本発明は、１またはそれ以上の生合成経路を介したイソプレノイドのロバスト産生の方法を提供する。本発明は、対象となる方法を実施するために、核酸、酵素、発現ベクター、および遺伝子組み換え宿主細胞も提供する。本発明は、遺伝子組み換え宿主細胞からのイソプレノイドの高産生能のための発酵方法も提供する。一局面では、イソプレノイドを産生する方法には、（ａ）経路酵素群のすべてが少なくとも１つの異種転写制御因子の制御下にあるソペンテニルピロリン酸を作るための酵素経路を含む複数の宿主細胞を得ること；ならびに、（ｂ）宿主細胞に最大比増殖速度を提供しうる条件と比較して準最適な条件下の培地において宿主細胞を培養することを含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレノイドを産生する方法であって
（ａ）経路酵素のすべてが少なくとも１つの異種転写制御因子の制御下にあるソペンテニルピロリン酸を作るための酵素経路を含む複数の宿主細胞を得ること；ならびに
（ｂ）該宿主細胞に最大比増殖速度を提供しうる条件と比較して準最適な条件下の培地において該宿主細胞を培養すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記経路がメバロン酸経路である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記経路がＤＸＰ経路である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの異種転写制御配列が誘導性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記経路酵素が単一の転写調節因子の制御下にある、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記経路酵素が複数の異種転写調節因子の制御下にある、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が原核生物である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が真核生物である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が菌類である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記経路に内因性メバロン酸経路を有する原核生物のメバロン酸経路酵素群をコードする核酸配列が含まれる、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記原核生物が、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）から選択される属である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸配列が、アセチル‐ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、およびメバロン酸キナーゼから選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸配列がクラスＩＩ ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、栄養分または温度またはこれらの両方が該宿主細胞に最大比増殖速度を提供しうる濃度未満に維持された培地中で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記培地の温度が、最大比増殖速度を提供しうる温度よりも少なくとも約２−２０℃低い、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞を、最大比増殖速度を提供しうる温度よりも少なくとも約５℃低い温度で培養する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記培地の温度が、最大比増殖速度を提供しうる温度よりも少なくとも約１０℃低い、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記培地に炭素源が含まれ、炭素源の量によって最大比増殖速度の約９０％またはそれ未満が提供される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記炭素源の量によって最大比増殖速度の約７５％またはそれ未満が提供される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記炭素源の量によって最大比増殖速度の約５０％またはそれ未満が提供される、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記炭素源の量によって最大比増殖速度の約２５％またはそれ未満が提供される、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記炭素源の量によって最大比増殖速度の約７５％−１０％が提供される、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記培地に、最大比増殖速度の約９０％またはそれ未満が提供されうる量未満で存在する窒素源が含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記窒素源の量によって最大比増殖速度の約７５％またはそれ未満が提供される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記窒素源の量によって最大比増殖速度の約５０％またはそれ未満が提供される、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記窒素源の量によって最大比増殖速度の約２５％またはそれ未満が提供される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記窒素源の量によって最大比増殖速度の約７５％−１０％が提供される、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記イソプレノイドが培地１リットル当たり約１０グラム以上の量で産生される、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記イソプレノイドが乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ｍｇ以上の量で産生される、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
前記イソプレノイドの量が約１５０時間以内に産生される、請求項３０または３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記イソプレノイドの量が約９６時間以内に産生される、請求項３０または３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記イソプレノイドの量が約７２時間以内に産生される、請求項３０または３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞が最大比増殖速度を提供しうる温度未満の温度で培養され、かつ、該宿主細胞が最大比増殖速度を提供しうる濃度未満に炭素源が維持された培地中で培養される、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、およびポリテルペンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
前記イソプレノイドがカロテノイドではない、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
前記イソプレノイドがＣ_５−Ｃ_２０イソプレノイドである、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロオール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
イソプレノイドを産生する方法であって：
（ａ）内因性メバロン酸経路を有する原核生物のメバロン酸経路酵素群をコードする核酸配列を含む複数の宿主細胞を得ること；ならびに
（ｂ）該宿主細胞に最大比増殖速度を提供しうる条件と比較して準最適な条件下の培地において該宿主細胞を培養すること、
を含む方法。
【請求項４１】
炭素源を含む培地中で培養した場合にイソプレノイドを培地１リットル当たり約１０グラムより多い量で産生可能な宿主細胞。
【請求項４２】
炭素源を含む培地中で培養した場合にイソプレノイドを乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ｍｇより多い量で産生可能な宿主細胞。
【請求項４３】
イソプレノイドの量が約１５０時間以内に産生される、請求項４０または４１のいずれかに記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２−１】

【図１２−２】

【図１３】

【図１４−１】

【図１４−２】

【図１５−１】

【図１５−２】

【図１６】

【公表番号】特表２００９−５３８６０１（Ｐ２００９−５３８６０１Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１２３２８（Ｐ２００９−５１２３２８）
【出願日】平成１９年５月２５日（２００７．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９８０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０３３９
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３４８６４６）アミリス　バイオテクノロジーズ，　インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】