乳酸生産方法
【課題】、乳酸生産酵母において効率的に乳酸を生産する乳酸生産方法を提供する。
【解決手段】 乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備え、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法とする。
【解決手段】 乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備え、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｌ−乳酸などの乳酸を、遺伝子組換え酵母を利用して生産することが試みられている。例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母において強力なプロモーターであるピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）プロモーターやアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）プロモーターの制御下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を発現させることが行われている（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、酵母の乳酸生産能をより効果的に利用して安定かつ効率的な工業的乳酸生産には、遺伝子組換え乳酸生産酵母特有の乳酸発酵条件を確立することが重要である。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１６４２９５号
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３（２００３）ｐ．３８−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らによれば、遺伝子組換え乳酸生産酵母は乳酸生産が強力なプロモーターを用いることによって強力に促進されているものの、発酵条件のわずかな変動により一定期間における乳酸収量が変動すること、すなわち、乳酸生産速度が変動するという不都合があることがわかった。発酵速度が低下して一定量の収量を得るための発酵が遅延化すれば、培養工程の生産管理上不確定なファクターが発生することになり好ましくない。また、発酵速度が低下しているにもかかわらず、一定時間で発酵を終了すれば、培養液中に原料たる糖分が残留することになる。残留糖分は、乳酸精製工程における乳酸比率を低下させるとともに、得られた乳酸を重合して得られるポリ乳酸の着色の一因となる。
【０００５】
そこで、本発明では、遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養して乳酸を生産する方法において、効率的に乳酸を生産することを一つの目的とする。また、本発明は、遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養して乳酸を生産する方法において、発酵期間、発酵速度、収率などの発酵特性をコントロールすることを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、遺伝子組換え乳酸生産酵母について、その乳酸生産速度の変動や乳酸収量の変動などの原因を検討したところ、酸素移動容量係数（ｋＬａ）の変動に大きく依存していることを見出した。ｋＬａは、発酵生産における発酵条件の一つであるが、遺伝子組換え乳酸生産酵母においては特に酸素移動容量係数に感受性が高く、低い酸素移動容量係数領域におけるわずかな差によって、乳酸生産特性、すなわち、乳酸生産速度、乳酸収量が異なってくることがわかった。本発明者らは、これらの知見に基づき、培養期間および一定の培養期間内における乳酸収量を容易に制御できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備え、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。この形態においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養することも好ましい一態様であり、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養することも好ましい一態様である。さらに、これらの上記いずれかの乳酸生産方法において、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させることが好ましい。
【０００８】
また、本発明の他の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備え、前記培養工程において酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させる、乳酸生産方法が提供される。この形態においては、前記培養工程は、（ａ）前記乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養する工程と、（ｂ）前記乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養する工程と、を含むことが好ましく、さらに、前記（ａ）工程を実施後に前記（ｂ）工程を実施することが好ましい。
【０００９】
さらにまた、本発明の他の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を通気攪拌下で培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。
【００１０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養液の通気および／または攪拌下、該培養液の溶存酸素量が１ｍｇ／Ｌ以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。この形態においては、前記培養工程における培養液の溶存酸素量が０．５ｍｇ／Ｌ以下であることがより好ましい態様である。
【００１１】
上記いずれかの乳酸生産方法においては、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられていることも好ましい態様である。さらに、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましい態様である。さらに、前記乳酸生産酵母は、ピルビン酸脱炭酸酵素および／またはアルコール脱水素酵素活性が低下されていることが好ましい態様であり、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されていることも好ましい態様である。さらにまた、前記乳酸生産酵母は、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を二以上備えていることも好ましい態様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の乳酸生産方法は、乳酸脱水素酵素活性を有する遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備えている。本発明の第１の形態においては、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養することを特徴としている。酸素移動容量係数（以下、単にｋＬａという。）（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲において、乳酸生産酵母の乳酸生産速度、乳酸収量、乳酸比率（生産物における乳酸の比率）について好ましい特徴を有する。このためこの範囲内のｋＬａで乳酸生産酵母を培養することで、効率的な乳酸生産が可能となる。ｋＬａ（ｈｒ−１）が６未満では、乳酸生産速度が遅くなる傾向があり、ｋＬａ（ｈｒ−１）が３６を超えると乳酸収量が低下する傾向にある。
【００１３】
また、本発明の第２の形態においては、前記培養工程においては、ｋＬａ（ｈｒ−１）を変化させることを特徴としている。前記乳酸生産酵母は、その乳酸生産速度がｋＬａ（ｈｒ−１）に依存する傾向が強いため、ｋＬａ（ｈｒ−１）を調整することで目的とする培養期間での乳酸生産を実現することができる。また、一定の培養期間内において残留糖分を抑制して高い乳酸収量や乳酸比率を得ることができる。
【００１４】
さらに、本発明の第３の形態においては、前記培養工程は、前記乳酸生産酵母を通気攪拌下で培養する工程を備えることを特徴としている。従来この種の酵母や乳酸菌において用いられていない通気攪拌下での培養によって予想外に良好な乳酸収量、乳酸比率を得ることができるとともに、乳酸生産速度も容易に制御できる。
【００１５】
さらに、本発明の第４の形態においては、前記培養工程は、前記乳酸生産酵母を培養液の通気および／または攪拌下、該培養液の溶存酸素濃度が１ｍｇ／Ｌ以下の範囲で培養することを特徴とする。こうした酸素条件で培養することで、予想外に良好な乳酸収量、乳酸比率を得ることができるとともに、乳酸生産速度も容易に制御できる。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１７】
（遺伝子組換え乳酸生産酵母）
（酵母）
本発明の乳酸生産形質転換酵母は、外来の乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する形質転換酵母である。本乳酸生産酵母を得るための酵母としては、アルコール発酵を行う酵母であって、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、などの酵母を挙げることができる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。好ましい酵母の一例としては、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株を例示できる。
【００１８】
なお、本乳酸生産酵母および乳酸生産方法において乳酸とは、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれであってもよい。
【００１９】
（ピルビン酸脱炭酸酵素活性あるいはアルコール脱水素酵素活性の低下）
本乳酸生産酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）活性および／またはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）活性が低下されていることが好ましい。これらの酵素は、酵母のアルコール発酵経路の酵素であり、アルコール発酵を行う酵母がその染色体上に本来的に有している酵素である。ピルビン酸脱炭酸酵素は、いわゆるオートレギュレーション機構を有する酵素であり、ピルビン酸脱炭酸酵素１〜６等がある。これらのうちいずれか１種あるいは２種以上が破壊されていればよいが、好ましくは最も活性が高いあるいは大量に発現されているピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）の活性が低下されていることが好ましい。また、アルコール脱水素酵素においても各種の亜種（ＡＤＨ１〜ＡＤＨ７）があるが、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）が大量に発現されている。したがってアルコール脱水素酵素１の活性が低下されていることが好ましい。
【００２０】
ピルビン酸脱炭酸酵素活性および／またはアルコール脱水素酵素活性が低下されているとは、人工的な操作によりあるいはスクリーニングによって、野生型よりも低い活性の該酵素が生産されているかあるいは該酵素の生産量が野生型よりも少ないものであることが好ましい。このような酵素活性の低下のための人工的操作としては、この酵素遺伝子を破壊（ノックアウト）することが好ましい。染色体上の特定遺伝子を破壊する手法は、当業者において周知である。
【００２１】
（乳酸脱水素酵素）
本乳酸生産酵母は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ＬＤＨ遺伝子）を保持している。ＬＤＨ遺伝子は、酵母においては外来性である。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、ラクトバシルス・ヘルベティカス、ラクトバシルス・カゼイ、クルイベロマイセス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルッキ、シゾサッカロミセス・ポンビ、リゾプス・オリゼ、Ｂ．メガテリウムなどの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。例えば、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるＬＤＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１に記載される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。したがってＬＤＨ遺伝子として、これらのいずれかのＬＤＨをコードするＤＮＡを用いることができる。本乳酸生産酵母は、ＬＤＨ遺伝子を少なくとも一つ、好ましくは二以上保持している。より好ましくは三以上保持している。さらに好ましくは四つ以上保持している。
【００２２】
（ＰＤＣプロモーター）
ＬＤＨ遺伝子は、強力なプロモーター活性を有するプロモーターの制御下に発現可能に備えられていることが好ましい。例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター（ＰＤＣプロモーター）の制御下に発現可能に備えられていることが好ましい。なかでも、十分に強力なプロモーターであるＰＤＣ１プロモーターを用いることが好ましい。より好ましくは、サッカロマイセス属（好ましくはセレビシエ）のＰＤＣ１プロモーターである。
【００２３】
例えば、ＰＤＣ１プロモーターとしては、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの他、同等の機能を有する限り、該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡ、あるいは、該ＤＮＡとの相同性が７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるＤＮＡを用いることができる。すなわち、酵母染色体上のＰＤＣ１プロモーターが、同一ではないが同等の機能を有するこれらのプロモーター活性を有するＤＮＡによって相同組換え等を介して置換されていてもよい。
【００２４】
本明細書においてストリンジェントな条件とは、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いＤＮＡを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約４２℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、５０％ホルムアミド存在下で約６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【００２５】
また、本明細書において、ＤＮＡなどの核酸の相同性については、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ），ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ＳＩＴ／ＦＡＳＴＡ．ｈｔｍｌ）などによって決定することができる。
【００２６】
（他のプロモーター）
また、ＬＤＨ遺伝子は、ＡＤＨ遺伝子のプロモーター（ＡＤＨプロモーター）を初めとする他の各種プロモーターの制御下に発現可能に備えることもできる。ＡＤＨは既に述べたようにアルコール発酵経路においてＰＤＣのすぐ後段の酵素である。ＡＤＨプロモーターとしては、十分に強力なプロモーターであるＡＤＨ１プロモーターを用いることが好ましい。
【００２７】
また、この他、ＬＤＨ遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビジエの高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）の遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ遺伝子）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）、ガラクトース１リン酸キナーゼ１遺伝子（ＧＡＬ１遺伝子）および転写エンハンサー因子１遺伝子（ＴＥＦ１遺伝子）のプロモーターの制御下に発現可能に導入することもできる。
【００２８】
なお、これらの他のプロモーターは、酵母の染色体上における各プロモーターと同等の機能を有する限り、該プロモーターのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡ、あるいは、ＡＤＨ１プロモーターとの相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるＤＮＡを用いることができる。
【００２９】
ＬＤＨ遺伝子は、酵母染色体外で維持されるプラスミドやＹＡＣなどにおいて保持されていてもよいが、好ましくは酵母染色体に組み込まれて保持される。
【００３０】
ＬＤＨ遺伝子は、好ましくは、酵母染色体において上記各種プロモーターの制御下に発現可能に備えられている。したがって、上記各種プロモーターとＬＤＨ遺伝子とを含む発現カセットを構築して、酵母染色体に導入することができる。また、ＬＤＨ遺伝子は、酵母染色体上にあるこれらの各種プロモーターの制御下にある内在性遺伝子を破壊するとともに該プロモーターの制御下に発現可能に組み込まれることもできる。また、これらの各種プロモーターの制御下に発現可能に連結したＬＤＨ遺伝子を、ＰＤＣ遺伝子および／またはＡＤＨ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込みこともできる。
【００３１】
さらに、ＰＤＣプロモーターやＡＤＨプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に備えるようにするには、酵母染色体におけるこれらのプロモーターの本来の位置においてこれらのプロモーターによって制御可能であってかつＰＤＣ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込まれていることが好ましい。こうすることで、ＰＤＣ活性やＡＤＨ活性を低下させてアルコール発酵を抑制できるとともに、本来ＰＤＣ遺伝子発現に作用していた強力なＰＤＣプロモーターやＡＤＨプロモーター活性をＬＤＨ遺伝子発現にスイッチさせることができる。破壊されそしてそれらのプロモーターがＬＤＨ遺伝子の発現に利用される遺伝子は、好ましくはＰＤＣ１遺伝子やＡＤＨ１遺伝子である。最も強力なＰＤＣ１プロモーターによって制御されるＰＤＣ１遺伝子が破壊されてＬＤＨ遺伝子が代わりに発現されることで効果的にＰＤＣ活性低下とＬＤＨ活性発現とを実現できる。
【００３２】
なお、ＰＤＣ１遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である（特開２００３−１６４２９５号）。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が発現するため、例えば、酵母のＰＤＣ１遺伝子が破壊されたとしても、酵母の生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来ＤＮＡを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。
【００３３】
なお、明らかなように、ＰＤＣプロモーター、ＡＤＨプロモーター及び他のプロモーターのＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、化学的に合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３４】
以上のように、本乳酸生産酵母においては、上記したＰＤＣ活性及びＡＤＨ活性を低下させる態様、各種のＬＤＨ遺伝子発現態様を各種組み合わせて採ることができる。好ましい乳酸生産酵母は、染色体上のＰＤＣ（好ましくはＰＤＣ１）遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に備えている。同時に、染色体上のＡＤＨ（好ましくはＡＤＨ１）遺伝子が破壊されていてもよい。また、この態様において、破壊された該ＡＤＨ（好ましくはＡＤＨ１）遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に備えることもできる。こうした乳酸生産酵母においては、好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは６以上、最も好ましくは８以上のＬＤＨ遺伝子を染色体上に備えている。
【００３５】
本乳酸生産酵母を取得するには、宿主酵母に対して、ＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子の破壊を行うとともに、ＬＤＨ遺伝子を発現可能に導入して形質転換することが好ましい。酵母に対してこのような遺伝子修飾を行うには、組換え用ＤＮＡ構築物を利用する。組換え用ＤＮＡ構築物は、特に限定しないで、線状等のＤＮＡ断片、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）等に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。
【００３６】
ＰＤＣ遺伝子あるいはＡＤＨ遺伝子の破壊のためのＤＮＡ構築物は、これらの遺伝子部位に導入して遺伝子を破壊するために相同組換え用の配列を備えることができる。相同組換え用ＤＮＡ配列は、破壊しようとするＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子であるターゲット部位あるいはその近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡ配列は、一つのターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも１箇所に相同である１の配列を有しており、好ましくは、ターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも２箇所にそれぞれ相同な配列を備えている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡ配列を、染色体上のターゲット遺伝子の上流側と下流側のＤＮＡとのそれぞれに相同なＤＮＡ配列とし、これらの相同組換え用ＤＮＡ配列の間に遺伝子を破壊するためのＤＮＡを備えるＤＮＡ構築物を酵母染色体に相同組換えにより導入することでターゲット部位の遺伝子を破壊することができる。
【００３７】
このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用ＤＮＡの選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用ＤＮＡを選択して相同組換え用ＤＮＡ構築物を構成することができる。例えば、ＰＤＣプロモーターの少なくとも一部と、ＰＤＣ遺伝子あるいはターミネーターの少なくとも一部とにそれぞれ相同なＤＮＡ配列を相同組換え用ＤＮＡ配列として用いることができる。同様に、ＡＤＨプロモーターの少なくとも一部とＡＤＨ遺伝子あるいはターミネーターの少なくとも一部とにそれぞれ相同なＤＮＡ配列を相同組換え用ＤＮＡ配列として用いることができる。
【００３８】
ＰＤＣ遺伝子を破壊するＤＮＡ構築物には、ＰＤＣ遺伝子をターゲットとするための相同組換え用ＤＮＡとともにＰＤＣ遺伝子を置換可能な形態でＬＤＨ遺伝子を有することができる。このようなＤＮＡ構築物によれば、ＰＤＣ遺伝子の破壊とともにＰＤＣプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に導入できる。
【００３９】
また、ＰＤＣ遺伝子を破壊するとともに、破壊した該ＰＤＣ遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を導入することもできるが、相同組換えにより染色体上のＰＤＣプロモーターに替えて同等のプロモーターを導入することもできる。例えば、既に述べたＰＤＣ１プロモーターのホモログ等である。
【００４０】
なお、使用するＤＮＡ構築物には、ＣＹＣ１ターミネーターやＴＤＨ３ターミネーターなどのターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性Ｇ４１８遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。
【００４１】
（乳酸の生産方法）
本乳酸生産酵母を適当な炭素源の存在下で培養することにより、培養物中にＬＤＨ遺伝子の発現産物である乳酸を生成させることができる。本乳酸生産方法によれば、培養系から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。
【００４２】
本発明の乳酸生産酵母の培養にあたっては、酵母の種類に応じて培養方法や培養条件を選択することができる。例えば、ジャーファーメンターを用いた液体培養法を挙げることができ、回分培養、半回分培養などの培養形式を採用できる。また、酵母を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００４３】
培養温度は、用いる乳酸生産酵母の生育可能な範囲で選択することができ、例えば、約２０℃〜約４０℃とすることができる。また、培地ｐＨは、ｐＨは２．０〜６．０に保持することが好ましく、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。
【００４４】
また、培養期間は、他の培養条件、特に、後述するようにｋＬａ（ｈｒ−１）によって大きく異なるが６〜７２時間程度とすることが好ましく、より好ましくは４８時間程度とする。
【００４５】
本乳酸生産方法は、乳酸生産酵母を通気攪拌下で、あるいは微好気状態よりも好気状態で培養することが好ましい。一般に、乳酸菌による乳酸発酵や酵母によるエタノール発酵では、通気を行わない微好気状態で発酵を行う。これに対して、本方法では、酵母による発酵生産においては従来用いられていない通気攪拌によって得られる培養液中の酸素条件を用いることを特徴としている。すなわち、微好気状態よりも好気的な酸素条件で発酵を行うことを特徴としている。乳酸生産酵母については、このような酸素条件下において初めて効率的な乳酸発酵が実現される。特に、遺伝子組換え乳酸生産酵母、なかでも、ＰＤＣ活性が低下するなどアルコール発酵が抑制された乳酸生産酵母あるいはＰＤＣ遺伝子のプロモーター下の制御下においてＬＤＨ遺伝子が発現可能に備えられた乳酸生産酵母においては、理由は明らかではないが、こうした酸素条件において初めて実用的な乳酸生産特性を得ることができる。なお、本生産方法においては、微好気状態よりも好気的な状態が得られる限り、通気および攪拌の双方を行うことのほか、通気および攪拌のうち一方のみを行ってもよい。
【００４６】
本方法の培養工程において得ようとする酸素条件は、使用する乳酸生産酵母が乳酸発酵可能なあるいは乳酸発酵を促進可能な程度であればよい。例えば、かかる酸素条件は、例えば、ｋＬａ（ｈｒ−１）として表現することができる。ｋＬａ（ｈｒ−１）は、通気攪拌培養時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で表すことができる。また、ｋＬａ（ｈｒ−１）（以下、単にｋＬａと略す。）は、通気攪拌培養時において、気相から供給される酸素と微生物によって消費される酸素とによって表される培養液中の酸素の収支式（２）において用いられる（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
【００４７】
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊−Ｃ） （１）
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊−Ｃ）−Ｑ02×Ｘ （２）
ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｘ：菌体濃度（ｇ／Ｌ）、Ｑ02：比呼吸速度（ｍｇＯ２／（ｇ・ｃｅｌｌ・ｈ）ｋＬａ：酸素移動容量係数（ｈｒ−１）である。
【００４８】
通気攪拌培養装置におけるｋＬａは、亜硫酸酸化法(バッチ法・連続法)、気体置換法（Gassing out法(スタティック法、ダイナミック法)）、排気ガス分析法などで測定できる（前掲生物工学実験書、ｐ３１１等）。以下に、気体置換法（ダイナミック法）によるｋＬａの測定の一例を示す。通気攪拌培養装置に水あるいは使用する培地をいれ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換するかあるいは亜硫酸ナトリムをほぼ飽和濃度に達する程度に加えることなどにより脱酸素するかして該液体の酸素濃度を低下させる。次いで、かかる液体中に溶存酸素濃度電極を差し込み、通気速度、攪拌速度および温度を設定して所定の通気攪拌下での溶存酸素の上昇過程を測定する。ここで、式（１）より、下記式（３）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−ｋＬａ×ｔ （３）
【００４９】
本発明においては、いくつかの通気条件と攪拌条件とを組み合わせた通気攪拌条件を設定して、これらの各種通気攪拌条件とｋＬａとの関係を予め求めた上、使用する通気攪拌培養装置についてｋＬａが６以上３６以下となる通気攪拌条件を予め設定することが好ましい。各種の通気攪拌条件に対するｋＬａは、各通気攪拌条件に設定した通気攪拌培養装置を上記記載の方法に従って運転し、溶存酸素濃度の上昇過程と平衡溶存酸素濃度とを測定することで求めることができる。
【００５０】
ｋＬａが６以上３６以下の範囲においては、乳酸生産酵母の乳酸生産速度、乳酸収量および残留糖分について好ましい培養特性を得ることができるため、安定して効率的な乳酸生産が実現できる。また、このｋＬａの範囲内で変化させて培養工程を実施することで、所望の培養期間で乳酸収量や残留糖分の好ましいレベルを確保して培養を終了させることができる。また、乳酸生産酵母はｋＬａがこの範囲内で低い場合には、乳酸生産速度が遅くなる傾向があり、ｋＬａが高い場合には、乳酸生産速度が速くなる傾向がある。したがって、例えば、比較的長い培養期間を設定する場合には、このｋＬａ範囲において相対的に低いｋＬａを設定することができ、比較的短い培養期間を設定する場合には、相対的に高いｋＬａを設定することができる。
【００５１】
例えば、ｋＬａが１６以下で培養することにより、最終的な乳酸収量を増大させることができる。ｋＬａが１６以下の場合には、おおよそＬＤＨ遺伝子のコピー数によらずに良好な最終乳酸収量を得ることができることが本発明者らより確認されている。また、このような傾向はｋＬａが小さいほど顕著である。さらに、ｋＬａが小さいほど乳酸比率が高くなる傾向がある。一方、ｋＬａが１６超で培養することにより、乳酸生産速度を向上させることができる。乳酸生産速度を向上させることで、培養工程時間を制御することが可能となる。より顕著に乳酸生産速度を向上させるには、ｋＬａを１８以上とすることが好ましく、ｋＬａを２０以上とすることがより好ましく、ｋＬａが２２以上であることが一層好ましい。
【００５２】
培養工程においては、ｋＬａを一定とすることもできるが、培養工程においてｋＬａを変化させることもできる。すなわち、予め異なるｋＬａによる培養期間を設定しておくこともできるし、ｋＬａを一定に設定して開始した培養工程における乳酸濃度や糖分濃度のモニタリング結果に応じて、異なるｋＬａの培養期間を新たに追加設定したりもできる。さらに、予め異なるｋＬａの培養工程を設定しておいてもよいし、こうした培養工程においても培養のモニタリング結果に応じてそれぞれの培養工程時間を変化させてもよい。このような培養工程におけるｋＬａの調整により、都合のよい培養工程時間内に好ましい乳酸収量や乳酸比率を得ることができる。
【００５３】
例えば、ｋＬａ一定の培養工程におけるモニタリングにおいて所定時点における残留糖分および／または乳酸濃度が予定値を下回る場合には、ｋＬａをより高く、好ましくは１６超、さらに好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上、一層好ましくは２２以上に変化させることで、培養工程時間を大きく延長することなく好ましい残留糖分および／または乳酸収量を確保できる。
【００５４】
培養工程には、ｋＬａが１６以下の第１の培養期間と、ｋＬａが１６超の第２の培養期間とを備えることができる。ｋＬａが１６以下であるとき、ｋＬａが１６超の範囲内にあるときよりも乳酸生産酵母の乳酸生産速度は遅いがその速度が持続される傾向にあり、最終的な乳酸収量や乳酸比率を向上させることができる。ｋＬａは１４以下であることがより好ましく、さらに好ましくは１１以下である。ｋＬａが１４以下さらに１１以下とすることでかかる傾向が顕著になるからである。なお、第１の培養期間におけるｋＬａは６以上であれば、乳酸生産速度が遅くなりすぎることがないため好ましい。一方、ｋＬａが１６超の範囲にあるとき、最終的な乳酸収量が低下する傾向にはあるものの乳酸生産速度は早い傾向にあるため、第２の培養期間を設定することで、培養期間を短縮することができる。ｋＬａは１８以上であることがより好ましく、さらに好ましくは２０以上であり、一層好ましくは２２以上である。なお、第２の培養期間における上限は３６以下であれば、乳酸収量を大きく低下させることがない。
【００５５】
このように、異なるｋＬａ領域での培養期間をそれぞれ備えることで、所望の培養期間、高い乳酸収量および乳酸比率、低い残留糖分を適宜得ることができる。異なるｋＬａ領域での培養工程を組み合わせる場合、より低いｋＬａ領域の培養工程を実施し、より高い領域の培養工程を実施することが好ましい。こうすることで、乳酸収量と乳酸生産速度の双方のバランスを容易に図ることができる。例えば、上記した第１の培養期間を実施後に上記第２の培養期間を実施することが好ましい。こうした順序で異なるｋＬａの培養期間を実施することで、培養期間、乳酸収量、乳酸比率および残留糖分等について好ましい特性を得ることができるとともに、培養工程の状況変化に対応することが容易となる。なお、異なるｋＬａ領域の培養工程を備える場合、２種のｋＬａによる各培養工程を備えるほか、３種以上のｋＬａの各培養工程を備えることもできる。
【００５６】
また、本培養工程において得ようとする酸素条件は、乳酸生産酵母の培養工程における培養液の溶存酸素量として表現することもできる。乳酸生産酵母の培養工程においては、溶存酸素量は、１ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましい。１ｍｇ／Ｌ以下であると乳酸の収量を一定以上に確保できるからである。より好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以下である。０．５ｍｇ／Ｌ以下であると、高い乳酸収率が得られるからである。なお、こうした溶存酸素濃度下においても微好気状態よりも好気状態であることが好ましい。こういった酸素条件は、培養液を通気のみでもまた攪拌のみでも得られることがあり、これらを双方組み合わせることによっても得ることができる。培養液の溶存酸素量は、培養工程全体を通じて上記濃度以下であることが好ましい。また、溶存酸素量の測定は、培養槽の酸素条件を代表できるような測定位置および測定個所における測定値から得られる数値を用いることが好ましい。
【００５７】
培養終了後、培養物から乳酸あるいはその塩を分離するには、通常の乳酸精製手段を使用することができる。例えば、酵母内に生産された場合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕などに細胞を破壊して,遺伝子産物を細胞と分離することができる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加する。また、菌体外に乳酸が生産された場合には、この培養液等を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去する。
【００５８】
これらの粗抽出画分に対しては、従来公知の各種精製分離法等を利用して、乳酸を精製することができる。また、必要に応じて、当該粗抽出画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。
【実施例１】
【００５９】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。なお、以下の実施例においては、ｋＬａは特に断りのない限りｋＬａ（ｈｒ−１）を意味している。
【００６０】
（乳酸生産形質転換酵母の作製）
ＬＤＨ遺伝子（ウシＬ−ＬＤＨ由来）を導入したサッカロマイセス・セレビシエを、本発明者らが既に構築したｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクター（特開２００３−２５９８７８号公報に記載）を用いて調製した。本ベクターは、酵母の１２番染色体上のＰＤＣ１遺伝子をターゲットとする染色体導入型ベクターであり、染色体上のＰＤＣ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列とＰＤＣ１遺伝子の下流側との相同組換え部位とを有している（図１）。このベクターが染色体上のＰＤＣ１遺伝子に導入されれば、ＰＤＣ１プロモーターの制御下においてＬＤＨ遺伝子が発現されることになる。なお、酵母への遺伝子導入法は、Ｉｔｏらの手法（Ito, H., Y. Fukuda, K.Murata and A. Kimura, Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations J. Bacteriol. Vol.153, p163-168）に従った。すなわち、宿主である酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録されているサッカロマイセス。セレビジエ菌株）のトリプトファン合成能を欠損した株を、１０ｍｌＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌およびＴＥバッファによる洗浄を行い、次に、０．５ｍｌＴＥバッファと０．５ｍｌ ０．２Ｍの酢酸リチウムを加え、３０℃にて１時間の振とう培養を行った後に、染色体導入型ベクターであるｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣＢベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｃＩ（いずれも宝酒造）で処理して、これを添加した。
【００６１】
本酵母懸濁液を３０℃で３０分振とう培養後、１５０μｌの７０％ポリエチレングリコール４０００（和光純薬）を加え、よく攪拌した。さらに、３０℃にて１時間振とう培養した後、４２℃にて５分間ヒートショックを与え、菌体を洗浄した後、２００μｌの水に懸濁したものをトリプトファン選択培地に塗沫した。
【００６２】
得られたコロニーを新たなトリプトファン選択培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株について、遺伝子導入の有無をＰＣＲ解析によって確認した。安定したトリプトファン合成能を有し、かつ、これらのプライマーのもとでＰＣＲ増幅が確認できたものを、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が適切に導入された形質転換株（２コピー体）と判断した。この２コピー体は、図２に示すように、酵母の１２番染色体のＰＤＣ１遺伝子を上記染色体導入型ベクターのＤＮＡにて置換したものである。
【００６３】
本実施例では、さらに、図２に示す酵母染色体（７番染色体および１２番染色体）の所定位置への染色体導入型ベクターを、上記ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣＢベクターに準じてそれぞれ構築し、既に得られた２コピー体に対して導入し形質転換を行い、６コピー体、８コピー体および１０コピー体を作製した。
【実施例２】
【００６４】
（発酵試験１）
通気攪拌式の培養装置（千代田化工社製ＴＦＬシリーズ、ジャー容量１Ｌ）における各種の通気攪拌条件において、回分法にて発酵試験を行うとともに、各通気攪拌条件に対するｋＬａを、窒素ガスを用いるダイナミック法により求めた。発酵試験は、表１に示す通気攪拌条件下で行った。
【００６５】
実施例１で作製したＴ１６７−１０Ｂ株（ＬＤＨ８コピー体）を、ＹＰＤ培地１００ｍｌバッフル付き三角フラスコを８０ｒｐｍで２４時間振とう培養後、菌体を遠心分離により回収し前培養菌体とした。ケーンジュースを蒸留水で希釈して糖濃度を１５ｗｔ％としたケーンジュース培地（１２１℃、３０分で加熱滅菌）５００ｍＬに、この前培養菌体を初発菌体濃度がＯＤ６００＝１〜３となるように接種し、温度３２℃に設定し表１に示す各種の通気攪拌条件下で培養した。なお、培養中、中和剤としてアンモニア水を用いて随時ｐＨを４．８〜５．４の間に調整した。培養開始後２４時間、３６時間および４８時間で培養液を採取して、乳酸濃度を測定した。乳酸濃度の測定は、酵素センサー（王子計測機器、バイオセンサＢＦ−４）を用いて行った。
【００６６】
発酵試験後、溶存酸素電極を用いるダイナミック法により各発酵条件におけるｋＬａを測定した。まず、発酵試験に採用した同一の通気攪拌条件および温度条件下で水５００ｍＬを投入し、溶存酸素電極（メトラートレド製Ｔタイプ）を挿入し、窒素ガスを十分に水中に吹き込んで電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行い、窒素ガスから空気に通気ガスを変更して培養装置の運転を開始し、溶存酸素濃度の経時変化を測定してｋＬａを求めた。得られたｋＬａを併せて表１に示す。また、ｋＬａを横軸に乳酸濃度を縦軸にしてプロットした結果を図３に示す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
図３に示すように、ｋＬａが高い場合に乳酸生産速度は速くなるが、ｋＬａが３６．０を超えると最終的な乳酸収量が低下する傾向にあった。また、ｋＬａが低い場合には初期の乳酸生産速度が遅く、ｋＬａが７．２より小さくなるとその傾向が強かった。さらに、ｋＬａが６．０以上で３６．０以下においては試験した培養期間においてはおおよそ安定した乳酸収量が得られ残留糖分もほとんどないが、ｋＬａが１８．０程度であるとき最も生産性が高かった。
【００６９】
以上のことから、乳酸生産酵母は、４０以下の低いｋＬａ領域における一定のｋＬａ範囲内において好ましい乳酸生産特性を発揮することがわかった。一方、このｋＬａ範囲内においても、乳酸生産速度が大きく変化し、一定の培養期間内における乳酸収量や残留糖分に大きく影響することがわかった。
【実施例３】
【００７０】
（発酵試験２）
次に、同一のｋＬａとなる各種の通気攪拌条件を設定して発酵試験を行い、乳酸生産酵母のｋＬａ依存性を確認した。ｋＬａと通気攪拌条件との関係を表２に示す。発酵試験は、表２に示す各種の通気攪拌条件を用いて行う以外は発酵試験１と同様に行った。結果を図４に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
図４に示すように、ｋＬａが１８となる各種の通気攪拌条件で発酵試験を行った結果は、通気攪拌条件にかかわらずほぼ同一の乳酸生産特性を示した。これらの結果は、乳酸生産酵母の発酵特性が、通気や攪拌のそれぞれに依存せず、これらについて設定された条件によって得られる単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力に依存するものであることを支持した。
【実施例４】
【００７３】
（発酵試験３）
本発酵試験では、乳酸生産酵母として実施例１で作製したＰＤＣ１ｐ−ＬＤＨ２コピー体、６コピー体および１０コピー体を用いて、これらの各種乳酸生産酵母に対して各種のｋＬａ（６、１１、１６、２２および２９）を設定して乳酸発酵を行い、ＬＤＨコピー数あるいはｋＬａと発酵特性との関係を確認した。発酵試験は、これらの乳酸生産酵母を用い、発酵用培地として初発糖濃度が１０ｗｔ％となるように蒸留水で希釈したケーンジュース培地を用いて所定のｋＬａで最大７２時間まで発酵を行った以外は、発酵試験１と同様に行った。なお、乳酸濃度に加えて、エタノール濃度およびグルコース濃度を、酵素センサー（王子計測機器、バイオセンサＢＦ−４）を用いて測定した。なお、ｋＬａと通気攪拌条件との関係は以下のとおりである。
【００７４】
ｋＬａ 通気量（Ｌ／分） 攪拌速度（ｒｐｍ）
６ ０．３ ６０
１１ ０．３ １５０
１６ ０．３ ２３０
２２ ０．３ ２７０
２９ ０．３ ２９０
【００７５】
発酵４８時間までの最大乳酸収量と該最大乳酸収量時におけるエタノール量、グルコース量および乳酸比率（％）（ただし、乳酸比率（％）＝乳酸濃度／（乳酸濃度＋２×エタノール濃度）×１００とした。）を表３〜表５に示し、各種乳酸生産酵母についての最大７２時間までの乳酸生産量のグラフを図５〜図７に示す。
【００７６】
【表３】
【表４】
【表５】
【００７７】
表３〜表５および図５〜図７に示すように、ＬＤＨのコピー数の観点からは、コピー数が多いほど乳酸生産速度は低下するが、乳酸収量や乳酸比率は増大する傾向にあった。また、ＬＤＨコピー数によりｋＬａに対する感受性が異なり、ＬＤＨコピー数が多いほど、ｋＬａによって乳酸生産速度が大きく変化する傾向があることわかった。すなわち、ＬＤＨコピー数が多くなるほど、ｋＬａが大きいときに乳酸生産速度が向上する傾向にあり、ｋＬａが小さいときに乳酸生産速度が低下する傾向にあった。一方、ｋＬａの観点からは、ｋＬａが小さいほど、最終的な乳酸収量および乳酸比率が増大する傾向があることがわかった。以上のことから、乳酸生産酵母は、乳酸生産速度、乳酸収量および乳酸比率についてｋＬａに影響を受けるとともに、これらの影響は乳酸収量の大きいＬＤＨのマルチコピー体においてより大きいことがわかった。したがって、乳酸生産酵母においては所望の乳酸生産特性を得るにはｋＬａの制御が有効であり、特にＬＤＨのマルチコピー体については、ｋＬａの制御によって発酵時間などのプロセス管理を容易に行いうることがわかった。
【実施例５】
【００７８】
（発酵試験４）
本発酵試験は、ｋＬａを培養工程において変化させたときの乳酸生産特性に与える影響を確認した。ｋＬａが１０．８の通気攪拌条件（通気量：０．３Ｌ／分、攪拌速度：１５０ｒｐｍ）で発酵を開始し、６時間経過後および１２時間経過後にｋＬａを１８．０（通気量：０．３Ｌ／分、攪拌速度：２４０ｒｐｍ）に切り換えて最大５５時間培養した点、およびケーンジュースを初発糖濃度１５ｗｔ％とした培地を用いる点以外は、発酵試験１と同様に発酵試験を行った。結果を図８に示す。
【００７９】
図７に示すように、ｋＬａを１８．０に切り換えた以降において乳酸生産速度は明らかに速くなり、糖分を消費するまでの発酵時間を５〜１０時間早めることができた。すなわち、培養工程の途中においてｋＬａを切り換えしたときにおいても、切り換え後のｋＬａに応じた乳酸生産酵母の乳酸生産特性が発現されることがわかった。このことから、培養工程中にｋＬａを変化させて乳酸生産速度を調整することにより、一定以上の乳酸収量や乳酸比率を確保しつつ乳酸生産酵母を用いた乳酸生産工程の培養期間を調整できることがわかった。以上のことは、乳酸生産速度がｋＬａに高度に依存していることを支持しており、同時に、ｋＬａの制御あるいは培養工程におけるｋＬａの変化が、乳酸生産速度を調整して糖を消費するまでの発酵終了時間を制御するのに有効であることを支持している。
【００８０】
（発酵試験５）
本発酵試験では、乳酸生産酵母として実施例１で作製したＰＤＣ１ｐ−ＬＤＨ１０コピー体を用いて、この乳酸生産酵母に対して２種類のｋＬａ（１６および２９）を設定して乳酸発酵を行い、発酵中、溶存酸素電極（メトラートレド製Ｔタイプ）を用いて溶存酸素濃度を測定した。発酵試験は、所定のｋＬａで発酵を行った以外は、発酵試験１と同様に行った。各ｋＬａ条件での発酵液の乳酸濃度と溶存酸素濃度についての測定結果を図９および図１０に示す。
【００８１】
図９および図１０に示すように、溶存酸素濃度は、発酵試験を通じて１ｐｐｍ以下であり、乳酸生産量に優れるｋＬａ＝１６の条件においては、発酵試験を通じて０．５ｐｐｍ以下であった。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構造を示す図。
【図２】実施例１で作製したＬＤＨ遺伝子導入酵母である２コピー体、６コピー体、８コピー体および１０コピー体における染色体上のＬＤＨ遺伝子導入部位を示す図。
【図３】ｋＬａを横軸に乳酸濃度を縦軸にしてプロットしたグラフ図。
【図４】ｋＬａ（１８）一定の異なる通気攪拌条件下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図５】ＬＤＨ２コピー体について異なるｋＬａ下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図６】ＬＤＨ６コピー体について異なるｋＬａ下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図７】ＬＤＨ１０コピー体について異なるｋＬａ下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図８】培養工程中にｋＬａを変化させた場合の乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図９】発酵試験５における溶存酸素濃度の変化を示す図。
【図１０】発酵試験５における乳酸濃度の変化を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｌ−乳酸などの乳酸を、遺伝子組換え酵母を利用して生産することが試みられている。例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母において強力なプロモーターであるピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）プロモーターやアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）プロモーターの制御下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を発現させることが行われている（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、酵母の乳酸生産能をより効果的に利用して安定かつ効率的な工業的乳酸生産には、遺伝子組換え乳酸生産酵母特有の乳酸発酵条件を確立することが重要である。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１６４２９５号
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３（２００３）ｐ．３８−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らによれば、遺伝子組換え乳酸生産酵母は乳酸生産が強力なプロモーターを用いることによって強力に促進されているものの、発酵条件のわずかな変動により一定期間における乳酸収量が変動すること、すなわち、乳酸生産速度が変動するという不都合があることがわかった。発酵速度が低下して一定量の収量を得るための発酵が遅延化すれば、培養工程の生産管理上不確定なファクターが発生することになり好ましくない。また、発酵速度が低下しているにもかかわらず、一定時間で発酵を終了すれば、培養液中に原料たる糖分が残留することになる。残留糖分は、乳酸精製工程における乳酸比率を低下させるとともに、得られた乳酸を重合して得られるポリ乳酸の着色の一因となる。
【０００５】
そこで、本発明では、遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養して乳酸を生産する方法において、効率的に乳酸を生産することを一つの目的とする。また、本発明は、遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養して乳酸を生産する方法において、発酵期間、発酵速度、収率などの発酵特性をコントロールすることを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、遺伝子組換え乳酸生産酵母について、その乳酸生産速度の変動や乳酸収量の変動などの原因を検討したところ、酸素移動容量係数（ｋＬａ）の変動に大きく依存していることを見出した。ｋＬａは、発酵生産における発酵条件の一つであるが、遺伝子組換え乳酸生産酵母においては特に酸素移動容量係数に感受性が高く、低い酸素移動容量係数領域におけるわずかな差によって、乳酸生産特性、すなわち、乳酸生産速度、乳酸収量が異なってくることがわかった。本発明者らは、これらの知見に基づき、培養期間および一定の培養期間内における乳酸収量を容易に制御できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備え、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。この形態においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養することも好ましい一態様であり、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養することも好ましい一態様である。さらに、これらの上記いずれかの乳酸生産方法において、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させることが好ましい。
【０００８】
また、本発明の他の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備え、前記培養工程において酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させる、乳酸生産方法が提供される。この形態においては、前記培養工程は、（ａ）前記乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養する工程と、（ｂ）前記乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養する工程と、を含むことが好ましく、さらに、前記（ａ）工程を実施後に前記（ｂ）工程を実施することが好ましい。
【０００９】
さらにまた、本発明の他の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を通気攪拌下で培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。
【００１０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、乳酸生産方法であって、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養液の通気および／または攪拌下、該培養液の溶存酸素量が１ｍｇ／Ｌ以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。この形態においては、前記培養工程における培養液の溶存酸素量が０．５ｍｇ／Ｌ以下であることがより好ましい態様である。
【００１１】
上記いずれかの乳酸生産方法においては、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられていることも好ましい態様である。さらに、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましい態様である。さらに、前記乳酸生産酵母は、ピルビン酸脱炭酸酵素および／またはアルコール脱水素酵素活性が低下されていることが好ましい態様であり、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されていることも好ましい態様である。さらにまた、前記乳酸生産酵母は、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を二以上備えていることも好ましい態様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の乳酸生産方法は、乳酸脱水素酵素活性を有する遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、を備えている。本発明の第１の形態においては、前記培養工程においては、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養することを特徴としている。酸素移動容量係数（以下、単にｋＬａという。）（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲において、乳酸生産酵母の乳酸生産速度、乳酸収量、乳酸比率（生産物における乳酸の比率）について好ましい特徴を有する。このためこの範囲内のｋＬａで乳酸生産酵母を培養することで、効率的な乳酸生産が可能となる。ｋＬａ（ｈｒ−１）が６未満では、乳酸生産速度が遅くなる傾向があり、ｋＬａ（ｈｒ−１）が３６を超えると乳酸収量が低下する傾向にある。
【００１３】
また、本発明の第２の形態においては、前記培養工程においては、ｋＬａ（ｈｒ−１）を変化させることを特徴としている。前記乳酸生産酵母は、その乳酸生産速度がｋＬａ（ｈｒ−１）に依存する傾向が強いため、ｋＬａ（ｈｒ−１）を調整することで目的とする培養期間での乳酸生産を実現することができる。また、一定の培養期間内において残留糖分を抑制して高い乳酸収量や乳酸比率を得ることができる。
【００１４】
さらに、本発明の第３の形態においては、前記培養工程は、前記乳酸生産酵母を通気攪拌下で培養する工程を備えることを特徴としている。従来この種の酵母や乳酸菌において用いられていない通気攪拌下での培養によって予想外に良好な乳酸収量、乳酸比率を得ることができるとともに、乳酸生産速度も容易に制御できる。
【００１５】
さらに、本発明の第４の形態においては、前記培養工程は、前記乳酸生産酵母を培養液の通気および／または攪拌下、該培養液の溶存酸素濃度が１ｍｇ／Ｌ以下の範囲で培養することを特徴とする。こうした酸素条件で培養することで、予想外に良好な乳酸収量、乳酸比率を得ることができるとともに、乳酸生産速度も容易に制御できる。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１７】
（遺伝子組換え乳酸生産酵母）
（酵母）
本発明の乳酸生産形質転換酵母は、外来の乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する形質転換酵母である。本乳酸生産酵母を得るための酵母としては、アルコール発酵を行う酵母であって、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、などの酵母を挙げることができる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。好ましい酵母の一例としては、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株を例示できる。
【００１８】
なお、本乳酸生産酵母および乳酸生産方法において乳酸とは、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれであってもよい。
【００１９】
（ピルビン酸脱炭酸酵素活性あるいはアルコール脱水素酵素活性の低下）
本乳酸生産酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）活性および／またはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）活性が低下されていることが好ましい。これらの酵素は、酵母のアルコール発酵経路の酵素であり、アルコール発酵を行う酵母がその染色体上に本来的に有している酵素である。ピルビン酸脱炭酸酵素は、いわゆるオートレギュレーション機構を有する酵素であり、ピルビン酸脱炭酸酵素１〜６等がある。これらのうちいずれか１種あるいは２種以上が破壊されていればよいが、好ましくは最も活性が高いあるいは大量に発現されているピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）の活性が低下されていることが好ましい。また、アルコール脱水素酵素においても各種の亜種（ＡＤＨ１〜ＡＤＨ７）があるが、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）が大量に発現されている。したがってアルコール脱水素酵素１の活性が低下されていることが好ましい。
【００２０】
ピルビン酸脱炭酸酵素活性および／またはアルコール脱水素酵素活性が低下されているとは、人工的な操作によりあるいはスクリーニングによって、野生型よりも低い活性の該酵素が生産されているかあるいは該酵素の生産量が野生型よりも少ないものであることが好ましい。このような酵素活性の低下のための人工的操作としては、この酵素遺伝子を破壊（ノックアウト）することが好ましい。染色体上の特定遺伝子を破壊する手法は、当業者において周知である。
【００２１】
（乳酸脱水素酵素）
本乳酸生産酵母は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（ＬＤＨ遺伝子）を保持している。ＬＤＨ遺伝子は、酵母においては外来性である。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、ラクトバシルス・ヘルベティカス、ラクトバシルス・カゼイ、クルイベロマイセス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルッキ、シゾサッカロミセス・ポンビ、リゾプス・オリゼ、Ｂ．メガテリウムなどの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。例えば、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるＬＤＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１に記載される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。したがってＬＤＨ遺伝子として、これらのいずれかのＬＤＨをコードするＤＮＡを用いることができる。本乳酸生産酵母は、ＬＤＨ遺伝子を少なくとも一つ、好ましくは二以上保持している。より好ましくは三以上保持している。さらに好ましくは四つ以上保持している。
【００２２】
（ＰＤＣプロモーター）
ＬＤＨ遺伝子は、強力なプロモーター活性を有するプロモーターの制御下に発現可能に備えられていることが好ましい。例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター（ＰＤＣプロモーター）の制御下に発現可能に備えられていることが好ましい。なかでも、十分に強力なプロモーターであるＰＤＣ１プロモーターを用いることが好ましい。より好ましくは、サッカロマイセス属（好ましくはセレビシエ）のＰＤＣ１プロモーターである。
【００２３】
例えば、ＰＤＣ１プロモーターとしては、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの他、同等の機能を有する限り、該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡ、あるいは、該ＤＮＡとの相同性が７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるＤＮＡを用いることができる。すなわち、酵母染色体上のＰＤＣ１プロモーターが、同一ではないが同等の機能を有するこれらのプロモーター活性を有するＤＮＡによって相同組換え等を介して置換されていてもよい。
【００２４】
本明細書においてストリンジェントな条件とは、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いＤＮＡを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約４２℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、５０％ホルムアミド存在下で約６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【００２５】
また、本明細書において、ＤＮＡなどの核酸の相同性については、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ），ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ＳＩＴ／ＦＡＳＴＡ．ｈｔｍｌ）などによって決定することができる。
【００２６】
（他のプロモーター）
また、ＬＤＨ遺伝子は、ＡＤＨ遺伝子のプロモーター（ＡＤＨプロモーター）を初めとする他の各種プロモーターの制御下に発現可能に備えることもできる。ＡＤＨは既に述べたようにアルコール発酵経路においてＰＤＣのすぐ後段の酵素である。ＡＤＨプロモーターとしては、十分に強力なプロモーターであるＡＤＨ１プロモーターを用いることが好ましい。
【００２７】
また、この他、ＬＤＨ遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビジエの高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）の遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ遺伝子）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）、ガラクトース１リン酸キナーゼ１遺伝子（ＧＡＬ１遺伝子）および転写エンハンサー因子１遺伝子（ＴＥＦ１遺伝子）のプロモーターの制御下に発現可能に導入することもできる。
【００２８】
なお、これらの他のプロモーターは、酵母の染色体上における各プロモーターと同等の機能を有する限り、該プロモーターのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡ、あるいは、ＡＤＨ１プロモーターとの相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるＤＮＡを用いることができる。
【００２９】
ＬＤＨ遺伝子は、酵母染色体外で維持されるプラスミドやＹＡＣなどにおいて保持されていてもよいが、好ましくは酵母染色体に組み込まれて保持される。
【００３０】
ＬＤＨ遺伝子は、好ましくは、酵母染色体において上記各種プロモーターの制御下に発現可能に備えられている。したがって、上記各種プロモーターとＬＤＨ遺伝子とを含む発現カセットを構築して、酵母染色体に導入することができる。また、ＬＤＨ遺伝子は、酵母染色体上にあるこれらの各種プロモーターの制御下にある内在性遺伝子を破壊するとともに該プロモーターの制御下に発現可能に組み込まれることもできる。また、これらの各種プロモーターの制御下に発現可能に連結したＬＤＨ遺伝子を、ＰＤＣ遺伝子および／またはＡＤＨ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込みこともできる。
【００３１】
さらに、ＰＤＣプロモーターやＡＤＨプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に備えるようにするには、酵母染色体におけるこれらのプロモーターの本来の位置においてこれらのプロモーターによって制御可能であってかつＰＤＣ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込まれていることが好ましい。こうすることで、ＰＤＣ活性やＡＤＨ活性を低下させてアルコール発酵を抑制できるとともに、本来ＰＤＣ遺伝子発現に作用していた強力なＰＤＣプロモーターやＡＤＨプロモーター活性をＬＤＨ遺伝子発現にスイッチさせることができる。破壊されそしてそれらのプロモーターがＬＤＨ遺伝子の発現に利用される遺伝子は、好ましくはＰＤＣ１遺伝子やＡＤＨ１遺伝子である。最も強力なＰＤＣ１プロモーターによって制御されるＰＤＣ１遺伝子が破壊されてＬＤＨ遺伝子が代わりに発現されることで効果的にＰＤＣ活性低下とＬＤＨ活性発現とを実現できる。
【００３２】
なお、ＰＤＣ１遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である（特開２００３−１６４２９５号）。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が発現するため、例えば、酵母のＰＤＣ１遺伝子が破壊されたとしても、酵母の生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来ＤＮＡを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。
【００３３】
なお、明らかなように、ＰＤＣプロモーター、ＡＤＨプロモーター及び他のプロモーターのＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、化学的に合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３４】
以上のように、本乳酸生産酵母においては、上記したＰＤＣ活性及びＡＤＨ活性を低下させる態様、各種のＬＤＨ遺伝子発現態様を各種組み合わせて採ることができる。好ましい乳酸生産酵母は、染色体上のＰＤＣ（好ましくはＰＤＣ１）遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に備えている。同時に、染色体上のＡＤＨ（好ましくはＡＤＨ１）遺伝子が破壊されていてもよい。また、この態様において、破壊された該ＡＤＨ（好ましくはＡＤＨ１）遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に備えることもできる。こうした乳酸生産酵母においては、好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは６以上、最も好ましくは８以上のＬＤＨ遺伝子を染色体上に備えている。
【００３５】
本乳酸生産酵母を取得するには、宿主酵母に対して、ＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子の破壊を行うとともに、ＬＤＨ遺伝子を発現可能に導入して形質転換することが好ましい。酵母に対してこのような遺伝子修飾を行うには、組換え用ＤＮＡ構築物を利用する。組換え用ＤＮＡ構築物は、特に限定しないで、線状等のＤＮＡ断片、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）等に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。
【００３６】
ＰＤＣ遺伝子あるいはＡＤＨ遺伝子の破壊のためのＤＮＡ構築物は、これらの遺伝子部位に導入して遺伝子を破壊するために相同組換え用の配列を備えることができる。相同組換え用ＤＮＡ配列は、破壊しようとするＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子であるターゲット部位あるいはその近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡ配列は、一つのターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも１箇所に相同である１の配列を有しており、好ましくは、ターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも２箇所にそれぞれ相同な配列を備えている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡ配列を、染色体上のターゲット遺伝子の上流側と下流側のＤＮＡとのそれぞれに相同なＤＮＡ配列とし、これらの相同組換え用ＤＮＡ配列の間に遺伝子を破壊するためのＤＮＡを備えるＤＮＡ構築物を酵母染色体に相同組換えにより導入することでターゲット部位の遺伝子を破壊することができる。
【００３７】
このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用ＤＮＡの選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用ＤＮＡを選択して相同組換え用ＤＮＡ構築物を構成することができる。例えば、ＰＤＣプロモーターの少なくとも一部と、ＰＤＣ遺伝子あるいはターミネーターの少なくとも一部とにそれぞれ相同なＤＮＡ配列を相同組換え用ＤＮＡ配列として用いることができる。同様に、ＡＤＨプロモーターの少なくとも一部とＡＤＨ遺伝子あるいはターミネーターの少なくとも一部とにそれぞれ相同なＤＮＡ配列を相同組換え用ＤＮＡ配列として用いることができる。
【００３８】
ＰＤＣ遺伝子を破壊するＤＮＡ構築物には、ＰＤＣ遺伝子をターゲットとするための相同組換え用ＤＮＡとともにＰＤＣ遺伝子を置換可能な形態でＬＤＨ遺伝子を有することができる。このようなＤＮＡ構築物によれば、ＰＤＣ遺伝子の破壊とともにＰＤＣプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を発現可能に導入できる。
【００３９】
また、ＰＤＣ遺伝子を破壊するとともに、破壊した該ＰＤＣ遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨ遺伝子を導入することもできるが、相同組換えにより染色体上のＰＤＣプロモーターに替えて同等のプロモーターを導入することもできる。例えば、既に述べたＰＤＣ１プロモーターのホモログ等である。
【００４０】
なお、使用するＤＮＡ構築物には、ＣＹＣ１ターミネーターやＴＤＨ３ターミネーターなどのターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性Ｇ４１８遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。
【００４１】
（乳酸の生産方法）
本乳酸生産酵母を適当な炭素源の存在下で培養することにより、培養物中にＬＤＨ遺伝子の発現産物である乳酸を生成させることができる。本乳酸生産方法によれば、培養系から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。
【００４２】
本発明の乳酸生産酵母の培養にあたっては、酵母の種類に応じて培養方法や培養条件を選択することができる。例えば、ジャーファーメンターを用いた液体培養法を挙げることができ、回分培養、半回分培養などの培養形式を採用できる。また、酵母を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００４３】
培養温度は、用いる乳酸生産酵母の生育可能な範囲で選択することができ、例えば、約２０℃〜約４０℃とすることができる。また、培地ｐＨは、ｐＨは２．０〜６．０に保持することが好ましく、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。
【００４４】
また、培養期間は、他の培養条件、特に、後述するようにｋＬａ（ｈｒ−１）によって大きく異なるが６〜７２時間程度とすることが好ましく、より好ましくは４８時間程度とする。
【００４５】
本乳酸生産方法は、乳酸生産酵母を通気攪拌下で、あるいは微好気状態よりも好気状態で培養することが好ましい。一般に、乳酸菌による乳酸発酵や酵母によるエタノール発酵では、通気を行わない微好気状態で発酵を行う。これに対して、本方法では、酵母による発酵生産においては従来用いられていない通気攪拌によって得られる培養液中の酸素条件を用いることを特徴としている。すなわち、微好気状態よりも好気的な酸素条件で発酵を行うことを特徴としている。乳酸生産酵母については、このような酸素条件下において初めて効率的な乳酸発酵が実現される。特に、遺伝子組換え乳酸生産酵母、なかでも、ＰＤＣ活性が低下するなどアルコール発酵が抑制された乳酸生産酵母あるいはＰＤＣ遺伝子のプロモーター下の制御下においてＬＤＨ遺伝子が発現可能に備えられた乳酸生産酵母においては、理由は明らかではないが、こうした酸素条件において初めて実用的な乳酸生産特性を得ることができる。なお、本生産方法においては、微好気状態よりも好気的な状態が得られる限り、通気および攪拌の双方を行うことのほか、通気および攪拌のうち一方のみを行ってもよい。
【００４６】
本方法の培養工程において得ようとする酸素条件は、使用する乳酸生産酵母が乳酸発酵可能なあるいは乳酸発酵を促進可能な程度であればよい。例えば、かかる酸素条件は、例えば、ｋＬａ（ｈｒ−１）として表現することができる。ｋＬａ（ｈｒ−１）は、通気攪拌培養時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で表すことができる。また、ｋＬａ（ｈｒ−１）（以下、単にｋＬａと略す。）は、通気攪拌培養時において、気相から供給される酸素と微生物によって消費される酸素とによって表される培養液中の酸素の収支式（２）において用いられる（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
【００４７】
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊−Ｃ） （１）
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊−Ｃ）−Ｑ02×Ｘ （２）
ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｘ：菌体濃度（ｇ／Ｌ）、Ｑ02：比呼吸速度（ｍｇＯ２／（ｇ・ｃｅｌｌ・ｈ）ｋＬａ：酸素移動容量係数（ｈｒ−１）である。
【００４８】
通気攪拌培養装置におけるｋＬａは、亜硫酸酸化法(バッチ法・連続法)、気体置換法（Gassing out法(スタティック法、ダイナミック法)）、排気ガス分析法などで測定できる（前掲生物工学実験書、ｐ３１１等）。以下に、気体置換法（ダイナミック法）によるｋＬａの測定の一例を示す。通気攪拌培養装置に水あるいは使用する培地をいれ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換するかあるいは亜硫酸ナトリムをほぼ飽和濃度に達する程度に加えることなどにより脱酸素するかして該液体の酸素濃度を低下させる。次いで、かかる液体中に溶存酸素濃度電極を差し込み、通気速度、攪拌速度および温度を設定して所定の通気攪拌下での溶存酸素の上昇過程を測定する。ここで、式（１）より、下記式（３）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−ｋＬａ×ｔ （３）
【００４９】
本発明においては、いくつかの通気条件と攪拌条件とを組み合わせた通気攪拌条件を設定して、これらの各種通気攪拌条件とｋＬａとの関係を予め求めた上、使用する通気攪拌培養装置についてｋＬａが６以上３６以下となる通気攪拌条件を予め設定することが好ましい。各種の通気攪拌条件に対するｋＬａは、各通気攪拌条件に設定した通気攪拌培養装置を上記記載の方法に従って運転し、溶存酸素濃度の上昇過程と平衡溶存酸素濃度とを測定することで求めることができる。
【００５０】
ｋＬａが６以上３６以下の範囲においては、乳酸生産酵母の乳酸生産速度、乳酸収量および残留糖分について好ましい培養特性を得ることができるため、安定して効率的な乳酸生産が実現できる。また、このｋＬａの範囲内で変化させて培養工程を実施することで、所望の培養期間で乳酸収量や残留糖分の好ましいレベルを確保して培養を終了させることができる。また、乳酸生産酵母はｋＬａがこの範囲内で低い場合には、乳酸生産速度が遅くなる傾向があり、ｋＬａが高い場合には、乳酸生産速度が速くなる傾向がある。したがって、例えば、比較的長い培養期間を設定する場合には、このｋＬａ範囲において相対的に低いｋＬａを設定することができ、比較的短い培養期間を設定する場合には、相対的に高いｋＬａを設定することができる。
【００５１】
例えば、ｋＬａが１６以下で培養することにより、最終的な乳酸収量を増大させることができる。ｋＬａが１６以下の場合には、おおよそＬＤＨ遺伝子のコピー数によらずに良好な最終乳酸収量を得ることができることが本発明者らより確認されている。また、このような傾向はｋＬａが小さいほど顕著である。さらに、ｋＬａが小さいほど乳酸比率が高くなる傾向がある。一方、ｋＬａが１６超で培養することにより、乳酸生産速度を向上させることができる。乳酸生産速度を向上させることで、培養工程時間を制御することが可能となる。より顕著に乳酸生産速度を向上させるには、ｋＬａを１８以上とすることが好ましく、ｋＬａを２０以上とすることがより好ましく、ｋＬａが２２以上であることが一層好ましい。
【００５２】
培養工程においては、ｋＬａを一定とすることもできるが、培養工程においてｋＬａを変化させることもできる。すなわち、予め異なるｋＬａによる培養期間を設定しておくこともできるし、ｋＬａを一定に設定して開始した培養工程における乳酸濃度や糖分濃度のモニタリング結果に応じて、異なるｋＬａの培養期間を新たに追加設定したりもできる。さらに、予め異なるｋＬａの培養工程を設定しておいてもよいし、こうした培養工程においても培養のモニタリング結果に応じてそれぞれの培養工程時間を変化させてもよい。このような培養工程におけるｋＬａの調整により、都合のよい培養工程時間内に好ましい乳酸収量や乳酸比率を得ることができる。
【００５３】
例えば、ｋＬａ一定の培養工程におけるモニタリングにおいて所定時点における残留糖分および／または乳酸濃度が予定値を下回る場合には、ｋＬａをより高く、好ましくは１６超、さらに好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上、一層好ましくは２２以上に変化させることで、培養工程時間を大きく延長することなく好ましい残留糖分および／または乳酸収量を確保できる。
【００５４】
培養工程には、ｋＬａが１６以下の第１の培養期間と、ｋＬａが１６超の第２の培養期間とを備えることができる。ｋＬａが１６以下であるとき、ｋＬａが１６超の範囲内にあるときよりも乳酸生産酵母の乳酸生産速度は遅いがその速度が持続される傾向にあり、最終的な乳酸収量や乳酸比率を向上させることができる。ｋＬａは１４以下であることがより好ましく、さらに好ましくは１１以下である。ｋＬａが１４以下さらに１１以下とすることでかかる傾向が顕著になるからである。なお、第１の培養期間におけるｋＬａは６以上であれば、乳酸生産速度が遅くなりすぎることがないため好ましい。一方、ｋＬａが１６超の範囲にあるとき、最終的な乳酸収量が低下する傾向にはあるものの乳酸生産速度は早い傾向にあるため、第２の培養期間を設定することで、培養期間を短縮することができる。ｋＬａは１８以上であることがより好ましく、さらに好ましくは２０以上であり、一層好ましくは２２以上である。なお、第２の培養期間における上限は３６以下であれば、乳酸収量を大きく低下させることがない。
【００５５】
このように、異なるｋＬａ領域での培養期間をそれぞれ備えることで、所望の培養期間、高い乳酸収量および乳酸比率、低い残留糖分を適宜得ることができる。異なるｋＬａ領域での培養工程を組み合わせる場合、より低いｋＬａ領域の培養工程を実施し、より高い領域の培養工程を実施することが好ましい。こうすることで、乳酸収量と乳酸生産速度の双方のバランスを容易に図ることができる。例えば、上記した第１の培養期間を実施後に上記第２の培養期間を実施することが好ましい。こうした順序で異なるｋＬａの培養期間を実施することで、培養期間、乳酸収量、乳酸比率および残留糖分等について好ましい特性を得ることができるとともに、培養工程の状況変化に対応することが容易となる。なお、異なるｋＬａ領域の培養工程を備える場合、２種のｋＬａによる各培養工程を備えるほか、３種以上のｋＬａの各培養工程を備えることもできる。
【００５６】
また、本培養工程において得ようとする酸素条件は、乳酸生産酵母の培養工程における培養液の溶存酸素量として表現することもできる。乳酸生産酵母の培養工程においては、溶存酸素量は、１ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましい。１ｍｇ／Ｌ以下であると乳酸の収量を一定以上に確保できるからである。より好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以下である。０．５ｍｇ／Ｌ以下であると、高い乳酸収率が得られるからである。なお、こうした溶存酸素濃度下においても微好気状態よりも好気状態であることが好ましい。こういった酸素条件は、培養液を通気のみでもまた攪拌のみでも得られることがあり、これらを双方組み合わせることによっても得ることができる。培養液の溶存酸素量は、培養工程全体を通じて上記濃度以下であることが好ましい。また、溶存酸素量の測定は、培養槽の酸素条件を代表できるような測定位置および測定個所における測定値から得られる数値を用いることが好ましい。
【００５７】
培養終了後、培養物から乳酸あるいはその塩を分離するには、通常の乳酸精製手段を使用することができる。例えば、酵母内に生産された場合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕などに細胞を破壊して,遺伝子産物を細胞と分離することができる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加する。また、菌体外に乳酸が生産された場合には、この培養液等を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去する。
【００５８】
これらの粗抽出画分に対しては、従来公知の各種精製分離法等を利用して、乳酸を精製することができる。また、必要に応じて、当該粗抽出画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。
【実施例１】
【００５９】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。なお、以下の実施例においては、ｋＬａは特に断りのない限りｋＬａ（ｈｒ−１）を意味している。
【００６０】
（乳酸生産形質転換酵母の作製）
ＬＤＨ遺伝子（ウシＬ−ＬＤＨ由来）を導入したサッカロマイセス・セレビシエを、本発明者らが既に構築したｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクター（特開２００３−２５９８７８号公報に記載）を用いて調製した。本ベクターは、酵母の１２番染色体上のＰＤＣ１遺伝子をターゲットとする染色体導入型ベクターであり、染色体上のＰＤＣ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列とＰＤＣ１遺伝子の下流側との相同組換え部位とを有している（図１）。このベクターが染色体上のＰＤＣ１遺伝子に導入されれば、ＰＤＣ１プロモーターの制御下においてＬＤＨ遺伝子が発現されることになる。なお、酵母への遺伝子導入法は、Ｉｔｏらの手法（Ito, H., Y. Fukuda, K.Murata and A. Kimura, Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations J. Bacteriol. Vol.153, p163-168）に従った。すなわち、宿主である酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録されているサッカロマイセス。セレビジエ菌株）のトリプトファン合成能を欠損した株を、１０ｍｌＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌およびＴＥバッファによる洗浄を行い、次に、０．５ｍｌＴＥバッファと０．５ｍｌ ０．２Ｍの酢酸リチウムを加え、３０℃にて１時間の振とう培養を行った後に、染色体導入型ベクターであるｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣＢベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｃＩ（いずれも宝酒造）で処理して、これを添加した。
【００６１】
本酵母懸濁液を３０℃で３０分振とう培養後、１５０μｌの７０％ポリエチレングリコール４０００（和光純薬）を加え、よく攪拌した。さらに、３０℃にて１時間振とう培養した後、４２℃にて５分間ヒートショックを与え、菌体を洗浄した後、２００μｌの水に懸濁したものをトリプトファン選択培地に塗沫した。
【００６２】
得られたコロニーを新たなトリプトファン選択培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株について、遺伝子導入の有無をＰＣＲ解析によって確認した。安定したトリプトファン合成能を有し、かつ、これらのプライマーのもとでＰＣＲ増幅が確認できたものを、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が適切に導入された形質転換株（２コピー体）と判断した。この２コピー体は、図２に示すように、酵母の１２番染色体のＰＤＣ１遺伝子を上記染色体導入型ベクターのＤＮＡにて置換したものである。
【００６３】
本実施例では、さらに、図２に示す酵母染色体（７番染色体および１２番染色体）の所定位置への染色体導入型ベクターを、上記ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣＢベクターに準じてそれぞれ構築し、既に得られた２コピー体に対して導入し形質転換を行い、６コピー体、８コピー体および１０コピー体を作製した。
【実施例２】
【００６４】
（発酵試験１）
通気攪拌式の培養装置（千代田化工社製ＴＦＬシリーズ、ジャー容量１Ｌ）における各種の通気攪拌条件において、回分法にて発酵試験を行うとともに、各通気攪拌条件に対するｋＬａを、窒素ガスを用いるダイナミック法により求めた。発酵試験は、表１に示す通気攪拌条件下で行った。
【００６５】
実施例１で作製したＴ１６７−１０Ｂ株（ＬＤＨ８コピー体）を、ＹＰＤ培地１００ｍｌバッフル付き三角フラスコを８０ｒｐｍで２４時間振とう培養後、菌体を遠心分離により回収し前培養菌体とした。ケーンジュースを蒸留水で希釈して糖濃度を１５ｗｔ％としたケーンジュース培地（１２１℃、３０分で加熱滅菌）５００ｍＬに、この前培養菌体を初発菌体濃度がＯＤ６００＝１〜３となるように接種し、温度３２℃に設定し表１に示す各種の通気攪拌条件下で培養した。なお、培養中、中和剤としてアンモニア水を用いて随時ｐＨを４．８〜５．４の間に調整した。培養開始後２４時間、３６時間および４８時間で培養液を採取して、乳酸濃度を測定した。乳酸濃度の測定は、酵素センサー（王子計測機器、バイオセンサＢＦ−４）を用いて行った。
【００６６】
発酵試験後、溶存酸素電極を用いるダイナミック法により各発酵条件におけるｋＬａを測定した。まず、発酵試験に採用した同一の通気攪拌条件および温度条件下で水５００ｍＬを投入し、溶存酸素電極（メトラートレド製Ｔタイプ）を挿入し、窒素ガスを十分に水中に吹き込んで電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行い、窒素ガスから空気に通気ガスを変更して培養装置の運転を開始し、溶存酸素濃度の経時変化を測定してｋＬａを求めた。得られたｋＬａを併せて表１に示す。また、ｋＬａを横軸に乳酸濃度を縦軸にしてプロットした結果を図３に示す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
図３に示すように、ｋＬａが高い場合に乳酸生産速度は速くなるが、ｋＬａが３６．０を超えると最終的な乳酸収量が低下する傾向にあった。また、ｋＬａが低い場合には初期の乳酸生産速度が遅く、ｋＬａが７．２より小さくなるとその傾向が強かった。さらに、ｋＬａが６．０以上で３６．０以下においては試験した培養期間においてはおおよそ安定した乳酸収量が得られ残留糖分もほとんどないが、ｋＬａが１８．０程度であるとき最も生産性が高かった。
【００６９】
以上のことから、乳酸生産酵母は、４０以下の低いｋＬａ領域における一定のｋＬａ範囲内において好ましい乳酸生産特性を発揮することがわかった。一方、このｋＬａ範囲内においても、乳酸生産速度が大きく変化し、一定の培養期間内における乳酸収量や残留糖分に大きく影響することがわかった。
【実施例３】
【００７０】
（発酵試験２）
次に、同一のｋＬａとなる各種の通気攪拌条件を設定して発酵試験を行い、乳酸生産酵母のｋＬａ依存性を確認した。ｋＬａと通気攪拌条件との関係を表２に示す。発酵試験は、表２に示す各種の通気攪拌条件を用いて行う以外は発酵試験１と同様に行った。結果を図４に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
図４に示すように、ｋＬａが１８となる各種の通気攪拌条件で発酵試験を行った結果は、通気攪拌条件にかかわらずほぼ同一の乳酸生産特性を示した。これらの結果は、乳酸生産酵母の発酵特性が、通気や攪拌のそれぞれに依存せず、これらについて設定された条件によって得られる単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力に依存するものであることを支持した。
【実施例４】
【００７３】
（発酵試験３）
本発酵試験では、乳酸生産酵母として実施例１で作製したＰＤＣ１ｐ−ＬＤＨ２コピー体、６コピー体および１０コピー体を用いて、これらの各種乳酸生産酵母に対して各種のｋＬａ（６、１１、１６、２２および２９）を設定して乳酸発酵を行い、ＬＤＨコピー数あるいはｋＬａと発酵特性との関係を確認した。発酵試験は、これらの乳酸生産酵母を用い、発酵用培地として初発糖濃度が１０ｗｔ％となるように蒸留水で希釈したケーンジュース培地を用いて所定のｋＬａで最大７２時間まで発酵を行った以外は、発酵試験１と同様に行った。なお、乳酸濃度に加えて、エタノール濃度およびグルコース濃度を、酵素センサー（王子計測機器、バイオセンサＢＦ−４）を用いて測定した。なお、ｋＬａと通気攪拌条件との関係は以下のとおりである。
【００７４】
ｋＬａ 通気量（Ｌ／分） 攪拌速度（ｒｐｍ）
６ ０．３ ６０
１１ ０．３ １５０
１６ ０．３ ２３０
２２ ０．３ ２７０
２９ ０．３ ２９０
【００７５】
発酵４８時間までの最大乳酸収量と該最大乳酸収量時におけるエタノール量、グルコース量および乳酸比率（％）（ただし、乳酸比率（％）＝乳酸濃度／（乳酸濃度＋２×エタノール濃度）×１００とした。）を表３〜表５に示し、各種乳酸生産酵母についての最大７２時間までの乳酸生産量のグラフを図５〜図７に示す。
【００７６】
【表３】
【表４】
【表５】
【００７７】
表３〜表５および図５〜図７に示すように、ＬＤＨのコピー数の観点からは、コピー数が多いほど乳酸生産速度は低下するが、乳酸収量や乳酸比率は増大する傾向にあった。また、ＬＤＨコピー数によりｋＬａに対する感受性が異なり、ＬＤＨコピー数が多いほど、ｋＬａによって乳酸生産速度が大きく変化する傾向があることわかった。すなわち、ＬＤＨコピー数が多くなるほど、ｋＬａが大きいときに乳酸生産速度が向上する傾向にあり、ｋＬａが小さいときに乳酸生産速度が低下する傾向にあった。一方、ｋＬａの観点からは、ｋＬａが小さいほど、最終的な乳酸収量および乳酸比率が増大する傾向があることがわかった。以上のことから、乳酸生産酵母は、乳酸生産速度、乳酸収量および乳酸比率についてｋＬａに影響を受けるとともに、これらの影響は乳酸収量の大きいＬＤＨのマルチコピー体においてより大きいことがわかった。したがって、乳酸生産酵母においては所望の乳酸生産特性を得るにはｋＬａの制御が有効であり、特にＬＤＨのマルチコピー体については、ｋＬａの制御によって発酵時間などのプロセス管理を容易に行いうることがわかった。
【実施例５】
【００７８】
（発酵試験４）
本発酵試験は、ｋＬａを培養工程において変化させたときの乳酸生産特性に与える影響を確認した。ｋＬａが１０．８の通気攪拌条件（通気量：０．３Ｌ／分、攪拌速度：１５０ｒｐｍ）で発酵を開始し、６時間経過後および１２時間経過後にｋＬａを１８．０（通気量：０．３Ｌ／分、攪拌速度：２４０ｒｐｍ）に切り換えて最大５５時間培養した点、およびケーンジュースを初発糖濃度１５ｗｔ％とした培地を用いる点以外は、発酵試験１と同様に発酵試験を行った。結果を図８に示す。
【００７９】
図７に示すように、ｋＬａを１８．０に切り換えた以降において乳酸生産速度は明らかに速くなり、糖分を消費するまでの発酵時間を５〜１０時間早めることができた。すなわち、培養工程の途中においてｋＬａを切り換えしたときにおいても、切り換え後のｋＬａに応じた乳酸生産酵母の乳酸生産特性が発現されることがわかった。このことから、培養工程中にｋＬａを変化させて乳酸生産速度を調整することにより、一定以上の乳酸収量や乳酸比率を確保しつつ乳酸生産酵母を用いた乳酸生産工程の培養期間を調整できることがわかった。以上のことは、乳酸生産速度がｋＬａに高度に依存していることを支持しており、同時に、ｋＬａの制御あるいは培養工程におけるｋＬａの変化が、乳酸生産速度を調整して糖を消費するまでの発酵終了時間を制御するのに有効であることを支持している。
【００８０】
（発酵試験５）
本発酵試験では、乳酸生産酵母として実施例１で作製したＰＤＣ１ｐ−ＬＤＨ１０コピー体を用いて、この乳酸生産酵母に対して２種類のｋＬａ（１６および２９）を設定して乳酸発酵を行い、発酵中、溶存酸素電極（メトラートレド製Ｔタイプ）を用いて溶存酸素濃度を測定した。発酵試験は、所定のｋＬａで発酵を行った以外は、発酵試験１と同様に行った。各ｋＬａ条件での発酵液の乳酸濃度と溶存酸素濃度についての測定結果を図９および図１０に示す。
【００８１】
図９および図１０に示すように、溶存酸素濃度は、発酵試験を通じて１ｐｐｍ以下であり、乳酸生産量に優れるｋＬａ＝１６の条件においては、発酵試験を通じて０．５ｐｐｍ以下であった。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構造を示す図。
【図２】実施例１で作製したＬＤＨ遺伝子導入酵母である２コピー体、６コピー体、８コピー体および１０コピー体における染色体上のＬＤＨ遺伝子導入部位を示す図。
【図３】ｋＬａを横軸に乳酸濃度を縦軸にしてプロットしたグラフ図。
【図４】ｋＬａ（１８）一定の異なる通気攪拌条件下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図５】ＬＤＨ２コピー体について異なるｋＬａ下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図６】ＬＤＨ６コピー体について異なるｋＬａ下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図７】ＬＤＨ１０コピー体について異なるｋＬａ下での乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図８】培養工程中にｋＬａを変化させた場合の乳酸生産量の変化を示すグラフ図。
【図９】発酵試験５における溶存酸素濃度の変化を示す図。
【図１０】発酵試験５における乳酸濃度の変化を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、
を備え、
前記培養工程は、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法。
【請求項２】
前記培養工程は、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養する工程である、請求項１に記載の乳酸生産方法。
【請求項３】
前記培養工程は、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養する工程である、請求項１に記載の乳酸生産方法。
【請求項４】
前記培養工程において酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させる、請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項５】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、
を備え、
前記培養工程において酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させる、乳酸生産方法。
【請求項６】
前記培養工程は、
（ａ）前記遺伝子組換え乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養する工程と、
（ｂ）前記遺伝子組換え乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養する工程と、
を含む、請求項５に記載の乳酸生産方法。
【請求項７】
前記（ａ）工程を実施後に前記（ｂ）工程を実施する、請求項６に記載の乳酸生産方法。
【請求項８】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を通気攪拌下で培養する工程を備える、乳酸生産方法。
【請求項９】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養液の通気および／または攪拌下で酸素を供給して該培養液の溶存酸素量が１ｍｇ／Ｌ以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法。
【請求項１０】
前記培養工程における培養液の溶存酸素量は０．５ｐｐｍ以下である、請求項９に記載の乳酸生産方法。
【請求項１１】
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項１〜１０のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１２】
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項１〜１１のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１３】
前記乳酸生産酵母は、ピルビン酸脱炭酸酵素および／またはアルコール脱水素酵素活性が低下されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１４】
前記乳酸生産酵母の酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１５】
前記乳酸生産酵母は、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を二以上備えている、請求項１〜１４のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、
を備え、
前記培養工程は、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が６以上３６以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法。
【請求項２】
前記培養工程は、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養する工程である、請求項１に記載の乳酸生産方法。
【請求項３】
前記培養工程は、酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養する工程である、請求項１に記載の乳酸生産方法。
【請求項４】
前記培養工程において酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させる、請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項５】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養する培養工程、
を備え、
前記培養工程において酸素移動容量係数（ｈｒ−１）を変化させる、乳酸生産方法。
【請求項６】
前記培養工程は、
（ａ）前記遺伝子組換え乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６以下の範囲で培養する工程と、
（ｂ）前記遺伝子組換え乳酸生産酵母を酸素移動容量係数（ｈｒ−１）が１６超の範囲で培養する工程と、
を含む、請求項５に記載の乳酸生産方法。
【請求項７】
前記（ａ）工程を実施後に前記（ｂ）工程を実施する、請求項６に記載の乳酸生産方法。
【請求項８】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を通気攪拌下で培養する工程を備える、乳酸生産方法。
【請求項９】
乳酸生産方法であって、
乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に備える乳酸生産酵母を培養液の通気および／または攪拌下で酸素を供給して該培養液の溶存酸素量が１ｍｇ／Ｌ以下の範囲で培養する工程を備える、乳酸生産方法。
【請求項１０】
前記培養工程における培養液の溶存酸素量は０．５ｐｐｍ以下である、請求項９に記載の乳酸生産方法。
【請求項１１】
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項１〜１０のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１２】
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項１〜１１のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１３】
前記乳酸生産酵母は、ピルビン酸脱炭酸酵素および／またはアルコール脱水素酵素活性が低下されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１４】
前記乳酸生産酵母の酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【請求項１５】
前記乳酸生産酵母は、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を二以上備えている、請求項１〜１４のいずれかに記載の乳酸生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−２０６０２（Ｐ２００６−２０６０２Ａ）
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０３７１４（Ｐ２００４−２０３７１４）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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