がん予後診断アッセイ
本発明は、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のより大きなリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少、ならびに／または診断未確定の癌を有する対象および／もしくはがん発症のリスクが増加した対象のリスクの増加と関連する、方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法に関する。該がんは、典型的に、肺、結腸直腸、小腸、食道または膵臓（ＬＣＢＯＰ）のがんなどの炎症誘発性のがんである。
【背景技術】
【０００２】
出願人らは、患者の広範なモノクローナルガンマグロブリン血症についてアッセイをする方法として、遊離軽鎖を長年にわたって研究してきた。そのような遊離軽鎖を診断に使用することについては、書籍「血清遊離軽鎖分析（Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）第５版（２００８年）Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら、ＩＳＢＮ０７０４４２７０２８に詳しく説明されている。
【０００３】
抗体は、重鎖および軽鎖からなる。それらは通常、二重対称（ｔｗｏ‐ｆｏｌｄ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）で、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖で構成され、各々、可変および定常領域を含有する。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、組み合わさって抗原結合部位を形成し、両鎖が抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。軽鎖には、κおよびλの２つのタイプがあり、どの抗体分子も、いずれか一方の軽鎖を用いて作られ、両方が用いられることはない。ヒトでは、λ分子より約２倍多くのκ分子が作られるが、これが異なる哺乳類もいる。通常は、軽鎖は重鎖に結合している。しかしながら、幾つかの結合していない「遊離軽鎖」が人々の血清または尿中で検出できる。遊離軽鎖は、通常、軽鎖が重鎖に結合することによって隠れている遊離軽鎖の表面に対する抗体を作ることによって特異的に識別しうる。遊離軽鎖（ＦＬＣ）では、この表面が露出され、それを免疫的に検出できる。κまたはλ遊離軽鎖検出用の市販のキットとしては、例えば、英国バーミンガム、バインディングサイトリミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）社製の「フリーライト（Ｆｒｅｅｌｉｔｅ）（商標）」が挙げられる。出願人らは、遊離κ／遊離λ比率の量を測定することが患者におけるモノクローナルガンマグロブリン血症の診断の一助となることを以前に見いだしている。それは、例えば、完全型免疫グロブリン多発性骨髄腫（ＭＭ）、軽鎖ＭＭ、非分泌ＭＭ、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症、くすぶり型ＭＭ、形質細胞腫およびＭＧＵＳ（意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症）の診断における一助として使用されてきた。また、ＦＬＣの検出は、例えば他のＢ細胞疾患の診断の補助として、実際にモノクローナルガンマグロブリン血症一般の診断のために、尿ベンスジョーンズタンパク質分析の代替物として使用されてきた。
【０００４】
従来は、λまたはκ軽鎖の１つの増加およびその結果としての異常な比率を求めた。例えば、多発性骨髄腫は悪性形質細胞のモノクローナル増殖に起因し、単一のタイプの免疫グロブリンを産生する単一のタイプの細胞の増加をもたらす。これは、個体内で観察される、λまたはκいずれか遊離軽鎖の量の増加となる。この濃度の増加を測定し、通常は遊離κの遊離λに対する比率をもとめ、正常範囲と比較する。これはモノクローナル疾患の診断の一助となる。さらに、遊離軽鎖アッセイはまた患者の疾患の治療後にも使用しうる。例えば、ＡＬアミロイドーシスに対する治療後の患者の予後診断を実施しうる。
【０００５】
Ｋａｔｚｍａｎら（Clin. Chem. (2002); 48(9): 1437-1944）は、モノクローナルガンマグロブリン血症の診断における遊離κおよび遊離λ免疫グロブリンに関する血清基準範囲および診断範囲を考察している。２１〜９０才の人々を免疫アッセイによって調査し、免疫固定によって得た結果と比較し、Ｂ細胞疾患をもつ人々におけるモノクローナル遊離軽鎖（ＦＬＣ）を検出するための免疫アッセイを最適化した。
【０００６】
κおよびλＦＬＣの量およびκ／λ比率を記録し、Ｂ細胞疾患の検出を目的として基準範囲を確定することができた。
【発明の概要】
【０００７】
今回、出願人らは、ＦＬＣ、特に総ＦＬＣについてアッセイすることを、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法に使用できることを見いだした。彼らは、ＦＬＣ濃度が、対象におけるそのようながんによる死亡のリスクに統計的に有意に関連し、そのようながんの有無の指標であることを見いだした。
【０００８】
明らかに健康な人からの血清中のＦＬＣの濃度は、ある程度、個人の腎臓のＦＬＣを濾過および排出する能力に影響される。ＦＬＣクリアランスが限られる人では、血清に見られるＦＬＣレベルに増加がある。結果として、今日、ＦＬＣは腎機能の良いマーカーと考えられている。単量体ＦＬＣカッパ分子（２５ｋＤａ）は、二量体のラムダ分子（５０ｋＤａ）と異なるサイズであるので、それらは共に、例えばクレアチニン１１３ｋＤａと比べて、糸球体濾過のより良いマーカーである。しかしながら、クレアチニンと対照的に、ＦＬＣの産生は多くの疾患の結果として起こりうるため、血清ＦＬＣは典型的には単独で腎機能マーカーとして使用されないことになる。
【０００９】
しかしながら、Ｂ細胞増殖／活性のマーカーは重要であり、Ｂ細胞はＦＬＣの生成に関与するので、これは臨床的に有用である。ＦＬＣ産生は、Ｂ細胞アップレギュレーションの初期指標である。この点において、それはＴ細胞によって媒介される炎症反応のマーカーであるＣＲＰの使用を補完することができる。
【００１０】
高いＦＬＣ濃度は、おそらく、慢性の腎臓もしくは炎症性の障害またはＢ細胞疾患の指標でありうる。つまり、異常なＦＬＣアッセイ結果は、現在のところ幾つかのテストを組合せることを必要とする、さまざまな障害のマーカーでありうる。これとは逆に、ＦＬＣアッセイ結果が正常な場合、良好な腎機能、炎症性の状態が無い状態およびＢ細胞疾患の証拠がないことを示す。
【００１１】
出願人は、さまざまな程度の腎機能障害を有する患者からの血清試料を詳しく調べた。患者の死因をＦＬＣ濃度と比較して調査した。がんと腎機能の間に関連性は観察されなかったが、ＦＬＣレベル、特に総ＦＬＣレベルが、がんによる死亡のリスクと明らかに関連することが観察された。Ｐ＜０．０３３の確率で観察された。
【００１２】
本発明は、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のより大きなリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、その対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少、ならびに／または診断未確定の癌を有する対象および／もしくはがん発症のリスクが増加した対象のリスクの増加と関連する、方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、対象からの試料中のＦＬＣの量を検出することを含む、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少と関連する、方法を提供する。
【００１４】
典型的に、対象は以前にがんと診断されたことがない。
【００１５】
がんは、炎症誘発性のがん、例えば肺、結腸直腸、小腸、食道または膵臓（ＬＣＢＯＰ
）のがんである。
【００１６】
ＦＬＣは、カッパまたはラムダＦＬＣでありうる。しかしながら、カッパＦＬＣまたはラムダＦＬＣを単独で検出することは、患者における例えばモノクローナル産生されたどちらか一方のＦＬＣの、例えば異常な高レベルを見逃しうるので、好ましくは総ＦＬＣ濃度を測定する。
【００１７】
総遊離軽鎖とは、試料中の遊離カッパ軽鎖と遊離ラムダ軽鎖との総量を意味する。
【００１８】
好ましくは、対象は必ずしもＢ細胞関連疾患の症状を有することはない。症状としては、再発性感染、骨痛および疲労を挙げられうる。そのようなＢ細胞関連疾患は、好ましくは、骨髄腫（完全型免疫グロブリン骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫など）、ＭＧＵＳ、ＡＬアミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、濾胞中心細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、プレＢ細胞白血病または急性リンパ性白血病ではない。さらに、典型的に、個人は骨髄機能が低下していない。典型的に、個人は、多くのそのような疾患で典型的に見られる異常なλ：κのＦＬＣ比率を有さない。
【００１９】
「総遊離軽鎖」という用語は、対象からの試料中のκおよびλ遊離軽鎖の量を意味する。
【００２０】
試料は、典型的に、対象からの血清の試料である。しかしながら、全血、血漿、尿、または組織もしくは体液のその他試料もまた、場合により利用しうる。
【００２１】
典型的に、総ＦＬＣなどのＦＬＣは、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫アッセイ、またはルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）（商標）ビーズなどの蛍光標識されたビーズを利用することによって測定する。
【００２２】
例えば、サンドイッチアッセイは、抗体を使用して特異的抗原を検出する。アッセイに使用する１つ以上の抗体を、検出可能な検体に基質を変換できる酵素を用いて標識しうる。そのような酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび当該技術分野において公知の他の酵素が挙げられる。代替的に、他の検出可能なタグまたは標識を、酵素の代わりに、または酵素と一緒に使用しうる。これらとしては、放射性同位元素、当該技術分野において公知の、広範な着色および蛍光標識、例えばフルオレセイン、アレクサフルオル、オレゴングリーン、ボディピー、ローダミンレッド、カスケードブルー、マリーナブルー、パシフィックブルー、カスケードイエロー、金；およびビオチンなどの複合体（例えば、英国インビトロジェン社から入手可能）が挙げられる。また、染料ゾル、化学発光ラベル、金属ゾルまたは着色ラテックスも使用しうる。１つ以上のこれら標識を、本明細書において記載されているさまざまな発明に従ってＥＬＩＳＡアッセイに使用するか、または代替的に、本明細書において記載されている他のアッセイ、標識された抗体もしくはキットに使用しうる。
【００２３】
サンドイッチ型アッセイの構造はそれ自体、当該技術分野において周知である。例えば、ＦＬＣに対して特異的な「捕捉抗体」を基質に固定する。「捕捉抗体」は、当該技術分野において周知である方法によって基質に固定しうる。試料中のＦＬＣは、「捕捉抗体」を介してＦＬＣを基質に結合する「捕捉抗体」によって結合される。
【００２４】
結合していない免疫グロブリンは洗い流しうる。
【００２５】
ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチアッセイでは、結合している免疫グロブリンの有無は、
目的のＦＬＣの結合抗体とは異なる部分に対して特異的な、標識された「検出抗体」を使用することによって測定しうる。
【００２６】
フローサイトメトリーを使用して、目的のＦＬＣの結合を検出しうる。本技法は、例えば細胞選別など当該技術分野において周知である。しかしながら、それを使用して、ビーズなどの標識された粒子を検出し、それらのサイズを測定することもできる。実用フローサイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、第３版 （１９９４年）、Ｈ．Ｓｈａｐｉｒｏ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、およびフローサイトメトリー第一原則（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）（第２版）２００１年、Ａ．Ｌ．Ｇｉｖｅｎ、Ｗｉｌｅｙ Ｌｉｓｓなどの多数のテキストブックが、フローサイトメトリーについて説明している。
【００２７】
ＦＬＣに対して特異的な抗体などの結合抗体の１つを、ポリスチレンまたはラテックスビーズなどのビーズに結合させる。ビーズを、試料および第２の検出抗体と共に混合する。検出抗体は、好ましくは、検出可能な標識で標識し、試料中で検出されるＦＬＣに結合させる。これにより、アッセイされるＦＬＣが存在する場合、標識されたビーズが得られる。
【００２８】
また、本明細書において記載されている他の検体に特異的な他の抗体を使用して、それら検体の検出を可能にしうる。
【００２９】
次いで、標識されたビーズを、フローサイトメトリーを介して検出しうる。異なる蛍光標識などの異なる標識を、例えば抗遊離λおよび抗遊離κ抗体に対して使用しうる。また、本明細書において記載されているがん特異的な抗原などの他の検体に対して特異的な他の抗体を、このアッセイまたは本明細書において記載されている他のアッセイに使用して、それら検体の検出を可能にしうる。これにより、結合したＦＬＣ各種の量を同時に測定でき、その他の検体の有無を決定できる。
【００３０】
代替的にまたは付加的に、異なる大きさのビーズを、異なる抗体、例えば異なるマーカーに特異的な抗体に対して使用しうる。フローサイトメトリーは異なる大きさのビーズを識別することができ、よって試料中の各ＦＬＣまたはその他の検体の量を迅速に測定することができる。
【００３１】
代替的な方法は、例えば、市販のルミネックス（商標）ビーズなどの蛍光標識されたビーズに結合する抗体を使用する。異なるビーズを異なる抗体と使用する。異なるビーズを、異なるフルオロフォア混合物で標識し、それ故に異なる検体を蛍光波長によって測定できる。ルミネックスビーズは、アメリカ合衆国、テキサス州オースチン、ルミネックスコーポレーション（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社より入手可能である。
【００３２】
好ましくは、アッセイは、比ろう法または比濁法を使用する。λ‐またはκ‐ＦＬＣの検出に関する比ろう法および比濁法のアッセイは、一般に当該技術分野において公知であるが、総ＦＬＣアッセイに関してはそうではない。それらは、アッセイとして最も良い感度のレベルを有し、λおよびκＦＬＣ濃度は別々に測定されうるか、総ＦＬＣ用の単一のアッセイに到達する。そのようなアッセイは、抗κおよび抗λＦＬＣ抗体を典型的に６０：４０の比率で含有するが、５０：５０などの他の比率も使用されうる。
【００３３】
また、抗体は、遊離λおよび遊離κ軽鎖の混合物に対して作られうる。
【００３４】
総ＦＬＣなどのＦＬＣの量は、標準の所定値と比較され、ＦＬＣの正常範囲より高いか低いかを決定されうる。
【００３５】
以下で詳細に論じるように、出願人らは、血清ＦＬＣのより高い濃度が、炎症誘発性がんをもつ患者における生存が減少する可能性の著しい増加に関連することを見いだしている。例えば、低い血清ＦＬＣレベルをもつ人々よりその関連性がある。
【００３６】
単位ＧＦＲ当たり１．７ｍｇ／Ｌを超えるＦＬＣレベルは、がんによる死亡リスクの増加に関連した。第９０パーセンタイル（単位ＧＦＲ当たり６．１２ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超えるレベルを持つ患者は、非常に著しく増加したリスクを有した（Ｐ＜０．００５）。
【００３７】
歴史的に見て、アッセイキットは、カッパおよびラムダＦＬＣを別々に測定し、比率を計算できるように製作されてきた。それらは、従来、疾患症状をすでに呈する個人に使用されている。
【００３８】
好ましくは、アッセイは、例えば約１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌの試料中のＦＬＣ、例えば総ＦＬＣを測定することができる。これは、圧倒的多数の人々において、異なる希釈にて試料を再アッセイすることを必要とせずに、血清ＦＬＣ濃度を検出することが期待されている。
【００３９】
好ましくは、その方法は、例えば抗遊離κ軽鎖および抗遊離λ軽鎖抗体またはその断片の混合物を利用することによる、免疫アッセイを利用して試料中の総遊離軽鎖の量を検出することを含む。そのような抗体は、５０：５０の抗κ：抗λ抗体の比率でありうる。ＦＬＣに結合する抗体または断片は、標識された抗体または断片を使用することによって直接的に、または抗遊離λもしくは抗遊離κ抗体に対する標識された抗体を使用して間接的に検出しうる。
【００４０】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ポリクローナルは同一鎖の異なる部分に対して作られるので同一タイプの軽鎖間の若干の変動を許容するため使用されうる。ポリクローナル抗体の作製については、例えば国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００４１】
好ましくは、全生存の可能性の増加を示すのに有意であることが特定および判明した総ＦＬＣなどの血清ＦＬＣの量は、５０ｍｇ／Ｌ未満である。４７．４ｍｇ／Ｌ未満のレベルで、Ｐ＜Ｏ．００１を示した。
【００４２】
単位ＧＦＲ（糸球体濾過率）当たり１．７ｍｇ／Ｌを超える修正ＦＬＣレベルをもつ個人は、顕著により短い生存を有した。第９０パーセンタイル（単位ＧＦＲ当たり６．１２ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超えるレベルを持つ患者は、非常に著しく増加したリスクを有した（Ｐ＜０．００５）。
【００４３】
また、ＦＬＣ用の、例えば本発明の方法で使用するためのアッセイキットも提供される。該キットは、試料中の総ＦＬＣ量を検出しうる。それらは、本発明の方法に使用するための取扱説明書と組み合せて提供されうる。
【００４４】
また、アッセイキットは、１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗がん抗原抗体を含む本発明の方法で使用される。一般に、マーカーである抗原は、多くのがんについて知られている。抗体は、そのようなマーカーに対して提供され、さらにがんを特定しうる。
【００４５】
アッセイキットは、２５ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは２０ｍｇ／Ｌ未満または約、１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌもしくは４ｍｇ／Ｌ未満の試料中の総遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出するように構成されうる。検量用の材料は、典型的に、１〜ｌ００ｍｇ／Ｌの範囲を
測定する。アッセイキットは、例えば比ろう法アッセイキットでありうる。好ましくは、キットは、ＦＬＣに対する１つ以上の抗体含む免疫アッセイキットである。典型的に、キットは、抗κおよび抗λＦＬＣ抗体の混合物を含む。典型的に、抗遊離κと抗遊離λ抗体が５０：５０の混合物が使用される。キットは、試料中の１〜１００ｍｇ／Ｌまたは、好ましくは１〜８０ｍｇ／Ｌの総遊離軽鎖の量を検出するように構成されうる。
【００４６】
また、（Ｆａｂ）２またはＦａｂ抗体などのＦＬＣに結合することができる抗体断片も使用されうる。
【００４７】
抗体または断片は、例えば前述のような標識を用いて標識されうる。標識された抗免疫グロブリン結合抗体またはその断片が提供され、ＦＬＣに結合する抗遊離λまたは抗遊離κが検出されうる。
【００４８】
キットは、示された範囲でアッセイを検量できるように検量用の液を含みうる。検量用の液は、好ましくは、例えば、１００ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満または１ｍｇ／Ｌまでの所定の濃度のＦＬＣを含有する。キットはまた、抗体の量、およびラテックス粒子上にコーティングした「ブロッキング」タンパク質の量を最適化することによって、ならびに、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度などの、補助試薬の濃度を最適化することによって構成されうる。
【００４９】
キットは、例えばＦＬＣについて複数の標準対照を含みうる。標準対照を使用して、ＦＬＣまたは生じる他の構成要素の濃度に関する標準曲線を有効にしうる。そのような標準対照は、先に検量された標準曲線が使用される試薬および状態に対して妥当であることを確認する。典型的に、それらは対象からの試料のアッセイと実質的に同時に使用される。標準は、ＦＬＣについて２０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは１５ｍｇ／Ｌ未満、約１０ｍｇ／Ｌ未満、またはアッセイがより低い濃度の遊離軽鎖を検出できるように、５ｍｇ／Ｌ未満の、１つ以上の標準を含みうる。
【００５０】
アッセイキットは、比ろう法または比濁法キットでありうる。それは、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、蛍光、化学発光もしくはビーズタイプアッセイまたはディップスティックでありうる。一般に、そのようなアッセイは当該技術分野において公知である。
【００５１】
アッセイキットはまた、本発明の方法で使用される取扱説明書を含みうる。取扱説明書は、正常値であると考えられている総遊離軽鎖の濃度の指標を含み、例えば、それ未満または実際にはそれを超えると、個人の生存の確率の増加または減少のどちらか、またはがんが存在する可能性の増加の指標を示しうる。そのような濃度は、上記で定義された通りでありうる。
【００５２】
本発明を、実施例を単なる例示として、以下の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、その総ＦＬＣ濃度を基にして五分位に分けられた試験集団についての生存の確率を示す。五分位レベルは、＜３３．３、３３．４〜４７．３、４７．４〜７６．８、６７．９〜１０６．３および＞１０６．５ｍｇ／Ｌである。
【図２】図２は、混合した抗λおよび抗κ遊離軽鎖抗体を使用する総ＦＬＣアッセイキットと比較しての、市販の別々の抗遊離κおよび抗遊離λアッセイキットを使用して得られた総ＦＬＣ濃度の比較である。
【実施例】
【００５４】
腫瘍予後診断
背景
がんによる死亡は、依然として一般的な死因である。早期診断および早期治療は、患者予後を飛躍的に改善することができ、正確なスクリーニングテストの継続的な開発は非常に重要になっている。幾つかのがんは、炎症誘発性の特質を有し、高い血清、免疫グロブリン、遊離軽鎖濃度は、それら腫瘍のうちの１つの有無または進行中の発症についての有用な標識であるかもしれないと仮定されていた。考慮された具体的ながんは、炎症に大きく関連するもの（肺、結腸直腸、小腸、食道、膵臓；ＬＣＢＯＰ）であった。
【００５５】
方法
さまざまな程度の腎機能障害をもつ１３００人の患者から、血清試料を採集し（「基準」）、その後、最長６３カ月の期間にわたって追跡調査した。
【００５６】
より詳細には、患者は、バーミンガム大学病院の腎臓クリニックから募った。患者は、例えば蛋白尿、血尿、慢性腎臓疾患（すべての病期）、末期腎不全（血液透析および腹膜透析）および腎移植レシピエントを含む、腎臓にさまざまな問題を有した。
【００５７】
行われたテストおよび評価は以下の通り：
血清クレアチニンおよび推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）
単位ＧＦＲ当たりＦＬＣの修正レベルは次のように計算した：総血清ＦＬＣ濃度 （ｍｇ／Ｌ）をコッククロフト・ゴールト式（ＲＥＦ）によりｍｌｓ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２で計算した推定糸球体濾過率で除した。このようにして、腎機能に依存しない単位ＧＦＲ当たりｍｇ／Ｌでの、患者の血清総ＦＬＣレベルを得た。
参照文献：Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ ＤＷ，Ｇａｕｌｔ ＭＨ：血清クレアチニンからのクレアチニンクリアランスの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ） Ｎｅｐｈｒｏｎ
１６：３１‐４１、１９７６年
【００５８】
尿アルブミン／クレアチニン比率
これらは、当該技術分野において標準的なテストである。
【００５９】
カッパおよびラムダの両方の血清ＦＬＣ濃度（フリーライト、バインディングサイトリミテッド社、バーミンガム、英国）
総血清ＦＬＣ濃度は、カッパＦＬＣおよびラムダＦＬＣの値を合計することによって計算した。
【００６０】
追跡調査：
患者を、死亡するまでの期間および死因について追跡調査した。
【００６１】
結果
患者生存のカプランマイヤー分析は、より高いＦＬＣレベルをもつ患者は、減少した生存を示した（Ｐ＜０．００１）。
【００６２】
生存率を図１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
血清総ＦＬＣを腎機能と独立して評価したとき、単位ＧＦＲ当たり＞１．７ｍｇ／ＬのＦＬＣのレベルは、著しくより短い生存を有した。（Ｐ＜０．０００１）。
【００６５】
【表２】
【００６６】
中央値（単位ＧＦＲ当たり１．７ｍｇ／Ｌ）を超える修正ＦＬＣレベルをもつ個人は、生存が著しくより短いことを有した。
【００６７】
死因を調査したとき、がんに続く死亡の可能性は、より高い総ＦＬＣ濃度をもつ患者で著しくより高かった。
【００６８】
【表３】
【００６９】
がんによる死亡の種類を特定した際、データはより強い印象を与える：
ＦＬＣ五分位１：脳腫瘍、尿路腫瘍
五分位２：結腸腫瘍、尿路腫瘍
五分位３：３×尿路腫瘍
五分位４：胸部がん、小腸腫瘍、食道がん、２×血液学的腫瘍
五分位５：肝臓、３×血液学的腫瘍、膵臓がん、食道がん、２×結腸腫瘍、２×肺腫瘍
【００７０】
したがって、より炎症誘発性である、またＢ細胞増殖と関連すると知られているがんは、より高いＦＬＣ五分位にあった。がんおよび腎機能の間に関連性は見られなかった。カプランマイヤー分析では、高いＦＬＣレベルは、がんによる死亡までのより短い期間と関連した（Ｐ＜０．０２３）。
【００７１】
総ＦＬＣレベルは、炎症誘発性がんによる死亡のリスクと明らかに関連した。
【００７２】
考察
なんらかの形の腎機能障害をもつ患者で結果を集めたが、腎機能はＬＣＢＯＰがんの進行と何ら関連性を有さないと考えられ、このことは、最も悪い腎機能をもつ人々で少しも発生率の増加がないことによって示された。これを受けて、総ＦＬＣの上昇は、論理上、一般の集団においてＬＣＢＯＰがん発生率の同様な予測となるであろう。検査（複数含む）は、低下した腎機能によるＦＬＣ濃度の背景の上昇がない一般の集団ではより感度が良いであろうと考えられる。
【００７３】
アッセイキット
本発明の方法は、以下のアッセイキットを利用しうる。アッセイキットは、患者試料内の、例えば血清中に存在する総遊離κおよび遊離λ軽鎖を定量する。これは、抗遊離κおよび抗遊離λ軽鎖ヒツジ抗体の５０：５０混合物を用いて、１００ｎｍカルボキシル修飾ラテックス粒子をコーティングすることによって達成しうる。以下に例示されたアッセイでは、総遊離軽鎖に関する測定範囲は、１〜８０ｍｇ／Ｌである。しかしながら、他の測
定範囲も同じように考慮されうる。
【００７４】
抗遊離κおよび抗遊離λ抗血清は、一般に当該技術分野において公知の技術を使用して、この場合ではヒツジで作製した。一般的な免疫化プロセスは、国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００７５】
抗κおよび抗λ抗血清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して等しい濃度まで希釈した。それら抗体を混ぜ合わせ、５０％の抗κ抗体および５０％の抗λ抗体を含む抗血清を作成した。
【００７６】
抗体を、１０ｍｇ／ｌｏｔのコーティング量（ｃｏａｔ ｌｏａｄ）でカルボキシル修飾ラテックスにコーティングした。これは、標準的な手順を使用して達成した。例えば、「微粒子試薬最適化：微粒子の専門家からの実験室参照マニュアル（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｎｕａｌ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｏｎ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」編者 Ｃａｒｙｌ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｊｉｍ Ｓｕｔｏｒ、Ｂｒｕｃｅ Ｓｈｕｌｌ、著作権 Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ、１９９４年（Ｐ／Ｎ０３４７８３５（１２９４）を参照されたい。
【００７７】
この参照文献はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用したアッセイキットの詳細も提供する。
【００７８】
混合した抗体を市販のκおよびλフリーライト（商標）キット（英国バーミンガム、バインディングサイトグループリミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）社から入手）を使用して得られた結果と比較した。そのようなフリーライト（商標）キットは、κ遊離軽鎖の量およびλ遊離軽鎖の量を、別々のアッセイにて特定する。総ＦＬＣキットを使用して曲線を作成し、対照濃度を使用して確認した。校正曲線は、１〜８０ｍｇ／Ｌの間の総遊離軽鎖について得ることができた。下記の結果の表において、κフリーライト（商標）、λフリーライト（商標）および総遊離軽鎖アッセイを使用して、κ遊離軽鎖（κＦＬＣ）、λ遊離軽鎖（λＦＬＣ）および総ＦＬＣについて結果を得た。これらの結果を１５の異なる正常血清試料について示す。比濁法により測定した結果を下表および図２に示す。
【００７９】
予備結果は、抗κおよび抗λ遊離軽鎖抗体に基づく総遊離軽鎖アッセイを使用する原理は実行可能であることを示す。
【００８０】
結果
【００８１】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法に関する。該がんは、典型的に、肺、結腸直腸、小腸、食道または膵臓（ＬＣＢＯＰ）のがんなどの炎症誘発性のがんである。
【背景技術】
【０００２】
出願人らは、患者の広範なモノクローナルガンマグロブリン血症についてアッセイをする方法として、遊離軽鎖を長年にわたって研究してきた。そのような遊離軽鎖を診断に使用することについては、書籍「血清遊離軽鎖分析（Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）第５版（２００８年）Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら、ＩＳＢＮ０７０４４２７０２８に詳しく説明されている。
【０００３】
抗体は、重鎖および軽鎖からなる。それらは通常、二重対称（ｔｗｏ‐ｆｏｌｄ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）で、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖で構成され、各々、可変および定常領域を含有する。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、組み合わさって抗原結合部位を形成し、両鎖が抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。軽鎖には、κおよびλの２つのタイプがあり、どの抗体分子も、いずれか一方の軽鎖を用いて作られ、両方が用いられることはない。ヒトでは、λ分子より約２倍多くのκ分子が作られるが、これが異なる哺乳類もいる。通常は、軽鎖は重鎖に結合している。しかしながら、幾つかの結合していない「遊離軽鎖」が人々の血清または尿中で検出できる。遊離軽鎖は、通常、軽鎖が重鎖に結合することによって隠れている遊離軽鎖の表面に対する抗体を作ることによって特異的に識別しうる。遊離軽鎖（ＦＬＣ）では、この表面が露出され、それを免疫的に検出できる。κまたはλ遊離軽鎖検出用の市販のキットとしては、例えば、英国バーミンガム、バインディングサイトリミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）社製の「フリーライト（Ｆｒｅｅｌｉｔｅ）（商標）」が挙げられる。出願人らは、遊離κ／遊離λ比率の量を測定することが患者におけるモノクローナルガンマグロブリン血症の診断の一助となることを以前に見いだしている。それは、例えば、完全型免疫グロブリン多発性骨髄腫（ＭＭ）、軽鎖ＭＭ、非分泌ＭＭ、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症、くすぶり型ＭＭ、形質細胞腫およびＭＧＵＳ（意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症）の診断における一助として使用されてきた。また、ＦＬＣの検出は、例えば他のＢ細胞疾患の診断の補助として、実際にモノクローナルガンマグロブリン血症一般の診断のために、尿ベンスジョーンズタンパク質分析の代替物として使用されてきた。
【０００４】
従来は、λまたはκ軽鎖の１つの増加およびその結果としての異常な比率を求めた。例えば、多発性骨髄腫は悪性形質細胞のモノクローナル増殖に起因し、単一のタイプの免疫グロブリンを産生する単一のタイプの細胞の増加をもたらす。これは、個体内で観察される、λまたはκいずれか遊離軽鎖の量の増加となる。この濃度の増加を測定し、通常は遊離κの遊離λに対する比率をもとめ、正常範囲と比較する。これはモノクローナル疾患の診断の一助となる。さらに、遊離軽鎖アッセイはまた患者の疾患の治療後にも使用しうる。例えば、ＡＬアミロイドーシスに対する治療後の患者の予後診断を実施しうる。
【０００５】
Ｋａｔｚｍａｎら（Clin. Chem. (2002); 48(9): 1437-1944）は、モノクローナルガンマグロブリン血症の診断における遊離κおよび遊離λ免疫グロブリンに関する血清基準範囲および診断範囲を考察している。２１〜９０才の人々を免疫アッセイによって調査し、免疫固定によって得た結果と比較し、Ｂ細胞疾患をもつ人々におけるモノクローナル遊離軽鎖（ＦＬＣ）を検出するための免疫アッセイを最適化した。
【０００６】
κおよびλＦＬＣの量およびκ／λ比率を記録し、Ｂ細胞疾患の検出を目的として基準範囲を確定することができた。
【発明の概要】
【０００７】
今回、出願人らは、ＦＬＣ、特に総ＦＬＣについてアッセイすることを、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法に使用できることを見いだした。彼らは、ＦＬＣ濃度が、対象におけるそのようながんによる死亡のリスクに統計的に有意に関連し、そのようながんの有無の指標であることを見いだした。
【０００８】
明らかに健康な人からの血清中のＦＬＣの濃度は、ある程度、個人の腎臓のＦＬＣを濾過および排出する能力に影響される。ＦＬＣクリアランスが限られる人では、血清に見られるＦＬＣレベルに増加がある。結果として、今日、ＦＬＣは腎機能の良いマーカーと考えられている。単量体ＦＬＣカッパ分子（２５ｋＤａ）は、二量体のラムダ分子（５０ｋＤａ）と異なるサイズであるので、それらは共に、例えばクレアチニン１１３ｋＤａと比べて、糸球体濾過のより良いマーカーである。しかしながら、クレアチニンと対照的に、ＦＬＣの産生は多くの疾患の結果として起こりうるため、血清ＦＬＣは典型的には単独で腎機能マーカーとして使用されないことになる。
【０００９】
しかしながら、Ｂ細胞増殖／活性のマーカーは重要であり、Ｂ細胞はＦＬＣの生成に関与するので、これは臨床的に有用である。ＦＬＣ産生は、Ｂ細胞アップレギュレーションの初期指標である。この点において、それはＴ細胞によって媒介される炎症反応のマーカーであるＣＲＰの使用を補完することができる。
【００１０】
高いＦＬＣ濃度は、おそらく、慢性の腎臓もしくは炎症性の障害またはＢ細胞疾患の指標でありうる。つまり、異常なＦＬＣアッセイ結果は、現在のところ幾つかのテストを組合せることを必要とする、さまざまな障害のマーカーでありうる。これとは逆に、ＦＬＣアッセイ結果が正常な場合、良好な腎機能、炎症性の状態が無い状態およびＢ細胞疾患の証拠がないことを示す。
【００１１】
出願人は、さまざまな程度の腎機能障害を有する患者からの血清試料を詳しく調べた。患者の死因をＦＬＣ濃度と比較して調査した。がんと腎機能の間に関連性は観察されなかったが、ＦＬＣレベル、特に総ＦＬＣレベルが、がんによる死亡のリスクと明らかに関連することが観察された。Ｐ＜０．０３３の確率で観察された。
【００１２】
本発明は、診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のより大きなリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、その対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少、ならびに／または診断未確定の癌を有する対象および／もしくはがん発症のリスクが増加した対象のリスクの増加と関連する、方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、対象からの試料中のＦＬＣの量を検出することを含む、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少と関連する、方法を提供する。
【００１４】
典型的に、対象は以前にがんと診断されたことがない。
【００１５】
がんは、炎症誘発性のがん、例えば肺、結腸直腸、小腸、食道または膵臓（ＬＣＢＯＰ
）のがんである。
【００１６】
ＦＬＣは、カッパまたはラムダＦＬＣでありうる。しかしながら、カッパＦＬＣまたはラムダＦＬＣを単独で検出することは、患者における例えばモノクローナル産生されたどちらか一方のＦＬＣの、例えば異常な高レベルを見逃しうるので、好ましくは総ＦＬＣ濃度を測定する。
【００１７】
総遊離軽鎖とは、試料中の遊離カッパ軽鎖と遊離ラムダ軽鎖との総量を意味する。
【００１８】
好ましくは、対象は必ずしもＢ細胞関連疾患の症状を有することはない。症状としては、再発性感染、骨痛および疲労を挙げられうる。そのようなＢ細胞関連疾患は、好ましくは、骨髄腫（完全型免疫グロブリン骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫など）、ＭＧＵＳ、ＡＬアミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、濾胞中心細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、プレＢ細胞白血病または急性リンパ性白血病ではない。さらに、典型的に、個人は骨髄機能が低下していない。典型的に、個人は、多くのそのような疾患で典型的に見られる異常なλ：κのＦＬＣ比率を有さない。
【００１９】
「総遊離軽鎖」という用語は、対象からの試料中のκおよびλ遊離軽鎖の量を意味する。
【００２０】
試料は、典型的に、対象からの血清の試料である。しかしながら、全血、血漿、尿、または組織もしくは体液のその他試料もまた、場合により利用しうる。
【００２１】
典型的に、総ＦＬＣなどのＦＬＣは、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫アッセイ、またはルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）（商標）ビーズなどの蛍光標識されたビーズを利用することによって測定する。
【００２２】
例えば、サンドイッチアッセイは、抗体を使用して特異的抗原を検出する。アッセイに使用する１つ以上の抗体を、検出可能な検体に基質を変換できる酵素を用いて標識しうる。そのような酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび当該技術分野において公知の他の酵素が挙げられる。代替的に、他の検出可能なタグまたは標識を、酵素の代わりに、または酵素と一緒に使用しうる。これらとしては、放射性同位元素、当該技術分野において公知の、広範な着色および蛍光標識、例えばフルオレセイン、アレクサフルオル、オレゴングリーン、ボディピー、ローダミンレッド、カスケードブルー、マリーナブルー、パシフィックブルー、カスケードイエロー、金；およびビオチンなどの複合体（例えば、英国インビトロジェン社から入手可能）が挙げられる。また、染料ゾル、化学発光ラベル、金属ゾルまたは着色ラテックスも使用しうる。１つ以上のこれら標識を、本明細書において記載されているさまざまな発明に従ってＥＬＩＳＡアッセイに使用するか、または代替的に、本明細書において記載されている他のアッセイ、標識された抗体もしくはキットに使用しうる。
【００２３】
サンドイッチ型アッセイの構造はそれ自体、当該技術分野において周知である。例えば、ＦＬＣに対して特異的な「捕捉抗体」を基質に固定する。「捕捉抗体」は、当該技術分野において周知である方法によって基質に固定しうる。試料中のＦＬＣは、「捕捉抗体」を介してＦＬＣを基質に結合する「捕捉抗体」によって結合される。
【００２４】
結合していない免疫グロブリンは洗い流しうる。
【００２５】
ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチアッセイでは、結合している免疫グロブリンの有無は、
目的のＦＬＣの結合抗体とは異なる部分に対して特異的な、標識された「検出抗体」を使用することによって測定しうる。
【００２６】
フローサイトメトリーを使用して、目的のＦＬＣの結合を検出しうる。本技法は、例えば細胞選別など当該技術分野において周知である。しかしながら、それを使用して、ビーズなどの標識された粒子を検出し、それらのサイズを測定することもできる。実用フローサイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、第３版 （１９９４年）、Ｈ．Ｓｈａｐｉｒｏ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、およびフローサイトメトリー第一原則（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）（第２版）２００１年、Ａ．Ｌ．Ｇｉｖｅｎ、Ｗｉｌｅｙ Ｌｉｓｓなどの多数のテキストブックが、フローサイトメトリーについて説明している。
【００２７】
ＦＬＣに対して特異的な抗体などの結合抗体の１つを、ポリスチレンまたはラテックスビーズなどのビーズに結合させる。ビーズを、試料および第２の検出抗体と共に混合する。検出抗体は、好ましくは、検出可能な標識で標識し、試料中で検出されるＦＬＣに結合させる。これにより、アッセイされるＦＬＣが存在する場合、標識されたビーズが得られる。
【００２８】
また、本明細書において記載されている他の検体に特異的な他の抗体を使用して、それら検体の検出を可能にしうる。
【００２９】
次いで、標識されたビーズを、フローサイトメトリーを介して検出しうる。異なる蛍光標識などの異なる標識を、例えば抗遊離λおよび抗遊離κ抗体に対して使用しうる。また、本明細書において記載されているがん特異的な抗原などの他の検体に対して特異的な他の抗体を、このアッセイまたは本明細書において記載されている他のアッセイに使用して、それら検体の検出を可能にしうる。これにより、結合したＦＬＣ各種の量を同時に測定でき、その他の検体の有無を決定できる。
【００３０】
代替的にまたは付加的に、異なる大きさのビーズを、異なる抗体、例えば異なるマーカーに特異的な抗体に対して使用しうる。フローサイトメトリーは異なる大きさのビーズを識別することができ、よって試料中の各ＦＬＣまたはその他の検体の量を迅速に測定することができる。
【００３１】
代替的な方法は、例えば、市販のルミネックス（商標）ビーズなどの蛍光標識されたビーズに結合する抗体を使用する。異なるビーズを異なる抗体と使用する。異なるビーズを、異なるフルオロフォア混合物で標識し、それ故に異なる検体を蛍光波長によって測定できる。ルミネックスビーズは、アメリカ合衆国、テキサス州オースチン、ルミネックスコーポレーション（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社より入手可能である。
【００３２】
好ましくは、アッセイは、比ろう法または比濁法を使用する。λ‐またはκ‐ＦＬＣの検出に関する比ろう法および比濁法のアッセイは、一般に当該技術分野において公知であるが、総ＦＬＣアッセイに関してはそうではない。それらは、アッセイとして最も良い感度のレベルを有し、λおよびκＦＬＣ濃度は別々に測定されうるか、総ＦＬＣ用の単一のアッセイに到達する。そのようなアッセイは、抗κおよび抗λＦＬＣ抗体を典型的に６０：４０の比率で含有するが、５０：５０などの他の比率も使用されうる。
【００３３】
また、抗体は、遊離λおよび遊離κ軽鎖の混合物に対して作られうる。
【００３４】
総ＦＬＣなどのＦＬＣの量は、標準の所定値と比較され、ＦＬＣの正常範囲より高いか低いかを決定されうる。
【００３５】
以下で詳細に論じるように、出願人らは、血清ＦＬＣのより高い濃度が、炎症誘発性がんをもつ患者における生存が減少する可能性の著しい増加に関連することを見いだしている。例えば、低い血清ＦＬＣレベルをもつ人々よりその関連性がある。
【００３６】
単位ＧＦＲ当たり１．７ｍｇ／Ｌを超えるＦＬＣレベルは、がんによる死亡リスクの増加に関連した。第９０パーセンタイル（単位ＧＦＲ当たり６．１２ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超えるレベルを持つ患者は、非常に著しく増加したリスクを有した（Ｐ＜０．００５）。
【００３７】
歴史的に見て、アッセイキットは、カッパおよびラムダＦＬＣを別々に測定し、比率を計算できるように製作されてきた。それらは、従来、疾患症状をすでに呈する個人に使用されている。
【００３８】
好ましくは、アッセイは、例えば約１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌの試料中のＦＬＣ、例えば総ＦＬＣを測定することができる。これは、圧倒的多数の人々において、異なる希釈にて試料を再アッセイすることを必要とせずに、血清ＦＬＣ濃度を検出することが期待されている。
【００３９】
好ましくは、その方法は、例えば抗遊離κ軽鎖および抗遊離λ軽鎖抗体またはその断片の混合物を利用することによる、免疫アッセイを利用して試料中の総遊離軽鎖の量を検出することを含む。そのような抗体は、５０：５０の抗κ：抗λ抗体の比率でありうる。ＦＬＣに結合する抗体または断片は、標識された抗体または断片を使用することによって直接的に、または抗遊離λもしくは抗遊離κ抗体に対する標識された抗体を使用して間接的に検出しうる。
【００４０】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ポリクローナルは同一鎖の異なる部分に対して作られるので同一タイプの軽鎖間の若干の変動を許容するため使用されうる。ポリクローナル抗体の作製については、例えば国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００４１】
好ましくは、全生存の可能性の増加を示すのに有意であることが特定および判明した総ＦＬＣなどの血清ＦＬＣの量は、５０ｍｇ／Ｌ未満である。４７．４ｍｇ／Ｌ未満のレベルで、Ｐ＜Ｏ．００１を示した。
【００４２】
単位ＧＦＲ（糸球体濾過率）当たり１．７ｍｇ／Ｌを超える修正ＦＬＣレベルをもつ個人は、顕著により短い生存を有した。第９０パーセンタイル（単位ＧＦＲ当たり６．１２ｍｇ／ＬのＦＬＣ）を超えるレベルを持つ患者は、非常に著しく増加したリスクを有した（Ｐ＜０．００５）。
【００４３】
また、ＦＬＣ用の、例えば本発明の方法で使用するためのアッセイキットも提供される。該キットは、試料中の総ＦＬＣ量を検出しうる。それらは、本発明の方法に使用するための取扱説明書と組み合せて提供されうる。
【００４４】
また、アッセイキットは、１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗がん抗原抗体を含む本発明の方法で使用される。一般に、マーカーである抗原は、多くのがんについて知られている。抗体は、そのようなマーカーに対して提供され、さらにがんを特定しうる。
【００４５】
アッセイキットは、２５ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは２０ｍｇ／Ｌ未満または約、１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌもしくは４ｍｇ／Ｌ未満の試料中の総遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出するように構成されうる。検量用の材料は、典型的に、１〜ｌ００ｍｇ／Ｌの範囲を
測定する。アッセイキットは、例えば比ろう法アッセイキットでありうる。好ましくは、キットは、ＦＬＣに対する１つ以上の抗体含む免疫アッセイキットである。典型的に、キットは、抗κおよび抗λＦＬＣ抗体の混合物を含む。典型的に、抗遊離κと抗遊離λ抗体が５０：５０の混合物が使用される。キットは、試料中の１〜１００ｍｇ／Ｌまたは、好ましくは１〜８０ｍｇ／Ｌの総遊離軽鎖の量を検出するように構成されうる。
【００４６】
また、（Ｆａｂ）２またはＦａｂ抗体などのＦＬＣに結合することができる抗体断片も使用されうる。
【００４７】
抗体または断片は、例えば前述のような標識を用いて標識されうる。標識された抗免疫グロブリン結合抗体またはその断片が提供され、ＦＬＣに結合する抗遊離λまたは抗遊離κが検出されうる。
【００４８】
キットは、示された範囲でアッセイを検量できるように検量用の液を含みうる。検量用の液は、好ましくは、例えば、１００ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満または１ｍｇ／Ｌまでの所定の濃度のＦＬＣを含有する。キットはまた、抗体の量、およびラテックス粒子上にコーティングした「ブロッキング」タンパク質の量を最適化することによって、ならびに、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度などの、補助試薬の濃度を最適化することによって構成されうる。
【００４９】
キットは、例えばＦＬＣについて複数の標準対照を含みうる。標準対照を使用して、ＦＬＣまたは生じる他の構成要素の濃度に関する標準曲線を有効にしうる。そのような標準対照は、先に検量された標準曲線が使用される試薬および状態に対して妥当であることを確認する。典型的に、それらは対象からの試料のアッセイと実質的に同時に使用される。標準は、ＦＬＣについて２０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは１５ｍｇ／Ｌ未満、約１０ｍｇ／Ｌ未満、またはアッセイがより低い濃度の遊離軽鎖を検出できるように、５ｍｇ／Ｌ未満の、１つ以上の標準を含みうる。
【００５０】
アッセイキットは、比ろう法または比濁法キットでありうる。それは、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、蛍光、化学発光もしくはビーズタイプアッセイまたはディップスティックでありうる。一般に、そのようなアッセイは当該技術分野において公知である。
【００５１】
アッセイキットはまた、本発明の方法で使用される取扱説明書を含みうる。取扱説明書は、正常値であると考えられている総遊離軽鎖の濃度の指標を含み、例えば、それ未満または実際にはそれを超えると、個人の生存の確率の増加または減少のどちらか、またはがんが存在する可能性の増加の指標を示しうる。そのような濃度は、上記で定義された通りでありうる。
【００５２】
本発明を、実施例を単なる例示として、以下の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、その総ＦＬＣ濃度を基にして五分位に分けられた試験集団についての生存の確率を示す。五分位レベルは、＜３３．３、３３．４〜４７．３、４７．４〜７６．８、６７．９〜１０６．３および＞１０６．５ｍｇ／Ｌである。
【図２】図２は、混合した抗λおよび抗κ遊離軽鎖抗体を使用する総ＦＬＣアッセイキットと比較しての、市販の別々の抗遊離κおよび抗遊離λアッセイキットを使用して得られた総ＦＬＣ濃度の比較である。
【実施例】
【００５４】
腫瘍予後診断
背景
がんによる死亡は、依然として一般的な死因である。早期診断および早期治療は、患者予後を飛躍的に改善することができ、正確なスクリーニングテストの継続的な開発は非常に重要になっている。幾つかのがんは、炎症誘発性の特質を有し、高い血清、免疫グロブリン、遊離軽鎖濃度は、それら腫瘍のうちの１つの有無または進行中の発症についての有用な標識であるかもしれないと仮定されていた。考慮された具体的ながんは、炎症に大きく関連するもの（肺、結腸直腸、小腸、食道、膵臓；ＬＣＢＯＰ）であった。
【００５５】
方法
さまざまな程度の腎機能障害をもつ１３００人の患者から、血清試料を採集し（「基準」）、その後、最長６３カ月の期間にわたって追跡調査した。
【００５６】
より詳細には、患者は、バーミンガム大学病院の腎臓クリニックから募った。患者は、例えば蛋白尿、血尿、慢性腎臓疾患（すべての病期）、末期腎不全（血液透析および腹膜透析）および腎移植レシピエントを含む、腎臓にさまざまな問題を有した。
【００５７】
行われたテストおよび評価は以下の通り：
血清クレアチニンおよび推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）
単位ＧＦＲ当たりＦＬＣの修正レベルは次のように計算した：総血清ＦＬＣ濃度 （ｍｇ／Ｌ）をコッククロフト・ゴールト式（ＲＥＦ）によりｍｌｓ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２で計算した推定糸球体濾過率で除した。このようにして、腎機能に依存しない単位ＧＦＲ当たりｍｇ／Ｌでの、患者の血清総ＦＬＣレベルを得た。
参照文献：Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ ＤＷ，Ｇａｕｌｔ ＭＨ：血清クレアチニンからのクレアチニンクリアランスの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ） Ｎｅｐｈｒｏｎ
１６：３１‐４１、１９７６年
【００５８】
尿アルブミン／クレアチニン比率
これらは、当該技術分野において標準的なテストである。
【００５９】
カッパおよびラムダの両方の血清ＦＬＣ濃度（フリーライト、バインディングサイトリミテッド社、バーミンガム、英国）
総血清ＦＬＣ濃度は、カッパＦＬＣおよびラムダＦＬＣの値を合計することによって計算した。
【００６０】
追跡調査：
患者を、死亡するまでの期間および死因について追跡調査した。
【００６１】
結果
患者生存のカプランマイヤー分析は、より高いＦＬＣレベルをもつ患者は、減少した生存を示した（Ｐ＜０．００１）。
【００６２】
生存率を図１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
血清総ＦＬＣを腎機能と独立して評価したとき、単位ＧＦＲ当たり＞１．７ｍｇ／ＬのＦＬＣのレベルは、著しくより短い生存を有した。（Ｐ＜０．０００１）。
【００６５】
【表２】
【００６６】
中央値（単位ＧＦＲ当たり１．７ｍｇ／Ｌ）を超える修正ＦＬＣレベルをもつ個人は、生存が著しくより短いことを有した。
【００６７】
死因を調査したとき、がんに続く死亡の可能性は、より高い総ＦＬＣ濃度をもつ患者で著しくより高かった。
【００６８】
【表３】
【００６９】
がんによる死亡の種類を特定した際、データはより強い印象を与える：
ＦＬＣ五分位１：脳腫瘍、尿路腫瘍
五分位２：結腸腫瘍、尿路腫瘍
五分位３：３×尿路腫瘍
五分位４：胸部がん、小腸腫瘍、食道がん、２×血液学的腫瘍
五分位５：肝臓、３×血液学的腫瘍、膵臓がん、食道がん、２×結腸腫瘍、２×肺腫瘍
【００７０】
したがって、より炎症誘発性である、またＢ細胞増殖と関連すると知られているがんは、より高いＦＬＣ五分位にあった。がんおよび腎機能の間に関連性は見られなかった。カプランマイヤー分析では、高いＦＬＣレベルは、がんによる死亡までのより短い期間と関連した（Ｐ＜０．０２３）。
【００７１】
総ＦＬＣレベルは、炎症誘発性がんによる死亡のリスクと明らかに関連した。
【００７２】
考察
なんらかの形の腎機能障害をもつ患者で結果を集めたが、腎機能はＬＣＢＯＰがんの進行と何ら関連性を有さないと考えられ、このことは、最も悪い腎機能をもつ人々で少しも発生率の増加がないことによって示された。これを受けて、総ＦＬＣの上昇は、論理上、一般の集団においてＬＣＢＯＰがん発生率の同様な予測となるであろう。検査（複数含む）は、低下した腎機能によるＦＬＣ濃度の背景の上昇がない一般の集団ではより感度が良いであろうと考えられる。
【００７３】
アッセイキット
本発明の方法は、以下のアッセイキットを利用しうる。アッセイキットは、患者試料内の、例えば血清中に存在する総遊離κおよび遊離λ軽鎖を定量する。これは、抗遊離κおよび抗遊離λ軽鎖ヒツジ抗体の５０：５０混合物を用いて、１００ｎｍカルボキシル修飾ラテックス粒子をコーティングすることによって達成しうる。以下に例示されたアッセイでは、総遊離軽鎖に関する測定範囲は、１〜８０ｍｇ／Ｌである。しかしながら、他の測
定範囲も同じように考慮されうる。
【００７４】
抗遊離κおよび抗遊離λ抗血清は、一般に当該技術分野において公知の技術を使用して、この場合ではヒツジで作製した。一般的な免疫化プロセスは、国際公開第９７／１７３７２号に記載されている。
【００７５】
抗κおよび抗λ抗血清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して等しい濃度まで希釈した。それら抗体を混ぜ合わせ、５０％の抗κ抗体および５０％の抗λ抗体を含む抗血清を作成した。
【００７６】
抗体を、１０ｍｇ／ｌｏｔのコーティング量（ｃｏａｔ ｌｏａｄ）でカルボキシル修飾ラテックスにコーティングした。これは、標準的な手順を使用して達成した。例えば、「微粒子試薬最適化：微粒子の専門家からの実験室参照マニュアル（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｎｕａｌ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｏｎ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」編者 Ｃａｒｙｌ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｊｉｍ Ｓｕｔｏｒ、Ｂｒｕｃｅ Ｓｈｕｌｌ、著作権 Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ、１９９４年（Ｐ／Ｎ０３４７８３５（１２９４）を参照されたい。
【００７７】
この参照文献はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用したアッセイキットの詳細も提供する。
【００７８】
混合した抗体を市販のκおよびλフリーライト（商標）キット（英国バーミンガム、バインディングサイトグループリミテッド（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）社から入手）を使用して得られた結果と比較した。そのようなフリーライト（商標）キットは、κ遊離軽鎖の量およびλ遊離軽鎖の量を、別々のアッセイにて特定する。総ＦＬＣキットを使用して曲線を作成し、対照濃度を使用して確認した。校正曲線は、１〜８０ｍｇ／Ｌの間の総遊離軽鎖について得ることができた。下記の結果の表において、κフリーライト（商標）、λフリーライト（商標）および総遊離軽鎖アッセイを使用して、κ遊離軽鎖（κＦＬＣ）、λ遊離軽鎖（λＦＬＣ）および総ＦＬＣについて結果を得た。これらの結果を１５の異なる正常血清試料について示す。比濁法により測定した結果を下表および図２に示す。
【００７９】
予備結果は、抗κおよび抗λ遊離軽鎖抗体に基づく総遊離軽鎖アッセイを使用する原理は実行可能であることを示す。
【００８０】
結果
【００８１】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のより大きなリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少、ならびに／または診断未確定の癌を有する対象および／もしくはがん発症のリスクが増加した対象のリスクの増加と関連する、方法。
【請求項２】
前記がんが、炎症誘発性がんであり、好ましくは、肺、結腸直腸、小腸、食道または膵臓（ＬＣＢＯＰ）がんである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遊離軽鎖の量が、前記試料における総遊離軽鎖の量である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＬＣが、前記対象の血清の試料において測定される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記総ＦＬＣが、抗遊離軽鎖抗体を使用する免疫アッセイにより測定される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、抗遊離κ軽鎖および抗遊離λ軽鎖抗体の混合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＬＣの量を比ろう法または比濁法によって検出することを含む、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、以前にがんを有すると診断されたことがない、および／またはＢ細胞関連疾患の症状を有しない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記方法において使用される取扱説明書を追加として含む、請求項１〜８に記載の前記方法に使用するためのアッセイキット。
【請求項１０】
前記アッセイキットを使用して得たＦＬＣの濃度が対象の生存の増加を示す正常値を追加として含む、請求項９に記載のアッセイキット。
【請求項１１】
１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗がん抗原抗体を含む、請求項１〜８に記載の方法に使用するためのアッセイキットまたは、請求項９もしくは１０に記載のアッセイキット。
【請求項１】
診断未確定のがん罹患のより大きなリスクを有する対象を特定し、および／またはがん発症のより大きなリスクがある対象を特定する、がんをもつ対象の予後診断の方法であって、対象からの試料における遊離軽鎖（ＦＬＣ）の量を検出することを含む方法であって、ＦＬＣのより高い量が、がんに起因する生存の減少、ならびに／または診断未確定の癌を有する対象および／もしくはがん発症のリスクが増加した対象のリスクの増加と関連する、方法。
【請求項２】
前記がんが、炎症誘発性がんであり、好ましくは、肺、結腸直腸、小腸、食道または膵臓（ＬＣＢＯＰ）がんである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遊離軽鎖の量が、前記試料における総遊離軽鎖の量である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＬＣが、前記対象の血清の試料において測定される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記総ＦＬＣが、抗遊離軽鎖抗体を使用する免疫アッセイにより測定される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、抗遊離κ軽鎖および抗遊離λ軽鎖抗体の混合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＬＣの量を比ろう法または比濁法によって検出することを含む、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、以前にがんを有すると診断されたことがない、および／またはＢ細胞関連疾患の症状を有しない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記方法において使用される取扱説明書を追加として含む、請求項１〜８に記載の前記方法に使用するためのアッセイキット。
【請求項１０】
前記アッセイキットを使用して得たＦＬＣの濃度が対象の生存の増加を示す正常値を追加として含む、請求項９に記載のアッセイキット。
【請求項１１】
１つ以上の抗ＦＬＣ抗体および１つ以上の抗がん抗原抗体を含む、請求項１〜８に記載の方法に使用するためのアッセイキットまたは、請求項９もしくは１０に記載のアッセイキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５１９０８２（Ｐ２０１３−５１９０８２Ａ）
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１６８７（Ｐ２０１２−５５１６８７）
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０５０１９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９５８１８
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５１０１８４４４９）ザ バインディング サイト グループ リミテッド (6)
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０５０１９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９５８１８
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５１０１８４４４９）ザ バインディング サイト グループ リミテッド (6)
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