がん検出のための多因子アッセイ
卵巣がんを検出するための方法を提供する。本方法は、患者の血液試料中のＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上のマーカーのレベルを検出するために多重イムノアッセイを使用し、この際、異常なレベルの２種またはそれ以上のマーカーの存在が、患者における卵巣がんの存在を示す。また、患者の血液中でのこれらのマーカーのレベルを定量するためのアレイならびに臨床卵巣がんの発症を予測する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがんを迅速に初期検出するための多因子アッセイのための方法および試薬である。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは、女性生殖路の３番目に多いがんである。多くの初期段階のがんは、無症候性であり、診断の４分の３を超える分は、疾患が局所または遠隔の転移をすでに確立している時点で下されている。攻撃的な細胞減少の（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）外科手術および白金ベースの化学療法にもかかわらず、臨床的に進行した卵巣がんを患う患者の５年生存率は、１５から２０パーセントにすぎないが、Ｉ期疾患での治癒率は通常、９０パーセントを上回る（Ｈｏｌｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｂｅｒｅｋ，Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，２０００．１９（１）：ｐ．３−１０）。これらの統計により、卵巣がんスクリーニングおよび初期同定を改善するための基本的な理論的根拠が得られる。
【０００３】
有効な初期検出方法が存在しないために、上皮性卵巣がんは、一部では致命的である。初期に検出されれば、生存率は劇的に上昇する。現在の研究では、女性、特に、卵巣がんを発症するリスクの高い女性を検査するための改善された方法を開発することに焦点が当てられている。しかしながら今のところ、前がん病巣は同定されていない。卵巣がんの相当部分において、いくつかの遺伝子、例えば、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２、ｃ−ｍｙｃおよびｐ５３の変化が同定されているが、これらの突然変異のいずれも、悪性度を提示しないし、一定期間にわたる腫瘍活動の前兆ともならない（Ｖｅｉｋｋｏｌａ，Ｔ．ら，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（２）：ｐ．２０３−１２；Ｂｅｒｅｋ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９１．１６４（４）：ｐ．１０３８−４２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １０４２−３；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００２．８（１０）：ｐ．３１９３−７；およびＤｉＢｌａｓｉｏ，Ａ．Ｍ．ら，Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９５．５３（１−６）：ｐ．３７５−９）。
【０００４】
むしろ、高いリスクを有する女性は、遺伝上の相談および遺伝試験に、さらに血清ＣＡ−１２５レベルの測定および経膣超音波測定に頼らざるを得ない（Ｏｅｈｌｅｒ，Ｍ．Ｋ．および Ｈ．Ｃａｆｆｉｅｒ，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．２０（６Ｄ）：ｐ．５１０９−１２；Ｓａｎｔｉｎ，Ａ．Ｄ，ら，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ
ｖｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１９９９．２０（３）：ｐ．１７７−８１；ならびにＳｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら，Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌ
ｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３．２１９（４５８７）：ｐ．９８３−５）。
【０００５】
しかしながら、ＣＡ−１２５は、初期段階の疾患を検出するための感受性もないし、特異性もない。これは、現在では一般的なスクリーニングのためには推奨されていない。ＣＡ−１２５は、疾患の応答または進行を監視する際に確実であると考えられるにすぎず、診断または予後のマーカーとしては考えられない（Ｇａｄｄｕｃｃｉ，Ａ．ら，Ｓｅｒｕｍ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．１９（２Ｂ）：ｐ．１４０１−５）。
【０００６】
経膣の超音波、ドップラーおよび形態学上の指標を使用してのスクリーニングは、多少は励みになる結果を示しているが、単独で使用すると、これは現在、一般的集団についてのスクリーニング試験で必要とされる特異性を欠いている（Ｋａｒａｙｉａｎｎａｋｉｓ，Ａ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ
ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００２．１３１（５）：ｐ．５４８−５５およびＪ．Ｋ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎ？Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２０００．１７（１）：ｐ．１４９−５２）。
【０００７】
腫瘍マーカーおよび超音波を組み合わせて利用する複合的スクリーニングは、より高い感度および特異性をもたらす。さらに、この組み合わせ手法は、最も費用的に効果のある有望なスクリーニングストラテジーである（ｋａｒａｙｉａｎｎａｋｉｓ ら，２００２
ａｎｄ Ｌｅｅ ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２０００）。しかしながら、これも、一般的集団においては有効性に問題がある。したがって、疾患を早期に検出するためのさらなるマーカーを開発する切実な必要性が存在する。
【０００８】
最近、固相タンパク質クロマトグラフィーと質量分析測定法とを組み合わせている表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析測定法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と称される新規の技術（Ｉｓｓａｑ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｔｈｅ ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００２．２９２（３）：ｐ．５８７−９２）に解説されている）が、卵巣がんにおけるバイオマーカーを発見するための新規手法として利用されている。
【０００９】
卵巣がん患者に関する、最近公表のランドマーク的研究では、卵巣がん進行についてのタンパク質プロファイリングするために、この新規技術が使用されている（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ，２００２．３５９（９３０６）：ｐ．５７２−７）。
【００１０】
この手法により、ＣＡ−１２５での３４％に比較して、９４％という陽性予測の値を有
する血清タンパク質プロファイルを識別することができた。しかしながら、この値は高いが、スクリーニングされるであろう集団での卵巣がんの発生率が低いことから、多数の擬陽性の発生を回避するためには、陽性を予測する値はほぼ１００％でなければならない。したがって、卵巣がんに関して有効な一般的集団をスクリーニングするために、この手法を利用する際に必要とされる特異性および確実性を必要とされる高レベルにするためには、さらに追加のマーカーが必要である。加えて、この手法は極めて費用がかかり、高リスク集団にしか適用することができないであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
卵巣がん細胞は様々な血管由来因子を産生し、様々なサイトカインの分泌を刺激するために、これらをバイオマーカーとして使用することができることは、よく知られている。しかしながら、これらの因子は個別には、初期段階の本疾患とは僅かしか関係していなかった。個々の患者の血清中にある複数の血管由来因子およびサイトカインを含む項目群を評価することにより、初期段階の卵巣がんを診断するために充分な特異性および感度が得られるであろうと仮定された。がん患者の血清マーカーに関する以前の試験はすべて、ＥＬＩＳＡを使用して行われたが、これは、極めてコストがかかり、しかも個々のサイトカイン各々について別々のキットを必要とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
卵巣がんを迅速に早期検出するための方法を提供する。この方法により、血管由来因子を含む幅広い項目群を同時に検査する機会、ならびに、例えば限定するものではないが、１時点について血清または血漿５０μｌのみを使用する複数時点でのこのような試験の反復が提供される。
[発明の説明]
患者における卵巣がんの存在をアッセイする方法を提供する。さらに、患者における卵巣がんの存在または成行きを予測する方法を提供する。この方法は、患者における卵巣がんの存在を決定するための方法を含み、これは、ＥＧＦ（上皮成長因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ−６（インターロイキン６、本明細書で使用する場合、「ＩＬ」を「インターロイキン」という）、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５（がん抗原１２５）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＭＣＰ−１（単球化学誘因物質タンパク質−１）、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン（anti-osteopontin）、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上を含む血液マーカーパネルで、患者の血液試料中のマーカーレベルを検出することを含み、この場合、次の状態：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOのうちの２つまたはそれ以上の存在が、患者における卵巣がんの存在を示している。
【００１３】
パネルの例は、これに限られないが：ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、ＦａｓＬ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；ＣＥＡ、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；サイトケラチ
ン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２；ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１；抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ；および抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦ；および抗ｂＨＣＧを含む。
【００１４】
さらに本方法は、線形回帰分析、判別ツリー分析およびヒューリスティックなナイーブベイズ（ｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓ）分析などの統計的方法を適用することにより、患者血液での２種またはそれ以上のマーカーレベルと１種または複数の対照試料での同じマーカーのレベルとを比較することをさらに含む。統計的方法は、コンピュータープロセスにより、例えば、市販の統計解析ソフトウェアにより行うことができるし、通常は行う。一つの実施態様における統計的方法は、判別ツリー分析、例えば、ＣＡＲＴ（Ｃ＆ＲＴ、判別および回帰ツリー）である。
【００１５】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上に特異的な結合試薬タイプ類を含むアレイであり、その場合、各結合試薬タイプが独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面上に位置する１個または複数の別々の位置に結合しているアレイも提供する。その支持体は、識別可能なマーカーを有するビーズであってもよく、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬が結合しているビーズとは異なる、識別可能なマーカーを有するビーズに結合している。識別可能なマーカーは、蛍光化合物または量子ドットを含んでもよい。
【００１６】
他の実施形態では、患者における卵巣がんの存在を決定する方法を提供するが、この方法は、患者の血液試料での抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＩＬ−８、抗オステオポンチン、抗ＶＥＧＦおよび抗ＰＤＧＦのうちの少なくとも１種のレベルを決定することを含み、その際、次の状態：抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗ＩＬ−８HI、抗オステオポンチンHI、抗ＶＥＧＦHI、抗Ａｋｔ１および抗ＰＤＧＦHIのうちの１種または複数の存在が、患者における卵巣がんの存在を示している。
【００１７】
別の実施形態では、臨床的に卵巣がんの発症を予測するための方法を提供し、この方法は、患者の血液における、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上の濃度変化を２つまたはそれ以上の時点で測定することを含む。その場合、２つの時点間での患者血液中の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度の上昇ならびに２つの時点間での患者の血液中のＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの濃度低下は、臨床的卵巣がんの発症を予測している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本出願に記載されている種々の範囲での数値の使用は、特に他に指示のない限り、記載の範囲内の最小値および最大値の両方の前に「約」との用語があるように、近似値として記載されている。この場合、記載された範囲を上回るか下回る若干の変動を用いて、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成することができる。したがって、これらの範囲の開示は
、最小値と最大値との間のすべての値を含む連続的な範囲を意図している。
【００１９】
本明細書は、卵巣悪性度を初期に迅速に同定するための多因子アッセイを提供する。卵巣がんの検出で使用可能な血液サイトカイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびがん抗原マーカーを次に同定する。サイトカインマーカーには、卵巣がんに罹る患者の血中で異常に発現されるＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１が含まれる。ＥＧＦおよびＭＣＰ−１は、対照のヒト個々と比較して、卵巣がんを患う患者では発現不足である一方で、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＶＥＧＦは、これらの患者で過剰発現される。このように、２種類またはそれ以上、典型的には３種または４種の次のパラメーター：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHIおよびＭＣＰ−１LOを示す患者は、卵巣がんを有するとの極めて高い可能性が存在する。
【００２０】
さらに、卵巣がんを伴う患者の血中に異常なレベルで存在する、あるＩｇ種が特定される。これらのマーカーには、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＭＵＣ−１、スルビビン、ｂＨＣＧ、オステオポンチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ａｋｔ１、サイトケラチン１９およびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）に対する抗体が挙げられる。このように、２種類またはそれ以上、通常は３種または４種の次のパラメーター：抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHIを示す患者は卵巣がんを有するとの極めて高い可能性が存在する。
【００２１】
さらに、卵巣がんを伴う患者の血中に異常に高レベルで存在する、あるがん抗原を同定する。これらのマーカーには、ＣＡ−１２５、ＦａｓＬ、ＣＥＡおよびサイトケラチン１９が含まれる。他のがん抗原は、卵巣がん患者では異常に低いレベルで存在し、これにはＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｍ−ＣＳＦ、カリクレイン８およびＥＧＦＲが含まれる。このように、２種類またはそれ以上、通常は３種または４種の次の状態：ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LOおよびＭ−ＣＳＦLOを示す患者が卵巣がんを有するとの極めて高い可能性が存在する。
【００２２】
前記の３つの群それぞれに由来する血液マーカーを含むパネルは、患者が卵巣がんに罹っているかどうかを同定する際に役立つ。ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上、通常は３種または４種から選択されるパネルは、正常／良性患者と卵巣がん患者とを区別する際に役立つ。正常／良性患者と卵巣がん患者とを区別する場合のその有用性により、いくつかのマーカーを初めに記載する。これらの新規の卵巣がんマーカーには、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＩＬ−８、抗ＶＥＧＦ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ−ＡＡ（血小板由来成長因子ＡＡホモダイマー）および抗Ａｋｔ１が挙げられる。
【００２３】
パラメーターである、ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＣＡ−１２５HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗ＰＤＧＦHI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LOおよびＭ−ＣＳＦLOは、これらのマーカーについて正常または対照の血液（血清または血漿）レベルと卵巣がんを患う患者における血液レベルとを統
計的に比較することにより決定される。下記に示される統計データは、患者における前記マーカーについて、一定のLOまたはHIパラメーターを規定するためのある値を同定している。LOまたはHI値の推定値について限定を意味しない例として、実施例１のデータを参照すると、ＥＧＦLOは、ＥＧＦが約２２４ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味し、Ｇ−ＣＳＦHIは、Ｇ−ＣＳＦが約２２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−６HIは、ＩＬ−６が約８．８ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−８HIは、ＩＬ−８が約１０．２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＣＡ−１２５HIは、ＣＡ−１２５が約１０ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＶＥＧＦHIは、ＶＥＧＦが約９１ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、あるいはＭＣＰ−１LOは、ＭＣＰ−１が約３４２ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味する。
【００２４】
次のものに限られないが、ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＣＡ−１２５HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗ＰＤＧＦHI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLOおよびＨｅｒ２／ｎｅｕLOを含む、本明細書で同定される他のマーカーに関するLOまたはHI値の同定は、本明細書に示されているグラフ、本明細書に示されているデータを参照することにより、および／または本明細書に記載されている統計的方法を使用することにより決定することができる。これらはすべて、本明細書に記載されているデータに基づき、生物統計学の分野における通常の専門家の能力による範囲内である。
【００２５】
これらのLOまたはHI値は近似値であり、統計的に由来することを理解されたい。各因子の相対的なレベルを検出し、LOまたはHIについての臨界値を規定する他の統計方法を使用する場合には、これらの近似値をやや上回るか、下回る値、通常は１標準偏差の範囲内の値を、LOまたはHI状態と正常とを区別するための統計的に有意な値と見なすこともありうる。この理由で、「約」との用語が記載の値とともに使用されている。「統計的判別方法」を使用して、正常な患者および良性増殖を伴う患者と卵巣がん患者とを区別し得るマーカーを同定し、そうした患者を区別するための各マーカーについての血中臨界値を決定する。そのために３種の特別な統計方法を使用して、判別するマーカーおよびそのパネルを同定する。これらの統計方法には：１）下記の実施例１に同定されているような線形回帰；２）下記の実施例４で同定されているような判別ツリー方法（下記の実施例で使用されるＣＡＲＴとともに、ＣＨＡＩＤおよびＱＵＥＳＴが、判別ツリープログラムである）；および３）下記の実施例７に記載されているような、マスキングされたクラス標識を予測するためのアルゴリズムの不偏性能を最適化する統計装置知能が含まれる。これらの統計方法はそれぞれ、生物統計分野の通常の専門家にはよく知られており、コンピューターでのプロセスとして行うことができる。統計方法を実行するために、次だけに限られないが、Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）から市販されているＳ−ＰＬＵＳ（登録商標）などの数多くのソフトウェア製品を市場で購入することができる。
【００２６】
卵巣がん患者に存在するマーカーおよびどのマーカーおよびどのマーカー群が卵巣がん患者を同定する場合に役立つかを同定ことにより、当技術分野の専門家であれば、本明細書の開示に基づき、優れた選択性および感度をもたらすパネルを同定することができる。優れた判別能力を与えるパネルの例には、これらに限られないが：ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；ＣＥＡ、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆａｓ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、Ｅ
ｒｂＢ２；ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１；抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ；ならびに抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦ；および抗ｂＨＣＧなどのパネルが挙げられる。生物統計分野の通常の専門家であれば、特定のパネルにあるマーカー数は、マーカーの組み合わせに応じて、異なってよいことを理解するであろう。特異性と同様に最適な感度が到達目標であるので、一つのパネルが２種のマーカーを有してもよいが、他のパネルが８種のマーカーを有してもよく、両方とも、同様の結果をもたらす。
【００２７】
「結合試薬」なる用語および類似の用語は、別の化合物または分子（免疫認識の場合にはエピトープである。）に特異的に、または実質上特異的に（即ち、限られた交差感受性を伴う）結合しうる化合物、組成物または分子をいう。「結合試薬タイプ」とは、単一の特異性を有する１つの結合試薬またはその集団である。結合試薬は通常、抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはその誘導体または類似体であり、さらに、次のものに限られないが、：Ｆｖ断片；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片；Ｆａｂ’断片；Ｆ（ａｂ’）２断片；ヒト化抗体および抗体断片；ラクダ化抗体および抗体断片；および前記の多価の別形態が含まれる。多価結合試薬を適切に使用することもでき、以下に限られないが、単一特異性または二特異性の抗体、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）2断片）、通常、共有結合されているか、その他により安定化された（即ち、
ロイシンジッパーまたはへリックス安定化されている）ｓｃＦｖ断片であるジアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）またはテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。さらに「結合試薬」には、当技術分野で記載されているようなアプタマーが含まれる。
【００２８】
抗体ならびにその誘導体および類似体ならびにアプタマーを含む抗原特異的結合試薬を製造する方法は、当技術分野でよく知られている。動物の免疫化によりポリクローナル抗体を生じさせることができる。標準的な（ハイブリドーマ）方法論に従い、モノクローナル抗体を調製することができる。標準的な方法に従い、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡからＤＮＡ断片を単離し、適切なＶ領域を適切な発現ベクター中でサブクローニングすることにより、ヒト化抗体を含む抗体誘導体および類似体を組換えにより調製することができる。ファージディスプレイおよびアプタマー技術は、文献に記載されており、これらにより、極めて親和性の低い交叉感受性を有する抗原特異的結合試薬のｉｎ ｖｉｔｒｏクローン増幅が可能である。ファージディスプレイの試薬およびシステムは市販されており、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から市販されているＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＰＡＳ）およびＭｏＢｉＴｅｃ ＬＬＣ
（Ｍａｒｃｏ Ｉｓｌａｎｄ、Ｆｌｏｒｉｄａ）から市販されているｐＳＫＡＮ Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍが例示される。アプタマー技術は、例えば、これらに限られないが、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，８４０，８６７号および同第６，５４４，７７６号の明細書に記載されている。
【００２９】
下記のＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰイムノアッセイは、サンドイッチ型アッセイの例である。用語「サンドイッチ型アッセイ」とは、抗原が２つの結合試薬（通常は抗体である）の間にサンドイッチされるイムノアッセイに関する。第１の結合試薬／抗体は表面に結合し、第２の結合試薬／抗体は検出可能な基を含む。検出可能な基の例には例えば、これらに限られないが：蛍光色素、酵素、第２の結合試薬と結合するためのエピトープ（例えば、第２の結合試薬／抗体がマウス抗体である場合には、それは蛍光標識された抗マウス抗体により検出される）、例えば、抗原または結合の対の片割れ、例えばビオチンが挙げられる。その表面は、例えば本明細書に記載されているように、通常の格子型アレイ（例えば、これらに限られないが９６ウェルプレートおよび平面マイクロ
アレイ）の場合には、平面表面であってよいか、あるいはコーティングされているビーズアレイ技術を伴う非平面表面であり、この際、ビーズの各々の「種」は、例えば、蛍光色素（本明細書ならびに米国特許第６，５９９，３３１号、同第６，５９２，８２２号および同第６，２６８，２２２号の明細書に記載のＬｕｍｉｎｅｘ技術など）または量子ドット技術（例えば、米国特許第６，３０６，６１０号明細書に記載されている）で標識されている。
【００３０】
下記の実施例に記載されているビーズ型イムノアッセイでは、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰシステムを使用している。ＬａｂＭＡＰシステムは、スペクトル的に区別される２種の蛍光色素で内部を染色されているポリスチレン微小球を導入している。これらの蛍光色素の正確な比を使用して、特異的なスペクトルアドレスを有する１００種の異なる微小球セットからなるアレイを作製する。各微小球セットは、その表面に異なる反応成分を有することができる。微小球セットは、そのスペクトルアドレスにより区別することができるので、これらを組み合わせると、１００種までの異なる分析物（analytes）を、単一の反応器中で同時に測定することができる。リポーター分子に結合した第３の蛍光色素により、微小球表面で生じた生体分子相互作用を定量する。微小球がＬｕｍｉｎｅｘ分析器を通過するときに、急速に流れている流体の流れの中で２種の別々のレーザーにより個別に調べる。高速デジタル信号プロセッシングにより、微小球をそのスペクトルアドレスに基づいて類別し、１試料当たり数秒で、表面の反応を定量する。
【００３１】
本明細書に記載されるアッセイでは、ビーズ型イムノアッセイが、いくつかの理由により好ましい。ＥＬＩＳＡと比較して、コストおよび処理量が格段に優れている。典型的な平面抗体マイクロアレイ技術（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から市販されているＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙアレイなど）と比較すると、定量目的に関して、ビーズは格段に優れている。それというのも、ビーズ技術は、もともと再現性、コストおよびテクニシャンの時間において困難を伴う血漿または血清の試料の前処理または分取を必要としないためである。この理由から、これらに限られないがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび抗体マイクロアレイ技術といった他のイムノアッセイも、本発明の状況下で使用することができるが、これらは好まれない。本明細書で使用する場合、「イムノアッセイ」とは、所望の血液マーカー、即ち、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの１種を検出および定量することができる免疫アッセイ、通常は、専らではないがサンドイッチアッセイを言及している。
【００３２】
マーカー：ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種、３種または４種もしくはそれ以上の血中レベルを決定するためのアッセイから生じたデータを使用して、患者での卵巣がんの可能性を決定することができる。
【００３３】
本明細書に示すように、次の条件：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビン
HI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOのうちの２種またはそれ以上、通常は３種または４種が患者の血液に当てはまる場合、患者が卵巣がんを有する極めて高い可能性が存在する。１つの実施形態では、次の条件：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOの内の３種またはそれ以上、好ましくは３種または４種が、患者の血液に当てはまる場合には、患者が卵巣がんを有する非常に高い可能性が存在する。
【００３４】
本発明の開示の関係において、「血液」には、本明細書に記載の方法に従い分析することができるすべての血液フラクション、例えば、血清が含まれる。血清は、試験することができる標準的な血液フラクションであり、下記の実施例で試験される。ある特定マーカーの血液レベルを測定するとは、適切ないずれの血液フラクションを、血液レベルを測定するために検査することができ、さらに、データをそのフラクションに存在する値として報告することができることを意味している。限定的に解されてはならないが例えば、あるマーカーの血液レベルを、５０ｐｇ／血清ｍＬとして記載することができる。
【００３５】
前記のように、特定の同定された血液マーカーのレベルを決定することにより卵巣がんを診断する方法を提供する。さらに、前臨床的卵巣がんを検出する方法を提供するが、これは、患者の血液において特定の同定されたマーカーの存在および／またはベロシティ（ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を決定することを含む。ベロシティとは、一定期間にわたる患者血液中でのマーカーの濃度変化を意味している。実施例７では、臨床的卵巣がんの発症を予測する際に、患者の血中特異的マーカーのベロシティを決定する値が、ある期間にわたるデータとして与えられる。前臨床的卵巣がんを示す明白なベロシティを有するマーカーには：卵巣がんの臨床的発症の３０〜４０ヶ月前に濃度が上昇し始める抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０、ならびに卵巣がんの臨床的発症の３０〜４０ヶ月前に濃度が低下し始めるＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
[実施例]
【実施例１】
【００３６】
患者集団
初期（Ｉ〜ＩＩ）段階の卵巣がんと診断されている患者５５人、良性骨盤内腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｐｅｌｖｉｃ ｍａｓｓｅｓ）を有する患者５５人および適合年齢をマッチさせた健康な対照５５人からの血清試料を試験した。初期（Ｉ〜ＩＩ）段階の卵巣がんを有する患者および良性骨盤内疾患を有する女性からの血清試料は、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＧＯＧ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）から得た。ＩＲＢプロトコルのもとに、全参加者から同意および血液検体を得た。婦人科上の診断および卵巣がんの段階付けを検証するため、臨床腫瘍学の専門家がチャートを検討した。組織学および段階を検証するため、病理学者が卵巣がん症例についての病理スライドを調査した。上皮卵巣がんおよび良性骨盤内症状の主要タイプのすべてが提示された。表Ａに患者のデータをまとめた。適合年齢をマッチさせた健康な女性からの対照血清試料は、ＩＲＢプロトコルに従い、Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ Ｃｏｕｔｙ Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｅｔｗｏｒｋから得た。
【００３７】
【表１】
【００３８】
血液試料の収集および貯蔵
標準化された静脈切開手順により、末梢血液１０ｍＬを被験者から採取した。抗凝血剤を用いずに、血液試料を２本の５ｍＬレッドトップ・バキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に集め、遠心分離により血清を分離し、すべての試料を直ちに凍結させ、−８０℃の専用冷凍庫に貯蔵した。すべての血液試料を、貯蔵日時、凍結／解凍サイクルおよび分類などの情報を探せるように研究用コンピューターに記録した。
【００３９】
ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）から購入した多重化キットを使用して、製造者のプロトコルに従い多重分析を行った。これらのキットについて最少サイトカイン検出レベルは、＜５ｐｇ／ｍＬである。次の２９種のサイトカイン、血管由来因子、死因子および成長因子を多重フォーマットで解析した：ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）、ＩＦＮγ（インターフェロンγ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５またはＭＣＰ２としても知られている、Ｒｅｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ Ｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質−１α）、ＭＩＰ−１β（マクロファージ炎症性タンパク質−１β）、ＭＣＰ−１、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）、ＦａｓＬ（Ｆａｓリガンド）、スルビビンおよびＣＡ−１２５。
【００４０】
９６ウェルマイクロプレート様式でアッセイを行った。底部フィルター（ｆｉｌｔｅｒ−ｂｏｔｔｏｍ）９６ウェルマイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）をＰＢＳ／ＢＳ
Ａで１０分間ブロックした。標準曲線を生じさせるために、製造者から得た適切な「標準」の段階的希釈を血清希釈剤中で調製した。「標準」および患者血清を二連で、５０μｌ／ウェルとなるようにピペットにより導入し、ビーズ混合物５０μｌと混合した。マイクロプレートをマイクロタイター・シェーカー上、室温で１時間インキュベーションした。次いで、真空マニホールドを使用して、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＥ結合二次抗体を適切なウェルに加え、暗所で継続的に振盪しながら４５分間インキュベーションした。ウェルを２回洗浄し、アッセイ緩衝液を各ウェルに加え、蛍光リーダーおよびＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ分析用ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含むＢｉｏ−Ｐｌｅｘサスペンジョンアレイ・システムを使用して、試料を分析した。５パラメーター曲線フィッティングを使用して、データ解析を行った。
【００４１】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの開発
ＣＡ−１２５を除くすべてのアナライトについては、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から、ＣＡ−１２５についてはＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）から購入した抗体ペアを使用して、多重化アッセイ系のためのＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＣＡ１２５試薬を開発した（表Ｂ）。
捕捉抗体はモノクローナル抗体であり、検出抗体はポリクローナル抗体であった。捕捉抗体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ）から購入したカルボキシル化ポリスチレン微小球第７４番に共有結合により結合させた。捕捉抗体と微小球との共有結合の形成は、Ｌｕｍｉｎｅｘにより推奨された手順に従って行った。要するに、微小球ストック溶液を、超音波浴（Ｓｏｎｉｃｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｐｉａｑｕｅ，Ｎ．Ｙ．）中で２分間分散させた。２．５×１０6微小球のアリコート
を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）（リン酸緩衝液）を含むマイクロタイター管中で再懸濁させて、最終容量８０μｌにした。微小球の均一な分布が観察されるまで、この懸濁液を超音波処理した。Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を両方とも５０ｍｇ／ｍＬで、リン酸緩衝液中で調製し、続いて、各溶液１０μｌを加えて、反応を安定化させ、微小球を活性化した。この懸濁液を室温で１０分間インキュベーションし、抗体５０μｇを含有するＰＢＳ２５０μｌに再懸濁させた。
【００４２】
混合物を暗所で継続的に振盪しながら一晩インキュベーションした。次いで、微小球をＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０、２５０μｌとともに４時間インキュベーションした。吸引した後に、ビーズをＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．１％アジ化ナトリウム、１ｍＬでブロックした。血球計算盤を用いて微小球を数え、１ｍＬ当たり微小球１０6個の最終濃度で
暗所中、４℃で貯蔵した。微小球２０００個をＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色することにより、モノクローナル抗体の結合効率を検証した。ＥＺ−ＬｉｎｋスルホＮＨＳ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、製造者プロトコルに従い、検出抗体Ａｂをビオチン化した。ＨＡＢＡアッセイを使用して、ビオチン導入の程度を測定したところ、タンパク質１モル当たりビオチン２０モルであった。検出抗体の濃度およびインキュベーション時間に関して、アッセイをさらに最適化した。新たに開発されたアッセイの感度を、連続希釈された精製タンパク質を使用して決定した。変動係数として表されるイントラアッセイ変動性を、患者１０人の試料についての平均をもとに算出し、２つの異なる時点で２回測定した。平均変動係数として表される重複測定の範囲内でのイントラアッセイ変動性は、８．５％であった（データは示さない）。各標準および試料１０個の４重のセット（quadruplicates）測定を試験することにより、インターアッセイ変動性を評価したところ、１０から２２％であり、平均は１６．５％であった（データは示さない）。新た
に開発されたキットを、一緒に多重化し、Ｌｕｍｉｎｅｘプロトコルに従い、交叉感受性が存在しないことを確認した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
加えて、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）から購入した抗体ペアを使用して、多重系のためのＣＡ−１２５試薬を開発した。捕捉抗体は、モノクローナルであり、検出抗体は、ヒツジポリクローナルであった。ＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造者のプロトコルに従い、捕捉抗体（Ａｂ）をビオチン化した。ＨＡＢＡアッセイを使用して、ビオチン導入の規模を測定したところ、タンパク質１モル当たりビオチン２０モルであった。捕捉抗体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ）から購入したカルボキシル化ポリスチレン微小球第７４番に共有結合させた。Ｌｕｍｉｎｅｘにより推奨された手順に従い、捕捉抗体と微小球との共有結合を行った。
【００４５】
要するに、微小球のストック溶液を、超音波浴（Ｓｏｎｉｃｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｐｉａｑｕｅ，Ｎ．Ｙ．）中で２分間分散させた。２．５×１０6微小球のアリコートを、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）
（リン酸緩衝液）を含むマイクロタイター管中で再懸濁させて、最終容量８０μｌにした。微小球の均一な分布が観察されるまで、この懸濁液を超音波処理した。Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を両方とも５０ｍｇ／ｍＬで、リン酸緩衝液中で調製し、続いて、各溶液１０μｌを加えて、反応を安定化させ、微小球を活性化した。この懸濁液を室温で１０分間インキュベーションし、抗体５０μｇを含有するＰＢＳ２５０μｌ中に再懸濁させた。この混合物を暗所で継続的に振盪しながら一晩インキュベーションした。次いで、微小球をＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０、２５０μｌとともに４時間インキュベーションした。吸引した後に、ビーズをＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．１％アジ化ナトリウム１ｍＬでブロックした。血球計算板を用いて微小球をカウントし、１ｍＬ当たり微小球１０6個の最終濃度で暗所中、４℃で貯蔵した。微小球２０
００個をＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色することにより、モノクローナル抗体の結合効率を試験した。検出抗体（Ａｂ）の濃度およびインキュベーション時間に関して、アッセイをさらに最適化した。連続希釈された精製ＣＡ−１２５を使用しＬｕｍｉｎｅｘアッセイおいて決定された、新開発のアッセイの感度は、２０ＩＵであった。変動係数として表されるイントラアッセイ変動性を、患者１０人の試料についての平均をもとに算出し、２つの異なる時点で２回測定した。平均変動係数として表される重複測定の範囲内でのイントラアッセイ変動性は、８．５％であった（データは示さない）。各標準および試料１０個の４倍重複（quadru
plicates）測定を試験することにより、インターアッセイ変動性を評価した。これらの試料の変動性は、１０から２２％であり、平均は１６．５％であった（データは示さない）。次いで、抗ＣＡ−１２５微小球を既存の多重キットと組み合わせた。
【００４６】
データの統計解析
Ｓ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェア（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｍａｔｈ Ｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，１９９９）を使用して、すべての統計解析を行った。データを初めに、トレーニングおよび試験セットにランダムに分ける；表Ｃに記載。次いで、ロジスティック回帰（Ｈｏｓｍｅｒ，ＤＷ，Ｓ Ｌｅｍｅｓｈｏｗ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８９）を使用して、各マーカーの最適な重み付け、ならびに引き続いて症例であると予測される確率を算出した。予測確率≧０．５のすべてを、予測症例と分類し；予測確率＜０．５を予測対照として分類した。ロジスティックモデルとトレーニングセットとを適合させた後に、疾患状態の判別を試験セットに関して計算した。
【００４７】
【表３】
【００４８】
サイトカイン
市販元から、組換えＶＥＧＦ、ＥＧＦおよびＭＣＰ−１を購入した。ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から、組換えＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１２を得た。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から、ポリクローナル中和抗ＥＧＦ Ａｂ（Ａｂ５２８）を得た。
ＬａｂＭａｐ技術によるサイトカインおよび血管由来因子の血清濃度
ＬａｂＭａｐ技術を使用する多重アッセイで、３種の臨床群：対照の健康なボランティア、良性骨盤内腫瘍を有する女性および初期卵巣がんを有する女性からの患者の血液中で、２６種の異なる血清マーカー（表Ｄ）の循環系濃度を評価した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
対照でも患者群でも、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦおよびスルビビンの血清レベルは検出不可能であった。ＩＬ−１β、ＭＩＰ−１
α、ＭＩＰ−１β、ＨＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＧＦＲおよびＦａｓＬは、測定可能な血清濃度を示したが、これは、対照と患者群とでは異ならなかった（データは示さない）。ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびＣＡ−１２５の血清濃度は、対照に比べて、卵巣がん患者では有意（Ｐ＜０．０１）に高かった。意外にも、卵巣がんを有する女性は、ＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１についてかなり低い血中レベルを示した（ｐ＜０．００１）。表Ｅおよび図１に、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０での結果を示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
統計解析
これらのサイトカインの予診可能性を評価するために、データを初めに、ほぼ同等サイズのトレーニングセットおよび試験セットにランダムに分けた。該当する比較（即ち、対照対初期がん、対照対良性および良性対初期がん）それぞれについて、ロジスティック回帰モデル（Ｈｏｓｍｅｒら，１９８９）を手初めにトレーニングデータに当てはめ；次いで、個々の試験セットを使用して、予測される確率（症例であると）および判別結果を得た。試験およびトレーニングデータのランダムな選択を各モデルで１０００回繰り返し、判別率の変動性に関する確実な推定値を得た。正確に判別されたパーセント（ＰＣＣ）、感度（ＳＥＮ）および特異性（ＳＰＣ）の平均値（トレーニングおよび試験セットの全部で１０００回のランダム分割にわたる）で、結果を記載した。ＰＣＣ、ＳＥＮおよびＳＰＣについての９５％信頼区間（９５％ＣI）も、分布の２．５および９７．５パーセンタ
イルとして示した。Ｓ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェア（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｍａｔｈ Ｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，１９９９）を使用して、すべての統計解析を行った。
【００５３】
通常、変数ｋを用いるロジスティックモデル（即ち、サイトカイン）を次の式で表すが、ここで、ｙ＾は、予測された症例状態であり、ｘ1からｘkは、該当するサイトカインで
の発現レベルである。
【００５４】
【数１】
【００５５】
ｌｏｇ関数（即ち、上式の左側）は、二分する結果（即ち、症例または対照）をｌｏｇ規格では線状である量に変換する。
次いで、ロジスティックモデルからの係数をトレーニングデータに適合させて使用し、症例であると予測された確率を、試験セットにおける各被験者について算出した。症例である予測確率が、トレーニングセットで観察された症例の割合よりも高かった場合には（通常、０．５を上回る）、被験者を予測された症例と判別した。症例であると予測された確率が、トレーニングセットで観察された症例の割合よりも低かった場合には、被験者を予測された対照と判別した。ロジスティックモデルを１つのデータセットに合わせ、次いで、結果を個々の（即ちランダムに選択された）試験セットについて予測することにより、判別の正確度、感度および特異性を公平に推定することができる。
【００５６】
所定の比較（例えば、対照対初期がん）のために、ロジスティックモデルを初めに、個別のサイトカインそれぞれに当てはめた。次いで、最も高い判別率（即ち、正確に判別されるパーセンテージ）をもたらすサイトカインを別個に、残りのサイトカインを各々伴う一連の２変数モデルに入れた。例えば、ＥＧＦが最も良好な判別をもたらした場合には、残りのサイトカインをそれぞれ、ＥＧＦを伴う２変数モデルに入れることにする。次いで、正確に分類された最も高いパーセンテージをもたらす２変数モデルを別個に、残りのサイトカイン各々と組み合わせて、一連の３変数モデルを生じさせる。同様のまたはより良好な判別正確度がより大きなモデルで達成することができるまで、同様のステップアップまたは前方選択の手順を続けた。最も高い判別率をもたらすモデルを、最適モデルと示す。
【００５７】
対照 対 初期卵巣がんの比較
表Ｆは、対照から初期卵巣がんを同定するために個々のサイトカインそれぞれを使用した場合の判別結果を示している。結果は、これらのサイトカインのいずれも個別には、初期がんの特別に正確な予測をもたらさないことを示している。ＥＧＦのみが、試験セット被験者の７５％を超えて正確に判別した。他には２種のサイトカイン（ＭＣＰおよびＩＬ−６）だけが、６０％を上回る正確な判別をもたらした。しかしながら、９５％信頼区間は、９種のサイトカインの中で、３種（ＥＧＦ、ＭＣＰおよびＩＬ−６）が個別に、偶然よりも有意に良好な判別をもたらすことを示している。即ち、ＰＣＣについて低い方の９５％信頼限界は、５０．０％より上であった。
【００５８】
【表６】
【００５９】
ＥＧＦが初期がんを最も予測したので、これをモデル選択プロセスに初めに入れた。前記のように前方選択プロセスを続けることにより、さらなるモデルを案出した。表Ｇは、生じた多重回帰モデルを示している。結果は、４種のサイトカインを伴うモデルが最も良好な類別率をもたらし、したがって、最適モデルとして選択されることを示している。ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＶＥＧＦを含む一モデルは、９０％を上回る正確度を、正確な判別（９０％）、感度（９０％）および特異性（９１％）においてもたらした。６種またはそれ以上のサイトカインを含むさらなるモデルは、判別率の低下をもたらした（ここには示さない）
【００６０】
【表７】
【００６１】
培養卵巣がん細胞の上澄み液中でのサイトカインレベル
ｉｎ ｖｉｖｏデータを実証するために、２種の卵巣腫瘍細胞系列：ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３の細胞培養培地中におけるＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１のレベルを評価した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ分析により、両方の細胞系列の調整培養培地中でのＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの測定できるレベルが明らかになった。このことは、卵巣腫瘍細胞による前記サイトカインの分泌を示している。対照的に調整培養培地において、測定できるＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０またはＭＣＰ−１は同定することができなかった（データは示さず）。
【００６２】
これらのｉｎ ｖｉｖｏ結果により、ＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２の比較的低い循環濃度が証明された。これらのサイトカインの低いレベルは、腫瘍による消費によると仮定した。この仮定を確認するために、３種すべてのサイトカインを測定可能な濃度で
含有する女性の血清１００μｌとともに、それぞれＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３卵巣腫瘍細胞１０8個をＲＴで１時間インキュベーションした。１時間のインキュベーション後
に、血清からこれら３種のサイトカインの完全な枯渇が観察された。さらに、卵巣腫瘍細胞系は両方とも、ＰＢＳまたは強化血清からＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２を消費した。特異的中和抗体の添加によりＥＧＦの特異的結合が阻害される場合には、血清からのＥＧＦの枯渇は観察されなかった（図２）。卵巣腫瘍細胞によるＰＢＳからの組換えＩＬ−６、ＩＬ−８またはＶＥＧＦの枯渇も観察されなかった（データは示さず）。
【００６３】
別々に染色された蛍光ビーズを使用するＬｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭａｐ検出アッセイは
、慣用されるＥＬＩＳＡを上回る明らかな利点を有する。即ち、ＥＬＩＳＡに匹敵する感度、正確度および再現性で多数のアナライトを同時に検出することができる（Ｖｅｉｋｋｏｌａら，２０００）。正常な対照との比較において、初期卵巣がんに罹った女性の血清をスクリーニングするためにＬａｂＭＡＰ技術を使用したところ、８種の循環タンパク質：ＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８が、卵巣がん特異性を有すると同定された。これらのタンパク質すべての循環レベルは、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定され、刊行されている所見に報告されているレベルに近かった。
【００６４】
対照と比較して、サイトカインレベルの２種の異なるパターンが卵巣がんでは観察された。ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＣＡ−１２５は、卵巣がん患者の血液中では上昇した。加えて、卵巣がんを伴う患者では循環Ｇ−ＣＳＦの比較的高いレベルが、初めて観察された。がん患者の血液中でのサイトカインの高い値は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞、即ち、腫瘍に応答する免疫または内皮細胞による分泌に起因しうる。刊行されている情報（Ｓａｎｔｉｎら，１９９９）と一致して、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｌｅｚｅｒｍａｎら，Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｆｒｅｓｈ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９
８ Ｊｕｎ；９（２）：１７１−９、およびＺｉｌｔｅｎｅｒら， Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．１９９３ Ｓｅｐ；４９（３）：６３５−４１）およびＩＬ−８（Ｘｕ，Ｌ．ａｎｄ Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ ８：ａｎ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃ
ｏｌ Ｒｅｓ，２０００．１２（２）：ｐ．９７−１０６）、ＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ分泌が卵巣がん細胞により観察された。
【００６５】
しかしながら、これらのサイトカインは、他の細胞によっても産生され、例えばＶＥＧＦは、平滑筋、黄体および副腎皮質細胞を含む複数の正常な細胞種により産生されて分泌され；ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）は、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞、線維芽細胞およびリンパ球を含む多くの細胞により産生されうる。腫瘍により分泌される因子は、腫瘍種に特異的であるだろうが、理論的には、腫瘍が一定サイズになって初めて、測定可能になる。このような腫瘍マーカーの例は、ＣＡ−１２５であり、これは、末期の上皮卵巣がんの８５％で上昇するが、Ｉ段階疾患を有する患者ではその５０％未満で上昇するにすぎない。他方、腫瘍の成長に応答して免疫および他の細胞で誘発されるサイトカインは比較的低い腫瘍特異性を示すが、腫瘍進展の初期では上昇し始めうる。理想的には、診断の試験は、両方の群を代表するマーカーの組み合わせを測定しなければならない。
【００６６】
ＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０により異なるパターンが提示されたが、これらは、対照血清と比較して卵巣がんでは低かった。調べた８種の抗原のうち、ＥＧＦが最も強い卵巣がんとの関連を示した。これは、卵巣がんを有する患者では低いＥＧＦレベルが疾患と強い関係を持つことの初めての記載である。甲状腺の分化がんを有する患者で、低下した循環ＥＧＦレベルが観察されている（Ｎｅｄｖｉｄｋｏｖａら，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄｓ Ｎｅｏｐｌａｓｍａ．１９９２；３９（１）：１１−４）が、乳がんまたはメラノーマの患者においてはそうではない（我々の未発表の観察）。
【００６７】
したがって、ＥＧＦの低い循環レベルは、がんに特異的であり得る。卵巣がん細胞はＥＧＦ受容体を発現し、ＥＧＦは、卵巣細胞のためのオートクリン成長因子である（Ｂａｒｏｎ，Ａ．Ｔ．ら，Ｓｅｒｕｍ ｓＥｒｂＢ１ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｏｒ ＩＶ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ
Ｐｒｅｖ，１９９９．８（２）：ｐ．１２９−３７およびＭａｉｈｌｅ，Ｎ．Ｊ．ら，ＥＧＦ／ＥｒｂＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ，２００２．１０７：ｐ．２４７−５８）。我々のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験が示すように、卵巣がん患者における低下した循環ＥＧＦレベルは、卵巣腫瘍細胞によるＥＧＦの消費によるようである。加えて、可溶性ＥＧＦ受容体（ｓＥｒｂＢ１）が、これらの患者末期の血液中で見いだされた（Ｂａｒｏｎら、１９９９およびＭａｉｈｌｅら２００２）。ＥＧＦＲ／ＥＧＦ相互作用は、付加的にＥＧＦのクリアランスを上昇させ、卵巣がん患者で血中ＥＧＦレベルの低減をもたらすようである。前記の刊行物（Ｂａｒｏｎら、１９９９およびＭａｉｈｌｅら、２００２）に反して、ＥｒｂＢ１の循環濃度における、卵巣がんに特異的な差異はＬａｂＭａｐ方法によって観察されなかったことを特記する。ＥＧＦと同様に初期の卵巣がん患者は、低いレベルの循環ＭＣＰ−１を示した。本明細書に示されている知見と同様に、対照に比較して卵巣がんにおけるＭＣＰ−１の低い循環レベルを、Ｐｅｎｓｏｎらが記載している（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ＩＬ−１ｂｅｔａ，ＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＭＣＰ−１，ＧＭ−ＣＳＦ ａｎｄ ＴＮＦａｌｐｈａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０００ Ｊａｎ；１０（１）：３３−４１）。
【００６８】
しかしながら他の研究は、対照に比較して卵巣がん患者でのＭＣＰ−１の高い循環レベルを報告している（Ｈｅｆｌｅｒら， Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａ
ｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９ Ｎｏｖ；８１（５）：８５５−９）。
【００６９】
前記マーカーの各々と卵巣がんとの相関は控えめではあるが、統計解析によりこれらのマーカーの中から３種または４種を含む組み合わせパネルは、疾患との極めて強い相関を示し、したがって卵巣がんを初期診断するために用い得ることが証明された。いくつかのモデルは、卵巣がんの初期診断に関してひけを取らぬ高い感度と特異性とを与えた。したがって、案出されたサイトカインの組み合わせは、マーカーの唯一のサブセットとして見なすべきではない。同数のサイトカインを有する他のモデル（結果に示さず）も、極めて類似した結果を往々にしてもたらしうる。例えば、試験された３変数モデルはすべて、著しく類似した判別率をもたらした。数多くの可能な組み合わせならびにトレーニングおよび試験セットを繰り返し区分するコンピュータによる需要からあらゆる可能なモデルにつ
いて徹底的に検索しなくて済む。ＣＡ−１２５は初期段階の卵巣がんに関して、比較的高い特異性を有するが、感度は低いという我々の観察は、公表物と一致する（例えば、Ｆｏｌｋら，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ １２５ ｌｅｖｅｌｓ
ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ−ｌｏｏｋ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１９９５ Ｍａｙ；５７（２）：１７８−８２）。興味深いことに、判別アルゴリズムにＣＡ−１２５を組み込むと、劣悪な判別結果、即ち低い感度となった。
【００７０】
ＬａｂＭａｐ技術により測定されたいくつかの血清マーカーの組み合わせにより、高い特異性および感度が得られた。したがって、ＬａｂＭａｐ技術により測定された初期卵巣がんについての血清マーカー組み合わせの予測能力は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ技術により同定されたプロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）スペクトルに関してＰｅｔｒｉｃｏｉｎおよびＬｉｏｔｔａのグループが報告した予測能力に匹敵する（Ｇｙｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３）。しかしながらこれら２つの技術を比較すると、ＬａｂＭａｐアッセイは、より高い再現性でしかも低費用の手法を提供している。我々の知る限り、本研究では、血清マーカーを使用する他の文献と比較して、最も高い予測能力が達成された。表Ｈは、単一および組み合わせ血清マーカーの感度および特異性に関する利用可能なデータを表している。
【００７１】
【表８】
【００７２】
1 Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ２００２
2 Ｌｕｏ
3 Ｂａｒｏｎら，１９９９
4 Ｓｋａｔｅｓ
5 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ
6 Ｎａｍ，Ｃｏｌｅ
7 Ｏｅｈｌｅｒ，Ｍ．Ｋ．ａｎｄ Ｈ．Ｃａｆｆｉｅｒ，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅ
ｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ，２０００．２０（６Ｄ）；ｐ．５１０９−１２；Ｏｂｅｒｍａｉｒ，Ａら，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１９９８．７７（１１）：ｐ．１８７０−４；Ｔａｎｉｒら，Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｍａｓｓｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２００３；２４（３−４）：２７１−４；ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒら，２００２
興味深いことに、サイトカイン数を（最適なモデルを超えて）多くするモデルでは、判別率の低下が観察された。この現象は、少なくとも部分的には試料サイズの限界によるようである。充分なデータを利用して、極めて正確な判別、高い感度および高い特異性を得ることができたが、より大きな試料サイズのためにさらなるデータ収集が可能であれば、モデルのさらなる複雑さ、より正確な結果を得ることができる。１変数（即ちモデルでのサイトカイン）当たり少なくとも１０回の観察を得るという一般的なルールは、このモデルでは２〜３変数でほぼ満たされる。ロジスティックモデルの線形特性は、何らかの制約をもたらすかも知れない。それというのもがんの確率は同時に、複数のサイトカインの多重的な組み合わせに依存しうるためである。未来分析は、他のさらに柔軟な回帰および判別方法、例えば、ニューラルネットワークおよび判別ツリーを導入するであろう。
【実施例２】
【００７３】
循環抗体の精製
抗原特異的（単一特異性）循環抗体または２種またはそれ以上のこのような循環抗体の集団（これらに限られないが）を、次のプロトコルに従って精製すると、特異的な循環抗体の血清濃度を決定するためのアッセイを容易にすることができる。この方法で精製されたＩｇは、個々の循環抗体を正確に定量するための対照として使用することができる。
【００７４】
該当する精製抗原、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、スルビビン、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ；ＡＦＰ、ｂＨＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、トランスグルタミナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤ、Ａｋｔ１（ｖ−ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルスがん遺伝子ホモログ１）などを、これらに限られないが、タンパク質をＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合させるための前記プロトコルを使用して、カルボキシレート修飾ポリスチレンビーズ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＬＢ４、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に共有結合させることができる。例えば、下記の実施例に示されているように、ＩＬ−６およびＩＬ−８は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ ＮＪから；ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、スルビビン、ＦａｓおよびＦａｓＬは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から；ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ；ＡＦＰおよびｂｈＣＧは、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）から；トランスグルタミナーゼは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）から；ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から；Ａｋｔ１はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から得た。カップリング反応は、ＰＢＳ、５％ＢＳＡ、０．０１％
ツイーン２０中で行った。ビーズ１ｍＬはタンパク質２ｍｇまで結合させる。アフィニティカラムを、前記のカップリング緩衝液の５カラム容量で平衡させた。
【００７５】
例えば、これらに限られないがＰＢＳを用いて１：２に希釈された血清試料をカラムに適用し、ＲＴ（約２５℃）で３０〜６０分インキュベーションした。該アフィニティカラムを１５カラム容量の結合緩衝液で洗浄した。結合した免疫グロブリン（約９９％ＩｇＧ／１％ＩｇＭ）を、５カラム容量のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＩｇＧ溶離緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００４，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で溶離する。溶離を２８０ｎｍでの吸光によりモニターした。１Ｍトリス（ｐＨ９．５）５０μｌを加えるか、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）結合緩衝液１００μｌを加えることにより、溶離した液を中和した。次のステップの間に、ヒトＩｇＭに対するウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を共有結合させているＳｉｇｍａビーズを有するアフィニティカラムを使用して、ＩｇＭ分子を除去した。最初のアフィティ結合に関して記載したと同様に、手順を正確に行う。最後に分光光度計により、タンパク質濃度を測定する。必要であるか望ましい場合には、標準的な方法論に従い長期保存のために、こうして精製されたヒト単一特異性ＩｇＧ調製物を濃縮し、無菌化し、アリコートに分け、凍結させることができる。
【実施例３】
【００７６】
血清サイトカイン分析
・患者集団
患者集団は、実施例１に記載されている。本研究では、各群からのより少ない試料を利用した（表Ｉ）
【００７７】
【表９】
【００７８】
ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＣＡ−１２５およびＭＣＰ−１についての多重ＬａｂＭａｐアッセイを、実質的に実施例１において記載したように行った。しかし、各アナライトを単一ビーズアッセイで試験して、検出抗体の最適な濃度を決
定した。次いで、微小球を多重化して、インキュベーション時間およびレポーターシグナルに関して最適化した。レポーターシグナルとして、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を様々な濃度で試験した。ＥＧＦＲおよびＦａｓＬでの最小サイトカイン検出レベルは、＜５ｐｇ／ｍＬであり、ＣＡ１２５では、＜５ＩＵ／ｍＬであった。変動係数として表されるイントラアッセイ変動性を、１０個の患者試料での平均に基づいて算出し、異なる２つの時点で２回測定した。平均変動係数として表される重複試験の範囲内でのイントラアッセイ変動性は、５．４〜９．１％の範囲であった（データは示さず）。各標準および１０の試料からなる４重のセット（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を試験することにより、インターアッセイ変動性を評価した。これらの試料の変動性は、５．６〜９．６％であった（データは示さず）。これらの単一アッセイを１つの多重アッセイに組み合わせて、さらに最適化した。２４セット（ｐｌｅｘ）での個々のサイトカインについてのインターアッセイ変動性は、３．５〜９．８％の範囲であり、イントラアッセイ変動性は、３．６〜１２．６％の範囲であった（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより提供された情報）。
データの統計解析
記述的な統計およびグラフ表示（即ちドット・プロット）を作成して、各疾患状態について各マーカーの分布を示した。ｔ検定とノンパラメトリックに等価であるＷｉｌｃｏｘｏｎ順位−和（ｒａｎｋ−ｓｕｍ）検定を使用して、各疾患状態間でのマーカー発現における差の有意性を評価した。スピアマンの（ノンパラメトリック）順位相関も算出して、マーカーの各ペア間での関係を算出した。
【００７９】
Ｓ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェアによって与えられた判別ツリー（ＣＡＲＴ）を使用して、卵巣がんの状態の識別を行った。有望な指標物質（例えば所定のサイトカイン）それぞれの範囲をまず探索し、次いで所定のデータセットの可能性を最大化するスプリット（split）を見出すことにより、判別ツリーは、結果（outcome）のクラス間（例えば、がん患者と対照とを）を識別する。生じたサブセット（または「節（node）」）それぞれの中で、アルゴリズムは、再び最適なスプリットを選択するためにそれぞれの変数の範囲を探索する。すべての観察が完全に識別されるか、あるいは所定の節内での試料サイズがさらに識別するには小さくなりすぎる（即ち、ｎ＝５以下）まで、このプロセスを続ける。データセットにおいて、２つの観察のみが、マーカーに関して欠測値を有しており、解析から除外された。生じた判別ツリーの最終アウトプットは、各スプリットについての決定基準のグラフ表示であり、最終スプリット（即ち末端の節）を越えて、症例であると予測される確率を示している。いくつかの他の方法（ロジスティック回帰およびニューラルネットワーク）も、同様ではあるが、やや最適さには劣る結果で実行された（結果は示さず）。
【００８０】
独立のデータを用いて１０倍交叉妥当化（ten-fold cross-validation）を実行し、判
別正確度（classification accuracy）を評価した。特に、該データを同じサイズ（また
は可能な限り同じサイズ；これらのデータではｎk＝８〜９）の１０個のサブセットにラ
ンダムに分けた。各サブセットについて、モデルを、そのサブセット外のデータの９０％に合わせた；生じたモデル（またはツリー）を次いで、所定サブセット内のデータの１０％に適用した。したがって、生じた判別正確度の推定値は、モデル適合および検証のために、別々のデータサブセットを利用し、かくして再置換のバイアス（ｒｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｉａｓ）を回避する。得られた感度および特異性は、決定ルール（即ち、所定の症例または対照として予測される可能性を判別するためのカットポイント）の範囲にわたって報告され、レシーバ−オペレータ特性（ＲＯＣ）曲線を生じさせた。ＲＯＣ曲線は、様々なカットポイントにわたる（１特異性）による感度の図形表示である。しかしながら交叉妥当化は、データの各サブセットについて可能性として異なるモデルをもたらすために、すべての観察を用いて（即ち、交叉妥当化を用いずに）生じさせた判別ツリーは、最適モデルを記載する目的のために示された。他に記載がなければ、０．５を上回る予測可能性を有する観察は、症例として（または、良性と対照とを比較するための良性
の状態として）判別する。
【００８１】
卵巣がん患者でのサイトカインおよびＣＡ１２５
ＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術を使用する多重アッセイで、３種の臨床群：初期段階（Ｉ〜ＩＩ）卵巣がんを有する女性、良性骨盤内腫瘍を有する女性および年齢をマッチさせた健康な対照（表Ｉ）からの患者の血清試料において、異なる機能群に属する２８種の異なる血清マーカーの循環濃度を評価した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびスルビビンの血清レベルは、対照でも患者の血清でも検出不可能であった。ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＨＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ｂＦＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβは、測定可能な血清濃度を示したが、これらは、対照と患者群とで異なることはなかった（データは示さず）。ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＡ１２５およびＶＥＧＦの血清濃度は、対照に比較して卵巣がん患者では著しく高いことが判明した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１）（表Ｊおよび図３）。ＬａｂＭＡＰ（登録商標）アッセイは、ＥＧＦ（２２４±１２ｐｇ／ｍｌ）およびＭＣＰ−１（３８４±２１ｐｇ／ｍｌ）では相対的に高い血清濃度を示した（表Ｊおよび図３）。意外にも、ＥＧＦおよびＭＣＰ−１の血清レベルは、対照に比較して卵巣がん患者では有意に低かった（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）（表Ｉおよび図３）。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
特に図３は、健康な対照、Ｉ〜ＩＩ期の卵巣がん患者および良性の婦人科疾患を有する
患者でのサイトカインおよび成長因子の血清レベルを示している。初期（Ｉ〜ＩＩ）卵巣がんを有する患者４５人、良性骨盤内腫瘍を有する患者４４人および年齢および性別をマッチさせた健康な対照３７人から血清を集めた。サイトカインおよび成長因子の循環濃度を、「方法」に記載されているようにＬａｂＭＡＰ技術を使用して測定した。測定を２回行った。図中の水平線は平均値を示している。＊はｐ＜０．０５での、＊＊は、ｐ＜０．０１での；＊＊＊はｐ＜０．００１での対照とがん患者との間の統計的有意性を示している。
【００８４】
良性腫瘍を有する患者の血清は、対照と比較して高いレベルのＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＡ−１２５を有していた（ｐ＜０．０５）。しかしながら、がん群と良性群との間に、Ｇ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦ濃度に関して統計的な差異は観察されなかった。ＣＡ−１２５レベルは、がん群に比較して良性群ではかなり（Ｐ＜０．０５）低かった。良性腫瘍を有する患者は、低レベルのＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１を有することを特徴とする（表Ｊおよび図３）。しかしながら、ＩＬ−６およびＩＬ−８の循環濃度は、卵巣がん患者の血清のみで上昇し、良性群では上昇しなかった（表Ｊおよび図３）。
卵巣がんバイオマーカーとしての血清サイトカインの統計解析
初期の卵巣がんと健康な対照との比較
表Ｊは、初期卵巣がんと対照とを区別するために個々のサイトカインをそれぞれ使用しての判別結果を示している。結果は、マーカーは個別には、初期がんについてやや正確な予測しかもたらさなかった。ＣＡ−１２５、ＥＧＦおよびＩＬ−６のみが、試験セット被験者の８０％を超える割合で正確に分類した（表Ｋ）
【００８５】
【表１１】
【００８６】
図４Ａは、対照と初期卵巣がんとを区別するためにＣＡＲＴ方法論を使用する判別ツリーを表している。図３のモデルは、モデルに適合する各群でのすべての観察を利用した（後続のパラグラフで説明されるように、判別正確度についての後の推定に利用される交叉妥当化とは逆）。この判別ツリーは、８種のマーカーのうち、５種を利用し、これには、ＣＡ１２５、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８が含まれた。各スプリットに記載されたデータの範囲（例えば、ＣＡ−１２５＜２６）は、データのサブセットを示しており、これはさらに分岐により左側に細分化する。例えば、ＣＡ−１２５＜２６を有する被験者を、ＩＬ−６（＜６．３５対＞６．３５）により細分化する一方で、ＣＡ−１２５＞２６を有する被験者を次いでさらに、ＩＬ−８のレベルにより細分化した（＜５．２６５対＞５．１６５）。各最終群（即ち、末端の節）に記載された数は、各サブセットの範囲内で症例である可能性を示している。
【００８７】
次いで、１０倍交叉妥当化を使用して、判別正確率（対象と初期がんとを区別する際の）を得た。図４Ｂは、生じたＲＯＣ曲線を示している。「方法」セクションに記載したように、感度および特異性は、各被験者を症例と対照とに判別するために使用されるカットポイント（即ち、判別ツリーからの予測確率）に依存している。０．５の標準的なカットポイント（即ち、０．５を上回る予測確率を有する者はすべて、がん症例として判別される）を使用すると、感度１００％、特異性８６％および正確な判別９３％が得られる。さらに特異性を９１％に固定すると、著しく高い感度９５．５％が得られた（この場合も正確な判別９３％）。あるいは９５．３％の特異性は、感度８４．１％（および正確な判別９０．０％）に対応する。レシーバ−オペレータ特性（ＲＯＣ）曲線下の全面積は、１（完全な判別を示す）に近く、０．９６６であった。
【００８８】
特に、図４Ａは、初期卵巣がんと健康な対照とを区別するための判別ツリーを示している。矩形は、サイトカインおよびサイトカインカットオフを含むスプリッティング節（splitting nodes）を示している。各スプリットに記載されているデータ範囲は、分岐によ
り左側にさらに細分化されるデータのサブセットを示している。各最終群（即ち末端の節）に記載された数は、各サブセット内で症例である確率を示している。図４Ｂは、バイオマーカー・パネルに関するレシーバ−オペレータ特性（ＲＯＣ）曲線を示している。初期卵巣がんと健康な対照との判別ツリー分析の１０倍交叉妥当化からの結果を示している。いくつかのモデルが、卵巣がんの初期診断に関して比較可能な高い感度および特異性を示した。したがって、結果的に生じたサイトカインの組み合わせを、唯一のマーカーサブセットと見なすべきではない。同じ数のサイトカインを有する他のモデル（示さない）も往々にして、極めて類似した結果をもたらした。例えば、試験された３変数モデルはすべて、非常に似た判別率をもたらした。数多くの可能な組み合わせ、ならびにトレーニングおよび試験セットを繰り返し区分するコンピューターによる要求によって、あらゆる可能なモデルを徹底的に検索しなくてもよい。
【００８９】
・対照および初期卵巣がんと良性状態との比較
良性骨盤内腫瘍と他の群とを区別するための血清バイオマーカー・パネルの有効性を評価するために、別々の判別ツリーモデルを適用して、１）良性状態 対 初期がんを、２）良性状態 対 対照を予測した。同様の１０倍交叉妥当化手順を使用して、判別正確度を評価した。良性とがんとの比較では、被験者の８０．２％が正確に判別され、感度は８４．１％、特異性は７５．７％であった。良性とがんとを比較するための判別ツリー（示さず）は、５種のマーカー（ＣＡ１２５、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＥＧＦおよびＶＥＧＦ）を利用した。良性と対照との比較では、被験者の９０．０％が正確に判別され、感度は８６．５％、特異性は９３．０％であった。良性と対照とを比較するための判別ツリー（示さず）は、８種のマーカーの中から６種を利用し、これにはＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＡ１２５、ＩＬ−６およびＩＬ−８が含まれていた。
【実施例４】
【００９０】
循環抗体についてのＬａｂＭＡＰアッセイの開発
底部がフィルターの９６ウェルマイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で、アッセイを行った。該当する精製抗原（実施例２に記載の供給源からのＩＬ−６、ＩＬ−８、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、スルビビン、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ；ＡＦＰ、ｂｈＣＧ、トランスグルタミナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤおよびＡｋｔ１）を抗体に関する記載と同様にしてＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合させた。
【００９１】
抗原結合ビーズを、４％ＢＳＡを含有するブロック緩衝液とともにマイクロタイターシェーカー上、室温で１時間、プレインキュベーションした。次いで、真空マニホールドを
使用して、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０）でビーズを３回洗浄し、続いて１：２５０に希釈された血清５０μｌとともに４℃で３０分間インキュベーションした。この希釈は、前の血清滴定に基づき抗ＩＬ−８ＩｇＧを回収するには最適のものとして選択された（データ示さず）。次いで洗浄手順を前記のように繰り返し、ビーズをヒトＩｇＧに対して生じたＰＥ結合ロバ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）４μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）とともに、継続的に振盪しながら暗所で４５分間インキュベーションした。ウェルを２回洗浄し、アッセイ緩衝液を各ウェルに加え、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ懸濁アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、試料を分析した。標準曲線のために、抗原結合ビーズを、特異抗原に対する連続希釈ヒト抗体とともにインキュベーションした。単一特異的ヒト抗体の精製は前記した。データ分析は５パラメーター曲線フィッティングを使用して行った。
【実施例５】
【００９２】
初期卵巣がんを有する患者、良性骨盤内腫瘍を有する患者および対照の健康な女性での循環抗体のＬａｂＭＡＰ分析
循環抗体を分析するために、パネルを作成した。このパネルは、次の抗体：ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ｂｈＣＧ、スルビビン、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、トランスグルタミナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ａｋｔ１、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤのための２８アッセイを含む。結果を定量化するために、精製ヒトＩｇＧの標準曲線を利用した。正確な定量のために、所定の抗原に特異的なヒト抗体（単一特異性）を実施例２に前記したように血清から精製した。血清サンプル、実施例１に前記したサンプル＋初期卵巣がんを有する患者からの追加的試料３１種、良性状態を有する患者からの試料６０種（表Ａ）および追加的な対照試料３０種を分析した。次の１２種の抗原に対する抗体の血清濃度は、対照および良性骨盤内腫瘍に比較して卵巣がん患者では著しく高いことが判明した（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）；ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｃ−Ｍｙｃ、ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＭＵＣ−１、スルビビン、ｂＨＣＧ、オステオポンチン、ＰＤＧＦ ＢＢ（図３）。
【００９３】
・初期卵巣がんと健康な対照との比較
この判別ツリーは、１３種のマーカーの中から５種を利用し、これには、ＣＡ１５−３、ＩＬ−８、スルビビン、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃが含まれた。０．５の標準的なカットポイントを使用すると、感度９５％、特異性１００％および正確な判別９８％が得られる。前記の１２種の循環抗体からの３〜約８種からなる他の組み合わせも、高い判別結果をもたらした。
【００９４】
・対照および初期卵巣がんと良性状態との比較
良性とがんとを比較する表Ｌに示されているように、被験者のうちの８９％が感度９５％および特異性８０％で正確に判別された。良性とがんとを比較するための判別ツリー（示さず）は、次の８種の抗原：ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｂＨＣＧおよびスルビビンに対する抗体を利用した。良性と対照との比較では、被験者の９８％が感度９６％および特異性９９％で正確に判別された。良性と対照とを比較するための判別ツリー（示さず）は４種のマーカーを利用し、これには、ＣＡ１５−３、ＩＬ−８、ＭＵＣ１およびｃ−ｍｙｃが含まれた。
【００９５】
【表１２】
【実施例６】
【００９６】
がんマーカーのためのＬａｂＭＡＰアッセイの作成
ＥｒｂＢ２、ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５、サイトケラチン１９（Ｃｙｆｒａ２１−１）、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）のためのアッセイを、実施例１と同様に開発した。これらのアッセイを開発するために使用された抗体および標準の供給源を表Ｍに示す。
【００９７】
【表１３】
【００９８】
初期卵巣がんを有する患者、良性骨盤内腫瘍を有する患者および対照の健康な女性でのがんマーカーのＬａｂＭＡＰ分析
このプロジェクトのために、初期段階卵巣がんを有する患者から試料３１種、良性状態を有する患者からの試料６０種および追加の対照試料３０種（表Ａに含まれる）を利用した。ＣＡ−１２５およびＣｙｆｒａ２１−１の血清濃度は、対照および良性骨盤内腫瘍を有する患者に比較して、卵巣がん患者では著しく高いことが判明した（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲの濃度は、対照分および良性群においてよりもがん群では著しく低かった（Ｐ＜０．０５）（図６）。
・初期卵巣がんと健康な対照との比較
ＬＵＭＩＮＥＸプロファイルのマスキングされたクラス標識を予測するため、アルゴリ
ズムの不偏性能を最適化する統計装置を使用して、次のデータを作成した。このｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓ分析により、感度９１％、特異性９４％および正確な判別９２％が生じた。
・対照および初期卵巣がんと良性状態との比較
これら４種のマーカーの組み合わせを使用する、良性とがんとの比較では、感度４０％および特異性９４％で、被験者の７６％が正確に判別された。これら４種のマーカーの組み合わせを使用する良性と対照との比較では、感度８６％および特異性８９％で、被験者の８７％が正確に判別された。
【００９９】
さらにデータを、ＣＡＲＴプログラムを使用して分析し、その結果を表ＮおよびＯに示す。がんと対照とを区別するためにパネル：サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦを使用すると、感度９４％、特異性９４．０％および正確な判別９４％が生じた。他の有効なパネルには：１）サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦおよびＥＧＦＲ；２）サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦおよびＦａｓ；３）サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡおよびＭ−ＣＳＦ；および４）サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡおよびＣＡ−１２５が含まれる。ＣＡＲＴ方法論を使用するがんと良性との増殖評価に対してパネルＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２を使用すると、感度８１．３％および特異性８８．１％で、被験者の８５．９％が正確に判別された。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
【表１５】
【実施例７】
【０１０２】
縦断的研究
複合ランダム化コントロール試験（ＲＣＴ）を、１９９６年に開始し２００１年１２月に
終了する年間スクリーニングでＳｔ Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ病院（英国、ロンドン）にて行い、がんについては２００３年１２月まで追跡する（Ｓｋａｔｅｓ，ＳＪら．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｉａｌ ＣＡ−１２５ Ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００３ ２１（Ｓｕｐｐｌ．）：２０６−２１０；「Ｓｋａｔｅｓ ら」）。この試験は、ＣＡ１２５を用い、さらにＳｋａｔｅｓらにより記載されている「Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ」アルゴリズムを使用する、唯一の血清ベースの卵巣がんスクリーニング試験である。そのアルゴリズムを予見的に評価し、このようなＲＣＴの実現可能性を決定するために、この研究が英国で企画された。
【０１０３】
この試験では、閉経期後の５０歳を超える（自己申告）の女性１３６８８人を集められた。基底となる疫学的な情報をすべての女性から得て、６７３４人をスクリーニングアームにランダム化した。これらの女性は、年間スクリーニングを２年間から６年間にわたって受けた。スクリーニングを２００１年１２月に終えた。６年間にわたり、６週間から１年間間隔の連続的な試料が得られた。全部で３５１７５種の試料を、血清バンクで得ることができ、がんおよび他の一般的な疾患の発生を記録するための追跡が進行中である。このコレクションからの最も独特で貴重な試料は、卵巣がんを有すると診断された女性からの臨床前の試料である。この研究からの血清バンクは、症状による提示と対照的に、スクリーニングにより卵巣／ファロピオ卵管のがんの進展が検出される１年未満前〜６年前からの１９人の女性からの９３血清試料のセットを目下含んでいる。
【０１０４】
すべての症例および対照は、高い家族履歴リスクを有さない、即ち、卵巣がんを有する親戚を１人以下しか有さない、閉経期後の≧５０才の女性である。原発性の卵巣／ファロピオ卵管がんと診断された研究参加者からの各血清試料を、健康なままだった女性からの３試料とマッチングさせた。すべての試料を採取し、郵便により室温、凝血管中で輸送した。中央研究室に届いたら、これらを直ちに遠心分離させ、血清を冷凍庫中、−２０℃で保管した。試料の輸送時間をすべての試料に関して記録した。すべて、５６時間未満の輸送時間を有していた。目下の研究では、試料の１アリコートを解凍し、１００ｍＬのアリコートに分配し、これを、冷凍庫中−２０℃で貯蔵した。
【０１０５】
卵巣がんを発症した、Ｂａｒｔの研究での女性から得た一連の血清試料をＬａｂＭＡＰ技術の使用により、実施例１〜６に記載のサイトカイン、循環抗体およびガンマーカーに関して分析した。図７Ａおよび７Ｂは、診断のほぼ３０から４０ヶ月前に、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＰＤＧＦＲαに対する抗体（図７Ａ）およびサイトカイン、ＩＬ−６、ＩＰ−１０（インターフェロンγ誘発タンパク質、ＭＷ１０ｋＤＡ）およびＩＦＮγの濃度（１１人の患者での平均）が一過性で上昇することを示している。
【０１０６】
さらに、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの濃度は、診断の４０ヶ月前から確実に減少する（図７Ｂ）。平均ＣＡ−１２５濃度の上昇は、診断の９ヶ月前に初めて明らかになる（図７Ｂ）。さらに目下のところ、ＣＡ−１２５の上昇は、介入のための充分な正当性を表さない。したがって、いくつかのマーカーのベロシティを組み合わせることは、外科的に介入することについて卵巣がん発現の充分な指標として役立つであろう。図７Ａおよび７Ｂにおいて、３〜３０ヶ月の時点で、ｎ＝１１：３６ヶ月は実際には、３６から４２ヶ月の期間を表しており（ｎ＝１１）、４２ヶ月は実際には、４２ヶ月以上の期間を示している（ｎ＝９）。
【０１０７】
多重Ｌｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰアッセイを、実施例１および３の記載とほぼ同様にして循環タンパク質；ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１、Ｍ
ＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１５、ＣＥＡ、ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲについて、さらに実施例４および５の記載と同様にして循環抗体；抗ＥＧＦ、抗ＩＬ−８、抗ＶＥＧＦ、抗ｐ５３、抗スルビビン、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体２）、抗ＭＵＣ１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｃ−ｍｙｃ２、抗オステオポンチン、抗ＰＳＡ、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦ、抗Ａｋｔ１および抗ＰＤＧＦＲα（血小板由来成長因子受容体α）について行った。循環抗体を、実施例２の記載のように抗原結合ビーズの混合物を使用してアフィニティ精製した。抗原結合ビーズは実施例２での記載と同様にして調製した。
【０１０８】
本明細書では、本発明の特定の実施形態を、本発明を限定するためではなく本発明を詳述するために記載したのであるが、当技術分野の専門家であれば、添付の請求項に記載の発明から逸脱することなく、本発明の原理および範囲内で、各部の詳細、材料および配置の数多くのバリエーションを作成することができることを認めるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、卵巣がん患者（OvCa）および健康な対照（C）での血清マーカーを示すグラフである。
【図２】図２は、卵巣がん細胞による可溶性ＥＧＦの吸収を示すグラフである。図中、“serum”は、血清を、“control”は対照を意味する。
【図３】図３は、実施例３に記載された３研究群における血清サイトカインレベルの分布を示すグラフである。図中、“benign”は、良性を、“control”は対照を意味する。
【図４Ａ】図４Ａは、初期段階卵巣がんと健康な対照とを区別するための判別ツリーを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例４に記載のＲＯＣ曲線を示すグラフである。図中、“specificity”は、特異性を、“sensitivity”は感度を意味する。
【図５】図５は、実施例６に記載された３研究群における循環抗体の血清レベル分布を示すグラフである。図中、“benign”は良性を、“control”は対照を意味する。
【図６】図６は、実施例６に記載された３研究群でのがんマーカーの血清レベル分布を示すグラフである。図中、“benign”は良性を、“control”は対照を意味する。
【図７Ａ】図７Ａは、血清中を循環する血清マーカーのベロシティを示すグラフである。図中、“Months before diagnosis”は、診断前の月数を意味する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、血清中を循環する血清マーカーのベロシティを示すグラフである。図中、“Months before diagnosis”は、診断前の月数を意味する。
【技術分野】
【０００１】
本発明はがんを迅速に初期検出するための多因子アッセイのための方法および試薬である。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは、女性生殖路の３番目に多いがんである。多くの初期段階のがんは、無症候性であり、診断の４分の３を超える分は、疾患が局所または遠隔の転移をすでに確立している時点で下されている。攻撃的な細胞減少の（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）外科手術および白金ベースの化学療法にもかかわらず、臨床的に進行した卵巣がんを患う患者の５年生存率は、１５から２０パーセントにすぎないが、Ｉ期疾患での治癒率は通常、９０パーセントを上回る（Ｈｏｌｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｂｅｒｅｋ，Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，２０００．１９（１）：ｐ．３−１０）。これらの統計により、卵巣がんスクリーニングおよび初期同定を改善するための基本的な理論的根拠が得られる。
【０００３】
有効な初期検出方法が存在しないために、上皮性卵巣がんは、一部では致命的である。初期に検出されれば、生存率は劇的に上昇する。現在の研究では、女性、特に、卵巣がんを発症するリスクの高い女性を検査するための改善された方法を開発することに焦点が当てられている。しかしながら今のところ、前がん病巣は同定されていない。卵巣がんの相当部分において、いくつかの遺伝子、例えば、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２、ｃ−ｍｙｃおよびｐ５３の変化が同定されているが、これらの突然変異のいずれも、悪性度を提示しないし、一定期間にわたる腫瘍活動の前兆ともならない（Ｖｅｉｋｋｏｌａ，Ｔ．ら，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（２）：ｐ．２０３−１２；Ｂｅｒｅｋ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９１．１６４（４）：ｐ．１０３８−４２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １０４２−３；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００２．８（１０）：ｐ．３１９３−７；およびＤｉＢｌａｓｉｏ，Ａ．Ｍ．ら，Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９５．５３（１−６）：ｐ．３７５−９）。
【０００４】
むしろ、高いリスクを有する女性は、遺伝上の相談および遺伝試験に、さらに血清ＣＡ−１２５レベルの測定および経膣超音波測定に頼らざるを得ない（Ｏｅｈｌｅｒ，Ｍ．Ｋ．および Ｈ．Ｃａｆｆｉｅｒ，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．２０（６Ｄ）：ｐ．５１０９−１２；Ｓａｎｔｉｎ，Ａ．Ｄ，ら，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ
ｖｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１９９９．２０（３）：ｐ．１７７−８１；ならびにＳｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら，Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌ
ｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３．２１９（４５８７）：ｐ．９８３−５）。
【０００５】
しかしながら、ＣＡ−１２５は、初期段階の疾患を検出するための感受性もないし、特異性もない。これは、現在では一般的なスクリーニングのためには推奨されていない。ＣＡ−１２５は、疾患の応答または進行を監視する際に確実であると考えられるにすぎず、診断または予後のマーカーとしては考えられない（Ｇａｄｄｕｃｃｉ，Ａ．ら，Ｓｅｒｕｍ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９．１９（２Ｂ）：ｐ．１４０１−５）。
【０００６】
経膣の超音波、ドップラーおよび形態学上の指標を使用してのスクリーニングは、多少は励みになる結果を示しているが、単独で使用すると、これは現在、一般的集団についてのスクリーニング試験で必要とされる特異性を欠いている（Ｋａｒａｙｉａｎｎａｋｉｓ，Ａ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ
ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００２．１３１（５）：ｐ．５４８−５５およびＪ．Ｋ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎ？Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２０００．１７（１）：ｐ．１４９−５２）。
【０００７】
腫瘍マーカーおよび超音波を組み合わせて利用する複合的スクリーニングは、より高い感度および特異性をもたらす。さらに、この組み合わせ手法は、最も費用的に効果のある有望なスクリーニングストラテジーである（ｋａｒａｙｉａｎｎａｋｉｓ ら，２００２
ａｎｄ Ｌｅｅ ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２０００）。しかしながら、これも、一般的集団においては有効性に問題がある。したがって、疾患を早期に検出するためのさらなるマーカーを開発する切実な必要性が存在する。
【０００８】
最近、固相タンパク質クロマトグラフィーと質量分析測定法とを組み合わせている表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析測定法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と称される新規の技術（Ｉｓｓａｑ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｔｈｅ ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００２．２９２（３）：ｐ．５８７−９２）に解説されている）が、卵巣がんにおけるバイオマーカーを発見するための新規手法として利用されている。
【０００９】
卵巣がん患者に関する、最近公表のランドマーク的研究では、卵巣がん進行についてのタンパク質プロファイリングするために、この新規技術が使用されている（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．Ｆ．ら，Ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ，２００２．３５９（９３０６）：ｐ．５７２−７）。
【００１０】
この手法により、ＣＡ−１２５での３４％に比較して、９４％という陽性予測の値を有
する血清タンパク質プロファイルを識別することができた。しかしながら、この値は高いが、スクリーニングされるであろう集団での卵巣がんの発生率が低いことから、多数の擬陽性の発生を回避するためには、陽性を予測する値はほぼ１００％でなければならない。したがって、卵巣がんに関して有効な一般的集団をスクリーニングするために、この手法を利用する際に必要とされる特異性および確実性を必要とされる高レベルにするためには、さらに追加のマーカーが必要である。加えて、この手法は極めて費用がかかり、高リスク集団にしか適用することができないであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
卵巣がん細胞は様々な血管由来因子を産生し、様々なサイトカインの分泌を刺激するために、これらをバイオマーカーとして使用することができることは、よく知られている。しかしながら、これらの因子は個別には、初期段階の本疾患とは僅かしか関係していなかった。個々の患者の血清中にある複数の血管由来因子およびサイトカインを含む項目群を評価することにより、初期段階の卵巣がんを診断するために充分な特異性および感度が得られるであろうと仮定された。がん患者の血清マーカーに関する以前の試験はすべて、ＥＬＩＳＡを使用して行われたが、これは、極めてコストがかかり、しかも個々のサイトカイン各々について別々のキットを必要とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
卵巣がんを迅速に早期検出するための方法を提供する。この方法により、血管由来因子を含む幅広い項目群を同時に検査する機会、ならびに、例えば限定するものではないが、１時点について血清または血漿５０μｌのみを使用する複数時点でのこのような試験の反復が提供される。
[発明の説明]
患者における卵巣がんの存在をアッセイする方法を提供する。さらに、患者における卵巣がんの存在または成行きを予測する方法を提供する。この方法は、患者における卵巣がんの存在を決定するための方法を含み、これは、ＥＧＦ（上皮成長因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ−６（インターロイキン６、本明細書で使用する場合、「ＩＬ」を「インターロイキン」という）、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５（がん抗原１２５）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＭＣＰ−１（単球化学誘因物質タンパク質−１）、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン（anti-osteopontin）、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上を含む血液マーカーパネルで、患者の血液試料中のマーカーレベルを検出することを含み、この場合、次の状態：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOのうちの２つまたはそれ以上の存在が、患者における卵巣がんの存在を示している。
【００１３】
パネルの例は、これに限られないが：ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、ＦａｓＬ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；ＣＥＡ、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；サイトケラチ
ン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２；ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１；抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ；および抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦ；および抗ｂＨＣＧを含む。
【００１４】
さらに本方法は、線形回帰分析、判別ツリー分析およびヒューリスティックなナイーブベイズ（ｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓ）分析などの統計的方法を適用することにより、患者血液での２種またはそれ以上のマーカーレベルと１種または複数の対照試料での同じマーカーのレベルとを比較することをさらに含む。統計的方法は、コンピュータープロセスにより、例えば、市販の統計解析ソフトウェアにより行うことができるし、通常は行う。一つの実施態様における統計的方法は、判別ツリー分析、例えば、ＣＡＲＴ（Ｃ＆ＲＴ、判別および回帰ツリー）である。
【００１５】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上に特異的な結合試薬タイプ類を含むアレイであり、その場合、各結合試薬タイプが独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面上に位置する１個または複数の別々の位置に結合しているアレイも提供する。その支持体は、識別可能なマーカーを有するビーズであってもよく、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬が結合しているビーズとは異なる、識別可能なマーカーを有するビーズに結合している。識別可能なマーカーは、蛍光化合物または量子ドットを含んでもよい。
【００１６】
他の実施形態では、患者における卵巣がんの存在を決定する方法を提供するが、この方法は、患者の血液試料での抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＩＬ−８、抗オステオポンチン、抗ＶＥＧＦおよび抗ＰＤＧＦのうちの少なくとも１種のレベルを決定することを含み、その際、次の状態：抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗ＩＬ−８HI、抗オステオポンチンHI、抗ＶＥＧＦHI、抗Ａｋｔ１および抗ＰＤＧＦHIのうちの１種または複数の存在が、患者における卵巣がんの存在を示している。
【００１７】
別の実施形態では、臨床的に卵巣がんの発症を予測するための方法を提供し、この方法は、患者の血液における、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上の濃度変化を２つまたはそれ以上の時点で測定することを含む。その場合、２つの時点間での患者血液中の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度の上昇ならびに２つの時点間での患者の血液中のＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの濃度低下は、臨床的卵巣がんの発症を予測している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本出願に記載されている種々の範囲での数値の使用は、特に他に指示のない限り、記載の範囲内の最小値および最大値の両方の前に「約」との用語があるように、近似値として記載されている。この場合、記載された範囲を上回るか下回る若干の変動を用いて、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成することができる。したがって、これらの範囲の開示は
、最小値と最大値との間のすべての値を含む連続的な範囲を意図している。
【００１９】
本明細書は、卵巣悪性度を初期に迅速に同定するための多因子アッセイを提供する。卵巣がんの検出で使用可能な血液サイトカイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびがん抗原マーカーを次に同定する。サイトカインマーカーには、卵巣がんに罹る患者の血中で異常に発現されるＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１が含まれる。ＥＧＦおよびＭＣＰ−１は、対照のヒト個々と比較して、卵巣がんを患う患者では発現不足である一方で、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＶＥＧＦは、これらの患者で過剰発現される。このように、２種類またはそれ以上、典型的には３種または４種の次のパラメーター：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHIおよびＭＣＰ−１LOを示す患者は、卵巣がんを有するとの極めて高い可能性が存在する。
【００２０】
さらに、卵巣がんを伴う患者の血中に異常なレベルで存在する、あるＩｇ種が特定される。これらのマーカーには、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＭＵＣ−１、スルビビン、ｂＨＣＧ、オステオポンチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ａｋｔ１、サイトケラチン１９およびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）に対する抗体が挙げられる。このように、２種類またはそれ以上、通常は３種または４種の次のパラメーター：抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHIを示す患者は卵巣がんを有するとの極めて高い可能性が存在する。
【００２１】
さらに、卵巣がんを伴う患者の血中に異常に高レベルで存在する、あるがん抗原を同定する。これらのマーカーには、ＣＡ−１２５、ＦａｓＬ、ＣＥＡおよびサイトケラチン１９が含まれる。他のがん抗原は、卵巣がん患者では異常に低いレベルで存在し、これにはＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｍ−ＣＳＦ、カリクレイン８およびＥＧＦＲが含まれる。このように、２種類またはそれ以上、通常は３種または４種の次の状態：ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LOおよびＭ−ＣＳＦLOを示す患者が卵巣がんを有するとの極めて高い可能性が存在する。
【００２２】
前記の３つの群それぞれに由来する血液マーカーを含むパネルは、患者が卵巣がんに罹っているかどうかを同定する際に役立つ。ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上、通常は３種または４種から選択されるパネルは、正常／良性患者と卵巣がん患者とを区別する際に役立つ。正常／良性患者と卵巣がん患者とを区別する場合のその有用性により、いくつかのマーカーを初めに記載する。これらの新規の卵巣がんマーカーには、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＩＬ−８、抗ＶＥＧＦ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ−ＡＡ（血小板由来成長因子ＡＡホモダイマー）および抗Ａｋｔ１が挙げられる。
【００２３】
パラメーターである、ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＣＡ−１２５HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗ＰＤＧＦHI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LOおよびＭ−ＣＳＦLOは、これらのマーカーについて正常または対照の血液（血清または血漿）レベルと卵巣がんを患う患者における血液レベルとを統
計的に比較することにより決定される。下記に示される統計データは、患者における前記マーカーについて、一定のLOまたはHIパラメーターを規定するためのある値を同定している。LOまたはHI値の推定値について限定を意味しない例として、実施例１のデータを参照すると、ＥＧＦLOは、ＥＧＦが約２２４ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味し、Ｇ−ＣＳＦHIは、Ｇ−ＣＳＦが約２２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−６HIは、ＩＬ−６が約８．８ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−８HIは、ＩＬ−８が約１０．２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＣＡ−１２５HIは、ＣＡ−１２５が約１０ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＶＥＧＦHIは、ＶＥＧＦが約９１ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、あるいはＭＣＰ−１LOは、ＭＣＰ−１が約３４２ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味する。
【００２４】
次のものに限られないが、ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＣＡ−１２５HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗ＰＤＧＦHI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLOおよびＨｅｒ２／ｎｅｕLOを含む、本明細書で同定される他のマーカーに関するLOまたはHI値の同定は、本明細書に示されているグラフ、本明細書に示されているデータを参照することにより、および／または本明細書に記載されている統計的方法を使用することにより決定することができる。これらはすべて、本明細書に記載されているデータに基づき、生物統計学の分野における通常の専門家の能力による範囲内である。
【００２５】
これらのLOまたはHI値は近似値であり、統計的に由来することを理解されたい。各因子の相対的なレベルを検出し、LOまたはHIについての臨界値を規定する他の統計方法を使用する場合には、これらの近似値をやや上回るか、下回る値、通常は１標準偏差の範囲内の値を、LOまたはHI状態と正常とを区別するための統計的に有意な値と見なすこともありうる。この理由で、「約」との用語が記載の値とともに使用されている。「統計的判別方法」を使用して、正常な患者および良性増殖を伴う患者と卵巣がん患者とを区別し得るマーカーを同定し、そうした患者を区別するための各マーカーについての血中臨界値を決定する。そのために３種の特別な統計方法を使用して、判別するマーカーおよびそのパネルを同定する。これらの統計方法には：１）下記の実施例１に同定されているような線形回帰；２）下記の実施例４で同定されているような判別ツリー方法（下記の実施例で使用されるＣＡＲＴとともに、ＣＨＡＩＤおよびＱＵＥＳＴが、判別ツリープログラムである）；および３）下記の実施例７に記載されているような、マスキングされたクラス標識を予測するためのアルゴリズムの不偏性能を最適化する統計装置知能が含まれる。これらの統計方法はそれぞれ、生物統計分野の通常の専門家にはよく知られており、コンピューターでのプロセスとして行うことができる。統計方法を実行するために、次だけに限られないが、Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）から市販されているＳ−ＰＬＵＳ（登録商標）などの数多くのソフトウェア製品を市場で購入することができる。
【００２６】
卵巣がん患者に存在するマーカーおよびどのマーカーおよびどのマーカー群が卵巣がん患者を同定する場合に役立つかを同定ことにより、当技術分野の専門家であれば、本明細書の開示に基づき、優れた選択性および感度をもたらすパネルを同定することができる。優れた判別能力を与えるパネルの例には、これらに限られないが：ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；ＣＥＡ、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆａｓ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、Ｅ
ｒｂＢ２；ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１；抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ；ならびに抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦ；および抗ｂＨＣＧなどのパネルが挙げられる。生物統計分野の通常の専門家であれば、特定のパネルにあるマーカー数は、マーカーの組み合わせに応じて、異なってよいことを理解するであろう。特異性と同様に最適な感度が到達目標であるので、一つのパネルが２種のマーカーを有してもよいが、他のパネルが８種のマーカーを有してもよく、両方とも、同様の結果をもたらす。
【００２７】
「結合試薬」なる用語および類似の用語は、別の化合物または分子（免疫認識の場合にはエピトープである。）に特異的に、または実質上特異的に（即ち、限られた交差感受性を伴う）結合しうる化合物、組成物または分子をいう。「結合試薬タイプ」とは、単一の特異性を有する１つの結合試薬またはその集団である。結合試薬は通常、抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはその誘導体または類似体であり、さらに、次のものに限られないが、：Ｆｖ断片；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片；Ｆａｂ’断片；Ｆ（ａｂ’）２断片；ヒト化抗体および抗体断片；ラクダ化抗体および抗体断片；および前記の多価の別形態が含まれる。多価結合試薬を適切に使用することもでき、以下に限られないが、単一特異性または二特異性の抗体、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）2断片）、通常、共有結合されているか、その他により安定化された（即ち、
ロイシンジッパーまたはへリックス安定化されている）ｓｃＦｖ断片であるジアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）またはテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。さらに「結合試薬」には、当技術分野で記載されているようなアプタマーが含まれる。
【００２８】
抗体ならびにその誘導体および類似体ならびにアプタマーを含む抗原特異的結合試薬を製造する方法は、当技術分野でよく知られている。動物の免疫化によりポリクローナル抗体を生じさせることができる。標準的な（ハイブリドーマ）方法論に従い、モノクローナル抗体を調製することができる。標準的な方法に従い、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡからＤＮＡ断片を単離し、適切なＶ領域を適切な発現ベクター中でサブクローニングすることにより、ヒト化抗体を含む抗体誘導体および類似体を組換えにより調製することができる。ファージディスプレイおよびアプタマー技術は、文献に記載されており、これらにより、極めて親和性の低い交叉感受性を有する抗原特異的結合試薬のｉｎ ｖｉｔｒｏクローン増幅が可能である。ファージディスプレイの試薬およびシステムは市販されており、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から市販されているＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＰＡＳ）およびＭｏＢｉＴｅｃ ＬＬＣ
（Ｍａｒｃｏ Ｉｓｌａｎｄ、Ｆｌｏｒｉｄａ）から市販されているｐＳＫＡＮ Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍが例示される。アプタマー技術は、例えば、これらに限られないが、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，８４０，８６７号および同第６，５４４，７７６号の明細書に記載されている。
【００２９】
下記のＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰイムノアッセイは、サンドイッチ型アッセイの例である。用語「サンドイッチ型アッセイ」とは、抗原が２つの結合試薬（通常は抗体である）の間にサンドイッチされるイムノアッセイに関する。第１の結合試薬／抗体は表面に結合し、第２の結合試薬／抗体は検出可能な基を含む。検出可能な基の例には例えば、これらに限られないが：蛍光色素、酵素、第２の結合試薬と結合するためのエピトープ（例えば、第２の結合試薬／抗体がマウス抗体である場合には、それは蛍光標識された抗マウス抗体により検出される）、例えば、抗原または結合の対の片割れ、例えばビオチンが挙げられる。その表面は、例えば本明細書に記載されているように、通常の格子型アレイ（例えば、これらに限られないが９６ウェルプレートおよび平面マイクロ
アレイ）の場合には、平面表面であってよいか、あるいはコーティングされているビーズアレイ技術を伴う非平面表面であり、この際、ビーズの各々の「種」は、例えば、蛍光色素（本明細書ならびに米国特許第６，５９９，３３１号、同第６，５９２，８２２号および同第６，２６８，２２２号の明細書に記載のＬｕｍｉｎｅｘ技術など）または量子ドット技術（例えば、米国特許第６，３０６，６１０号明細書に記載されている）で標識されている。
【００３０】
下記の実施例に記載されているビーズ型イムノアッセイでは、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰシステムを使用している。ＬａｂＭＡＰシステムは、スペクトル的に区別される２種の蛍光色素で内部を染色されているポリスチレン微小球を導入している。これらの蛍光色素の正確な比を使用して、特異的なスペクトルアドレスを有する１００種の異なる微小球セットからなるアレイを作製する。各微小球セットは、その表面に異なる反応成分を有することができる。微小球セットは、そのスペクトルアドレスにより区別することができるので、これらを組み合わせると、１００種までの異なる分析物（analytes）を、単一の反応器中で同時に測定することができる。リポーター分子に結合した第３の蛍光色素により、微小球表面で生じた生体分子相互作用を定量する。微小球がＬｕｍｉｎｅｘ分析器を通過するときに、急速に流れている流体の流れの中で２種の別々のレーザーにより個別に調べる。高速デジタル信号プロセッシングにより、微小球をそのスペクトルアドレスに基づいて類別し、１試料当たり数秒で、表面の反応を定量する。
【００３１】
本明細書に記載されるアッセイでは、ビーズ型イムノアッセイが、いくつかの理由により好ましい。ＥＬＩＳＡと比較して、コストおよび処理量が格段に優れている。典型的な平面抗体マイクロアレイ技術（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から市販されているＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙアレイなど）と比較すると、定量目的に関して、ビーズは格段に優れている。それというのも、ビーズ技術は、もともと再現性、コストおよびテクニシャンの時間において困難を伴う血漿または血清の試料の前処理または分取を必要としないためである。この理由から、これらに限られないがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび抗体マイクロアレイ技術といった他のイムノアッセイも、本発明の状況下で使用することができるが、これらは好まれない。本明細書で使用する場合、「イムノアッセイ」とは、所望の血液マーカー、即ち、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの１種を検出および定量することができる免疫アッセイ、通常は、専らではないがサンドイッチアッセイを言及している。
【００３２】
マーカー：ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種、３種または４種もしくはそれ以上の血中レベルを決定するためのアッセイから生じたデータを使用して、患者での卵巣がんの可能性を決定することができる。
【００３３】
本明細書に示すように、次の条件：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビン
HI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOのうちの２種またはそれ以上、通常は３種または４種が患者の血液に当てはまる場合、患者が卵巣がんを有する極めて高い可能性が存在する。１つの実施形態では、次の条件：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOの内の３種またはそれ以上、好ましくは３種または４種が、患者の血液に当てはまる場合には、患者が卵巣がんを有する非常に高い可能性が存在する。
【００３４】
本発明の開示の関係において、「血液」には、本明細書に記載の方法に従い分析することができるすべての血液フラクション、例えば、血清が含まれる。血清は、試験することができる標準的な血液フラクションであり、下記の実施例で試験される。ある特定マーカーの血液レベルを測定するとは、適切ないずれの血液フラクションを、血液レベルを測定するために検査することができ、さらに、データをそのフラクションに存在する値として報告することができることを意味している。限定的に解されてはならないが例えば、あるマーカーの血液レベルを、５０ｐｇ／血清ｍＬとして記載することができる。
【００３５】
前記のように、特定の同定された血液マーカーのレベルを決定することにより卵巣がんを診断する方法を提供する。さらに、前臨床的卵巣がんを検出する方法を提供するが、これは、患者の血液において特定の同定されたマーカーの存在および／またはベロシティ（ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を決定することを含む。ベロシティとは、一定期間にわたる患者血液中でのマーカーの濃度変化を意味している。実施例７では、臨床的卵巣がんの発症を予測する際に、患者の血中特異的マーカーのベロシティを決定する値が、ある期間にわたるデータとして与えられる。前臨床的卵巣がんを示す明白なベロシティを有するマーカーには：卵巣がんの臨床的発症の３０〜４０ヶ月前に濃度が上昇し始める抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０、ならびに卵巣がんの臨床的発症の３０〜４０ヶ月前に濃度が低下し始めるＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
[実施例]
【実施例１】
【００３６】
患者集団
初期（Ｉ〜ＩＩ）段階の卵巣がんと診断されている患者５５人、良性骨盤内腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｐｅｌｖｉｃ ｍａｓｓｅｓ）を有する患者５５人および適合年齢をマッチさせた健康な対照５５人からの血清試料を試験した。初期（Ｉ〜ＩＩ）段階の卵巣がんを有する患者および良性骨盤内疾患を有する女性からの血清試料は、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＧＯＧ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）から得た。ＩＲＢプロトコルのもとに、全参加者から同意および血液検体を得た。婦人科上の診断および卵巣がんの段階付けを検証するため、臨床腫瘍学の専門家がチャートを検討した。組織学および段階を検証するため、病理学者が卵巣がん症例についての病理スライドを調査した。上皮卵巣がんおよび良性骨盤内症状の主要タイプのすべてが提示された。表Ａに患者のデータをまとめた。適合年齢をマッチさせた健康な女性からの対照血清試料は、ＩＲＢプロトコルに従い、Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ Ｃｏｕｔｙ Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｅｔｗｏｒｋから得た。
【００３７】
【表１】
【００３８】
血液試料の収集および貯蔵
標準化された静脈切開手順により、末梢血液１０ｍＬを被験者から採取した。抗凝血剤を用いずに、血液試料を２本の５ｍＬレッドトップ・バキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に集め、遠心分離により血清を分離し、すべての試料を直ちに凍結させ、−８０℃の専用冷凍庫に貯蔵した。すべての血液試料を、貯蔵日時、凍結／解凍サイクルおよび分類などの情報を探せるように研究用コンピューターに記録した。
【００３９】
ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）から購入した多重化キットを使用して、製造者のプロトコルに従い多重分析を行った。これらのキットについて最少サイトカイン検出レベルは、＜５ｐｇ／ｍＬである。次の２９種のサイトカイン、血管由来因子、死因子および成長因子を多重フォーマットで解析した：ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）、ＩＦＮγ（インターフェロンγ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５またはＭＣＰ２としても知られている、Ｒｅｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ Ｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質−１α）、ＭＩＰ−１β（マクロファージ炎症性タンパク質−１β）、ＭＣＰ−１、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）、ＦａｓＬ（Ｆａｓリガンド）、スルビビンおよびＣＡ−１２５。
【００４０】
９６ウェルマイクロプレート様式でアッセイを行った。底部フィルター（ｆｉｌｔｅｒ−ｂｏｔｔｏｍ）９６ウェルマイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）をＰＢＳ／ＢＳ
Ａで１０分間ブロックした。標準曲線を生じさせるために、製造者から得た適切な「標準」の段階的希釈を血清希釈剤中で調製した。「標準」および患者血清を二連で、５０μｌ／ウェルとなるようにピペットにより導入し、ビーズ混合物５０μｌと混合した。マイクロプレートをマイクロタイター・シェーカー上、室温で１時間インキュベーションした。次いで、真空マニホールドを使用して、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＥ結合二次抗体を適切なウェルに加え、暗所で継続的に振盪しながら４５分間インキュベーションした。ウェルを２回洗浄し、アッセイ緩衝液を各ウェルに加え、蛍光リーダーおよびＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ分析用ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含むＢｉｏ−Ｐｌｅｘサスペンジョンアレイ・システムを使用して、試料を分析した。５パラメーター曲線フィッティングを使用して、データ解析を行った。
【００４１】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの開発
ＣＡ−１２５を除くすべてのアナライトについては、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から、ＣＡ−１２５についてはＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）から購入した抗体ペアを使用して、多重化アッセイ系のためのＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＣＡ１２５試薬を開発した（表Ｂ）。
捕捉抗体はモノクローナル抗体であり、検出抗体はポリクローナル抗体であった。捕捉抗体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ）から購入したカルボキシル化ポリスチレン微小球第７４番に共有結合により結合させた。捕捉抗体と微小球との共有結合の形成は、Ｌｕｍｉｎｅｘにより推奨された手順に従って行った。要するに、微小球ストック溶液を、超音波浴（Ｓｏｎｉｃｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｐｉａｑｕｅ，Ｎ．Ｙ．）中で２分間分散させた。２．５×１０6微小球のアリコート
を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）（リン酸緩衝液）を含むマイクロタイター管中で再懸濁させて、最終容量８０μｌにした。微小球の均一な分布が観察されるまで、この懸濁液を超音波処理した。Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を両方とも５０ｍｇ／ｍＬで、リン酸緩衝液中で調製し、続いて、各溶液１０μｌを加えて、反応を安定化させ、微小球を活性化した。この懸濁液を室温で１０分間インキュベーションし、抗体５０μｇを含有するＰＢＳ２５０μｌに再懸濁させた。
【００４２】
混合物を暗所で継続的に振盪しながら一晩インキュベーションした。次いで、微小球をＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０、２５０μｌとともに４時間インキュベーションした。吸引した後に、ビーズをＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．１％アジ化ナトリウム、１ｍＬでブロックした。血球計算盤を用いて微小球を数え、１ｍＬ当たり微小球１０6個の最終濃度で
暗所中、４℃で貯蔵した。微小球２０００個をＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色することにより、モノクローナル抗体の結合効率を検証した。ＥＺ−ＬｉｎｋスルホＮＨＳ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、製造者プロトコルに従い、検出抗体Ａｂをビオチン化した。ＨＡＢＡアッセイを使用して、ビオチン導入の程度を測定したところ、タンパク質１モル当たりビオチン２０モルであった。検出抗体の濃度およびインキュベーション時間に関して、アッセイをさらに最適化した。新たに開発されたアッセイの感度を、連続希釈された精製タンパク質を使用して決定した。変動係数として表されるイントラアッセイ変動性を、患者１０人の試料についての平均をもとに算出し、２つの異なる時点で２回測定した。平均変動係数として表される重複測定の範囲内でのイントラアッセイ変動性は、８．５％であった（データは示さない）。各標準および試料１０個の４重のセット（quadruplicates）測定を試験することにより、インターアッセイ変動性を評価したところ、１０から２２％であり、平均は１６．５％であった（データは示さない）。新た
に開発されたキットを、一緒に多重化し、Ｌｕｍｉｎｅｘプロトコルに従い、交叉感受性が存在しないことを確認した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
加えて、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）から購入した抗体ペアを使用して、多重系のためのＣＡ−１２５試薬を開発した。捕捉抗体は、モノクローナルであり、検出抗体は、ヒツジポリクローナルであった。ＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造者のプロトコルに従い、捕捉抗体（Ａｂ）をビオチン化した。ＨＡＢＡアッセイを使用して、ビオチン導入の規模を測定したところ、タンパク質１モル当たりビオチン２０モルであった。捕捉抗体は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ）から購入したカルボキシル化ポリスチレン微小球第７４番に共有結合させた。Ｌｕｍｉｎｅｘにより推奨された手順に従い、捕捉抗体と微小球との共有結合を行った。
【００４５】
要するに、微小球のストック溶液を、超音波浴（Ｓｏｎｉｃｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｐｉａｑｕｅ，Ｎ．Ｙ．）中で２分間分散させた。２．５×１０6微小球のアリコートを、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）
（リン酸緩衝液）を含むマイクロタイター管中で再懸濁させて、最終容量８０μｌにした。微小球の均一な分布が観察されるまで、この懸濁液を超音波処理した。Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を両方とも５０ｍｇ／ｍＬで、リン酸緩衝液中で調製し、続いて、各溶液１０μｌを加えて、反応を安定化させ、微小球を活性化した。この懸濁液を室温で１０分間インキュベーションし、抗体５０μｇを含有するＰＢＳ２５０μｌ中に再懸濁させた。この混合物を暗所で継続的に振盪しながら一晩インキュベーションした。次いで、微小球をＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０、２５０μｌとともに４時間インキュベーションした。吸引した後に、ビーズをＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．１％アジ化ナトリウム１ｍＬでブロックした。血球計算板を用いて微小球をカウントし、１ｍＬ当たり微小球１０6個の最終濃度で暗所中、４℃で貯蔵した。微小球２０
００個をＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色することにより、モノクローナル抗体の結合効率を試験した。検出抗体（Ａｂ）の濃度およびインキュベーション時間に関して、アッセイをさらに最適化した。連続希釈された精製ＣＡ−１２５を使用しＬｕｍｉｎｅｘアッセイおいて決定された、新開発のアッセイの感度は、２０ＩＵであった。変動係数として表されるイントラアッセイ変動性を、患者１０人の試料についての平均をもとに算出し、２つの異なる時点で２回測定した。平均変動係数として表される重複測定の範囲内でのイントラアッセイ変動性は、８．５％であった（データは示さない）。各標準および試料１０個の４倍重複（quadru
plicates）測定を試験することにより、インターアッセイ変動性を評価した。これらの試料の変動性は、１０から２２％であり、平均は１６．５％であった（データは示さない）。次いで、抗ＣＡ−１２５微小球を既存の多重キットと組み合わせた。
【００４６】
データの統計解析
Ｓ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェア（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｍａｔｈ Ｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，１９９９）を使用して、すべての統計解析を行った。データを初めに、トレーニングおよび試験セットにランダムに分ける；表Ｃに記載。次いで、ロジスティック回帰（Ｈｏｓｍｅｒ，ＤＷ，Ｓ Ｌｅｍｅｓｈｏｗ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８９）を使用して、各マーカーの最適な重み付け、ならびに引き続いて症例であると予測される確率を算出した。予測確率≧０．５のすべてを、予測症例と分類し；予測確率＜０．５を予測対照として分類した。ロジスティックモデルとトレーニングセットとを適合させた後に、疾患状態の判別を試験セットに関して計算した。
【００４７】
【表３】
【００４８】
サイトカイン
市販元から、組換えＶＥＧＦ、ＥＧＦおよびＭＣＰ−１を購入した。ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から、組換えＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１２を得た。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から、ポリクローナル中和抗ＥＧＦ Ａｂ（Ａｂ５２８）を得た。
ＬａｂＭａｐ技術によるサイトカインおよび血管由来因子の血清濃度
ＬａｂＭａｐ技術を使用する多重アッセイで、３種の臨床群：対照の健康なボランティア、良性骨盤内腫瘍を有する女性および初期卵巣がんを有する女性からの患者の血液中で、２６種の異なる血清マーカー（表Ｄ）の循環系濃度を評価した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
対照でも患者群でも、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦおよびスルビビンの血清レベルは検出不可能であった。ＩＬ−１β、ＭＩＰ−１
α、ＭＩＰ−１β、ＨＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＧＦＲおよびＦａｓＬは、測定可能な血清濃度を示したが、これは、対照と患者群とでは異ならなかった（データは示さない）。ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびＣＡ−１２５の血清濃度は、対照に比べて、卵巣がん患者では有意（Ｐ＜０．０１）に高かった。意外にも、卵巣がんを有する女性は、ＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１についてかなり低い血中レベルを示した（ｐ＜０．００１）。表Ｅおよび図１に、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０での結果を示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
統計解析
これらのサイトカインの予診可能性を評価するために、データを初めに、ほぼ同等サイズのトレーニングセットおよび試験セットにランダムに分けた。該当する比較（即ち、対照対初期がん、対照対良性および良性対初期がん）それぞれについて、ロジスティック回帰モデル（Ｈｏｓｍｅｒら，１９８９）を手初めにトレーニングデータに当てはめ；次いで、個々の試験セットを使用して、予測される確率（症例であると）および判別結果を得た。試験およびトレーニングデータのランダムな選択を各モデルで１０００回繰り返し、判別率の変動性に関する確実な推定値を得た。正確に判別されたパーセント（ＰＣＣ）、感度（ＳＥＮ）および特異性（ＳＰＣ）の平均値（トレーニングおよび試験セットの全部で１０００回のランダム分割にわたる）で、結果を記載した。ＰＣＣ、ＳＥＮおよびＳＰＣについての９５％信頼区間（９５％ＣI）も、分布の２．５および９７．５パーセンタ
イルとして示した。Ｓ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェア（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｍａｔｈ Ｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，１９９９）を使用して、すべての統計解析を行った。
【００５３】
通常、変数ｋを用いるロジスティックモデル（即ち、サイトカイン）を次の式で表すが、ここで、ｙ＾は、予測された症例状態であり、ｘ1からｘkは、該当するサイトカインで
の発現レベルである。
【００５４】
【数１】
【００５５】
ｌｏｇ関数（即ち、上式の左側）は、二分する結果（即ち、症例または対照）をｌｏｇ規格では線状である量に変換する。
次いで、ロジスティックモデルからの係数をトレーニングデータに適合させて使用し、症例であると予測された確率を、試験セットにおける各被験者について算出した。症例である予測確率が、トレーニングセットで観察された症例の割合よりも高かった場合には（通常、０．５を上回る）、被験者を予測された症例と判別した。症例であると予測された確率が、トレーニングセットで観察された症例の割合よりも低かった場合には、被験者を予測された対照と判別した。ロジスティックモデルを１つのデータセットに合わせ、次いで、結果を個々の（即ちランダムに選択された）試験セットについて予測することにより、判別の正確度、感度および特異性を公平に推定することができる。
【００５６】
所定の比較（例えば、対照対初期がん）のために、ロジスティックモデルを初めに、個別のサイトカインそれぞれに当てはめた。次いで、最も高い判別率（即ち、正確に判別されるパーセンテージ）をもたらすサイトカインを別個に、残りのサイトカインを各々伴う一連の２変数モデルに入れた。例えば、ＥＧＦが最も良好な判別をもたらした場合には、残りのサイトカインをそれぞれ、ＥＧＦを伴う２変数モデルに入れることにする。次いで、正確に分類された最も高いパーセンテージをもたらす２変数モデルを別個に、残りのサイトカイン各々と組み合わせて、一連の３変数モデルを生じさせる。同様のまたはより良好な判別正確度がより大きなモデルで達成することができるまで、同様のステップアップまたは前方選択の手順を続けた。最も高い判別率をもたらすモデルを、最適モデルと示す。
【００５７】
対照 対 初期卵巣がんの比較
表Ｆは、対照から初期卵巣がんを同定するために個々のサイトカインそれぞれを使用した場合の判別結果を示している。結果は、これらのサイトカインのいずれも個別には、初期がんの特別に正確な予測をもたらさないことを示している。ＥＧＦのみが、試験セット被験者の７５％を超えて正確に判別した。他には２種のサイトカイン（ＭＣＰおよびＩＬ−６）だけが、６０％を上回る正確な判別をもたらした。しかしながら、９５％信頼区間は、９種のサイトカインの中で、３種（ＥＧＦ、ＭＣＰおよびＩＬ−６）が個別に、偶然よりも有意に良好な判別をもたらすことを示している。即ち、ＰＣＣについて低い方の９５％信頼限界は、５０．０％より上であった。
【００５８】
【表６】
【００５９】
ＥＧＦが初期がんを最も予測したので、これをモデル選択プロセスに初めに入れた。前記のように前方選択プロセスを続けることにより、さらなるモデルを案出した。表Ｇは、生じた多重回帰モデルを示している。結果は、４種のサイトカインを伴うモデルが最も良好な類別率をもたらし、したがって、最適モデルとして選択されることを示している。ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＶＥＧＦを含む一モデルは、９０％を上回る正確度を、正確な判別（９０％）、感度（９０％）および特異性（９１％）においてもたらした。６種またはそれ以上のサイトカインを含むさらなるモデルは、判別率の低下をもたらした（ここには示さない）
【００６０】
【表７】
【００６１】
培養卵巣がん細胞の上澄み液中でのサイトカインレベル
ｉｎ ｖｉｖｏデータを実証するために、２種の卵巣腫瘍細胞系列：ＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３の細胞培養培地中におけるＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１のレベルを評価した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ分析により、両方の細胞系列の調整培養培地中でのＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの測定できるレベルが明らかになった。このことは、卵巣腫瘍細胞による前記サイトカインの分泌を示している。対照的に調整培養培地において、測定できるＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０またはＭＣＰ−１は同定することができなかった（データは示さず）。
【００６２】
これらのｉｎ ｖｉｖｏ結果により、ＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２の比較的低い循環濃度が証明された。これらのサイトカインの低いレベルは、腫瘍による消費によると仮定した。この仮定を確認するために、３種すべてのサイトカインを測定可能な濃度で
含有する女性の血清１００μｌとともに、それぞれＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３卵巣腫瘍細胞１０8個をＲＴで１時間インキュベーションした。１時間のインキュベーション後
に、血清からこれら３種のサイトカインの完全な枯渇が観察された。さらに、卵巣腫瘍細胞系は両方とも、ＰＢＳまたは強化血清からＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２を消費した。特異的中和抗体の添加によりＥＧＦの特異的結合が阻害される場合には、血清からのＥＧＦの枯渇は観察されなかった（図２）。卵巣腫瘍細胞によるＰＢＳからの組換えＩＬ−６、ＩＬ−８またはＶＥＧＦの枯渇も観察されなかった（データは示さず）。
【００６３】
別々に染色された蛍光ビーズを使用するＬｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭａｐ検出アッセイは
、慣用されるＥＬＩＳＡを上回る明らかな利点を有する。即ち、ＥＬＩＳＡに匹敵する感度、正確度および再現性で多数のアナライトを同時に検出することができる（Ｖｅｉｋｋｏｌａら，２０００）。正常な対照との比較において、初期卵巣がんに罹った女性の血清をスクリーニングするためにＬａｂＭＡＰ技術を使用したところ、８種の循環タンパク質：ＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８が、卵巣がん特異性を有すると同定された。これらのタンパク質すべての循環レベルは、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定され、刊行されている所見に報告されているレベルに近かった。
【００６４】
対照と比較して、サイトカインレベルの２種の異なるパターンが卵巣がんでは観察された。ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＣＡ−１２５は、卵巣がん患者の血液中では上昇した。加えて、卵巣がんを伴う患者では循環Ｇ−ＣＳＦの比較的高いレベルが、初めて観察された。がん患者の血液中でのサイトカインの高い値は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞、即ち、腫瘍に応答する免疫または内皮細胞による分泌に起因しうる。刊行されている情報（Ｓａｎｔｉｎら，１９９９）と一致して、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｌｅｚｅｒｍａｎら，Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｆｒｅｓｈ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９
８ Ｊｕｎ；９（２）：１７１−９、およびＺｉｌｔｅｎｅｒら， Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．１９９３ Ｓｅｐ；４９（３）：６３５−４１）およびＩＬ−８（Ｘｕ，Ｌ．ａｎｄ Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ ８：ａｎ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃ
ｏｌ Ｒｅｓ，２０００．１２（２）：ｐ．９７−１０６）、ＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ分泌が卵巣がん細胞により観察された。
【００６５】
しかしながら、これらのサイトカインは、他の細胞によっても産生され、例えばＶＥＧＦは、平滑筋、黄体および副腎皮質細胞を含む複数の正常な細胞種により産生されて分泌され；ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）は、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞、線維芽細胞およびリンパ球を含む多くの細胞により産生されうる。腫瘍により分泌される因子は、腫瘍種に特異的であるだろうが、理論的には、腫瘍が一定サイズになって初めて、測定可能になる。このような腫瘍マーカーの例は、ＣＡ−１２５であり、これは、末期の上皮卵巣がんの８５％で上昇するが、Ｉ段階疾患を有する患者ではその５０％未満で上昇するにすぎない。他方、腫瘍の成長に応答して免疫および他の細胞で誘発されるサイトカインは比較的低い腫瘍特異性を示すが、腫瘍進展の初期では上昇し始めうる。理想的には、診断の試験は、両方の群を代表するマーカーの組み合わせを測定しなければならない。
【００６６】
ＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０により異なるパターンが提示されたが、これらは、対照血清と比較して卵巣がんでは低かった。調べた８種の抗原のうち、ＥＧＦが最も強い卵巣がんとの関連を示した。これは、卵巣がんを有する患者では低いＥＧＦレベルが疾患と強い関係を持つことの初めての記載である。甲状腺の分化がんを有する患者で、低下した循環ＥＧＦレベルが観察されている（Ｎｅｄｖｉｄｋｏｖａら，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄｓ Ｎｅｏｐｌａｓｍａ．１９９２；３９（１）：１１−４）が、乳がんまたはメラノーマの患者においてはそうではない（我々の未発表の観察）。
【００６７】
したがって、ＥＧＦの低い循環レベルは、がんに特異的であり得る。卵巣がん細胞はＥＧＦ受容体を発現し、ＥＧＦは、卵巣細胞のためのオートクリン成長因子である（Ｂａｒｏｎ，Ａ．Ｔ．ら，Ｓｅｒｕｍ ｓＥｒｂＢ１ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｏｒ ＩＶ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ
Ｐｒｅｖ，１９９９．８（２）：ｐ．１２９−３７およびＭａｉｈｌｅ，Ｎ．Ｊ．ら，ＥＧＦ／ＥｒｂＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ，２００２．１０７：ｐ．２４７−５８）。我々のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験が示すように、卵巣がん患者における低下した循環ＥＧＦレベルは、卵巣腫瘍細胞によるＥＧＦの消費によるようである。加えて、可溶性ＥＧＦ受容体（ｓＥｒｂＢ１）が、これらの患者末期の血液中で見いだされた（Ｂａｒｏｎら、１９９９およびＭａｉｈｌｅら２００２）。ＥＧＦＲ／ＥＧＦ相互作用は、付加的にＥＧＦのクリアランスを上昇させ、卵巣がん患者で血中ＥＧＦレベルの低減をもたらすようである。前記の刊行物（Ｂａｒｏｎら、１９９９およびＭａｉｈｌｅら、２００２）に反して、ＥｒｂＢ１の循環濃度における、卵巣がんに特異的な差異はＬａｂＭａｐ方法によって観察されなかったことを特記する。ＥＧＦと同様に初期の卵巣がん患者は、低いレベルの循環ＭＣＰ−１を示した。本明細書に示されている知見と同様に、対照に比較して卵巣がんにおけるＭＣＰ−１の低い循環レベルを、Ｐｅｎｓｏｎらが記載している（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ＩＬ−１ｂｅｔａ，ＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＭＣＰ−１，ＧＭ−ＣＳＦ ａｎｄ ＴＮＦａｌｐｈａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０００ Ｊａｎ；１０（１）：３３−４１）。
【００６８】
しかしながら他の研究は、対照に比較して卵巣がん患者でのＭＣＰ−１の高い循環レベルを報告している（Ｈｅｆｌｅｒら， Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａ
ｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９ Ｎｏｖ；８１（５）：８５５−９）。
【００６９】
前記マーカーの各々と卵巣がんとの相関は控えめではあるが、統計解析によりこれらのマーカーの中から３種または４種を含む組み合わせパネルは、疾患との極めて強い相関を示し、したがって卵巣がんを初期診断するために用い得ることが証明された。いくつかのモデルは、卵巣がんの初期診断に関してひけを取らぬ高い感度と特異性とを与えた。したがって、案出されたサイトカインの組み合わせは、マーカーの唯一のサブセットとして見なすべきではない。同数のサイトカインを有する他のモデル（結果に示さず）も、極めて類似した結果を往々にしてもたらしうる。例えば、試験された３変数モデルはすべて、著しく類似した判別率をもたらした。数多くの可能な組み合わせならびにトレーニングおよび試験セットを繰り返し区分するコンピュータによる需要からあらゆる可能なモデルにつ
いて徹底的に検索しなくて済む。ＣＡ−１２５は初期段階の卵巣がんに関して、比較的高い特異性を有するが、感度は低いという我々の観察は、公表物と一致する（例えば、Ｆｏｌｋら，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ １２５ ｌｅｖｅｌｓ
ｉｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ−ｌｏｏｋ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１９９５ Ｍａｙ；５７（２）：１７８−８２）。興味深いことに、判別アルゴリズムにＣＡ−１２５を組み込むと、劣悪な判別結果、即ち低い感度となった。
【００７０】
ＬａｂＭａｐ技術により測定されたいくつかの血清マーカーの組み合わせにより、高い特異性および感度が得られた。したがって、ＬａｂＭａｐ技術により測定された初期卵巣がんについての血清マーカー組み合わせの予測能力は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ技術により同定されたプロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）スペクトルに関してＰｅｔｒｉｃｏｉｎおよびＬｉｏｔｔａのグループが報告した予測能力に匹敵する（Ｇｙｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３）。しかしながらこれら２つの技術を比較すると、ＬａｂＭａｐアッセイは、より高い再現性でしかも低費用の手法を提供している。我々の知る限り、本研究では、血清マーカーを使用する他の文献と比較して、最も高い予測能力が達成された。表Ｈは、単一および組み合わせ血清マーカーの感度および特異性に関する利用可能なデータを表している。
【００７１】
【表８】
【００７２】
1 Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ２００２
2 Ｌｕｏ
3 Ｂａｒｏｎら，１９９９
4 Ｓｋａｔｅｓ
5 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ
6 Ｎａｍ，Ｃｏｌｅ
7 Ｏｅｈｌｅｒ，Ｍ．Ｋ．ａｎｄ Ｈ．Ｃａｆｆｉｅｒ，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅ
ｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ，２０００．２０（６Ｄ）；ｐ．５１０９−１２；Ｏｂｅｒｍａｉｒ，Ａら，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１９９８．７７（１１）：ｐ．１８７０−４；Ｔａｎｉｒら，Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｍａｓｓｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２００３；２４（３−４）：２７１−４；ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒら，２００２
興味深いことに、サイトカイン数を（最適なモデルを超えて）多くするモデルでは、判別率の低下が観察された。この現象は、少なくとも部分的には試料サイズの限界によるようである。充分なデータを利用して、極めて正確な判別、高い感度および高い特異性を得ることができたが、より大きな試料サイズのためにさらなるデータ収集が可能であれば、モデルのさらなる複雑さ、より正確な結果を得ることができる。１変数（即ちモデルでのサイトカイン）当たり少なくとも１０回の観察を得るという一般的なルールは、このモデルでは２〜３変数でほぼ満たされる。ロジスティックモデルの線形特性は、何らかの制約をもたらすかも知れない。それというのもがんの確率は同時に、複数のサイトカインの多重的な組み合わせに依存しうるためである。未来分析は、他のさらに柔軟な回帰および判別方法、例えば、ニューラルネットワークおよび判別ツリーを導入するであろう。
【実施例２】
【００７３】
循環抗体の精製
抗原特異的（単一特異性）循環抗体または２種またはそれ以上のこのような循環抗体の集団（これらに限られないが）を、次のプロトコルに従って精製すると、特異的な循環抗体の血清濃度を決定するためのアッセイを容易にすることができる。この方法で精製されたＩｇは、個々の循環抗体を正確に定量するための対照として使用することができる。
【００７４】
該当する精製抗原、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、スルビビン、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ；ＡＦＰ、ｂＨＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、トランスグルタミナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤ、Ａｋｔ１（ｖ−ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルスがん遺伝子ホモログ１）などを、これらに限られないが、タンパク質をＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合させるための前記プロトコルを使用して、カルボキシレート修飾ポリスチレンビーズ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＬＢ４、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に共有結合させることができる。例えば、下記の実施例に示されているように、ＩＬ−６およびＩＬ−８は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ ＮＪから；ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、スルビビン、ＦａｓおよびＦａｓＬは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から；ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ；ＡＦＰおよびｂｈＣＧは、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）から；トランスグルタミナーゼは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）から；ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から；Ａｋｔ１はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から得た。カップリング反応は、ＰＢＳ、５％ＢＳＡ、０．０１％
ツイーン２０中で行った。ビーズ１ｍＬはタンパク質２ｍｇまで結合させる。アフィニティカラムを、前記のカップリング緩衝液の５カラム容量で平衡させた。
【００７５】
例えば、これらに限られないがＰＢＳを用いて１：２に希釈された血清試料をカラムに適用し、ＲＴ（約２５℃）で３０〜６０分インキュベーションした。該アフィニティカラムを１５カラム容量の結合緩衝液で洗浄した。結合した免疫グロブリン（約９９％ＩｇＧ／１％ＩｇＭ）を、５カラム容量のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＩｇＧ溶離緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００４，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で溶離する。溶離を２８０ｎｍでの吸光によりモニターした。１Ｍトリス（ｐＨ９．５）５０μｌを加えるか、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）結合緩衝液１００μｌを加えることにより、溶離した液を中和した。次のステップの間に、ヒトＩｇＭに対するウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を共有結合させているＳｉｇｍａビーズを有するアフィニティカラムを使用して、ＩｇＭ分子を除去した。最初のアフィティ結合に関して記載したと同様に、手順を正確に行う。最後に分光光度計により、タンパク質濃度を測定する。必要であるか望ましい場合には、標準的な方法論に従い長期保存のために、こうして精製されたヒト単一特異性ＩｇＧ調製物を濃縮し、無菌化し、アリコートに分け、凍結させることができる。
【実施例３】
【００７６】
血清サイトカイン分析
・患者集団
患者集団は、実施例１に記載されている。本研究では、各群からのより少ない試料を利用した（表Ｉ）
【００７７】
【表９】
【００７８】
ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＣＡ−１２５およびＭＣＰ−１についての多重ＬａｂＭａｐアッセイを、実質的に実施例１において記載したように行った。しかし、各アナライトを単一ビーズアッセイで試験して、検出抗体の最適な濃度を決
定した。次いで、微小球を多重化して、インキュベーション時間およびレポーターシグナルに関して最適化した。レポーターシグナルとして、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を様々な濃度で試験した。ＥＧＦＲおよびＦａｓＬでの最小サイトカイン検出レベルは、＜５ｐｇ／ｍＬであり、ＣＡ１２５では、＜５ＩＵ／ｍＬであった。変動係数として表されるイントラアッセイ変動性を、１０個の患者試料での平均に基づいて算出し、異なる２つの時点で２回測定した。平均変動係数として表される重複試験の範囲内でのイントラアッセイ変動性は、５．４〜９．１％の範囲であった（データは示さず）。各標準および１０の試料からなる４重のセット（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を試験することにより、インターアッセイ変動性を評価した。これらの試料の変動性は、５．６〜９．６％であった（データは示さず）。これらの単一アッセイを１つの多重アッセイに組み合わせて、さらに最適化した。２４セット（ｐｌｅｘ）での個々のサイトカインについてのインターアッセイ変動性は、３．５〜９．８％の範囲であり、イントラアッセイ変動性は、３．６〜１２．６％の範囲であった（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより提供された情報）。
データの統計解析
記述的な統計およびグラフ表示（即ちドット・プロット）を作成して、各疾患状態について各マーカーの分布を示した。ｔ検定とノンパラメトリックに等価であるＷｉｌｃｏｘｏｎ順位−和（ｒａｎｋ−ｓｕｍ）検定を使用して、各疾患状態間でのマーカー発現における差の有意性を評価した。スピアマンの（ノンパラメトリック）順位相関も算出して、マーカーの各ペア間での関係を算出した。
【００７９】
Ｓ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェアによって与えられた判別ツリー（ＣＡＲＴ）を使用して、卵巣がんの状態の識別を行った。有望な指標物質（例えば所定のサイトカイン）それぞれの範囲をまず探索し、次いで所定のデータセットの可能性を最大化するスプリット（split）を見出すことにより、判別ツリーは、結果（outcome）のクラス間（例えば、がん患者と対照とを）を識別する。生じたサブセット（または「節（node）」）それぞれの中で、アルゴリズムは、再び最適なスプリットを選択するためにそれぞれの変数の範囲を探索する。すべての観察が完全に識別されるか、あるいは所定の節内での試料サイズがさらに識別するには小さくなりすぎる（即ち、ｎ＝５以下）まで、このプロセスを続ける。データセットにおいて、２つの観察のみが、マーカーに関して欠測値を有しており、解析から除外された。生じた判別ツリーの最終アウトプットは、各スプリットについての決定基準のグラフ表示であり、最終スプリット（即ち末端の節）を越えて、症例であると予測される確率を示している。いくつかの他の方法（ロジスティック回帰およびニューラルネットワーク）も、同様ではあるが、やや最適さには劣る結果で実行された（結果は示さず）。
【００８０】
独立のデータを用いて１０倍交叉妥当化（ten-fold cross-validation）を実行し、判
別正確度（classification accuracy）を評価した。特に、該データを同じサイズ（また
は可能な限り同じサイズ；これらのデータではｎk＝８〜９）の１０個のサブセットにラ
ンダムに分けた。各サブセットについて、モデルを、そのサブセット外のデータの９０％に合わせた；生じたモデル（またはツリー）を次いで、所定サブセット内のデータの１０％に適用した。したがって、生じた判別正確度の推定値は、モデル適合および検証のために、別々のデータサブセットを利用し、かくして再置換のバイアス（ｒｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｉａｓ）を回避する。得られた感度および特異性は、決定ルール（即ち、所定の症例または対照として予測される可能性を判別するためのカットポイント）の範囲にわたって報告され、レシーバ−オペレータ特性（ＲＯＣ）曲線を生じさせた。ＲＯＣ曲線は、様々なカットポイントにわたる（１特異性）による感度の図形表示である。しかしながら交叉妥当化は、データの各サブセットについて可能性として異なるモデルをもたらすために、すべての観察を用いて（即ち、交叉妥当化を用いずに）生じさせた判別ツリーは、最適モデルを記載する目的のために示された。他に記載がなければ、０．５を上回る予測可能性を有する観察は、症例として（または、良性と対照とを比較するための良性
の状態として）判別する。
【００８１】
卵巣がん患者でのサイトカインおよびＣＡ１２５
ＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術を使用する多重アッセイで、３種の臨床群：初期段階（Ｉ〜ＩＩ）卵巣がんを有する女性、良性骨盤内腫瘍を有する女性および年齢をマッチさせた健康な対照（表Ｉ）からの患者の血清試料において、異なる機能群に属する２８種の異なる血清マーカーの循環濃度を評価した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびスルビビンの血清レベルは、対照でも患者の血清でも検出不可能であった。ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＨＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ｂＦＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβは、測定可能な血清濃度を示したが、これらは、対照と患者群とで異なることはなかった（データは示さず）。ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＡ１２５およびＶＥＧＦの血清濃度は、対照に比較して卵巣がん患者では著しく高いことが判明した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１）（表Ｊおよび図３）。ＬａｂＭＡＰ（登録商標）アッセイは、ＥＧＦ（２２４±１２ｐｇ／ｍｌ）およびＭＣＰ−１（３８４±２１ｐｇ／ｍｌ）では相対的に高い血清濃度を示した（表Ｊおよび図３）。意外にも、ＥＧＦおよびＭＣＰ−１の血清レベルは、対照に比較して卵巣がん患者では有意に低かった（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）（表Ｉおよび図３）。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
特に図３は、健康な対照、Ｉ〜ＩＩ期の卵巣がん患者および良性の婦人科疾患を有する
患者でのサイトカインおよび成長因子の血清レベルを示している。初期（Ｉ〜ＩＩ）卵巣がんを有する患者４５人、良性骨盤内腫瘍を有する患者４４人および年齢および性別をマッチさせた健康な対照３７人から血清を集めた。サイトカインおよび成長因子の循環濃度を、「方法」に記載されているようにＬａｂＭＡＰ技術を使用して測定した。測定を２回行った。図中の水平線は平均値を示している。＊はｐ＜０．０５での、＊＊は、ｐ＜０．０１での；＊＊＊はｐ＜０．００１での対照とがん患者との間の統計的有意性を示している。
【００８４】
良性腫瘍を有する患者の血清は、対照と比較して高いレベルのＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＡ−１２５を有していた（ｐ＜０．０５）。しかしながら、がん群と良性群との間に、Ｇ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦ濃度に関して統計的な差異は観察されなかった。ＣＡ−１２５レベルは、がん群に比較して良性群ではかなり（Ｐ＜０．０５）低かった。良性腫瘍を有する患者は、低レベルのＥＧＦ、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１を有することを特徴とする（表Ｊおよび図３）。しかしながら、ＩＬ−６およびＩＬ−８の循環濃度は、卵巣がん患者の血清のみで上昇し、良性群では上昇しなかった（表Ｊおよび図３）。
卵巣がんバイオマーカーとしての血清サイトカインの統計解析
初期の卵巣がんと健康な対照との比較
表Ｊは、初期卵巣がんと対照とを区別するために個々のサイトカインをそれぞれ使用しての判別結果を示している。結果は、マーカーは個別には、初期がんについてやや正確な予測しかもたらさなかった。ＣＡ−１２５、ＥＧＦおよびＩＬ−６のみが、試験セット被験者の８０％を超える割合で正確に分類した（表Ｋ）
【００８５】
【表１１】
【００８６】
図４Ａは、対照と初期卵巣がんとを区別するためにＣＡＲＴ方法論を使用する判別ツリーを表している。図３のモデルは、モデルに適合する各群でのすべての観察を利用した（後続のパラグラフで説明されるように、判別正確度についての後の推定に利用される交叉妥当化とは逆）。この判別ツリーは、８種のマーカーのうち、５種を利用し、これには、ＣＡ１２５、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８が含まれた。各スプリットに記載されたデータの範囲（例えば、ＣＡ−１２５＜２６）は、データのサブセットを示しており、これはさらに分岐により左側に細分化する。例えば、ＣＡ−１２５＜２６を有する被験者を、ＩＬ−６（＜６．３５対＞６．３５）により細分化する一方で、ＣＡ−１２５＞２６を有する被験者を次いでさらに、ＩＬ−８のレベルにより細分化した（＜５．２６５対＞５．１６５）。各最終群（即ち、末端の節）に記載された数は、各サブセットの範囲内で症例である可能性を示している。
【００８７】
次いで、１０倍交叉妥当化を使用して、判別正確率（対象と初期がんとを区別する際の）を得た。図４Ｂは、生じたＲＯＣ曲線を示している。「方法」セクションに記載したように、感度および特異性は、各被験者を症例と対照とに判別するために使用されるカットポイント（即ち、判別ツリーからの予測確率）に依存している。０．５の標準的なカットポイント（即ち、０．５を上回る予測確率を有する者はすべて、がん症例として判別される）を使用すると、感度１００％、特異性８６％および正確な判別９３％が得られる。さらに特異性を９１％に固定すると、著しく高い感度９５．５％が得られた（この場合も正確な判別９３％）。あるいは９５．３％の特異性は、感度８４．１％（および正確な判別９０．０％）に対応する。レシーバ−オペレータ特性（ＲＯＣ）曲線下の全面積は、１（完全な判別を示す）に近く、０．９６６であった。
【００８８】
特に、図４Ａは、初期卵巣がんと健康な対照とを区別するための判別ツリーを示している。矩形は、サイトカインおよびサイトカインカットオフを含むスプリッティング節（splitting nodes）を示している。各スプリットに記載されているデータ範囲は、分岐によ
り左側にさらに細分化されるデータのサブセットを示している。各最終群（即ち末端の節）に記載された数は、各サブセット内で症例である確率を示している。図４Ｂは、バイオマーカー・パネルに関するレシーバ−オペレータ特性（ＲＯＣ）曲線を示している。初期卵巣がんと健康な対照との判別ツリー分析の１０倍交叉妥当化からの結果を示している。いくつかのモデルが、卵巣がんの初期診断に関して比較可能な高い感度および特異性を示した。したがって、結果的に生じたサイトカインの組み合わせを、唯一のマーカーサブセットと見なすべきではない。同じ数のサイトカインを有する他のモデル（示さない）も往々にして、極めて類似した結果をもたらした。例えば、試験された３変数モデルはすべて、非常に似た判別率をもたらした。数多くの可能な組み合わせ、ならびにトレーニングおよび試験セットを繰り返し区分するコンピューターによる要求によって、あらゆる可能なモデルを徹底的に検索しなくてもよい。
【００８９】
・対照および初期卵巣がんと良性状態との比較
良性骨盤内腫瘍と他の群とを区別するための血清バイオマーカー・パネルの有効性を評価するために、別々の判別ツリーモデルを適用して、１）良性状態 対 初期がんを、２）良性状態 対 対照を予測した。同様の１０倍交叉妥当化手順を使用して、判別正確度を評価した。良性とがんとの比較では、被験者の８０．２％が正確に判別され、感度は８４．１％、特異性は７５．７％であった。良性とがんとを比較するための判別ツリー（示さず）は、５種のマーカー（ＣＡ１２５、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＥＧＦおよびＶＥＧＦ）を利用した。良性と対照との比較では、被験者の９０．０％が正確に判別され、感度は８６．５％、特異性は９３．０％であった。良性と対照とを比較するための判別ツリー（示さず）は、８種のマーカーの中から６種を利用し、これにはＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＡ１２５、ＩＬ−６およびＩＬ−８が含まれていた。
【実施例４】
【００９０】
循環抗体についてのＬａｂＭＡＰアッセイの開発
底部がフィルターの９６ウェルマイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で、アッセイを行った。該当する精製抗原（実施例２に記載の供給源からのＩＬ−６、ＩＬ−８、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、スルビビン、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ；ＡＦＰ、ｂｈＣＧ、トランスグルタミナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤおよびＡｋｔ１）を抗体に関する記載と同様にしてＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合させた。
【００９１】
抗原結合ビーズを、４％ＢＳＡを含有するブロック緩衝液とともにマイクロタイターシェーカー上、室温で１時間、プレインキュベーションした。次いで、真空マニホールドを
使用して、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０）でビーズを３回洗浄し、続いて１：２５０に希釈された血清５０μｌとともに４℃で３０分間インキュベーションした。この希釈は、前の血清滴定に基づき抗ＩＬ−８ＩｇＧを回収するには最適のものとして選択された（データ示さず）。次いで洗浄手順を前記のように繰り返し、ビーズをヒトＩｇＧに対して生じたＰＥ結合ロバ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）４μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）とともに、継続的に振盪しながら暗所で４５分間インキュベーションした。ウェルを２回洗浄し、アッセイ緩衝液を各ウェルに加え、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ懸濁アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、試料を分析した。標準曲線のために、抗原結合ビーズを、特異抗原に対する連続希釈ヒト抗体とともにインキュベーションした。単一特異的ヒト抗体の精製は前記した。データ分析は５パラメーター曲線フィッティングを使用して行った。
【実施例５】
【００９２】
初期卵巣がんを有する患者、良性骨盤内腫瘍を有する患者および対照の健康な女性での循環抗体のＬａｂＭＡＰ分析
循環抗体を分析するために、パネルを作成した。このパネルは、次の抗体：ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ｂｈＣＧ、スルビビン、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、トランスグルタミナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ａｋｔ１、ｐ５３；サイクリンＢ、サイクリンＤのための２８アッセイを含む。結果を定量化するために、精製ヒトＩｇＧの標準曲線を利用した。正確な定量のために、所定の抗原に特異的なヒト抗体（単一特異性）を実施例２に前記したように血清から精製した。血清サンプル、実施例１に前記したサンプル＋初期卵巣がんを有する患者からの追加的試料３１種、良性状態を有する患者からの試料６０種（表Ａ）および追加的な対照試料３０種を分析した。次の１２種の抗原に対する抗体の血清濃度は、対照および良性骨盤内腫瘍に比較して卵巣がん患者では著しく高いことが判明した（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）；ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｃ−Ｍｙｃ、ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＭＵＣ−１、スルビビン、ｂＨＣＧ、オステオポンチン、ＰＤＧＦ ＢＢ（図３）。
【００９３】
・初期卵巣がんと健康な対照との比較
この判別ツリーは、１３種のマーカーの中から５種を利用し、これには、ＣＡ１５−３、ＩＬ−８、スルビビン、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃが含まれた。０．５の標準的なカットポイントを使用すると、感度９５％、特異性１００％および正確な判別９８％が得られる。前記の１２種の循環抗体からの３〜約８種からなる他の組み合わせも、高い判別結果をもたらした。
【００９４】
・対照および初期卵巣がんと良性状態との比較
良性とがんとを比較する表Ｌに示されているように、被験者のうちの８９％が感度９５％および特異性８０％で正確に判別された。良性とがんとを比較するための判別ツリー（示さず）は、次の８種の抗原：ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｂＨＣＧおよびスルビビンに対する抗体を利用した。良性と対照との比較では、被験者の９８％が感度９６％および特異性９９％で正確に判別された。良性と対照とを比較するための判別ツリー（示さず）は４種のマーカーを利用し、これには、ＣＡ１５−３、ＩＬ−８、ＭＵＣ１およびｃ−ｍｙｃが含まれた。
【００９５】
【表１２】
【実施例６】
【００９６】
がんマーカーのためのＬａｂＭＡＰアッセイの作成
ＥｒｂＢ２、ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５、サイトケラチン１９（Ｃｙｆｒａ２１−１）、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）のためのアッセイを、実施例１と同様に開発した。これらのアッセイを開発するために使用された抗体および標準の供給源を表Ｍに示す。
【００９７】
【表１３】
【００９８】
初期卵巣がんを有する患者、良性骨盤内腫瘍を有する患者および対照の健康な女性でのがんマーカーのＬａｂＭＡＰ分析
このプロジェクトのために、初期段階卵巣がんを有する患者から試料３１種、良性状態を有する患者からの試料６０種および追加の対照試料３０種（表Ａに含まれる）を利用した。ＣＡ−１２５およびＣｙｆｒａ２１−１の血清濃度は、対照および良性骨盤内腫瘍を有する患者に比較して、卵巣がん患者では著しく高いことが判明した（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲの濃度は、対照分および良性群においてよりもがん群では著しく低かった（Ｐ＜０．０５）（図６）。
・初期卵巣がんと健康な対照との比較
ＬＵＭＩＮＥＸプロファイルのマスキングされたクラス標識を予測するため、アルゴリ
ズムの不偏性能を最適化する統計装置を使用して、次のデータを作成した。このｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓ分析により、感度９１％、特異性９４％および正確な判別９２％が生じた。
・対照および初期卵巣がんと良性状態との比較
これら４種のマーカーの組み合わせを使用する、良性とがんとの比較では、感度４０％および特異性９４％で、被験者の７６％が正確に判別された。これら４種のマーカーの組み合わせを使用する良性と対照との比較では、感度８６％および特異性８９％で、被験者の８７％が正確に判別された。
【００９９】
さらにデータを、ＣＡＲＴプログラムを使用して分析し、その結果を表ＮおよびＯに示す。がんと対照とを区別するためにパネル：サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦを使用すると、感度９４％、特異性９４．０％および正確な判別９４％が生じた。他の有効なパネルには：１）サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦおよびＥＧＦＲ；２）サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦおよびＦａｓ；３）サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡおよびＭ−ＣＳＦ；および４）サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡおよびＣＡ−１２５が含まれる。ＣＡＲＴ方法論を使用するがんと良性との増殖評価に対してパネルＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２を使用すると、感度８１．３％および特異性８８．１％で、被験者の８５．９％が正確に判別された。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
【表１５】
【実施例７】
【０１０２】
縦断的研究
複合ランダム化コントロール試験（ＲＣＴ）を、１９９６年に開始し２００１年１２月に
終了する年間スクリーニングでＳｔ Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ病院（英国、ロンドン）にて行い、がんについては２００３年１２月まで追跡する（Ｓｋａｔｅｓ，ＳＪら．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｉａｌ ＣＡ−１２５ Ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｗｏｍｅｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００３ ２１（Ｓｕｐｐｌ．）：２０６−２１０；「Ｓｋａｔｅｓ ら」）。この試験は、ＣＡ１２５を用い、さらにＳｋａｔｅｓらにより記載されている「Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ」アルゴリズムを使用する、唯一の血清ベースの卵巣がんスクリーニング試験である。そのアルゴリズムを予見的に評価し、このようなＲＣＴの実現可能性を決定するために、この研究が英国で企画された。
【０１０３】
この試験では、閉経期後の５０歳を超える（自己申告）の女性１３６８８人を集められた。基底となる疫学的な情報をすべての女性から得て、６７３４人をスクリーニングアームにランダム化した。これらの女性は、年間スクリーニングを２年間から６年間にわたって受けた。スクリーニングを２００１年１２月に終えた。６年間にわたり、６週間から１年間間隔の連続的な試料が得られた。全部で３５１７５種の試料を、血清バンクで得ることができ、がんおよび他の一般的な疾患の発生を記録するための追跡が進行中である。このコレクションからの最も独特で貴重な試料は、卵巣がんを有すると診断された女性からの臨床前の試料である。この研究からの血清バンクは、症状による提示と対照的に、スクリーニングにより卵巣／ファロピオ卵管のがんの進展が検出される１年未満前〜６年前からの１９人の女性からの９３血清試料のセットを目下含んでいる。
【０１０４】
すべての症例および対照は、高い家族履歴リスクを有さない、即ち、卵巣がんを有する親戚を１人以下しか有さない、閉経期後の≧５０才の女性である。原発性の卵巣／ファロピオ卵管がんと診断された研究参加者からの各血清試料を、健康なままだった女性からの３試料とマッチングさせた。すべての試料を採取し、郵便により室温、凝血管中で輸送した。中央研究室に届いたら、これらを直ちに遠心分離させ、血清を冷凍庫中、−２０℃で保管した。試料の輸送時間をすべての試料に関して記録した。すべて、５６時間未満の輸送時間を有していた。目下の研究では、試料の１アリコートを解凍し、１００ｍＬのアリコートに分配し、これを、冷凍庫中−２０℃で貯蔵した。
【０１０５】
卵巣がんを発症した、Ｂａｒｔの研究での女性から得た一連の血清試料をＬａｂＭＡＰ技術の使用により、実施例１〜６に記載のサイトカイン、循環抗体およびガンマーカーに関して分析した。図７Ａおよび７Ｂは、診断のほぼ３０から４０ヶ月前に、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＰＤＧＦＲαに対する抗体（図７Ａ）およびサイトカイン、ＩＬ−６、ＩＰ−１０（インターフェロンγ誘発タンパク質、ＭＷ１０ｋＤＡ）およびＩＦＮγの濃度（１１人の患者での平均）が一過性で上昇することを示している。
【０１０６】
さらに、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの濃度は、診断の４０ヶ月前から確実に減少する（図７Ｂ）。平均ＣＡ−１２５濃度の上昇は、診断の９ヶ月前に初めて明らかになる（図７Ｂ）。さらに目下のところ、ＣＡ−１２５の上昇は、介入のための充分な正当性を表さない。したがって、いくつかのマーカーのベロシティを組み合わせることは、外科的に介入することについて卵巣がん発現の充分な指標として役立つであろう。図７Ａおよび７Ｂにおいて、３〜３０ヶ月の時点で、ｎ＝１１：３６ヶ月は実際には、３６から４２ヶ月の期間を表しており（ｎ＝１１）、４２ヶ月は実際には、４２ヶ月以上の期間を示している（ｎ＝９）。
【０１０７】
多重Ｌｕｍｉｎｅｘ ＬａｂＭＡＰアッセイを、実施例１および３の記載とほぼ同様にして循環タンパク質；ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１、Ｍ
ＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１５、ＣＥＡ、ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲについて、さらに実施例４および５の記載と同様にして循環抗体；抗ＥＧＦ、抗ＩＬ−８、抗ＶＥＧＦ、抗ｐ５３、抗スルビビン、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体２）、抗ＭＵＣ１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｃ−ｍｙｃ２、抗オステオポンチン、抗ＰＳＡ、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦ、抗Ａｋｔ１および抗ＰＤＧＦＲα（血小板由来成長因子受容体α）について行った。循環抗体を、実施例２の記載のように抗原結合ビーズの混合物を使用してアフィニティ精製した。抗原結合ビーズは実施例２での記載と同様にして調製した。
【０１０８】
本明細書では、本発明の特定の実施形態を、本発明を限定するためではなく本発明を詳述するために記載したのであるが、当技術分野の専門家であれば、添付の請求項に記載の発明から逸脱することなく、本発明の原理および範囲内で、各部の詳細、材料および配置の数多くのバリエーションを作成することができることを認めるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、卵巣がん患者（OvCa）および健康な対照（C）での血清マーカーを示すグラフである。
【図２】図２は、卵巣がん細胞による可溶性ＥＧＦの吸収を示すグラフである。図中、“serum”は、血清を、“control”は対照を意味する。
【図３】図３は、実施例３に記載された３研究群における血清サイトカインレベルの分布を示すグラフである。図中、“benign”は、良性を、“control”は対照を意味する。
【図４Ａ】図４Ａは、初期段階卵巣がんと健康な対照とを区別するための判別ツリーを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例４に記載のＲＯＣ曲線を示すグラフである。図中、“specificity”は、特異性を、“sensitivity”は感度を意味する。
【図５】図５は、実施例６に記載された３研究群における循環抗体の血清レベル分布を示すグラフである。図中、“benign”は良性を、“control”は対照を意味する。
【図６】図６は、実施例６に記載された３研究群でのがんマーカーの血清レベル分布を示すグラフである。図中、“benign”は良性を、“control”は対照を意味する。
【図７Ａ】図７Ａは、血清中を循環する血清マーカーのベロシティを示すグラフである。図中、“Months before diagnosis”は、診断前の月数を意味する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、血清中を循環する血清マーカーのベロシティを示すグラフである。図中、“Months before diagnosis”は、診断前の月数を意味する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上を含む血液マーカーパネルにおいて、該患者の血液試料中のマーカーレベルを決定することを含み、この場合、次の状態：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOのうちの２つまたはそれ以上の存在が、患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの３種から５種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの４種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの５種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記のパネルが、サイトケラチン１９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記のパネルが、カリクレイン−８をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記のパネルが、ＣＥＡをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＣＡ−１２５の一方または両方をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＦａｓＬの一方または両方をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記のパネルが、ＣＫ−１９をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記のパネルが：
ａ． ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｂ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；
ｃ． ＣＥＡ、ＦＡＳ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｄ． サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；
ｅ． カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｆ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；
ｇ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆａｓ；
ｈ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｉ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；
ｊ． ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２；および
ｋ． 抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ
のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
線形回帰分析、判別ツリー分析およびヒューリスティックなナイーブＢａｙｅｓ分析からなる群から選択される統計的方法を適用することにより、患者の血液での２種またはそれ以上のマーカーのレベルと対照試料での同じマーカーのレベルとを比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の統計的方法を、コンピュータープロセスにより行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の統計的方法は、判別ツリー分析である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約８０％の感度および少なくとも約８０％の特異性をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約８５％の感度をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約８５％の特異性をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９０％の特異性をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９９％の特異性をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記のパネルは、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチンおよび抗ＰＤＧＦのうちの２種またはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記のパネルは、ＣＡ−１２５、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＣＥＡおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記のパネルは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５およびサイトケラチン１９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記のパネルは、抗ＣＡ１５−３、ＩＬ−８、スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記のパネルは、抗ＣＡ１５−３、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３、抗ｂＨＧＣおよび抗ｃ−ｍｙｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記の血液試料は、血清試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
患者の血液におけるＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上の量を決定するため、イムノアッセイを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記のイムノアッセイは、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に特異的な複数の結合試薬タイプを含むアレイを利用し、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上に特異的な結合試薬タイプを含み、その際、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合していることを特徴とするアレイ。
【請求項３４】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬が結合するビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３５】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３６】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３７】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗
ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上に対して個別に特異的である複数の結合試薬タイプから実質的になるアレイで、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合する、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３８】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの３種から５種を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３９】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの４種を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４０】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの５種を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４１】
前記のパネルが、サイトケラチン１９を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４２】
前記のパネルが、カリクレイン−８をさらに含む、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４３】
前記のパネルが、ＣＥＡをさらに含む、請求項４２に記載のアレイ。
【請求項４４】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＣＡ−１２５の一方または両方をさらに含む、請求項４３に記載のアレイ。
【請求項４５】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５をさらに含む、請求項４２に記載のアレイ。
【請求項４６】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＦａｓＬの一方または両方をさらに含む、請求項４５に記載のアレイ。
【請求項４７】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５をさらに含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４８】
前記のパネルが、ＣＫ−１９をさらに含む、請求項４７に記載のアレイ。
【請求項４９】
前記のパネルが：
ａ． ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｂ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；
ｃ． ＣＥＡ、ＦＡＳ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｄ． サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；
ｅ． カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｆ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；
ｇ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆａｓ；
ｈ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｉ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；
ｊ． ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２；および
ｋ． 抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ
のいずれかである、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項５０】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＩＬ−８、抗オステオポンチン、抗ＶＥＧＦおよび抗ＰＤＧＦのうちの少なくとも１種のレベルを患者の血液試料で決定することを含み、この場合、次の状態：抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗ＩＬ−８HI、抗オステオポンチンHI、抗ＶＥＧＦHIおよび抗ＰＤＧＦHIのうちの１種または複数の存在が患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５１】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃを含む血液マーカーパネルで、患者の血液試料中のマーカーレベルを決定することを含み、この場合、次の状態：抗ＣＡ１５−３HI、抗ＩＬ−８HI、抗スルビビンHI、抗ｐ５３HIおよび抗ｃ−ｍｙｃHIの存在が患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５２】
前記の血液マーカーパネルは、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦおよび抗ｂＨＣＧをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
線形回帰分析、判別ツリー分析およびヒューリスティックなナイーブＢａｙｅｓ分析からなる群から選択される統計的方法を適用することにより、患者の血液でのマーカーのレベルと対照試料での同じマーカーのレベルとを比較することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記の統計的方法を、コンピュータープロセスにより行う、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記の統計的方法は、判別ツリー分析である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９０％の感度および少なくとも約９９％の特異性をもたらす、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９０％の感度および少なくとも約９９％の特異性をもたらす、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
患者の血液中の抗ＣＡ１５−３HI、抗ＩＬ−８HI、抗スルビビンHI、抗ｐ５３HIおよび抗ｃ−ｍｙｃHIの量を決定するため、イムノアッセイを行うことを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記のイムノアッセイは、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に特異的な複数の結合試薬タイプを含むアレイを利用し、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃに特異的な複数の結合試薬タイプを含み、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合していることを特徴とするアレイ。
【請求項６４】
抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦおよび抗ｂＨＣＧに特異的な複数の結合試薬タイプをさらに含み、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項６３に記載のアレイ。
【請求項６５】
臨床的卵巣がんの発症を予測する方法であって、患者の血液中の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上の、２つまたはそれ以上の時点での濃度変化を決定することを含み、この場合、２つの時点間での該患者の血液中の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度上昇ならびに２つの時点間での該患者の血液中のＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの濃度低下が、臨床的卵巣がんの発症の前兆であることを特徴とする方法。
【請求項６６】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１のうちの３種またはそれ以上を含む血液マーカーパネルで、該患者の血液試料中のマーカーレベルを決定することを含み、この場合、次の状態：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHIまたはＭＣＰ−１LOのうちの３種またはそれ以上の存在が、患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項６７】
ＥＧＦLOは、ＥＧＦが約２２４ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味し、Ｇ−ＣＳＦHIは、Ｇ−ＣＳＦが約２２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−６HIは、ＩＬ−６が約８．８ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−８HIは、ＩＬ−８が約１０．２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＣＡ−１２５HIは、ＣＡ−１２５が約１０ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＶＥＧＦHIは、ＶＥＧＦが約９１ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＭＣＰ−１LOは、ＭＣＰ−１が約３４２ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
患者の血液中でのＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦまたはＭＣＰ−１の量を決定するため、イムノアッセイを行うことを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記のイムノアッセイは、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に特異的な複数の結合試薬タイプを含むアレイを利用し、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイ
プは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、ＣＡ−１２５およびＭＣＰ−１のうちの３種またはそれ以上に特異的な複数の結合試薬タイプを含み、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合していることを特徴とするアレイ。
【請求項７４】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項７３に記載のアレイ。
【請求項７５】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項７４に記載のアレイ。
【請求項７６】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項７４に記載のアレイ。
【請求項７７】
他の結合試薬に対比して独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合しているＣＡ−１２５に特異的な結合試薬タイプをさらに含む、請求項７３に記載のアレイ。
【請求項１】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上を含む血液マーカーパネルにおいて、該患者の血液試料中のマーカーレベルを決定することを含み、この場合、次の状態：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHI、ＭＣＰ−１LO、抗ＩＬ−６HI、抗ＩＬ−８HI、抗ＣＡ−１２５HI、抗ｃ−ｍｙｃHI、抗ｐ５３HI、抗ＣＥＡHI、抗ＣＡ１５−３HI、抗ＭＵＣ−１HI、抗スルビビンHI、抗ｂＨＣＧHI、抗オステオポンチンHI、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗Ａｋｔ１HI、抗サイトケラチン１９HIおよび抗ＰＤＧＦHI、ＣＡ−１２５HI、サイトケラチン１９HI、ＥＧＦＲLO、Ｈｅｒ２／ｎｅｕLO、ＣＥＡHI、ＦａｓＬHI、カリクレイン−８LO、ＥｒｂＢ２LO、およびＭ−ＣＳＦLOのうちの２つまたはそれ以上の存在が、患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの３種から５種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの４種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの５種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記のパネルが、サイトケラチン１９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記のパネルが、カリクレイン−８をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記のパネルが、ＣＥＡをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＣＡ−１２５の一方または両方をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＦａｓＬの一方または両方をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記のパネルが、ＣＫ−１９をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記のパネルが：
ａ． ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｂ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；
ｃ． ＣＥＡ、ＦＡＳ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｄ． サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；
ｅ． カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｆ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；
ｇ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆａｓ；
ｈ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｉ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；
ｊ． ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２；および
ｋ． 抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ
のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
線形回帰分析、判別ツリー分析およびヒューリスティックなナイーブＢａｙｅｓ分析からなる群から選択される統計的方法を適用することにより、患者の血液での２種またはそれ以上のマーカーのレベルと対照試料での同じマーカーのレベルとを比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の統計的方法を、コンピュータープロセスにより行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の統計的方法は、判別ツリー分析である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約８０％の感度および少なくとも約８０％の特異性をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約８５％の感度をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約８５％の特異性をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９０％の特異性をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９９％の特異性をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記のパネルは、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチンおよび抗ＰＤＧＦのうちの２種またはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記のパネルは、ＣＡ−１２５、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＣＥＡおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記のパネルは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５およびサイトケラチン１９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記のパネルは、抗ＣＡ１５−３、ＩＬ−８、スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記のパネルは、抗ＣＡ１５−３、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３、抗ｂＨＧＣおよび抗ｃ−ｍｙｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記の血液試料は、血清試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
患者の血液におけるＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上の量を決定するため、イムノアッセイを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記のイムノアッセイは、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に特異的な複数の結合試薬タイプを含むアレイを利用し、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ＩＬ６、抗ＩＬ８、抗ＣＡ−１２５、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ａｋｔ１、抗サイトケラチン１９、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦ、ＦａｓＬ、ＥｒｂＢ２およびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上に特異的な結合試薬タイプを含み、その際、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合していることを特徴とするアレイ。
【請求項３４】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬が結合するビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３５】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３６】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３７】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗
ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上に対して個別に特異的である複数の結合試薬タイプから実質的になるアレイで、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合する、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３８】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの３種から５種を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３９】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの４種を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４０】
前記のパネルが、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＡ−１２５、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１５−３、抗ＭＵＣ−１、抗スルビビン、抗ｂＨＣＧ、抗オステオポンチン、抗ＰＤＧＦ、サイトケラチン１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、カリクレイン−８、Ｍ−ＣＳＦおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの５種を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４１】
前記のパネルが、サイトケラチン１９を含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４２】
前記のパネルが、カリクレイン−８をさらに含む、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４３】
前記のパネルが、ＣＥＡをさらに含む、請求項４２に記載のアレイ。
【請求項４４】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＣＡ−１２５の一方または両方をさらに含む、請求項４３に記載のアレイ。
【請求項４５】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５をさらに含む、請求項４２に記載のアレイ。
【請求項４６】
前記のパネルが、Ｍ−ＣＳＦおよびＦａｓＬの一方または両方をさらに含む、請求項４５に記載のアレイ。
【請求項４７】
前記のパネルが、ＣＡ−１２５をさらに含む、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項４８】
前記のパネルが、ＣＫ−１９をさらに含む、請求項４７に記載のアレイ。
【請求項４９】
前記のパネルが：
ａ． ＣＡ−１２５、サイトケラチン−１９、Ｆａｓ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｂ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、Ｆａｓ、ＥＧＦＲ、カリクレイン−８；
ｃ． ＣＥＡ、ＦＡＳ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｄ． サイトケラチン１９、カリクレイン８、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、Ｍ−ＣＳＦ；
ｅ． カリクレイン−８、ＥＧＦＲ、ＣＡ−１２５；
ｆ． サイトケラチン−１９、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦＲ；
ｇ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＡ−１２５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆａｓ；
ｈ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、Ｍ−ＣＳＦ；
ｉ． サイトケラチン−１９、カリクレイン−８、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５；
ｊ． ＣＡ１２５、サイトケラチン１９、ＥｒｂＢ２；および
ｋ． 抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃ
のいずれかである、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項５０】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＩＬ−８、抗オステオポンチン、抗ＶＥＧＦおよび抗ＰＤＧＦのうちの少なくとも１種のレベルを患者の血液試料で決定することを含み、この場合、次の状態：抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕHI、抗ＩＬ−８HI、抗オステオポンチンHI、抗ＶＥＧＦHIおよび抗ＰＤＧＦHIのうちの１種または複数の存在が患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５１】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃを含む血液マーカーパネルで、患者の血液試料中のマーカーレベルを決定することを含み、この場合、次の状態：抗ＣＡ１５−３HI、抗ＩＬ−８HI、抗スルビビンHI、抗ｐ５３HIおよび抗ｃ−ｍｙｃHIの存在が患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項５２】
前記の血液マーカーパネルは、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦおよび抗ｂＨＣＧをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
線形回帰分析、判別ツリー分析およびヒューリスティックなナイーブＢａｙｅｓ分析からなる群から選択される統計的方法を適用することにより、患者の血液でのマーカーのレベルと対照試料での同じマーカーのレベルとを比較することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記の統計的方法を、コンピュータープロセスにより行う、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記の統計的方法は、判別ツリー分析である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９０％の感度および少なくとも約９９％の特異性をもたらす、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記のパネルは、前記の統計的方法を使用すると少なくとも約９０％の感度および少なくとも約９９％の特異性をもたらす、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
患者の血液中の抗ＣＡ１５−３HI、抗ＩＬ−８HI、抗スルビビンHI、抗ｐ５３HIおよび抗ｃ−ｍｙｃHIの量を決定するため、イムノアッセイを行うことを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記のイムノアッセイは、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に特異的な複数の結合試薬タイプを含むアレイを利用し、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
抗ＣＡ１５−３、抗ＩＬ−８、抗スルビビン、抗ｐ５３および抗ｃ−ｍｙｃに特異的な複数の結合試薬タイプを含み、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合していることを特徴とするアレイ。
【請求項６４】
抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−６、抗ＥＧＦおよび抗ｂＨＣＧに特異的な複数の結合試薬タイプをさらに含み、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項６３に記載のアレイ。
【請求項６５】
臨床的卵巣がんの発症を予測する方法であって、患者の血液中の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕのうちの２種またはそれ以上の、２つまたはそれ以上の時点での濃度変化を決定することを含み、この場合、２つの時点間での該患者の血液中の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗ＭＵＣ−１、抗ｃ−ｍｙｃ、抗ｐ５３、抗ＣＡ−１２５、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ７２−４、抗ＰＤＧＦＲα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度上昇ならびに２つの時点間での該患者の血液中のＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの濃度低下が、臨床的卵巣がんの発症の前兆であることを特徴とする方法。
【請求項６６】
患者における卵巣がんの存在を決定する方法であって、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１のうちの３種またはそれ以上を含む血液マーカーパネルで、該患者の血液試料中のマーカーレベルを決定することを含み、この場合、次の状態：ＥＧＦLO、Ｇ−ＣＳＦHI、ＩＬ−６HI、ＩＬ−８HI、ＶＥＧＦHIまたはＭＣＰ−１LOのうちの３種またはそれ以上の存在が、患者における卵巣がんの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項６７】
ＥＧＦLOは、ＥＧＦが約２２４ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味し、Ｇ−ＣＳＦHIは、Ｇ−ＣＳＦが約２２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−６HIは、ＩＬ−６が約８．８ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＩＬ−８HIは、ＩＬ−８が約１０．２ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＣＡ−１２５HIは、ＣＡ−１２５が約１０ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＶＥＧＦHIは、ＶＥＧＦが約９１ｐｇ／ｍＬを上回ることを意味し、ＭＣＰ−１LOは、ＭＣＰ−１が約３４２ｐｇ／ｍＬ未満であることを意味する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
患者の血液中でのＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦまたはＭＣＰ−１の量を決定するため、イムノアッセイを行うことを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記のイムノアッセイは、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１に特異的な複数の結合試薬タイプを含むアレイを利用し、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合している、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイ
プは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、ＣＡ−１２５およびＭＣＰ−１のうちの３種またはそれ以上に特異的な複数の結合試薬タイプを含み、この場合、各結合試薬タイプは独立に、１個または複数の支持体の１つまたは複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合していることを特徴とするアレイ。
【請求項７４】
前記の支持体は、識別可能なマーカーを含むビーズであり、この場合、各結合試薬タイプは、別の結合試薬タイプが結合しているビーズとは異なる識別可能なマーカーを含むビーズに結合している、請求項７３に記載のアレイ。
【請求項７５】
前記の識別可能なマーカーは、蛍光化合物を含む、請求項７４に記載のアレイ。
【請求項７６】
前記の識別可能なマーカーは、量子ドットを含む、請求項７４に記載のアレイ。
【請求項７７】
他の結合試薬に対比して独立に、１個または複数の支持体の１個または複数の表面において１個または複数の別々の位置に結合しているＣＡ−１２５に特異的な結合試薬タイプをさらに含む、請求項７３に記載のアレイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５０２９８３（Ｐ２００７−５０２９８３Ａ）
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３９４１（Ｐ２００６−５２３９４１）
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６３１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６１２６
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０１１０２９８８）ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション (24)
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６３１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６１２６
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０１１０２９８８）ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション (24)
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