アンモニアの消去方法およびそのための試薬
【目的】 グルタミンシンセターゼを使用してアンモニアを消去する反応を完全に停止してから、目的の生体成分の測定を行うことにより、定量性、正確性に優れた簡便で廉価なアンモニア消去法およびそのための試薬を提供する。
【構成】 グルタミンシンセターゼ、Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰおよび活性化金属を特定量のＥＤＴＡ塩の共存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いでＥＤＴＡ塩をさらに多量に加えてグルタミンシンセターゼの反応を停止する。
【構成】 グルタミンシンセターゼ、Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰおよび活性化金属を特定量のＥＤＴＡ塩の共存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いでＥＤＴＡ塩をさらに多量に加えてグルタミンシンセターゼの反応を停止する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料中の尿素窒素、クレアチニン等の生体成分から尿素反応によりアンモニアを生成し、このアンモニアを測定することにより、尿素窒素、クレアチニン等の生体成分を測定する系において、測定時に正誤差を与える内因性アンモニアまたは外因性アンモニアを消去する方法およびそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、アンモニアを生成する反応系を利用して生体成分を測定する系において、アンモニアの影響を回避する手段として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせてアンモニアを消去する方法が知られている（臨床検査−機器・試薬−第１４巻、第１８３〜１８８頁、１９９１年）。しかし、この方法はイソクエン酸デヒドロゲナーゼの基質であるイソクエン酸が高価であるとの欠点を有する。また上記酵素に代えて、グルタミンシンセターゼを使用するアンモニアを消去する方法が知られている（特開平１−１８７０９６号公報）。この方法は試料中の内因性のアンモニアに予め活性化金属、例えばマグネシウムイオンの存在下でグルタミンシンセターゼを作用させて消去し、次いで活性化金属との結合性の強い結合剤、例えばＥＤＴＡ塩などを加えてグルタミンシンセターゼの反応を止めた後、目的の生体成分を測定する方法であり、アンモニアの消去系では下記式１の反応が進行する。
【０００３】
【数１】
【０００４】上記方法では目的成分を測定する第二試薬へＥＤＴＡ塩を添加して、第一試薬中のグルタミンシンセターゼの反応を停止しようとする。すなわち尿素窒素を測定するには、グルタミン酸、ＡＤＰ、α−ケトグルタル酸、マグネシウムイオン、グルタミンシンセターゼおよびＮＡＤＨを含む第一試薬を試料に添加してから、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、α−ケトグルタル酸およびＥＤＴＡ・２Ｎａを含む第二試薬を添加し、吸光度の減少を測定している。しかしながら第二試薬にＥＤＴＡ塩を添加しても、上記反応は完全に停止せずに、目的の生体成分の測定において負誤差を与えるという欠点が見出された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はグルタミンシンセターゼを使用してアンモニアを消去する反応を完全に停止してから、目的の生体成分の測定を行うことにより、定量性、正確性に優れた簡便で廉価なアンモニア消去法およびそのための試薬を提供することにある。
【０００６】本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討したところ、活性化金属との結合性の強い結合剤を第一試薬において特定量使用して、試料中のアンモニアを消去した後、さらに該結合剤を添加してグルタミンシンセターゼの反応を停止し、目的の生体成分を測定することにより、上記目的が達成されることを見出した。
【０００７】すなわち本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤１〜１０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いで該結合剤をさらに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミンシンセターゼ反応を停止することを特徴とするアンモニアの消去法である。
【０００８】または本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレアーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中の尿素窒素の測定法である。
【０００９】さらに本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のクレアチニンの測定法である。
【００１０】本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼの測定法である。
【００１１】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなる尿素窒素測定用試薬である。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）ウレアーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【００１２】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるクレアチニン測定用試薬である。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【００１３】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるグアナーゼ測定用試薬である。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）グアニン（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【００１４】本発明に使用されるグルタミンシンセターゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．１２）は、Ｌ−グルタミン酸およびアンモニアにＡＴＰの存在下に作用して、Ｌ−グルタミン、ＡＤＰおよび無機リン酸を生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例えば各種高等動物の脳や肝臓、豆の種子、大腸菌その他の微生物から得られ、好適にはバチルス属、ミクロコッカス属およびブレビバクテリウム属由来のものが挙げられる。
【００１５】本発明に使用される活性化金属としては、２価金属イオン、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン等が好適に用いられる。これらのイオンは通常、塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形で用いられる。具体的にはＭｇＣｌ2 , ＭｎＣｌ2 ，ＣｏＣｌ2 ，ＭｇＣＯ3 ，ＭｎＣＯ3 ，ＣｏＣＯ3 ，ＭｇＳＯ4 ，ＭｎＳＯ4 ，ＣｏＳＯ4 等が挙げられる。
【００１６】本発明に使用される活性化金属との結合性の強い結合剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸塩（ＮＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸塩（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパン四酢酸塩（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ四酢酸塩（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ二酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、トランス−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等及びそれらの塩類を含むキレート剤、またはピロリン酸及びその塩類が挙げられる。
【００１７】本発明のアンモニアを消去する試薬および目的成分を測定する第一試薬および第二試薬のｐＨは、各種緩衝液によりｐＨ５〜１１に保たれているのが好ましい。好ましい緩衝液としては、例えばトリエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
【００１８】本発明の上記試薬は必要により、界面活性剤、防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤としては、ＮａＮ3 、抗生物質が好適に用いられる。
【００１９】試薬の形状としては、液状試薬であっても、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせてもよい。
【００２０】本発明では目的成分を測定する第一試薬に活性化金属との結合性の強い結合剤を１〜１０ｍＭ含有させる必要がある。第一試薬に該結合剤が１ｍＭ未満含有すると、前記〔式１〕の反応が完全に停止せず、測定値に負誤差を生ずる。さらに１０ｍＭを越えて含有すると、アンモニアの消去が充分に行われない。本発明では第二試薬に上記結合剤を１〜１００ｍＭ含有させて、グルタミンシンセターゼの反応を停止する。グルタミンシンセターゼの反応を停止するために、さらにグルタミンシンセターゼ反応阻害剤、例えばＡＤＰなどを添加してもよい。
【００２１】本発明に使用されるグルタミンシンセターゼの濃度はアンモニアの消去に適した濃度であれば、特に限定されないが、好適には２〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で用いられる。Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰの使用濃度としては、アンモニアの消去に適した濃度であれば、特に限定されないが、Ｌ−グルタミン酸は１〜１００ｍＭ、ＡＴＰは５〜５０ｍＭの範囲で好適に用いられる。また活性化金属もアンモニアの消去に適した濃度であれば、特に限定はされないが、好適には５〜５０ｍＭの範囲で用いられる。
【００２２】本発明に使用されるウレアーゼは、尿素と水に作用してアンモニアと二酸化炭素を生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例えば細菌、酵母、カビ、植物、下等動物などから広く得られる。好適にはナタマメ由来のものが挙げられる。その濃度は特に制限されないが、尿素窒素測定用試薬中、好適には０．５〜５０Ｕ／ｍｌである。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、α−ケトグルタル酸にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に作用して、Ｌ−グルタミン酸と水をはＮＡＤ（Ｐ）+ を生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例えば細菌、酵母、カビなどから得られる。好適には牛肝由来のものが挙げられる。その濃度は特に限定されないが、好適には０．１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００２３】本発明に使用されるクレアチニンデイミナーゼとは、クレアチンと水に作用してＮ−メチルヒダントインとアンモニアを生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、種々の微生物、例えばクロストリジウム(Clostridium) 属、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属などから得られる。その濃度は特に制限されないが、クレアチニン測定試薬中、好適には０．２〜２０Ｕ／ｍｌである。
【００２４】本発明に使用れるグアニンとはグアナーゼの存在下に水と反応してキサンチンとアンモニアを生成する。その濃度は特に制限されないが、グアナーゼ測定試薬中、好適には５〜５００ｍＭである。
【００２５】本発明の尿素窒素測定用試薬の一例としては、下記組成を含むものがある。
第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２６】本発明のクレアチニン測定用試薬の一例としては、下記組成を含むものがある。
第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ ０．２〜２０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２７】本発明のグアナーゼ測定用試薬の一例としては、下記組成を含むものがある。
第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％第二試薬： （ｆ）グアニン ５〜５００ｍＭ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２８】本発明の方法を用いて目的成分を測定する条件としては、特に厳密に規制するものではないが、反応温度は０〜４０℃の間で、３７℃または３０℃が好適に用いられる。反応後の吸光度は通常、３４０ｎｍにて測定する。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３０】試料液尿素窒素溶液（１５、６０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したもの、（アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したものおよび尿素窒素溶液又はアンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１の測定結果から、アンモニアを添加した場合にも、アンモニアの影響を受けることなく、尿素窒素量がほぼ正確に測定できたことがわかる。
【００３３】比較例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３４】試料液実施例１と同じものを使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３５】表１の測定結果より、第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止しておらず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００３６】比較例２ 第一試薬 Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３７】試料液実施例１と同じものを使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３８】表１の測定結果より、第一試薬ＥＤＴＡ・２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと、アンモニアを添加した場合に尿素窒素量がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００３９】比較例３ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４０】試料液実施例１と同じものを使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００４１】表１の測定結果より、第一試薬のグルタミンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加しないと、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後グルタミンシンセターゼが完全に停止せず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００４２】実施例２ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４３】試料液クレアチニン溶液（１．１ｍｇ／ｄｌ、５．７ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したもの、アンモニア溶液（３０ｍｇ／ｄｌ、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したものおよびクレアチニン溶液又はアンモニア溶液に添加しない管理血清を使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表２にクレアチニン量として示す。
【００４４】比較例４〜６下記第一試薬および第二試薬を用いて、実施例１と同じ試料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度測定した。その結果を表２にクレアチニン量として示す。
第一試薬（比較例４）
グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例４）
クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４５】
第一試薬（比較例５）
Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例５）
クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４６】
第一試薬（比較例６）
グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例６）
クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４７】
【表２】
【００４８】表２の測定結果から、アンモニアを添加した場合（実施例２）にも、アンモニアの影響を受けることなく、クレアチニン量がほぼ正確に測定できていることがわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと（比較例４）、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止しておらず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。また第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと（比較例５）、アンモニアを添加した場合にクレアチニン量がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加しないと（比較例６）、アンモニアを添加した場合にアンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止せず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００４９】実施例３ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬 グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５０】試料液グアナーゼ溶液（２．０、６．０Ｕ／１）を管理血清に添加したもの、アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したものおよびグアナーゼ溶液又はアンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表３にグアナーゼ活性として示す。
【００５１】比較例７〜９下記第一試薬および第二試薬を用いて、実施例１と同じ資料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度を測定した。その測定結果は表３にグアナーゼ活性として示す。
第一試薬（比較例７）
グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例７）
グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５２】
第一試薬（比較例８）
Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例８）
グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５３】
第一試薬（比較例９）
グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例９）
グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５４】
【表３】
【００５５】表３の測定結果から、アンモニアを添加した場合（実施例３）にも、アンモニアの影響を受けることなく、グアナーゼ量がほぼ正確に測定できていることがわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと（比較例７）、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止しておらず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。 また第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋをグルタミンシンセターゼを添加しないと（比較例８）、アンモニア添加した場合にグアナーゼ活性がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加しないと（比較例９）、アンモニアを添加した場合にアンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止せず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。なお、上記実施例および比較例において、非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルシクロヘキシルエーテルを使用した。
【００５６】
【発明の効果】活性化金属との結合性の強い結合剤を目的成分を測定する第二試薬に含有させるだけでは、グルタミンシンセターゼの反応を完全に停止することができず、負の誤差を生じる（比較例２、３参照）。したがって本発明では、特定量の結合剤の共存下にグルタミンシンセターゼを反応させて内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いで目的とする測定成分、例えば尿素窒素、クレアチニン、グアナーゼなどの測定系にさらに該結合剤を添加することにより、グルタミンシンセターゼの反応を完全に消去させて目的成分を測定することにより、上記欠点を解消する。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料中の尿素窒素、クレアチニン等の生体成分から尿素反応によりアンモニアを生成し、このアンモニアを測定することにより、尿素窒素、クレアチニン等の生体成分を測定する系において、測定時に正誤差を与える内因性アンモニアまたは外因性アンモニアを消去する方法およびそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、アンモニアを生成する反応系を利用して生体成分を測定する系において、アンモニアの影響を回避する手段として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼを組み合わせてアンモニアを消去する方法が知られている（臨床検査−機器・試薬−第１４巻、第１８３〜１８８頁、１９９１年）。しかし、この方法はイソクエン酸デヒドロゲナーゼの基質であるイソクエン酸が高価であるとの欠点を有する。また上記酵素に代えて、グルタミンシンセターゼを使用するアンモニアを消去する方法が知られている（特開平１−１８７０９６号公報）。この方法は試料中の内因性のアンモニアに予め活性化金属、例えばマグネシウムイオンの存在下でグルタミンシンセターゼを作用させて消去し、次いで活性化金属との結合性の強い結合剤、例えばＥＤＴＡ塩などを加えてグルタミンシンセターゼの反応を止めた後、目的の生体成分を測定する方法であり、アンモニアの消去系では下記式１の反応が進行する。
【０００３】
【数１】
【０００４】上記方法では目的成分を測定する第二試薬へＥＤＴＡ塩を添加して、第一試薬中のグルタミンシンセターゼの反応を停止しようとする。すなわち尿素窒素を測定するには、グルタミン酸、ＡＤＰ、α−ケトグルタル酸、マグネシウムイオン、グルタミンシンセターゼおよびＮＡＤＨを含む第一試薬を試料に添加してから、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、α−ケトグルタル酸およびＥＤＴＡ・２Ｎａを含む第二試薬を添加し、吸光度の減少を測定している。しかしながら第二試薬にＥＤＴＡ塩を添加しても、上記反応は完全に停止せずに、目的の生体成分の測定において負誤差を与えるという欠点が見出された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はグルタミンシンセターゼを使用してアンモニアを消去する反応を完全に停止してから、目的の生体成分の測定を行うことにより、定量性、正確性に優れた簡便で廉価なアンモニア消去法およびそのための試薬を提供することにある。
【０００６】本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討したところ、活性化金属との結合性の強い結合剤を第一試薬において特定量使用して、試料中のアンモニアを消去した後、さらに該結合剤を添加してグルタミンシンセターゼの反応を停止し、目的の生体成分を測定することにより、上記目的が達成されることを見出した。
【０００７】すなわち本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤１〜１０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いで該結合剤をさらに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミンシンセターゼ反応を停止することを特徴とするアンモニアの消去法である。
【０００８】または本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレアーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中の尿素窒素の測定法である。
【０００９】さらに本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のクレアチニンの測定法である。
【００１０】本発明は（ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼの測定法である。
【００１１】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなる尿素窒素測定用試薬である。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）ウレアーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【００１２】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるクレアチニン測定用試薬である。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【００１３】本発明は下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるグアナーゼ測定用試薬である。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）グアニン（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【００１４】本発明に使用されるグルタミンシンセターゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．１２）は、Ｌ−グルタミン酸およびアンモニアにＡＴＰの存在下に作用して、Ｌ−グルタミン、ＡＤＰおよび無機リン酸を生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例えば各種高等動物の脳や肝臓、豆の種子、大腸菌その他の微生物から得られ、好適にはバチルス属、ミクロコッカス属およびブレビバクテリウム属由来のものが挙げられる。
【００１５】本発明に使用される活性化金属としては、２価金属イオン、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン等が好適に用いられる。これらのイオンは通常、塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形で用いられる。具体的にはＭｇＣｌ2 , ＭｎＣｌ2 ，ＣｏＣｌ2 ，ＭｇＣＯ3 ，ＭｎＣＯ3 ，ＣｏＣＯ3 ，ＭｇＳＯ4 ，ＭｎＳＯ4 ，ＣｏＳＯ4 等が挙げられる。
【００１６】本発明に使用される活性化金属との結合性の強い結合剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸塩（ＮＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸塩（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパン四酢酸塩（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ四酢酸塩（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ二酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、トランス−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等及びそれらの塩類を含むキレート剤、またはピロリン酸及びその塩類が挙げられる。
【００１７】本発明のアンモニアを消去する試薬および目的成分を測定する第一試薬および第二試薬のｐＨは、各種緩衝液によりｐＨ５〜１１に保たれているのが好ましい。好ましい緩衝液としては、例えばトリエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
【００１８】本発明の上記試薬は必要により、界面活性剤、防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤としては、ＮａＮ3 、抗生物質が好適に用いられる。
【００１９】試薬の形状としては、液状試薬であっても、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせてもよい。
【００２０】本発明では目的成分を測定する第一試薬に活性化金属との結合性の強い結合剤を１〜１０ｍＭ含有させる必要がある。第一試薬に該結合剤が１ｍＭ未満含有すると、前記〔式１〕の反応が完全に停止せず、測定値に負誤差を生ずる。さらに１０ｍＭを越えて含有すると、アンモニアの消去が充分に行われない。本発明では第二試薬に上記結合剤を１〜１００ｍＭ含有させて、グルタミンシンセターゼの反応を停止する。グルタミンシンセターゼの反応を停止するために、さらにグルタミンシンセターゼ反応阻害剤、例えばＡＤＰなどを添加してもよい。
【００２１】本発明に使用されるグルタミンシンセターゼの濃度はアンモニアの消去に適した濃度であれば、特に限定されないが、好適には２〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で用いられる。Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰの使用濃度としては、アンモニアの消去に適した濃度であれば、特に限定されないが、Ｌ−グルタミン酸は１〜１００ｍＭ、ＡＴＰは５〜５０ｍＭの範囲で好適に用いられる。また活性化金属もアンモニアの消去に適した濃度であれば、特に限定はされないが、好適には５〜５０ｍＭの範囲で用いられる。
【００２２】本発明に使用されるウレアーゼは、尿素と水に作用してアンモニアと二酸化炭素を生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例えば細菌、酵母、カビ、植物、下等動物などから広く得られる。好適にはナタマメ由来のものが挙げられる。その濃度は特に制限されないが、尿素窒素測定用試薬中、好適には０．５〜５０Ｕ／ｍｌである。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、α−ケトグルタル酸にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に作用して、Ｌ−グルタミン酸と水をはＮＡＤ（Ｐ）+ を生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、例えば細菌、酵母、カビなどから得られる。好適には牛肝由来のものが挙げられる。その濃度は特に限定されないが、好適には０．１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００２３】本発明に使用されるクレアチニンデイミナーゼとは、クレアチンと水に作用してＮ−メチルヒダントインとアンモニアを生成する反応を触媒する。このような酵素の起源は特に限定されるものではなく、種々の微生物、例えばクロストリジウム(Clostridium) 属、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属などから得られる。その濃度は特に制限されないが、クレアチニン測定試薬中、好適には０．２〜２０Ｕ／ｍｌである。
【００２４】本発明に使用れるグアニンとはグアナーゼの存在下に水と反応してキサンチンとアンモニアを生成する。その濃度は特に制限されないが、グアナーゼ測定試薬中、好適には５〜５００ｍＭである。
【００２５】本発明の尿素窒素測定用試薬の一例としては、下記組成を含むものがある。
第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％第二試薬： （ｆ）ウレアーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２６】本発明のクレアチニン測定用試薬の一例としては、下記組成を含むものがある。
第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％第二試薬： （ｆ）クレアチニンデイミナーゼ ０．２〜２０Ｕ／ｍｌ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２７】本発明のグアナーゼ測定用試薬の一例としては、下記組成を含むものがある。
第一試薬： （ａ）グルタミンシンセターゼ ２〜１００Ｕ／ｍｌ （ｂ）Ｌ−グルタミン酸 １〜１００ｍＭ （ｃ）ＡＴＰ ５〜５０ｍＭ （ｄ）活性化金属 ５〜５０ｍＭ （ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％第二試薬： （ｆ）グアニン ５〜５００ｍＭ （ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ （ｈ）α−ケトグルタル酸 １〜１００ｍＭ （ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ０．０１〜１０ｍＭ （ｊ）活性化金属との結合性の強い結合剤 １〜１００ｍＭ ＡＤＰ ０．０２〜５０ｍＭ および 非イオン性界面活性剤 ０．０１〜２％
【００２８】本発明の方法を用いて目的成分を測定する条件としては、特に厳密に規制するものではないが、反応温度は０〜４０℃の間で、３７℃または３０℃が好適に用いられる。反応後の吸光度は通常、３４０ｎｍにて測定する。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３０】試料液尿素窒素溶液（１５、６０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したもの、（アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したものおよび尿素窒素溶液又はアンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１の測定結果から、アンモニアを添加した場合にも、アンモニアの影響を受けることなく、尿素窒素量がほぼ正確に測定できたことがわかる。
【００３３】比較例１ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ（バチルス属由来） ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３４】試料液実施例１と同じものを使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３５】表１の測定結果より、第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止しておらず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００３６】比較例２ 第一試薬 Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００３７】試料液実施例１と同じものを使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００３８】表１の測定結果より、第一試薬ＥＤＴＡ・２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと、アンモニアを添加した場合に尿素窒素量がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００３９】比較例３ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来）１．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４０】試料液実施例１と同じものを使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表１に尿素窒素量として示す。
【００４１】表１の測定結果より、第一試薬のグルタミンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加しないと、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後グルタミンシンセターゼが完全に停止せず、尿素窒素の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００４２】実施例２ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬 クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４３】試料液クレアチニン溶液（１．１ｍｇ／ｄｌ、５．７ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したもの、アンモニア溶液（３０ｍｇ／ｄｌ、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したものおよびクレアチニン溶液又はアンモニア溶液に添加しない管理血清を使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表２にクレアチニン量として示す。
【００４４】比較例４〜６下記第一試薬および第二試薬を用いて、実施例１と同じ試料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度測定した。その結果を表２にクレアチニン量として示す。
第一試薬（比較例４）
グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例４）
クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４５】
第一試薬（比較例５）
Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例５）
クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４６】
第一試薬（比較例６）
グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例６）
クレアチニンデイミナーゼ １０Ｕ／ｍｌ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ
【００４７】
【表２】
【００４８】表２の測定結果から、アンモニアを添加した場合（実施例２）にも、アンモニアの影響を受けることなく、クレアチニン量がほぼ正確に測定できていることがわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと（比較例４）、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止しておらず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。また第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋとグルタミンシンセターゼを添加しないと（比較例５）、アンモニアを添加した場合にクレアチニン量がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加しないと（比較例６）、アンモニアを添加した場合にアンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止せず、クレアチニンの測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。
【００４９】実施例３ 第一試薬 グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ２ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬 グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５０】試料液グアナーゼ溶液（２．０、６．０Ｕ／１）を管理血清に添加したもの、アンモニア溶液（３０、９０ｍｇ／ｄｌ）を管理血清に添加したものおよびグアナーゼ溶液又はアンモニア溶液を添加しない管理血清を使用した。
操作方法試料液０．１ｍｌに第一試薬３ｍｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬を１ｍｌ加えて、単位時間当り吸光度変化を３４０ｎｍで測定した。測定結果を表３にグアナーゼ活性として示す。
【００５１】比較例７〜９下記第一試薬および第二試薬を用いて、実施例１と同じ資料液を実施例１と同じ操作方法により吸光度を測定した。その測定結果は表３にグアナーゼ活性として示す。
第一試薬（比較例７）
グルタミンシンセターゼ ６Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例７）
グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５２】
第一試薬（比較例８）
Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例８）
グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５３】
第一試薬（比較例９）
グルタミンシンセターゼ ３Ｕ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸 ５０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ １．５Ｕ／ｍｌ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ 第二試薬（比較例９）
グアニン ２００μＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １．５Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｋ ７０ｍＭ 非イオン性界面活性剤 ０．１％ グッド緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＭ
【００５４】
【表３】
【００５５】表３の測定結果から、アンモニアを添加した場合（実施例３）にも、アンモニアの影響を受けることなく、グアナーゼ量がほぼ正確に測定できていることがわかる。また第一試薬からＥＤＴＡ・２Ｋを除くと（比較例７）、アンモニアを添加した場合にアンモニアの消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止しておらず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。 また第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋをグルタミンシンセターゼを添加しないと（比較例８）、アンモニア添加した場合にグアナーゼ活性がアンモニアの影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。さらに第一試薬のグルタミンシンセターゼ濃度を低下させても、第一試薬にＥＤＴＡ・２Ｋを添加しないと（比較例９）、アンモニアを添加した場合にアンモニア消去後、グルタミンシンセターゼが完全に停止せず、グアナーゼ活性の測定値が負の影響を受けて正確に測定されていないことがわかる。なお、上記実施例および比較例において、非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルシクロヘキシルエーテルを使用した。
【００５６】
【発明の効果】活性化金属との結合性の強い結合剤を目的成分を測定する第二試薬に含有させるだけでは、グルタミンシンセターゼの反応を完全に停止することができず、負の誤差を生じる（比較例２、３参照）。したがって本発明では、特定量の結合剤の共存下にグルタミンシンセターゼを反応させて内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いで目的とする測定成分、例えば尿素窒素、クレアチニン、グアナーゼなどの測定系にさらに該結合剤を添加することにより、グルタミンシンセターゼの反応を完全に消去させて目的成分を測定することにより、上記欠点を解消する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤１〜１０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いで該結合剤をさらに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミンシンセダーゼ反応を停止することを特徴とするアンモニアの消去法。
【請求項２】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレアーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中の尿素窒素の測定法。
【請求項３】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のクレアチニンの測定法。
【請求項４】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼの測定法。
【請求項５】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなる尿素窒素測定用試薬。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）ウレアーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【請求項６】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるクレアチニン測定用試薬。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【請求項７】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるグアナーゼ測定用試薬。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）グアニン（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【請求項１】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属を、（ｅ）活性化金属との結合性の強い結合剤１〜１０ｍＭの共存下に試料に作用させて、内因性アンモニアおよび外因性アンモニアを消去し、次いで該結合剤をさらに１〜１００ｍＭ添加して、グルタミンシンセダーゼ反応を停止することを特徴とするアンモニアの消去法。
【請求項２】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰおよび（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）ウレアーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含有する第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中の尿素窒素の測定法。
【請求項３】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のクレアチニンの測定法。
【請求項４】 （ａ）グルタミンシンセターゼ、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸、（ｃ）ＡＴＰ、（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第一試薬を試料に作用させ、次いで（ｆ）グアニン、（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）α−ケトグルタル酸、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ塩を含む第二試薬を作用させ、次いで吸光度変化を測定することを特徴とする試料中のグアナーゼの測定法。
【請求項５】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなる尿素窒素測定用試薬。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）ウレアーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【請求項６】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるクレアチニン測定用試薬。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）クレアチニンデイミナーゼ（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【請求項７】下記組成を含む第一試薬と下記第二試薬からなるグアナーゼ測定用試薬。
第一試薬：（ａ）グルタミンシンセターゼ（ｂ）Ｌ−グルタミン酸（ｃ）ＡＴＰ（ｄ）活性化金属および（ｅ）１〜１０ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤第二試薬：（ｆ）グアニン（ｇ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｈ）α−ケトグルタル酸（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび（ｊ）１〜１００ｍＭの活性化金属との結合性の強い結合剤
【公開番号】特開平７−５１０９４
【公開日】平成７年（１９９５）２月２８日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−１９９５９６
【出願日】平成５年（１９９３）８月１１日
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【公開日】平成７年（１９９５）２月２８日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）８月１１日
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
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