アガラーゼを用いた微生物の取得方法
【課題】ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用して、ＶＢＮＣ状微生物だけでなく、ストレス耐性微生物にも適用でき、かつ、微生物を効率良く取得できる技術を提供する。
【解決手段】自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物、或いはストレス耐性微生物を取得するにあたり、試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、当該微生物含有ゲルマイクロドロップを培養し、当該ゲル内で微生物が増殖しない、或いは微生物が増殖する微生物含有ゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法。
【解決手段】自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物、或いはストレス耐性微生物を取得するにあたり、試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、当該微生物含有ゲルマイクロドロップを培養し、当該ゲル内で微生物が増殖しない、或いは微生物が増殖する微生物含有ゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然界から産業上有用な微生物を取得するためのスクリーニング技術に関し、更に詳細には、自然界に多く存在し、生存するが培養が困難な微生物群又はストレス耐性微生物を、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用して効率良く取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を分離し、培養し、新たな微生物を得るための手段としては、平板培養法が古くから知られている。これは、１８７６年にコッホが発明した方法であり、多種多様の微生物が混在する試料を平板培地（プレート）にまき、一定時間培養後、プレート上に形成されたコロニーを単離する微生物の単一コロニー又は単一細胞を分離する方法である。通常、単離されたコロニーの中から、目的にかなう微生物が検索される。
この平板培養法をベースとして様々な微生物の取得方法が開発されると共に、産業上有用な微生物が数多く分離され利用されてきた。
【０００３】
また、１９７０年代の後半には、蛍光顕微鏡を用いた分離源中の全菌数計数法が確立され、その後、多種多様な微生物を計数する技術が開発された。
一方で、自然界分離源中の微生物に起因する生物活性を蛍光色素染色法で検出する技術が開発され、これらの技術開発によって従来の平板培養法では培養できない微生物が自然界に多く存在することが解明されてきた。
【０００４】
土壌、河川、汚泥等の自然界には多種多様な微生物が存在するが、その中には、上述の平板培養法に従い、通常の栄養培地で培養可能な微生物群と、生物活性を示すが培養困難な微生物群が存在し、後者の生物活性を示すが培養困難な微生物は、ＶＢＮＣ状態の微生物（自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物）として知られるようになった。
【０００５】
通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源から、ＶＢＮＣ状微生物のみを分離する方法としては、例えば、（１）試料液中の微生物細胞を、アガロースゲル微小粒子中に包括してアガロースゲル微小粒子集団を得て、（２）上記アガロースゲル微小粒子集団から、上記試料中に含まれている微生物のうち平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖できるような増殖環境下に置き、（３）増殖環境におかれたアガロースゲル微小粒子集団から１個の微生物細胞を有する微小粒子をセルソーターにより識別して分離する方法が開発され、活性汚泥から新規微生物を取得する方法として有効であることが示されている（特許文献１：特開２０００−１９７４７９号公報）。
【０００６】
前記（１）は、いわゆるゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法に基づくものである。ゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法とは、試料液中の微生物細胞をアガロースなどのゲル微小粒子（ゲルマイクロドロップ）中に包括させ、１個のゲルマイクロドロップが１個の微生物細胞を有するゲルマイクロドロップ集団を得る方法である。
一方、（３）は、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法に基づくものである。フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法とは、粒子をその物理的または化学的差異をパラメーターとして、セルソーター等を用いて分離する方法である。
【０００７】
このような上記特許文献１（特開２０００−１９７４７９号公報）記載の方法によれば、ＶＢＮＣ状微生物の単一細胞をアガロースゲルに包括した形で分離できる。
このような方法により分離されたＶＢＮＣ状微生物は、いわば仮死状態にあることから、実際に利用するためには、該微生物を培養可能な状態あるいは平板培養でコロニー形成可能な状態、すなわち通常の微生物に蘇生させる必要がある。
このようなＶＢＮＣ状微生物の蘇生に用いられる技術としては、例えばカタラーゼを含む栄養培地を利用する方法が有効であることが知られている（特許文献２：特開２００４−０８９１０６号公報）。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１９７４７９号公報
【特許文献２】特開２００４−０８９１０６号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，３８６１−３８６６，（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記特許文献１（特開２０００−１９７４７９号公報）記載のゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用した微生物の分離方法は、微生物のコロニー形成が十分になされず微生物の有効利用を図ることができないという問題があった。
【００１０】
また、上述のようなゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を用いた微生物分離法は、通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源から、通常の生育が良好な菌を分離するための方法（非特許文献１：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，３８６１−３８６６，１９９０）、或いはＶＢＮＣ状微生物のみを分離するための方法として考えられているが、ゲル内という特殊な環境下、且つ、高温、高浸透圧、高過酸化水素など、微生物にとりストレスのかかる環境下で生育する微生物、いわゆるストレス耐性微生物の分離にも応用できる可能性があるとも考えられる。すなわち、上記特許文献１記載の分離方法のうち、前記（２）の系における培養条件を、通常の微生物が増殖できないようなストレスのかかる条件とし、さらに、（３）の系にて１個のゲルマイクロドロップ内に複数の微生物が存在するものを分離・採取するようにすれば、ストレス耐性微生物の分離に利用できる可能性があるとも考えられる。
【００１１】
しかし、特許文献１記載の方法をストレス耐性微生物に適用すると、上述のＶＢＮＣ状微生物の場合と同様、微生物の利用効率の点で問題が生じるものと推測される。
また、特許文献１記載には、アガロースとしてゲル化温度の低いもの、すなわち融解温度の低いアガロースを利用することが好ましいとされており、ストレス耐性微生物、特に高温（例えば、５０〜６０℃）での生育能を有する微生物に、このような中温で生育する微生物を想定したゲル化温度の低いアガロース（例えば、Ｓｉｇｍａ社製：カタログ番号Ａ２５７６）を適用すると、培養の際の高温（例えば、５０〜６０℃）で融解してしまい、微生物の取得が事実上困難となるという問題があった。そこで、融解温度の高いアガロースを使用すると、ゲル強度が高いため、ゲル化温度が低くゲル強度も低いアガロースを使用した場合と比較して物理的な力によるアガロースゲルの破壊が困難となり、アガロースゲルから、微生物を取り出す工夫が一層必要になる。
【００１２】
この発明の主要な課題は、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用して、ＶＢＮＣ状微生物だけでなく、ストレス耐性微生物にも適用でき、かつ、微生物を効率良く取得できる技術を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の課題についての研究において、ゲルマイクロドロップ法およびフローサイトメトリー法を利用してＶＢＮＣ状微生物やストレス耐性微生物を効率良く取得するための条件について、鋭意検討を重ねた。
その結果、ゲルマイクロドロップ法およびフローサイトメトリー法を経て分離されたＶＢＮＣ状性微生物あるいは各ストレス耐性微生物を含有するゲルマイクロドロップに、アガラーゼを添加してアガロースゲルを溶解することにより、内包する微生物を効率よく取得できることを見出した。アガラーゼによってアガロースゲルを溶解した場合、溶解しなかった場合と比較し、コロニー形成数が５〜７倍に向上することが明らかとなり、主要課題を解決することができた。
【００１４】
次に、堆肥中微生物をアガロースゲルで内包した後、通常の栄養培地で培養し、ゲルマイクロドロップに包括したＶＢＮＣ状微生物をフローサイトメトリー法で分離した後、アガラーゼによってアガロースゲルを溶解して、カタラーゼを添加して培養すると、アガラーゼを添加しなかった場合と比較し、コロニー形成数が５倍に向上することが明らかとなった。
【００１５】
さらに、堆肥中微生物をアガロースゲルで内包した後、各ストレス条件での栄養培地で培養し、ゲルマイクロドロップに包括した各ストレス耐性微生物をフローサイトメトリー法で分離した。その後、アガラーゼによってアガロースゲルを溶解して、寒天平板培地で培養すると、アガラーゼを添加しなかった場合と比較し、コロニー形成数が５〜６倍、或いはそれ以上に向上することが明らかとなり、主要課題を解決した。
【００１６】
アガラーゼに関しては、アガロース製ゲルマイクロドロップ内の遺伝子を効率良く取得・解析する方法としては報告例があるが（特表２００２−５３１０５６号公報参照）、ＤＮＡと比較するとサイズが大きく、かつ、現に生きている状態での取得が望まれる、ＶＢＮＣ状微生物あるいはストレス耐性能を有する微生物の取得に応用した例は未だない。
【００１７】
即ち、本発明によれば、自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を取得するにあたり、試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、当該微生物含有ゲルマイクロドロップを培養し、当該ゲル内で微生物が増殖せずかつ１個の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法が提供される。
また、本発明によれば、ストレス耐性微生物を取得するにあたり、試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、当該微生物含有ゲルマイクロドロップをストレスのかかる培養条件下で培養し、ゲル内で微生物が増殖し複数の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法が提供される。
更に、本発明によれば、アガロースとして、融解温度５０〜６０℃のアガロースを用い、さらに微生物含有ゲルマイクロドロップの培養を、５０℃〜６０℃で行うことにより、高温耐性微生物を取得することを特徴とする前記方法が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の微生物の取得方法によれば、従来のゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を組み合わせた微生物の取得方法において、アガラーゼを用いることにより、ＶＢＮＣ状微生物やストレス耐性微生物の取得効率を大幅に向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
本発明は、微生物の取得、特に、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物（ＶＢＮＣ状微生物）、及びストレス耐性微生物の取得に関するものである。これらの微生物は、平板培養法等の従来の培養方法で培養可能な通常の微生物とは区別できる特殊な性質を持つ点で共通する。
【００２０】
本発明において、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物とは、通常自然界から微生物を分離する際に用いられる方法、例えば、土壌等の特定の分離源から試料を採取し、採取した試料を段階的に希釈後、平板培地に塗布し、一定時間平板培養後、プレート上に形成されるコロニーを分取する方法によっては、培養・取得が困難な微生物群を言う。
このような、自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を、本明細書において、ＶＢＮＣ状微生物と称する場合がある。
【００２１】
本発明でいう自然界とは、従来の培養方法では分離できない微生物が存在し得るすべての環境を意味し、例えば、土壌、泥、湖水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境、或いは深海、深地下、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、強アルカリ性地、高塩地、乾燥地、腐敗などにより少数の微生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境が含まれる。また、病院、食品工場における空気および活性汚泥、風味付け汁、果汁等の食品加工産業原料、更に金属表面等の人工的環境も、自然界に含める。
【００２２】
本発明において、ストレス耐性微生物とは、微生物にとりストレスのかかるような条件下、すなわち、特殊環境下で成育可能な微生物を意味する。
特殊環境とは、自然界における一般的な微生物の生育条件以外の条件を意味する。自然界においては、通常の温度（３０℃程度）、中性付近（ｐH７程度）等一般的な微生物が生育可能な条件以外の条件下にも、多くの微生物が存在しており（今中忠行監修 エヌ・ティー・エス社 微生物利用の大展開 １００−１０５頁）、掘越らによれば、かかる一般的な微生物が生育可能な条件以外の条件が、特殊環境と定義される（掘越弘毅、極限微生物−新しい遺伝子資源−、講談社サイエンティフィク（１９８８））。具体的には、温度は６０℃以上あるいは１０℃以下、ｐHは９以上あるいは３以下、塩濃度（浸透圧）１５％以上、圧力４００気圧以上などが、特殊環境の定義に該当する。更に、自然界以外にも人工的に作り出される湿度０％の乾燥状態、有機溶媒が１０％以上含有される状態、放射線の照射した条件、あるいは真空なども特殊環境条件に含まれる。なお、これら一連の特殊環境は、単一の要素だけでなく、２つ以上の要素の組み合わせ、例えば高温かつ高浸透圧なども、特殊環境に含まれる。特に、高温耐性微生物の中には、通常の高温による集積培養では取得し難い場合が多い。
本発明では、このような特殊環境で生育可能な微生物をストレス耐性微生物（特殊環境微生物）と称する。
【００２３】
本発明において、試料とは、上記ＶＢＮＣ状微生物、ストレス耐性微生物が存在する可能性のある試料を意味し、上記微生物以外の微生物、例えば、通常の平板培養で培養可能な微生物が含まれていても良い。
堆肥等侠雑物を多く含む試料を用いる場合には、ゲルマイクロドロップ化する前に前処理を行い侠雑物を除去しておくことが望ましい。以下、堆肥の場合を例に取り、前処理法を説明する。
【００２４】
堆肥試料を一定量採取し、純水に懸濁してホモゲナイズして微粒子化する。これを遠心分離して侠雑物（比較的大きなサイズの微粒子）を除去する。この際、微生物を沈降させない程度の緩やかな条件（例えば１０００ｒｐｍ、１０分）で行う。次に、４０μｍ程度のナイロンメッシュおよび５〜１０μｍの膜を用いて順次濾過して侠雑物を除去する。得られた濾過液を段階的に希釈し、希釈液中の菌数が１Ｘ１０7／ｍｌになる程度に希釈するのが好ましい。
【００２５】
本発明の方法において、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包含する（ゲルマイクロドロップ化する）とは、試料中の微生物細胞をゲル微小粒子中に包括せしめることを意味する。
ゲルマイクロドロップ化は、いわゆるゲルマイクロドロップ法に従って行うことができる。ここで、ゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法とは、試料液中の微生物細胞をアガロースなどのゲル微小粒子（ゲルマイクロドロップ）中に包括させ、１個のゲルマイクロドロップが１個の微生物細胞を有するゲルマイクロドロップ集団を得る方法である。
【００２６】
ゲルマイクロドロップを作製するためのゲルとしては、ゲル化する性質を有し微生物細胞に害を与えないアガロースを使用する。使用するアガロースについては、目的に応じたゲル化温度を有するものを使用する。例えば、ＶＢＮＣ状微生物を取得する場合ゲル化温度が低いものが望ましく、例示すればＳｉｇｍａ社のＴｙｐｅ ＶＩＩ（Ｌｏｗ Ｇｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：カタログ番号Ａ４０１８）、ＴｙｐｅＩＸ−Ａ（Ｇｅｌｐｏｉｎｔ＜１７、Ｓｉｇｍａ：カタログ番号Ａ２５７６）等が好ましい。
一方、ストレス耐性微生物を取得する場合には、後述するように、ゲル化した後ゲルマイクロドロップをストレス環境におく必要があるため、各ストレス条件下でも壊れない強度を有していることが必要になる。例えば、高温耐性の微生物を取得する場合には、該微生物の生育する高温度条件下で壊れないアガロース、すなわち、融点の高いアガロースが望ましい。
【００２７】
アガロースのゲル化温度、融解温度と強度の関係を明らかにすべく、表１にＳｉｇｍａ社製アガロース（Ｓｉｇｍａ製カタログ９３頁）の性質を示した。
ゲル化温度の低いアガロースは、ゲルの強度が弱く、中の微生物を取り出しやすいという長所があるが、一方で高温では融解してしまうという短所がある。逆に、ゲル化温度の高いアガロースは、融解温度も高くなるが、強度も上昇し、物理的力による破壊によって中の微生物が取り出しにくくなるといった性質を有している。
【００２８】
【表１】
【００２９】
アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包含してアガロースゲルマイクロドロップを作製するための手順、条件を、一例を挙げて説明する。
先ず、上記試料溶液とアガロース溶液とを、アガロースのゲル化温度より高い温度下にて、混合し、試料／アガロース混合液を得る。溶液中のアガロースの濃度は、使用するアガロースの性質、特にそのゲル化温度と、分離する微生物の性質等に依存しているが、通常２％前後、好ましくは１〜３％とすることが好ましい。
【００３０】
次に、上記試料／アガロース混合液を乳化する。乳化は、どのような方法によってもよく、例えば、内圧式超小型膜乳化モジュール（例えばＳＰＧテクノ株式会社製）を用いて行うことができる。
内圧式乳化モジュールによる乳化は、次のようにして行う。アガロースがゲル化しない温度に予め調整した油分（例えばミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社のＬｉｇｈｔ Ｗｈｉｔｅ Ｏｉｌ等））を入れた容器を適当な微細孔を有する膜にて二室に分割し、一方の部屋は加圧できるようにし（加圧室）、他方の部屋（加圧されていない）は攪拌できるようにする（非加圧室）。アガロースがゲル化しない温度（ゲル化温度を超える温度）に調整しておいた試料／アガロース混合液を加圧室に滴下し、加圧すると、加圧室から非加圧室に膜の微細孔を通って液が通過し、攪拌されている非加圧室にて乳化液が生成される。
【００３１】
得られた乳化液をアガロースのゲル化温度以下に冷却すると、アガロースゲルマイクロドロップが形成される。必要により、ゲルマイクロドロップを例えば７０ミクロンナイロンメッシュに通し大きな粒子を除くことが望ましい。
【００３２】
このようなゲルマイクロドロップ化の結果、微生物細胞を包括したゲルマイクロドロップを得ることができる。通常は、１個のゲルマイクロドロップあたり１個または複数の微生物細胞を包括したゲルマイクロドロップの集団が得られるが、本発明においては、１個のゲルマイクロドロップあたり１個の微生物細胞を包括するゲルマイクロドロップが多いほど好ましく、このような１個の微生物細胞を包括するゲルマイクロドロップのみを作製することが、より好ましい。
上記例示したゲルマイクロドロップ化の方法に従うと、集団中の大部分のゲルマイクロドロップが１個の微生物細胞しか有しないゲルマイクロドロップ集団が得られる。
【００３３】
続いて、本発明の方法においては、上記のようにして取得された微生物含有ゲルマイクロドロップを培養する。ＶＢＮＣ状微生物及びストレス耐性微生物のいずれを取得したい場合にも、以下の各条件下で培養した後には、微生物細胞を１個含んだゲルマイクロドロップと複数の微生物細胞を有するゲルマイクロドロップとを含んだゲルマイクロドロップの混合溶液が得られ、取得対象外の微生物を含むゲルマイクロドロップから区別することができる。
【００３４】
まず、ＶＢＮＣ状微生物を取得する場合の培養条件について説明すると、上記微生物細胞を包みこんでいるアガロースゲルマイクロドロップ集団を、通常用いられる栄養培地を使用した液体培養法で培養する。すなわち、通常の微生物が増殖できるような増殖環境下におけば良い。例えば、通常完全培地を使用する等、大多数の微生物にとって望ましい環境で行うことができる。
なお、古生物や極端な環境から採取された試料を取り扱う場合には、古生物やその試料中に含まれていることが予想される微生物にとって望ましいと考えられる環境を配慮して培養条件を設定することが望ましい。
【００３５】
所定期間培養することにより、通常の微生物はゲルマイクロドロップ中においても増殖してゲルマイクロドロップ中に複数の細胞が存在するようになる。一方、ＶＢＮＣ状微生物は増殖することが困難なため、ゲルマイクロドロップ中のＶＢＮＣ状微生物の細胞数は、増殖前の１個に止まっている。
【００３６】
本発明で使用することのできる栄養培地は、微生物の分離に使用される通常の栄養培地であり、温和な環境から採取された試料については、完全培地を使用することができる。
このような培地として具体的には、ＮＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｌｕｒｉａ−Ｂａｒｔａｎｉ−ｂｒｏｔｈ：カゼイン加水分解物 １．０％、酵母エキス ０．５％、食塩 １．０％、ＤＩＦＣＯ社）、ＴＯＲＹＰＴＩＣ ＳＯＹ ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＹＧ培地（グルコース ０．１％、酵母エキス ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、ｐＨ６．８）等を例示することができる。
【００３７】
特定の微生物群、例えば乳酸菌の分離を目指す場合には、ＧＹＰ−Ｓ培地（グルコース １％、酵母エキス １．０％、ペプトン ０．５％、酢酸ナトリウム ０．２％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５％、塩溶液 ０．５％、ｐＨ６．８）を用いることができる。一方、酵母、酢酸菌、乳酸菌等を取得したい場合には、ＧＹＭＰ培地（グルコース １％、酵母エキス ０．５％、麦芽エキス ０．３％、ペプトン ０．５％、ｐＨ６．０）等を用いることができる。
一方、古生物や極端な環境から採取した試料の場合には、上述の通り、採取した試料の存在する環境を考慮し、その環境に適合した培地を使用することが望ましい。例えば、活性汚泥から採取した試料の場合には、活性汚泥を培地の構成成分として加えることが望ましく、海洋微生物を分離する際には、海水または人工海水を培地成分として使用することが望ましい。
【００３８】
一方、ストレス耐性微生物を取得する場合の培養条件について説明すると、前記の方法で得た微生物を包括するゲルマイクロドロップ集団を、目的とする微生物が生育するストレス環境下（特殊環境下）におく。例えば、浸透圧、過酸化水素などの各ストレスに対する耐性菌の分離には、浸透圧のストレスがかかった条件としてはソルビトールを３５％含有した高浸透圧ＹＧ培地を用いることができ、また、過酸化水素のストレスがかかった条件としては３０％の過酸化水素溶液を用い、過酸化水素を０．００２％含有したＹＧ培地を使用することができる。更に、高温度（例えば、５０〜６０℃）に対する耐性菌（高温耐性微生物）の場合は、高温度条件、例えば５０〜６０℃の温度条件で培養することができるが、この場合は、ゲルマイクロドロップ形成の際に用いるアガロースとして、融解温度５０〜６０℃のアガロースを用いることが望ましい。
【００３９】
ストレスのかかる培養条件で、アガロースゲルマイクロドロップに包括された微生物を培養すると、ストレス耐性能を有する微生物は、アガロースゲルマイクロドロップ内で増殖しゲルマイクロドロップは複数の細胞を含むことになる。一方、各ストレス耐性能を有していない微生物は、アガロースゲルマイクロドロップ内で１個の微生物細胞のままである。
【００４０】
本発明の方法においては、培養に引き続いて、取得したい微生物を含有するゲルマイクロドロップを他のゲルマイクロドロップから分別・採取する。
ＶＢＮＣ状微生物を取得したい場合には、ゲル内で微生物の増殖が見られないゲルマイクロドロップ、好ましくは、ゲル内で微生物の増殖が見られずかつ微生物細胞を１個だけ含むゲルマイクロドロップにＶＢＮＣ状微生物が含まれているので、これを複数の微生物細胞を含むゲルマイクロドロップから分離すれば良い。一方、ストレス耐性微生物を取得したい場合には、ゲル内で微生物が増殖しかつ複数の微生物を含有するゲルマイクロドロップを、これをゲル内での微生物が増殖しない微生物含有ゲルマイクロドロップから分離すればよい。
【００４１】
ゲルマイクロドロップの混合溶液から目的とするゲルマイクロドロップ群を分別・採取するには、フローサイトメトリー法を利用する。
フローサイトメトリー（ＦＣ：ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法とは、粒子をその物理的または化学的差異をパラメーターとして、セルソーター等を用いて分離する方法である。具体的には、１つの分析因子（セル）を、直径８０μｍの水流上に１列に流し、レーザーを照射してその散乱光、蛍光を解析し、解析した特定の因子（セル）のみを取得するため、電気パルスを流し目的の因子を取得する方法をいう。電気パルスを流し目的の因子を取得するには、セルソーター（ＣＳ）と呼ばれる装置が使用される。フローサイトメトリーの他にセルソーターを備えたシステムは、ＦＣ／ＣＳシステム（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる。後述の実施例においては、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用したが、これに限定されず、同様な機能を有するものであればどのようなものを使用しても良い。
【００４２】
フローサイトメトリー法は、特開２０００−１９７４７９号公報に記載された条件で行うことができる。
ゲルマイクロドロップに包括された微生物（粒子）の分別・識別は、大きさを表すレーザー光の前方散乱光強度（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳ））、粒子の内部構造の複雑性を表すレーザー光の側方散乱光強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳ））、および微生物が特定の蛍光染料により染色されることにより生ずる蛍光強度（ＦＬ）の三個のパラメーターの内、二個（二次元）または三個（三次元）の組み合わせにより行うことができる。
【００４３】
すなわち、１個しか微生物細胞を含まないゲルマイクロドロップと複数個の微生物細胞を含むゲルマイクロドロップとは、ＦＳとＳＳとを用いて識別することができる。
また、必要があれば、生きている細胞と死滅した細胞とを識別することもでき、例えば、ＣＦＤＡ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）やＣＦＤＡ−ＡＭ（ｃａｒｂｏｘｙｆｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）等、生菌を死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いて識別（ＦＬシグナル）することもできる。
【００４４】
ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードで検出し、ＳＳおよびＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルター（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｌｏｎｇ−ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）によってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチューブで検出できる。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルター（ｌａｓｅｒ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）を用いることによって、自家蛍光から散乱光フラクションを除くことが望ましい。
【００４５】
蛍光は５５０ｎｍ二色長経路フィルターで分離し、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０−５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０−５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５−６８５ｎｍ）として測定する方法が採用される。
かくしてＶＢＮＣ状微生物の単一細胞、またはストレス耐性微生物の複数細胞をゲルマイクロドロップの形で単離することができる。
【００４６】
本発明においては、続いて、上記フローサイトメトリー法により分離された微生物含有ゲルマイクロドロップに、アガラーゼ（アガロースを分解する酵素）を添加してアガロース性ゲルを溶解せしめる。
本発明で使用できるアガラーゼは、起源、種類を問わずアガロースを溶解せしめる作用を有するものであればよい。例えば、Ｓｉｇｍａ社製のカタログ番号Ａ６３０６などが使用され得る。
アガラーゼの使用に際しては、製品をそのまま利用することもできるが、アガラーゼの酵素活性単位が１００Ｕ／ｍｌになるよう生理食塩水に溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌後、使用するとよい。
【００４７】
アガラーゼを作用させるとゲルマイクロドロップは溶解し、包含されていた微生物細胞が溶液中に出てくる。取り出された微生物を含む溶液を、通常の微生物の採取方法と同様に、供試試料としてプレートに塗布し、平板培養法で培養し、プレート上に生成されるコロニーを分離することによりＶＢＮＣ状微生物またはストレス耐性微生物を効率よく採取できる。アガラーゼを作用させると採取されるコロニーの数がアガラーゼを使用しない場合に比べて５〜６倍或いはそれ以上に増加させることができる。尚、上記平板培養法でＶＢＮＣ状微生物を採取する場合には、カタラーゼ、システイン化合物（特願２００５−１１３０６７の方法も引用しました。）などのＶＢＮＣ状微生物を蘇生させる効果のある物質をプレートに添加して培養することが望ましい。
【００４８】
本発明の方法は、ＶＢＮＣ状微生物またはストレス耐性微生物を取得対象とするものであるが、ストレス耐性を有し且つＶＢＮＣ状の微生物の取得に利用することも可能である。
この場合、例えば高温耐性のＶＢＮＣ状微生物を取得するには、上記の通りゲルマイクロドロップ化した後、高温下というストレス環境でゲルマイクロドロップを培養し、ゲル内で増殖するもの、すなわち高温耐性ではあるがＶＢＮＣ状を呈しない微生物を含むゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法により除去する。残った微生物含有ゲルマイクロドロップからアガラーゼにより微生物を取り出して、カタラーゼを含有するプレートを高温で平板培養し、プレート上に成育するものを採取すれば高温耐性のＶＢＮＣ状微生物を得ることができる。
【００４９】
以上説明したような本発明の微生物の取得方法によれば、ＶＢＮＣ状微生物やストレス耐性微生物の取得効率を大幅に向上することができる。特に、融点の高いアガロースを用いてゲルマイクロドロップ化を行い、微生物含有ゲルマイクロドロップの培養温度を高温度（５０〜６０℃）に設定することにより、高温耐性微生物、特に、通常の高温による集積培養では取得困難な微生物を取得することが可能である。
【実施例】
【００５０】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら代表例に限定されるものではない。
【００５１】
実施例１（高温で生育するＶＢＮＣ状微生物の取得）
以下の手順により、堆肥からの高温（５０℃）で生育するＶＢＮＣ状微生物の取得を試みた。
熊本県の堆肥場より取得した堆肥１ｇを試料とし、これに生理食塩水１０ｍｌを添加し、ポリトロンでホモジナイズ（５秒間、３回）した。次に、遠心分離（１，０００ｒｐｍＸ１０分）して未分解有機物等の侠雑物を沈降・除去した。得られた上清を４０μｍのナイロンメッシュで濾過して侠雑物を除去し、濾過液を調製した。
【００５２】
得られた濾過液を、生理食塩水にて細胞数が１ｘ１０7／ｍｌとなるように希釈し、微生物含有希釈液を得た。細胞数の確認は、松下エコシステム社製バイオプローラーを用いて実施した。
一方、Ｓｉｇｍａ社製アガロースＴｙｐｅ ＶＩＩ（Ｌｏｗ Ｇｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：カタログ番号Ａ４０１８）の２％水溶液を、電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて５０℃に保温してアガロース溶液を調製した。
【００５３】
上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロース溶液１ｍｌとを混合し、５０℃にてボルテックスミキサーを用いてよく攪拌・混合した。次に、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｉｇｈｔ ｗｈｉｔｅ ｏｉｌ）を満たしたＳＰＧ膜（膜乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に、上記混合液をシリンジを用いて、加圧下に同じミネラルオイル中に押し出して、乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分置いてアガロースをゲル化させ、ゲルマイクロドロップを得た。これに生理食塩水を加えて洗浄し、遠心によってゲルマイクロドロップを回収した。この操作を二回実施し、ミネラルオイルを洗い落とし、更にこれを６０μｍのナイロンメンブレンに通した。
【００５４】
ナイロンメンブレンを通過したゲルマイクロドロップ画分を、ＹＧ液体培地で、５０℃、２０時間通気・攪拌（１００ｒｐｍ）培養した（増殖環境下に置いた）。培養終了後のゲルマイクロドロップはＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液（最終濃度０．０５％）中でよく攪拌し、２０μｍナイロンメンブレンで濾過し、生理食塩水で十分に洗浄し、次にＣＦＤＡにより蛍光染色した。ＣＦＤＡ染色後、アガロースゲル微小粒子を含む試料を、以下の条件・手順に従いフローサイトメトリーにて解析した。
【００５５】
フローサイトメトリーとして、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いた（フローセルのノズル部分は直径１００μｍであった）。ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードを用いて検出した。ＦＬシグナルは、レーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルターによってスプリットした５１７ｎｍの光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光部分を除いた。
【００５６】
フローサイトメトリーを操作して、セルソーターサイトグラムでＦＬシグナルの大きい集団と小さい集団に分離した。すなわち、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０−５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０−５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５−６８５ｎｍ）として測定した。
ＦＬシグナルの小さい集団のゲルマイクロドロップを顕微鏡観察したところ、一つのゲルマイクロドロップ中に１個の細胞が存在していることが観察された。また、この一つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、ＣＦＤＡ染色により生きている細胞であることが分かった。
一方、ＦＬシグナルの大きい集団は、顕微鏡観察の結果、１つのゲルマイクロドロップ中に複数の細胞を含んでいた。尚、顕微鏡観察は、顕微鏡として倒立顕微鏡（オリンパス Ｕ−ＴＢＩＵ−ＴＢＩ９０）を使用し、倍率は１０００倍で、位相差条件で行った。
【００５７】
このように、フローサイトメトリー解析とソーティングを行い、ゲルマイクロドロップ内で増殖しコロニーを形成したゲルマイクロドロップをフローサイトメーターにより除去し、残りのゲルマイクロドロップ（増殖が確認されなかった生細胞を含有するもの）を取得した。
【００５８】
このようにして選択されたアガロース製ゲルマイクロドロップに、アガラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製：Ａ６３０６）を１００Ｕ／ｍｌ加え、３７℃で１時間酵素作用させた。酵素作用によりゲルは溶解し、ゲルから取り出された微生物の溶液が得られた。
【００５９】
このようにして取得した微生物溶液を、カタラーゼ（２０００ｕｎｉｔｓ／ｐｌａｔｅ）を添加したＹＧ寒天培地に塗抹し、５０℃で４８週間培養後、プレート上に生育したコロニー数を計測した（試験区）。一方、アガラーゼを添加しないままのゲルマイクロドロップについても、そのまま同様の培養を行い、アガラーゼ無添加対照区とした。
試験区とアガラーゼ無添加の対照区とを比較した結果、アガラーゼを添加した場合、アガラーゼ無添加の対照区と比較して、コロニー形成数は約１０倍増加し、アガラーゼ添加の顕著な効果が認められた。
【００６０】
実施例２（高温且つ高浸透圧下で生育可能な微生物の分離）
以下の手順により、堆肥からの高温（５０℃）かつ高浸透圧下で生育可能な微生物の取得を試みた。
熊本県の堆肥場より取得した堆肥１ｇを試料とし、これに生理食塩水１０ｍｌを添加し、ポリトロンでホモジナイズ（５秒間、３回）した。次に、遠心分離（１，０００ｒｐｍＸ１０分）して未分解有機物等の侠雑物を沈降・除去した。得られた上清を４０μｍのナイロンメッシュで濾過して侠雑物を除去し、濾過液を調製した。
【００６１】
得られた濾過液を、生理食塩水にて細胞数が１ｘ１０7／ｍｌとなるように希釈し、微生物含有希釈液を得た。細胞数の確認は、松下エコシステム社製バイオプローラーを用いて実施した。
一方、Ｓｉｇｍａ社製アガロースＴｙｐｅ ＶＩＩ（Ｌｏｗ Ｇｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：カタログ番号Ａ４０１８）の２％水溶液を、電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて５０℃に保温してアガロース溶液を調製した。
【００６２】
上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロース溶液１ｍｌとを混合し、５０℃にてボルテックスミキサーを用いてよく攪拌・混合した。次に、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｉｇｈｔ ｗｈｉｔｅ ｏｉｌ）を満たしたＳＰＧ膜（膜乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に、上記混合液をシリンジを用いて、加圧下に同じミネラルオイル中に押し出して乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分おきアガロースをゲル化させゲルマイクロドロップを得た。これに生理食塩水を加えて洗浄し、遠心によってゲルマイクロドロップを回収した。この操作を二回実施し、ミネラルオイルを洗い落とし、更にこれを６０μｍのナイロンメンブレンに通した。
【００６３】
ナイロンメンブレンを通過したゲルマイクロドロップ画分を、３５％量のソルビトールを含有し、浸透圧を約５Ｍｐａ（塩濃度（ＮａＣｌ）３．５%の海水の浸透圧が２．４Ｍｐａとの知見から算出した。）上昇させたＹＧ液体培地で、５０℃、２０時間通気・攪拌（１００ｒｐｍ）培養した（増殖環境下に置いた）。培養終了後のゲルマイクロドロップはＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液（最終濃度：０．０５％）中でよく攪拌し、２０μmナイロンメンブレンで濾過し、生理食塩水で十分に洗浄し、次にＣＦＤＡにより蛍光染色した。ＣＦＤＡ染色後、アガロースゲル微小粒子を含む試料を、以下の条件・手順に従い、フローサイトメトリーにて解析した。
【００６４】
フローサイトメトリーとして、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いた（フローセルのノズル部分は直径１００μｍであった）。ＦＳシグナルとして２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードを用いて検出した。ＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルターによってスプリットした５１７ｎｍの光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光部分を除いた。
【００６５】
フローサイトメトリーを操作して、セルソーターサイトグラムでＦＬシグナルの大きい集団と小さい集団に分離した。すなわち、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０−５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０−５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５−６８５ｎｍ）として測定した。
ＦＬシグナルの小さい集団のゲルマイクロドロップを顕微鏡観察したところ、一つのゲルマイクロドロップ中に１個の細胞が存在していることが観察された。この一つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、ＣＦＤＡ染色により生きている細胞であることがわかった。
一方、ＦＬシグナルの大きい集団は、顕微鏡観察の結果、１つのゲルマイクロドロップ中に複数の細胞を含んでいた。尚、顕微鏡観察は、実施例１と同様にして行った。
【００６６】
このように、フローサイトメトリーでの解析とソーティングを行い、ゲルマイクロドロップ内で増殖し、コロニーを形成したゲルマイクロドロップを取得した。
【００６７】
この取得したアガロース製ゲルマイクロドロップにアガラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製：Ａ６３０６）を１００Ｕ／ｍｌ加え、３７℃で１時間酵素を作用させた。酵素作用によりゲルは溶解し、ゲル内の微生物の溶液が得られた。
【００６８】
このようにして取得した微生物溶液をＹＧ寒天培地に塗抹し、５０℃で４８週間培養後、プレート上に生育したコロニー数を計測した（試験区）。一方、アガラーゼを添加しないままのゲルマイクロドロップについても、そのまま同様の培養を行い、アガラーゼ無添加対照区とした。
試験区とアガラーゼ無添加の対照区とを比較した結果、アガラーゼを添加した場合、アガラーゼ無添加の対照区と比較して、コロニー形成数は約１０倍増加し、アガラーゼ添加の顕著な効果が認められた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然界から産業上有用な微生物を取得するためのスクリーニング技術に関し、更に詳細には、自然界に多く存在し、生存するが培養が困難な微生物群又はストレス耐性微生物を、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用して効率良く取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を分離し、培養し、新たな微生物を得るための手段としては、平板培養法が古くから知られている。これは、１８７６年にコッホが発明した方法であり、多種多様の微生物が混在する試料を平板培地（プレート）にまき、一定時間培養後、プレート上に形成されたコロニーを単離する微生物の単一コロニー又は単一細胞を分離する方法である。通常、単離されたコロニーの中から、目的にかなう微生物が検索される。
この平板培養法をベースとして様々な微生物の取得方法が開発されると共に、産業上有用な微生物が数多く分離され利用されてきた。
【０００３】
また、１９７０年代の後半には、蛍光顕微鏡を用いた分離源中の全菌数計数法が確立され、その後、多種多様な微生物を計数する技術が開発された。
一方で、自然界分離源中の微生物に起因する生物活性を蛍光色素染色法で検出する技術が開発され、これらの技術開発によって従来の平板培養法では培養できない微生物が自然界に多く存在することが解明されてきた。
【０００４】
土壌、河川、汚泥等の自然界には多種多様な微生物が存在するが、その中には、上述の平板培養法に従い、通常の栄養培地で培養可能な微生物群と、生物活性を示すが培養困難な微生物群が存在し、後者の生物活性を示すが培養困難な微生物は、ＶＢＮＣ状態の微生物（自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物）として知られるようになった。
【０００５】
通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源から、ＶＢＮＣ状微生物のみを分離する方法としては、例えば、（１）試料液中の微生物細胞を、アガロースゲル微小粒子中に包括してアガロースゲル微小粒子集団を得て、（２）上記アガロースゲル微小粒子集団から、上記試料中に含まれている微生物のうち平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖できるような増殖環境下に置き、（３）増殖環境におかれたアガロースゲル微小粒子集団から１個の微生物細胞を有する微小粒子をセルソーターにより識別して分離する方法が開発され、活性汚泥から新規微生物を取得する方法として有効であることが示されている（特許文献１：特開２０００−１９７４７９号公報）。
【０００６】
前記（１）は、いわゆるゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法に基づくものである。ゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法とは、試料液中の微生物細胞をアガロースなどのゲル微小粒子（ゲルマイクロドロップ）中に包括させ、１個のゲルマイクロドロップが１個の微生物細胞を有するゲルマイクロドロップ集団を得る方法である。
一方、（３）は、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法に基づくものである。フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法とは、粒子をその物理的または化学的差異をパラメーターとして、セルソーター等を用いて分離する方法である。
【０００７】
このような上記特許文献１（特開２０００−１９７４７９号公報）記載の方法によれば、ＶＢＮＣ状微生物の単一細胞をアガロースゲルに包括した形で分離できる。
このような方法により分離されたＶＢＮＣ状微生物は、いわば仮死状態にあることから、実際に利用するためには、該微生物を培養可能な状態あるいは平板培養でコロニー形成可能な状態、すなわち通常の微生物に蘇生させる必要がある。
このようなＶＢＮＣ状微生物の蘇生に用いられる技術としては、例えばカタラーゼを含む栄養培地を利用する方法が有効であることが知られている（特許文献２：特開２００４−０８９１０６号公報）。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１９７４７９号公報
【特許文献２】特開２００４−０８９１０６号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，３８６１−３８６６，（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記特許文献１（特開２０００−１９７４７９号公報）記載のゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用した微生物の分離方法は、微生物のコロニー形成が十分になされず微生物の有効利用を図ることができないという問題があった。
【００１０】
また、上述のようなゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を用いた微生物分離法は、通常の微生物とＶＢＮＣ状微生物が混在する微生物資源から、通常の生育が良好な菌を分離するための方法（非特許文献１：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，３８６１−３８６６，１９９０）、或いはＶＢＮＣ状微生物のみを分離するための方法として考えられているが、ゲル内という特殊な環境下、且つ、高温、高浸透圧、高過酸化水素など、微生物にとりストレスのかかる環境下で生育する微生物、いわゆるストレス耐性微生物の分離にも応用できる可能性があるとも考えられる。すなわち、上記特許文献１記載の分離方法のうち、前記（２）の系における培養条件を、通常の微生物が増殖できないようなストレスのかかる条件とし、さらに、（３）の系にて１個のゲルマイクロドロップ内に複数の微生物が存在するものを分離・採取するようにすれば、ストレス耐性微生物の分離に利用できる可能性があるとも考えられる。
【００１１】
しかし、特許文献１記載の方法をストレス耐性微生物に適用すると、上述のＶＢＮＣ状微生物の場合と同様、微生物の利用効率の点で問題が生じるものと推測される。
また、特許文献１記載には、アガロースとしてゲル化温度の低いもの、すなわち融解温度の低いアガロースを利用することが好ましいとされており、ストレス耐性微生物、特に高温（例えば、５０〜６０℃）での生育能を有する微生物に、このような中温で生育する微生物を想定したゲル化温度の低いアガロース（例えば、Ｓｉｇｍａ社製：カタログ番号Ａ２５７６）を適用すると、培養の際の高温（例えば、５０〜６０℃）で融解してしまい、微生物の取得が事実上困難となるという問題があった。そこで、融解温度の高いアガロースを使用すると、ゲル強度が高いため、ゲル化温度が低くゲル強度も低いアガロースを使用した場合と比較して物理的な力によるアガロースゲルの破壊が困難となり、アガロースゲルから、微生物を取り出す工夫が一層必要になる。
【００１２】
この発明の主要な課題は、ゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を利用して、ＶＢＮＣ状微生物だけでなく、ストレス耐性微生物にも適用でき、かつ、微生物を効率良く取得できる技術を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の課題についての研究において、ゲルマイクロドロップ法およびフローサイトメトリー法を利用してＶＢＮＣ状微生物やストレス耐性微生物を効率良く取得するための条件について、鋭意検討を重ねた。
その結果、ゲルマイクロドロップ法およびフローサイトメトリー法を経て分離されたＶＢＮＣ状性微生物あるいは各ストレス耐性微生物を含有するゲルマイクロドロップに、アガラーゼを添加してアガロースゲルを溶解することにより、内包する微生物を効率よく取得できることを見出した。アガラーゼによってアガロースゲルを溶解した場合、溶解しなかった場合と比較し、コロニー形成数が５〜７倍に向上することが明らかとなり、主要課題を解決することができた。
【００１４】
次に、堆肥中微生物をアガロースゲルで内包した後、通常の栄養培地で培養し、ゲルマイクロドロップに包括したＶＢＮＣ状微生物をフローサイトメトリー法で分離した後、アガラーゼによってアガロースゲルを溶解して、カタラーゼを添加して培養すると、アガラーゼを添加しなかった場合と比較し、コロニー形成数が５倍に向上することが明らかとなった。
【００１５】
さらに、堆肥中微生物をアガロースゲルで内包した後、各ストレス条件での栄養培地で培養し、ゲルマイクロドロップに包括した各ストレス耐性微生物をフローサイトメトリー法で分離した。その後、アガラーゼによってアガロースゲルを溶解して、寒天平板培地で培養すると、アガラーゼを添加しなかった場合と比較し、コロニー形成数が５〜６倍、或いはそれ以上に向上することが明らかとなり、主要課題を解決した。
【００１６】
アガラーゼに関しては、アガロース製ゲルマイクロドロップ内の遺伝子を効率良く取得・解析する方法としては報告例があるが（特表２００２−５３１０５６号公報参照）、ＤＮＡと比較するとサイズが大きく、かつ、現に生きている状態での取得が望まれる、ＶＢＮＣ状微生物あるいはストレス耐性能を有する微生物の取得に応用した例は未だない。
【００１７】
即ち、本発明によれば、自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を取得するにあたり、試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、当該微生物含有ゲルマイクロドロップを培養し、当該ゲル内で微生物が増殖せずかつ１個の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法が提供される。
また、本発明によれば、ストレス耐性微生物を取得するにあたり、試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、当該微生物含有ゲルマイクロドロップをストレスのかかる培養条件下で培養し、ゲル内で微生物が増殖し複数の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法が提供される。
更に、本発明によれば、アガロースとして、融解温度５０〜６０℃のアガロースを用い、さらに微生物含有ゲルマイクロドロップの培養を、５０℃〜６０℃で行うことにより、高温耐性微生物を取得することを特徴とする前記方法が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の微生物の取得方法によれば、従来のゲルマイクロドロップ法とフローサイトメトリー法を組み合わせた微生物の取得方法において、アガラーゼを用いることにより、ＶＢＮＣ状微生物やストレス耐性微生物の取得効率を大幅に向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
本発明は、微生物の取得、特に、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物（ＶＢＮＣ状微生物）、及びストレス耐性微生物の取得に関するものである。これらの微生物は、平板培養法等の従来の培養方法で培養可能な通常の微生物とは区別できる特殊な性質を持つ点で共通する。
【００２０】
本発明において、自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物とは、通常自然界から微生物を分離する際に用いられる方法、例えば、土壌等の特定の分離源から試料を採取し、採取した試料を段階的に希釈後、平板培地に塗布し、一定時間平板培養後、プレート上に形成されるコロニーを分取する方法によっては、培養・取得が困難な微生物群を言う。
このような、自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を、本明細書において、ＶＢＮＣ状微生物と称する場合がある。
【００２１】
本発明でいう自然界とは、従来の培養方法では分離できない微生物が存在し得るすべての環境を意味し、例えば、土壌、泥、湖水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境、或いは深海、深地下、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、強アルカリ性地、高塩地、乾燥地、腐敗などにより少数の微生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境が含まれる。また、病院、食品工場における空気および活性汚泥、風味付け汁、果汁等の食品加工産業原料、更に金属表面等の人工的環境も、自然界に含める。
【００２２】
本発明において、ストレス耐性微生物とは、微生物にとりストレスのかかるような条件下、すなわち、特殊環境下で成育可能な微生物を意味する。
特殊環境とは、自然界における一般的な微生物の生育条件以外の条件を意味する。自然界においては、通常の温度（３０℃程度）、中性付近（ｐH７程度）等一般的な微生物が生育可能な条件以外の条件下にも、多くの微生物が存在しており（今中忠行監修 エヌ・ティー・エス社 微生物利用の大展開 １００−１０５頁）、掘越らによれば、かかる一般的な微生物が生育可能な条件以外の条件が、特殊環境と定義される（掘越弘毅、極限微生物−新しい遺伝子資源−、講談社サイエンティフィク（１９８８））。具体的には、温度は６０℃以上あるいは１０℃以下、ｐHは９以上あるいは３以下、塩濃度（浸透圧）１５％以上、圧力４００気圧以上などが、特殊環境の定義に該当する。更に、自然界以外にも人工的に作り出される湿度０％の乾燥状態、有機溶媒が１０％以上含有される状態、放射線の照射した条件、あるいは真空なども特殊環境条件に含まれる。なお、これら一連の特殊環境は、単一の要素だけでなく、２つ以上の要素の組み合わせ、例えば高温かつ高浸透圧なども、特殊環境に含まれる。特に、高温耐性微生物の中には、通常の高温による集積培養では取得し難い場合が多い。
本発明では、このような特殊環境で生育可能な微生物をストレス耐性微生物（特殊環境微生物）と称する。
【００２３】
本発明において、試料とは、上記ＶＢＮＣ状微生物、ストレス耐性微生物が存在する可能性のある試料を意味し、上記微生物以外の微生物、例えば、通常の平板培養で培養可能な微生物が含まれていても良い。
堆肥等侠雑物を多く含む試料を用いる場合には、ゲルマイクロドロップ化する前に前処理を行い侠雑物を除去しておくことが望ましい。以下、堆肥の場合を例に取り、前処理法を説明する。
【００２４】
堆肥試料を一定量採取し、純水に懸濁してホモゲナイズして微粒子化する。これを遠心分離して侠雑物（比較的大きなサイズの微粒子）を除去する。この際、微生物を沈降させない程度の緩やかな条件（例えば１０００ｒｐｍ、１０分）で行う。次に、４０μｍ程度のナイロンメッシュおよび５〜１０μｍの膜を用いて順次濾過して侠雑物を除去する。得られた濾過液を段階的に希釈し、希釈液中の菌数が１Ｘ１０7／ｍｌになる程度に希釈するのが好ましい。
【００２５】
本発明の方法において、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包含する（ゲルマイクロドロップ化する）とは、試料中の微生物細胞をゲル微小粒子中に包括せしめることを意味する。
ゲルマイクロドロップ化は、いわゆるゲルマイクロドロップ法に従って行うことができる。ここで、ゲルマイクロドロップ（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）法とは、試料液中の微生物細胞をアガロースなどのゲル微小粒子（ゲルマイクロドロップ）中に包括させ、１個のゲルマイクロドロップが１個の微生物細胞を有するゲルマイクロドロップ集団を得る方法である。
【００２６】
ゲルマイクロドロップを作製するためのゲルとしては、ゲル化する性質を有し微生物細胞に害を与えないアガロースを使用する。使用するアガロースについては、目的に応じたゲル化温度を有するものを使用する。例えば、ＶＢＮＣ状微生物を取得する場合ゲル化温度が低いものが望ましく、例示すればＳｉｇｍａ社のＴｙｐｅ ＶＩＩ（Ｌｏｗ Ｇｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：カタログ番号Ａ４０１８）、ＴｙｐｅＩＸ−Ａ（Ｇｅｌｐｏｉｎｔ＜１７、Ｓｉｇｍａ：カタログ番号Ａ２５７６）等が好ましい。
一方、ストレス耐性微生物を取得する場合には、後述するように、ゲル化した後ゲルマイクロドロップをストレス環境におく必要があるため、各ストレス条件下でも壊れない強度を有していることが必要になる。例えば、高温耐性の微生物を取得する場合には、該微生物の生育する高温度条件下で壊れないアガロース、すなわち、融点の高いアガロースが望ましい。
【００２７】
アガロースのゲル化温度、融解温度と強度の関係を明らかにすべく、表１にＳｉｇｍａ社製アガロース（Ｓｉｇｍａ製カタログ９３頁）の性質を示した。
ゲル化温度の低いアガロースは、ゲルの強度が弱く、中の微生物を取り出しやすいという長所があるが、一方で高温では融解してしまうという短所がある。逆に、ゲル化温度の高いアガロースは、融解温度も高くなるが、強度も上昇し、物理的力による破壊によって中の微生物が取り出しにくくなるといった性質を有している。
【００２８】
【表１】
【００２９】
アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包含してアガロースゲルマイクロドロップを作製するための手順、条件を、一例を挙げて説明する。
先ず、上記試料溶液とアガロース溶液とを、アガロースのゲル化温度より高い温度下にて、混合し、試料／アガロース混合液を得る。溶液中のアガロースの濃度は、使用するアガロースの性質、特にそのゲル化温度と、分離する微生物の性質等に依存しているが、通常２％前後、好ましくは１〜３％とすることが好ましい。
【００３０】
次に、上記試料／アガロース混合液を乳化する。乳化は、どのような方法によってもよく、例えば、内圧式超小型膜乳化モジュール（例えばＳＰＧテクノ株式会社製）を用いて行うことができる。
内圧式乳化モジュールによる乳化は、次のようにして行う。アガロースがゲル化しない温度に予め調整した油分（例えばミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社のＬｉｇｈｔ Ｗｈｉｔｅ Ｏｉｌ等））を入れた容器を適当な微細孔を有する膜にて二室に分割し、一方の部屋は加圧できるようにし（加圧室）、他方の部屋（加圧されていない）は攪拌できるようにする（非加圧室）。アガロースがゲル化しない温度（ゲル化温度を超える温度）に調整しておいた試料／アガロース混合液を加圧室に滴下し、加圧すると、加圧室から非加圧室に膜の微細孔を通って液が通過し、攪拌されている非加圧室にて乳化液が生成される。
【００３１】
得られた乳化液をアガロースのゲル化温度以下に冷却すると、アガロースゲルマイクロドロップが形成される。必要により、ゲルマイクロドロップを例えば７０ミクロンナイロンメッシュに通し大きな粒子を除くことが望ましい。
【００３２】
このようなゲルマイクロドロップ化の結果、微生物細胞を包括したゲルマイクロドロップを得ることができる。通常は、１個のゲルマイクロドロップあたり１個または複数の微生物細胞を包括したゲルマイクロドロップの集団が得られるが、本発明においては、１個のゲルマイクロドロップあたり１個の微生物細胞を包括するゲルマイクロドロップが多いほど好ましく、このような１個の微生物細胞を包括するゲルマイクロドロップのみを作製することが、より好ましい。
上記例示したゲルマイクロドロップ化の方法に従うと、集団中の大部分のゲルマイクロドロップが１個の微生物細胞しか有しないゲルマイクロドロップ集団が得られる。
【００３３】
続いて、本発明の方法においては、上記のようにして取得された微生物含有ゲルマイクロドロップを培養する。ＶＢＮＣ状微生物及びストレス耐性微生物のいずれを取得したい場合にも、以下の各条件下で培養した後には、微生物細胞を１個含んだゲルマイクロドロップと複数の微生物細胞を有するゲルマイクロドロップとを含んだゲルマイクロドロップの混合溶液が得られ、取得対象外の微生物を含むゲルマイクロドロップから区別することができる。
【００３４】
まず、ＶＢＮＣ状微生物を取得する場合の培養条件について説明すると、上記微生物細胞を包みこんでいるアガロースゲルマイクロドロップ集団を、通常用いられる栄養培地を使用した液体培養法で培養する。すなわち、通常の微生物が増殖できるような増殖環境下におけば良い。例えば、通常完全培地を使用する等、大多数の微生物にとって望ましい環境で行うことができる。
なお、古生物や極端な環境から採取された試料を取り扱う場合には、古生物やその試料中に含まれていることが予想される微生物にとって望ましいと考えられる環境を配慮して培養条件を設定することが望ましい。
【００３５】
所定期間培養することにより、通常の微生物はゲルマイクロドロップ中においても増殖してゲルマイクロドロップ中に複数の細胞が存在するようになる。一方、ＶＢＮＣ状微生物は増殖することが困難なため、ゲルマイクロドロップ中のＶＢＮＣ状微生物の細胞数は、増殖前の１個に止まっている。
【００３６】
本発明で使用することのできる栄養培地は、微生物の分離に使用される通常の栄養培地であり、温和な環境から採取された試料については、完全培地を使用することができる。
このような培地として具体的には、ＮＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｌｕｒｉａ−Ｂａｒｔａｎｉ−ｂｒｏｔｈ：カゼイン加水分解物 １．０％、酵母エキス ０．５％、食塩 １．０％、ＤＩＦＣＯ社）、ＴＯＲＹＰＴＩＣ ＳＯＹ ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＹＧ培地（グルコース ０．１％、酵母エキス ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、ｐＨ６．８）等を例示することができる。
【００３７】
特定の微生物群、例えば乳酸菌の分離を目指す場合には、ＧＹＰ−Ｓ培地（グルコース １％、酵母エキス １．０％、ペプトン ０．５％、酢酸ナトリウム ０．２％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５％、塩溶液 ０．５％、ｐＨ６．８）を用いることができる。一方、酵母、酢酸菌、乳酸菌等を取得したい場合には、ＧＹＭＰ培地（グルコース １％、酵母エキス ０．５％、麦芽エキス ０．３％、ペプトン ０．５％、ｐＨ６．０）等を用いることができる。
一方、古生物や極端な環境から採取した試料の場合には、上述の通り、採取した試料の存在する環境を考慮し、その環境に適合した培地を使用することが望ましい。例えば、活性汚泥から採取した試料の場合には、活性汚泥を培地の構成成分として加えることが望ましく、海洋微生物を分離する際には、海水または人工海水を培地成分として使用することが望ましい。
【００３８】
一方、ストレス耐性微生物を取得する場合の培養条件について説明すると、前記の方法で得た微生物を包括するゲルマイクロドロップ集団を、目的とする微生物が生育するストレス環境下（特殊環境下）におく。例えば、浸透圧、過酸化水素などの各ストレスに対する耐性菌の分離には、浸透圧のストレスがかかった条件としてはソルビトールを３５％含有した高浸透圧ＹＧ培地を用いることができ、また、過酸化水素のストレスがかかった条件としては３０％の過酸化水素溶液を用い、過酸化水素を０．００２％含有したＹＧ培地を使用することができる。更に、高温度（例えば、５０〜６０℃）に対する耐性菌（高温耐性微生物）の場合は、高温度条件、例えば５０〜６０℃の温度条件で培養することができるが、この場合は、ゲルマイクロドロップ形成の際に用いるアガロースとして、融解温度５０〜６０℃のアガロースを用いることが望ましい。
【００３９】
ストレスのかかる培養条件で、アガロースゲルマイクロドロップに包括された微生物を培養すると、ストレス耐性能を有する微生物は、アガロースゲルマイクロドロップ内で増殖しゲルマイクロドロップは複数の細胞を含むことになる。一方、各ストレス耐性能を有していない微生物は、アガロースゲルマイクロドロップ内で１個の微生物細胞のままである。
【００４０】
本発明の方法においては、培養に引き続いて、取得したい微生物を含有するゲルマイクロドロップを他のゲルマイクロドロップから分別・採取する。
ＶＢＮＣ状微生物を取得したい場合には、ゲル内で微生物の増殖が見られないゲルマイクロドロップ、好ましくは、ゲル内で微生物の増殖が見られずかつ微生物細胞を１個だけ含むゲルマイクロドロップにＶＢＮＣ状微生物が含まれているので、これを複数の微生物細胞を含むゲルマイクロドロップから分離すれば良い。一方、ストレス耐性微生物を取得したい場合には、ゲル内で微生物が増殖しかつ複数の微生物を含有するゲルマイクロドロップを、これをゲル内での微生物が増殖しない微生物含有ゲルマイクロドロップから分離すればよい。
【００４１】
ゲルマイクロドロップの混合溶液から目的とするゲルマイクロドロップ群を分別・採取するには、フローサイトメトリー法を利用する。
フローサイトメトリー（ＦＣ：ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法とは、粒子をその物理的または化学的差異をパラメーターとして、セルソーター等を用いて分離する方法である。具体的には、１つの分析因子（セル）を、直径８０μｍの水流上に１列に流し、レーザーを照射してその散乱光、蛍光を解析し、解析した特定の因子（セル）のみを取得するため、電気パルスを流し目的の因子を取得する方法をいう。電気パルスを流し目的の因子を取得するには、セルソーター（ＣＳ）と呼ばれる装置が使用される。フローサイトメトリーの他にセルソーターを備えたシステムは、ＦＣ／ＣＳシステム（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる。後述の実施例においては、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用したが、これに限定されず、同様な機能を有するものであればどのようなものを使用しても良い。
【００４２】
フローサイトメトリー法は、特開２０００−１９７４７９号公報に記載された条件で行うことができる。
ゲルマイクロドロップに包括された微生物（粒子）の分別・識別は、大きさを表すレーザー光の前方散乱光強度（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳ））、粒子の内部構造の複雑性を表すレーザー光の側方散乱光強度（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳ））、および微生物が特定の蛍光染料により染色されることにより生ずる蛍光強度（ＦＬ）の三個のパラメーターの内、二個（二次元）または三個（三次元）の組み合わせにより行うことができる。
【００４３】
すなわち、１個しか微生物細胞を含まないゲルマイクロドロップと複数個の微生物細胞を含むゲルマイクロドロップとは、ＦＳとＳＳとを用いて識別することができる。
また、必要があれば、生きている細胞と死滅した細胞とを識別することもでき、例えば、ＣＦＤＡ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）やＣＦＤＡ−ＡＭ（ｃａｒｂｏｘｙｆｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）等、生菌を死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いて識別（ＦＬシグナル）することもできる。
【００４４】
ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードで検出し、ＳＳおよびＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルター（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｌｏｎｇ−ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）によってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチューブで検出できる。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルター（ｌａｓｅｒ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）を用いることによって、自家蛍光から散乱光フラクションを除くことが望ましい。
【００４５】
蛍光は５５０ｎｍ二色長経路フィルターで分離し、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０−５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０−５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５−６８５ｎｍ）として測定する方法が採用される。
かくしてＶＢＮＣ状微生物の単一細胞、またはストレス耐性微生物の複数細胞をゲルマイクロドロップの形で単離することができる。
【００４６】
本発明においては、続いて、上記フローサイトメトリー法により分離された微生物含有ゲルマイクロドロップに、アガラーゼ（アガロースを分解する酵素）を添加してアガロース性ゲルを溶解せしめる。
本発明で使用できるアガラーゼは、起源、種類を問わずアガロースを溶解せしめる作用を有するものであればよい。例えば、Ｓｉｇｍａ社製のカタログ番号Ａ６３０６などが使用され得る。
アガラーゼの使用に際しては、製品をそのまま利用することもできるが、アガラーゼの酵素活性単位が１００Ｕ／ｍｌになるよう生理食塩水に溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌後、使用するとよい。
【００４７】
アガラーゼを作用させるとゲルマイクロドロップは溶解し、包含されていた微生物細胞が溶液中に出てくる。取り出された微生物を含む溶液を、通常の微生物の採取方法と同様に、供試試料としてプレートに塗布し、平板培養法で培養し、プレート上に生成されるコロニーを分離することによりＶＢＮＣ状微生物またはストレス耐性微生物を効率よく採取できる。アガラーゼを作用させると採取されるコロニーの数がアガラーゼを使用しない場合に比べて５〜６倍或いはそれ以上に増加させることができる。尚、上記平板培養法でＶＢＮＣ状微生物を採取する場合には、カタラーゼ、システイン化合物（特願２００５−１１３０６７の方法も引用しました。）などのＶＢＮＣ状微生物を蘇生させる効果のある物質をプレートに添加して培養することが望ましい。
【００４８】
本発明の方法は、ＶＢＮＣ状微生物またはストレス耐性微生物を取得対象とするものであるが、ストレス耐性を有し且つＶＢＮＣ状の微生物の取得に利用することも可能である。
この場合、例えば高温耐性のＶＢＮＣ状微生物を取得するには、上記の通りゲルマイクロドロップ化した後、高温下というストレス環境でゲルマイクロドロップを培養し、ゲル内で増殖するもの、すなわち高温耐性ではあるがＶＢＮＣ状を呈しない微生物を含むゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法により除去する。残った微生物含有ゲルマイクロドロップからアガラーゼにより微生物を取り出して、カタラーゼを含有するプレートを高温で平板培養し、プレート上に成育するものを採取すれば高温耐性のＶＢＮＣ状微生物を得ることができる。
【００４９】
以上説明したような本発明の微生物の取得方法によれば、ＶＢＮＣ状微生物やストレス耐性微生物の取得効率を大幅に向上することができる。特に、融点の高いアガロースを用いてゲルマイクロドロップ化を行い、微生物含有ゲルマイクロドロップの培養温度を高温度（５０〜６０℃）に設定することにより、高温耐性微生物、特に、通常の高温による集積培養では取得困難な微生物を取得することが可能である。
【実施例】
【００５０】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら代表例に限定されるものではない。
【００５１】
実施例１（高温で生育するＶＢＮＣ状微生物の取得）
以下の手順により、堆肥からの高温（５０℃）で生育するＶＢＮＣ状微生物の取得を試みた。
熊本県の堆肥場より取得した堆肥１ｇを試料とし、これに生理食塩水１０ｍｌを添加し、ポリトロンでホモジナイズ（５秒間、３回）した。次に、遠心分離（１，０００ｒｐｍＸ１０分）して未分解有機物等の侠雑物を沈降・除去した。得られた上清を４０μｍのナイロンメッシュで濾過して侠雑物を除去し、濾過液を調製した。
【００５２】
得られた濾過液を、生理食塩水にて細胞数が１ｘ１０7／ｍｌとなるように希釈し、微生物含有希釈液を得た。細胞数の確認は、松下エコシステム社製バイオプローラーを用いて実施した。
一方、Ｓｉｇｍａ社製アガロースＴｙｐｅ ＶＩＩ（Ｌｏｗ Ｇｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：カタログ番号Ａ４０１８）の２％水溶液を、電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて５０℃に保温してアガロース溶液を調製した。
【００５３】
上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロース溶液１ｍｌとを混合し、５０℃にてボルテックスミキサーを用いてよく攪拌・混合した。次に、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｉｇｈｔ ｗｈｉｔｅ ｏｉｌ）を満たしたＳＰＧ膜（膜乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に、上記混合液をシリンジを用いて、加圧下に同じミネラルオイル中に押し出して、乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分置いてアガロースをゲル化させ、ゲルマイクロドロップを得た。これに生理食塩水を加えて洗浄し、遠心によってゲルマイクロドロップを回収した。この操作を二回実施し、ミネラルオイルを洗い落とし、更にこれを６０μｍのナイロンメンブレンに通した。
【００５４】
ナイロンメンブレンを通過したゲルマイクロドロップ画分を、ＹＧ液体培地で、５０℃、２０時間通気・攪拌（１００ｒｐｍ）培養した（増殖環境下に置いた）。培養終了後のゲルマイクロドロップはＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液（最終濃度０．０５％）中でよく攪拌し、２０μｍナイロンメンブレンで濾過し、生理食塩水で十分に洗浄し、次にＣＦＤＡにより蛍光染色した。ＣＦＤＡ染色後、アガロースゲル微小粒子を含む試料を、以下の条件・手順に従いフローサイトメトリーにて解析した。
【００５５】
フローサイトメトリーとして、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いた（フローセルのノズル部分は直径１００μｍであった）。ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードを用いて検出した。ＦＬシグナルは、レーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルターによってスプリットした５１７ｎｍの光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光部分を除いた。
【００５６】
フローサイトメトリーを操作して、セルソーターサイトグラムでＦＬシグナルの大きい集団と小さい集団に分離した。すなわち、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０−５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０−５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５−６８５ｎｍ）として測定した。
ＦＬシグナルの小さい集団のゲルマイクロドロップを顕微鏡観察したところ、一つのゲルマイクロドロップ中に１個の細胞が存在していることが観察された。また、この一つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、ＣＦＤＡ染色により生きている細胞であることが分かった。
一方、ＦＬシグナルの大きい集団は、顕微鏡観察の結果、１つのゲルマイクロドロップ中に複数の細胞を含んでいた。尚、顕微鏡観察は、顕微鏡として倒立顕微鏡（オリンパス Ｕ−ＴＢＩＵ−ＴＢＩ９０）を使用し、倍率は１０００倍で、位相差条件で行った。
【００５７】
このように、フローサイトメトリー解析とソーティングを行い、ゲルマイクロドロップ内で増殖しコロニーを形成したゲルマイクロドロップをフローサイトメーターにより除去し、残りのゲルマイクロドロップ（増殖が確認されなかった生細胞を含有するもの）を取得した。
【００５８】
このようにして選択されたアガロース製ゲルマイクロドロップに、アガラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製：Ａ６３０６）を１００Ｕ／ｍｌ加え、３７℃で１時間酵素作用させた。酵素作用によりゲルは溶解し、ゲルから取り出された微生物の溶液が得られた。
【００５９】
このようにして取得した微生物溶液を、カタラーゼ（２０００ｕｎｉｔｓ／ｐｌａｔｅ）を添加したＹＧ寒天培地に塗抹し、５０℃で４８週間培養後、プレート上に生育したコロニー数を計測した（試験区）。一方、アガラーゼを添加しないままのゲルマイクロドロップについても、そのまま同様の培養を行い、アガラーゼ無添加対照区とした。
試験区とアガラーゼ無添加の対照区とを比較した結果、アガラーゼを添加した場合、アガラーゼ無添加の対照区と比較して、コロニー形成数は約１０倍増加し、アガラーゼ添加の顕著な効果が認められた。
【００６０】
実施例２（高温且つ高浸透圧下で生育可能な微生物の分離）
以下の手順により、堆肥からの高温（５０℃）かつ高浸透圧下で生育可能な微生物の取得を試みた。
熊本県の堆肥場より取得した堆肥１ｇを試料とし、これに生理食塩水１０ｍｌを添加し、ポリトロンでホモジナイズ（５秒間、３回）した。次に、遠心分離（１，０００ｒｐｍＸ１０分）して未分解有機物等の侠雑物を沈降・除去した。得られた上清を４０μｍのナイロンメッシュで濾過して侠雑物を除去し、濾過液を調製した。
【００６１】
得られた濾過液を、生理食塩水にて細胞数が１ｘ１０7／ｍｌとなるように希釈し、微生物含有希釈液を得た。細胞数の確認は、松下エコシステム社製バイオプローラーを用いて実施した。
一方、Ｓｉｇｍａ社製アガロースＴｙｐｅ ＶＩＩ（Ｌｏｗ Ｇｅｌｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：カタログ番号Ａ４０１８）の２％水溶液を、電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて５０℃に保温してアガロース溶液を調製した。
【００６２】
上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロース溶液１ｍｌとを混合し、５０℃にてボルテックスミキサーを用いてよく攪拌・混合した。次に、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｉｇｈｔ ｗｈｉｔｅ ｏｉｌ）を満たしたＳＰＧ膜（膜乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に、上記混合液をシリンジを用いて、加圧下に同じミネラルオイル中に押し出して乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分おきアガロースをゲル化させゲルマイクロドロップを得た。これに生理食塩水を加えて洗浄し、遠心によってゲルマイクロドロップを回収した。この操作を二回実施し、ミネラルオイルを洗い落とし、更にこれを６０μｍのナイロンメンブレンに通した。
【００６３】
ナイロンメンブレンを通過したゲルマイクロドロップ画分を、３５％量のソルビトールを含有し、浸透圧を約５Ｍｐａ（塩濃度（ＮａＣｌ）３．５%の海水の浸透圧が２．４Ｍｐａとの知見から算出した。）上昇させたＹＧ液体培地で、５０℃、２０時間通気・攪拌（１００ｒｐｍ）培養した（増殖環境下に置いた）。培養終了後のゲルマイクロドロップはＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液（最終濃度：０．０５％）中でよく攪拌し、２０μmナイロンメンブレンで濾過し、生理食塩水で十分に洗浄し、次にＣＦＤＡにより蛍光染色した。ＣＦＤＡ染色後、アガロースゲル微小粒子を含む試料を、以下の条件・手順に従い、フローサイトメトリーにて解析した。
【００６４】
フローサイトメトリーとして、１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを搭載したＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いた（フローセルのノズル部分は直径１００μｍであった）。ＦＳシグナルとして２°ないし２０°の散乱光をフォトダイオードを用いて検出した。ＦＬシグナルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長経路フィルターによってスプリットした５１７ｎｍの光をフォトマルチプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光部分を除いた。
【００６５】
フローサイトメトリーを操作して、セルソーターサイトグラムでＦＬシグナルの大きい集団と小さい集団に分離した。すなわち、５２５ｎｍパスフィルター（ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ１シグナル（５２０−５３０ｎｍ）として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび５７５バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）を通過したものをＦＬ２（５７０−５８０ｎｍ）として測定し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものをＦＬ３（６６５−６８５ｎｍ）として測定した。
ＦＬシグナルの小さい集団のゲルマイクロドロップを顕微鏡観察したところ、一つのゲルマイクロドロップ中に１個の細胞が存在していることが観察された。この一つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、ＣＦＤＡ染色により生きている細胞であることがわかった。
一方、ＦＬシグナルの大きい集団は、顕微鏡観察の結果、１つのゲルマイクロドロップ中に複数の細胞を含んでいた。尚、顕微鏡観察は、実施例１と同様にして行った。
【００６６】
このように、フローサイトメトリーでの解析とソーティングを行い、ゲルマイクロドロップ内で増殖し、コロニーを形成したゲルマイクロドロップを取得した。
【００６７】
この取得したアガロース製ゲルマイクロドロップにアガラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製：Ａ６３０６）を１００Ｕ／ｍｌ加え、３７℃で１時間酵素を作用させた。酵素作用によりゲルは溶解し、ゲル内の微生物の溶液が得られた。
【００６８】
このようにして取得した微生物溶液をＹＧ寒天培地に塗抹し、５０℃で４８週間培養後、プレート上に生育したコロニー数を計測した（試験区）。一方、アガラーゼを添加しないままのゲルマイクロドロップについても、そのまま同様の培養を行い、アガラーゼ無添加対照区とした。
試験区とアガラーゼ無添加の対照区とを比較した結果、アガラーゼを添加した場合、アガラーゼ無添加の対照区と比較して、コロニー形成数は約１０倍増加し、アガラーゼ添加の顕著な効果が認められた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を取得するにあたり、
試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、
当該微生物含有ゲルマイクロドロップを培養し、当該ゲル内で微生物が増殖せずかつ１個の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、
分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法。
【請求項２】
ストレス耐性微生物を取得するにあたり、
試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、
当該微生物含有ゲルマイクロドロップをストレスのかかる培養条件下で培養し、ゲル内で微生物が増殖し複数の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、
分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法。
【請求項３】
アガロースとして、融解温度５０〜６０℃のアガロースを用い、さらに微生物含有ゲルマイクロドロップの培養を、５０℃〜６０℃で行うことにより、高温耐性微生物を取得することを特徴とする請求項２記載の微生物の取得方法。
【請求項１】
自然界に存在し生きているが培養困難な状態の微生物を取得するにあたり、
試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、
当該微生物含有ゲルマイクロドロップを培養し、当該ゲル内で微生物が増殖せずかつ１個の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、
分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法。
【請求項２】
ストレス耐性微生物を取得するにあたり、
試料中に存在する微生物を、アガロースを用いてゲルマイクロドロップ中に包括し、
当該微生物含有ゲルマイクロドロップをストレスのかかる培養条件下で培養し、ゲル内で微生物が増殖し複数の微生物を含有するゲルマイクロドロップをフローサイトメトリー法にて分離し、
分離された微生物含有ゲルマイクロドロップにアガラーゼを添加してゲルを溶解せしめることを特徴とする微生物の取得方法。
【請求項３】
アガロースとして、融解温度５０〜６０℃のアガロースを用い、さらに微生物含有ゲルマイクロドロップの培養を、５０℃〜６０℃で行うことにより、高温耐性微生物を取得することを特徴とする請求項２記載の微生物の取得方法。
【公開番号】特開２００７−１１１０２３（Ｐ２００７−１１１０２３Ａ）
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０８８８８（Ｐ２００５−３０８８８８）
【出願日】平成１７年１０月２４日（２００５．１０．２４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２４日（２００５．１０．２４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
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