結合タンパクである。好適なＤＮＡ結合タンパクは、Ｈ１、Ｈ２Ａ又はＨ２Ｂなどのヒストンである。ヒストンは、牛胸腺などの天然ソースに由来していてもよいし、バクテリア内で合成されたリコンビナントタンパクであってもよい。ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパクは、ポリリジンなどのポリカチオン化合物に比べて種々の点で利点を有している。ヒトＨ１ヒストンタンパクは、免疫原性がなく、アナフィラキシーを誘導しない。ポリリジンはアナフィラキシーショックを誘導し、非常に免疫原性が高い。好適実施例においてＤＮＡ結合タンパクは、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルやヒトヒストンＨ１のＣ末端ドメイン（ＮＬＳ−Ｈ１）の両方を有するバクテリアにて合成されたリコンビナントヒストンなどの核局在化シグナルにリンクされている。
【００１４】
好適実施例において、ポリエチレンイミン又は同様のポリマーは、ポリカチオンとして使用され、構造番号１の化合物は、両親媒性化合物として使用されている。他の好適実施例において、ヒストンＨ１タンパクは、ポリカチオンとして使用され、構造番号１の化合物は、両親媒性化合物として使用されている。ｓｉＲＮＡは、細胞における標的遺伝子の効果の検討又は細胞における治療効果の影響を検討するために使用されてもよい。
【００１５】
好適実施例において、細胞は、不死化又はトランスフォームされた細胞株などの組織培養中で保持された動物細胞であってもよい。これらに含まれるのは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）から入手可能な種々の細胞株であって、例えば、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）細胞、Ｒａｔ１（ラット線維芽細胞）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵母）細胞、ＣＶ−１（サル腎臓）細胞、ＣＯＳ（サル腎臓）細胞、２９３（ヒト初期胚腎臓）細胞、ＨｅＬａ（ヒト頚部子宮癌）細胞、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓）細胞、Ｓｆ９（昆虫上皮性卵巣癌）細胞やこれらに類する細胞などが挙げられる。
【００１６】
他の好適実施例において、細胞は、初代又は二代細胞であってもよく、これが意味するのは、細胞は、動物から採取した後、比較的短期間、組織培養にて保持されている、ということである。これに含まれるのは、限定されないが、肝臓初代細胞及び筋初代細胞やこれらに類する細胞である。組織内の細胞は、細胞外マトリックスを分解するトリプシンやコラゲナーゼなどの分解酵素により単離される。組織は種々の異なる細胞型から構成されており、好適な細胞型を一定の精製量得るべく、勾配遠心分離や抗体分画などの精製方法を使用してもよい。例えば、初代筋芽細胞は、パーコール（Ｓｉｇｍａ社製）勾配遠心分離を用いて線維芽細胞が混入している組織から分離される。
【００１７】
他の好適実施例において、細胞は、ｉｎ ｓｉｔｕやｉｎ ｖｉｖｏの組織内に存在する動物細胞であってもよく、この細胞は、組織や動物から分離されていないということを意味する。
【００１８】
好適実施例において、遺伝子発現を阻害する目的（いわゆるＲＮＡ干渉）で、ｓｉＲＮＡを動物細胞へと送達する方法を述べており、両親媒性化合物、効果量のポリカチオン及び溶液状態のｓｉＲＮＡからなる複合体を形成する方法並びにこの３つの要素を用いて細胞に関連づける方法を有している。好適な両親媒性化合物は構造番号１の化合物である。好適なポリカチオンはエトキシル化ＰＥＩである。他の好適なポリカチオンはヒストンである。
【００１９】
細胞へのｓｉＲＮＡの移行を媒介すべく、ポリカチオンと組み合わせて種々の両親媒性化合物を用いてもよい。好適実施例において、この両親媒性化合物は陽イオン性を有している。この陽イオン性両親媒性化合物は、天然由来ではないポリアミンであってもよく、これら１つ以上のアミンは、少なくとも１つの疎水性残基に結合されており、この疎水性残基は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモンを有している。両親媒性化合物は、リポソームを形成していても形成していなくてもよい。好適実施例において、複数の新規な両親媒性陽イオン化合物を述べている。この化合物は、一般的に以下の一般構造
【００２０】
【化２】
構造番号１
を有しており：Ｒ１及びＲ２は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。Ｒ１及びＲ２は、同一であっても異なっていてもよい。
【００２１】
遺伝子導入に関して以前に述べられている陽イオン性リポソームの使用と比較して、上述の新規な両親媒性化合物のほとんどは、単独で使用する場合、細胞内への遺伝子の移行を効果的に媒介しない。しかしながら、これら新規の陽イオン性両親媒性化合物をポリカチオンとともに使用すると、最小限の細胞毒性を以て、種々の動物細胞へ効果的に遺伝子を導入することが可能となる。ポリカチオン及び両親媒性化合物の組み合わせは、ｓｉＲＮＡの送達の効率を促進する。
【００２２】
好適実施例において、本発明は、動物細胞へｓｉＲＮＡを送達する方法を提供し、この方法は、構造番号１の化合物と溶液状態のｓｉＲＮＡ及びポリカチオンを混和し３つの要素を有する複合体を調製し、この複合体を動物細胞に関連付けし、且つ、細胞内部にこのｓｉＲＮＡを送達する方法を有する。このｓｉＲＮＡは、その後、細胞内における特定の遺伝子の発現を阻害する。この両親媒性化合物は、ｓｉＲＮＡを加える前、ｓｉＲＮＡを加えるのと同時に、又はｓｉＲＮＡを加えた後に、ポリカチオンと混和されてもよい。
【００２３】
好適実施例において述べているのは、細胞内部において核酸発現を阻害する複合体である。この複合体は、複合体を形成すべく、１つの化合物又は複数の化合物とｓｉＲＮＡを有しており、この複合体のゼータポテンシャルは、ｓｉＲＮＡ単独のゼータポテンシャルよりも負である。ｉｎ ｖｉｖｏにおける哺乳類血管へとこの複合体を導入し、且つ、この複合体を細胞に送達し、選択された遺伝子発現が阻害される。
【００２４】
好適実施例において、ポリカチオン、ｓｉＲＮＡ又は両親媒性化合物は、機能性置換基を結合することにより改変されてもよい。この機能性置換基は、限定されないが、ｓｉＲＮＡの送達を容易にする標的化シグナル又はラベル又はその他の基であってもよい。この置換基は、複合体形成に先立ち、１つ以上の組成物に結合されてもよい。代替的に、この置換基は、複合体の形成の後に結合されてもよい。
【００２５】
好適実施例において、動物細胞にｓｉＲＮＡを送達するための化合物、組成物、及び方法を用いてもよく、この細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、又はｉｎ ｖｉｖｏに存在していてもよい。
【００２６】
好適実施例において、本発明は、動物細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法を開示しており、この方法は、両親媒性化合物、効果量のポリカチオン及び溶液状態の選択されたｓｉＲＮＡからなる３つの要素を有する複合体を用いて細胞に関連づける工程を含んでいる。送達という用語が意味するのは、ｓｉＲＮＡが細胞に関連付けられることであって、これにより、遺伝子発現を阻害することにより細胞の内在的な特性が変化する。この複合体は、細胞膜上に存在していてもよく、或いは、細胞質、核又はその他の細胞内小器官の内部に存在していてもよい。送達に関連した相互に変換可能な、使用されているその他の用語には、トランスフェクト、移行又はトランスフォームなどが含まれる。
【００２７】
好適実施例において、本発明は、陽イオン性両親媒性化合物及びこの調製方法であって、この化合物は、動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達を促進し、この化合物は、以下の一般構造
【００２８】
【化３】
構造番号１
を有しており：Ｒ１及びＲ２は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。
【００２９】
この化合物は陽イオン性として考えられる。なぜなら、この分子は、全体的に正電荷を有しているからである（ゼータポテンシャルが正）。この化合物は、両親媒性であると考えられる。なぜなら、この分子は、一端には疎水性基を有し、他端には親水性基を有しているためである。疎水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基は水を排除する。典型的に、疎水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基は水を排除する。炭化水素は、疎水性基である。親水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基は水を好む性質を有している。典型的に、かかる化学残基は、水溶性であり、水に対して水素結合供与基又は受容基である。親水性基の例には、以下の化学残基を有する化合物が含まれる；つまり、炭化水素、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシ、アミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基などを含む置換基である。
【００３０】
好適実施例において、これらの両親媒性化合物は、ポリカチオン及びｓｉＲＮＡと組み合わされて３つの要素を有する複合体を形成し、細胞にこのｓｉＲＮＡを送達する目的で動物に関連付けられる。他の好適実施例において、これらの両親媒性化合物は、例えば脂質など他の両親媒性化合物と組み合わされても良く、その後、動物細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに用いられる。
【００３１】
ｓｉＲＮＡは、短鎖の、１５から５０塩基対、又は好ましくは２１から２５塩基対の二本鎖リボ核酸である。「核酸」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドを有するポリマーを参照する技術用語である。天然のヌクレオチドは、デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）基、リン酸基及び塩基を有している。塩基には、プリン類及びピリミジン類が含まれ、さらに、天然の化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然のアナログが更に含まれる。プリン類及びピリミジン類に関する合成誘導体は、限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート及びハロゲン化アルキルなどの塩基上に新規の反応基を置換する改変物を含む。「塩基」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡに関する種々の公知の塩基アナログを包含し、限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドリキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン及び２，６−ジアミノプリンを含む。ヌクレオチドは<核酸ポリマーの単量体単位であって、天然のポリヌクレオチドではリン酸基を介して共に結合されている。天然のポリヌクレオチドは、リボース−リン酸骨格を有している。人工又は合成のポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて重合化されており、同じ又は同様の塩基を含んでいるが、天然のリボース−リン酸骨格とは異なるタイプの骨格を有していてもよい。これらの骨格に含まれるのは、限定されないが、ＰＮＡ類（ペプチド核酸）、フォスフォロチオエート、フォスフォロジアミデート、モルフォリノ類及び天然のポリヌクレオチドにおけるリン酸骨格に関するその他のバリアントである。
【００３２】
ｓｉＲＮＡは、遺伝子の一部と同一及びほぼ同一の配列を有している。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて重合化されていてもよく、リコンビナントＲＮＡ又はこれらの基の誘導体はキメラ配列を有している。このｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害するように、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又は種々の適切な組み合わせを含んでいても良い。このＲＮＡは、好ましくは二本鎖であるが、単鎖、三本鎖又は４本鎖であってもよい。
【００３３】
送達されたｓｉＲＮＡは、細胞質又は核の内部に保持することが可能である。ｓｉＲＮＡは、内在的又は外来的なヌクレオチド配列の発現を阻害すべく、或いは、一般的に細胞に関連付けられていない特定の生理学的特性に影響を及ぼすべく細胞に送達されてもよい。
【００３４】
ここで、タンパクは、ポリペプチドにおいて、互いに結合された２つのアミノ酸残基以上の線形シリーズを参照している。疾病状態を減弱し又は阻止することに関するタンパク質の「治療学的」効果は、細胞内に留まるか、細胞膜に結合し続けるか、一般循環又は血流に進入することが可能な細胞から分泌され、且つ分離されることにより達成されてもよい。治療的な分泌タンパクは、ホルモン、サイトカイン、成長因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク（例えばα１−アンチトリプシン）、血管新生タンパク（例えば、血管上皮細胞生長因子、線維芽細胞成長因子など）、抗血管新生タンパク（例えば、エンドスタチン、アンジオスタチンなど）及び血液中に存在するその他のタンパクを含む。細胞膜上のタンパク質は、タンパク又はリポタンパクを取り込むべく、細胞に受容体を供することにより治療的な効果を有することも可能である（例えば低密度リポタンパク受容体）。細胞内に存在する治療的タンパク（「細胞内タンパク質」）は、フェニルケトン尿など、循環する毒性代謝物を排泄する酵素であってもよい。これらはまた、癌細胞の増殖性又は癌原性を減弱させてもよいし（例えば、転移性を減弱させる）、或いはウィルスの複製を阻害してもよい。細胞内タンパクは、細胞骨格（例えば、アクチン、ジストロフィン、ミオシン、ザルコグリカン、ジストログリカンなど）の一部であってもよく、且つ、心筋症及び筋骨格関連疾患（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面・肩甲・上腕型筋ジストロフィーなど）であってもよい。心臓疾患を処置する特定の他の治療タンパクには、心筋収縮性に影響を与えるポリペプチド（例えば、カルシウム及びナトリウムチャネル）、再狭窄阻害剤（例えば、一酸化窒素合成酵素）、血管新生因子、及び抗血管新生因子などが含まれる。
【００３５】
ｓｉＲＮＡは、治療的な細胞変化を生じさせるべく、細胞に送達されてもよい。治療的な目的（疾患を処置したり防止することを含む動物における健康状態を向上させる技術）に関連して、ｓｉＲＮＡ又は他の遺伝子に関連する物質の送達は、遺伝子治療と呼ばれている。ｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕにて器官に直接送達されてもよいし、ｅｘ ｖｉｖｏにて細胞に間接的に導入し器官に移植されてもよい。タンパクの合成を阻害したりＲＮＡ量を減少させるには、ｓｉＲＮＡを細胞へと導入することが必要である。主要な変異遺伝子により惹き起こされる常染色体性優性筋ジストロフィーなどの疾患は、治療的なｓｉＲＮＡを用いた処置に関する候補例である。ｓｉＲＮＡの送達は、主要タンパクの産生を阻害し、これにより、疾患症状を減弱させる。
【００３６】
ポリカチオンは、概ね正荷電を有するポリマーを意味しており、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ヒドロキシブロマイド、ポリエチレンイメイン又はヒストンなどが挙げられる。重合体性ポリカチオンは、正荷電、中性荷電又は負荷電を有する単量体ユニットを含んでいてもよいが、ポリマーのネットでの荷電は、正荷電であるべきである。また、ポリカチオンは、２つ以上の正荷電を有する非重合性分子も意味している。
【００３７】
ＤＮＡ結合タンパクは、本発明における応用例にて述べた条件下で核酸に関連付けられるタンパクであって、核酸に対して高い結合定数を有する複合体を形成している。このＤＮＡ結合タンパクは、天然型にて効果量を用いてもよく、又はこの目的に関連して改変された型にて用いられても良い。このポリカチオンの「効果量」は、ｓｉＲＮＡの送達を生じさせることができる量である。好適実施例において、このポリカチオンは、ポリヌクレオチド結合タンパクであって、牛胸腺などの動物組織に由来したものや、大腸菌にてリコンビナントにて合成されたものである。好ましくは、このポリヌクレオチド結合タンパクは、ヒストンタンパクなどの陽イオン性を有している。ヒストンＨ１タンパクは、好適なヒストン型であって、複数の供給者（Ｓｉｇｍａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなど）から購入することが可能である。
【００３８】
（その他の定義）
（脂質）
水に不溶性であるが、クロロフォルムやベンゼンなどの有機系溶媒に可溶な、複数の異なる有機系化合物群である。脂質は、親水性及び疎水性部分を有している。脂質は、複合体脂質、単純脂質、及び合成脂質を含むべく意図されている。
【００３９】
（複合体脂質）
複合体脂質は、脂肪酸のエステル体であって、グリセライド（脂肪又は油）、糖脂質、リン脂質及びワックスを含んでいる。
【００４０】
（単純脂質）
単純脂質は、ステロイドやテルペン類を含んでいる。
【００４１】
（合成脂質）
合成脂質は、脂肪酸から調製されたアミドを含んでおり、そのカルボン酸は、アミド、１つ以上の原子が他のヘテロ原子（例えば、窒素やイオウ）などにより置換されている複合体脂質の合成変異体、追加の疎水性基が化学結合されている単純脂質の誘導体に変換されている。合成脂質は、１つ以上の遊離基を有していてもよい。
【００４２】
（脂肪）
脂肪は、長鎖カルボン酸のグリセロールエステル体である。脂肪の加水分解により、グリセロール及びカルボン酸、つまり脂肪酸、を産生する。脂肪酸は、飽和又は不飽和（１つ以上の二重結合を有する）であってもよい。
【００４３】
（油）
油は、カルボン酸のエステル体であるか、或いは、脂肪酸のグリセライドである。
【００４４】
（糖脂質）
糖脂質は、脂質を有する糖体である。この糖体は、典型的には、ガラクトース、グルコース又はイノシトールである。
【００４５】
（リン脂質）
リン脂質は、リン酸基及び１つ以上の脂肪酸（脂肪酸のエステル体として）の両方を有する脂質である。このリン酸基は、１つ以上の有機基に結合されていてもよい。
【００４６】
（ワックス）
ワックスは、種々の形態の固形、又は半固形の物質であって、一般的に脂肪酸のエステル体である。
【００４７】
（ポリイミダゾリニウム）：
ポリイミダゾリニウムは、１つ以上のイミダソリニウムなるサブユニットを有するポリマー（ランダム共重合体、ブロック共重合体又はその他の共重合体）である。ポリイミダゾリニウムは、イミダソリニウムのホモポリマーも意味している。このイミダソリニウムなるサブユニットは、ポリマーの主鎖であってもよいし、或いは、ポリマーの主鎖における側鎖であってもよい。このポリマーは、ネットでの天然型ポリマー、ポリカチオン、又はポリアニオンであってもよい。
【００４８】
（イミダゾリニウム（イミダゾリニウムサブユニット））
【００４９】
【化４】
イミダソリニウム（イミダソリニウムサブユニット）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４ａ、Ｒ５ａ及びＲ５ｂなるサブユニットは、種々の置換において、独立して、水素ラジカル又は炭素ラジカルであってもよい。対イオン（Ｘ）は、種々の対イオンであってもよい。対イオンには、限定されないが、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、及びトシレートを含む。
【００５０】
（ポリ−２−イミダゾリン）
ポリ−２−イミダゾリンは、１つ以上のイミダソリニウムなるサブユニットを有するポリマー（ランダム共重合体、ブロック共重合体又はその他の共重合体）である。また、ポリ−２−イミダゾリンは、２−イミダゾリンサブユニットを有するホモポリマーをも意味している。このイミダゾリンサブユニットは、ポリマーの主鎖であってもよいし、或いは、ポリマーの主鎖における側鎖であってもよい。このポリマーは、ネットでの天然型ポリマー、ポリカチオン、又はポリアニオンであってもよい。
【００５１】
（２−イミダゾリン（２−イミダゾリンサブユニット））
【００５２】
【化５】
２−イミダゾリン（イミダゾリンサブユニット）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４ａ、Ｒ５ａ及びＲ５ｂなる置換基は、種々の置換において、独立して、水素ラジカル又は炭素ラジカルであってもよい。
【００５３】
（複合体）
複合化又は複合体形成と呼ばれる工程を介して複合体を形成すべく、２つの分子が組み合わされており、静電気的相互作用、水素結合、及び疎水結合などの非共有的総合作用を介して互いに接している。
【００５４】
（改変）
二番目の分子により、いわゆる改変なる工程を介して改変物を形成すべく、分子が改変され、この２つの分子は、共有結合を介して結合される。つまり、この２つの分子は、一番目の分子に由来する原子と二番目の原子に由来する原子との間で共有結合を形成しており、新規な単一の分子を形成する。化学的共有結合は、電子密度の共有が存在する２つの分子間での相互作用した結合である。また、改変は、非共有結合を介して、２つの分子間での相互作用も意味している。例えば、クラウンエーテルは、特定のアミノ酸にて非共有結合を形成してもよい。
【００５５】
（塩）
塩は、イオン結合を含む種々の化合物であり、１つ以上の電子が他の原子に完全に移行した結合である。塩は、溶液に溶解した場合、陽イオンと陰イオンとに解離するイオン性化合物であって、溶液にイオン強度が増加する。
【００５６】
（薬物学的許容可能塩）
薬物学的許容可能塩は、酸及び塩基付加塩の両方を意味している。
【００５７】
（薬物学的許容可能酸付加塩）
薬物学的許容可能酸付加塩は、生物学的に有効で遊離塩基の特性を有する塩であって、生物学的その他望ましくないものではなく、無機酸及び有機酸にて形成され、例えば、無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸及びこれに類似する酸が含まれ、有機酸には、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロニル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸及びこれに類する酸が含まれる。
【００５８】
（薬物学的許容可能塩基付加塩）
薬物学的許容可能塩基付加塩は、生物学的に有効で遊離酸の特性を有するする塩であって、生物学的その他望ましくないものではない。この塩は、無機塩基を加えるか、遊離酸に有機塩基を加えて調製される。無機塩基に由来する塩には、限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩及びアルミニウム塩及びこれに類する塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、限定されないが、一級、二級及び三級アミンが含まれ、例えば、メチルアミン、トリエチルアミン及びこれに類するアミンが挙げられる。
【００５９】
（内部ポリ電解質複合体）
内部ポリ電解質複合体は、反対する荷電のポリ電解質間の非共有な相互作用である。
【００６０】
（荷電、極性及びサイン）
化合物の荷電、極性及びサインは、化合物が１つ以上の電子（正荷電、極性又はサイン）を失うかどうか、或いは、１つ以上の電子（正荷電、極性又はサイン）を取得するかどうかを参照している。
【００６１】
（細胞標的化シグナル）
細胞標的化シグナル（又はシグナル）は、本願において、薬物又は核酸などの生物学的に活性を有する化合物を改変する分子として規定されており、培養条件又は全器官の両方において、（組織などの）細胞配置又は細胞の位置に作用可能である。外来遺伝子の細胞内又は組織配置を改変することにより、生物学的に活性を有する化合物の機能は促進可能である。
【００６２】
この細胞標的化シグナルは、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭化水素（非発現）ポリ核酸又は合成化合物であってもよい。この細胞標的化シグナルは、受容体への細胞結合、核への細胞質輸送及び核移行を促進するか、或いは、エンドソームやその他の細胞内ベシクルから遊離させる。
【００６３】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、核近傍への薬物の標的化及び／又は核内部への移行を促進する。かかる核移行シグナルは、タンパクであっても、ペプチドであってもよく、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳやヌクレオプラスミンなどが挙げられる。これら核局在化シグナルは、例えば、カリオフェリンβと相互作用するＮＬＳ受容体（カリオフェリンα）など種々の核移行因子と相互作用する。核移行タンパクは、それ自身、ＮＬＳとして機能する。なぜなら、これらは、核孔又は核に標的化されているからである。例えば、カリオフェリンβは、それ自身、ＤＮＡを核孔複合体へ標的化することができる。複数のペプチドは、ＳＶ４０Ｔ抗原に由来している。これらには、短鎖のＮＬＳ又は長鎖のＮＬＳを含む。他のＮＬＳペプチドは、Ｍ９タンパク、ヌクレオプラシミン及びｃ−ｍｙｃに由来する。
【００６４】
細胞内分画からの放出を促進するシグナル（放出シグナル）は、エンドソーム（初期及び後期）、ライソゾーム、ファゴソーム、ベシクル、滑面小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）及び筋小胞体などの細胞内小器官からのＤＮＡの放出を惹き起こす可能性がある。この放出に含まれるのは、細胞内分画から細胞質への移動や、又は細胞内分画から核などの小器官への移動である。放出シグナルに含まれるのは、クロロキン、ファビロマイシン又はベレフェルディンＡなどの化学物質、ＥＲ保持シグナル（ＫＤＥＬ配列）、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンサブユニットＨＡ−２ペプチドなどのウィルス成分及び他のタイプの両親媒性ペプチドである。
【００６５】
細胞性受容体シグナルは、細胞と生物学的に活性を有する化合物との関連付けを促進する種々のシグナルである。これは、化合物の細胞表面への結合性を増加し及び／又は細胞内分画との関連付けの両方により達成されてもよく、例えば：細胞表面の結合性を促進することによるエンドサイトーシスを促進するリガンドなどを挙げることができる。これに含まれるのは、アシオログライコプロテインやガラクトース残基を用いることによるアシアログライコプロテイン受容体へ標的化する物質である。インスリン、ＥＧＦ又はトランスフェリンなどの他のタンパク質を標的化に用いてもよい。ＲＧＤ配列を含むペプチドは、多くの細胞を標的化するのに用いてもよい。細胞膜上のチオール、スルフヒドリル又はジスルフィド基などの他の標的化群には、脂質、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及び両親媒性誘導体などの膜と相互作用する分子を含んでいる。加えて、ウィルスタンパク質を細胞と結合するのに用いてもよい。
【００６６】
（相互作用モディファイヤー）
相互作用モディファイヤーは、相互作用モディファイヤーを含まない分子に相対して、分子がそれ自身と又は他の分子と相互作用する方式を変更する。この改変の結果として、自己相互作用又は他の分子との相互作用は、増加又は減弱される。例えば、細胞標的化シグナルは、分子と分子又は細胞内分画との間の相互作用を変化させる相互作用モディファイヤーである。ポリエチレングリコールは、１つの相互作用モディファイヤーであって、分子とそれ自身及び他の分子との相互作用を減弱させる。
【００６７】
（リンケージ）
２つの他の基（化学残基）との共有結合又はスペーサーを提供する結合である。リンケージは、電気的に中性であってもよく、或いは、正又は負に帯電していてもよい。この化学残基は、疎水性又は親水性であってもよい。好適なスペーサー群に含まれるのは、限定されないが、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ６−Ｃ１８アラルキル、Ｃ６−Ｃ１８アラルケニル、エステル、エーテル、ケトン、アルコール、ポリオール、アミド、アミン、ポリグリコール、ポリエーテル、ポリアミン、チオール、チオエーテル、チオエステル、リン含有物質、及び複素環などである。リンケージは、１つ以上の不安定結合を有していてもよい。
【００６８】
（二機能性）
クロスリンカーとして通常参照される二機能性分子は、２つの分子と共に結合すべく使用され、つまり、２つの分子間のリンケージを形成する。二機能性分子は、ホモ又はヘテロな二機能性を有していてもよい。
【００６９】
（不安定結合）
不安定結合は、選択的に切断可能な共有結合である。つまり、不安定結合は、他の共有結合の切断を伴うことなく、他の共有結合の存在下で切断されてもよい。例えば、ジスルフィド結合は、分子に存在する可能性のある炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−イオウ結合、炭素−窒素結合などの他の結合の切断を伴うことなく、チオールの存在下で切断可能である。不安定が意味するのは、切断可能であるということである。
【００７０】
（不安定リンケージ）
不安定リンケージは、不安定結合を有する化学物質であって、２つの他の基との間のスペーサー又はリンクを提供する。リンクされるこの基は、以下から選択されてもよい。つまり、生物学的活性化合物、膜活性化化合物、膜活性を阻害する化合物、機能性反応性基、モノマー及び細胞標的化シグナルである。スペーサー基は、化学残基を含んでいてもよく、これらは以下の群から選択される。つまり、アルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリコール、アミド、単糖体、多糖体及び酸素、イオウ若しくは窒素などのヘテロ原子である。スペーサーは、電気的に中性であってもよいし、或いは、正又は負荷電していてもよいし、あるいは、全体として中性、正、又は負荷電しつつ正荷電及び負荷電していてもよい。
【００７１】
（ｐＨ−不安定リンケージ及び結合）
ｐＨ不安定性とは、産生条件下（ｐＨ<７）での共有結合の選択的な切断を参照している。つまり、ｐＨ不安定結合は、他の共有結合の存在下、これらを切断することなく、切断されてもよい。
【００７２】
（両親媒性化合物）
両親媒性化合物は、親水性（水溶性）部分と、疎水性（不溶性）部分とを有している。親水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基が水を好む性質を有しているということである。典型的には、かかる化学基は、水溶性であり、且つ水素結合供与基であるか、或いは水の受容基である。親水性基の例には、以下の残基を有する化合物が含まれる：炭水化物、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基を含む基である。疎水性基は、定量的ない見合いで、その化学残基は水を排除する性質を有している。典型的に、かかる化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない。炭化水素は、疎水性基である。
【００７３】
（ポリマー）
モノマーと呼ばれるより小さなユニットが共に繰り返し結合することにより構築される分子である。本願の応用例において、ポリマーなる用語が含むのは、２から約８０のモノマーを有するオリゴマーと８０以上のモノマーを有するポリマーとを含んでいる。ポリマーは、リンカー、分岐ネットワーク、スター、コンブ、又はラダー型のポリマーであってもよい。ポリマーは、単一のモノマーが用いられるホモポリマーであってもよく、或いは、２つ以上のモノマーが使用される共重合体であってもよい。共重合体のタイプに含まれるのは、代替、ランダム、ブロック及びグラフト型である。ポリマーの主鎖は、ポリマー長の伸張に必要な結合を有する原子から構成されている。ポリマーの側鎖は、ポリマー長の伸張に必要ではない結合を有する原子から構成されている。重合化技術における当業者にとって、上述の工程に利用可能な重合化工程には種々の分離が存在している。この重合化は、チェイン又はステップであってもよい。この分類に関する既述は、追加及び濃縮ポリマーの終了にしばしば使用されている。「Ｍｏｓｔ ｓｔｅｐ−ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｍｏｓｔ ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｒｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ" （Ｍ．Ｐ Ｓｔｅｎｖｅｎｓ ｐｏｒｙｍｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９０）である。テンプレートポリ重合化は、ドーターポリマーからポリマーを形成すべく使用してもよい。
【００７４】
（ステップ重合化）
重合化ステップにおいて、重合化は、ステップ毎の様式にて行う。ポリマー伸張は、モノマー、オリゴマー及びポリマー間の反応により起こる。イニシエーターは必要ない。なぜなら、一貫して同様の反応であり、末端はすでに反応性を有しているので終了ステップが存在しないためである。重合化率は、機能性基の減少につれて低下する。典型的にステップ重合化は、２つの異なる方法のいずれかにより行われる。１つの方法は、モノマーが同一の分子にて反応性を有する機能性基（Ａ及びＢ）を有しており、
Ａ−Ｂは、−［Ａ−Ｂ］−
を生成する。また、他の方法は、２つの二機能性モノマーを有している。
【００７５】
Ａ−Ａ＋Ｂ−Ｂは、−［Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ］−
を生成する。
【００７６】
一般に、これらの反応には、アシレーション又はアルキレーションが含まれてもよい。アシレーションは、分子にアシル基（−ＣＯＲ）を導入することで定義されている。アルキレーションは、分子にアルキル基を導入することで定義されている。
【００７７】
もし、機能性基Ａがアミンであると、Ｂは、（限定されないが）、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、スルフォニルクロライド、アルデヒド（ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドを含む）、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルフォスフェート、アリルハライド（ジフルオロ−ジニトロベンゼン）、無水物、酸ハライド、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｏ−ニトロフェニルペンタクロロフェニルエステル、又はペンタフルオロフェニルエステルであってもよい。他の場合、機能性基Ａがアミンである場合、機能性基Ｂは、アシル化剤又はアルキル化剤又はアミン化剤であってもよい。
【００７８】
機能性基Ａがチオール又はスルフヒドリルである場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、ヨードアセチル誘導体、マレイミド、アジリジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体、又はジスルフィド誘導体（例えば、ピリジルジスルフィド又は５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体）であってもよい。
【００７９】
機能性基Ａがカルボン酸塩である場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、そのジアゾアセテート又は使用されるカルボジイミドのアミンであってもよい。カルボニルジイミダゾール、ジメチルアミノピリジン、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド又はアルコールなど、カルボジイミド及びジメチルアミノピリジンを使用して、他の付加物を使用してもよい。
【００８０】
機能性基Ａが水酸基である場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、エポキシド、オキシラン及び使用されるカロボニルジイミダゾール又はＮ，Ｎ’−ジサクシニミジルカーボネートのアミン、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルクロロフォーメート又はその他のクロロフォーメートのアミンであってもよい。
【００８１】
機能性基Ａがアルデヒド又はケトンである場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、アミン（ＮａＣＮＢＨ３などの還元剤により還元されてもされなくてもよいイミン又はイミニウムを形成すべく）、又は水酸基化合物であってもよく、ケトン又はアセタールを形成する。
【００８２】
他の手法は、１つのモノマーを有すべく、
Ａ−Ａ＋他の試薬にて−［Ａ−Ａ］−
を生成する方法である。機能性基Ａがチオール、スルフヒドリルである場合、ヨウ素（Ｉ２）又はＮａＩＯ４（ペリオデートナトリウム）や酸素などの酸化剤によりジスルフィド結合に変換されてもよい。機能性基Ａは、チオール、スルフヒドリル、酸化及びジスルフィド形成を実行する２−イミノチオレート（トラウト試薬）による反応による基に変換されるアミンであってもよい。ジスルフィド結合形成を触媒すべく、（ピリジルジスルフィド又は５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体などの）ジスルフィド誘導体を使用してもよい。
【００８３】
上述の例のいずれかにおける機能性基Ａ又はＢは、光反応基であってもよく、例えば、アリルアジド、ハロゲン化アリルアジド、ジアゾ、ベンゾフェノン、アルキン又はジアリジン誘導体などが挙げられる。
【００８４】
アミン、水酸基、チオール、スルフヒドリル、カルボキシル基の反応によりアミド、アミジン、ジスルフィド、エーテル、エステル、エナミン、尿素、イソチオウレア、イソウレア、スルフォンアミド、カーボネート、炭素−窒素二重結合（イミン）、アルキルアミン結合（二級アミン）、炭素が水酸基を有する炭素−窒素単結合、チオエーテル、ジオール、ヒドラゾン、ジアゾ、又はスルフォンなどの化学結合を生成する。
【００８５】
連鎖重合：ポリマーの連鎖重合化伸張は、モノマーユニットを連続して添加し、限定した数の鎖の成長により起こる。この反応の開始及び伸張機構は、異なっており、通常、伸張停止ステップである。この重合化率は、モノマーが消失するまで一定に保持される。
【００８６】
ビニル、アクリレート、メタクリレート、メタクリルアミド基を有するモノマーは、連鎖反応を実行してもよく、ラジカルであっても、陰イオン性であっても、陽イオン性であってもよい。連鎖重合化は、閉環又は開環重合化により達成されてもよい。反応開始における種々の異なるタイプのフリーラジカルを使用してもよく、パーオキサイド、ヒドロキシパーオキサイド、及び２，２’−アゾビス（アミジノプロパン）ジヒドロクロライド（ＡＡＰ）などのアゾ化合物が含まれる。化合物は、２つ以上の要素により製造された材料である。
【００８７】
モノマーのタイプ：重合化工程には、種々の広範なモノマーを使用してもよい。これらに含まれるのは、アミン、イミジン、グアニジン、イミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、複素環（イミダゾール、ピリジン、モルフォリン、ピリミジン、又はピレンなど）などの正荷電した有機系モノマーである。このアミンは、ｐＨ感受性であってもよく、このアミンのｐＫａは、４から８の生理学的な範囲内である。特定のアミンに含まれるのは、スペルミン、スペルミジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン（ＡＥＰＤ）、及び３，３’−ジアミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルジプロピルアンモニウムブロマイドである。
【００８８】
また、モノマーは、疎水性、親水性又は両親媒性であってもよい。また、モノマーは、アクリジン、チアゾールオレンジ又はエチジウムブロマイドなどの挿入剤であってもよい。
【００８９】
モノマー及びポリマーに関する他のコンポーネント：ポリマーは、その利用性を増大させる他の群を有している。この群は、ポリマー形成に先立ちモノマーに導入されてもよいし、ポリマー形成の後にポリマーに結合されてもよい。この群に含まれるのは：標的化群としてポリマーを標的化するために使用される群であるが、特定の細胞又は組織に対する核酸複合体である。かかる標的化試薬の例に含まれるのは、アシオログライコプロテイン又はガラクトース残基を用いたアシアログライコプロテイン受容体への標的化剤である。標的化には、例えば、インスリン、ＥＧＦ又はトランスフェリンなどの他のタンパクを使用してもよい。タンパク質は、互いに結合した２つ以上のアミン酸で構築された分子を参照している。このアミノ酸は、天然由来でも合成でもよい。ＲＧＤ配列を有するペプチドは、多くの細胞を標的化するのに用いられてもよい。細胞膜上のチオール、スルフヒドリル又はジスルフィド基と反応する化学品群は、多くのタイプの細胞を標的化するのに用いられてもよい。標的化には、葉酸及びその他のビタミン類を用いてもよい。他の標的化群含まれる分子は、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及びアムフォテリシン誘導体などの膜と反応する分子である。
【００９０】
超分子複合体を細胞に相互作用させた後、薬物の送達、又は細胞の特定部分への核酸の送達性を増加すべく他の標的化群を使用してもよい。例えば、エンドソームを崩壊させるべく試薬を使用してもよく、核に標的化すべく核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用してもよい。
【００９１】
種々のリガンドは、薬物及び遺伝子を細胞及び特定の細胞性受容体に標的化すべく使用されてきた。リガンドは、細胞膜上又は細胞の近傍の細胞膜への標的を検索してもよい。受容体へのリガンドの結合は、典型的にエンドサイトーシスを開始する。ＤＮＡ相対には、リガンドを使用してもよく、エンドサイトーシスが行われない受容体に結合する。例えば、インテグリン受容体に結合するＲＧＤペプチド配列を有するペプチドを使用してもよい。加えて、ウィルスタンパクは、細胞に複合体を結合すべく使用されてもよい。脂質及びステロイドは、細胞膜に複合体を直接挿入すべく使用されてもよい。
【００９２】
また、ポリマーは、それ自身で分解可能な基を有していてもよい。この標的化群に結合する際、分解により、この複合体と標的化群に関連する受容体との相互作用を減弱させる。分解可能な基に含まれるのは、限定されないが、ジスルフィド結合、ジオール、ジアゾ結合、エステル結合、スルフォン結合、アセタール、ケタール、エノールエーテル、エノールエステル、エナミン及びイミンなどである。
【００９３】
（多価電解質）
多価電解質又はポリイオンは、１つ以上の電荷を有するポリマーであって、つまり、このポリマーは、１つ以上の電子を取得するか消失する群を有している。ポリカチオンは、ネットで正荷電している多価電解質であって、例えば、ポリ−Ｌ−リジンがある。ポリカチオンは、正荷電、中性荷電又は負荷電しているモノマーユニットを有していてもよいが、このポリマーのネットでの電荷は正荷電でなければならない。また、ポリカチオンは、２つ以上の正電荷を有する非重合型分子を意味していてもよい。ポリアニオンは、ネットで負電荷を有する多価電解質である。このポリアニオンは、正荷電、中性荷電又は負荷電しているモノマーユニットを有していてもよいが、このポリマーのネットでの電荷は負荷電でなければならない。また、ポリアニオンは、２つ以上の負電荷を有する非重合型分子を意味していてもよい。両性イオンなる用語は、同様の分子の一部である酸性基と塩基性基との反応生成物（塩）を参照している。
【００９４】
（立体構造安定化剤）
立体構造安定化剤は、長鎖の親水性群であって、粒子の静電的相互作用に対する立体障害を起こす粒子による最小産物であるポリマーに対する凝集を阻止している。この例として含まれるのは：アルキル基、ＰＥＧ鎖、ポリサッカライド、アルキルアミンなどであろう。静電気的相互作用は、正電荷と負電荷との間の吸引力に起因する２つ以上の物質における非共有的な関連付けである。
【００９５】
（緩衝液）
緩衝液は、弱酸又は弱塩基及びこれらの塩類から調製される。緩衝液溶液は、この溶液に酸又は塩基を追加した際、ｐＨの変化を阻止する。
【００９６】
（生物学的、化学的、又は生化学的反応）
生物学的、化学的、又は生化学的反応は、イオン及び／若しくは共有結合の形成又は分解を含んでいる。
【００９７】
（反応性を有する）
イオン結合又は共有結合を他の化合物と形成することができる場合、この化合物は反応性を有している。共有結合を形成可能な反応性を有する化合物の一部は、反応性機能性基として参照する。
【００９８】
（ステロイド）
ステロイド誘導体は、ステロール、水酸基残基が改変（例えば、アシル化）されているステロール、ステロイドホルモン、又はこれらのアナログを意味している。この改変は、スペーサー群、リンカー又は反応性を有する群を包含している。
【００９９】
（ステリック）
立体障害又はステリックは、同一の分子内の隣り合う群に起因した化学反応を阻止したり遅らせたりすることである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１００】
１．両親媒性化合物の合成
Ａ．ＭＣ７６３の合成
【０１０１】
【化６】
２５ｍＬのフレーム・ドライド・フラスコに、オレイルクロライド（新規に蒸留したもの、１．０ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）及びラロイルクロライド（０．７ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）をジクロロメタンに溶解したものを窒素下で加えた。得た溶液を、氷浴にて０℃に冷却した。１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（０．５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）に続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）を加えた。この水浴を除去し、溶液を１５時間、室温で撹拌した。この溶液を１ＮのＮａＯＨ（１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮した。
【０１０２】
得た残渣の約３０％を、セミプレパラティブＨＰＬＣにて、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸なる溶離液を用いて、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラム（１５０Å、５μｍ、２５０×２１ｍｍ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ社製）上で精製した。このカラムから３種類の化合物を分離し、マススペクトロメーター（Ｓｃｉｅｘ社製、ＡＰＩ１５０ＥＸ）により評価した。
【０１０３】
ＭＣ７６３（分子量６４７）
ＭＣ７６２（分子量５６４）
ＭＣ＃７９８（分子量７２９．２５）
【０１０４】
【化７】
Ｂ．ＭＣ７６５の合成
【０１０５】
【化８】
２５ｍＬのフレーム・ドライド・フラスコに、オレイルクロライド（新規に蒸留したもの、１．０ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ）、ミリストイルクロライド（０．８３ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）をジクロロメタンに混和した混液を窒素下で加えた。得た溶液を、氷浴にて０℃に冷却した。１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（０．５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）に続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ）を加えた。この水浴を除去し、溶液を１５時間、室温で撹拌した。この溶液を１ＮのＮａＯＨ（１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮した。
【０１０６】
得た残渣の約３０％を、セミプレパラティブＨＰＬＣにて、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸なる溶離液を用いて、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラム（１５０Å、５μｍ、２５０×２１ｍｍ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ社製）上で精製した。このカラムから３種類の化合物を分離し、マススペクトロメーター（Ｓｃｉｅｘ社製、ＡＰＩ１５０ＥＸ）により評価した。
【０１０７】
ＭＣ７６５（分子量６７４）
ＭＣ７６４（分子量６２０）
ＭＣ＃７９８（分子量７２９．２５）
【０１０８】
【化９】
Ｃ．ＭＣ７７４の合成
【０１０９】
【化１０】
０℃に冷却したジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解した１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（１０μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）の溶液に、デカノイルクロライド（２５μＬ、０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１．μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、この溶液を室温にまで加温させた。１２時間後、この溶液を水（２ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮し、ＴＬＣにて精製したＭＣ７７４（２１．６ｍｇ、８７％）を得た。
【０１１０】
Ｄ．ＭＣ７７５の合成
【０１１１】
【化１１】
ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解した１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（１０μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液に、パルミトイル酸（３０．８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１．μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。１２時間後、この溶液をフィルターに通し、水（２ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮し、ＴＬＣにて精製したＭＣ７７５（２１．５ｍｇ、８１％）を得た。
【０１１２】
Ｅ．ＭＣ７７７、ＭＣ７７８、及びＭＣ７７９の合成
【０１１３】
【化１２】
【０１１４】
【化１３】
ジクロロメタン（８ｍＬ）に溶解したベンゾチアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−フォスフォノニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＢＯＰ，１．３００ｇ、２．５００ｍｍｏｌ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社製）に、チオクロ酸（０．２４８ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）及びリノレイン酸（３６５μＬ、１．２０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）を加えた。得た溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６１０μＬ、３．５ｍｍｏｌ）に続いて１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（２０６μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１６時間後、この溶液を水（２０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮し、１．８００ｇの粗品を得た。この粗品の８５ｍｇを２ｍＬのアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）／１ｍＬの水（０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解し、逆相ＨＰＬＣ（１０−９０％のＢで４０分）、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラムにて、精製し、３１．８ｍｇのＭＣ７７７、１．３ｍｇのＭＣ７７８及び１．５ｍｇのＭＣ７７９を得た。
【０１１５】
Ｆ．ＭＣ７８０、ＭＣ７８１及びＭＣ７８２の合成
【０１１６】
【化１４】
【０１１７】
【化１５】
化合物ＭＣ７８０、ＭＣ７８１及びＭＣ７８２は、化合物ＭＣ７７７、ＭＣ７７８及びＭＣ７７９と同様の合成方法を用いて調製した。合成品由来の粗品は、２ｍＬのアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）／１ｍＬの水（０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解し、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラムにて精製し、７．１ｍｇのＭＣ７８０、１３．０ｍｇのＭＣ７８１及び１８．０ｍｇのＭＣ７８２を得た。
【０１１８】
Ｇ．ポリシラザンの合成：
一般的実験：ポリアミンをＤＭＦに溶解し２０から５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。分離した容器において、クロロシロキサンをＴＨＦに溶解し２０から５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。クロロシラン溶液の適当量（改変すべきアミノ残基のモル比に基づいて）をポリアミン溶液に撹拌しながら加え、白色の固体を得た。この反応容器に水を加え、使用直前にポリアミンに基づいて１から１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に調製した。ジイソプロピルアミノメチルポリスチレンなどの固形の支持体塩基を含有していてもよく、フィルター化又は最終溶液の遠心分離により除去した。この一般的な実験手法に従って、以下の化合物を調製した。
【０１１９】
【表１】
試薬：ｂｒＰＥＩ−８００、ｂｒＰＥＩ−１８００；ポリエチレンイミン（塩基ポリマー平均分子量約８００、１８００）、アルドリッチ・ケミカル社製
ＰＥＩ−１０ｋ；ポリエチルイミン（塩基ポリマー平均分子量約１０，０００）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製
ｂｒＰＥＩ−２５ｋ；分岐ポリエチレンイミン（塩基ポリマー平均分子量約２５，０００）、アルドリッチ・ケミカル社製
ジクロロジメチルシラン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジクロロシラン、ジクロロジフェニルシラン、アルドリッチ・ケミカル社製
１，１，４，４−テトラメチル−１，４−ジクロロジシルエチレン、１，３−ジクロロテトライソプロピルジシロキサン、ユナイテッド・ケミカル・テクノロジーズ社製
ジイソプロピルアミノメチルポリスチレン、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製。
【０１２０】
２．ｉｎ ｖｉｖｏにて動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達；
レポーター遺伝子の使用
マーカー又はレポーター遺伝子は、簡便に測定可能な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドであって、例えば、ホタルルシフェラーゼ又はグリーンフルオレッセンスタンパク（ＧＦＰ）である。マーカー遺伝子の産生物の存在が示すのは、細胞がトランスフェクトされており、且つ、産生物量が示すのは、トランスフェクションの効率である。ｓｉＲＮＡ送達方法と組み合わせたルシフェラーゼレポーター遺伝子は、本願において、ｓｉＲＮＡの送達の効率を定量的に同定すべく使用された。
【０１２１】
（トランスフェクション用複合体の調製）
組成物又は３つの要素から構成される複合体は、１つ以上の両親媒性化合物と、有効量のポリカチオンと、ポリヌクレオチドとを混和混和することにより調製された。１つの好適実施例において、ｓｉＲＮＡは、第１に血清不含培地中又は毒性を有しない溶液中にてポリカチオンと混和され、その後、この混液に両親媒性化合物を加えた。ｓｉＲＮＡ、ポリカチオン及び両親媒性化合物を含有する混液を細胞に加えた。他の好適実施例において、両親媒性化合物は、第１に溶液状態のポリカチオンと混和され、この混液にｓｉＲＮＡを加えた。その後、ｓｉＲＮＡ、ポリカチオン及び両親媒性化合物を有する混液を、細胞に添加した。
【０１２２】
Ａ．ＡＴＣＣ哺乳類ＣＯＳ７細胞へのｓｉＲＮＡの送達
ＣＯＳ７細胞は、１０％の胎仔牛血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ中で保持された。全ての培養は、３７℃にて、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で行った。トランスフェクション前約２４時間に、細胞を、Ｔ７５フラスコ中に適当な密度にて載置し、一昼夜インキュベートした。約５０％のコンフレントに達した際、細胞は、最初、ｐＧＬ−３コントロール（ホタルルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）及びｐＲＬ−ＳＶ４０（シー・パンジールシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）にて、ＴｒａｎｓＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬を用いて、製造者の推奨する方法に従って（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、トランスフェクトされた。１５μｇのｐＧＬ−３コントロール及び５０ｎｇのｐＲＬ−ＳＶ４０を、５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混和した４５μＬのＴｒａｎｓＴ−ＬＴ１に加え、室温にて５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳにて洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡにて回収し、培地に懸濁し、１０％の血清を含有する２５０μＬのＤＭＥＭを用いて２４穴プレートに載置し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１２３】
その後、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）、０．６ｐｍｏｌを、ウェル当たり１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに混和した、示した送達剤に混和し、室温で５分間インキュベートし、３７℃で細胞に加えた。
【０１２４】
ｐＧＬ−３コントロールプラスミドは、ＳＶ４０エンハンサー及びアーリープロモーター領域にて翻訳制御されたホタルｌｕｃ＋のコーディング領域を有している。ｐＲＬ−ＳＶ４０プラスミドは、ＳＶ４０エンハンサー及びアーリープロモーター領域にて翻訳制御されたＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓなるシー・パンジーのルシフェラーゼのコーディング領域を有している。
【０１２５】
３’末端が突出した、単鎖の遺伝子特異的なアンチセンスＲＮＡオリゴマーを調製し、ＰＡＧＥ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製、ＬａＦａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）にて精製した。２つの相同性を有するオリゴヌクレオチドを４０μＭずつを、２分間、９４度で加熱しながら、２５０μＬの１００ｍＭＮａＣｌ／５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液にてアニールし、１分間９０℃に冷却し、その後、一分間当たり１℃の割合で２０℃にまで冷却した。得たｓｉＲＮＡを２０℃で使用前まで保存した。
【０１２６】
ｐＧＬ−３コントロール中のｌｕｃ＋遺伝子と同一のセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有しており：
【０１２７】
【化１６】
ｌｕｃ＋のリーディングフレームの１５５番目から１７３番目までの配列に対応している。上述のヌクレオチドにある「ｒ」という文字が示すのは、リボヌクレオチドである。ｐＧＬ−３コントロール中のｌｕｃ＋遺伝子と同一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有しており：
【０１２８】
【化１７】
ｌｕｃ＋のリーディングフレームのアンチセンス方向に、１７３番目から１５５番目までの配列に対応している。上述のヌクレオチドにある「ｒ」という文字が示すのは、リボヌクレオチドである。ｌｕｃ＋のコーディング配列を有する、アニールされたオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋として参照する。
【０１２９】
細胞を２４時間後に回収し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。Ｌｕｒｎａｔ ＬＢ９５０７（ＥＧ&Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）ルミノメーターを用いた。ルシフェラーゼの発現量は、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔにて記録した。その後、シー・パンジーのルシフェラーゼ発現に関して適正化し、ｓｉＲＮＡを欠除するホタルルシフェラーゼ発現に対する百分率にて示した。少なくとも２つのウェルにおける細胞に関する平均値として示した。
【０１３０】
【表２】
表Ａ．ｅＰＥＩにＭＣ＃７３３を添加すると、ｓｉＲＮＡの生物学的活性が上昇した
表Ａ．における結果が示すのは、ｅＰＥＩと組み合わせて両親媒性化合物ＭＣ＃７９８を添加することによりｓｉＲＮＡの送達が有意に促進された、ということである。最大送達は、ＰＥＩ／ＭＣ＃７９８の比率が４：１（重量／重量）の際に達成された。
【０１３１】
表１．ｅＰＥＩ及び両親媒性化合物処方を用いた、ｐＧＬ３コントロールをトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞へのｓｉ−ＲＮＡ−Ｌｕｃ＋の送達
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
【表４】
この結果は、示した組成物を用いて、ＣＯＳ７細胞へのｓｉＲＮＡの効果的な送達を示している。
【０１３４】
Ｂ．エトキシル化ＰＥＩ／ＭＣ＃４９８により媒介されたｓｉＲＮＡの送達は、培養下の哺乳類細胞における標的遺伝子の発現の阻害において顕著な効果を示す。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋のＩＣ５０を同定すべく、トランジエントにトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の滴定を行った。結果が示すのは、標的となるｌｕｃ＋の発現を５０％阻害するのに必要なｓｉＲＮＡの濃度は、約０．１８ｎＭであるということである（表Ｂ）。この濃度は少なくとも、最も効果的なアンチセンス分子に必要な濃度の１００倍以下である(非特許文献２９)。ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋による最大阻害は２５から１００ｎＭで惹起され、ほぼ９５％であった。これは、ルシフェラーゼ発現を惹起すべく使用されたプラスミド中に含まれているＳＶ−４０エンハンサーにより与えられた高いレベルである。ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋のセンス又はアンチセンスＲＮＡのいずれか（表Ｂ）、或いは、プラスミドにおける配位列に標的化されたｓｉＲＮＡが送達される際（データは示さず）には、阻害は観察されなかった。これらの結果が示すのは、ｓｉＲＮＡは、特定の遺伝子発現を阻害するのに最も効果的な試薬である、ということである。
【０１３６】
【表５】
表Ｂ．ｅＰＥＩ：ＭＣ＃９７８を４：１で用いてｓｉＲＮＡを送達すると、ＣＯＳ−７細胞におけるＬｕｃ＋標的遺伝子発現を強力且つ特異的に阻害する。低い濃度のｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋（０−１ｎＭ）でのＬｕｃ＋の阻害程度が示すのは、約０．１８ｎＭのＩＣ５０を有するということである。
【０１３７】
Ｃ．エトキシル化ＰＥＩ／ＭＣ＃９８７は、多重化細胞株へのｓｉＲＮＡの送達に効果的である。
【０１３８】
また、ｓｉＲＮＡの効果は、ルシフェラーゼ発現プラスミドをトランジエントにトランスフェクトした他の細胞株において検討した。２９３細胞、ＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞への１ｎＭの濃度でのｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の送達は、それぞれ、ホタルルシフェラーゼ標的遺伝子の発現をそれぞれ７０％、９４％及び８７％と阻害した（表Ｃ）。この結果は期待されていたものに妥当であって、より高い濃度のｓｉＲＮＡは、より高いレベルの阻害をもたらす。野生型のホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドにてステーブルにトランスフェクトしたマウス３Ｔ３細胞において検討した結果では、１ｎＭのｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の送達後にルシフェラーゼ活性が７５％阻害したことを示した。これらの結果が示すのは、ｓｉＲＮＡは、トランジエント及びステーブルにトランスフェクトした哺乳類細胞株の両方において遺伝子発現の阻害が顕著に効果的であるということである。
【０１３９】
【表６】
表Ｃ：ｅＰＥＩ／ＭＣ＃７９８にて媒介したｓｉＲＮＡの送達は、低い濃度のｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）であっても、種々の哺乳類細胞株において発現したｌｕｃ＋を強力に阻害する。
【０１４０】
Ｄ．ポリシラザン／ＭＣ７９８は、ＣＯＳ細胞に対するｓｉＲＮＡの送達に効果的である。
【０１４１】
上述と同様の方法により、ＭＣ６８１は、ｓｉＲＮＡの送達が効果的であることを示した。
【０１４２】
表２．ｅＰＥＩ：両親媒性化合物処方を用いた、ｐＧＬ−３コントロールをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対するｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の送達
【０１４３】
【表７】
Ｅ．ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞に対するＲＮＡオリゴの送達
ＲＮＡオリゴの送達も検討した。ミュータントスプライシングサイトにて一体化したルシフェラーゼ遺伝子を有する市販のＨｅＬａ細胞を用いた。このミュータントスプレイシングサイトは、トランケートされた不活性なルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを産生する。ＲＮＡ塩基対をブロックし、このスプライシングサイトをブロックすることにより、活性を有する全長の酵素の発現が可能となる。従って、この細胞株におけるルシフェラーゼ活性は、直接送達されたＲＮＡ量に比例的である。
【０１４４】
ＨｅＬａＬｕｃ／７０５細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、標準的なＨｅＬａ細胞と同様に培養した。この細胞を３×１０６細胞／ウェルにて２４穴の培養ディッシュに載置し、２４時間培養した。培地を、以下の配列を有する１０ｎＭのＲＮＡオリゴ及びポリカチオン／両親媒性化合物を含有する１．０ｍＬのＤＭＥＭに置換した。
【０１４５】
【化１８】
（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて、４時間インキュベートした。その後、培地を、１０％胎仔牛血清を含有するＤＭＥＭに交換した。その後、細胞をさらに４８時間培養した。細胞を回収し、ライゼートに関して、上述のＬｕｒｎａｔＬＢ９５０７（ＥＧ&Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）ルミノメーター［Ｗｏｌｆｆ、１９９０＃７２］を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１４６】
結果：
表３．ポリカチオン：両親媒性化合物処方を用いた、ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞へのＲＮＡ−オリゴの送達
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
【表９】
ＭＣ７９８と共にｅＰＥＩ及びＭＣ６８１は、ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞へのＲＮＡオリゴの送達性を示した。
【０１４９】
Ｆ．染色体融合レポーター遺伝子におけるｓｉＲＮＡにより媒介された阻害
理想的には、標的となる遺伝子発現におけるｓｉＲＮＡの阻害効果は、内在性遺伝子に対して、完全で、長期間続き、良好に作用することである。これらの特徴は、部分的であり、或いは、短期間の阻害の後に得られるデータの解釈において惹き起こされる困難性を伴うことなく、遺伝子機能の直接的な解析を可能とする。上述の例において我々が示したのは、レポーター遺伝子を用いてトランジエントにトランスフェクトした細胞株において９５％の阻害が達成可能であるというデータである。クロモゾームに組み込まれた遺伝子が阻害可能かどうかを同定すべく、野生型のホタルルシフェラーゼをコードする発現プラスミドをステーブルにトランスフェクトしたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて検討を行った。最終濃度が２５ｎＭのｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋（又はコントロールのｓｉＲＮＡ−ｏｒｉの細胞への）送達に、ＥＰＥＩとＭＣ７９８（ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ）とを組み合わせて用いた。コントロールは、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独を受け入れる細胞及び非処理細胞を含んでいる。実験の間、培地を交換し、４日毎に細胞を継代した。分裂する細胞を、トランスフェクション後１、２、３、７、１０及び１４日目に回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果が示すのは、ルシフェラーゼ発現に対するｓｉＲＮＡ−ｌｕｃの阻害は、検討した日のそれぞれにおいて８０から９５％の範囲であった（表Ｂ下部参照）。コントロールのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞又はＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独で処理した細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルは、非処理細胞に比較して、有意な差ではなかった。これらの結果が示すのは、ｓｉＲＮＡにて媒介されるＲＮＡ干渉は、これらの培養細胞株において高度に効果的であって長期間持続するものであることであり、マウス卵母細胞にて検討した結果から観察されるＲＮＡ干渉にて一貫しており、ＲＮＡ干渉は、５０から１００倍増加していた。
【０１５０】
【表１０】
表Ｂ：ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ由来ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃの単独適用は、ルシフェラーゼ発現において長期間阻害した。データは、コントロールのｓｉＲＮＡ−ｏｒｉを適用した細胞にて標準化した。
【０１５１】
Ｇ．ＥＰＥＩ及びＭＣ７９８を用いた、内在性遺伝子発現（核ラミンＡ／Ｃ）のｓｉＲＮＡにより媒介された阻害
最終濃度を２５ｎＭとして、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ［又はコントロールのｓｉＲＮＡ］の分裂ＣＨＯ細胞への送達に、ＥＰＥＩとＭＣ７９８を組み合わせて（ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ）使用した。コントロールは、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独を適用される細胞又は非処理細胞を含んでいる。実験の間、培地を交換し、４日毎に細胞を継代した。分裂する細胞を、トランスフェクション後、２日目に回収し、細胞質総タンパクを精製した。ラミンＡ／Ｃに標的化されたｓｉＲＮＡ（及びコントロールのｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされた細胞に由来するタンパク質の一部を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３から１２％のグラジエントゲル）を実行し、ナイロンメンブレンに電気を用いてトランスファーした。核ラミンＡ／Ｃのタンパク発現は、ウェスタンブロット分析により定量化した（抗マウスラミンＡ／Ｃ）。結果が示すのは、核ラミン発現のｓｉＲＮＡ−ラミンＡ／Ｃ阻害は、検討した日において８０から９５％であった。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞又はＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独で処理した細胞におけるラミンＡ／Ｃのレベルは、非処理細胞に比べて有意差がなかった。この結果が示すのは、ｓｉＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉は、内在性細胞性遺伝子の発現阻害において高度に効果的である、ということである。
【０１５２】
上述した内容は、本発明の手段のみを例示する目的である。さらに、当業者には種々の改変及び変更を即座に行うことが可能であることから、上述した正確な構造及び制御へと、本発明を限定することを所望するものではない。従って、全ての適切な改変及び等価物は、本発明の範囲内に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンからなる組成物並びにｓｉＲＮＡを動物細胞に送達するためにかかる組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞に存在する二本鎖ＲＮＡが特定の配列と同一又はほぼ同一の遺伝子の発現を阻害する現象である。この阻害は、標的遺伝子から翻訳されたメッセンジャーＲＮＡの分解を惹起する(非特許文献１)。ＲＮＡ干渉の誘導に関与する二本鎖ＲＮＡは、干渉ＲＮＡ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれている。ＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を介した機構及び細胞機構は、遺伝的及び生化学的手法の両方を用いて研究されている。生化学的分析が示唆するのは、細胞質に導入されたｄｓＲＮＡが、２１から２５塩基程度のＲＮＡ断片にプロセッシングされることから始まることである(非特許文献２〜６)。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討で示されたのは、スモールインターフェアリングＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるこれらｄｓＲＮＡは、ＤｉｃｅｒなるＲＮＡｓｅＩＩＩ様酵素により部分的に生成されることである(非特許文献７)。これらｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解のガイドとして機能しているようで、これは、標的ｍＲＮＡが特定のｓｉＲＮＡにより覆われる領域の中心の位置で切断されるためである(非特許文献８)。生化学的事実が示唆するのは、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシングコンプレックス（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多重的なヌクレアーゼ複合体の一部であるということである(非特許文献２)。この複合体タンパクの一つであるアルゴナウテ２（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２）は、アルゴナウテ遺伝子ファミリーの産生物として同定された(非特許文献９)。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのホモログであるｒｄｅ−１及び関連する遺伝子であってＮ．ｃｒａｓｓａのホモログであるｑｄｅ−２を含むこの遺伝子ファミリーは、遺伝的検討によりＲＮＡ干渉に必須であることが示された(非特許文献１０〜１２)。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子スクリーニングにおいて、ＲＮＡ干渉に必須な遺伝子としてｍｕｔ−７が同定された。この遺伝子は、ＲＮＡｓｅＤに類似しており、ｍＲＮＡ分解ステップにおいてその遺伝子産物が機能することを示唆している(非特許文献１３)。
【０００３】
遺伝子の機能解析に繁用的なＣ．ｅｌｅｇａｎｓやＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒなどのモデル系により、哺乳動物における新規な薬物標的の可能性に関連する手がかりを得ることが可能であるにもかかわらず、哺乳類のモデル系における遺伝子機能の解析には、より直接的な手法が存在する。従来示されたのは、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導するのに用いられ、且つ、マウス卵母細胞及び初期胚における標的の遺伝子発現を阻害する、ということである(非特許文献１４、１５)。しかしながら、その他の多くの検討により得られたデータが示すのは、培養哺乳類細胞又は初期胚後の組織においてＲＮＡ干渉を誘導すべくｄｓＲＮＡを使用することは、遺伝子サイレンシングの配列特異的な手法として効果的でないということである(非特許文献１６、１７)。この矛盾は、周知であるインターフェロン合成におけるｄｓＲＮＡ媒介誘導の大部分に起因する可能性があり、この反応経路は卵母細胞や初期胚に存在しない。ｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性化は、細胞生理学及び遺伝子発現に配列特異的な効果を及ぼさない(非特許文献１８〜２１)。インターフェロン反応における主要な組成物は、ｄｓＲＮＡ依存性リン酸化タンパクであるプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）であって、これは、伸張因子であるｅＩＦ２ａをリン酸化し且つ不活性化する。加えて、インターフェロンはｄｓＲＮＡ依存性２−５（Ａ）シンテターゼの合成を誘導し、これは、配列非特異的なＲＮＡｓｅＬの活性化を導く２‘−５’ポリアデニル酸を合成する(非特許文献２２)。
【０００４】
しかしながら、このＰＫＲパスウェイは３０塩基対未満のｄｓＲＮＡにより活性化されず、完全な活性化には、８０塩基対以上のｄｓＲＮＡが必要である(非特許文献１９、２０)。この事実が示唆するのは、より長鎖のｄｓＲＮＡに変えて、ＲＮＡ干渉を惹起するのにｓｉＲＮＡを使用する場合、インターフェロンの反応性の少なくとも一部を経由する可能性があるということである。２１から２５塩基対のｓｉＲＮＡを培養条件下にて哺乳類細胞に送達する検討から得られたデータが示すのは、ＲＮＡ干渉を介した配列特異的な阻害が効果的に起こったということである(非特許文献２３、２４)。これらの検討において遺伝子特異的阻害は、種々の不死化細胞及び初代細胞株の両方にて観察された。強力なエンハンサーを含有する、トランジエントにトランスフェクトされたプラスミドから発現されたレポーター遺伝子に対して標的化されたｓｉＲＮＡを用いると、阻害の程度は８０から９６％の間で変化した。関連しない配列のコントロールのレポーター遺伝子の発現は、このｓｉＲＮＡにより影響されず、且つ、関連しない配列に対して、ｓｉＲＮＡを使用しても阻害は観察されなかった。内在性遺伝子の発現もまた、ｓｉＲＮＡの検出限界以下にて観察阻害されなかった。これらのデータは、哺乳類培養細胞株におけるｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉の特異性及び効果を示し、且つ、インターフェロンの反応性はこの塩基対のｓｉＲＮＡにより活性化されないことが示唆される。この結果により、ＲＮＡ干渉は哺乳細胞における遺伝子発現を効果的に阻害するのに使用可能であることが示唆される。
【０００５】
ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の阻害発現能は明らかに有益である。例えば、多くの疾患は特定の遺伝子又は遺伝子群の異常な発現により惹起される。ＲＮＡ干渉は、有害遺伝子の発現を阻害するのに使用することが可能であって、従って、疾患症状を軽減又は治癒を供することになる。例えば、癌状態又はウィルス複製に貢献する遺伝子を阻害することも可能である。加えて、筋ジストロフィーなどの遺伝的疾患を惹き起こす変異遺伝子を阻害することも可能である。リウマチ症などの炎症性疾患もまた、シクロオキシゲナーゼやサイトカインなどの遺伝子を阻害することにより処置可能である。標的臓器の例として含まれるのは、肝臓、膵臓、脾臓、皮膚、脳、前立腺、心臓などである。加えて、ＲＮＡ干渉は、遺伝子機能を検討するための実在の遺伝子「ノックアウト」動物に類似の動物を繁殖するのに使用することも可能である。
【０００６】
薬物創製もまた、ｓｉＲＮＡ技術により促進される可能性がある。標的の評価に関するｓｉＲＮＡ手法は、活性を有する薬物標的をスクリーニングすべくより早く、より安価な手法を提供するであろう。薬物標的に関する情報は、活性を有する薬物標的を阻害するばかりでなく、阻害タンパク及びそのパスウェイが有意な現象論的効果を有するかどうかを同定することにより収集されるであろう。例えば、ＬＤＬ受容体発現の阻害は血清ＬＤＬレベルを上昇させ、従って、この受容体のアップレギュレーションは、治療学的効果を示唆するであろう。標的遺伝子又はパスウェイだけでなく遺伝子の発現における阻害の反応効果を同定するのに発現アレイを使用することが可能である(非特許文献２５)。機能的パスウェイや（パスウェイに相互作用する）ネットワーク内において遺伝子産物を判別するであろう。
【０００７】
生物学的活性物質を細胞内領域へと効果的に送達するのは、種々のベシクルを用いて達成されてきた。特定のタイプのベシクルの一つであるリポソームは、薬物送達における最も開発されたタイプの一つである。１９７０年代から開発されてきたリポソームは、微小なベシクルであって、親水性及び疎水性領域の両方を有する両性分子を有している。リポソームは１つのタイプの両親媒性分子又は複数の異なる両親媒性分子から形成される。リポソームを用いて生物学的に活性な化合物を複合化するのに複数の方法が開発されてきた。特にリポソームで複合化されたポリヌクレオチドは、哺乳細胞に送達されてきた。ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）の後(非特許文献２６)、複数の陽イオン性脂質がこの目的に合成されてきた。本質的に、全ての陽イオン性脂質は、両親媒性化合物であって、疎水性領域、スペーサー及び陽イオン荷電したアミン（類）を有している。この陽イオン性脂質は、時に、リポソームを形成すべく、ＤＯＰＥ（ヂオレイルフォスファチジルエタノールアミン）などの融合誘導因子脂質に混和される。この陽イオン性リポソームは、その後プラスミドＤＮＡ及びＤＮＡの両性複合体に混和され、リポソームは、組織培養ディッシュ中の細胞やｉｎ ｖｉｖｏに適用される。陽イオン性リポソーム形成におけるプラスミドＤＮＡの混合の容易性、ＤＮＡを複合化する陽イオン性脂質の能力及び比較的高いレベルのトランスフェクション効率は、これらの製剤の利用の増加をもたらしてきた。しかしながら、これらの陽イオン性脂質の製剤は、培養細胞及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて典型的に毒性を有しているという一般的な欠点を有している(非特許文献２７、２８)。最近、脂質は、細胞のトランスフェクションを促進すべく、他のＤＮＡ結合化合物に関連して使用されている。本発明は、動物細胞であるｉｎ ｖｉｔｒｏやｉｎ ｖｉｖｏへの送達に関する生物学的に活性を有する新規なポリイオンを有する複合体の調製に使用されるべく、新規な両親媒性化合物及びこれらの調製方法を提供する。この複合体は、低毒性でありながら細胞外から細胞内へとこのポリイオンを高効率にて移行を促進する。
【０００８】
本発明は、動物細胞であるｉｎ ｖｉｔｒｏやｉｎ ｖｉｖｏに、高効率で低毒性にて、ｓｉＲＮＡを送達する、トランスフェクション試薬及び方法について述べる。本発明における方法は、ＲＮＡ干渉の目的に関して、ｓｉＲＮＡを動物細胞に効果的に送達することを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】P.A. Sharp. Genes Dev 15:485-490., 2001.
【非特許文献２】S.M. Hammond, E. Bernstein, D. Beach and G.J. Hannon. Nature 404:293-296., 2000.
【非特許文献３】A.J. Hamilton and D.C. Baulcombe. Science 286:950-952., 1999.
【非特許文献４】P.D. Zamore, T. Tuschl, P.A. Sharp and D.P. Bartel. Cell 101:25-33., 2000.
【非特許文献５】D. Yang, H. Lu and J.W. Erickson. Curr Biol 10:1191-1200., 2000.
【非特許文献６】S. Parrish, J. Fleenor, S. Xu, C. Mello and A. Fire. Mol Cell 6:1077-1087., 2000.
【非特許文献７】E. Bernstein, A.A. Caudy, S.M. Hammond and G.J. Hannon. Nature 409:363-366., 2001.
【非特許文献８】S.M. Elbashir, W. Lendeckel and T. Tuschl. Genes Dev 15:188-200., 2001.
【非特許文献９】S.M. Hammond, A.A. Caudy and G.J. Hannon. Nat Rev Genet 2:110-119., 2001.
【非特許文献１０】H. Tabara, M. Sarkissian, W.G. Kelly, J. Fleenor, A. Grishok, L. Timmons, A. Fire and C.C. Mello. Cell 99:123-132., 1999.
【非特許文献１１】M. Fagard, S. Boutet, J.B. Morel, C. Bellini and H. Vaucheret. Proc Natl Acad Sci U S A 97:11650-11654., 2000.
【非特許文献１２】C. Catalanotto, G. Azzalin, G. Macino and C. Cogoni. Nature 404:245., 2000.
【非特許文献１３】R.F. Ketting, T.H. Haverkamp, H.G. van Luenen and R.H. Plasterk. Cell 99:133-141., 1999.
【非特許文献１４】F. Wianny and M. Zernicka-Goetz. Nat Cell Biol 2:70-75., 2000.
【非特許文献１５】P. Svoboda, P. Stein, H. Hayashi and R.M. Schultz. Development 127:4147-4156., 2000.
【非特許文献１６】N.J. Caplen, J. Fleenor, A. Fire and R.A. Morgan. Gene 252:95-105., 2000.
【非特許文献１７】T. Tuschl, P.D. Zamore, R. Lehmann, D.P. Bartel and P.A. Sharp. Genes Dev 13:3191-3197., 1999.
【非特許文献１８】G.R. Stark, I.M. Kerr, B.R. Williams, R.H. Silverman and R.D. Schreiber. Annu Rev Biochem 67:227-264., 1998.
【非特許文献１９】L. Manche, S.R. Green, C. Schmedt and M.B. Mathews. Mol Cell Biol 12:5238-5248., 1992.
【非特許文献２０】M.A. Minks, D.K. West, S. Benvin and C. Baglioni. J Biol Chem 254:10180-10183., 1979.
【非特許文献２１】M.J. Clemens and A. Elia. J Interferon Cytokine Res 17:503-524., 1997.
【非特許文献２２】M.R. Player and P.F. Torrence. Pharmacol Ther 78:55-113., 1998.
【非特許文献２３】N.J. Caplen, S. Parrish, F. Imani, A. Fire and R.A. Morgan. Proc Natl Acad Sci U S A 98:9742-9747., 2001.
【非特許文献２４】S.M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber and T. Tuschl. Nature 411:494-498., 2001.
【非特許文献２５】J.F. Reidhaar-Olson and J. Hammer. Current Drug Discovery April:20-24., 2001.
【非特許文献２６】Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M. Proc Natl Acad Sci U S A 84(21):7413-7417., 1987.
【非特許文献２７】Gao, X and Huang, L. Biochem. Biophys. Res. Com. 179:280-285., 1991.
【非特許文献２８】Leventis, R and Silvius, JR. Biochim. et Biophys. Acta. 1990;1023:124-132.
【非特許文献２９】J. Summerton, D. Stein, S.B. Huang, P. Matthews, D. Weller and M. Partridge. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:63-70., 1997.
【発明の概要】
【００１０】
（本発明の概略）
本発明は、３つの要素、つまり、ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンからなる複合体を用いて動物細胞へのｓｉＲＮＡ移行を提供する。新規な両親媒性化合物及びこの調製方法を述べる。好適実施例において述べているのは、ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンからなる組成物並びに細胞内における遺伝子発現を阻害する目的で、かかる組成物を用いて、ｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏへとｓｉＲＮＡを送達する方法である。
【００１１】
好適実施例において、述べられている組成物及び化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達を容易にすることである。このｓｉＲＮＡは、細胞内に発現されている標的遺伝子と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を有している。さらに、ポリカチオン及び両親媒性化合物を共に用いることにより、ｓｉＲＮＡの移行効率を有意に増加させ、ｓｉＲＮＡは、選択された標的遺伝子の発現を阻害する。
【００１２】
好適実施例において、ポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾレニウム、ポリアリルアミン及びこれらに類する化合物などのポリマーである。好適な陽イオンポリマーは、エトキシル化ポリエチレンイミン（ｅＰＥＩ）である。
【００１３】
好適実施例において、ポリカチオンはＤＮＡ結合タンパクである。好適なＤＮＡ結合タンパクは、Ｈ１、Ｈ２Ａ又はＨ２Ｂなどのヒストンである。ヒストンは、牛胸腺などの天然ソースに由来していてもよいし、バクテリア内で合成されたリコンビナントタンパクであってもよい。ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパクは、ポリリジンなどのポリカチオン化合物に比べて種々の点で利点を有している。ヒトＨ１ヒストンタンパクは、免疫原性がなく、アナフィラキシーを誘導しない。ポリリジンはアナフィラキシーショックを誘導し、非常に免疫原性が高い。好適実施例においてＤＮＡ結合タンパクは、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルやヒトヒストンＨ１のＣ末端ドメイン（ＮＬＳ−Ｈ１）の両方を有するバクテリアにて合成されたリコンビナントヒストンなどの核局在化シグナルにリンクされている。
【００１４】
好適実施例において、ポリエチレンイミン又は同様のポリマーは、ポリカチオンとして使用され、構造番号１の化合物は、両親媒性化合物として使用されている。他の好適実施例において、ヒストンＨ１タンパクは、ポリカチオンとして使用され、構造番号１の化合物は、両親媒性化合物として使用されている。ｓｉＲＮＡは、細胞における標的遺伝子の効果の検討又は細胞における治療効果の影響を検討するために使用されてもよい。
【００１５】
好適実施例において、細胞は、不死化又はトランスフォームされた細胞株などの組織培養中で保持された動物細胞であってもよい。これらに含まれるのは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）から入手可能な種々の細胞株であって、例えば、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）細胞、Ｒａｔ１（ラット線維芽細胞）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵母）細胞、ＣＶ−１（サル腎臓）細胞、ＣＯＳ（サル腎臓）細胞、２９３（ヒト初期胚腎臓）細胞、ＨｅＬａ（ヒト頚部子宮癌）細胞、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓）細胞、Ｓｆ９（昆虫上皮性卵巣癌）細胞やこれらに類する細胞などが挙げられる。
【００１６】
他の好適実施例において、細胞は、初代又は二代細胞であってもよく、これが意味するのは、細胞は、動物から採取した後、比較的短期間、組織培養にて保持されている、ということである。これに含まれるのは、限定されないが、肝臓初代細胞及び筋初代細胞やこれらに類する細胞である。組織内の細胞は、細胞外マトリックスを分解するトリプシンやコラゲナーゼなどの分解酵素により単離される。組織は種々の異なる細胞型から構成されており、好適な細胞型を一定の精製量得るべく、勾配遠心分離や抗体分画などの精製方法を使用してもよい。例えば、初代筋芽細胞は、パーコール（Ｓｉｇｍａ社製）勾配遠心分離を用いて線維芽細胞が混入している組織から分離される。
【００１７】
他の好適実施例において、細胞は、ｉｎ ｓｉｔｕやｉｎ ｖｉｖｏの組織内に存在する動物細胞であってもよく、この細胞は、組織や動物から分離されていないということを意味する。
【００１８】
好適実施例において、遺伝子発現を阻害する目的（いわゆるＲＮＡ干渉）で、ｓｉＲＮＡを動物細胞へと送達する方法を述べており、両親媒性化合物、効果量のポリカチオン及び溶液状態のｓｉＲＮＡからなる複合体を形成する方法並びにこの３つの要素を用いて細胞に関連づける方法を有している。好適な両親媒性化合物は構造番号１の化合物である。好適なポリカチオンはエトキシル化ＰＥＩである。他の好適なポリカチオンはヒストンである。
【００１９】
細胞へのｓｉＲＮＡの移行を媒介すべく、ポリカチオンと組み合わせて種々の両親媒性化合物を用いてもよい。好適実施例において、この両親媒性化合物は陽イオン性を有している。この陽イオン性両親媒性化合物は、天然由来ではないポリアミンであってもよく、これら１つ以上のアミンは、少なくとも１つの疎水性残基に結合されており、この疎水性残基は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモンを有している。両親媒性化合物は、リポソームを形成していても形成していなくてもよい。好適実施例において、複数の新規な両親媒性陽イオン化合物を述べている。この化合物は、一般的に以下の一般構造
【００２０】
【化２】
構造番号１
を有しており：Ｒ１及びＲ２は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。Ｒ１及びＲ２は、同一であっても異なっていてもよい。
【００２１】
遺伝子導入に関して以前に述べられている陽イオン性リポソームの使用と比較して、上述の新規な両親媒性化合物のほとんどは、単独で使用する場合、細胞内への遺伝子の移行を効果的に媒介しない。しかしながら、これら新規の陽イオン性両親媒性化合物をポリカチオンとともに使用すると、最小限の細胞毒性を以て、種々の動物細胞へ効果的に遺伝子を導入することが可能となる。ポリカチオン及び両親媒性化合物の組み合わせは、ｓｉＲＮＡの送達の効率を促進する。
【００２２】
好適実施例において、本発明は、動物細胞へｓｉＲＮＡを送達する方法を提供し、この方法は、構造番号１の化合物と溶液状態のｓｉＲＮＡ及びポリカチオンを混和し３つの要素を有する複合体を調製し、この複合体を動物細胞に関連付けし、且つ、細胞内部にこのｓｉＲＮＡを送達する方法を有する。このｓｉＲＮＡは、その後、細胞内における特定の遺伝子の発現を阻害する。この両親媒性化合物は、ｓｉＲＮＡを加える前、ｓｉＲＮＡを加えるのと同時に、又はｓｉＲＮＡを加えた後に、ポリカチオンと混和されてもよい。
【００２３】
好適実施例において述べているのは、細胞内部において核酸発現を阻害する複合体である。この複合体は、複合体を形成すべく、１つの化合物又は複数の化合物とｓｉＲＮＡを有しており、この複合体のゼータポテンシャルは、ｓｉＲＮＡ単独のゼータポテンシャルよりも負である。ｉｎ ｖｉｖｏにおける哺乳類血管へとこの複合体を導入し、且つ、この複合体を細胞に送達し、選択された遺伝子発現が阻害される。
【００２４】
好適実施例において、ポリカチオン、ｓｉＲＮＡ又は両親媒性化合物は、機能性置換基を結合することにより改変されてもよい。この機能性置換基は、限定されないが、ｓｉＲＮＡの送達を容易にする標的化シグナル又はラベル又はその他の基であってもよい。この置換基は、複合体形成に先立ち、１つ以上の組成物に結合されてもよい。代替的に、この置換基は、複合体の形成の後に結合されてもよい。
【００２５】
好適実施例において、動物細胞にｓｉＲＮＡを送達するための化合物、組成物、及び方法を用いてもよく、この細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、又はｉｎ ｖｉｖｏに存在していてもよい。
【００２６】
好適実施例において、本発明は、動物細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法を開示しており、この方法は、両親媒性化合物、効果量のポリカチオン及び溶液状態の選択されたｓｉＲＮＡからなる３つの要素を有する複合体を用いて細胞に関連づける工程を含んでいる。送達という用語が意味するのは、ｓｉＲＮＡが細胞に関連付けられることであって、これにより、遺伝子発現を阻害することにより細胞の内在的な特性が変化する。この複合体は、細胞膜上に存在していてもよく、或いは、細胞質、核又はその他の細胞内小器官の内部に存在していてもよい。送達に関連した相互に変換可能な、使用されているその他の用語には、トランスフェクト、移行又はトランスフォームなどが含まれる。
【００２７】
好適実施例において、本発明は、陽イオン性両親媒性化合物及びこの調製方法であって、この化合物は、動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達を促進し、この化合物は、以下の一般構造
【００２８】
【化３】
構造番号１
を有しており：Ｒ１及びＲ２は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。
【００２９】
この化合物は陽イオン性として考えられる。なぜなら、この分子は、全体的に正電荷を有しているからである（ゼータポテンシャルが正）。この化合物は、両親媒性であると考えられる。なぜなら、この分子は、一端には疎水性基を有し、他端には親水性基を有しているためである。疎水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基は水を排除する。典型的に、疎水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基は水を排除する。炭化水素は、疎水性基である。親水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基は水を好む性質を有している。典型的に、かかる化学残基は、水溶性であり、水に対して水素結合供与基又は受容基である。親水性基の例には、以下の化学残基を有する化合物が含まれる；つまり、炭化水素、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシ、アミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基などを含む置換基である。
【００３０】
好適実施例において、これらの両親媒性化合物は、ポリカチオン及びｓｉＲＮＡと組み合わされて３つの要素を有する複合体を形成し、細胞にこのｓｉＲＮＡを送達する目的で動物に関連付けられる。他の好適実施例において、これらの両親媒性化合物は、例えば脂質など他の両親媒性化合物と組み合わされても良く、その後、動物細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに用いられる。
【００３１】
ｓｉＲＮＡは、短鎖の、１５から５０塩基対、又は好ましくは２１から２５塩基対の二本鎖リボ核酸である。「核酸」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドを有するポリマーを参照する技術用語である。天然のヌクレオチドは、デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）基、リン酸基及び塩基を有している。塩基には、プリン類及びピリミジン類が含まれ、さらに、天然の化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然のアナログが更に含まれる。プリン類及びピリミジン類に関する合成誘導体は、限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート及びハロゲン化アルキルなどの塩基上に新規の反応基を置換する改変物を含む。「塩基」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡに関する種々の公知の塩基アナログを包含し、限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドリキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン及び２，６−ジアミノプリンを含む。ヌクレオチドは<核酸ポリマーの単量体単位であって、天然のポリヌクレオチドではリン酸基を介して共に結合されている。天然のポリヌクレオチドは、リボース−リン酸骨格を有している。人工又は合成のポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて重合化されており、同じ又は同様の塩基を含んでいるが、天然のリボース−リン酸骨格とは異なるタイプの骨格を有していてもよい。これらの骨格に含まれるのは、限定されないが、ＰＮＡ類（ペプチド核酸）、フォスフォロチオエート、フォスフォロジアミデート、モルフォリノ類及び天然のポリヌクレオチドにおけるリン酸骨格に関するその他のバリアントである。
【００３２】
ｓｉＲＮＡは、遺伝子の一部と同一及びほぼ同一の配列を有している。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて重合化されていてもよく、リコンビナントＲＮＡ又はこれらの基の誘導体はキメラ配列を有している。このｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害するように、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又は種々の適切な組み合わせを含んでいても良い。このＲＮＡは、好ましくは二本鎖であるが、単鎖、三本鎖又は４本鎖であってもよい。
【００３３】
送達されたｓｉＲＮＡは、細胞質又は核の内部に保持することが可能である。ｓｉＲＮＡは、内在的又は外来的なヌクレオチド配列の発現を阻害すべく、或いは、一般的に細胞に関連付けられていない特定の生理学的特性に影響を及ぼすべく細胞に送達されてもよい。
【００３４】
ここで、タンパクは、ポリペプチドにおいて、互いに結合された２つのアミノ酸残基以上の線形シリーズを参照している。疾病状態を減弱し又は阻止することに関するタンパク質の「治療学的」効果は、細胞内に留まるか、細胞膜に結合し続けるか、一般循環又は血流に進入することが可能な細胞から分泌され、且つ分離されることにより達成されてもよい。治療的な分泌タンパクは、ホルモン、サイトカイン、成長因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク（例えばα１−アンチトリプシン）、血管新生タンパク（例えば、血管上皮細胞生長因子、線維芽細胞成長因子など）、抗血管新生タンパク（例えば、エンドスタチン、アンジオスタチンなど）及び血液中に存在するその他のタンパクを含む。細胞膜上のタンパク質は、タンパク又はリポタンパクを取り込むべく、細胞に受容体を供することにより治療的な効果を有することも可能である（例えば低密度リポタンパク受容体）。細胞内に存在する治療的タンパク（「細胞内タンパク質」）は、フェニルケトン尿など、循環する毒性代謝物を排泄する酵素であってもよい。これらはまた、癌細胞の増殖性又は癌原性を減弱させてもよいし（例えば、転移性を減弱させる）、或いはウィルスの複製を阻害してもよい。細胞内タンパクは、細胞骨格（例えば、アクチン、ジストロフィン、ミオシン、ザルコグリカン、ジストログリカンなど）の一部であってもよく、且つ、心筋症及び筋骨格関連疾患（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面・肩甲・上腕型筋ジストロフィーなど）であってもよい。心臓疾患を処置する特定の他の治療タンパクには、心筋収縮性に影響を与えるポリペプチド（例えば、カルシウム及びナトリウムチャネル）、再狭窄阻害剤（例えば、一酸化窒素合成酵素）、血管新生因子、及び抗血管新生因子などが含まれる。
【００３５】
ｓｉＲＮＡは、治療的な細胞変化を生じさせるべく、細胞に送達されてもよい。治療的な目的（疾患を処置したり防止することを含む動物における健康状態を向上させる技術）に関連して、ｓｉＲＮＡ又は他の遺伝子に関連する物質の送達は、遺伝子治療と呼ばれている。ｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕにて器官に直接送達されてもよいし、ｅｘ ｖｉｖｏにて細胞に間接的に導入し器官に移植されてもよい。タンパクの合成を阻害したりＲＮＡ量を減少させるには、ｓｉＲＮＡを細胞へと導入することが必要である。主要な変異遺伝子により惹き起こされる常染色体性優性筋ジストロフィーなどの疾患は、治療的なｓｉＲＮＡを用いた処置に関する候補例である。ｓｉＲＮＡの送達は、主要タンパクの産生を阻害し、これにより、疾患症状を減弱させる。
【００３６】
ポリカチオンは、概ね正荷電を有するポリマーを意味しており、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ヒドロキシブロマイド、ポリエチレンイメイン又はヒストンなどが挙げられる。重合体性ポリカチオンは、正荷電、中性荷電又は負荷電を有する単量体ユニットを含んでいてもよいが、ポリマーのネットでの荷電は、正荷電であるべきである。また、ポリカチオンは、２つ以上の正荷電を有する非重合性分子も意味している。
【００３７】
ＤＮＡ結合タンパクは、本発明における応用例にて述べた条件下で核酸に関連付けられるタンパクであって、核酸に対して高い結合定数を有する複合体を形成している。このＤＮＡ結合タンパクは、天然型にて効果量を用いてもよく、又はこの目的に関連して改変された型にて用いられても良い。このポリカチオンの「効果量」は、ｓｉＲＮＡの送達を生じさせることができる量である。好適実施例において、このポリカチオンは、ポリヌクレオチド結合タンパクであって、牛胸腺などの動物組織に由来したものや、大腸菌にてリコンビナントにて合成されたものである。好ましくは、このポリヌクレオチド結合タンパクは、ヒストンタンパクなどの陽イオン性を有している。ヒストンＨ１タンパクは、好適なヒストン型であって、複数の供給者（Ｓｉｇｍａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなど）から購入することが可能である。
【００３８】
（その他の定義）
（脂質）
水に不溶性であるが、クロロフォルムやベンゼンなどの有機系溶媒に可溶な、複数の異なる有機系化合物群である。脂質は、親水性及び疎水性部分を有している。脂質は、複合体脂質、単純脂質、及び合成脂質を含むべく意図されている。
【００３９】
（複合体脂質）
複合体脂質は、脂肪酸のエステル体であって、グリセライド（脂肪又は油）、糖脂質、リン脂質及びワックスを含んでいる。
【００４０】
（単純脂質）
単純脂質は、ステロイドやテルペン類を含んでいる。
【００４１】
（合成脂質）
合成脂質は、脂肪酸から調製されたアミドを含んでおり、そのカルボン酸は、アミド、１つ以上の原子が他のヘテロ原子（例えば、窒素やイオウ）などにより置換されている複合体脂質の合成変異体、追加の疎水性基が化学結合されている単純脂質の誘導体に変換されている。合成脂質は、１つ以上の遊離基を有していてもよい。
【００４２】
（脂肪）
脂肪は、長鎖カルボン酸のグリセロールエステル体である。脂肪の加水分解により、グリセロール及びカルボン酸、つまり脂肪酸、を産生する。脂肪酸は、飽和又は不飽和（１つ以上の二重結合を有する）であってもよい。
【００４３】
（油）
油は、カルボン酸のエステル体であるか、或いは、脂肪酸のグリセライドである。
【００４４】
（糖脂質）
糖脂質は、脂質を有する糖体である。この糖体は、典型的には、ガラクトース、グルコース又はイノシトールである。
【００４５】
（リン脂質）
リン脂質は、リン酸基及び１つ以上の脂肪酸（脂肪酸のエステル体として）の両方を有する脂質である。このリン酸基は、１つ以上の有機基に結合されていてもよい。
【００４６】
（ワックス）
ワックスは、種々の形態の固形、又は半固形の物質であって、一般的に脂肪酸のエステル体である。
【００４７】
（ポリイミダゾリニウム）：
ポリイミダゾリニウムは、１つ以上のイミダソリニウムなるサブユニットを有するポリマー（ランダム共重合体、ブロック共重合体又はその他の共重合体）である。ポリイミダゾリニウムは、イミダソリニウムのホモポリマーも意味している。このイミダソリニウムなるサブユニットは、ポリマーの主鎖であってもよいし、或いは、ポリマーの主鎖における側鎖であってもよい。このポリマーは、ネットでの天然型ポリマー、ポリカチオン、又はポリアニオンであってもよい。
【００４８】
（イミダゾリニウム（イミダゾリニウムサブユニット））
【００４９】
【化４】
イミダソリニウム（イミダソリニウムサブユニット）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４ａ、Ｒ５ａ及びＲ５ｂなるサブユニットは、種々の置換において、独立して、水素ラジカル又は炭素ラジカルであってもよい。対イオン（Ｘ）は、種々の対イオンであってもよい。対イオンには、限定されないが、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、及びトシレートを含む。
【００５０】
（ポリ−２−イミダゾリン）
ポリ−２−イミダゾリンは、１つ以上のイミダソリニウムなるサブユニットを有するポリマー（ランダム共重合体、ブロック共重合体又はその他の共重合体）である。また、ポリ−２−イミダゾリンは、２−イミダゾリンサブユニットを有するホモポリマーをも意味している。このイミダゾリンサブユニットは、ポリマーの主鎖であってもよいし、或いは、ポリマーの主鎖における側鎖であってもよい。このポリマーは、ネットでの天然型ポリマー、ポリカチオン、又はポリアニオンであってもよい。
【００５１】
（２−イミダゾリン（２−イミダゾリンサブユニット））
【００５２】
【化５】
２−イミダゾリン（イミダゾリンサブユニット）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４ａ、Ｒ５ａ及びＲ５ｂなる置換基は、種々の置換において、独立して、水素ラジカル又は炭素ラジカルであってもよい。
【００５３】
（複合体）
複合化又は複合体形成と呼ばれる工程を介して複合体を形成すべく、２つの分子が組み合わされており、静電気的相互作用、水素結合、及び疎水結合などの非共有的総合作用を介して互いに接している。
【００５４】
（改変）
二番目の分子により、いわゆる改変なる工程を介して改変物を形成すべく、分子が改変され、この２つの分子は、共有結合を介して結合される。つまり、この２つの分子は、一番目の分子に由来する原子と二番目の原子に由来する原子との間で共有結合を形成しており、新規な単一の分子を形成する。化学的共有結合は、電子密度の共有が存在する２つの分子間での相互作用した結合である。また、改変は、非共有結合を介して、２つの分子間での相互作用も意味している。例えば、クラウンエーテルは、特定のアミノ酸にて非共有結合を形成してもよい。
【００５５】
（塩）
塩は、イオン結合を含む種々の化合物であり、１つ以上の電子が他の原子に完全に移行した結合である。塩は、溶液に溶解した場合、陽イオンと陰イオンとに解離するイオン性化合物であって、溶液にイオン強度が増加する。
【００５６】
（薬物学的許容可能塩）
薬物学的許容可能塩は、酸及び塩基付加塩の両方を意味している。
【００５７】
（薬物学的許容可能酸付加塩）
薬物学的許容可能酸付加塩は、生物学的に有効で遊離塩基の特性を有する塩であって、生物学的その他望ましくないものではなく、無機酸及び有機酸にて形成され、例えば、無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸及びこれに類似する酸が含まれ、有機酸には、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロニル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸及びこれに類する酸が含まれる。
【００５８】
（薬物学的許容可能塩基付加塩）
薬物学的許容可能塩基付加塩は、生物学的に有効で遊離酸の特性を有するする塩であって、生物学的その他望ましくないものではない。この塩は、無機塩基を加えるか、遊離酸に有機塩基を加えて調製される。無機塩基に由来する塩には、限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩及びアルミニウム塩及びこれに類する塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、限定されないが、一級、二級及び三級アミンが含まれ、例えば、メチルアミン、トリエチルアミン及びこれに類するアミンが挙げられる。
【００５９】
（内部ポリ電解質複合体）
内部ポリ電解質複合体は、反対する荷電のポリ電解質間の非共有な相互作用である。
【００６０】
（荷電、極性及びサイン）
化合物の荷電、極性及びサインは、化合物が１つ以上の電子（正荷電、極性又はサイン）を失うかどうか、或いは、１つ以上の電子（正荷電、極性又はサイン）を取得するかどうかを参照している。
【００６１】
（細胞標的化シグナル）
細胞標的化シグナル（又はシグナル）は、本願において、薬物又は核酸などの生物学的に活性を有する化合物を改変する分子として規定されており、培養条件又は全器官の両方において、（組織などの）細胞配置又は細胞の位置に作用可能である。外来遺伝子の細胞内又は組織配置を改変することにより、生物学的に活性を有する化合物の機能は促進可能である。
【００６２】
この細胞標的化シグナルは、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭化水素（非発現）ポリ核酸又は合成化合物であってもよい。この細胞標的化シグナルは、受容体への細胞結合、核への細胞質輸送及び核移行を促進するか、或いは、エンドソームやその他の細胞内ベシクルから遊離させる。
【００６３】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、核近傍への薬物の標的化及び／又は核内部への移行を促進する。かかる核移行シグナルは、タンパクであっても、ペプチドであってもよく、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳやヌクレオプラスミンなどが挙げられる。これら核局在化シグナルは、例えば、カリオフェリンβと相互作用するＮＬＳ受容体（カリオフェリンα）など種々の核移行因子と相互作用する。核移行タンパクは、それ自身、ＮＬＳとして機能する。なぜなら、これらは、核孔又は核に標的化されているからである。例えば、カリオフェリンβは、それ自身、ＤＮＡを核孔複合体へ標的化することができる。複数のペプチドは、ＳＶ４０Ｔ抗原に由来している。これらには、短鎖のＮＬＳ又は長鎖のＮＬＳを含む。他のＮＬＳペプチドは、Ｍ９タンパク、ヌクレオプラシミン及びｃ−ｍｙｃに由来する。
【００６４】
細胞内分画からの放出を促進するシグナル（放出シグナル）は、エンドソーム（初期及び後期）、ライソゾーム、ファゴソーム、ベシクル、滑面小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）及び筋小胞体などの細胞内小器官からのＤＮＡの放出を惹き起こす可能性がある。この放出に含まれるのは、細胞内分画から細胞質への移動や、又は細胞内分画から核などの小器官への移動である。放出シグナルに含まれるのは、クロロキン、ファビロマイシン又はベレフェルディンＡなどの化学物質、ＥＲ保持シグナル（ＫＤＥＬ配列）、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンサブユニットＨＡ−２ペプチドなどのウィルス成分及び他のタイプの両親媒性ペプチドである。
【００６５】
細胞性受容体シグナルは、細胞と生物学的に活性を有する化合物との関連付けを促進する種々のシグナルである。これは、化合物の細胞表面への結合性を増加し及び／又は細胞内分画との関連付けの両方により達成されてもよく、例えば：細胞表面の結合性を促進することによるエンドサイトーシスを促進するリガンドなどを挙げることができる。これに含まれるのは、アシオログライコプロテインやガラクトース残基を用いることによるアシアログライコプロテイン受容体へ標的化する物質である。インスリン、ＥＧＦ又はトランスフェリンなどの他のタンパク質を標的化に用いてもよい。ＲＧＤ配列を含むペプチドは、多くの細胞を標的化するのに用いてもよい。細胞膜上のチオール、スルフヒドリル又はジスルフィド基などの他の標的化群には、脂質、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及び両親媒性誘導体などの膜と相互作用する分子を含んでいる。加えて、ウィルスタンパク質を細胞と結合するのに用いてもよい。
【００６６】
（相互作用モディファイヤー）
相互作用モディファイヤーは、相互作用モディファイヤーを含まない分子に相対して、分子がそれ自身と又は他の分子と相互作用する方式を変更する。この改変の結果として、自己相互作用又は他の分子との相互作用は、増加又は減弱される。例えば、細胞標的化シグナルは、分子と分子又は細胞内分画との間の相互作用を変化させる相互作用モディファイヤーである。ポリエチレングリコールは、１つの相互作用モディファイヤーであって、分子とそれ自身及び他の分子との相互作用を減弱させる。
【００６７】
（リンケージ）
２つの他の基（化学残基）との共有結合又はスペーサーを提供する結合である。リンケージは、電気的に中性であってもよく、或いは、正又は負に帯電していてもよい。この化学残基は、疎水性又は親水性であってもよい。好適なスペーサー群に含まれるのは、限定されないが、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ６−Ｃ１８アラルキル、Ｃ６−Ｃ１８アラルケニル、エステル、エーテル、ケトン、アルコール、ポリオール、アミド、アミン、ポリグリコール、ポリエーテル、ポリアミン、チオール、チオエーテル、チオエステル、リン含有物質、及び複素環などである。リンケージは、１つ以上の不安定結合を有していてもよい。
【００６８】
（二機能性）
クロスリンカーとして通常参照される二機能性分子は、２つの分子と共に結合すべく使用され、つまり、２つの分子間のリンケージを形成する。二機能性分子は、ホモ又はヘテロな二機能性を有していてもよい。
【００６９】
（不安定結合）
不安定結合は、選択的に切断可能な共有結合である。つまり、不安定結合は、他の共有結合の切断を伴うことなく、他の共有結合の存在下で切断されてもよい。例えば、ジスルフィド結合は、分子に存在する可能性のある炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−イオウ結合、炭素−窒素結合などの他の結合の切断を伴うことなく、チオールの存在下で切断可能である。不安定が意味するのは、切断可能であるということである。
【００７０】
（不安定リンケージ）
不安定リンケージは、不安定結合を有する化学物質であって、２つの他の基との間のスペーサー又はリンクを提供する。リンクされるこの基は、以下から選択されてもよい。つまり、生物学的活性化合物、膜活性化化合物、膜活性を阻害する化合物、機能性反応性基、モノマー及び細胞標的化シグナルである。スペーサー基は、化学残基を含んでいてもよく、これらは以下の群から選択される。つまり、アルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリコール、アミド、単糖体、多糖体及び酸素、イオウ若しくは窒素などのヘテロ原子である。スペーサーは、電気的に中性であってもよいし、或いは、正又は負荷電していてもよいし、あるいは、全体として中性、正、又は負荷電しつつ正荷電及び負荷電していてもよい。
【００７１】
（ｐＨ−不安定リンケージ及び結合）
ｐＨ不安定性とは、産生条件下（ｐＨ<７）での共有結合の選択的な切断を参照している。つまり、ｐＨ不安定結合は、他の共有結合の存在下、これらを切断することなく、切断されてもよい。
【００７２】
（両親媒性化合物）
両親媒性化合物は、親水性（水溶性）部分と、疎水性（不溶性）部分とを有している。親水性基は、定量的な意味合いで、その化学残基が水を好む性質を有しているということである。典型的には、かかる化学基は、水溶性であり、且つ水素結合供与基であるか、或いは水の受容基である。親水性基の例には、以下の残基を有する化合物が含まれる：炭水化物、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基を含む基である。疎水性基は、定量的ない見合いで、その化学残基は水を排除する性質を有している。典型的に、かかる化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない。炭化水素は、疎水性基である。
【００７３】
（ポリマー）
モノマーと呼ばれるより小さなユニットが共に繰り返し結合することにより構築される分子である。本願の応用例において、ポリマーなる用語が含むのは、２から約８０のモノマーを有するオリゴマーと８０以上のモノマーを有するポリマーとを含んでいる。ポリマーは、リンカー、分岐ネットワーク、スター、コンブ、又はラダー型のポリマーであってもよい。ポリマーは、単一のモノマーが用いられるホモポリマーであってもよく、或いは、２つ以上のモノマーが使用される共重合体であってもよい。共重合体のタイプに含まれるのは、代替、ランダム、ブロック及びグラフト型である。ポリマーの主鎖は、ポリマー長の伸張に必要な結合を有する原子から構成されている。ポリマーの側鎖は、ポリマー長の伸張に必要ではない結合を有する原子から構成されている。重合化技術における当業者にとって、上述の工程に利用可能な重合化工程には種々の分離が存在している。この重合化は、チェイン又はステップであってもよい。この分類に関する既述は、追加及び濃縮ポリマーの終了にしばしば使用されている。「Ｍｏｓｔ ｓｔｅｐ−ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｍｏｓｔ ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｒｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ" （Ｍ．Ｐ Ｓｔｅｎｖｅｎｓ ｐｏｒｙｍｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９０）である。テンプレートポリ重合化は、ドーターポリマーからポリマーを形成すべく使用してもよい。
【００７４】
（ステップ重合化）
重合化ステップにおいて、重合化は、ステップ毎の様式にて行う。ポリマー伸張は、モノマー、オリゴマー及びポリマー間の反応により起こる。イニシエーターは必要ない。なぜなら、一貫して同様の反応であり、末端はすでに反応性を有しているので終了ステップが存在しないためである。重合化率は、機能性基の減少につれて低下する。典型的にステップ重合化は、２つの異なる方法のいずれかにより行われる。１つの方法は、モノマーが同一の分子にて反応性を有する機能性基（Ａ及びＢ）を有しており、
Ａ−Ｂは、−［Ａ−Ｂ］−
を生成する。また、他の方法は、２つの二機能性モノマーを有している。
【００７５】
Ａ−Ａ＋Ｂ−Ｂは、−［Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ］−
を生成する。
【００７６】
一般に、これらの反応には、アシレーション又はアルキレーションが含まれてもよい。アシレーションは、分子にアシル基（−ＣＯＲ）を導入することで定義されている。アルキレーションは、分子にアルキル基を導入することで定義されている。
【００７７】
もし、機能性基Ａがアミンであると、Ｂは、（限定されないが）、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、スルフォニルクロライド、アルデヒド（ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドを含む）、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルフォスフェート、アリルハライド（ジフルオロ−ジニトロベンゼン）、無水物、酸ハライド、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｏ−ニトロフェニルペンタクロロフェニルエステル、又はペンタフルオロフェニルエステルであってもよい。他の場合、機能性基Ａがアミンである場合、機能性基Ｂは、アシル化剤又はアルキル化剤又はアミン化剤であってもよい。
【００７８】
機能性基Ａがチオール又はスルフヒドリルである場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、ヨードアセチル誘導体、マレイミド、アジリジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体、又はジスルフィド誘導体（例えば、ピリジルジスルフィド又は５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体）であってもよい。
【００７９】
機能性基Ａがカルボン酸塩である場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、そのジアゾアセテート又は使用されるカルボジイミドのアミンであってもよい。カルボニルジイミダゾール、ジメチルアミノピリジン、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド又はアルコールなど、カルボジイミド及びジメチルアミノピリジンを使用して、他の付加物を使用してもよい。
【００８０】
機能性基Ａが水酸基である場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、エポキシド、オキシラン及び使用されるカロボニルジイミダゾール又はＮ，Ｎ’−ジサクシニミジルカーボネートのアミン、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルクロロフォーメート又はその他のクロロフォーメートのアミンであってもよい。
【００８１】
機能性基Ａがアルデヒド又はケトンである場合、機能性基Ｂは、（限定されないが）、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、アミン（ＮａＣＮＢＨ３などの還元剤により還元されてもされなくてもよいイミン又はイミニウムを形成すべく）、又は水酸基化合物であってもよく、ケトン又はアセタールを形成する。
【００８２】
他の手法は、１つのモノマーを有すべく、
Ａ−Ａ＋他の試薬にて−［Ａ−Ａ］−
を生成する方法である。機能性基Ａがチオール、スルフヒドリルである場合、ヨウ素（Ｉ２）又はＮａＩＯ４（ペリオデートナトリウム）や酸素などの酸化剤によりジスルフィド結合に変換されてもよい。機能性基Ａは、チオール、スルフヒドリル、酸化及びジスルフィド形成を実行する２−イミノチオレート（トラウト試薬）による反応による基に変換されるアミンであってもよい。ジスルフィド結合形成を触媒すべく、（ピリジルジスルフィド又は５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体などの）ジスルフィド誘導体を使用してもよい。
【００８３】
上述の例のいずれかにおける機能性基Ａ又はＢは、光反応基であってもよく、例えば、アリルアジド、ハロゲン化アリルアジド、ジアゾ、ベンゾフェノン、アルキン又はジアリジン誘導体などが挙げられる。
【００８４】
アミン、水酸基、チオール、スルフヒドリル、カルボキシル基の反応によりアミド、アミジン、ジスルフィド、エーテル、エステル、エナミン、尿素、イソチオウレア、イソウレア、スルフォンアミド、カーボネート、炭素−窒素二重結合（イミン）、アルキルアミン結合（二級アミン）、炭素が水酸基を有する炭素−窒素単結合、チオエーテル、ジオール、ヒドラゾン、ジアゾ、又はスルフォンなどの化学結合を生成する。
【００８５】
連鎖重合：ポリマーの連鎖重合化伸張は、モノマーユニットを連続して添加し、限定した数の鎖の成長により起こる。この反応の開始及び伸張機構は、異なっており、通常、伸張停止ステップである。この重合化率は、モノマーが消失するまで一定に保持される。
【００８６】
ビニル、アクリレート、メタクリレート、メタクリルアミド基を有するモノマーは、連鎖反応を実行してもよく、ラジカルであっても、陰イオン性であっても、陽イオン性であってもよい。連鎖重合化は、閉環又は開環重合化により達成されてもよい。反応開始における種々の異なるタイプのフリーラジカルを使用してもよく、パーオキサイド、ヒドロキシパーオキサイド、及び２，２’−アゾビス（アミジノプロパン）ジヒドロクロライド（ＡＡＰ）などのアゾ化合物が含まれる。化合物は、２つ以上の要素により製造された材料である。
【００８７】
モノマーのタイプ：重合化工程には、種々の広範なモノマーを使用してもよい。これらに含まれるのは、アミン、イミジン、グアニジン、イミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、複素環（イミダゾール、ピリジン、モルフォリン、ピリミジン、又はピレンなど）などの正荷電した有機系モノマーである。このアミンは、ｐＨ感受性であってもよく、このアミンのｐＫａは、４から８の生理学的な範囲内である。特定のアミンに含まれるのは、スペルミン、スペルミジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン（ＡＥＰＤ）、及び３，３’−ジアミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルジプロピルアンモニウムブロマイドである。
【００８８】
また、モノマーは、疎水性、親水性又は両親媒性であってもよい。また、モノマーは、アクリジン、チアゾールオレンジ又はエチジウムブロマイドなどの挿入剤であってもよい。
【００８９】
モノマー及びポリマーに関する他のコンポーネント：ポリマーは、その利用性を増大させる他の群を有している。この群は、ポリマー形成に先立ちモノマーに導入されてもよいし、ポリマー形成の後にポリマーに結合されてもよい。この群に含まれるのは：標的化群としてポリマーを標的化するために使用される群であるが、特定の細胞又は組織に対する核酸複合体である。かかる標的化試薬の例に含まれるのは、アシオログライコプロテイン又はガラクトース残基を用いたアシアログライコプロテイン受容体への標的化剤である。標的化には、例えば、インスリン、ＥＧＦ又はトランスフェリンなどの他のタンパクを使用してもよい。タンパク質は、互いに結合した２つ以上のアミン酸で構築された分子を参照している。このアミノ酸は、天然由来でも合成でもよい。ＲＧＤ配列を有するペプチドは、多くの細胞を標的化するのに用いられてもよい。細胞膜上のチオール、スルフヒドリル又はジスルフィド基と反応する化学品群は、多くのタイプの細胞を標的化するのに用いられてもよい。標的化には、葉酸及びその他のビタミン類を用いてもよい。他の標的化群含まれる分子は、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及びアムフォテリシン誘導体などの膜と反応する分子である。
【００９０】
超分子複合体を細胞に相互作用させた後、薬物の送達、又は細胞の特定部分への核酸の送達性を増加すべく他の標的化群を使用してもよい。例えば、エンドソームを崩壊させるべく試薬を使用してもよく、核に標的化すべく核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用してもよい。
【００９１】
種々のリガンドは、薬物及び遺伝子を細胞及び特定の細胞性受容体に標的化すべく使用されてきた。リガンドは、細胞膜上又は細胞の近傍の細胞膜への標的を検索してもよい。受容体へのリガンドの結合は、典型的にエンドサイトーシスを開始する。ＤＮＡ相対には、リガンドを使用してもよく、エンドサイトーシスが行われない受容体に結合する。例えば、インテグリン受容体に結合するＲＧＤペプチド配列を有するペプチドを使用してもよい。加えて、ウィルスタンパクは、細胞に複合体を結合すべく使用されてもよい。脂質及びステロイドは、細胞膜に複合体を直接挿入すべく使用されてもよい。
【００９２】
また、ポリマーは、それ自身で分解可能な基を有していてもよい。この標的化群に結合する際、分解により、この複合体と標的化群に関連する受容体との相互作用を減弱させる。分解可能な基に含まれるのは、限定されないが、ジスルフィド結合、ジオール、ジアゾ結合、エステル結合、スルフォン結合、アセタール、ケタール、エノールエーテル、エノールエステル、エナミン及びイミンなどである。
【００９３】
（多価電解質）
多価電解質又はポリイオンは、１つ以上の電荷を有するポリマーであって、つまり、このポリマーは、１つ以上の電子を取得するか消失する群を有している。ポリカチオンは、ネットで正荷電している多価電解質であって、例えば、ポリ−Ｌ−リジンがある。ポリカチオンは、正荷電、中性荷電又は負荷電しているモノマーユニットを有していてもよいが、このポリマーのネットでの電荷は正荷電でなければならない。また、ポリカチオンは、２つ以上の正電荷を有する非重合型分子を意味していてもよい。ポリアニオンは、ネットで負電荷を有する多価電解質である。このポリアニオンは、正荷電、中性荷電又は負荷電しているモノマーユニットを有していてもよいが、このポリマーのネットでの電荷は負荷電でなければならない。また、ポリアニオンは、２つ以上の負電荷を有する非重合型分子を意味していてもよい。両性イオンなる用語は、同様の分子の一部である酸性基と塩基性基との反応生成物（塩）を参照している。
【００９４】
（立体構造安定化剤）
立体構造安定化剤は、長鎖の親水性群であって、粒子の静電的相互作用に対する立体障害を起こす粒子による最小産物であるポリマーに対する凝集を阻止している。この例として含まれるのは：アルキル基、ＰＥＧ鎖、ポリサッカライド、アルキルアミンなどであろう。静電気的相互作用は、正電荷と負電荷との間の吸引力に起因する２つ以上の物質における非共有的な関連付けである。
【００９５】
（緩衝液）
緩衝液は、弱酸又は弱塩基及びこれらの塩類から調製される。緩衝液溶液は、この溶液に酸又は塩基を追加した際、ｐＨの変化を阻止する。
【００９６】
（生物学的、化学的、又は生化学的反応）
生物学的、化学的、又は生化学的反応は、イオン及び／若しくは共有結合の形成又は分解を含んでいる。
【００９７】
（反応性を有する）
イオン結合又は共有結合を他の化合物と形成することができる場合、この化合物は反応性を有している。共有結合を形成可能な反応性を有する化合物の一部は、反応性機能性基として参照する。
【００９８】
（ステロイド）
ステロイド誘導体は、ステロール、水酸基残基が改変（例えば、アシル化）されているステロール、ステロイドホルモン、又はこれらのアナログを意味している。この改変は、スペーサー群、リンカー又は反応性を有する群を包含している。
【００９９】
（ステリック）
立体障害又はステリックは、同一の分子内の隣り合う群に起因した化学反応を阻止したり遅らせたりすることである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１００】
１．両親媒性化合物の合成
Ａ．ＭＣ７６３の合成
【０１０１】
【化６】
２５ｍＬのフレーム・ドライド・フラスコに、オレイルクロライド（新規に蒸留したもの、１．０ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）及びラロイルクロライド（０．７ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）をジクロロメタンに溶解したものを窒素下で加えた。得た溶液を、氷浴にて０℃に冷却した。１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（０．５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）に続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）を加えた。この水浴を除去し、溶液を１５時間、室温で撹拌した。この溶液を１ＮのＮａＯＨ（１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮した。
【０１０２】
得た残渣の約３０％を、セミプレパラティブＨＰＬＣにて、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸なる溶離液を用いて、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラム（１５０Å、５μｍ、２５０×２１ｍｍ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ社製）上で精製した。このカラムから３種類の化合物を分離し、マススペクトロメーター（Ｓｃｉｅｘ社製、ＡＰＩ１５０ＥＸ）により評価した。
【０１０３】
ＭＣ７６３（分子量６４７）
ＭＣ７６２（分子量５６４）
ＭＣ＃７９８（分子量７２９．２５）
【０１０４】
【化７】
Ｂ．ＭＣ７６５の合成
【０１０５】
【化８】
２５ｍＬのフレーム・ドライド・フラスコに、オレイルクロライド（新規に蒸留したもの、１．０ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ）、ミリストイルクロライド（０．８３ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）をジクロロメタンに混和した混液を窒素下で加えた。得た溶液を、氷浴にて０℃に冷却した。１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（０．５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）に続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ）を加えた。この水浴を除去し、溶液を１５時間、室温で撹拌した。この溶液を１ＮのＮａＯＨ（１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮した。
【０１０６】
得た残渣の約３０％を、セミプレパラティブＨＰＬＣにて、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸なる溶離液を用いて、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラム（１５０Å、５μｍ、２５０×２１ｍｍ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ社製）上で精製した。このカラムから３種類の化合物を分離し、マススペクトロメーター（Ｓｃｉｅｘ社製、ＡＰＩ１５０ＥＸ）により評価した。
【０１０７】
ＭＣ７６５（分子量６７４）
ＭＣ７６４（分子量６２０）
ＭＣ＃７９８（分子量７２９．２５）
【０１０８】
【化９】
Ｃ．ＭＣ７７４の合成
【０１０９】
【化１０】
０℃に冷却したジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解した１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（１０μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）の溶液に、デカノイルクロライド（２５μＬ、０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１．μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、この溶液を室温にまで加温させた。１２時間後、この溶液を水（２ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮し、ＴＬＣにて精製したＭＣ７７４（２１．６ｍｇ、８７％）を得た。
【０１１０】
Ｄ．ＭＣ７７５の合成
【０１１１】
【化１１】
ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解した１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（１０μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液に、パルミトイル酸（３０．８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１．μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。１２時間後、この溶液をフィルターに通し、水（２ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮し、ＴＬＣにて精製したＭＣ７７５（２１．５ｍｇ、８１％）を得た。
【０１１２】
Ｅ．ＭＣ７７７、ＭＣ７７８、及びＭＣ７７９の合成
【０１１３】
【化１２】
【０１１４】
【化１３】
ジクロロメタン（８ｍＬ）に溶解したベンゾチアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−フォスフォノニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＢＯＰ，１．３００ｇ、２．５００ｍｍｏｌ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社製）に、チオクロ酸（０．２４８ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）及びリノレイン酸（３６５μＬ、１．２０ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル社製）を加えた。得た溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６１０μＬ、３．５ｍｍｏｌ）に続いて１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（２０６μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１６時間後、この溶液を水（２０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下で濃縮し、１．８００ｇの粗品を得た。この粗品の８５ｍｇを２ｍＬのアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）／１ｍＬの水（０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解し、逆相ＨＰＬＣ（１０−９０％のＢで４０分）、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラムにて、精製し、３１．８ｍｇのＭＣ７７７、１．３ｍｇのＭＣ７７８及び１．５ｍｇのＭＣ７７９を得た。
【０１１５】
Ｆ．ＭＣ７８０、ＭＣ７８１及びＭＣ７８２の合成
【０１１６】
【化１４】
【０１１７】
【化１５】
化合物ＭＣ７８０、ＭＣ７８１及びＭＣ７８２は、化合物ＭＣ７７７、ＭＣ７７８及びＭＣ７７９と同様の合成方法を用いて調製した。合成品由来の粗品は、２ｍＬのアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）／１ｍＬの水（０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解し、Ｂｅｔａ Ｂａｓｉｃ Ｃｙａｎｏカラムにて精製し、７．１ｍｇのＭＣ７８０、１３．０ｍｇのＭＣ７８１及び１８．０ｍｇのＭＣ７８２を得た。
【０１１８】
Ｇ．ポリシラザンの合成：
一般的実験：ポリアミンをＤＭＦに溶解し２０から５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。分離した容器において、クロロシロキサンをＴＨＦに溶解し２０から５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。クロロシラン溶液の適当量（改変すべきアミノ残基のモル比に基づいて）をポリアミン溶液に撹拌しながら加え、白色の固体を得た。この反応容器に水を加え、使用直前にポリアミンに基づいて１から１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に調製した。ジイソプロピルアミノメチルポリスチレンなどの固形の支持体塩基を含有していてもよく、フィルター化又は最終溶液の遠心分離により除去した。この一般的な実験手法に従って、以下の化合物を調製した。
【０１１９】
【表１】
試薬：ｂｒＰＥＩ−８００、ｂｒＰＥＩ−１８００；ポリエチレンイミン（塩基ポリマー平均分子量約８００、１８００）、アルドリッチ・ケミカル社製
ＰＥＩ−１０ｋ；ポリエチルイミン（塩基ポリマー平均分子量約１０，０００）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製
ｂｒＰＥＩ−２５ｋ；分岐ポリエチレンイミン（塩基ポリマー平均分子量約２５，０００）、アルドリッチ・ケミカル社製
ジクロロジメチルシラン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジクロロシラン、ジクロロジフェニルシラン、アルドリッチ・ケミカル社製
１，１，４，４−テトラメチル−１，４−ジクロロジシルエチレン、１，３−ジクロロテトライソプロピルジシロキサン、ユナイテッド・ケミカル・テクノロジーズ社製
ジイソプロピルアミノメチルポリスチレン、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製。
【０１２０】
２．ｉｎ ｖｉｖｏにて動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達；
レポーター遺伝子の使用
マーカー又はレポーター遺伝子は、簡便に測定可能な遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドであって、例えば、ホタルルシフェラーゼ又はグリーンフルオレッセンスタンパク（ＧＦＰ）である。マーカー遺伝子の産生物の存在が示すのは、細胞がトランスフェクトされており、且つ、産生物量が示すのは、トランスフェクションの効率である。ｓｉＲＮＡ送達方法と組み合わせたルシフェラーゼレポーター遺伝子は、本願において、ｓｉＲＮＡの送達の効率を定量的に同定すべく使用された。
【０１２１】
（トランスフェクション用複合体の調製）
組成物又は３つの要素から構成される複合体は、１つ以上の両親媒性化合物と、有効量のポリカチオンと、ポリヌクレオチドとを混和混和することにより調製された。１つの好適実施例において、ｓｉＲＮＡは、第１に血清不含培地中又は毒性を有しない溶液中にてポリカチオンと混和され、その後、この混液に両親媒性化合物を加えた。ｓｉＲＮＡ、ポリカチオン及び両親媒性化合物を含有する混液を細胞に加えた。他の好適実施例において、両親媒性化合物は、第１に溶液状態のポリカチオンと混和され、この混液にｓｉＲＮＡを加えた。その後、ｓｉＲＮＡ、ポリカチオン及び両親媒性化合物を有する混液を、細胞に添加した。
【０１２２】
Ａ．ＡＴＣＣ哺乳類ＣＯＳ７細胞へのｓｉＲＮＡの送達
ＣＯＳ７細胞は、１０％の胎仔牛血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ中で保持された。全ての培養は、３７℃にて、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で行った。トランスフェクション前約２４時間に、細胞を、Ｔ７５フラスコ中に適当な密度にて載置し、一昼夜インキュベートした。約５０％のコンフレントに達した際、細胞は、最初、ｐＧＬ−３コントロール（ホタルルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）及びｐＲＬ−ＳＶ４０（シー・パンジールシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）にて、ＴｒａｎｓＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬を用いて、製造者の推奨する方法に従って（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、トランスフェクトされた。１５μｇのｐＧＬ−３コントロール及び５０ｎｇのｐＲＬ−ＳＶ４０を、５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混和した４５μＬのＴｒａｎｓＴ−ＬＴ１に加え、室温にて５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳにて洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡにて回収し、培地に懸濁し、１０％の血清を含有する２５０μＬのＤＭＥＭを用いて２４穴プレートに載置し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１２３】
その後、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）、０．６ｐｍｏｌを、ウェル当たり１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに混和した、示した送達剤に混和し、室温で５分間インキュベートし、３７℃で細胞に加えた。
【０１２４】
ｐＧＬ−３コントロールプラスミドは、ＳＶ４０エンハンサー及びアーリープロモーター領域にて翻訳制御されたホタルｌｕｃ＋のコーディング領域を有している。ｐＲＬ−ＳＶ４０プラスミドは、ＳＶ４０エンハンサー及びアーリープロモーター領域にて翻訳制御されたＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓなるシー・パンジーのルシフェラーゼのコーディング領域を有している。
【０１２５】
３’末端が突出した、単鎖の遺伝子特異的なアンチセンスＲＮＡオリゴマーを調製し、ＰＡＧＥ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製、ＬａＦａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）にて精製した。２つの相同性を有するオリゴヌクレオチドを４０μＭずつを、２分間、９４度で加熱しながら、２５０μＬの１００ｍＭＮａＣｌ／５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液にてアニールし、１分間９０℃に冷却し、その後、一分間当たり１℃の割合で２０℃にまで冷却した。得たｓｉＲＮＡを２０℃で使用前まで保存した。
【０１２６】
ｐＧＬ−３コントロール中のｌｕｃ＋遺伝子と同一のセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有しており：
【０１２７】
【化１６】
ｌｕｃ＋のリーディングフレームの１５５番目から１７３番目までの配列に対応している。上述のヌクレオチドにある「ｒ」という文字が示すのは、リボヌクレオチドである。ｐＧＬ−３コントロール中のｌｕｃ＋遺伝子と同一のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有しており：
【０１２８】
【化１７】
ｌｕｃ＋のリーディングフレームのアンチセンス方向に、１７３番目から１５５番目までの配列に対応している。上述のヌクレオチドにある「ｒ」という文字が示すのは、リボヌクレオチドである。ｌｕｃ＋のコーディング配列を有する、アニールされたオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋として参照する。
【０１２９】
細胞を２４時間後に回収し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。Ｌｕｒｎａｔ ＬＢ９５０７（ＥＧ&Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）ルミノメーターを用いた。ルシフェラーゼの発現量は、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔにて記録した。その後、シー・パンジーのルシフェラーゼ発現に関して適正化し、ｓｉＲＮＡを欠除するホタルルシフェラーゼ発現に対する百分率にて示した。少なくとも２つのウェルにおける細胞に関する平均値として示した。
【０１３０】
【表２】
表Ａ．ｅＰＥＩにＭＣ＃７３３を添加すると、ｓｉＲＮＡの生物学的活性が上昇した
表Ａ．における結果が示すのは、ｅＰＥＩと組み合わせて両親媒性化合物ＭＣ＃７９８を添加することによりｓｉＲＮＡの送達が有意に促進された、ということである。最大送達は、ＰＥＩ／ＭＣ＃７９８の比率が４：１（重量／重量）の際に達成された。
【０１３１】
表１．ｅＰＥＩ及び両親媒性化合物処方を用いた、ｐＧＬ３コントロールをトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞へのｓｉ−ＲＮＡ−Ｌｕｃ＋の送達
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
【表４】
この結果は、示した組成物を用いて、ＣＯＳ７細胞へのｓｉＲＮＡの効果的な送達を示している。
【０１３４】
Ｂ．エトキシル化ＰＥＩ／ＭＣ＃４９８により媒介されたｓｉＲＮＡの送達は、培養下の哺乳類細胞における標的遺伝子の発現の阻害において顕著な効果を示す。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋のＩＣ５０を同定すべく、トランジエントにトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の滴定を行った。結果が示すのは、標的となるｌｕｃ＋の発現を５０％阻害するのに必要なｓｉＲＮＡの濃度は、約０．１８ｎＭであるということである（表Ｂ）。この濃度は少なくとも、最も効果的なアンチセンス分子に必要な濃度の１００倍以下である(非特許文献２９)。ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋による最大阻害は２５から１００ｎＭで惹起され、ほぼ９５％であった。これは、ルシフェラーゼ発現を惹起すべく使用されたプラスミド中に含まれているＳＶ−４０エンハンサーにより与えられた高いレベルである。ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋のセンス又はアンチセンスＲＮＡのいずれか（表Ｂ）、或いは、プラスミドにおける配位列に標的化されたｓｉＲＮＡが送達される際（データは示さず）には、阻害は観察されなかった。これらの結果が示すのは、ｓｉＲＮＡは、特定の遺伝子発現を阻害するのに最も効果的な試薬である、ということである。
【０１３６】
【表５】
表Ｂ．ｅＰＥＩ：ＭＣ＃９７８を４：１で用いてｓｉＲＮＡを送達すると、ＣＯＳ−７細胞におけるＬｕｃ＋標的遺伝子発現を強力且つ特異的に阻害する。低い濃度のｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋（０−１ｎＭ）でのＬｕｃ＋の阻害程度が示すのは、約０．１８ｎＭのＩＣ５０を有するということである。
【０１３７】
Ｃ．エトキシル化ＰＥＩ／ＭＣ＃９８７は、多重化細胞株へのｓｉＲＮＡの送達に効果的である。
【０１３８】
また、ｓｉＲＮＡの効果は、ルシフェラーゼ発現プラスミドをトランジエントにトランスフェクトした他の細胞株において検討した。２９３細胞、ＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞への１ｎＭの濃度でのｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の送達は、それぞれ、ホタルルシフェラーゼ標的遺伝子の発現をそれぞれ７０％、９４％及び８７％と阻害した（表Ｃ）。この結果は期待されていたものに妥当であって、より高い濃度のｓｉＲＮＡは、より高いレベルの阻害をもたらす。野生型のホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドにてステーブルにトランスフェクトしたマウス３Ｔ３細胞において検討した結果では、１ｎＭのｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の送達後にルシフェラーゼ活性が７５％阻害したことを示した。これらの結果が示すのは、ｓｉＲＮＡは、トランジエント及びステーブルにトランスフェクトした哺乳類細胞株の両方において遺伝子発現の阻害が顕著に効果的であるということである。
【０１３９】
【表６】
表Ｃ：ｅＰＥＩ／ＭＣ＃７９８にて媒介したｓｉＲＮＡの送達は、低い濃度のｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）であっても、種々の哺乳類細胞株において発現したｌｕｃ＋を強力に阻害する。
【０１４０】
Ｄ．ポリシラザン／ＭＣ７９８は、ＣＯＳ細胞に対するｓｉＲＮＡの送達に効果的である。
【０１４１】
上述と同様の方法により、ＭＣ６８１は、ｓｉＲＮＡの送達が効果的であることを示した。
【０１４２】
表２．ｅＰＥＩ：両親媒性化合物処方を用いた、ｐＧＬ−３コントロールをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対するｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の送達
【０１４３】
【表７】
Ｅ．ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞に対するＲＮＡオリゴの送達
ＲＮＡオリゴの送達も検討した。ミュータントスプライシングサイトにて一体化したルシフェラーゼ遺伝子を有する市販のＨｅＬａ細胞を用いた。このミュータントスプレイシングサイトは、トランケートされた不活性なルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを産生する。ＲＮＡ塩基対をブロックし、このスプライシングサイトをブロックすることにより、活性を有する全長の酵素の発現が可能となる。従って、この細胞株におけるルシフェラーゼ活性は、直接送達されたＲＮＡ量に比例的である。
【０１４４】
ＨｅＬａＬｕｃ／７０５細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、標準的なＨｅＬａ細胞と同様に培養した。この細胞を３×１０６細胞／ウェルにて２４穴の培養ディッシュに載置し、２４時間培養した。培地を、以下の配列を有する１０ｎＭのＲＮＡオリゴ及びポリカチオン／両親媒性化合物を含有する１．０ｍＬのＤＭＥＭに置換した。
【０１４５】
【化１８】
（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて、４時間インキュベートした。その後、培地を、１０％胎仔牛血清を含有するＤＭＥＭに交換した。その後、細胞をさらに４８時間培養した。細胞を回収し、ライゼートに関して、上述のＬｕｒｎａｔＬＢ９５０７（ＥＧ&Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）ルミノメーター［Ｗｏｌｆｆ、１９９０＃７２］を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１４６】
結果：
表３．ポリカチオン：両親媒性化合物処方を用いた、ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞へのＲＮＡ−オリゴの送達
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
【表９】
ＭＣ７９８と共にｅＰＥＩ及びＭＣ６８１は、ＨｅＬａ−Ｌｕｃ細胞へのＲＮＡオリゴの送達性を示した。
【０１４９】
Ｆ．染色体融合レポーター遺伝子におけるｓｉＲＮＡにより媒介された阻害
理想的には、標的となる遺伝子発現におけるｓｉＲＮＡの阻害効果は、内在性遺伝子に対して、完全で、長期間続き、良好に作用することである。これらの特徴は、部分的であり、或いは、短期間の阻害の後に得られるデータの解釈において惹き起こされる困難性を伴うことなく、遺伝子機能の直接的な解析を可能とする。上述の例において我々が示したのは、レポーター遺伝子を用いてトランジエントにトランスフェクトした細胞株において９５％の阻害が達成可能であるというデータである。クロモゾームに組み込まれた遺伝子が阻害可能かどうかを同定すべく、野生型のホタルルシフェラーゼをコードする発現プラスミドをステーブルにトランスフェクトしたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて検討を行った。最終濃度が２５ｎＭのｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋（又はコントロールのｓｉＲＮＡ−ｏｒｉの細胞への）送達に、ＥＰＥＩとＭＣ７９８（ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ）とを組み合わせて用いた。コントロールは、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独を受け入れる細胞及び非処理細胞を含んでいる。実験の間、培地を交換し、４日毎に細胞を継代した。分裂する細胞を、トランスフェクション後１、２、３、７、１０及び１４日目に回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果が示すのは、ルシフェラーゼ発現に対するｓｉＲＮＡ−ｌｕｃの阻害は、検討した日のそれぞれにおいて８０から９５％の範囲であった（表Ｂ下部参照）。コントロールのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞又はＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独で処理した細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルは、非処理細胞に比較して、有意な差ではなかった。これらの結果が示すのは、ｓｉＲＮＡにて媒介されるＲＮＡ干渉は、これらの培養細胞株において高度に効果的であって長期間持続するものであることであり、マウス卵母細胞にて検討した結果から観察されるＲＮＡ干渉にて一貫しており、ＲＮＡ干渉は、５０から１００倍増加していた。
【０１５０】
【表１０】
表Ｂ：ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ由来ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃの単独適用は、ルシフェラーゼ発現において長期間阻害した。データは、コントロールのｓｉＲＮＡ−ｏｒｉを適用した細胞にて標準化した。
【０１５１】
Ｇ．ＥＰＥＩ及びＭＣ７９８を用いた、内在性遺伝子発現（核ラミンＡ／Ｃ）のｓｉＲＮＡにより媒介された阻害
最終濃度を２５ｎＭとして、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ［又はコントロールのｓｉＲＮＡ］の分裂ＣＨＯ細胞への送達に、ＥＰＥＩとＭＣ７９８を組み合わせて（ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ）使用した。コントロールは、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独を適用される細胞又は非処理細胞を含んでいる。実験の間、培地を交換し、４日毎に細胞を継代した。分裂する細胞を、トランスフェクション後、２日目に回収し、細胞質総タンパクを精製した。ラミンＡ／Ｃに標的化されたｓｉＲＮＡ（及びコントロールのｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトされた細胞に由来するタンパク質の一部を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３から１２％のグラジエントゲル）を実行し、ナイロンメンブレンに電気を用いてトランスファーした。核ラミンＡ／Ｃのタンパク発現は、ウェスタンブロット分析により定量化した（抗マウスラミンＡ／Ｃ）。結果が示すのは、核ラミン発現のｓｉＲＮＡ−ラミンＡ／Ｃ阻害は、検討した日において８０から９５％であった。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞又はＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ単独で処理した細胞におけるラミンＡ／Ｃのレベルは、非処理細胞に比べて有意差がなかった。この結果が示すのは、ｓｉＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉は、内在性細胞性遺伝子の発現阻害において高度に効果的である、ということである。
【０１５２】
上述した内容は、本発明の手段のみを例示する目的である。さらに、当業者には種々の改変及び変更を即座に行うことが可能であることから、上述した正確な構造及び制御へと、本発明を限定することを所望するものではない。従って、全ての適切な改変及び等価物は、本発明の範囲内に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性化合物、ポリカチオン及びｓｉＲＮＡを有する送達可能な組成物。
【請求項２】
前記ポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパクであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合タンパクは、ヒストンであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒストンは、ヒストンＨ１であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリカチオンは、ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
以下の構造
【化１】
を有し、
Ｒ１及びＲ２は、炭素数６乃至２４のアルカン、炭素数６乃至２４のアルケン、シクロアルキル、ステロール、ステロイド、置換脂質、脂肪酸のアシルセグメント、疎水性ホルモン及び疎水性ホルモンアナログからなる群から選択されていることを特徴とする請求項１に記載の両親媒性化合物。
【請求項７】
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は同一であることを特徴とする請求項６に記載の両親媒性化合物。
【請求項８】
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は異なっていることを特徴とする請求項６に記載の両親媒性化合物。
【請求項９】
動物細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法であって：
両親媒性化合物、効果量のポリカチオン及び溶液状態のｓｉＲＮＡにて構成される組成物を用いて、前記細胞を関連付けすることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパクであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合タンパクはヒストンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒストンは、ヒストンＨ１であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリカチオンは、ポリマーであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物細胞はｉｎ ｖｉｖｏに存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏに存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏに存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１】
両親媒性化合物、ポリカチオン及びｓｉＲＮＡを有する送達可能な組成物。
【請求項２】
前記ポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパクであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合タンパクは、ヒストンであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒストンは、ヒストンＨ１であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリカチオンは、ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
以下の構造
【化１】
を有し、
Ｒ１及びＲ２は、炭素数６乃至２４のアルカン、炭素数６乃至２４のアルケン、シクロアルキル、ステロール、ステロイド、置換脂質、脂肪酸のアシルセグメント、疎水性ホルモン及び疎水性ホルモンアナログからなる群から選択されていることを特徴とする請求項１に記載の両親媒性化合物。
【請求項７】
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は同一であることを特徴とする請求項６に記載の両親媒性化合物。
【請求項８】
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は異なっていることを特徴とする請求項６に記載の両親媒性化合物。
【請求項９】
動物細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法であって：
両親媒性化合物、効果量のポリカチオン及び溶液状態のｓｉＲＮＡにて構成される組成物を用いて、前記細胞を関連付けすることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパクであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合タンパクはヒストンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒストンは、ヒストンＨ１であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリカチオンは、ポリマーであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物細胞はｉｎ ｖｉｖｏに存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏに存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏに存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−１３２６６５（Ｐ２０１０−１３２６６５Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１（Ｐ２０１０−１１）
【出願日】平成２２年１月４日（２０１０．１．４）
【分割の表示】特願２００３−５４２６２１（Ｐ２００３−５４２６２１）の分割
【原出願日】平成１４年５月３０日（２００２．５．３０）
【出願人】（５０４０７４９８３）マイラス バイオ コーポレーション (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月４日（２０１０．１．４）
【分割の表示】特願２００３−５４２６２１（Ｐ２００３−５４２６２１）の分割
【原出願日】平成１４年５月３０日（２００２．５．３０）
【出願人】（５０４０７４９８３）マイラス バイオ コーポレーション (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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