改変されたペプチドYYおよびそれらの結合体

【課題】治療用ペプチドを改変して、これらをペプチダーゼ活性から保護し、そしてインビボでの作用のより長い持続時間を提供し、一方で低い毒性を維持し、なお改変されたペプチドの治療方法の提供。
【解決手段】改変された治療用ペプチドであって、その治療用ペプチドは、ペプチダーゼ安定化治療用ペプチド結合体を形成し得、そのペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸、アミノ末端アミノ酸、構造活性関係分析によって同定される治療的活性な領域およびより低い治療的活性な領域を含む。そのペプチドは、それが、アミノ酸のそのより低い治療的活性な領域に位置するアミノ酸に結合される反応性基を有する、特定のアミノ酸配列を含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(発明の分野)
本発明は、改変された治療用ペプチドに関する。特に、本発明は、ペプチドが選択的に
血液成分に結合体化することを可能にする改変による、内因性治療用ペプチドの、ペプチ
ダーゼ活性からの保護に関し、従って、ペプチダーゼ活性からのペプチドの保護、および
種々の障害を処置するための治療用ペプチドの作用の持続時間の増加に関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
多くの内因性ペプチドは、生物学的プロセスの主要な成分であると記載されてきた。こ
れらのペプチドのいくつかは、種々の障害の管理のための主要な治療薬剤として、同定さ
れてきた。一般に、内因性ペプチドは、非天然の配列を有する合成ペプチドよりも、治療
薬剤としてより所望される。なぜなら、内因性ペプチドは、その内因性特性に起因して、
免疫応答を生成しないからである。さらに、内因性ペプチドは、その標的レセプターに対
して非常に特異的であり、そして合成および製造が容易である。しかし、このような治療
用ペプチドの送達の主要な困難は、これらの短い血清中半減期であり、これは主として、
迅速な血清クリアランス、およびペプチダーゼの作用を介するタンパク質分解性分解に起
因する。
【0003】
ペプチダーゼは、結合を横切って水分子を挿入することによって、ペプチドにおけるペ
プチド結合を破壊する。一般に、大部分のペプチドは、数分以下の様式で、身体内におい
てペプチダーゼにより破壊される。さらに、いくつかのペプチダーゼは、特定の型のペプ
チドに対して特異的であり、これらの分解をさらにより迅速にする。従って、ペプチドを
治療薬剤として使用する場合には、その活性は一般に減少される。なぜなら、このペプチ
ドが、ペプチダーゼの作用に起因して、身体内で迅速に分解するからである。
【0004】
この欠点を克服するための1つの方法は、大きな投薬量の目的の治療用ペプチドを患者
に投与し、これによって、ペプチドのいくらかが分解する場合でさえも、治療的に効果的
であるために十分に残るようにすることである。しかし、この方法は、患者に対して非常
に不快である。大部分の治療用ペプチドは経口投与され得ないので、治療用ペプチドが絶
えず注入されなければならないか、静脈内注射により頻繁に投与されなければならないか
、または皮下注射という不都合な経路によって頻繁に投与されなければならないかのいず
れかである。頻繁な投与に関する必要性はまた、多くの潜在的なペプチド治療剤が、処置
の経過あたり受容不可能に高い計画費用を有する結果となる。多量の分解したペプチドの
存在はまた、所望でない副作用を生じさせ得る。
【0005】
投与の際の不快および高い費用は、魅力的な生物活性プロフィールを有する大部分の治
療用ペプチドが薬物候補物として開発されない2つの理由である。その代わりに、これら
の治療用ペプチドは、治療用ペプチドの代わりとなるペプチド模倣物化合物の開発のため
のテンプレートとして使用される。生体工学および大きな製薬会社は、頻繁に、長く高価
な最適化プログラムに着手して、受容不可能な副作用プロフィールを招くことなく、治療
用ペプチドにおいて見られる活性を模倣する非ペプチドの有機化合物を開発することを試
みる。例えば、環状ペプチド、ペプチド模倣物ならびに高価なSAR(構造活性関係)お
よび分子モデル化試験から生じる小分子は、非常に多くのペプチド模倣物の開発をもたら
した。しかし、これらのペプチド模倣物は、いかなる様式においても、治療用ペプチドの
正確な最初の生物学的性質を反映せず、従って、治療薬剤として内因性治療用ペプチドに
劣る。
【0006】
ペプチド模倣物を作製することの代替は、ペプチダーゼの活性をブロックして、治療用
ペプチドの分解を防止すること、または治療用ペプチドの分解が減速されながらもなお生
物学的活性を維持する様式で治療用ペプチドを改変することである。このような方法とし
ては、ポリマー材料(例えば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリ
エチレングリコールおよびポリアミノ酸)との結合体化、アドロイチン(adroiti
n)サルフェートとの結合体化、ならびに多糖類、低分子量化合物(例えば、アミノレシ
チン(aminolethicin)、脂肪酸、ビタミンB12、およびグリコシド)との
結合体化が挙げられる。しかし、これらの結合体は、依然として、しばしばプロテアーゼ
活性に対して感受性である。さらに、これらのペプチドの治療的活性は、しばしば、ポリ
マー材料の付加により減少する。最後に、この材料がインビボで注射される場合に、これ
らの結合体が免疫応答を生じる危険性が存在する。いくつかの方法は、キャリアタンパク
質とエキソビボで結合体化し、ランダムな結合体の生成を生じることを含む。結合体は製
造が困難であるので、これらの興味は、キャリアが市販で入手可能であること、およびこ
れらの乏しい薬経済学により制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
従って、治療用ペプチドを改変して、これらをペプチダーゼ活性から保護し、そしてイ
ンビボでの作用のより長い持続時間を提供し、一方で低い毒性を維持し、なお改変された
ペプチドの治療の利点を保持するための、新規方法に関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
(発明の要旨)
項目1.改変された治療用ペプチドであって、その治療用ペプチドは、ぺプチダーゼ安定
化治療用ペプチドを形成し得、その治療用ペプチドは、3個と50個との間のアミノ酸か
らなり、そのペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸、アミノ末端アミノ酸、アミノ酸の治
療的に活性な領域およびアミノ酸の治療的により低い活性の領域を有しアミノ酸の治療的
により低い活性の領域を有し、そのペプチドは、以下:
血液成分上のアミノ酸、ヒドロキシル基、またはチオール基と反応して、安定な共有結
合を形成し、それによってそのぺプチダーゼ安定化治療用ペプチドを形成する反応性基で
あって、ここで、その反応性基は、スクシンイミジル基およびマレイミド基からなる群よ
り選択され、そしてその反応性基は、そのアミノ酸の治療的により低い活性の領域に位置
するアミノ酸に結合される、反応性基、
を含む、改変された治療用ペプチド。
項目2.項目1に記載のペプチドであって、上記アミノ酸の治療的に活性な領域が、上記
カルボキシ末端アミノ酸、および上記アミノ末端アミノ酸に結合される上記反応性基を含
む、ペプチド。
項目3.項目1に記載のペプチドであって、上記アミノ酸の治療的に活性な領域が、上記
アミノ末端アミノ酸、および上記カルボキシ末端アミノ酸に結合される上記反応性基を含
む、ペプチド。
項目4.項目1に記載のペプチドであって、上記アミノ酸の治療的に活性な領域が、上記
カルボキシ末端アミノ酸、および上記アミノ末端アミノ酸とそのカルボキシ末端アミノ酸
との間に位置するアミノ酸に結合される上記反応性基を含む、ペプチド。
項目5.項目1に記載のペプチドであって、上記アミノ酸の治療的に活性な領域が、上記
アミノ末端アミノ酸、およびおよびそのアミノ末端アミノ酸と上記カルボキシ末端アミノ
酸との間に配置されたアミノ酸に結合される上記反応性基を含む、ペプチド。
項目6.項目1に記載の改変された治療用ペプチドを合成する方法であって、その方法は
、以下:
a)その治療用ペプチドが、システインを含まない場合、上記カルボキシ末端アミノ酸
からそのペプチドを合成し、そして上記反応性基をそのカルボキシ末端アミノ酸に付加す
るか、または末端リジンをそのカルボキシ末端アミノ酸に付加しかつその反応性基をその
末端リジンに付加する工程;
b)その治療用ペプチドが、たった1つのシステインを含む場合、その反応性基を上記
治療的により低い活性の領域のアミノ酸に付加する前に、そのシステインを保護基と反応
させる工程;
c)その治療用ペプチドが、ジスルフィド架橋として2つのシステインを含む場合、そ
の2つのシステインを酸化し、そしてその反応性基を上記アミノ末端アミノ酸、またはそ
のカルボキシ末端アミノ酸、またはそのカルボキシ末端アミノ酸とそのアミノ末端アミノ
酸との間に位置するアミノ酸に付加する工程;ならびに
d)その治療用ペプチドが、ジスルフィド架橋として2より多くのシステインを含む場
合、そのジスルフィド架橋におけるそのシステインを連続的に酸化し、そしてその反応性
基のそのカルボキシ末端アミノ酸への付加の前に、そのペプチドを精製する工程、
を包含する、方法。
項目7.インビボでペプチダーゼ活性から治療用ペプチドを保護するための方法であって
、そのペプチドは、3個と50個との間のアミノ酸からなり、かつカルボキシ末端および
アミノ末端、ならびにカルボキシ末端アミノ酸およびアミノ末端アミノ酸を有し、その方
法は、以下:
(a)反応性基をそのカルボキシ末端アミノ酸、そのアミノ末端アミノ酸、またはその
アミノ末端アミノ酸とそのカルボキシ末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸に結合させ
ることによってそのペプチドを改変する工程であって、その結果、その改変されたペプチ
ドが、血液成分上の反応性官能基とインビボで共有結合を形成し得る、工程;
(b)その反応性基と血液成分上の反応性官能基との間に共有結合を形成してペプチド
−血液成分結合体を形成し、それによってペプチダーゼ活性からそのペプチドを保護する
工程;ならびに
(c)そのペプチド−血液成分結合体の安定性を分析して、そのペプチドのペプチダー
ゼ活性からの保護を評価する工程、
を包含する、方法。
項目8.工程(b)より前にインビボで上記改変されたペプチドを投与し、その結果、上
記ペプチド−血液成分結合体がインビボで形成される工程をさらに包含する、項目7に記
載の方法。
項目9.工程(b)は、エキソビボで起こる、項目7に記載の方法。
項目10.工程(c)は、インビボで行われる、項目7に記載の方法。
項目11.上記反応性基は、マレイミド基である、項目7に記載の方法。
項目12.上記反応性基は、連結基を介して上記ペプチドに結合される、項目7に記載の
方法。
項目13.上記血液成分はアルブミンである、項目7に記載の方法。
項目14.1以上の上記アミノ酸は、合成的である、項目7に記載の方法。
項目15.インビボでペプチダーゼ活性から治療用ペプチドを保護する方法であって、そ
のペプチドは、3個と50個との間のアミノ酸からなり、かつアミノ酸の治療的に活性な
領域およびアミノ酸の治療的により低い活性の領域を有し、その方法は、以下:
(a)そのアミノ酸の治療的に活性な領域を決定する工程;
(b)そのアミノ酸の治療的により低い活性の領域に含まれるアミノ酸において、反応
性基をそのアミノ酸に結合させて改変されたペプチドを形成することによってそのペプチ
ドを改変し、その結果、その改変されたペプチドが治療的活性を有し、かつ血液成分上の
反応性官能基とインビボで共有結合を形成し得る、工程;
(c)反応性実体と血液成分上の反応性官能基との間に共有結合を形成してペプチド−
血液成分結合体を形成し、それによって、そのペプチドをペプチダーゼ活性から保護する
工程;ならびに
(d)そのペプチド−血液成分結合体の安定性を分析してそのペプチドのペプチダーゼ
活性からの保護を評価する工程、
を包含する、ペプチド。
項目16.工程(c)の前に上記改変されたペプチドをインビボで投与し、その結果、上
記ペプチド−血液成分結合体が、インビボで形成される、工程をさらに包含する、項目1
5に記載の方法。
項目17.工程(c)は、エキソビボで起こる、項目15に記載の方法。
項目18.工程(d)は、インビボで行われる、項目15に記載の方法。
項目19.工程(c)は、インビボで行われる、項目17に記載の方法。
項目20.工程(d)は、エキソビボで行われる、項目19に記載の方法。
項目21.項目15に記載の方法であって、ここで、上記ペプチドは。カルボキシ末端、
アミノ末端、カルボキシ末端アミノ酸およびアミノ末端アミノ酸を有し、そして工程(b
)は、さらに、以下:
(a)上記治療的により低い活性の領域が、そのペプチドのカルボキシ末端に位置する
場合、そのペプチドのカルボキシ末端アミノ酸においてそのペプチドを改変する工程;
(b)上記より低い活性部分が、そのペプチドのそのアミノ末端に位置する場合、その
ペプチドのアミノ末端アミノ酸においてそのペプチドを改変する工程;ならびに
(c)そのより低い活性部分が、そのペプチドのアミノ末端にもカルボキシ末端にも位
置しない場合、そのカルボキシ末端とそのアミノ末端との間に位置するアミノ酸において
そのペプチドを改変する工程、
を包含する、方法。
項目22.上記反応性基は、マレイミド基である、項目15に記載の方法。
項目23.上記反応性基は、連結基を介して上記ペプチドに結合される、項目2に記載の
方法。
項目24.上記血液成分は、アルブミンである、項目15に記載の方法。
項目25.1以上の上記アミノ酸は、合成的である、項目15に記載の方法。
本発明は、目的の治療用ペプチドを改変し、そしてこのペプチドをタンパク質キャリア
に付着させ、その結果、ペプチダーゼの作用が防止されるか、または減速されることによ
り、身体内でのペプチドの分解の問題を克服することに関する。より特定すると、本発明
は、血液タンパク質の利用可能な官能基と反応して共有結合を形成し得る、治療用ペプチ
ドの化学的に反応性の新規誘導体(特に、治療用ペプチド−マレイミド誘導体)に関する
。本発明はまた、このような治療用ペプチドの化学的に反応性の新規な誘導体またはアナ
ログに関する。本発明は、さらに、このような化合物の治療的使用に関する。
【0009】
本発明は、切断される最初の残基への合成的改変を利用して、治療用ペプチドを改変し
、そしてタンパク質キャリア(好ましくは、アルブミン)に、インビボまたはエキソビボ
の技術を介して付着させて、ペプチダーゼの作用を防止または減少させることに関する。
治療用ペプチドは、通常、N末端部分、C末端部分、またはペプチド鎖の内部の部分にお
いて、活性である。本発明の技術を使用して、治療用ペプチドの活性部分以外の部位を、
特定の反応性基により改変する。これらの反応性基は、血液成分に存在する官能基と共有
結合を形成し得る。この反応性基は、治療用ペプチドが血液成分と結合する場合に、この
ペプチドが親化合物の活性のかなりの割合を保持するような部位に位置する。
【0010】
本発明において使用される化学的改変による、治療用ペプチドの改変は、全てまたは大
部分のペプチド特異性が、血液成分への付着にもかかわらず保存されるような様式で、な
される。この治療用ペプチド−血液成分複合体は、ここで、ペプチダーゼにより分解され
ることなく、そしてこのペプチドがその治療的活性を依然として維持しながら、種々の身
体領域に移動し得る。本発明は、全ての公知の治療用ペプチドに適用可能であり、そして
遊離ペプチドと改変した治療用ペプチドとについての薬物動力学的パラメータを直接比較
することにより、生理学的条件下で容易に試験される。
【0011】
本発明は、3と50との間のアミノ酸からなる、ペプチダーゼに対して安定化された治
療用ペプチドを形成し得る、改変された治療用ペプチドに関する。このペプチドは、カル
ボキシ末端アミノ酸、アミノ末端アミノ酸、アミノ酸の治療的に活性な領域およびアミノ
酸の治療的活性の低い領域を有する。このペプチドは、血液成分上のアミノ基、ヒドロキ
シル基、またはチオール基と反応して、安定な共有結合を形成し、これによって、ペプチ
ダーゼに対して安定化された治療用ペプチドを形成する、反応性基を含む。本発明のペプ
チドにおいて、反応性基は、スクシンイミジル基およびマレイミド基からなる群から選択
され、そしてこの反応性基は、アミノ酸の治療的により低い活性の領域に位置するアミノ
酸に付着される。
【0012】
1つの実施形態において、ペプチドの治療的に活性な領域は、カルボキシ末端アミノ酸
を含み、そして反応性基は、上記アミノ末端アミノ酸に付着される。
【0013】
別の実施形態において、ペプチドの治療的に活性な領域は、アミノ末端アミノ酸を含み
、そして反応性基は、カルボキシ末端アミノ酸に付着される。
【0014】
別の実施形態において、ペプチドの治療的に活性な領域は、カルボキシ末端アミノ酸を
含み、そして反応性基は、アミノ末端アミノ酸とカルボキシ末端アミノ酸との間に位置す
るアミノ酸に付着される。
【0015】
なお別の実施形態において、治療的に活性な領域は、アミノ末端アミノ酸を含み、そし
て反応性基は、アミノ末端アミノ酸とカルボキシ末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸
に付着される。
【0016】
本発明はまた、改変された治療用ペプチドを合成する方法に関する。この方法は、以下
の工程を包含する。第一工程において、治療用ペプチドがシステインを含まない場合には
、このペプチドをカルボキシ末端アミノ酸から合成し、そして反応性基をこのカルボキシ
末端アミノ酸に付加する。あるいは、末端リジンをカルボキシ末端アミノ酸に付加させ、
そして反応性基をこの末端リジンに付加する。第二工程において、治療用ペプチドが1つ
のみのシステインを含む場合には、このシステインを保護基と反応させ、その後、このペ
プチドの治療的により低い活性の領域のアミノ酸に反応性基を付加する。第三工程におい
て、治療用ペプチドが2つのシステインをジスルフィド架橋として含む場合には、これら
2つのシステインを酸化して、反応性基を、この治療用ペプチドのアミノ末端アミノ酸、
もしくはカルボキシ末端アミノ酸、またはカルボキシ末端アミノ酸とアミノ末端アミノ酸
との間に位置するアミノ酸に付加させる。第四工程において、治療用ペプチドが2つより
多いシステインをジスルフィド架橋として含む場合には、これらのシステインを、ジスル
フィド架橋において連続的に酸化し、そしてこのペプチドを精製し、その後、反応性基を
カルボキシ末端アミノ酸に付加する。
【0017】
本発明はまた、治療用ペプチドをインビボでペプチダーゼ活性から保護するための方法
に関し、このペプチドは、3と50との間のアミノ酸からなり、そしてカルボキシ末端お
よびアミノ末端、ならびにカルボキシ末端アミノ酸およびアミノ末端アミノ酸を有する。
この方法は、以下の工程を包含する:
(a)反応性基を、カルボキシ末端アミノ酸、アミノ末端アミノ酸、またはアミノ酸末
端アミノ酸とカルボキシ末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸に付着させることにより
、ペプチドを改変する工程であって、その結果、この改変されたペプチドが、血液成分の
反応性官能基とインビボで共有結合を形成し得る、工程;
(b)反応性基と血液成分の反応性官能基との間に共有結合を形成して、ペプチド−血
液成分結合体を形成する工程であって、これによって、このペプチドをペプチダーゼ活性
から保護する、工程;ならびに
(c)このペプチド−血液成分結合体の安定性を分析して、このペプチドのペプチダー
ゼ活性からの保護を評価する工程。
これらの工程は、インビボで実施してもエキソビボで実施してもいずれでもよい。
【0018】
本発明はまた、治療用ペプチドをペプチダーゼ活性からインビボで保護するための方法
に関し、このペプチドは、3と50との間のアミノ酸からなり、そしてアミノ酸の治療的
に活性な領域およびアミノ酸の治療的により低い活性の領域を有する。この方法は、以下
の工程を包含する:
(a)アミノ酸の治療的に活性な領域を決定する工程;
(b)反応性基をアミノ酸に付着させて改変されたペプチドを形成することによって、
アミノ酸の治療的により低い活性の領域に含まれるアミノ酸においてペプチドを改変する
工程であって、その結果、この改変されたペプチドが治療的活性を有し、そして血液成分
の反応性官能基とインビボで共有結合を形成し得る、工程;
(c)反応性実体と血液成分の反応性官能基との間に共有結合を形成して、ペプチド−
血液成分結合体を形成する工程であって、これによって、このペプチドをペプチダーゼ活
性から保護する、工程;ならびに
(d)このペプチド−血液成分結合体の安定性を分析して、このペプチドのペプチダー
ゼ活性からの保護を評価する、工程。
これらの工程は、インビボで実施してもエキソビボで実施してもいずれでもよい。
【0019】
本発明の組成物および方法において有用なペプチドとしては、配列番号1〜配列番号1
617に提示されるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【0020】
(発明の詳細な説明)
(定義)
本発明の完全な理解を確実にするために、以下の定義を提供する:
反応性基: 反応性基とは、共有結合を形成し得る実体である。このような反応性基は
、目的の治療用ペプチドに連結または結合される。反応性基は、一般に、水性環境内で安
定であり、そして通常、カルボキシ基、ホスホリル基、または従来のアシル基であり、エ
ステルまたは混合無水物のいずれか、あるいはイミデートとして存在し、これによって、
移動性の血液成分の標的部位の、アミノ基、ヒドロキシまたはチオールのような官能基と
共有結合を形成し得る。大部分において、これらのエステルは、フェノール性化合物を含
むか、またはチオールエステル、アルキルエステル、リン酸エステルなどである。反応性
基としては、スクシンイミジル(succimidyl)基およびマレイミド基が挙げら
れる。
【0021】
官能基: 官能基とは、改変された治療用ペプチドの反応性基が反応して共有結合を形
成する、血液成分上の基であり、可動性タンパク質および固定タンパク質を含む。官能基
は、通常、エステル反応性基との結合のためのヒドロキシル基、マレイミド、イミデート
およびチオールエステル基との結合のためのチオール基;活性化カルボキシル基、ホスホ
リル基または反応性基上の他の任意のアシル基との結合のためのアミノ基を含む。
【0022】
血液成分: 血液成分は、固定されていても可動であってもいずれでもよい。固定され
た血液成分は、非可動性の血液成分であり、そして組織、膜レセプター、介在タンパク質
、フィブリンタンパク質、コラーゲン、血小板、内皮細胞、上皮細胞およびこれらが結合
する膜および膜レセプター、身体の細胞(somatic body cell)、骨格
細胞および平滑筋細胞、神経成分、骨細胞および破骨細胞ならびに全ての身体組織(特に
、循環系およびリンパ系に関連するもの)を含む。可動性血液成分とは、いかなる延長し
た期間にわたっても(一般的には5分を超えず、より通常には1分)固定された位置を有
さない、血液成分である。これらの血液成分は、膜結合しておらず、そして延長した期間
にわたって血液中に存在し、そして少なくとも0.1μg/mlの最小濃度で存在する。
可動性血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチン、ならびにI
gMおよびIgGのような免疫グロブリンが挙げられる。可動性血液成分の半減期は、少
なくとも約12時間である。
【0023】
保護基: 保護基とは、ペプチド誘導体をそれ自体と反応しないよう保護するために利
用される、化学部分である。種々の保護基が、米国特許第5,493,007号(これは
、本明細書中に参考として援用される)に開示される。このような保護基としては、アセ
チル、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、t−ブチルオキシカルボニル
(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)などが挙げられる。特定の保護された
アミノ酸を、表1に示す。
【0024】
連結基: 連結基とは、反応性基を治療用ペプチドに連結または接続する、化学部分で
ある。連結基は、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキル基で置
換されたアルキニル基またはアミノ基、シクロアルキル基、多環式基、アリール基、ポリ
アリール基、置換アリール基、複素環式基、および置換複素環式基を含み得る。連結基は
また、AEA((2−アミノ)エトキシ酢酸)または好ましい連結基であるAEEA([
2−(2−アミノ)エトキシ)]エトキシ酢酸)のような、ポリエトキシアミノ酸を含み
得る。好ましい連結基は、アミノエトキシエトキシ酢酸(AEEA)である。
【0025】
感受性官能基: 感受性官能基とは、治療用ペプチドに潜在的な反応部位を提供する、
原子の群である。存在する場合には、感受性官能基は、リンカー−反応性基改変のための
付着点として、選択され得る。感受性官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、チオ
ール基、およびヒドロキシル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
改変された治療用ペプチド: 改変された治療用ペプチドとは、反応性基の付着により
改変された治療用ペプチドであり、そして血液成分との結合体化により、ペプチダーゼに
対して安定化されたペプチドを形成し得る。反応性基は、連結基を介してか、または必要
に応じて連結基を使用せずにかのいずれかで、治療用ペプチドに付着され得る。1つ以上
のさらなるアミノ酸が治療用ペプチドに付加されて、反応性基の付着を容易にし得ること
もまた、考慮される。改変されたペプチドは、血液成分との結合体化がインビボで起こる
ように、インビボで投与され得るか、またはこれらは、最初に血液成分とインビトロで結
合体化され、そして得られるペプチダーゼに対して安定化されたペプチド(以下に定義さ
れるような)が、インビボで投与され得る。用語「改変された治療用ペプチド」および「
改変されたペプチド」は、本願において交換可能に使用され得る。
【0027】
ペプチダーゼに対して安定化された治療用ペプチド: ペプチダーゼに対して安定化さ
れた治療用ペプチドとは、連結基のありまたはなしで、改変されたペプチドの反応性基と
血液成分の官能基との間に形成される共有結合を介して、血液成分に結合体化された、改
変されたペプチドである。ペプチダーゼに対して安定化されたペプチドは、インビボでペ
プチダーゼの存在下で、安定化されていないペプチドより安定である。ペプチダーゼに対
して安定化された治療用ペプチドは、一般に、同じ配列の安定化されていないペプチドと
比較して、少なくとも10〜50%増加した半減期を有する。ペプチダーゼ安定性は、血
清または血液中の改変されていない治療用ペプチドの半減期と、血清または血液中の改変
された対応する治療用ペプチドの半減期とを比較することにより、決定される。半減期は
、改変されたペプチドおよび改変されていないペプチドの投与後の血清または血液をサン
プリングし、そしてそのペプチドの活性を決定することにより、決定される。活性を決定
することに加えて、治療用ペプチドの長さもまた、測定され得る。
【0028】
(治療用ペプチド)−本発明にて使用される場合、治療用ペプチドとは、以下に規定さ
れるような治療的活性を有する、2アミノ酸と50アミノ酸との間のアミノ酸鎖である。
各治療用ペプチドは、アミノ末端(N末端またはアミノ末端アミノ酸とも呼ばれる)、カ
ルボキシル末端(C末端またはカルボキシル末端アミノ酸とも呼ばれる)、そしてこのア
ミノ末端とカルボキシル末端との間に位置する内部アミノ酸を有する。このアミノ末端は
、遊離α−アミノ基を有するその治療用ペプチド中で唯一のアミノ酸により規定される。
このカルボキシル末端は、遊離α−カルボキシル基を有するその治療用ペプチド中で唯一
のアミノ酸により規定される。
【0029】
本発明にて使用される治療用ペプチドは、一般にそのアミノ末端か、カルボキシル末端
か、または内部アミノ酸に位置する、治療的に活性な領域を含む。この治療的に活性な領
域は、本願にてより詳細に規定されるような、盲目的(blind)置換または構造活性
相関(SAR)駆動置換を使用して同定され得る。SARは、一連の化合物について、分
子の構造とその薬理学的活性との間の関係を規定する分析である。あるいは、その治療的
に活性な領域が以前に規定されておりそしてその文献にて利用可能である場合、科学雑誌
のような参考文献を参照することにより、その治療的に活性な領域が入手され得る。その
ペプチドの治療的に活性な領域の位置の知識は、下記により詳細に規定されるように、そ
の治療用ペプチドを改変するために重要である。
【0030】
本発明にて使用される治療用ペプチドは、そのアミノ末端か、カルボキシル末端もしく
はカルボキシル末端付近か、または内部アミノ酸もしくは内部アミノ酸付近に一般的に位
置する、治療的により低い活性の領域も含む。この治療的により低い活性な領域は、その
治療用ペプチドの治療的に活性な領域と一致しないアミノ酸の領域である。この治療的に
より低い活性な領域は、一般的には治療的に活性な領域から離れて位置し、その結果、そ
の治療的により低い活性な領域での改変は、その治療用ペプチドの治療的活性に実質的に
は影響しない。例えば、その治療的に活性な領域がアミノ末端に位置する場合、その治療
用ペプチドは、カルボキシル末端または内部アミノ酸のいずれかにて改変される。あるい
は、その治療的に活性な領域がカルボキシル末端に位置する場合、その治療用ペプチドは
、アミノ末端または内部アミノ酸のいずれかにて改変される。最後に、その治療的に活性
な領域が内部領域に位置する場合、その治療用ペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ
ル末端のいずれかにて改変される。
【0031】
「治療的活性」は、患者における生物学的障害を治癒することまたは治療することに関
する、任意の活性である。上記治療用ペプチドの例としては、以下が挙げられる:下垂体
ホルモン(例えば、バソプレシン、オキシトシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質
刺激ホルモン、成長ホルモン);視床下部ホルモン(例えば、成長ホルモン放出因子、副
腎皮質刺激ホルモン放出因子、プロラクチン放出ペプチド、性腺刺激ホルモン放出ホルモ
ンおよびその関連ペプチド、黄体化ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホル
モン、オレキシン、およびソマトスタチン);甲状腺ホルモン(例えば、カルシトニン、
カルシトニン前駆体、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド);副甲状腺ホルモンおよ
びその関連タンパク質;膵ホルモン(例えば、インスリンおよびインスリン様ペプチド、
グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、アミリン、ペプチドYY、および神経ペ
プチドY);消化ホルモン(例えば、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ガストリン
阻害ペプチド、コレシストキニン、セクレチン、モチリン、および血管作用性腸ペプチド
);ナトリウム排泄増加性ペプチド(例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳ナトリ
ウム利尿ペプチド、およびC型ナトリウム利尿ペプチド);ニューロキニン(ニューロキ
ニンA、ニューロキニンBおよびP物質);レニン関連ペプチド(例えば、レニン物質お
よびインヒビターおよびアンギオテンシン);エンドセリン(ビッグエンドセリン、エン
ドセリンAレセプターアンタゴニスト、およびサラフォトキシン(sarafotoxi
n)ペプチドを含む);ならびに他のペプチド(例えば、アドレノメデュリンペプチド、
アラトスタチン(allatostatin)ペプチド、アミロイドβタンパク質フラグ
メント、抗生物質ペプチドおよび抗真菌ペプチド、アポトーシス関連ペプチド、bag細
胞ペプチド、ボンベシン、骨Glaタンパク質ペプチド、CARTペプチド、走化性ペプ
チド、コルチコスタチン(cortistatin)ペプチド、フィブロネクチンフラグ
メントおよびフィブリン関連ペプチド、FMRFおよびアナログペプチド、ガラニンおよ
び関連ペプチド、成長因子および関連ペプチド、G治療用ペプチド結合タンパク質フラグ
メント、グアニリンおよびウログアニリン、インヒビンペプチド、インターロイキンおよ
びインターロイキンレセプタータンパク質、ラミニンフラグメント、レプチンフラグメン
トペプチド、ロイコキニン(leucokinin)、マスト細胞脱顆粒ペプチド、下垂
体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、パンクレアスタチン、ペプチドT、ポリペ
プチド、ウイルス関連ペプチド、シグナル伝達試薬、毒素、および以下のような種々のペ
プチド:アジュバントペプチドアナログ、α接合因子、抗不整脈ペプチド、凍結防止ポリ
ペプチド、食欲不振誘発性ペプチド、ウシ松果体抗生殖ペプチド、ブルシン、C3ペプチ
ドP16、腫瘍壊死因子、カドヘリンペプチド、クロモグラニンAフラグメント、避妊テ
トラペプチド、コナントキン(conantokin)G、コナントキン(conant
okin)T、甲殻類心臓作用性ペプチド、C−テロペプチド、シトクロムb588ペプ
チド、デコルシン、デリシャス(delicious)ペプチド、Δ−睡眠誘導ペプチド
、ジアゼムパム(diazempam)結合インヒビターフラグメント、一酸化窒素シン
ターゼブロッキングペプチド、OVAペプチド、血小板カルパインインヒビター(P1)
、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1、リジン(rigin)、精神分裂病関
連ペプチド、血清胸腺因子、ナトリウムカリウムA治療ペプチダーゼインヒビター1、ス
ペラクト(speract)、精子活性化ペプチド、システミン、トロンビンレセプター
アゴニスト、胸腺液性γ2因子、チモペンチン、サイモシンα1、胸腺因子、ツフシン、
アジポキニンホルモン、尿毒症性ペンタペプチド、および他の治療用ペプチド)。
【0032】
これらの定義を考慮すると、本発明の焦点は、治療用ペプチドをインビボにてペプチダ
ーゼ活性から保護するように改変し、それによって患者にこのペプチド自体を投与するこ
とと比較して、当該治療用ペプチドの有効治療寿命を伸長することである。
【0033】
(1.本発明において用いられる治療用ペプチド)
添付の配列表(SEQUENCE LISTING)に提供されるような治療用ペプチ
ドの決定されたアミノ酸配列から選択したペプチドフラグメントは、本発明を含む開発に
おける開始点を構成する。このペプチドは、2〜50アミノ酸長の範囲にわたる。互換可
能な用語である「ペプチドフラグメント」および「ペプチド部分」は、天然に存在するア
ミノ酸配列から誘導可能な合成のアミノ酸配列および天然に存在するアミノ酸配列の両方
を含むことが意図される。
【0034】
1つの実施形態において、ペプチドおよびペプチドフラグメントは、以下において詳細
に考察されるような、ベンチトップ(bench−top)法、または自動ペプチド合成
機のいずれかによって、従来の手段により合成される。しかし、例えば、タンパク質分解
酵素を用いて、天然に存在するアミノ酸配列を断片化することにより、ペプチドのフラグ
メントを獲得することもまた可能である。さらに、Maniatis、T.ら、Mole
cular Biology:A Laboratory Manual,Cold S
pring Harbor,New York(1982)(本明細書中にて参考として
援用される)により開示されるように、組換えDNA技術の使用により、治療用ペプチド
の所望のフラグメントを得ることが可能である。既存の方法論に対して他の新しい改変の
使用もまた意図される。
【0035】
本発明は、治療用ペプチドの天然に存在する配列から誘導可能なペプチドを包含する。
ペプチドが天然に存在する配列を断片化することにより獲得され得る場合、またはペプチ
ドが、天然に存在するアミノ酸配列の配列の知識もしくはこの配列をコードする遺伝物質
(DNAまたはRNA)の知識に基いて合成され得る場合、そのペプチドは「天然に存在
するアミノ酸配列から誘導可能である」と言われる。ペプチドの「誘導体」であると言わ
れる分子は、本発明の範囲内に含まれる。このような「誘導体」は、以下の特徴を有する
:(1)治療用ペプチドまたはこのペプチドの同様のサイズのフラグメントと実質的な相
同性を共有する、そして(2)このペプチドと同じ治療活性を伴って機能し得る。
【0036】
ペプチドの誘導体のアミノ酸配列が、その誘導体と同じアミノ酸残基を有するペプチド
またはペプチドのフラグメントのいずれかの配列と、少なくとも80%、そしてより好ま
しくは少なくとも90%、そして最も好ましくは少なくとも95%同じである場合、その
ペプチドの誘導体は、このペプチドと「実質的な相同性」を共有していると言われる。
【0037】
本発明の誘導体は、以下に詳細に考察するように、天然に存在する治療用ペプチドの配
列に実質的に相同な配列を含むことに加えて、そのアミノ末端および/またはカルボキシ
末端で、1つ以上のさらなるアミノ酸を含み得る、フラグメントを包含する。従って、本
発明は、天然に存在する治療用ペプチド配列に存在しないかもしれない1つ以上のアミノ
酸を含み得る、治療用ペプチドのポリペプチドフラグメントに関する(ただし、このよう
なフラグメントが、その治療用ペプチドの活性を超える治療活性を有する場合である)。
【0038】
同様に、本発明は、天然に存在する治療用ペプチドの配列と実質的に相同である配列を
含むが、その治療用ペプチドに天然に見出されるアミノ末端および/またはカルボキシ末
端の1つ以上のさらなるアミノ酸を欠失し得る、ポリペプチドフラグメントを包含する。
従って、本発明は、その天然に存在するペプチド配列に通常存在する1つ以上のアミノ酸
を欠失し得る治療用ペプチドのポリペプチドフラグメントに関する(ただし、このような
ポリペプチドがその治療用ペプチドの活性を超える治療活性を有する場合である)。
【0039】
本発明はまた、重要ではないアミノ酸置換を有する(従って、その天然の配列のアミノ
酸配列とは異なるアミノ酸を有する)、上記フラグメントの明白または瑣末な改変体を包
含する(ただし、このような改変体が、上記誘導体の活性と実質的に同一である活性を有
する場合である)。明白な置換または瑣末な置換の例としては、塩基性残基同士の置換(
すなわち、LysをArgに)、疎水性残基同士の置換(すなわち、IleをLeuに)
、または芳香族残基同士の置換(すなわち、TyrをPheに)、などが挙げられる。
【0040】
当該分野で公知のとおり、アミノ酸残基は、以下に詳細に考察するように、適切なアミ
ノ保護基またはカルボキシル保護基を用いて、その保護形態または非保護形態であり得る
。可変性の長さのペプチドは、遊離アミン(N末端へ)、またはその酸付加塩の形態であ
り得る。通常の酸付加塩は、ハロゲン化水素酸(hydrohalic acid)塩(
すなわち、HBr、HIまたはより好ましくはHCl)である。有用なカチオンは、アル
カリ金属またはアルカリ土類金属のカチオン(すなわち、Na、K、Li、Ca、Baな
ど)またはアミンカチオン(すなわち、テトラアルキルアンモニウム、トリアルキルアン
モニウム(ここでアルキルは、C1〜C12であり得る))である。
【0041】
治療活性を有する任意のペプチドが、本発明において用いられ得る。以下のペプチドの
リストにより、本発明において用いられ得るペプチドの例が提供される。しかし、この例
は、排他的ではなく、本発明に用いられ得るペプチドの数または型を決して限定しない。
これらの治療用ペプチドおよびこれらのペプチドから生成されるフラグメントは、本発明
に従って改変され得、そして身体中で治療的に用いられ得る。
【0042】
(A.下垂体ホルモン(配列番号1〜72))
(副腎皮質刺激ホルモン(ACTH、またはコルチコトロピンともいう)(配列番号1
〜22)−副腎皮質の内分泌機能は、下垂体前葉ホルモンACTHにより調節される。A
CTH(39アミノ酸のペプチド)は、コルチコトロピン放出因子の制御下で、下垂体前
葉のコルチコトロフにおいて生成される。ACTHは、プロ−オピオメラノコルチン(P
OMC)として公知の241アミノ酸前駆体から翻訳後修飾により誘導される。
【0043】
ACTHの生物学的役割は、副腎皮質の嵩および生存度を維持すること、および副腎皮
質ステロイド(主に、コルチソルおよびコルチコステロン)の産生を刺激することである
。ACTHの作用の機構は、ACTHレセプターへの結合、その後のアデニレートサイク
ラーゼの活性化、サイクリックAMP(cAMP)の上昇、および副腎皮質組織のプロテ
インキナーゼA(PKA)活性の増大を含む。これらの事象の主要な効果は、側鎖切断酵
素(コレステロールをプレグネノロンに転換する)の活性を増大することである。種々の
副腎皮質の区画における酵素の分布が原因で、ACTHの主な生理学的効果は、グルココ
ルチコステロイドの産生である。
【0044】
副腎皮質活性を制御する機能だけでなく、ACTHは、内分泌腺および内分泌腺の調節
、温度制御、ならびに神経再生および発達への影響を含む、多様な生物学的役割を有する
ようである。さらに、ACTHおよびそのフラグメントは、意欲、学習および行動に影響
する。従って、治療用因子としてのACTHの使用は、これらの機能の制御を助け得る。
下垂体前葉からのACTHの放出は、コルチコトロピン放出因子(CRF)により媒介さ
れる。
【0045】
(成長ホルモンペプチド(配列番号23〜24、45)−ヒト胎盤性ラクトゲン(hP
L)、成長ホルモン、およびプロラクチン(PrI)は、成長ホルモンファミリーを構成
する。全てが約200アミノ酸、2つのジスルフィド結合を有し、そしてグルコシル化を
有さない。それぞれがその活性に対して特定のレセプターおよび特有の特徴を有するが、
その全てが、成長促進活性および乳腺刺激性活性を保有する。成熟GH(22,000ダ
ルトン)は、一本のポリペプチド鎖として好酸性下垂体ソマトトロピン産生細胞において
合成される。選択的RNAスプライシングが原因で、少量の多少小さい分子形態もまた分
泌される。
【0046】
GHに関する多数の遺伝的欠損が存在する。GH欠損性小人は、GHを合成または分泌
する能力を欠き、そしてこれらの低身長の個体は、GH療法によく応答する。ピグミーは
、GHに対するIGF−1応答を欠くが、その代謝効果を欠くのではない;従って、ピグ
ミーでは、欠損は、本質的にはレセプター後(post−receptor))である。
結局、ラロン型小人は、正常または過剰の血漿GHを有するが、肝臓GHレセプターを欠
き、そして循環のIGF−1のレベルが低いのである。これらの個体における欠損は、I
GF−1の産生による、GHに対する応答不能に密接に関連している。長骨の骨端閉鎖前
の過剰な量GHの産生は、巨人症をもたらし、そして骨端閉鎖の後にGHが過剰になる場
合は、末端の骨の成長が末端肥大症の特徴的特徴をもたらす。治療用因子としてGHを用
いれば、これらの障害の処置を助け、そしてGHレベルが低いかまたは正常な他の種類の
低身長において、もしかすると成長を刺激するかもしれない。
【0047】
(メラニン細胞刺激ホルモン(MSH)(配列番号25〜39))−メラニン細胞刺激
ホルモン(MSH)は、ドーパミンの制御下で、下垂体中間部において生成される。MS
Hは、脊椎動物の色素細胞メラニン産生の制御、学習および行動に関する神経機能、なら
びに胎児発達において重要な生理学的役割を有し得る。Sawyer、T.K.ら、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA,79,1751(1982)を参照のこと。
【0048】
(オキシトシン(配列番号40〜44))−オキシトシンは、乳汁分泌の増強、子宮の
収縮、および出産前の骨盤の弛緩に関与する。授乳中の女性におけるオキシトシンの分泌
は、哺乳中の乳首の刺激により得られる直接の神経的フィードバックにより刺激される。
オキシトシンの生理学的効果としては、乳腺筋上皮細胞の収縮(乳腺からの乳汁の駆出を
誘導する)、および出産をうながす子宮平滑筋収縮の刺激が挙げられる。オキシトシンは
、乳腺の分泌腺房の周囲の筋上皮細胞を収縮させ、管を通って乳汁を押し出す。さらに、
オキシトシンはプロラクチンの放出を刺激する。そしてプロラクチンは、乳房の栄養であ
り(trophic)、そして乳汁の腺房形成を刺激する。従って、結合体化されたオキ
シトシンは、乳汁分泌を補助するために、そして出産前に骨盤を弛緩するのを補助するた
めに用いられ得る。このオキシトシンはまた、産後(post partum)子宮出血
を防ぐために用いられる。
【0049】
バソプレシン(ADH)(配列番号46〜72)−バソプレシンはまた、抗利尿ホルモ
ン(ADH)としても公知である。なぜなら、バソプレシンは、体液浸透圧の主要な調節
因子であり、抗利尿をもたらし、そして血圧を上昇させるからである。バソプレシンは、
形質膜レセプターに結合し、そしてGタンパク質を通じて作用し、サイクリックAMP/
プロテインキナーゼA(cAMP/PKA)調節系を活性化する。バソプレシンの分泌は
、浸透圧受容体(osmoreceptor)により、視床下部において調節される。浸
透圧受容体は、水濃度を検知し、そして血漿浸透圧が上昇すれば、バソプレシン分泌の上
昇を刺激する。分泌されたバソプレシンは、尿細管細胞において水の再吸収速度を上昇さ
せ、Na+が濃縮されている尿の排泄を引き起こし、従って、体液の浸透圧の正味の低下
を引き起こす。バソプレシンの欠損は、尿崩症として知られた状態である、水っぽい尿(
watery urine)および多渇症をもたらす。従って、結合体化したバソプレシ
ンまたはバソプレシンフラグメントの使用は、これらの障害を防止し、そして身体の浸透
圧の規則正しい維持を可能にする。
【0050】
(B.視床下部ホルモン(放出因子))
(コルチコトロピン放出因子(CRF)および関連ペプチド(配列番号73〜102)
)−41アミノ酸のペプチドである、コルチコトロピン放出ホルモン(CRF)は、脳お
よび末梢の両方における作用を通じてストレスに対する全般的応答を協調させるのに重要
な役割を果たす。脳においては、CRFは、視床下部室傍核の小細胞性ニューロンから主
に産生されそして分泌される。そこから、CRF含有ニューロンは、正中隆起の門脈毛細
血管に投射し、そして副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、βエンドルフィン、および下
垂体由来の他のプロオピオメラノコルチン(POMC)由来ペプチドの分泌を刺激するよ
うに働く。引き続く、副腎糖質コルチコイドのACTH誘導性放出は、ストレスに対する
内分泌応答を媒介する、視床下部−下垂体−副腎系(HPA)における最終段階を示す。
CRFの神経内分泌的な役割に加えて、CRFはまた、神経伝達物質および神経変調物質
として機能し、生理学的、薬理学的および病理学的刺激に対して、広範なスペクトルの自
律神経効果、行動効果、および免疫効果を惹起する。
【0051】
臨床試験により、CRF過剰分泌が種々の疾患(例えば、大うつ病、不安関連疾患、摂
食障害、および炎症性障害)に関連していることが示された。アルツハイマー病、痴呆、
肥満および多くの内分泌疾患において、低レベルのCRFが見出されている。従って、高
レベルまたは低レベルのCRFに関連する効果に対抗する治療薬としてのCRFの使用は
、異常なCRFレベルに関連する疾患の処置のための基礎を提供する。いくつかのペプチ
ドアンタゴニストおよび非ペプチドアンタゴニストが開発されており、広範に研究されて
いる。これには、αらせんCRF(9〜41),アストレシン(Astressin)、
D−PheCRF(12〜41)(ペプチドアンタゴニスト)およびCP−154526
(非ペプチドアンタゴニスト)が挙げられる。これらのCRFアンタゴニストは、抑うつ
、不安および他のCRH関連疾病の処置のための新規な薬剤を提供し得る。従って、結合
体化されたCRFペプチドは、長期ステロイド使用の間の副腎の状態および生存度を維持
するため、または抗炎症性薬剤として用いられ得る。
【0052】
(性腺刺激ホルモン(ゴナドトロピン)放出ホルモン関連ペプチド(GAP)(配列番
号103〜110)−GAPは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)への前駆体
分子に含まれる。GAPは、プロラクチン阻害特性を有する。Gn−RHは、視床下部に
より分泌されるホルモンである。これは、性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン(FSH
)および黄体形成ホルモン(LH)の放出を刺激する。低レベルの循環する性ホルモンは
、GnRH合成のフィードバック阻害を軽減し、FSHおよびLHのレベルの上昇を導く
。後者のペプチドホルモンは、性腺組織に結合し、サイクリックAMP(cAMP)およ
びプロテインキナーゼA(PKA)媒介径路を介した性ホルモン産生を生じる。結合体化
されたGnRHは、受胎能を補助するため、または雄性もしくは雌性のいずれかにおける
避妊薬として用いられ得る。この因子は、動物およびヒトにおける用途を有する。
【0053】
(成長ホルモン放出因子(GRF)(配列番号111〜134)) GRFは、下垂体
前葉における成長ホルモンの合成および分泌を制御する際に重要な役割を果たす視床下部
ペプチドである。いくつかの構造的に関連しない短いペプチドはまた、異なる機構により
成長ホルモン分泌を誘発するすることが報告された。
【0054】
GRFの影響下で、成長ホルモンは、全身循環に放出され、標的組織にIGF−1を分
泌させる。成長ホルモンはまた、他のより直接的な代謝効果を有する;これは、血糖上昇
効果および脂質分解効果の両方である。全身的なIGF−1の主な供給源は肝臓であるが
、大部分の他の組織も分泌し、そして全身的IGF−1に寄与する。肝臓IGF−1は、
組織成長の主なレギュレーターであると見なされている。特に、肝臓により分泌されるI
GF−1は、全身を通した成長を同期化させ、組織サイズおよび質量の恒常的平衡(ho
meostatic balance)を生じると考えられる。周辺組織により分泌され
るIGF−1は、一般に、生物学的作用におけるオートクラインまたはパラクリンである
と見なされている。次いで、GH放出を増加させる治療剤として結合体化したGRFを使
用することは、GRFにより調節される成長機能を含む障害の処置を補助する。
【0055】
(黄体形成ホルモン放出ホルモン(LH−RH)(配列番号135−161)) 黄体
形成ホルモン放出ホルモンは、性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞
刺激ホルモン(FSH)の分泌の神経調節において重要なメディエーターである。LH−
RHは、血漿性腺刺激ホルモンおよび性ステロイドレベルを調節することによって、性行
動を変化させ得る。Vale,W.W.ら、Peptides,Structure a
nd Biological Function,Proceedings of th
e Sixth American Peptide Symposium,Gross
,EおよびMeienhofer,M.編,781(1979)を参照のこと。結合体化
したLH−RH薬剤を使用して、受精能(fertility)の補助としてヒトまたは
動物における排卵を刺激し得る。
【0056】
(オレキシン(配列番号162〜164)) オレキシンは、最近発見され、特徴づけ
られた視床下部由来の神経ペプチドのファミリーである。オレキシンは、食欲および食物
消費を刺激する。それらの遺伝子は、視床下部外側部において両側にかつ対称に発現され
る。視床下部外側部は、視床下部の「摂食中枢」であることが早くに決定された。対照的
に、いわゆる満腹中枢は腹内側視床下部(ventromedial hypothal
amus)において発現され、そしてレプチン調節性神経ペプチドネットワークにより支
配される。
【0057】
(プロラクチン放出ペプチド(配列番号65〜170)) プロラクチンは、好酸性下
垂体ラクトトロープ(lactotrope)により生成される。プロラクチン放出ペプ
チドは、ラクトトロープに対して作用して、プロラクチンを放出させる。RPLは、哺乳
動物において(しかし通常はエストロゲン様性ホルモンでプライムされた乳腺組織におい
てのみ)乳汁分泌を開始し、そして維持する。結合体化したPRPは、ヒトまたは動物に
おける乳汁分泌を増大させるために使用され得る。
【0058】
(ソマトスタチン(配列番号171〜201)) 成長ホルモン放出阻害因子(GIF
)としても公知のソマトスタチンは、14アミノ酸のペプチドであり、そして視床下部お
よび膵臓のd細胞の両方により分泌される(その膵臓バージョンは、以下で議論される)
。ソマトスタチンは、種々の部位(下垂体、膵臓、腸および脳を含む)の生理学的機能を
調節することが報告された。これは成長ホルモン、インスリン、およびグルカゴンの放出
を阻害する。これは、多くの生物学的役割を有し、これらの役割としては、以下が挙げら
れる:内分泌および外分泌細胞からの基本的および刺激されたホルモン分泌の阻害、歩行
運動(locomotor activity)および認識機能に対する効果、ならびに
小細胞肺癌におけるあり得る治療価値。Reubi,J.C.ら,Endocrinol
ogy,110,1049(1982)を参照のこと。結合体化したソマトスタチンを使
用して、小児における巨人症または成人における先端巨大症を処置し得る。
【0059】
(サイロトロピン放出ホルモン(THR)およびアナログ(配列番号202〜214)
) THRは、甲状腺刺激ホルモン(TSH,サイロトロピンとしても公知)の生成およ
びプロラクチン分泌を刺激する。成体において、TSHは、一般的なタンパク質合成のア
ップレギュレート、および正の窒素平衡の状態の誘導を担う。胚においては、正常な発生
に必要である。胚における甲状腺機能低下は、クレチン病の原因である。クレチン病は、
複数の先天的欠損(congenital defect)および精神遅滞により特徴づ
けられる。次いで、結合体化したTHRは、これらの障害の処置における治療剤として使
用され得る。これはまた、下垂体が原因の甲状腺機能不全を処置するためにまたはヒトの
甲状腺腫瘍の診断において使用され得る。
【0060】
(C.甲状腺ホルモン)
(カルシトニン(CT)およびカルチトニン前駆体ペプチド(配列番号215〜224
)) カルシトニン(CT)は、甲状腺のC細胞により分泌される32アミノ酸のペプチ
ドである。カルシトニンは、骨粗鬆症の症状を軽減するために治療的に用いられるが、そ
の作用機構の詳細は不明なままである。しかし、これは、CTが単離された細胞で上皮小
体ホルモン(PTH)の合成を誘導し、このことは血漿CA2+レベルの増加をインビボで
導くことが観察された。さらに、CTはオステオポリン(Opn)、すなわち、破骨細胞
により生成されたタンパク質の合成を減少し、そして骨に対する破骨細胞の付着の原因で
あることが示された。従って、治療用ペプチドとして結合体化したCTを用いることは、
PTH誘導を介して血漿Ca2+を上昇させ、そして骨への破骨細胞結合を減少させること
により骨の再吸収が低減される。
【0061】
(カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)(配列番号225〜253)) CG
RPは、37アミノ酸のペプチドであり。このペプチドは、カルシトニン遺伝子転写物の
選択的スプライシングから生じる。これは、少なくとも2つの形態で存在する:α−CG
RP(またはCGRP−I)およびβ−CGRP(またはCGRP−II)。CGRPは
、アミリンおよびアドレノメデュリンとかなりの相同性を有し、そして中枢または末梢の
両方で器官に広範に分布する。これらの器官としては、以下が挙げられる:皮膚、心臓、
膵臓、肺および腎臓。CGRPは、神経系および心臓血管系、炎症および代謝に影響を及
ぼす、多くの生物学的役割を有する。
【0062】
(D.上皮小体ホルモンおよび関連ペプチド)
(上皮小体ホルモン(PTH)(配列番号254〜293)) 上皮小体ホルモン(P
TH)は、全身のCa2+レベルに応答して上皮小体主細胞により合成され、そして分泌さ
れる。これは、血清カルシウム濃度の調節に主な役割を果たし、それによって鉱質および
骨代謝の生理に影響を及ぼす。上皮小体のCa2+レセプターは、PKC、Ca2+およびI
3の細胞内レベルを増加させることによりCa2+に応答する;この段階の後、PTH分
泌がタンパク質合成期間の後に続く。主細胞におけるPTHの合成および分泌は構成的で
あるが、Ca2+は、血漿Ca2+レベルが上昇した場合にPTHのタンパク質分解の速度を
増大させ、そしてCa2+レベルが低下した場合にPTHのタンパク質分解を減少させるこ
とにより、主細胞におけるPTHのレベル(従って、その分泌)を調節する。PTHの役
割は、細胞外液体におけるCa2+濃度を調節することである。従って、PTH分泌を調節
するフィードバックループは、上皮小体、Ca2+、および以下に記載の標的組織に関与す
る。
【0063】
PTHは、cAMP共役型原形質膜レセプターに結合することにより作用し、生物学的
応答において最高点に達する反応のカスケードを開始する。身体のPTHに対する応答は
複雑であるが、全ての組織において細胞外液体におけるCa2+レベルを増大させることに
向けられる。PTHは、破骨細胞活性を刺激することにより骨の溶解を誘導し、このこと
は、血漿Ca2+およびホスフェートの上昇を導く。腎臓において、PTHは、その再吸収
を刺激することにより腎臓Ca2+クリアランスを減少させ;同時に、PTHは、ホスフェ
ートの再吸収を減少させ、そしてそれによってそのクリアランスを増大させる。最後に、
PTHは、肝臓、腎臓および腸に対して作用して、ステロイドホルモン1,25−ジヒド
ロキシコレカルシフェロール(カルシトリオール)の生成を刺激する。このステロイドホ
ルモンは、腸におけるCa2+吸収を担う。結合体化したPTHを使用して、上皮小体ホル
モン欠損状態を有する患者におけるカルシウムホメオスタシスを調節し得る。インヒビタ
ーアナログを使用して、過剰なPTHレベルを有する腎不全患者または他の患者における
PTH作用をブロックし得る。
【0064】
(上皮小体ホルモン関連タンパク質(PTHrP)(配列番号294〜309)) 上
皮小体ホルモン関連タンパク質(PTHrP)は、軟骨細胞分化を低減させ、そしてアポ
トーシス性細胞死を妨げる生理学的レギュレーターとして注意が向けられた。PTHrP
は、上皮小体ホルモン(PTH)(カルシウムホメオスタシスの主要レギュレーター)に
対する構造的類似性を有する腫瘍由来の分泌タンパク質として最初に同定された。PTH
およびPTHrPは、共通のGタンパク質共役細胞表面レセプター(PTH/PTHrP
またはPTH−1レセプター)に結合する。このレセプターは、これらのペプチドのN末
端領域(1〜34)を認識する。従って、腫瘍由来のPTHrPが循環中に入る場合、こ
れは、古典的なPTH標的器官(例えば、骨および腎臓)におけるレセプターを活性化し
、そしてPTH様生物活性を誘発する。骨の再吸収を促進し、そしてカルシウム排出を阻
害することにより、循環PTHrPは、悪性に関連する体液性高カルシウム血症の通常の
新生物随伴症候群を生じる。
【0065】
腫瘍において最初に発見されたが、PTHrPは、その後、胎児および成体骨格を含む
著しい種々の正常組織において発現されることが示された。そのアミノ末端PTH−1レ
セプターと協同して作用する場合、PTHrPは、細胞増殖および分化を調節するように
作用する。骨に対する断続的PTH投与の同化効果および骨粗鬆症におけるその治療的潜
在性は、広範に調査された。PTHrPが、破骨細胞におけるPTH/PTHrPレセプ
ターについての内因性リガンドであるという認識に対して、同化薬剤としてのその使用も
また調査された。改変PTHrPペプチドは、PTHと同様な指示のために使用され得る

【0066】
(E.膵臓ホルモン) 膵臓ホルモンの主要な役割は、主に、主細胞エネルギー供給の
異化および同化に関与する多くの酵素の濃度および活性を調節することによる、体全体の
エネルギー代謝の調節である。
【0067】
(アミリン(配列番号310〜335)) 膵臓β細胞ホルモンであるアミリンは、C
GRPおよびカルシトニンに関連する37アミノ酸のペプチドである。これは、膵臓β細
胞からインスリンと共に同時分泌される。アミリンは、1型糖尿病で欠損している。アミ
リンは、インスリンと共に働いて、血流における血漿グルコース濃度を調節するようであ
る。このことは、グルカゴンの治療後ペプチドランジアル(peptiderandia
l)分泌を停止させ、そして胃が空になる速度を抑制する。糖尿病を有する人々は、イン
スリン分泌における欠損と並行してアミリンの分泌の欠損を有し、このことにより、治療
後ペプチドランジアル期間の間に血流へのグルカゴンの過剰な流入が生じている。
【0068】
インスリン置換治療は糖尿病処置の基礎であるが、アミリンおよびインスリン両方の機
能の置換により、グルコース制御の正常の生理をより完全に回復させることが可能になり
得る。2型糖尿病は、島アミロイド沈着により特徴づけられる。この島アミロイド沈着は
、島アミロイドポリペプチドのアミロイド生成ヒト形態からおもに構成される。結合体化
したアミリンを糖尿病の管理において用いて、食事後の高血糖症を制限し得る。
【0069】
(グルカゴン(配列番号336〜376)) グルカゴンは、非常に大きなプログルカ
ゴン分子として、ランゲルハンス島のα細胞により合成される29アミノ酸のホルモンで
ある。インスリンのように、グルカゴンは血漿キャリアタンパク質を欠き、そしてインス
リンのように、その循環半減期はまた、約5分である。後者の形質の結果として、グルカ
ゴンの主要な効果は、膵臓分泌物を含む血液がそそぎ込まれる最初の組織である肝臓に対
してである。グルカゴンは、原形質膜レセプターに結合し、そしてGタンパク質を介して
アデニレートシクラーゼに共役される。cAMPおよびPKAの、結果として生じた増加
は、インスリンが肝臓に対して有する上記の効果の全てを逆転させる。この増加はまた、
循環グルコースの顕著な上昇を導き、グルコースは、肝臓糖新生および肝臓グリコーゲン
分解から誘導される。結合体化したグルカゴン構築物は、再発した高血糖症を有する不安
定型糖尿病を管理するか、医原性高血糖症を予防もしくは処置するために使用され得る。
【0070】
(インスリンおよびインスリン様ペプチド(配列番号377〜382)) これらの認
識されたホルモンの最初は、膵臓により生成される21アミノ酸および30アミノ酸のジ
スルフィド結合ジペプチドであるインスリンであった。インスリンの主要な機能は、多く
の高血糖症生成ホルモンの協調した作用を阻止することであり、そして低い血糖レベルを
維持することである。インスリンは、IGF−1、IGF−2およびリラキシンを含む、
構造的かつ機能的に類似した分子のファミリーのメンバーである。4分子全ての三次元構
造が類似しており、そして増殖促進活性を全てが有するが、インスリンの優勢な役割は代
謝であり、その一方、IGFおよびリラキシンの優勢な役割は、細胞増殖および分化の調
節にある。
【0071】
インスリンは、ランゲルハンス島b細胞におけるプレプロホルモンとして合成される。
そのシグナルペプチドは、小胞体の槽において除去され、そしてこれはゴルジにおける分
泌小胞にパッケージされ、そのネイティブな構造に折り畳みされ、そして2つのジスルフ
ィド結合の形成によりそのコンホメーションをロックする。特異的プロテアーゼ活性はそ
の分子の中心三分の一を切断し、Cペプチドとして解離させ、カルボキシ末端Aペプチド
に結合したアミノ末端Bペプチドジスルフィドを残す。
【0072】
インスリンは、全ての細胞で同じである原形質膜レセプターに結合することにより、そ
の細胞内効果を生じる。このレセプターは、ジスルフィド結合した糖タンパク質である。
インスリンの1つの機能(シグナル伝達におけるその役割は別として)は、肝外組織にお
けるグルコース輸送を増加することであり、原形質膜におけるグルコース輸送体分子の数
を増加させることによる。グルコース輸送体は、ターンオーバーの連続した状態にある。
輸送体の原形質膜含有量における増加は、原形質膜への新たな輸送体の漸増速度の増加に
由来する。これは、細胞質に局在した予備形成した輸送体の特別なプールから誘導される

【0073】
グルコース代謝を調節することにおけるその役割(および糖尿病を処置することにおけ
るその治療的用途)に加えて、インスリンは、脂質生合成を刺激し、脂質分解を減少させ
、そして細胞へのアミノ酸輸送を増大させる。インスリンはまた、転写を調節し、多くの
mRNAの細胞含有量を改変する。このことは、増殖、DNA合成および細胞複製を刺激
し、インスリンがIGFおよびリラキシンと共通して保持している効果である。従って、
結合体化したインスリンを使用して、糖尿病を管理し得る。
【0074】
(神経ペプチドY(配列番号383〜389)) 36アミノ酸残基を有するペプチド
である神経ペプチドY(NPY)は、末梢神経系および中枢神経系の両方において最も豊
富な神経ペプチドの1つである。神経ペプチドは、膵臓ポリペプチドファミリーのペプチ
ドに属する。その関連分子であるペプチドYY(PYY)および膵臓ポリペプチド(PP
)と同様に、NPYは、レセプターに結合するために、分子のフリーな末端を合わせる際
に重要なヘアピン構成に曲げられる。
【0075】
NPYは、中枢神経系(CNS)および末梢において広範な役割を発揮する。そのCN
S作用は、摂食およびエネルギー支出、ならびに心拍数、血圧、覚醒および気分における
変化に対する主要な効果を含む。末梢において、NPYは、血管収縮および高血圧を引き
起こし;これはまた、胃腸経路および尿生殖路において見いだされ、胃腸および腎臓標的
に対する作用によりその機能に影響を与える。最近の研究において、視床下部NPYは、
肥満の特徴を発生させることにおいて基本的役割を果たすことが見出され、視床下部へ体
脂肪をシグナル伝達する経路および体脂肪含有量を調節することにおける主要なトランス
デューサーである。肥満遺伝子産物であるレプチンは、肥満(ob/ob)マウスにおい
てNPY遺伝子発現を減少させることが見いだされた。インスリンおよびコルチコステロ
イドはまた、インスリンがNPY発現を減少し、そしてコルチコステロイドがNPY発現
を増加して、視床下部NPY合成の調節に関与する。結合体化したNPYを使用して、肥
満および肥満患者におけるMODM(II型糖尿病)を処置し得る。
【0076】
(膵臓ポリペプチド(PP)(配列390〜396)) 膵臓ポリペプチド(PP)は
、膵臓島および外分泌膵臓内のF細胞により生成された36アミノ酸のホルモンである。
これは、調節ペプチドのPP折り畳み(PP fold)ファミリーのメンバーであり、
糖原分解を増加させ、そして胃腸活動を調節する。従って、結合体化した膵臓ポリペプチ
ドを用いて、食物の吸収および代謝を改変し得る。
【0077】
(ペプチドYY(配列番号397〜400)) PYYは、36アミノ酸長のペプチド
であり、ブタ腸組織から最初に単離され、そして主に腸内分泌細胞に局在する。これは、
多くの生物学的活性を有し、これらの活性としては、以下が挙げられる:消化系内の広範
な活性ならびに腸電解質および液体分泌の強力な阻害。
【0078】
(ソマトスタチン(配列番号171〜201)) 膵臓のd細胞により分泌されるソマ
トスタチンは、視床下部により分泌されるソマトスタチンと同一の14アミノ酸のペプチ
ドである。神経組織においては、ソマトスタチンは、GH分泌を阻害し、従って、全身的
な効果を有する。膵臓においては、ソマトスタチンは、他の膵臓ホルモンのパラクリンイ
ンヒビターとして作用し、従って、全身的な効果もまた有する。ソマトスタチン分泌は、
血糖レベルに主に応答し、血糖レベルが上昇するにつれて増加し、従って、グルカゴン分
泌のダウンレギュレートを導くと推測される。次いで、結合体化したソマトスタチンを使
用して、糖尿病の管理を補助し得る。
【0079】
(F.消化ホルモン)
(コレシストキニン(CCK)および関連ペプチド(配列番号401〜416)) C
CKは、もともとはブタ小腸から単離された33アミノ酸のポリペプチドである。これは
、胆嚢収縮および胆汁流を刺激し、そして膵臓からの消化酵素の分泌を増加させる。これ
は複数の形態で存在し、この形態としては、CCK−4およびCCK−8が挙げられ、オ
クタペプチドが、最も大きな活性を示す優勢な分子種を示す。これは、CCK/ガストリ
ンペプチドファミリーに属し、そして中枢的には神経系、および末梢的には胃腸系に分布
する。これは多くの生物学的役割を有し、この役割としては、以下が挙げられる:膵臓分
泌の刺激、胆嚢収縮、およびGI経路の腸流動性(mobility)、ならびに満腹お
よび疼痛刺激のあり得る媒介。結合体化したCCKは、胆嚢の診断的研究または慢性胆嚢
炎において使用され得る。
【0080】
(ガストリン放出ペプチド(GRP)(配列番号417〜429)) GRPは、もと
もとはブタ非洞胃組織から単離された27アミノ酸のペプチドであり、そしてボンベシン
増殖と名付けられたカエル皮膚ペプチドのホモログである。これは、脳、肺および胃腸管
を含む組織において、中枢または末梢の両方に広範囲分布している。これは、種々の細胞
の生理学的プロセスを調節する。これらのプロセスとしては、分泌、平滑筋収縮、神経伝
達および細胞増殖が挙げられる。結合体化したGRPは、麻痺性イレウスまたは年配の者
における便秘の処置において使用され得る。
【0081】
ガストリンおよび関連するペプチド(配列番号417〜429)−ガストリンは、胃の
幽門洞によって産生される、酸およびペプシンの分泌を刺激する、17アミノ酸のポリペ
プチドである。ガストリンはまた、膵臓分泌を刺激する。複数の活性な産物はガストリン
前駆体から生成され、そしてガストリン生合成には複数の制御点が存在する。生合成前駆
体および中間体(プロガストリンおよびGly−ガストリン)は、推定の増殖因子である
;それらの産物であるアミド化ガストリンは、上皮細胞増殖、酸産生性壁細胞およびヒス
タミン分泌腸クロム親和様(ECL)細胞の分化、ならびにECL細胞におけるヒスタミ
ンの合成および貯蔵に関連する遺伝子の発現、ならびに急性刺激酸分泌を調節する。ガス
トリンはまた、上皮増殖因子(EGF)ファミリーのメンバーの産生を刺激し、このこと
は次いで、壁細胞機能を阻害するが表面上皮細胞の増殖を刺激する。血漿ガストリン濃度
は、Helicobacter pyloriを有する被験体において上昇し、この被験
体は、十二指腸潰瘍疾患および胃癌の上昇した危険性を有することが公知である。それゆ
え、治療薬剤としてのガストリンまたはガストリンアンタゴニストの使用は、主な上部胃
腸管疾患を処置するために寄与し得る。
【0082】
ガストリン阻害ペプチド(配列番号417〜429)−ガストリン阻害ペプチドは、ガ
ストリンの分泌を阻害する43アミノ酸のポリペプチドである。結合体化されたGIPを
用いて、重篤な消化性潰瘍疾患を処置し得る。
【0083】
モチリン(配列番号430〜433)−モチリンは、胃腸の筋肉を制御する、22アミ
ノ酸のポリペプチドである。モチリン産生細胞は、十二指腸、上部空腸および結腸直腸腺
癌(colorectal adenocarinoma)ならびに中腸類癌腫に分布す
る。モチリンは、腸の運動性を刺激する。
【0084】
セクレチン(配列番号434〜441)−セクレチンは、4.5未満のpH値で十二指
腸から分泌され、膵臓腺房細胞を刺激してバイカーボネートおよびH2Oを放出させる、
27アミノ酸のポリペプチドである。セクレチンは、神経ペプチド群における神経伝達物
質(化学メッセンジャー)である。セレクチンは、消化を制御するホルモンのうちの1つ
である(ガストリンおよびコレシストキニンは他方のホルモンである)。セレクチンは、
27アミノ酸から構成されるポリペプチドであり、そして胃が空な場合に消化器系におけ
る細胞によって分泌される。セクレチンは、腸の酸性度を中和するバイカーボネートが豊
富である消化液を膵臓が出すこと、ペプシン(タンパク質の消化を助ける酵素)を胃が産
生すること、および胆汁を肝臓が産生することを刺激する。
【0085】
セクレチンは、自閉を処置する際に有用であり得る。1つの研究では、自閉の範囲の障
害を有する小児は、上部胃腸の内視鏡検査およびセクレチンの静脈内投与を受けて、膵臓
胆汁分泌が刺激された。3人全員が、非自閉患者と比較した場合、膵臓胆汁分泌応答の増
加を有した(1〜2mL/分に対して7.5〜10mL/分)。セクレチン注入の5週間
以内に、改善されたアイコンタクト、警戒および表現的言語の拡大によって現れるその挙
動における劇的な改善が観察されたように、小児の胃腸の症状の有意な改善が観察された
。これらの臨床的観察は、自閉挙動を有する患者における胃腸機能と脳機能との間の関連
を示唆する。
【0086】
血管作用性腸ポリペプチド(VIP)および関連するペプチド(配列番号442〜46
4)−VIPは、視床下部およびGI管によって産生される、28残基のポリペプチドで
ある。VIPは、GIを弛緩させ、酸およびペプシンの分泌を阻害し、末梢自律神経系に
おいて神経伝達物質として作用し、そして膵臓および腸からのH2Oおよび電解質の分泌
を増加させる。VIPは、肺および腸において元々発見された。そしてVIPはまた、脳
、肝臓、膵臓、平滑筋およびリンパ球を含む組織において見出されている。VIPは、P
ACAP、PHI、セクレチンおよびグルカゴンを含む、ペプチドのファミリーに構造的
に関連している。VIPは、血管拡張、電解質分泌、免疫機能の調節および神経伝達を含
む、多岐にわたる範囲の生物学的作用を有する。結合体化されたVIPは、塩酸欠乏、虚
血性大腸炎および過敏性腸症候群(IBS)の処置において有用であり得る。
【0087】
G.ナトリウム利尿ペプチド−ナトリウム利尿ペプチドホルモンファミリーには、血圧
および流体のホメオスタシスの調節に関与する、3つのメンバー(心房性ナトリウム利尿
ペプチド(ANP)、B型ナトリウム利尿ペプチド(BNP、脳ナトリウム利尿ペプチド
)およびC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP))が存在する。
【0088】
心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)(配列番号465〜507)−ANPは、ジ
スルフィド結合を含む、28アミノ酸ペプチドのホルモンである。ANPは、ナトリウム
利尿効果、利尿効果および血管緊張低下効果を発揮し、そして身体の血液容量および血圧
のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。Smith,F.G.ら、J.Dev.
Physiol.12,55(1989)を参照のこと。ANP放出を制御する機構は、
猛烈な調査の対象であり、そして現在かなり良く理解されている。ANP分泌の主な決定
要因は、筋細胞の伸長である。心臓からのBNP放出を調節する因子についてはずっとわ
ずかにしか公知でないが、筋細胞伸長もまた、心房および心室の両方からのBNP放出を
刺激することが報告されている。しかし、壁の伸長が直接作用するのか、またはエンドセ
リン−1、一酸化窒素もしくはアンギオテンシンIIのような、拡張に応じて遊離された
因子を介して作用するかは、証明されていない。近年の研究は、エンドセリンのA型レセ
プターを刺激することによって、エンドセリンが、理性ある動物における心房性筋細胞か
らの急性容量負荷誘導性ANP分泌のメディエーターとして重要な生理学的役割を果たす
ことを示す。実際、直接伸長ではなく、心房性壁の伸長に応じて遊離された内因性パラ分
泌因子/自己分泌因子は、エンドセリンA/B型およびアンギオテンシンIIレセプター
の組み合わされた阻害の間のANP分泌のほぼ完全な遮断によって証明されるように、容
量負荷に応じたANP分泌の活性化を担うようである。さらに、特定の実験条件下では、
アンギオテンシンIIおよび一酸化窒素はまた、伸長活性化ANP分泌に対して有意な調
節効果を発揮し得る。エンドセリン−1、アンギオテンシンIIおよび一酸化窒素が伸長
活性化ANP放出を相乗的に調節する分子機構は、未だに不明である。1997年11月
12日に発行された要約第75巻876−885頁、Journal of Molec
ular Medicine。結合体化ANPは、悪性高血圧または重篤な高血圧および
腎不全の管理において有用である。
【0089】
脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)(配列番号507〜516)−脳ナトリウム利尿
ペプチド(BNP)は、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの1メンバーであり、心室か
ら産生および放出される。BNPは、A型グアニル酸シクラーゼ共役レセプターを通して
、体液容量、血圧および血管の緊張を調節する。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP
)のようなBNPは、電解質−流体ホメオスタシスにおいて役割を果たす。結合体化され
たBNPは、心不全の管理において有用であり得る。
【0090】
C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)(配列番号517〜524)−C型ナトリウム
利尿ペプチド(CNP)は、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの第3のメンバーであり
、血管内皮細胞(EC)において産生され、そして内皮由来弛緩ペプチドとして作用する
。心房性ナトリウム利尿ペプチドおよび脳ナトリウム利尿ペプチドは、循環性ホルモンと
して心血管機能および内分泌機能の調節に関与することが周知であるが、C型ナトリウム
利尿ペプチド(CNP)の役割は未知のままである。
【0091】
CNPは、中枢神経系および血管内皮細胞に主に見出され、一方、ANPおよびBNP
は心臓ホルモンである。ANPは正常な成体心臓の心房において主に合成され、一方、B
NPは心房および心室の両方によって産生される。
【0092】
H.タキキニン(配列番号525〜627)−ニューロキニンA、Bおよびサブスタン
スPを含む、完全な生物学的活性に必要とされる共通のC末端配列(F−X−GLM−N
2)を共有する、ニューロキニンAおよびサブスタンスPを含むファミリーのペプチド

【0093】
ニューロキニンA−ニューロキニンAは、サブスタンスKとして以前に公知のデカペプ
チドである。ニューロキニンAは、サブスタンスPおよびニューロキニンBを含む、タキ
キニンファミリーの神経ペプチドのメンバーである。ニューロキニンAは、平滑筋の収縮
、痛みの伝達、気管支収縮、血管拡張および免疫系の調節に関連する種々の活性を示す。
【0094】
ニューロメジン−ニューロメジンは、平滑筋刺激ペプチドであり、通常4つの群に分け
られる:ボンベシン様、カシニン様、ニューロテンシン様およびニューロメジンU。これ
らの神経ペプチドおよびそれらのレセプターは、HPA下垂体軸(hypophysea
l pituitary axis)の全構成要素に局在し、唯一の例外はニューロキニ
ンBであるようであり、ニューロキニンBは、腺下垂体に検出されない。ニューロメジン
は、多種多様の効果をHPA軸に対して発揮し、そして副腎に対するそれらの作用は、副
腎皮質の増殖、構造および機能の調節におけるそれらの関与を示唆する。ニューロメジン
は、直接的効果および間接的効果の両方を副腎皮質に対して発揮し得る。直接的効果は、
単離または培養された副腎皮質細胞によるミネラルコルチコイド治療用ペプチドおよびグ
ルココルチコイド治療用ペプチドの刺激、ならびに細胞内[Ca2+]の動員によって証
明される。一方、間接的効果は、ACTH、アルギニン−バソプレッシン、アンギオテン
シンII、カテコールアミンによって、または髄質起源の他の調節物質によって媒介され
得る。
【0095】
サブスタンスPおよび関連するペプチド−サブスタンスPは、脳および腸から最初に単
離された11アミノ酸ペプチドである。サブスタンスPは、脊髄における痛みの伝達に関
与する神経調節物質として提唱されている。サブスタンスPはまた、平滑筋の収縮、血圧
の低下、分泌組織の刺激および肥満細胞からのヒスタミンの放出に影響を与える。
【0096】
(I.レニン関連ペプチド)
アンギオテンシン(配列番号628〜677)−アンギオテンシンは、腎臓酵素レニン
によるa2−グロビンの酵素的切断に由来する10アミノ酸ペプチドである。次いで、C
末端の2アミノ酸は遊離されて、アンギオテンシンIを生じ、これは、副腎細胞からのア
ルドステロンの刺激された合成および放出を通して本態性高血圧を担う。これは、血圧、
血漿容量、ニューロンの機能的口渇、および水取り込みを調節する、多機能性ホルモンで
ある。
【0097】
アンギオテンシンIIは、アンギオテンシン変換酵素によるアンギオテンシンIに由来
するオクタペプチドであり、そして心臓、腎臓および肝臓のような器官において中心およ
び周縁部の両方に広範囲に分布する。アンギオテンシンIVは、アンギオテンシンIまた
はアンギオテンシンIIのいずれかからタンパク質分解性切断によって代謝的に形成され
る、アンギオテンシンIIの末端のヘキサペプチドフラグメントである。アンギオテンシ
ンIVは、血管の制御、心臓生長、腎臓血流および記憶機能において役割を果たす。
【0098】
アンギオテンシンIIは、血管平滑筋緊張、血圧、自由水取り込みおよびナトリウム貯
留を調節する重要なペプチドホルモンである。アンギオテンシンIIは、血管痙攣性緊張
の増加、ナトリウム貯留の増加および自由水取り込みの増加を刺激することによって、血
管内容量の損失を保証する血管ホメオスタシスを制御する。
【0099】
レニンの基質およびインヒビター(配列番号678〜684)−レニンは、非常に特異
的なアスパラギン酸プロテアーゼであり、これは、顆粒状上皮細胞と呼ばれる、腎臓の脈
管構造における分化した平滑筋細胞によって合成および放出される。レニンは、その基質
であるアンギオテンシノーゲンに特異的であり、レニンは、アンギオテンシノーゲンをL
eu10−Val11結合で特異的に切断して、デカペプチドであるアンギオテンシンI(A
I)を形成する。レニン−アンギオテンシン系は、脊椎動物全体の流体および無機質のバ
ランスの制御に関与する。レニンは、哺乳動物、トリ、爬虫類、両生類、硬骨魚、軟骨魚
および無顎類(agnathan)に見出され得る。特異的レニンインヒビターはまた、
例えば、高血圧および鬱血性心不全の処置のための治療適用について設計され得る(Bl
undellら、1987)。
【0100】
J.エンドセリンおよび関連するペプチド(配列番号685〜744)−エンドセリン
ペプチドファミリーは、21アミノ酸のアイソフォームであるエンドセリン−1、エンド
セリン−2、エンドセリン−3、サラホトキシン(蛇毒)およびサソリ毒素からなる。
【0101】
エンドセリン(ET)および大きなエンドセリン−エンドセリンは、広範な種々の器官
系における内皮細胞に見出される。エンドセリンのレベルおよび合成の変化に関連した病
理および生理学的プロセスの例としては、以下が挙げられる:アテローム性動脈硬化症お
よび高血圧、冠状動脈血管痙攣、急性腎不全、細胞内Ca2+レベルの変化、ならびにレ
ニン−アンギオテンシン系に対する効果。エンドセリンは、アンギオテンシンII、バソ
プレッシンおよびサイトカイン(例えば、TGF−βm、TNF−α、IL−β−)レベ
ルのバリエーション、ならびに血流の増加を含む他の生理学的事象に応じて放出される。
【0102】
エンドセリンファミリーのペプチドは、内皮細胞上清から最初に単離された非常に強力
な内因性血管収縮剤からなる。これらは、血管収縮効果を動脈に対して運ぶことによって
器官に対する血流を調節する。エンドセリンは、大きなエンドセリンに由来し、大きなエ
ンドセリンは、独特の膜結合型メタロプロテアーゼであるエンドセリン変換酵素によって
、21アミノ酸の生物活性形態(ET−1、ET−2およびET−3)へと切断される。
【0103】
3つのアイソフォーム(ET−1、ET−2、ET−3)のうち、エンドセリン−1は
、主なアイソフォームであり、そして血管機能の調節に重要な役割を果たす。内因性エン
ドセリンペプチドおよびそれらのレセプターは、血管、子宮、膀胱および腸を含む、多く
の平滑筋組織全体に異なって分布する。この広範な分布および局在を通して、これらは、
血管緊張を調節する際および有糸分裂誘発を引き起こす際に生物学的機能を発揮する。E
Tおよびそれらのレセプターサブタイプはまた、種々の内分泌器官に存在する。これは、
プロラクチン、ゴナドトロピンGHおよびTSHの分泌のモジュレーターとして作用する
ようである。エンドセリンはまた、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不
全、腎不全、全身性高血圧、肺性高血圧、大脳の血管痙攣における疾患マーカーまたは病
因因子であり得る。
【0104】
外から投与されたエンドセリン−1は、末梢抵抗および血圧を用量依存性様式で上昇さ
せることが実証されている。しかし、静脈内投与の最初の数分間の間に、エンドセリンは
また、血管拡張化合物(例えば、一酸化窒素、プロスタサイクリンおよび心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド)の放出におそらく起因して、末梢抵抗および血圧を低下させる。
【0105】
ET(A)レセプターアンタゴニスト−エンドセリンレセプターは、2つの型として存
在する:A(ET−A)およびB(ET−B1およびET−B2)。ET−Aレセプター
は担い、一方、ET−B1およびET−B2はそれぞれ血管緊張低下および血管収縮を媒
介する。
【0106】
サラホトキシンペプチド−既に記載したように、エンドセリン(ET)ペプチドは、G
タンパク質共役レセプターに結合する強力な増殖因子である。Atractaspis
engaddensisから単離されたサラホトキシン(S6)は、エンドセリンに対し
て非常に相同である。サラホトキシンペプチドは、顕著な血管収縮活性を有し、そして蛇
またはサソリに咬まれた後の虚血性四肢の損失を担う。これらは、ショックおよび敗血症
における血管収縮(vasopressive)剤としてのペプチダーゼ安定化ペプチド
として治療的に用いられ得る。
【0107】
K.オピオイドペプチド(配列番号745−927)−オピオイドは、鎮痛剤として臨
床的に用いられる大きなクラスの薬物であり、これは、植物由来および合成のアルカロイ
ドならびに哺乳動物の脳において内因的に見出されるペプチドの両方を含む。植物由来ア
ルカロイドは数千年にわたって公知であり、そして用いられているが、内因性オピオイド
ペプチドは、1970年代半ばにようやく発見された。
【0108】
オピオイドとしては、カソモルフィン(casomorphin)ペプチド、デモルフ
ィン(demorphin)、エンドルフィン、エンケファリン、デルトロフィン、ジノ
ルフィン、ならびにこれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。
【0109】
カソモルフィンペプチド−カソモルフィンペプチドは、カゼイン(β−カソモルフィン
)に由来する新規なオピオイドペプチドである。βカソモルフィンは、食物タンパク質(
β−カゼイン)から生じた、さらに詳細にわたって研究されたオピオイドペプチドである
。これらは、ウシβ−カゼインから元々単離された。この同じ配列は、ヒツジおよびバッ
ファローのβ−カゼインにおいて生じる。
【0110】
デモルフィン(dermorphin)−デモルフィンは、Phylomedusa
sauvageiのカエル皮膚から元々単離された、7アミノ酸ペプチドである。デモル
フィンは、μオピオイドレセプターに対して高親和性で結合するリガンドであり、そして
痛覚脱失、内分泌調節、免疫調節、K+コンダクタンスの増加および活動電位の阻害を含
む、多くの生物学的役割を有する。
【0111】
ジノルフィン/新たなエンドルフィン前駆体関連ペプチド−ジノルフィンは、中枢神経
系において複数の形態で存在する内因性オピオイドのクラスである。ジノルフィンは、前
駆体プロジノルフィン(プロエンケファリンB)に由来する。ジノルフィンA1−17と
しても公知のジノルフィンは、配列Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu5−Arg
−Arg−Ile−Arg−Pro10−Lys−Leu−Lys−Trp−Asp15−A
sn−Gln(配列番号1)を有する周知のオピオイドである。Dyn A1−13(配
列番号2)、Dyn A2−13(配列番号3)、Dyn A1−12、Dyn A2−
12およびDyn
A2−17、ならびにアミドアナログ(例えば、Leeらの米国特許第4,462,9
41号に言及されるアミドアナログ)、N末端短縮化ジノルフィンアナログ(例えば、L
eeらの国際特許出願WO 96/06626に記載されるN末端短縮化ジノルフィンア
ナログ)ならびにdes−Tyrまたはdes−Tyr−Glyのアナログ(例えば、ま
たLeeらの国際特許出願WO 93/25217に開示されるアナログ)を含めて、ジ
ノルフィンの多数の誘導体およびアナログが公知である。ジノルフィン(dynorph
i)は、非常に強力なオピオイドであり、そしてκレセプターに対する選択的親和性を示
す。Goldstein,A.、Peptides、Structure and Fu
nction、Proceedings of the 8th American P
eptides Symposium、Hruby、V.J.およびRich、D.H.
編、409(1983)を参照のこと。
【0112】
エンドルフィン−エンドルフィン(endorphi)は、前駆体タンパク質リポトロ
ピンに由来する。エンドルフィンは、いくつかの生物学的反応(例えば、痛覚脱失、行動
変化および成長ホルモン放出)を惹起することが見出されている。Akil,H.ら、A
nn.Rev.Neurosci.、7,223(1984)を参照のこと。
【0113】
エンケファリン(enkepalin)および関連ペプチド−エンケファリンおよびエ
ンドルフィンは、痛みのインパルスの伝達を阻害する神経ホルモンである。中枢神経系お
よび末梢神経系の両方におけるニューロンの活性は、それらの放出部位から極めて離れた
細胞に作用する多数の神経ホルモンによって影響を受ける。神経ホルモンは、神経細胞が
シナプスの神経伝達物質に応答する能力を改変し得る。神経系に対して絶大な効果を有す
るいくつかの低分子ペプチド(例えば、エンケファリン(例えば、Met−エンケファリ
ンおよびLeu−エンケファリン)ならびにエンドルフィン(例えば、βエンドルフィン
))が近年発見されている。これらの3つのものは、それらの機能に必須である共通のテ
トラペプチド配列(Tyr−Gly−Gly−Phe)を含む。エンケファリンおよびエ
ンドルフィンは、天然の鎮痛剤またはアヘン剤として機能し、そして中枢神経系における
疼痛応答を減少させる。Akil,H.ら、Ann.Rev.Neurosci.、7、
223(1984)もまた参照のこと。
【0114】
L.胸腺ペプチド(配列番号928〜934)−胸腺は、乳児および成体の両方におい
てT細胞免疫の発達および調節を担うと考えられている。胸腺は、その上皮細胞を通した
、胸腺ペプチドと呼ばれる種々の非細胞性ホルモン様産物の分泌を介してその調節機能を
発揮するようである。
【0115】
胸腺ペプチドは、T細胞に対して多くの効果を有することが報告されている。いくつか
の研究は、胸腺ペプチドが未成熟な前駆体細胞の、その充分に能力のあるT細胞への発達
を補助し得ることを報告した。胸腺ペプチドは、T細胞上での種々のサイトカインおよび
モノカインレセプターの発現を調節するようであり、そして免疫系が抗原投与された場合
にIL−2、インターフェロンαおよびインターフェロンγ(疾患と闘う物質)の分泌を
誘導する。化学療法によって引き起こされた免疫不全を有する小児における胸腺ホルモン
の使用が、循環するT細胞の増加、T細胞サブセットの正常化、および遅延型過敏反応の
修復をもたらしたことについての報告が存在する。
【0116】
チモポエチン−チモポエチンは、公知の胸腺ホルモンのうちで最大であり、そして49
アミノ酸からなる。
【0117】
サイミュリン−胸腺血清因子として以前に公知のサイミュリンは、化学的に特徴付けら
れた胸腺ホルモンのうちの最小のものであり、そして9アミノ酸からなる。サイミュリン
は、免疫系T細胞の産生の刺激を担うホルモンである。
【0118】
サイモペンティン−サイモペンティンは、治療用ペプチド5またはTimunoxとし
ても公知の、小さな、合成された胸腺ペプチド薬物である。米国では、サイモペンティン
は、Immunobiology Research InstituteによってAI
DS治療として開発されている。サイモペンティンは、大部分の他の胸腺ペプチド薬物よ
りも詳細にわたって研究されている。少なくとも1つの研究は、未処置のコントロール関
係者と比較して、サイモペンティンを1週間に3回受けた患者における、T細胞の有意な
上昇およびわずかな臨床的改善を主張した。14の未処置のコントロール関係者と比較し
て、薬物を摂った患者は、より大きな「免疫学的安定性」およびいくらかの臨床的改善を
示した。
【0119】
チモシン−チモシンは、15以上のタンパク質の混合物である。これらのタンパク質の
うちの1つは、28アミノ酸からなるチモシンα−1である。チモシンは、一次免疫欠損
の処置のために、そしてインフルエンザワクチンについてのブースターとして腎臓透析患
者において治療用途を有する。チモシンはまた、進行中の臨床試験において慢性B型肝炎
およびC型肝炎、HIV感染ならびに特定の形態の癌に対する活性について試験されてい
る。
【0120】
胸腺体液因子(THF)−THFは、抗HIV処置として現在試験されている胸腺ペプ
チドである。CMV関連免疫抑制を有するラットにおける前臨床研究では、THFは、T
細胞の調節を通して免疫能力を回復した。さらに、THFは、ヘルペスの処置において治
療用途を有し得、(少なくとも1つの研究において)ウイルス感染の迅速な後退およびT
細胞集団の増加を引き起こす。
【0121】
(L.他のペプチド)
(アドレノメデュリンペプチド(AM)(配列番号935〜945))
アドレノメデュリンは、心臓血管機能に対して主要な効果を発揮する強力な血管拡張ペ
プチドである。その全身投与は、迅速かつ深刻な血圧の低下および肺の血流の増加を引き
起こす。他のその作用は気管支拡張であり、飲酒行動(drinking behavi
or)のインヒビター、およびアンギオテンシン誘導アルドステロン分泌のインヒビター
である。The Journal of Biological Chemistry、
第270巻、43号、25344−25347頁、1995およびそこに引用されている
参考文献を参照のこと。
【0122】
(アラトスタチンペプチド(配列番号946〜949))
アラトスタチンは、幼若ホルモンの産生を制御するために昆虫によって合成される6〜
18アミノ酸のペプチドである。幼若ホルモンは、次には、変態および卵生成を含む機能
を調節する。アラトスタチンファミリーの神経ペプチドは、幼若ホルモン(これは、ゴキ
ブリDiploptera punctataにおいて発生および生殖の局面を調節する
)のインビトロ産生を阻害するが、これらは、血液リンパ、腸におけるペプチダーゼによ
る不活化に感受性であり、そして内部組織に結合する。
【0123】
(アミロイドβタンパク質フラグメント(Aβフラグメント)(配列番号950〜10
10))
これらは、アルツハイマー病の脳における神経炎性斑中に細胞内的および細胞外的に蓄
積するアミロイド斑の主要な成分である。Aβは、4.5kDのタンパク質であり、約4
0〜42アミノ酸長であり、これは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のC末端に
由来する。APPは、膜貫通糖タンパク質であり、これは、正常なプロセシング経路にお
いて、Aβタンパク質内部で切断されて、APPの分泌型であるα−sAPPを産生する
。α−aAPPの形成は、Aβの形成を妨げる。Aβは、APPの異常なプロセシングに
よって蓄積し、その結果、Aβ産生の原因である酵素の活性を阻害する化合物が探索され
ることが提案されてきた。例えば、Wagnerら、Biotech.Report(1
994/1995)、106−107頁;およびSelkoe(1993)TINS 1
6:403−409を参照のこと。特定の条件下で、Aβペプチドは最初に凝集し、次い
で、アミロイド原線維に特徴的な折り畳まれたβシート構造として沈着する。β−アミロ
イド(1−42)型は、β−アミロイド(1−40)よりも有意に早い速度でかつ大きな
程度で凝集する。
【0124】
(抗菌ペプチド(配列番号1011〜1047))
抗菌ペプチドは、大部分の多細胞生物の先天性免疫系の鍵となる成分であり、これは、
1以上の微生物(例えば、細菌、真菌、原生動物、酵母、およびマイコバクテリア)に対
して活性である。このようなペプチドの例としては、ディフェンシン、セクロピン(ce
cropin)、ブフォリン(buforin)、およびマガイニン(magainin
)が挙げられる。配列および分類の広い分岐にも関わらず、大部分の抗菌ペプチドは、共
通の作用メカニズム(すなわち、病原体の膜透過化)を共有する。抗菌ペプチドは、2つ
の広いグループ:直鎖状および環状に分類される。直鎖状抗菌ペプチドにおいて、2つの
サブグループが存在する:αヘリックス両親媒性コンホメーションを取る傾向のある直鎖
状ペプチド、および、Pro、Arg、またはTrpのようなアミノ酸に富む異常な組成
の直鎖状ペプチド。環状グループは、すべてのシステイン含有ペプチドを含み、そしてさ
らに、単一または複数のジスルフィド構造に対応する2つのサブグループに分割され得る

【0125】
大部分の抗菌ペプチドは、原形質膜の透過の増加を引き起こす。特定の膜タンパク質の
阻害、ストレスタンパク質の合成、DNA合成の停止、ディフェンシンによる一本鎖DN
Aの切断、ブフォリンによるDNAとの相互作用(合成の停止を伴わない)、または過酸
化水素の産生のような、他の機構の証拠もまた存在する。抗菌ペプチドはまた、真核生物
細胞におけるアポトーシスまたは細菌標的における自己分解のような、自己破壊的な機構
を誘発することによって作用し得る。抗菌ペプチドはまた、偽基質として働くことによっ
てか、または基質の接近を妨害する活性部位に強固に結合することによってのいずれかで
、病原性生物によって産生される酵素のインヒビターとして作用することが知られている

【0126】
抗菌ペプチドのレベルの増加は、いくつかの動物およびヒトの感染について(例えば、
Mycobacterium、Pasteurella、またはCryptoporid
ium感染におけるα−ディフェンシン)、そして水疱および創傷液中において種々のペ
プチドが報告されている。炎症性状況または刺激はまた、抗生物質ペプチドの誘導と関連
する。
【0127】
枯渇したレベルの抗菌ペプチドは、いくつかの病理と関連する。従って、特異的顆粒欠
損症候群の患者は、α−ディフェンシンを完全に欠き、頻繁かつ重篤な細菌感染に苦しむ
。HIV患者の唾液からの低レベルのヒスタチン(histatin)は、口のカンジダ
症および真菌感染の高い発生率と相関していた。おそらく、ヒトの病理における抗菌ペプ
チドの関連性の最も説得力のある例証は、気道の再発性の細菌感染と関連する遺伝病であ
る、嚢胞性線維症に由来する。この疾患を引き起こす欠損した塩素チャネルは、肺胞液の
塩分を増大させ、従って、塩分に感受性であるβ−ディフェンシンの抗菌活性を損なう。
Andreu D.(編)(1998)「Antimicrobial peptide
s」Biopolymers(Peptide Science)第47巻、第6号、4
13−491頁。A.Andreu、L.Rivas(1998)Animal
Antimicrobial Peptides:An Overview,Biop
olymers(Pep.Sci.)47:415−433。
【0128】
(抗酸化ペプチド(配列番号1048〜1050))
抗酸化剤は、組織に対する酸化的損傷を防ぐ薬剤である。哺乳動物細胞は、連続して活
性酸素種(例えば、スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、および一重
項酸素)に曝される。これらの反応性酸素中間体は、好気性代謝、薬物および他の生体異
物の異化、紫外線およびX線照射、ならびに食細胞(例えば、白血球)の呼吸性バースト
に応答して、インビボで細胞によって生成されて、侵入する細菌(例えば、創傷を通じて
導入されたもの)を殺傷する。例えば、過酸化水素は、特に、ストレスを受けた細胞およ
び損傷した細胞によって、大部分の生きている生物の呼吸の間に産生される。
【0129】
抗酸化ペプチドの1つの例は、ナチュラルキラー増強因子B(NKEF−B)であり、
これは、最近発見された抗酸化剤の高度に保存されたファミリーに属する。ナチュラルキ
ラー増強因子(NKEF)は、NK細胞傷害性を増加させるその能力に基づいて、同定お
よびクローニングされた。2つの遺伝子(NKEF−AおよびNKEF−B)は、NKE
Fタンパク質をコードし、そして示された配列分析は、各々が高度に保存された抗酸化剤
のファミリーに属することを示唆する。NKEF−Bの抗酸化剤としての役割は、過酸化
水素による酸化的損傷に対する、トランスフェクトされた細胞のその防御によって実証さ
れた。NKEF−Bは、酸化促進剤(例えば、アルキルヒドロペルオキシドおよびMeH
g)に対する抗酸化活性を有する。その抗酸化活性とともに、HPによるNKEF−Bの
誘導は、NKEF−Bが、種々の生体異物毒性薬剤に対する防御を提供する、重要な酸化
的ストレスタンパク質であることを示す。
【0130】
(アポトーシス関連ペプチド(配列番号1051〜1075)
動物細胞は、固有の細胞死のプログラムを介して自己破壊し得る(Steller、1
995)。アポトーシスは、特定の形態学的および生化学的特性によって特徴付けられる
、プログラムされた細胞死の一形態である(Wyllieら、1980)。形態学的に、
アポトーシスは、死滅しつつある細胞の一連の構造変化(原形質膜の小疱形成(すなわち
、水膨れ)、細胞質および核の凝縮、ならびに膜アポトーシス小体への細胞の断片化)に
よって特徴付けられる(Steller、1995;Wyllieら、1980)。
【0131】
生化学的には、アポトーシスは、クロマチンの分解によって特徴付けられ、これは、最
初には50〜300キロ塩基の大きなフラグメント、引き続いて200塩基のモノマーお
よびマルチマーである、より小さなフラグメントになる(Oberhammerら、19
93;Wyllie、1980)。アポトーシスの他の生化学的な指標は、タンパク質ク
ラステリン(TRPM−2またはSGP−2としてもまた公知)(Pearseら、19
92)の誘導レベルまたは増加レベル、および酵素II型トランスグルタミナーゼ(この
酵素は、アポトーシス小体の外被にタンパク質を架橋させる)の活性化である(Fesu
sら、1991)。アポトーシスは、組織および細胞型によって変化し得る、関連する形
態学的プロセスおよび生化学的プロセスの複雑な現象である(Zakeriら、1995
)。
【0132】
アポトーシスの遂行は、死滅しつつある細胞からの細胞成分の漏出を最小化する(アポ
トーシスは、細胞を退縮させる)。例えば、プロテアーゼは、隣接する細胞を損傷させ得
るか、または炎症性応答を刺激し得る。アポトーシスのこの基本的な特徴は、アポトーシ
スをネクローシスから区別する。ネクローシスは、通常、外傷から生じ、損傷した細胞を
膨張および溶解させ、炎症性応答を刺激する細胞質性の物質を放出する(Steller
、1995;Wyllieら、1980)。
【0133】
(嚢細胞ペプチド(BCP)(配列番号1076〜1080))
海洋軟体動物Aplysia californicaの神経ペプチド作動性嚢細胞は
、動物の産卵行動に関与する。これらの神経分泌性細胞は、産卵ホルモン(ELH)前駆
体タンパク質を合成し、複数の生物活性ペプチド(ELHを含む)、いくつかの嚢細胞ペ
プチド(BCP)、および酸性ペプチド(AP)を産生する。海洋軟体動物Aplysi
a californicaの嚢細胞は、産卵を開始する、十分に特徴付けられた神経内
分泌細胞である。性的成熟の間、これらの細胞(嚢細胞ニューロン)は、神経系刺激の期
間の間に放出されるホルモンを貯蔵する能力を発達させる。このホルモンは、産卵のプロ
セスに重要であり、それゆえその動物が性的に成熟する前に放出されてはならない。α−
嚢細胞ペプチドは、インビトロで嚢細胞活性を誘発し得る、構造的に関連するペプチドの
小さなファミリーに属する。
【0134】
(ボンベシン(配列番号1081〜1090))
ボンベシンは、共通のC末端配列Trp−Ala−X−Gly−His−Met−NH
2およびN末端領域を共有するペプチドのファミリーに属する、生物活性テトラデカペプ
チド神経ペプチドである。これは、内因性のガストリンの放出による胃の傷害を予防する
、脳の神経および腸において見出される調節的な役割を有する。ボンベシンの哺乳動物ホ
モログは、ガストリン放出ペプチド(GRP)である。
【0135】
(骨Glaタンパク質ペプチド(配列番号1091〜1097))
オステオカルシン(骨Glaタンパク質またはBGP)は、骨形成のプロセスにおいて
、骨芽細胞によって産生および分泌される。コラーゲンと同様に、このタンパク質は、骨
マトリックスの成分である。血清オステオカルシンは、骨形成速度が上昇した場合に上昇
する。レベルは、骨成長が最も速い思春期の間において高い。レベルは、しばしば、高い
骨の代謝回転を有する疾患(例えば、上皮小体機能亢進症および甲状腺機能亢進症)にお
いてもまた高い。閉経後の骨粗しょう症において、オステオカルシンレベルは、ときおり
増加し、このことは、二次的な骨の迅速な骨吸収への代謝回転の増加を反映する。より高
齢の被験体において発症する、老人性の骨粗しょう症においては、オステオカルシンレベ
ルが低いようであり、このことは、骨の代謝回転および骨形成の両方の速度が減少してい
ることを反映する。骨形成を増加させる処置レジメンはまた、血清オステオカルシンレベ
ルを上昇させる。
【0136】
(CARTペプチド(配列番号1098〜1100))
コカインおよびアンフェタミン調節転写物ペプチド(CART)は、強力な食欲抑制活
性を有する、最近発見された視床下部性ペプチドである。ラットにおいて、CART遺伝
子は、129アミノ酸残基または116アミノ酸残基のいずれかのペプチドをコードする
のに対して、ヒトにおいては短い型のみが存在する。推定シグナル配列は、102残基ま
たは89残基のプロホルモン中に生じる27アミノ酸残基である。CARTのC末端は、
48アミノ酸残基および3つのジスルフィド結合からなり、この分子の生物学的に活性な
部分を構成すると考えられている。
【0137】
中枢神経系において、CARTは、多くの視床下部の核において高度に発現され、それ
らのいくつかは、摂食行動の調節に関与する。CART mRNAは、レプチンによって
調節されており、そして発現されたCARTは、神経ペプチドYによって誘導される摂食
応答を無効にさえする、摂食の強力なインヒビターである。従って、推定CARTレセプ
ターは、抗肥満薬物についての強力な治療標的である。CART,a new anor
ectic peptide Thim L;Kristensen P;Larsen
PJ;Wulff BS,Int J Biochem Cell Biol、30(
12):1281−4 1998 Decを参照のこと。
【0138】
(細胞接着ペプチド(配列番号1101))
細胞接着ペプチドは、外部刺激に対する細胞応答に直接的に関与する。例えば、炎症性
応答の間に、白血球は、原形質区画から離れて、抗原性の傷害の点に移動しなくてはなら
ない。この移動事象の機構は、可溶性メディエーターと膜結合細胞接着分子との間の複雑
な相互作用である。可溶性細胞走化因子は、種々の常在性の細胞によって損傷された組織
中で産生され、原形質区画の外に化学的濃度勾配を生じさせる。これらの因子の、白血球
上のそれらのレセプターとの相互作用は、走化因子の増加する濃度に向かっての白血球の
方向付けられた移動をもたらす。同時に、種々の接着ペプチドは、内皮組織上で最初の転
がり(rolling)を媒介する白血球上でアップレギュレートされ、活性化された内
皮組織上の特定のリガンドに結合し、そして最終的に、内皮細胞間でのその組織への移動
をもたらす。事象のカスケードにおけるこの段階は、「細胞接着分子」と名付けられた特
定の細胞表面タンパク質の相互作用によって媒介される。この分子は、例えば、E−セレ
クチン(ELAM−1、内皮白血球接着分子−1)、ICAM−1(細胞間接着分子−1
)、およびVCAM−1(血管細胞接着分子−1)である。
【0139】
(走化性ペプチド(配列番号1102〜1113))
走化性ペプチドは、白血球(white cell)、白血球(leukocyte)
、およびマクロファージの、感染もしくは傷害の部位の組織への移動を刺激するか、また
は代替的に、これらの同じ細胞の、これらの部位から離れる移動を妨害するペプチドであ
る。
【0140】
(補体インヒビター(配列番号1114〜1120))
異種移植片(xenotransplant)に対する補体攻撃の阻害は、補体インヒ
ビターの使用によって達成され得る。移植された器官の拒絶は、極度に迅速な超急性拒絶
(HAR)期およびより遅い細胞拒絶期の両方を含み得る。異種移植片のHARは、あら
かじめ形成された、ドナーの器官の内皮に結合する「天然の」抗体により開始され、そし
て、この抗体は、ドナーの組織内皮に結合して、レシピエントの免疫系による補体攻撃を
活性化する。補体の活性化は、走化性、凝血促進性、炎症誘発性、接着性、および細胞溶
解性の特性を有する、液相タンパク質(C3a、C5a)および膜結合タンパク質(C3
bおよびC5b−9、すなわち、C5b、C6、C7、C8、およびC9)の生成をもた
らす。補体インヒビターは、このプロセスを阻害する。
【0141】
(コルチスタチンペプチド(配列番号1121〜1124))
コルチスタチン(cortistatin)は、そのmRNAが睡眠遮断の間に蓄積し
、明らかに、皮質興奮性に対するアセチルコリンの効果に拮抗することによって作用し、
それによって、脳の徐波の同期化をもたらす。コルチスタチン−14(CST−14)は
、ソマトスタチン−14(SRIF−14)とその14残基のうちの11を共有し、なお
その睡眠の生理、歩行運動の行動、および海馬の機能に対する効果は、ソマトスタチンの
効果とは全く異なっている。
【0142】
(フィブロネクチンフラグメントおよびフィブリン関連ペプチド(配列番号1125〜
1174))
フィブロネクチンは、反復する相同なペプチド配列の3つの型のブロックから構成され
る、大きな糖タンパク質である。相同なブロックのうちのいくつかは、2つのほぼ同一の
サブユニットアーム上に直鎖状のアレイに組織化される機能的ドメインを形成する。各ア
ームは、機能的ドメインに分けられ得、これらは、しばしば、その領域に結合する物質の
1つによって呼ばれる(例えば、ヘパリン結合フラグメント、フィブリン結合フラグメン
ト、および細胞結合フラグメント)。いくつかの細胞型において、フィブロネクチンの細
胞結合ドメインのArg−Gly−Asp(RGD)配列は、lib/IIIaと呼ばれ
る細胞表面糖タンパク質と相互作用する。フィブロネクチンはまた、細胞外および基底膜
の成分、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質、種々の細菌(staphylococc
iおよびstreptococciを含む)、ならびに寄生生物(例えば、Trypan
osoma cruziおよびLeishmania種)に結合する。
【0143】
フィブロネクチンは、いくつかの接着機能(例えば、細胞−細胞接着、細胞−基底膜接
着、および凝塊安定化)を有する。さらに、フィブロネクチンは、胚形成、神経再生、線
維芽細胞移動、マクロファージ機能、ならびに、哺乳動物細胞および細胞外マトリックス
への病原体(ウイルス、真菌、細菌、および原生動物)の結合を促進する。従って、フィ
ブロネクチンは、創傷治癒の最終段階を通しての感染の開始からの感染の病因に関与する
。Proctor,R.A.、Rev.Infect.Dis.、9、317(1987
)を参照のこと。
【0144】
(FMRFおよび類似のペプチド(配列番号1175〜1187))
FMRFは、FMRFアミド遺伝子にコードされた神経ペプチドであり、共通のC末端
FMRFアミドを有するが、異なるN末端伸長を有する。FMRFアミド関連ペプチド(
FaRP)は、動物界の至るところに存在し、そして神経機能および胃腸機能の両方に影
響を与える。生物は、共通のC末端構造を有するが異なるN末端アミノ酸伸長を有する、
多数のFaRPをコードするいくつかの遺伝子を有する。
【0145】
(ガラニンおよび関連するペプチド(配列番号1188〜1208))
ガラニンは、もともとブタの小腸から単離された29〜30アミノ酸のペプチドである
。これは、2つの生物学的に活性な形態で見出されている:GAL(1〜19)および非
アミド化形態のGAL(1〜30)である。ガラニンは、多くの生物学的役割を有し、そ
れらとしては以下が挙げられる:視床下部における生体アミンの放出の阻害、コリン作用
性機能のシナプス前部およびシナプス後部の阻害、胃腸のホメオスタシスの維持、ならび
にインスリンおよびグルカゴンの分泌の調節。
【0146】
(増殖因子および関連するペプチド(配列番号1209〜1240))
増殖因子は、細胞分裂を調節するタンパク質のファミリーである。いくつかの増殖因子
は細胞型特異的であり、適切なレセプターを有する細胞のみの分裂を刺激する。他の増殖
因子は、その効果においてより一般的である。増殖因子の効果と拮抗して、分裂を遅延ま
たは妨害する細胞外因子もまた、存在する(例えば、トランスフォーミング増殖因子βお
よび腫瘍壊死因子)。これらの細胞外シグナルは、ホルモンのレセプターと非常に類似し
ている細胞表面レセプターを通して、そして類似の機構(細胞内第2メッセンジャーの産
生、タンパク質リン酸化、および究極的には、遺伝子発現の変更)によって作用する。
【0147】
(G治療用ペプチド結合タンパク質フラグメント(配列番号1241〜1246))
G治療用ペプチド(Gtherapeutic peptide)結合調節タンパク質
(Gタンパク質)のファミリーのメンバーは、膜結合レセプターから細胞内エフェクター
にシグナルを伝達する。このファミリーには、GsおよびGiが含まれ、これらは、それぞ
れ、アデニル酸シクラーゼの刺激および阻害の原因である。トランスデューシン(T)は
、網膜杆状体外部セグメントの円板膜に局在し、光によるロドプシンの活性化を、サイク
リックGMPホスホジエステラーゼ活性の増加に連関させる。もともとウシ脳において見
出されたGoは、このファミリーの第4のメンバーである。
【0148】
精製されたGタンパク質は、類似の物理学的特性を有する。これらは、αサブユニット
、βサブユニット、およびγサブユニットから構成されるヘテロダイマーである。αサブ
ユニットはG治療用ペプチドに結合し、そしてこれを加水分解する。S.M.Mumby
ら、PNAS 83,265(1986)およびLehninger 764頁を参照の
こと。
【0149】
(グアニリンおよびウログアニリン(配列番号1247〜1249))
グアニリンおよびウログアニリンは、腸粘膜および尿から単離されたペプチドであり、
これらは、腸細胞中のサイクリックGMP産生を調節し、グアニル酸シクラーゼCに結合
してそれを活性化し、そして脊椎動物の多くの上皮中での塩および水の輸送を制御し、い
くつかの熱安定性細菌のエンテロトキシンの作用を模倣する。腎臓においては、これらの
両方が、十分に実証されているナトリウム排泄増加性効果およびカリウム排泄増加性効果
を有する。
【0150】
腸における塩素分泌は、グアニル酸シクラーゼC(GC−C)の活性化を介して、これ
らのホルモンによって調節される。両方のペプチドは、種々の組織および器官(腎臓を含
む)において発現される。単離された、灌流した腎臓およびインビボのこれらのホルモン
は、ナトリウム排泄増加および利尿を誘導するが、しかし、腎臓中のそれらの作用の局在
および細胞機構は、なお未知である。
【0151】
(インヒビンペプチド(配列番号1250〜1255)
インヒビンは、2つのサブユニット(αは134アミノ酸;βは、115〜116アミ
ノ酸)から構成される。その役割は、FSH分泌の阻害である。2つのインヒビンアイソ
フォーム(インヒビンAおよびインヒビンB)は、配偶子成熟の過程で性腺によって産生
され、そして月経周期の間、異なる分泌パターンを有する。インヒビンはまた、胎盤およ
び胚膜によって産生され、そして妊娠の生理学的適応に関与し得る。臨床的には、インヒ
ビンは、閉経後の女性における感度の高い腫瘍マーカーとして、または不妊の女性におけ
る卵巣の抑制(ovarian reserve)を評価するための有用なツールとして
働き得;これらはまた、母性(materno)胎児障害の診断において使用され、そし
て卵の成熟を妨害し得るか、または排卵を阻害し得る。
【0152】
(インターロイキン(IL)およびインターロイキンレセプタータンパク質(配列番号
1256〜1263))
インターロイキンは、造血起源の細胞を標的とする増殖因子である。免疫応答および炎
症応答と関連する種々の生物学的活性は、インターロイキンに起因している。これらの応
答には、発熱、軟骨破壊、骨吸収、胸腺細胞増殖、Tリンパ球およびBリンパ球の活性化
、肝実細胞からの急性期タンパク質合成の誘導、線維芽細胞増殖、ならびに骨髄細胞の分
化および増殖が挙げられる。
【0153】
(ラミニンフラグメント(配列番号1264〜1284))
ラミニン(基底膜の主要非コラーゲン糖タンパク質)は、インビトロで種々の腫瘍細胞
型の接着、拡散、および移動を促進することが示された。特に、実験室において現在主要
な研究は、インタクトなラミニン、ラミニンの精製されたタンパク質分解フラグメント、
およびラミニンの合成ペプチドを、この大きなタンパク質における機能的に活性な部位を
同定するために利用する。このような基底膜の成分は、種々の細胞型についての増殖、発
生および分化の重要なモジュレーターである。結合体化ラミニンは、組織の炎症または線
維症を予防するのに使用され得る。
【0154】
このカテゴリーはまた、ペプチドクリングル−5(すなわちK−5)を含む。本明細書
中で使用されるように、用語「クリングル5」とは、哺乳動物プラスミノーゲン分子の5
番目のクリングル領域によって規定される特定の三次元コンフォメーションに寄与する3
つのジスルフィド結合を有する哺乳動物のプラスミノーゲンの領域をいう。1つのこのよ
うなジスルフィド結合は、アミノ酸462位および541位に位置するシステイン残基と
連結し、第2の結合は、アミノ酸483位および524位に位置するシステイン残基に連
結し、そして第3の結合は、アミノ酸512位および536位に位置するシステイン残基
に連結する。用語「クリングル5ペプチドペプチド」とは、哺乳動物プラスミノーゲンの
対応するペプチドフラグメントに相同な実質的配列を有する、4アミノ酸と104アミノ
酸の間(両端を含む)の抗脈管形成活性を有するペプチドをいう。
【0155】
(レプチン(leptin)フラグメントペプチド(配列番号1285〜1288))
レプチン(肥満遺伝子のタンパク質産物)は、脂肪細胞によって分泌される。レプチン
は、ヒトにおける体重および代謝の調節に関与し、また、インシュリン耐性症候群の病態
生理学に関与し得、このインシュリン耐性症候群は、心臓血管疾患の発生と関連する。
【0156】
(ロイコキニン(leucokinin)(配列番号1289〜98))
ロイコキニンは、腸運動性および細管流体分泌速度を刺激する、広範な昆虫ホルモンの
グループである。細管において、それらの主要な作用は、基底外側の膜上のレセプターに
結合することによって塩化物透過性を上昇させることである。
【0157】
(下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)(配列番号129
9〜1311)
これは、38アミノ酸ペプチドであり、これは最初にヒツジ視床下部から単離され、こ
れはまた、PACAP−27と呼ばれる27アミノ酸形態において生じる。PACAPは
、視床下部に局在化しており、他には、脳、気道および胃腸系において局在化している。
これは、神経伝達およびホルモン機能、エネルギー代謝の調節の関与、およびニューロン
保護作用活性を含む多くの生物学的作用を有する。
【0158】
(パンクレアスタチン(配列番号1312〜1324))
パンクレアスタチンは、49アミノ酸ペプチドであり、最初にブタ膵臓から単離、精製
および特徴付けされた。異なる組織におけるその生物学的活性は、分子のC末端部分に割
り当てられ得る。パンクレアスタチンは、プロホルモン前駆体、クロモグラニンAを有し
、このクロモグラニンAは、内分泌膵臓を含む神経内分泌に存在する糖タンパク質である

【0159】
(ポリペプチド(配列番号1325〜1326))
これらは、反復性の鎖である。2つの例を提供する:(pro−Hyp−Gly)10
*20H20およびポリL−リジン塩酸塩。
【0160】
(シグナル伝達試薬(配列番号1327〜1367))
シグナル伝達は、細胞外シグナル(例えば、化学的、力学的、または電気的)が増幅さ
れ、細胞性応答に変換されるプロセスである。多くの試薬が、このプロセスに含まれ、例
えば、アチャチン−1(achatin−1)、グリコーゲンシンターゼ、オートカムチ
ド2(autocamtide2)、カルシニューリン自己阻害ペプチド、カルモジュリ
ン依存性プロテインキナーゼII、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ基質、カル
モジュリン依存性プロテインキナーゼ基質アナログ。CSK−17、Cys−Kempt
ide、オートカムチド2、マランチド(malantide)、メリチン、リン酸アク
セプターペプチド、プロテインキナーゼCフラグメント、P34cd2キナーゼフラグメ
ント、P60c−src基質II、プロテインキナーゼAフラグメント、チロシンプロテ
インキナーゼ基質、シンチド2(syntide2)、S6キナーゼ基質ペプチド32、
チロシン特異性プロテインキナーゼインヒビター、およびそれらの誘導体およびフラグメ
ントが挙げられる。
【0161】
(トロンビンインヒビター(配列番号1368〜1377))
トロンビンは、凝固カスケードにおいて重要な調節酵素である;トロンビンは、正のフ
ィードバック調節因子と負のフィードバック調節因子との両方として多元的な役割に役立
つ。止血に対するその直接的な効果に加えて、トロンビンは、動脈血栓症の病原を支持お
よび増幅する様々な細胞型に対する直接的な効果を及ぼす。この酵素は、血小板の強力な
活性化因子であり、血小板を凝集させ、物質(例えば、ADP TXA.sub.2NE
)を放出し、これは、さらに、血栓サイクルを増加させる。フィブリンメッシュ内の血小
板は、白色血栓の主要なフレームワークを含む。トロンビンはまた、内皮細胞に直接的な
効果を及ぼし、これは、血管収縮物質の放出および接着分子のトランスロケーションを引
き起こし、これは、免疫細胞の接着の部位となる。さらに、この酵素は、平滑筋細胞の有
糸分裂誘発および線維芽細胞の増殖を引き起こす。この分析から、トロンビンインヒビタ
ーによるトロンビン活性の阻害が、血栓症と関連する増殖事象の減少に向かった実行可能
な治療アプローチを構成することが明らかである。
【0162】
(毒素(配列番号1387〜1415))
毒素は、本発明を用いて、標的癌細胞、レセプター、ウイルス、または血液細胞に結合
体化され得る。一旦毒素が標的細胞に結合すると、その毒素は内部移行し、細胞毒性を引
き起こし、そして結果的に細胞死を引き起こす。毒素は、癌治療剤として広く使用されて
いる。
【0163】
毒素の分類の一つの例は、肥満細胞脱顆粒ペプチド、ハチ毒から単離された2つのジス
ルフィド架橋を有するカチオン性22−アミノ酸残基ペプチドであり、これは、肥満細胞
脱顆粒を引き起こし、低濃度でヒスタミン放出を引き起こし、高濃度で抗炎症活性を有す
る。この肥満細胞脱顆粒ペプチドは、強力な抗炎症性があり、炎症を減少する際、ヒドロ
コルチゾンより100倍より高く効果的である。これらの独特の免疫学的性質のため、M
CDペプチドは、肥満細胞、好塩基性細胞、および白血球のような炎症性細胞の分泌メカ
ニズムを研究する際有用なツールとして役立ち得、治療的可能性を有する化合物の設計に
導く。肥満細胞顆粒化ペプチドの例は、マストパランであり、これはスズメバチの毒液か
ら生じる。マストパランは、肥満細胞を0.5μg/mlの濃度で脱顆粒し、同じ濃度で
細胞からヒスタミンを放出させる。IY.Hiraiら、Chem.Pharm.Bul
l.27,1942(1979)を参照のこと。
【0164】
このような毒素の他の例は、オメガ−アガトキシンTK、アゲレニン(ageleni
n)、アパミン、カルシクジン(calcicudine)、カルシセプチン(calc
iseptine)、チャーブドトキシン(charbdotoxine)、クロロトキ
シン(chorotoxine)、コノトキシン、内毒素インヒビター、ゲグラフィート
キシン(gegraphutoxine)、イベリオトキシン(iberiotoxin
)、カリオトキシン(kaliotoxin)、肥満細胞顆粒化ペプチド、マーガトキシ
ン(margatoxin)、神経毒NSTX−3、PLTX−II、サイラトキシン(
scyllatoxine)、スチコダクチラトキシン(stichodactyla
toxin)、ならびにこれらの誘導体およびフラグメントが挙げられる。
【0165】
(トリプシンインヒビター(配列番号1416〜1418))
トリプシンインヒビターは、トリプシン、ならびに他のセリンプロテアーゼのインヒビ
ターとして機能する。肺炎症、膵炎、心筋梗塞、脳血管虚血の処置に有用である。
【0166】
(ウイルス関連ペプチド(配列番号1419〜1529))
ウイルス関連ペプチドは、ウイルス関連タンパク質、例えば、ウイルスレセプイター、
ウイルスインヒビター、およびエンベロープタンパク質である。例としては、以下が挙げ
られるが、これらには限定されない:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、RSウイルス(
RSV)、ヒトパラインフルエンザウイルス(HPV)、麻疹ウイルス(MeV)、およ
びシミアン免疫不全ウイルス(SIV)のペプチドインヒビター、蛍光発生的ヒトCMV
プロテアーゼ基質、HCVコアタンパク質、HCV NS4Aタンパク質、B型肝炎ウイ
ルスレセプター結合フラグメント、B型肝炎ウイルスPre−S領域、ヘルペスウイルス
インヒビター2、HIVエンベロープタンパク質フラグメント、HIVgagフラグメン
ト、HIV基質、HIV−1阻害ペプチド、ペプチドT、T21、V3デカペプチド、ウ
イルス複製インヒビターペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体。
【0167】
これらのペプチドは、治療的に投与され得る。例えば、ペプチドTは、HIV−1gp
120のV2領域からの8アミノ酸の鎖である。これらのアミノ酸は、HIVの外側エン
ベロープの部分と類似している。これらのアミノ酸は、HIV関連の神経学的症状および
全身症状の治療法として研究されており、ペプチドTは、発熱、寝汗、体重減少、および
疲労のような症状を軽減し得る。これはまた、乾癬損傷を散らすことが示されている。
【0168】
(種々雑多なペプチド(配列番号1529〜1617))
アジュバントペプチドアナログ、α接合因子、抗不整脈ペプチド、食欲不振誘発性ペプ
チド、α−1抗トリプシン、ウシ松果体抗生殖ペプチド、バルシン(bursin)、C
3ペプチドP16、カドヘリンペプチド、クロモグラニンAフラグメント、避妊テトラペ
プチド、コナントキンG(conantokin G)、コナントキンT、甲殻類心臓作
用ペプチド、C−テロペプチド、チトクロムb588ペプチド、デコルシン(decor
cin)、デリシャスペプチド、δ睡眠誘導ペプチド、ジアゼパム結合インヒビターフラ
グメント、一酸化窒素シンターゼ遮断ペプチド、OVAペプチド、血小板カルパインイン
ヒビター(P1)、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1、リギン(rigin)
、精神分裂病関連ペプチド、ナトリウムカリウムA治療ペプチダーゼインヒビター−1(
sodium potassium Atherapeutic peptidease
inhibitor−1)、スペラクト、精子活性化ペプチド、システミン(syst
emin)、トロンビンレセプターアゴニスト(3つのペプチド)、ツフシン、アジポキ
ニンホルモン、尿毒症ペンタペプチド、凍結防止ペプチド、腫瘍壊死因子、ヒル[Des
Asp10]Decorsin、L−オルニチルタウリン(Ornithyltaur
ine)塩酸塩、p−アミノフェニルアセチルツフシン、
【0169】
【化1】


ウニ精子活性化ペプチド、SHU−9119 MC3−RおよびMC4Rアンタゴニスト
、グラスピモド(glaspimod)(免疫刺激剤、細菌感染、真菌感染、免疫不全、
免疫障害、白血球減少症に対して有用)、HP−228(メラノコルチン、化学療法誘導
嘔吐、毒性、疼痛、真性糖尿病、炎症、慢性関節リウマチ、肥満に対して有用)、α−2
−プラスミンインヒビター(プラスミンインヒビター)、APC腫瘍抑制因子(腫瘍抑制
因子、新生物に対して有用)、初期妊娠因子(免疫抑制因子)、エンドゼピン(endo
zepine)ジアゼパム結合インヒビター(レセプターペプチド)、γインターフェロ
ン(白血病に対して有用)、腺カリクレインn−1(免疫刺激剤)、胎盤リボヌクレアー
ゼインヒビター、サルコレシン(sarcolecin)結合タンパク質、界面活性タン
パク質D、ウィルムス腫瘍抑制因子、ウィルムス腫瘍抑制因子、GABAB 1bレセプ
ターペプチド、プリオン関連ペプチド(iPrP13)、コリン結合タンパク質フラグメ
ント(細菌関連ペプチド)、テロメラーゼインヒビター、カルジオスタチン(cardi
ostatin)ペプチド、エンドスタチン(endostatin)誘導ペプチド(新
脈管形成インヒビター)、プリオン阻害ペプチド、N−メチルD−アスパラギン酸レセプ
ターアンタゴニスト、C−ペプチドアナログ(糖尿病合併症に対して有用)が挙げられる

【0170】
(2.修飾治療用ペプチド)
本発明は、修飾治療用ペプチドおよびそれらの誘導体に関する。本発明の修飾治療用ペ
プチドは、共有結合を形成するために、血液成分の利用可能な反応性官能基と反応し得る
反応性基を含む。本発明はまた、このような修飾物、血液成分とのこのような組み合わせ
およびそれらの使用方法に関する。これらの方法は、修飾治療用ペプチドの効果的な治療
インビボ半減期を延ばす工程を含む。
【0171】
タンパク質上の官能性と共有結合を形成するために、反応性基として広範な種々の活性
なカルボキシル基、特にエステルを使用し得、ここで、ヒドロキシル部分は、治療用ペプ
チドを修飾するために必要とされるレベルで生理学的に受容可能である。多くの異なるヒ
ドロキシル基がこれらの連結剤において使用され得るが、最も通常のものは、N−ヒドロ
キシスクシンイミド(NHS)、およびN−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド(sul
fo−NHS)である。
【0172】
第一級アミンは、以下のスキーム1Aに図示されるようにNHSエステルに対する重要
な標的である。タンパク質のN末端に存在するアクセス可能なα−アミンが、NHSエス
テルと反応する。しかし、タンパク質のα−アミノ基は、NHSカップリングについて望
ましくないかまたは利用可能でないかもしれない。5個のアミノ酸がその側鎖に窒素を有
するが、リジンのε−アミンのみが、有意にNHSエステルと反応する。アミド結合は、
NHSエステルが、結合反応において、以下のスキーム1Aに示されるように、第一級ア
ミンと反応し、N−ヒドロキシスクシンイミドを放出する場合に形成される。
【0173】
【化2】


本発明の好ましい実施形態において、タンパク質の官能基はチオール基であり、反応性
基は、γ−マレイミド−ブチルアミド(GMBA)またはMPAのようなマレイミド含有
基である。マレイミド基は、反応混合物のpHが以下のスキーム1Bに示されるように6
.5と7.4の間で維持される場合、ペプチドのスルフヒドリル基について最も選択的で
ある。pH7.0において、マレイミド基とスルフヒドリルとの反応速度は、アミンとの
反応より1000倍速い。マレイミド基とスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結
合が形成され、これは、生理学的な条件下では切断され得ない。
【0174】
【化3】


本発明の治療用ペプチドおよびペプチド誘導体は、血液成分の特異的標識化および非特
異的標識化のために修飾され得る。
【0175】
(A.特異的標識化)
好ましくは、本発明の治療用ペプチドは、移動性血液タンパク質のチオール基と特異的
に反応するように設計される。このような反応は、好ましくは、血清アルブミンまたはI
gGのような移動性血液タンパク質のチオール基へのマレイミド連結(例えば、GMBS
、MPAまたは他のマレイミドから調製される)を用いて修飾される治療用ペプチドの共
有結合によって確立される。
【0176】
特定の条件下において、マレイミドとの特異的な標識化は、NHSおよびsulfo−
NHSのような基を用いる移動性タンパク質の非特異的な標識化に比べていくつかの利点
を提供する。チオール基は、インビボにおいてアミノ基よりもあまり豊富ではない。従っ
て、本発明のマレイミド誘導体は、より少ないタンパク質に共有結合する。例えば、アル
ブミン(最も豊富な血液タンパク質)において、一つのチオール基のみが存在する。従っ
て、治療用ペプチドマレイミド−アルブミン結合体は、治療用ペプチド対アルブミンを約
1:1のモル比で含む傾向がある。アルブミンに加えて、IgG分子(クラスII)もま
た、遊離チオールを有する。IgG分子および血清アルブミンが血液において可溶なタン
パク質の大部分を構成するので、これらはまた、マレイミド修飾治療用ペプチドに共有結
合するのに利用可能な血液中の遊離チオール基の大部分を構成する。
【0177】
さらに、遊離チオール含有血液タンパク質の間でさえ、マレイミドを用いた特異的標識
化は、アルブミン自体の独特の特徴付けに起因して、治療用ペプチドマレイミド−アルブ
ミン結合体の優先的な形成に導く。アルブミンの単一の遊離チオール基は、種間において
高度に保存され、アミノ酸残基34(Cys34)に位置する。最近、アルブミンのCys
34が他の遊離チオール含有タンパク質の遊離チオールと比べて高い反応性を有することが
示されている。これは、アルブミンのCys34に対する非常に低いpK値(5.5)に一
部起因する。これは、一般的にシステイン残基の典型的なpK値(典型的には約8)より
もずっと低い。この低いpKに起因して、正常な生理学的条件下でアルブミンのCys34
は、主にイオン化された形態であり、これは、その反応性を劇的に増加させる。Cys34
の低いpK値に加えて、Cys34の反応性を高める別の因子はその位置であり、その位置
は、アルブミンのV領域の一つのループの表面に近接した間隙である。この位置は、Cy
34を全ての種類のリガンドに対してまさしく利用可能にし、遊離ラジカルトラップおよ
び遊離チオール捕捉剤としてCys34の生物学的役割において重要な因子である。これら
の性質は、Cys34を治療用ペプチドマレイミドに非常に反応性にし、反応速度の加速は
、他の遊離チオール含有タンパク質と治療用ペプチドマレイミドの反応の反応速度に比べ
て、1000倍であり得る。
【0178】
治療用ペプチドマレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、Cys34に特異的にペプ
チド対アルブミンを1:1で含むことに関連する再現性である。グルタルアルデヒド、D
CC、EDCおよび例えば、遊離アミンについての他の化学活性化のような他の技術は、
この選択性を欠いている。例えば、アルブミンは、52個のリジン残基を含み、このうち
の25〜30個は、アルブミンの表面に位置し、そして結合のためにアクセス可能である
。これらのリジン残基の活性化、あるいはこれらのリジン残基を通して結合するペプチド
の修飾は、結合体の不均一な集団を生じる。ペプチド対アルブミンの1:1のモル比が使
用される場合でさえ、生成物は、複数の結合体酸物からなり、そのいくつかは、アルブミ
ン当たり0、1、2以上のペプチドを含み、それぞれは、25〜30個の利用可能なリジ
ン部位のいずれか1つにランダムに結合されるペプチドを有する。多くの組み合わせが可
能である場合、抽出成分およびそれぞれのバッチの性質の特徴付けは困難になり、バッチ
間の再現性はほとんど不可能であり、このような結合体を治療剤としてあまり望ましくな
くする。さらに、アルブミンのリジン残基を介する結合体化が、アルブミン分子当たりの
治療剤のより多くを送達する利点を少なくとも有するようであるが、研究によって、治療
剤対アルブミンの1:1の比が好ましいことが示された。Stehleら、「The L
oading Rate Determines Tumor Targeting P
roperties of Methotrexate−Albumin Conjug
ates
in Rats」、Anti−Cancer Drugs,第8巻,677−685頁
(1997)による論文(その全体において本明細書中で援用される)において、著者ら
は、抗癌剤メトトレキサート対グルタルアルデヒドを介して結合されるアルブミンの1:
1の比が最も有望な結果を与えたことを報告した。これらの結合体は腫瘍細胞によって取
り込まれたが、5:1〜20:1のメトトレキサート分子を有する結合体は、変化したH
PLCプロフィールを有し、そしてインビボで肝臓に迅速に取り込まれた。これらの高い
比において、アルブミンに対するコンフォメーションの変化は、治療キャリアとしてのそ
の有効性を減少することが推論された。
【0179】
マレイミド−治療用ペプチドのインビボでの制御された投与を通して、アルブミンおよ
びIgGのインビボでの特異的な標識化を制御し得る。典型的な投与において、80〜9
0%の投与されたマレイミド−治療用ペプチドが、アルブミンを標識し、5%未満がIg
Gを標識する。グルタチオンのような遊離チオールの微量標識がまた、生じる。このよう
な特異的な標識化は、インビボ用途に好ましい。なぜなら、これは、投与された薬剤の見
積もられた半減期の正確な計算を可能にするからである。
【0180】
制御された特異的なインビボ標識化を提供することに加えて、マレイミド−治療用ペプ
チドは、血清アルブミンおよびIgGのエキソビボでの特異的標識化を提供し得る。この
ようなエキソビボの標識化は、血清アルブミンおよび/またはIgGを含む血液、血清ま
たは生理食塩水へのマレイミド−治療用ペプチドの添加を包含する。一旦、マレイミド−
治療用ペプチドを用いてエキソビボで修飾すると、血液、血清または生理食塩溶液は、イ
ンビボ処置のために血液に再投与され得る。
【0181】
NHS−ペプチドと対照的に、マレイミド−治療用ペプチドは、一般的に、水性溶液の
存在下および遊離アミンの存在下において、非常に安定である。マレイミド−治療用ペプ
チドが遊離チオールとのみ反応するので、マレイミド−治療用ペプチドがそれ自体と反応
することを防ぐために、保護基は、一般的に必要ではない。さらにペプチドの増加した安
定性によって、インビボ用途に適切な非常に精製された産物を調製するためのHPLCの
ようなさらなる精製工程の使用を可能になる。最後に、増加した化学的安定性は、より長
い有効期限を有する製品を提供する。
(B.非特異的標識)
本発明の治療用ペプチドはまた、血液成分の非特異的標識のために改変され得る。アミ
ノ基との結合が一般的に使用され得、特に非特異的標識のためのアミド結合の形成を伴う
。そのような結合を形成するために、治療用ペプチドと結合した化学反応性基として、広
範に種々の活性カルボキシル基、特にエステルを使用し得、ここでそのヒドロキシル部分
は、必要とされるレベルにおいて生理学的に受容可能である。多数の異なるヒドロキシル
基がこれらの結合剤において使用され得るが、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)
およびN−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド(スルホ−NHS)が最も都合が良い。
【0182】
利用され得る他の結合剤は、米国特許第5,612,034号(これは、本明細書中に
参考として援用される)において記載される。
【0183】
非特異的治療用ペプチドの化学反応性基がインビボで反応し得る種々の部位としては、
細胞、特に赤血球(成熟赤血球)および血小板、ならびにタンパク質(例えば、免疫グロ
ブリン(IgGおよびIgMを含む)、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タ
ンパク質、トランスフェリン、サイロキシン結合蛋白、α−2−マクログロブリンなど)
が挙げられる。誘導体化された治療用ペプチドが反応するそれらのレセプター(これは、
長命ではない)は、一般的に、およそ3日以内にヒト宿主から除去される。上記に示され
るタンパク質(細胞のタンパク質を含む)は、血中濃度に基づいて、特に半減期に関して
は、少なくとも3日間血流中に残存し、そして5日間以上残存し得る(一般的に、60日
間を超えず、より一般的には30日間を超えない)。
【0184】
ほとんどの部分について、反応は、血液中の移動性成分、詳細には血液タンパク質およ
び細胞、より詳細には血液タンパク質および成熟赤血球を伴う。「移動性」とは、その成
分が、任意の長期間(一般的には5分間を超えず、より一般的には1分間である)一定の
場所にいないことを意図するが、いくつかの血液成分は、長期間、比較的停止し得る。最
初は、標識されたタンパク質および細胞の比較的不均一な集団が存在する。しかし、ほと
んどの部分について、投与後数日以内でその集団は、血流中の標識されたタンパク質の半
減期に依存して、最初の集団とは実質的に異なってくる。従って、通常、およそ3日以内
もしくはそれ以上の期間内に、IgGは、血流において優勢な標識タンパク質となる。
【0185】
通常、投与後5日までに、IgG、血清アルブミンおよび成熟赤血球は、血液中の結合
成分の少なくとも約60mol%、通常は少なくとも約75mol%となり、IgG、I
gM(実質的により少ない程度まで)および血清アルブミンは、非細胞性結合成分の少な
くとも約50mol%、通常は少なくとも約75mol%、より一般には約80mol%
となる。
【0186】
血液成分に対する非特異的治療用ペプチドの所望の結合体は、患者に直接その治療用ペ
プチドを投与することによって、インビボにて調製され得る。この患者は、ヒトまたは他
の哺乳動物であり得る。その投与は、ボーラス形態でなされるか、または流れを計器で調
節して注入することなどによって、ゆっくりと長期間で導入され得る。
【0187】
所望される場合、対象結合体はまた、血液と本発明の改変治療用ペプチドとを組み合わ
せることによって、エキソビボで調製され得、血液成分上の反応性官能基と改変治療用ペ
プチドとの共有結合を可能にし、次いで、宿主にその結合体化血液を戻すか、または投与
する。さらに、上記のことは、初めに、個々の血液成分または限られた数の成分(例えば
、赤血球細胞、免疫グロブリン、血清アルブミンなど)を精製し、そしてその成分または
複数の成分をエキソビボにて化学的に反応性の治療(ltherpeutic)ペプチド
と組み合わせることによって達成され得る。次いで、標識された血液または血液成分は、
治療的に有効な結合体をインビボで被験体に提供するために宿主に戻され得る。その血液
はまた、エキソビボで操作する間の凝固を予防するために処理され得る。
【0188】
(3.本発明において使用される治療用ペプチドの合成)
ペプチドフラグメントは、当業者に公知の固相ペプチド化学の標準的な方法によって、
合成され得る。例えば、ペプチドフラグメントは、アプライドバイオシステムシンセサイ
ザー(Applied Biosystem synthesizer)を使用する、S
tewardおよびYoung(Steward,J. M.およびYoung,J.D
.,Solid Phase Peptide Synthesis,第2版.,Pie
rce Chemical Company,Rockford,III.,(1984
))により記載される手順に従がう固相化学技術によって合成され得る。次いで、同様に
、複数のフラグメントが共に結合して合成されて、より大きなフラグメントを形成する。
これらの合成ペプチドフラグメントはまた、特定の位置におけるアミノ酸置換を伴って作
製され得る。
【0189】
固相ペプチド合成について、多くの技術の概要が、J.M.StewartおよびJ.
D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,W.
H.Freeman Co.(San Francisco),1963およびJ.Me
ienhofer,Hormonal Proteins and Peptides,
第2巻 46頁、Academic Press(New York),1973におい
て見出され得る。伝統的な溶液合成については、G.SchroderおよびK.Lup
ke,The Peptides,第1巻、Acacemic Press(New Y
ork)を参照のこと。一般的にこれらの方法は、1つ以上のアミノ酸または適切に保護
されたアミノ酸を連続的に付加してペプチド鎖に成長させることを含む。通常、第1のア
ミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される
。次いで、その保護されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸は、不活性固体支持体
に付着されるか、あるいは、アミド結合を形成するために適切な条件下において、適切に
保護されたコンプリメンタリー(complimentary)(アミノもしくはカルボ
キシル)基を有する配列中に次のアミノ酸を付加することによって溶液中で利用される。
次いで、保護基をこの新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、そして次のアミノ酸(
適切に保護された)が付加などされる。
【0190】
全ての所望のアミノ酸が、適切な配列内に結合された後、全ての残りの保護基(および
任意の固体支持体)が連続的にか、または同時に除去されて、最終的なポリヌクレオチド
ができる。この一般的手順の単純な改変によって、1つよりも多くのアミノ酸を一度に付
加させて、鎖を成長させることが可能となる(例えば、保護されたトリペプチドを適切に
保護されたジペプチドに(キラル中心をラセミ化しない条件下で)結合させることによっ
て脱保護の後、ペンタペプチドを形成させることによる)。
【0191】
本発明の化合物を調製する特に好ましい方法は、固相ペプチド合成を含み、ここでアミ
ノ酸α−N−末端は、酸感受性基または塩基感受性基によって保護される。そのような保
護基は、ペプチド結合形成の条件に対して安定であるという特性を有するべき一方で、成
長するペプチド鎖の破壊またはその中に含まれる任意のキラル中心のラセミ化を伴わずに
容易に除去可能であるという特性も有すべきである。適切な保護基は、9−フルオレニル
メチルオキシカルボニル(Fmoc)、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、ベンジ
ルオキシカルボニル(Cbz)、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、t−アミル
オキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメト
キシベンジルオキシカルボニル、o−ニトロフェニルスルフェニル、2−シアノ−t−ブ
チルオキシカルボニルなどである。9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル(Fmo
c)保護基は、治療用ペプチドフラグメントの合成のために特に好ましい。他の好ましい
側鎖保護基は、リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に関しては、2,2,5,
7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(pmc)、ニトロ基、p−トルエンス
ルホニル基、4−メトキシベンゼン−スルホニル基、Cbz基、Boc基、およびアダマ
ンチルオキシカルボニル基;チロシンに関しては、ベンジル基、o−ブロモベンジルオキ
シカルボニル基、2,6−ジクロロベンジル基、イソプロピル基、t−ブチル(t−Bu
)基、シクロヘキシル基、シクロペニル基およびアセチル(Ac)基であり;セリンに関
しては、t−ブチル基、ベンジル基およびテトラヒドロピラニル基であり;ヒスチジンに
関しては、トリチル基、ベンジル基、Cbz基、p−トルエンスルホニル基および2,4
−ジニトロフェニル基であり;トリプトファンに関しては、ホルミル基であり;アスパラ
ギン酸およびグルタミン酸に関しては、ベンジル基およびt−ブチル基ならびにシステイ
ンに関しては、トリフェニルメチル(トリチル)基である。
【0192】
固相ペプチド合成方法において、α−C−末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹
脂に付着される。上記合成のために有用な適切な固体支持体は、段階的な縮合−脱保護反
応の試薬および反応条件に対して不活性であり、ならびに使用される媒体に不溶性である
材料である。α−C−末端カルボキシペプチドの合成のための好ましい固体支持体は、4
−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ(スチレン−1%ジビニルベンゼン)であ
る。α−C−末端アミドペプチドのための好ましい固相支持体は、4−(2’,4’−ジ
メトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)フェノキシアセトアミドエチル樹脂である
(Applied
Biosystems(Foster City,Calif.)から入手可能)。こ
のα−C−末端アミノ酸は、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(HOBT)、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス(ジメ
チルアミノ)ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート(BOP)またはビス(2−オ
キソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィンクロリド(BOPCl)を伴うか、または伴わ
ずに、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N,N’−ジイソプロピ
ルカルボジイミド(DIC)またはO−ベンゾトリアゾル−1−イル−N,N,N’,N
’,−テトラメチルウロニウム−ヘキサフロオロホスフェート(HBTU)によって樹脂
に結合され、結合は、ジクロロメタンまたはDMFのような溶媒中で10℃と50℃との
間の温度にて約1時間〜24時間の間媒介される。
【0193】
固体支持体が、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)フ
ェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、Fmoc基は、上記のα−C−末端アミ
ノ酸とのカップリングの前に、第二級アミン、好ましくはピペリジンで切断される。脱保
護された4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)フェノキシ
−アセトアミドエチル樹脂へのカップリングのための好ましい方法は、DMF中O−ベン
ゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’,−テトラメチルウロニウム−ヘキサフ
ロオロホスフェート(HBTU、1当量)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(H
OBT、1当量)である。保護されたアミノ酸の連続的なカップリングは、当該分野にお
いて周知の自動ポリペプチドシンセサイザーにおいて実行され得る。好ましい実施形態に
おいて、成長するペプチド鎖のα−N−末端アミノ酸は、Fmocで保護される。成長す
るペプチドのα−N−末端側からのFmoc保護基の除去は、第二級アミン、好ましくは
ピペリジンを用いて処理することによって達成される。次いで、各々の保護アミノ酸は、
およそ3倍の過剰なモル濃度で導入され、そして好ましくは、カップリングはDMF中で
実行される。カップリング剤は、通常、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N
’,N’,−テトラメチルウロニウム−ヘキサフロオロホスフェート(HBTU、1当量
)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT、1当量)である。
【0194】
固相合成の終点において、このポリペプチドは、連続的にか、または1回の操作でのい
ずれかで、樹脂から取り出されて、そして脱保護される。ポリペプチドの取り出しおよび
脱保護は、チオアニソール、水、エタンジチオールおよびトリフルオロ酢酸を含む切断試
薬(cleavage reagent)を用いて、樹脂結合ポリペプチドを処理するこ
とにより1回の操作で達成され得る。ポリペプチドのα−C−末端がアルキルアミドであ
る場合、樹脂は、アルキルアミンを用いるアミノ分解によって切断される。あるいは、ペ
プチドは、例えば、メタノールを用いるエステル交換反応、続いてアミノ分解または直接
的アミド基交換によって取り出され得る。保護ペプチドは、この時点で精製され得るか、
または次の工程に直接使用され得る。側鎖保護基の除去は、上記の切断カクテル(coc
ktail)を使用して達成される。完全に脱保護されたペプチドは、任意または全ての
以下の型:弱塩基樹脂上のイオン交換(アセテート形態);非誘導体化ポリスチレン−ジ
ビニルベンゼン上の疎水性吸着クロマトグラフィー(例えば、Amberlite XA
D);シリカゲル吸着クロマトグラフィー;カルボキシメチルセルロース上のイオン交換
クロマトグラフィー;分配クロマトグラフィー(例えば、Sephadex G−25、
LH−20)または向流分配;高速液体クロマトグラフィー(HPLC)(特に、オクチ
ル−もしくはオクタデシルシリル−シリカ結合相充填剤上の逆相HPLC)を利用する一
連のクロマトグラフィー工程により精製される。
【0195】
これらの治療用ペプチドの分子量は、Fast Atom Bombardment(
FAB)Mass Spectroscopyを使用して決定される。
【0196】
本発明の治療用ペプチドは、プロドラッグとしての使用のために、N末端保護基および
C末端保護基を用いて合成され得る。
【0197】
((1)N−末端保護基)
上記に議論されるように、用語「N−保護基」とは、アミノ酸もしくはペプチドのα−
N−末端を保護すること、さもなくばアミノ酸もしくはペプチドのアミノ基を、合成手順
の間の望ましくない反応物に対して保護することが意図されるそれらの基をいう。一般的
に、使用されるN−保護基は、Greene、「Protective Groups
In Organic Synthesis」(John Wiley&Sons、Ne
w York(1981))(これは、本明細書中に参考として援用される)に開示され
る。さらに、保護基を、例えば、酵素的加水分解によって容易にインビボで切断されるプ
ロドラッグとして使用して、生物学的に活性なペアレント(parent)を放出し得る
。α−N−保護基は、低級アルカノイル基(例えば、ホルミル基、アセチル基(「Ac」
)、プロピオニル基、ピバロイル基、t−ブチルアセチル基など;2−クロロアセチル基
、2−ブロモアセチル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、フタリル基
、o−ニトロフェノキシアセチル基、クロロブチリル基、ベンゾイル基、4−クロロベン
ゾイル基、4−ブロモベンゾイル基、4−ニトロベンゾイル基などを含む他のアシル基;
例えば、ベンゼンスルホニル基、p−トルエンスルホニル基などのようなスルホニル基;
例えば、ベンジルオキシカルボニル基、p−クロロベンジルオキシカルボニル基、p−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基、p−ニトロベンジルオキシカルボニル基、2−ニト
ロベンジルオキシカルボニル基、p−ブロモベンジルオキシカルボニル基、3,4−ジメ
トキシベンジルオキシカルボニル基、3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、
2,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、4−エトキシベンジルオキシカルボニ
ル基、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、3,4,5−トリ
メトキシベンジルオキシカルボニル基、1−(p−ビフェニルイル)−1−メチルエトキ
シカルボニル基、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、
ベンズヒドリルオキシカルボニル基、t−ブチルオキシカルボニル基、ジイソプロピルメ
トキシオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、
メトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、2,2,2−トリクロロエトキシカ
ルボニル基、フェノキシカルボニル基、4−ニトロフェノキシカルボニル基、フルオレニ
ル−9−メトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、アダマンチルオキ
シカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、フェニルチオカルボニル基などの
カルバメート形成基;例えば、ベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンジルオキシメチ
ル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)などのようなアリールア
ルキル基ならびに例えば、トリメチルシリルなどのようなシリル基を含む。
【0198】
((2)カルボキシ保護基)
上記で議論されるように、用語「カルボキシ保護基」とは、化合物の他の官能基部位に
関与する反応が実施されながらカルボン酸官能基をブロックもしくは保護するために使用
されるカルボン酸保護エステル基またはアミド基のことをいうが、る。カルボキシ保護基
は、Greene、「Protective Groups in Organic S
ynthesis」152〜186頁(1981)(これは、本明細書中に参考として援
用される)に開示される。さらに、カルボキシ保護基は、例えば、酵素的加水分解によっ
て容易にインビボで切断され、生物学的に活性なペアレントを放出し得る。そのようなカ
ルボキシ保護基は、当業者に周知であり、米国特許第3,840,556号および同第3
,719,667号にて記載されるように、ペニシリンおよびセファロスポリンの分野に
おけるカルボキシル基の保護において広範囲に使用されている。これらの開示は、本明細
書中に参考として援用される。代表的なカルボキシ保護基は、C1−C8低級アルキル基(
例えば、メチル基、エチル基またはt−ブチル基など);例えば、フェネチル基またはベ
ンジル基のようなアリールアルキル基ならびに例えば、アルコキシベンジル基またはニト
ロベンジル基などのようなそれらの置換誘導体;例えば、フェニルエテニル基などのアリ
ールアルケニル;アリールおよび例えば、5−インダニル基などのようなその置換誘導体
で;例えば、ジメチルアミノエチル基などのようなジアルキルアミノアルキル基;例えば
、アセトキシメチル基、ブチリルオキシメチル基、バレリルオキシメチル基、イソブチリ
ルオキシメチル基、イソバレリルオキシメチル基、1−(プロピオニルオキシ)−1−エ
チル基、1−(ピバロイルオキシ)−1−エチル基、1−メチル−1−(プロピオニルオ
キシ)−1−エチル基、ピバロイルオキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基などの
ようなアルカノイルオキシアルキル基;例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル
基、シクロブチルカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルカルボニルオキシメチル基
、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル基などのようなシクロアルカノイルオキシアル
キル基;例えば、ベンゾイルオキシメチル基、ベンゾイルオキシエチル基などのようなア
ロイルオキシアルキル基;例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル基、2−ベンジルカ
ルボニルオキシエチル基などのようなアリールアルキルカルボニルオキシアルキル基;例
えば、メトキシカルボニルメチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル基、1−メ
トキシカルボニル−1−エチル基などのようなアルコキシカルボニルアルキル基またはシ
クロアルキルオキシカルボニルアルキル基;例えば、メトキシカルボニルオキシメチル基
、t−ブチルオキシカルボニルオキシメチル基、1−エトキシカルボニルオキシ−1−エ
チル基、1−シクロへキシルオキシカルボニルオキシ−1−エチル基などのようなアルコ
キシカルボニルオキシアルキル基またはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル基;例
えば、2−(フェノキシカルボニルオキシ)エチル基、2−(5−インダニルオキシカル
ボニルオキシ)エチル基などのようなアリールオキシカルボニルオキシアルキル基;例え
ば、2−(1−メトキシ−2−メチルプロパン−2−オイルオキシ)エチル基などのよう
なアルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル基;例えば、2−(ベンジルオキシカル
ボニルオキシ)エチル基などのようなアリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル
基;例えば、2−(3−フェニルプロペン−2−イルオキシカルボニルオキシ)エチル基
などのようなアリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル基;例えば、t−ブチ
ルオキシカルボニルアミノメチル基などのようなアルコキシカルボニルアミノアルキル基
;例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル基などのようなアルキルアミノカルボニ
ルアミノアルキル基;例えば、アセチルアミノメチル基などのようなアルカノイルアミノ
アルキル基;例えば、4−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル基などのような複
素環式カルボニルオキシアルキル基;例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル基、ジエ
チルアミノカルボニルメチル基などのようなジアルキルアミノカルボニルアルキル基;例
えば、(5−t−ブチル−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−イル)メチル基など
のような(5−(低級アルキル)−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−イル)アル
キル基;ならびに、例えば、(5−フェニル−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−
イル)メチル基などのような(5−フェニル−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−
イル)アルキル基である。
【0199】
代表的なアミドカルボキシ保護基は、アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカ
ルボニル基である。
【0200】
本発明の好ましいカルボキシ保護化合物には複数の化合物があり、ここでその保護カル
ボキシ基は、低級アルキルエステル、シクロアルキルエステルもしくはアリールアルキル
エステル(例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピル
エステル、ブチルエステル、sec−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエス
テル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチ
ルエステルなど)またはアルカノイルオキシアルキルエステル、シクロアルカノイルオキ
シアルキルエステル、アロイルオキシアルキルエステルもしくはアリールアルキルカルボ
ニルオキシアルキルエステルである。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキル
アミノカルボニル基である。例えば、アスパラギン酸は、酸不安定基(例えば、t−ブチ
ル基)によりα−C−末端にて保護され得、そして水素化不安定基(例えば、ベンジル基
)によりβ−C−末端にて保護され得、次いで、合成中に選択的に脱保護され得る。
【0201】
あるいは、例えば、当該分野において周知の方法に従がうタンパク質分解酵素を使用し
て、天然に存在するアミノ酸配列を断片化することによりペプチドのフラグメントを得る
こともまた可能である。さらに、この治療用ペプチドの所望のフラグメントを、当該分野
において周知の方法を使用する組換えDNA技術の使用を介して得ることが可能である。
【0202】
(治療用ペプチドの改変)
本発明の改変された治療用ペプチドを生成する様式は、その分子を含む種々の要素の性
質に依存して、広範に変動する。合成手順は、単純であるように、高収率を提供するよう
に、そして高度に精製された安定な生成物を可能とするように、選択される。通常、反応
性基は、最終段階として、例えば、カルボキシル基を用いて作製され、活性エステルを形
成するためのエステル化が、合成の最終工程である。本発明の改変された治療用ペプチド
の生成のための特定の方法を、以下に記載する。
【0203】
一般的に、本発明の改変された治療用ペプチドは、ブラインド(blind)または構
造活性相関(SAR)駆動置換を使用して、作製され得る。SARは、分子の構造と、一
連の化合物に対するその薬理学的活性との間の関係を規定する分析である。個々の治療用
ペプチドに関連した種々の研究により、如何にしてペプチドの活性が、化学的構造または
化学的特性のバリエーションに従って変動するかが示される。より詳細には、最初に遊離
ペプチドの治療的活性をアッセイする。次いで、本発明に従い、そのペプチドのN末端、
C末端または内部のいずれかで連結基のみによって、そのペプチドを改変する。連結基と
しては、上記で考察したような反応性基が挙げられる。この改変されたペプチド連結基の
治療的活性を、次いでアッセイし、そして検出された活性に基づいて、改変部位に関して
決定を下す。次いで、ペプチド結合体を調製し、そしてその治療的活性を決定する。結合
体化後のペプチドの治療的活性が実質的に低減されていない場合(すなわち、治療的活性
が、1/10未満低減されている場合)、ペプチドの安定性を、そのインビボ寿命によっ
て示されるように測定する。安定性が所望されるレベルまで改善されない場合、ペプチド
を、代替的な部位で改変する。そして、所望されるレベルの治療的活性および所望される
安定性が達成されるまで、この手順を繰り返す。
【0204】
より詳細には、リンカーおよび反応性基での誘導体化を受けさせるために選択された各
治療用ペプチドを、以下の基準に従って改変する:末端のカルボン酸基が、治療用ペプチ
ドにおいて利用可能であり、そしてこの末端のカルボン酸基が薬理学的活性の保持に重要
ではなく、そして他の感受性官能基が治療用ペプチドに存在しない場合、このカルボン酸
を、リンカー反応性基改変のための結合部位として選択する。末端のカルボン酸基が薬理
学的活性に関与している場合、またはカルボン酸が利用可能ではない場合、薬理学的活性
の保持に重要ではない任意の他の感受性反応性基を、リンカー反応性基改変のための結合
部位として選択する。いくつかの感受性官能基が治療用ペプチドにおいて利用可能である
場合、リンカー/反応性基の付加および保護されたすべての感受性官能基の脱保護後に、
薬理学的活性の保持がなお得られるような様式で、保護基の組み合わせが使用される。感
受性官能基が治療用ペプチドにおいて利用可能ではない、またはより単純な改変経路が所
望される場合、合成的な試みが、生物学的活性の保持およびレセプター特異性または標的
特異性の保持が得られるような様式での本来のペプチドの改変を可能にする。この場合、
改変は、ペプチドの反対の末端において生じる。
【0205】
NHS誘導体は、治療用ペプチドにおいて、他の感受性官能基の不在下でカルボン酸か
ら合成され得る。特に、このような治療用ペプチドは、無水CH2Cl2およびEDC中で
N−ヒドロキシスクシンイミドと反応し、そしてこの生成物は、クロマトグラフィーによ
って精製されるか、またはNHS誘導体を与えるに適切な溶媒系から再結晶化される。
【0206】
あるいは、NHS誘導体は、アミノ基および/またはチオール基、ならびにカルボン酸
を含む治療用ペプチドから合成され得る。分子中に遊離のアミノ基またはチオール基が存
在する場合、NHS誘導体の付加を実施する前に、これらの感受性官能基を保護すること
が好ましい。例えば、分子が遊離アミノ基を含む場合、Fmocまたは好ましくはtBo
c保護アミンへのアミンの転換が、上記化学を実施する前に必要とされる。アミン官能基
(functionality)は、NHS誘導体の調製後に脱保護されない。従って、
この方法は、所望される薬理学的効果を誘導するために、アミン基が遊離状態であること
が必要とされない化合物のみに対して適用される。アミノ基が、分子の本来の生物学的特
性を保持するために遊離状態であることが必要とされる場合、実施例3〜6に記載された
別の型の化学が実施されなければならない。
【0207】
さらに、NHS誘導体は、アミノ基またはチオール基を含み、そしてカルボン酸を含ま
ない治療用ペプチドから合成され得る。選択された分子が、カルボン酸を含まない場合、
一連の二官能性リンカーを使用して、その分子を反応性NHS誘導体へと変換し得る。例
えば、DMF中に溶解され、そして遊離アミノ含有分子に付加されたエチレングリコール
ビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)およびトリエチルアミン(EGSの方
が有利なように、10:1の比率で)は、モノNHS誘導体を生成する。チオール誘導体
化分子からNHS誘導体を生成するためには、DMF中のN−[−マレイミドブチリルオ
キシ]スクシンイミドエステル(GMBS)およびトリエチルアミンが使用され得る。マ
レイミド基は、遊離チオールと反応し、そしてNHS誘導体は、シリカでのクロマトグラ
フィーによってか、またはHPLCによって反応混合物から精製される。
【0208】
NHS誘導体はまた、複数の感受性官能基を含む治療用ペプチドから合成され得る。各
々の場合に、異なる様式で分析および解明がなされなければならない。しかし、市販され
ている多量の保護基および二官能性リンカーのお陰により、本発明は、治療用ペプチドを
誘導体化するために、好ましくはわずか1つの化学的工程で(実施例1または3に記載さ
れるように)、または2工程(実施例2に記載され、感受性基の予めの保護を含む)もし
くは3工程(保護、活性化、および脱保護)で、任意の治療用ペプチドに適用可能である
。例外的な状況下でのみ、治療用ペプチドを活性NHSまたはマレイミド誘導体に転換す
るために、複数の(3工程を超える)合成工程を使用することが必要とされる。
【0209】
マレイミド誘導体はまた、遊離アミノ基および遊離カルボン酸を含む治療用ペプチドか
ら合成され得る。アミノ誘導体化分子からマレイミド誘導体を生成するためには、DMF
中のN−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GMBS)および
トリエチルアミンが使用され得る。スクシンイミドエステル基は遊離アミノと反応し、そ
してマレイミド誘導体は、結晶化によってか、またはシリカでのクロマトグラフィーによ
ってか、またはHPLCによって、反応混合物から精製される。
【0210】
最後に、マレイミド誘導体は、複数の他の感受性官能基を含み、そして遊離カルボン酸
を含まない治療用ペプチドから合成され得る。選択された分子が、カルボン酸を含まない
場合、一連の二官能性架橋試薬を使用して、分子を反応性NHS誘導体に変換し得る。例
えば、DMF中でのHBTU/HOBt/DIEA活性化を使用して、マレイミドプロピ
オン酸(MPA)を、遊離アミンにカップリングし、遊離アミンとMPAのカルボン酸基
との反応を通してマレイミド誘導体を生成し得る。あるいは、リシン残基をペプチドのC
末端に付加して、以下の実施例に記載されるように、リシンのアミノ基での結合体化を可
能にし得る。この付加されたリシンは、樹脂の最初の選択によって設計されたように、ア
ミド官能基によってキャッピングされた末端を維持しつつ、ペプチドのC末端での単純か
つ効率的な改変を可能にする。
【0211】
多くの他の市販されるヘテロ二官能性架橋試薬が、必要とされる場合に代替的に使用さ
れ得る。多数の二官能性化合物が、実体への架橋のために利用可能である。例示的な試薬
としては、以下が挙げられる:アジドベンゾイルヒドラジド、N−[4−(p−アジドサ
リチルアミノ)ブチル]−3’−[2’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド)、ビス−
スルホスクシンイミジルスベレート(suberate)、ジメチルアジピイミデート(
adipimidate)、ジスクシンイミジル酒石酸塩、N−y−マレイミドブチリル
オキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−4−アジドベ
ンゾエート、N−スクシンイミジル[4−アジドフェニル]−1,3’−ジチオプロピオ
ネート、N−スクシンイミジル[4−ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルア
ルデヒド、およびスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−
カルボキシレート。
【0212】
さらにより詳細には、ペプチドは、好ましくは、その置換基の性質、および遊離システ
インの存在または不在に従って、改変される。大半のペプチドは、3つの異なる分類に集
められ得る:(1)システインを含まないペプチド;(2)1つのシステインを含むペプ
チド、(3)ジスルフィド架橋(システイン)として、2つのシステインを含むペプチド
;および(4)複数のシステインを含むペプチド。
【0213】
(A.システインを含まないペプチド)
ペプチドがシステインを含まない場合、支持体樹脂から切断され、そして完全に保護さ
れたすべての残基で、C末端からの付加を実施する。EDCおよびNHSとのC末端の液
相活性化を、ワンポット(one pot)において、アミノ−アルキル−マレイミドと
反応させ得る。次いで、ペプチドを、完全に脱保護する。あるいは、リシン残基をペプチ
ドのC末端に付加して、アミド基でキャッピングされたカルボキシ末端を維持しつつ、リ
シンのεアミノ基での改変を可能にし得る。このようなリシン残基の付加は、好ましくは
、付加がペプチドの治療的活性に実質的に影響しない場合にのみ実施される。システイン
を含まないペプチドのC末端改変についての一般化反応スキームを、以下の模式図に例示
する。
【0214】
【化4】


N末端改変が有利であり、そして再度、システインを含まないペプチドについての場合
は、N末端における付加が、支持体樹脂上に存在するすべての残基で実施され、そして完
全に保護される。活性化NHS−Mal二官能性リンカーの付加は、樹脂上に存在するペ
プチドと脱保護されたN−末端において実施され得る。次いで、ペプチドは完全に脱保護
される。システインを含まず、そしてC末端改変を受ける治療用ペプチドの例を、実施例
7〜26に記載する。システインを含まず、そしてN末端改変を受ける治療用ペプチドの
例を、実施例27〜38に記載する。システインを含まないペプチドのN末端改変につい
ての一般化反応スキームを、それぞれ、ヘテロNHSマレイミド(GMBS様)および3
−MPAを用いて、以下の模式図において例示する。
【0215】
【化5】

【0216】
【化6】


あるいは、ペプチドは、内部アミノ酸(すなわち、C末端でもN末端でもない)で改変
され得る。遊離システインを含まないペプチドの内部アミノ酸での改変についての一般化
反応スキームを、ホモビスNHSおよびヘテロNHSマレイミドを用いて、以下の模式図
において例示する。
【0217】
【化7】

【0218】
【化8】


システインを含まず、そして上記のように改変され得るペプチドとしては、以下が挙げ
られる:Kringle5ペプチドのフラグメント、GLP−1ペプチドのフラグメント
、ダイノルフィンAのフラグメント、ヒト成長ホルモン放出因子、ヒトニューロペプチド
Yの1−24フラグメント、およびヒトセクレチン。これらの各ペプチドについての化学
の完全な説明を、実施例の節において報告する。
【0219】
(B.1つのシステインを含むペプチド)
1つのシステインを含むペプチドの場合、システインは、マレイミドの付加後に、キャ
ッピングされたままでなければならない。システインが、結合部位に含まれる場合、シス
テインが保護基によってキャッピングされて、どの程度の効力が損失したかに関する評価
がなされなければならない。システインが、キャッピングされたままであり得る場合、合
成経路は、C末端改変またはN末端改変のいずれかについて上記のA欄に記載された経路
と類似する。
【0220】
あるいは、ペプチドは、内部アミノ酸(すなわち、C末端でもN末端でもない)で改変
され得る。システインを含まないペプチドの内部アミノ酸での改変についての一般化反応
スキームを、ホモビスマレイミドおよびヘテロNHSマレイミド(GMBS様)を用いて
、以下の模式図において例示する。
【0221】
【化9】

【0222】
【化10】


1つのシステインを含む治療用ペプチドの例としては、以下が挙げられる:Gα(Gt
herapeuticペプチド結合タンパク質のαサブユニット)、ラット脳一酸化窒素
シンターゼブロッキングペプチドの724−739フラグメント、ヒト[Tyr0]イン
ヒビンのαサブユニット1−32フラグメント、HIVエンベロープタンパク質の254
−274フラグメント、およびP34cdc2キナーゼフラグメント。
【0223】
(C.ジスルフィド架橋(システイン)として、2つのシステインを含むペプチド)
ペプチドが、ジスルフィド架橋として2つのシステインを含む場合、ペプチドを、マレ
イミドの付加前に支持体樹脂から切断する。C末端からのペプチドの改変については、ペ
プチドが樹脂から切断される場合に脱保護されることが必要な、カルボキシ末端(これは
、支持体樹脂からの切断に起因して、保護されないままである)および2つのシステイン
を除いて、すべての保護基が存在する。温和な空気中酸化がジスルフィド架橋を生じ、そ
してペプチドは、その段階で精製され得る。次いで、ジスルフィド架橋の存在下でC末端
を活性化するために、そしてC末端にマレイミドを付加する(アミノ−アルキル−マレイ
ミドを通して)ために、液相化学が必要とされる。次いで、ペプチドは完全に脱保護され
る。
【0224】
N末端でのペプチドの改変については、ペプチドは、支持体樹脂に残存し得る。2つの
システインは、マレイミドの付加前に、選択的に脱保護される。潜在的に触媒によって補
助される(不均一な)空気中酸化は、樹脂上に存在するペプチドとのジスルフィドを生じ
得る。次いで、マレイミドがN末端に付加され、そしてペプチドが、樹脂から切断され、
そして完全に脱保護される。ジスルフィド架橋において2つのシステインを含むペプチド
の内部アミノ酸での改変についての一般化反応スキームを、以下の模式図において例示す
る。
【0225】
【化11】


あるいは、ペプチドは、内部アミノ酸(すなわち、C末端またはN末端のいずれでもな
い)において修飾され得る。ジスルフィド架橋いおいて2つのシステインを含むペプチド
の内部アミノ酸における修飾のための一般化された反応スキームは、以下の説明図で例示
される。
【0226】
【化12】


ジスルフィド架橋として2つのシステインを含む治療用ペプチドの例としては、ヒトオ
ステオカルシン1−49、ヒト糖尿病関連ペプチド、ヒト/イヌ心房性ナトリウム利尿ペ
プチドの5−28フラグメント、ウシバクテネシン(bactenecin)、およびヒ
ト[Tyr0]−コルチスタチン(cortistatin)29が挙げられる。
【0227】
(D.複数のシステインを含むペプチド)
ペプチドが、ジスルフィド架橋として複数のシステインを含む場合、ペプチドは、マレ
イミドの付加前に支持体樹脂から切断される。C末端からのペプチドの修飾に関して、全
ての保護基が、カルボキシ末端(カルボキシ末端は、支持体樹脂からの切断に起因して保
護されないままにある)およびジスルフィド架橋を構築するとされる2つのシステインを
除いて存在する。他のジスルフィド架橋に関与するシステインは、保護基の選択を用いて
、対において順に脱保護される。次の架橋に移動する前に1つずつ各架橋を構築し、そし
て精製することが推奨される。おだやかな空気中酸化が、ジスルフィド架橋を産生し、そ
してペプチドが、各段階で精製されるべきである。次いで、溶液相化学が、ジスルフィド
架橋の存在下でC末端を活性化し、そしてC末端に(アミノ−アルキル−マレイミドを介
して)マレイミドを付加するのに必要とされる。次いで、ペプチドは完全に脱保護される

【0228】
N末端からのペプチドの修飾に関しては、支持体樹脂上でペプチドを切断し得、そして
選択的に最初の2つのシステインを脱保護して穏やかな空気中酸化のもと、ジスルフィド
を構築し得る。引き続く脱保護は、マレイミドの付加の前に、他のジスルフィドを提供す
る。触媒(不均一)により潜在的に促進される空気中酸化は、なお樹脂上にあるペプチド
とジスルフィドを産生し得る。次いで、マレイミドは、N末端上で付加され、そしてペプ
チドは、樹脂から切断され、そして完全に脱保護される。
【0229】
あるいは、ペプチドは、内部アミノ酸(すなわち、C末端またはN末端のどちらでもな
い)において修飾され得る。
【0230】
複数のシステインを含むペプチドとしては、ヒトエンドセリンおよび[Lys4]サラ
ホトキシンS6cが挙げられる。
【0231】
(5.修飾された治療用ペプチドの投与)
修飾された治療用ペプチドは、生理学的に受容可能な媒体(例えば、脱イオン水、リン
酸緩衝化生理食塩水(PBS)、生理食塩水、水性エタノールまたは他のアルコール、血
漿、蛋白様溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物油など)中で投与さ
れる。含まれ得る他の添加物としては、緩衝液(この媒体は、約5〜10の範囲のpHで
一般的に緩衝化され、緩衝液は一般に約50〜250mMの濃度の範囲である)、塩(塩
の濃度は、一般に約5〜500mMの範囲である)、生理的に受容可能な安定剤などが挙
げられる。組成物は、都合の良い保存および輸送のために凍結乾燥され得る。
【0232】
修飾された治療(ltherapeutic)ペプチドは、大部分について、経口的に
、非経口的に(例えば、脈管内に(IV)、動脈内に(IA)、筋肉内に(IM)、皮下
に(SC)など)投与される。投与は、適切な場合には、輸注により得る。いくつかの場
合において(ここで、官能基の反応は比較的緩慢である)、投与は、経口的、経鼻的、直
腸的、経皮的またはエーロゾルであり得、ここで結合体の性質は、脈管系への移動を可能
にする。通常、一回の注入が使用されるが、所望の場合、1回より多い注入が用いられ得
る。修飾された治療用ペプチドは、任意の都合のよい手段(注射器、トロカール、カテー
テルなどを含む)により投与され得る。投与の特定の様式は、投与されるべき量、1回の
ボーラスであるかまたは継続的な投与であるかなどに依存して変化する。好ましくは、投
与は、脈管内であり(この導入の部位は、本発明に対して重要なものではない)、好まし
くは急速な血流が存在する部位(例えば、静脈内、末梢静脈または中心静脈)である。他
の経路は、投与が、遅延性放出技術または保護マトリックスと結びつけられる使用を見出
し得る。この意図は、治療(ltherapeutic)ペプチドが血液中で効率的に分
布されることであり、その結果、血液成分と反応し得る。結合体の濃度は、一般的に約1
pg/ml〜50mg/mlで、広範に変化する。脈管内に投与される総量は、一般に約
0.1mg/ml〜約10mg/ml、より通常では、約1mg/ml〜約5mg/ml
の範囲である。
【0233】
血液の永続成分(例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、赤血球および血小板)を
結合することにより、多数の利点が結果として生じる。修飾された治療用ペプチド成分の
活性は、数日〜数週間延長される。1回の投与のみ、この期間に与えられる必要がある。
活性化合物は、大きい分子に主に結合されることから(ここでは、他の生理学的プロセス
を妨げるように細胞内に取り込まれる可能性が低い)、より優れた特異性が達成され得る

【0234】
血液成分間の共有結合の形成は、インビボまたはエキソビボで生じ得る。エキソビボの
共有結合形成に関して、修飾された治療(ltherapeutic)ペプチドが、血液
、血清あるいはヒト血清アルブミンまたはIgGを含む生理食塩水溶液に添加され、修飾
された治療用ペプチドと血液成分との間の共有結合形成を可能にする。好ましい様式にお
いて、治療用ペプチドは、マレイミドを用いて修飾され、そして生理食塩水溶液中でヒト
血清アルブミンと反応される。一旦、修飾された治療用ペプチドが血液成分と反応して、
治療用ペプチドタンパク質結合体を形成すると、この結合体は、患者に投与され得る。
【0235】
あるいは、修飾された治療用ペプチドは、直接患者に投与され得、その結果、共有結合
が、インビボにおいて、修飾された治療用ペプチドと結合成分との間で形成する。
【0236】
さらに、治療用ペプチドの局在化した送達が所望される場合、いくつかの送達方法が使
用され得る。
【0237】
(A.切開手術領域の洗浄)
切開(open)手術への補助としての治療的化合物の投与を内含する、局所的な治療
的化合物についての多数の適用が存在する。これらの場合において、治療的化合物は、閉
合の前に手術部位(すなわち、その部位の部分)において洗浄されるか、または治療的化
合物が、限られた空間(例えば、動脈内膜切除手順後の動脈切片の内部または切除の間の
GI管の一部分)において短期間インキュベートされ、そして過剰の液体が引き続いて排
除される。
【0238】
(B.組織移植片のインキュベーション)
組織移植片(例えば、自己および生体異物性の静脈/動脈移植片ならびに弁の移植片な
らびに器官移植片)が、修飾されている治療的化合物を用いて予め処理され、治療用溶液
中でその移植片をインキュベートするかおよび/またはこのような溶液を用いてその移植
片を灌流するかのいずれかにより、共有結合を形成することを可能にし得る。
【0239】
(C.カテーテル送達)
カテーテルは、器官(例えば、膀胱、GI管、膣/子宮)内部への内視鏡手順の一部と
してか、または心臓血管系カテーテル手順(例えば、バルーン血管形成術)の補助として
のいずれかで、治療的化合物を送達するために使用される。標準的カテーテルならびによ
り新しい薬物送達およびイオン導入カテーテルが利用され得る。
【0240】
(D.直接的注射)
特定の血管化の乏しい空間(例えば、関節内関節空間)に関して、治療的化合物の直接
注射により、表面組織に生体結合体化し(bioconjugate)得、そして薬物効
果の所望される持続期間を達成し得る。他の適用は以下が挙げられ得る:骨髄内注射、腫
瘍内注射、腟内注射、子宮内注射、腸管内注射、エウスターキオ管内注射、鞘内注射、皮
下注射、関節内注射、腹腔内注射または眼内注射ならびに気管支鏡を介して、経鼻胃管を
介しておよび腎造瘻術を介する。
【0241】
(6.修飾された治療用ペプチド誘導体の存在のモニタリング)
本発明の別の局面は、生物学的サンプル(例えば、血液)における治療用ペプチドおよ
び/またはアナログ、あるいはそれらの誘導体および結合体の濃度を決定する方法、なら
びに修飾されたペプチドのペプチダーゼ安定性を決定する方法に関する。哺乳動物宿主の
血液は、1回以上、修飾された治療用ペプチド化合物の存在についてモニターされ得る。
宿主の血液の一部分またはサンプルを採取することにより、治療用ペプチドが治療的活性
であるのに十分な量で永続血液成分に結合されているか否かを決定し得、そしてその後、
血液中の治療用ペプチド成分のレベルを決定し得る。所望される場合、治療用ペプチド誘
導体分子がどの血液成分に結合されるかもまた決定され得る。これは、非特異的治療用ペ
プチドを使用する場合に特に重要である。特定のマレイミド治療用ペプチドに関して、血
清アルブミンおよびIgGの半減期を算出することは、はるかに簡単である。
【0242】
治療用ペプチド、アナログ、誘導体および結合体の濃度を決定する1つの方法は、治療
用ペプチドまたは治療用ペプチドアナログあるいはそれらの誘導体および結合体に特異的
な抗体を使用すること、ならびにこのような治療用ペプチド、アナログ、および/または
それらの誘導体または結合体と潜在的に関連する毒性に対する処置としての抗体を使用す
ることである。これは、患者において、インビボで、治療用ペプチドの安定性および寿命
の増加が、処置の間の新規の問題(毒性に関する可能性の増加を含む)を導き得るので有
利である。しかし、いくつかの場合、従来の抗体アッセイが、切断される治療用ペプチド
と切断されない治療用ペプチドとの間の相違を認識し得ないことが言及されるべきである
。このような場合、他のアッセイ技術が使用され得る(例えば、LC/MS)(液体クロ
マトグラフィー/質量分析法)。
【0243】
特定の治療用ペプチド、そのアナログまたは誘導体に特異性を有する抗体(モノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか)の使用は、任意のこのような問題を仲裁
する際に補助し得る。抗体は、特定の治療用ペプチド、そのアナログもしくは誘導体を用
いて、またはその因子の免疫原性フラグメント、あるいはこの因子の抗原決定基に対応す
る合成された免疫原を用いて免疫された宿主から生成され得るか、またはそれらに由来し
得る。好ましい抗体は、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドアナログのネイティブな形
態、誘導体化形態、および結合体化形態に対して、高い特異性および親和性を有する。こ
のような抗体はまた、酵素、蛍光色素、または放射性標識を用いて標識され得る。
【0244】
誘導体化された治療用ペプチドに特異的な抗体は、誘導体化された治療用ペプチド特異
的抗体の誘導のために精製された治療用ペプチドを使用するすることにより、産生され得
る。抗体の誘導により、動物中への注射による免疫応答の刺激のみならず、合成抗体また
は他の特異的結合分子の産生における類似の工程(例えば、組換え免疫グロブリンライブ
ラリーのスクリーニング)も意図される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体
の両方が、当該分野で周知の手順により産生され得る。いくつかの場合、モノクローナル
抗体の使用は、ポリクローナル抗体よりも好適であり得る(例えば、分解がエピトープ/
抗体認識の及ばない領域にわたって起こる場合)。
【0245】
抗体が、治療用ペプチド、そのアナログまたは誘導体の投与により誘導された毒性を処
置するために使用され得、そしてエキソビボまたはインビボで使用され得る。エキソビボ
の方法は、固体支持体に固定された抗体を使用する、毒性に対する免疫透析処置を含む。
インビボの方法は、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するのに有効な量の抗体の投
与を含む。
【0246】
抗体は、無菌条件下で抗体と血液を接触させることにより、エキソビボで患者の血液か
ら、治療用ペプチド、そのアナログまたは誘導体、およびその結合体を除去するために使
用され得る。例えば、抗体は、カラムマトリックス上に固着(fix)され得るかまたは
さもなくば固定化(immobilize)され得、そして患者の血液が、その患者から
取り出され得、そしてそのマトリックスに通過され得る。治療用ペプチドアナログ、誘導
体または結合体が、抗体に結合しそして低濃度の治療用ペプチド、アナログ、誘導体また
は結合体を含む血液が、次いで、患者の循環系に戻され得る。除去される治療用ペプチド
化合物の量は、圧力および流速を調整することにより、制御され得る。患者の血液の血漿
成分由来の治療用ペプチド、アナログ、誘導体および結合体の優先的な除去は、例えば、
半透膜の使用により、またはさもなくば、抗治療抗体を含むマトリックスを血漿成分が通
過する前に、当該分野で公知の方法により細胞成分から血漿成分をまず分離することによ
り、もたらされ得る。あるいは、治療用ペプチド結合体化血球(赤血球細胞を含む)の優
先的な除去は、患者の血液中の血球を回収し、そして濃縮し、ならびに患者の血液の血清
成分の排除に対してそれらの細胞を、固着された抗治療抗体と接触させることによりもた
らされ得る。
【0247】
抗体は、処置のために、治療用ペプチド、アナログ、誘導体または結合体を受容してい
る患者に、インビボで非経口的に投与され得る。抗体は、治療用ペプチド化合物および結
合体に結合する。一旦治療用ペプチドに結合されると、活性は、完全にはブロックされな
いとしても、妨げられ、それにより患者の血流中の治療用ペプチド化合物の生物学的有効
濃度を低減し、そして有害な副作用を最少にする。さらに、結合された抗体−治療用ペプ
チド複合体は、患者の血流からの治療用ペプチド化合物および結合体のクリアランスを容
易にする。
【0248】
十分に記載されている本発明を、ここで以下の限定されない実施例により例示する。
【実施例】
【0249】
(実施例)
(A.改変された治療用ペプチドの合成の一般方法)
100μmolの規模での、改変されたペプチドの固相ペプチド合成を、Fmoc保護
Rink Amide MBHA樹脂、Fmoc保護アミノ酸、O−ベンゾトリアゾール
−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
(HBTU)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液およびN−メチルモルホリ
ン(NMM)での活性化用いてSymphony Peptide Synthesiz
er上で実行し、そしてFmoc基のピペリジン脱保護を行った(工程1)。末端Fmo
c基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達成し(工程2)、続いて、3−マレイミ
ドプロピオン酸(3−MPA)のカップリング、酢酸のカップリングまたは1つまたは複
数のFmoc−AEEAのカップリングのいずれかを行い、続いて3−MPAのカップリ
ングを行う(工程3)。樹脂の切断および生成物の単離を、86% TFA/5% TI
S/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続い
て、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax
18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出
器(Varian Dynamax UVD
II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å、8μm
、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイナリーH
PLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。生成物は、ダイオードアレ
イ検出器を備えるHewlett Packard LCMS−1100シリーズ分光計
を用いるRP−HPLC質量分光計によりそしてエレクトロスプレーイオン化を用いて決
定される場合、>95%の純度を有するべきである。
【0250】
(B.ネイティブペプチド鎖の変更)
ペプチドの改変を容易にするために、1以上のアミノ酸残基を、実施例1〜5に記載さ
れるようにペプチドに付加し得、そして/または1以上のアミノ酸残基を、他のアミノ酸
残基で置換し得る。この変更は、反応性基の結合を援助する。
【0251】
(実施例1 クリングル−5のC末端でのLysの付加。NAc−Pro−Arg−L
ys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−NH2.3TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)OH、
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pb
f)−OH、Fmoc−Pro−OH。樹脂に結合したアミノ酸のN末端でのFmoc基
の逆ブロック化を、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。
酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリングに類似の条件下で実行した。樹脂からの最
終切断を、上記の通りに切断混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、そ
して調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥の際に所望の生成物を白色固体として得た。
【0252】
(実施例2 クリングル−5のC末端でのLysの付加。NAc−Arg−Lys−L
eu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−NH2.2TFA.3TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)OH、
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pb
f)−OH。樹脂に結合したアミノ酸のN末端でのFmoc基の逆ブロックを、DMF中
の20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。酢酸のカップリングを、アミ
ノ酸カップリングと類似の条件下で実行した。樹脂からの最終切断を、上記の通りに切断
混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、そして調製用HPLCにより精
製し、凍結乾燥の際に所望の生成物を白色固体として得た。
【0253】
(実施例3 クリングル−5のN末端でのLysの付加。NAc−Tyr−Thr−T
hr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−N
H2.3TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)OH、
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pb
f)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−
Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tB
u)OH。樹脂に結合したアミノ酸のN末端でのFmoc基の逆ブロックを、DMF中の
20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。酢酸のカップリングを、アミノ
酸カップリングと類似の条件下で実行した。樹脂からの最終切断を、上記の通りに切断混
合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、そして調製用HPLCにより精製
し、凍結乾燥の際に所望の生成物を白色固体として得た。
【0254】
(実施例4 クリングル−5のN末端におけるLysの付加。Cysの位置524にお
けるAlaでの置換。NAc−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Va
l−Gly−Gly−Pro−Trp−Ala524−Tyr−Thr−Thr−Asn−
Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−NH2.4TFA
の調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)OH、
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pb
f)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−
Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tB
u)OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−Pro−OH
、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Val−OH、Fmo
c−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Pr
o−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH。樹
脂に結合したアミノ酸のN末端でのFmoc基の逆ブロックを、DMF中の20%のピペ
リジンを用いて約15〜20分間実行した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリン
グと類似の条件下で実行した。樹脂からの最終切断を、上記の通りに切断混合物を用いて
実行した。生成物を、沈殿により単離し、そして調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥
の際に所望の生成物を白色固体として得た。
【0255】
(実施例5 クリングル−5のN末端におけるLysの付加。NAc−Arg−As
n−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pro−Trp−Ly
s−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Trp−O
H、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fm
oc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Val−OH、
Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(T
rt)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH。樹脂に結合したアミノ酸のN末端で
のFmoc基の逆ブロックを、DMF中の20%のピペリジンを用いて15〜20分間実
行した。酢酸のカップリングを、アミノ酸カップリングと類似の条件下で実行した。樹脂
からの最終切断を、上記の通りに切断混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単
離し、そして調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥の際に所望の生成物を白色固体とし
て得た。
【0256】
(実施例6 D−Ala2 GLP−1(7−36)アミドの調製)
100μmolの規模での、GLP−1アナログの固相ペプチド合成を、手動固相合成
ならびに、Fmoc保護Rink Amide MBHA樹脂、Fmoc保護アミノ酸、
O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘ
キサフルオロホスフェート(HBTU)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液
およびN−メチルモルホリン(NMM)での活性化を用いるSymphony Pept
ide Synthesizerを用いて実行し、そしてFmoc基のピペリジン脱保護
を行った(工程1)。樹脂の切断および生成物の単離を、85% TFA/5% TIS
/5%のチオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイス
冷却Et2Oにより沈殿させる(工程2)。生成物をVarian(Rainin)調製
用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.045% TFA(
A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phe
nomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムお
よびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および25
4nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精
製し、所望のペプチドをRP−HPLCによって決定された通りに>95%純度で得る。
これらの工程を、以下の概略ダイヤグラム中に図示する。
【0257】
【化13】


(C.システインを含まないペプチドからの改変されたペプチドの調製)
複数の保護官能基を含有しかつシステインを含有しない治療用ペプチドからのマレイミ
ドペプチドの調製を、以下に記載の通りのペプチドの合成により例示する。このペプチド
を、N末端、C末端またはN末端とC末端との間に位置するアミノ酸にて改変し得る。こ
の改変されたペプチドを、天然のペプチド配列のN末端を切断(linking off
)するか、または天然のペプチド配列の改変されたC末端を切断することにより合成する
。1以上のさらなるアミノ酸を、治療用ペプチドに付加し、反応性基の結合を容易にし得
る。
【0258】
(1.C末端での治療用ペプチドの改変)
(実施例7 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるRSVペプチドの改変
。Val−lle−Thr−lle−Glu−Leu−Ser−Asn−lle−Lys
−Glu−Asn−Lys−Met−Asn−Gly−Ala−Lys−Val−Lys
−Leu−lle−Lys−Gln−Glu−Leu−Asp−Lys−Tyr−Lys
−Asn−Ala−Val−Lys−(Nε−MPA)の調製。)
100μmol規模での、DACアナログの固相ペプチド合成を、手動の固相合成、S
ymphony Peptide SynthesizerおよびFmoc保護Rink
Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ酸を、連続的に樹脂に付加
する:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Al
a−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、F
moc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−As
p(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、F
moc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−ll
e−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−V
al−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc
−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Glu(t
Bu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc
−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−O
H、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Thr(
tBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Val−OH。それらを、N,N
−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリア
ゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホス
フェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化す
る。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムア
ミド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Lys(Aloc)基の選
択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1
:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh3)4の溶液で2時間樹脂を処理すること
によって達成する(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM
中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5m
L)で洗浄する。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自
動化する(工程3)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミ
ド(DMF)で3回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、
85% TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて
樹脂から切断し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4
)。生成物を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:3
0〜55%B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045%
TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフ
ェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dyn
amax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLC
により9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定する
ように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0259】
(実施例8 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるDyn A 1−13
の改変−Dyn A 1−13(Nε−MPA)−NH2 Tyr−Gly−Gly−P
he−Leu−Arg−Arg−lle−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−(
Nε−MPA)−NH2の合成)
100μmol規模での、Dyn A 1−13の固相ペプチド合成を、手動の固相合
成、Symphony Peptide SynthesizerおよびFmoc保護R
ink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ酸を、連続的に樹脂
に付加する:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc
−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−O
H、Fmoc−lle−H、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Arg(P
bf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH。それらを、N,N
−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリア
ゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホス
フェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化す
る。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムア
ミド(DMF)溶液を用いて20分間で達成する(工程1)。Lys(Aloc)基の選
択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1
:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することに
よって達成する(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中
の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL
)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動
化する(工程3)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド
(DMF)で3回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、8
5% TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹
脂から切断し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)
。生成物を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30
〜55%B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045%
TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェ
ニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dyna
max
UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9
.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、
>95%純度で所望のDACを得る。
【0260】
この生成物の構造は、以下:
【0261】
【化14】


である。
【0262】
(実施例9 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるDyn A 2−13
の改変−Dyn A 2−13(Nε−MPA)−NH2 Gly−Gly−Phe−L
eu−Arg−Arg−lle−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−(Nε−M
PA)−NH2の合成)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、連続的にRink Amide
MBHA樹脂に付加した:Fmoc−Lys(Mtt)−OH、Fmoc−Leu−OH
、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Arg(P
bf)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc
−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmo
c−Gly−OH、およびBoc−Gly−OH。手動合成を、残りの工程について使用
した:DMF中のHBTU/HOBt/DIEA活性化を用いるMtt基の選択的除去お
よびMPAのカップリング。標的ダイノルフィンアナログを、樹脂から除去した;生成物
を、沈殿により単離し、そして調製的HPLCにより精製して、凍結乾燥の際に35%収
率で白色固体として所望の生成物を得た。分析的HPLCは、生成物がRt=30.42
分で>95%純度であると示した。ESI−MS m/z:C731232515(MH+
、計算値1590.0、実測値 MH3+ 531.3。
【0263】
(実施例10 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるDyn A 1−
13の改変−Dyn A 1−13(AEA3−MPA)−NH2 Tyr−Gly−Gl
y−Phe−Leu−Arg−Arg−lle−Arg−Pro−Lys−Leu−Ly
s−(AEA3−MPA)−NH2の合成)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、連続的にRink Amide
MBHA樹脂に付加した:Fmoc−Lys(Mtt)−OH、Fmoc−Leu−OH
、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Arg(P
bf)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc
−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmo
c−Gly−OH、Fmoc−Gly−OHおよびBoc−Tyr(Boc)−OH。手
動合成を、残りの工程について使用した:Mtt基の選択的除去、各カップリング間にお
ける3つのFmoc−AEA−OH基(AEA=アミノエトキシ酢酸)のFmoc除去を
用いるカップリング、およびDMF中のHBTU/HOBt/DIEA活性を用いるMP
A酸。標的ダイノルフィンアナログを、樹脂から除去した;生成物を、沈殿により単離し
、そして調製的HPLCにより精製して、凍結乾燥の際に29%収率で白色固体として所
望の生成物を得た。分析的HPLCは、生成物がRt=33.06分で>95%純度であ
ると示した。ESI−MS m/z:C941542923(MH+)、計算値2057.2
、実測値 MH4+ 515.4、MH3+ 686.9、MH2+ 1029.7。
【0264】
【化15】


(実施例11 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるDyn A 2−
13の改変−Dyn A 2−13(AEA3−MPA)−NH2 GIy−Gly−Ph
e−Leu−Arg−Arg−lle−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−(A
EA3−MPA)−NH2の合成)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、連続的にRink Amide
MBHA樹脂に付加した:Fmoc−Lys(Mtt)−OH、Fmoc−Leu−OH
、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Arg(P
bf)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc
−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmo
c−Gly−OHおよびFmoc−Gly−OH。手動合成を、残りの工程について使用
した:Mtt基の選択的除去、各カップリング間における3つのFmoc−AEA−OH
基とFmoc除去を用いるカップリング、およびDMF中のHBTU/HOBt/DIE
A活性を用いるMPA。標的ダイノルフィンアナログを、樹脂から除去した;生成物を、
沈殿により単離し、そして調製的HPLCにより精製して、凍結乾燥の際に29%収率で
白色固体として所望の生成物を得た。分析的HPLCは、生成物がRt=31.88分で
>95%純度であると示した。ESI−MS m/z:C851452521(MH+)、計
算値1894.3、実測値 MH4+ 474.6、MH3+ 632.4、MH2+ 948
.10。
【0265】
【化16】


(実施例12 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるニューロペプチド
Yの改変−Tyr−Pro−Ser−Lys−Pro−Asp−Asn−Pro−Gl
y−Glu−Asp−Ala−Pro−Ala−Glu−Asp−Met−Ala−Ar
g−Tyr−Tyr−Ser−Ala−Leu−Lys−(N−εMPA)−NH2の調
製)
100μmol規模での、改変されたニューロペプチド Yアナログの固相ペプチド合
成を、手動の固相合成、Symphony Peptide Synthesizerお
よびFmoc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ
酸を、連続的に樹脂に付加する:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Le
u−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−T
yr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Arg(Pbf
)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Asp(tB
u)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc
−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmo
c−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Pro−
OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmo
c−Pro−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH。それらを、N,N−ジメチルホ
ルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−
イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(H
BTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc
保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF
)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を
、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中
に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成す
る(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% H
OAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した
。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程
3)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で
3回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA
/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し
、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、
Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(
2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B)
)の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシ
ル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UV
D II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5m
L/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>95
%純度で所望のDACを得る。
【0266】
(実施例13 C末端アルギニンにおけるGLP−1(7−36)の改変−GLP−1
(7−36)−EDA−MPAの調製)
100μmol規模での、改変されたGLP−1アナログの固相ペプチド合成を、手動
でかつSymphony Peptide Synthesizer SASRIN(超
酸感応性樹脂)上で実行する。以下の保護アミノ酸を、連続的に樹脂に付加する:Fmo
c−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(Boc)−
OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp(Boc)
−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−
Ala−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc
−Gly−OH、Fmco−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fm
oc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser
(tBu)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fm
oc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe
−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gl
u(OtBu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Boc−His(Trt)−OH。そ
れらを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O
−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキ
サフルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を
用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジ
メチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。完全に保護
されたペプチドを、1% TFA/DCMを用いる処置によって樹脂から切断する(工程
2)。次いで、エチレンジアミンおよび3−マレイミドプロピオン酸を、遊離のC末端に
連続的に付加する(工程3)。次いで、保護基を、切断し、そして生成物を、86% T
FA/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソールおよび2%のフェノールを用
いて単離し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。
生成物を、Dynamax
18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出
器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を備
えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVar
ian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて、調製用逆相HPL
Cにより精製し、RP−HPLCによって決定するように、>95%純度で所望のDAC
を得る。これらの工程を、以下の概略ダイアグラム中に例示する。
【0267】
【化17】


(実施例14 C末端セリンにおけるエキセンディン−4の改変。エキセンディン−4
(1−39)−EDA−MPAの調製)
100μmol規模での、改変されたエキセンディン−4アナログの固相ペプチド合成
を、手動でかつSymphony Peptide Synthesizer SASR
IN(超酸感応性樹脂)上で実行する。以下の保護アミノ酸を、連続的に樹脂に付加する
:Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−O
H、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fm
oc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro
−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt
)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−T
rp(Boc)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−lle−OH
、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)
−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、
Fmoc−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Bo
c)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−
Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(t
Bu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc
−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Bo
c−His(Trt)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に
溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’
−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロ
ピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(
V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活
性化する(工程1)。完全に保護されたペプチドを、1% TFA/DCMを用いる処理
によって樹脂から切断する(工程2)。次いで、エチレンジアミンおよび3−マレイミド
プロピオン酸を、遊離のC末端に連続的に付加する(工程3)。次いで、保護基を、切断
し、そして生成物を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソ
ールおよび2%のフェノールを用いて単離し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2
Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガ
ードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dyna
max UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18
60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製
用バイナリーHPLCシステムを用いて、調製用逆相HPLCにより精製し、RP−HP
LCによって決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0268】
【化18】


(実施例15 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるセクレチンペプチド
の改変。His−Ser−Asp−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Glu−
Leu−Ser−Arg−Leu−Arg−Glu−Gly−Ala−Arg−Leu−
Glu−Arg−Leu−Leu−Gln−Gly−Leu−Val−Lys−(Nε−
MPA)−NH2の調製)
100μmol規模での、改変されたセクレチンペプチドアナログの固相ペプチド合成
を、手動の固相合成、Symphony Peptide Synthesizerおよ
びFmoc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ酸
を、連続的に樹脂に付加する:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Val
−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gln(Trt
)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pb
f)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc
−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−O
H、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc
−Leu−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−O
H、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(
tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmo
c−Ser(tBu)−OH、Fmoc−His(Boc)−OH。それらを、N,N−
ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾ
ール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフ
ェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する
。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミ
ド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択
的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:
0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによ
って達成する(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の
20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)
で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化
する(工程3)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(
DMF)で3回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85
% TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂
から切断し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。
生成物を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜
55%B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% T
FA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニ
ル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynam
ax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCによ
り9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するよう
に、>95%純度で所望のDACを得る。
【0269】
(実施例16 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるクリングル−5の
改変。NAc−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−(
Nε−MPA)−NH2.2TFAの調製)
100μmol規模での、改変されたクリングル−5ペプチドの固相ペプチド合成を、
手動の固相合成、Symphony Peptide SynthesizerおよびF
moc保護Rink Amide MBHAを用いて実行した。以下の保護アミノ酸を、
連続的に樹脂に付加する:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH
、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(P
bf)−OH、Fmoc−Pro−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,
N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を
、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて
20分間活性化する(工程1)。合成の終りに、無水酢酸を、N末端をアセチル化するた
めに添加した。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLの
CHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh3
4の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程2)。次いで、この樹脂
を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(
6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレ
イミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程3)。すべてのカップリングの間
に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で3回洗浄し、そしてイソプロパノ
ールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA/5% TIS/5% チオアニ
ソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し、続いて、ドライアイスで冷却さ
れたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Rainin)調
製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.045% TFA
(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Ph
enomenex Luna
10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Vari
an Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用
逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによ
って決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0270】
(実施例17 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるクリングル−5の改
変。NAc−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Ty
r−Asp−Tyr−Lys−(Nε−MPA)−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Tyr(tBu)OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tB
u)OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−A
rg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−T
yr(tBu)OH(工程1)。樹脂結合アミノ酸のN末端におけるFmoc基の逆ブロ
ックを、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。樹脂からの
最終切断を、上記の通りに切断混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、
そしてHPLCにより精製し、凍結乾燥の際に白色固体として所望の生成物を得た。Ly
s(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM
:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間
樹脂を処理することによって達成する(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6
×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およ
びDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸
の添加のために再自動化する(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TF
A/5% TIS/5%
チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却
されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Rainin)
調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.045% TF
A(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を用いて、P
henomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラ
ムおよびUV検出器(Varian
Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相
HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製した。
【0271】
(実施例18 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるクリングルの改変。
NAc−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−
Pro−Trp−Ala−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−
Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−(Nε−MPA)−NH2.3TFAの調製

自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Tyr(tBu)OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tB
u)OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−A
rg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−T
yr(tBu)OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−P
ro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Val−O
H、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp
(OtBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、F
moc−Arg(Pbf)−OH(工程1)。樹脂結合アミノ酸のN末端のFmoc基の
逆ブロックを、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。酢酸
のカップリングを、アミノ酸のカップリングと類似の条件下で実行した。樹脂からの最終
切断を、上記の通りに切断混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、そし
て調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥の際に白色固体として所望の生成物を得た。
【0272】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85%
TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し
、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、
Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(
2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B)
)の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシ
ル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UV
D II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5m
L/分にて180分にわたって精製した。
【0273】
(実施例19 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるクリングル−5の改
変。NAc−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gl
y−Pro−Trp−Lys− (Nε−MPA)−NH2.TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Trp−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gl
y−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−
Asn(Trt)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH(工程1)。Lys(Al
oc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOA
c(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処
理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL
)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF
(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加の
ために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(
Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.
045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出
)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm
×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(
λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて1
80分にわたって精製した。
【0274】
(実施例20 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるクリングル−5の改
変。NAc−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−(Nε−MP
A)−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH(工程1)。樹脂結合アミノ酸のN末端におけるFmoc基の逆
ブロックを、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。酢酸の
カップリングを、アミノ酸のカップリングと類似の条件下で実行した。樹脂からの最終切
断を、上記の通りに切断混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、そして
調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥の際に白色固体として所望の生成物を得た。Ly
s(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM
:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間
樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6
×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およ
びDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸
の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TF
A/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続い
て、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Var
ian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2
中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の
勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、
21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD
II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/
分にて180分にわたって精製した。
【0275】
(実施例21 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるクリングル−5の改
変。NAc−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Lys−(Nε−MP
A)−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Leu−O
H、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc
−Pro−OH(工程1)。樹脂結合アミノ酸のN末端のFmoc基における逆ブロック
を、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15〜20分間実行した。酢酸のカップリ
ングを、アミノ酸のカップリングと類似の条件下で実行した。樹脂からの最終切断を、上
記の通りに切断混合物を用いて実行した。生成物を、沈殿により単離し、そしてHPLC
により精製し、凍結乾燥の際に白色固体として所望の生成物を得た。
【0276】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85%
TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し
、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、
Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(
2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B)
)の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシ
ル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UV
D II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5m
L/分にて180分にわたって精製した。
【0277】
(実施例22 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ酸基におけるクリングル−5
の改変。NAc−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−
(Nε−AEEA−MPA)−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc
−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH(工程1)。樹脂結合アミノ酸のN
末端におけるFmoc基の逆ブロックを、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15
〜20分間実行した。酢酸のカップリングを、アミノ酸のカップリングと類似の条件下で
実行した。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCH
Cl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34
の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、
CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×
5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、添加のために
再自動化した(工程3)。次いで、この合成を、AEEA(アミノエトキシエトキシ酢酸
)基および3−マレイミドプロピオン酸(MPA)の添加のために再自動化した(工程3
)。樹脂切断および生成物の単離を、85%
TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し
、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させた(工程4)。生成物を、
Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(
2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B)
)の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシ
ル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UV
D II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5m
L/分にて180分にわたって精製した。
【0278】
(実施例23 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるクリングル−5の改
変。NAc−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−(N
ε−AEEAn−MPA)−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc
−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH(工程1)。樹脂結合アミノ酸のN
末端におけるFmoc基の逆ブロックを、DMF中の20%のピペリジンを用いて約15
〜20分間実行した。酢酸のカップリングを、アミノ酸のカップリングと類似の条件下で
実行した。
【0279】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。この合成を、添加のために再自動化した。次
いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸(MPA)およびAEEA(アミノエト
キシエトキシ酢酸)基の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の
単離を、85% TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノール
を用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4
)。生成物を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:3
0〜55%B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045%
TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフ
ェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dyn
amax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLC
により9.5mL/分にて180分にわたって精製した。
【0280】
(実施例24 付加されたC末端リジン残基のεアミノ基におけるGLP−1の改変。
GLP−1(1−36)−Lys37(Nε−MPA)−NH2.5TFA;His−As
p−Glu−Phe−Glu−Arg−His−Ala−Glu−Gly−Thr−Ph
e−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gl
y−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−lle−Ala−Trp−Le
u−Val−Lys−Gly−Arg−Lys(Nε−MPA)−NH2.5TFAの調
製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ty
r(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(Ot
Bu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Boc−His(N−Trt)−OH、Fmo
c−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Phe
−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Asp(OBu)−OH、B
oc−His(N−Trt)−OH(工程1)。
【0281】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸(MPA)の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離
を、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(
Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.
045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出
)を用いて、Phenomenex Luna
10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Vari
an Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用
逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製した。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。これらの工程は、以下の概略ダイアグラムに図示
される。
【0282】
【化19】


(実施例25 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるGLP−1の改変
。GLP−1(1−36)−Lys37(Nε−AEEA−AEEA−MPA)−NH2
5TFA;His−Asp−Glu−Phe−Glu−Arg−His−Ala−Glu
−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr
−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−lle
−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gly−Arg−Lys(Nε−AEEA
−AEEA−MPA)−NH2.5TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ty
r(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(Ot
Bu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Boc−His(N−Trt)−OH、Fmo
c−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Phe
−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、
Boc−His(N−Trt)−OH(工程1)。
【0283】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、2つのAEEA(アミ
ノエトキシエトキシ酢酸)基および3−マレイミドプリピオン酸(MPA)の添加のため
に再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TFA/5% T
IS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライア
イスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Ra
inin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.04
5% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を
用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×2
5cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ2
14および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180
分にわたって精製した。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有し、ESI−
MS m/z:C1742654456(MH+)、計算値3868、実測値[M+H22+
934、[M+H33+1290、[M+H44+967であった。これらの工程を、以下
の概略ダイアグラムに図示する。
【0284】
【化20】


(実施例26 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるGLP−1の改変
。GLP−1(7−36)−Lys37(Nε−MPA)−NH2.4TFA;His−A
la−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−S
er−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−P
he−lle−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gly−Arg−Lys(N
ε−MPA)−NH2.4TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ty
r(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(Ot
Bu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Boc−His(N−Trt)−OH(工程1
)。
【0285】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸(MPA)の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離
を、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させた(工程4)。生成物を、Varian(
Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.
045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出
)を用いて、Phenomenex Luna
10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Vari
an Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用
逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製した。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。
【0286】
(実施例27 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ酸基におけるGLP−1の改
変。GLP−1(7−36)−Lys37(Nε−AEEA−AEEA−MPA)−NH2
.4TFA His−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−As
p−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−Al
a−Lys−Glu−Phe−lle−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−Gl
y−Arg−Lys(Nε−AEEA−AEEA−MPA)−NH2.4TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ty
r(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(Ot
Bu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Boc−His(N−Trt)−OH(工程1
)。
【0287】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、2つのAEEA(アミ
ノエトキシエトキシ酢酸)基および3−マレイミドプリピオン酸(MPA)の添加のため
に再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TFA/5% T
IS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライア
イスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Ra
inin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.04
5% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を
用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×2
5cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ2
14および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180
分にわたって精製した。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0288】
(実施例28 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるD−Ala2GL
P−1の改変。D−Ala2GLP−1(7−36)−Lys37(Nε−MPA)−NH2
.4TFA His−d−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−
Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−Gly−Gln−Ala−
Ala−Lys−Glu−Phe−lle−Ala−Trp−Leu−Val−Lys−
Gly−Arg−Lys(Nε−MPA)−NHh2.4TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ty
r(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(Ot
Bu)−OH、Fmoc−d−Ala−OH、Boc−His(N−Trt)−OH(工
程1)。
【0289】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸(MPA)の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離
を、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(
Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.
045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出
)を用いて、Phenomenex Luna
10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Vari
an Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用
逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製した。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。これらの工程を、以下の概略ダイアグラムに図示
する。
【0290】
【化21】


(実施例29 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるD−Ala2GL
P−1の改変。D−Ala2GLP−1(7−36)−Lys37(Nε−AEEA−AE
EA−MPA)−NH2.4TFA His−D−Ala−Glu−Gly−Thr−P
he−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Ser−Tyr−Leu−Glu−G
ly−Gln−Ala−Ala−Lys−Glu−Phe−lle−Ala−Trp−L
eu−Val−Lys−Gly−Arg−Lys(Nε−AEEA−AEEA−MPA)
−NH2.4TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−O
H、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(tBoc)−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ty
r(Pbf)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(Ot
Bu)−OH、Fmoc−d−Ala−OH、Boc−His(N−Trt)−OH(工
程1)。
【0291】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、2つのAEEA(アミ
ノエトキシエトキシ酢酸)基および3−マレイミドプリピオン酸(MPA)の添加のため
に再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TFA/5% T
IS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライア
イスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Ra
inin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.04
5% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を
用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×2
5cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ2
14および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180
分にわたって精製した。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。これら
の工程を、以下の概略ダイアグラムに図示する。
【0292】
【化22】


(実施例30 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるエキセジン−4(
1−39)の改変。エキセンジン−4(1−39)−Lys40(Nε−MPA)−NH2
;His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu
−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−Val−Arg
−Leu−Phe−lle−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−Gly−Gly
−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Lys
(Nε−MPA)−NH2.5TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc
−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser
−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gl
y−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−L
ys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−
Glu(OtBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmo
c−Leu−OH、Fmoc−Arg(Bpf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtB
u)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc
−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(t
Bu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmo
c−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−
OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu
(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Boc−His(Trt)−OH(工程
1)。
【0293】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸(MPA)の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離
を、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(
Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.
045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出
)を用いて、Phenomenex Luna
10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Vari
an Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用
逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製した。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。これらの工程を、以下の概略ダイアグラムに図示
する。
【0294】
【化23】


(実施例31 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるエキセンジン−4
(1−39)の改変。エキセジン4(1−39)−Lys40(Nε−AEEA−AEEA
−MPA)−NH2.5TFA;His−Gly−Glu−Gly−Thr−Phe−T
hr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−G
lu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−lle−Glu−Trp−Leu−L
ys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−P
ro−Pro−Ser−Lys(Nε−AEEA−AEEA−MPA)−NH2.5TF

自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc
−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly
−OH、Fmoc−Ser−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pr
o−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Tr
t)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−
Trp−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmo
c−Phe−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Bpf)−OH、Fm
oc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、
Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc
−Met−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−O
H、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(
OtBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−
OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly
−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Boc−Hi
s(Trt)−OH(工程1)。
【0295】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、2つのAEEA(アミ
ノエトキシエトキシ酢酸)基および3−マレイミドプリピオン酸(MPA)の添加のため
に再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TFA/5% T
IS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライア
イスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Ra
inin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.04
5% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を
用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×2
5cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ2
14および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180
分にわたって精製した。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。これら
の工程を、以下の概略ダイアグラムに図示する。
【0296】
【化24】


(実施例32 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるエキセンジン−3
(1−39)の改変。エキセンジン−3(1−39)−Lys40(Nε−MPA)−NH
2.5TFA;His−Ser−Asp−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−A
sp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu−Glu−Ala−V
al−Arg−Leu−Phe−lle−Glu−Trp−Leu−Lys−Asn−G
ly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−S
er−Lys(Nε−MPA)−NH2.5TFAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc
−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser
−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gl
y−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−L
ys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−
Glu(OtBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmo
c−Leu−OH、Fmoc−Arg(Bpf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtB
u)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc
−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(t
Bu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmo
c−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−
OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp
(OtBu)−OH、Fmoc−Ser(OtBu)−OH、Boc−His(Trt)
−OH(工程1)。
【0297】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピ
オン酸(MPA)の添加のために再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離
を、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(
Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.
045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出
)を用いて、Phenomenex Luna
10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Vari
an Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用
逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製した。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。これらの工程を、以下の概略ダイアグラムに図示
する。
【0298】
【化25】


(実施例33 付加されたC末端リジン残基のε−アミノ基におけるエキセンジン−3
(1−39)の改変。エキセンジン−3(1−39)−Lys40(Nε−AEEA−AE
EA−MPA)−NH2.5TFA;His−Ser−Asp−Gly−Thr−Phe
−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Met−Glu−Glu
−Glu−Ala−Val−Arg−Leu−Phe−lle−Glu−Trp−Leu
−Lys−Asn−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro
−Pro−Pro−Ser−Lys(Nε−AEEA−AEEA−MPA)NH2.5T
FAの調製)
自動ペプチド合成を使用して、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide
MBHA樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−
Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc
−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ser
−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gl
y−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−L
ys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−
Glu(OtBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmo
c−Leu−OH、Fmoc−Arg(Bpf)−OH、Fmoc−Val−OH、Fm
oc−Ala−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtB
u)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc
−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ser(t
Bu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmo
c−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−
OH、Fmoc−Thr(tBu)OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp(
OtBu)−OH、Fmoc−Ser(OtBu)−OH、Boc−His(Trt)−
OH(工程1)。
【0299】
Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3
NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で
2時間樹脂を処理することによって達成した(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl
3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)
、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、2つのAEEA(アミ
ノエトキシエトキシ酢酸)基および3−マレイミドプリピオン酸(MPA)の添加のため
に再自動化した(工程3)。樹脂切断および生成物の単離を、85% TFA/5% T
IS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライア
イスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Ra
inin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.04
5% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を
用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×2
5cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ2
14および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180
分にわたって精製した。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0300】
(実施例34 C末端におけるHIV−1 DP 178の改変。改変されたHIV−
1 DP 178抗融合誘導ペプチド Tyr−Thr−Ser−Leu−lle−Hi
s−Ser−Leu−lle−Glu−Glu−Ser−Gln−Asn−Glu−Gl
u−Glu−Lys−Asn−Glu−Glu−Glu−Leu−Leu−Glu−Le
u−Asp−Lys−Trp−Ala−Ser−Leu−Trp−Asn−Trp−Ph
e−Lys−(Nε−MPA)−NH2の調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Mtt)−OH、Fmoc−Phe−OH
、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−
Trp(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH
、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Lys(B
oc)−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc
−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmo
c−Glu(Tbu)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Glu(
tBu)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−O
H、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc
−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Gln(T
rt)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH
、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Leu−O
H、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、Fmoc
−lle−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmo
c−Thr(tBu)−OHおよびBoc−Tyr(tBu)−OH。手動合成を、残り
の工程について使用する:Mtt基の選択的除去およびDMF中のHBTU/HOBt/
DIEA活性を用いるマレイミドプロピオン酸(MPA)のカップリング。標的分子を、
樹脂から除去する;生成物を沈殿により単離し、そして調製用HPLCにより精製して、
所望の生成物を凍結乾燥の際に白色固体として得る。
【0301】
(実施例35 C末端におけるHIV−1 DP 107の改変。改変されたHIV−
1 DP 107抗融合誘導ペプチド Asn−Asn−Leu−Leu−Arg−Al
a−lle−Glu−Ala−Glu−Glu−His−Leu−Leu−Glu−Le
u−Thr−Val−Trp−Glu−lle−Lys−Glu−Leu−Glu−Al
a−Arg−lle−Leu−Ala−Val−Glu−Arg−Tyr−Leu−Ly
s−Asp−Glu−Lys−(Nε−MPA)−NH2の調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加した:Fmoc−Lys(Mtt)−OH、Fmoc−Gln(Tr
t)−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Arg(Pb
f)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−
Ala−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmo
c−Leu−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−
OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Trp
(Boc)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fm
oc−Leu−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Leu−OH、F
moc−Leu−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、Fmoc−Gln(Trt
)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−G
lu(tBu)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc
−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH。手動合成を、残りの工
程について使用する:Mtt基の選択的除去およびDMF中のHBTU/HOBt/DI
EA活性を用いるマレイミドプロピオン酸(MPA)のカップリング。標的アナログを、
樹脂から除去する;生成物を沈殿により単離し、そして調製用HPLCにより精製して、
所望の生成物を凍結乾燥の際に白色固体として得る。
【0302】
(2.N末端における治療用ペプチドの改変)
(実施例36 付加されたN末端リジン残基のε−アミノ基におけるRSVペプチドの
改変。(Nε−MPA)−Lys−Val−lle−Thr−lle−Glu−Leu−
Ser−Asn−lle−Lys−Glu−Asn−Lys−Met−Asn−Gly−
Ala−Lys−Val−Lys−Leu−lle−Lys−Gln−Glu−Leu−
Asp−Lys−Tyr−Lys−Asn−Ala−Valの調製)
100μmolの規模での、改変されたRSVペプチドの固相ペプチド合成を、手動固
相合成、Symphony Peptide SynthesizerおよびFmoc保
護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ酸を、樹脂に連
続的に付加する:Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Asn
(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−
OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmo
c−Leu−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−
OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Leu
−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ly
s(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−A
sn(Trt)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、
Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−L
ys(Boc)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、
Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Glu(tB
u)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−
lle−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。それら
を、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解させ、そして配列に従って、O−
ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフ
ルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用い
て活性化する。Fmoc保護基の除去を、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の
20%(V/V)ピペリジンの溶液を用いて20分間で達成する(工程1)。Lys(A
loc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HO
Ac(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh3)4の溶液で2時間樹脂
を処理することによって達成する(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5
mL)、DCM中の20%
HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄
する。次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(
工程3)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF
)で3回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% T
FA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切
断し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物
を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%
B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(
B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘ
キシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax
UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.
5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>
95%純度で所望のDACを得る。
【0303】
(実施例37 付加されたN末端リジン残基のε−アミノ基におけるニューロペプチド
Yの改変。(N−εMPA)−Lys−Tyr−Pro−Ser−Lys−Pro−G
lu−Asn−Pro−Gly−Glu−Asp−Ala−Pro−Ala−Glu−A
sp−Met−Ala−Arg−Tyr−Tyr−Ser−Ala−Leuの調製)
100μmolの規模での、改変されたニューロペプチド Yの固相ペプチド合成を、
手動固相合成、Symphony Peptide SynthesizerおよびFm
oc保護Rink Amide MBHAを用いて実行した。以下の保護アミノ酸を、樹
脂に連続的に付加する:Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Ser(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tB
u)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Met−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH
、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmo
c−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Glu
(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fm
oc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Tyr(tBu)
−OH、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミ
ド(DMF)中に溶解させ、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−
N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)
およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の
除去を、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%(V/V)ピペリジンの溶
液を用いて20分間で達成する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手
動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶
解した3当量のPd(PPh3)4の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する
(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HO
Ac(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄する。
次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程3
)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で3
回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA/
5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し、
続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、V
arian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H
2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045%
TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフ
ェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dyn
amax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLC
により9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定する
ように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0304】
(実施例38 付加されたN末端リジン残基のε−アミノ基におけるニューロペプチド
Yの改変。(N−εMPA)−Lys−Tyr−Pro−Ser−Lys−Pro−A
sp−Asn−Pro−Gly−Glu−Asp−Ala−Pro−Ala−Glu−A
sp−Met−Ala−Arg−Tyr−Tyr−Ser−Ala−Leuの調製)
100μmolの規模での、改変されたニューロペプチド Yの固相ペプチド合成を、
手動固相合成、Symphony Peptide SynthesizerおよびFm
oc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ酸を、樹
脂に連続的に付加する:Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Ser(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tB
u)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−
Met−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH
、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmo
c−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Gly−
OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asp
(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fm
oc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Tyr(tBu)
−OH、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミ
ド(DMF)中に溶解させ、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−
N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)
およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の
除去を、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%(V/V)ピペリジンの溶
液を用いて20分間で達成する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手
動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶
解した3当量のPd(PPh3)4の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する
(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HO
Ac(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄する。
次いで、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程3
)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で3
回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA/
5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し、
続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、V
arian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H
2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045%
TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフ
ェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dyn
amax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLC
により9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定する
ように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0305】
(実施例39 付加されたN末端リジン残基のεアミノ基におけるDyn A1−13
の改変−(Nε−MPA)−Dyn A 1−13−NH2 (Nε−MPA)−Lys
−Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−lle−Arg−Pro
−Lys−Leuの合成)
100μmolの規模での、改変されたDyn A 1−13アナログの固相ペプチド
合成を、手動固相合成、Symphony Peptide Synthesizerお
よびFmoc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ
酸を、樹脂に連続的に付加する:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu
−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ar
g(Pbf)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、F
moc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH
、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)中に溶解させ、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N
,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を
、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%(V/V)ピペリジンの溶液を用
いて20分間で達成する。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そし
て5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のP
d(PPh3)4の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程2)。次い
で、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL
)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄する。次いで、この合成
を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程3)。すべてのカッ
プリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で3回洗浄し、そして
イソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA/5% TIS/5
% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し、続いて、ドライア
イスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Ra
inin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.04
5% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を
用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×2
5cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ2
14および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180
分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>95%純度で所望のD
ACを得る。
【0306】
(実施例40 N末端グリシンにおけるDyn A 2−17−NH2の改変−MPA
−AEA3−Dyn A 2−17−NH2 (MPA−AEA−AEA−AEA)−Gl
y−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−lle−Arg−Pro−Lys−Le
u−Lys−Trp−Asp−Asn−Gluの合成)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸およびマレイミドを、Rink Am
ide MBHA樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fm
oc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tr
p(Boc)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Leu−OH、F
moc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Arg(Pbf
)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−A
rg(Pbf)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−
Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−AEA−OH、Fmoc−AEA−
OH、Fmoc−AEA−OHおよびMPA。次いで、標的ダイノルフィンアナログを、
樹脂から除去した;生成物を、沈殿によって単離し、そして調製用HPLCにより精製し
、所望の生成物を凍結乾燥の際に32%の収率で淡黄色固体として得た。分析的HPLC
は、生成物が、Rt=33.44分で>95%純度であることを示した。ESI−MS
m/z:C1091723529(MH+)、計算値2436.8、実測値MH3+813.6

【0307】
【化26】


(実施例42 付加されたN末端リジン残基のε−アミノ基におけるクリングル−5の
改変。(Nε−MPA)−Lys−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−
Tyr−NH2.2TFAの調製)
100μmolの規模での、改変されたクリングル−5アナログの固相ペプチド合成を
、手動固相合成、Symphony Peptide SynthesizerおよびF
moc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ酸を、
樹脂に連続的に付加する:Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Asp(tB
u)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−
Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH
、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)中に溶解させ、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N
,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を
、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の20%(V/V)ピペリジンの溶液を用
いて20分間で達成する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実
行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した
3当量のPd(PPh3)4の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程
2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(
6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄する。次いで
、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程3)。す
べてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で3回洗浄
し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA/5%
TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し、続いて
、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Vari
an(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中
の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾
配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、2
1mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD I
I)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分
にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>95%純度
で所望のDACを得る。
【0308】
(実施例43 N末端プロリンにおけるクリングル−5の改変。(MPA−AEEA)
−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−NH2.2TF
Aの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20
%のピペリジンを用いて達成し(工程2)、続いて、3−MPAのカップリングをする。
生じたFmoc−AEEA−ペプチドのDMF中の20%のピペリジンを用いる脱保護は
、その後の3−MPAの付加を可能にする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、8
6% TFA/5% TIS/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノ
ールを用いて実行し、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。
生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25
cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax
UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å
、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイ
ナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。
【0309】
(実施例44 N末端プロリンにおけるクリングル−5の改変。(MPA)−Pro−
Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−Lys−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20
%のピペリジンを用いて達成し(工程2)、続いて、3−MPAのカップリングをする(
工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2
/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイス
冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、
8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian
Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynama
x C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rain
in)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。
生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−
1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC
質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0310】
(実施例45 N末端チロシンにおけるクリングル−5の改変。(MPA−AEEA)
−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp
−Tyr−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmo
c−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(
tBu)OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達成
し(工程2)、続いて、Fmoc−AEEAのカップリングをする。生じたFmoc−A
EEA−ペプチドのDMF中の20%のピペリジンを用いる脱保護は、その後の3−MP
Aの付加を可能にする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5%
TIS/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し
、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dyna
max C18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびU
V検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254nm
)を備えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いる
Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相H
PLCにより精製する。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0311】
(実施例46 N末端チロシンにおけるクリングル−5の改変。(MPA)−Tyr−
Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−
NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmo
c−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(
tBu)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達
成し(工程2)、続いて、Fmoc−AEEAのカップリングをする(工程3)。樹脂切
断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2% チオアニ
ソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイス冷却Et2Oによ
り沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモ
ジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax
UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å
、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイ
ナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。
【0312】
(実施例47 N末端アルギニンにおけるクリングル−5の改変。(MPA−AEEA
)−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Gly−Pro−Trp−Al
a−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−As
p−Tyr−NH2.3TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmo
c−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(
tBu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−Pro
−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Val−OH、
Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp(O
tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmo
c−Arg(Pbf)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジ
ンを用いて達成し(工程2)、続いて、3−MPAのカップリングをする。生じたFmo
c−AEEA−ペプチドのDMF中の20%のピペリジンを用いる脱保護は、その後の3
−MPAの付加を可能にする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA
/5% TIS/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて
実行し、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、D
ynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムお
よびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および25
4nm)を備えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを
用いるVarian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用
逆相HPLCにより精製する。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett
Packard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイ
オン化を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0313】
(実施例48 N末端アルギニンにおけるクリングル−5の改変。(MPA)−Arg
−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pro−Trp
−Ala−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr
−Asp−Tyr−NH2.3TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmo
c−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(
tBu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Trp−OH、Fmoc−Pro
−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Val−OH、
Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp(O
tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmo
c−Arg(Pbf)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジ
ンを用いて達成し(工程2)、続いて、Fmoc−AEEAのカップリングをする(工程
3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2
% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイス冷却
Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μ
mのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian D
ynamax UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax
18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin
)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。生成
物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard
LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるR
P−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0314】
(実施例49 N末端アルギニンにおけるクリングル−5の改変。(MPA−AEEA
)−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pr
o−Trp−NH2.TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Trp−O
H、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fm
oc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、
Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(T
rt)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護
を、20%のピペリジンを用いて達成し(工程2)、続いて、Fmoc−AEEAのカッ
プリングをする。生じたFmoc−AEEA−ペプチドのDMF中の20%のピペリジン
を用いる脱保護は、その後の3−MPAの付加を可能にする(工程3)。樹脂切断および
生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2% チオアニソールお
よび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿さ
せる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール
、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD
II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å、8μm
、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイナリーH
PLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。生成物は、ジオードアレイ
検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ分光計を
用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定す
る場合>95%純度を有した。
【0315】
(実施例50 N末端アルギニンにおけるクリングル−5の改変。(MPA)−Arg
−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pro−Trp
−NH2.TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Trp−O
H、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Gly−OH、Fm
oc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Gly−OH、
Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(T
rt)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護
を、20%のピペリジンを用いて達成し(工程2)、続いて、3−MPAのカップリング
をする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5%
2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax
18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出
器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を備
えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVar
ian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLC
により精製する。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Packa
rd LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用い
るRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0316】
(実施例51 N末端アルギニンにおけるクリングル−5の改変。(MPA−AEEA
)−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達
成し(工程2)、続いて、Fmoc−AEEAのカップリングをする。生じたFmoc−
AEEA−ペプチドのDMF中の20%のピペリジンを用いる脱保護は、その後の3−M
PAの付加を可能にする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5
% TIS/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行
し、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dyn
amax C18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよび
UV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254n
m)を備えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用い
るVarian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相
HPLCにより精製する。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett P
ackard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン
化を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0317】
(実施例52 N末端アルギニンにおけるクリングル−5の改変。(MPA)−Arg
−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Tyr(t
Bu)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(
Pbf)−OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達
成し(工程2)、続いて、3−MPAのカップリングをする(工程3)。樹脂切断および
生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2% チオアニソールお
よび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿さ
せる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール
、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax
UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å
、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイ
ナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製する。生成物は、ジオー
ドアレイ検出器を備えたHewlett Packard LCMS−1100シリーズ
分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるRP−HPLC質量分光計によっ
て決定する場合>95%純度を有した。
【0318】
(実施例53 N末端プロリンにおけるクリングル−5の改変。(MPA−AEEA)
−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させた:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asp(O
tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmo
c−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−
OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達成し(工程
2)、続いて、Fmoc−AEEAのカップリングをする。生じたFmoc−AEEA−
ペプチドのDMF中の20%のピペリジンを用いる脱保護は、その後の3−MPAの付加
を可能にする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS
/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて
、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax
18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器
(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を備え
たDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVari
an(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCに
より精製する。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Packar
d LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いる
RP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0319】
(実施例54 N末端プロリンにおけるクリングル−5の改変。(MPA)−Pro−
Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−NH2.2TFAの調製)
自動ペプチド合成を用いて、以下の保護アミノ酸を、Rink Amide MBHA
樹脂に連続的に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asp(O
tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmo
c−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−
OH(工程1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達成し(工程
2)、続いて、3−MPAのカップリングをする(工程3)。樹脂切断および生成物単離
を、86% TFA/5%
TIS/5% H2O/2% チオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し
、続いて、ドライアイス冷却Et2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dyna
max C18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびU
V検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254nm
)を備えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いる
Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相H
PLCにより精製する。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Pa
ckard LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化
を用いるRP−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。
【0320】
(3.内部アミノ酸における改変)
(実施例55 Lys26(ε−MPA)GLP−1(7−36)−NH2の合成)
100μmolの規模での、改変されたGLP−1アナログの固相ペプチド合成を、手
動でかつFmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSymphony
Peptide Synthesizer上で実行した。以下の保護アミノ酸を、連続的
に樹脂に付加させた:Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gly−OH、F
moc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Leu−OH、
Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−lle−OH
、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(
Aloc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gl
n(Trt)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tB
u)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−
Asp(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tB
u)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−
Gly−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Ala−OH、Boc
−His(Trt)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶
解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−
テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピ
ルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(V
/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活性
化する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5m
LのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(P
Ph34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程2)。次いで、この
樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、DC
M(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、3−
マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程3)。樹脂切断および生成物
単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソールおよび2
%フェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿さ
せる(工程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール
、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD
II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å、8μm
、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイナリーH
PLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製し、RP−HPLCによって決定
するように、>95%純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の概略ダイアグ
ラムに図示する。
【0321】
【化27】


(D.1つの遊離システインを含有するペプチドからの改変されたペプチドの調製)
1つの遊離システインを含有する治療用ペプチドからのマレイミドペプチドの調製を、
以下に記載の通りのペプチドの合成によって例示する。このペプチドを、N末端、C末端
またはN末端とC末端との間に位置するアミノ酸にて改変し得る。
【0322】
複数の保護官能基および1つの遊離システイン残基を有する複数のシステイン残基すべ
て(すなわち、1つのシステイン残基を除くすべてのシステイン残基は、ジスルフィドと
して拘束される)を含有するペプチドからのマレイミドペプチドの調製。実施例5のよう
な天然配列における内部アミノ酸からの連結。遊離システイン残基は、キャップされるか
または別のアミノ酸(例えば、アラニン、メチオニンなど)で置換されなければならない

【0323】
ペプチドが、1つのシステインを含む場合、このシステインは、マレイミドの付加の後
キャップされたままでいなければならない。システインが、結合部位に含まれる場合、潜
在性が度の程度失われ、システインが、どの程度保護基にキャップされているかという評
価をしなければならない。システインが、キャップされ得るままである場合、合成経路は
、上記の実施例(i)と同様である。1つのシステインを含む治療用ペプチドの例として
は、Gα(G治療用ペプチド結合タンパク質のαサブユニット)、ラット脳一酸化炭素シ
ンセターゼブロックペプチドの724−739フラグメント、ヒト[Tyr0]インヒビ
ンのαサブユニット1−32、HIVエンベロープタンパク質の254−274フラグメ
ントおよびP34cdc2キナーゼフラグメントが挙げられる。
【0324】
(1.N末端における改変)
(実施例56 付加されたN末端リジンにおけるインヒビンペプチドの改変。(Nε−
MPA)−Lys−Tyr−Ser−Thr−Pro−Leu−Met−Ser−Trp
−Pro−Trp−Ser−Pro−Ser−Ala−Leu−Arg−Leu−Leu
−Gln−Arg−Pro−Pro−Glu−Glu−Pro−Ala−Ala−Ala
−His−Ala−Asn−Cys−His−Argの調製)
100μmolの規模での、改変されたインヒビンペプチドアナログの固相ペプチド合
成を、手動の固相合成、Symphony Peptide Synthesizerお
よびFmoc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ
酸を、連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Hi
s(Boc)−OH、Fmoc−Cys(Trt)−OH、Fmoc−Asn(Trt)
−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−His(Boc)−OH、Fmoc−Al
a−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Glu(tB
u)−OH、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−
Pro−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH
、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser(tBu)−
OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Trp
(Boc)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fm
oc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Leu−OH、F
moc−Pro−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu
)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。
それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、
O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘ
キサフルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)
を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−
ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Lys(
Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:H
OAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂
を処理することによって達成する(工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5
mL)、DCM中の20%
HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄
した。次いで、この合成を、3−マレイミドプロピオン酸の添加のために再自動化する(
工程3)。すべてのカップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF
)で3回洗浄し、そしてイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% T
FA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切
断し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物
を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%
B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(
B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘ
キシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax
UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.
5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>
95%純度で所望のDACを得る。
【0325】
(実施例57 N末端におけるRSV抗融合誘導ペプチドの改変。3−(MPA)−V
al−lle−Thr−lle−Glu−Leu−Ser−Asn−lle−Lys−G
lu−Asn−Lys−Cys−Asn−Glu−Ala−Lys−Val−Lys−L
eu−lle−Lys−Glu−Glu−Leu−Asp−Lys−Tyr−Lys−A
sn−Ala−Valの調製)
最初に、システイン(Cys)を、ネイティブ配列内のメチオニン(Met)と置換し
た。100μmolの規模での、改変された抗RSVアナログの固相ペプチド合成を、S
ymphony Peptide Synthesizer上で、Fmoc保護Rink
Amide MBHA樹脂、Fmoc保護アミノ酸、N,N−ジメチルホルムアミド(
DMF)中のO−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびN−メチルモルホリン(NM
M)を用いる活性化を用いて実行し、そしてFmoc基のピペリジン脱保護をする(工程
1)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達成し(工程2)、続い
て、3−MPAのカップリングをする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、85%
TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて実行し
、、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を
、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B
(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B
))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキ
シル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax U
VD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5
mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>9
5%純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の概略ダイアグラムに図示する。
【0326】
【化28】


(2.C末端における改変)
(実施例58 付加されたC末端リジンにおけるインヒビンペプチドの改変。(Nε−
MPA)−Lys−Cys−Asn−Leu−Lys−Glu−Asp−Gly−lle
−Ser−Ala−Ala−Lys−Asp−Val−Lysの調製)
100μmolの規模での、改変されたインヒビンペプチドアナログの固相ペプチド合
成を、手動の固相合成、Symphony Peptide Synthesizerお
よびFmoc保護Rink Amide MBHAを用いて実行する。以下の保護アミノ
酸を、連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Va
l−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、F
moc−Ala−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、
Fmoc−lle−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp(tBu)−OH
、Fmoc−Glu(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−
Leu−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Cys(Trt)−OH
、Fmoc−Lys(Aloc)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,
N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を
、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて
20分間活性化する(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し
、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当
量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程2)。
次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5
mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この
合成を、3−マレイミドプロピオン酸の付加のために自動化する(工程3)。すべてのカ
ップリングの間に、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)で3回洗浄し、そし
てイソプロパノールで3回洗浄する。このペプチドを、85% TFA/5% TIS/
5% チオアニソールおよび5%のフェノールを用いて樹脂から切断し、続いて、ドライ
アイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(R
ainin)調製用バイナリーHPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.0
45% TFA(A)およびCH3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)
を用いて、Phenomenex Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×
25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ
214および254nm)を用いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて18
0分にわたって精製し、RP−HPLCによって決定するように、>95%純度で所望の
DACを得る。
【0327】
(実施例59 C末端におけるRSV融合誘導ペプチドの改変。Val−lle−Th
r−lle−Glu−Leu−Ser−Asn−lle−Lys−Glu−Asn−Ly
s−Cys−Asn−Gly−Ala−Lys−Val−Lys−Leu−lle−Ly
s−Gln−Glu−Leu−Asp−Lys−Tyr−Asn−Ala−Val−(A
EEA.MPA))
複数の保護官能基および1個のシステインを含有するペプチドからのマレイミドペプチ
ドの調製を、改変されたRSV融合誘導ペプチドの合成によって例示する。改変されたR
SV融合誘導ペプチドを、以下の概略ダイアグラムによって例示されるように、ナチュラ
ルペプチド配列にリジン残基を付加させることによるC末端の切断によって合成した。シ
ステイン残基が、ペプチド配列内に含まれ、そしてペプチドの生物学的活性が本質的にな
い場合、この残基は、別のアミノ酸(例えば、アラニン、メチオニンなど)と置換されな
ければならない。以下の合成において、システイン(Cys)を、ネイティブRSV配列
内のメチオニン(Met)と置換した。
【0328】
100μmolの規模での、マレイミドRSV融合誘導ペプチドの固相ペプチド合成を
、手動の固相合成およびFmoc保護Rink Amide MBHAを用いるSymp
hony Peptide Synthesizer、Fmoc保護アミノ酸、N,N−
ジメチルホルムアミド(DMF)中のO−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’
,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)を用いて実
行し、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化し、Fmoc基のピペリ
ジン脱保護をする(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、
そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量
のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程2)。次
いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5m
L)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合
成を、3−マレイミドプロピオン酸の付加のために自動化する(工程3)。樹脂切断およ
び生成物単離を、85% TFA/5% TIS/5% チオアニソールおよび5%のフ
ェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる
(工程4)。生成物を、Varian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステ
ム(:30〜55%B(H2O中の0.045% TFA(A)およびCH3CN中の0.
045% TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomenex Luna 1
0μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian
Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用いて、調製用逆相
HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−HPLCによって
決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の概略ダイ
アグラムに図示する。
【0329】
【化29】


(3.内部アミノ酸における改変)
(実施例60 Cys−Asn−Leu−Lys−Glu−Asp−Gly−lle−
Ser−Ala−Ala−Lys−Asp−ValにおけるGαペプチドの改変)
複数の保護官能基および1つのシステインを含有するペプチドからのマレイミドペプチ
ドの調製を、改変されたGαペプチドの合成によって例示する。改変されたGαペプチド
を、以下に記載のように内部アミノ酸における結合によって合成する。
【0330】
システイン残基が、ペプチド配列内に含まれ、かつ本質的にペプチドの生物学的活性が
ない場合において、この残基は、キャップされるかまたは別のアミノ酸(例えば、アラニ
ン、メチオニンなど)で置換される。100μmolの規模での、改変されたGαペプチ
ドの固相ペプチド合成を、手動の固相合成およびFmoc保護Rink Amide M
BHAを用いるSymphony Peptide Synthesizer、Fmoc
保護アミノ酸、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中O−ベンゾトリアゾール−1
−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(
HBTU)を用いて実行し、N−メチルモルホリン(NMM)を用いて活性化し、Fmo
c基のピペリジン脱保護をする(工程1)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手
動で実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶
解した3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(
工程2)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOA
c(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次
いで、この合成を、3−マレイミドプロピオン酸の付加のために再自動化する(工程3)
。樹脂切断および生成物単離を、85% TFA/5% TIS/5% チオアニソール
および5%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oに
より沈殿させる(工程4)。生成物を、Varian(Rainin)調製用バイナリー
HPLCシステム(:30〜55%B(H2O中の0.045% TFA(A)およびC
3CN中の0.045% TFA(B))の勾配溶出)を用いて、Phenomene
x Luna 10μのフェニル−ヘキシル、21mm×25cmカラムおよびUV検出
器(Varian Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を用
いて、調製用逆相HPLCにより9.5mL/分にて180分にわたって精製し、RP−
HPLCによって決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0331】
(E.ジスルフィド架橋で2つのシステインを含有するペプチドからの改変されたペプ
チドの調製)
ペプチドが、ジスルフィド結合として2つのシステインを含有する場合、ペプチドを、
マレイミドの付加の前に支持体樹脂から切断する。本発明者らは、他のt−Boc保護リ
ジンの存在下でリジンを選択的に脱保護するために、Mtt基で保護されたLysを付加
させることを必要とする。すべての保護基は、カルボキシ末端(これは、支持体樹脂から
の切断に起因して保護されないままでいる)および2つのシステインを除いて存在し、こ
れらは、ペプチドが樹脂から切断される場合に、脱保護される必要がある。穏やかな空気
酸化は、ジスルフィド架橋を与え、そしてこのペプチドは、この段階で精製され得る。次
いで、液相化学は、ジスルフィド架橋の存在下でC末端を活性化する必要があり、そして
マレイミド(アミノ−アルキル−マレイミドを介する)をC末端に付加させる必要がある
。次いで、このペプチドを、脱保護する。ジスルフィド架橋として2つのシステインを含
有する治療用ペプチドの例としては、ヒトオステオカルシン1−49、ヒト糖尿病関連ペ
プチド、ヒト/イヌ心房性ナトリウム利尿ペプチド、ウシバクテネシン(bactene
cin)、およびヒト[Tyr0]−コルチスタチン29が挙げれる。
【0332】
ジスルフィド架橋で2つのシステインを含有する治療用ペプチドからのマレイミドペプ
チドの調製は、以下に記載のようなペプチドの合成によって例示される。このペプチドを
、N末端、C末端、またはN末端とC末端との間に位置するアミノ酸において改変し得る

【0333】
(1.N末端における改変)
(実施例61 N末端におけるTH−1ペプチドの改変。(Nε−MPA)NH2−L
ys−Arg−Gly−Asp−Ala−Cys−Glu−Gly−Asp−Ser−G
ly−Gly−Pro−Phe−Cysの調製)
複数の保護官能基を含有しかつ全く遊離システイン残基を含有しない(すなわち、すべ
てのシステイン残基は、ジスルフィド架橋として拘束される)ペプチドからのチオール環
化マレイミドペプチドの調製を、改変されたTH−1ペプチドの合成によって例示する。
【0334】
100μmolの規模での、改変されたTH−1ペプチドの固相ペプチド合成を、手動
で実行し、そしてFmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSymph
ony Peptide Synthesizer、Fmoc保護アミノ酸、N,N−ジ
メチルホルムアミド(DMF)中O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N
’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)を用いて実行し
、N−メチルモルホリン(NMM)を用いて活性化し、Fmoc基のピペリジン脱保護を
する(工程1)。Acm基の除去および樹脂DAC上で環化を形成する2つのCys残基
の生じる酸化を、TI(CF3CO)2を用いて達成した(工程2)。末端Fmoc基の脱
保護を、20%のピペリジンを用いて達成し、続いて、3−MPAのカップリングをする
(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2
O/2%のチオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイ
スで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程4)。生成物を、Dynamax C18
、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(V
arian Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を備えたD
ynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian
(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて、調製用逆相HPLCによ
り精製した。生成物は、ジオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard
LCMS−1100シリーズ分光計を用いかつエレクトロスプレーイオン化を用いるR
P−HPLC質量分光計によって決定する場合>95%純度を有した。ESI−MS m
/z:C669520262(MH+)、1646.8、実測値:1646.7。これらの
工程を、以下の概略的ダイアグラムに図示する。
【0335】
【化30】


(実施例62 N−MPA−Ser1−ソマトスタチン−28の合成)
100μmolの規模での、DAC:ソマトスタチン−28アナログの固相ペプチド合
成を、手動でかつ、Fmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSymp
hony Peptide Synthesizerを用いて実行する。以下の保護アミ
ノ酸を、連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Cys(Acm)−OH、Fmoc−S
er(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、
Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−T
rp(Boc)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−
Asn(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Cys(Ac
m)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Lys(B
oc)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−O
H、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−
OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Pro−OH、F
moc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−As
n(Trt)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH。そ
れらを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O
−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキ
サフルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を
用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジ
メチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Acm基の
除去およびジスルフィド架橋を形成する2つのCys残基の生じる酸化を、ヨウ素を用い
て達成する(工程2)。末端Fmoc基の脱保護を、20%のピペリジンを用いて達成し
、続いて3−MPAのカップリングをする(工程3)。樹脂切断および生成物単離を、8
6% TFA/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソールおよび2%のフェノ
ールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工
程4)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール、21m
m×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)
(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å、8μm、21m
m×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシ
ステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製し、RP−HPLCによって決定するよう
に、>95%純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の概略的ダイアグラムに
例示する。
【0336】
【化31】


(2.C末端における改変)
(実施例63 ソマトスタチン−28−EDA−MPAの合成)
100μmolの規模での、DAC:ソマトスタチン−28アナログの固相ペプチド合
成を、手動でかつ、SASRIN(超酸感応性樹脂)を用いるSymphony Pep
tide Synthesizer上で実行する。以下の保護アミノ酸を、連続的に樹脂
に付加させる:Fmoc−Cys(Acm)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH
、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Thr(t
Bu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH
、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Asn(Trt)−O
H、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Cys(Acm)−OH、Fmoc
−Gly−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmo
c−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Arg
(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Me
t−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Asn(Tr
t)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、
Fmoc−Ala−OH、Boc−Ser(tBu)−OH。それらを、N,N−ジメチ
ルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−
1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fm
oc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。完全に保護されたペプチドを、1%
TFA/DCMを用いて樹脂から切断する(工程2)。Acm基の除去およびジスルフ
ィド架橋を形成する2つのCys残基の生じる酸化を、ヨウ素を用いて達成する(工程3
)。次いで、エチレンジアミンおよび3−マレイミドプロピオン酸を、連続的に遊離のC
末端に付加する(工程4)。次いで、保護基を切断し、そして生成物を、86% TFA
/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソールおよび2%のフェノールを用いて
実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程5)。生成
物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cm
カラムおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)(λ214お
よび254nm)を備えたDynamax C18、60Å、8μm、21mm×25cm
カラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイナリーHPLCシステムを用い
て調製用逆相HPLCにより精製し、RP−HPLCによって決定するように、>95%
純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の概略的ダイアグラムに例示する。
【0337】
【化32】


(3.内部アミノ酸における改変)
(実施例64 Lys14(ε−MPA)−ソマトスタチン−28の合成)
100μmolの規模での、DAC:ソマトスタチン−28アナログの固相ペプチド合
成を、手動でかつ、Fmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSymp
hony Peptide Synthesizer上で実行する。以下の保護アミノ酸
を、連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Cys(Acm)−OH、Fmoc−Ser
(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fm
oc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Trp
(Boc)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−As
n(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Cys(Acm)
−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Lys(Alo
c)−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH
、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−O
H、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Pro−OH、Fm
oc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Asn
(Trt)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH。それ
らを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−
ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサ
フルオロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用
いて活性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメ
チルホルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Acm基の除
去およびジスルフィド架橋を形成する2つのCys残基の生じる酸化を、ヨウ素を用いて
達成する(工程2)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、そして5
mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量のPd(
PPh3)4の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程3)。次いで、
この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5mL)、
DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄した。次いで、この合成を、
3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程4)。樹脂切断および生
成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソールおよ
び2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2Oにより
沈殿させる(工程5)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガードモジ
ュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynamax
UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、60Å、
8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用バイナ
リーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製し、RP−HPLCによっ
て決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の概略的
ダイアグラムに例示する。
【0338】
【化33】


(F.複数のシステインを含有するペプチドからの改変されたペプチドの調製)
(1.N末端における改変)
(実施例65 N−MPA−Cys1−エンドセリン−1(1−21)−OHの合成)
100μmolの規模での、改変されたエンドセリン−1アナログの固相ペプチド合成
を、手動でかつ、Fmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSymph
ony Peptide Synthesizer上で実行する。以下の保護アミノ酸を
、連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−lle−
OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Le
u−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、Fmoc−Cys(Acm)−OH、F
moc−Phe−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Val−OH、
Fmoc−Cys(tBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−
Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Met−O
H、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Ser(
tBu)−OH、Fmoc−Cys(tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−O
H、Fmoc−Cys(Acm)−OH。それらを、N,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,
N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)および
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する。Fmoc保護基の除去を
、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)溶液を用いて
20分間活性化する(工程1)。Acm基の除去およびジスルフィド架橋を形成する2つ
のCys残基の生じる酸化を、ヨウ素を用いて達成する(工程2)。tBu基の除去およ
び樹脂上に第2のジスルフィド架橋を形成するその他の2つのCysの生じる酸化を、タ
リウム(III)トリフルオロアセテートを用いて達成する(工程3)。末端Fmoc基
の脱保護を、20%のピペリジンを用い、続いて、3−MPAのカップリングによって達
成する(工程4)。樹脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5%
2O/2%のチオアニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドラ
イアイスで冷却されたEt2Oにより沈殿させる(工程5)。生成物を、Dynamax
18、60Å、8μmのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出
器(Varian
Dynamax UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynama
x C18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rain
in)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製し、R
P−HPLCによって決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。
【0339】
【化34】


これらの工程を、上記の概略的ダイアグラムに例示する。
【0340】
(2.C末端における改変)
(実施例66 エンドセリン−1(1−21)Lys22−(Nε−MPA)−OHの合
成)
100μmolの規模での、改変されたエンドセリン−1アナログの固相ペプチド合成
を、手動でかつFmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSympho
ny Peptide Synthesizer上で実行する。以下の保護アミノ酸を、
連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Trp(
Boc)−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−lle−OH、Fmoc−Asp
(OtBu)−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、F
moc−Cys(Acm)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Tyr(tBu
)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Cys(tBu)−OH、Fmoc−G
lu(OtBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asp(Ot
Bu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ser(
tBu)−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Cys(tBu)−O
H、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Boc−Cys(Acm)−OH。それらを、
N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾ
トリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオ
ロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活
性化する。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホ
ルムアミド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Acm基の除去およ
び樹脂上に第1ジスルフィド架橋を形成する第1の2つのCys残基の生じる酸化を、ヨ
ウ素を用いて達成する(工程2)。tBu基の除去および樹脂上に第2のジスルフィド架
橋を形成するその他の2つのCysの生じる酸化を、タリウム(III)トリフルオロア
セテートを用いて達成する(工程3)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で
実行し、そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解し
た3当量のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程
4)。次いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(
6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄する。次いで
、この合成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程5)。樹
脂切断および生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2%のチオ
アニソールおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却された
Et2Oにより沈殿させる(工程6)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μ
mのガードモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian D
ynamax UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax
18、60Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin
)調製用バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製し、RP−
HPLCによって決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。これらの工程を
、以下の概略的ダイアグラム中に図示する。
【0341】
【化35】


(3.内部アミノ酸における改変)
(実施例67 Lys4(Nε−MPA)サラフォトキシンB(1−21)−OHの合
成)
100μmolの規模での、改変されたサラフォトキシン−Bアナログの固相ペプチド
合成を、手動でかつFmoc保護Rink Amide MBHA樹脂を用いるSymp
hony Peptide Synthesizer上で実行する。以下の保護アミノ酸
を、連続的に樹脂に付加させる:Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−lle
−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−G
ln(Trt)−OH、Fmoc−His(Trt)−OH、Fmoc−Cys(Acm
)−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−L
eu−OH、Fmoc−Cys(tBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH
、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc
−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−
OH、Fmoc−Lys(Aloc)−OH、Fmoc−Cys(tBu)−OH、Fm
oc−Ser(tBu)−OH、Boc−Cys(Acm)−OH。それらを、N,N−
ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、そして配列に従って、O−ベンゾトリアゾ
ール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフ
ェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を用いて活性化する
。Fmoc保護基の除去を、20%(V/V)ピペリジンのN,N−ジメチルホルムアミ
ド(DMF)溶液を用いて20分間活性化する(工程1)。Acm基の除去および樹脂上
に第1ジスルフィド架橋を形成する第1の2つのCys残基の生じる酸化を、ヨウ素を用
いて達成する(工程2)。tBu基の除去および樹脂上に第2のジスルフィド架橋を形成
するその他の2つのCysの生じる酸化を、タリウム(III)トリフルオロアセテート
を用いて達成する(工程3)。Lys(Aloc)基の選択的脱保護を、手動で実行し、
そして5mLのCHCl3:NMM:HOAc(18:1:0.5)中に溶解した3当量
のPd(PPh34の溶液で2時間樹脂を処理することによって達成する(工程4)。次
いで、この樹脂を、CHCl3(6×5mL)、DCM中の20% HOAc(6×5m
L)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で洗浄する。次いで、この合
成を、3−マレイミドプリピオン酸の添加のために再自動化する(工程5)。樹脂切断お
よび生成物単離を、86% TFA/5% TIS/5% H2O/2%のチオアニソー
ルおよび2%のフェノールを用いて実行し、続いて、ドライアイスで冷却されたEt2
により沈殿させる(工程6)。生成物を、Dynamax C18、60Å、8μmのガー
ドモジュール、21mm×25cmカラムおよびUV検出器(Varian Dynam
ax UVD II)(λ214および254nm)を備えたDynamax C18、6
0Å、8μm、21mm×25cmカラムを用いるVarian(Rainin)調製用
バイナリーHPLCシステムを用いて調製用逆相HPLCにより精製し、RP−HPLC
によって決定するように、>95%純度で所望のDACを得る。これらの工程を、以下の
概略的ダイアグラム中に図示する。
【0342】
【化36】


(F.ペプチド安定性アッセイ)
(実施例68 K5のペプチド安定性アッセイ)
ペプチド安定性アッセイを実行した。(MPA)−Pro−Arg−Lys−Leu−
Tyr−Asp−Lys−NH2。2TFAを、上記の通りに合成し、そしてMPA−K
5を同定した。非改変の対応ペプチドPro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp
−Lysもまた、3−MPAの付加なしで実施例20に記載の通りに合成し、そしてK5
として同定した。
【0343】
K5(MW1260.18、918.12遊離塩基)を、水中の100mMの貯蔵溶液
として調製した。MPA−K5(MW=1411.17、1069.11遊離塩基)を、
水中の100mMの貯蔵溶液として調製した。ヒト血清アルブミン(HSA)を、Alp
ha Therapeuticから入手可能なAlbutein(登録商標)として25
%溶液(計算値250mg/ml、3.75mM)として得た。ヒト血漿を、Golde
n West Biologicalsから得た。
【0344】
(1)ヒト血漿におけるK5の安定性
K5を1μMの溶液として調製し、そして25%のヒト血清アルブミン中に溶解させた
。次いで、この混合物を、ヒト血漿の存在下で最終濃度160mMのK5まで37℃にて
インキュベートした。100μlのアリコートを、0、4および24時間において血漿か
ら回収した。100μlのアリコートをすべてのタンパク質を沈殿させるために、100
μlのブロッキング溶液(5容量の5%のZnSO4/3容量のアセトニトリル/2容量
のメタノール)で混合した。サンプルを10,000gにて5分間遠心分離し、そしてペ
プチドを含有する上清を、再転換し、そして0.22μmフィルターを通して濾過した。
遊離インタクトなK5ペプチドの存在を、HPLC/MSによりアッセイした。結果を以
下に示す。血清におけるK5ペプチドの検出についてのHPLCパラメータは、以下の通
りであった。
【0345】
HPLC方法は、以下の通りであった:A Vydac C18 250×4.6mm
、5μ粒子サイズカラムを利用した。カラム温度は、30℃であり、流速は、0.5ml
/分であった。流動性相Aは、0.1%のTFA/水であった。流動性相Bは、0.1%
TFA/アセトニトリルであった。注入容量は、10μlであった。
【0346】
勾配は、以下の通りであった:
時間(分) %A %B
0 95 5
20 70 30
25 10 90
30 10 90
35 95 5
45 95 5
タンパク質を214、215および334nmにて検出した。質量分光分析のために、
イオン化様式は、300〜2000のM/Z範囲におけるAPI−エレクトロスプレー(
陽性様式)であった。ゲインは、3.0であり、フラグメンターは、120vであり、闘
値は、20であり、ステップサイズは、0.1であった。ガス温度は、350℃であり、
そして乾燥ガス容量は、10.0l/分であった。Neb圧力は、24psiであり、そ
してVcapは、3500Vであった。HPLC方法は以下の通りであった:A Vyd
ac C18 250×4.6分、5μ 粒子サイズカラムを利用した。カラム温度は、
30℃であり、流速は、0.5ml/分であった。流動性相Aは、0.1%のTFA/水
であった。流動性相Bは、0.1%のTFA/アセトニトリルであった。注入容量は、1
0μlであった。
【0347】
勾配は、以下のとおりであった:
時間(分) %A %B
0 95 5
20 70 30
25 10 90
30 10 90
35 95 5
45 95 5
タンパク質を、214、254および334nmにて検出した。質量分光分析のために
、イオン化様式は、300〜2000のM/Z範囲におけるAPI−エレクトロスプレー
(陽性様式)であった。ゲインは、3.0であり、フラグメンターは、120vであり、
闘値は、20であり、ステップサイズは、0.1であった。ガス温度は、350℃であり
、そして乾燥ガス容量は、10.0l/分であった。Neb圧力は、24psiであり、
そしてVcapは、3500Vであった。
【0348】
時間 血漿中の%K5ペプチド
0時間 100%
4時間 9%
24時間 0%
結果は、非改変のK5ペプチドが、プロテアーゼ活性の結果と同様に血漿中で不安定で
あることを実証する。
【0349】
(2)血漿中のMPA−K5−HSA結合体の安定性
MPA−K5(改変K5ペプチド)を、室温にて25% HSAを用いて2時間インキ
ュベートした。次いで、MPA−K5−結合体を、最終濃度160μmでヒト血漿の存在
下37℃にてインキュベートした。特定のインキュベーション期間(0、4および24時
間)の後、100μlのアリコートを、取り上げ、そして0.22μフィルターを通して
濾過した。インタクトな結合体の存在を、HPLC−MSによりアッセイした。
【0350】
カラムは、Aquapore RP−300、250×4.6mm、7μ粒子サイズで
あった。カラム温度は、50℃であった。流動性相Aは、0.1% TFA/水であった
。流動性相Bは、0.1% TFA/アセトニトリルであった。注入容量は、1μlであ
った。勾配は、以下の通りであった:
時間(分) %A %B 流速(ml/分)
0 66 34 0.700
1 66 34 0.700
25 58.8 41.2 0.700
30 50 50 0.70
35 5 95 1.00
41 5 95 1.00
45 66 34 1.00
46 66 34 0.70。
【0351】
ペプチドを、定量化のために214nmにて検出した。ペプチドの質量分光分析のため
に、イオン化様式は、1280〜1500m/zの範囲のAPI−エレクトロスプレーで
あり、ゲイン1.0、フラグメンター125V、闘値100、ステップサイズ0.40で
あった。ガス温度は、350℃であり、乾燥ガスは、13.0l/分であった。圧力は、
60psiであり、そしてVcapは、6000Vであった。結果を、以下に示す。
【0352】
血流における循環するアルブミンのおよそ33%は、メルカプトアルブミン(SH−ア
ルブミン)であり、これは、内因性スルフヒドリル化合物(例えば、システインまたはグ
ルタチオン)によってブロックされ、従って、マレイミド基との反応に利用可能である。
循環するアルブミンの残余の66%は、キャップされるかまたはスルフヒドリル化合物に
よってブロックされる。HPLC MSアッセイは、キャップされたHSA、SH−アル
ブミン、およびK5−MPA−アルブミンの同定を可能にする。MPAは、アルブミン上
で遊離のチオールに共有結合する。血漿中のアルブミンの3つの形態の安定性は、以下に
示される。
【0353】
【表1】


K5−MPA−HSAの百分率は、非改変のK5と対称的に、24時間の血漿アッセイ
を通して相対的に一定のままであり、血漿中で4時間のみでK5の元のの量の9%まで減
少させた。結果は、血漿中でかなり不安定なK5と対照的に、K5−MPA−HSAは、
血漿中でペプチターゼ活性からかなり安定であることを実証する。
【0354】
(実施例70 ダイノルフィンのペプチド安定性アッセイ)
血清ペプチターゼの存在下でペプチド結合体の安定性を決定するために、Dyn A−
(1−13)−OH、Dyn A−(1−13)−NH2およびDyn
A 1−13(MPA)−NH2の血清安定性を、比較した。Dyn A−(1−13
)−OH、Dyn A−(1−13)−NH2およびDyn A−1−13(MPA)−
NH2を上記の通りに合成した。ダイノルフィンペプチドを、ヒトヘパリン処理化血漿を
用いて最終濃度4mg/mLまで混合した。37℃での必要なインキュベーション時間(
0,20、20、60、120、180、360および480分)の後、100μLのア
リコートを、すべてのタンパク質を沈殿させる100μLのブロック溶液(5%ZnSO
4水溶液の5容量、アセトニトリルの3容量、メタノールの2容量)に添加した。遠心分
離(10,000g、2.5分間)の後、透明な上清を回収し、0.45μmフィルター
を通して濾過し、そしてLC/MS分析まで氷上で貯蔵した。
【0355】
サンプルを214nmにおいてLCを用いて分析し、検出された化合物の同一性を決定
するために、異なる化合物およびMSの存在を検出した。次いで、LCクロマトグラムか
らの各ピークについての積分面積%を、時間およびヒト血漿中で決定された相対安定性に
対してプロットした。
【0356】
Dyn A−(1−13)−OHおよびDyn A−(1−13)−NH2についての
安定性データは、文献に報告されたデータと一致した:ダイノルフィンペプチドのタンパ
ク分解性崩壊は、かなり迅速である。Dyn A−(1−13)−OHは、約10分の半
減期を有した。Dyn A−(1−13)−NH2は、約30分の半減期を有した。対照
的に、Dyn A−(1−13)−NH2は、血清ペプチターゼ活性の存在下で顕著な安
定性を示した。非改変ダイノルフィンペプチドを、60分以内に分解する。対照的に、改
変ダイノルフィンペプチド(Dyn A−(1−13)−NH2)は、480分まで血清
ペプチターゼ活性に安定である。
【0357】
ダイノルフィン結合体の安定性決定を、ELISAによって決定する。観測されたシグ
ナルが、ダイノルフィン結合体に起因するか否かおよびこの結合体が、何かを決定するた
めに、8時間後の反応混合物のLC質量分光分析を実行した。質量分光法の使用は、結合
体の分子量の決定を可能にし、そしてダイノルフィン結合体の任意の切断された形態であ
るか否かの決定を可能にする。ヒト血漿の質量分析は、アルブミンの2つの形態、664
36Daでの遊離のチオールおよび66557Daにおける酸化形態を示す。質量分光法
はまた、均等な混合物での、Dyn 2−13切断化結合体(68046Da)とインタ
クトなDyn 1−13結合体(68207Da)との間で区別し得る。
【0358】
480分の曝露の後、血清から得たダイノルフィンサンプルの血清ペプチターゼに対す
る質量分光分析は、インタクトな結合体(68192Da)の存在のみを同定し、崩壊産
物の存在を同定しなく、それによって、血清ペプチターゼ活性からのダイノルフィン結合
体の安定性を実証する。
【0359】
【表2】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明

【公開番号】特開2010−168384(P2010−168384A)
【公開日】平成22年8月5日(2010.8.5)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−20780(P2010−20780)
【出願日】平成22年2月1日(2010.2.1)
【分割の表示】特願2008−8555(P2008−8555)の分割
【原出願日】平成12年5月17日(2000.5.17)
【出願人】(507340636)コンジュケム バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド (18)
【Fターム(参考)】