有機酸生産用形質転換体
【課題】有機酸の発酵生産に際し、相応の対遺伝子導入数効果又は対遺伝子導入数効果の高い遺伝子発現系を提供する。
【解決手段】複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持するように形質転換体を作製する。複数種類のプロモーターによって有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを発現させることで、単一プロモーターによる発現時より高い発現増強効果が得られる。
【解決手段】複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持するように形質転換体を作製する。複数種類のプロモーターによって有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを発現させることで、単一プロモーターによる発現時より高い発現増強効果が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、有機酸生産に使用するための形質転換体に関し、詳しくは、微生物による有機酸生産に関し、対遺伝子導入数効果の高い複数種類のプロモーターを組み合わせて備える形質転換体に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え酵母などの遺伝子組換え微生物を培養すると、発酵生産により大量の目的遺伝子を生産させることが可能であるが、こうした遺伝子組換え技術を利用して物質生産を行う場合には、高発現プロモーターが必要である。例えば、L−乳酸やD−乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエ属に導入して、乳酸を生産する試みに関しては多数の報告がなされているが、そのほとんどにおいて十分な生産量が得られていない。こうしたなかで、本出願人らは、ピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子(PDC1)プロモーターが遺伝子組換え酵母による乳酸などの発酵生産において高い乳酸生産量を得られるプロモーターであることを見出し既に開示している(特許文献1)。また、染色体中のPDC1遺伝子を破壊するとともに当該遺伝子のプロモーターの下流に乳酸脱水素酵素遺伝子を結合させることでPDC1遺伝子のプロモーター機能を利用して乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させつつ、本来のPDC1タンパク質の機能を制御したシステムも見出している(特許文献2)。
【特許文献1】特開2003−164294
【特許文献2】特開2003−164295
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
組換え微生物における発酵生産においては、常に一層の大量生産が要請される。PDC1遺伝子プロモーターを利用した上記システムを用いて乳酸を高生産するには、PDC1遺伝子プロモーターを用いて乳酸脱水素酵素を複数個導入した組換え微生物の利用が試みられることが多い。しかしながら、PDC1プロモーターを利用して外来遺伝子を複数コピー導入した場合には、相応の生産量(効果)が得られる。しかしながら、外来遺伝子の導入数が多いと宿主酵母の生育能が低下し、グルコースの消費能が低下するといった問題があることもわかった。グルコース消費能の低下は、発酵速度が遅延して培養期間が長期間化することになる。
【0004】
そこで、本発明は、有機酸の発酵生産に際し、相応の対遺伝子導入数効果又は対遺伝子導入数効果の高い遺伝子発現系を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、複数個遺伝子導入しても、グルコースなど炭素原代謝能を維持又は増大させることができる遺伝子発現系を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、乳酸の発酵生産に適した遺伝子発現系を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、上記した課題を解決するために検討を重ねたところ、予想に反し、複数種類のプロモーターを組み合わせることにより、強力なプロモーターであるPDC1遺伝子プロモーターを用いた場合の対遺伝子導入数効果を上回る対遺伝子導入数効果を得ることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【0006】
本発明の一つの態様によれば、複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体が提供される。
【0007】
前記複数種類のプロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2(TDH2)遺伝子プロモーター、熱ショックタンパク質30(HSP30)遺伝子プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7(HXT7)遺伝子プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1(AHP1)遺伝子プロモーター、膜タンパク質1(MRH1)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1(TDH1)遺伝子プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1(TPI1)遺伝子プロモーター、細胞壁関連タンパク質12(CCW12)遺伝子及びリボゾーマルプロテインS31(RSP31)遺伝子プロモーターからなる群から選択されることが好ましい。
【0008】
また、前記複数種類のプロモーターの少なくとも一種類はPDC1遺伝子プロモーターとすることができ、このとき、PDC1遺伝子プロモーターにより有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを少なくとも2コピーを保持していることが好ましい。
【0009】
さらに、前記有機酸は乳酸であり、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質とすることができる。この場合、前記有機酸はD−乳酸であり、前記タンパク質は、D−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターから選択することができる。特に、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターとすることができる。また、前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されていることが好ましい。さらにまた、PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピーと、HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、を備えることも好ましい。
【0010】
また、前記有機酸は、L−乳酸であり、前記タンパク質は、L−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター、TDH3遺伝子プロモーター及びHOR7遺伝子プロモーターから選択することもできる。この複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーターとHOR7遺伝子プロモーターとすることができる。また、前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のL−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されていることが好ましい。さらにまたPDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを6コピー以上と、HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、を備えることも好ましい。
【0011】
これらのいずれかの形質転換体においては、前記複数種類のプロモーターと前記コードDNAとは、いずれも染色体上に保持されていることが好ましい。また、前記形質転換体は、酵母とすることができ、この場合、サッカロマイセス・セレビシエ属酵母とすることができる。
【0012】
また、これらのいずれかの形質転換体においては、前記染色体上に保持される少なくとも一つの前記コードDNAが染色体上のPDC1遺伝子を破壊していることが好ましい。
【0013】
本発明の他の一つの態様によれば、有機酸生産用形質転換体の製造方法であって、
少なくとも、以下の2種類のDNA構築物:
PDC1遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第1のDNA構築物及び
PDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第2のDNA構築物、
を宿主に導入することにより、PDC1遺伝子プロモーターを含む複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体を作製する工程を備える、製造方法が提供される。
【0014】
また、本発明の他の一つの態様によれば、
有機酸の生産方法であって、
上記したいずれかの形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を培地において培養して有機酸を生産する工程と、
を備える、有機酸生産方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
本発明は、複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持している形質転換体、その製造、その形質転換体を利用した有機酸生産、有機酸生産のために選択されるプロモーター群等に関する。以下、本発明の各種の態様について説明する。
【0016】
1.形質転換体
本発明の形質転換体は、Eshrichia coli、Bacillus subtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、sf9、sf21等の昆虫細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞など、遺伝子組換え細胞として利用可能な従来公知の宿主細胞から形質転換により有機酸生産が可能な細胞を用いることができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物である。酵母のエタノール発酵の酵素系列、特に、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の破壊と当該遺伝子のプロモーターによる制御によって外来遺伝子を高発現可能であるからである。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエIFO2260株や同YPH株を例示できる。
【0017】
本発明の形質転換体は、有機酸生産用とすることができる。本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができ、好ましくは、乳酸である。乳酸には、L−乳酸、D−乳酸、及びDL−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【0018】
1−1.プロモーター
本発明の形質転換体は、複数種類のプロモーターと、これらのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNA(以下、コードDNAという。)と、を保持している。以下、本形質転換体におけるプロモーターについて説明する。
【0019】
本形質転換体における複数種類のプロモーターとしては、形質転換体においてプロモーター活性を発現可能なプロモーターの集合(プロモーター群)から選択される2種以上とすることができる。このようなプロモーター群としては、ピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2遺伝子(TDH2遺伝子)プロモーター、熱ショックタンパク質30遺伝子(HSP30遺伝子)プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7遺伝子(HXT7遺伝子)プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1遺伝子(AHP1遺伝子)プロモーター、膜タンパク質1関連遺伝子(MRH1遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1遺伝子(TDH1遺伝子)プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1遺伝子(TPI1遺伝子)プロモーター及び細胞壁関連タンパク質12遺伝子(CCW12遺伝子)及びリボゾーマルプロテインS31遺伝子(RSP31遺伝子)プロモーターから選択される2種類以上が挙げられる。これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、本発明の形質転換酵母において好ましく用いられる。
【0020】
こうしたプロモーター群から選択される複数種類のプロモーターとしては、少なくともPDC1遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。PDC1プロモーターは、一定の遺伝子導入数以上でその遺伝子導入数に見合った遺伝子発現増強効果が得られにくくなるものの、単独で強力なプロモーターであるとともに、酵母において有機酸を生産させるのに有効なプロモーターであるからである。特に、酵母のPDC1遺伝子を破壊するとともにPDC1遺伝子プロモーターの制御下で有機酸生産に関与するタンパク質をコードする外来DNAを発現させることに有効である。
【0021】
好ましい組み合わせのプロモーターを選択できるプロモーター群としては、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターからなるプロモーター群が挙げられる。このプロモーター群から選択される2種類又は3種類のプロモーターの組み合わせは、D−乳酸の生産に適している。このプロモーター群に基づくプロモーターの組み合わせは、必ずしもPDC1遺伝子プロモーターを含んでいる必要はないが、好ましくは、PDC1遺伝子プロモーターを含んでいる。PDC1遺伝子プロモーターに対して、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターのいずれをも組み合わせることができるが、これら3種全てを含む組み合わせであってもよい。PDC1遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードDNAを導入した形質転換体では、PDC1遺伝子プロモーターを単独で利用して同導入数のコードDNAを導入した形質転換体よりも高いD−乳酸生産量が得られる。また、このような形質転換体は、炭素源代謝能を維持又は向上させることができる。したがって、PDC1多コピー導入のデメリットを回避することができる。
【0022】
また、好ましい他のプロモーター群は、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター及びTDH3遺伝子プロモーターからなる群が挙げられる。このプロモーター群によれば、特に、L−乳酸の生産に適したプロモーターの組み合わせを得ることができる。このプロモーター群から構成される組み合わせにおいても、PDC1遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。また、PDC1遺伝子プロモーターに対して、HOR7遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター及びTDH3遺伝子プロモーターのいずれか又は2種類以上を組み合わせることが可能である。PDC1遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードDNAを導入した形質転換体は、PDC1遺伝子プロモーターを単独で利用して同導入数のコードDNAを導入した形質転換体よりも高いD−乳酸生産量が得られ、PDC1遺伝子プロモーターによる多コピー数導入のデメリットを回避できる。PDC1遺伝子プロモーターに組み合わせるプロモーターとしては、HOR7遺伝子プロモーターが好ましい。
【0023】
なお、本発明のプロモーターを構成するポリヌクレオチドは、ゲノムDNAであってもよく、また、化学的な手法等により人工的に得られたDNAであってもよい。
【0024】
こうしたプロモーターとしては、配列番号1〜12に記載される塩基配列からなるDNAが挙げられる。配列番号1〜12に記載された塩基配列で示されるプロモーターは、それぞれ、酵母サッカロマイセスセレビジエのピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2遺伝子(TDH2遺伝子)プロモーター、熱ショックタンパク質30遺伝子(HSP30遺伝子)プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7遺伝子(HXT7遺伝子)プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1遺伝子(AHP1遺伝子)プロモーター、膜タンパク質1関連遺伝子(MRH1遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1遺伝子(TDH1遺伝子)プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1遺伝子(TPI1遺伝子)プロモーター、細胞壁関連タンパク質12遺伝子(CCW12遺伝子)リボゾーマルプロテインS31遺伝子(RSP31遺伝子)プロモーターの各プロモーター活性を有するDNA断片として取得されたものである。本発明のプロモーターは、これらのプロモーターの他、他の酵母や微生物などから上記した塩基配列又はその一部に基づいてハイブリダイゼーション技術や、PCR技術を利用して得られかつ同等のプロモーター活性を有するこれらのプロモーターの相同体を含んでいる。
【0025】
プロモーターの相同体は、上記各配列番号に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、各配列番号に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA又はその一部のDNAをプローブとして、一般的なハイブリダイゼーション技術(Southern,EM., J Mol Biol, 1975,98,503.)により得ることができる。また、かかるDNAは、各配列番号に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR技術(Saiki,RK.Science,1985,230,1350., et al.,Saiki, RK.et al.,Science,1988,239,487)により合成することもできる。こうしたDNAの単離に好ましく用いられるストリンジェントな条件としては、50%ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が37℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いDNAを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、50%ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約42℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、50%ホルムアミド存在下で約65℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【0026】
また、プロモーターの相同体は、各配列番号に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって酸性条件下でプロモーター活性を有するものが挙げられる。このようなDNAは、既に述べたハイブリダイゼーション技術やPCR技術等によって得ることもできるし、また、Site−directedmutagenesis法(Kramer, W.& Fritz,HJ.,Method Enzymol.,1987,154,350)によって、各配列番号に記載の塩基配列に人工的に変異を導入することによっても得ることができる。
【0027】
なお、これらのプロモーターの相同体における各配列番号記載の塩基配列との相同性は、単離されたDNAにおいて70%以上であることが好ましく、より好ましくは80%以上であり、さらに好ましくは90%以上である。なお、DNAの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムBLAST(http://blast.genome.ad.jp),FASTA(http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html)などによって決定することができる。
【0028】
本発明のプロモーターは、本プロモーター活性を有する限りこのような各種形態のDNAの一部分であってもよい。
【0029】
1−2.有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNA
本形質転換体は、本プロモーターに対して機能的に結合された所望のタンパク質をコードするDNA(以下、コードDNAともいう。)を備えている。コードDNAは、cDNAのみならず、転写されても翻訳されないDNA配列を含むものであってもよい。タンパク質は特に限定しないが、コードDNAは乳酸等の有機酸生産のためのDNA、すなわち、有機酸生産に関連する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAとすることができる。かかるタンパク質をコードするDNAを本プロモーターに対して機能的に結合させることで、相乗的に有機酸生産が促進されることが期待される。このような酵素としては、乳酸生産の場合には、L−乳酸脱水素酵素、D−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルCoAシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。
【0030】
乳酸脱水素酵素(LDH)としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のLDHの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたLDHも包含している。LDHとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。L−LDHとしては、ウシ由来のLDH(L−LDH)である。例えば、ウシ由来のLDHとして配列番号14に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるLDHをコードするDNAとしては、配列番号13に記載される塩基配列からなるDNAを挙げることができる。さらに、本発明におけるLDHは、これらのLDHのホモログも包含している。LDHホモログは、天然由来のLDHのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸でありかつLDH活性を有しているタンパク質、および、天然由来のLDHとアミノ配列の相同性が少なくとも70%、好ましくは80%以上を有しかつLDH活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、D−LDHとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のD−LDHである。
【0031】
1−3.プロモーターとコードDNAとの保持形態
本発明の形質転換体は、本プロモーターと、コードDNAとを備えるが、これらのセットは、細胞質あるいは宿主細胞において宿主染色体外において保持されていてもよいし、また、宿主染色体に組み込まれて保持されていてもよい。好ましくは染色体上に保持されている。
【0032】
これらのセットが染色体上に保持されるときには、これらの染色体組み込みと同時に宿主染色体上の所望の遺伝子を破壊することができる。破壊する遺伝子は、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子であることが好ましいが、これについては後述する。例えば、サッカロマイセス属酵母などの酵母において、有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを用いて有機酸を生産する場合、PDC1遺伝子を破壊することが好ましい。PDC1遺伝子はオートレギュレーション機構が存在する遺伝子であるとともに、強力なプロモーターであるPDC1遺伝子プロモーターによって制御されるため、この遺伝子を破壊することにより、有機酸生産酵素と競合する関係にあるエタノール生産酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制することができる。
【0033】
特に、乳酸脱水素酵素をコードするDNAを用いて乳酸を生産する場合には、当該破壊形態が一層有効である。PDC1遺伝子は、乳酸脱水素酵素の基質であるピルビン酸を基質とし乳酸脱水素酵素に対して競合的に作用するからである。該遺伝子を破壊することで、ピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制し乳酸脱水素酵素を発現させることができ、同時に乳酸脱水素酵素は本プロモーターDNAにより有機酸(乳酸)存在下において発現が活性化されるため、乳酸生産がより一層促進されるものと期待される。
【0034】
PDC1遺伝子を破壊する場合、PDC1遺伝子座においてコードDNAを発現させるのに用いるプロモーターは、上記したプロモーターのいずれであってもよいが、PDC1遺伝子プロモーター下でコードDNAを発現させることが好ましい。PDC1遺伝子プロモーターは、内在性のものであってもよいし、コードDNAと同様に外来性であってもよい。
【0035】
なお、PDC1遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である(特開2003−164295号)。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が存在するため、例えば、酵母のPDC1遺伝子が破壊されたとしても、PDC5遺伝子が活性化され、酵母のエタノール生産機能は維持され、生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来DNAを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。
【0036】
なお、多数のコピー数で本プロモーターの制御下でコードDNAを宿主染色体に導入する場合、遺伝子の導入部位は特に限定しないが、副生成物であるグリセロール量を低減するという目的では、グリセロール生産に関与する遺伝子であるGPD1遺伝子、GPD2遺伝子に導入し、これら遺伝子を破壊することが好ましい。この他、副生成物を低減させる目的であればその副生成物の生産に関連する遺伝子を破壊することが好ましい。これらの遺伝子座には、それぞれプロモーターとコードDNAとのセットが1セットのみ導入されることが好ましい。
【0037】
1−4.コードDNAのコピー数
コードDNAは、プロモーターの下流に機能的に結合された状態で保持される。こうした状態で保持されるコードDNAのコピー数の合計は、2コピー又は3コピー以上である。コピー数は、用いるプロモーターの種類にもよるが、好ましくは10コピー以下である。コピー数が10を大きく超えると、宿主の増殖機能等の維持が難しくなる場合があるからである。
【0038】
プロモーターとしてPDC1遺伝子プロモーターを利用する場合、PDC1遺伝子プロモーターは2コピー以上であることが好ましい。酵母においては宿主染色体上にPDC1遺伝子プロモーターを有しており、この遺伝子座を利用することでPDC1遺伝子プロモーターを2コピー保持することができる。また、PDC1遺伝子プロモーターは、コピー数におおよそ応じた範囲の発現増強効果が得られる範囲内で3コピー以上が保持されていてもよい。生産しようとする有機酸の種類や利用する宿主の種類等によりPDC1遺伝子プロモーターが有効に働くコピー数が異なる。
【0039】
例えば、酵母におけるD−乳酸の製造にあたっては、PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するコードDNAは2コピーであることが好ましい。D−乳酸の生産にあたっては、PDC1遺伝子プロモーターによるコピー数が3以上であると、発現増強効果がコピー数に対応しなくなる傾向があるからである。
【0040】
また、PDC1遺伝子プロモーターを好ましくは2コピーと、この群のPDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターを好ましくは合計で2コピー以上、より好ましくは合計で4コピー以上備える形質転換酵母は、同数のコピー数でPDC1遺伝子プロモーターが導入された形質転換酵母よりも高いD−乳酸生産能を備えることができるとともに高い炭素源代謝能を備えることができる。特に、PDC1遺伝子プロモーターと、HOR7遺伝子プロモーターとTDH2遺伝子プロモーターとの組み合わせが好ましく用いられる。
【0041】
また、L−乳酸の生産にあたっては、好ましくは4コピー以上であり、より好ましくは6コピー以上、さらに好ましくは8コピー以上である。L−乳酸の場合、PDC1遺伝子プロモーターのコピー数が8コピー程度までは、コピー数におおよそ見あった発現増強効果が得られるからである。さらに、PDC1遺伝子プロモーターを6コピー以上、より好ましくは8コピー以上とこのプロモーター群のPDC1遺伝子プロモーター以外の他のプロモーターを1コピー以上好ましくは2コピー以上保持する形質転換酵母は、同数のコピー数でPDC1遺伝子プロモーターが導入された形質転換酵母よりも極めて高いL−乳酸生産能を備えることができる。PDC1遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードDNAを導入した形質転換体では、これらのプロモーターの総導入数と同導入数でPDC1遺伝子プロモーターを単独で利用してコードDNAを導入した形質転換体よりも高いD−乳酸生産量が得られる。特に、HOR7遺伝子プロモーターが好ましく用いられる。
【0042】
2.形質転換体の製造方法
以上説明した形質転換体は、本プロモーターとコードDNAとを備えるDNA構築物を宿主細胞に導入し形質転換させることにより得ることができる。したがって、本発明の一つの態様として有機酸を生産する形質転換体の作製用のDNA構築物も包含する。プロモーターの少なくとも一つはPDC1遺伝子プロモーターであることから、少なくとも、PDC1遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第1のDNA構築物と、PDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第2のDNA構築物とを宿主に導入することが好ましい。
【0043】
(DNA構築物)
DNA構築物は、特に限定しないで、DNAそのもの、プラスミド(DNA)、ウイルス(DNA)バクテリオファージ(DNA)、レトロトランスポゾン(DNA)、人工染色体(YAC、PAC、BAC、MAC等)を、外来遺伝子の導入形態(染色体外あるいは染色体内)や宿主細胞の種類に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。
【0044】
本発明におけるDNA構築物は、本プロモーターやコードDNAを染色体上に組み込むためには、例えば、染色体のPDC1遺伝子座等の所定部位への相同組換え用のDNA配列を備えるようにする。このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用DNA配列の選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用DNA配列を選択して相同組換え用DNA構築物を構成することができる。
【0045】
なお、DNA構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性G418遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。
【0046】
なお、DNA構築物は、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、PEG法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。これにより本発明の形質転換体を得ることができる。本DNA構築物の導入後、その宿主細胞は、選択培地で培養される。
【0047】
なお、本DNA構築物が宿主に導入されたか否か、あるいは染色体上の所望の部位に本DNA構築物が導入されたか否かの確認は、PCR法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、導入部位特異的プライマーによりPCRを行い、PCR産物については、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでPCRを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
【0048】
3.有機酸の生産方法
本発明の有機酸の生産方法は、これらの形質転換体のいずれかを準備する工程と、この形質転換体を培養する工程と、を備えている。本発明の形質転換体を培養することにより、培養液などの培地中に外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を生成させることができる。このような有機酸生産方法によれば、複数種類のプロモーターによりコードDNAの発現が促進されるため、有機酸を大量に生産させることができる。
【0049】
本発明の方法において、前記培養工程の培養条件は適宜設定することができるが、例えば、乳酸製造のためには、静置培養、振とう培養、または通気攪拌培養等の通気条件を適宜選択して行うことができる。温度は、25℃〜35℃程度とし、pH4.0〜8.0の範囲とし、培養時間は24〜72時間程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【0050】
この他、培養工程においては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。乳酸などの有機酸の生産にあたっては、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。
【0051】
培地から有機酸を分離する工程を実施することにより、有機酸を得ることができる。なお、本発明において培地とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本方法の培養工程において有機酸を中和している場合には、適当な脱塩工程を実施することでフリーの有機酸を採取できる。必要に応じて、有機酸含有画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。
【実施例1】
【0052】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
【0053】
(2コピー染色体導入型ベクター)
(1)PDC1プロモーター発現のベクター
PDC1プロモーター下でD−乳酸脱水素酵素を発現させるためのpBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターを作製した。なお、pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターの構成図を図1に示す。
【0054】
(2)TDH2プロモーター発現用ベクターの作製
TDH2プロモーター下でD−乳酸脱水素酵素を発現させるためのベクターを、pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターのD−LDH・CYC1Tカセットを制限酵素SpeI、BamHIで切り出して、pBTrp−TDH2P−LDHベクターのSpeI、BamHIサイトに導入してpBTrp−TDH2P−LDHベクターを構築した。なお、pBTrp−TDH2P−LDHベクターを図2に示す。
【0055】
(3)HOR7プロモーター発現用ベクターの作製
HOR7プロモーター下でD−乳酸脱水素酵素を発現させるためのベクターを、pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターのD−LDH・CYC1Tカセットを制限酵素SpeI、BamHIで切り出して、pBTrp−HOR7P−LDHベクターのSpeI、BamHIサイトに導入してpBTrp−HOR7P−LDHベクターを構築した。なお、pBTrp−HOR7P−LDHベクターを図3に示す。
【実施例2】
【0056】
(4コピー染色体導入型ベクターの作製)
(1)HOR7発現用ベクター
pBTrp−HOR7−LDHベクターのHOR7P・D−LDH・CYC1Tカセットを制限酵素NotI及びBamHIで切り出して、pBCAT−PTベクターのNotI/BamHIサイトに導入して、pBCAT−HOR7P−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターに、PCR増幅して得たGPD1下流断片とGPD1上流断片を順次連結して、pBCHO−DLDHベクター(図4)を構築した。なお、GPD1上流及び下流断片のPCR増幅には、表1に示すプライマーを用いるとともに、TaKaRaEx Taq(商標)を用い、Gene AmpPCRSystem9700(PE Applied BioSystems社製)で94℃、1分の処理後、94℃で30秒、53℃で30秒及び72℃で30秒を1サイクルとする反応を25サイクル実施後、4℃で保冷して増幅断片を得た。鋳型DNAは、酵母IFO2260のゲノムを用いた。なお、pBCAT−PTベクターを、図5に示す。
【0057】
【表1】
【0058】
(2)PDC1プロモーター発現のベクター
pBTrp−PDC1P−DLDHMEベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBCHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBCPD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD1上流断片を連結して、pBCPD−DLDHベクター(図6)を構築した。
【0059】
(3)TDH2プロモーター発現用ベクター
pBTrp−TDH2P−DLDHベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBCHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBCPD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD1上流断片を連結して、pBCTD−DLDHベクター(図7)を構築した。
【実施例3】
【0060】
(6コピー染色体導入型ベクターの作製)
(1)HOR7プロモーター発現用ベクター
pBhph−PTベクターのTDH3・ハイグロマイシン・CYC1Tカセットを制限酵素BamHI及びXhoIで切り出して、pBCHO−DLDHのSpeI/XhoIサイトに導入して、pBHHO−DLDHベクターを構築した。次いで、本ベクターにPCR増幅したGPD2下流断片及びGPD2上流断片を順次連結して、pBHHO2−DLDHベクター(図8)を構築した。なお、GPD2上流及び下流断片のPCR増幅には、表2に示すプライマーを用いるとともに、TaKaRaEx Taq(商標)を用い、Gene AmpPCRSystem9700(PE Applied BioSystems社製)で94℃、1分の処理後、94℃で30秒、53℃で30秒及び72℃で30秒を1サイクルとする反応を25サイクル実施後、4℃で保冷して増幅断片を得た。鋳型DNAは、酵母IFO2260のゲノムを用いた。なお、pBhph−PTベクターを、図9に示す。
【表2】
【0061】
(2)TDH2プロモーター発現用ベクター
pBTrp−TDH2P−DLDHベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBHHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBHTD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD2上流断片及び下流断片を順次連結して、pBHTD2−DLDHベクター(図10)を構築した。
【0062】
(2)PDC1プロモーター発現用ベクター
pBTrp−PDC1P−DLDHMEベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBHHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBHPD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD2上流断片及び下流断片を順次連結して、pBHPD2−DLDHベクター(図11)を構築した。
【0063】
なお、上記の一連のDNA連結反応は、LigaFast Rapid DNA Ligation(プロメガ社製)を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。また、Ligation反応溶液のコンピテント細胞への形質転換には、大腸菌JM109株(東洋紡社製)を使用した。いずれの場合も、抗生物質アンピシリン100μg/mlを含有したLBプレート下でコロニー選抜を行い、各コロニー用いたコロニーPCRを行うことで、目的のベクターであるかを確認した。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等の一連操作の詳細なマニュアルは、Molecular Cloning “A Laboratory Manual second edition”(Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989)に従った。
【実施例4】
【0064】
(D−乳酸生産形質転換酵母の作製)
(1)2コピー導入株の作製
宿主である酵母IFO2260株(社団法人・発酵研究所に登録されている菌株)のトリプトファン合成能が欠損した株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例1にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素PvuII処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、pBTRP−PDC1P−DLDHMEベクター、pBTRP−TDH2P−DLDHベクター、pBTRP−HOR7P−DLDHベクターの3種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてトリプトファン選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【0065】
得られたそれぞれのコロニーを新たなトリプトファン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をYPD培養液2mlで一晩培養し、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【0066】
この株を胞子形成培地(1%酢酸カリウム、2%アガ−含有)において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のPDC1遺伝子領域の両方にPDC1遺伝子が破壊されたD−LDH遺伝子が組み込まれている株を取得した。このうち、D−LDH遺伝子のプロモーターがPDC1遺伝子プロモーターであるものをTC14株、TDH2遺伝子プロモーターであるものをTD10株、HOR7遺伝子プロモーターであるものをTD9株とした。
【0067】
(2)4コピー導入株の作製
D−LDH遺伝子が2コピー導入されたTC14株の一つであるTC14−6−3A株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例2にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素KpnI及びBstXIで処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、pBCTD−DLDHベクター、pBCHO−DLDHベクター、pBCPD−DLDHベクターの3種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてクロラムフェニコール選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【0068】
得られたそれぞれのコロニーを新たなクロラムフェニコール選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をYPD培養液2mlで一晩培養し、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【0069】
この株を胞子形成培地(1%酢酸カリウム、2%アガ−含有)において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGPD1遺伝子領域の両方にGPD1遺伝子が破壊されたD−LDH遺伝子が組み込まれている株を取得した。この株は、既にPDC1遺伝子が破壊されてD−LDH遺伝子が2コピー組み込まれているので、D−LDH遺伝子が4コピー導入されていることになる。このうち、GPD1遺伝子破壊部分のD−LDH遺伝子のプロモーターがTDH2遺伝子プロモーターであるものをTD3株、HOR7遺伝子プロモーターであるものをTD1株、PDC1遺伝子プロモーターであるものをTD15株とした。
【0070】
(2)6コピー導入株の作製
D−LDH遺伝子が4コピー導入されたTD1株の一つであるTD1−19−4A株及びTD15−13−12B株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例3にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素KpnI及びBstXIで処理し、遺伝子導入した。
【0071】
なお、TD1−19−4A株に導入した具体的な導入ベクターは、pBHHO2−DLDLHベクター、pBHTD2−DLDHベクターの2種類であった。また、TD15−12−12B株に導入した具体的な導入ベクターは、pBHTD2−DLDHベクターの2種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてハイグロマイシン選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【0072】
得られたそれぞれのコロニーを新たなハイグロマイシン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をYPD培養液2mlで一晩培養し、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【0073】
この株を胞子形成培地(1%酢酸カリウム、2%アガ−含有)において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGPD2遺伝子領域の両方にGPD2遺伝子が破壊されたD−LDH遺伝子が組み込まれている株を取得した。この株は、既にD−LDH遺伝子が4コピー組み込まれているので、D−LDH遺伝子が6コピー導入されていることになる。TD1−19−4A株のGPD2破壊部分のD−LDH遺伝子のプロモーターがHOR7遺伝子プロモーターであるものをTD5株、TDH2遺伝子プロモーターであるものをTD6株とした。また、TD15−13−12B株のGPD2遺伝子破壊部分のD−LDH遺伝子のプロモーターがPDC1遺伝子プロモーターであるものをTD16株とした。なお、TD5株及びTD6株は、それぞれ2種類及び3種類のプロモーターが含まれており、TD16株は、PDC1プロモーターのみとなっている。
【実施例5】
【0074】
(発酵試験による乳酸の生産(YPD培地))
得られた形質転換酵母をYPD液体培地5mlに植菌し、30℃、130rpmで一晩、振とう培養を行い、OD600nm=1.2のものを初発菌体とした。このうちの2mlを10%グルコース含有YPD培養液40mlに植菌し(全量42ml)、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、3日間振とう培養した。
【0075】
培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるD−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図12及び図13に示す。尚、グルコースは検出されなかった。
【0076】
図12に示すように、各プロモーターによるD−LDH遺伝子2コピー株を比較するとPDC1遺伝子プロモーターを用いた系が最も優れており(D−乳酸生産量4.5%)、TDH2遺伝子プロモーター及びHOR7遺伝子プロモーターは互いに同等であった(同3.9%)。これに対して、D−LDH遺伝子の4コピー株では、PDC1遺伝子プロモーター(同6%)よりも、PDC1プロモーターに他のプロモーターを組み合わせたものの方がD−乳酸生産量が大幅に向上していた(TDH2遺伝子プロモーターを組み合わせた株(TD3−17−8B株):7%、HOR7遺伝子プロモーターを組み合わせた株(TD1−19−4A):6.8%)。加えて、理由は定かでないが、副生成物のエタノールの生産量も抑えることができた。
【0077】
また、図13に示すように、6コピー株において比較するとPDC1単独での6コピー株(TD16−3−2A)よりも、複数種類のプロモーターを利用した6コピー体(TD15−49−1D株、TD6−6−4A株)の方がD−乳酸生産量が高いことが認められた。
【実施例6】
【0078】
(発酵試験による乳酸の生産(糖蜜含有培地))
得られた形質転換酵母を糖蜜含有液体培地(スクロース9.7%、糖蜜0.6%)60mlに菌体濃度が0.5%となるように接種し、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、3日間振とう培養した。
【0079】
培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるD−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。また、D−乳酸の対糖収率(D−乳酸生産量%/初発のスクロース濃度%)を算出した。これらの結果を図14に示す。
【0080】
図12に示すように、PDC1遺伝子プロモーターを単独で利用した4コピー株(比較例:TD15−3−2B株)に比べて、複数種類のプロモーターを用いた4コピー株(実施例:TD3―17−8B株及び6コピー株(実施例:TD6−6−4A株)は、D−乳酸生産量が大幅に増大しており、対糖収率も83%、88%であった。
【0081】
また、実施例ではグルコースも完全に消費されているとともに、エタノールの生産量が抑えられていた。複数種類のプロモーターを用いることで栄養源に乏しい培地でも乳酸を高生産できることがわかった。
【実施例7】
【0082】
本実施例では、L−乳酸生産における複数種類のプロモーターの利用について検証した。形質転換体の作製にあたっては、PDC1遺伝子プロモーターを利用して8コピーのL−LDH遺伝子を導入した株を親株として用い、計10コピーのL−LDH遺伝子を導入した形質転換酵母を作製し、発酵試験を行った。
【0083】
(10コピー発現用ベクターの構築)
(1)PDC1遺伝子プロモーター発現用ベクター
既に構築したpBHPH−PTベクターに制限酵素SpeI及びBamHIによりL−LDH断片、制限酵素SacI及びNotIよりRCS断片、制限酵素ApaI及びKpnIによりRSB9断片を順次導入し、pBHPH−LDHプレベクターを構築した。これらに、NotI及びSpeIによりPDC1プロモーター断片を連結させ、最終ベクターであるpBHPH−PDC1P−LDHKCBベクターを構築した(図15)。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを、表3に示す。
【表3】
【0084】
(2)TDH2プロモーター発現用ベクター
pBHPH−LDHプレベクターに、制限酵素、NotI及びSpeIによりTDH2遺伝子プロモーター断片を連結して、最終ベクターであるpBHPH−TDH2P−LDHKCBベクターを構築した(図16)。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを表3に示す。
【0085】
(3)TDH3プロモーター発現用ベクター
pBHPH−LDHプレベクターに、制限酵素、NotI及びSpeIによりTDH3遺伝子プロモーター断片を連結して、最終ベクターであるpBHPH−TDH3P−LDHKCBベクターを構築した(図17)。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを表3に示す。
【0086】
(4)HOR7発現用ベクター
pBCAT−PTベクターに、制限酵素SpeI及びBamHIによりL−LDH断片、制限酵素SacI及びNoIによりGPD2上流断片、ApaI及びKpnにより、GPD2下流断片を順次導入し、pBCAT−LDHプレベクターを構築した。次いで、このベクターに、制限酵素NotI及びSpeIによりHOR7遺伝子プロモーター断片を連結させて、最終ベクターであるpBCAT−HOR7P−LDHKCBベクターを構築した(図18)。
【実施例8】
【0087】
(L乳酸生産形質転換酵母の作製)
(1)10コピー導入株の作製
既に構築した乳酸生産酵母TC10−1−3B株、TC20−2−1C株(いずれもL−LDH遺伝子をPDC1遺伝子プロモーター下において8コピー保持する形質転換酵母である。)を宿主として、上記4種類の発現用ベクターを用いて形質転換した。形質転換の方法は、適切な選抜培地を用いて実施例4と同様に行い、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の存在が確認できたものを形質転換体とした。さらに、適切な選抜培地を用いて実施例4と同様に新たに導入したプロモーターとL−LDH遺伝子とを2コピー備える形質転換体を取得した。これらの形質転換体においては、L−LDH遺伝子を合計10コピー保持することとなる。得られた形質転換体におけるプロモーターの組み合わせは以下の表4に示す。
【0088】
【表4】
【実施例9】
【0089】
(発酵試験による乳酸の生産(YPD培地))
得られた形質転換酵母をYPD液体培地5mlに植菌し、30℃、130rpmで一晩、振とう培養を行い、OD600nm=1.2のものを初発菌体とした。このうちの2mlを10%グルコース含有YPD培養液4に植菌し(全量42ml)、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、3日間微好気条件下で振とう培養を行った。
【0090】
培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるL−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図19及び図20に示す。
【0091】
図14に示すように、PDC1遺伝子プロモーター制御下でLDH遺伝子を8コピー導入した株に対して、LDH遺伝子を10コピー導入した株はいずれも乳酸生産量の増大及びエタノール生産量の減少が認められた。また、プロモーターとして、PDC1遺伝子プロモーター単独よりもPDC1遺伝子プロモーターとTHD2、TDH3、HOR7遺伝子プロモーターを利用してLDH遺伝子を導入した株においてより大きな生産量の向上が認められた。以上のことから、L−LDH遺伝子を複数コピー発現させる場合においても、単一種類のプロモーターでなく、複数種類のプロモーターを用いることが有効であることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【0092】
配列番号15〜30:合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【0093】
【図1】pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターの構成図である。
【図2】pBTrp−TDH2P−LDHベクターの構成図である。
【図3】pBTrp−HOR7P−LDHベクターの構成図である。
【図4】pBCHO−DLDHベクターの構成図である。
【図5】pBCAT−PTベクターの構成図である。
【図6】pBCPD−DLDHベクターの構成図である。
【図7】pBCTD−DLDHベクターの構成図である。
【図8】pBHHO2−DLDHベクターの構成図である。
【図9】pBhph−PTベクターの構成図である。
【図10】pBHTD2−DLDHベクターの構成図である。
【図11】pBHPD2−DLDHベクターの構成図である。
【図12】各種形質転換酵母株におけるD−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【図13】各種形質転換酵母株におけるD−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【図14】各種形質転換酵母株におけるD−乳酸発酵試験の結果(糖蜜培地)を示すグラフ図である。
【図15】pBHPH−PDC1P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図16】pBHPH−TDH2P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図17】pBHPH−TDH3P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図18】pBCAT−HOR7P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図19】各種形質転換酵母株におけるL−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【図20】各種形質転換酵母株におけるL−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【技術分野】
【0001】
本発明は、有機酸生産に使用するための形質転換体に関し、詳しくは、微生物による有機酸生産に関し、対遺伝子導入数効果の高い複数種類のプロモーターを組み合わせて備える形質転換体に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え酵母などの遺伝子組換え微生物を培養すると、発酵生産により大量の目的遺伝子を生産させることが可能であるが、こうした遺伝子組換え技術を利用して物質生産を行う場合には、高発現プロモーターが必要である。例えば、L−乳酸やD−乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエ属に導入して、乳酸を生産する試みに関しては多数の報告がなされているが、そのほとんどにおいて十分な生産量が得られていない。こうしたなかで、本出願人らは、ピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子(PDC1)プロモーターが遺伝子組換え酵母による乳酸などの発酵生産において高い乳酸生産量を得られるプロモーターであることを見出し既に開示している(特許文献1)。また、染色体中のPDC1遺伝子を破壊するとともに当該遺伝子のプロモーターの下流に乳酸脱水素酵素遺伝子を結合させることでPDC1遺伝子のプロモーター機能を利用して乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させつつ、本来のPDC1タンパク質の機能を制御したシステムも見出している(特許文献2)。
【特許文献1】特開2003−164294
【特許文献2】特開2003−164295
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
組換え微生物における発酵生産においては、常に一層の大量生産が要請される。PDC1遺伝子プロモーターを利用した上記システムを用いて乳酸を高生産するには、PDC1遺伝子プロモーターを用いて乳酸脱水素酵素を複数個導入した組換え微生物の利用が試みられることが多い。しかしながら、PDC1プロモーターを利用して外来遺伝子を複数コピー導入した場合には、相応の生産量(効果)が得られる。しかしながら、外来遺伝子の導入数が多いと宿主酵母の生育能が低下し、グルコースの消費能が低下するといった問題があることもわかった。グルコース消費能の低下は、発酵速度が遅延して培養期間が長期間化することになる。
【0004】
そこで、本発明は、有機酸の発酵生産に際し、相応の対遺伝子導入数効果又は対遺伝子導入数効果の高い遺伝子発現系を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、複数個遺伝子導入しても、グルコースなど炭素原代謝能を維持又は増大させることができる遺伝子発現系を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、乳酸の発酵生産に適した遺伝子発現系を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、上記した課題を解決するために検討を重ねたところ、予想に反し、複数種類のプロモーターを組み合わせることにより、強力なプロモーターであるPDC1遺伝子プロモーターを用いた場合の対遺伝子導入数効果を上回る対遺伝子導入数効果を得ることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【0006】
本発明の一つの態様によれば、複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体が提供される。
【0007】
前記複数種類のプロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2(TDH2)遺伝子プロモーター、熱ショックタンパク質30(HSP30)遺伝子プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7(HXT7)遺伝子プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1(AHP1)遺伝子プロモーター、膜タンパク質1(MRH1)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1(TDH1)遺伝子プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1(TPI1)遺伝子プロモーター、細胞壁関連タンパク質12(CCW12)遺伝子及びリボゾーマルプロテインS31(RSP31)遺伝子プロモーターからなる群から選択されることが好ましい。
【0008】
また、前記複数種類のプロモーターの少なくとも一種類はPDC1遺伝子プロモーターとすることができ、このとき、PDC1遺伝子プロモーターにより有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを少なくとも2コピーを保持していることが好ましい。
【0009】
さらに、前記有機酸は乳酸であり、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質とすることができる。この場合、前記有機酸はD−乳酸であり、前記タンパク質は、D−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターから選択することができる。特に、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターとすることができる。また、前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されていることが好ましい。さらにまた、PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピーと、HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、を備えることも好ましい。
【0010】
また、前記有機酸は、L−乳酸であり、前記タンパク質は、L−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター、TDH3遺伝子プロモーター及びHOR7遺伝子プロモーターから選択することもできる。この複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーターとHOR7遺伝子プロモーターとすることができる。また、前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のL−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されていることが好ましい。さらにまたPDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを6コピー以上と、HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、を備えることも好ましい。
【0011】
これらのいずれかの形質転換体においては、前記複数種類のプロモーターと前記コードDNAとは、いずれも染色体上に保持されていることが好ましい。また、前記形質転換体は、酵母とすることができ、この場合、サッカロマイセス・セレビシエ属酵母とすることができる。
【0012】
また、これらのいずれかの形質転換体においては、前記染色体上に保持される少なくとも一つの前記コードDNAが染色体上のPDC1遺伝子を破壊していることが好ましい。
【0013】
本発明の他の一つの態様によれば、有機酸生産用形質転換体の製造方法であって、
少なくとも、以下の2種類のDNA構築物:
PDC1遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第1のDNA構築物及び
PDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第2のDNA構築物、
を宿主に導入することにより、PDC1遺伝子プロモーターを含む複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体を作製する工程を備える、製造方法が提供される。
【0014】
また、本発明の他の一つの態様によれば、
有機酸の生産方法であって、
上記したいずれかの形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を培地において培養して有機酸を生産する工程と、
を備える、有機酸生産方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
本発明は、複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持している形質転換体、その製造、その形質転換体を利用した有機酸生産、有機酸生産のために選択されるプロモーター群等に関する。以下、本発明の各種の態様について説明する。
【0016】
1.形質転換体
本発明の形質転換体は、Eshrichia coli、Bacillus subtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、sf9、sf21等の昆虫細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞など、遺伝子組換え細胞として利用可能な従来公知の宿主細胞から形質転換により有機酸生産が可能な細胞を用いることができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物である。酵母のエタノール発酵の酵素系列、特に、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の破壊と当該遺伝子のプロモーターによる制御によって外来遺伝子を高発現可能であるからである。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエIFO2260株や同YPH株を例示できる。
【0017】
本発明の形質転換体は、有機酸生産用とすることができる。本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができ、好ましくは、乳酸である。乳酸には、L−乳酸、D−乳酸、及びDL−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【0018】
1−1.プロモーター
本発明の形質転換体は、複数種類のプロモーターと、これらのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNA(以下、コードDNAという。)と、を保持している。以下、本形質転換体におけるプロモーターについて説明する。
【0019】
本形質転換体における複数種類のプロモーターとしては、形質転換体においてプロモーター活性を発現可能なプロモーターの集合(プロモーター群)から選択される2種以上とすることができる。このようなプロモーター群としては、ピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2遺伝子(TDH2遺伝子)プロモーター、熱ショックタンパク質30遺伝子(HSP30遺伝子)プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7遺伝子(HXT7遺伝子)プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1遺伝子(AHP1遺伝子)プロモーター、膜タンパク質1関連遺伝子(MRH1遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1遺伝子(TDH1遺伝子)プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1遺伝子(TPI1遺伝子)プロモーター及び細胞壁関連タンパク質12遺伝子(CCW12遺伝子)及びリボゾーマルプロテインS31遺伝子(RSP31遺伝子)プロモーターから選択される2種類以上が挙げられる。これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、本発明の形質転換酵母において好ましく用いられる。
【0020】
こうしたプロモーター群から選択される複数種類のプロモーターとしては、少なくともPDC1遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。PDC1プロモーターは、一定の遺伝子導入数以上でその遺伝子導入数に見合った遺伝子発現増強効果が得られにくくなるものの、単独で強力なプロモーターであるとともに、酵母において有機酸を生産させるのに有効なプロモーターであるからである。特に、酵母のPDC1遺伝子を破壊するとともにPDC1遺伝子プロモーターの制御下で有機酸生産に関与するタンパク質をコードする外来DNAを発現させることに有効である。
【0021】
好ましい組み合わせのプロモーターを選択できるプロモーター群としては、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターからなるプロモーター群が挙げられる。このプロモーター群から選択される2種類又は3種類のプロモーターの組み合わせは、D−乳酸の生産に適している。このプロモーター群に基づくプロモーターの組み合わせは、必ずしもPDC1遺伝子プロモーターを含んでいる必要はないが、好ましくは、PDC1遺伝子プロモーターを含んでいる。PDC1遺伝子プロモーターに対して、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターのいずれをも組み合わせることができるが、これら3種全てを含む組み合わせであってもよい。PDC1遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードDNAを導入した形質転換体では、PDC1遺伝子プロモーターを単独で利用して同導入数のコードDNAを導入した形質転換体よりも高いD−乳酸生産量が得られる。また、このような形質転換体は、炭素源代謝能を維持又は向上させることができる。したがって、PDC1多コピー導入のデメリットを回避することができる。
【0022】
また、好ましい他のプロモーター群は、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター及びTDH3遺伝子プロモーターからなる群が挙げられる。このプロモーター群によれば、特に、L−乳酸の生産に適したプロモーターの組み合わせを得ることができる。このプロモーター群から構成される組み合わせにおいても、PDC1遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。また、PDC1遺伝子プロモーターに対して、HOR7遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター及びTDH3遺伝子プロモーターのいずれか又は2種類以上を組み合わせることが可能である。PDC1遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードDNAを導入した形質転換体は、PDC1遺伝子プロモーターを単独で利用して同導入数のコードDNAを導入した形質転換体よりも高いD−乳酸生産量が得られ、PDC1遺伝子プロモーターによる多コピー数導入のデメリットを回避できる。PDC1遺伝子プロモーターに組み合わせるプロモーターとしては、HOR7遺伝子プロモーターが好ましい。
【0023】
なお、本発明のプロモーターを構成するポリヌクレオチドは、ゲノムDNAであってもよく、また、化学的な手法等により人工的に得られたDNAであってもよい。
【0024】
こうしたプロモーターとしては、配列番号1〜12に記載される塩基配列からなるDNAが挙げられる。配列番号1〜12に記載された塩基配列で示されるプロモーターは、それぞれ、酵母サッカロマイセスセレビジエのピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2遺伝子(TDH2遺伝子)プロモーター、熱ショックタンパク質30遺伝子(HSP30遺伝子)プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7遺伝子(HXT7遺伝子)プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1遺伝子(AHP1遺伝子)プロモーター、膜タンパク質1関連遺伝子(MRH1遺伝子)プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1遺伝子(TDH1遺伝子)プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1遺伝子(TPI1遺伝子)プロモーター、細胞壁関連タンパク質12遺伝子(CCW12遺伝子)リボゾーマルプロテインS31遺伝子(RSP31遺伝子)プロモーターの各プロモーター活性を有するDNA断片として取得されたものである。本発明のプロモーターは、これらのプロモーターの他、他の酵母や微生物などから上記した塩基配列又はその一部に基づいてハイブリダイゼーション技術や、PCR技術を利用して得られかつ同等のプロモーター活性を有するこれらのプロモーターの相同体を含んでいる。
【0025】
プロモーターの相同体は、上記各配列番号に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、各配列番号に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA又はその一部のDNAをプローブとして、一般的なハイブリダイゼーション技術(Southern,EM., J Mol Biol, 1975,98,503.)により得ることができる。また、かかるDNAは、各配列番号に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR技術(Saiki,RK.Science,1985,230,1350., et al.,Saiki, RK.et al.,Science,1988,239,487)により合成することもできる。こうしたDNAの単離に好ましく用いられるストリンジェントな条件としては、50%ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が37℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いDNAを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、50%ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約42℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、50%ホルムアミド存在下で約65℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【0026】
また、プロモーターの相同体は、各配列番号に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって酸性条件下でプロモーター活性を有するものが挙げられる。このようなDNAは、既に述べたハイブリダイゼーション技術やPCR技術等によって得ることもできるし、また、Site−directedmutagenesis法(Kramer, W.& Fritz,HJ.,Method Enzymol.,1987,154,350)によって、各配列番号に記載の塩基配列に人工的に変異を導入することによっても得ることができる。
【0027】
なお、これらのプロモーターの相同体における各配列番号記載の塩基配列との相同性は、単離されたDNAにおいて70%以上であることが好ましく、より好ましくは80%以上であり、さらに好ましくは90%以上である。なお、DNAの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムBLAST(http://blast.genome.ad.jp),FASTA(http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html)などによって決定することができる。
【0028】
本発明のプロモーターは、本プロモーター活性を有する限りこのような各種形態のDNAの一部分であってもよい。
【0029】
1−2.有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNA
本形質転換体は、本プロモーターに対して機能的に結合された所望のタンパク質をコードするDNA(以下、コードDNAともいう。)を備えている。コードDNAは、cDNAのみならず、転写されても翻訳されないDNA配列を含むものであってもよい。タンパク質は特に限定しないが、コードDNAは乳酸等の有機酸生産のためのDNA、すなわち、有機酸生産に関連する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAとすることができる。かかるタンパク質をコードするDNAを本プロモーターに対して機能的に結合させることで、相乗的に有機酸生産が促進されることが期待される。このような酵素としては、乳酸生産の場合には、L−乳酸脱水素酵素、D−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルCoAシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。
【0030】
乳酸脱水素酵素(LDH)としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のLDHの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたLDHも包含している。LDHとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。L−LDHとしては、ウシ由来のLDH(L−LDH)である。例えば、ウシ由来のLDHとして配列番号14に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるLDHをコードするDNAとしては、配列番号13に記載される塩基配列からなるDNAを挙げることができる。さらに、本発明におけるLDHは、これらのLDHのホモログも包含している。LDHホモログは、天然由来のLDHのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸でありかつLDH活性を有しているタンパク質、および、天然由来のLDHとアミノ配列の相同性が少なくとも70%、好ましくは80%以上を有しかつLDH活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、D−LDHとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のD−LDHである。
【0031】
1−3.プロモーターとコードDNAとの保持形態
本発明の形質転換体は、本プロモーターと、コードDNAとを備えるが、これらのセットは、細胞質あるいは宿主細胞において宿主染色体外において保持されていてもよいし、また、宿主染色体に組み込まれて保持されていてもよい。好ましくは染色体上に保持されている。
【0032】
これらのセットが染色体上に保持されるときには、これらの染色体組み込みと同時に宿主染色体上の所望の遺伝子を破壊することができる。破壊する遺伝子は、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子であることが好ましいが、これについては後述する。例えば、サッカロマイセス属酵母などの酵母において、有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを用いて有機酸を生産する場合、PDC1遺伝子を破壊することが好ましい。PDC1遺伝子はオートレギュレーション機構が存在する遺伝子であるとともに、強力なプロモーターであるPDC1遺伝子プロモーターによって制御されるため、この遺伝子を破壊することにより、有機酸生産酵素と競合する関係にあるエタノール生産酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制することができる。
【0033】
特に、乳酸脱水素酵素をコードするDNAを用いて乳酸を生産する場合には、当該破壊形態が一層有効である。PDC1遺伝子は、乳酸脱水素酵素の基質であるピルビン酸を基質とし乳酸脱水素酵素に対して競合的に作用するからである。該遺伝子を破壊することで、ピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制し乳酸脱水素酵素を発現させることができ、同時に乳酸脱水素酵素は本プロモーターDNAにより有機酸(乳酸)存在下において発現が活性化されるため、乳酸生産がより一層促進されるものと期待される。
【0034】
PDC1遺伝子を破壊する場合、PDC1遺伝子座においてコードDNAを発現させるのに用いるプロモーターは、上記したプロモーターのいずれであってもよいが、PDC1遺伝子プロモーター下でコードDNAを発現させることが好ましい。PDC1遺伝子プロモーターは、内在性のものであってもよいし、コードDNAと同様に外来性であってもよい。
【0035】
なお、PDC1遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である(特開2003−164295号)。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が存在するため、例えば、酵母のPDC1遺伝子が破壊されたとしても、PDC5遺伝子が活性化され、酵母のエタノール生産機能は維持され、生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来DNAを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。
【0036】
なお、多数のコピー数で本プロモーターの制御下でコードDNAを宿主染色体に導入する場合、遺伝子の導入部位は特に限定しないが、副生成物であるグリセロール量を低減するという目的では、グリセロール生産に関与する遺伝子であるGPD1遺伝子、GPD2遺伝子に導入し、これら遺伝子を破壊することが好ましい。この他、副生成物を低減させる目的であればその副生成物の生産に関連する遺伝子を破壊することが好ましい。これらの遺伝子座には、それぞれプロモーターとコードDNAとのセットが1セットのみ導入されることが好ましい。
【0037】
1−4.コードDNAのコピー数
コードDNAは、プロモーターの下流に機能的に結合された状態で保持される。こうした状態で保持されるコードDNAのコピー数の合計は、2コピー又は3コピー以上である。コピー数は、用いるプロモーターの種類にもよるが、好ましくは10コピー以下である。コピー数が10を大きく超えると、宿主の増殖機能等の維持が難しくなる場合があるからである。
【0038】
プロモーターとしてPDC1遺伝子プロモーターを利用する場合、PDC1遺伝子プロモーターは2コピー以上であることが好ましい。酵母においては宿主染色体上にPDC1遺伝子プロモーターを有しており、この遺伝子座を利用することでPDC1遺伝子プロモーターを2コピー保持することができる。また、PDC1遺伝子プロモーターは、コピー数におおよそ応じた範囲の発現増強効果が得られる範囲内で3コピー以上が保持されていてもよい。生産しようとする有機酸の種類や利用する宿主の種類等によりPDC1遺伝子プロモーターが有効に働くコピー数が異なる。
【0039】
例えば、酵母におけるD−乳酸の製造にあたっては、PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するコードDNAは2コピーであることが好ましい。D−乳酸の生産にあたっては、PDC1遺伝子プロモーターによるコピー数が3以上であると、発現増強効果がコピー数に対応しなくなる傾向があるからである。
【0040】
また、PDC1遺伝子プロモーターを好ましくは2コピーと、この群のPDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターを好ましくは合計で2コピー以上、より好ましくは合計で4コピー以上備える形質転換酵母は、同数のコピー数でPDC1遺伝子プロモーターが導入された形質転換酵母よりも高いD−乳酸生産能を備えることができるとともに高い炭素源代謝能を備えることができる。特に、PDC1遺伝子プロモーターと、HOR7遺伝子プロモーターとTDH2遺伝子プロモーターとの組み合わせが好ましく用いられる。
【0041】
また、L−乳酸の生産にあたっては、好ましくは4コピー以上であり、より好ましくは6コピー以上、さらに好ましくは8コピー以上である。L−乳酸の場合、PDC1遺伝子プロモーターのコピー数が8コピー程度までは、コピー数におおよそ見あった発現増強効果が得られるからである。さらに、PDC1遺伝子プロモーターを6コピー以上、より好ましくは8コピー以上とこのプロモーター群のPDC1遺伝子プロモーター以外の他のプロモーターを1コピー以上好ましくは2コピー以上保持する形質転換酵母は、同数のコピー数でPDC1遺伝子プロモーターが導入された形質転換酵母よりも極めて高いL−乳酸生産能を備えることができる。PDC1遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードDNAを導入した形質転換体では、これらのプロモーターの総導入数と同導入数でPDC1遺伝子プロモーターを単独で利用してコードDNAを導入した形質転換体よりも高いD−乳酸生産量が得られる。特に、HOR7遺伝子プロモーターが好ましく用いられる。
【0042】
2.形質転換体の製造方法
以上説明した形質転換体は、本プロモーターとコードDNAとを備えるDNA構築物を宿主細胞に導入し形質転換させることにより得ることができる。したがって、本発明の一つの態様として有機酸を生産する形質転換体の作製用のDNA構築物も包含する。プロモーターの少なくとも一つはPDC1遺伝子プロモーターであることから、少なくとも、PDC1遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第1のDNA構築物と、PDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第2のDNA構築物とを宿主に導入することが好ましい。
【0043】
(DNA構築物)
DNA構築物は、特に限定しないで、DNAそのもの、プラスミド(DNA)、ウイルス(DNA)バクテリオファージ(DNA)、レトロトランスポゾン(DNA)、人工染色体(YAC、PAC、BAC、MAC等)を、外来遺伝子の導入形態(染色体外あるいは染色体内)や宿主細胞の種類に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。
【0044】
本発明におけるDNA構築物は、本プロモーターやコードDNAを染色体上に組み込むためには、例えば、染色体のPDC1遺伝子座等の所定部位への相同組換え用のDNA配列を備えるようにする。このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用DNA配列の選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用DNA配列を選択して相同組換え用DNA構築物を構成することができる。
【0045】
なお、DNA構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性G418遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。
【0046】
なお、DNA構築物は、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、PEG法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。これにより本発明の形質転換体を得ることができる。本DNA構築物の導入後、その宿主細胞は、選択培地で培養される。
【0047】
なお、本DNA構築物が宿主に導入されたか否か、あるいは染色体上の所望の部位に本DNA構築物が導入されたか否かの確認は、PCR法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、導入部位特異的プライマーによりPCRを行い、PCR産物については、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでPCRを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
【0048】
3.有機酸の生産方法
本発明の有機酸の生産方法は、これらの形質転換体のいずれかを準備する工程と、この形質転換体を培養する工程と、を備えている。本発明の形質転換体を培養することにより、培養液などの培地中に外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を生成させることができる。このような有機酸生産方法によれば、複数種類のプロモーターによりコードDNAの発現が促進されるため、有機酸を大量に生産させることができる。
【0049】
本発明の方法において、前記培養工程の培養条件は適宜設定することができるが、例えば、乳酸製造のためには、静置培養、振とう培養、または通気攪拌培養等の通気条件を適宜選択して行うことができる。温度は、25℃〜35℃程度とし、pH4.0〜8.0の範囲とし、培養時間は24〜72時間程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【0050】
この他、培養工程においては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。乳酸などの有機酸の生産にあたっては、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。
【0051】
培地から有機酸を分離する工程を実施することにより、有機酸を得ることができる。なお、本発明において培地とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本方法の培養工程において有機酸を中和している場合には、適当な脱塩工程を実施することでフリーの有機酸を採取できる。必要に応じて、有機酸含有画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。
【実施例1】
【0052】
以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
【0053】
(2コピー染色体導入型ベクター)
(1)PDC1プロモーター発現のベクター
PDC1プロモーター下でD−乳酸脱水素酵素を発現させるためのpBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターを作製した。なお、pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターの構成図を図1に示す。
【0054】
(2)TDH2プロモーター発現用ベクターの作製
TDH2プロモーター下でD−乳酸脱水素酵素を発現させるためのベクターを、pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターのD−LDH・CYC1Tカセットを制限酵素SpeI、BamHIで切り出して、pBTrp−TDH2P−LDHベクターのSpeI、BamHIサイトに導入してpBTrp−TDH2P−LDHベクターを構築した。なお、pBTrp−TDH2P−LDHベクターを図2に示す。
【0055】
(3)HOR7プロモーター発現用ベクターの作製
HOR7プロモーター下でD−乳酸脱水素酵素を発現させるためのベクターを、pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターのD−LDH・CYC1Tカセットを制限酵素SpeI、BamHIで切り出して、pBTrp−HOR7P−LDHベクターのSpeI、BamHIサイトに導入してpBTrp−HOR7P−LDHベクターを構築した。なお、pBTrp−HOR7P−LDHベクターを図3に示す。
【実施例2】
【0056】
(4コピー染色体導入型ベクターの作製)
(1)HOR7発現用ベクター
pBTrp−HOR7−LDHベクターのHOR7P・D−LDH・CYC1Tカセットを制限酵素NotI及びBamHIで切り出して、pBCAT−PTベクターのNotI/BamHIサイトに導入して、pBCAT−HOR7P−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターに、PCR増幅して得たGPD1下流断片とGPD1上流断片を順次連結して、pBCHO−DLDHベクター(図4)を構築した。なお、GPD1上流及び下流断片のPCR増幅には、表1に示すプライマーを用いるとともに、TaKaRaEx Taq(商標)を用い、Gene AmpPCRSystem9700(PE Applied BioSystems社製)で94℃、1分の処理後、94℃で30秒、53℃で30秒及び72℃で30秒を1サイクルとする反応を25サイクル実施後、4℃で保冷して増幅断片を得た。鋳型DNAは、酵母IFO2260のゲノムを用いた。なお、pBCAT−PTベクターを、図5に示す。
【0057】
【表1】
【0058】
(2)PDC1プロモーター発現のベクター
pBTrp−PDC1P−DLDHMEベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBCHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBCPD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD1上流断片を連結して、pBCPD−DLDHベクター(図6)を構築した。
【0059】
(3)TDH2プロモーター発現用ベクター
pBTrp−TDH2P−DLDHベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBCHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBCPD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD1上流断片を連結して、pBCTD−DLDHベクター(図7)を構築した。
【実施例3】
【0060】
(6コピー染色体導入型ベクターの作製)
(1)HOR7プロモーター発現用ベクター
pBhph−PTベクターのTDH3・ハイグロマイシン・CYC1Tカセットを制限酵素BamHI及びXhoIで切り出して、pBCHO−DLDHのSpeI/XhoIサイトに導入して、pBHHO−DLDHベクターを構築した。次いで、本ベクターにPCR増幅したGPD2下流断片及びGPD2上流断片を順次連結して、pBHHO2−DLDHベクター(図8)を構築した。なお、GPD2上流及び下流断片のPCR増幅には、表2に示すプライマーを用いるとともに、TaKaRaEx Taq(商標)を用い、Gene AmpPCRSystem9700(PE Applied BioSystems社製)で94℃、1分の処理後、94℃で30秒、53℃で30秒及び72℃で30秒を1サイクルとする反応を25サイクル実施後、4℃で保冷して増幅断片を得た。鋳型DNAは、酵母IFO2260のゲノムを用いた。なお、pBhph−PTベクターを、図9に示す。
【表2】
【0061】
(2)TDH2プロモーター発現用ベクター
pBTrp−TDH2P−DLDHベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBHHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBHTD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD2上流断片及び下流断片を順次連結して、pBHTD2−DLDHベクター(図10)を構築した。
【0062】
(2)PDC1プロモーター発現用ベクター
pBTrp−PDC1P−DLDHMEベクターのプロモーターカセットを制限酵素NotI及びSpeIで切り出して、pBHHO−DLDHベクターのNotI/SpeIサイトに導入して、pBHPD−DLDHpreベクターを構築した。次いで、このベクターのNotIサイトにGPD2上流断片及び下流断片を順次連結して、pBHPD2−DLDHベクター(図11)を構築した。
【0063】
なお、上記の一連のDNA連結反応は、LigaFast Rapid DNA Ligation(プロメガ社製)を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。また、Ligation反応溶液のコンピテント細胞への形質転換には、大腸菌JM109株(東洋紡社製)を使用した。いずれの場合も、抗生物質アンピシリン100μg/mlを含有したLBプレート下でコロニー選抜を行い、各コロニー用いたコロニーPCRを行うことで、目的のベクターであるかを確認した。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等の一連操作の詳細なマニュアルは、Molecular Cloning “A Laboratory Manual second edition”(Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989)に従った。
【実施例4】
【0064】
(D−乳酸生産形質転換酵母の作製)
(1)2コピー導入株の作製
宿主である酵母IFO2260株(社団法人・発酵研究所に登録されている菌株)のトリプトファン合成能が欠損した株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例1にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素PvuII処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、pBTRP−PDC1P−DLDHMEベクター、pBTRP−TDH2P−DLDHベクター、pBTRP−HOR7P−DLDHベクターの3種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてトリプトファン選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【0065】
得られたそれぞれのコロニーを新たなトリプトファン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をYPD培養液2mlで一晩培養し、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【0066】
この株を胞子形成培地(1%酢酸カリウム、2%アガ−含有)において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のPDC1遺伝子領域の両方にPDC1遺伝子が破壊されたD−LDH遺伝子が組み込まれている株を取得した。このうち、D−LDH遺伝子のプロモーターがPDC1遺伝子プロモーターであるものをTC14株、TDH2遺伝子プロモーターであるものをTD10株、HOR7遺伝子プロモーターであるものをTD9株とした。
【0067】
(2)4コピー導入株の作製
D−LDH遺伝子が2コピー導入されたTC14株の一つであるTC14−6−3A株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例2にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素KpnI及びBstXIで処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、pBCTD−DLDHベクター、pBCHO−DLDHベクター、pBCPD−DLDHベクターの3種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてクロラムフェニコール選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【0068】
得られたそれぞれのコロニーを新たなクロラムフェニコール選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をYPD培養液2mlで一晩培養し、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【0069】
この株を胞子形成培地(1%酢酸カリウム、2%アガ−含有)において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGPD1遺伝子領域の両方にGPD1遺伝子が破壊されたD−LDH遺伝子が組み込まれている株を取得した。この株は、既にPDC1遺伝子が破壊されてD−LDH遺伝子が2コピー組み込まれているので、D−LDH遺伝子が4コピー導入されていることになる。このうち、GPD1遺伝子破壊部分のD−LDH遺伝子のプロモーターがTDH2遺伝子プロモーターであるものをTD3株、HOR7遺伝子プロモーターであるものをTD1株、PDC1遺伝子プロモーターであるものをTD15株とした。
【0070】
(2)6コピー導入株の作製
D−LDH遺伝子が4コピー導入されたTD1株の一つであるTD1−19−4A株及びTD15−13−12B株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例3にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素KpnI及びBstXIで処理し、遺伝子導入した。
【0071】
なお、TD1−19−4A株に導入した具体的な導入ベクターは、pBHHO2−DLDLHベクター、pBHTD2−DLDHベクターの2種類であった。また、TD15−12−12B株に導入した具体的な導入ベクターは、pBHTD2−DLDHベクターの2種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてハイグロマイシン選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【0072】
得られたそれぞれのコロニーを新たなハイグロマイシン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をYPD培養液2mlで一晩培養し、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。
【0073】
この株を胞子形成培地(1%酢酸カリウム、2%アガ−含有)において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGPD2遺伝子領域の両方にGPD2遺伝子が破壊されたD−LDH遺伝子が組み込まれている株を取得した。この株は、既にD−LDH遺伝子が4コピー組み込まれているので、D−LDH遺伝子が6コピー導入されていることになる。TD1−19−4A株のGPD2破壊部分のD−LDH遺伝子のプロモーターがHOR7遺伝子プロモーターであるものをTD5株、TDH2遺伝子プロモーターであるものをTD6株とした。また、TD15−13−12B株のGPD2遺伝子破壊部分のD−LDH遺伝子のプロモーターがPDC1遺伝子プロモーターであるものをTD16株とした。なお、TD5株及びTD6株は、それぞれ2種類及び3種類のプロモーターが含まれており、TD16株は、PDC1プロモーターのみとなっている。
【実施例5】
【0074】
(発酵試験による乳酸の生産(YPD培地))
得られた形質転換酵母をYPD液体培地5mlに植菌し、30℃、130rpmで一晩、振とう培養を行い、OD600nm=1.2のものを初発菌体とした。このうちの2mlを10%グルコース含有YPD培養液40mlに植菌し(全量42ml)、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、3日間振とう培養した。
【0075】
培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるD−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図12及び図13に示す。尚、グルコースは検出されなかった。
【0076】
図12に示すように、各プロモーターによるD−LDH遺伝子2コピー株を比較するとPDC1遺伝子プロモーターを用いた系が最も優れており(D−乳酸生産量4.5%)、TDH2遺伝子プロモーター及びHOR7遺伝子プロモーターは互いに同等であった(同3.9%)。これに対して、D−LDH遺伝子の4コピー株では、PDC1遺伝子プロモーター(同6%)よりも、PDC1プロモーターに他のプロモーターを組み合わせたものの方がD−乳酸生産量が大幅に向上していた(TDH2遺伝子プロモーターを組み合わせた株(TD3−17−8B株):7%、HOR7遺伝子プロモーターを組み合わせた株(TD1−19−4A):6.8%)。加えて、理由は定かでないが、副生成物のエタノールの生産量も抑えることができた。
【0077】
また、図13に示すように、6コピー株において比較するとPDC1単独での6コピー株(TD16−3−2A)よりも、複数種類のプロモーターを利用した6コピー体(TD15−49−1D株、TD6−6−4A株)の方がD−乳酸生産量が高いことが認められた。
【実施例6】
【0078】
(発酵試験による乳酸の生産(糖蜜含有培地))
得られた形質転換酵母を糖蜜含有液体培地(スクロース9.7%、糖蜜0.6%)60mlに菌体濃度が0.5%となるように接種し、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、3日間振とう培養した。
【0079】
培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるD−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。また、D−乳酸の対糖収率(D−乳酸生産量%/初発のスクロース濃度%)を算出した。これらの結果を図14に示す。
【0080】
図12に示すように、PDC1遺伝子プロモーターを単独で利用した4コピー株(比較例:TD15−3−2B株)に比べて、複数種類のプロモーターを用いた4コピー株(実施例:TD3―17−8B株及び6コピー株(実施例:TD6−6−4A株)は、D−乳酸生産量が大幅に増大しており、対糖収率も83%、88%であった。
【0081】
また、実施例ではグルコースも完全に消費されているとともに、エタノールの生産量が抑えられていた。複数種類のプロモーターを用いることで栄養源に乏しい培地でも乳酸を高生産できることがわかった。
【実施例7】
【0082】
本実施例では、L−乳酸生産における複数種類のプロモーターの利用について検証した。形質転換体の作製にあたっては、PDC1遺伝子プロモーターを利用して8コピーのL−LDH遺伝子を導入した株を親株として用い、計10コピーのL−LDH遺伝子を導入した形質転換酵母を作製し、発酵試験を行った。
【0083】
(10コピー発現用ベクターの構築)
(1)PDC1遺伝子プロモーター発現用ベクター
既に構築したpBHPH−PTベクターに制限酵素SpeI及びBamHIによりL−LDH断片、制限酵素SacI及びNotIよりRCS断片、制限酵素ApaI及びKpnIによりRSB9断片を順次導入し、pBHPH−LDHプレベクターを構築した。これらに、NotI及びSpeIによりPDC1プロモーター断片を連結させ、最終ベクターであるpBHPH−PDC1P−LDHKCBベクターを構築した(図15)。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを、表3に示す。
【表3】
【0084】
(2)TDH2プロモーター発現用ベクター
pBHPH−LDHプレベクターに、制限酵素、NotI及びSpeIによりTDH2遺伝子プロモーター断片を連結して、最終ベクターであるpBHPH−TDH2P−LDHKCBベクターを構築した(図16)。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを表3に示す。
【0085】
(3)TDH3プロモーター発現用ベクター
pBHPH−LDHプレベクターに、制限酵素、NotI及びSpeIによりTDH3遺伝子プロモーター断片を連結して、最終ベクターであるpBHPH−TDH3P−LDHKCBベクターを構築した(図17)。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。プロモーター及び各断片はPCRによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを表3に示す。
【0086】
(4)HOR7発現用ベクター
pBCAT−PTベクターに、制限酵素SpeI及びBamHIによりL−LDH断片、制限酵素SacI及びNoIによりGPD2上流断片、ApaI及びKpnにより、GPD2下流断片を順次導入し、pBCAT−LDHプレベクターを構築した。次いで、このベクターに、制限酵素NotI及びSpeIによりHOR7遺伝子プロモーター断片を連結させて、最終ベクターであるpBCAT−HOR7P−LDHKCBベクターを構築した(図18)。
【実施例8】
【0087】
(L乳酸生産形質転換酵母の作製)
(1)10コピー導入株の作製
既に構築した乳酸生産酵母TC10−1−3B株、TC20−2−1C株(いずれもL−LDH遺伝子をPDC1遺伝子プロモーター下において8コピー保持する形質転換酵母である。)を宿主として、上記4種類の発現用ベクターを用いて形質転換した。形質転換の方法は、適切な選抜培地を用いて実施例4と同様に行い、コロニーPCR解析を行い、導入遺伝子の存在が確認できたものを形質転換体とした。さらに、適切な選抜培地を用いて実施例4と同様に新たに導入したプロモーターとL−LDH遺伝子とを2コピー備える形質転換体を取得した。これらの形質転換体においては、L−LDH遺伝子を合計10コピー保持することとなる。得られた形質転換体におけるプロモーターの組み合わせは以下の表4に示す。
【0088】
【表4】
【実施例9】
【0089】
(発酵試験による乳酸の生産(YPD培地))
得られた形質転換酵母をYPD液体培地5mlに植菌し、30℃、130rpmで一晩、振とう培養を行い、OD600nm=1.2のものを初発菌体とした。このうちの2mlを10%グルコース含有YPD培養液4に植菌し(全量42ml)、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、3日間微好気条件下で振とう培養を行った。
【0090】
培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるL−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図19及び図20に示す。
【0091】
図14に示すように、PDC1遺伝子プロモーター制御下でLDH遺伝子を8コピー導入した株に対して、LDH遺伝子を10コピー導入した株はいずれも乳酸生産量の増大及びエタノール生産量の減少が認められた。また、プロモーターとして、PDC1遺伝子プロモーター単独よりもPDC1遺伝子プロモーターとTHD2、TDH3、HOR7遺伝子プロモーターを利用してLDH遺伝子を導入した株においてより大きな生産量の向上が認められた。以上のことから、L−LDH遺伝子を複数コピー発現させる場合においても、単一種類のプロモーターでなく、複数種類のプロモーターを用いることが有効であることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【0092】
配列番号15〜30:合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【0093】
【図1】pBTrp−PDCIP−DLDHMEベクターの構成図である。
【図2】pBTrp−TDH2P−LDHベクターの構成図である。
【図3】pBTrp−HOR7P−LDHベクターの構成図である。
【図4】pBCHO−DLDHベクターの構成図である。
【図5】pBCAT−PTベクターの構成図である。
【図6】pBCPD−DLDHベクターの構成図である。
【図7】pBCTD−DLDHベクターの構成図である。
【図8】pBHHO2−DLDHベクターの構成図である。
【図9】pBhph−PTベクターの構成図である。
【図10】pBHTD2−DLDHベクターの構成図である。
【図11】pBHPD2−DLDHベクターの構成図である。
【図12】各種形質転換酵母株におけるD−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【図13】各種形質転換酵母株におけるD−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【図14】各種形質転換酵母株におけるD−乳酸発酵試験の結果(糖蜜培地)を示すグラフ図である。
【図15】pBHPH−PDC1P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図16】pBHPH−TDH2P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図17】pBHPH−TDH3P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図18】pBCAT−HOR7P−LDHKCBベクターの構成図である。
【図19】各種形質転換酵母株におけるL−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【図20】各種形質転換酵母株におけるL−乳酸発酵試験の結果(YPD培養液)を示すグラフ図である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体。
【請求項2】
前記複数種類のプロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2(TDH2)遺伝子プロモーター、熱ショックタンパク質30(HSP30)遺伝子プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7(HXT7)遺伝子プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1(AHP1)遺伝子プロモーター、膜タンパク質1(MRH1)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1(TDH1)遺伝子プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1(TPI1)遺伝子プロモーター、細胞壁関連タンパク質12(CCW12)遺伝子及びリボゾーマルプロテインS31(RSP31)遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項1に記載の形質転換体。
【請求項3】
前記複数種類のプロモーターの少なくとも一種類はPDC1遺伝子プロモーターである、請求項1又は2に記載の形質転換体。
【請求項4】
PDC1遺伝子プロモーターと当該プロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを少なくとも2コピー保持している、請求項3に記載の形質転換体。
【請求項5】
前記有機酸は乳酸であり、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項1〜4のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項6】
前記有機酸はD−乳酸であり、前記タンパク質は、D−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターから選択される、請求項5に記載の形質転換体。
【請求項7】
前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターである、請求項6に記載の形質転換体。
【請求項8】
前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されている、請求項6又は7に記載の形質転換体。
【請求項9】
PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピーと、
HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、
を備える、請求項6〜8のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項10】
前記有機酸は、L−乳酸であり、前記タンパク質は、L−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター、TDH3遺伝子プロモーター及びHOR7遺伝子プロモーターから選択される、請求項5に記載の形質転換体。
【請求項11】
前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーターとHOR7遺伝子プロモーターある、請求項10に記載の形質転換体。
【請求項12】
前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されている、請求項10又は11に記載の形質転換体。
【請求項13】
PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを6コピー以上と、
HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、
を備える、請求項10〜12のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項14】
前記複数種類のプロモーターと前記コードDNAとは、いずれも染色体上に保持されている、請求項1〜13のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項15】
前記形質転換体は、酵母である、請求項1〜14のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項16】
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ属酵母である、請求項15に記載の形質転換体。
【請求項17】
前記染色体上に保持される少なくとも一つの前記コードDNAは、染色体上のPDC1遺伝子を破壊している、請求項14〜16のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項18】
有機酸生産用形質転換体の製造方法であって、
少なくとも、以下の2種類のDNA構築物:
PDC1遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第1のDNA構築物及び
PDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第2のDNA構築物、
を宿主に導入することにより、PDC1遺伝子プロモーターを含む複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体を作製する工程を備える、製造方法。
【請求項19】
有機酸の生産方法であって、
請求項1〜17のいずれかに記載の形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を培地において培養して有機酸を生産する工程と、
を備える、有機酸生産方法。
【請求項1】
複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体。
【請求項2】
前記複数種類のプロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素1(PDC1)遺伝子プロモーター、高浸透圧応答7遺伝子(HOR7)プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素2(TDH2)遺伝子プロモーター、熱ショックタンパク質30(HSP30)遺伝子プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質7(HXT7)遺伝子プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ1(AHP1)遺伝子プロモーター、膜タンパク質1(MRH1)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素3(TDH3)遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素1(TDH1)遺伝子プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ1(TPI1)遺伝子プロモーター、細胞壁関連タンパク質12(CCW12)遺伝子及びリボゾーマルプロテインS31(RSP31)遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項1に記載の形質転換体。
【請求項3】
前記複数種類のプロモーターの少なくとも一種類はPDC1遺伝子プロモーターである、請求項1又は2に記載の形質転換体。
【請求項4】
PDC1遺伝子プロモーターと当該プロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを少なくとも2コピー保持している、請求項3に記載の形質転換体。
【請求項5】
前記有機酸は乳酸であり、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項1〜4のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項6】
前記有機酸はD−乳酸であり、前記タンパク質は、D−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターから選択される、請求項5に記載の形質転換体。
【請求項7】
前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、HOR7遺伝子プロモーター及びTDH2遺伝子プロモーターである、請求項6に記載の形質転換体。
【請求項8】
前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されている、請求項6又は7に記載の形質転換体。
【請求項9】
PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピーと、
HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、
を備える、請求項6〜8のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項10】
前記有機酸は、L−乳酸であり、前記タンパク質は、L−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーター、TDH2遺伝子プロモーター、TDH3遺伝子プロモーター及びHOR7遺伝子プロモーターから選択される、請求項5に記載の形質転換体。
【請求項11】
前記複数種類のプロモーターは、PDC1遺伝子プロモーターとHOR7遺伝子プロモーターある、請求項10に記載の形質転換体。
【請求項12】
前記複数種類のプロモーターにより合計10コピー以下のD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが染色体上に導入されている、請求項10又は11に記載の形質転換体。
【請求項13】
PDC1遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを6コピー以上と、
HOR7遺伝子プロモーター及び/又はTDH2遺伝子プロモーターにより導入されるD−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを2コピー以上と、
を備える、請求項10〜12のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項14】
前記複数種類のプロモーターと前記コードDNAとは、いずれも染色体上に保持されている、請求項1〜13のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項15】
前記形質転換体は、酵母である、請求項1〜14のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項16】
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ属酵母である、請求項15に記載の形質転換体。
【請求項17】
前記染色体上に保持される少なくとも一つの前記コードDNAは、染色体上のPDC1遺伝子を破壊している、請求項14〜16のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項18】
有機酸生産用形質転換体の製造方法であって、
少なくとも、以下の2種類のDNA構築物:
PDC1遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第1のDNA構築物及び
PDC1遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを備える第2のDNA構築物、
を宿主に導入することにより、PDC1遺伝子プロモーターを含む複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAとを保持する形質転換体を作製する工程を備える、製造方法。
【請求項19】
有機酸の生産方法であって、
請求項1〜17のいずれかに記載の形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を培地において培養して有機酸を生産する工程と、
を備える、有機酸生産方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図2】
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【図5】
【図6】
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【図9】
【図10】
【図11】
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【図18】
【図19】
【図20】
【公開番号】特開2006−296377(P2006−296377A)
【公開日】平成18年11月2日(2006.11.2)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−126963(P2005−126963)
【出願日】平成17年4月25日(2005.4.25)
【出願人】(000003609)株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】(000003207)トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成18年11月2日(2006.11.2)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年4月25日(2005.4.25)
【出願人】(000003609)株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】(000003207)トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Fターム(参考)】
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