抗原ｕＰＡＲに対して向けられる標的化結合剤、およびこうした抗体の使用を記載する。特に、抗原ｕＰＡＲに対して向けられる完全ヒト・モノクローナル抗体。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、および該分子を含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）に渡る、特にＦＲ１〜ＦＲ４、またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の隣接する重鎖および軽鎖配列に対応する配列。こうした免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現しているハイブリドーマまたは他の細胞株。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
［０００１］本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９のもとに、２００６年４月１０日出願の米国仮出願第６０／７９０，６４２号に優先権を請求し、該出願は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
分野
［０００２］本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に対する標的化結合剤およびこうした剤の使用に関する。より具体的には、本発明は、ｕＰＡＲに対して向けられる完全ヒト・モノクローナル抗体に関する。記載する結合剤は、ｕＰＡＲの活性および／または過剰産生と関連する疾患の診断法として、そして該疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
背景
［０００３］ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ、ＣＤ８７）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００２６５０は、５５〜６０ｋＤａの非常にグリコシル化された３１３残基ポリペプチドであり、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカーによって、細胞膜の外葉に連結されている。該タンパク質は、３つの非常に相同なドメイン、ＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩにフォールディングされる（Ｈｕａｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１： ６５６−６５９ ２００６）。ｕＰＡＲのＮ末端は、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）結合部位（ＤＩ）を提供する（Ｇａｒｄｓｖｏｌｌら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４： ３７９９５−３８００３ １９９９）。証拠によって、ドメイン３中の残基が、リガンド結合部位の組み立てに関与し、そしてドメイン２および３がドメイン１へのｕＰＡ結合のアフィニティーを増加させることが示唆されている（Ｌｉａｎｇら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６： ２８９４６−２８９５３ ２００１）。Ｃ末端ドメイン（ＤＩＩＩ）はプロセシングされて、残基ｓｅｒ２８２、ｇｌｙ２８３、ａｌａ２８４を含むグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカーが付加される。ＤＩおよびＤＩＩの間のリンカー領域中（Ｈｏｙｅｒ−Ｈａｎｓｅｎら， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４３： ２１−２６ １９９７； Ａｎｄｏｌｆｏら， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ８８： ２９８−３０６ ２００２）、ならびにＣ末端ドメイン内の残基（Ｂｅａｕｆｏｒｔら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２： ５４５０−５４９ ２００４）のタンパク質分解的切断の結果、ＤＩＩおよびＤＩＩＩを含む膜係留型、ならびにＤＩ−ＤＩＩＩまたはＤＩＩ−ＤＩＩＩを含むｕＰＡＲの可溶性型（ｓｕＰＡＲ）の両方が存在する。糖脂質アンカーの切断はまた、細胞表面からｕＰＡＲを遊離させうる（Ｗｉｌｈｅｌｍら， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８０： ２２５−２３５ １９９９）。ＤＩを取り込んだ可溶性ｕＰＡＲは、ウロキナーゼに結合する能力を保持する（Ｈｉｇａｚｉら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０： １７３７５−１７３８０ １９９５）。
【０００４】
［０００４］ｕＰＡＲは、循環白血球、血管平滑筋細胞、血管新生内皮細胞、骨髄細胞、および線維芽細胞を含む、多くの種類の細胞表面上で発現される。細胞表面でのｕＰＡＲ発現の上方制御、およびプラスミノーゲン活性化は、炎症、創傷修復、関節炎（Ｓｚｅｋａｎｅｃｚら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ５０： ３１４−３１９ １９９７）、アテローム性動脈硬化症（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １７： ４３９−４４４ １９９７）、血管新生、ならびに腫瘍浸潤および転移を含む、いくつかの状態に結びつけられてきている。血漿中に可溶性ｕＰＡＲが上昇したレベルで存在すると、結腸直腸癌の予後マーカーとなることが示されてきている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９１： ８６９−８７４ １９９９）。
【０００５】
［０００５］不活性酵素前駆体プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼ・プラスミンへの活性化は、線維素溶解を制御する重要な事象である。２つのプラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）がある。ｔＰＡは、血漿中の重要なプラスミノーゲン活性化因子であるようであるが、ｕＰＡは、ｕＰＡＲへの結合の結果として、細胞表面プラスミノーゲン活性化と関連する。ウロキナーゼは、非常に低い生得的酵素活性を示すか、またはまったく該活性を示さない、一本鎖酵素前駆体（ｓｃｕＰＡ）として分泌される。プラスミンによって酵素的に切断された後、ｓｃｕＰＡは、ジスルフィド結合で連結された活性二鎖高分子量（ＨＭＶ）−ｕＰＡに変換される。このＨＭＷ−ｕＰＡは、Ａ鎖（ａａ １−１５８）およびＢ鎖またはＬＭＷ−ｕＰＡ（ａａ １５９−４１１）で構成される。ｕＰＡＲとｕＰＡの主な相互作用は、アミノ末端断片（ＡＴＦ）に位置する、Ａ鎖中のｕＰＡの増殖因子ドメイン（ＧＦＤ）ａａ １−４８を通じて仲介される。ｕＰＡＲと相互作用するｕＰＡ中の第二の部位（連結ペプチド、ａａ １３６−１４３）が同定されてきている。
【０００６】
［０００６］ｕＰＡＲに関するｕＰＡの結合アフィニティーは、約１ｎＭ（Ｋｄ）である。異なる種の間で、ｕＰＡＲの一次構造を比較すると、ヒトｕＰＡＲは、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））のものと９５％同一であり、そしてマウス（ムス・ムスキュルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））のものと６０％しか同一でない。さらに、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの高アフィニティー結合は、種特異的である。種を渡る、ｕＰＡＲに対するｕＰＡ（例えばラットｕＰＡＲへのヒトｕＰＡ）のアフィニティーは、少なくとも２桁異なる。
【０００７】
［０００７］ｕＰＡＲへのｕＰＡの細胞表面補充は、細胞表面プラスミノーゲン活性化を制御する：ｓｃｕＰＡは、受容体が結合している際、より効率的に活性化される（Ｅｌｌｉｓら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４： ２１８５−２１８８ １９８９）；受容体に結合したｕＰＡの触媒効率は、溶液相中のｕＰＡに比較して増加する（Ｈｉｇａｚｉら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０： １７３７５−１７３８０ １９９５）； ＰＡＩ−１は、受容体に結合したｕＰＡの阻害剤として、より効率的でない（Ｅｌｌｉｓら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５： ９９０４−９９０８ １９９０）。今度は、プラスミノーゲンが、低および高アフィニティー相互作用を通じて、細胞表面に補充され、そして細胞表面でプラスミン生成がより効率的に進行し、そしてプラスミン生成はまた、その生理学的阻害剤に、より感受性でない。腫瘍細胞表面では、プラスミノーゲン活性化によって、腫瘍進行に寄与するいくつかのプロセスが促進され、こうしたプロセスには、マトリックス−メタロプロテアーゼの活性化、細胞外マトリックスタンパク質の分解、腫瘍増殖および浸潤を駆動する増殖因子の放出および活性化が含まれる（Ａｎｄｒｅａｓｅｎら， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２： １−２２ １９９７）。
【０００８】
［０００８］プラスミノーゲン活性化における、よく確立された役割に加えて、より最近、ビトロネクチンの接着受容体としてのｕＰＡＲの役割、ｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびＰＡＩ−１を伴う複雑な相互作用が、証拠によって確立されてきている（ＷａｌｔｚおよびＣｈａｐｍａｎ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９： １４７４６−１４７５０ １９９４； Ｃｚｅｋａｙら， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６０： ７８１−７９１ ２００３； Ｌｉら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８： ２９９２５−２９９３２ ２００３）。細胞表面ｕＰＡＲの切断によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで走化性があることが示されているＤＩＩドメイン上のエピトープが曝露される（Ｄｅｇｒｙｓｅら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０： ２４７９２−２４８０３ ２００５）。インテグリン受容体との相互作用が報告されており（例えば、Ｗｅｉら， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６８： ５０１−５１１ ２００５； Ｗｅｉら， Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １２： ２９７５−２９８６ ２００１）、そしてｕＰＡ結合の結果としての細胞シグナル伝達経路の活性化が立証されている（ＢｌａｓｉおよびＣａｒｍｅｌｉｅｔ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３： ９３２−９４３ ２００２に概説される）。
【０００９】
［０００９］ｕＰＡＲおよびウロキナーゼ発現の増加は、乳癌、膀胱癌、胃癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌を含む、ある範囲のヒト癌において、腫瘍進行と相関している（Ｅｄｏ ｄｅ ＢｏｃｋおよびＷａｎｇ， Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４： １３−３９ ２００４）。ｕＰＡＲ遺伝子発現は、腫瘍プロモーター、増殖因子、サイトカインおよびホルモンによって、ならびにアテローム生成性リポタンパク質または低酸素症によって増加する。免疫組織化学およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究によって、ｕＰＡ／ｕＰＡＲ複合体が、腫瘍の浸潤縁に位置し（Ｐｙｋｅら， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １３８： １０５９−１０６７ １９９１）、そして腫瘍浸潤と相関することが示された。ｕＰＡ、ｕＰＡＲまたはＰＡＩ−１各々の高発現レベルは、異なる種類の腫瘍において、劣った予後に関連づけられている（ＤｕｆｆｙおよびＤｕｇｇａｎ， Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７： ５４１−５４８ ２００４）。
【００１０】
［００１０］他の研究者らは、ポリクローナル・ウロキナーゼ受容体抗体が腫瘍体積を減少させ、そしてｉｎ ｖｉｖｏで潜在性の腫瘍転移の存在を検出しうることを示している（ＲａｂｂａｎｉおよびＧｌａｄｕ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２：２３９０−７ ２００２）。アデノウイルスが仲介するｕＰＡ−ＡＴＦの送達（Ｌｉら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５ １１０５−１１１３ １９９８； Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６： １１５７−１１６７ ２００５）、ｕＰＡ−ＡＴＦの安定トランスフェクション（Ｚｈｕら， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０： ２９７−３０５ ２００１）、アンチセンスｕＰＡＲ（Ｍｏｈａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９： ３３６９−３３７３ １９９９）または組み合わせアンチセンスｕＰＡＲ／ｕＰＡ（Ｇｏｎｄｉら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２： ５９６７−５９７５ ２００３）によって、ｕＰＡＲ活性の遮断または喪失、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏの浸潤、ならびにｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍増殖および浸潤の阻害が生じた。さらに、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の非受容体結合領域由来のペプチドは、腫瘍進行および血管新生を阻害し、そしてｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞死を誘導した（Ｇｕｏら， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １４：１４００−１４１０ ２０００）。
【発明の開示】
【００１１】
概要
［００１１］本発明の態様は、ｕＰＡＲに特異的に結合し、そしてそれによってプラスミノーゲン活性化および特定のマトリックス−メタロプロテアーゼの活性化を阻害する、完全ヒト標的化結合剤に関する。標的化結合剤はまた、腫瘍細胞接着および／または浸潤、ならびに／あるいは細胞性転移も阻害する。さらに、標的化結合剤は、腫瘍増殖を減少させるのに有用である。これが達成可能な機構には、ｕＰＡのその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害するか、ｕＰＡＲ／ｕＰＡ限局性ｕＰＡ酵素活性を阻害するか、インテグリンまたはビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質との相互作用を抑止して、それによってｕＰＡＲの有効濃度を減少させることのいずれかを含むことも可能であり、そしてこれらに限定されない。
【００１２】
［００１２］したがって、本発明の１つの態様は、ｕＰＡＲに特異的に結合し、そしてｕＰＡのｕＰＡＲへの結合を阻害する、標的化結合剤である。標的化結合剤は、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭまたは５０ｐＭ未満のＫ_ｄで、ｕＰＡＲに結合可能である。
【００１３】
［００１３］さらに別の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そして１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、または１００ｐｇ／ｍｌ以下程度に低い抗体濃度で、Ｕ９３７細胞に対するプラスミノーゲン活性化の９０％より多くを阻害する、標的化結合剤である。
【００１４】
［００１４］さらに別の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そして１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０で、Ｕ９３７細胞に対するプラスミノーゲン活性化を阻害する、標的化結合剤である。
【００１５】
［００１５］さらに別の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そして１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、または１００ｐｇ／ｍｌ以下程度に低い標的化結合剤濃度で、ｕＰＡＲが仲介する、ビトロネクチンへのＵ９３７細胞の細胞接着の９０％より多くを阻害する、標的化結合剤である。さらに別の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そして１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、または１００ｐｇ／ｍｌ以下程度に低い標的化結合剤濃度で、ｕＰＡＲが仲介する、ビトロネクチンへのＵ９３７細胞の細胞接着の８０％より多くを阻害する、標的化結合剤である。
【００１６】
［００１６］さらに別の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そして１０００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、または１００ｐｇ／ｍｌ以下程度に低い標的化結合剤濃度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭへのＨＴ−１０８０細胞の浸潤の９０％より多くを阻害する、標的化結合剤である。
【００１７】
［００１７］別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。一般の当業者が、ＣＤＲ決定を容易に達成可能であることが注目される。例えば、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２， メリーランド州ベセスダ（１９９１）， 第１−３巻を参照されたい。
【００１８】
［００１８］別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。
【００１９】
［００１９］別の態様において、標的化結合剤は、表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。
【００２０】
［００２０］別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）、２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）または４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）のいずれかの任意の１つの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。
【００２１】
［００２１］別の態様において、標的化結合剤は、表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む配列を含んでもよい。別の態様において、標的化結合剤は、表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含んでもよい。
【００２２】
［００２２］別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つ、および表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含む。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ、および表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００２３】
［００２３］別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つ、および表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む配列を含む。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ、および表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００２４】
［００２４］別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１９に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．６．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１９に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．６．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の態様において、標的化結合剤は、表１８に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体４．１８．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１９に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体４．１８．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。
【００２５】
［００２５］本発明の１つの態様において、標的化結合剤は抗体である。本発明の１つの態様において、標的化結合剤はモノクローナル抗体である。本発明の１つの態様において、標的化結合剤は完全ヒト・モノクローナル抗体である。
【００２６】
［００２６］別の態様において、ｕＰＡＲに結合し、そして表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体がある。別の態様において、ｕＰＡＲに結合し、そして表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体がある。別の態様において、ｕＰＡＲに結合し、そして表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体がある。特定の態様において、抗体は完全ヒト・モノクローナル抗体である。
【００２７】
［００２７］さらに別の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そして表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。別の態様において、ｕＰＡＲに結合し、そして表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む重鎖アミノ酸配列を含む抗体がある。別の態様において、ｕＰＡＲに結合し、そして表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列を含む抗体がある。特定の態様において、抗体は完全ヒト・モノクローナル抗体である。
【００２８】
［００２８］別の態様において、ｕＰＡＲに結合する抗体は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含んでもよい。別の態様において、抗体は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含むアミノ酸配列を含んでもよい。別の態様において、抗体は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２９】
［００２９］別の態様において、ｕＰＡＲに結合する抗体は、表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含んでもよい。別の態様において、抗体は、表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含むアミノ酸配列を含んでもよい。別の態様において、抗体は、表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３０】
［００３０］別の態様において、ｕＰＡＲに結合する抗体は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む重鎖アミノ酸配列、および表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列の１つを含む軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つを含む重鎖アミノ酸配列、および表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３１】
［００３１］別の態様において、ｕＰＡＲに結合する抗体は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む重鎖アミノ酸配列、および表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つを含む重鎖アミノ酸配列、および表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか２つ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３のいずれか）を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、表１８に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに表１９に示すような、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１のいずれかの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３２】
［００３２］別の態様において、抗体は、表１８に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに表１９に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、表１８に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．６．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに表１９に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体２．６．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。別の態様において、抗体は、表１８に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体４．１８．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに表１９に示すような完全ヒト・モノクローナル抗体４．１８．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３３】
［００３３］本発明のさらなる態様は、本発明の標的化結合剤または抗体と、ｕＰＡＲへの結合に関して交差競合する、標的化結合剤である。本発明の別の態様において、本発明の標的化結合剤または抗体と、ｕＰＡＲへの結合に関して交差競合する抗体がある。
【００３４】
［００３４］別の態様において、標的化結合剤または抗体は、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１および４．１８．１のいずれか１つと、ｕＰＡＲへの結合に関して交差競合する。本発明の１つの態様において、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１および４．１８．１のいずれか１つと、ｕＰＡＲへの結合に関して交差競合する抗体がある。
【００３５】
［００３５］本発明のさらなる態様は、ｕＰＡＲ上の、本発明の標的化結合剤または抗体と同じエピトープに結合する、標的化結合剤である。本発明の別の態様において、ｕＰＡＲ上の、本発明の標的化結合剤または抗体と同じエピトープに結合する、抗体がある。
【００３６】
［００３６］本発明の１つの態様において、ｕＰＡＲ上の、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１および４．１８．１のいずれか１つと同じエピトープに結合する、標的化結合剤がある。本発明の１つの態様において、ｕＰＡＲ上の、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１および４．１８．１のいずれか１つと同じエピトープに結合する、抗体がある。
【００３７】
［００３７］１つの態様において、標的化結合剤は、以下により詳細に論じるように、ｕＰＡＲに特異的に結合する、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）、２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）および／または４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）の１以上を含む。
【００３８】
［００３８］１つの態様において、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５およびＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６より選択されるハイブリドーマによって産生される、標的化結合剤または抗体を提供する。１つの態様において、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５およびＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体より誘導可能な標的化結合剤または抗体を提供する。
【００３９】
［００３９］１つの態様において、標的化結合剤は、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）、２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）および／または４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）の１以上から誘導可能な抗体を含む。
【００４０】
［００４０］１つの態様において、標的化結合剤は、配列番号２６、３０または５０の配列を有するポリペプチドを含む。１つの態様において、標的化結合剤は、配列番号２８、３２または５２の配列を有するポリペプチドを含む。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号２６、３０または５０の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号２８、３２または５２の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む。
【００４１】
［００４１］１つの態様において、本発明の標的化結合剤は、配列番号２６の配列を含むポリペプチドを含み、該配列は、表１５の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の標的化結合剤は、配列番号３０の配列を含むポリペプチドを含み、該配列は、表１３の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の標的化結合剤は、配列番号５０の配列を含むポリペプチドを含み、該配列は、表１７の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の標的化結合剤は、配列番号２８の配列を含むポリペプチドを含み、該配列は、表１４の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の標的化結合剤は、配列番号３２の配列を含むポリペプチドを含み、該配列は、表１２の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の標的化結合剤は、配列番号５２の配列を含むポリペプチドを含み、該配列は、表１６の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。
【００４２】
［００４２］１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号２６の配列を含む重鎖ポリペプチドを含み、該配列は、表１５の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号３０の配列を含む重鎖ポリペプチドを含み、該配列は、表１３の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号５０の配列を含む重鎖ポリペプチドを含み、該配列は、表１７の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号２８の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含み、該配列は、表１４の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号３２の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含み、該配列は、表１２の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号５２の配列を含む軽鎖ポリペプチドを含み、該配列は、表１６の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせのいずれか１つを有する。
【００４３】
［００４３］本発明はさらに、患者試料中のｕＰＡＲのレベルをアッセイするための方法であって、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体と、患者由来の生物学的試料を接触させ、そして前記試料中の前記抗体およびｕＰＡＲ間の結合レベルを検出する工程を含む、前記方法を提供する。より具体的な態様において、生物学的試料は、血液、血漿、唾液、脳脊髄液、骨髄または尿である。
【００４４】
［００４４］他の態様において、本発明は、本発明の標的化結合剤または該剤の結合性断片、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物を提供する。他の態様において、本発明は、本発明の抗体またはその結合性断片、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物を提供する。
【００４５】
［００４５］本発明は、悪性腫瘍の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲに結合する、本発明の標的化結合剤の療法的有効用量を該動物に投与することによって、動物において悪性腫瘍を治療する方法を提供する。特定の態様において、動物はヒトである。特定の態様において、標的化結合剤は本発明の抗体であり、そして２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）、２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）および４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）からなる群より選択されることも可能である。
【００４６】
［００４６］特定の態様において、悪性腫瘍は：黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭部および頸部癌、中皮腫、肉腫、胆道（胆管）癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、ならびに類表皮癌からなる群より選択されることも可能である。
【００４７】
［００４７］本発明のさらにさらなる態様には、細胞接着および／または浸潤関連疾患を患う動物を効率的に治療する方法であって、細胞接着および／または浸潤関連疾患の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲに特異的に結合する、本発明の標的化結合剤の療法的有効用量を該動物に投与する工程を含む、前記方法が含まれる。特定の態様において、動物はヒトである。特定の態様において、標的化結合剤は、完全ヒト・モノクローナル抗体である。特定の態様において、細胞接着または細胞浸潤関連疾患は、腫瘍転移である。特定の態様において、標的化結合剤は本発明の抗体であり、そして２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）、２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）および４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）からなる群より選択されることも可能である。
【００４８】
［００４８］治療可能な細胞接着および浸潤関連疾患には、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭部および頸部癌、中皮腫、肉腫、胆道（胆管）癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、ならびに類表皮癌が含まれる。
【００４９】
［００４９］治療可能な細胞接着および浸潤関連疾患には、非新生物疾患、例えば炎症性、または過剰増殖性疾患が含まれ、これらには、限定されるわけではないが、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー性結膜炎が含まれる。
【００５０】
［００５０］本発明のさらなる態様には、動物において、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着および／または浸潤を阻害する方法が含まれる。これらの方法には、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着および浸潤の治療が必要な動物を選択し、そして本発明の標的化結合剤または完全ヒト・モノクローナル抗体の療法的有効用量を、前記動物に投与する工程が含まれ、ここで前記抗体はｕＰＡＲに特異的に結合する。
【００５１】
［００５１］本発明のさらなる態様には、動物における細胞接着または浸潤関連疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗体の使用が含まれ、ここで前記モノクローナル抗体は、ｕＰＡＲに特異的に結合する。
【００５２】
［００５２］さらにさらなる態様において、本明細書記載の標的化結合剤を、動物における、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着、および／または浸潤の有効な治療用の薬剤の調製に用いてもよく、ここで前記標的化結合剤は、ｕＰＡＲに特異的に結合する。さらにさらなる態様において、本明細書記載の抗体を、動物における、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着、および／または浸潤の有効な治療用の薬剤の調製に用いてもよく、ここで前記抗体は、ｕＰＡＲに特異的に結合する。
【００５３】
［００５３］本明細書記載の本発明の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そしてｕＰＡＲ機能に影響を及ぼす標的化結合剤に関する。本明細書記載の本発明の他の態様は、ｕＰＡＲに結合し、そしてｕＰＡＲ機能に影響を及ぼすモノクローナル抗体に関する。他の態様は、ｕＰＡＲに関する高い結合アフィニティー、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでｕＰＡＲを中和する能力、ならびにｕＰＡＲが誘導する細胞接着および／または浸潤および／または腫瘍増殖を阻害する能力を含む、療法的観点から望ましい特性を持つ、本発明の抗ｕＰＡＲ抗体に関する。他の態様は、ｕＰＡＲに関する高い結合アフィニティー、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでｕＰＡＲを中和する能力、ならびにｕＰＡＲが誘導する細胞接着および／または浸潤および／または腫瘍増殖を阻害する能力を含む、療法的観点から望ましい特性を持つ、本発明の抗ｕＰＡＲ抗体の調製に関する。他の態様は、ｕＰＡＲに関する高い結合アフィニティー、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでｕＰＡＲを中和する能力、ならびにｕＰＡＲが誘導する細胞接着および／または浸潤および／または腫瘍増殖を阻害する能力を含む、療法的観点から望ましい特性を持つ、本発明の完全ヒト抗ｕＰＡＲ抗体に関する。他の態様は、ｕＰＡＲに関する高い結合アフィニティー、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでｕＰＡＲを中和する能力、ならびにｕＰＡＲが誘導する細胞接着および／または浸潤および／または腫瘍増殖を阻害する能力を含む、療法的観点から望ましい特性を持つ、本発明の完全ヒト抗ｕＰＡＲ抗体の調製に関する。
【００５４】
［００５４］１つの態様において、本発明には、非常に高いアフィニティー（Ｋｄ）でｕＰＡＲに結合する抗体が含まれる。例えば、限定されるわけではないが、１０^−５、１０^−６、１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０または１０^−１１Ｍ未満、あるいはこれらの中の任意の範囲または値のＫｄで、ｕＰＡＲに結合可能な、ヒト、ウサギ、マウス、キメラまたはヒト化抗体。本明細書に記載するように、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって、アフィニティーおよび／またはアビディティー測定値を測定してもよい。
【００５５】
［００５５］本発明の１つの態様には、ｕＰＡＲに結合する単離抗体、またはこれらの抗体の断片が含まれる。当該技術分野に知られるように、抗体は、例えば、ポリクローナル、オリゴクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および／または完全ヒト抗体であってもよい。本明細書記載の本発明の態様はまた、これらの抗体を産生するための細胞も提供する。
【００５６】
［００５６］本発明の態様が、抗体、あるいは生成法または産生法のいかなる特定の型にも限定されないことが認識されるであろう。例えば、本発明の抗ｕＰＡＲ抗体は、全長抗体（例えば損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ヒトＦｃ領域を有する）または抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖまたはＤａｂ（Ｄａｂは、ヒト抗体の最小機能結合単位である））であってもよい。さらに、抗体を分泌するハイブリドーマから、あるいは抗体をコードする単数または複数の遺伝子で形質転換されたかまたはトランスフェクションされている組換え的に産生された細胞から、抗体を製造してもよい。
【００５７】
［００５７］本発明の他の態様には、本明細書に記載するような標的化結合剤、抗体またはその断片のいずれかをコードする単離核酸分子、抗ｕＰＡＲ抗体をコードする単離核酸分子を有するベクター、あるいはこうした核酸分子のいずれかで形質転換されている宿主細胞が含まれる。さらに、本発明の１つの態様は、核酸分子を発現させて抗体を産生する条件下で、宿主細胞を培養した後、抗体を回収することによって、本発明の抗ｕＰＡＲ抗体を産生する方法である。本発明の態様にはまた、抗体産生のために宿主細胞内にトランスフェクションした際、抗体またはその断片の収量を増加させるために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体の断片をコードする、いかなる核酸分子も含まれることを理解すべきである。
【００５８】
［００５８］さらなる態様には、ヒトｕＰＡＲまたはその断片、および１以上のオルソロガス配列またはその断片で哺乳動物を免疫することによって、ｕＰＡＲに対する高アフィニティー抗体を産生する方法が含まれる。
【００５９】
［００５９］他の態様は、ｕＰＡＲに特異的に結合する単離抗体の生成および同定に基づく。ｕＰＡＲは、新生物疾患などの細胞接着および／または浸潤関連疾患において、上昇したレベルで発現される。ｕＰＡＲの生物学的活性を阻害すると、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着および浸潤、ならびに他の望ましい効果が防止されうる。
【００６０】
［００６０］本発明の別の態様には、疾患または状態を診断する方法であって、本明細書に記載するように調製した抗体を利用して、患者試料中のｕＰＡＲのレベルを検出する、前記方法が含まれる。１つの態様において、患者試料は、血液または血清である。さらなる態様において、抗ｕＰＡＲ抗体を用いた、ｕＰＡＲの過剰発現の同定を伴う、リスク要因の同定法、疾患の診断法、および疾患の病期診断法を提示する。
【００６１】
［００６１］本発明の別の態様には、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体と、血清または細胞を接触させ、そしてその後、ｕＰＡＲの存在を検出することによって、細胞中のｕＰＡＲの発現と関連する状態を診断する方法が含まれる。好ましい状態には、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌腫を含む、細胞接着および／または浸潤関連疾患が含まれる。
【００６２】
［００６２］別の態様において、本発明には、哺乳動物組織、細胞、または体液中のｕＰＡＲを検出して、ｕＰＡＲ関連疾患に関してスクリーニングするためのアッセイキットが含まれる。該キットには、ｕＰＡＲに結合する、本発明の標的化結合剤または抗体、ならびに存在するならば、ｕＰＡＲと抗体の反応を示すための手段が含まれる。１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、ｕＰＡＲに結合する抗体は標識されている。さらに別の態様において、抗体は、非標識一次抗体であり、そしてキットにはさらに、一次抗体を検出するための手段が含まれる。１つの態様において、検出するための手段には、抗免疫グロブリンである、標識二次抗体が含まれる。蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群より選択されるマーカーで、該抗体を標識してもよい。
【００６３】
［００６３］本発明の他の態様には、薬学的に許容されうるキャリアーまたは希釈剤と混合された、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体の有効量を有する薬学的組成物が含まれる。さらに他の態様において、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体、あるいはその断片を、療法剤にコンジュゲート化する。療法剤は、例えば、毒素または放射性同位体であってもよい。
【００６４】
［００６４］さらに別の態様には、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体の有効量を、患者に投与することによって、患者におけるｕＰＡＲの発現と関連する疾患または状態を治療するための方法が含まれる。本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体を単独で投与してもよいし、あるいはさらなる抗体または化学療法薬剤または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。例えば、細胞接着および／または浸潤を遮断するｕＰＡＲ抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物を、腫瘍細胞増殖を直接阻害することが示された薬剤と組み合わせて投与してもよい。該方法をｉｎ ｖｉｖｏで実行してもよく、そして患者は、好ましくはヒト患者である。好ましい態様において、該方法は、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌腫を含む、細胞接着および／または浸潤関連疾患の治療に関する。
【００６５】
［００６５］別の態様において、本発明は、容器を含む製品を提供する。容器には、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体を含有する組成物、ならびにｕＰＡＲの過剰発現によって特徴付けられる細胞接着および／または浸潤関連疾患を治療するために該組成物を使用可能であることを示す、パッケージ挿入物またはラベルが含まれる。
【００６６】
［００６６］いくつかの態様において、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体を患者に投与した後、除去剤を投与して、過剰な循環抗体を血液から除去する。
［００６７］さらに別の態様は、細胞接着および／または浸潤関連疾患などの疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体の使用である。１つの態様において、細胞接着および／または浸潤関連疾患には、癌腫、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、結腸直腸、食道、甲状腺、膵臓、前立腺および膀胱の癌が含まれる。別の態様において、細胞接着および／または浸潤関連疾患には、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、肉腫、頭部および頸部癌、中皮腫、胆道（胆管）癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および神経膠芽腫が含まれる。
【００６７】
［００６８］さらに別の態様は、動物における悪性腫瘍の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体の使用である。
［００６９］本発明のさらに別の態様は、非新生物疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体の使用である。本発明のさらに別の態様は、限定されるわけではないが、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー性結膜炎を含む、炎症性、または過剰増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗ｕＰＡＲ抗体の使用である。
【００６８】
詳細な説明
［００７９］本発明の態様は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合する標的化結合剤に関する。いくつかの態様において、結合剤はｕＰＡＲに結合し、そしてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害する。１つの態様において、標的化結合剤はモノクローナル抗体またはその結合性断片である。
【００６９】
［００８０］本発明の他の態様には、完全ヒト抗ｕＰＡＲ抗体、および療法的に有用な抗体調製物が含まれる。１つの態様において、本発明の抗ｕＰＡＲ抗体の調製物は、ｕＰＡＲに関する強い結合アフィニティー、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミノーゲン活性化を阻害する能力、ならびにｕＰＡＲが誘導する細胞接着および浸潤をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで阻害する能力を含む、望ましい療法特性を有する。
【００７０】
［００８１］本発明の態様にはまた、抗ｕＰＡＲ抗体の単離結合性断片も含まれる。１つの態様において、結合性断片は、完全ヒト抗ｕＰＡＲ抗体に由来する。典型的な断片には、以下により詳細に記載するように、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｄａｂ、または他の周知の抗体断片が含まれる。本発明の態様にはまた、ｕＰＡＲに対する完全ヒト抗体を発現する細胞も含まれる。細胞の例には、ハイブリドーマ、または組換え的に生成された細胞、例えば、ｕＰＡＲに対する抗体を産生する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞の変異体（例えばＤＧ４４）およびＮＳ０細胞が含まれる。ＣＨＯ細胞の変異体に関するさらなる情報は、本明細書にその全体が援用される、ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＲｅｉｌｌｙ（２００４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５， ４５６−４６２に見いだされうる。
【００７１】
［００８２］さらに、本発明の態様には、疾患を治療するためにこれらの抗体を使用する方法が含まれる。本発明の抗ｕＰＡＲ抗体は、ｕＰＡＲが仲介するプラスミノーゲン活性化を防止し、それによって細胞接着および／または浸潤を阻害するのに有用である。いかなる特定の理論にも限定されることなく、この阻害の作用機構には、ｕＰＡがその受容体ｕＰＡＲに結合することからの阻害が含まれることも可能である。本発明の抗ｕＰＡＲ抗体はまた、ｕＰＡＲ／ｕＰＡ限局性ｕＰＡ酵素活性を阻害して、それによってｕＰＡＲの有効濃度を減少させることも可能である。本発明の抗ｕＰＡＲ抗体は、ｕＰＡＲに依存する、ビトロネクチンへの細胞の接着を阻害することも可能であり、そしてまた、インテグリンが仲介する細胞接着のｕＰＡＲ修飾を混乱させることも可能である。本発明の抗ｕＰＡＲ抗体はまた、ｕＰＡＲへのｕＰＡ結合を阻害するか、またはインテグリンおよび増殖因子受容体とのｕＰＡＲ相互作用を混乱させた結果、細胞内シグナル伝達を修飾することも可能である。この阻害機構を通じて治療可能な疾患には、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌および腫瘍が含まれる。
【００７２】
［００８３］本発明の他の態様には、生物学的試料中のｕＰＡＲの量を特異的に決定するための診断アッセイが含まれる。アッセイキットには、こうした抗体を検出するのに必要な標識とともに、本発明の抗ｕＰＡＲ抗体が含まれてもよい。これらの診断アッセイは、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌腫を含む、細胞接着および浸潤関連疾患に関してスクリーニングするのに有用である。
【００７３】
［００８４］本発明の別の側面は、ｕＰＡＲに結合する、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストである。１つの態様において、アンタゴニストは、抗体などの標的化結合剤である。アンタゴニストは：
ｉ）ｕＰＡＲ；または
ｉｉ）ｕＰＡ／ｕＰＡＲ複合体
、あるいはこれらの組み合わせに結合してもよい。１つの態様において、アンタゴニストは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗することが可能である。アンタゴニストは、本明細書記載の抗体、例えば、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）、２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）および４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）から選択可能である。
【００７４】
［００８５］１つの態様において、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストは、ｕＰＡＲに結合可能であり、そしてそれによってｕＰＡＲが仲介するプラスミノーゲン活性化を防止し、それによって細胞接着および／または浸潤を阻害することも可能である。この阻害作用の機構には、アンタゴニストがｕＰＡＲに結合し、そしてｕＰＡのその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害することが含まれうる。いかなる特定の理論的考慮にも束縛されることは望まないが、ｕＰＡＲの生物学的活性の拮抗を達成可能な機構には、限定されるわけではないが、ｕＰＡの受容体ｕＰＡＲへの結合の阻害、またはｕＰＡＲ／ｕＰＡ限局性ｕＰＡ酵素活性の阻害が含まれる。
【００７５】
［００８６］１つの態様は、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１と同じ、単数または複数のエピトープに結合する、標的化結合剤である。
【００７６】
［００８７］１つの態様は、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１と同じ、単数または複数のエピトープに結合する、抗体である。
［００８８］１つの態様において、標的化結合剤は、１ナノモル濃度（ｎＭ）未満のＫ_ｄでｕＰＡＲに結合する。標的化結合剤は、５００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫ_ｄで結合してもよい。標的化結合剤は、４００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫ_ｄで結合してもよい。標的化結合剤は、３００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫ_ｄで結合してもよい。別の態様において、標的化結合剤は、２００ｐＭ未満のＫ_ｄで結合する。
【００７７】
［００８９］１つの態様は、上述のような標的化結合剤を産生するハイブリドーマである。１つの態様は、上述のような抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマである。１つの態様において、ハイブリドーマは、完全ヒト・モノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。別の態様において、ハイブリドーマは、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１の軽鎖および／または重鎖を産生する。あるいは、ハイブリドーマは、完全ヒト・モノクローナル抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１と同じ単数または複数のエピトープに結合する抗体を産生してもよい。
【００７８】
［００９０］別の態様は、上述のような標的化結合剤をコードする核酸分子である。１つの態様は、上述のような抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。１つの態様において、核酸分子は、完全ヒト・モノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。さらに別の態様は、抗体２．１９．２、２．６．１または４．１８．１より選択される完全ヒト・モノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。
【００７９】
［００９１］本発明の別の態様は、上述のような単数または複数の核酸分子を含むベクターであり、該ベクターは、上に定義するような標的化結合剤をコードする。本発明の１つの態様は、上述のような単数または複数の核酸分子を含むベクターであり、該ベクターは、上に定義するような抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。
【００８０】
［００９２］本発明のさらに別の態様は、上に定義するようなベクターを含む宿主細胞である。あるいは、宿主細胞は、１より多いベクターを含んでもよい。
［００９３］さらに、本発明の１つの態様は、標的化結合剤を産生する方法、または核酸分子を発現させて標的化結合剤を産生する条件下で、宿主細胞を培養した後、標的化結合剤を回収することによる、本発明の方法である。本発明の１つの態様は、核酸分子を発現させて抗体を産生する条件下で、宿主細胞を培養した後、抗体を回収することによって、本発明の抗体を産生する方法である。
【００８１】
［００９４］１つの態様において、本発明には、上述のような標的化結合剤をコードする、少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクションし、宿主細胞中で核酸分子を発現させ、そして標的化結合剤を単離することによって、標的化結合剤を作製する方法が含まれる。１つの態様において、本発明には、上述のような抗体をコードする、少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクションし、宿主細胞中で核酸分子を発現させ、そして抗体を単離することによって、抗体を作製する方法が含まれる。
【００８２】
［００９５］別の側面にしたがって、本発明には、本明細書に記載するようなアンタゴニストを投与することによって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する方法が含まれる。該方法には、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストの療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。
【００８３】
［００９６］本発明の別の側面には、上述のような標的化結合剤を投与することによって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する方法が含まれる。該方法には、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する標的化結合剤の療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。
【００８４】
［００９７］本発明の別の側面には、上述のような抗体を投与することによって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する方法が含まれる。該方法には、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する抗体の療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。
【００８５】
［００９８］別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストの療法的有効量を投与することによって、哺乳動物における疾患関連細胞接着および／または浸潤を治療する方法を提供する。該方法には、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストの療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。
【００８６】
［００９９］別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する標的化結合剤の療法的有効量を投与することによって、哺乳動物における疾患関連細胞接着および／または浸潤を治療する方法を提供する。該方法には、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する標的化結合剤の療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。標的化結合剤を単独で投与してもよいし、あるいはさらなる抗体または化学療法薬剤または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【００８７】
［０１００］別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する抗体の療法的有効量を投与することによって、哺乳動物における疾患関連細胞接着および／または浸潤を治療する方法を提供する。該方法には、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する抗体の療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。抗体を単独で投与してもよいし、あるいはさらなる抗体または化学療法薬剤または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【００８８】
［０１０１］別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストの療法的有効量を投与することによって、哺乳動物における癌を治療する方法を提供する。該方法には、癌の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗するアンタゴニストの療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。アンタゴニストを単独で投与してもよいし、あるいはさらなる抗体または化学療法薬剤または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【００８９】
［０１０２］別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する標的化結合剤の療法的有効量を投与することによって、哺乳動物における癌を治療する方法を提供する。該方法には、癌の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する標的化結合剤の療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。標的化結合剤を単独で投与してもよいし、あるいはさらなる抗体または化学療法薬剤または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【００９０】
［０１０３］別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する抗体の療法的有効量を投与することによって、哺乳動物における癌を治療する方法を提供する。該方法には、癌の治療が必要な動物を選択し、そしてｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する抗体の療法的有効用量を該動物に投与する工程が含まれてもよい。抗体を単独で投与してもよいし、あるいはさらなる抗体または化学療法薬剤または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【００９１】
［０１０４］本発明の別の側面にしたがって、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療用の薬剤の製造のための、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニストの使用を提供する。
【００９２】
［０１０５］本発明の別の側面にしたがって、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療用の薬剤の製造のための、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する標的化結合剤の使用を提供する。
【００９３】
［０１０６］本発明の別の側面にしたがって、疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療用の薬剤の製造のための、ｕＰＡＲの生物学的活性に拮抗する抗体の使用を提供する。
【００９４】
［０１０７］１つの態様において、本発明は、ｕＰＡＲ受容体のみに、またはｕＰＡＲ受容体に部分的に依存する腫瘍を持つ患者において、ｕＰＡＲに拮抗する際の使用に特に適している。
【００９５】
［０１０８］本発明の別の態様には、哺乳動物組織、細胞、または体液中のｕＰＡＲを検出して、細胞接着および浸潤関連疾患に関してスクリーニングするためのアッセイキットが含まれる。該キットには、ｕＰＡＲに結合する標的化結合剤、および存在するならば、ｕＰＡＲと標的化結合剤の反応を示すための手段が含まれる。１つの態様において、ｕＰＡＲに結合する標的化結合剤は標識されている。別の態様において、標的化結合剤は、標識されず、そしてキットはさらに、標的化結合剤を検出するための手段を含む。好ましくは、標的化結合剤は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群より選択されるマーカーで、標識される。
【００９６】
［０１０９］本発明の別の態様には、哺乳動物組織、細胞、または体液中のｕＰＡＲを検出して、細胞接着および浸潤関連疾患に関してスクリーニングするためのアッセイキットが含まれる。該キットには、ｕＰＡＲに結合する抗体、および存在するならば、ｕＰＡＲと抗体の反応を示すための手段が含まれる。抗体はモノクローナル抗体であってもよい。１つの態様において、ｕＰＡＲに結合する抗体は標識されている。別の態様において、抗体は、非標識一次抗体であり、そしてキットはさらに、一次抗体を検出するための手段を含む。１つの態様において、手段には、抗免疫グロブリンである、標識二次抗体が含まれる。好ましくは、該抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群より選択されるマーカーで、標識される。
【００９７】
［０１１０］抗ｕＰＡＲ抗体に関するさらなる態様、特徴等を、以下にさらに詳細に提供する。
配列表
［０１１１］本発明の態様には、表１に以下に列挙する特定の抗ｕＰＡＲ抗体が含まれる。この表は、対応する重鎖および軽鎖遺伝子の可変ドメインの配列番号とともに、各抗ｕＰＡＲ抗体の同定番号を報告する。各抗体は、２つの小数点で区切られた３つの数字を含む同定番号を与えられている。
【００９８】
表１
【００９９】
【表１−１】

【０１００】
【表１−２】

【０１０１】
定義
［０１１２］別に定義しない限り、本明細書に用いる科学的用語および技術的用語は、一般の当業者に通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションと関連して利用する用語、およびこれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。
【０１０２】
［０１１３］組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換には、標準的技術を用いる（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）。製造者の指定にしたがい、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、酵素反応および精製技術を行う。当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用し、そして論じる、多様な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されるように、一般的に、前述の技術および方法を行う。例えば、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１））を参照されたい。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して利用する用語、ならびにこれらの実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いる。
【０１０３】
［０１１４］本開示にしたがって利用した際、以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
［０１１５］アンタゴニストは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、あるいはこれらの断片またはこれらのコンジュゲートもしくは融合タンパク質であってもよい。ＲＮＡｉの概説には、Ｍｉｌｈａｖｅｔ Ｏ， Ｇａｒｙ ＤＳ， Ｍａｔｔｓｏｎ ＭＰ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ． ２００３ Ｄｅｃ；５５（４）：６２９−４８． 概説）を参照されたく、そしてアンチセンスの概説には、Ｏｐａｌｉｎｓｋａ ＪＢ， Ｇｅｗｉｒｔｚ ＡＭ．（Ｓｃｉ ＳＴＫＥ． ２００３ Ｏｃｔ ２８；２００３（２０６）：ｐｅ４７．）を参照されたい。
【０１０４】
［０１１６］疾患関連細胞接着および／または浸潤は、いかなる異常な、望ましくない、または病的な細胞接着および／または浸潤であってもよく、例えば腫瘍関連細胞接着および／または浸潤であってもよい。細胞接着および／または浸潤関連疾患には、限定されるわけではないが、非固形腫瘍、例えば、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫、そしてまた、固形腫瘍、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽腫、甲状腺、胆管、骨、胃、脳／ＣＮＳ、頭部および頸部、肝臓系、胃、前立腺、乳房、腎臓、精巣、卵巣、皮膚、子宮頸部、肺、筋肉、ニューロン、食道、膀胱、肺、子宮、膣、子宮内膜、腎臓、結腸直腸、膵臓、胸膜／腹膜、唾液腺、および表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｏｕｓ）の癌腫が含まれる。
【０１０５】
［０１１７］化合物は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ、いかなる小分子量化合物も指す。
［０１１８］用語「ｕＰＡＲ」は、分子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体を指す。
【０１０６】
［０１１９］用語「中和」は、抗体などの標的化結合剤を指す場合、抗体が、標的抗原の活性を排除するか、または有意に減少させる能力に関する。したがって、本発明の「中和」抗ｕＰＡＲ抗体は、ｕＰＡＲの活性を排除するかまたは有意に減少させることが可能である。中和ｕＰＡＲ抗体は、例えば、ｕＰＡのその受容体ｕＰＡＲへの結合を遮断することによって作用可能である。この結合を遮断することによって、ｕＰＡが仲介するプラスミノーゲン活性化は、有意に、または完全に、排除される。理想的には、ｕＰＡＲに対する中和抗体は、細胞接着および／または浸潤を阻害する。
【０１０７】
［０１２０］用語「ポリペプチド」は、本明細書において、ポリペプチド配列の天然タンパク質、断片または類似体を指す、一般的な用語として用いられる。したがって、天然タンパク質、断片、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明にしたがった、好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒト・カッパ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパまたはラムダ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子とともに、重鎖免疫グロブリンを含む組み合わせ、およびその逆によって形成される抗体分子、ならびにその断片および類似体を含む。本発明にしたがった、好ましいポリペプチドはまた、単に、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはその断片も含んでもよい。
【０１０８】
［０１２１］用語「天然存在」は、本明細書において、対象に適用した際、対象が天然で見られうるという事実を指す。例えば、天然供給源から単離可能であり、そして人間によって、実験室において、または別の方式で、意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然存在である。
【０１０９】
［０１２２］用語「機能可能であるように連結された」は、本明細書において、その意図される方式で機能することが可能にされた関係にある、そのように記載された構成要素の位置を指す。例えば、コード配列に「機能可能であるように連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成される方式で連結されている。
【０１１０】
［０１２３］用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡへテロ二重鎖の、少なくとも長さ１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を意味する。この用語には、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖型が含まれる。
【０１１１】
［０１２４］本明細書で称される用語「オリゴヌクレオチド」には、天然存在連結および非天然存在連結によって一緒に連結された、天然存在ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、一般的に２００塩基以下の長さを含む、ポリヌクレオチド・サブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜６０塩基、そして最も好ましくは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブ用に、一本鎖であるが；オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子突然変異体の構築で使用するため、二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドのいずれかであってもよい。
【０１１２】
［０１２５］本明細書で称される用語「天然存在ヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書で称される用語「修飾ヌクレオチド」には、修飾されたまたは置換された糖基等を含むヌクレオチドが含まれる。本明細書で称される用語「オリゴヌクレオチド連結」には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデート等のオリゴヌクレオチド連結が含まれる。例えば、その開示が本明細書に援用される、ＬａＰｌａｎｃｈｅら Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：９０８１（１９８６）； Ｓｔｅｃら Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０６：６０７７（１９８４）； Ｓｔｅｉｎら Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９（１９８８）； Ｚｏｎら Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９（１９９１）； Ｚｏｎら Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ． ８７−１０８（Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， 英国オックスフォード（１９９１））； Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号； ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。所望の場合、オリゴヌクレオチドには、検出のための標識が含まれてもよい。
【０１１３】
［０１２６］２つのアミノ酸配列間に部分的なまたは完全な同一性がある場合、これらの配列は「相同」である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列を最大マッチングになるように並列させた場合、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。マッチングを最大にする際、ギャップ（マッチングさせている２つの配列のいずれかにおけるもの）が許可され；５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、突然変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティを伴い、プログラムＡＬＩＧＮを用いて、５（標準偏差単位）よりも高い並列スコアを有するならば、本明細書でこの用語を用いた場合、２つのタンパク質配列（または少なくとも長さ約３０アミノ酸の該タンパク質配列に由来するポリペプチド配列）は相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中， ｐｐ． １０１−１１０（第５巻， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の補遺２、ｐｐ． １−１０を参照されたい。２つの配列またはその部分は、より好ましくは、これらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に並列された際、５０％以上同一であるならば、相同である。２つのオルソロガス配列内に、相同性が異なる領域がありうることを認識しなければならない。例えば、マウスおよびヒトのオルソログの機能部位は、非機能領域より高い度合いの相同性を有しうる。
【０１１４】
［０１２７］用語「に対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相同である（すなわち、厳密に進化的に関連せずに、同一である）か、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。
【０１１５】
［０１２８］対照的に、用語「に相補的」は、本明細書において、相補配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【０１１６】
［０１２９］用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウィンドウに渡って同一である（すなわちヌクレオチドごとまたは残基ごとに基づいて）ことを意味する。用語「配列同一性パーセント」は、２つの最適に並列された配列を、比較ウィンドウに渡って比較し、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）またはアミノ酸残基が両方の配列に生じる位の数を決定して、マッチした位の数を得て、マッチした位の数を比較ウィンドウ中の位の総数（すなわちウィンドウサイズ）によって割り、そして結果に１００を乗じて、配列同一性パーセントを得ることによって、計算される。用語「実質的同一性」は、本明細書において、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位の比較ウィンドウに渡って、しばしば、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位のウィンドウに渡って、参照配列に比較した際、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、比較ウィンドウに渡って、全部で参照配列の２０パーセント以下の欠失または付加を含んでもよい配列に、参照配列を比較することによって、配列同一性パーセントを計算する、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を意味する。参照配列はより大きい配列のサブセットであってもよい。
【０１１７】
［０１３０］本明細書において、２０の慣用的なアミノ酸およびその略語は、慣用的な用法にしたがう。本明細書に援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ− Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版， Ｅ．Ｓ． ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ． Ｇｒｅｎ監修， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１））を参照されたい。２０の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非慣用的アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適した構成要素でありうる。非慣用的なアミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で用いるポリペプチド表記法において、標準的な用法および慣例にしたがって、左側はアミノ末端方向であり、そして右側はカルボキシ末端方向である。
【０１１８】
［０１３１］同様に、別に明記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は５’端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向と称され；ＲＮＡと同じ配列を有し、そしてＲＮＡ転写物の５’端より５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され；ＲＮＡと同じ配列を有し、そしてＲＮＡ転写物の３’端より３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【０１１９】
［０１３２］ポリペプチドに適用した際、用語「実質的同一性」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を用いて、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで、最適に並列された際、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１２０】
［０１３３］本明細書に論じるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における重要でない変動は、アミノ酸配列中のこうした変動が、本明細書記載の抗体または免疫グロブリン分子に対する、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するならば、本発明に含まれると意図される。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、関連側鎖を有するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般的に、ファミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは：セリンおよびスレオニンは、脂肪族ヒドロキシファミリーであり；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシン、グルタミン酸でのアスパラギン酸、セリンでのスレオニンの単一の置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の置換は、特に、その置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合、生じる分子の結合機能または特性に大きな影響を及ぼさないであろうと予測することは妥当である。アミノ酸変化によって、機能するペプチドが生じるかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって、容易に決定可能である。アッセイは、本明細書に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、一般の当業者によって容易に調製可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近くに存在する。構造ドメインおよび機能ドメインは、公的または私的な配列データベースに、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを比較することによって、同定可能である。好ましくは、コンピュータ化比較法を用いて、既知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定する。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が知られる。Ｂｏｗｉｅら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。したがって、前述の例は、当業者が、本明細書記載の抗体に一致して、構造ドメインおよび機能ドメインを定義するのに使用可能な、配列モチーフおよび構造コンホメーションを認識可能であることを示す。
【０１２１】
［０１３４］好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するため、結合アフィニティーを改変し、（４）結合アフィニティーを改変し、そして（４）こうした類似体に他の物理化学特性または機能特性を与えるかあるいはこうした類似体のこうした特性を修正するものである。類似体には、天然存在ペプチド配列以外の配列の多様な突然変異タンパク質が含まれうる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を、天然存在配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外のポリペプチドの部分において）行うことも可能である。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特徴を実質的に変化させてはならない（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを破壊するか、または親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク（１９８４））； Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ． ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ． Ｔｏｏｚｅ監修， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載され、これらは各々、本明細書に援用される。
【０１２２】
［０１３５］用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残っているアミノ酸配列が、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然存在配列中の対応する位と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも長さ５、６、８、または１０アミノ酸、好ましくは少なくとも長さ１４アミノ酸、より好ましくは少なくとも長さ２０アミノ酸、通常、少なくとも長さ５０アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも長さ７０アミノ酸である。用語「類似体」は、本明細書において、推定されるアミノ酸配列の一部に実質的な同一性を有し、そして以下の特性の少なくとも１つを有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントで構成されるポリペプチドを指す：（１）適切な結合条件下での、ｕＰＡＲへの特異的な結合、（２）適切なｕＰＡ／ｕＰＡＲ結合を遮断する能力、または（３）ｕＰＡ活性を阻害する能力。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然存在配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも長さ２０アミノ酸、好ましくは少なくとも長さ５０アミノ酸以上であり、そしてしばしば、全長天然存在ポリペプチドと同じくらい長いことも可能である。
【０１２３】
［０１３６］ペプチド類似体は、一般的に、薬学産業において、テンプレート・ペプチドのものと類似の特性を持つ、非ペプチド薬剤として用いられる。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」（「ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」）と称される。本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ， Ｊ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． １５：２９（１９８６）； ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９（１９８７）。こうした化合物は、しばしば、コンピュータ化分子モデリングの補助で開発される。療法的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、同等の療法効果または予防効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：−−ＣＨ_２ＮＨ−−、−−ＣＨ_２Ｓ−−、−−ＣＨ_２−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ_２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−−、および−−ＣＨ_２ＳＯ−−からなる群より選択される連結により、場合によって置換された１以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を、同じ種類のＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定なペプチドを生成することも可能である。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む、制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドを、当該技術分野に知られる方法（本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：３８７（１９９２））によって生成することも可能であり；これは例えば、ペプチドを環状化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによる。
【０１２４】
［０１３７］本明細書において、用語「抗体」は、抗原の抗原性決定基の特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を持つ三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される、少なくとも１つの結合ドメインで構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。抗体は、典型的には四量体型を有し、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各々の対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０１２５】
［０１３８］本明細書において、標的化結合剤、標的化結合タンパク質、特異的結合タンパク質等の用語は、標的部位に優先的に結合する抗体またはその結合性断片を指す。１つの態様において、標的化結合剤は、１つの標的部位に対してのみ特異的である。他の態様において、標的化結合剤は、１より多い標的部位に特異的である。１つの態様において、標的化結合剤はモノクローナル抗体であってもよく、そして標的部位はエピトープであってもよい。
【０１２６】
［０１３９］抗体の「結合性断片」は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体の酵素的または化学的切断によって産生される。結合性断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｄａｂおよび一本鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体は、同一の各結合部位を有すると理解される。抗体は、過剰な抗体が、少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、そしてより一般的には約８５％（ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定した際）を超えて、対抗受容体に結合する受容体の量を減少させる場合、対抗受容体への受容体の接着を、実質的に阻害する。
【０１２７】
［０１４０］抗体は、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびに可溶性型または結合型で標識されていてもよい抗体、ならびに、単独の、または既知の技術によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせたその断片、変異体または誘導体であってもよい。抗体はいかなる種由来であってもよい。用語、抗体にはまた、本発明の抗体の結合性断片も含まれる；典型的な断片には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体性可変領域（ディアボディ）およびジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）が含まれる。
【０１２８】
［０１４１］用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合可能ないかなるタンパク質決定基も含まれる。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、そして常にではないが、特定の三次元構造特性とともに、特定の電荷特性を有することも可能である。抗体は、解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、そして最も好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１２９】
［０１４２］用語「剤」は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的物質から作製される抽出物を意味する。
［０１４３］ｕＰＡＲポリペプチドに関する「活性である」または「活性」は、天然ｕＰＡＲポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するｕＰＡＲポリペプチドの部分を指す。「生物学的」は、本明細書で用いた際、天然ｕＰＡＲポリペプチドの活性から生じる生物学的機能を指す。好ましいｕＰＡＲ生物学的活性には、例えば、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着および浸潤が含まれる。
【０１３０】
［０１４４］「哺乳動物」は、本明細書で用いた際、哺乳動物と見なされるいかなる動物も指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
［０１４５］酵素、パパインでの抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても知られる、２つの同一の抗原結合性断片、および抗原結合活性を持たないが、結晶化する能力を有する「Ｆｃ」断片を生じる。酵素、ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり、そして２つの抗原結合部位を含む、Ｆ（ａｂ’）_２断片を生じる。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【０１３１】
［０１４６］「Ｆｖ」は、本明細書で用いた際、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最少断片を指す。
［０１４７］「Ｆａｂ」は、本明細書で用いた際、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体断片を指す。
【０１３２】
［０１４８］「Ｄａｂ」は、本明細書で用いた際、ヒト抗体の最小機能結合単位である抗体断片を指す。
［０１４９］用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。
【０１３３】
［０１５０］「リポソーム」は、本明細書で用いた際、本発明のｕＰＡＲポリペプチド、またはこうしたｕＰＡＲポリペプチドに対する抗体を含んでもよい薬剤を哺乳動物に送達するのに有用でありうる小胞を指す。
【０１３４】
［０１５１］「標識」または「標識された」は、本明細書において、ポリペプチドに対する検出可能部分、例えば放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識基またはビオチニル基の付加を指す。放射性同位体または放射性核種には、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉが含まれてもよく、蛍光標識には、ローダミン、ランタニド、リンまたはＦＩＴＣが含まれてもよく、そして酵素標識には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼが含まれてもよい。
【０１３５】
［０１５２］用語「薬学的剤または薬剤」は、本明細書において、患者に適切に投与された際、所望の療法効果を誘導可能な化学的化合物または組成物を指す。本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ， Ｓ．監修， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， サンフランシスコ（１９８５））、（本明細書に援用される）に例示されるように、当該技術分野における慣用的用法にしたがって用いられる。
【０１３６】
［０１５３］本明細書において、「実質的に純粋な」は、対象種が、存在する主な種である（すなわちモル濃度に基づいて、組成物中の他の個々の種いずれよりもより豊富である）ことを意味し、そして好ましくは、実質的に純粋な分画は、対象種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル濃度に基づいて）を構成する組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０％より多くを構成し、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、および９９％より多くを構成するであろう。最も好ましくは、対象種は、本質的に均質に精製され（慣用的検出法によって、組成物中に混入種が検出不能である）、ここで組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。
【０１３７】
［０１５４］用語「患者」には、ヒトおよび獣医学的被験体が含まれる。
ヒト抗体および抗体のヒト化
［０１５５］ヒト抗体は、ネズミまたはラットの可変および／または定常領域を所持する抗体に付随する問題のいくつかを回避する。こうしたネズミまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の迅速なクリアランスを導く可能性もあるし、あるいは患者によって抗体に対する免疫応答が生成されるのを導く可能性もある。ネズミまたはラット由来抗体の利用を回避するため、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物または動物内に、機能するヒト抗体遺伝子座を導入することによって、完全ヒト抗体を生成してもよい。
【０１３８】
［０１５６］完全ヒト抗体を生成するための１つの方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の、１０００ｋｂまでであるが、１０００ｋｂ未満である大きさの生殖系列設定断片を含有するように操作されている、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の使用を通じる。Ｍｅｎｄｅｚら Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）、ならびにＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統は、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）より入手可能である。
【０１３９】
［０１５７］マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の産生は、米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１月１２日出願、第０７／６１０，５１５号、１９９０年１１月８日出願、第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月２４日出願、第０７／９２２，６４９号、１９９２年７月３０日出願、第０８／０３１，８０１号、１９９３年３月１５日出願、第０８／１１２，８４８号、１９９３年８月２７日出願、第０８／２３４，１４５号、１９９４年４月２８日出願、第０８／３７６，２７９号、１９９５年１月２０日出願、第０８／４３０，９３８号、１９９５年４月２７日出願、第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日出願、第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日出願、第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日出願、第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日出願、第０８／４６２，５１３号、１９９５年６月５日出願、第０８／７２４，７５２号、１９９６年１０月２日出願、第０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、米国公報第２００３／００９３８２０号、２００１年１１月３０日出願、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第５，９３９，５９８号、および日本国特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号、第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号、および第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号にさらに論じられ、そして描写される。欧州特許第ＥＰ ０ ４６３ １５１ Ｂ１号、１９９６年６月１２日付与公表（ｇｒａｎｔ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）、国際特許出願第ＷＯ ９４／０２６０２号、１９９４年２月３日公表、国際特許出願第ＷＯ ９６／３４０９６号、１９９６年１０月３１日公表、第ＷＯ ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日公表、第ＷＯ ００／７６３１０号、２０００年１２月２１日公表もまた、参照されたい。上記引用特許、出願、および参考文献各々の開示は、その全体が本明細書に援用される。
【０１４０】
［０１５８］別のアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．を含む他のグループは、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用した。ミニ遺伝子座アプローチでは、Ｉｇ遺伝子座由来の片（個々の遺伝子）の包含を通じて、外因性Ｉｇ遺伝子座を模倣する。したがって、１以上のＶ_Ｈ遺伝子、１以上のＤ_Ｈ遺伝子、１以上のＪ_Ｈ遺伝子、ｍｕ定常領域、および通常は第二の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）を、動物内に挿入するための構築物になるように形成する。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、ならびに各々、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号および第６，０２３，０１０号、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、および第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月２９日出願、第０７／５７５，９６２号、１９９０年８月３１日出願、第０７／８１０，２７９号、１９９１年１２月１７日出願、第０７／８５３，４０８号、１９９２年３月１８日出願、第０７／９０４，０６８号、１９９２年６月２３日出願、第０７／９９０，８６０号、１９９２年１２月１６日出願、第０８／０５３，１３１号、１９９３年４月２６日出願、第０８／０９６，７６２号、１９９３年７月２２日出願、第０８／１５５，３０１号、１９９３年１１月１８日出願、第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月３日出願、第０８／１６５，６９９号、１９９３年１２月１０日出願、第０８／２０９，７４１号、１９９４年３月９日出願に記載され、これらの開示は本明細書に援用される。その開示が全体として本明細書に援用される、欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号、国際特許出願第ＷＯ ９２／０３９１８号、第ＷＯ ９２／２２６４５号、第ＷＯ ９２／２２６４７号、第ＷＯ ９２／２２６７０号、第ＷＯ ９３／１２２２７号、第ＷＯ ９４／００５６９号、第ＷＯ ９４／２５５８５号、第ＷＯ ９６／１４４３６号、第ＷＯ ９７／１３８５２号、および第ＷＯ ９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号もまた、参照されたい。その開示が全体として本明細書に援用される、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｃｈｅｎら、１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、Ｃｈｏｉら、１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎら（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）もさらに参照されたい。
【０１４１】
［０１５９］キリンもまた、微小細胞（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）融合を通じて、染色体の大きな片、または全染色体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成を立証した。その開示が本明細書に援用される、欧州特許出願第７７３ ２８８号および第８４３ ９６１号を参照されたい。さらに、キリンのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスの交雑育種の結果である、ＫＭ^ＴＭマウスが生成された。これらのマウスは、キリン・マウスのヒトＩｇＨトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのカッパ鎖導入遺伝子を所持する（Ｉｓｈｉｄａら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， （２００２）４：９１−１０２）。
【０１４２】
［０１６０］ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によっても得られうる。適切な例には、限定されるわけではないが、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（以前のＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイ等が含まれる。
【０１４３】
抗体の調製
［０１６１］本明細書記載の抗体は、以下に記載するように、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通じて調製された。その結果、こうしたマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生可能であり、そしてネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生は欠損している。これを達成するために利用される技術は、本明細書の背景セクションに開示する特許、出願、および参考文献に開示される。しかし、特に、マウスおよび該マウス由来の抗体のトランスジェニック産生の好ましい態様が、米国特許出願第０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、ならびに国際特許出願第ＷＯ ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日公表、および第ＷＯ ００／７６３１０号、２０００年１２月２１日公表に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。その開示が本明細書に援用される、Ｍｅｎｄｅｚら Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）もまた参照されたい。
【０１４４】
［０１６２］こうした技術の使用を通じて、多様な抗原に対する完全ヒト・モノクローナル抗体を産生した。本質的に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を、目的の抗原（例えばｕＰＡＲ）で免疫し、リンパ系細胞（Ｂ細胞など）を過免疫（ｈｙｐｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスから回収し、そして回収したリンパ球を骨髄腫型細胞株と融合させて、不死ハイブリドーマ細胞株を調製する。これらのハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、そして選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。本明細書に提供するのは、ｕＰＡＲに特異的な抗体を産生する多数のハイブリドーマ細胞株の産生法である。さらに、本明細書に提供するのは、こうした抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、こうした細胞株によって産生される抗体の性質決定である。
【０１４５】
［０１６３］あるいは、骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを生成する代わりに、Ｂ細胞を直接アッセイしてもよい。例えば、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞を過免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離し、そして増殖させ、そして抗体分泌形質細胞に分化させてもよい。次いで、細胞上清由来の抗体を、ｕＰＡＲ免疫原に対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。また、上清を、ｕＰＡＲの断片に対する免疫反応性に関してスクリーニングして、ｕＰＡＲ上の機能的に関心が持たれるドメインに対する結合に関して、異なる抗体をさらにマッピングしてもよい。また、他の関連ヒト受容体に対して、そしてｕＰＡＲのラット、マウス、およびカニクイザルなどの非ヒト霊長類のオルソログに対して、抗体をスクリーニングしてもよく、後者は、種交差反応性を決定するためである。個々のウェルまたはプールしたウェルのいずれかからハイブリドーマを作製する融合を含む多様な方法によって、あるいはＥＢＶでの感染または既知の不死化遺伝子によるトランスフェクション、そしてその後の適切な培地中でのプレーティングによって、目的の抗体を含有するウェル由来のＢ細胞を、不死化してもよい。あるいは、次いで、ｕＰＡＲ特異的溶血プラークアッセイ（例えばＢａｂｃｏｏｋら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：７８４３−４８（１９９６）を参照されたい）を用いて、望ましい特異性を持つ抗体を分泌する単一の形質細胞を単離する。溶解の標的とされる細胞は、好ましくは、ｕＰＡＲ抗原でコーティングされたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）である。
【０１４６】
［０１６４］目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するＢ細胞培養の存在下で、プラークの形成は、目的の形質細胞を取り巻くヒツジ赤血球の、ｕＰＡＲが仲介する特異的溶解を示す。プラーク中心の単一の抗原特異的形質細胞を単離してもよく、そして抗体の特異性をコードする遺伝的情報を、単一の形質細胞から単離する。逆転写後のＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングしてもよい。次いで、こうしたクローニングされたＤＮＡを、適切な発現ベクター、好ましくは、ｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含有するｐｃＤＮＡベクターに、さらに挿入してもよい。次いで、生成したベクターを、宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションし、そして転写を誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾した、慣用的な栄養培地中で培養してもよい。
【０１４７】
［０１６５］一般的に、融合ハイブリドーマによって産生される抗体は、完全ヒト・カッパまたはラムダ軽鎖を含むヒトＩｇＧ２重鎖であった。本明細書に記載する抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖ならびにＩｇＧ２重鎖を所持する。抗体はまた、ＩｇＧ１を含む他のヒト・アイソタイプのものであってもよい。抗体は、高いアフィニティーを所持し、固相および溶液相技術によって測定した際、典型的には約１０^−６〜約１０^−１２Ｍまたはそれ未満のＫｄを所持する。ｕＰＡＲの活性を阻害するには、少なくとも１０^−１１ＭのＫＤを所持する抗体が好ましい。
【０１４８】
［０１６６］認識されるであろうように、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で、抗体を発現させてもよい。特定の抗体をコードする配列を用いて、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換してもよい。形質転換は、例えばウイルスにおける（またはウイルスベクター内への）ポリヌクレオチドのパッケージング、およびウイルス（またはベクター）での宿主細胞の形質導入を含む、宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入のために知られる任意の方法によっても、または米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（これらの特許は本明細書に援用される）に例示されるように、当該技術分野に知られるトランスフェクション法によってもよい。用いる形質転換法は、形質転換しようとする宿主に応じる。哺乳動物細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数または複数）の被包、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１４９】
［０１６７］発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野に周知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高発現レベルを有し、そして恒常的なｕＰＡＲ結合特性を持つ抗体を産生するかを決定することによって、特に好ましい細胞株を選択する。
【０１５０】
［０１６８］ｍＡｂがｕＰＡＲ活性を有意に中和する能力（以下の実施例において立証されるようなもの）に基づいて、これらの抗体は、ｕＰＡＲ発現から生じる症状および状態を治療する際に療法効果を有するであろう。特定の態様において、本明細書の抗体および方法は、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着、浸潤および細胞内シグナル伝達から生じる症状の治療に関する。
【０１５１】
［０１６９］本発明の別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニスト、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む薬学的組成物を提供する。１つの態様において、アンタゴニストは抗体を含む。本発明の別の側面にしたがって、ｕＰＡＲの生物学的活性のアンタゴニスト、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。１つの態様において、アンタゴニストは抗体を含む。
【０１５２】
［０１７０］抗ｕＰＡＲ抗体は、患者試料におけるｕＰＡＲの検出に有用であり、そしてしたがって、本明細書に記載するような疾患状態の診断として有用である。さらに、ｕＰＡ活性を有意に阻害する能力（以下の実施例に立証するようなもの）に基づいて、抗ｕＰＡＲ抗体は、ｕＰＡＲ発現から生じる症状および状態を治療する際に療法効果を有する。特定の態様において、本明細書の抗体および方法は、ｕＰＡＲが誘導する細胞接着、浸潤および細胞内シグナル伝達から生じる症状の治療に関する。さらなる態様は、本明細書記載の抗体および方法を用いて、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、および膵臓癌を含む、細胞接着および浸潤関連疾患を治療することを伴う。抗体はまた、関節炎、アテローム性動脈硬化症および血管新生を伴う疾患における細胞接着および／または浸潤を治療する際にも有用でありうる。
【０１５３】
療法的投与および配合
［０１７１］本発明の態様には、疾患に対する治療として有用な抗ｕＰＡＲ抗体の無菌薬学的配合物が含まれる。こうした配合物は、ｕＰＡのその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害し、それによって、例えば、血清または組織ｕＰＡＲが異常に上昇している病的状態を有効に治療するであろう。抗ｕＰＡＲ抗体は、好ましくは、ｕＰＡを強力に阻害し、そして好ましくは、ヒトにおける低頻度の投薬を可能にする、適切な作用期間を有する。作用期間延長は、皮下または筋内注射などの別の非経口投与経路による、より頻繁でなく、そしてより好適な投薬スケジュールを可能にするであろう。
【０１５４】
［０１７２］例えば、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に、無菌ろ過膜を通じたろ過によって、無菌配合物を生成してもよい。抗体は、通常、凍結乾燥型で、または溶液中で、保存されるであろう。療法抗体組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓などの、配合物の回収を可能にするアダプターを有するバイアルに入れられる。
【０１５５】
［０１７３］抗体投与経路は、既知の方法にしたがって、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋内、眼内、動脈内、クモ膜下腔内、吸入または病巣内経路による注射または注入であるか、腫瘍部位への直接注射であるか、あるいは以下に示すような持続放出系による。抗体は、好ましくは、注入によって、またはボーラス注射によって、連続投与される。
【０１５６】
［０１７４］療法的に使用しようとする抗体の有効量は、例えば、療法目的、投与経路、および患者の状態に応じるであろう。したがって、最適療法効果を得るために、治療専門家が、必要に応じて、投薬量を力価決定し、そして投与経路を修飾することが好ましい。典型的には、臨床医は、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、抗体を投与するであろう。この療法の進行は、慣用的アッセイによって、または本明細書記載のアッセイによって、容易に監視される。
【０１５７】
［０１７５］本明細書に記載するような抗体は、薬学的に許容されうるキャリアーと混合して調製可能である。この療法組成物を、静脈内投与してもよいし、あるいは好ましくは液体または粉末エアロゾル（凍結乾燥）として、鼻または肺を通じて投与してもよい。組成物はまた、所望に応じて、非経口投与してもまたは皮下投与してもよい。全身投与する場合、療法組成物は、無菌、発熱物質不含で、そしてｐＨ、等張性、および安定性を十分顧慮して、非経口的に許容されうる溶液中になければならない。これらの条件は、当業者に知られる。簡潔には、所望の度合いの純度を有する化合物を、薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、保存または投与のために、本明細書記載の化合物の投薬配合物を調製する。こうした物質は、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに対して毒性でなく、そしてこうした物質には、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの酸化防止剤；ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコールなどのナトリウムおよび／または非イオン性界面活性剤などの対イオンが含まれる。
【０１５８】
［０１７６］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｅｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載されるように、慣用的薬学的実施にしたがって、注射用の無菌組成物を配合してもよい。例えば、水、あるいはゴマ油、ピーナツ油または綿実油のような天然存在植物油、あるいはオレイン酸エチル等のような合成脂肪性ビヒクルなどの薬学的に許容されうるキャリアー中での活性化合物の溶解または懸濁が望ましい可能性もある。許容される薬学的実施にしたがって、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤等を取り込んでもよい。
【０１５９】
［０１７７］持続放出調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、こうしたマトリックスは、成形された物品、フィルムまたはマイクロカプセルの形である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， （１９８１）１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ．， （１９８２）１２：９８−１０５に記載されるようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， （１９８３）２２：５４７−５５６）、分解不能エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）、分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ Ｄｅｐｏｔ^ＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー、および酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体）、およびポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が含まれる。
【０１６０】
［０１７８］エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間に渡って分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。被包されたタンパク質が、体内に長期間残ると、３７℃で湿気に曝露された結果として、変性するかまたは凝集し、生物学的活性の喪失およびもしかすると免疫原性の変化を生じる可能性もある。関与する機構に応じて、タンパク質安定化のための合理的戦略を考案してもよい。例えば、凝集機構が、ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を調節し、適切な添加剤を用い、そして特定のポリマーマトリックス組成を発展させることによって、安定化を達成してもよい。
【０１６１】
［０１７９］持続放出組成物にはまた、結晶を懸濁中に維持することが可能な適切な配合物中に懸濁された抗体の結晶の調製物も含まれる。これらの調製物は、皮下または腹腔内注射されると、持続放出効果を生じうる。他の組成物にはまた、リポソームに捕捉された抗体も含まれる。こうした抗体を含有するリポソームは、それ自体知られる方法によって調製される：米国特許第ＤＥ ３，２１８，１２１号； Ｅｐｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， （１９８５）８２：３６８８−３６９２； Ｈｗａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， （１９８０）７７：４０３０−４０３４； ＥＰ ５２，３２２； ＥＰ ３６，６７６； ＥＰ ８８，０４６； ＥＰ １４３，９４９； １４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ １０２，３２４。
【０１６２】
［０１８０］所定の患者に対する抗体配合物の投薬量は、疾患の重症度および種類、体重、性別、食餌、投与時間および経路、他の薬剤および他の関連する臨床要因を含む、薬剤作用を修飾することが知られる多様な要因を考慮して、主治医によって決定されるであろう。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法のいずれかによって、療法的有効投薬量を決定してもよい。
【０１６３】
［０１８１］療法的に使用しようとする、本明細書記載の抗体の有効量は、例えば、療法目的、投与経路、および患者の状態に応じるであろう。したがって、治療専門家が、投薬量を力価決定し、そして最適療法効果を得るために、必要に応じて、投与経路を修飾することが好ましい。典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから最大１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇまでの範囲、またはそれより多くてもよい。典型的には、臨床医は、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、療法抗体を投与するであろう。この療法の進行は、慣用的アッセイによって、または本明細書に記載するように、容易に監視される。
【０１６４】
［０１８２］本明細書の組成物および方法にしたがった、療法実体の投与は、改善された輸送、送達、耐性等を提供するために、配合物内に取り込まれる、適切なキャリアー、賦形剤、および他の剤とともに投与されるであろうことが認識されるであろう。これらの配合物には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルジョン、エマルジョン・カルボワックス（多様な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックス含有半固体混合物が含まれる。前述の混合物のいずれも、配合物中の活性成分が配合によって不活化されず、そして配合物が投与経路に生理学的に適合し、そして耐性であるならば、本発明にしたがった治療および療法において適切でありうる。薬学的化学者に周知の配合物、賦形剤、およびキャリアーに関連するさらなる情報に関しては、Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ． “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ” Ｒｅｇｕｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（２）：２１０−８（２０００）， Ｗａｎｇ Ｗ． “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．” Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ２０３（１−２）：１−６０（２０００）， Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ “Ｌｉｐｉｄｓ， ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ， ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．” Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ．８９（８）：９６７−７８（２０００）， Ｐｏｗｅｌｌら “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ” ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ５２：２３８−３１１（１９９８）、およびこれら文献中の引用文献もまた、参照されたい。
【０１６５】
他の療法剤の設計および生成
［０１８３］本発明にしたがって、そしてｕＰＡＲに関する、本明細書で産生し、そして性質決定する抗体の活性に基づいて、抗体部分より勝る他の療法様式の設計を容易にする。こうした様式には、限定されるわけではないが、進化した抗体療法剤、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、および放射標識療法、単一ドメイン抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖまたはＤａｂ、ペプチド療法剤の生成、新規足場中のｕＰＡＲ結合ドメイン、遺伝子治療、特にイントラボディ、アンチセンス療法、および小分子が含まれる。
【０１６６】
［０１８４］進化した抗体療法剤の生成と関連して、補体結合が望ましい特質である場合、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、または放射標識の使用を通じて、細胞殺傷のための補体に対する依存性を回避することも可能でありうる。
【０１６７】
［０１８５］（ｉ）一方はｕＰＡＲに対する特異性を持ち、そして他方は第二の分子に対する特異性を持ち、ともにコンジュゲート化されている、２つの抗体、（ｉｉ）ｕＰＡＲに対して特異的な１つの鎖、および第二の分子に対して特異的な第二の鎖を有する、単一抗体、または（ｉｉｉ）ｕＰＡＲおよび他の分子に対する特異性を有する一本鎖抗体を含む、二重特異性抗体を生成してもよい。こうした二重特異性抗体は、周知である技術を用いて生成可能であり；例えば（ｉ）および（ｉｉ）に関連して、例えば、Ｆａｎｇｅｒら Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：７２−８１（１９９４）、ならびにＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ、上記を、そして（ｉｉｉ）に関連して、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（補遺）７：５１−５２（１９９２）を参照されたい。どちらの場合も、限定されるわけではないが、ＣＤ１６またはＣＤ６４（例えばＤｅｏら Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７）を参照されたい）、あるいはＣＤ８９（例えばＶａｌｅｒｉｕｓら Ｂｌｏｏｄ ９０：４４８５−４４９２（１９９７））を含む、重鎖活性化受容体に対して、第二の特異性を作製してもよい。
【０１６８】
［０１８６］当業者に周知の技術を利用して、免疫毒素として作用するように、抗体を修飾することもまた可能である。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４：２５２（１９９３）を参照されたい。また、米国特許第５，１９４，５９４号も参照されたい。放射標識抗体の調製と関連して、当該技術分野に周知の技術を利用して、こうした修飾抗体を容易に調製可能である。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ中 ６５５−６８６（第２版， ＣｈａｆｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ監修， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照されたい。また、米国特許第４，６８１，５８１号、第４，７３５，２１０号、第５，１０１，８２７号、第５，１０２，９９０号（ＲＥ ３５，５００）、第５，６４８，４７１号、および第５，６９７，９０２号もまた参照されたい。
【０１６９】
併用
［０１８７］本明細書において定義する抗腫瘍治療を、単一療法として適用してもよいし、または抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、慣用的な手術または放射線療法または化学療法を伴ってもよい。こうした化学療法には、１以上の以下のカテゴリーの抗腫瘍剤が含まれてもよい：
（ｉ）内科的腫瘍学で用いられるような、他の抗増殖／抗新生物薬剤およびその併用、例えばアルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）およびニトロソ尿素）；代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、ならびに５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジンなどの抗葉酸剤、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）およびエキセメスタン）および５αレダクターゼの阻害剤、例えばフィナステリド；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤（例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際特許出願ＷＯ ０１／９４３４１）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５； Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２００４， ４７， ６６５８−６６６１）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、ならびにマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の他の阻害剤、またはカテプシンの阻害剤、セリンプロテアーゼ、例えばマトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼの阻害剤、ヘパラナーゼの阻害剤）；
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害剤：例えばこうした阻害剤には、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチン^ＴＭ］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［エルビタックス、Ｃ２２５］およびＳｔｅｒｎら Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ２００５， Ｖｏｌ．５４， ｐｐ１１−２９に開示される任意の増殖因子または増殖因子受容体）が含まれ；こうした阻害剤にはまた、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば上皮増殖因子ファミリーの阻害剤（例えばＥＧＦＲファミリー・チロシンキナーゼ阻害剤、例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ １０３３）、ラパチニブなどのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、イマチニブなどの血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシル・トランスフェラーゼ阻害剤などのＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、例えばソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６））、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを通じた細胞シグナル伝達の阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様増殖因子）キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８およびＡＸ３９４５９）、ならびにＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が含まれる；
（ｖ）抗血管新生剤、例えば血管内皮増殖因子の効果を阻害するもの［例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ（アバスチン^ＴＭ）、ならびに４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４； ＷＯ ０１／３２６５１の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１； ＷＯ ００／４７２１２内の実施例２４０）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７； ＷＯ ９８／３５９８５）およびＳＵ１１２４８（スニチニブ； ＷＯ ０１／６０８１４）などのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、国際特許出願ＷＯ ９７／２２５９６、ＷＯ ９７／３００３５、ＷＯ ９７／３２８５６およびＷＯ ９８／１３３５４に開示するものなどの化合物、ならびに他の機構によって作用する化合物（例えば、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤であるリノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）およびアンジオスタチン］；
（ｖｉ）血管損傷剤、例えばコンブレタスタチンＡ４、ならびに国際特許出願ＷＯ ９９／０２１６６、ＷＯ ００／４０５２９、ＷＯ ００／４１６６９、ＷＯ ０１／９２２２４、ＷＯ ０２／０４４３４およびＷＯ ０２／０８２１３に開示される化合物；
（ｖｉｉ）アンチセンス療法、例えば抗ｒａｓアンチセンスであるＩＳＩＳ ２５０３などの上に列挙する標的に対して向けられるもの；
（ｖｉｉｉ）例えば、異常なｐ５３、あるいは異常なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常な遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるものなどのＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子治療などの化学療法または放射線療法に対する患者耐性を増加させるアプローチを含む、遺伝子治療アプローチ；ならびに
（ｉｘ）例えば、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏアプローチ、例えばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインでトランスフェクションした樹状細胞などのトランスフェクションした免疫細胞を用いたアプローチ、サイトカインでトランスフェクションした腫瘍細胞株を用いたアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチを含む、免疫療法アプローチ。
【０１７０】
［０１８８］１つの態様において、本明細書に定義する抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、内科的腫瘍学で用いられるような、他の抗増殖／抗新生物薬剤およびその併用、例えばアルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド、およびニトロソ尿素）；代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、ならびに５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジンなどの抗葉酸剤、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）での治療を伴ってもよい。
【０１７１】
［０１８９］１つの態様において、本明細書に定義する抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、ゲムシタビンでの治療を伴ってもよい。
［０１９０］治療の個々の構成要素を同時に、連続してまたは別個に投与することによって、こうした共同の治療を達成してもよい。こうした併用産物は、本明細書において上述する投薬量範囲内の本発明の化合物またはその薬学的に許容されうる塩、および認可された投薬量範囲内の他の薬学的活性剤を使用する。
【実施例】
【０１７２】
［０１９１］以下の実施例は、行う実験および達成される結果を含めて、例示目的のみのために提供され、そして本明細書の解説を制限するとは見なされないものとする。
実施例１
免疫および力価決定
免疫
［０１９２］それぞれ、可溶性ｕＰＡＲ（組換えヒトｕＰＡＲ／Ｈｉｓ６、カタログ番号８０７−ＵＫ−１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）および細胞結合ｕＰＡＲ（細胞表面にヒトｕＰＡＲを発現しているＢ３００．１９トランスフェクタント）を用いて、免疫を行った。Ｂ３００．１９トランスフェクタントを生成するため、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター内にヒト全長ｕＰＡＲ ｃＤＮＡを挿入した。エレクトロポレーションを介して、Ｂ３００．１９細胞を一過性にトランスフェクションした。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって、細胞表面上のヒトｕＰＡＲの発現が免疫に適したレベルであることを確認した。その開示が本明細書に援用される米国特許出願第０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、および国際特許出願第ＷＯ ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日公表、および第ＷＯ ００／７６３１０号、２０００年１２月２１日公表に開示される方法にしたがって、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ^ＴＭにおける免疫のため、作戦１では、１０μｇ／マウスの可溶性タンパク質を、そして作戦２では、１ｘ１０^７細胞／マウスのＢ３００．１９トランスフェクション細胞を用いた。免疫プログラムを表２に要約する。
【０１７３】
力価による採取用動物の選択
［０１９３］ヒトｕＰＡＲに対する抗体の力価をＦＡＣＳによって試験した。免疫プログラム終了時、実施例２に記載するように、エレクトロポレーションによって、マウス骨髄腫細胞、ならびに免疫したマウスの脾臓およびリンパ節から単離したリンパ球を用いて、融合を実行した。
【０１７４】
表２：免疫プログラムの要約
【０１７５】
【表２】

【０１７６】
「Ｆｐ」は、「足蹠」を指す。
実施例２
リンパ球回収、Ｂ細胞単離、融合およびハイブリドーマの生成
［０１９４］免疫したマウスを頸椎脱臼によって屠殺し、そして流入領域リンパ節を採取し、そして各コホートからプールした。ＤＭＥＭ中ですりつぶすことによって、リンパ系細胞を解離させて、組織から細胞を遊離させ、そして細胞をＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞を計数し、そして１億個のリンパ球あたり０．９ｍｌのＤＭＥＭを細胞ペレットに添加して、細胞を穏やかにしかし完全に再懸濁した。１億個の細胞あたり、１００μｌのＣＤ９０＋磁気ビーズを用いて、磁気ビーズと細胞を４℃で１５分間インキュベーションすることによって、細胞を標識した。最大１０^８陽性細胞（または最大２ｘ１０^９総細胞）を含有する磁気標識細胞懸濁物をＬＳ＋カラム上に装填し、そしてカラムをＤＭＥＭで洗浄した。総流出物をＣＤ９０陰性分画（これらの細胞の大部分は、Ｂ細胞であると期待された）として収集した。
【０１７７】
［０１９５］上記由来の洗浄した濃縮Ｂ細胞およびＡＴＣＣから購入した、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、カタログ番号ＣＲＬ １５８０（Ｋｅａｒｎｅｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３， １９７９， １５４８−１５５０）を１：１の比で混合することによって、融合を行った。８００ｘｇの遠心分離によって、細胞混合物を穏やかにペレットにした。上清を完全に除去した後、２〜４ｍｌのプロナーゼ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３７０２；ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ）で２分を超えずに、細胞を処理した。次いで、３〜５ｍｌのＦＢＳを添加して、酵素活性を停止し、そしてエレクトロ細胞融合溶液（ＥＣＦＳ、０．３Ｍスクロース、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ７９０３、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ２５４５、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ４７０５）を用いて、懸濁物を４０ｍｌ総体積に調整した。遠心分離後に上清を除去し、そして４０ｍｌ ＥＣＦＳ中に細胞を再懸濁した。この洗浄工程を反復し、そして再び、細胞をＥＣＦＳ中に再懸濁して、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度にした。
【０１７８】
［０１９６］融合生成装置（モデルＥＣＭ２００１、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、エレクトロ細胞融合を行った。用いた融合チャンバーサイズは２．０ｍｌであり、以下の装置設定を用いた：
［０１９７］調節条件：電圧：５０Ｖ、時間：５０秒。
［０１９８］電圧：３０００Ｖ、時間：３０μ秒で膜破壊
［０１９９］融合後保持時間：３秒
［０２００］ＥＣＦ後、細胞懸濁物を、無菌条件下で、融合チャンバーから注意深く除去し、そしてＬ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシ・インスリン）（すべてＳｉｇｍａ）およびＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を補充した、同体積のハイブリドーマ培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する無菌試験管内に移した。細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベーションし、そして次いで、４００ｘｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。小体積のハイブリドーマ選択培地（０．５ｘＨＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ培地）中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして９６ウェルプレートあたり、総数５ｘ１０^６ Ｂ細胞およびウェルあたり２００μｌの最終プレーティングに基づいて、さらなるハイブリドーマ選択培地を用いて、体積を適切に調整した。細胞を穏やかに混合し、そして９６ウェルプレート内にピペッティングし、そして増殖を可能にした。第７日または第１０日、培地の半分を除去し、そして細胞にハイブリドーマ選択培地を再供給した。
【０１７９】
［０２０１］選択培地中でルーチンとして、ハイブリドーマを増殖させた。潜在的に抗ヒトｕＰＡＲ抗体を産生するハイブリドーマから収集した消耗上清を、続くスクリーニングアッセイに供した。
【０１８０】
実施例３
細胞に結合したｈｕ−ｕＰＡＲへの結合
［０２０２］蛍光測定微量体積アッセイ技術（ＦＭＡＴ）を用いて、ヒトｕＰＡＲを発現するようにトランスフェクションしたネズミ・プレＢ細胞株Ｂ３００．１９（ＡＴＣＣ）、および対照としてのＢ３００．１９親細胞を用いて、細胞に結合したｕＰＡＲへの抗体の結合を試験した。アッセイに、５，０００細胞／ウェルを使用した。マウス抗ヒトｕＰＡＲ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ８０７）を陽性対照試薬として用い、一方、Ｇ２ ＫＬＨ上清（１：１０）を陰性対照試薬として用いた。４００ｎｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｃｙ５コンジュゲート（マウス抗体対照には、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｃｙ５コンジュゲート）を用いて、結合した抗体を検出した。それぞれ、５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトκ−ＰＥまたはヤギ抗ヒトγ−Ｃｙ５コンジュゲート（どちらもＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した）の両方を用いて、結合した抗体を検出することによって、ＦＡＣＳ分析によって陽性株を確認した。染色された各色素に関して、陽性および陰性細胞の間の幾何平均値の比を表にした。１．９５より高い比をヒットと見なした。各融合由来のヒトγおよびκ特異的ヒットの数を表３に列挙する。
【０１８１】
表３．ＦＡＣＳ分析によって確認されるような、細胞に結合したｈｕ−ｕＰＡＲに結合した抗体の数
【０１８２】
【表３】

【０１８３】
実施例４
競合的結合
［０２０３］このアッセイにおいて、ＦＡＣＳ分析によって、抗体が、細胞に結合したｕＰＡＲへのヒトｕＰＡの結合を阻害する能力を試験した。簡潔には、ネズミ線維芽細胞Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクションして、ヒトｕＰＡＲを発現させた。９９％生存率のトランスフェクタントを、１：２希釈の上清と、４℃で一晩インキュベーションした。洗浄後、細胞を５００ｎｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ標識ｔｃ−ｕＰＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と１時間インキュベーションした。ビオチンとコンジュゲート化されたウサギ抗ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入）を用いて、結合したＦＩＴＣ−ｕＰＡを検出した。シグナルを増幅するため、三次検出試薬、ストレプトアビジン（ｓｔｒａｐａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙ５コンジュゲート（ＳＡ−Ｃｙ５、２．５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入）を使用した。モノクローナル抗ヒトｕＰＡＲ抗体ＭＡＢ８０７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、受容体−リガンド結合を中和）を陽性対照試薬として用いた。
【０１８４】
［０２０４］ハイブリドーマ株由来の総数４３３の上清（結合剤）を試験し、そして５０％の阻害を陽性と見なした。各融合由来の陽性株（中和剤）を表４に要約する。４回の融合の中で、ｕＰＡのｕＰＡＲへの結合を阻害可能な総数１０２の株がある。
【０１８５】
表４．ｕＰＡ／ｕＰＡＲ結合を阻害したＡｂの数
【０１８６】
【表４】

【０１８７】
実施例５
非ヒト霊長類に対する交差反応性
［０２０５］カニクイザル由来のｕＰＡＲをクローニングし、そしてＣＨＯＫ１細胞表面上で発現させた。このアッセイにおいて、ＦＡＣＳ分析によって、細胞に結合したカニクイザルｕＰＡＲへの抗体の結合（親細胞を陰性対照とする）を試験した。ネズミ抗ヒトｕＰＡＲ抗体ＭＡＢ８０７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照試薬として使用した。簡潔には、９９％生存率のＣＨＯＫ１／ｃｙｎｏ−ｕＰＡＲトランスフェクタントを、１：２希釈の上清と、４℃でインキュベーションした。どちらもＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した、ヤギ抗ヒトγ鎖Ｃｙ５コンジュゲート（５μｇ／ｍｌ）および抗ヒトκ鎖ＰＥコンジュゲート（２．５μｇ／ｍｌ）両方を用いて、結合したヒト抗体を検出した。染色された各色素に関して、陽性および陰性細胞の間の幾何平均値の比を見いだした。１．９５より高い比をヒットと見なした。ｕＰＡ／ｕＰＡＲ結合に阻害活性を示した株（中和剤）のみをこのアッセイに供した。表５に要約するように、試験した１０２株のうち９０が、ＣＨＯＫ１細胞表面上に発現されるｃｙｎｏ−ｕＰＡＲに結合する能力を示した。以下の実施例１２に示すように、３０の候補をクローニングし、そして精製した後、カニクイザルｕＰＡＲに対する交差反応性が確認された。
【０１８８】
表５．カニクイザルｕＰＡＲを発現している細胞に結合した抗体の数
【０１８９】
【表５】

【０１９０】
実施例６
動力学的アッセイ
高抗原（ＨＡ）定量化（ＥＬＩＳＡ）
［０２０６］以下に記載する限定抗原定量化アッセイと比較して、より多量のｕＰＡＲで、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした（４．２μｇ／ｍｌ）。抗体（Ａｂ）を含有する試料を、ｕＰＡＲでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で力価決定し、そして一晩インキュベーションして、適切な平衡までＡｂ結合を可能にした。試料中のＡｂの力価決定は、１：２００〜１：１９，５３１の希釈範囲を含んだ。既知の濃度のｕＰＡＲ特異的抗体の標準曲線を用いて、アッセイの直線範囲を定義した。直線範囲内のデータを用いて、各力価決定試料中のｕＰＡＲ特異的Ａｂの相対的濃度を得た。高ｕＰＡＲ濃度および一晩インキュベーションは、Ａｂアフィニティーの効果を限定し、各試料中に存在するｕＰＡＲ特異的Ａｂの相対量の定量化を可能にした。
【０１９１】
限定抗原（ＬＡ）定量化（ＥＬＩＳＡ）
［０２０７］以下に記載する高抗原定量化アッセイと比較して、より少量のｕＰＡＲで、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした（３２０、１６０、８０、４０および２０ｎｇ／ｍｌ）。抗体（Ａｂ）（１：２５希釈）の１つの濃度を含有する試料を一晩インキュベーションして、Ａｂ結合が平衡に近づくのを可能にした。低抗原濃度は、抗体濃度の効果を限定し、相対的アフィニティーに基づいた、抗体のランキングを可能にした。
【０１９２】
［０２０８］ＨＡ／ＬＡ動力学アッセイによって、ｕＰＡ／ｕＰＡＲ結合を阻害する能力を有する１０２株（中和剤）を試験した。ｕＰＡ／ｕＰＡＲ結合阻害およびＦＡＣＳに基づく結合の有効性と組み合わせて、結果を分析した。表６は、望ましい中和活性および好ましい結合動力学を有する３０のハイブリドーマ株に関する結果を要約する。
【０１９３】
実施例７
特異性研究
［０２０９］ｕＰＡＲに最も近い相同体は、ヒトＬｙ６ｅである（約３６％類似性）。この研究では、Ｌｙ６ｅに交差反応したすべての抗体を同定し、そして排除した。
【０１９４】
［０２１０］標準的プロトコルにしたがって、ヒトＬｙ６ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＢＣ１１９７０９）をクローニングし、そしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させた。適切な検出抗体を欠いているため、Ｌｙ６ｅに融合しているｍｙｃタグを探査し（ｐｒｏｂｉｎｇ）、それとともに、同じ抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロット上で、発現されたタンパク質の分子サイズが正しいことを立証することによって、Ｌｙ６ｅの発現が信頼できることを確認した。
【０１９５】
［０２１１］１：２ハイブリドーマ上清を用いたＦＡＣＳ分析によって、Ｌｙ６ｅを発現するようにトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔに対する抗体の反応性を決定し、そしてＣｙ５とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトγ鎖（２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で探査した。トランスフェクタントへの抗ｍｙｃ抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の結合が、陽性対照として働き、そして（Ｌｙ６ｅ陰性）親細胞へのこの抗体の結合が、陰性対照として働いた。１．９５の陽性対陰性の幾何平均比を閾値として用いた。１．９５を超える読み取り値を結合剤と見なした。その結果、１０２の中和剤の中で、４．６７および４．５０株のみが、Ｌｙ６ｅ発現細胞に結合することが見いだされた。他のものは、Ｌｙ６ｅに交差反応性を持たなかった。表６は、クローニングのために選択された３０株の特性を要約する。
【０１９６】
表６．細胞クローニング用の３０株の選択に関する要約
【０１９７】
【表６】

【０１９８】
［０２１２］一次および二次スクリーニングアッセイを通じて、表６に要約するような、細胞に結合したヒトｕＰＡＲ、ｕＰＡ／ｕＰＡＲ結合の阻害、および動力学ランキングに基づいて、総数３０のハイブリドーマ株を同定した。この中で、２つの株は、細胞表面上のｃｙｎｏ−ｕＰＡＲに結合しなかった。抗体はいずれも、ネズミｕＰＡＲと反応せず、そして選択した株のいずれも、ｕＰＡＲに最も近い相同体であるＬｙ６ｅと反応しなかった。
【０１９９】
［０２１３］これらの３０株をクローニングし、そして以下に記載するように、さらに性質決定した。
実施例８
プラスミノーゲン活性化アッセイ
［０２１４］ｕＰＡＲを発現することが知られるヒト組織細胞（ｈｉｓｔｏｃｙｔｉｃ）リンパ腫細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣ）をこのアッセイに使用した。細胞表面ｕＰＡＲに結合した際、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｓｃｕＰＡ）は活性化されてｕＰＡになることが可能であり、そしてプラスミノーゲンをプラスミンに切断することが可能である。後者は、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ ７−アミド−４−メチルクマリン（ＶＬＫ−ＡＭＣ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｖ３１３８）を切断して、そして蛍光ＡＭＣ色素を放出する。したがって、アッセイ系中の蛍光単位の強度は、細胞表面ｕＰＡＲに結合したｕＰＡの量の指標となる。ｕＰＡＲに対する中和ｍＡｂは、ｓｃｕＰＡの結合を阻害し、そしてしたがって、蛍光を抑制すると期待された。
【０２００】
［０２１５］Ｕ９３７細胞を維持し、そして５％ＣＯ_２、３７℃で、１．５ｇ／ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／ｌグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０％ＦＢＳを含有するように調整された、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で増殖させた。アッセイを実行するため、Ｕ９３７細胞を６０，０００細胞／ウェルの密度でＶ底プレート内に植え付け、そして１，５００ｒｐｍで３分間細胞を回転させて落とすことによって、冷反応緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４、２％ＢＳＡを含む）で洗浄した。再懸濁後、示す最終濃度で、氷上で１時間、細胞をｍＡｂで処理した。処理した細胞懸濁物を、３ｎＭの最終濃度のｓｃｕＰＡでスパイク処理した。細胞懸濁物を、氷上で１時間インキュベーションした後、冷反応緩衝液で洗浄した。５０μｌの１μＭ Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよび４００μＭ ＶＬＫ−ＡＭＣ基質を細胞懸濁物に添加して、その体積を２００μｌに調整した。Ｔｅｃａｎ読み取り装置での蛍光測定のため、混合物をＦＭＡＴプレートに移した。
【０２０１】
［０２１６］３０のｍＡｂをプラスミノーゲン活性化アッセイにおいて、まず試験した。次いで、他のものより高いプラスミノーゲン活性化阻害活性を持つ１５の候補を、さらなる試験のために選択した。図１に示すように、多様な濃度で阻害活性を試験することによって、１５の選択したｍＡｂに関する用量−反応関係曲線を生成した。各ｍＡｂ濃度に関して、３つ組で試験を行った。各ｍＡｂに関する定量的指標、ＩＣ５０を、表１１に含める。
【０２０２】
［０２１７］抗体４．１９．１および１．４１．１に関する曲線の間に、明らかなギャップがあることが注目された。ギャップの左側の曲線（８つのｍＡｂ、すなわち、４．１８．１、４．５０．２、４．１３．２、４．１２．２、２．６．１、１．９９．１、２．１９．２、および４．１９．１を含む）は、より高い有効性および強度を有した。これらは、１μｇ／ｍｌ程度の低い濃度で、９０％を超えて、プラスミノーゲン活性化を阻害した。したがって、これらの８つのｍＡｂを、さらなる性質決定のために選択した。
【０２０３】
実施例９
接着アッセイ
［０２１８］９６ウェル・マイクロタイタープレートを、リン酸ナトリウム（ｐＨ９）中、ビトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）で、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを３％ＢＳＡで、室温で少なくとも１時間ブロッキングした。２．５ｍｌの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌおよび１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて、Ｕ９３７細胞を氷上で３分間、酸ストリッピングした。次いで、０．５ｍｌの５００ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）によって、酸性細胞懸濁物を中和した。
【０２０４】
［０２１９］次いで、あらかじめ温めた血清不含培地で２回、そして１％ＢＳＡを含有しそしてＭｎ^２＋を含まないＨＢＢＳで再び２回、細胞を洗浄した後、最終的に、１８０，０００細胞／１００μｌでＨＢＢＳ中に再懸濁した。次いで、酸ストリッピングした細胞を、１０μｇ／ｍｌのあらかじめ選択したｍＡｂと、４℃で１時間インキュベーションした。続いて、細胞を２５ｎＭ ｓｃｕＰＡでスパイク処理した。
【０２０５】
［０２２０］５０μｌの細胞およびそのあらかじめ選択したｍＡｂを、マイクロタイタープレート中のビトロネクチンをコーティングした各ウェルに添加した。３７℃で４０分間、細胞をプレートに接着させた。温ＨＢＳＳを用いて、結合していない細胞を洗い落とした。プレートを−８０℃で１時間置くことによって、結合した細胞を凍結した。次いで、細胞を室温で融解した。１００ｍｌのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解緩衝液を各ウェルに添加し、そして４８５ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光で、蛍光を読み取った。
【０２０６】
［０２２１］実施例８由来の１５の選択したｍＡｂを、最初は２μｇ／ｍｌで、接着アッセイに供した。接着を阻害した８つのｍＡｂが見いだされた際、図２に例示するように、これらに関する用量−反応関係曲線を３つ組で得た。残った７つのｍＡｂは、明示する実験条件下で、明らかな阻害効果を示さなかった。
【０２０７】
［０２２２］ヒト・アイソタイプＩｇＧまたはヤギＩｇＧ対照のいずれも、ビトロネクチンへのＵ９３７の接着を阻害しなかった。既知の中和剤であるヤギ抗ｕＰＡＲ（黒い太い点線、図２）と同様、これらの阻害性の８つのｍＡｂは、用量依存方式で、ビトロネクチンへの細胞接着を阻害した。グラフ中の曲線の最も左側のグループは、ｍＡｂ ４．１８．１、２．６．１、２．１９．２、および４．５０．２で構成される。アッセイ中で試験した最大ｍＡｂ濃度は、２μｇ／ｍｌであった。この濃度で、少なくともｍＡｂ ２．１９．２および２．６．１は、９０％阻害に到達し、そしてｍＡｂ ４．１８．１は、ｕＰＡＲが仲介するビトロネクチンへの細胞接着の９０％阻害に近づく。この実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２０８】
［０２２３］抗体の他の特徴に対する抗接着活性の相関を表１１に要約する。
実施例１０
浸潤アッセイ
［０２２４］Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号３５６２３７、ロット番号００７０２４−７．７ｍｇ／ｍｌ）を４℃の冷蔵庫中、氷上で一晩、解凍した。孔サイズ８μｍのＢＤ ２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート中の各ウェルに、８０μｌのゲルを添加し、そして細胞接着前に、３７℃で９０分間インキュベーションした。細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＤＭＥＭ（０．２％ＦＣＳ）培地中、１ｘ１０^５細胞／ｍｌで、ＨＴ−１０８０細胞を再懸濁した。１００μｌ（１ｘ１０^４細胞）の細胞懸濁物を無菌エッペンドルフ試験管にアリコットし、そしてときどき混合しながら、０．１、１．０、および１０μｇ／ｍｌの最終濃度のｍＡｂと、３７℃で１時間プレインキュベーションした。未処理対照試料もまた、ときどき混合しながら、３７℃で１時間プレインキュベーションした。
【０２０９】
［０２２５］０．１、１．０、および１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを補充した７５０μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）培地を、下部トランスウェル・チャンバーの適切なウェルに添加した。７５０μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）培地を、対照試料の下部チャンバーに添加した。固形化Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭを含有する上部チャンバーを下部トランスウェル・チャンバー内に挿入し、そして１００μｌ（１ｘ１０^４細胞）のプレインキュベーション細胞懸濁物を、適切なウェルの上部チャンバーにアリコットし、そしてチャンバーを３７℃で３日間インキュベーションした。−２０℃メタノール中に室温で２０分間浸すことによって、トランスウェルを固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｂ２２６１）（１０μＭ）で染色する前に、トランスウェルをＰＢＳで２回洗浄した。染色後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。２０ｘ対物レンズを用いて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ最上部の細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭに浸潤した細胞の２０μｍの連続切片の光学的イメージを得た。Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州ベセスダ）画像分析ソフトウェアパッケージを使用して、各切片での細胞数を計算した。各試料に関して、すべての切片中に存在する、明記した距離（６０〜２００μｍ）を超えて浸潤した細胞のパーセント数としてデータを提示した。
【０２１０】
［０２２６］実施例８由来の１５のｍＡｂを、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２に関してはＰＫ１６．３．１、ＩｇＧ４に関しては１０８．２．１）とともに、０．１、１．０、および１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度でアッセイに使用した。６０μｍの距離を超えて浸潤した細胞数を、「ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプ対照を超えた倍変化」に基準化した。図３中の３つのパネルは、上から下に、それぞれ、０．１、１．０、および１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度で収集したデータに相当する。試験した大部分のｍＡｂは、細胞浸潤を阻害することが見いだされた。抗体２．１９．１、２．６．１および４．１８．１は、最適な有効性および強度を有した。１０μｇ／ｍｌの濃度で、ｍＡｂ ２．１９．１は、６０μｍの距離を超えた浸潤を完全に阻害し、そしてｍＡｂ ２．６．１および４．１８．１はどちらも９０％阻害を達成した。続いて、２．６．１、２．１９．２および４．１８．１の分析を０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲に渡って行い、そして８０μＭの深さでＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭに浸潤した細胞の数によって浸潤を決定した。図５に示すように、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２および４．１８．１は、８０μｍまでの細胞移動を有意に阻害する（＞７０％阻害）ことが見いだされた。
【０２１１】
実施例１１
低および高解像度ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭを用いたアフィニティーの決定
低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ
［０２２７］低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ試験のため、アフィニティー決定に関して、３１のハイブリドーマ細胞株産物またはハイブリドーマ上清のセレクションを試験した。ルーチンのアミンカップリングを用いて、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭチップ上の高密度ヤギ抗ヒト抗体表面を調製した。１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐ泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、０．００５％サーファクタントＰ２０）中、すべてのｍＡｂをおよそ６μｇ／ｍｌに希釈した。１０μｌ／分で３０秒間の接触時間を用い、その後、ｍＡｂベースラインの安定化のため、１００μｌ／分の流速で５分間の洗浄を行って、各ｍＡｂを別個のフローセル上で捕捉した。次に、ｈｕ−ｕＰＡＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ロットＡＬＨ０１４０２Ａ）を、全表面に３１２ｎＭ（２３℃）で９０秒間注入した後、５分間解離させた（１００μｌ／分の流速）。４分間のｈｕ−ｕＰＡＲ注入（３１２ｎＭ、５０μｌ／分の流速）で、４つのｍＡｂを再分析した。泳動緩衝液中ですべての抗原試料を調製した。全捕捉／注入サイクル後に、１４６ｍＭリン酸（ｐＨ１．５）を１５秒間１回パルス処理して、表面を再生した。
【０２１２】
［０２２８］各サイクルに関して、各抗原注入前の緩衝液注入のベースラインドリフトを減じた。
［０２２９］ＣＬＡＭＰ（Ｄａｖｉｄ Ｇ． ＭｙｓｚｋａおよびＴｈｏｍａｓ Ｍｏｒｔｏｎ（１９９８）“ＣＬＡＭＰ（ｃ）： ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｋｉｎｅｔｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ，” ＴＩＢＳ ２３， １４９−１５０）を用いて、１：１相互作用モデルにデータを広範囲で適合させて、結合動力学を決定した。データを適合させる際に、物質移動係数を用いた。動力学分析結果を表７ａに列挙する。分析中に用いたｍＡｂ上清もまた示す。高アフィニティーから低アフィニティーにｍＡｂをランキングする。
【０２１３】
表７ａ．低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭから得た、ハイブリドーマ株に関するアフィニティー決定結果
【０２１４】
【表７−１】

【０２１５】
［０２３０］大部分のＡｂは、１：１モデルに非常によく適合する。ｍＡｂ ３．１３３および３．１６７の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）データは、ある程度の複雑さを示したが、動力学的パラメータは、許容されうる概算値である。ｍＡｂ １．１６３の分析において、会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）が緩慢である（１０^３Ｍ^−１ｓ^−１の桁）ため、注入時間をより長い４分間にしてもなお、有意な曲率は生じなかった。
【０２１６】
高解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ
［０２３１］大部分のｍＡｂが１：１モデルに非常によく適合したことを考慮すると、株産物低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭから得たアフィニティーランキングは、信頼性があると考えられた。３つのクローニングおよび精製ｍＡｂの高解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭを用いたＫｄ決定を、別個の実験で行った。
【０２１７】
［０２３２］３つの精製ｍＡｂ各々（２．１９．２、２．６．１および４．１８．１）を、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭチップの異なるフローセル表面上にアミンカップリングし、そしてヒトｕＰＡＲへの結合アフィニティーに関して試験した。固定のため、すべてのｍＡｂを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中に希釈した。すべての実験に関して、泳動緩衝液および試料調製緩衝液は、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する脱気ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、０．００５％サーファクタントＰ２０）であった。１００μｌ／分の流速、２３℃で、すべての実験を行った。二重参照のため、いくつかの緩衝液注入を分散させて、連続希釈（２倍）ｕＰＡＲ試料を３つ組で９０秒間、ランダムに注入した。すべての高解像度実験に、Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ ２０００バイオセンサー装置を用いた。物質移動期間を含めて、１：１相互作用モデルにデータを広範囲で適合させた。生じたＫ_Ｄ値を表７ｂに要約する。
【０２１８】
表７ｂ．高解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭから得た、クローニングおよび精製ｍＡｂに関するアフィニティー決定結果
【０２１９】
【表７−２】

【０２２０】
［０２３３］抗体２．１９．２、２．６．１、および４．１８．１のＫｄ値は、それぞれ、１７５ｐＭ、２４９ｐＭ、および４４６ｐＭであった。高解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭでの各抗体のＫｄランキングは、低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭで得たものと一致した。
【０２２１】
実施例１２
マウスおよびサルｕＰＡＲに対する交差反応性
［０２３４］マウス交差反応性を決定するため、過剰な可溶性マウスｕＰＡＲを用いた競合アッセイにおいて、Ｕ９３７細胞表面上に発現されたヒトｕＰＡＲへのｍＡｂ結合を検出した。アッセイ中、ｕＰＡＲを発現している細胞にｍＡｂを曝露する前に、過剰量の組換えマウスｕＰＡＲをｍＡｂとプレインキュベーションした。ｍＡｂがマウスｕＰＡＲと交差反応する場合、プレインキュベーションはｍＡｂをマスキングし、したがって、ｍＡｂはヒトｕＰＡＲに結合しないであろう。
【０２２２】
［０２３５］マウスｕＰＡＲ／ヒトＩｇＧ Ｆｃキメラ（ｕＰＡＲＨｕＩｇＧ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５３１−ＰＡ−１００）をマウスｕＰＡＲとして用いた。１μｇ／ｍｌ、５０μｌの各ｍＡｂを、等体積のマウスｕＰＡＲＨｕＩｇＧ ４０μｇ／ｍｌと混合した。ｍＡｂおよびマウスｕＰＡＲの最終濃度は、それぞれ５００ｎｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌであった（Ｍｏ−ｕＰＡＲＨｕＩｇのおよその分子量は６６〜９０Ｋｄである）。混合物は、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．０５％ ＮａＮ_３を補充したＰＢＳ）中であり、そしてこれを３０分間インキュベーションした。続いて、２０，０００のＵ３９７細胞を混合物に添加し、氷上でさらに３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了時、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて５回洗浄することによって、結合していないｍＡｂを徹底的に除去した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて、Ｃｙ５（Ｃｙ５−ビス−ＯＳＵ、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナトインドジカルボシアニン、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＰＡ１５０００）−標識ヤギ抗Ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃ（５．０μｇ／ｍｌ）および７ＡＡＤ（５．０μｇ／ｍｌ）で、結合したｍＡｂを検出した。
【０２２３】
［０２３６］過剰量の可溶性組換えマウスｕＰＡＲが、細胞に結合したヒトｕＰＡＲへのいかなるｍＡｂの結合も遮断せず（データ未提示）、ｍＡｂがいずれもマウスｕＰＡＲに交差反応しなかったことが示されることが、結果によって示された。マウス交差反応性結果を決定的にするため、ＦＡＣＳ分析を用いて、細胞に結合したマウスｕＰＡＲへのｍＡｂの直接結合を測定した。結合組織由来のマウス細胞株、ＮＣＴＣ Ｌ９２９をＦＡＣＳ分析に使用した。ＦＡＣＳ緩衝液を用いて、採取した細胞を５０，０００細胞／ウェルに再懸濁して、Ｖ底プレート内に入れて、氷上においた。６．２５μｇ／ｍｌの最終濃度のｕＰＡＲ ｍＡｂをウェルに添加し、そして氷上で１時間インキュベーションした。洗浄後、５μｇ／ｍｌのＣｙ５標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃおよび５μｇ／ｍｌの７ＡＡＤを添加した。混合物を氷上で１５分間インキュベーションし、洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析のため、冷ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
【０２２４】
［０２３７］表８は、ＦＡＣＳ結果を要約する。マウス抗原と交差反応するラット抗ｕＰＡＲは大きなシフトを生じ、幾何平均は２４８．０７であった。対照的に、検出のための二次抗体を伴う、マウス抗ｕＰＡＲ ｍＡｂ（マウス抗原に対する反応性を欠く）、ラット、マウスおよびヒト由来のアイソタイプ対照に関する幾何平均値は、３．１４〜１３．０７の範囲であった。完全ヒトｕＰＡＲ ｍＡｂはすべて、９〜１２の間の幾何平均を示し、これは、上記の陰性対照でみられるバックグラウンドに匹敵した。したがって、ｍＡｂはいずれも、細胞表面マウスｕＰＡＲには結合しないと結論づけられた。
【０２２５】
表８．ＦＡＣＳ分析結果の要約
【０２２６】
【表８】

【０２２７】
［０２３８］クローニング前に、３０の選択したハイブリドーマ株のうち２つ（３．１３３および３．１６７）は、サルｕＰＡＲに対する交差反応性を欠くことが示された。クローニング後、ＦＡＣＳ分析を用いて、２９３Ｔ細胞表面上に組換え的に発現されたサルｕＰＡＲに対する交差反応性を確認した。ＦＡＣＳ分析結果を図４に要約する。
【０２２８】
［０２３９］陰性対照抗体に比較して、抗ｕＰＡＲ ｍＡｂはすべて、細胞に結合したサルｕＰＡＲに結合したが、幾何平均値は、非常に多様であった。弱い結合剤には、ｍＡｂ １．１５９．１、１．１６３．１、３．１４．１およびｍＡｂ １．１００．１が含まれた。ｍＡｂ ２．１９．２、２．６．１、および４．１８．１は、サル抗原に非常に強く交差反応することが見いだされた（図４）。
【０２２９】
実施例１３
カニクイザル・アフィニティー
［０２４０］ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）法を用いて、いくつかの抗体の動力学的測定を評価した。この方法は、平衡時の正式なアフィニティー測定の、溶液に基づく測定を伴う。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した組換えヒトｕＰＡＲ（アミノ酸１〜３０３）を、ＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズにカップリングした。１Ｍ Ｔｒｉｓ中の１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで、ビーズ上の残った活性基をブロッキングし、そして製造者に推奨されるように、ブロッキング溶液中に保存した。ヒトｕＰＡＲとカップリングしているビーズが固相として働く、自動化フローイムノアッセイ系ＫｉｎＥｘＡ ３０００を用いて、ＫｉｎＥｘＡ実験を実行した。
【０２３０】
［０２４１］配列番号８１として示すヌクレオチド配列は、Ｃ末端にインフレームＨｉｓタグを持つカニクイザル・タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする（配列番号８２）。製造者の推奨にしたがって、タンパク質産生のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞において、このヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一過性にトランスフェクションすることによって、カニクイザルｕＰＡＲを産生した。この一過性トランスフェクション由来の馴化培地を、上述のようなアフィニティー決定に用いた。
【０２３１】
［０２４２］簡潔には、一定量の２．６．１または２．１９．２抗ｕＰＡＲ抗体（５ｎＭまたは５００ｐＭ）を、およそ６２５ｎＭから始まる組換えカニクイザルｕＰＡＲ ＥＣＤを含有する馴化培地の力価決定濃度と、インキュベーションした。抗原／抗体複合体を、室温で４８時間〜１６８時間インキュベーションして、平衡に到達するのを可能にした。ヒトｕＰＡＲカップリングビーズを用いて混合物を引きつけて、結合していない抗体を集積させた。試料緩衝液中、Ｃｙ５コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖特異的二次抗体を含有する溶液を用いて、捕捉された抗体を検出した。結合したシグナルを、ｈＩＬ−１３の非存在下での対照の比率として、相対値に変換した。すべての平衡実験に関して、各試料の３つの複製物を測定した。結果を以下の表９に要約する。ＫｉｎＥｘＡソフトウェア内に含有される、未知のリガンド濃度での１部位均質結合モデルを用いたデータの非線形回帰分析から、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を得た。該ソフトウェアは、Ｋ_Ｄを計算し、そして理論的Ｋ_Ｄ曲線にデータ点を適合させることによって、９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間は、Ｋ_Ｄ低およびＫ_Ｄ高として提供される。
【０２３２】
表９．カニクイザル結合活性に関するＫｉｎＥｘＡ結果の要約
【０２３３】
【表９】

【０２３４】
実施例１４
内在化アッセイ
［０２４３］Ｕ９３７細胞を用いたｕＰＡＲ内在化を誘導する能力に関して、実施例８由来の８つのｍＡｂを試験した。１００，０００細胞を含有する細胞懸濁物を、２つ組で、Ｖ底プレートの各ウェル内にピペッティングした。２つのＶ底プレートを用意し、一方は抗体複合体での内在化の間、３７℃で維持し、そしてもう一方は４℃でインキュベーションした。８つのｕＰＡＲ ｍＡｂの各々を、５μｇ／ｍｌで、氷上でＵ９３７細胞と１５分間インキュベーションした。氷上でのインキュベーションは、一次ｍＡｂの内在化を防止するために必要であった。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。続いて、冷ＦＡＣＳ緩衝液中、５μｇ／ｍｌのａｌｅｘａ６４７標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ２１２４９）１００μｌ中、細胞を氷上で１５分間インキュベーションした。これによって、いかなる内在化も許さずに、結合したｕＰＡＲ ｍＡｂにヤギＦＡＢが結合することが可能になった。氷上で１５分間インキュベーションした後、１つのプレートを氷上に維持し、一方、他方のプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。
【０２３５】
［０２４４］ｍＡｂ−ＦＡＢ複合体と１時間インキュベーションした後、細胞を冷５％ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そしてストリッピング剤として２００μｌのＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）を各ウェルに添加した。プレートをどちらもＴＣＥＰと氷上で１時間インキュベーションした後、洗浄し、そしてＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。４μｌの７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を各ウェルに添加した後、氷上で１０分間インキュベーションし、その後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【０２３６】
［０２４５］以下の等式を用いて、内在化の割合を計算した：
［０２４６］［（３７ストリップ−４ストリップ）／（４ストリップなし−４ストリップ）］ｘ１００
［０２４７］式中、「３７ストリップ」は、ＴＣＥＰを用いた、３７℃での幾何平均であり；
「４ストリップ」は、ＴＣＥＰを用いた、氷上での幾何平均であり；
「４ストリップなし」は、ＴＣＥＰを用いない、氷上での幾何平均である（表１０を参照されたい）。
【０２３７】
表１０．内在化アッセイの要約
【０２３８】
【表１０】

【０２３９】
［０２４８］表１０に要約するように、３７℃で１時間インキュベーションした後、あるとしても、非常にわずかな内在化しか検出されなかった。実験を２回反復して、類似の結果を得た。
【０２４０】
［０２４９］表１１は、実施例８由来の１５の候補のｉｎ ｖｉｔｒｏ性質決定の結果を要約する。
表１１． １５のｕＰＡＲ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ性質決定アッセイ結果の要約
【０２４１】
【表１１】

【０２４２】
^＊括弧内の数字は、各カテゴリーに関するランクキング順を示す。
実施例１５
ｕＰＡＲ抗体の構造分析
［０２５０］抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列決定して、ＤＮＡ配列を決定した。各ガンマおよびカッパ鎖の組み合わせに関して、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含めて、配列表に、抗ｕＰＡＲ抗体の完全配列情報を提供する。可変重鎖配列を分析して、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列およびＪ領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳して、一次アミノ酸配列を決定し、そして生殖系列ＶＨ、ＤおよびＪ領域配列に比較して、体細胞超変異を評価した。
【０２４３】
［０２５１］表１８は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）生殖系列重鎖領域に、抗体重鎖領域を比較する表である。表１９は、同族生殖系列軽鎖領域に、抗体カッパ軽鎖領域を比較する表である。
【０２４４】
［０２５２］免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、多数の生殖系列ＤＮＡセグメントにコードされ、Ｂ細胞個体発生中に、これらが連結されて機能性可変領域（Ｖ_ＨＤＪ_ＨまたはＶ_ＫＪ_Ｋ）になる。ｕＰＡＲに対する抗体反応の分子多様性および遺伝的多様性を詳細に研究した。これらのアッセイによって、抗ｕＰＡＲ抗体に特異的ないくつかの点が明らかになった。
【０２４５】
［０２５３］各ハイブリドーマから収集したシスター・クローンの中のアミノ酸配列が同一であることを認識すべきである。例えば、ｍＡｂ ２．１９．３の重鎖および軽鎖配列は、ｍＡｂ ２．１９および２．１９．１の配列と同一であろう。
【０２４６】
［０２５４］配列決定データによると、２．６．１および４．１８．１の重鎖の一次構造は類似であるが、同一ではない。２．１９．２は、他の２つと構造的に異なる。
［０２５５］特定の抗体が、アミノ酸レベルで、それぞれの生殖系列配列と異なる場合、抗体配列を生殖系列配列に突然変異させ直してもよいこともまた認識すべきである。こうした訂正突然変異は、標準的分子生物学的技術を用いて、１つ、２つ、３つまたはそれより多い位で、あるいは突然変異位のいずれかの組み合わせで、生じてもよい。限定されない例として、表１９は、ｍＡｂ ４．１８．１の軽鎖配列（配列番号５２）が、ＦＲ１領域中のＳｅｒからＰｈｅの突然変異（突然変異１）、ＦＲ１領域中のＶａｌからＭｅｔの突然変異（突然変異２）、ＦＲ２領域中のＬｙｓからＴｈｒの突然変異（突然変異３）、ＦＲ３領域中のＩｌｅからＰｈｅの突然変異（突然変異４）、およびＦＲ３領域中のＳｅｒからＩｌｅの突然変異（突然変異５）を通じて、対応する生殖系列配列（配列番号６６）と異なることを示す。したがって、ｍＡｂ ４．１８．１の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異１を変化させて、突然変異１の部位で生殖系列配列を得てもよい。さらに、ｍＡｂ ４．１８．１の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異２または突然変異３を変化させて、突然変異２または突然変異３の部位で生殖系列配列を得てもよい。さらに、ｍＡｂ ４．１８．１の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異１および突然変異２の両方、または２以上の突然変異の任意の他の組み合わせを変化させて、これらの特定の部位で生殖系列配列を得てもよい。以下の表１２〜１７は、ｍＡｂ ２．１９．２、２．６．１および４．１８．１に関して、生殖系列からのこうした変動の位置を例示する。各列は、太字で示した位置の生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせを表す。
【０２４７】
表１２． 示した残基番号での生殖系列に対するｍＡｂ ２．１９．２軽鎖（配列番号３２）の典型的な突然変異
【０２４８】
【表１２−１】

【０２４９】
【表１２−２】

【０２５０】
【表１２−３】

【０２５１】
【表１２−４】

【０２５２】
表１３． 示した残基番号での生殖系列に対するｍＡｂ ２．１９．２重鎖（配列番号３０）の典型的な突然変異
【０２５３】
【表１３】

【０２５４】
表１４． 示した残基番号での生殖系列に対するｍＡｂ ２．６．１軽鎖（配列番号２８）の典型的な突然変異
【０２５５】
【表１４】

【０２５６】
表１５． 示した残基番号での生殖系列に対するｍＡｂ ２．６．１重鎖（配列番号２６）の典型的な突然変異
【０２５７】
【表１５−１】

【０２５８】
【表１５−２】

【０２５９】
【表１５−３】

【０２６０】
【表１５−４】

【０２６１】
【表１５−５】

【０２６２】
【表１５−６】

【０２６３】
【表１５−７】

【０２６４】
【表１５−８】

【０２６５】
【表１５−９】

【０２６６】
【表１５−１０】

【０２６７】
【表１５−１１】

【０２６８】
【表１５−１２】

【０２６９】
【表１５−１３】

【０２７０】
【表１５−１４】

【０２７１】
【表１５−１５】

【０２７２】
【表１５−１６】

【０２７３】
【表１５−１７】

【０２７４】
【表１５−１８】

【０２７５】
【表１５−１９】

【０２７６】
【表１５−２０】

【０２７７】
【表１５−２１】

【０２７８】
【表１５−２２】

【０２７９】
【表１５−２３】

【０２８０】
【表１５−２４】

【０２８１】
【表１５−２５】

【０２８２】
【表１５−２６】

【０２８３】
【表１５−２７】

【０２８４】
【表１５−２８】

【０２８５】
【表１５−２９】

【０２８６】
【表１５−３０】

【０２８７】
【表１５−３１】

【０２８８】
【表１５−３２】

【０２８９】
表１６． 示した残基番号での生殖系列に対するｍＡｂ ４．１８．１軽鎖（配列番号５２）の典型的な突然変異
【０２９０】
【表１６−１】

【０２９１】
【表１６−２】

【０２９２】
【表１６−３】

【０２９３】
【表１６−４】

【０２９４】
【表１６−５】

【０２９５】
【表１６−６】

【０２９６】
【表１６−７】

【０２９７】
【表１６−８】

【０２９８】
表１７． 示した残基番号での生殖系列に対するｍＡｂ ４．１８．１重鎖（配列番号５０）の典型的な突然変異
【０２９９】
【表１７−１】

【０３００】
【表１７−２】

【０３０１】
【表１７−３】

【０３０２】
【表１７−４】

【０３０３】
【表１７−５】

【０３０４】
【表１７−６】

【０３０５】
【表１７−７】

【０３０６】
【表１７−８】

【０３０７】
表１８．重鎖分析
【０３０８】
【表１８−１】

【０３０９】
【表１８−２】

【０３１０】
【表１８−３】

【０３１１】
【表１８−４】

【０３１２】
表１９．軽鎖分析
【０３１３】
【表１９−１】

【０３１４】
【表１９−２】

【０３１５】
【表１９−３】

【０３１６】
実施例１６
ｕＰＡＲ結合エピトープの同定
［０２５６］抗ｕＰＡＲ抗体がマウスｕＰＡＲと交差反応するのに失敗したため、本発明者らは、いくつかのマウスｕＰＡＲ−ヒトｕＰＡＲキメラタンパク質を生成して、抗体結合に関与するドメインを同定した。各々、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む、ネズミＤ１／ヒトＤ２Ｄ３；ネズミＤ１／ヒトＤ２／ネズミＤ３；およびヒトＤ１Ｄ２／ネズミＤ３ｕＰＡＲを含むキメラ・ヒト−ネズミｕＰＡＲを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中、分泌タンパク質として発現した。培養上清のウェスタンブロッティングによって、２．６．１、２．１９．２、および４．１８．１の結合部位を決定し；抗Ｈｉｓ ｍＡｂを用いた検出によって、適切な組換えタンパク質が発現されていることを立証した。２．１９．２の結合エピトープはドメインＩに存在し、そして２．６．１は、主に、ドメインＩＩ／ＩＩＩ内のエピトープと相互作用し、そして４．１８．１はドメインＩＩ中のエピトープと相互作用する（図６を参照されたい）。
【０３１７】
［０２５７］エピトープ・ビニングに用いたタンパク質をコードするヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列を以下の表２０に示す。
表２０．エピトープ・ビニングに用いたヌクレオチドおよびアミノ酸配列
【０３１８】
【表２０】

【０３１９】
実施例１７
ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖および転移の阻害
［０２５８］安定してＧＦＰ（ＭＤＡ ＭＢ２３１−ＧＦＰ細胞）を発現しているＭＤＡ ＭＢ２３１細胞を培養中で増殖させて、そして８５％集密で採取した。総数５ｘ１０^５の腫瘍細胞を生理食塩水／２０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ中で、雌Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪体内に接種した。移植３日後、マウスに以下を投与した：対照の非特異的アイソタイプ一致ＩｇＧ４；ドキソルビシンＲｘ、５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．、週１回、２週間；対照または抗ヒトｕＰＡＲ ｍＡｂ ０．５ｍｇ／マウスｉ．ｐ．、実験期間中、週１回。キャリパーを用いて、週１回、腫瘍増殖を測定し、そして公式（ａｘｂ^２／２）、式中、ａ−長径の長さであり、ｂ−垂直小径の幅である、にしたがって腫瘍体積を計算した（図７）。未治療対照腫瘍増殖（図７には示さない）は、ＩｇＧ４アイソタイプ対照に比較して、有意には異ならなかった。
【０３２０】
［０２５９］研究終了時、原発腫瘍を固定し、そしてさらなる分析のため、対照および実験動物から、肺、肝臓および脾臓を除去した。標準的免疫組織化学技術を用いて、以下のタンパク質に関して、組織切片を染色した：Ｋｉ６７；ＣＤ３１；ＭＡＰＫ；ホスホ−ＭＡＰＫ；ＦＡＫ；ホスホ−ＦＡＫ。ＢｉｏＱｕａｎｔ画像分析ソフトウェアを用いて、染色強度を測定し、そして治療群あたり６匹の動物由来のデータを記録した（図８）。
【０３２１】
［０２６０］肺、肝臓、および脾臓組織を同様に処理し、そして蛍光顕微鏡によって腫瘍細胞を同定し、そして転移数を記録した（図９）。
［０２６１］図７〜９に立証するように、抗ｕＰＡＲ抗体は、原発腫瘍増殖を阻害し、そして離れた臓器への転移発生を有意に阻害した。原発腫瘍の免疫組織化学検査は、増殖マーカーＫｉ６７に対する効果をまったく示さなかったが、対照に比較して、ｐＭＡＰＫおよびｐＦＡＫのレベルの一貫した阻害があった。予期せぬことに、ＣＤ３１染色もまた、染色強度のある程度の減少を示したが、ネズミｕＰＡＲとの抗体交差反応性が存在せず、機構は、局所腫瘍関連ｕＰＡ活性の結果としての、間接的なものであると仮定しなければならない。
【０３２２】
実施例１８
免疫組織化学
［０２６２］凍結細胞ペレットおよび正常ヒト組織マイクロアレイ（ＴｒｉＳｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）に対して、ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と一緒に、２．６．１、２．１９．２および４．１８．１の結合プロフィールを評価した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．のマウス抗ｕＰＡＲ（カタログ番号３９３６、ロット番号０４１２２３）が、研究における陽性対照Ａｂであった。０〜３＋のスケール（±はっきりしない染色；１＋弱い染色；２＋中程度の染色；３＋強い染色）を用いて、目によって、染色強度を概算した。ＰＣ３ヒト前立腺癌由来の凍結細胞ペレットおよびＵ９３７ヒト組織細胞リンパ腫Ｕ９３７細胞ペレットを陽性対照として用い、そして膜および細胞質染色の両方を観察した（表２１を参照されたい）。陰性対照抗体でバックグラウンド染色が観察された場合、染色がバックグラウンドより強く、そして／またはバックグラウンドから区別可能である場合のみ、または染色が、陰性対照抗体で染色されない試験組織内の細胞中にある場合のみ、陽性染色と報告した（以下の表２３を参照されたい）。
【０３２３】
表２１．細胞ペレット中の染色強度
【０３２４】
【表２１】

【０３２５】
［０２６３］ヒト組織マイクロアレイの染色のため、２．６．１、２．１９．２および４．１８．１をビオチンでコンジュゲート化し、Ｕ９３７細胞への結合に関して再評価して（以下の表２２を参照されたい）、そして次いで、組織マイクロアレイを染色するのに用いた。
【０３２６】
表２２．ビオチン−コンジュゲート化ｍＡｂを用いた細胞ペレット中の染色強度
【０３２７】
【表２２】

【０３２８】
［０２６４］組織マイクロアレイを、２０μｇ／ｍｌの濃度のビオチン・コンジュゲート化抗体で染色した。結果を表２３に示す。示す場合、ｃ＝細胞質であり、そしてｍ＝膜染色パターンである。
【０３２９】
表２３．組織マイクロアレイ染色パターン
【０３３０】
【表２３−１】

【０３３１】
【表２３−２】

【０３３２】
実施例１９
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
［０２６５］膵臓癌と診断されたヒト癌患者群を、治療群にランダム化する。各患者群を、本明細書記載のｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２または４．１８．１の毎週静脈内注射で治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の抗体の有効量を４〜８ヶ月間、投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを与える。
【０３３３】
［０２６６］治療措置中および措置後、定期的に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。ｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２または４．１８．１での毎週抗体治療を受けた患者が、抗体治療を受けなかった患者に比較して、腫瘍サイズの有意な減少、進行までの遅延、または生存延長を示すことが見いだされる。何人かの治療患者では、腫瘍はもはや検出不能である。対照的に、対照群においては、腫瘍サイズは、増加するか、または実質的に同じままである。
【０３３４】
実施例２０
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
［０２６７］甲状腺癌と診断されたヒト癌患者群を、治療群にランダム化する。各患者群を、本明細書記載のｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２または４．１８．１の静脈内注射で、３週間ごとに、治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の抗体の有効量を４〜８ヶ月間、およびゲムシタビンの有効療法用量を投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを与える。治療措置中および措置後、定期的に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって腫瘍負荷を評価する。ｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２または４．１８．１での３週間の抗体治療およびゲムシタビン治療を受けた患者が、抗体およびゲムシタビン治療を受けなかった患者に比較して、腫瘍サイズの有意な減少、進行までの遅延、または生存延長を示すことが見いだされる。何人かの治療患者では、腫瘍はもはや検出不能である。対照的に、対照群においては、腫瘍サイズは、増加するか、または実質的に同じままである。
【０３３５】
実施例２１
ヒト患者における腫瘍転移の阻害
［０２６８］非小細胞肺癌と診断されたヒト癌患者群を、治療群にランダム化する。標準的化学療法措置に加えて、各患者群を、本明細書記載のｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２または４．１８．１の静脈内注射で、毎週、治療する。各患者に、５ｍｇ／ｋｇ／週〜１５ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の抗体の有効量を２〜８ヶ月間、投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを与える。
【０３３６】
［０２６９］治療措置中および措置後、定期的に、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって転移病巣を評価する。ｍＡｂ ２．６．１、２．１９．２または４．１８．１で毎週抗体治療を受けた患者が、抗体治療を受けなかった患者に比較して、転移病巣の数およびサイズの有意な減少を示すことが見いだされる。
【０３３７】
実施例２２
ヒト患者におけるエストロゲン受容体陽性乳癌の治療
［０２７０］成人女性が、エストロゲン受容体陽性乳癌と診断される。患者を、ｍＡｂ ２．１９．２および抗ホルモン剤の静脈内注射で、２〜８ヶ月の期間に渡って２週間ごとに治療する。その結果、患者は、進行がない生存の延長を経験する。
【０３３８】
実施例２３
ヒト患者におけるＨＥＲ２陽性乳癌の治療
［０２７１］成人女性が、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断される。患者を、ｍＡｂ ２．１９．２および抗ｈｅｒ２剤の静脈内注射で、２〜８ヶ月の期間に渡って毎週治療する。その結果、患者は、腫瘍サイズの有意な減少を経験する。
【０３３９】
実施例２４
ヒト患者におけるＥＧＦＲ発現性肺癌の治療
［０２７２］成人男性が、ＥＧＦＲ発現性肺癌と診断される。患者を、ｍＡｂ ２．１９．２および受容体チロシンキナーゼ阻害剤の静脈内注射で、２〜８ヶ月の期間に渡って毎週治療する。その結果、患者は、進行までの時間の有意な遅延を経験する。
【０３４０】
実施例２５
ヒト患者における関節炎の治療
［０２７３］成人女性が、重度の関節炎と診断される。患者を、ｍＡｂ ２．１９．２の静脈内注射で、３週間の期間に渡って２週間ごとに治療する。その結果、患者は、関節炎症状の有意な減少を経験する。
【０３４１】
実施例２７
ヒト患者におけるアテローム性動脈硬化症の治療
［０２７４］成人男性が、アテローム性動脈硬化症と診断される。患者を、ｍＡｂ ４．１８．１の静脈内注射で、１年間の期間に渡って１週間おきに治療する。その結果、患者は、狭心症などのアテローム性動脈硬化症の症状の減少を経験する。
【０３４２】
援用
［０２７５］特許、特許出願、論文、教科書等を含む、本明細書に引用するすべての参考文献、および該文献に引用される参考文献は、すでにそうでない度合いまで、その全体が本明細書に援用される。
【０３４３】
同等物
［０２７６］前述の記載した明細書は、当業者が本発明を実施可能となるのに十分であると見なされる。前述の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳述し、そして発明者らが意図する最適の様式を記載する。しかし、前述の記述がテキスト中でいかに詳細であるかに関わらず、本発明を多くの方式で実施してもよく、そして本発明は付随する請求項およびその任意の同等物にしたがって解釈されるべきであることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３４４】
【図１】［００７０］図１は、プラスミノーゲン活性化阻害アッセイにおける、１５の抗ｕＰＡＲモノクローナル抗体の阻害効果を示す線グラフである。各ｍＡｂに関する用量−反応関係曲線を例示する。最高の有効性および強度を示す８つの抗体を垂直のブラケットによって示す。太字のレジェンドは、最強の阻害を示した抗体を示す。Ｌｏｇ［ｍＡｂ］（μｇ／ｍｌ）の単位を持つ抗体濃度の関数として、阻害パーセント（「阻害％」）を示す。
【図２】［００７１］図２は、ｕＰＡＲ ｍＡｂが、ビトロネクチンへのＵ９３７細胞の接着を阻害する能力を示す線グラフである。８つのｍＡｂ、ならびにヒトおよびヤギ・アイソタイプ陰性対照およびヤギ抗ｕＰＡＲ陽性対照に関する用量−反応関係曲線を示す。Ｌｏｇ［ｍＡｂ］（ｎｇ／ｍｌ）の単位を持つ抗体濃度の関数として、阻害パーセント（「阻害％」）を示す。
【図３】［００７２］図３は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ膜調製物へのＨＴ−１０８０浸潤に対するｕＰＡＲ ｍＡｂの阻害効果を示す。０．１μｇ／ｍｌ（上部グラフ）、１．０μｇ／ｍｌ）（中央部グラフ）、および１０μｇ／ｍｌ（下部グラフ）の濃度の抗体を試験した。アイソタイプ対照に対して、処理によって６０マイクロメートル（μｍ）を超えてＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭに浸潤した細胞数の比をプロットする。
【図４】［００７３］図４は、２９３Ｔ細胞表面上に発現されるサル（カニクイザル）ｕＰＡＲへの抗ｕＰＡＲモノクローナル抗体の結合を示す棒グラフである。ヒストグラフ（ｈｉｓｔｏｇｒａｐｈ）ピークシフトのＦＡＣＳ分析から得られる幾何平均値をプロットする。
【図５】［００７４］図５は、腫瘍細胞浸潤に対する抗ｕＰＡＲ ｍＡｂの効果を示す棒グラフである。０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度の各抗体に関して、８０マイクロメートル（μＭ）を超えてＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭに浸潤したＨＴ−１０８０細胞の割合を示す。
【図６】［００７５］図６は、ウェスタンブロッティングによる、抗ヒトｕＰＡＲ ｍＡｂのエピトープ結合分析の結果を示す。ヒト−ネズミｕＰＡＲキメラ（Ｈｉｓタグ化）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、そして示すような抗ヒトｕＰＡＲ ｍＡｂを用いて、ｕＰＡＲ発現を検出した。レーン１−ネズミＤＩ／ＤＩＩＩ−ヒトＤＩＩ；レーン２−ネズミＤＩ／ＤＩＩ−ヒトＤＩＩＩ；レーン３−ネズミＤＩ−ヒトＤＩＩ／ＤＩＩＩ；レーン４−ヒトＤＩ／ＤＩＩ−ネズミＤＩＩＩ；レーン５−ヒトｕＰＡＲ。
【図７】［００７６］図７は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ＧＦＰ正所性異種移植片の固形腫瘍増殖に対する抗ｕＰＡＲ ｍＡｂの効果を示す線グラフである。試験した各抗体に関して、そしてＩｇＧ４アイソタイプおよびドキソルビシン対照に関して、移植後の時点（移植後の週数）の平均腫瘍体積（ｃｍ^３）を示す。未治療対照腫瘍増殖（未提示）は、ＩｇＧ４アイソタイプ対照と有意には異ならなかった。
【図８】［００７７］図８Ａ〜Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ＧＦＰ正所性異種移植片の原発性腫瘍中で測定される、腫瘍バイオマーカー発現に対する抗ｕＰＡＲモノクローナル抗体の活性を示す棒グラフである。データは、治療群あたり６匹の動物の腫瘍から測定した、染色強度（密度）の平均＋／−標準偏差を表す；ｋｉ−６７（図８ａ）、ＣＤ３１（図８ｂ）、ＭＡＰＫ（図８ｃ）、ｐＭＡＰＫ（図８ｄ）、ＦＡＫ（図８ｅ）、ｐＦＡＫ（図８ｆ）、未治療、ドキソルビシンおよびＩｇＧ４対照を含む。
【図９】［００７８］図９Ａ〜Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−ＧＦＰ正所性異種移植片を持つマウスにおいて、抗ｕＰＡＲ ｍＡｂが転移を阻害する活性を表す棒グラフである。データは、示すような治療群あたり６匹の動物由来の、肺（図９Ａ）または肝臓（図９Ｂ）由来の組織切片における１０の視野中の腫瘍病巣数の平均＋／−標準偏差を表す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合し、そしてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のｕＰＡＲへの結合を阻害する、単離された標的化結合剤。
【請求項２】
Ｕ９３７細胞に対するプラスミノーゲン活性化を９０％より多く阻害する、請求項１の標的化結合剤。
【請求項３】
０．０８μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０で、Ｕ９３７細胞に対するプラスミノーゲン活性化を阻害する、請求項１の標的化結合剤。
【請求項４】
ｕＰＡＲが仲介する、２μｇ／ｍｌの濃度のビトロネクチンへのＵ９３７細胞の細胞接着の８０％より多くを阻害する、請求項１の標的化結合剤。
【請求項５】
１０μｇ／ｍｌの濃度のＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭへの細胞浸潤の９０％より多くを阻害する、請求項１の標的化結合剤。
【請求項６】
哺乳動物における腫瘍増殖および転移を阻害する、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項７】
５００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄでｕＰＡＲに結合する、請求項１〜６のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項８】
４００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄでｕＰＡＲに結合する、請求項１〜６のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項９】
３００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄでｕＰＡＲに結合する、請求項１〜６のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項１０】
２００ピコモル濃度（ｐＭ）未満のＫｄでｕＰＡＲに結合する、請求項１〜６のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項１２】
表１に示すようなモノクローナル抗体のいずれか１つである、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項１３】
モノクローナル抗体２．１９．２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４）である、請求項１２の標的化結合剤。
【請求項１４】
モノクローナル抗体２．６．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５）である、請求項１２の標的化結合剤。
【請求項１５】
モノクローナル抗体４．１８．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６）である、請求項１２の標的化結合剤。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７４、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７５およびＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４７６より選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、標的化結合剤。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれか一項のモノクローナル抗体から誘導可能である、標的化結合剤。
【請求項１８】
完全ヒト・モノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項１９】
完全ヒト・モノクローナル抗体の結合性断片である、請求項１〜１７のいずれか一項の標的化結合剤。
【請求項２０】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖおよびＤａｂからなる群より選択される、請求項１９の標的化結合剤。
【請求項２１】
配列番号２６の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１の標的化結合剤。
【請求項２２】
配列番号２６が、表１５の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを有する、請求項２１の標的化結合剤。
【請求項２３】
配列番号２８の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１の標的化結合剤。
【請求項２４】
配列番号２８が、表１４の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを有する、請求項２３の標的化結合剤。
【請求項２５】
配列番号３０の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１の標的化結合剤。
【請求項２６】
配列番号３０が、表１３の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを有する、請求項２５の標的化結合剤。
【請求項２７】
配列番号３２の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１の標的化結合剤。
【請求項２８】
配列番号３２が、表１２の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを有する、請求項２７の標的化結合剤。
【請求項２９】
配列番号５０の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１の標的化結合剤。
【請求項３０】
配列番号５０が、表１７の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを有する、請求項２９の標的化結合剤。
【請求項３１】
配列番号５２の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１の標的化結合剤。
【請求項３２】
配列番号５２が、表１６の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを有する、請求項３１の標的化結合剤。
【請求項３３】
ｕＰＡＲへの結合に関して、請求項１〜１７の標的化結合剤のいずれか１つと交差競合する、標的化結合剤。
【請求項３４】
請求項１〜１７の標的化結合剤のいずれか１つと同じ、ｕＰＡＲ上のエピトープに結合する、標的化結合剤。
【請求項３５】
ａ）表１８または表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列のいずれか１つ；
ｂ）表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
ｃ）表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
ｄ）表１８に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに表１９に示すようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含むアミノ配列を含む、標的化結合剤。
【請求項３６】
抗体である、請求項２１〜３５のいずれか一項記載の標的化結合剤。
【請求項３７】
完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項３６記載の標的化結合剤。
【請求項３８】
完全ヒト・モノクローナル抗体の結合性断片である、請求項３７記載の標的化結合剤。
【請求項３９】
先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤をコードする、核酸分子。
【請求項４０】
請求項３９の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４１】
請求項４０のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４２】
動物において、悪性腫瘍を治療する方法であって：
悪性腫瘍の治療が必要な動物を選択し；そして
先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤の療法的有効用量を前記動物に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４３】
前記動物がヒトである、請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記標的化結合剤が請求項１３〜１６の標的化結合剤のいずれか１つである、請求項４２の方法。
【請求項４５】
前記悪性腫瘍が：黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭部および頸部癌、中皮腫、肉腫、胆道（胆管）癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、ならびに類表皮癌からなる群より選択される、請求項４２〜４４の方法。
【請求項４６】
ｕＰＡＲが誘導する疾患関連細胞接着および／または浸潤を治療する方法であって：
疾患関連細胞接着および／または浸潤の治療が必要な動物を選択し；そして
請求項１〜３８のいずれか一項の標的化結合剤の療法的有効用量を前記動物に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記動物がヒトである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記標的化結合剤が完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項４６の方法。
【請求項４９】
前記疾患関連細胞接着および／または浸潤が腫瘍転移である、請求項４６〜４８の方法。
【請求項５０】
前記標的化結合剤が請求項１３〜１６の標的化結合剤のいずれか１つより選択される、請求項４６の方法。
【請求項５１】
非新生物疾患を治療する方法であって：
非新生物疾患の治療が必要な動物を選択し；そして
請求項１〜３８のいずれか一項の標的化結合剤の療法的有効用量を前記動物に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項５２】
前記動物がヒトである、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記標的化結合剤が完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項５１の方法。
【請求項５４】
前記標的化結合剤が請求項１３〜１６の標的化結合剤のいずれか１つより選択される、請求項５１の方法。
【請求項５５】
非新生物疾患が、関節炎、アテローム性動脈硬化症およびアレルギー性結膜炎からなる群より選択される、請求項５１〜５４のいずれか一項の方法。
【請求項５６】
請求項１〜３８のいずれか一項の標的化結合剤または該剤の結合性断片、および療法剤を含む、コンジュゲート。
【請求項５７】
療法剤が毒素である、請求項５６のコンジュゲート。
【請求項５８】
療法剤が放射性同位体である、請求項５６のコンジュゲート。
【請求項５９】
療法剤が薬学的組成物である、請求項５６のコンジュゲート。
【請求項６０】
悪性腫瘍の治療用の薬剤の調製における、請求項１〜３８のいずれかの標的化結合剤の使用。
【請求項６１】
ｕＰＡＲが誘導する細胞接着および／または浸潤の治療用の薬剤の調製における、請求項１〜３８のいずれかの標的化結合剤の使用。
【請求項６２】
非新生物疾患の治療用の薬剤の調製における、請求項１〜３８のいずれかの標的化結合剤の使用。
【請求項６３】
薬学的に許容されうるキャリアーと混合された、請求項１〜３８のいずれかの標的化結合剤。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２００９−５３３４４６（Ｐ２００９−５３３４４６Ａ）
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０５４４７（Ｐ２００９−５０５４４７）
【出願日】平成１９年４月９日（２００７．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２０６９３
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ　アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】